JP2024023297A - 可溶化アピラーゼ、方法及び使用 - Google Patents
可溶化アピラーゼ、方法及び使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2024023297A JP2024023297A JP2023193640A JP2023193640A JP2024023297A JP 2024023297 A JP2024023297 A JP 2024023297A JP 2023193640 A JP2023193640 A JP 2023193640A JP 2023193640 A JP2023193640 A JP 2023193640A JP 2024023297 A JP2024023297 A JP 2024023297A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- apyrase
- acute
- injury
- solubilized human
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010007730 Apyrase Proteins 0.000 title claims abstract description 128
- 102000007347 Apyrase Human genes 0.000 title claims abstract description 128
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 47
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 78
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 63
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 63
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 40
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims abstract description 34
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims abstract description 34
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 23
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 20
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 78
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 claims description 47
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 claims description 47
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 claims description 47
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 46
- 102100029722 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Human genes 0.000 claims description 39
- 101001012447 Homo sapiens Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 Proteins 0.000 claims description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 32
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 26
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 claims description 26
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 claims description 26
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims description 22
- 208000034486 Multi-organ failure Diseases 0.000 claims description 20
- 208000029744 multiple organ dysfunction syndrome Diseases 0.000 claims description 20
- 208000010718 Multiple Organ Failure Diseases 0.000 claims description 19
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 18
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 16
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 claims description 16
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 16
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 16
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 claims description 14
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 claims description 14
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 14
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 claims description 14
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 claims description 12
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 12
- 208000012947 ischemia reperfusion injury Diseases 0.000 claims description 12
- 230000004768 organ dysfunction Effects 0.000 claims description 12
- 238000007675 cardiac surgery Methods 0.000 claims description 11
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 9
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 8
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 8
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 claims description 7
- 206010039020 Rhabdomyolysis Diseases 0.000 claims description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 7
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 claims description 7
- 231100000515 lung injury Toxicity 0.000 claims description 7
- 230000008733 trauma Effects 0.000 claims description 7
- 208000037892 acute myocardial injury Diseases 0.000 claims description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 6
- 210000001765 aortic valve Anatomy 0.000 claims description 6
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 claims description 6
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 claims description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 6
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 claims description 6
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 claims description 5
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 5
- 230000009692 acute damage Effects 0.000 claims description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 5
- 206010069351 acute lung injury Diseases 0.000 claims description 4
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 102220468054 Brother of CDO_N73Q_mutation Human genes 0.000 claims description 3
- 208000004852 Lung Injury Diseases 0.000 claims description 3
- 206010069363 Traumatic lung injury Diseases 0.000 claims description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 claims description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 102220004414 rs104894504 Human genes 0.000 claims description 3
- 102220257472 rs1553380245 Human genes 0.000 claims description 3
- 102220068569 rs794727519 Human genes 0.000 claims description 3
- 102200148410 rs672601363 Human genes 0.000 claims description 2
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 claims description 2
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 claims 1
- 206010038687 Respiratory distress Diseases 0.000 claims 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 123
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 95
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 90
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 45
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 38
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 36
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 31
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 30
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 17
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 11
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 11
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 11
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 10
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 10
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 10
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 9
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 8
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- 101100501552 Homo sapiens ENTPD1 gene Proteins 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 6
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 6
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 6
- 102100023038 WD and tetratricopeptide repeats protein 1 Human genes 0.000 description 6
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 5
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 5
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 5
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 4
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 4
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- VQPIHIGAMRSAAN-WMUFLLRFSA-N (3S)-3-[[(2S)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]acetyl]amino]propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]hexanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]acetyl]amino]hexanoyl]amino]-4-[[(2S)-1-[[(2S)-4-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[[2-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S,3R)-1-[[(1S)-1-carboxy-2-phenylethyl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-carboxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-carboxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-1,4-dioxobutan-2-yl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](Cc1ccc(O)cc1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O VQPIHIGAMRSAAN-WMUFLLRFSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010080422 CD39 antigen Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 101000605054 Mus musculus Epididymal-specific lipocalin-8 Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010063897 Renal ischaemia Diseases 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 3
- 238000002689 xenotransplantation Methods 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 101100054570 Caenorhabditis elegans acn-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 2
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 208000009857 Microaneurysm Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- HLXRWTJXGMHOFN-XJSNKYLASA-N Verbenalin Chemical compound O([C@@H]1OC=C([C@H]2C(=O)C[C@H](C)[C@H]21)C(=O)OC)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HLXRWTJXGMHOFN-XJSNKYLASA-N 0.000 description 2
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 2
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000013059 nephrectomy Methods 0.000 description 2
- 230000008816 organ damage Effects 0.000 description 2
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011311 validation assay Methods 0.000 description 2
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000005552 B01AC04 - Clopidogrel Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010008092 Cerebral artery thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010011091 Coronary artery thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100029725 Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 3 Human genes 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N Fentrazamide Chemical compound N1=NN(C=2C(=CC=CC=2)Cl)C(=O)N1C(=O)N(CC)C1CCCCC1 LLQPHQFNMLZJMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101001012432 Homo sapiens Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 3 Proteins 0.000 description 1
- 206010021137 Hypovolaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010070511 Hypoxic-ischaemic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 1
- 150000007649 L alpha amino acids Chemical class 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010091175 Matriptase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 208000037212 Neonatal hypoxic and ischemic brain injury Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102100037600 P2Y purinoceptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 206010072564 Peripheral artery thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 108010085249 Purinergic P2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108050002788 RNA polymerase sigma-H factor Proteins 0.000 description 1
- 208000019155 Radiation injury Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019892 Stellar Nutrition 0.000 description 1
- 102100037942 Suppressor of tumorigenicity 14 protein Human genes 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 208000024248 Vascular System injury Diseases 0.000 description 1
- 208000012339 Vascular injury Diseases 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- HLXRWTJXGMHOFN-UHFFFAOYSA-N Verbenalin Natural products C12C(C)CC(=O)C2C(C(=O)OC)=COC1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HLXRWTJXGMHOFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 108010011081 adenosine monophosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000007845 assembly PCR Methods 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 208000009973 brain hypoxia - ischemia Diseases 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010007625 cardiogenic shock Diseases 0.000 description 1
- 230000036996 cardiovascular health Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N clopidogrel Chemical compound C1([C@H](N2CC=3C=CSC=3CC2)C(=O)OC)=CC=CC=C1Cl GKTWGGQPFAXNFI-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- 229960003009 clopidogrel Drugs 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000004121 copper complexes of chlorophylls and chlorophyllins Substances 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002528 coronary thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 108010047482 ectoATPase Proteins 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 230000010502 episomal replication Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 229940014144 folate Drugs 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- ZSZNUIGFWQXJMQ-UHFFFAOYSA-K gold(3+);phosphate Chemical compound [Au+3].[O-]P([O-])([O-])=O ZSZNUIGFWQXJMQ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002631 hypothermal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 238000001499 laser induced fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000003589 nefrotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000381 nephrotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- -1 nucleotide diphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940099990 ogen Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 208000033300 perinatal asphyxia Diseases 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 201000011461 pre-eclampsia Diseases 0.000 description 1
- 229940071643 prefilled syringe Drugs 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000002254 renal artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000006276 transfer reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- 210000000626 ureter Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
- C12Y306/01—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) in phosphorus-containing anhydrides (3.6.1)
- C12Y306/01005—Apyrase (3.6.1.5), i.e. ATP diphosphohydrolase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Virology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【課題】可溶化ヒトアピラーゼ、及び該アピラーゼを含む医薬組成物を提供する。【解決手段】一態様として、N末端欠失、C末端欠失及び中央部修飾からなるリストから選択される少なくとも2つの修飾を有する可溶化ヒトアピラーゼであって、N末端欠失、C末端欠失及び中央部修飾を有し、又は、a)前記N末端欠失が30~50アミノ酸長であり、b)前記C末端欠失が20~40アミノ酸長であり、c)前記中央部修飾が欠失及び/又は点突然変異を含む可溶化ヒトアピラーゼ、及び、該アピラーゼの治療的有効用量と1つ以上の薬学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物を提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、可溶化アピラーゼポリペプチドの設計及び治療的使用、組織損傷を予防及び
処置するのに有用な医薬組成物及び方法に関する。
処置するのに有用な医薬組成物及び方法に関する。
アピラーゼ(ATP-ジホスファターゼ、アデノシンジホスファターゼ、ADPase
又はATPジホスホヒドロラーゼ)は、ヌクレオチド二リン酸及び三リン酸(NDP及び
NTP)の両方に対する酵素活性の形質膜結合酵素群であり、NDPを中間体として2つ
の個別の連続的なリン酸放出段階においてNTPを一リン酸ヌクレオチド(NMP)に加
水分解する。細胞表面上に存在し、細胞外ヌクレオチドを加水分解するエクトATPas
eの殆どは、この酵素ファミリーに属する。これらは、ATP及びADPの両方を加水分
解するという点で、ATPを特異的に加水分解するATPaseとは異なる。
又はATPジホスホヒドロラーゼ)は、ヌクレオチド二リン酸及び三リン酸(NDP及び
NTP)の両方に対する酵素活性の形質膜結合酵素群であり、NDPを中間体として2つ
の個別の連続的なリン酸放出段階においてNTPを一リン酸ヌクレオチド(NMP)に加
水分解する。細胞表面上に存在し、細胞外ヌクレオチドを加水分解するエクトATPas
eの殆どは、この酵素ファミリーに属する。これらは、ATP及びADPの両方を加水分
解するという点で、ATPを特異的に加水分解するATPaseとは異なる。
表面抗原分類39(CD39、UniProt P49961又は配列番号1)として
も知られる、最初に分かったヒトアピラーゼ、エクトヌクレオシドトリホスフェートジホ
スホヒドロラーゼ-1(遺伝子:ENTPD1、タンパク質:NTPDase1)は、細
胞表面に局在する酵素であり、細胞外に向いている触媒部位を有する。
も知られる、最初に分かったヒトアピラーゼ、エクトヌクレオシドトリホスフェートジホ
スホヒドロラーゼ-1(遺伝子:ENTPD1、タンパク質:NTPDase1)は、細
胞表面に局在する酵素であり、細胞外に向いている触媒部位を有する。
既知のヒトCD39ファミリーの中で、メンバーCD39L3は、CD39とCD39
L1(エクトATPase)との間の生化学的活性を有する、エクトアピラーゼ(エクト
ATPDase)として知られる。具体的にヒトCD39L3は、治療目的のために、例
えば米国特許第7247300B1号明細書(参照により本明細書中に組み込まれる)で
開示されるように、又は配列番号3として本明細書中に含まれているように、可溶化され
、精製されている。
L1(エクトATPase)との間の生化学的活性を有する、エクトアピラーゼ(エクト
ATPDase)として知られる。具体的にヒトCD39L3は、治療目的のために、例
えば米国特許第7247300B1号明細書(参照により本明細書中に組み込まれる)で
開示されるように、又は配列番号3として本明細書中に含まれているように、可溶化され
、精製されている。
本開示は、とりわけ、ヒトCD39などの可溶化ヒトアピラーゼのある種の修飾が、驚
くべきことに、活性タンパク質をもたらし、その作製がそれでもなお安全且つ容易である
という予想外の知見に基づく。
くべきことに、活性タンパク質をもたらし、その作製がそれでもなお安全且つ容易である
という予想外の知見に基づく。
本発明の第1の態様によれば、N末端欠失、C末端欠失及び中央部修飾からなるリスト
から選択される少なくとも2つの修飾を有する可溶化ヒトアピラーゼが提供される。
から選択される少なくとも2つの修飾を有する可溶化ヒトアピラーゼが提供される。
ある実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは、N末端欠失、C末端欠失及び修飾欠失を
含む。
含む。
ある実施形態では、中央部修飾は、1個以上のアミノ酸の欠失を含む。別の実施形態で
は、中央部修飾は、置換突然変異などの1個以上のアミノ酸の点突然変異を含む。また別
の実施形態では、中央部修飾は、1個以上のアミノ酸の欠失及び1個以上のアミノ酸の点
突然変異、例えば置換突然変異など、の組み合わせである。
は、中央部修飾は、置換突然変異などの1個以上のアミノ酸の点突然変異を含む。また別
の実施形態では、中央部修飾は、1個以上のアミノ酸の欠失及び1個以上のアミノ酸の点
突然変異、例えば置換突然変異など、の組み合わせである。
N末端欠失は、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40
、41、42、43、44、45、46、47、48、49又は50個のアミノ酸の欠失
など、配列番号1に従う野生型CD39配列のN末端からの30~50個のアミノ酸の欠
失であり得る。好ましい実施形態では、N末端欠失は、34、37、38又は45個のア
ミノ酸である。
、41、42、43、44、45、46、47、48、49又は50個のアミノ酸の欠失
など、配列番号1に従う野生型CD39配列のN末端からの30~50個のアミノ酸の欠
失であり得る。好ましい実施形態では、N末端欠失は、34、37、38又は45個のア
ミノ酸である。
C末端欠失は、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30
、31、32、33、34、35、36、37、38、39又は40個アミノ酸の欠失な
ど、配列番号1に従う野生型CD39配列のC末端からの20~40個のアミノ酸の欠失
であり得る。好ましい実施形態では、C末端欠失は37個のアミノ酸のうち22、29で
ある。
、31、32、33、34、35、36、37、38、39又は40個アミノ酸の欠失な
ど、配列番号1に従う野生型CD39配列のC末端からの20~40個のアミノ酸の欠失
であり得る。好ましい実施形態では、C末端欠失は37個のアミノ酸のうち22、29で
ある。
中央部欠失は、10、11、12、13、14又は15個のアミノ酸の欠失など、配列
番号1に従う野生型CD39配列からの10~15個の連続アミノ酸の欠失であり得る。
好ましい実施形態では、中央部欠失は、配列番号1に従う野生型CD39配列に対してア
ミノ酸番号193~204など、12個のアミノ酸である。
番号1に従う野生型CD39配列からの10~15個の連続アミノ酸の欠失であり得る。
好ましい実施形態では、中央部欠失は、配列番号1に従う野生型CD39配列に対してア
ミノ酸番号193~204など、12個のアミノ酸である。
一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは、K71E、N73Q、V95A、G102
D、Y104S、T106S、R113M、L149M、V151A、E173D、T2
29A、L254M、K258R、W263R、E276D、N292Q、R304G、
I319T、N327Q、A362N、F365S、N371Q、K405N、Y412
F、L424Q、H436D、I437N、F439S、G441D、N457Q、P4
63S及びS469Rからなる群から選択される、配列番号1に従う野生型CD39配列
に対する1、2、3、4又は5個の点突然変異を含む。
D、Y104S、T106S、R113M、L149M、V151A、E173D、T2
29A、L254M、K258R、W263R、E276D、N292Q、R304G、
I319T、N327Q、A362N、F365S、N371Q、K405N、Y412
F、L424Q、H436D、I437N、F439S、G441D、N457Q、P4
63S及びS469Rからなる群から選択される、配列番号1に従う野生型CD39配列
に対する1、2、3、4又は5個の点突然変異を含む。
一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号4、配列番号6、配列番号32、
配列番号54、配列番号56、配列番号70、配列番号76及び配列番号78からなる群
から選択される配列を含む。
配列番号54、配列番号56、配列番号70、配列番号76及び配列番号78からなる群
から選択される配列を含む。
一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号131、配列番号133、配列番
号135、配列番号137、配列番号139及び配列番号141からなる群から選択され
る配列を含む。
号135、配列番号137、配列番号139及び配列番号141からなる群から選択され
る配列を含む。
具体的な一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号213、配列番号227
、配列番号219、配列番号227、配列番号217、配列番号209、配列番号221
、配列番号72、配列番号215、配列番号223、配列番号211、配列番号58及び
配列番号229からなる群から選択される配列を含む。
、配列番号219、配列番号227、配列番号217、配列番号209、配列番号221
、配列番号72、配列番号215、配列番号223、配列番号211、配列番号58及び
配列番号229からなる群から選択される配列を含む。
具体的な一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号213、配列番号227
、配列番号219、配列番号227、配列番号217、配列番号209、配列番号221
、配列番号72、配列番号215、配列番号223、配列番号211、配列番号58及び
配列番号229からなる群から選択される配列からなる。
、配列番号219、配列番号227、配列番号217、配列番号209、配列番号221
、配列番号72、配列番号215、配列番号223、配列番号211、配列番号58及び
配列番号229からなる群から選択される配列からなる。
好ましい実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号58、配列番号72及び配
列番号229からなる群から選択される配列を含む。
列番号229からなる群から選択される配列を含む。
一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは配列番号58を含む。一実施形態では、可溶
化ヒトアピラーゼは配列番号72を含む。一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは配列
番号229を含む。
化ヒトアピラーゼは配列番号72を含む。一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは配列
番号229を含む。
好ましい実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号58、配列番号72及び配
列番号229からなる群から選択される配列からなる。
列番号229からなる群から選択される配列からなる。
一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは配列番号58からなる。一実施形態では,可
溶化ヒトアピラーゼは配列番号72からなる。一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは
配列番号229からなる。
溶化ヒトアピラーゼは配列番号72からなる。一実施形態では、可溶化ヒトアピラーゼは
配列番号229からなる。
本発明の第2の態様によれば、本発明は、本発明の第1の態様によるアピラーゼの治療
的有効用量を含む医薬組成物に関し、1つ以上の薬学的に許容可能な担体が提供される。
的有効用量を含む医薬組成物に関し、1つ以上の薬学的に許容可能な担体が提供される。
一実施形態では、本医薬組成物は、1つ以上のさらなる有効成分をさらに含む。
本発明の第3の態様によれば、薬剤としての使用のための第1の態様による単離アピラ
ーゼが提供される。
ーゼが提供される。
本発明の第4の態様によれば、組織損傷の処置での使用のための第1の態様による単離
アピラーゼが提供される。
アピラーゼが提供される。
組織損傷は、急性脳傷害(卒中発作);急性多臓器不全;腎臓又は他の固形臓器の移植
後の臓器移植後臓器機能障害;火傷による損傷;放射線による損傷;外傷及び/又は低酸
素による急性損傷、例えば急性呼吸窮迫症候群(ARDS)又は肺傷害など;急性腎臓傷
害、例えば胸部外科手術(例えば大動脈弁置換術、冠動脈バイパス術)又は敗血症又は横
紋筋融解症又は抗生物質若しくは他の薬剤の毒性効果に対する二次的な急性腎臓傷害など
;急性心筋傷害であり得る。
後の臓器移植後臓器機能障害;火傷による損傷;放射線による損傷;外傷及び/又は低酸
素による急性損傷、例えば急性呼吸窮迫症候群(ARDS)又は肺傷害など;急性腎臓傷
害、例えば胸部外科手術(例えば大動脈弁置換術、冠動脈バイパス術)又は敗血症又は横
紋筋融解症又は抗生物質若しくは他の薬剤の毒性効果に対する二次的な急性腎臓傷害など
;急性心筋傷害であり得る。
別の実施形態では、本開示の第4の態様は、心臓手術に付随する急性腎臓傷害の処置で
の使用のための、本発明の第1の態様による単離アピラーゼに関する。
の使用のための、本発明の第1の態様による単離アピラーゼに関する。
別の実施形態では、本開示の第4の態様は、臓器移植後臓器機能障害(DGF)、急性
呼吸窮迫症候群(ARDS)、急性心筋梗塞(AMI)、外傷性脳傷害(TBI)/急性
虚血性発作(AIS)、虚血再灌流傷害(IRI)又は多臓器不全(MOF)と呼ばれる
ことが多いそれらの組み合わせの処置での使用のための本発明の第1の態様による単離ア
ピラーゼに関する。
呼吸窮迫症候群(ARDS)、急性心筋梗塞(AMI)、外傷性脳傷害(TBI)/急性
虚血性発作(AIS)、虚血再灌流傷害(IRI)又は多臓器不全(MOF)と呼ばれる
ことが多いそれらの組み合わせの処置での使用のための本発明の第1の態様による単離ア
ピラーゼに関する。
一実施形態では、心臓手術に付随する急性腎臓傷害の処置のために使用される可溶化ヒ
トアピラーゼは、配列番号58のアミノ酸配列を含む。
トアピラーゼは、配列番号58のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、心臓手術に付随する急性腎臓傷害の処置のために使用される可溶化ヒ
トアピラーゼは、配列番号72のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、心臓手術に付随
する急性腎臓傷害の処置のために使用される可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号229の
アミノ酸配列を含む。
トアピラーゼは、配列番号72のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、心臓手術に付随
する急性腎臓傷害の処置のために使用される可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号229の
アミノ酸配列を含む。
さらなる好ましい実施形態では、本開示は、敗血症に付随する急性腎臓傷害の処置のた
めの本発明の第1の態様による単離アピラーゼの使用に関する。
めの本発明の第1の態様による単離アピラーゼの使用に関する。
第4の態様の一実施形態では、敗血症に付随する急性腎臓傷害の処置での使用のための
可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号58のアミノ酸配列を含む。
可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号58のアミノ酸配列を含む。
第4の態様の一実施形態では、敗血症に付随する急性腎臓傷害の処置での使用のための
可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号72のアミノ酸配列を含む。
可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号72のアミノ酸配列を含む。
第4の態様の一実施形態では、敗血症に付随する急性腎臓傷害の処置での使用のための
可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号229のアミノ酸配列を含む。
可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号229のアミノ酸配列を含む。
本発明の第5の態様によれば、ヒト対象において組織損傷を処置する方法が提供され、
これは、前記対象に第1の態様による可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与する
ことを含む。本発明の第5の態様の一実施形態は、このような処置を必要とする対象に本
発明の第1の態様による単離アピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、心臓手
術に付随する急性腎臓傷害を処置する方法に関する。
これは、前記対象に第1の態様による可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与する
ことを含む。本発明の第5の態様の一実施形態は、このような処置を必要とする対象に本
発明の第1の態様による単離アピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、心臓手
術に付随する急性腎臓傷害を処置する方法に関する。
本発明の第5の態様の別の実施形態は、このような処置を必要とする対象に本発明の第
1の態様による単離アピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、臓器移植後臓器
機能障害(DGF)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、急性心筋梗塞(AMI)、外傷
性脳傷害(TBI)/急性虚血性発作(AIS)虚血再灌流傷害(IRI)又は多臓器不
全(MOF)と呼ばれることが多いそれらの組み合わせを処置する方法に関する。
1の態様による単離アピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、臓器移植後臓器
機能障害(DGF)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、急性心筋梗塞(AMI)、外傷
性脳傷害(TBI)/急性虚血性発作(AIS)虚血再灌流傷害(IRI)又は多臓器不
全(MOF)と呼ばれることが多いそれらの組み合わせを処置する方法に関する。
第5の態様のある実施形態では、心臓手術に付随する急性腎臓傷害を処置する方法にお
いて使用される可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号58、配列番号72又は配列番号22
9のアミノ酸配列を含む。
いて使用される可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号58、配列番号72又は配列番号22
9のアミノ酸配列を含む。
本発明の第5の態様の一実施形態は、このような処置を必要とする対象に本発明の第1
の態様による単離アピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、敗血症に付随する
急性腎臓傷害を処置する方法に関する。
の態様による単離アピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、敗血症に付随する
急性腎臓傷害を処置する方法に関する。
第5の態様の一実施形態では、敗血症に付随する急性腎臓傷害を処置する方法において
使用される可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号58、配列番号72又は配列番号229の
アミノ酸配列を含む。組織損傷は、急性脳傷害(卒中発作);急性多臓器不全;腎臓又は
他の固形臓器の移植後の臓器移植後臓器機能障害;火傷による損傷;放射線による損傷;
外傷及び/又は低酸素による急性損傷、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)又は肺傷害など
;急性腎臓傷害、例えば胸部手術(例えば大動脈弁置換術、冠動脈バイパス術)又は敗血
症又は横紋筋融解症又は抗生物質若しくは他の薬剤の毒性効果に対する二次的な急性腎臓
傷害など;急性心筋傷害であり得る。
使用される可溶化ヒトアピラーゼは、配列番号58、配列番号72又は配列番号229の
アミノ酸配列を含む。組織損傷は、急性脳傷害(卒中発作);急性多臓器不全;腎臓又は
他の固形臓器の移植後の臓器移植後臓器機能障害;火傷による損傷;放射線による損傷;
外傷及び/又は低酸素による急性損傷、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)又は肺傷害など
;急性腎臓傷害、例えば胸部手術(例えば大動脈弁置換術、冠動脈バイパス術)又は敗血
症又は横紋筋融解症又は抗生物質若しくは他の薬剤の毒性効果に対する二次的な急性腎臓
傷害など;急性心筋傷害であり得る。
本発明の第6の態様によれば、第1の態様による何れかのアピラーゼをコードする単離
核酸分子が提供される。
核酸分子が提供される。
本発明の第7の態様によれば、第6の態様による1つ以上の核酸配列を含むクローニン
グ又は発現ベクターが提供され、ここでこのベクターは、第1の態様による単離アピラー
ゼの組み換え産生に適切である。
グ又は発現ベクターが提供され、ここでこのベクターは、第1の態様による単離アピラー
ゼの組み換え産生に適切である。
本発明の第8の態様によれば、第7の態様による1つ以上のクローニング又は発現ベク
ターを含む宿主細胞が提供される。
ターを含む宿主細胞が提供される。
本発明の第9の態様によれば、第1の態様によるアピラーゼの産生のための工程が提供
され、これは、第8の態様による宿主細胞を培養し、前記アピラーゼを精製して回収する
ことを含む。
され、これは、第8の態様による宿主細胞を培養し、前記アピラーゼを精製して回収する
ことを含む。
本開示はとりわけ、可溶化CD39のある一定の修飾が、驚くべきことに、活性タンパ
ク質をもたらし、その作製が安全且つ容易であるという予想外の知見に基づく。
ク質をもたらし、その作製が安全且つ容易であるという予想外の知見に基づく。
以下の具体例で示されるように、好ましい実施形態は、N末端欠失、C末端欠失及び中
央部欠失からなるリストから選択される少なくとも2つの修飾を有する可溶化ヒトアピラ
ーゼ、例えば配列番号4、配列番号6、配列番号32、配列番号54、配列番号56、配
列番号70、配列番号76及び配列番号78からなる群から選択される配列を含む可溶化
ヒトアピラーゼなどである。
央部欠失からなるリストから選択される少なくとも2つの修飾を有する可溶化ヒトアピラ
ーゼ、例えば配列番号4、配列番号6、配列番号32、配列番号54、配列番号56、配
列番号70、配列番号76及び配列番号78からなる群から選択される配列を含む可溶化
ヒトアピラーゼなどである。
発明者らは、免疫原性上昇のリスク及び従って安全性リスクを上昇させるので過多な修
飾を依然として導入せずに、活性保持、発現される能力の両方を有する可溶化ヒトアピラ
ーゼを獲得するために、いくつかの異なる配列修飾ストラテジーを試みた。驚くべきこと
に、効率及びヒトアピラーゼ発現能の両方を上昇させることが分かった1つの配列修飾は
、同時に過多な免疫原性リスクを付加しない、中央セクションの欠失、所謂デルタMIL
(ΔMIL)修飾であった。
飾を依然として導入せずに、活性保持、発現される能力の両方を有する可溶化ヒトアピラ
ーゼを獲得するために、いくつかの異なる配列修飾ストラテジーを試みた。驚くべきこと
に、効率及びヒトアピラーゼ発現能の両方を上昇させることが分かった1つの配列修飾は
、同時に過多な免疫原性リスクを付加しない、中央セクションの欠失、所謂デルタMIL
(ΔMIL)修飾であった。
本発明の実施形態による可溶化ヒトアピラーゼの発現を上昇させるために、N末端発現
タグを試験した。様々なN末端発現タグが当技術分野で知られているが、驚くべきことに
全てのタグが機能するわけではなかった。発明者らは、予見され得ていなかった数個のタ
グが機能したことを見出した。
タグを試験した。様々なN末端発現タグが当技術分野で知られているが、驚くべきことに
全てのタグが機能するわけではなかった。発明者らは、予見され得ていなかった数個のタ
グが機能したことを見出した。
これらのN末端タグは、配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号
137、配列番号139又は配列番号141であった。本明細書中で示されるように、特
に好ましいタグは、配列番号133、配列番号135又は配列番号137である。
137、配列番号139又は配列番号141であった。本明細書中で示されるように、特
に好ましいタグは、配列番号133、配列番号135又は配列番号137である。
具体的な詳細を以下の実施例9~13で示す。しかし、これらの実施例の非予測可能な
性質を例示するために、比較のまとめを表1で与える。
性質を例示するために、比較のまとめを表1で与える。
1.定義
当業者が本発明を実施し易くするために、この記載全体を通じて次の用語を使用する。
当業者が本発明を実施し易くするために、この記載全体を通じて次の用語を使用する。
「CD39」及び「hCD39」という用語は、本開示全体を通じて同義的に使用され
、別段示されない限り、UniProt P49961又は配列番号1に従うヒト表面抗
原分類39(CD39)を意味する。
、別段示されない限り、UniProt P49961又は配列番号1に従うヒト表面抗
原分類39(CD39)を意味する。
「アピラーゼ」という用語は、別段示されない限り、ヒトアピラーゼを指す。「可溶化
アピラーゼ」は、本明細書中で使用される場合、野生型タンパク質として細胞膜に結合し
て存在するアピラーゼが修飾されており、もはや細胞膜に結合しないようになっているが
、可溶性の状態で存在すること、即ち細胞膜にもはや係留されないことを意味する。
アピラーゼ」は、本明細書中で使用される場合、野生型タンパク質として細胞膜に結合し
て存在するアピラーゼが修飾されており、もはや細胞膜に結合しないようになっているが
、可溶性の状態で存在すること、即ち細胞膜にもはや係留されないことを意味する。
「MIL」という略語は、膜相互作用ループを指し、これには、細胞膜を通じて物理的
に係留されるN末端及びC末端部分に加え、細胞膜と相互作用する野生型(ヒト)CD3
9タンパク質の中央部がある。「デルタMIL」又は「ΔMIL」という用語は、野生型
(ヒト)CD39からのMIL配列の欠失を指す。
に係留されるN末端及びC末端部分に加え、細胞膜と相互作用する野生型(ヒト)CD3
9タンパク質の中央部がある。「デルタMIL」又は「ΔMIL」という用語は、野生型
(ヒト)CD39からのMIL配列の欠失を指す。
「約」という用語は、数値xに関して、例えば+/-10%を意味する。「約」という
用語は、数字範囲又は数の一覧の前に使用する場合、一連の中でそれぞれの数に適用され
、例えば、「約1~5」という句は、「約1~約5」として解釈すべき、又は例えば「約
1、2、3、4」という句は、「約1、約2、約3、約4など」として解釈すべきである
。
用語は、数字範囲又は数の一覧の前に使用する場合、一連の中でそれぞれの数に適用され
、例えば、「約1~5」という句は、「約1~約5」として解釈すべき、又は例えば「約
1、2、3、4」という句は、「約1、約2、約3、約4など」として解釈すべきである
。
「実質的に」という語は、「完全に」を排除せず、例えば「実質的にY不含である」組
成物は、完全にY不含であり得る。必要な場合、「実質的に」という語は、本開示の定義
から省略され得る。
成物は、完全にY不含であり得る。必要な場合、「実質的に」という語は、本開示の定義
から省略され得る。
「含む(comprising)」という用語は、「含む(including)」並
びに「からなる(consisting)」を包含し、例えばXを「含む(compri
sing)」組成物は、独占的にXからなり得るか、又は何かさらなるものを含み得、例
えばX+Yである。
びに「からなる(consisting)」を包含し、例えばXを「含む(compri
sing)」組成物は、独占的にXからなり得るか、又は何かさらなるものを含み得、例
えばX+Yである。
ネイティブポリペプチド及びその機能的誘導体に関する「同一性」は、最大パーセント
同一性を達成するために配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入した後の、配列
同一性の一部として保存的置換を考慮しない、対応するネイティブポリペプチドの残基と
同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書中で定義される。
N又はC末端伸長及び挿入の何れも、同一性を低下させるように解釈されるものはない。
アライメントのための方法及びコンピュータプログラムは周知である。標準的なアライメ
ントアルゴリズム、例えばAltshul et al.((1990)J.Mol.B
iol.,215:403 410)により記載されるBasic Local Ali
gnment Search Tool(BLAST);Needleman et a
l.のアルゴリズム((1970)J.Mol.Biol.,48:444 453);
又はMeyers et al.のアルゴリズム((1988)Comput.Appl
.Biosci.,4:11 17)によってパーセント同一性が決定され得る。一連の
パラメーターは、ギャップペナルティーが12であり、ギャップ伸長ペナルティーが4で
あり、フレームシフトギャップペナルティーが5であるBlosum62スコア行列であ
り得る。2つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間のパーセント同一性はまた、ギャップ長
ペナルティーが12であり、ギャップペナルティーが4であるPAM120ウェイト・レ
ジデュー・テーブル(weight residue table)を使用して、ALI
GNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている、E.Meyers and
W.Miller((1989)CABIOS,4:11-17)のアルゴリズムを使用
して決定され得る。
同一性を達成するために配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入した後の、配列
同一性の一部として保存的置換を考慮しない、対応するネイティブポリペプチドの残基と
同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書中で定義される。
N又はC末端伸長及び挿入の何れも、同一性を低下させるように解釈されるものはない。
アライメントのための方法及びコンピュータプログラムは周知である。標準的なアライメ
ントアルゴリズム、例えばAltshul et al.((1990)J.Mol.B
iol.,215:403 410)により記載されるBasic Local Ali
gnment Search Tool(BLAST);Needleman et a
l.のアルゴリズム((1970)J.Mol.Biol.,48:444 453);
又はMeyers et al.のアルゴリズム((1988)Comput.Appl
.Biosci.,4:11 17)によってパーセント同一性が決定され得る。一連の
パラメーターは、ギャップペナルティーが12であり、ギャップ伸長ペナルティーが4で
あり、フレームシフトギャップペナルティーが5であるBlosum62スコア行列であ
り得る。2つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間のパーセント同一性はまた、ギャップ長
ペナルティーが12であり、ギャップペナルティーが4であるPAM120ウェイト・レ
ジデュー・テーブル(weight residue table)を使用して、ALI
GNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている、E.Meyers and
W.Miller((1989)CABIOS,4:11-17)のアルゴリズムを使用
して決定され得る。
「アミノ酸」は、例えば全ての天然のL-α-アミノ酸を指し、D-アミノ酸を含む。
「アミノ酸配列変異体」という句は、本開示による配列と比較した場合、それらのアミノ
酸配列中でいくつかの相違がある分子を指す。本開示によるタンパク質の、例えば指定さ
れる配列の、アミノ酸配列変異体は、依然としてアピラーゼ活性を有する。アミノ酸配列
変異体は、置換変異体(少なくとも1個のアミノ酸残基が除去され、本開示によるポリペ
プチド中の同じ位置でその場所において異なるアミノ酸が挿入されているもの)、挿入変
異体(1個以上のアミノ酸が本開示によるポリペプチド中の特定の位置のアミノ酸のすぐ
隣に挿入されているもの)及び欠失変異体(1個以上のアミノ酸が本開示によるポリペプ
チド中で除去されているもの)を含む。
「アミノ酸配列変異体」という句は、本開示による配列と比較した場合、それらのアミノ
酸配列中でいくつかの相違がある分子を指す。本開示によるタンパク質の、例えば指定さ
れる配列の、アミノ酸配列変異体は、依然としてアピラーゼ活性を有する。アミノ酸配列
変異体は、置換変異体(少なくとも1個のアミノ酸残基が除去され、本開示によるポリペ
プチド中の同じ位置でその場所において異なるアミノ酸が挿入されているもの)、挿入変
異体(1個以上のアミノ酸が本開示によるポリペプチド中の特定の位置のアミノ酸のすぐ
隣に挿入されているもの)及び欠失変異体(1個以上のアミノ酸が本開示によるポリペプ
チド中で除去されているもの)を含む。
「処置(treatment)」又は「処置する(treat)」という用語は、本明
細書中で、対象への本発明によるアピラーゼの適用若しくは投与又は、対象若しくは対象
由来の単離組織若しくは細胞株への前記アピラーゼを含む医薬組成物の適用若しくは投与
として定義され、この対象には組織損傷、組織損傷に関連する症状があり、目的は、とり
わけ細胞外ATPレベルを低下させることによって、組織損傷又は組織損傷の何らかの関
連症状を、緩和する、寛解させる又は改善することである。
細書中で、対象への本発明によるアピラーゼの適用若しくは投与又は、対象若しくは対象
由来の単離組織若しくは細胞株への前記アピラーゼを含む医薬組成物の適用若しくは投与
として定義され、この対象には組織損傷、組織損傷に関連する症状があり、目的は、とり
わけ細胞外ATPレベルを低下させることによって、組織損傷又は組織損傷の何らかの関
連症状を、緩和する、寛解させる又は改善することである。
「処置(treatment)」とは、対象へのアピラーゼを含む医薬組成物の適用若
しくは投与又は対象由来の単離組織若しくは細胞株への本発明のアピラーゼを含む医薬組
成物の適用若しくは投与も意図し、対象は組織損傷又は組織損傷に関連する症状を有し、
目的は、組織損傷又は組織損傷の何れかの関連症状を、緩和する、寛解させる又は改善す
ることである。
しくは投与又は対象由来の単離組織若しくは細胞株への本発明のアピラーゼを含む医薬組
成物の適用若しくは投与も意図し、対象は組織損傷又は組織損傷に関連する症状を有し、
目的は、組織損傷又は組織損傷の何れかの関連症状を、緩和する、寛解させる又は改善す
ることである。
「防ぐ(prevent)」又は「防ぐこと(preventing)」という用語は
、予防的又は予防の処置を指し;これは、疾患、障害及び/又はそれに付随する症状の発
症を遅らせるか又はその発症を防ぐことに関する。
、予防的又は予防の処置を指し;これは、疾患、障害及び/又はそれに付随する症状の発
症を遅らせるか又はその発症を防ぐことに関する。
本明細書中で使用される場合、対象は、このような対象が生物学的に、医学的に又はク
オリティーオブライフにおいてこのような処置から恩恵を受ける場合、処置を「必要とす
る」。
オリティーオブライフにおいてこのような処置から恩恵を受ける場合、処置を「必要とす
る」。
「薬学的に許容可能な」という用語は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨害しない
無毒性物質を意味する。
無毒性物質を意味する。
本明細書中で使用される場合、対象化合物を「投与(administration)
」又は「投与すること(administering)」という用語は、処置を必要とす
る対象に本発明の化合物及びそのプロドラッグを提供することを意味する。1つ以上のさ
らなる治療剤「と組み合わせた」投与には、何れかの順序及び何れかの投与経路での同時
(同時的)及び連続投与が含まれる。
」又は「投与すること(administering)」という用語は、処置を必要とす
る対象に本発明の化合物及びそのプロドラッグを提供することを意味する。1つ以上のさ
らなる治療剤「と組み合わせた」投与には、何れかの順序及び何れかの投与経路での同時
(同時的)及び連続投与が含まれる。
本明細書中で使用される場合、「治療的有効用量」は、障害又は再発障害の少なくとも
1つの症状を、処置する、防ぐ、その発症を防ぐ、治癒させる、遅らせる、その重症度を
低下させる、寛解させるか、又はこのような処置をせずに予想されるものを超えて患者の
生存を延長させるための、患者(ヒトなど)への単回又は複数回投与時に有効である、ア
ピラーゼの用量(量)を指す。単独で投与される個々の有効成分(例えばアピラーゼ)に
適用される場合、この用語は、その成分のみを指す。組み合わせに適用される場合、この
用語は、組み合わせて、投与が連続的であろうと同時であろうと、治療効果を生じさせる
有効成分の合わせた用量又は量を指す。
1つの症状を、処置する、防ぐ、その発症を防ぐ、治癒させる、遅らせる、その重症度を
低下させる、寛解させるか、又はこのような処置をせずに予想されるものを超えて患者の
生存を延長させるための、患者(ヒトなど)への単回又は複数回投与時に有効である、ア
ピラーゼの用量(量)を指す。単独で投与される個々の有効成分(例えばアピラーゼ)に
適用される場合、この用語は、その成分のみを指す。組み合わせに適用される場合、この
用語は、組み合わせて、投与が連続的であろうと同時であろうと、治療効果を生じさせる
有効成分の合わせた用量又は量を指す。
「投与レジメン」という句は、疾病を処置するために使用されるレジメン、例えば組織
損傷の処置中に使用される投与プロトコールを意味する。
損傷の処置中に使用される投与プロトコールを意味する。
「投与するための手段」という句は、プレフィルドシリンジ、バイアル及びシリンジ、
注射ペン、自動注入装置、静脈(i.v.)点滴及びバッグ、ポンプ、パッチポンプなど
を含むが限定されない、患者に薬物を全身投与するための何らかの利用可能な道具を示す
ために使用される。このような物品を用いて、患者が薬物を自己投与し得る(即ち自分自
身のために薬物を投与する)か又は医師が薬物を投与し得る。
注射ペン、自動注入装置、静脈(i.v.)点滴及びバッグ、ポンプ、パッチポンプなど
を含むが限定されない、患者に薬物を全身投与するための何らかの利用可能な道具を示す
ために使用される。このような物品を用いて、患者が薬物を自己投与し得る(即ち自分自
身のために薬物を投与する)か又は医師が薬物を投与し得る。
2.実施例1:膜遊離型CD39
野生型ヒトアピラーゼCD39(hCD39、UniProt P49961又は配列
番号1)は、N末端の膜貫通ドメイン(推定aa17~37)、中央の推定膜相互作用ル
ープ(MIL推定aa193~204)及びC末端膜貫通ドメイン(推定aa479~4
99)により細胞膜において天然に係留される。哺乳動物宿主細胞を用いてCD39の可
溶性変異体の発現を可能にするため、膜遊離型又は可溶化型タンパク質を得るためにCD
39配列のいくつかのエレメントを修飾した。分泌リーダー及び精製タグ(配列番号13
3)によって、天然のリーダー配列及びN末端膜貫通領域を置換した。発現、精製及び活
性パラメーターを最適化するために、CD39の細胞外ドメインの境界を変動させた(そ
れぞれ配列番号1のアミノ酸番号38~476、配列番号1のアミノ酸番号39~469
、配列番号1のアミノ酸46~461及び配列番号1のアミノ酸46~476)。システ
インをアラニンにより置換することによって、又はジスルフィド架橋により作られるルー
プを短縮することによって、凝集傾向及び酵素活性に対するシステイン及びジスルフィド
架橋の影響を体系的に評価した(配列番号107、109、111、113及び115)
。疎水性アミノ酸のストレッチはラットCD39の構造研究に記載され(Zebisch
et al,J.Mol.Biol.(2012),415,288-306,野生型
ラットCD39,Uniprot P97687、配列番号2で示される)、このループ
は細胞膜(MIL)と相互作用し得ると考えられる。発明者らは、配列アライメントによ
りヒトCD39配列に対する知見を置き換えて、ループ欠失(CD39ΔMIL又はEP
28、配列番号4で示されるとおり)を有するCD39変異体を作製した。機能的CD3
9の発現レベル及び熱安定性に対するMILの欠失(又はデルタ/Δ)の影響を評価した
。
野生型ヒトアピラーゼCD39(hCD39、UniProt P49961又は配列
番号1)は、N末端の膜貫通ドメイン(推定aa17~37)、中央の推定膜相互作用ル
ープ(MIL推定aa193~204)及びC末端膜貫通ドメイン(推定aa479~4
99)により細胞膜において天然に係留される。哺乳動物宿主細胞を用いてCD39の可
溶性変異体の発現を可能にするため、膜遊離型又は可溶化型タンパク質を得るためにCD
39配列のいくつかのエレメントを修飾した。分泌リーダー及び精製タグ(配列番号13
3)によって、天然のリーダー配列及びN末端膜貫通領域を置換した。発現、精製及び活
性パラメーターを最適化するために、CD39の細胞外ドメインの境界を変動させた(そ
れぞれ配列番号1のアミノ酸番号38~476、配列番号1のアミノ酸番号39~469
、配列番号1のアミノ酸46~461及び配列番号1のアミノ酸46~476)。システ
インをアラニンにより置換することによって、又はジスルフィド架橋により作られるルー
プを短縮することによって、凝集傾向及び酵素活性に対するシステイン及びジスルフィド
架橋の影響を体系的に評価した(配列番号107、109、111、113及び115)
。疎水性アミノ酸のストレッチはラットCD39の構造研究に記載され(Zebisch
et al,J.Mol.Biol.(2012),415,288-306,野生型
ラットCD39,Uniprot P97687、配列番号2で示される)、このループ
は細胞膜(MIL)と相互作用し得ると考えられる。発明者らは、配列アライメントによ
りヒトCD39配列に対する知見を置き換えて、ループ欠失(CD39ΔMIL又はEP
28、配列番号4で示されるとおり)を有するCD39変異体を作製した。機能的CD3
9の発現レベル及び熱安定性に対するMILの欠失(又はデルタ/Δ)の影響を評価した
。
配列番号1及び配列番号4の配列アライメントを示す図1で見られ得るように、CD3
9ΔMIL(配列番号4)を形成させるために、N末端アミノ酸1~27、C末端アミノ
酸477~510及び中央膜相互作用ループ(MIL)アミノ酸193~204をwtC
D39(配列番号1)から欠失させた。
9ΔMIL(配列番号4)を形成させるために、N末端アミノ酸1~27、C末端アミノ
酸477~510及び中央膜相互作用ループ(MIL)アミノ酸193~204をwtC
D39(配列番号1)から欠失させた。
熱安定性に対する異なる配列修飾の影響を研究した。さらに、CHO細胞発現収率及び
単量体の含量に対する異なる配列修飾の影響を研究した。
単量体の含量に対する異なる配列修飾の影響を研究した。
(1)方法
(a)発現プラスミドの作製
異なるhCD39境界変異体及び膜相互作用ループ(MIL)欠失をコードするDNA
配列は、ホモサピエンスに対するコドン最適性を含めGeneArt(Life Tec
hnologies Inc.Regensburg,Germany)に注文した。h
CD39変異体をコードする配列は、GeneArt由来ベクター又は内部で作製された
その変異体から哺乳動物細胞中での分泌に適切な発現ベクターへと、標準的な分子生物学
的技術によりサブクローニングした。修飾されたオリゴヌクレオチドによってシステイン
架橋欠失変異体中に存在するシステインからアラニンへの突然変異を標的とし、続くアセ
ンブリーPCR段階後に、作製された断片を前に言及した同じ発現ベクターにサブクロー
ニングした。発現ベクターのエレメントとしては、プロモーター(サイトメガロウイルス
(CMV)エンハンサー-プロモーター)、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリア
デニル化シグナル及び転写終結因子(ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子)、エピソーム
複製及び原核生物における複製を可能にするエレメント(例えばSV40起点及びCol
E1又は当技術分野で公知の他のもの)及び選択を可能にするためのエレメント(アンピ
シリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー)が挙げられる。短縮型可溶化ヒトCD39バー
ジョンのリストを表2で例示し、配列番号1を基準にしてアミノ酸修飾を付番した。
(a)発現プラスミドの作製
異なるhCD39境界変異体及び膜相互作用ループ(MIL)欠失をコードするDNA
配列は、ホモサピエンスに対するコドン最適性を含めGeneArt(Life Tec
hnologies Inc.Regensburg,Germany)に注文した。h
CD39変異体をコードする配列は、GeneArt由来ベクター又は内部で作製された
その変異体から哺乳動物細胞中での分泌に適切な発現ベクターへと、標準的な分子生物学
的技術によりサブクローニングした。修飾されたオリゴヌクレオチドによってシステイン
架橋欠失変異体中に存在するシステインからアラニンへの突然変異を標的とし、続くアセ
ンブリーPCR段階後に、作製された断片を前に言及した同じ発現ベクターにサブクロー
ニングした。発現ベクターのエレメントとしては、プロモーター(サイトメガロウイルス
(CMV)エンハンサー-プロモーター)、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリア
デニル化シグナル及び転写終結因子(ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子)、エピソーム
複製及び原核生物における複製を可能にするエレメント(例えばSV40起点及びCol
E1又は当技術分野で公知の他のもの)及び選択を可能にするためのエレメント(アンピ
シリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー)が挙げられる。短縮型可溶化ヒトCD39バー
ジョンのリストを表2で例示し、配列番号1を基準にしてアミノ酸修飾を付番した。
(b)hCD39変異体のマイクロスケール発現
血清非存在下でのタンパク質の一過性発現のための好ましい宿主細胞株の1つとしてマ
イクロスケール実験のために293-6E細胞(参照により本明細書中に組み込まれる国
際公開第2006096989A2号パンフレットで開示されるとおり)を選択した。遺
伝子移入試薬としてFuGene HD(Roche Applied Science
,Cat.No.04709705001)を使用して、遺伝子移入を行った。遺伝子移
入及び細胞の増殖のために、V3血清不含培地(Bioconcept,Cat.No.
V3-K)を使用した懸濁培養において293-6E細胞を培養した。5%CO2で加湿
インキュベーターにおいてオービタル振盪機(100~120rpm)上、Cornin
g振盪フラスコ(Corning,Tewksbury,MA)中で細胞を増殖させた(
シードフラスコ)。シード培養物中の細胞は、指数増殖期で維持し(5x105~3x1
06/mLの細胞密度)、遺伝子移入に対する>90%の生存能を示すべきである。細胞
密度がこの範囲外であると、希釈後に遅滞期となるか又は遺伝子移入効率が低下するかの
何れかが起こる。
血清非存在下でのタンパク質の一過性発現のための好ましい宿主細胞株の1つとしてマ
イクロスケール実験のために293-6E細胞(参照により本明細書中に組み込まれる国
際公開第2006096989A2号パンフレットで開示されるとおり)を選択した。遺
伝子移入試薬としてFuGene HD(Roche Applied Science
,Cat.No.04709705001)を使用して、遺伝子移入を行った。遺伝子移
入及び細胞の増殖のために、V3血清不含培地(Bioconcept,Cat.No.
V3-K)を使用した懸濁培養において293-6E細胞を培養した。5%CO2で加湿
インキュベーターにおいてオービタル振盪機(100~120rpm)上、Cornin
g振盪フラスコ(Corning,Tewksbury,MA)中で細胞を増殖させた(
シードフラスコ)。シード培養物中の細胞は、指数増殖期で維持し(5x105~3x1
06/mLの細胞密度)、遺伝子移入に対する>90%の生存能を示すべきである。細胞
密度がこの範囲外であると、希釈後に遅滞期となるか又は遺伝子移入効率が低下するかの
何れかが起こる。
マイクロスケール(0.5mL)遺伝子移入の場合、細胞のアリコートをシード培養か
ら採取し、V3血清不含培地中で細胞0.5x106個/mLに調整した。14μLのV
3血清不含培地中で0.5μgのhCD39発現プラスミドを希釈することによって、D
NA溶液(溶液1と呼ばれる)を調製し、次に2.3μLのFuGene HD溶液も1
4μLのV3血清不含培地中で希釈した(溶液2)。室温(RT)で5~10分間、両溶
液を温置した。その後、穏やかに混合しながら溶液2を溶液1に添加し、室温でさらに5
~15分間温置した。次に、48ウェル組織培養プレート(Corning,Tewks
bury,MA)中で播種される0.5x106個細胞/mLの0.5mLの細胞に遺伝
子移入混合液を添加し、5%CO2で加湿インキュベーター中のオービタル振盪機(30
0rpm)上にプレートを置いた。4℃にて10分間にわたり4000rpmの遠心分離
を行うことによって、遺伝子移入から3日後に培養物を回収した(Heraeus,Mu
ltifuge 3 S-R,Thermo Scientific,Rockford
,IL)。さらなる処理まで、回収した細胞上清を4℃で保管した。
ら採取し、V3血清不含培地中で細胞0.5x106個/mLに調整した。14μLのV
3血清不含培地中で0.5μgのhCD39発現プラスミドを希釈することによって、D
NA溶液(溶液1と呼ばれる)を調製し、次に2.3μLのFuGene HD溶液も1
4μLのV3血清不含培地中で希釈した(溶液2)。室温(RT)で5~10分間、両溶
液を温置した。その後、穏やかに混合しながら溶液2を溶液1に添加し、室温でさらに5
~15分間温置した。次に、48ウェル組織培養プレート(Corning,Tewks
bury,MA)中で播種される0.5x106個細胞/mLの0.5mLの細胞に遺伝
子移入混合液を添加し、5%CO2で加湿インキュベーター中のオービタル振盪機(30
0rpm)上にプレートを置いた。4℃にて10分間にわたり4000rpmの遠心分離
を行うことによって、遺伝子移入から3日後に培養物を回収した(Heraeus,Mu
ltifuge 3 S-R,Thermo Scientific,Rockford
,IL)。さらなる処理まで、回収した細胞上清を4℃で保管した。
(c)マイクロスケール発現上清におけるウエスタンブロット分析
組み換えhCD39変異体の発現及び正しい形成を調べるために、マイクロスケール発
現上清においてウエスタンブロット分析を行った。E-PAGE(商標)ローディング緩
衝液(4x,Invitrogen,#EPBNF-01)中で8μLの上清を希釈し、
非還元条件のE-Page48、8%ゲル(Invitrogen,#EP04808)
上に載せた。E-baseマザー装置(mother device)(Invitro
gen)上で23分間ゲルを泳動し、製造者の説明書に従い、iBlot system
(Invitrogen)を使用して、タンパク質をニトロセルロース膜(Invitr
ogen IB301001)に転写した(7min稼働)。TBS/0.05Twee
n20(TBST)中で3回洗浄した後、穏やかに撹拌しながら5%ミルク/TBSTと
ともに膜を1時間温置し、続いて2%ミルク/TBST中で希釈した抗APPマウス抗体
の4μg/mL溶液(Novartis内部で、タンパク質タグ付加のために使用したア
ミロイド前駆体タンパク質(APP)のペプチドストレッチに対して抗体を作製)ととも
に1時間温置した。さらなる3回の洗浄段階後、2%ミルク/TBST中で希釈した抗マ
ウスIgG-アルカリホスファターゼ(Sigma-Aldrich、A5153-1M
L)の1:1000希釈液とともに膜を温置し、TBST中で再び3回洗浄し、続いてT
BS中ですすぎ段階を行った。製造者の説明書に従いSIGMAFAST(商標)BCI
P(登録商標)/NBT(Sigma-Aldrich,#B5655-25TAB)を
使用して1~5分間シグナルを発色させ、水で膜をすすぐことによってシグナルを停止さ
せた。
組み換えhCD39変異体の発現及び正しい形成を調べるために、マイクロスケール発
現上清においてウエスタンブロット分析を行った。E-PAGE(商標)ローディング緩
衝液(4x,Invitrogen,#EPBNF-01)中で8μLの上清を希釈し、
非還元条件のE-Page48、8%ゲル(Invitrogen,#EP04808)
上に載せた。E-baseマザー装置(mother device)(Invitro
gen)上で23分間ゲルを泳動し、製造者の説明書に従い、iBlot system
(Invitrogen)を使用して、タンパク質をニトロセルロース膜(Invitr
ogen IB301001)に転写した(7min稼働)。TBS/0.05Twee
n20(TBST)中で3回洗浄した後、穏やかに撹拌しながら5%ミルク/TBSTと
ともに膜を1時間温置し、続いて2%ミルク/TBST中で希釈した抗APPマウス抗体
の4μg/mL溶液(Novartis内部で、タンパク質タグ付加のために使用したア
ミロイド前駆体タンパク質(APP)のペプチドストレッチに対して抗体を作製)ととも
に1時間温置した。さらなる3回の洗浄段階後、2%ミルク/TBST中で希釈した抗マ
ウスIgG-アルカリホスファターゼ(Sigma-Aldrich、A5153-1M
L)の1:1000希釈液とともに膜を温置し、TBST中で再び3回洗浄し、続いてT
BS中ですすぎ段階を行った。製造者の説明書に従いSIGMAFAST(商標)BCI
P(登録商標)/NBT(Sigma-Aldrich,#B5655-25TAB)を
使用して1~5分間シグナルを発色させ、水で膜をすすぐことによってシグナルを停止さ
せた。
(d)固相AxPaseアッセイ
マイクロスケール発現上清からのプレート捕捉hCD39変異体に対してPi Col
orLock Goldリン酸検出系(Innova Biosciences,cat
n.303-0030)を使用して、ATPase、ADPase及びAMPase活
性を判定した(固相Axpaseアッセイ)。この方法は、製造者により推奨される溶液
に基づくアッセイ(液相Axpaseアッセイ)と比較して感度がより低いことが分かっ
たが、マイクロスケール発現上清中に存在する可能性がある宿主細胞酵素が介在するAx
Pase活性を低下させるという長所がある。PBS中で希釈した20μLの抗APPマ
ウス抗体10μg/mL溶液抗体(Novartis内部で、タンパク質タグ付加のため
に使用されるアミロイド前駆体タンパク質(APP)のペプチドストレッチに対して作製
された抗体)をmaxisorp 384ウェルクリアプレート(Nunc)の各ウェル
に添加し、4℃で一晩温置した。TBSTで3回洗浄した後、穏やかに撹拌しながら室温
で100μLの5%ミルク/TBSTを使用してウェルを1時間ブロッキング処理した。
さらなる3回の洗浄段階後、2%ミルク/TBST中の20μLの連続希釈マイクロスケ
ール発現上清を3つ組でウェルに添加し、穏やかに撹拌しながら室温で2時間温置した。
次に、ウェルを再び、100μLのTBSTで4回及び80μLの50mM Tris-
Cl/5mM MgCl2 pH7.5で2回洗浄した。50mM Tris-Cl/5
mM MgCl2 pH7.5(ATP:SIGMA A2383、ADP:SIGMA
A2754)中で希釈した30μLの80μMアデノシンリン酸溶液をそれぞれ3つ組
で添加し、37℃で24時間温置した。製造者の説明書に従い調製した7.5μLのGo
ld試薬混合液を使用して10分間にわたりシグナルを発色させ、3μLの安定化剤を使
用して反応を停止させた。TECAN Genios Pro機器を使用して620nm
での吸収を読み取った。
マイクロスケール発現上清からのプレート捕捉hCD39変異体に対してPi Col
orLock Goldリン酸検出系(Innova Biosciences,cat
n.303-0030)を使用して、ATPase、ADPase及びAMPase活
性を判定した(固相Axpaseアッセイ)。この方法は、製造者により推奨される溶液
に基づくアッセイ(液相Axpaseアッセイ)と比較して感度がより低いことが分かっ
たが、マイクロスケール発現上清中に存在する可能性がある宿主細胞酵素が介在するAx
Pase活性を低下させるという長所がある。PBS中で希釈した20μLの抗APPマ
ウス抗体10μg/mL溶液抗体(Novartis内部で、タンパク質タグ付加のため
に使用されるアミロイド前駆体タンパク質(APP)のペプチドストレッチに対して作製
された抗体)をmaxisorp 384ウェルクリアプレート(Nunc)の各ウェル
に添加し、4℃で一晩温置した。TBSTで3回洗浄した後、穏やかに撹拌しながら室温
で100μLの5%ミルク/TBSTを使用してウェルを1時間ブロッキング処理した。
さらなる3回の洗浄段階後、2%ミルク/TBST中の20μLの連続希釈マイクロスケ
ール発現上清を3つ組でウェルに添加し、穏やかに撹拌しながら室温で2時間温置した。
次に、ウェルを再び、100μLのTBSTで4回及び80μLの50mM Tris-
Cl/5mM MgCl2 pH7.5で2回洗浄した。50mM Tris-Cl/5
mM MgCl2 pH7.5(ATP:SIGMA A2383、ADP:SIGMA
A2754)中で希釈した30μLの80μMアデノシンリン酸溶液をそれぞれ3つ組
で添加し、37℃で24時間温置した。製造者の説明書に従い調製した7.5μLのGo
ld試薬混合液を使用して10分間にわたりシグナルを発色させ、3μLの安定化剤を使
用して反応を停止させた。TECAN Genios Pro機器を使用して620nm
での吸収を読み取った。
(2)結果
(a)hCD39発現レベルに対する境界、膜相互作用ループ(MIL)欠失及びシステ
イン架橋欠失の影響
異なるhCD39変異体の発現レベルを評価するために、0.5mLの293-6E細
胞において対応する発現プラスミドを2つ組で遺伝子移入し、遺伝子移入の3日後に回収
した上清においてウエスタンブロット(抗APP検出Ab)を行った。結果を図2A及び
図2Bで例示する。
(a)hCD39発現レベルに対する境界、膜相互作用ループ(MIL)欠失及びシステ
イン架橋欠失の影響
異なるhCD39変異体の発現レベルを評価するために、0.5mLの293-6E細
胞において対応する発現プラスミドを2つ組で遺伝子移入し、遺伝子移入の3日後に回収
した上清においてウエスタンブロット(抗APP検出Ab)を行った。結果を図2A及び
図2Bで例示する。
結果は、aa46と比較して、aa38で開始するhCD39のより高い発現レベルを
示す。N末端境界並びにMIL欠失は、発現レベルに対して大きな影響がないと思われる
。hCD39(aa46-461)の状況下で第1又は第4のシステイン架橋が欠失して
いるhCD39のより高い発現レベルも観察された。hCD39(aa46-461)Δ
MIL骨格も使用して、第1のシステイン架橋欠失のより高い発現レベルを確認した。
示す。N末端境界並びにMIL欠失は、発現レベルに対して大きな影響がないと思われる
。hCD39(aa46-461)の状況下で第1又は第4のシステイン架橋が欠失して
いるhCD39のより高い発現レベルも観察された。hCD39(aa46-461)Δ
MIL骨格も使用して、第1のシステイン架橋欠失のより高い発現レベルを確認した。
hCD39活性に対する境界、膜相互作用ループ(MIL)欠失及びシステイン架橋欠
失の影響
上記上清試料において固相AxPaseアッセイによってCD39酵素活性を測定した
。結果を図3及び図4並びに表3で例示する。
失の影響
上記上清試料において固相AxPaseアッセイによってCD39酵素活性を測定した
。結果を図3及び図4並びに表3で例示する。
MILの欠失により、機能的に発現されるCD39組み換えタンパク質の割合が増加す
ると思われる。境界が異なることにより、活性のあるhCD39活性に対して大きな影響
は示されない。結果は、システイン架橋欠失変異体全てのATPase活性の強い低下又
は完全な消失を示す。固相ADPaseアッセイを使用して同様の結果を得た。従って、
驚くべきことにCD39発現効率及びCD39発現能力を両方とも上昇させる配列修飾は
デルタMIL(ΔMIL)修飾である。
ると思われる。境界が異なることにより、活性のあるhCD39活性に対して大きな影響
は示されない。結果は、システイン架橋欠失変異体全てのATPase活性の強い低下又
は完全な消失を示す。固相ADPaseアッセイを使用して同様の結果を得た。従って、
驚くべきことにCD39発現効率及びCD39発現能力を両方とも上昇させる配列修飾は
デルタMIL(ΔMIL)修飾である。
3.実施例2:発現タグ
候補の発現特性を向上させるために、様々な発現タグを試験した。
候補の発現特性を向上させるために、様々な発現タグを試験した。
表4で示されるように、IL-2のN末端部分に基づく異なる発現タグ(配列番号13
1)を試験した。配列番号131による発現タグ1-16aaはGeneartにより合
成された。
1)を試験した。配列番号131による発現タグ1-16aaはGeneartにより合
成された。
配列番号4で示されるようにCD39ΔMILに関して全ての発現タグを試験した。コ
ンストラクト全てがAPPタグ及びHisタグを含んだ。
ンストラクト全てがAPPタグ及びHisタグを含んだ。
図5で示されるように、ベクターpRS5aを発現のために使用した。プライマー対を
表4で示した。
表4で示した。
アニーリング温度は全例で64℃であった。
1μL鋳型DNA保存液、25μL Kapa Hifi Hotstartポリメラ
ーゼ(kappa Biosystems/KK2602より)、1.5μLフォワード
プライマー、1.5μLリバースプライマーを混合し、H2Oで50μLまで最終体積を
調整することによってPCR溶液を調製した。
ーゼ(kappa Biosystems/KK2602より)、1.5μLフォワード
プライマー、1.5μLリバースプライマーを混合し、H2Oで50μLまで最終体積を
調整することによってPCR溶液を調製した。
表5のスケジュールに従いPCR反応を行った。
PCR反応の完了後、製造者の説明書に従い、Wizard(登録商標)SV Gel
及びPCR Clean-Up Kit,Promega,No.9282、1カラム、
30μL中での溶出を使用してDNA抽出を行った。
及びPCR Clean-Up Kit,Promega,No.9282、1カラム、
30μL中での溶出を使用してDNA抽出を行った。
CutSmart(R)緩衝液中でNew England Biolabs(NEB
)、NruI-HF(NEB#R3192)及びNotI-HF(NEB#R3189)
により供給された酵素で挿入物及びベクターを切断した。反応時間は37℃で3時間であ
った。
)、NruI-HF(NEB#R3192)及びNotI-HF(NEB#R3189)
により供給された酵素で挿入物及びベクターを切断した。反応時間は37℃で3時間であ
った。
生産者の有効なプロトコールに従い、迅速DNA脱リン酸化及びライゲーションキット
、Fa.Roche,No.04898117001とともに脱リン酸化ベクターを用い
てライゲーションを一晩行った。
、Fa.Roche,No.04898117001とともに脱リン酸化ベクターを用い
てライゲーションを一晩行った。
翌日、フォワードプライマーP270(配列番号165)及びリバースプライマーP2
71(配列番号166)を用いたDNA-Miniprep及び配列分析のために単コロ
ニーを拾った。
71(配列番号166)を用いたDNA-Miniprep及び配列分析のために単コロ
ニーを拾った。
さらに、表6に従って、発現を上昇させることが当技術分野で知られる数個のタンパク
質配列を試験した。
質配列を試験した。
試験した、得られた組み合わせを表7で示す。
タンパク質(データは示さない)の発現をもたらした表6からの先行技術タグはなかっ
た。先行技術はこれらの配列が発現を上昇させるはずであることを教示するので、これは
予想外であった。
た。先行技術はこれらの配列が発現を上昇させるはずであることを教示するので、これは
予想外であった。
4.実施例3:さらなる突然変異
可溶性CD39の特徴を改善し、薬物開発に適切にするために、配列番号4で示される
、CD39ΔMIL、EP28においてさらなる修飾を導入した。異なる突然変異及び突
然変異した変異体は、表8で見られ、配列番号1で示されるような野生型CD39のアミ
ノ酸位置に従い付番する。
可溶性CD39の特徴を改善し、薬物開発に適切にするために、配列番号4で示される
、CD39ΔMIL、EP28においてさらなる修飾を導入した。異なる突然変異及び突
然変異した変異体は、表8で見られ、配列番号1で示されるような野生型CD39のアミ
ノ酸位置に従い付番する。
活性部位中の2つの突然変異は、より高い活性につながる(365及び412)。
5.実施例4:グリコシル化部位除去
上のEP14変異体に基づき、表9による点突然変異を導入することによってグリコシ
ル化部位の効果を調べ、配列番号1で示されるような野生型CD39のアミノ酸位置に従
い付番する。
上のEP14変異体に基づき、表9による点突然変異を導入することによってグリコシ
ル化部位の効果を調べ、配列番号1で示されるような野生型CD39のアミノ酸位置に従
い付番する。
(a)材料及び方法
クローニングのために発現ベクターpRS5a(図5)を使用した。表10で示される
ようにプライマーを使用した。
クローニングのために発現ベクターpRS5a(図5)を使用した。表10で示される
ようにプライマーを使用した。
製造者の説明書に従い、PCRのためにQuikChange Lightning
Site-directed Mutagenesis Kit(Agilent,No
.210519-5)を使用した。
Site-directed Mutagenesis Kit(Agilent,No
.210519-5)を使用した。
翌日、DNA-Miniprepのために単コロニーを拾い、フォワードプライマーP
270(配列番号165)及びリバースプライマーP271(配列番号166)を用いて
配列分析を行った。
270(配列番号165)及びリバースプライマーP271(配列番号166)を用いて
配列分析を行った。
(突然変異誘発による)ベクター骨格の精度も確実にするために、次の方法を使用して
、pRS5aの新しいベクター骨格(図5)に、配列決定した挿入断片をクローニングし
た。
、pRS5aの新しいベクター骨格(図5)に、配列決定した挿入断片をクローニングし
た。
APP_HIS-Tag、保存濃縮液3.3μg/μLを含有する、発現タグ配列番号
135とともに配列番号36のベクター骨格を使用して、ベクターを調製した。
135とともに配列番号36のベクター骨格を使用して、ベクターを調製した。
50μLの最終体積まで10μgベクター-DNA、0.4μL HindIII(1
00U/μL、NEB)、2μL EcoRI(20U/μL、NEB)、5μL Cu
tsmart緩衝液10xconc.(NEB)、H2Oを混合することによって、ベク
ターを消化した。37℃で3時間消化を行った。
00U/μL、NEB)、2μL EcoRI(20U/μL、NEB)、5μL Cu
tsmart緩衝液10xconc.(NEB)、H2Oを混合することによって、ベク
ターを消化した。37℃で3時間消化を行った。
アルカリホスファターゼ、子牛腸(CIP,NEB,No.M0290L)、10U/
μLを用いて脱リン酸化を行った。消化の直後、消化したベクターに3μLのCIPを添
加し、37℃で30分間温置した。消化し、脱リン酸化したベクターを分取0.8%TA
Eアガロースゲル上に載せ、約6100bpのベクターの妥当なバンドサイズを切り出し
た。Wizard(登録商標)SV Gel及びPCR Clean-Up Kit,P
romega,No.9282、1カラムを用いて、100μLの溶出で、クリーンアッ
プを行った。OD260nmは64ng/μLの濃度を示した。
μLを用いて脱リン酸化を行った。消化の直後、消化したベクターに3μLのCIPを添
加し、37℃で30分間温置した。消化し、脱リン酸化したベクターを分取0.8%TA
Eアガロースゲル上に載せ、約6100bpのベクターの妥当なバンドサイズを切り出し
た。Wizard(登録商標)SV Gel及びPCR Clean-Up Kit,P
romega,No.9282、1カラムを用いて、100μLの溶出で、クリーンアッ
プを行った。OD260nmは64ng/μLの濃度を示した。
42.5μLのDNA(各DNAに対して約3~5μg)、5μL Cutsmart
緩衝液、10xconc.、NEB no B7204S、0.4μL HindIII
-HF、100U/μL、NEB no.R3104S、2μL EcoRI-HF、2
0U/μL、NEB no.R3103Lを混合し、体積をH2Oで50μLに調整する
ことによって、突然変異挿入断片の消化を行った。PCR機器中で37℃にて3時間、消
化を行った。分取0.8%TAEアガロースゲルに、消化した挿入物を載せ、約1400
bpのベクターの妥当なバンドサイズを切り出した。Wizard(登録商標)SV G
el及びPCR Clean-Up Kit,Promega,No.9282、1カラ
ムを用いて、30μLの溶出で、クリーンアップを行った。OD260nmは1~25n
g/μLの濃度を示した。
緩衝液、10xconc.、NEB no B7204S、0.4μL HindIII
-HF、100U/μL、NEB no.R3104S、2μL EcoRI-HF、2
0U/μL、NEB no.R3103Lを混合し、体積をH2Oで50μLに調整する
ことによって、突然変異挿入断片の消化を行った。PCR機器中で37℃にて3時間、消
化を行った。分取0.8%TAEアガロースゲルに、消化した挿入物を載せ、約1400
bpのベクターの妥当なバンドサイズを切り出した。Wizard(登録商標)SV G
el及びPCR Clean-Up Kit,Promega,No.9282、1カラ
ムを用いて、30μLの溶出で、クリーンアップを行った。OD260nmは1~25n
g/μLの濃度を示した。
Rapid DNA Ligation Kit,No.K1423,Fa.Ther
mo Scientificとともに(ベクター:挿入比約1:10)を使用してライゲ
ーションを行った。4μL 5xライゲーション緩衝液を1μLリガーゼ、2μLベクタ
ー断片、HindIII/EcoRI消化、保存濃縮液64ng/μL、13μL挿入断
片、HindIII/EcoRI消化、保存濃縮液1~25ng/μLと混合した。RT
で10分間、ライゲーションを行った。
mo Scientificとともに(ベクター:挿入比約1:10)を使用してライゲ
ーションを行った。4μL 5xライゲーション緩衝液を1μLリガーゼ、2μLベクタ
ー断片、HindIII/EcoRI消化、保存濃縮液64ng/μL、13μL挿入断
片、HindIII/EcoRI消化、保存濃縮液1~25ng/μLと混合した。RT
で10分間、ライゲーションを行った。
氷上での30分間にわたる80μL化学コンピーテントXL1Blue細胞(Nova
rtis,FS/RL)との10μLライゲーション物の温置によって形質転換を行った
。Eppendorfインキュベーター中で42℃にて45秒間の熱ショックを行い、続
いて氷上で2分間温置した。その後、1mL 2YT培地を添加し、続いてEppend
orf振盪機(800rpm)上で37℃にて1.5時間温置した。7000rpmで3
分間、細胞を遠心分離し、LB/Carb/Gluc上にコロニーを蒔いた。続いてプレ
ートを37℃で一晩温置した。
rtis,FS/RL)との10μLライゲーション物の温置によって形質転換を行った
。Eppendorfインキュベーター中で42℃にて45秒間の熱ショックを行い、続
いて氷上で2分間温置した。その後、1mL 2YT培地を添加し、続いてEppend
orf振盪機(800rpm)上で37℃にて1.5時間温置した。7000rpmで3
分間、細胞を遠心分離し、LB/Carb/Gluc上にコロニーを蒔いた。続いてプレ
ートを37℃で一晩温置した。
翌日、DNA-Miniprepのために単コロニーを拾い、フォワードプライマーP
270(配列番号165)及びリバースプライマーP271(配列番号166)を使用し
て配列分析を行った。
270(配列番号165)及びリバースプライマーP271(配列番号166)を使用し
て配列分析を行った。
7日間の発現により、200mLスケールで、妥当な配列をHEK293細胞に遺伝子
移入した。
移入した。
次の材料を使用した:
SV40ラージT抗原(HEK293-T)を構成的に発現するヒト胚腎臓細胞、例え
ばATCC11268
ポリエチレンイミン”MAX”MW40.000(PEI)(Polyscience
s,Cat.24765)、RTにてH20中で溶解し、NaOHでpH7.05に調整
。
M11V3血清不含培地(Bioconcept,CH,Cat:V3-K)
DNA:供給者により推奨されるプロトコールに従い、Qiagen DNA Kit
、Midiprep-Kit(No.12943)を用いて調製。
SV40ラージT抗原(HEK293-T)を構成的に発現するヒト胚腎臓細胞、例え
ばATCC11268
ポリエチレンイミン”MAX”MW40.000(PEI)(Polyscience
s,Cat.24765)、RTにてH20中で溶解し、NaOHでpH7.05に調整
。
M11V3血清不含培地(Bioconcept,CH,Cat:V3-K)
DNA:供給者により推奨されるプロトコールに従い、Qiagen DNA Kit
、Midiprep-Kit(No.12943)を用いて調製。
一過性遺伝子移入のための細胞培養作業は全て、血清不含M11V3培地中で増殖させ
た懸濁適合HEK293-T細胞を使用して行う。
た懸濁適合HEK293-T細胞を使用して行う。
5%CO2の加湿CO2-インキュベーターにおいてオービタル振盪機(115rpm
)上でCorning振盪フラスコ(Corning,USA)中で細胞を増殖させる(
シードフラスコ)。
)上でCorning振盪フラスコ(Corning,USA)中で細胞を増殖させる(
シードフラスコ)。
使用される細胞は指数増殖期になっており(5x105~3x106/mLの細胞密度
)、>90%の生存能であった。
)、>90%の生存能であった。
数を数えた細胞を使用して、小スケール(ここでは20/50又は100mL)で遺伝
子移入を行い、細胞の対応する量をM11V3培地で細胞1.4x106個/mLに調整
した。最終遺伝子移入体積の36%細胞懸濁液を使用する。
子移入を行い、細胞の対応する量をM11V3培地で細胞1.4x106個/mLに調整
した。最終遺伝子移入体積の36%細胞懸濁液を使用する。
7%最終体積M11V3中で1mg/L最終体積DNAを希釈し、穏やかに混合するこ
とによって、DNA溶液(溶液1)を調製する。非滅菌ろ過DNAなので培養物の汚染を
防ぐために、フィーディング後、Penc./Strepを遺伝子移入物に添加した。次
に、7%最終体積M11V3中で3mg/L最終体積PEI溶液を希釈し、穏やかに混合
する(溶液2)。5~10分にわたり室温(RT)で両溶液を温置する。その後、穏やか
に混合しながら溶液2を溶液1に添加し、RTでさらに5~15分間温置する。温置後、
遺伝子移入混合物を細胞に添加し、培養物を4時間培養する(115rpm、37℃、5
%CO2)。
とによって、DNA溶液(溶液1)を調製する。非滅菌ろ過DNAなので培養物の汚染を
防ぐために、フィーディング後、Penc./Strepを遺伝子移入物に添加した。次
に、7%最終体積M11V3中で3mg/L最終体積PEI溶液を希釈し、穏やかに混合
する(溶液2)。5~10分にわたり室温(RT)で両溶液を温置する。その後、穏やか
に混合しながら溶液2を溶液1に添加し、RTでさらに5~15分間温置する。温置後、
遺伝子移入混合物を細胞に添加し、培養物を4時間培養する(115rpm、37℃、5
%CO2)。
発現の7日後に上清を回収した。
遠心分離4500rpm.、15min.、4℃(Heraeus,Multifug
e 3 S-R)
e 3 S-R)
滅菌ろ過、0.22μm(Stericup filter,Thermo Scie
ntific,Cat.567-0020))を通じて清澄化。
ntific,Cat.567-0020))を通じて清澄化。
さらなる段階のために上清を精製に送る。Open Access APP-カラム上
でIPCに対して上清の1mL試料を使用する。
でIPCに対して上清の1mL試料を使用する。
試料バイアルは、ガラス圧着バイアル、2mL Agilent、カタログ番号518
2-0543及びキャップ:圧着11mm、カタログ番号5040-4667であった。
2-0543及びキャップ:圧着11mm、カタログ番号5040-4667であった。
5mL Histrap HPカラム(GE Life Sciences,Orde
r No.17-5248-02)を使用して、次のプロトコールに従い、Aekta
Pure又はAekta Avant(GE Healthcare)上で固定化金属ア
フィニティークロマトグラフィー(IMAC)を使用して、タンパク質を精製した。仕様
を表11で示す。
r No.17-5248-02)を使用して、次のプロトコールに従い、Aekta
Pure又はAekta Avant(GE Healthcare)上で固定化金属ア
フィニティークロマトグラフィー(IMAC)を使用して、タンパク質を精製した。仕様
を表11で示す。
表12及び表13に従い、使用する緩衝液を構成した。
表14による、得られるタンパク質を保管した。
(b)結果及び解釈
分析的SECの収率及び単量体のピークに関する突然変異体の改善はなかった。配列番
号137による発現タグ付きの親タンパク質(EP14)は、分析における最良の収率及
び最大単量体のピークをもたらした。最低収率及びまた最低単量体のピークは突然変異体
N371Qで得た。
分析的SECの収率及び単量体のピークに関する突然変異体の改善はなかった。配列番
号137による発現タグ付きの親タンパク質(EP14)は、分析における最良の収率及
び最大単量体のピークをもたらした。最低収率及びまた最低単量体のピークは突然変異体
N371Qで得た。
6.実施例5:組み合わせ
試行し、さらに特性を改善するために、上の実施例3で導入された突然変異のうちいく
つかを下の表15に従い組み合わせた。突然変異は、配列番号1で示されるような野生型
CD39のアミノ酸位置に従い付番する。
試行し、さらに特性を改善するために、上の実施例3で導入された突然変異のうちいく
つかを下の表15に従い組み合わせた。突然変異は、配列番号1で示されるような野生型
CD39のアミノ酸位置に従い付番する。
(a)材料及び方法
表16によるプライマーを使用した。
表16によるプライマーを使用した。
次のピペッティングスキームを使用してPCR反応を設定した:
5μLの10x反応緩衝液、
1μL ds-DNA-鋳型(保存濃縮液100ng/μL)、
1.5μLプライマー1、
1.5μLプライマー2、
1μL dNTP混合物、
1.5μL QuickSolution試薬、
35.5μL H2O(50μLの最終体積に対する)及び
1μL QuickChange Lightning Enzyme。
5μLの10x反応緩衝液、
1μL ds-DNA-鋳型(保存濃縮液100ng/μL)、
1.5μLプライマー1、
1.5μLプライマー2、
1μL dNTP混合物、
1.5μL QuickSolution試薬、
35.5μL H2O(50μLの最終体積に対する)及び
1μL QuickChange Lightning Enzyme。
表17によるPCRサイクリングパラメーターを使用した。
反応直後、2μL DpnI-酵素を各反応に添加し、混合し、37℃で5分間温置し
た。
た。
次のようにXL10-gold ultra-competent細胞への形質転換を
行った。氷上で細胞を凍結融解した。45μL/形質転換を使用し、2μL B-MEを
各バイアルに添加した。次に、3μL DpnI-消化PCR産物を添加し、15mLの
BDチューブ中、氷上で30分間温置した。その後、試料を40秒間熱ショック処理し、
氷上で2分間温置した。次に、950μL SOC培地を添加し、続いて振盪インキュベ
ーター中で37℃にて1.5時間温置した。最後に、LB-carb-プレート上に細胞
を蒔き、37℃で一晩温置した。翌日、DNA-miniprep及び配列分析のために
単コロニーを拾った。
行った。氷上で細胞を凍結融解した。45μL/形質転換を使用し、2μL B-MEを
各バイアルに添加した。次に、3μL DpnI-消化PCR産物を添加し、15mLの
BDチューブ中、氷上で30分間温置した。その後、試料を40秒間熱ショック処理し、
氷上で2分間温置した。次に、950μL SOC培地を添加し、続いて振盪インキュベ
ーター中で37℃にて1.5時間温置した。最後に、LB-carb-プレート上に細胞
を蒔き、37℃で一晩温置した。翌日、DNA-miniprep及び配列分析のために
単コロニーを拾った。
実施例4に記載のように、妥当な配列をHEK293細胞に遺伝子移入した。
次のように固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)を使用してタン
パク質を精製した。95mLの上清を使用した(全ての約4mLを分析(IPC)用に維
持する)。
パク質を精製した。95mLの上清を使用した(全ての約4mLを分析(IPC)用に維
持する)。
使用材料:
Nickel-NTA-Agarose、Qiagen,Cat No./ID:30
230、Poly-Prep Chromatography Column,empt
y,BioRad,No.731-1550,IMAC A緩衝液pH7.4(20mM
NaPO4-緩衝液及び50mMイミダゾール含有)。IMAC B緩衝液pH7.4
(20mM NaPO4-緩衝液及び300mMイミダゾール含有)。TBS(Mill
iQ-Waterにより10x濃縮を1x濃縮に希釈)。Ultracel-10メンブ
レン、10K、UFC801096付きAmicon Ultra-4 Centrif
ugal Filter Unit。
Nickel-NTA-Agarose、Qiagen,Cat No./ID:30
230、Poly-Prep Chromatography Column,empt
y,BioRad,No.731-1550,IMAC A緩衝液pH7.4(20mM
NaPO4-緩衝液及び50mMイミダゾール含有)。IMAC B緩衝液pH7.4
(20mM NaPO4-緩衝液及び300mMイミダゾール含有)。TBS(Mill
iQ-Waterにより10x濃縮を1x濃縮に希釈)。Ultracel-10メンブ
レン、10K、UFC801096付きAmicon Ultra-4 Centrif
ugal Filter Unit。
工程段階:
1.Qiagenの1mL Nickel-NTA-Agarose(=0.5mL
CV)でカラムを調製;
2.10CV IMAC Aで平衡化;
3.カラム上での15/45mL SNのローディング(フロースルーを回収);
4.10CV IMAC Aで洗浄(15mL Falconチューブ中で回収);
5.IMAC Bの6.5CV中で溶出;
6.溶出物の濃度の決定;
7.Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Uni
t 10Kを用いた約400μLへの3.5mL試料の濃縮;
8.TBS添加及び遠心分離5000することによる緩衝液交換。
1.Qiagenの1mL Nickel-NTA-Agarose(=0.5mL
CV)でカラムを調製;
2.10CV IMAC Aで平衡化;
3.カラム上での15/45mL SNのローディング(フロースルーを回収);
4.10CV IMAC Aで洗浄(15mL Falconチューブ中で回収);
5.IMAC Bの6.5CV中で溶出;
6.溶出物の濃度の決定;
7.Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Uni
t 10Kを用いた約400μLへの3.5mL試料の濃縮;
8.TBS添加及び遠心分離5000することによる緩衝液交換。
40μLの各試料で分析SECを使用し、12μLの各試料でタンパク質ゲルを使用し
て、試料を分析した。
て、試料を分析した。
得られたタンパク質を保存した。
(b)結果及び解釈
結果を表18で示す。
結果を表18で示す。
プロテアーゼ部位:
マトリプターゼを挿入した場合、産生されなかった/収率が非常に低かった。フューリ
ン部位で約40%収率があった(しかしフューリンプラスミドとの同時遺伝子移入であっ
たので、遺伝子移入に対してDNAの50%のみを同様に使用した)。
マトリプターゼを挿入した場合、産生されなかった/収率が非常に低かった。フューリ
ン部位で約40%収率があった(しかしフューリンプラスミドとの同時遺伝子移入であっ
たので、遺伝子移入に対してDNAの50%のみを同様に使用した)。
IL2-短縮:
aa1-3が含まれる全ての短縮が同等の結果を与え、他と比較してaa1-3のみが
僅かにより低くなり得るが、これは、試料から試料への変動であり得る。短縮aa4-1
2ではタンパク質発現がなくなる。全ての他のEP-変異体のように、IL2-star
tとhCD39-タンパク質との間にTSSリンカーを含有するEP28の間で差は見ら
れ得なかった。
aa1-3が含まれる全ての短縮が同等の結果を与え、他と比較してaa1-3のみが
僅かにより低くなり得るが、これは、試料から試料への変動であり得る。短縮aa4-1
2ではタンパク質発現がなくなる。全ての他のEP-変異体のように、IL2-star
tとhCD39-タンパク質との間にTSSリンカーを含有するEP28の間で差は見ら
れ得なかった。
組み合わせ:
EP19(L424Q)との組み合わせは、タンパク質発現の顕著な改善につながらな
かった。
EP19(L424Q)との組み合わせは、タンパク質発現の顕著な改善につながらな
かった。
EP1(R113M)との組み合わせは、分析SECでより低い凝集を示した。NEG
726はよく発現されたが、全ての試験物のうち最低の凝集を示した(約37%)。EP
14xEP17の組み合わせは、何らかのさらなる改善につながらなかった(F365S
+Y412F)。
726はよく発現されたが、全ての試験物のうち最低の凝集を示した(約37%)。EP
14xEP17の組み合わせは、何らかのさらなる改善につながらなかった(F365S
+Y412F)。
7.実施例6:最終候補のクローニング
さらなる試験のために以下の表19で示されるような臨床候補の選択物を発現させた。
さらなる試験のために以下の表19で示されるような臨床候補の選択物を発現させた。
次のプライマーを使用した:
次のピペッティングスキームを使用してPCR反応を設定した:
0.25μL DMSO、
20ngベクター
1.5μL挿入物(45ng/μL)、
2μL 5xHF緩衝液、
0.1μL Phusion pol、
0.08μL dNTP混合物
10-XμL ddH2O
0.25μL DMSO、
20ngベクター
1.5μL挿入物(45ng/μL)、
2μL 5xHF緩衝液、
0.1μL Phusion pol、
0.08μL dNTP混合物
10-XμL ddH2O
表17によるPCRサイクリングパラメーターを使用した。
反応直後、各反応に0.5μL DpnI-酵素を添加し、混合し、37℃で2時間温
置した。
置した。
XL10-gold ultra-competent細胞への形質転換を次のように
行った。細胞を氷上で凍結融解した。45μL/形質転換を使用して、2μL B-ME
を各バイアルに添加した。次に、3μL DpnI-消化PCR産物を添加し、15mL
のBDチューブ中で氷上にて30分間温置した。その後、試料を40秒間熱ショック処理
し、氷上で2分間温置した。次に、950μL SOC培地を添加し、続いて振盪インキ
ュベーター中で37℃にて1.5時間温置した。最後に、LB-carb-プレート上に
細胞を蒔き、37℃で一晩温置した。翌日、DNA-miniprep及び配列分析のた
めに単コロニーを拾った。
行った。細胞を氷上で凍結融解した。45μL/形質転換を使用して、2μL B-ME
を各バイアルに添加した。次に、3μL DpnI-消化PCR産物を添加し、15mL
のBDチューブ中で氷上にて30分間温置した。その後、試料を40秒間熱ショック処理
し、氷上で2分間温置した。次に、950μL SOC培地を添加し、続いて振盪インキ
ュベーター中で37℃にて1.5時間温置した。最後に、LB-carb-プレート上に
細胞を蒔き、37℃で一晩温置した。翌日、DNA-miniprep及び配列分析のた
めに単コロニーを拾った。
配列が正しかったことを確実にするために、新しいベクター背景に全てのコンストラク
トをサブクローニングした。このために、PCRで全てのコンストラクトを増幅し、G4
S-リンカーを挿入し、次にHindIII/EcoRIで消化した。得られたタンパク
質を保存した。
トをサブクローニングした。このために、PCRで全てのコンストラクトを増幅し、G4
S-リンカーを挿入し、次にHindIII/EcoRIで消化した。得られたタンパク
質を保存した。
8.実施例7:比較タンパク質の作製
(1)ヌル突然変異
インビボ実験用に陰性対照タンパク質を作製するために、1/2個の突然変異を親ヒト
CD39ΔMILタンパク質(EP28)に挿入した。この突然変異は、このタンパク質
の酵素活性を排除するか又は低下させることが文献に記載されている。突然変異位置はE
174A及びS218Aである。
(1)ヌル突然変異
インビボ実験用に陰性対照タンパク質を作製するために、1/2個の突然変異を親ヒト
CD39ΔMILタンパク質(EP28)に挿入した。この突然変異は、このタンパク質
の酵素活性を排除するか又は低下させることが文献に記載されている。突然変異位置はE
174A及びS218Aである。
次のプライマーを使用した:
次のピペッティングスキームを使用してPCR反応を設定した:
5μLの10x反応緩衝液、
1μL ds-DNA-鋳型(保管濃縮液100ng/μL)、
1.5μLプライマー1、
1.5μLプライマー2、
1μL dNTP混合液
1.5μL QuickSolution試薬、
35.5μL H2O(50μLの最終体積に対する)及び
1μL QuickChange Lightning Enzyme。
5μLの10x反応緩衝液、
1μL ds-DNA-鋳型(保管濃縮液100ng/μL)、
1.5μLプライマー1、
1.5μLプライマー2、
1μL dNTP混合液
1.5μL QuickSolution試薬、
35.5μL H2O(50μLの最終体積に対する)及び
1μL QuickChange Lightning Enzyme。
表17によるPCRサイクリングパラメーターを使用した。
反応直後、2μL DpnI-酵素を各反応に添加し、混合し、37℃で5分間温置し
た。
た。
XL10-gold ultra-competent細胞への形質転換を次のように
行った。細胞を氷上で凍結融解した。45μL/形質転換を使用し、2μL B-MEを
各バイアルに添加した。次に、3μL DpnI消化PCR産物を添加し、15mL B
Dチューブ中で氷上にて30分間温置した。その後、試料を40秒間熱ショック処理し、
氷上で2分間温置した。次に、950μL SOC培地を添加し、続いて振盪インキュベ
ーター中で37℃にて1.5時間温置した。最後に、LB-carb-プレート上に細胞
を蒔き、37℃で一晩温置した。翌日、DNA-miniprep及び配列分析のために
単コロニーを拾った。
行った。細胞を氷上で凍結融解した。45μL/形質転換を使用し、2μL B-MEを
各バイアルに添加した。次に、3μL DpnI消化PCR産物を添加し、15mL B
Dチューブ中で氷上にて30分間温置した。その後、試料を40秒間熱ショック処理し、
氷上で2分間温置した。次に、950μL SOC培地を添加し、続いて振盪インキュベ
ーター中で37℃にて1.5時間温置した。最後に、LB-carb-プレート上に細胞
を蒔き、37℃で一晩温置した。翌日、DNA-miniprep及び配列分析のために
単コロニーを拾った。
次のプロトコールに従い、妥当な配列をHEK293細胞に遺伝子移入した。
50μLの最終体積まで、10μgベクター-DNA、0.4μL HindIII(
100U/μL、NEB)、2μL EcoRI(20U/μL、NEB)、5μL C
utsmart緩衝液10xconc.(NEB)及びH2Oを使用して消化緩衝液を調
製した。37℃で3時間、消化反応を行った。
100U/μL、NEB)、2μL EcoRI(20U/μL、NEB)、5μL C
utsmart緩衝液10xconc.(NEB)及びH2Oを使用して消化緩衝液を調
製した。37℃で3時間、消化反応を行った。
消化の直後、脱リン酸化反応を行った。消化したベクター混合物に子牛腸アルカリホス
ファターゼ(10U/μL、CIP、NEB、No.M0290L)を添加し(3μL)
、37℃で30分間温置した。
ファターゼ(10U/μL、CIP、NEB、No.M0290L)を添加し(3μL)
、37℃で30分間温置した。
配列を調べるために、消化し、脱リン酸化したベクターをサブクローニングした。
次のプロトコールに従い、妥当な配列をHEK293細胞に遺伝子移入した。
次の材料を使用して、7日間の発現を行った;1.SV40 largeT抗原を構成
的に発現するヒト胚腎臓細胞(HEK293-T、ATCC11268);2.ポリエチ
レンイミン”MAX”MW40.000(PEI)(Polysciences,Cat
.24765)。
的に発現するヒト胚腎臓細胞(HEK293-T、ATCC11268);2.ポリエチ
レンイミン”MAX”MW40.000(PEI)(Polysciences,Cat
.24765)。
室温(RT)にて900mL細胞培養グレード水中で1g PEIを慎重に溶解させる
ことによってPEI溶液を調製する。次に、これを7.05の最終pHになるようにNa
OHで中和する。最後に、体積を1Lに調整し、0.22μmフィルターを通じて溶液を
ろ過し、アリコートで分配し、さらなる使用まで-80℃で凍結する。凍結融解した後、
-20℃で最大3回までアリコートを再凍結し得るが、-20℃で長期間保管すべきでは
ない。
ことによってPEI溶液を調製する。次に、これを7.05の最終pHになるようにNa
OHで中和する。最後に、体積を1Lに調整し、0.22μmフィルターを通じて溶液を
ろ過し、アリコートで分配し、さらなる使用まで-80℃で凍結する。凍結融解した後、
-20℃で最大3回までアリコートを再凍結し得るが、-20℃で長期間保管すべきでは
ない。
M11V3血清不含培地(Bioconcept,CH,Cat:V3-K)。
血清不含M11V3培地中で増殖させた懸濁適合HEK293-T細胞を使用して、一
過性遺伝子移入のための全ての細胞培養作業を行う。
過性遺伝子移入のための全ての細胞培養作業を行う。
小スケール(<5L)遺伝子移入の場合、5%CO2の加湿CO2インキュベーターに
おいて、オービタル振盪機(100rpm)上でCorning振盪フラスコ(Corn
ing,USA)中で細胞を増殖させる(シードフラスコ)。
おいて、オービタル振盪機(100rpm)上でCorning振盪フラスコ(Corn
ing,USA)中で細胞を増殖させる(シードフラスコ)。
一般に、シード培養中の細胞は指数増殖期(5x105~3x106/mLの細胞密度
)であるべきであり、生存能は>90%である。細胞密度がこの範囲外であると、分割後
に遅滞期となるか又は遺伝子移入効率が低下するかの何れかが起こる。
)であるべきであり、生存能は>90%である。細胞密度がこの範囲外であると、分割後
に遅滞期となるか又は遺伝子移入効率が低下するかの何れかが起こる。
小スケール(ここでは2L)遺伝子移入の場合、細胞のアリコートをシード培養物から
採取し、M11V3培地により最終体積の36%で細胞1.4x106個/mLに調整す
る。
採取し、M11V3培地により最終体積の36%で細胞1.4x106個/mLに調整す
る。
7%最終体積M11V3中で1mg/L最終体積DNAを希釈し、穏やかに混合するこ
とによって、DNA溶液(溶液1)を調製する。培養物の汚染を防ぐために、0.22μ
mフィルター(例えばMillipore Stericup)を使用してこの溶液をろ
過し得る。ここでは、体積が小さいので滅菌ろ過は行っていない。次に、3mg/L最終
体積PEI溶液を7%最終体積M11V3中で希釈し、穏やかに混合する(溶液2)。室
温(RT)で5~10分間両溶液を温置する。その後、穏やかに混合しながら溶液2を溶
液1に添加し、さらに5~15分間RTで温置する(PEIは、DNAを覆い/凝縮させ
て正荷電粒子にし、これが陰イオン性の細胞表面残基に結合し、エンドサイトーシスを介
して細胞に取り込まれるので、温置時間中に再び混合しない)。温置後、遺伝子移入混合
物を細胞に添加し、培養物を4時間培養する(10rpm、37℃、6%CO2)。
とによって、DNA溶液(溶液1)を調製する。培養物の汚染を防ぐために、0.22μ
mフィルター(例えばMillipore Stericup)を使用してこの溶液をろ
過し得る。ここでは、体積が小さいので滅菌ろ過は行っていない。次に、3mg/L最終
体積PEI溶液を7%最終体積M11V3中で希釈し、穏やかに混合する(溶液2)。室
温(RT)で5~10分間両溶液を温置する。その後、穏やかに混合しながら溶液2を溶
液1に添加し、さらに5~15分間RTで温置する(PEIは、DNAを覆い/凝縮させ
て正荷電粒子にし、これが陰イオン性の細胞表面残基に結合し、エンドサイトーシスを介
して細胞に取り込まれるので、温置時間中に再び混合しない)。温置後、遺伝子移入混合
物を細胞に添加し、培養物を4時間培養する(10rpm、37℃、6%CO2)。
最後に、次の実施例に従い、培養物に残りの50%最終体積M11V3培地を供給する
:接種体積:細胞1.4x106個/mLで36mL。
:接種体積:細胞1.4x106個/mLで36mL。
溶液1:100μgプラスミドDNA入りの7mL M11V3培地。溶液2:300
μg PEI(300μL)入りの7mL M11V3培地。
供給:50mL M11V3、合計100mL。
μg PEI(300μL)入りの7mL M11V3培地。
供給:50mL M11V3、合計100mL。
次のように固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)を使用してタン
パク質を精製した。95mLの上清を使用した(全ての約4mLを分析(IPC)用に維
持する)。
パク質を精製した。95mLの上清を使用した(全ての約4mLを分析(IPC)用に維
持する)。
使用材料:
Nickel-NTA Agarose,Qiagen,Cat No./ID:30
230,Poly-Prep Chromatography Column,empt
y,BioRad,No.731-1550,IMAC A緩衝液pH7.4(20mM
NaPO4-緩衝液及び50mMイミダゾール含有)。IMAC B緩衝液pH7.4
(20mM NaPO4-緩衝液及び300mMイミダゾール含有)。TBS(Mill
iQ-Waterで10x濃縮を1x濃縮に希釈)。Ultracel-10メンブレン
、10K、UFC801096付きのAmicon Ultra-4 Centrifu
gal Filter Unit。
Nickel-NTA Agarose,Qiagen,Cat No./ID:30
230,Poly-Prep Chromatography Column,empt
y,BioRad,No.731-1550,IMAC A緩衝液pH7.4(20mM
NaPO4-緩衝液及び50mMイミダゾール含有)。IMAC B緩衝液pH7.4
(20mM NaPO4-緩衝液及び300mMイミダゾール含有)。TBS(Mill
iQ-Waterで10x濃縮を1x濃縮に希釈)。Ultracel-10メンブレン
、10K、UFC801096付きのAmicon Ultra-4 Centrifu
gal Filter Unit。
工程段階:
1.Qiagenの1mL Nickel-NTA-Agarose(=0.5mL
CV)でカラムを調製;
2.10CV IMAC Aで平衡化;
3.カラム上で15/45mL SNをローディング(フロースルーを回収);
4.10CV IMAC Aで洗浄(15mL Falconチューブ中で回収);
5.6.5CVのIMAC B中で溶出;
6.溶出物の濃度の決定;
7.Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Uni
t 10Kを用いて約400μLまで3.5mL試料を濃縮;
8.TBSの添加及び遠心分離5000により緩衝液交換。
1.Qiagenの1mL Nickel-NTA-Agarose(=0.5mL
CV)でカラムを調製;
2.10CV IMAC Aで平衡化;
3.カラム上で15/45mL SNをローディング(フロースルーを回収);
4.10CV IMAC Aで洗浄(15mL Falconチューブ中で回収);
5.6.5CVのIMAC B中で溶出;
6.溶出物の濃度の決定;
7.Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Uni
t 10Kを用いて約400μLまで3.5mL試料を濃縮;
8.TBSの添加及び遠心分離5000により緩衝液交換。
40μLの各試料を用いた分析用SECを使用して、及び12μLの各試料とともにタ
ンパク質ゲルを使用して、試料を分析した。
ンパク質ゲルを使用して、試料を分析した。
得られたタンパク質を保存した。
(2)plusMIL
オーバーラップ伸長PCRで膜相互作用ループ(aa193-204)を用いてEP1
4aa1-3のクローニングを行った。
オーバーラップ伸長PCRで膜相互作用ループ(aa193-204)を用いてEP1
4aa1-3のクローニングを行った。
次のプライマーを使用した。
次のピペッティングスキームを使用してPCR反応を設定した:
1.2μL Phusion Hot Start Polymerase、
24μL 5xHF-緩衝液、
0.96μL 100mM dNTP(各dNTP 25mM)、
0.6μL Fwプライマー、
0.6μL Revプライマー、
92.64μL DEPC H2O。
1.2μL Phusion Hot Start Polymerase、
24μL 5xHF-緩衝液、
0.96μL 100mM dNTP(各dNTP 25mM)、
0.6μL Fwプライマー、
0.6μL Revプライマー、
92.64μL DEPC H2O。
表17に従うPCRサイクリングパラメーターを使用した。
反応直後に2μL DpnI-酵素を各反応物に添加し、混合し、37℃で2時間温置
した。
した。
2μL PCR産物を96ウェルPCRプレート移し、氷上で冷却することによって形
質転換を行った。20μL STELLAR化学コンポーネント(component)
細菌を添加し、ピペッティングで一度出し入れすることにより慎重に混合した。試料を氷
上で30分間温置し、次にPCR機器中で42℃で45秒温置し、続いて氷上で60秒間
さらに温置した。最後に、90μL SOC培地を添加し、37℃で1時間温置した。遺
伝子移入混合物全てをLB-アンピシリン又はLB-カルベンシリンプレート上に蒔き、
37℃で一晩増殖させた。
質転換を行った。20μL STELLAR化学コンポーネント(component)
細菌を添加し、ピペッティングで一度出し入れすることにより慎重に混合した。試料を氷
上で30分間温置し、次にPCR機器中で42℃で45秒温置し、続いて氷上で60秒間
さらに温置した。最後に、90μL SOC培地を添加し、37℃で1時間温置した。遺
伝子移入混合物全てをLB-アンピシリン又はLB-カルベンシリンプレート上に蒔き、
37℃で一晩増殖させた。
配列番号155に従うアミノ酸配列を有する得られたタンパク質EP14_plusM
ILを保存した。
ILを保存した。
9.実施例8:酵素活性
酵素活性アッセイを使用して、前の実施例で作製した候補の特徴を調べた。
酵素活性アッセイを使用して、前の実施例で作製した候補の特徴を調べた。
次の試薬を使用した:Pi不含緩衝液、リン酸不含生理食塩水溶液(140mM Na
Cl、5mM KCl、1mM MgCl2、2mM CaCl2、10mM Hepe
s、pH7.4);及びPi不含緩衝液+2%BSA、20mg/mL BSA;CD3
9タンパク質(配列番号1に従う)入りのリン酸不含生理食塩水溶液;ATP。
Cl、5mM KCl、1mM MgCl2、2mM CaCl2、10mM Hepe
s、pH7.4);及びPi不含緩衝液+2%BSA、20mg/mL BSA;CD3
9タンパク質(配列番号1に従う)入りのリン酸不含生理食塩水溶液;ATP。
2つ組CD39溶液を2μg/mLで調製した。15μL ATP保存液+1185μ
L緩衝液、全部で1.2mL、から、1000μMで2つ組ATP溶液を調製した。
L緩衝液、全部で1.2mL、から、1000μMで2つ組ATP溶液を調製した。
120μL最終/ウェルを満たした48ウェルPCRプレートにおいて60μL AT
Pを60μL CD39と、又は対照用のPi不含緩衝液と60μLを混合することによ
って、酵素反応を試験した。最終濃度は500μM ATP及び1μg/mL CD39
であった。
Pを60μL CD39と、又は対照用のPi不含緩衝液と60μLを混合することによ
って、酵素反応を試験した。最終濃度は500μM ATP及び1μg/mL CD39
であった。
それぞれ0、5、15、30、60、90及び150分間にわたり37℃で試料を温置
した。次に、Pi放出アッセイ又はHPLCの何れかにより試料を評価した。
した。次に、Pi放出アッセイ又はHPLCの何れかにより試料を評価した。
(1)Pi放出アッセイ
(a)材料及び方法
製造者の説明書に従い、標準Pi検出キットから試薬を調製した。
(a)材料及び方法
製造者の説明書に従い、標準Pi検出キットから試薬を調製した。
水中での希釈により、Piによる標準曲線を作成した。Pi保存液(100μM)の1
:2連続希釈液を調製した:450μL+450μL水。標準曲線濃度は50μM/25
μM/12.5μM/6.25μM/3.1μM/1.5μM/0μMであった。
:2連続希釈液を調製した:450μL+450μL水。標準曲線濃度は50μM/25
μM/12.5μM/6.25μM/3.1μM/1.5μM/0μMであった。
Gold試薬混合液を調製した:4mL gold試薬+40μL促進剤(3プレート
に対して)。96ウェルプレートにおいて、H2O中で試料を1:10希釈した(水中で
希釈:10μL試料+90μL H2O)。50μL、1:10希釈試料を96の半分の
領域のウェルプレート(Corning、3690)の各ウェルに分配した。12.5μ
L Gold試薬混合液を各ウェルに添加し(25%試料体積)、試料を室温で10分間
温置した。635nmで吸収を読んだ。
に対して)。96ウェルプレートにおいて、H2O中で試料を1:10希釈した(水中で
希釈:10μL試料+90μL H2O)。50μL、1:10希釈試料を96の半分の
領域のウェルプレート(Corning、3690)の各ウェルに分配した。12.5μ
L Gold試薬混合液を各ウェルに添加し(25%試料体積)、試料を室温で10分間
温置した。635nmで吸収を読んだ。
(b)結果及び解釈
候補に対する比較結果を表26で示す。
候補に対する比較結果を表26で示す。
酵素に500μM ATPを添加し、経時的にHPLC(下に記載の方法)によりAT
P、ADP、AMPの濃度を分析することによって、酵素活性を測定した。得られた反応
速度曲線は、酵素定数を得るために図6のモデルとフィットさせた。酵素定数Kcatに
関して、酵素は次の順序(低活性~高活性):EP28(wt)、EP17、EP14、
EP15を示す。
P、ADP、AMPの濃度を分析することによって、酵素活性を測定した。得られた反応
速度曲線は、酵素定数を得るために図6のモデルとフィットさせた。酵素定数Kcatに
関して、酵素は次の順序(低活性~高活性):EP28(wt)、EP17、EP14、
EP15を示す。
図7は、EP28に対する反応速度データ及びモデルフィットを示す。図8は、EP1
4に対する反応速度データ及びモデルフィットを示す。図9は、EP15に対する反応速
度データ及びモデルフィットを示す。
4に対する反応速度データ及びモデルフィットを示す。図9は、EP15に対する反応速
度データ及びモデルフィットを示す。
EP28(wt)、EP14、EP15及びEP17に対する酵素定数の概要は、表2
7で示す。野生型(WT)と比較して、3つの新規変異体は触媒活性の向上を示す。重要
なこととして、新規変異体は、触媒速度定数(kcat)触媒効率(kcat/Km)の
明らかな上昇を示す。組織損傷及び血栓症中の、報告されるATP及びADP基質濃度が
報告されるKmを上回るので、このkcat及びkcat/Kmの上昇は、インビボでの
活性がより高いと言い換えられると思われる。
7で示す。野生型(WT)と比較して、3つの新規変異体は触媒活性の向上を示す。重要
なこととして、新規変異体は、触媒速度定数(kcat)触媒効率(kcat/Km)の
明らかな上昇を示す。組織損傷及び血栓症中の、報告されるATP及びADP基質濃度が
報告されるKmを上回るので、このkcat及びkcat/Kmの上昇は、インビボでの
活性がより高いと言い換えられると思われる。
(2)HPLC検証アッセイ(反応速度及び用量反応)
(a)材料及び方法
HPLC検証アッセイで候補を試験した。HPLCのために70μLの各試料をガラス
バイアルに移した。
(a)材料及び方法
HPLC検証アッセイで候補を試験した。HPLCのために70μLの各試料をガラス
バイアルに移した。
表28で示されるような保存溶液5mMを用いて候補試料を調製した。
1000μM 20μLの各保存溶液をHPLCバイアル中で混合した。
500μM 20μL 1mM+20μL H2O
100μM 10μL 1mM+90μL H2O
10μM 10μL 100μM+90μL H2O
1μM 10μL 10μM+90μL H2O
500μM 20μL 1mM+20μL H2O
100μM 10μL 1mM+90μL H2O
10μM 10μL 100μM+90μL H2O
1μM 10μL 10μM+90μL H2O
CapPump(G1376A)、Degasser(G1379A)、ALS(G1
329A)、Thermostat(G1330B、ColComp(G1316A)及
びDAD(G1315A)とともにAgilent 1100 Systemを使用して
、HPLC分離を行った。溶媒A:10mM KH2PO4(04243、Riedel
-de Haen)+2mM TBA臭化物、pH7.0(86857-10G-F、F
luka)及び溶媒B:10mM KH2PO4/ACN 1/1+2mM TBA臭化
物、pH5.5。カラム:Nucleodur 300-5 C18ec、2x150m
m、5μM、Macherey-Nagel 760185.20Batch E141
00258 36654055。カラム温度は40℃、注入体積10μL、流速は0.3
mL/minであり、勾配は0-3’:0%B;3-23’:0-95%B、直線的;2
3-28’:95%B、直線的;28-29’:95-0%B、直線的;5’Post
Time”。DAD:247nm及び259nm。
329A)、Thermostat(G1330B、ColComp(G1316A)及
びDAD(G1315A)とともにAgilent 1100 Systemを使用して
、HPLC分離を行った。溶媒A:10mM KH2PO4(04243、Riedel
-de Haen)+2mM TBA臭化物、pH7.0(86857-10G-F、F
luka)及び溶媒B:10mM KH2PO4/ACN 1/1+2mM TBA臭化
物、pH5.5。カラム:Nucleodur 300-5 C18ec、2x150m
m、5μM、Macherey-Nagel 760185.20Batch E141
00258 36654055。カラム温度は40℃、注入体積10μL、流速は0.3
mL/minであり、勾配は0-3’:0%B;3-23’:0-95%B、直線的;2
3-28’:95%B、直線的;28-29’:95-0%B、直線的;5’Post
Time”。DAD:247nm及び259nm。
Waters UPLC I classを使用して、UPLC分離を行った。溶媒A
:10mM KH2PO4/10mM K2HPO4 1/1+2mM TBA臭化物、
pH7.0。溶媒B:10mM KH2PO4/ACN 1/1+2mM TBA臭化物
、pH5.5。カラム:Fortis Bio C18、2.1x50mm、5μm、d
i2chrom BIO318-020301 SN H03161210-2。カラム
温度は40℃であり、注入体積は10μLであり、流速は0.5mL/minであり、勾
配は0-1’:0%B;1-8’:0-55%B、直線的;8-10’:55%B;10
-11’:55-0%B、直線的;14’停止時間。DADは247nm及び259nm
であった。
:10mM KH2PO4/10mM K2HPO4 1/1+2mM TBA臭化物、
pH7.0。溶媒B:10mM KH2PO4/ACN 1/1+2mM TBA臭化物
、pH5.5。カラム:Fortis Bio C18、2.1x50mm、5μm、d
i2chrom BIO318-020301 SN H03161210-2。カラム
温度は40℃であり、注入体積は10μLであり、流速は0.5mL/minであり、勾
配は0-1’:0%B;1-8’:0-55%B、直線的;8-10’:55%B;10
-11’:55-0%B、直線的;14’停止時間。DADは247nm及び259nm
であった。
(b)結果
結果は図7、8、9及び11で見ることができ、これらは異なる実施形態による候補に
対して、反応速度データ及びモデルフィットを示す。
結果は図7、8、9及び11で見ることができ、これらは異なる実施形態による候補に
対して、反応速度データ及びモデルフィットを示す。
10.実施例9:インビトロ活性、最初のスクリーニング
IL2-リーダーなし及びIL2-startなしで、哺乳動物発現ベクターpRS5
a_Leader_APP_His(図5)において、前の実施例に記載のCD39バー
ジョンEP1~EP24をクローニングした。
IL2-リーダーなし及びIL2-startなしで、哺乳動物発現ベクターpRS5
a_Leader_APP_His(図5)において、前の実施例に記載のCD39バー
ジョンEP1~EP24をクローニングした。
(a)材料及び方法
7日間にわたるHEK293(PEI-遺伝子移入)におけるEP-Hitsの小スケ
ール発現(20/50mLスケール)を行い、続いてAPP-HPLC上でIPCを行っ
た(上記のとおり)。
7日間にわたるHEK293(PEI-遺伝子移入)におけるEP-Hitsの小スケ
ール発現(20/50mLスケール)を行い、続いてAPP-HPLC上でIPCを行っ
た(上記のとおり)。
Ni-NTA-カラム(0.5mL CV)での15/45mL細胞上清のタンパク質
精製;6CV IMAC B緩衝液(20mM NaPO4-緩衝液、300mMイミダ
ゾール、pH7.4)での溶出;
TBS、pH7.4中での精製タンパク質の濃縮及び再緩衝;
タンパク質ゲル、分析SECでのタンパク質の分析;
全ての変異体及び3つの対照(親hCD39-dMIL又はEP28、IL2-star
tあり及びなし、及び8M-バージョン、IL2-startなし)の送達:TBS、p
H7.4中の90~200uLの精製タンパク質。
精製;6CV IMAC B緩衝液(20mM NaPO4-緩衝液、300mMイミダ
ゾール、pH7.4)での溶出;
TBS、pH7.4中での精製タンパク質の濃縮及び再緩衝;
タンパク質ゲル、分析SECでのタンパク質の分析;
全ての変異体及び3つの対照(親hCD39-dMIL又はEP28、IL2-star
tあり及びなし、及び8M-バージョン、IL2-startなし)の送達:TBS、p
H7.4中の90~200uLの精製タンパク質。
(b)結果及び解釈
結果を下の表29でまとめる。
結果を下の表29でまとめる。
試料は全てTBSpH7.4中であり、APP-(配列番号247)及びHis-Ta
g(配列番号249)を有する。
g(配列番号249)を有する。
親ヒトCD39ΔMIL(EP28)のみが15アミノ酸長のIL2-start、a
a1-15(配列番号133)を有する。
a1-15(配列番号133)を有する。
Pi放出アッセイBOENKTH1-0252824、double det。60及
び180分間の値。
び180分間の値。
11.実施例10:インビトロ活性、精密なスクリーニング
2回目で12個の突然変異体のサブセットを試験したが、IL-2 startにより
大きい発現スケールが可能となる。
2回目で12個の突然変異体のサブセットを試験したが、IL-2 startにより
大きい発現スケールが可能となる。
(a)材料及び方法
15アミノ酸長のIL2-start、aa1-15付きの哺乳動物発現ベクターpR
S5a_Leader_APP_His(配列番号133)(図5)。7日間にわたるH
EK293(PEI-遺伝子移入)におけるEP-Hitsの小規模発現(50/100
mLスケール)に続いて、APP-HPLC上でIPCを行った(上記のとおり)。
15アミノ酸長のIL2-start、aa1-15付きの哺乳動物発現ベクターpR
S5a_Leader_APP_His(配列番号133)(図5)。7日間にわたるH
EK293(PEI-遺伝子移入)におけるEP-Hitsの小規模発現(50/100
mLスケール)に続いて、APP-HPLC上でIPCを行った(上記のとおり)。
Ni-NTA-カラム(0.5mL CV)による45/95mL細胞上清のタンパク
質精製
6CV IMAC B緩衝液(20mM NaPO4-緩衝液、300mMイミダゾー
ル、pH7.4)で溶出
TBS、pH7.4中での精製タンパク質の濃縮及び再緩衝
タンパク質ゲル、分析SECでのタンパク質の分析
全ての変異体及び対照(親hCD39-dMIL又はEP28、IL2-start
aa1-15あり(配列番号133))の送達:
TBS、pH7.4中の500μLの精製タンパク質。
質精製
6CV IMAC B緩衝液(20mM NaPO4-緩衝液、300mMイミダゾー
ル、pH7.4)で溶出
TBS、pH7.4中での精製タンパク質の濃縮及び再緩衝
タンパク質ゲル、分析SECでのタンパク質の分析
全ての変異体及び対照(親hCD39-dMIL又はEP28、IL2-start
aa1-15あり(配列番号133))の送達:
TBS、pH7.4中の500μLの精製タンパク質。
(b)結果及び解釈
結果を下の表30、表31及び表32でまとめる。
結果を下の表30、表31及び表32でまとめる。
12.実施例11:インビボ活性、pK
(a)材料及び方法
インビボPKの場合、4匹の意識のある雌C57BL/6マウスに対してPBS緩衝液
中の10mg/mLの最終濃度の10mg/kg化合物を尾静脈に静脈内投与した(1m
L/kg)。マウスはWIGAから入手し、体重は22g前後であった。生存中の実験は
全てスイス動物福祉法の下で行った。POCT Minivettesを使用して小体積
血清チューブに、投与後0.25、3、8、24及び48時間で全血を回収した(50μ
L/時間点)。血清を分離し、濃度決定のために使用した。
(a)材料及び方法
インビボPKの場合、4匹の意識のある雌C57BL/6マウスに対してPBS緩衝液
中の10mg/mLの最終濃度の10mg/kg化合物を尾静脈に静脈内投与した(1m
L/kg)。マウスはWIGAから入手し、体重は22g前後であった。生存中の実験は
全てスイス動物福祉法の下で行った。POCT Minivettesを使用して小体積
血清チューブに、投与後0.25、3、8、24及び48時間で全血を回収した(50μ
L/時間点)。血清を分離し、濃度決定のために使用した。
Gyrolab技術は、遠心力及びレーザー誘起蛍光検出を通じて働くアフィニティー
フロースルー方式を使用した、ナノリットルスケールの自動化免疫アッセイである。Gy
rolab Bioaffy CDにおいてストレプトアビジン被覆ビーズをアフィニテ
ィーカラムに予め充填する。各CDは112本のカラムを含有する。微細構造に対するア
フィニティー捕捉カラムは15nLを含む。注入した試料は毛細管作用により入る。ビオ
チン化捕捉試薬は、ストレプトアビジン被覆ビーズに結合する。後で、検体溶液を注入し
、それは捕捉分子に結合する。最後に、フルオロフォア標識検出試薬を適用する。CD3
9の場合、APPタグの利用可能性に依存して、2回の異なるアッセイ読み取りを使用し
た。
1)抗CD39(40035)及び抗APP(27431)は図10Aで見られる。
2)Fab(40035)及び抗Fc/抗CD39(40044)1:1プレミックス
(全EP28aa1-16コンストラクト)は図10Bで見られる。アミンカップリング
によりビオチン化された場合、抗体40044は活性を失い、従って抗体40035のみ
をビオチン化した。
フロースルー方式を使用した、ナノリットルスケールの自動化免疫アッセイである。Gy
rolab Bioaffy CDにおいてストレプトアビジン被覆ビーズをアフィニテ
ィーカラムに予め充填する。各CDは112本のカラムを含有する。微細構造に対するア
フィニティー捕捉カラムは15nLを含む。注入した試料は毛細管作用により入る。ビオ
チン化捕捉試薬は、ストレプトアビジン被覆ビーズに結合する。後で、検体溶液を注入し
、それは捕捉分子に結合する。最後に、フルオロフォア標識検出試薬を適用する。CD3
9の場合、APPタグの利用可能性に依存して、2回の異なるアッセイ読み取りを使用し
た。
1)抗CD39(40035)及び抗APP(27431)は図10Aで見られる。
2)Fab(40035)及び抗Fc/抗CD39(40044)1:1プレミックス
(全EP28aa1-16コンストラクト)は図10Bで見られる。アミンカップリング
によりビオチン化された場合、抗体40044は活性を失い、従って抗体40035のみ
をビオチン化した。
1:2の希釈系列中の5%(v/v)マウス血清を含有するRexxip A中でCD
39コンストラクトに対する全ての標準曲線を希釈した。APPタグ付加コンストラクト
に対する適用される濃度範囲は5000ng/mL~9.77ng/mLであり、EP2
8aa1-16の場合、これは10000ng/mL~9.77ng/mLであった。5
%(v/v)マウス血清を含有するRexxip A中で全てのマウス血清試料を1:1
00希釈した。5%(v/v)マウス血清を含有するRexxip A中でCD39コン
ストラクトのQC試料を希釈した(APPタグ付きのコンストラクトに対して50及び5
00ng/mL及びEP28aa1-16に対して500及び1000ng/mL)。全
てのビオチン化捕捉試薬に対する最終濃度は0.1mg/mLであり、蛍光標識検出抗体
をRexxip F中で10nMに希釈した。
39コンストラクトに対する全ての標準曲線を希釈した。APPタグ付加コンストラクト
に対する適用される濃度範囲は5000ng/mL~9.77ng/mLであり、EP2
8aa1-16の場合、これは10000ng/mL~9.77ng/mLであった。5
%(v/v)マウス血清を含有するRexxip A中で全てのマウス血清試料を1:1
00希釈した。5%(v/v)マウス血清を含有するRexxip A中でCD39コン
ストラクトのQC試料を希釈した(APPタグ付きのコンストラクトに対して50及び5
00ng/mL及びEP28aa1-16に対して500及び1000ng/mL)。全
てのビオチン化捕捉試薬に対する最終濃度は0.1mg/mLであり、蛍光標識検出抗体
をRexxip F中で10nMに希釈した。
(b)結果及び解釈
結果を表34でまとめる。見られ得るように、全ての候補が同じPKを示す。従って候
補の選択はPK特性に基づかなかった。
結果を表34でまとめる。見られ得るように、全ての候補が同じPKを示す。従って候
補の選択はPK特性に基づかなかった。
13.実施例12:インビボ活性、AKIモデル
(a)材料及び方法
I/R設定の開始前に右腎臓の腎摘除術を行う。全体的な生体のダイナミクスを変化さ
せる代償機序を避けるために第2の腎臓を摘出した。自発呼吸する麻酔動物を恒温性監視
システムの恒温性ブランケット上に置き、滅菌ガーゼで被覆する。低体温を回避するため
に、直腸プローブを通じて体温を記録し、36.5~37.5℃の範囲で調節する。動物
に麻酔をかけ、剃毛し、消毒する(Betaseptic)。正中線切開/開腹手術後に
、腹部の内容物を左に寄せ、右腎臓を摘出する。尿管及び血管を連絡切断し、結紮し(9
-0Ethicon)、次いで腎臓を摘出する。
(a)材料及び方法
I/R設定の開始前に右腎臓の腎摘除術を行う。全体的な生体のダイナミクスを変化さ
せる代償機序を避けるために第2の腎臓を摘出した。自発呼吸する麻酔動物を恒温性監視
システムの恒温性ブランケット上に置き、滅菌ガーゼで被覆する。低体温を回避するため
に、直腸プローブを通じて体温を記録し、36.5~37.5℃の範囲で調節する。動物
に麻酔をかけ、剃毛し、消毒する(Betaseptic)。正中線切開/開腹手術後に
、腹部の内容物を左に寄せ、右腎臓を摘出する。尿管及び血管を連絡切断し、結紮し(9
-0Ethicon)、次いで腎臓を摘出する。
I/R傷害誘発:右腎臓の腎摘除術直後に、腹部内容物を右に寄せ、腎臓虚血誘導のた
めに左腎臓動脈を切り離す。
めに左腎臓動脈を切り離す。
腎臓への血流を阻止し、腎臓虚血を誘発するために、微細動脈瘤クリップを使用して椎
弓根をクランプする。腎臓虚血の持続時間は、クランプ処理の時間から開始する。腎臓の
色が数秒で赤から暗紫色に変化することにより虚血の成功を確認する。虚血後、微細動脈
瘤クリップを外し、腎臓の色が赤に変化することによって再灌流が示される。
弓根をクランプする。腎臓虚血の持続時間は、クランプ処理の時間から開始する。腎臓の
色が数秒で赤から暗紫色に変化することにより虚血の成功を確認する。虚血後、微細動脈
瘤クリップを外し、腎臓の色が赤に変化することによって再灌流が示される。
(b)結果及び解釈
結果は図12で見られる。候補は、それらの特異的なインビトロ活性と相関するインビ
ボでの用量反応を示す。図12Aは親EP28に対する結果を示し、図12BはEP1x
EP17に対する結果を示し、図12CはEP14に対する結果を示す。見られ得るよう
に、EP28及びEP1xEP17は同様の用量反応を示し、一方でインビトロ活性がよ
り高いEP14は、より低い用量で十分な効果を示す。
結果は図12で見られる。候補は、それらの特異的なインビトロ活性と相関するインビ
ボでの用量反応を示す。図12Aは親EP28に対する結果を示し、図12BはEP1x
EP17に対する結果を示し、図12CはEP14に対する結果を示す。見られ得るよう
に、EP28及びEP1xEP17は同様の用量反応を示し、一方でインビトロ活性がよ
り高いEP14は、より低い用量で十分な効果を示す。
14.実施例13:タイター、収率及び開発可能性
商業的規模で選択候補を製造するために、比較的高収率でそれらを発現可能であること
が重要である。治療用タンパク質の場合、これは、高産生クローンの選択を可能にする濃
縮技術の欠如に加えて方式が複雑であるために、治療用抗体と比較してあまり容易ではな
い可能性がある。
商業的規模で選択候補を製造するために、比較的高収率でそれらを発現可能であること
が重要である。治療用タンパク質の場合、これは、高産生クローンの選択を可能にする濃
縮技術の欠如に加えて方式が複雑であるために、治療用抗体と比較してあまり容易ではな
い可能性がある。
両候補、EP14aa1-3及びEP28aa1-3は、同等な技術的特徴を有し、こ
れは非常に困難であった。特に、早期発現バッチの低発現タイター(データは示さない)
は、生産コストに影響を与えるか、又は宿主細胞タンパク質の制御が堅固ではないので、
規模拡大後にさらにより低くなり得る。
れは非常に困難であった。特に、早期発現バッチの低発現タイター(データは示さない)
は、生産コストに影響を与えるか、又は宿主細胞タンパク質の制御が堅固ではないので、
規模拡大後にさらにより低くなり得る。
両候補に対する早期クローン選択によってタンパク質発現を改善しようとするために、
必要とされる個々に適した精製工程が必要であった。この目的に対して、候補EP28a
a1-3及びEP14aa1-3を発現する細胞のプールを作製した。
必要とされる個々に適した精製工程が必要であった。この目的に対して、候補EP28a
a1-3及びEP14aa1-3を発現する細胞のプールを作製した。
EP28aa1-16/EP14aa1-3発現細胞株の産生のための宿主細胞株とし
て親CHO細胞株を使用した。宿主細胞株は、例えば両方ともそれらの全体において参照
により組み込まれる特許出願、国際公開第2015092737号パンフレット及び同第
2015092735号パンフレットに記載されるような、当業者にとって周知のCHO
-K1細胞株由来である。EP28aa1-16/EP14aa1-3組み換え細胞株を
調製するためにCHO株からの単一バイアルを使用した。
て親CHO細胞株を使用した。宿主細胞株は、例えば両方ともそれらの全体において参照
により組み込まれる特許出願、国際公開第2015092737号パンフレット及び同第
2015092735号パンフレットに記載されるような、当業者にとって周知のCHO
-K1細胞株由来である。EP28aa1-16/EP14aa1-3組み換え細胞株を
調製するためにCHO株からの単一バイアルを使用した。
化学的に定義される培地中で細胞を増殖させた。1μgのSwaIで線状化したプラス
ミドDNA、EP28aa1-16/EP14aa1-3をコードする発現ベクターを遺
伝子移入につき添加した。化学的に定義された培地中で遺伝子移入反応を行った。
ミドDNA、EP28aa1-16/EP14aa1-3をコードする発現ベクターを遺
伝子移入につき添加した。化学的に定義された培地中で遺伝子移入反応を行った。
製造者の説明書に従い、AMAXA Gene Pulserを使用して、エレクトロ
ポレーションにより遺伝子移入を行った。遺伝子移入のために使用する親CHO細胞は、
指数増殖期であり、細胞生存能は95%を超えた。全部で、細胞5x106個/遺伝子移
入を使用して3回の遺伝子移入を行った。遺伝子移入の直後に、科学的に定義された培地
を含有する振盪フラスコに細胞を移した。
ポレーションにより遺伝子移入を行った。遺伝子移入のために使用する親CHO細胞は、
指数増殖期であり、細胞生存能は95%を超えた。全部で、細胞5x106個/遺伝子移
入を使用して3回の遺伝子移入を行った。遺伝子移入の直後に、科学的に定義された培地
を含有する振盪フラスコに細胞を移した。
選択工程の開始前に36.5℃及び10%CO2で細胞プールを48時間温置した。発
現ベクター中でコードされる選択マーカーを使用して、選択手順を行った。遺伝子移入及
び低葉酸条件下での増殖の48時間後に、化学的に定義された培地に10nM MTXを
添加することによって、さらなる選択圧をかけた。MTX選択開始から21日後に、主に
MTX耐性細胞からなるプール集団が出現した。プール後、回収細胞を凍結した。EP2
8aa1-16/EP14aa1-3の濃度の決定のために、化学的に定義された培地中
での標準的な流加培養を設定した。生成物濃度を決定するために、逆相クロマトグラフィ
ー(RPC)を使用した。個別化されたクローン細胞株を得るためのFACS単細胞選別
/細胞プリンター手順用に、EP28aa1-16/EP14aa1-3を産生するCH
O細胞プールを使用した。
現ベクター中でコードされる選択マーカーを使用して、選択手順を行った。遺伝子移入及
び低葉酸条件下での増殖の48時間後に、化学的に定義された培地に10nM MTXを
添加することによって、さらなる選択圧をかけた。MTX選択開始から21日後に、主に
MTX耐性細胞からなるプール集団が出現した。プール後、回収細胞を凍結した。EP2
8aa1-16/EP14aa1-3の濃度の決定のために、化学的に定義された培地中
での標準的な流加培養を設定した。生成物濃度を決定するために、逆相クロマトグラフィ
ー(RPC)を使用した。個別化されたクローン細胞株を得るためのFACS単細胞選別
/細胞プリンター手順用に、EP28aa1-16/EP14aa1-3を産生するCH
O細胞プールを使用した。
15.実施例14:治療用途
P2X7Rを活性化する細胞外ATPは、移植片対宿主疾患を促進するなど、いくつか
の疾患と明らかに関連している(Wilhelm et al.Graft-versu
s-host disease is enhanced by extracellu
lar ATP activating P2X7R.Nature Medicine
16:12,pages 1434-1439(2010))。
P2X7Rを活性化する細胞外ATPは、移植片対宿主疾患を促進するなど、いくつか
の疾患と明らかに関連している(Wilhelm et al.Graft-versu
s-host disease is enhanced by extracellu
lar ATP activating P2X7R.Nature Medicine
16:12,pages 1434-1439(2010))。
さらに、インビトロ及びインビボ試験の両方から、ADPのレベルを調節することによ
りCD39が心血管系の健康において重要なアピラーゼに相当することが示される。アピ
ラーゼは、細胞外ADPを代謝することによって血小板凝集を阻害することが知られてい
る。
りCD39が心血管系の健康において重要なアピラーゼに相当することが示される。アピ
ラーゼは、細胞外ADPを代謝することによって血小板凝集を阻害することが知られてい
る。
ヒトアピラーゼは、血小板上でADP受容体に不可逆的に結合するクロピドグレル(P
lavix(商標))のような他の治療薬とは対照的に、血小板と共有結合しない。これ
により、治療的阻害のより速やかな消失、従って血小板活性化が過剰である患者に対する
より安全なアプローチが可能になる。これは、血小板活性化が過剰である患者に対してよ
り安全なアプローチを提供する。
lavix(商標))のような他の治療薬とは対照的に、血小板と共有結合しない。これ
により、治療的阻害のより速やかな消失、従って血小板活性化が過剰である患者に対する
より安全なアプローチが可能になる。これは、血小板活性化が過剰である患者に対してよ
り安全なアプローチを提供する。
従って、本発明による化合物など、細胞外ATPのレベルを低下させる化合物の治療用
途のための明らかな根拠がある。
途のための明らかな根拠がある。
本発明による化合物の治療用途の具体的な非限定例は、外傷及び/又は低酸素による急
性臓器障害、例えば急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、肺傷害など、腎不全、急性腎臓傷
害(AKI)(冠動脈バイパス移植手術後の急性腎臓傷害を含む)、腎臓又は他の固形臓
器の移植(異種移植を含む)後の臓器移植後臓器機能障害又は血管疾患、例えば閉塞性血
管疾患など、移植及び異種移植、次のものに罹患している個体の処置:卒中発作、冠動脈
疾患又は心筋梗塞から起こる傷害、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、塞栓症、子癇
前症、血管形成術、血管傷害、移植、新生児低酸素性虚血性脳症、血小板関連虚血障害(
肺虚血、冠動脈虚血及び脳虚血を含む)、虚血再灌流傷害(IRI)血栓障害(冠動脈血
栓症、大脳動脈血栓症、心臓内血栓症、末梢動脈血栓症及び静脈血栓症を含む)、腎臓又
は他の固形臓器の移植(異種移植を含む)後の臓器移植後臓器機能障害、である。本発明
による化合物の治療用途の他の非限定例は、火傷又は放射線による損傷、敗血症の処置、
創傷治癒改善、出血若しくは出血リスクの軽減、臓器障害、移植片対宿主疾患の予防又は
移植拒絶の予防である。
性臓器障害、例えば急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、肺傷害など、腎不全、急性腎臓傷
害(AKI)(冠動脈バイパス移植手術後の急性腎臓傷害を含む)、腎臓又は他の固形臓
器の移植(異種移植を含む)後の臓器移植後臓器機能障害又は血管疾患、例えば閉塞性血
管疾患など、移植及び異種移植、次のものに罹患している個体の処置:卒中発作、冠動脈
疾患又は心筋梗塞から起こる傷害、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、塞栓症、子癇
前症、血管形成術、血管傷害、移植、新生児低酸素性虚血性脳症、血小板関連虚血障害(
肺虚血、冠動脈虚血及び脳虚血を含む)、虚血再灌流傷害(IRI)血栓障害(冠動脈血
栓症、大脳動脈血栓症、心臓内血栓症、末梢動脈血栓症及び静脈血栓症を含む)、腎臓又
は他の固形臓器の移植(異種移植を含む)後の臓器移植後臓器機能障害、である。本発明
による化合物の治療用途の他の非限定例は、火傷又は放射線による損傷、敗血症の処置、
創傷治癒改善、出血若しくは出血リスクの軽減、臓器障害、移植片対宿主疾患の予防又は
移植拒絶の予防である。
本発明による化合物の特に好ましい治療用途は、急性腎臓傷害(AKI)、例えば冠動
脈バイパス移植術後の急性腎臓傷害又は敗血症又は横紋筋融解症である。この状態は、患
者死亡率を上昇させ、標準治療(SoC)がない。集中治療ユニットにおけるAKIの主
要な原因は、敗血症(47.5%)、大手術(34%)、心原性ショック(27%)、血
液量減少(26%)及び腎毒性化合物(19%)である。さらにAKIは、慢性腎臓病(
CKD)の発症に対する独立した強いリスク因子である。大きな心臓手術患者の20~3
0%は急性腎臓傷害になる。別の好ましい実施形態は、心臓手術に関連する急性腎臓傷害
の処置のための本発明による単離アピラーゼの使用に関する。
脈バイパス移植術後の急性腎臓傷害又は敗血症又は横紋筋融解症である。この状態は、患
者死亡率を上昇させ、標準治療(SoC)がない。集中治療ユニットにおけるAKIの主
要な原因は、敗血症(47.5%)、大手術(34%)、心原性ショック(27%)、血
液量減少(26%)及び腎毒性化合物(19%)である。さらにAKIは、慢性腎臓病(
CKD)の発症に対する独立した強いリスク因子である。大きな心臓手術患者の20~3
0%は急性腎臓傷害になる。別の好ましい実施形態は、心臓手術に関連する急性腎臓傷害
の処置のための本発明による単離アピラーゼの使用に関する。
別の実施形態では、本開示は、臓器移植後臓器機能障害(DGF)、急性呼吸窮迫症候
群(ARDS)、急性心筋梗塞(AMI)、外傷性脳傷害(TBI)/急性虚血性発作(
AIS)又は多臓器不全(MOF)と呼ばれることが多いそれらの組み合わせの処置での
使用のための本発明による単離アピラーゼに関する。
群(ARDS)、急性心筋梗塞(AMI)、外傷性脳傷害(TBI)/急性虚血性発作(
AIS)又は多臓器不全(MOF)と呼ばれることが多いそれらの組み合わせの処置での
使用のための本発明による単離アピラーゼに関する。
16.急性腎臓傷害(AKI)は敗血症の一般的な合併症である。敗血症患者の28%
がAKIになる。さらなる好ましい実施形態では、本開示は、敗血症に付随する急性腎臓
傷害の処置のための本発明による単離アピラーゼの使用に関する。
がAKIになる。さらなる好ましい実施形態では、本開示は、敗血症に付随する急性腎臓
傷害の処置のための本発明による単離アピラーゼの使用に関する。
実施例15:治療組成物
治療用タンパク質は一般的に、即時投与の水性形態で又は投与前の適切な希釈剤での再
構成用の凍結乾燥物としての何れかで処方される。タンパク質は、例えばプレフィルドシ
リンジ中で、凍結乾燥物として、又は水性組成物としての何れかで処方され得る。
治療用タンパク質は一般的に、即時投与の水性形態で又は投与前の適切な希釈剤での再
構成用の凍結乾燥物としての何れかで処方される。タンパク質は、例えばプレフィルドシ
リンジ中で、凍結乾燥物として、又は水性組成物としての何れかで処方され得る。
適切な処方物は、患者への送達のための、水性医薬組成物又は、治療用タンパク質有効
成分が高濃度であり、タンパク質凝集が低レベルである溶液を与えるために再構成され得
る凍結乾燥物を提供し得る。高濃度のタンパク質は、患者に送達しなければならない物質
の量(用量)を低下させるので有用である。投与体積を小さくすることにより、患者に固
定用量を送達するために要する時間が抑えられる。高濃度タンパク質を伴う本発明の水性
組成物は皮下投与に特に適切である。
成分が高濃度であり、タンパク質凝集が低レベルである溶液を与えるために再構成され得
る凍結乾燥物を提供し得る。高濃度のタンパク質は、患者に送達しなければならない物質
の量(用量)を低下させるので有用である。投与体積を小さくすることにより、患者に固
定用量を送達するために要する時間が抑えられる。高濃度タンパク質を伴う本発明の水性
組成物は皮下投与に特に適切である。
従って、本発明は、例えば皮下投与のための、治療用タンパク質を含む、対象での投与
に適切な水性医薬組成物を提供する。
に適切な水性医薬組成物を提供する。
薬学的に許容可能な担体と組み合わせた場合、医薬組成物として治療用タンパク質を使
用し得る。このような組成物は、治療用タンパク質に加えて、担体、様々な希釈剤、充填
剤、塩、緩衝液、安定化剤、可溶化剤及び当技術分野で周知の他の物質を含有し得る。担
体の特徴は投与経路に依存する。開示される方法での使用のための医薬組成物は、特定の
標的障害の処置のためのさらなる治療剤も含有し得る。
用し得る。このような組成物は、治療用タンパク質に加えて、担体、様々な希釈剤、充填
剤、塩、緩衝液、安定化剤、可溶化剤及び当技術分野で周知の他の物質を含有し得る。担
体の特徴は投与経路に依存する。開示される方法での使用のための医薬組成物は、特定の
標的障害の処置のためのさらなる治療剤も含有し得る。
17.実施例16:投与経路
一般的には、本発明によるタンパク質は、注射により、例えば静脈内、腹腔内又は皮下
の何れかで投与される。この投与を遂行するための方法は当業者にとって公知である。局
所若しくは経口投与され得るか又は粘膜を横断して通過可能であり得る組成物を得ること
も可能であり得る。当業者により認識されるように、特定の選択された投与経路に適切な
ように、投与するための何らかの適切な投与のための手段を使用し得る。
一般的には、本発明によるタンパク質は、注射により、例えば静脈内、腹腔内又は皮下
の何れかで投与される。この投与を遂行するための方法は当業者にとって公知である。局
所若しくは経口投与され得るか又は粘膜を横断して通過可能であり得る組成物を得ること
も可能であり得る。当業者により認識されるように、特定の選択された投与経路に適切な
ように、投与するための何らかの適切な投与のための手段を使用し得る。
可能な投与経路の例としては、非経口(例えば静脈内(I.V.又はIV)、筋肉内(
IM)、皮内、皮下(S.C.又はSC)又は点滴)、経口及び肺(例えば吸入)、鼻腔
、経皮(局所)、経粘膜、動脈内、連続点滴及び直腸投与が挙げられる。非経口、皮内又
は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、次の構成成分:滅菌希釈剤、例えば注
射用の水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリ
コール又は他の合成溶媒など;抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベンな
ど;抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなど;キレート剤、例え
ばエチレンジアミンテトラ酢酸など;緩衝液、例えば酢酸、クエン酸又はリン酸など、及
び等張性の調整のための薬剤、例えば塩化ナトリウム又はデキストロースなどを含み得る
。酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムなどでpHを調整し得る。非経口製剤は
、ガラス又はプラスチック製の、アンプル、使い捨てシリンジ又は複数回投与バイアル中
に封入され得る。
IM)、皮内、皮下(S.C.又はSC)又は点滴)、経口及び肺(例えば吸入)、鼻腔
、経皮(局所)、経粘膜、動脈内、連続点滴及び直腸投与が挙げられる。非経口、皮内又
は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は、次の構成成分:滅菌希釈剤、例えば注
射用の水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリ
コール又は他の合成溶媒など;抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベンな
ど;抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなど;キレート剤、例え
ばエチレンジアミンテトラ酢酸など;緩衝液、例えば酢酸、クエン酸又はリン酸など、及
び等張性の調整のための薬剤、例えば塩化ナトリウム又はデキストロースなどを含み得る
。酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムなどでpHを調整し得る。非経口製剤は
、ガラス又はプラスチック製の、アンプル、使い捨てシリンジ又は複数回投与バイアル中
に封入され得る。
治療を必要とする対象への本発明によるタンパク質の「負荷用量」を投与することによ
って、アピラーゼ療法を開始し得る。「負荷用量」は、対象に投与される本発明によるタ
ンパク質の初回用量を意図し、ここで、投与される本発明によるタンパク質の用量はより
高い用量範囲内に入る。「負荷用量」は、単回投与、例えばタンパク質がIV投与される
場合は単回点滴として、又は、完全な「負荷用量」が約24時間の期間内(又は、疾患の
重症度に基づき、複数回静脈内投与が必要な場合は最初の月内)に投与される限り、複数
回投与として、例えばタンパク質がIV投与される場合は複数回点滴として、投与され得
る。「負荷用量」の投与後、次に本発明によるタンパク質の1回以上のさらなる治療的有
効用量を対象に投与する。例えば毎週投与するスケジュール又は2週間ごとに1回、3週
間ごとに1回若しくは4週間ごとに1回の投与に従い、後続の治療的有効用量を投与し得
る。このような実施形態では、後続の治療的有効用量は一般に、より低い用量範囲内に入
る。
って、アピラーゼ療法を開始し得る。「負荷用量」は、対象に投与される本発明によるタ
ンパク質の初回用量を意図し、ここで、投与される本発明によるタンパク質の用量はより
高い用量範囲内に入る。「負荷用量」は、単回投与、例えばタンパク質がIV投与される
場合は単回点滴として、又は、完全な「負荷用量」が約24時間の期間内(又は、疾患の
重症度に基づき、複数回静脈内投与が必要な場合は最初の月内)に投与される限り、複数
回投与として、例えばタンパク質がIV投与される場合は複数回点滴として、投与され得
る。「負荷用量」の投与後、次に本発明によるタンパク質の1回以上のさらなる治療的有
効用量を対象に投与する。例えば毎週投与するスケジュール又は2週間ごとに1回、3週
間ごとに1回若しくは4週間ごとに1回の投与に従い、後続の治療的有効用量を投与し得
る。このような実施形態では、後続の治療的有効用量は一般に、より低い用量範囲内に入
る。
或いは、いくつかの実施形態では、「負荷用量」後、本発明によるタンパク質の後の治
療的有効用量は、「維持スケジュール」に従い投与され、本発明によるタンパク質の治療
的有効用量は、1か月に1回、6週間ごとに1回、2か月ごとに1回、10週間ごとに1
回、3か月ごとに1回、14週間ごとに1開、4か月ごとに1回、18週間ごとに1回、
5か月ごとに1回、22週間ごとに1回、6か月ごとに1回、7か月ごとに1回、8か月
ごとに1回、9か月ごとに1回、10か月ごとに1回、11か月ごとに1回又は12か月
ごとに1回投与される。このような実施形態では、本発明によるタンパク質の治療的有効
用量は、特により頻繁な間隔で、例えば2週間ごとに1回~1か月に1回、後続用量が投
与される場合はより低い用量範囲内に入るか、又は、特に後続用量がより少ない頻度の間
隔で投与される場合、例えば続く用量が1か月~12か月離して投与される場合はより高
い用量範囲内に入る。
療的有効用量は、「維持スケジュール」に従い投与され、本発明によるタンパク質の治療
的有効用量は、1か月に1回、6週間ごとに1回、2か月ごとに1回、10週間ごとに1
回、3か月ごとに1回、14週間ごとに1開、4か月ごとに1回、18週間ごとに1回、
5か月ごとに1回、22週間ごとに1回、6か月ごとに1回、7か月ごとに1回、8か月
ごとに1回、9か月ごとに1回、10か月ごとに1回、11か月ごとに1回又は12か月
ごとに1回投与される。このような実施形態では、本発明によるタンパク質の治療的有効
用量は、特により頻繁な間隔で、例えば2週間ごとに1回~1か月に1回、後続用量が投
与される場合はより低い用量範囲内に入るか、又は、特に後続用量がより少ない頻度の間
隔で投与される場合、例えば続く用量が1か月~12か月離して投与される場合はより高
い用量範囲内に入る。
投与のタイミングは一般に、活性化合物の最初の投与日から測定され、これは「ベース
ライン」としても知られる。しかし、医療提供者によって異なる命名の慣習を使用する。
ライン」としても知られる。しかし、医療提供者によって異なる命名の慣習を使用する。
注目すべきこととして、第0週は、一部の医療提供者により第1週と呼ばれ得、一方で
第0日は、一部の医療提供者によって第1日と呼ばれ得る。従って、医師によっては、例
えば第3週中/第21日に、第3週中/第22日に、第4週中/第21日に、第4週中/
第22日に与えられるような用量と呼ぶ可能性があり、一方で同じ投与スケジュールを指
す。一貫性を保つために、投与の最初の週は本明細書中では第0週と呼び、一方で投与の
最初の日を第1日と呼ぶ。しかし、この命名の慣例は単に一貫性のために使用され、限定
するものと解釈すべきではなく、即ち毎週の投与は、医師が特定の週を「第1週」又は「
第2週」と呼ぶか否かにかかわらないタンパク質の週用量の提供であることを当業者は理
解するであろう。本明細書中で述べられるような投与レジメの例は図1及び2で見られる
。正確な時間点で用量が提供される必要がなく、例えば適切な週にそれが提供される限り
、およそ第29日での用量が例えば第24日~第34日に、例えば第30日に提供され得
ることが理解されるであろう。
第0日は、一部の医療提供者によって第1日と呼ばれ得る。従って、医師によっては、例
えば第3週中/第21日に、第3週中/第22日に、第4週中/第21日に、第4週中/
第22日に与えられるような用量と呼ぶ可能性があり、一方で同じ投与スケジュールを指
す。一貫性を保つために、投与の最初の週は本明細書中では第0週と呼び、一方で投与の
最初の日を第1日と呼ぶ。しかし、この命名の慣例は単に一貫性のために使用され、限定
するものと解釈すべきではなく、即ち毎週の投与は、医師が特定の週を「第1週」又は「
第2週」と呼ぶか否かにかかわらないタンパク質の週用量の提供であることを当業者は理
解するであろう。本明細書中で述べられるような投与レジメの例は図1及び2で見られる
。正確な時間点で用量が提供される必要がなく、例えば適切な週にそれが提供される限り
、およそ第29日での用量が例えば第24日~第34日に、例えば第30日に提供され得
ることが理解されるであろう。
本明細書中で使用される場合、「[指定される用量]の送達を可能にするためのタンパ
ク質の十分量を有する容器」という句は、ある種の容器(例えばバイアル、ペン、シリン
ジ)がそこに、所望の用量を提供するために使用され得るタンパク質(例えば医薬組成物
の一部として)の体積を配置していることを意味するために使用される。例として、所望
の用量が500mgである場合、臨床家は、250mg/mLの濃度のタンパク質処方物
を含有する容器から2mL、500mg/mLの濃度のタンパク質処方物を含有する容器
から1mL、1000mg/mLの濃度のタンパク質処方物を含有する容器から0.5m
Lなどを使用し得る。それぞれのこのような場合、これらの容器は、所望の500mg用
量の送達を可能にするためのタンパク質の十分量を有する。
ク質の十分量を有する容器」という句は、ある種の容器(例えばバイアル、ペン、シリン
ジ)がそこに、所望の用量を提供するために使用され得るタンパク質(例えば医薬組成物
の一部として)の体積を配置していることを意味するために使用される。例として、所望
の用量が500mgである場合、臨床家は、250mg/mLの濃度のタンパク質処方物
を含有する容器から2mL、500mg/mLの濃度のタンパク質処方物を含有する容器
から1mL、1000mg/mLの濃度のタンパク質処方物を含有する容器から0.5m
Lなどを使用し得る。それぞれのこのような場合、これらの容器は、所望の500mg用
量の送達を可能にするためのタンパク質の十分量を有する。
本明細書中で使用される場合、「[指定用量]の[投与経路]送達を可能にするための
投与量で処方される」という句は、指定の投与経路(例えばs.c.又はi.v.)を介
してタンパク質の所望の用量を提供するためにある種の医薬組成物が使用され得ることを
意味するために使用される。例として、所望の皮下用量が500mgである場合、臨床家
は、250mg/mLの濃度を有する2mLのタンパク質処方物、500mg/mLの濃
度を有する1mLのタンパク質処方物、1000mg/mLの濃度を有する0.5mLの
タンパク質処方物などを使用し得る。それぞれのこのような場合において、これらのタン
パク質処方物は、本タンパク質の皮下送達を可能にするのに十分に高い濃度である。皮下
送達は一般に、約2mL未満の体積、好ましくは約1mL以下の体積の送達を必要とする
。しかし、例えばパッチ/ポンプ機序を使用して経時的により大きな体積が送達され得る
。
投与量で処方される」という句は、指定の投与経路(例えばs.c.又はi.v.)を介
してタンパク質の所望の用量を提供するためにある種の医薬組成物が使用され得ることを
意味するために使用される。例として、所望の皮下用量が500mgである場合、臨床家
は、250mg/mLの濃度を有する2mLのタンパク質処方物、500mg/mLの濃
度を有する1mLのタンパク質処方物、1000mg/mLの濃度を有する0.5mLの
タンパク質処方物などを使用し得る。それぞれのこのような場合において、これらのタン
パク質処方物は、本タンパク質の皮下送達を可能にするのに十分に高い濃度である。皮下
送達は一般に、約2mL未満の体積、好ましくは約1mL以下の体積の送達を必要とする
。しかし、例えばパッチ/ポンプ機序を使用して経時的により大きな体積が送達され得る
。
患者における組織損傷処置用の薬剤の製造のためのタンパク質の使用が本明細書中で開
示され、この薬剤は、容器を含むように処方され、各容器は、少なくとも約75mg、1
50mg、300mg又は600mgタンパク質/単位用量の送達を可能とするためのタ
ンパク質の十分な量を有する。
示され、この薬剤は、容器を含むように処方され、各容器は、少なくとも約75mg、1
50mg、300mg又は600mgタンパク質/単位用量の送達を可能とするためのタ
ンパク質の十分な量を有する。
患者における組織損傷処置用の薬剤の製造のためのタンパク質の使用が本明細書中で開
示され、この薬剤は、600mgのうち75mg、150mg、300mgのタンパク質
/単位用量で全身送達(例えばi.v.又はs.c.送達)することを可能にするための
投与量で処方される。
示され、この薬剤は、600mgのうち75mg、150mg、300mgのタンパク質
/単位用量で全身送達(例えばi.v.又はs.c.送達)することを可能にするための
投与量で処方される。
18.実施例17:キット
本開示は、(場合に応じて)タンパク質で組織損傷がある患者を処置するためのキット
も包含する。このようなキットは、タンパク質(例えば液体又は凍結乾燥形態)又はこの
タンパク質(上記)を含む医薬組成物を含む。さらに、このようなキットは、本タンパク
質を投与するための手段(例えばシリンジ及びバイアル、プレフィルドシリンジ、プレフ
ィルドペン、パッチ/ポンプ)及び使用説明書を含み得る。この説明書は、具体的な投与
計画の一部として患者にタンパク質を提供することを開示し得る。これらのキットは、例
えば開示されるタンパク質と組み合わせた送達のために、乾癬を処置するためのさらなる
治療剤(上記)も含有し得る。
本開示は、(場合に応じて)タンパク質で組織損傷がある患者を処置するためのキット
も包含する。このようなキットは、タンパク質(例えば液体又は凍結乾燥形態)又はこの
タンパク質(上記)を含む医薬組成物を含む。さらに、このようなキットは、本タンパク
質を投与するための手段(例えばシリンジ及びバイアル、プレフィルドシリンジ、プレフ
ィルドペン、パッチ/ポンプ)及び使用説明書を含み得る。この説明書は、具体的な投与
計画の一部として患者にタンパク質を提供することを開示し得る。これらのキットは、例
えば開示されるタンパク質と組み合わせた送達のために、乾癬を処置するためのさらなる
治療剤(上記)も含有し得る。
「投与するための手段」という句は、プレフィルドシリンジ、バイアル及びシリンジ、
注射ペン、自動注入装置、i.v.点滴及びバッグ、ポンプ、パッチ/ポンプなどを含む
が限定されない、患者に薬物を全身投与するための何らかの利用可能な装備を示すために
使用される。このような物品を使用して、患者は、薬物を自分で投与(即ち自分自身のた
めに薬物を投与)し得るか、又はケア提供者若しくは医師が薬物を投与し得る。
注射ペン、自動注入装置、i.v.点滴及びバッグ、ポンプ、パッチ/ポンプなどを含む
が限定されない、患者に薬物を全身投与するための何らかの利用可能な装備を示すために
使用される。このような物品を使用して、患者は、薬物を自分で投与(即ち自分自身のた
めに薬物を投与)し得るか、又はケア提供者若しくは医師が薬物を投与し得る。
a)タンパク質の治療的有効量を含む医薬組成物;b)患者に本タンパク質を投与する
ための手段;及びc)それを必要とする患者にタンパク質を皮下投与することを提供する
説明書を含む、組織損傷を有する患者の処置のためのキットが本明細書中で開示される。
ための手段;及びc)それを必要とする患者にタンパク質を皮下投与することを提供する
説明書を含む、組織損傷を有する患者の処置のためのキットが本明細書中で開示される。
配列表
本発明を実施するための有用なアミノ酸及びヌクレオチド配列を表35で開示する。
本発明を実施するための有用なアミノ酸及びヌクレオチド配列を表35で開示する。
a)タンパク質の治療的有効量を含む医薬組成物;b)患者に本タンパク質を投与するための手段;及びc)それを必要とする患者にタンパク質を皮下投与することを提供する説明書を含む、組織損傷を有する患者の処置のためのキットが本明細書中で開示される。
以下の態様を包含し得る。
[1] N末端欠失、C末端欠失及び中央部修飾からなるリストから選択される少なくとも2つの修飾を有する可溶化ヒトアピラーゼ。
[2] N末端欠失、C末端欠失及び中央部修飾を有する、上記[1]に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
[3] a)前記N末端欠失が30~50アミノ酸長であり、
b)前記C末端欠失が20~40アミノ酸長であり、
c)前記中央部修飾が欠失及び/又は点突然変異を含む、
上記[1]又は[2]に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
[4] 前記中央部修飾が、10~15個の連続アミノ酸の欠失を含む、上記[1]~[3]の何れか一項に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
[5] 中央部の欠失が、配列番号1に記載の野生型CD39配列に対する、アミノ酸番号193~204の欠失である、上記[4]に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
[6] 前記中央部修飾が、K71E、N73Q、V95A、G102D、Y104S、T106S、R113M、L149M、V151A、E173D、T229A、L254M、K258R、W263R、E276D、N292Q、R304G、I319T、N327Q、A362N、F365S、N371Q、K405N、Y412F、L424Q、H436D、I437N、F439S、G441D、N457Q、P463S及びS469Rからなる群から選択される、配列番号1に記載の野生型CD39配列に対する1、2、3、4又は5個の点突然変異を含む点突然変異を含む、上記[1]~[5]の何れか一項に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
[7] 配列番号4、配列番号6、配列番号32、配列番号54、配列番号56、配列番号70、配列番号76及び配列番号78からなる群から選択される配列を含む、上記[1]~[6]の何れか一項に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
[8] 配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139及び配列番号141からなる群から選択される配列を含む、上記[1]~[7]の何れか一項に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
[9] 配列番号213、配列番号227、配列番号219、配列番号225、配列番号217、配列番号209、配列番号221、配列番号72、配列番号215、配列番号223、配列番号211、配列番号58及び配列番号229からなる群から選択される配列を含むか又はそれらからなる、上記[8]に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
[10] 配列番号58、配列番号72及び配列番号229からなる群から選択される配列からなる、上記[9]に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
[11] 上記[1]~[10]の何れか一項に記載のアピラーゼの治療的有効用量と、1つ以上の薬学的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。
[12] 1つ以上のさらなる有効成分をさらに含む、上記[11]に記載の医薬組成物。
[13] 薬剤としての使用のための上記[1]~[10]の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
[14] 組織損傷の処置における使用のための上記[1]~[10]の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
[15] 前記組織損傷が、急性脳傷害(卒中発作);急性多臓器不全;腎臓又は他の固形臓器の移植後の臓器移植後臓器機能障害;火傷による損傷;放射線による損傷;外傷及び/又は急性呼吸窮迫症候群(ARDS)又は肺傷害などの低酸素による急性損傷;急性腎臓傷害、例えば胸部手術(例えば大動脈弁置換術、冠動脈バイパス術)又は敗血症又は横紋筋融解症又は抗生物質若しくは他の薬品の毒性効果に対する二次的な急性腎臓傷害など;急性心筋傷害である、上記[14]に記載の使用のための単離アピラーゼ。
[16] 心臓手術に伴う急性腎臓傷害の処置での使用のための上記[1]~[10]の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
[17] 臓器移植後臓器機能障害(DGF)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、急性心筋梗塞(AMI)、外傷性脳傷害(TBI)/急性虚血性発作(AIS)、虚血再灌流傷害(IRI)又は多臓器不全(MOF)と呼ばれることが多いそれらの組み合わせの処置における使用のための、上記[1]~[10]の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
[18] 敗血症に付随する急性腎臓傷害の処置での使用のための、上記[1]~[10]の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
[19] 対象に対して可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、ヒト対象において組織損傷を処置する方法。
[20] 前記可溶化ヒトアピラーゼが上記[1]~[10]の何れか一項に記載のアピラーゼである、上記[19]に記載の方法。
[21] 前記組織損傷が、急性脳傷害(卒中発作);急性多臓器不全;腎臓又は他の固形臓器移植後の臓器移植後臓器機能障害;火傷による損傷;放射線による損傷;外傷及び/又は急性呼吸窮迫症候群(ARDS)又は肺傷害などの低酸素による急性損傷;急性腎臓傷害、例えば胸部手術(例えば大動脈弁置換術、冠動脈バイパス術)又は敗血症又は横紋筋融解症又は抗生物質若しくは他の薬品の毒性効果に対する二次的な急性腎臓傷害など;急性心筋傷害である、上記[19]又は[20]に記載の方法。
[22] 心臓手術に付随する急性腎臓傷害を処置する方法であって、このような処置を必要とする対象に可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、方法。
[23] 臓器移植後臓器機能障害(DGF)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、急性心筋梗塞(AMI)、外傷性脳傷害(TBI)/急性虚血性発作(AIS)虚血再灌流傷害(IRI)又は多臓器不全(MOF)と呼ばれることが多いそれらの組み合わせを処置する方法であって、このような処置を必要とする対象に可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、方法。
[24] 敗血症に付随する急性腎臓傷害を処置する方法であって、このような処置を必要とする対象に可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、方法。
[25] 上記[1]~[10]の何れか一項に記載の何れかのアピラーゼをコードする単離核酸分子。
[26] 上記[1]~[10]の何れか一項に記載の単離アピラーゼの組み換え産生に適切である、上記[25]に記載の1つ以上の核酸配列を含むクローニング又は発現ベクター。
[27] 上記[26]に記載の1つ以上のクローニング又は発現ベクターを含む、宿主細胞。
[28] 上記[27]に記載の宿主細胞を培養し、アピラーゼを精製して回収することを含む、上記[1]~[10]の何れか一項に記載のアピラーゼの産生のためのプロセス。
以下の態様を包含し得る。
[1] N末端欠失、C末端欠失及び中央部修飾からなるリストから選択される少なくとも2つの修飾を有する可溶化ヒトアピラーゼ。
[2] N末端欠失、C末端欠失及び中央部修飾を有する、上記[1]に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
[3] a)前記N末端欠失が30~50アミノ酸長であり、
b)前記C末端欠失が20~40アミノ酸長であり、
c)前記中央部修飾が欠失及び/又は点突然変異を含む、
上記[1]又は[2]に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
[4] 前記中央部修飾が、10~15個の連続アミノ酸の欠失を含む、上記[1]~[3]の何れか一項に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
[5] 中央部の欠失が、配列番号1に記載の野生型CD39配列に対する、アミノ酸番号193~204の欠失である、上記[4]に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
[6] 前記中央部修飾が、K71E、N73Q、V95A、G102D、Y104S、T106S、R113M、L149M、V151A、E173D、T229A、L254M、K258R、W263R、E276D、N292Q、R304G、I319T、N327Q、A362N、F365S、N371Q、K405N、Y412F、L424Q、H436D、I437N、F439S、G441D、N457Q、P463S及びS469Rからなる群から選択される、配列番号1に記載の野生型CD39配列に対する1、2、3、4又は5個の点突然変異を含む点突然変異を含む、上記[1]~[5]の何れか一項に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
[7] 配列番号4、配列番号6、配列番号32、配列番号54、配列番号56、配列番号70、配列番号76及び配列番号78からなる群から選択される配列を含む、上記[1]~[6]の何れか一項に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
[8] 配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139及び配列番号141からなる群から選択される配列を含む、上記[1]~[7]の何れか一項に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
[9] 配列番号213、配列番号227、配列番号219、配列番号225、配列番号217、配列番号209、配列番号221、配列番号72、配列番号215、配列番号223、配列番号211、配列番号58及び配列番号229からなる群から選択される配列を含むか又はそれらからなる、上記[8]に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
[10] 配列番号58、配列番号72及び配列番号229からなる群から選択される配列からなる、上記[9]に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
[11] 上記[1]~[10]の何れか一項に記載のアピラーゼの治療的有効用量と、1つ以上の薬学的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。
[12] 1つ以上のさらなる有効成分をさらに含む、上記[11]に記載の医薬組成物。
[13] 薬剤としての使用のための上記[1]~[10]の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
[14] 組織損傷の処置における使用のための上記[1]~[10]の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
[15] 前記組織損傷が、急性脳傷害(卒中発作);急性多臓器不全;腎臓又は他の固形臓器の移植後の臓器移植後臓器機能障害;火傷による損傷;放射線による損傷;外傷及び/又は急性呼吸窮迫症候群(ARDS)又は肺傷害などの低酸素による急性損傷;急性腎臓傷害、例えば胸部手術(例えば大動脈弁置換術、冠動脈バイパス術)又は敗血症又は横紋筋融解症又は抗生物質若しくは他の薬品の毒性効果に対する二次的な急性腎臓傷害など;急性心筋傷害である、上記[14]に記載の使用のための単離アピラーゼ。
[16] 心臓手術に伴う急性腎臓傷害の処置での使用のための上記[1]~[10]の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
[17] 臓器移植後臓器機能障害(DGF)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、急性心筋梗塞(AMI)、外傷性脳傷害(TBI)/急性虚血性発作(AIS)、虚血再灌流傷害(IRI)又は多臓器不全(MOF)と呼ばれることが多いそれらの組み合わせの処置における使用のための、上記[1]~[10]の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
[18] 敗血症に付随する急性腎臓傷害の処置での使用のための、上記[1]~[10]の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
[19] 対象に対して可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、ヒト対象において組織損傷を処置する方法。
[20] 前記可溶化ヒトアピラーゼが上記[1]~[10]の何れか一項に記載のアピラーゼである、上記[19]に記載の方法。
[21] 前記組織損傷が、急性脳傷害(卒中発作);急性多臓器不全;腎臓又は他の固形臓器移植後の臓器移植後臓器機能障害;火傷による損傷;放射線による損傷;外傷及び/又は急性呼吸窮迫症候群(ARDS)又は肺傷害などの低酸素による急性損傷;急性腎臓傷害、例えば胸部手術(例えば大動脈弁置換術、冠動脈バイパス術)又は敗血症又は横紋筋融解症又は抗生物質若しくは他の薬品の毒性効果に対する二次的な急性腎臓傷害など;急性心筋傷害である、上記[19]又は[20]に記載の方法。
[22] 心臓手術に付随する急性腎臓傷害を処置する方法であって、このような処置を必要とする対象に可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、方法。
[23] 臓器移植後臓器機能障害(DGF)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、急性心筋梗塞(AMI)、外傷性脳傷害(TBI)/急性虚血性発作(AIS)虚血再灌流傷害(IRI)又は多臓器不全(MOF)と呼ばれることが多いそれらの組み合わせを処置する方法であって、このような処置を必要とする対象に可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、方法。
[24] 敗血症に付随する急性腎臓傷害を処置する方法であって、このような処置を必要とする対象に可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、方法。
[25] 上記[1]~[10]の何れか一項に記載の何れかのアピラーゼをコードする単離核酸分子。
[26] 上記[1]~[10]の何れか一項に記載の単離アピラーゼの組み換え産生に適切である、上記[25]に記載の1つ以上の核酸配列を含むクローニング又は発現ベクター。
[27] 上記[26]に記載の1つ以上のクローニング又は発現ベクターを含む、宿主細胞。
[28] 上記[27]に記載の宿主細胞を培養し、アピラーゼを精製して回収することを含む、上記[1]~[10]の何れか一項に記載のアピラーゼの産生のためのプロセス。
Claims (28)
- N末端欠失、C末端欠失及び中央部修飾からなるリストから選択される少なくとも2つ
の修飾を有する可溶化ヒトアピラーゼ。 - N末端欠失、C末端欠失及び中央部修飾を有する、請求項1に記載の可溶化ヒトアピラ
ーゼ。 - a)前記N末端欠失が30~50アミノ酸長であり、
b)前記C末端欠失が20~40アミノ酸長であり、
c)前記中央部修飾が欠失及び/又は点突然変異を含む、
請求項1又は2に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。 - 前記中央部修飾が、10~15個の連続アミノ酸の欠失を含む、請求項1~3の何れか
一項に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。 - 中央部の欠失が、配列番号1に記載の野生型CD39配列に対する、アミノ酸番号19
3~204の欠失である、請求項4に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。 - 前記中央部修飾が、K71E、N73Q、V95A、G102D、Y104S、T10
6S、R113M、L149M、V151A、E173D、T229A、L254M、K
258R、W263R、E276D、N292Q、R304G、I319T、N327Q
、A362N、F365S、N371Q、K405N、Y412F、L424Q、H43
6D、I437N、F439S、G441D、N457Q、P463S及びS469Rか
らなる群から選択される、配列番号1に記載の野生型CD39配列に対する1、2、3、
4又は5個の点突然変異を含む点突然変異を含む、請求項1~5の何れか一項に記載の可
溶化ヒトアピラーゼ。 - 配列番号4、配列番号6、配列番号32、配列番号54、配列番号56、配列番号70
、配列番号76及び配列番号78からなる群から選択される配列を含む、請求項1~6の
何れか一項に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。 - 配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139
及び配列番号141からなる群から選択される配列を含む、請求項1~7の何れか一項に
記載の可溶化ヒトアピラーゼ。 - 配列番号213、配列番号227、配列番号219、配列番号225、配列番号217
、配列番号209、配列番号221、配列番号72、配列番号215、配列番号223、
配列番号211、配列番号58及び配列番号229からなる群から選択される配列を含む
か又はそれらからなる、請求項8に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。 - 配列番号58、配列番号72及び配列番号229からなる群から選択される配列からな
る、請求項9に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。 - 請求項1~10の何れか一項に記載のアピラーゼの治療的有効用量と、1つ以上の薬学
的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。 - 1つ以上のさらなる有効成分をさらに含む、請求項11に記載の医薬組成物。
- 薬剤としての使用のための請求項1~10の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
- 組織損傷の処置における使用のための請求項1~10の何れか一項に記載の単離アピラ
ーゼ。 - 前記組織損傷が、急性脳傷害(卒中発作);急性多臓器不全;腎臓又は他の固形臓器の
移植後の臓器移植後臓器機能障害;火傷による損傷;放射線による損傷;外傷及び/又は
急性呼吸窮迫症候群(ARDS)又は肺傷害などの低酸素による急性損傷;急性腎臓傷害
、例えば胸部手術(例えば大動脈弁置換術、冠動脈バイパス術)又は敗血症又は横紋筋融
解症又は抗生物質若しくは他の薬品の毒性効果に対する二次的な急性腎臓傷害など;急性
心筋傷害である、請求項14に記載の使用のための単離アピラーゼ。 - 心臓手術に伴う急性腎臓傷害の処置での使用のための請求項1~10の何れか一項に記
載の単離アピラーゼ。 - 臓器移植後臓器機能障害(DGF)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、急性心筋梗塞
(AMI)、外傷性脳傷害(TBI)/急性虚血性発作(AIS)、虚血再灌流傷害(I
RI)又は多臓器不全(MOF)と呼ばれることが多いそれらの組み合わせの処置におけ
る使用のための、請求項1~10の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。 - 敗血症に付随する急性腎臓傷害の処置での使用のための、請求項1~10の何れか一項
に記載の単離アピラーゼ。 - 対象に対して可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、ヒト対象
において組織損傷を処置する方法。 - 前記可溶化ヒトアピラーゼが請求項1~10の何れか一項に記載のアピラーゼである、
請求項19に記載の方法。 - 前記組織損傷が、急性脳傷害(卒中発作);急性多臓器不全;腎臓又は他の固形臓器移
植後の臓器移植後臓器機能障害;火傷による損傷;放射線による損傷;外傷及び/又は急
性呼吸窮迫症候群(ARDS)又は肺傷害などの低酸素による急性損傷;急性腎臓傷害、
例えば胸部手術(例えば大動脈弁置換術、冠動脈バイパス術)又は敗血症又は横紋筋融解
症又は抗生物質若しくは他の薬品の毒性効果に対する二次的な急性腎臓傷害など;急性心
筋傷害である、請求項19又は20に記載の方法。 - 心臓手術に付随する急性腎臓傷害を処置する方法であって、このような処置を必要とす
る対象に可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、方法。 - 臓器移植後臓器機能障害(DGF)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、急性心筋梗塞
(AMI)、外傷性脳傷害(TBI)/急性虚血性発作(AIS)虚血再灌流傷害(IR
I)又は多臓器不全(MOF)と呼ばれることが多いそれらの組み合わせを処置する方法
であって、このような処置を必要とする対象に可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を
投与することを含む、方法。 - 敗血症に付随する急性腎臓傷害を処置する方法であって、このような処置を必要とする
対象に可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、方法。 - 請求項1~10の何れか一項に記載の何れかのアピラーゼをコードする単離核酸分子。
- 請求項1~10の何れか一項に記載の単離アピラーゼの組み換え産生に適切である、請
求項25に記載の1つ以上の核酸配列を含むクローニング又は発現ベクター。 - 請求項26に記載の1つ以上のクローニング又は発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項27に記載の宿主細胞を培養し、アピラーゼを精製して回収することを含む、請
求項1~10の何れか一項に記載のアピラーゼの産生のための工程。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP18184269.1 | 2018-07-18 | ||
EP18184269 | 2018-07-18 | ||
PCT/IB2019/056117 WO2020016804A1 (en) | 2018-07-18 | 2019-07-17 | Solubilized apyrases, methods and use |
JP2021502432A JP7425784B2 (ja) | 2018-07-18 | 2019-07-17 | 可溶化アピラーゼ、方法及び使用 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021502432A Division JP7425784B2 (ja) | 2018-07-18 | 2019-07-17 | 可溶化アピラーゼ、方法及び使用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2024023297A true JP2024023297A (ja) | 2024-02-21 |
Family
ID=62985993
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021502432A Active JP7425784B2 (ja) | 2018-07-18 | 2019-07-17 | 可溶化アピラーゼ、方法及び使用 |
JP2023193640A Pending JP2024023297A (ja) | 2018-07-18 | 2023-11-14 | 可溶化アピラーゼ、方法及び使用 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021502432A Active JP7425784B2 (ja) | 2018-07-18 | 2019-07-17 | 可溶化アピラーゼ、方法及び使用 |
Country Status (26)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220356455A1 (ja) |
EP (1) | EP3824079A1 (ja) |
JP (2) | JP7425784B2 (ja) |
KR (1) | KR20210035806A (ja) |
CN (1) | CN112424346A (ja) |
AR (1) | AR115790A1 (ja) |
AU (1) | AU2019306821B2 (ja) |
BR (1) | BR112021000586A2 (ja) |
CA (1) | CA3103684A1 (ja) |
CL (1) | CL2021000129A1 (ja) |
CO (1) | CO2021000210A2 (ja) |
CR (1) | CR20210021A (ja) |
CU (1) | CU20210008A7 (ja) |
EA (1) | EA202190057A1 (ja) |
EC (1) | ECSP21002804A (ja) |
IL (1) | IL280191A (ja) |
JO (1) | JOP20210008A1 (ja) |
MA (1) | MA53177A (ja) |
MX (1) | MX2021000542A (ja) |
PE (1) | PE20210185A1 (ja) |
PH (1) | PH12021550122A1 (ja) |
SG (1) | SG11202011776RA (ja) |
TW (1) | TW202016299A (ja) |
UY (1) | UY38299A (ja) |
WO (1) | WO2020016804A1 (ja) |
ZA (1) | ZA202007187B (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2021243173A1 (en) * | 2020-05-28 | 2021-12-02 | Charm Sciences, Inc. | Methods and assemblies for sample analysis |
WO2024023746A1 (en) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Novartis Ag | Improved production of cd39 variants |
TW202404627A (zh) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | 瑞士商諾華公司 | 使用cd39、重組cd39用於急性器官損傷的治療 |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU6425699A (en) | 1998-10-16 | 2000-05-08 | Cornell Research Foundation Inc. | Methods of inhibiting platelet activation and recruitment |
US20020002277A1 (en) * | 1998-10-16 | 2002-01-03 | Maliszewski Charles Richard | Inhibitors of platelet activation and recruitment |
US6867177B2 (en) | 1999-08-13 | 2005-03-15 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | CD39/ECTO-adpase as a treatment for thrombotic and ischemic disorders |
US7247300B1 (en) | 2002-11-07 | 2007-07-24 | Apt Therapeutics, Inc. | Therapeutic use of soluble CD39L3 |
WO2006096989A2 (en) | 2005-03-17 | 2006-09-21 | National Research Council Of Canada | Expression vectors containing a truncated epstein barr nuclear antigen 1 lacking the gly-gly-ala domain for enhanced transient gene expression |
WO2011088231A1 (en) * | 2010-01-13 | 2011-07-21 | Apt Therapeutics, Inc. | Apyrase therapy for bleeding conditions |
DK3083677T3 (da) | 2013-12-20 | 2019-11-25 | Novartis Ag | Hidtil ukendte eukaryote celler og fremgangsmåder til rekombinant ekspression af et produkt af interesse |
RU2720525C2 (ru) | 2013-12-20 | 2020-04-30 | Новартис Аг | Новые эукариотические клетки и способы их получения для рекомбинантной экспрессии представляющего интерес продукта |
-
2019
- 2019-07-15 UY UY0001038299A patent/UY38299A/es unknown
- 2019-07-16 TW TW108125140A patent/TW202016299A/zh unknown
- 2019-07-16 AR ARP190102009A patent/AR115790A1/es unknown
- 2019-07-17 CN CN201980047594.2A patent/CN112424346A/zh active Pending
- 2019-07-17 PE PE2021000054A patent/PE20210185A1/es unknown
- 2019-07-17 CR CR20210021A patent/CR20210021A/es unknown
- 2019-07-17 US US17/261,533 patent/US20220356455A1/en active Pending
- 2019-07-17 AU AU2019306821A patent/AU2019306821B2/en active Active
- 2019-07-17 BR BR112021000586-2A patent/BR112021000586A2/pt unknown
- 2019-07-17 CA CA3103684A patent/CA3103684A1/en active Pending
- 2019-07-17 WO PCT/IB2019/056117 patent/WO2020016804A1/en active Application Filing
- 2019-07-17 MA MA053177A patent/MA53177A/fr unknown
- 2019-07-17 EP EP19769879.8A patent/EP3824079A1/en active Pending
- 2019-07-17 KR KR1020217001187A patent/KR20210035806A/ko unknown
- 2019-07-17 EA EA202190057A patent/EA202190057A1/ru unknown
- 2019-07-17 SG SG11202011776RA patent/SG11202011776RA/en unknown
- 2019-07-17 MX MX2021000542A patent/MX2021000542A/es unknown
- 2019-07-17 JO JOP/2021/0008A patent/JOP20210008A1/ar unknown
- 2019-07-17 CU CU2021000008A patent/CU20210008A7/es unknown
- 2019-07-17 JP JP2021502432A patent/JP7425784B2/ja active Active
-
2020
- 2020-11-18 ZA ZA2020/07187A patent/ZA202007187B/en unknown
-
2021
- 2021-01-14 IL IL280191A patent/IL280191A/en unknown
- 2021-01-14 EC ECSENADI20212804A patent/ECSP21002804A/es unknown
- 2021-01-14 CO CONC2021/0000210A patent/CO2021000210A2/es unknown
- 2021-01-15 PH PH12021550122A patent/PH12021550122A1/en unknown
- 2021-01-15 CL CL2021000129A patent/CL2021000129A1/es unknown
-
2023
- 2023-11-14 JP JP2023193640A patent/JP2024023297A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA3103684A1 (en) | 2020-01-23 |
AU2019306821A1 (en) | 2020-12-24 |
CO2021000210A2 (es) | 2021-01-18 |
BR112021000586A2 (pt) | 2021-04-06 |
KR20210035806A (ko) | 2021-04-01 |
AR115790A1 (es) | 2021-02-24 |
CU20210008A7 (es) | 2021-08-06 |
JP7425784B2 (ja) | 2024-01-31 |
US20220356455A1 (en) | 2022-11-10 |
PE20210185A1 (es) | 2021-02-02 |
EP3824079A1 (en) | 2021-05-26 |
SG11202011776RA (en) | 2021-02-25 |
WO2020016804A1 (en) | 2020-01-23 |
CR20210021A (es) | 2021-03-23 |
CL2021000129A1 (es) | 2021-08-20 |
MA53177A (fr) | 2021-05-26 |
ZA202007187B (en) | 2022-06-29 |
PH12021550122A1 (en) | 2021-09-27 |
CN112424346A (zh) | 2021-02-26 |
JOP20210008A1 (ar) | 2021-01-12 |
JP2021529550A (ja) | 2021-11-04 |
MX2021000542A (es) | 2021-03-29 |
ECSP21002804A (es) | 2021-04-29 |
TW202016299A (zh) | 2020-05-01 |
UY38299A (es) | 2020-02-28 |
AU2019306821B2 (en) | 2022-09-29 |
EA202190057A1 (ru) | 2021-08-24 |
IL280191A (en) | 2021-03-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2024023297A (ja) | 可溶化アピラーゼ、方法及び使用 | |
US4966849A (en) | CDNA and genes for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression | |
KR101992807B1 (ko) | 조직 재생을 유도하기 위한 펩티드 및 그의 이용 | |
JP2016028604A (ja) | IL−4Rαに結合する涙液リポカリンムテイン | |
JP2018535964A (ja) | 線維芽細胞増殖因子(fgf)1アナログによるステロイド誘導性高血糖の処置 | |
CA2848118C (en) | Endostatin mutants with mutations at atp binding sites | |
Huang et al. | The bifunctional SDF‐1‐AnxA5 fusion protein protects cardiac function after myocardial infarction | |
CN109071678A (zh) | 神经生长因子融合蛋白、制备方法及其用途 | |
CN101875693A (zh) | 具备抗血管生成活性的白蛋白变异体及其制备方法 | |
CN101516907A (zh) | 泪液脂质运载蛋白的突变蛋白及其获得方法 | |
CN111373034A (zh) | 重组尿酸酶 | |
CN109867725B (zh) | PD-1-Fc融合蛋白及其制备方法和用途 | |
CN111770767A (zh) | 用于从生物流体中去除纤溶蛋白的体外设备和基质、其方法和用途 | |
CN114621327B (zh) | GLP-1、GIP和Gcg多重受体激动蛋白质 | |
RU2791992C2 (ru) | Солюбилизированные апиразы, способы и применение | |
CN113583107B (zh) | CRIg功能区蛋白变体及其应用 | |
EA023016B1 (ru) | Составной белок | |
CN113024675A (zh) | 一种hb-nc4重组蛋白及其制备方法与应用 | |
JP2023527816A (ja) | インターロイキン-1受容体アンタゴニスト及びそれを含む融合タンパク質 | |
JP2004520056A (ja) | 可溶性ssaoの精製のための方法 | |
CN114617956B (zh) | 一种高效降糖的蛋白质药物 | |
JP3471879B2 (ja) | セリンキナーゼ活性の抑制方法、pi3−キナーゼのサブユニット間の結合活性の調整方法、pi3−キナーゼのサブユニット結合抗体、この抗体を生成するハイブリドーマ細胞系、核酸分子、プラスミド、アゴニスト、アンタゴニスト、pi3−キナーゼ活性を抑制するサブユニット結合分子、サブユニットの存在検出方法、pi3−キナーゼ活性の抑制剤製造方法、およびpi3−キナーゼ活性の抑制剤 | |
CN114805562B (zh) | 抗新型冠状病毒人源化纳米抗体及其应用 | |
KR20110026071A (ko) | 인간 호메오 도메인 유전자 유래의 단백질 도입 도메인 및 이를 이용한 단백질 도입 벡터 | |
EP3430059A1 (en) | Anti-antithrombin single-domain antibodies and polypeptides comprising thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231213 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20231213 |