TW202016299A - 溶解的腺三磷雙磷酸酶、方法及用途 - Google Patents
溶解的腺三磷雙磷酸酶、方法及用途 Download PDFInfo
- Publication number
- TW202016299A TW202016299A TW108125140A TW108125140A TW202016299A TW 202016299 A TW202016299 A TW 202016299A TW 108125140 A TW108125140 A TW 108125140A TW 108125140 A TW108125140 A TW 108125140A TW 202016299 A TW202016299 A TW 202016299A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- artificial sequence
- seq
- source
- adenosine triphosphatase
- description
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 108010007730 Apyrase Proteins 0.000 title abstract description 4
- 102000007347 Apyrase Human genes 0.000 title abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 28
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 claims abstract description 22
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 claims abstract description 22
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 claims description 93
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 claims description 93
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 78
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 75
- 102100029722 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 45
- 101001012447 Homo sapiens Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 45
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 claims description 39
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 claims description 39
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 claims description 39
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 39
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 39
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 33
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 24
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 24
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 21
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 18
- 208000021709 Delayed Graft Function Diseases 0.000 claims description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 15
- 208000034486 Multi-organ failure Diseases 0.000 claims description 14
- 208000010718 Multiple Organ Failure Diseases 0.000 claims description 14
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 208000029744 multiple organ dysfunction syndrome Diseases 0.000 claims description 14
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 11
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 11
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 10
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 claims description 10
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 claims description 10
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 10
- 238000007675 cardiac surgery Methods 0.000 claims description 10
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 claims description 10
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 9
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 claims description 7
- 108030003004 Triphosphatases Proteins 0.000 claims description 7
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 claims description 7
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 6
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims description 6
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims description 5
- 208000019155 Radiation injury Diseases 0.000 claims description 5
- 206010039020 Rhabdomyolysis Diseases 0.000 claims description 5
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 claims description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 5
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 claims description 5
- 208000012947 ischemia reperfusion injury Diseases 0.000 claims description 5
- 231100000515 lung injury Toxicity 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 230000008733 trauma Effects 0.000 claims description 5
- 230000009692 acute damage Effects 0.000 claims description 4
- 206010069351 acute lung injury Diseases 0.000 claims description 4
- 208000037892 acute myocardial injury Diseases 0.000 claims description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 4
- 210000001765 aortic valve Anatomy 0.000 claims description 4
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 claims description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 102220468054 Brother of CDO_N73Q_mutation Human genes 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 102220004414 rs104894504 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220257472 rs1553380245 Human genes 0.000 claims description 2
- 102200148410 rs672601363 Human genes 0.000 claims description 2
- 102220068569 rs794727519 Human genes 0.000 claims description 2
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 claims 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 107
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 31
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 18
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 abstract description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 161
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 94
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 90
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 89
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 85
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 85
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 85
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 36
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 32
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 30
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 28
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 27
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 20
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 17
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 11
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 10
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 9
- 102100023038 WD and tetratricopeptide repeats protein 1 Human genes 0.000 description 8
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 7
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 7
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 7
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 7
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 7
- 101100501552 Homo sapiens ENTPD1 gene Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 6
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 6
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 6
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 5
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 5
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 5
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 5
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 4
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 4
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 description 4
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 3
- 206010063897 Renal ischaemia Diseases 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 239000005552 B01AC04 - Clopidogrel Substances 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 101100054570 Caenorhabditis elegans acn-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 208000009857 Microaneurysm Diseases 0.000 description 2
- 101000605054 Mus musculus Epididymal-specific lipocalin-8 Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 2
- GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N clopidogrel Chemical compound C1([C@H](N2CC=3C=CSC=3CC2)C(=O)OC)=CC=CC=C1Cl GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013059 nephrectomy Methods 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229960005141 piperazine Drugs 0.000 description 2
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 206010003178 Arterial thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 201000006474 Brain Ischemia Diseases 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101000894568 Catharanthus roseus Catharanthine synthase Proteins 0.000 description 1
- 206010008092 Cerebral artery thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 206010008120 Cerebral ischaemia Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010011091 Coronary artery thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710116102 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100029723 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100029725 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 3 Human genes 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 1
- LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N Fentrazamide Chemical compound N1=NN(C=2C(=CC=CC=2)Cl)C(=O)N1C(=O)N(CC)C1CCCCC1 LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101001012441 Homo sapiens Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001012432 Homo sapiens Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010021137 Hypovolaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010070511 Hypoxic-ischaemic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- 150000007649 L alpha amino acids Chemical class 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 208000037212 Neonatal hypoxic and ischemic brain injury Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- PYPRPMDWAJYOCK-UHFFFAOYSA-N OP(O)(=O)OP(O)(O)=O.OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(O)=O.OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O PYPRPMDWAJYOCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037600 P2Y purinoceptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 108010085249 Purinergic P2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019892 Stellar Nutrition 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 206010069363 Traumatic lung injury Diseases 0.000 description 1
- 208000024248 Vascular System injury Diseases 0.000 description 1
- 208000012339 Vascular injury Diseases 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000007845 assembly PCR Methods 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 208000009973 brain hypoxia - ischemia Diseases 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 206010007625 cardiogenic shock Diseases 0.000 description 1
- 230000036996 cardiovascular health Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003009 clopidogrel Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004883 computer application Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002528 coronary thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 230000009429 distress Effects 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 108010047482 ectoATPase Proteins 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010502 episomal replication Effects 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- ZSZNUIGFWQXJMQ-UHFFFAOYSA-K gold(3+);phosphate Chemical compound [Au+3].[O-]P([O-])([O-])=O ZSZNUIGFWQXJMQ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002631 hypothermal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 208000023589 ischemic disease Diseases 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 238000001499 laser induced fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000003589 nefrotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000381 nephrotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- -1 nucleotide monophosphate Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 208000033300 perinatal asphyxia Diseases 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229940020573 plavix Drugs 0.000 description 1
- 238000012123 point-of-care testing Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 201000011461 pre-eclampsia Diseases 0.000 description 1
- 229940071643 prefilled syringe Drugs 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002254 renal artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical class OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000626 ureter Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
- C12Y306/01—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) in phosphorus-containing anhydrides (3.6.1)
- C12Y306/01005—Apyrase (3.6.1.5), i.e. ATP diphosphohydrolase
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Virology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本發明涉及溶解的腺三磷雙磷酸酶多肽的設計和治療用途、藥物組成物、用於預防和治療組織損傷的治療用途及方法。
Description
本發明涉及溶解的腺三磷雙磷酸酶多肽的設計和治療用途、藥物組成物、以及用於預防和治療組織損傷之方法。
腺三磷雙磷酸酶(ATP-二磷酸酶、腺苷二磷酸酶、ADP酶、或ATP二磷酸水解酶)係質膜結合的針對二磷酸核苷酸和三磷酸核苷酸(NDP和NTP)二者都具有活性的酶的酶組,並在兩個不同的連續磷酸鹽釋放步驟中以NDP為中間體將NTP水解成核苷酸一磷酸(NMP)。大多數在細胞表面發生並水解細胞外核苷酸的外部ATP酶屬於該酶家族。它們與藉由水解ATP和ADP二者來特異性水解ATP的ATP酶不同。
第一種已知的人腺三磷雙磷酸酶(外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1(基因:ENTPD1,蛋白質:NTPD酶1),也稱為分化簇39(CD39,UniProt P49961,或SEQ ID NO:1))係位於細胞表面的酶,具有面向細胞外的催化位點(extracellularly facing catalytic site)。
在已知的人CD39家族中,成員CD39L3被稱為外部-腺三磷雙磷酸酶(外部-ATPD酶),其在CD39和CD39L1(外部-ATP酶)之間具有生物化
學活性。具體地,人CD39L3已被溶解並純化以用於治療目的,例如,如在US 7247300 B1(藉由援引併入本文)中所揭露的或作為SEQ ID NO:3包括在本文中。
本揭露尤其基於如下意想不到的發現:溶解的人腺三磷雙磷酸酶(如人CD39)的某些修飾導致具有驚人活性的蛋白質,該蛋白質仍然係安全且易於製造的。
根據本發明的第一方面,提供了一種溶解的人腺三磷雙磷酸酶,其具有至少兩個修飾,該等修飾選自由以下組成的列表:N末端缺失、C末端缺失和中心修飾。
在一個實施方式中,溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含N末端缺失、C末端缺失和修飾缺失。
在一個實施方式中,中心修飾包含一個或多個胺基酸的缺失。在另一個實施方式中,中心修飾包含一個或多個胺基酸的點突變,如取代突變。在又另一個實施方式中,中心修飾係一個或多個胺基酸的缺失和一個或多個胺基酸的點突變(如取代突變)的組合。
N末端缺失可以是從根據SEQ ID NO:1的野生型CD39序列的N末端缺失的30與50個胺基酸之間,如30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個胺基酸的缺失。在較佳的實施方式中,N末端缺失係34、37、38或45個胺基酸。
C末端缺失可以是從根據SEQ ID NO:1的野生型CD39序列的C末端缺失的20與40個胺基酸之間,如20、21、22、23、24、25、26、27、28、
29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個胺基酸的缺失。在較佳的實施方式中,C末端缺失係22、29或37個胺基酸。
中心缺失可以是從根據SEQ ID NO:1的野生型CD39序列缺失的10與15個連續胺基酸之間,如10、11、12、13、14或15個胺基酸的缺失。在較佳的實施方式中,中心缺失係12個胺基酸,如與根據SEQ ID NO:1的野生型CD39序列相關的胺基酸編號193至204。
在一個實施方式中,溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含與根據SEQ ID NO:1的野生型CD39序列相關的一個、兩個、三個、四個或五個點突變,該等突變選自由以下組成之群組:K71E、N73Q、V95A、G102D、Y104S、T106S、R113M、L149M、V151A、E173D、T229A、L254M、K258R、W263R、E276D、N292Q、R304G、I319T、N327Q、A362N、F365S、N371Q、K405N、Y412F、L424Q、H436D、I437N、F439S、G441D、N457Q、P463S、和S469R。
在一個實施方式中,溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含如下序列,該序列選自由以下組成之群組:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:76、和SEQ ID NO:78。
在一個實施方式中,溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含如下序列,該序列選自由以下組成之群組:SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:141。
在一個具體的實施方式中,溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含如下序列,該序列選自由以下組成之群組:SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:229。
在一個具體的實施方式中,溶解的人腺三磷雙磷酸酶由如下序列組成,該序列選自由以下組成之群組:SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:229。
在較佳的實施方式中,溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含如下序列,該序列選自由以下組成之群組:SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:229。
在一個實施方式中,溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含SEQ ID NO:58。在一個實施方式中,溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含SEQ ID NO:72。在一個實施方式中,溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含SEQ ID NO:229。
在較佳的實施方式中,溶解的人腺三磷雙磷酸酶由如下序列組成,該序列選自由以下組成之群組:SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:229。
在一個實施方式中,溶解的人腺三磷雙磷酸酶由SEQ ID NO:58組成。在一個實施方式中,溶解的人腺三磷雙磷酸酶由SEQ ID NO:72組成。在一個實施方式中,溶解的人腺三磷雙磷酸酶由SEQ ID NO:229組成。
根據本發明的第二方面,本發明涉及包含治療有效劑量的根據本發明第一方面的腺三磷雙磷酸酶的藥物組成物,並提供了一種或多種藥學上可接受的運載體。
在一個實施方式中,藥物組成物進一步包含一種或多種另外的活性成分。
根據本發明的第三方面,提供了用作藥物的分離的根據第一方面的腺三磷雙磷酸酶。
根據本發明的第四方面,提供了用於治療組織損傷的分離的根據第一方面的腺三磷雙磷酸酶。
組織損傷可以是急性腦損傷(中風);急性多器官衰竭;腎臟或其他實體器官移植後移植物功能延遲;燒傷;輻射損傷;由於創傷和/或缺氧引起的急性損傷,如急性呼吸窘迫症候群(ARDS)或肺損傷;急性腎損傷,如繼發於胸外科手術(例如主動脈瓣置換術、冠狀動脈繞道手術)或敗血症或橫紋肌溶解症或抗生素或其他藥物的毒性作用的急性腎損傷;急性心肌損傷。
在另一個實施方式中,本揭露的第四方面涉及根據本發明第一方面的分離的腺三磷雙磷酸酶,該腺三磷雙磷酸酶用於治療心臟手術相關的急性腎損傷。
在另一個實施方式中,本揭露的第四方面涉及根據本發明第一方面的分離的腺三磷雙磷酸酶,該腺三磷雙磷酸酶用於治療移植物功能延遲(DGF)、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、急性心肌梗塞(AMI)、外傷性腦損傷(TBI)/急性缺血性中風(AIS)、缺血再灌注損傷(IRI)、或通常被稱為多器官衰竭(MOF)的其組合。
在一個實施方式中,用於治療心臟手術相關的急性腎損傷的溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含SEQ ID NO:58的胺基酸序列。
在一個實施方式中,用於治療心臟手術相關的急性腎損傷的溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含SEQ ID NO:72的胺基酸序列。在一個實施方式中,用於治療心臟手術相關的急性腎損傷的溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含SEQ ID NO:229的胺基酸序列。
在另外的較佳實施方式中,本揭露涉及根據本發明第一方面的分離的腺三磷雙磷酸酶用於治療敗血症相關的急性腎損傷之用途。
在第四方面的一個實施方式中,用於治療敗血症相關的急性腎損傷的溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含SEQ ID NO:58的胺基酸序列。
在第四方面的一個實施方式中,用於治療敗血症相關的急性腎損傷的溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含SEQ ID NO:72的胺基酸序列。
在第四方面的一個實施方式中,用於治療敗血症相關的急性腎損傷的溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含SEQ ID NO:229的胺基酸序列。
根據本發明的第五方面,提供了治療人受試者中的組織損傷之方法,該方法包括向所述受試者施用治療有效劑量的根據第一方面的溶解的人腺三磷雙磷酸酶。本發明第五方面的一個實施方式涉及治療心臟手術相關的急性腎損傷之方法,該方法包括向需要這種治療的受試者施用治療有效劑量的根據本發明第一方面的分離的腺三磷雙磷酸酶。
本發明第五方面的另一個實施方式涉及治療移植物功能延遲(DGF)、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、急性心肌梗塞(AMI)、外傷性腦損傷(TBI)/急性缺血性中風(AIS)、缺血再灌注損傷(IRI)、或通常被稱為多器官衰竭(MOF)的其組合之方法,該方法包括向需要這種治療的受試者施用治療有效劑量的根據本發明第一方面的分離的腺三磷雙磷酸酶。
在第五方面的一個實施方式中,用於治療心臟手術相關的急性腎損傷的方法中的溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:229的胺基酸序列。
本發明第五方面的一個實施方式涉及治療敗血症相關的急性腎損傷之方法,該方法包括向需要這種治療的受試者施用治療有效劑量的分離的根據本發明第一方面的腺三磷雙磷酸酶。
在第五方面的一個實施方式中,用於治療敗血症相關的急性腎損傷的方法中的溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:72或
SEQ ID NO:229的胺基酸序列。組織損傷可以是急性腦損傷(中風);急性多器官衰竭;腎臟或其他實體器官移植後移植物功能延遲;燒傷;輻射損傷;由於創傷和/或缺氧引起的急性損傷,如急性呼吸窘迫症候群(ARDS)或肺損傷;急性腎損傷,如繼發於胸外科手術(例如主動脈瓣置換術、冠狀動脈繞道手術)或敗血症或橫紋肌溶解症或抗生素或其他藥物的毒性作用的急性腎損傷;急性心肌損傷。
根據本發明的第六方面,提供了編碼根據第一方面的任何腺三磷雙磷酸酶的分離的核酸分子。
根據本發明的第七方面,提供了包含根據第六方面的一種或多種核酸序列的選殖載體或表現載體,其中該載體適用於根據第一方面的分離的腺三磷雙磷酸酶的重組產生。
根據本發明的第八方面,提供了包含根據第七方面的一種或多種選殖載體或表現載體的宿主細胞。
根據本發明的第九方面,提供了用於生產根據第一方面的腺三磷雙磷酸酶之方法,該方法包括培養根據第八方面的宿主細胞,純化和回收所述腺三磷雙磷酸酶。
[圖1]係序列比對;
[圖2A]係根據實施方式藉由抗APP西方墨點法跡進行的含有人CD39的上清液表現水平之表示;
[圖2B]係根據實施方式藉由抗APP西方墨點法跡進行的含有半胱胺酸橋缺失的人CD39變體的上清液表現水平的表示;
[圖3]係顯示CD39變體的固相ATP酶測定結果之圖;
[圖4]係顯示根據實施方式用人CD39變體轉化的HEK293細胞上的固相ATP切割之圖;
[圖5]係根據實施方式的載體之示意性概述;
[圖6]係基於穩態近似之酶模型;
[圖7]係根據實施方式的蛋白質的動力學數據和模型擬合之概述;
[圖8]係根據實施方式的蛋白質的動力學數據和模型擬合之概述;
[圖9]係根據實施方式的蛋白質的動力學數據和模型擬合之概述;
[圖10]係實驗條件之示意性圖示;
[圖11]係顯示根據實施方式的蛋白質的AMP水平之圖;以及
[圖12]係顯示根據實施方式的蛋白質的體內結果之圖。
本揭露尤其基於如下意想不到的發現:溶解的CD39的某些修飾導致具有驚人活性的蛋白質,該蛋白質係安全且易於製造的。
如以下具體實例中所示,較佳的實施方式係一種溶解的人腺三磷雙磷酸酶,其具有至少兩個修飾,該等修飾選自由以下組成的列表:N末端缺失、C末端缺失和中心缺失,如包含如下序列的溶解的人腺三磷雙磷酸酶,該序列選自由以下組成之群組:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:76、和SEQ ID NO:78。
發明人嘗試了若干種不同的序列修飾策略以獲得兼具保留活性和待表現能力的溶解的人腺三磷雙磷酸酶,同時因為免疫原性增加的風險並因此增加了安全性風險,仍未引入太多修飾。令人驚訝的是,一種被發現既增加效率又增加表現人腺三磷雙磷酸酶的能力的序列修飾係中心部分的缺失,即所謂的δMIL(△MIL)修飾,同時不添加過多的免疫原性風險。
為了增加根據本發明實施方式的溶解的人腺三磷雙磷酸酶的表現,測試了N末端表現標籤。各種N末端表現標籤係本領域已知的,但令人驚訝的是並非所有標籤都起作用。發明人發現有幾個標籤起作用,這係不可預見的。
該等N末端標籤係SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:141。如本文所示,特別較佳的標籤係SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135或SEQ ID NO:137。
具體細節在以下實例9至13中列出。然而,為了展示該等實例的不可預測的性質,表1中呈現了比較總結。
1. 定義
為了便於熟悉該項技術者實施本發明,在整個說明書中使用以下術語。
術語「CD39」和「hCD39」在整個揭露中同義使用,並且除非另有說明,否則意指根據UniProt P49961或SEQ ID NO:1的人分化簇39(CD39)。
除非另有說明,否則術語「腺三磷雙磷酸酶」係指人腺三磷雙磷酸酶。如本文所使用的,「溶解的腺三磷雙磷酸酶」意指作為野生型蛋白質存在的與細胞膜結合的腺三磷雙磷酸酶已被修飾,使得其不再與細胞膜結合而是以可溶狀態存在,即不再錨定至細胞膜上。
縮寫「MIL」係指膜相互作用環,其係與細胞膜相互作用的野生型(人)CD39蛋白質的中心部分,除了藉由細胞膜物理錨定的N末端和C末端部分。術語「δMIL(delta MIL或△MIL)」係指來自野生型(人)CD39的MIL序列的缺失。
與數值x相關的術語「約」意指例如+/-10%。當在數值範圍或數字清單前使用時,術語「約」適用於系列中的每個數字,例如,短語「約1-5」應被解釋為「約1-約5」,或例如,短語「約1、2、3、4」應被解釋為「約1、約2、約3、約4等」。
詞語「基本上」不排除「完全」,例如,「基本上不含」Y的組成物可以完全不含Y。在必要的情況下,可以從本揭露的定義中省略詞語「基本上」。
術語「包含」涵蓋「包括」以及「由...組成」,例如,「包含」X的組成物可以僅由X組成或可以包括另外的一些,例如X+Y。
關於天然多肽及其功能衍生物的「同一性」在本文中定義為:在比對序列並且引入空位(如果需要的話)以實現最大同一性百分比之後,並且不考慮任何保守取代作為序列同一性的一部分,候選序列中胺基酸殘基與相應天然多肽的殘基相同的百分比。N-末端或C-末端延伸與插入均不應解釋為降低同一性。用於比對的方法及電腦程式係熟知的。百分比同一性可藉由標準比對演算法來確定,例如Altshul等人描述的基本局部比對搜索工具(BLAST)((1990)J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌],215:403 410);Needleman等人的演算法((1970)J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌],48:444 453);或Meyers等人的演算法((1988)Comput.Appl.Biosci.[生物科學中的電腦應用],4:11 17)。一組參數可以是具有空位罰分12、空位延伸罰分4、以及移碼空位罰分5的Blosum 62評分矩陣。也可使用已經整合到ALIGN程式(版本2.0)中的E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS,4:11-17)的演算法,使用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12和空位罰分4確定兩個胺基酸或核苷酸序列之間的百分比同一性。
「一個或多個胺基酸」係指例如所有天然存在的L-α-胺基酸並且包括D-胺基酸。短語「胺基酸序列變體」係指與根據本揭露的序列相比在其胺基酸序列中具有一些差異的分子。根據本揭露的蛋白質(例如,指定序列)的胺基酸序列變體,仍然具有腺三磷雙磷酸酶活性。胺基酸序列變體包括取代性變體(去除至少一個胺基酸殘基且在根據本揭露的多肽中的相同位置插入不同胺基酸的那些變體)、插入性變體(緊鄰根據本揭露的多肽中的特定位置處的胺基酸插入一個或多個胺基酸的那些變體)以及缺失性變體(在根據本揭露的多肽中去除一個或多個胺基酸的那些變體)。
術語「治療(treatment或treat)」在本文中定義為:向受試者應用或施用根據本發明的腺三磷雙磷酸酶,或者向受試者或來自受試者的分離的組織或細胞系應用或施用包含所述腺三磷雙磷酸酶的藥物組成物,其中該受試
者具有組織損傷,與組織損傷相關的症狀,其目的是尤其是藉由降低細胞外ATP的水平來緩解、減輕或改善組織損傷或與組織損傷相關的任何症狀。
「治療」還旨在向受試者應用或施用包含腺三磷雙磷酸酶的藥物組成物,或者向來自受試者的分離的組織或細胞系應用或施用包含本發明的腺三磷雙磷酸酶的藥物組成物,其中該受試者具有組織損傷或與組織損傷相關的症狀,其目的是緩解、減輕或改善組織損傷或與組織損傷相關的任何症狀。
術語「預防(prevent/preventing)」係指預防性(prophylactic/preventative)處理;其關注的是延遲或防止與之相關的疾病、障礙和/或症狀的發作。
如本文所使用的,如果受試者將在生物學上、在醫學上或在生活品質上從治療中獲益,則這類受試者係「需要」這種治療的。
術語「藥學上可接受的」意指不干擾一種或多種活性成分的生物活性的有效性的無毒性材料。
如本文所使用的,術語「施用(administration/administering)」主題化合物意指向需要治療的受試者提供本發明的化合物及其前藥。與一或多種其他治療劑「組合」施用包括以任何順序和任何施用途徑同時(並行)施用和連續施用。
如本文所使用的,「治療有效劑量」係指腺三磷雙磷酸酶在以單劑量或多劑量向患者(如人)施用時有效地治療、預防、防止發病、治癒、延遲、降低嚴重程度、減輕障礙或復發障礙的至少一種症狀、或延長患者的存活期超出無此治療存在時所預期存活期的劑量(量)。當應用於單獨施用的單獨活性成分(例如腺三磷雙磷酸酶)時,該術語係指單獨的該成分。當應用於組合時,該術語係指產生治療作用的活性成分(無論連續還是同時組合施用)的組合劑量或量。
短語「劑量方案」意指用於治療疾病的方案,例如在組織損傷治療期間使用的給藥方案。
短語「施用裝置」用於表示向患者全身性地施用藥物的任何可用器具,包括但不限於預填充注射器、小瓶及注射器、注射筆、自動注射器、靜脈內(i.v.)滴注器和袋、泵、貼片泵等。使用該等物品,患者可自施用藥物(即自行施用藥物),或可由醫師施用藥物。
2. 實例1:無膜CD39
野生型人腺三磷雙磷酸酶CD39(hCD39,UniProt P49961或SEQ ID NO:1)藉由N-末端的跨膜結構域(推定的aa 17-37)、中心推定的膜相互作用環(MIL推定的aa 193-204)和C-末端的跨膜結構域(推定的aa 479-499)天然錨定在細胞膜中。為了能夠使用哺乳動物宿主細胞表現CD39的可溶變體,已經修飾了CD39序列的若干個元件以獲得無膜的或溶解的蛋白質。天然前導序列和N-末端跨膜區被分泌前導序列和純化標籤(SEQ ID NO:133)取代。已經改變CD39的細胞外結構域的邊界以優化表現、純化和活性參數(分別為SEQ ID NO:1的胺基酸編號38-476、SEQ ID NO:1的胺基酸編號39-469、SEQ ID NO:1的胺基酸46-461、和SEQ ID NO:1的胺基酸46-476)。藉由用丙胺酸取代半胱胺酸或藉由縮短由二硫橋(SEQ ID 107、109、111、113和115)構成的環,系統地評估半胱胺酸和二硫橋對聚集傾向和酶活性的影響。在大鼠CD39的結構工作(Zebisch等人,J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌](2012),415,288-306,野生型大鼠CD39,Uniprot P97687,列出在SEQ ID NO:2中)中描述了一段疏水性胺基酸,並且據認為,該環可能與細胞膜(MIL)相互作用。我們藉由序列比對將結果翻譯成人CD39序列,並生成具有環缺失的CD39變體(CD39△MIL或EP28,如SEQ ID NO:4中所列出的)。評估MIL的缺失(或δ/△)對功能性CD39的表現水平和熱穩定性的影響。
從圖1(顯示了SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4的序列比對)中可以看出,N末端胺基酸1至27、C末端胺基酸477至510和中心膜相互作用環(MIL)胺基酸193至204從wtCD39(SEQ ID NO:1)缺失以形成CD39△MIL(SEQ ID NO:4)。
研究了不同序列修飾對熱穩定性的影響。此外,研究了不同序列修飾對CHO細胞表現產率和單體含量的影響。
(1)方法
(a)表現質粒的生成
編碼不同hCD39邊界變體和膜相互作用環(MIL)缺失的DNA序列在GeneArt(生命技術公司(Life Technologies Inc.),雷根斯堡(Regensburg),德國)處訂購,包括針對智人的密碼子優化。藉由標準分子生物學技術將編碼hCD39變體的序列從GeneArt衍生的載體或其內部生成的變體亞選殖到適用於在哺乳動物細胞中分泌的表現載體中。存在於半胱胺酸橋缺失變體中的半胱胺酸至丙胺酸突變被經修飾的寡核苷酸靶向,並且在隨後的組裝PCR步驟後,將生成的片段亞選殖到先前提及的相同表現載體中。表現載體的元件包括啟動子(巨細胞病毒(CMV)增強子-啟動子)、促進分泌的訊號序列、多腺苷酸化訊號和轉錄終止子(牛生長激素(BGH)基因)、允許在原核生物中游離型複製和複製的元件(例如SV40起點和ColE1或本領域已知的其他元件)和允許選擇的元件(胺苄青黴素抗性基因和吉歐黴素標記)。表2中展示了截短的、溶解的人CD39版本的列表,其中胺基酸修飾參考SEQ ID NO:1進行編號。
(b)hCD39變體的微規模表現
選擇293-6E細胞(如WO 2006096989 A2中所揭露,藉由援引併入本文)用於微規模實驗,將其作為在不存在血清的情況下暫態表現蛋白質的較佳宿主細胞系之一。使用FuGene HD(羅氏應用科學部(Roche Applied Science),目錄號04709705001)作為轉染試劑進行轉染。使用V3無血清培養基(生物概念公司(Bioconcept),目錄號V3-K)在懸浮培養中培養293-6E細胞,用於轉染和繁殖細胞。細胞在Corning搖瓶(科寧公司(Corning),特克斯貝裡(Tewksbury),麻塞諸塞州)中在軌道振盪器(100-120rpm)上在5% CO2的加濕培養箱中生長(種子燒瓶)。種子培養物中的細胞應保持在指數生長期
(細胞密度在5 x 105與3 x 106/mL之間),並且展現出>90%的轉染活力。超出該範圍的細胞密度將導致稀釋後的遲滯期或降低的轉染效率。
對於微規模(0.5ml)轉染,從種子培養物中取出等分試樣的細胞,並在V3無血清培養基中調節至0.5 x 106個細胞/mL。藉由在14μl的V3無血清培養基中稀釋0.5μg的hCD39表現質粒來製備DNA溶液(稱為溶液1),然後也將2.3μl的FuGene HD溶液稀釋於14μl的V3無血清培養基中(溶液2)。將兩種溶液在室溫(RT)下孵育5-10min。此後,在溫和混合下將溶液2添加到溶液1中,並在室溫下再孵育5-15分鐘。然後將轉染混合物以0.5 x 106個細胞/mL添加到0.5ml的細胞中,接種於48孔組織培養板(科寧公司,特克斯貝裡,麻塞諸塞州)中,並將板置於在5% CO2的加濕培養箱中的軌道振盪器(300rpm)上。轉染後3天藉由在4℃下以4000rpm離心10分鐘來收穫培養物(賀利氏公司(Heraeus),Multifuge 3 S-R,賽默科技公司(Thermo Scientific),羅克福德(Rockford),伊利諾州)。將回收的細胞上清液儲存在4℃下直至進一步處理。
(c)對微規模表現上清液進行的西方墨點法跡分析
對微規模表現上清液進行西方墨點法跡分析,以檢查重組hCD39變體的表現和正確形成。將8μl的上清液稀釋在E-PAGETM載入緩衝液(4 x,英傑公司(Invitrogen),#EPBNF-01)中,並在非還原條件下載入到E-Page 48,8%凝膠上(英傑公司,#EP04808)。將凝膠在E基母裝置(E-base mother device)(英傑公司)上運行23min,並根據製造商的說明(運行7min)使用iBlot系統(英傑公司)將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜(英傑公司IB301001)。在TBS/0.05 Tween20(TBST)中洗滌3次後,將膜與5%乳/TBST在溫和攪拌下孵育1h,隨後與在2%乳/TBST中稀釋的4μg/ml的抗APP小鼠抗體(諾華公司內部抗體,針對用於蛋白質標記的澱粉樣前驅蛋白(APP)的肽段產生)溶液孵育1hr。在
另外3次洗滌步驟後,將膜與在2%乳/TBST中稀釋的抗小鼠IgG-鹼性磷酸酶(西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich),A5153-1ML)的1:1000稀釋液一起孵育,並在TBST中再次洗滌3次,隨後在TBS中進行沖洗步驟。根據製造商的說明使用SIGMAFASTTM BCIP®/NBT(西格瑪奧德里奇公司,#B5655-25TAB),將訊號顯影1-5分鐘,並藉由用水沖洗膜來停止訊號。
(d)固相AxP酶測定
使用Pi ColorLock Gold磷酸鹽檢測系統(伊諾華生物科學公司(Innova Biosciences),目錄號303-0030)在來自微規模表現上清液(固相Axp酶測定)的板捕獲的hCD39變體上確定ATP酶的、ADP酶的和AMP酶的活性。發現該方法與製造商推薦的基於溶液的測定(液相Axp酶測定)相比更不敏感,但是具有降低可能存在於微規模表現上清液中的宿主細胞酶介導的AxP酶活性的優點。將在PBS中稀釋的20μl的抗APP小鼠抗體10μg/ml溶液抗體(諾華公司內部抗體,針對用於蛋白質標記的澱粉樣前驅蛋白(APP)的肽段產生)添加到maxisorp 384孔透明板(Nunc)的每個孔中,並在4℃下孵育過夜。用TBST洗滌三次後,在室溫下在溫和攪拌下使用100μl的5%乳/TBST將孔封閉1h。在另外三個洗滌步驟後,將20μl的在2%乳/TBST中連續稀釋的微規模表現上清液一式三份添加到孔中,並在室溫下在溫和攪拌下孵育2hr。然後將孔用100μl的TBST再次洗滌四次,並用80μl的50mM Tris-Cl/5mM MgCl2 pH 7.5洗滌兩次。將在50mM Tris-Cl/5 mM MgCl2 pH 7.5(ATP:西格瑪公司(SIGMA)A2383,ADP:西格瑪公司A2754)中稀釋的30μl的80μM腺苷磷酸鹽溶液添加到每個一式三份中,並在37℃下孵育24hr。使用根據製造商的說明製備的7.5μl的金試劑混合物,將訊號顯影10分鐘,並使用3μl的穩定劑停止反應。使用TECAN Genios Pro儀器讀取620nm處的吸光度。
(2)結果
(a)邊界、膜相互作用環(MIL)缺失和半胱胺酸橋缺失對hCD39表現水平的影響
為了評估不同hCD39變體的表現水平,將相應的表現質粒在0.5ml的293-6E細胞中一式兩份轉染,並在轉染後3天收集的上清液上進行西方墨點法跡(抗APP檢測Ab)。結果在圖2A和圖2B中展示。
結果表示,與aa46相比,從aa38處起始的hCD39的表現水平更高。N末端邊界以及MIL缺失似乎對表現水平沒有重大影響。還觀察到在hCD39(aa46-461)的背景下,缺失第一或第四半胱胺酸橋的hCD39的更高表現水平。使用hCD39(aa46-461)△MIL骨架也證實了第一半胱胺酸橋缺失的更高表現水平。
(b)邊界、膜相互作用環(MIL)缺失和半胱胺酸橋缺失對hCD39活性的影響
藉由固相AxP酶測定對上述上清液樣品測量CD39酶活性。結果在圖3和圖4以及表3中展示。
MIL的缺失似乎增加了功能性表現的CD39重組蛋白的級分。不同邊界不顯示對活躍的hCD39活性的任何重大影響。結果表示所有半胱胺酸橋缺失的變體的ATP酶活性強烈降低或完全消除。使用固相ADP酶測定獲得了相似的結果。因此,令人驚訝的是,既提高效率又提高表現CD39的能力的序列修飾係δMIL(△MIL)修飾。
3. 實例2:表現標籤
為了改善候選物的表現特性,測試了不同的表現標籤。
如表4中所列出的,測試了基於IL-2(SEQ ID NO:131)的N-末端部分的不同表現標籤。根據SEQ ID NO:131,表現標籤1-16aa由Geneart合成。
如SEQ ID NO:4中所列出的,測試了與CD39△MIL相關的所有表現標籤。所有構建體都包括APP標籤和His標籤。
如圖5中所列出的,載體pRS5a用於表現。引物對如在表4中所列出的。
在所有情況下退火溫度均為64℃。
藉由混合1μl模板DNA儲備液,25μl Kapa高保真暖開機聚合酶(來自卡帕生物系統公司(kappa Biosystems)/KK2602)來製備PCR溶液。1.5μl正向引物,1.5μl反向引物,並用H
2
O將終體積調節至50μl。
根據表5中的時間表運行PCR反應。
完成PCR反應後,根據製造商的說明,使用Wizard® SV凝膠和PCR清除套組(kit)(PCR Clean-Up Kit)(普洛麥格公司(Promega),編號9282,1柱,在30μl中洗脫)進行DNA提取。
在CutSmart(R)緩衝液中用新英格蘭生物實驗室公司(New England Biolabs,NEB)提供的酶NruI-HF(NEB #R3192)和NotI-HF(NEB #R3189)切割插入物和載體。反應時間在37℃下3h。
根據生產者的有效方案,用快速DNA去磷酸化(Rapid DNA Dephosphorylation)和連接套組(Ligation Kit)(Fa.羅氏公司,編號04898117001)的去磷酸化載體進行過夜連接。
第二天,挑選單菌落用於DNA-微量製備並用正向引物P270(SEQ ID NO:165)和反向引物P271(SEQ ID NO:166)進行序列分析。
此外,根據表6,測試了本領域已知的一些增加表現的蛋白質序列。
測試的所得組合在表7中列出。
來自表6的先前技術標籤均未給出蛋白質的表現(數據未顯示)。這係意想不到的,因為先前技術教導該等序列應該增加表現。
4. 實例3:其他突變
為了改善可溶CD39的特徵並使其適用於藥物開發,在SEQ ID NO:4中列出的CD39△MIL、EP28中引入了其他修飾。不同的突變和突變的變
體見於表8中,並根據如SEQ ID NO:1中所列出的野生型CD39的胺基酸位置編號。
活性位點中的兩個突變導致更高的活性(365和412)。
5. 實例4:糖基化位點去除
基於上述EP14變體,藉由引入根據表9的點突變來檢查糖基化位點的作用,所述點突變根據如SEQ ID NO:1所列出的野生型CD39的胺基酸位置編號。
(a)材料與方法
將表現載體pRS5a(圖5)用於選殖。使用如在表10中所列出的引物。
根據製造商的說明,使用QuikChange Lightning定點誘變套組(安捷倫公司(Agilent),編號210519-5)進行PCR。
第二天,挑選單菌落用於DNA-微量製備並用正向引物P270(SEQ ID NO:165)和反向引物P271(SEQ ID NO:166)進行序列分析。
同樣地,為了確保載體骨架的正確性(由於誘變),使用以下方法將測序的插入物片段選殖到pRS5a(圖5)的新載體骨架中。
使用SEQ ID NO:36(具有表現標籤SEQ ID NO:135,含有APP_HIS-標籤,儲備液濃度3.3μg/μl)的載體骨架製備載體。
藉由混合10μg載體-DNA、0.4μl HindIII(100U/μl,NEB)、2μl EcoRI(20U/μl,NEB)、5μl Cutsmart緩衝液10x濃度(NEB)、H2O至終體積為50μl,來消化載體。將消化在37℃下運行3h。
用鹼性磷酸酶,牛小腸(CIP,NEB,編號M0290L,10U/μl)進行去磷酸化。消化後直接將3μl的CIP添加到消化的載體中,並在37℃下孵育30min。將消化的和去磷酸化的載體載入到製備型0.8% TAE瓊脂糖凝膠上,切下了約6100bp的載體的正確條帶大小。用Wizard® SV凝膠和PCR清除套組(普洛麥格公司,編號9282,1柱,在100ul中洗脫)進行清除。OD260nm顯示濃度為64ng/μl。
藉由混合42.5μl DNA(每種DNA約3-5ug)、5μl Cutsmart緩衝液(10x濃度,NEB編號B7204S)、0.4μl HindIII-HF(100U/μl,NEB編號R3104S)、2μl EcoRI-HF(20U/μl,NEB編號R3103L),並用H2O調節體積
至50μl,進行突變的插入物片段的消化。消化在37℃下在PCR儀中進行3h。將消化的插入物載入到製備型0.8% TAE瓊脂糖凝膠上,切下了約1400bp的載體的正確條帶大小。用Wizard® SV凝膠和PCR清除套組(普洛麥格公司,編號9282,1柱,在30μl中洗脫)進行清除。OD260nm顯示濃度為1-25ng/μl。
使用(載體:插入物比例約1:10),用快速DNA連接套組(編號K1423,Fa.賽默科技公司)進行連接。將4μl 5x連接緩衝液與1μl連接酶、2μl載體片段(HindIII/EcoRI消化的,儲備液濃度64ng/μl)、13μl插入物片段(HindIII/EcoRI消化的,儲備液濃度1-25ng/μl)混合。將連接在RT下運行10分鐘。
藉由將10μl的連接與80μl化學感受態XL1Blue細胞(諾華公司,FS/RL)在冰上孵育30min進行轉化。在Eppendorf培養箱中在42℃下熱休克45sec,隨後在冰上孵育2min。之後,添加1ml 2YT培養基,隨後在Eppendorf振盪器(800rpm)上在37℃下孵育1.5h。將細胞以7000rpm離心3min,並將菌落鋪板在LB/Carb/Gluc上。板,隨後在37℃下孵育過夜。
第二天,挑選單菌落用於DNA-微量製備並用正向引物P270(SEQ ID NO:165)和反向引物P271(SEQ ID NO:166)進行序列分析。
根據7天的表現,200ml規模將正確的序列轉染到HEK293細胞中。
使用了以下材料:
組成型表現SV40大T抗原的人胚腎細胞(HEK293-T)(例如ATCC11268)
聚乙烯亞胺「MAX」MW 40.000(PEI)(波利塞斯公司(Polysciences),目錄號24765),在RT下溶解於H20中,用NaOH調節至pH 7.05。
M11V3無血清培養基(生物概念公司,CH,目錄號:V3-K)
DNA:根據供應商推薦的方案,用凱傑公司(Qiagen)DNA套組,中量製備套組(Midiprep-Kit)(編號12943)製備
用於暫態轉染的所有細胞培養工作均使用在無血清M11V3培養基中生長的懸浮適應的HEK293-T細胞進行。
細胞在Corning搖瓶(科寧公司,美國)中在軌道振盪器(115rpm)上在具有5% CO2的加濕CO2培養箱中生長(種子燒瓶)。
使用的細胞已處於指數生長期(細胞密度在5 x 105和3 x 106/ml之間)並且具有>90%的活力。
使用已計數,並且已用M11V3培養基調節至1.4x106個細胞/ml的相應細胞量的細胞,以小規模(此處為20/50ml或100ml)進行轉染。使用終轉染體積的36%細胞懸浮液。
藉由在7%終體積M11V3中稀釋1mg/L終體積DNA並溫和混合來製備DNA溶液(溶液1)。為了防止由於未經過無菌過濾的DNA導致的培養物污染,在進料後已將Penc./Strep添加到轉染中。然後,將3mg/L終體積PEI溶液在7%終體積M11V3中稀釋並溫和混合(溶液2)。將兩種溶液在室溫(RT)下孵育5-10min。此後,在溫和混合下將溶液2添加到溶液1中,並在RT下再孵育5-15分鐘。孵育後,將轉染混合物添加到細胞中,並將培養物培養四小時(115rpm,37℃,5% CO2)。
表現7天後收穫上清液。
離心4500rpm,15min,4℃(賀利氏公司,Multifuge 3 S-R)
通過無菌過濾器(0.22μm,Stericup過濾器,賽默科技公司,目錄號567-0020)澄清
將上清液遞送至純化用於進一步的步驟。將1ml的上清液樣品用於在開放存取APP柱(Open Access APP-column)上的IPC。
樣品小瓶係玻璃鉗口瓶(2ml,安捷倫公司,目錄號5182-0543)和帽(鉗口11mm,目錄號5040-4667)。
根據以下方案,使用5ml Histrap HP柱(GE生命科學公司集團(GE Life Sciences),訂購號17-5248-02),在Aekta Pure或Aekta Avant(GE醫療集團(GE Healthcare))上使用固定化金屬親和層析(IMAC)純化蛋白質。說明在表11中列出。
使用的緩衝液根據表12和表13組成。
根據表14,儲存所得蛋白質。
(b)結果和解釋
關於分析SEC的產率和單體峰,突變體沒有改善。具有根據SEQ ID NO:137的表現標籤的親本蛋白(EP14)在分析中給出最佳產率和最高單體峰。用突變體N371Q實現最低產率以及最差單體峰。
6. 實例5:組合
為了嘗試和進一步改善特性,根據下表15組合了上述實例3中引入的一些突變。根據如SEQ ID NO:1中所列出的野生型CD39的胺基酸位置對突變進行編號。
(a)材料與方法
使用根據表16的引物。
使用以下移液方案建立PCR反應:
5μl的10x反應緩衝液、
1μl ds-DNA-模板(儲備液濃度100ng/μl)、
1.5μl引物1、
1.5μl引物2、
1μl dNTP混合物
1.5μl QuickSolution公司(QuickSolution)試劑、
35.5μl H2O(終體積為50μl)、和
1μl QuickChange Lightning Enzyme。
使用根據表17的PCR循環參數。
反應後直接將2μl DpnI酶添加到每個反應中,混合並在37℃下孵育5min。
如下進行到XL10-金超-感受態細胞的轉化。將細胞在冰上解凍。使用45μl/轉化,並將2μl B-ME添加到每個小瓶中。然後,添加3μl DpnI消化的PCR產物,並在冰上在15ml BD管中孵育30min。此後,將樣品熱休克40秒並在冰上孵育2min。接下來,添加950μl SOC培養基,隨後在37℃下在振盪培養箱中孵育1.5h。最後,將細胞鋪板在LB-carb-板上並在37℃下孵育過夜。第二天,挑選單菌落用於DNA-微量製備和序列分析。
如實例4中所述,將正確的序列轉染到HEK293細胞中。
根據以下使用固定化金屬親和層析(IMAC)純化蛋白質。使用95ml上清液(保留全部的約4ml用於分析(IPC))。
使用的材料:
鎳-NTA瓊脂糖(凱傑公司,目錄號/ID:30230)、Poly-Prep層析柱(空,伯樂公司(BioRad),編號731-1550)、IMAC A緩衝液pH 7.4(含有20mM NaPO4緩衝液和50mM咪唑)。IMAC B緩衝液pH 7.4(含有20mM NaPO4緩衝液和300mM咪唑)。TBS(10x濃度,用MilliQ水稀釋至1x濃度)。Amicon Ultra-4離心過濾單元,具有Ultracel-10膜,10K,UFC 801096。
方法步驟:
1.用1ml凱傑公司(=0.5ml CV)的鎳-NTA-瓊脂糖製備柱;
2.用10CV IMAC A平衡;
3.在柱上載入15/45ml SN(收集流過物);
4.用10CV IMAC A洗滌(收集在15ml Falcon管中);
5.在6.5CV的IMAC B中洗脫;
6.洗脫液濃度的確定;
7.用Amicon Ultra-4離心過濾單元10K將3.5ml樣品濃縮至約400μl;
8.藉由添加TBS和離心5000進行緩衝液交換;
使用具有40μl每種樣品的分析SEC並使用具有12μl每種樣品的蛋白質凝膠分析樣品。
儲存所得蛋白質。
(b)結果和解釋
結果顯示在表18中。
蛋白酶位點:
插入蛋白裂解酶時,沒有產率/產率非常低。具有弗林蛋白酶位點時,有約40%的產率(但對於轉染,同樣僅使用了50%的DNA,因為它係與弗林蛋白酶質粒的共轉染)。
IL2-截短:
包括aa1-3的所有截短都給出了可比較的結果,aa1-3與其他相比可能僅會略更低,但這可能是樣品之間的差異。截短aa4-12導致無蛋白質表現。與所有其他EP變體一樣,在含有IL2-起始和hCD39-蛋白之間的TSS接頭的EP28之間沒有發現差異。
組合:
與EP19(L424Q)的組合不會導致蛋白質表現的顯著改善。
與EP1(R113M)組合在分析SEC中展現出更低的聚集。NEG726表現良好,但顯示所有測試的最差聚集(約37%)。EP14xEP17的組合不會導致任何進一步的改善(F365S+Y412F)。
7. 實例6:最終候選物的選殖
表現了如下表19中所列出的臨床候選物的選擇用於進一步測試。
使用以下引物:
使用以下移液方案建立PCR反應:
0.25μl DMSO、
20ng載體
1.5μl插入物(45ng/μl)、
2μl 5 x HF緩衝液、
0.1μl Phusion pol、
0.08μl dNTP混合物
10-X μl ddH2O
使用根據表17的PCR循環參數。
反應後直接將0.5μl DpnI酶添加到每個反應中,混合並在37℃下孵育2h。
如下進行到XL10-金超-感受態細胞的轉化。將細胞在冰上解凍。使用45μl/轉化,並將2μl B-ME添加到每個小瓶中。然後,添加3μl DpnI消化的PCR產物,並在冰上在15ml BD管中孵育30min。此後,將樣品熱休克40秒並在冰上孵育2min。接下來,添加950μl SOC培養基,隨後在37℃下在振盪培養箱中孵育1.5h。最後,將細胞鋪板在LB-carb-板上並在37℃下孵育過夜。第二天,挑選單菌落用於DNA-微量製備和序列分析。
將所有構建體亞選殖到新的載體背景中以確保序列係正確的。為此,用PCR擴增所有構建體,插入G4S-接頭,隨後用HindIII/EcoRI消化。
儲存所得蛋白質。
8. 實例7:比較蛋白的生成
(1)無效突變
為了生成用於體內研究的陰性對照蛋白,將一個/兩個突變插入到親本人CD39△MIL蛋白(EP28)中。已經在文獻中描述了該等突變以去除或降低該蛋白質的酶活性。突變位置係E174A和S218A。
使用以下引物:
使用以下移液方案建立PCR反應:
5μl的10x反應緩衝液、
1μl ds-DNA-模板(儲備液濃度100ng/μl)、
1.5μl引物1、
1.5μl引物2、
1μl dNTP混合物
1.5μl QuickSolution公司(QuickSolution)試劑、
35.5μl H2O(終體積為50μl)、和
1μl QuickChange Lightning Enzyme。
使用根據表17的PCR循環參數。
反應後直接將2μl DpnI酶添加到每個反應中,混合並在37℃下孵育5min。
如下進行到XL10-金超-感受態細胞的轉化。將細胞在冰上解凍。使用45μl/轉化,並將2μl B-ME添加到每個小瓶中。然後,添加3μl DpnI消化的PCR產物,並在冰上在15ml BD管中孵育30min。此後,將樣品熱休克40秒並在冰上孵育2min。接下來,添加950μl SOC培養基,隨後在37℃下在振盪培養箱中孵育1.5h。最後,將細胞鋪板在LB-carb-板上並在37℃下孵育過夜。第二天,挑選單菌落用於DNA-微量製備和序列分析。
根據以下方案,將正確的序列轉染到HEK293細胞中。
使用10μg載體-DNA、0.4μl HindIII(100U/μl,NEB)、2μl EcoRI(20U/μl,NEB)、5μl Cutsmart緩衝液10x濃度(NEB)和H2O來製備消化緩衝液至終體積為50μl。將消化反應在37℃下運行3h。
消化後立即運行去磷酸化反應。將牛小腸鹼性磷酸酶(10U/μl,CIP,NEB,編號M0290L)添加到(3μl)消化的載體混合物中並在37℃下孵育30min。
將消化的和去磷酸化的載體亞選殖以檢查序列。
根據以下方案,將正確的序列轉染到HEK293細胞中。
使用以下材料進行7天的表現;1.組成型表現SV40大T抗原的人胚腎細胞(HEK293-T,ATCC11268);2.聚乙烯亞胺「MAX」MW 40.000(PEI)(波利塞斯公司,目錄號24765)。
藉由在室溫(RT)下將1g PEI小心地溶解在900ml細胞培養級水中來製備PEI溶液。然後用NaOH中和,最終pH為7.05。最後,將體積調節至1L並將溶液通過0.22μm過濾器過濾,以等分試樣分佈並在-80℃下冷凍直至進一步使用。解凍後,等分試樣可在-20℃下重新冷凍3次,但不應在-20℃下長期保存。
M11V3無血清培養基(生物概念公司,CH,目錄號:V3-K)。
用於暫態轉染的所有細胞培養工作均使用在無血清M11V3培養基中生長的懸浮適應的HEK293-T細胞進行。
對於小規模(<5L)轉染,細胞在Coming搖瓶(科寧公司,美國)中在軌道振盪器(100rpm)上在具有5% CO2的加濕CO2培養箱中生長(種子燒瓶)。
通常,種子培養物中的細胞應處於指數生長期(細胞密度在5 x 105與3 x 106/ml之間),並且具有>90%的活力。超出該範圍的細胞密度將導致分裂後的遲滯期或降低的轉染功效。
對於小規模(此處為2L)轉染,從種子培養物中取出等分試樣的細胞,並將該等細胞用M11V3培養基在36%的終體積中調節至1.4 x 106個細胞/ml。
藉由在7%終體積M11V3中稀釋1mg/L終體積DNA並溫和混合來製備DNA溶液(溶液1)。為了預防培養物污染,可以使用0.22μm過濾器(例如Millipore Stericup)過濾該溶液。此處因為體積小,所以尚未進行無菌過濾。然後,將3mg/L終體積PEI溶液在7%終體積M11V3中稀釋並溫和混合(溶液2)。將兩種溶液在室溫(RT)下孵育5-10min。此後,在溫和混合下將溶液2添加到溶液1中,並在RT下再孵育5-15分鐘(在孵育期間不要再混合,因為PEI將DNA覆蓋/濃縮成帶正電荷的顆粒,該等顆粒與陰離子細胞表面殘留物結合並藉由胞吞作用進入細胞)。孵育後,將轉染混合物添加到細胞中,並將培養物培養四小時(10rpm,37℃,6% CO2)。
最後,根據以下實例用剩餘的50%終體積M11V3培養基進料培養物:接種體積:36ml,其中1.4 x 106個細胞/ml。
溶液1:含有100μg質粒DNA的7ml M11V3培養基。溶液2:含有300μg PEI(300μl)的7ml M11V3培養基
進料:50ml M11V3,總共100ml。
根據以下使用固定化金屬親和層析(IMAC)純化蛋白質。使用95ml上清液(保留全部的約4ml用於分析(IPC))。
使用的材料:
鎳-NTA瓊脂糖(凱傑公司,目錄號/ID:30230)、Poly-Prep層析柱(空,伯樂公司(BioRad),編號731-1550)、IMAC A緩衝液pH 7.4(含有20mM NaPO4緩衝液和50mM咪唑)。IMAC B緩衝液pH 7.4(含有20mM NaPO4緩衝液和300mM咪唑)。TBS(10x濃度,用MilliQ水稀釋至1x濃度)。Amicon Ultra-4離心過濾單元,具有Ultracel-10膜,10K,UFC 801096。
方法步驟:
1.用1ml凱傑公司(=0.5ml CV)的鎳-NTA-瓊脂糖製備柱;
2.用10CV IMAC A平衡;
3.在柱上載入15/45ml SN(收集流過物);
4.用10CV IMAC A洗滌(收集在15ml Falcon管中);
5.在6.5CV的IMAC B中洗脫;
6.洗脫液濃度的確定;
7.用Amicon Ultra-4離心過濾單元10K將3.5ml樣品濃縮至約400μl;
8.藉由添加TBS和離心5000進行緩衝液交換;
使用具有40μl每種樣品的分析SEC並使用具有12μl每種樣品的蛋白質凝膠分析樣品。
儲存所得蛋白質。
(2)plusMIL
用重疊延伸PCR進行具有膜相互作用環(aa193-204)的EP14aa1-3的選殖。
使用以下引物:
使用以下移液方案建立PCR反應:
1.2μl Phusion暖開機聚合酶、
24μl 5x HF-緩衝液、
0.96μl 100mM dNTPs(每種dNTP的25mM)、
0.6μl Fw引物、
0.6μl Rev引物、
92.64μl DEPC H2O。
使用根據表17的PCR循環參數。
反應後直接將2μl DpnI酶添加到每個反應中,混合並在37℃下孵育2h。
藉由將2μl PCR產物轉移到96孔PCR板並在冰上冷卻,來進行轉化。添加20μl STELLAR化學組分細菌,並藉由上下移液一次小心地混合。將樣品在冰上孵育30min,然後在42℃下在PCR儀中孵育45sec,隨後在冰上再孵育60sec。最後,添加90μl SOC培養基並在37℃下孵育1hr。將整個轉染混合物鋪板在LB-胺苄青黴素或LB-羧苄青黴素板上,並在37℃下生長過夜。
儲存所得蛋白質EP14_plusMIL,該蛋白質具有根據SEQ ID NO:155的胺基酸序列。
9. 實例8:酶活性
使用酶活性測定表徵在先前實例中生成的候選物。
使用以下試劑:Pi游離緩衝液,無磷酸鹽的生理鹽水溶液(140mM NaCl,5mM KCl,1mM MgCl2,2mM CaCl2,10mM Hepes,pH 7.4);和Pi游離緩衝液+2%BSA,具有20mg/ml BSA的無磷酸鹽的生理鹽水溶液;CD39蛋白(根據SEQ ID NO:1);ATP。
以2μg/ml製備重複的CD39溶液。從15μl ATP儲備液+1185μl緩衝液(總共1.2ml)中以1000μM製備重複的ATP溶液。
藉由將60μl ATP與60μl CD39或60μl含Pi游離緩衝液混合用於對照,在填充有120μl終/孔的48孔PCR板中研究酶反應。終濃度為500μMATP和1μg/ml CD39。
將樣品在37℃下分別孵育0、5、15、30、60、90和150分鐘。然後,藉由Pi釋放測定或HPLC評估樣品。
(1)Pi釋放測定
(a)材料與方法
根據製造商的說明,從標準Pi檢測套組製備試劑。
藉由在水中的稀釋製備具有Pi的標準曲線。製備1:2系列稀釋的Pi儲備液(100μM):450μl+450μl水。標準曲線濃度為:50μM/25μM/12.5μM/6.25μM/3.1μM/1.5μM/0μM。
製備金試劑混合物:4ml金試劑+40μl加速劑(用於3個板)。在96孔板中,將樣品在H2O中1:10稀釋(在水中稀釋:10μl樣品+90μl H2O)。將50μl,1:10稀釋的樣品分佈在96個半區域孔板(科寧公司,3690)的每個孔中。將12.5μl金試劑混合物添加到每個孔中(25%樣品體積),並將樣品在室溫下孵育10min。在635nm處讀取吸光度。
(b)結果和解釋
候選物的比較結果顯示在表26中。
藉由將500μM ATP添加到酶中並用HPLC(方法描述如下)隨時間分析ATP、ADP、AMP的濃度來測量酶活性。所得的動力學曲線擬合圖6中的模型以獲得酶常數。就酶常數Kcat而言,該等酶顯示以下順序(低活性至高活性):EP28(wt)、EP17、EP14、EP15。
圖7顯示了EP28的動力學數據和模型擬合。圖8顯示了EP14的動力學數據和模型擬合。圖9顯示了EP15的動力學數據和模型擬合。
EP28(wt)、EP14、EP15和EP17的酶常數概述顯示在表27中。與野生型(WT)相比,三種新型變體顯示出增加的催化活性。重要的是,該等新變體顯示出催化速率常數(kcat)、催化效率(kcat/Km)的明顯增加。由於在組織損傷和血栓形成期間報告的ATP和ADP底物濃度高於報告的Km,所以kcat和kcat/Km的這種增加可能轉化為更高的體內活性。
(2)HPLC驗證測定(動力學和劑量響應)
(a)材料與方法
用HPLC驗證測定測試候選物。將70μl的每種樣品轉移到用於HPLC的玻璃小瓶中。
如表28所示,用5mM的儲備溶液製備校準樣品。
1000μM將20μL的每種儲備溶液在HPLC小瓶中混合
500μM 20μL 1mM+20μL H2O
100μM 10μL 1mM+90μL H2O
10μM 10μL 100μM+90μL H2O
1μM 10μL 10μM+90μL H2O
使用具有毛細管泵(CapPump)(G1376A)、脫氣器(G1379A)、ALS(G1329A)、恒溫器(G1330B)、ColComp(G1316A)和DAD(G1315A)的安捷倫公司1100系統進行HPLC分離。溶劑A:10mM KH2PO4(04243,Riedel-de Haën)+2mM TBA溴化物,pH 7.0(86857-10G-F,佛魯卡公司(Fluka))和溶劑B:10mM KH2PO4/ACN 1/1+2mM TBA溴化物,pH 5.5。柱:Nucleodur 300-5 C18 ec,2 x 150mm,5μm,Macherey-Nagel公司(Macherey-Nagel)760185.20批次E14100258 36654055。柱溫為40℃,注射體積為10μL,流速為0.3ml/min,以及梯度為0-3':0% B;3-23':0-95% B,線性;23-28':95% B,線性;28-29':95-0% B,線性;5'後時間"。DAD:247nm和259nm。
使用Waters UPLC I class類進行UPLC分離。溶劑A:10mM KH2PO4/10mM K2HPO4 1/1+2mM TBA溴化物,pH 7.0。溶劑B:10mM KH2PO4/ACN 1/1+2mM TBA溴化物,pH 5.5。柱:福蒂斯生物公司(Fortis Bio)C18,2.1 x 50mm,5μm,di2chrom BIO318-020301 SN H03161210-2。柱溫為40℃,注射體積為10μL,流速為0.5ml/min,以及梯度為0-1':0% B;1-8':0-55% B,線性;8-10':55% B;10-11':55-0% B,線性;14'停止時間。DAD係247nm和259nm。
(b)結果
結果可以見於圖7、8、9和11中,顯示了根據不同實施方式的候選物的動力學數據和模型擬合。
10. 實例9:體外活性,初始篩選
將先前實例中描述的CD39版本EP1至EP24選殖到哺乳動物表現載體pRS5a_前導序列_APP_His(圖5)中,不含IL2-前導序列且不含IL2-起始。
(a)材料與方法
在HEK293(PEI-轉染)中進行7天EP-Hits的小規模表現(20/50ml規模),隨後在APP-HPLC上進行IPC(如上所述)。
用Ni-NTA柱(0.5ml CV)對15/45ml細胞上清液進行蛋白質純化;
用6CV IMAC B緩衝液(20mM NaPO4-緩衝液,300mM咪唑,pH 7.4)洗脫;
在TBS,pH 7.4中濃縮和再緩衝純化的蛋白;
用蛋白質凝膠、分析SEC對蛋白質進行分析;
所有變體和三個對照(親本hCD39-dMIL,或含有和不含IL2-起始的EP28,以及不含IL2-起始的8M-版本)的遞送:在TBS,pH 7.4中90-200ul的純化的蛋白
(b)結果和解釋
結果總結在下表29中。
所有樣品均在TBS pH 7.4中並且具有APP-(SEQ ID N:247)和His-標籤(SEQ ID NO:249)。
僅親本人CD39△MIL(EP28)具有15個胺基酸長的IL2-起始,aa1-15(SEQ ID NO:133)。
Pi釋放測定BOENKTH1-0252824,雙重檢測。持續60min和180min。值
11. 實例10:體外活性,精緻篩選
第二次測試了12個突變體的子集,但含有IL-2起始允許更大的表現規模。
(a)材料與方法
哺乳動物表現載體pRS5a_前導序列_APP_His,具有15個胺基酸長的IL2-起始,aa1-15(SEQ ID NO:133)(圖5)。在HEK293(PEI-轉染)中持續7天的EP-Hits的小規模表現(50/100ml規模),隨後在APP-HPLC上進行IPC(如上所述)。
用Ni-NTA柱(0.5ml CV)對45/95ml細胞上清液進行蛋白質純化
用6CV IMAC B緩衝液(20mM NaPO4-緩衝液,300mM咪唑,pH 7.4)洗脫;
在TBS,pH 7.4中濃縮和再緩衝純化的蛋白,
用蛋白質凝膠、分析SEC對蛋白質進行分析;
所有變體和對照(親本hCD39-dMIL、或EP28(含有IL2-起始aa1-15(SEQ ID NO:133))的遞送:
在TBS,pH 7.4中500ul的純化的蛋白
(b)結果和解釋
結果總結在下表30、表31和表32中。
12. 實例11:體內活性,pK
(a)材料與方法
對於體內PK,經由尾靜脈向4隻清醒的雌性C57BL/6小鼠靜脈內(1ml/kg)施用PBS緩衝液中終濃度為10mg/ml的10mg/kg化合物。小鼠獲自WIGA獲得並且體重約22g。所有生命工作都是根據瑞士動物福利法(Swiss animal welfare law)進行的。
使用POCT Minivettes,在小體積血清管中在給藥後0.25、3、8、24和48h收集全血(每個時間點50μL)。分離血清並用於濃度確定。
Gyrolab技術係使用親和流通物形式的奈米級自動化免疫測定,其藉由離心力和雷射誘導的螢光檢測起作用。將鏈黴親和素包被的珠預包裝在Gyrolab Bioaffy CD上的親和柱中。每個CD含有112個柱。每個微結構的親和捕獲柱包含15nl。注射的樣品藉由毛細作用進入。生物素化的捕獲試劑與鏈黴親和素包被的珠結合。然後,注射分析物溶液,其與捕獲的分子結合。最後,應用螢光團標記的檢測試劑。在CD39的情況下,取決於APP標籤的可用性,使用兩種不同的測定讀數。
1)抗-CD39(40035)和抗-APP(27431)見於圖10A中。
2)Fab(40035)和抗-Fc/抗-CD39(40044)1:1預混合物(所有EP28aa1-16構建體)見於圖10B中。當藉由胺偶聯被生物素化時,抗體40044喪失活性,因此,僅抗體40035被生物素化。
將CD39構建體的所有標準曲線在含有5%(v/v)小鼠血清的Rexxip A中以1:2的稀釋系列稀釋。APP標記構建體的應用濃度範圍為5000ng/ml-9.77ng/ml,並且EP28aa1-16的應用濃度範圍為10000ng/ml-9.77ng/ml。將所有小鼠血清樣品在含有5%(v/v)小鼠血清的Rexxip A中以1:100稀釋。將CD39構建體的QC樣品在含有5%(v/v)小鼠血清的Rexxip A中稀釋(對於具有APP標籤的構建體為50和500ng/ml,對於EP28aa1-16為500和1000ng/ml)。所有生物素化的捕獲試劑的終濃度為0.1mg/ml,並且將螢光標記的檢測抗體在Rexxip F中稀釋至10nM。
(b)結果和解釋
結果總結在表33中。可以看出,所有候選物都顯示出相同的PK。因此,候選物的選擇不是基於PK特性。
13. 實例12:體內活性,AKI模型
(a)材料與方法
在I/R設置開始之前進行右腎的腎切除術。去除第二腎以避免改變生物學的整個動態的補償機制。將自主呼吸麻醉的動物置於恒溫監測系統的恒溫毯上並用無菌紗布覆蓋。藉由直腸探針記錄體溫並控制在36.5℃-37.5℃的範圍內以避免體溫過低。對動物進行麻醉、剃毛和消毒(Betaseptic)。在中線切開/剖腹術之後,將腹部內容物縮回到左側並去除右側腎。將輸尿管和血管斷開並結紮(9-0愛惜康公司(Ethicon)),然後去除腎臟。
I/R損傷誘導:在右腎的腎切除術後立即將腹部內容物縮回到右側,並且解剖左腎動脈游離用於腎缺血誘導。
微動脈瘤夾用於夾持腎蒂以阻斷血液流向腎臟並誘導腎缺血。腎缺血的持續時間從夾持的時間開始。藉由幾秒鐘內腎臟從紅色到深紫色的顏色變化證實了成功缺血。缺血後,去除微動脈瘤夾並藉由腎臟顏色變為紅色來表明再灌注。
(b)結果和解釋
結果見於圖12中。候選物顯示出體內劑量響應,這與它們具體的體外活性相關。圖12A顯示了親本EP28的結果,圖12B顯示了EP1xEP17的結果,圖12C顯示了EP14的結果。可以看出,EP28和EP1xEP17顯示了相似的劑量響應,而具有較高體外活性的EP14在更低劑量下顯示出完全功效。
14. 實例13:滴度、產率和可展性
為了以商業規模製造選擇的候選物,重要的是能夠以相對高的產率表現它們。治療蛋白與治療抗體相比可能不是那麼簡單,因為除了缺乏能夠選擇高產殖株的富集技術之外還存在形式複雜性。
EP14aa1-3和EP28aa1-3這兩種候選物具有可比較的技術特徵,這係具有挑戰性的。特別地,早期表現批次(數據未顯示)的低表現滴度影響
生產成本,或者由於對宿主細胞蛋白質的控制不穩健,甚至可能在擴大規模後甚至更低。
為了藉由兩種候選物的早期殖株選擇來嘗試改善蛋白質表現,需要定製的純化製程。為此,生成表現候選物EP28aa1-3和EP14aa1-3的細胞庫。
將親本CHO細胞系用作宿主細胞系,用於產生表現EP28aa1-16/EP14aa1-3的細胞系。宿主細胞系衍生自熟悉該項技術者熟知的CHO-K1細胞系,其方式描述於例如專利申請WO 2015092737和WO 2015092735中,將兩者藉由援引以其全文併入本文。來自CHO系的單個小瓶用於製備EP28aa1-16/EP14aa1-3重組細胞系。
細胞在化學成分確定的培養基中生長。每次轉染添加一μg的SwaI線性化的質粒DNA、編碼EP28aa1-16/EP14aa1-3的表現載體。轉染反應在化學成分確定的培養基中進行。
根據製造商的說明,使用AMAXA Gene Pulser藉由電穿孔進行轉染。用於轉染的親本CHO細胞處於指數生長期,具有高於95%的細胞活力。總計,用5 x 106個細胞/轉染進行三次轉染。轉染後立即將細胞轉移到含有中等大小的化學成分確定的培養基的搖瓶中。
在開始選擇過程之前,將細胞庫在36.5℃和10% CO2下孵育48小時。使用在表現載體中編碼的選擇標記進行選擇程序。在低葉酸條件下轉染和生長48小時後,藉由向化學成分確定的培養基中添加10nM MTX來施加另外的選擇壓力。在MTX選擇開始後21天,出現了主要由MTX抗性細胞組成的庫群。庫回收後冷凍細胞。在化學成分確定的培養基中設置標準進料批次用於確定EP28aa1-16/EP14aa1-3的濃度。反相層析(RPC)用於確定產物濃度。將產生EP28aa1-16/EP14aa1-3的CHO細胞庫用於FACS單細胞分選/細胞印製程序以獲得個性化的選殖細胞系。
15. 實例14:治療用途
激活P2X7R的細胞外ATP已明確地與若干種疾病相關聯,如增強移植物抗宿主病(Wilhelm等人,Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R.[激活P2X7R的細胞外ATP增強移植物抗宿主病],Nature Medicine[自然醫學]16:12,第1434-1439頁,(2010))。
此外,體外和體內研究均表示CD39藉由調節ADP的水平代表心血管健康中重要的腺三磷雙磷酸酶。已知腺三磷雙磷酸酶藉由代謝細胞外ADP來抑制血小板聚集。
與其他療法(像氯吡格雷(PlavixTM))相反,人腺三磷雙磷酸酶不與血小板共價結合,其不可逆地與血小板上的ADP受體結合。這允許治療阻斷的更快消失,並因此允許對於血小板活化過度的患者更安全的方法。這為血小板活化過度的患者提供了更安全的方法。
因此,對於降低細胞外ATP水平的化合物(如,根據本發明的化合物)的治療用途存在明確的基礎。
根據本發明的化合物的治療用途的具體非限制性實例係由於創傷和/或缺氧引起的急性器官損傷,如急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、肺損傷、腎功能衰竭、急性腎損傷(AKI)(包括冠狀動脈旁路移植手術後的急性腎損傷)、腎臟或其他實體器官移植(包括異種器官移植)後的移植物功能延遲,或血管疾病(如閉塞性血管疾病),移植和異種器官移植,治療患有由以下引起的中風、冠狀動脈疾病或損傷的個體:心肌梗塞、動脈粥樣硬化、動脈硬化、栓塞、子癇前期、血管成形術、血管損傷、移植、新生兒缺氧缺血性腦病,血小板相關的缺血性疾病(包括肺缺血、冠狀動脈缺血和腦缺血),缺血再灌注損傷(IRI)血栓性疾病(包括冠狀動脈血栓形成、腦動脈血栓形成、心內血栓形成、外周動脈血栓形成、以及靜脈血栓形成),腎臟或其他實體器官移植(包括異種器
官移植)後的移植物功能延遲。根據本發明的化合物的治療用途的其他非限制性實例係治療燒傷或輻射損傷、敗血症,改善傷口癒合,減少出血或出血風險,預防器官損傷、移植物抗宿主病或預防移植排斥。
特別地,根據本發明的化合物的較佳治療用途係急性腎損傷(AKI),如冠狀動脈旁路移植手術或敗血症或橫紋肌溶解術後的急性腎損傷。這種情況增加患者的死亡率,並且沒有標準護理(SoC)。重症監護病房中AKI的主要原因係:敗血症(47.5%)、大手術(34%)、心源性休克(27%)、血容量不足(26%)和腎毒性化合物(19%)。此外,AKI係發展為慢性腎病(CKD)的獨立強風險因素。20-30%的主要心臟手術患者獲得急性腎損傷。另一個較佳實施方式涉及分離的根據本發明的腺三磷雙磷酸酶用於治療心臟手術相關的急性腎損傷的用途。
在另一個實施方式中,本揭露涉及分離的根據本發明的腺三磷雙磷酸酶,該腺三磷雙磷酸酶用於治療移植物功能延遲(DGF)、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、急性心肌梗塞(AMI)、外傷性腦損傷(TBI)/急性缺血性中風(AIS)、或通常被稱為多器官衰竭(MOF)的其組合。
16.急性腎損傷(AKI)係敗血症的常見併發症。28%的敗血症患者獲得AKI。在另外的較佳實施方式中,本揭露涉及根據本發明的分離的腺三磷雙磷酸酶用於治療敗血症相關的急性腎損傷的用途。實例15:治療組成物
治療蛋白通常被配製成水性形式以備施用或者配製成凍乾物以在施用前與適合的稀釋劑重構。蛋白質可以被配製成凍乾物,或配製成水性組成物,例如在預填充注射器中。
適合的製劑可以提供水性藥物組成物或凍乾物,該凍乾物可以重構以給出具有高濃度的治療蛋白活性成分和低水平的蛋白質聚集的溶液用於遞送至患者。高濃度的蛋白質之所以有用,係因為高濃度降低了必須被遞送給患
者的材料量(劑量)。降低的給藥體積使得向患者遞送固定劑量所花費的時間降至最低。具有高濃度蛋白質的本發明的水性組成物特別適合皮下施用。
因此,本發明提供了適用於在受試者中施用(例如用於皮下施用)的水性藥物組成物,該水性藥物組成物包含治療蛋白。
當與藥學上可接受的運載體組合時,治療蛋白可以用作藥物組成物。除治療蛋白外,這種組成物可含有運載體、各種稀釋劑、填料、鹽、緩衝液、穩定劑,增溶劑和本領域熟知的其它材料。運載體的特徵將取決於施用途徑。在所揭露的方法中使用的藥物組成物還可以含有用於治療特定靶向障礙的另外的治療劑。
17. 實例16:施用途徑
通常,例如藉由靜脈內、腹膜內或皮下注射來施用根據本發明的蛋白質。完成此施用的方法係熟悉該項技術者已知的。還可能獲得可以局部或口服施用的組成物,或者能夠透過黏膜傳遞的組成物。如熟悉該項技術者所理解的,可以使用任何適合的施用方式,如適合於特定的所選施用途徑。
可能的施用途徑的實例包括腸胃外(例如,靜脈內(I.V.或IV)、肌內(IM)、真皮內、皮下(S.C.或SC)、或輸注)、口服和肺(例如吸入)、經鼻、經皮(局部)、經黏膜、動脈內、持續輸注、以及直腸施用。被用於胃腸外、真皮內、或皮下應用的溶液或懸浮液可以包括以下組分:無菌稀釋劑,如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑;抗細菌劑,如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯;抗氧化劑,如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉;螯合劑,如乙二胺四乙酸;緩衝液如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽;並且用於調節滲透壓的試劑如氯化鈉或葡萄糖。可以用酸或鹼(例如鹽酸或氫氧化鈉)調節pH。腸胃外製劑可以被封裝在由玻璃或塑膠製成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。
可以藉由向需要療法的受試者施用根據本發明的蛋白質的「負荷劑量」來啟動腺三磷雙磷酸酶療法。「負荷劑量」旨在施用於受試者的根據本發明的蛋白質的初始劑量,其中施用的根據本發明的蛋白質的劑量落入更高給藥範圍內。「負荷劑量」可以單次施用,例如,單次輸注,其中IV施用蛋白質,或多次施用,例如,多次輸注,其中IV施用蛋白質,只要在約24小時的時間段內(或基於疾病的嚴重程度,如果需要多次靜脈內施用的話,則在第一個月內)施用完整的「負荷劑量」。施用「負荷劑量」後,再向受試者施用一個或多個另外的治療有效劑量的根據本發明的蛋白質。可以例如根據每週給藥方案、或者每兩週一次、每三週一次或每四週一次施用後續治療有效劑量。在這類實施方式中,後續治療有效劑量通常落在更低給藥範圍內。
可替代地,在一些實施方式中,在「負荷劑量」後,根據「維持方案」施用後續治療有效劑量的根據本發明的蛋白質,其中施用治療有效劑量的根據本發明的蛋白質每月一次、每6週一次、每兩個月一次、每10週一次、每三個月一次、每14週一次、每四個月一次、每18週一次、每五個月一次、每22週一次、每六個月一次、每7個月一次、每8個月一次、每9個月一次、每10個月一次、每11個月一次或者每12個月一次。在這類實施方式中,根據本發明的蛋白質的治療有效劑量落在更低給藥範圍內,特別是以更高頻率間隔(例如每兩週一次至每月一次)施用後續劑量時,或者落在更高給藥範圍內,特別是以更低頻率間隔施用後續劑量時,例如,在間隔一個月至12個月施用後續劑量的情況下。
給藥的時間通常從第一劑量活性化合物的當天(也稱為「基線」)測量。然而,不同的醫療服務人員使用不同的命名慣例。
值得注意的是,一些醫療服務人員可能稱第零週為第1週,而一些醫療服務人員可能稱第零天為第一天。因此,有可能不同醫師將指明劑量例
如在第3週/在第21天期間、在第3週/在第22天期間、第4週/在第21天期間、第4週/在第22天期間給予,而指的是相同給藥時間表。為了一致性,給藥的第一週將在本文中稱為第0週,而給藥的第一天將被稱為第1天。然而,熟悉該項技術者將理解,該命名規則僅用於一致性並且不應被解釋為限制,即,每週給藥係提供每週劑量的蛋白質,無論醫生是否參考特定的一週為「第1週」或「第2週」。如本文所述的劑量方案的實例見圖1和圖2。應理解,無需在精確時間點提供劑量,例如大約預定在第29天的劑量可例如在第24天至第34天(例如第30天)提供,只要提供在適當的星期中即可。
如本文所使用的,短語「具有足夠量的蛋白質的容器以允許[指定劑量]的遞送」用於表示給定容器(例如,小瓶、筆、注射器)已在其中配置可用於提供所需劑量的一定體積的蛋白質(例如,作為藥物組成物的一部分)。作為一種實例,如果所希望的劑量係500mg,那麼臨床醫生可能使用來自含有濃度為250mg/ml的蛋白質配製物的容器中的2ml、來自含有濃度為500mg/ml的蛋白質配製物的容器中的1ml、來自含有濃度為1000mg/ml的蛋白質配製物的容器中的0.5ml等。在每個這樣的情況下,該等容器具有足夠量的蛋白質以允許遞送所希望的500mg的劑量。
如本文所使用的,短語「以允許[施用途徑]遞送[指定劑量]的劑量配製」用於表示給定的藥物組成物可用於藉由指定的施用途徑(例如s.c.或i.v.)提供所需劑量的蛋白質。作為一種實例,如果所希望的皮下劑量係500mg,那麼臨床醫生可能使用具有濃度為250mg/ml的2ml蛋白質配製物、具有濃度為500mg/ml的1ml蛋白質配製物、具有濃度為1000mg/ml的0.5ml蛋白質配製物等。在每個這樣的情況下,該等蛋白質配製物處於足夠高的濃度以允許皮下遞送蛋白質。皮下遞送通常需要遞送小於約2ml的體積,較佳的是約1ml或更小的體積。然而,可以使用例如貼片/泵機制隨時間遞送更高的體積。
本文揭露了蛋白質用於製造治療患者中的組織損傷的藥物的用途,其中該藥物被配製成包含容器,每個容器具有足夠量的蛋白質以允許每單位劑量遞送至少約75mg、150mg、300mg或600mg的蛋白質。
本文揭露了蛋白質用於製造治療患者中的組織損傷的藥物的用途,其中該藥物以一定劑量被配製以允許每單位劑量全身遞送(例如,i.v.或s.c.遞送)75mg、150mg、300mg或600mg的蛋白質。
18. 實例17:套組
本揭露還涵蓋用蛋白質治療患有組織損傷(視情況而定)的患者的套組。此類套組包含蛋白質(例如,以液體或凍乾形式)或包含該蛋白質(如上所述)的藥物組成物。另外,此類套組可包含用於施用蛋白質的裝置(例如注射器和小瓶、預填充注射器、預填充筆、貼片/泵)及使用說明書。說明書可以揭露將蛋白質作為具體給藥方案的一部分提供給患者。該等套組還可以含有用於治療銀屑病,例如用於與所裝入的蛋白質組合遞送的另外的治療劑(如上所述)。
短語「施用裝置」用於表示向患者全身性地施用藥物的任何可用器具,包括但不限於預填充注射器、小瓶及注射器、注射筆、自動注射器、靜脈內滴注器和袋、泵、貼片/泵等。使用該等物品,患者可自施用藥物(即自行施用藥物),或可由護理給予者或醫師施用藥物。
本文揭露了用於治療患有組織損傷的患者的套組,該等套組包含:a)藥物組成物,該藥物組成物包含治療有效量的蛋白質;b)用於向患者施用蛋白質的裝置;和c)說明書,該說明書提供了向有需要的患者皮下施用蛋白質。
序列表
表34中揭露了用於實施本發明的有用的胺基酸和核苷酸序列。
<110> 諾華公司(NOVARTIS AG)
<120> 溶解的腺三磷雙磷酸酶、方法及用途
<130> PAT057510-EP-EPA
<140> EP 18184269.1
<141> 2018-07-18
<160> 253
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 510
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 511
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<400> 2
<210> 3
<211> 441
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
<210> 4
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 4
<210> 5
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 5
<210> 6
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 6
<210> 7
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 7
<210> 8
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 8
<210> 9
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 9
<210> 10
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 10
<210> 11
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 11
<210> 12
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 12
<210> 13
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 13
<210> 14
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 14
<210> 15
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 15
<210> 16
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 16
<210> 17
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 17
<210> 18
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 18
<210> 19
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 19
<210> 20
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 20
<210> 21
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 21
<210> 22
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 22
<210> 23
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 23
<210> 24
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 24
<210> 25
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 25
<210> 26
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 26
<210> 27
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 27
<210> 28
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 28
<210> 29
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 29
<210> 30
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 30
<210> 31
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 31
<210> 32
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 32
<210> 33
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 33
<210> 34
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 34
<210> 35
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 35
<210> 36
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 36
<210> 37
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 37
<210> 38
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 38
<210> 39
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 39
<210> 40
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 40
<210> 41
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 41
<210> 42
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 42
<210> 43
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 43
<210> 44
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 44
<210> 45
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 45
<210> 46
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 46
<210> 47
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 47
<210> 48
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 48
<210> 49
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 49
<210> 50
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 50
<210> 51
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 51
<210> 52
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 52
<210> 53
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 53
<210> 54
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 54
<210> 55
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 55
<210> 56
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 56
<210> 57
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 57
<210> 58
<211> 430
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 58
<210> 59
<211> 1290
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 59
<210> 60
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 60
<210> 61
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 61
<210> 62
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 62
<210> 63
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 63
<210> 64
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 64
<210> 65
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 65
<210> 66
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 66
<210> 67
<211> 1326
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 67
<210> 68
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 68
<210> 69
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 69
<210> 70
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 70
<210> 71
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 71
<210> 72
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 72
<210> 73
<211> 1329
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 73
<210> 74
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 74
<210> 75
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 75
<210> 76
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 76
<210> 77
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 77
<210> 78
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 78
<210> 79
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 79
<210> 80
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 80
<210> 81
<211> 1299
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 81
<210> 82
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 82
<210> 83
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 83
<210> 84
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 84
<210> 85
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 85
<210> 86
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 86
<210> 87
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 87
<210> 88
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 88
<210> 89
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 89
<210> 90
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 90
<210> 91
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 91
<210> 92
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 92
<210> 93
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 93
<210> 94
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 94
<210> 95
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 95
<210> 96
<211> 427
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 96
<210> 97
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 97
<210> 98
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 98
<210> 99
<211> 431
<212> PRT
<213> 智人
<400> 99
<210> 100
<211> 1293
<212> DNA
<213> 智人
<400> 100
<210> 101
<211> 431
<212> PRT
<213> 智人
<400> 101
<210> 102
<211> 1293
<212> DNA
<213> 智人
<400> 102
<210> 103
<211> 416
<212> PRT
<213> 智人
<400> 103
<210> 104
<211> 1248
<212> DNA
<213> 智人
<400> 104
<210> 105
<211> 404
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 105
<210> 106
<211> 1212
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 106
<210> 107
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 107
<210> 108
<211> 1248
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 108
<210> 109
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 109
<210> 110
<211> 1248
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 110
<210> 111
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 111
<210> 112
<211> 1248
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 112
<210> 113
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 113
<210> 114
<211> 1248
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 114
<210> 115
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 115
<210> 116
<211> 1248
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 116
<210> 117
<211> 404
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 117
<210> 118
<211> 1212
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 118
<210> 119
<211> 404
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 119
<210> 120
<211> 1212
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 120
<210> 121
<211> 404
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 121
<210> 122
<211> 1212
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 122
<210> 123
<211> 404
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 123
<210> 124
<211> 1212
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 124
<210> 125
<211> 404
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 125
<210> 126
<211> 1212
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 126
<210> 127
<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 127
<210> 128
<211> 1293
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 128
<210> 129
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 129
<210> 130
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 130
<210> 131
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成肽"
<400> 131
<210> 132
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成寡核苷酸"
<400> 132
<210> 133
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成肽"
<400> 133
<210> 134
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成寡核苷酸"
<400> 134
<210> 135
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成肽"
<400> 135
<210> 136
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成寡核苷酸"
<400> 136
<210> 137
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成肽"
<400> 137
<210> 138
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成寡核苷酸"
<400> 138
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成肽"
<400> 139
<210> 140
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成寡核苷酸"
<400> 140
<210> 141
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成肽"
<400> 141
<210> 142
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成寡核苷酸"
<400> 142
<210> 143
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成肽"
<400> 143
<210> 144
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成寡核苷酸"
<400> 144
<210> 145
<211> 426
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 145
<210> 146
<211> 1278
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 146
<210> 147
<211> 537
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 147
<210> 148
<211> 1611
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 148
<210> 149
<211> 508
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 149
<210> 150
<211> 1524
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 150
<210> 151
<211> 618
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 151
<210> 152
<211> 1854
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 152
<210> 153
<211> 625
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 153
<210> 154
<211> 1875
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 154
<210> 155
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 155
<210> 156
<211> 1317
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 156
<210> 157
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 157
<210> 158
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 158
<210> 159
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 159
<210> 160
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 160
<210> 161
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 161
<210> 162
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 162
<210> 163
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 163
<210> 164
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 164
<210> 165
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 165
<210> 166
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 166
<210> 167
<211> 76
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 167
<210> 168
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 168
<210> 169
<211> 186
<212> PRT
<213> 智人
<400> 169
<210> 170
<211> 193
<212> PRT
<213> 智人
<400> 170
<210> 171
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 171
<210> 172
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 172
<210> 173
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 173
<210> 174
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 174
<210> 175
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 175
<210> 176
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 176
<210> 177
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 177
<210> 178
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 178
<210> 179
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 179
<210> 180
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 180
<210> 181
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 181
<210> 182
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 182
<210> 183
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 183
<210> 184
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 184
<210> 185
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 185
<210> 186
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 186
<210> 187
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 187
<210> 188
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 188
<210> 189
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 189
<210> 190
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 190
<210> 191
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 191
<210> 192
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 192
<210> 193
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 193
<210> 194
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 194
<210> 195
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 195
<210> 196
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 196
<210> 197
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 197
<210> 198
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 198
<210> 199
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 199
<210> 200
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 200
<210> 201
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 201
<210> 202
<211> 119
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 202
<210> 203
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 203
<210> 204
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 204
<210> 205
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 205
<210> 206
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 206
<210> 207
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 207
<210> 208
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成引物"
<400> 208
<210> 209
<211> 430
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 209
<210> 210
<211> 1290
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 210
<210> 211
<211> 430
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 211
<210> 212
<211> 1290
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 212
<210> 213
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 213
<210> 214
<211> 1299
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 214
<210> 215
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 215
<210> 216
<211> 1326
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 216
<210> 217
<211> 430
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 217
<210> 218
<211> 1290
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 218
<210> 219
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 219
<210> 220
<211> 1299
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 220
<210> 221
<211> 430
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 221
<210> 222
<211> 1290
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 222
<210> 223
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 223
<210> 224
<211> 1299
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 224
<210> 225
<211> 430
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 225
<210> 226
<211> 1290
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 226
<210> 227
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 227
<210> 228
<211> 1299
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 228
<210> 229
<211> 430
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 229
<210> 230
<211> 1290
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 230
<210> 231
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 231
<210> 232
<211> 1299
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 232
<210> 233
<211> 430
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 233
<210> 234
<211> 1290
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 234
<210> 235
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 235
<210> 236
<211> 1299
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 236
<210> 237
<211> 430
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 237
<210> 238
<211> 1290
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 238
<210> 239
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 239
<210> 240
<211> 1299
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 240
<210> 241
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 241
<210> 242
<211> 1326
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 242
<210> 243
<211> 430
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 243
<210> 244
<211> 1290
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 244
<210> 245
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多肽"
<400> 245
<210> 246
<211> 1299
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成多核苷酸"
<400> 246
<210> 247
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成肽"
<400> 247
<210> 248
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成寡核苷酸"
<400> 248
<210> 249
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成6xHis標籤"
<400> 249
<210> 250
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成寡核苷酸"
<400> 250
<210> 251
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成肽"
<400> 251
<210> 252
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成肽"
<400> 252
<210> 253
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 來源
<223> /注釋="人工序列的描述:合成肽"
<400> 253
Claims (28)
- 一種溶解的人腺三磷雙磷酸酶,其具有至少兩個修飾,該等修飾選自由以下組成的列表:N末端缺失、C末端缺失和中心修飾。
- 如申請專利範圍第1項所述之溶解的人腺三磷雙磷酸酶,該溶解的人腺三磷雙磷酸酶具有N末端缺失、C末端缺失和中心修飾。
- 如申請專利範圍第1或2項所述之溶解的人腺三磷雙磷酸酶,其中a)該N末端缺失長度在30與50個胺基酸之間,b)該C末端缺失長度在20與40個胺基酸之間,和c)該中心修飾包含缺失和/或點突變。
- 如前述申請專利範圍中任一項所述之溶解的人腺三磷雙磷酸酶,其中該中心修飾包含10至15個連續胺基酸的缺失。
- 如申請專利範圍第4項所述之溶解的人腺三磷雙磷酸酶,其中該中心缺失係與根據SEQ ID NO:1的野生型CD39序列相關的胺基酸編號193至204的缺失。
- 如前述申請專利範圍中任一項所述之溶解的人腺三磷雙磷酸酶,其中該中心修飾包含點突變,該點突變包含與根據SEQ IDNO:1的野生型CD39序列相關的一個、兩個、三個、四個或五個點突變,所述點突變選自由以下組成之群組:K71E、N73Q、V95A、G102D、Y104S、T106S、R113M、L149M、V151A、E173D、T229A、L254M、K258R、W263R、E276D、N292Q、R304G、I319T、N327Q、A362N、F365S、N371Q、K405N、Y412F、L424Q、H436D、I437N、F439S、G441D、N457Q、P463S、和S469R。
- 如前述申請專利範圍中任一項所述之溶解的人腺三磷雙磷酸酶,該溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含如下序列,該序列選自由以下組成之群組:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:76、和SEQ ID NO:78。
- 如前述申請專利範圍中任一項所述之溶解的人腺三磷雙磷酸酶,該溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含如下序列,該序列選自由以下組成之群組:SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:141。
- 如申請專利範圍第8項所述之溶解的人腺三磷雙磷酸酶,該溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含如下序列或由如下序列組成,該序列選自由以下組成之群組:SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:219、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:229。
- 如申請專利範圍第9項所述之溶解的人腺三磷雙磷酸酶,該溶解的人腺三磷雙磷酸酶由如下序列組成,該序列選自由以下組成之群組:SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:229。
- 一種藥物組成物,該藥物組成物包含治療有效劑量的如申請專利範圍第1至10項中任一項所述之腺三磷雙磷酸酶、和一種或多種藥學上可接受的運載體。
- 如申請專利範圍第11項所述之藥物組成物,該藥物組成物進一步包含一種或多種另外的活性成分。
- 一種分離的如申請專利範圍第1至10項所述之腺三磷雙磷酸酶,該分離的腺三磷雙磷酸酶用作藥物。
- 一種分離的如申請專利範圍第1至10項所述之腺三磷雙磷酸酶,該分離的腺三磷雙磷酸酶用於治療組織損傷。
- 用於根據申請專利範圍第14項所述使用之分離的腺三磷雙磷酸酶,其中該組織損傷係急性腦損傷(中風);急性多器官衰竭;腎臟或其他實體器官移植後移植物功能延遲;燒傷;輻射損傷;由於創傷和/或缺氧引起的急性損傷,如急性呼吸窘迫症候群(ARDS)或肺損傷;急性腎損傷,如繼發於胸外科手術(例如主動脈瓣置換術、冠狀動脈繞道手術)或敗血症或橫紋肌溶解症或抗生素或其他藥物的毒性作用的急性腎損傷;急性心肌損傷。
- 一種分離的如申請專利範圍第1-10項所述之腺三磷雙磷酸酶,該分離的腺三磷雙磷酸酶用於治療心臟手術相關的急性腎損傷。
- 一種分離的如申請專利範圍第1-10項所述之腺三磷雙磷酸酶,該分離的腺三磷雙磷酸酶用於治療移植物功能延遲(DGF)、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、急性心肌梗塞(AMI)、外傷性腦損傷(TBI)/急性缺血性中風(AIS)、缺血再灌注損傷(IRI)、或通常被稱為多器官衰竭(MOF)的其組合。
- 一種分離的如申請專利範圍第1-10項所述之腺三磷雙磷酸酶,該分離的腺三磷雙磷酸酶用於治療敗血症相關的急性腎損傷。
- 溶解的人腺三磷雙磷酸酶在製造用於治療人受試者中的組織損傷的藥物中之用途。
- 如申請專利範圍第19項所述之用途,其中該溶解的人腺三磷雙磷酸酶係如申請專利範圍第1至10項所述之腺三磷雙磷酸酶。
- 如申請專利範圍第19或20項所述之用途,其中該組織損傷係急性腦損傷(中風);急性多器官衰竭;腎臟或其他實體器官移植後移植物功能延遲;燒傷;輻射損傷;由於創傷和/或缺氧引起的急性損傷,如急性呼吸窘迫 症候群(ARDS)或肺損傷;急性腎損傷,如繼發於胸外科手術(例如主動脈瓣置換術、冠狀動脈繞道手術)或敗血症或橫紋肌溶解症或抗生素或其他藥物的毒性作用的急性腎損傷;急性心肌損傷。
- 溶解的人腺三磷雙磷酸酶在製造用於治療心臟手術相關的急性腎損傷的藥物中之用途。
- 溶解的人腺三磷雙磷酸酶在製造用於治療移植物功能延遲(DGF)、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、急性心肌梗塞(AMI)、外傷性腦損傷(TBI)/急性缺血性中風(AIS)、缺血再灌注損傷(IRI)、或通常被稱為多器官衰竭(MOF)的其組合的藥物中之用途。
- 溶解的人腺三磷雙磷酸酶在製造用於治療敗血症相關的急性腎損傷的藥物中之用途。
- 一種分離的核酸分子,該分離的核酸分子編碼如申請專利範圍第1至10項中所述之任何腺三磷雙磷酸酶。
- 一種選殖載體或表現載體,該選殖載體或表現載體包含一種或多種如申請專利範圍第25項所述之核酸序列,其中該載體適用於分離的如申請專利範圍第1至10項中所述之腺三磷雙磷酸酶的重組產生。
- 一種宿主細胞,該宿主細胞包含一種或多種如申請專利範圍第26項所述之選殖載體或表現載體。
- 一種用於生產如申請專利範圍第1至10項中任一項所述之腺三磷雙磷酸酶之方法,該方法包括培養如申請專利範圍第27項所述之宿主細胞,純化和回收所述腺三磷雙磷酸酶。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP18184269.1 | 2018-07-18 | ||
EP18184269 | 2018-07-18 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW202016299A true TW202016299A (zh) | 2020-05-01 |
Family
ID=62985993
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW108125140A TW202016299A (zh) | 2018-07-18 | 2019-07-16 | 溶解的腺三磷雙磷酸酶、方法及用途 |
Country Status (26)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220356455A1 (zh) |
EP (1) | EP3824079A1 (zh) |
JP (2) | JP7425784B2 (zh) |
KR (1) | KR20210035806A (zh) |
CN (1) | CN112424346A (zh) |
AR (1) | AR115790A1 (zh) |
AU (1) | AU2019306821B2 (zh) |
BR (1) | BR112021000586A2 (zh) |
CA (1) | CA3103684A1 (zh) |
CL (1) | CL2021000129A1 (zh) |
CO (1) | CO2021000210A2 (zh) |
CR (1) | CR20210021A (zh) |
CU (1) | CU20210008A7 (zh) |
EA (1) | EA202190057A1 (zh) |
EC (1) | ECSP21002804A (zh) |
IL (1) | IL280191A (zh) |
JO (1) | JOP20210008A1 (zh) |
MA (1) | MA53177A (zh) |
MX (1) | MX2021000542A (zh) |
PE (1) | PE20210185A1 (zh) |
PH (1) | PH12021550122A1 (zh) |
SG (1) | SG11202011776RA (zh) |
TW (1) | TW202016299A (zh) |
UY (1) | UY38299A (zh) |
WO (1) | WO2020016804A1 (zh) |
ZA (1) | ZA202007187B (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2021243173A1 (en) * | 2020-05-28 | 2021-12-02 | Charm Sciences, Inc. | Methods and assemblies for sample analysis |
WO2024023746A1 (en) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Novartis Ag | Improved production of cd39 variants |
TW202404627A (zh) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | 瑞士商諾華公司 | 使用cd39、重組cd39用於急性器官損傷的治療 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU6425699A (en) | 1998-10-16 | 2000-05-08 | Cornell Research Foundation Inc. | Methods of inhibiting platelet activation and recruitment |
US20020002277A1 (en) * | 1998-10-16 | 2002-01-03 | Maliszewski Charles Richard | Inhibitors of platelet activation and recruitment |
US6867177B2 (en) | 1999-08-13 | 2005-03-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | CD39/ECTO-adpase as a treatment for thrombotic and ischemic disorders |
US7247300B1 (en) | 2002-11-07 | 2007-07-24 | Apt Therapeutics, Inc. | Therapeutic use of soluble CD39L3 |
WO2006096989A2 (en) | 2005-03-17 | 2006-09-21 | National Research Council Of Canada | Expression vectors containing a truncated epstein barr nuclear antigen 1 lacking the gly-gly-ala domain for enhanced transient gene expression |
WO2011088231A1 (en) * | 2010-01-13 | 2011-07-21 | Apt Therapeutics, Inc. | Apyrase therapy for bleeding conditions |
DK3083677T3 (da) | 2013-12-20 | 2019-11-25 | Novartis Ag | Hidtil ukendte eukaryote celler og fremgangsmåder til rekombinant ekspression af et produkt af interesse |
RU2720525C2 (ru) | 2013-12-20 | 2020-04-30 | Новартис Аг | Новые эукариотические клетки и способы их получения для рекомбинантной экспрессии представляющего интерес продукта |
-
2019
- 2019-07-15 UY UY0001038299A patent/UY38299A/es unknown
- 2019-07-16 TW TW108125140A patent/TW202016299A/zh unknown
- 2019-07-16 AR ARP190102009A patent/AR115790A1/es unknown
- 2019-07-17 CN CN201980047594.2A patent/CN112424346A/zh active Pending
- 2019-07-17 PE PE2021000054A patent/PE20210185A1/es unknown
- 2019-07-17 CR CR20210021A patent/CR20210021A/es unknown
- 2019-07-17 US US17/261,533 patent/US20220356455A1/en active Pending
- 2019-07-17 AU AU2019306821A patent/AU2019306821B2/en active Active
- 2019-07-17 BR BR112021000586-2A patent/BR112021000586A2/pt unknown
- 2019-07-17 CA CA3103684A patent/CA3103684A1/en active Pending
- 2019-07-17 WO PCT/IB2019/056117 patent/WO2020016804A1/en active Application Filing
- 2019-07-17 MA MA053177A patent/MA53177A/fr unknown
- 2019-07-17 EP EP19769879.8A patent/EP3824079A1/en active Pending
- 2019-07-17 KR KR1020217001187A patent/KR20210035806A/ko unknown
- 2019-07-17 EA EA202190057A patent/EA202190057A1/ru unknown
- 2019-07-17 SG SG11202011776RA patent/SG11202011776RA/en unknown
- 2019-07-17 MX MX2021000542A patent/MX2021000542A/es unknown
- 2019-07-17 JO JOP/2021/0008A patent/JOP20210008A1/ar unknown
- 2019-07-17 CU CU2021000008A patent/CU20210008A7/es unknown
- 2019-07-17 JP JP2021502432A patent/JP7425784B2/ja active Active
-
2020
- 2020-11-18 ZA ZA2020/07187A patent/ZA202007187B/en unknown
-
2021
- 2021-01-14 IL IL280191A patent/IL280191A/en unknown
- 2021-01-14 EC ECSENADI20212804A patent/ECSP21002804A/es unknown
- 2021-01-14 CO CONC2021/0000210A patent/CO2021000210A2/es unknown
- 2021-01-15 PH PH12021550122A patent/PH12021550122A1/en unknown
- 2021-01-15 CL CL2021000129A patent/CL2021000129A1/es unknown
-
2023
- 2023-11-14 JP JP2023193640A patent/JP2024023297A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA3103684A1 (en) | 2020-01-23 |
AU2019306821A1 (en) | 2020-12-24 |
CO2021000210A2 (es) | 2021-01-18 |
JP2024023297A (ja) | 2024-02-21 |
BR112021000586A2 (pt) | 2021-04-06 |
KR20210035806A (ko) | 2021-04-01 |
AR115790A1 (es) | 2021-02-24 |
CU20210008A7 (es) | 2021-08-06 |
JP7425784B2 (ja) | 2024-01-31 |
US20220356455A1 (en) | 2022-11-10 |
PE20210185A1 (es) | 2021-02-02 |
EP3824079A1 (en) | 2021-05-26 |
SG11202011776RA (en) | 2021-02-25 |
WO2020016804A1 (en) | 2020-01-23 |
CR20210021A (es) | 2021-03-23 |
CL2021000129A1 (es) | 2021-08-20 |
MA53177A (fr) | 2021-05-26 |
ZA202007187B (en) | 2022-06-29 |
PH12021550122A1 (en) | 2021-09-27 |
CN112424346A (zh) | 2021-02-26 |
JOP20210008A1 (ar) | 2021-01-12 |
JP2021529550A (ja) | 2021-11-04 |
MX2021000542A (es) | 2021-03-29 |
ECSP21002804A (es) | 2021-04-29 |
UY38299A (es) | 2020-02-28 |
AU2019306821B2 (en) | 2022-09-29 |
EA202190057A1 (ru) | 2021-08-24 |
IL280191A (en) | 2021-03-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6766194B2 (ja) | IL−4Rαに結合する涙液リポカリンムテイン | |
US8926972B2 (en) | Anti-angiogenesis fusion proteins | |
TW202016299A (zh) | 溶解的腺三磷雙磷酸酶、方法及用途 | |
Zhang et al. | Enhanced delivery of erythropoietin across the blood–brain barrier for neuroprotection against ischemic neuronal injury | |
JP7096668B2 (ja) | 長時間作用型凝固因子およびその製造方法 | |
EP3098241A1 (en) | Fusion protein inhibiting angiogenesis or growth and use thereof | |
TW201420606A (zh) | 同源二聚體蛋白 | |
CN102470156A (zh) | 选择性作用于αvβ3整合素并缀合人血清白蛋白(HSA)变体的多肽及其药学用途 | |
CN101875693B (zh) | 具备抗血管生成活性的白蛋白变异体及其制备方法 | |
CA2848118C (en) | Endostatin mutants with mutations at atp binding sites | |
TW201738265A (zh) | 降低血糖之化合物 | |
WO2014193800A2 (en) | Aptamers for the treatment of sickle cell disease | |
CN103755813B (zh) | 一种靶向性抗肿瘤融合蛋白及其编码基因与表达质粒 | |
CN111770767A (zh) | 用于从生物流体中去除纤溶蛋白的体外设备和基质、其方法和用途 | |
JP6375112B2 (ja) | テネクテプラーゼの医薬組成物 | |
CN114621327B (zh) | GLP-1、GIP和Gcg多重受体激动蛋白质 | |
CN110982802B (zh) | 一种重组人sgk3蛋白激酶水凝胶及其制备方法与促进心肌再生的应用 | |
RU2791992C2 (ru) | Солюбилизированные апиразы, способы и применение | |
CN112274631A (zh) | 重组蛋白Semaphorin3G在防治视网膜疾病中的医药用途 | |
CN104926946A (zh) | 具有延长体内半衰期的adamts13-mdtcs融合蛋白及其应用 | |
WO2000047611A2 (en) | Polymeric immunoglobulin receptor (pigr)-binding domains and methods of use therefor | |
US9365841B1 (en) | High activity mutants of butyrylcholinesterase for cocaine hydrolysis | |
AU2022317144A1 (en) | Ptprs in autoimmunity | |
CN101671389A (zh) | 无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素及其用途 |