BR112021000586A2 - Apirases solubilizadas, métodos e uso - Google Patents
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Abstract
a presente invenção refere-se ao projeto e uso terapêutico de polipeptídeos de apirase solubilizada, composições farmacêuticas, usos terapêuticos e métodos úteis para prevenção e tratamento de dano tecidual.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "APIRASES SOLUBILIZADAS, MÉTODOS E USO".
[0001] A presente invenção refere-se ao projeto e uso terapêutico de polipeptídeos de apirase solubilizada, composições farmacêuticas e métodos úteis para prevenção e tratamento de dano tecidual.
[0002] Apirase (ATP-difosfatase, adenosina difosfatase, ADPase ou ATP difosfo-hidrolase) é um grupo enzimático ligado à membrana plasmática de enzimas ativas contra ambos nucleotídeos di e trifosfato (NDPs e NTPs) e que hidrolisam NTPs em monofosfatos de nucleotídeo (NMPs) em duas etapas de liberação de fosfato sucessivas distintas, com NDPs como intermediários. A maioria das ecto-ATPases que ocorrem na superfície celular e hidrolisam nucleotídeos extracelular pertencem a essa família enzimática. As mesmas se diferem de ATPases, que hidrolisam especificamente ATP, hidrolisando-se tanto ATP quanto ADP.
[0003] A primeira apirase humana conhecida, ectonucleosídeo trifosfato difosfo-hidrolase-1 (gene: ENTPD1, proteína: NTPDase1), também conhecida como aglomerado de diferenciação 39 (CD39, UniProt P49961, ou SEQ ID NO: 1) são enzimas localizadas em superfície celular com um sítio catalítico voltado para o lado extracelular.
[0004] Dentro da família de CD39 humana conhecida, o membro CD39L3 é conhecido como uma ecto-apirase (ecto-ATPDase) com atividade bioquímica entre CD39 e CD39L1 (ecto-ATPase). Especificamente, CD39L3 humana foi solubilizada e purificada para fins terapêuticos, por exemplo, conforme revelado no documento nº US7247300B1 (incorporado no presente documento a título de referência) ou incluído no presente documento como a SEQ ID NO: 3.
[0005] A presente invenção é, entre outras, com base na constatação inesperada de que determinadas modificações de apirase humana solubilizada, tais como CD39 humana, resultam em uma proteína surpreendentemente ativa, que ainda é segura e fácil de fabricar.
[0006] De acordo com um primeiro aspecto da invenção, uma apirase humana solubilizada tem pelo menos duas modificações selecionadas dentre a lista que consiste em: deleção do N-terminal, deleção do C-terminal e modificação central é fornecida.
[0007] Em uma modalidade, a apirase humana solubilizada compreende uma deleção do N-terminal, uma deleção do C-terminal e uma deleção do modificação.
[0008] Em uma modalidade, a modificação central compreende uma deleção do um ou mais aminoácidos. Em outra modalidade, a modificação central compreende uma mutação pontual de um ou mais aminoácidos, tal como uma mutação de substituição. Em ainda outra modalidade, a modificação central é uma combinação de uma deleção do um ou mais aminoácidos e uma mutação pontual, tal como uma mutação de substituição, de um ou mais aminoácidos.
[0009] A deleção do N-terminal pode ter entre 30 e 50 aminoácidos deletados do N-terminal da sequência de CD39 de tipo selvagem de acordo com a SEQ ID NO: 1, tal como uma deleção do 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 aminoácidos. Em uma modalidade preferencial, a deleção do N-terminal é de 34, 37, 38 ou 45 aminoácidos.
[0010] A deleção do C-terminal pode ter entre 20 e 40 aminoácidos deletados do C-terminal da sequência de CD39 de tipo selvagem de acordo com a SEQ ID NO: 1, tal como uma deleção do 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 aminoácidos. Em uma modalidade preferencial, a deleção do C-terminal é de 22, 29 ou 37 aminoácidos.
[0011] A deleção central pode ter entre 10 e 15 aminoácidos consecutivos deletados da sequência de CD39 de tipo selvagem de acordo com a SEQ ID NO: 1, tal como uma deleção do 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos. Em uma modalidade preferencial, a deleção central é de 12 aminoácidos, tal como aminoácidos número 193 a 204 em relação à sequência de CD39 de tipo selvagem de acordo com a SEQ ID NO: 1.
[0012] Em uma modalidade, a apirase humana solubilizada compreende uma, duas, três, quatro ou cinco mutações pontuais em relação à sequência de CD39 de tipo selvagem de acordo com a SEQ ID NO: 1, selecionada dentre o grupo que consiste em K71E, N73Q, V95A, G102D, Y104S, T106S, R113M, L149M, V151A, E173D, T229A, L254M, K258R, W263R, E276D, N292Q, R304G, I319T, N327Q, A362N, F365S, N371Q, K405N, Y412F, L424Q, H436D, I437N, F439S, G441D, N457Q, P463S, e S469R.
[0013] Em uma modalidade, a apirase humana solubilizada compreende uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 76, e SEQ ID NO: 78.
[0014] Em uma modalidade, a apirase humana solubilizada compreende uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139 e SEQ ID NO: 141.
[0015] Em uma modalidade específica, a apirase humana solubilizada compreende uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 229.
[0016] Em uma modalidade específica, a apirase humana solubilizada consiste em uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 229.
[0017] Em uma modalidade preferencial, a apirase humana solubilizada compreende uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 72 e SEQ ID NO: 229.
[0018] Em uma modalidade, a apirase humana solubilizada compreende a SEQ ID NO: 58. Em uma modalidade, a apirase humana solubilizada compreende a SEQ ID NO: 72. Em uma modalidade, a apirase humana solubilizada compreende a SEQ ID NO: 229.
[0019] Em uma modalidade preferencial, a apirase humana solubilizada consiste em uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 72 e SEQ ID NO: 229.
[0020] Em uma modalidade, a apirase humana solubilizada consiste em SEQ ID NO: 58. Em uma modalidade, a apirase humana solubilizada consiste em SEQ ID NO: 72. Em uma modalidade, a apirase humana solubilizada consiste em SEQ ID NO: 229.
[0021] De acordo com um segundo aspecto da invenção, a invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende uma dose terapeuticamente eficaz da apirase de acordo com o primeiro aspecto da invenção, e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis são fornecidos.
[0022] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende adicionalmente um ou mais ingredientes ativos adicionais.
[0023] De acordo com um terceiro aspecto da invenção, uma apirase isolada, de acordo com o primeiro aspecto, para uso como um medicamento é fornecida.
[0024] De acordo com um quarto aspecto da invenção, uma apirase isolada, de acordo com o primeiro aspecto, para uso no tratamento de dano tecidual é fornecida.
[0025] O dano tecidual pode ser lesão cerebral aguda (derrame); falências aguda de múltiplos órgãos; função retardada do enxerto após transplante de rim ou outros órgãos sólidos; danos por queimadura; dano de radiação; danos agudos devido a trauma e/ou hipóxia, tais como síndrome de desconforto respiratório aguda (SDRA) ou lesão pulmonar; lesão renal aguda, tal como lesão renal aguda secundária à cirurgia torácica (por exemplo, substituição de válvula aórtica, cirurgia de revascularização do miocárdio) ou sepse ou rabdomiólise ou efeitos tóxicos de antibióticos ou outro medicamento; lesão aguda do miocárdio.
[0026] Em outra modalidade, o quarto aspecto da descrição se refere a uma apirase isolada, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, para uso no tratamento de lesão renal aguda associada à cirurgia cardíaca.
[0027] Em outra modalidade, o quarto aspecto da descrição se refere a uma apirase isolada, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, para uso no tratamento de função retardada do enxerto (FRE), síndrome de desconforto respiratório aguda (SDRA), infarto agudo do miocárdio (IAM), lesão cerebral traumática (LCT) / acidente vascular cerebral isquêmico agudo (AVCi), lesão de isquemia- reperfusão (LIR) ou combinações dos mesmos frequentemente denominadas falências de múltiplos órgãos (FMO).
[0028] Em uma modalidade, a apirase humana solubilizada usada para o tratamento de lesão renal aguda associada à cirurgia cardíaca compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58.
[0029] Em uma modalidade, a apirase humana solubilizada usada para o tratamento de lesão renal aguda associada à cirurgia cardíaca compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72. Em uma modalidade, a apirase humana solubilizada usada para o tratamento de lesão renal aguda associada à cirurgia cardíaca compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 229.
[0030] Em uma modalidade preferencial adicional, a descrição se refere ao uso de uma apirase isolada, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, para o tratamento de lesão renal aguda associada à sepse.
[0031] Em uma modalidade do quarto aspecto, a apirase humana solubilizada para uso no tratamento de lesão renal aguda associada à sepse compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58.
[0032] Em uma modalidade do quarto aspecto, a apirase humana solubilizada para uso no tratamento de lesão renal aguda associada à sepse compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 72.
[0033] Em uma modalidade do quarto aspecto, a apirase humana solubilizada para uso no tratamento de lesão renal aguda associada à sepse compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 229.
[0034] De acordo com um quinto aspecto da invenção, um método para tratamento de dano tecidual em um indivíduo humano que compreende administrar uma dose terapeuticamente eficaz de apirase humana solubilizada, de acordo com o primeiro aspecto, ao dito indivíduo é fornecido. Uma modalidade do quinto aspecto da invenção se refere a um método para tratamento de lesão renal aguda associada à cirurgia cardíaca que compreende administrar uma dose terapeuticamente eficaz de uma apirase isolada, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, a um indivíduo que necessita de tal tratamento.
[0035] Outra modalidade do quinto aspecto da invenção se refere a um método para tratamento de função retardada do enxerto (FRE), síndrome de desconforto respiratório aguda (SDRA), infarto agudo do miocárdio (IAM), lesão cerebral traumática (LCT) / acidente vascular cerebral isquêmico agudo (AVCi) lesão de isquemia-reperfusão (LIR) ou combinações dos mesmos frequentemente denominadas falências de múltiplos órgãos (FMO), que compreende administrar uma dose terapeuticamente eficaz de uma apirase isolada, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, a um indivíduo que necessita de tal tratamento.
[0036] Em uma modalidade do quinto aspecto, a apirase humana solubilizada usada no método para tratamento de lesão renal aguda associada à cirurgia cardíaca compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 229.
[0037] Uma modalidade do quinto aspecto da invenção se refere a um método para tratamento de lesão renal aguda associada à sepse que compreende administrar uma dose terapeuticamente eficaz de uma apirase isolada, de acordo com o primeiro aspecto da invenção, a um indivíduo que necessita de tal tratamento.
[0038] Em uma modalidade do quinto aspecto, a apirase humana solubilizada usada no método para tratamento de lesão renal aguda associada à sepse compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 72 ou SEQ ID NO: 229. O dano tecidual pode ser lesão cerebral aguda (derrame); falências aguda de múltiplos órgãos; função retardada do enxerto após transplante de rim ou outros órgãos sólidos; danos por queimadura; dano de radiação; danos agudos devido a trauma e/ou hipóxia, tais como síndrome de desconforto respiratório aguda (SDRA) ou lesão pulmonar; lesão renal aguda, tal como lesão renal aguda secundária à cirurgia torácica (por exemplo, substituição de válvula aórtica, cirurgia de revascularização do miocárdio) ou sepse ou rabdomiólise ou efeitos tóxicos de antibióticos ou outro medicamento; lesão aguda do miocárdio.
[0039] De acordo com um sexto aspecto da invenção, uma molécula de ácido nucleico isolado que codifica qualquer apirase, de acordo com o primeiro aspecto, é fornecida.
[0040] De acordo com um sétimo aspecto da invenção, um vetor de clonagem ou expressão que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos, de acordo com o sexto aspecto, é fornecido, em que o vetor é adequado para a produção recombinante de apirase isolada, de acordo com o primeiro aspecto.
[0041] De acordo com um oitavo aspecto da invenção, uma célula hospedeira que compreende um ou mais vetores de clonagem ou expressão, de acordo com o sétimo aspecto, é fornecida.
[0042] De acordo com um nono aspecto da invenção, um processo para a produção de uma apirase, de acordo com o primeiro aspecto, que compreende cultivar uma célula hospedeira, de acordo com o oitavo aspecto, purificar e recuperar a dita apirase é fornecido.
[0043] A Figura 1 é um alinhamento de sequência;
[0044] A Figura 2A é uma representação de um nível de expressão de sobrenadante que contém CD39 humana por Western Blot anti-APP de acordo com uma modalidade;
[0045] A Figura 2B é uma representação de nível de expressão de sobrenadante que contém variantes de CD39 humana de deleção do ponte de cisteína por Western Blot anti-APP de acordo com uma modalidade;
[0046] A Figura 3 é um gráfico que mostra resultados de ensaio de ATPase de fase sólida de variantes de CD39;
[0047] A Figura 4 é um gráfico que mostra clivagem de ATP de fase sólida em células HEK293 transformadas com variantes de CD39 humana de acordo com uma modalidade;
[0048] A Figura 5 é uma visão geral esquemática de um vetor de acordo com uma modalidade;
[0049] A Figura 6 é um modelo enzimático com base em aproximação de estado estável;
[0050] A Figura 7 é uma visão geral de dados cinéticos e ajuste de modelo para uma proteína de acordo com uma modalidade;
[0051] A Figura 8 é uma visão geral de dados cinéticos e ajuste de modelo para uma proteína de acordo com uma modalidade;
[0052] A Figura 9 é uma visão geral de dados cinéticos e ajuste de modelo para uma proteína de acordo com uma modalidade;
[0053] A Figura 10 é uma representação esquemática de condições experimentais;
[0054] A Figura 11 é um gráfico que mostra níveis de AMP para proteínas de acordo com modalidades; e
[0055] A Figura 12 são gráficos que mostram resultados in vivo para proteínas de acordo com modalidades.
[0056] A presente invenção é, entre outras, com base na constatação inesperada de que determinadas modificações de CD39 solubilizada, resultam em uma proteína surpreendentemente ativa, que é segura e fácil de fabricar.
[0057] Conforme será mostrado nos exemplos específicos abaixo, uma modalidade preferencial é uma apirase humana solubilizada com pelo menos duas modificações selecionadas dentre a lista que consiste em: deleção do N-terminal, deleção do C-terminal e deleção central, tal como uma apirase humana solubilizada que compreende uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 76, e SEQ ID NO: 78.
[0058] Os inventores tentaram diversas estratégias de modificação de sequência diferentes para obter apirase humana solubilizada com atividade e habilidade retidas a serem expressas, enquanto ainda não se introduz muitas modificações devido ao risco de imunogenicidade aumentada e, assim, risco contra segurança aumentado. Surpreendentemente, uma modificação de sequência que demonstrou aumentar tanto a eficiência quanto a habilidade em expressar apirase humana foi uma deleção do uma seção central, a denominada modificação delta MIL (ΔMIL), ao mesmo tempo que não acrescenta muito risco de imunogenicidade.
[0059] Para aumentar a expressão da apirase humana solubilizada de acordo com modalidades da invenção, etiquetas de expressão de N- terminal foram testadas. Várias etiquetas de expressão de N-terminal são conhecidas na técnica, porém, surpreendentemente nem todas as etiquetas funcionaram. Os inventores constataram que algumas etiquetas funcionaram, o que não poderia ser previsto.
[0060] Essas etiquetas de N-terminal foram SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139 ou SEQ ID NO: 141. Conforme mostrado no presente documento, etiquetas particularmente preferenciais são a SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135 ou SEQ ID NO: 137.
[0061] Detalhes específicos são apresentados nos Exemplos 9 a 13 abaixo. No entanto, de modo a ilustrar a natureza imprevisível desses Exemplos, um resumo comparativo é apresentado na Tabela 1. Tabela 1. Resumo das modalidades preferenciais. Construto Modificações Atividade Título comparada à EP28 (g/l) paterna nº de N- Número In vitro In vivo terminal aa de da SEQ ID mutações NO: 131 pontuais EP1xEP17 6 2 1,5x 0,6 EP17xEP19 6 2 1,5x 0,26 EP1xEP17xEP19 6 3 1,5x 0,46 EP17xEP19 3 2 1,5x 0,40 EP1xEP17xEP19 3 3 1,5x 0,58 EP1 3 1 1x 0,29
EP1xEP14 3 2 4x 0,50 EP28 16 0 1x 1x 0,08 EP1xEP17_K405N 15 3 1,5x 1x 1,4 EP1xEP14 6 2 4x 0,3 EP1xEP17 3 2 1,5x 0,68 EP28 3 0 1x 0,10 EP14 3 1 4x 4x 0,27
1. Definições
[0062] Para facilitar que uma pessoa versada na técnica pratique a invenção, os seguintes termos são usados ao longo da descrição.
[0063] Os termos "CD39" e "hCD39" são usados como sinônimos ao longo da descrição e a menos que seja afirmado de outra forma significam aglomerado humano de diferenciação 39 (CD39) de acordo com UniProt P49961 ou SEQ ID NO: 1.
[0064] O termo "apirase" se refere à apirase humana a menos que seja afirmado de outra forma. Uma "apirase solubilizada", conforme usado no presente documento, significa que essa apirase, que como uma proteína de tipo selvagem existe ligada a uma membrana celular, foi modificada de modo que não esteja mais ligada à membrana celular, porém, exista em um estado solúvel, isto é, não mais ancorada na membrana celular.
[0065] A abreviação "MIL" se refere ao laço de interação de membrana, que é uma parte central da proteína de tipo selvagem (humana) CD39 que interage com a membrana celular, além das partes de N-terminal e C-terminal que são fisicamente ancoradas através da membrana celular. O termo "delta MIL", ou "ΔMIL", se refere à deleção da sequência MIL de CD39 de tipo selvagem (humana).
[0066] O termo "cerca de" em relação a um valor numérico x significa, por exemplo, +/- 10%. Quando usado na frente de uma faixa numérica ou lista de números, o termo "cerca de" se aplica a cada número na série, por exemplo, a frase "cerca de 1 a 5" deve ser interpretada como "cerca de 1 a cerca de 5" ou, por exemplo, a frase "cerca de 1, 2, 3, 4" deve ser interpretada como "cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, etc.".
[0067] A palavra "substancialmente" não exclui "completamente", por exemplo, uma composição que está "substancialmente isenta" de Y pode estar completamente isenta de Y. Quando necessário, a palavra "substancialmente" pode ser omitida da definição da descrição.
[0068] O termo "que compreende" engloba "que inclui" bem como " que consiste", por exemplo, uma composição "que compreende" X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.
[0069] "Identidade" no que diz respeito a um polipeptídeo nativo e seu derivado funcional é definida no presente documento como a porcentagem de resíduos de aminoácidos na sequência candidata que são idênticos aos resíduos de um polipeptídeo nativo correspondente, após alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para se alcançar a porcentagem máxima de identidade e não considerando qualquer substituição conservativa como parte da identidade de sequências. Nem extensões nem inserções de N-terminal ou C-terminal deverão ser interpretadas como reduzindo a identidade. Métodos e programas de computador para o alinhamento são bem conhecidos. A porcentagem de identidade pode ser determinada por algoritmos de alinhamento padrão, por exemplo, a Ferramenta de Pesquisa por Alinhamento Local Básico (BLAST) descrita por Altshul et al. ((1990) J. Mol. Biol., 215: 403 a 410); o algoritmo de Needleman et al. ((1970) J. Mol. Biol., 48: 444 a 453); ou o algoritmo de Meyers et al. ((1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11 a 17). Um conjunto de parâmetros pode ser a matriz de pontuação Blosum 62 com uma penalidade de lacuna de 12, uma penalidade de extensão de lacuna de 4 e uma penalidade de lacuna de alteração de matriz de leitura de 5. A porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoácidos ou nucleotídeos pode ser também determinada com o uso do algoritmo de E. Meyers e W. Miller ((1989) CABIOS, 4: 11 a 17) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), com o uso de uma tabela de resíduos de pesos PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4.
[0070] "Aminoácido (ou aminoácidos)" se refere a todos os L-α- aminoácidos de ocorrência natural, por exemplo, e incluem D- aminoácidos. A frase "variante da sequência de aminoácidos" se refere às moléculas com algumas diferenças nas suas sequências de aminoácidos em comparação com as sequências de acordo com a presente invenção. As variantes de sequência de aminoácidos de uma proteína de acordo com a presente invenção, por exemplo, de uma sequência especificada, ainda têm atividade de apirase. As variantes da sequência de aminoácidos incluem variantes substitucionais (aquelas que têm, pelo menos, um resíduo de aminoácido removido e um aminoácido diferente inserido em seu lugar na mesma posição em um polipeptídeo de acordo com a presente invenção), variantes insercionais (aquelas com um ou mais aminoácidos inseridos imediatamente adjacentes a um aminoácido em uma posição particular em um polipeptídeo de acordo com a presente invenção) e variantes delecionais (aquelas com um ou mais aminoácidos removidos em um polipeptídeo de acordo com a presente invenção).
[0071] O termo "tratamento" ou "tratar" é definido no presente documento como a aplicação ou administração de apirase, de acordo com a invenção, a um indivíduo, ou aplicação ou administração de uma composição farmacêutica que compreende a dita apirase a um indivíduo, ou um tecido isolado ou linha celular de um indivíduo, quando o indivíduo tem dano tecidual, um sintoma associado ao dano tecidual, quando o propósito é aliviar, amenizar ou melhorar o dano tecidual ou quaisquer sintomas associados ao dano tecidual, entre outros, reduzindo-se níveis de ATP extracelular.
[0072] Por "tratamento" também se entende a aplicação ou administração de uma composição farmacêutica que compreende uma apirase a um indivíduo, ou aplicação ou administração de uma composição farmacêutica que compreende apirase da invenção a um tecido isolado ou linha celular de um indivíduo, quando o indivíduo tem um dano tecidual ou um sintoma associado ao dano tecidual, quando o propósito é aliviar, amenizar ou melhorar o dano tecidual ou quaisquer sintomas associados ao dano tecidual.
[0073] O termo "prevenção" ou "prevenir" se refere ao tratamento profilático ou preventivo; o mesmo diz respeito a atrasar o início, ou impedir o início da doença, distúrbios e/ou sintomas associados à mesma.
[0074] Conforme usado no presente documento, um indivíduo "necessita de" um tratamento se tal indivíduo se beneficiar biológica, medicamente ou em qualidade de vida de tal tratamento.
[0075] O termo "farmaceuticamente aceitável" significa um material não tóxico que não interfere com a eficácia da atividade biológica do ingrediente (ou ingredientes) ativo.
[0076] Conforme usado no presente documento, o termo "administração" ou "que administra" do composto em questão significa fornecer um composto da invenção e pró-fármacos do mesmo a um indivíduo que necessita de tratamento. Administração "em combinação com" um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui administração simultânea (concomitante) e consecutiva em qualquer ordem, e em qualquer via de administração.
[0077] Conforme usado no presente documento, uma "dose terapeuticamente eficaz" se refere a uma dose (uma quantidade) de uma apirase que é eficaz, mediante administração de dose única ou múltipla a um paciente (como um ser humano) para tratar, impedir, impedir o início, curar, atrasar, reduzir a severidade, amenizar pelo menos um sintoma de um distúrbio ou distúrbio recorrente, ou prolongar a sobrevida do paciente além do esperado na ausência de tal tratamento. Quando aplicado a um ingrediente ativo individual (por exemplo, apirase) administrado sozinho, o termo se refere somente àquele ingrediente. Quando aplicado a uma combinação, o termo se refere a quantidades ou doses combinadas dos ingredientes ativos que resultam no efeito terapêutico, quer administradas em combinação, em série ou simultaneamente.
[0078] A frase "regime de dosagem" significa o regime usado para tratar uma doença, por exemplo, o protocolo de dosagem usado durante o tratamento de dano tecidual.
[0079] A frase "meios de administração" é usada para indicar qualquer implemento disponível para administrar sistematicamente um fármaco a um paciente, que inclui, porém, sem limitação, uma seringa pré-carregada, um frasco e seringa, uma caneta de injeção, um autoinjetor, uma bolsa de gotejamento intravenoso (i.v.), uma bomba, uma bomba de emplastro, etc. Com tais itens, um paciente pode se autoadministrar o fármaco (isto é, administrar o fármaco por si próprio) ou um médico pode administrar o fármaco.
2. Exemplo 1: CD39 livre de membrana
[0080] Apirase humana de tipo selvagem CD39 (hCD39, UniProt P49961, ou SEQ ID NO: 1) é naturalmente ancorada na membrana celular por um domínio de transmembrana no N-terminal (putativo aa 17 a 37), um laço de interação de membrana putativo central (MIL putativo aa 193 a 204) e um domínio de transmembrana de C-terminal (putativo aa 479 a 499). Para possibilitar a expressão de uma variante solúvel de CD39 com o uso de uma célula hospedeira de mamífero, diversos elementos da sequência de CD39 foram modificados para obter uma proteína livre de membrana ou proteína solubilizada. A sequência líder natural e região de transmembrana de N-terminal foram substituídas por um líder de secreção e uma etiqueta de purificação (SEQ ID NO: 133). Os limites do domínio extracelular de CD39 foram variados para otimizar parâmetros de expressão, purificação e atividade (nº de aminoácidos 38 a 476 da SEQ ID NO: 1, nº de aminoácidos 39 a 469 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 46 a 461 da SEQ ID NO: 1 e aminoácidos 46 a 476 da SEQ ID NO: 1, respectivamente). O impacto das cisteínas e pontes de dissulfeto sobre a propensão de agregação e atividade enzimática foi avaliado sistematicamente substituindo-se as cisteínas por alanina ou encurtando-se o laço produzido através da ponte de dissulfeto (SEQ ID 107, 109, 111, 113 e 115). Uma extensão de aminoácido hidrofóbico foi descrita no trabalho estrutural da CD39 de rato (Zebisch et al, J.Mol. Biol. (2012), 415, 288 a 306, CD39 de rato de tipo selvagem, Uniprot P97687, apresentada na SEQ ID NO: 2) e é através disso que o laço pode interagir com a membrana celular (MIL). Foram traduzidas as constatações para a sequência de CD39 humana através de alinhamento de sequência e geradas variantes de CD39 que têm uma deleção do laço (CD39ΔMIL ou EP28, conforme apresentado na SEQ ID NO: 4). O impacto da deleção (ou delta/Δ) do MIL sobre o nível de expressão de CD39 funcional e estabilidade térmica foi avaliado.
[0081] Como pode ser visto a partir da Figura 1, que mostra um alinhamento de sequência da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 4, aminoácidos de N-terminal 1 a 27, aminoácidos de C-terminal 477 a 510, e os aminoácidos de laço de interação de membrana (MIL) centrais 193 a 204, foram deletados de wtCD39 (SEQ ID NO: 1) para formar CD39ΔMIL (SEQ ID NO: 4).
[0082] O impacto das diferentes modificações de sequências sobre a estabilidade térmica foi estudado. Além disso, o impacto das diferentes modificações de sequências sobre rendimentos de expressão celular CHO e teor monomérico foi estudado. (1) Métodos (a) Geração de plasmídeos de expressão
[0083] Sequências de DNA que codificam diferentes variantes de limite de hCD39 e deleção do laço de interação de membrana (MIL) foram ordenadas em GeneArt (Life Technologies Inc. Regensburg, Alemanha) que inclui otimização de códon para Homo sapiens. Sequências que codificam variantes de hCD39 foram subclonadas através de técnicas de biologia molecular padrão dos vetores derivados de GeneArt ou variantes internamente geradas dos mesmos em um vetor de expressão adequado para secreção em células de mamíferos. Mutações de cisteína para alanina presentes nas variantes de ponte de cisteína deletada foram alvejadas através de oligonucleotídeos modificados e após uma etapa de PCR de montagem subsequente os fragmentos gerados foram subclonados no mesmo vetor de expressão mencionado anteriormente. Os elementos do vetor de expressão incluem um promotor (promotor-intensificador de citomegalovírus (CMV)), uma sequência de sinal para facilitar a secreção, um sinal de poliadenilação e terminador de transcrição (gene de Hormônio de Crescimento Bovino (BGH)), um elemento permitindo replicação epissomal e replicação em procariotas (por exemplo, origem SV40 e ColE1 ou outros conhecidos na técnica) e elementos para permitir a seleção (gene de resistência a ampicilina e marcador de zeocina). Uma lista de versões de CD39 humana solubilizadas truncadas é ilustrada na Tabela 2, com as modificações de aminoácido numeradas com referência à SEQ ID NO: 1. Tabela 2. Versões de CD39 humana solubilizadas truncadas. Referência ID de sequência Modificação (ou modificações) de aminoácidos CD39(aa39-469) SEQ ID NO: 99 Truncações de N e C-Terminal CD39(aa46-476) SEQ ID NO: 101 Truncações de N e C-Terminal
CD39(aa46-461) SEQ ID NO: 103 Truncações de N e C-Terminal CD39(aa46- SEQ ID NO: 105 Truncações de N e C-Terminal, 461)_dMIL(193-204) e deleção central CD39(aa46-461)_delta cys1 SEQ ID NO: 107 Truncações de N e C-Terminal, e deleção do cisteína CD39(aa46-461)_delta cys2 SEQ ID NO: 109 Truncações de N e C-Terminal, e deleção do cisteína CD39(aa46-461)_delta cys3 SEQ ID NO: 111 Truncações de N e C-Terminal, e deleção do cisteína CD39(aa46-461)_delta cys4 SEQ ID NO: 113 Truncações de N e C-Terminal, e deleção do cisteína CD39(aa46-461)_delta cys5 SEQ ID NO: 115 Truncações de N e C-Terminal, e deleção do cisteína CD39(aa46- SEQ ID NO: 117 Truncações de N e C-Terminal, 461)_dMIL(193-204)_delta deleção central e deleção do cys1 cisteína CD39(aa46- SEQ ID NO: 119 Truncações de N e C-Terminal, 461)_dMIL(193-204)_delta deleção central e deleção do cys2 cisteína CD39(aa46- SEQ ID NO: 121 Truncações de N e C-Terminal, 461)_dMIL(193-204)_delta deleção central e deleção do cys3 cisteína CD39(aa46- SEQ ID NO: 123 Truncações de N e C-Terminal, 461)_dMIL(193-204)_delta deleção central e deleção do cys4 cisteína CD39(aa46- SEQ ID NO: 125 Truncações de N e C-Terminal, 461)_dMIL(193-204)_delta deleção central e deleção do cys5 cisteína CD39(aa38-476)_delta337- SEQ ID NO: 127 Truncações de N e C-Terminal, 344 e deleção do cisteína CD39(aa38- SEQ ID NO: 129 Truncações de N e C-Terminal, 476)_C338A_C343A e mutações pontuais de cisteína
(b) Expressão em microescala de variantes de hCD39
[0084] Células 293-6E (conforme revelado no documento nº WO2006096989A2, incorporado no presente documento a título de referência) foram escolhidas para experimento em microescala como uma das linhas de célula hospedeira preferenciais para expressão transiente de proteínas na ausência de soro. Transfecção foi realizada com o uso de FuGene HD (Roche Applied Science, nº de categoria 04709705001) como reagente de transfecção. Células 293-6E foram cultivadas em cultura de suspensão com o uso de meio de cultura isento de soro V3 (Bioconcept, nº de categoria V3-K) para transfecção e propagação das células. Células foram cultivadas em frascos de agitação Corning (Corning, Tewksbury, MA) em um agitador orbital (100 a 120 rpm) em uma incubadora umidificada em 5% de CO2 (frascos de semente). Células nas culturas de semente devem ser mantidas na fase de crescimento exponencial (densidades de célula entre 5x105 e 3x106/ml) e exibem uma viabilidade de >90% para transfecção. Densidades de célula fora dessa faixa resultarão em uma fase de latência após diluição ou eficiência de transfecção reduzida.
[0085] Para transfecções em microescala (0,5 ml), uma alíquota de células foi retirada das culturas de semente e ajustada para 0,5x10 6 células/ml em meio de cultura isento de soro V3. A solução de DNA (denominada Solução 1) foi preparada diluindo-se 0,5 µg de plasmídeos de expressão hCD39 em 14 µl de meio de cultura isento de soro V3, então, 2,3 µl de solução de FuGene HD também foram diluídos em 14 µl de meio de cultura isento de soro V3 (Solução 2). Ambas as soluções foram incubadas por 5 a 10 min em temperatura ambiente (RT). Depois disso, a solução 2 foi adicionada à solução 1 com mistura suave e incubada por mais 5 a 15 minutos em temperatura ambiente. A mistura de transfecção foi, então, adicionada à 0,5 ml de células a 0,5x10 6 células/ml semeadas em uma placa de cultura de tecido de 48 poços (Corning, Tewksbury, MA) e placa colocada em um agitador orbital (300 rpm) em uma incubadora umidificada a 5% de CO 2. A cultura foi coletada 3 dias após transfecção através de centrifugação a 4.000 rpm por 10 minutos a 4°C (Heraeus, Multifuge 3 S-R, Thermo Scientific, Rockford, IL). O sobrenadante de célula recuperada foi armazenado a 4°C até processamento adicional. (c) Análise de western-blot em sobrenadante de expressão em microescala
[0086] A análise de Western-Blot foi realizada em sobrenadante de expressão em microescala de modo a verificar a expressão e a formação correta de variantes de hCD39 recombinantes. 8 µl de sobrenadante foram diluídos em Tampão de Carregamento E-PAGE™ (4x, Invitrogen, nº EPBNF-01) e carregados em E-Page 48, 8% de gel (Invitrogen, nº EP04808) em condições não redutoras. Gel foi executado em dispositivo mãe E-base (Invitrogen) por 23 min e proteínas foram transferidas para membrana de Nitrocelulose (Invitrogen IB301001) com o uso do sistema iBlot (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante (execução de 7 min). Após lavagem em 3 tempos em TBS/0,05 Tween20 (TBST), a membrana foi incubada por 1 h com 5% de Leite/TBST em agitação suave seguida por incubação de 1 h com solução a 4 µg/ml de anticorpo de camundongo anti-APP (Novartis, anticorpo internamente elevado contra uma extensão peptídica de proteína de precursor de amiloide (APP) usada para alvejamento de proteína) diluída em 2% de Leite/TBST. Após 3 etapas de lavagem adicionais, a membrana foi incubada com diluição de 1:1.000 de Fosfatase Alcalina de IgG anti-Camundongo (Sigma-Aldrich, A5153- 1ML) diluída em 2% de Leite/TBST e lavada novamente 3 vezes em TBST seguido por uma etapa de enxágue em TBS. Sinal foi desenvolvido por 1 a 5 minutos com o uso de SIGMAFAST™ BCIP®/NBT (Sigma-Aldrich, nº B5655-25TAB) de acordo com instruções do fabricante e sinal parado enxaguando-se a membrana com água. (d) Ensaio de AxPase de fase sólida
[0087] Atividades de ATPase, ADPase e AMPase foram determinadas com o uso de sistema de detecção de fosfato Pi ColorLock Gold (Innova Biosciences, nº de categoria 303-0030) em variantes de hCD39 capturadas em placa a partir de sobrenadante de expressão em microescala (ensaio de Axpase de fase sólida). Esse método se mostrou menos sensível em comparação com ensaio com base em solução (ensaio de Axpase de fase líquida) recomendado pelo fabricante, porém, teria a vantagem de reduzir atividade de AxPase mediada pelas enzimas de célula hospedeira potencialmente presentes no sobrenadante de expressão em microescala. 20 µl de anticorpo de solução a 10 µg/ml de anticorpo de camundongo anti-APP (Novartis, anticorpo internamente elevado contra uma extensão peptídica de proteína de precursor de amiloide (APP) usada para alvejamento de proteína) diluídos em PBS foram adicionados em cada poço de uma placa transparente de 384 poços maxisorp (Nunc) e incubados de um dia para o outro a 4 °C. Após três lavagens com TBST, os poços foram bloqueados por 1 h com o uso de 100 µl de 5% de Leite/TBST em temperatura ambiente em agitação suave. Após três etapas de lavagem adicionais, 20 µl de sobrenadante de expressão em microescala diluídos em série em 2% de Leite/TBST foram adicionados em tréplicas aos poços e incubados por 2 h em temperatura ambiente com agitação suave. Poços foram, então, lavados novamente quatro vezes com 100 µl de TBST e duas vezes com 80 µl de 50 mM de Tris-Cl/5 mM de MgCl2, pH 7,5. 30 µl de 80 µM de soluções de Fosfato de Adenosina diluídos em 50 mM de Tris-Cl/5 mM de MgCl2, pH 7,5 (ATP: SIGMA A2383, ADP: SIGMA A2754) foram adicionados em cada tréplica e incubados por 24 h a 37°C. Sinal foi desenvolvido com o uso de 7,5 µl de mistura de reagente Gold preparada de acordo com instruções do fabricante por 10 minutos e a reação parou com o uso de 3 µl de Estabilizador. Absorção em leitura de 620 nm com uso do instrumento TECAN Genios Pro. (2) Resultados (a) Efeito de Limites, Deleção de Laço de Interação de Membrana (MIL) e Deleção de Ponte de Cisteína em Nível de Expressão de hCD39
[0088] De modo a avaliar o nível de expressão de diferentes variantes de hCD39, plasmídeos de expressão correspondentes foram transfectados em duplicata em 0,5 ml de células 293-6E e Western Blot (detecção anti-APP Ab) realizado em sobrenadante coletado 3 dias após transfecção. Resultados são ilustrados na Figura 2A e na Figura 2B.
[0089] Resultados indicam um nível de expressão superior de hCD39 com início em aa38 em comparação com aa46. Limites de N- terminal assim como a deleção do MIL parecem não ter grande impacto sobre o nível de expressão. O nível de expressão superior de hCD39 que tem a primeira ou quarta ponte de cisteína deletada no contexto de hCD39 (aa46-461) também foi observado. O nível de expressão superior de primeira deleção do ponte de cisteína foi confirmado com o uso também de cadeia principal de ΔMIL de hCD39 (aa46-461). (b) Efeito de Limites, Deleção de Laço de Interação de Membrana (MIL) e Deleção de Ponte de Cisteína em Atividade de hCD39
[0090] A atividade enzimática de CD39 foi medida através de ensaio de AxPase de fase sólida nas amostras de sobrenadante descritas acima. Resultados são ilustrados na Figura 3 e na Figura 4, assim como na Tabela 3. Tabela 3. Ensaio de ATP de fase sólida em variantes de CD39
Amostra Sequência Sinal médio Diluição Diluição Diluição Diluição 1/2 1/6 1/18 1/54 Figura 3 hCD39 (aa46- SEQ ID NO: 0,12755 0,12905 0,13155 0,13545 461)_Delta Cys1 107 hCD39 (aa46- SEQ ID NO: 0,1287 0,13615 0,12915 0,1375 461)_Delta Cys2 109 hCD39 (aa46- SEQ ID NO: 0,12265 0,1336 0,13485 0,1365 461)_Delta Cys3 111 hCD39 (aa46- SEQ ID NO: 0,14 0,1302 0,13535 0,1322 461)_Delta Cys4 113 hCD39 (aa46- SEQ ID NO: 0,1226 0,13865 0,13375 0,13225 461)_Delta Cys5 115 hCD39 (aa46- SEQ ID NO: 0,17695 0,16 0,15755 0,1551 461)_Delta 117 MIL_Delta Cys1 hCD39 (aa46- SEQ ID NO: 0,1318 0,1419 0,13065 0,1299 461)_Delta 119 MIL_Delta Cys2 hCD39 (aa46- SEQ ID NO: 0,13505 0,1376 0,1347 0,13775 461)_Delta 121 MIL_Delta Cys3 hCD39 (aa46- SEQ ID NO: 0,21195 0,18745 0,16915 0,14975 461)_Delta 123 MIL_Delta Cys4 hCD39 (aa46- SEQ ID NO: 0,1343 0,1486 0,13135 0,10465 461)_Delta 125 MIL_Delta Cys5 hCD39 (aa46-461) SEQ ID NO: 0,30345 0,2433 0,1879 0,1851 103 hCD39 (aa46- SEQ ID NO: 0,5037 0,3779 0,32345 0,2567 461)_Delta MIL 105 hCD39 (aa38-476) Sequência 0,30745 0,23855 0,18315 0,17295 não mostrada hCD39 (aa46-476) SEQ ID NO: 0,34815 0,254 0,1975 0,1817 101 não transfectada 0,1459 0,14155 0,13855 0,13675 Figura 4 hCD39 (aa38-476) Sequência 0,45775 0,4007 0,1997 0,14215 não mostrada hCD39 (aa46- SEQ ID NO: 0,8983 0,9294 0,6561 0,35405 461)_Delta MIL 105 hCD39 (aa46-476) SEQ ID NO: 0,5756 0,4855 0,27525 0,153 101 hCD39 (aa46-461) SEQ ID NO: 0,562 0,52455 0,28625 0,15175 103 hCD39 (aa38- SEQ ID NO: 1,0224 0,9696 0,6263 0,4354 476)_Delta MIL 4 (EP28) não transfectada 0,1483 0,1494 0,158 0,1502
[0091] Deleção de MIL parece aumentar a fração de proteínas recombinantes de CD39 funcionalmente expressas. Diferentes limites não mostram nenhum grande impacto sobre a atividade de hCD39 ativa. Resultados indicam atividade de ATPase fortemente reduzida ou completamente abolida de todas as variantes de ponte de cisteína deletada. Resultados similares foram obtidos com o uso de ensaio de ADPase de Fase Sólida. Assim, surpreendentemente, a modificação de sequência que aumenta tanto a eficiência quanto a habilidade em expressar CD39 é a modificação delta MIL (ΔMIL).
3. Exemplo 2: Etiquetas de expressão
[0092] De modo a melhorar as propriedades de expressão dos candidatos, diferentes etiquetas de expressão foram testadas.
[0093] Diferentes etiquetas de expressão com base na porção N- terminal de IL-2 (SEQ ID NO: 131) foram testadas, conforme apresentado na Tabela 4. Etiqueta de expressão 1-16 aa, de acordo com a SEQ ID NO: 131, foi sintetizada por Geneart. Tabela 4. Visão geral de variante de etiqueta de expressão de IL-2 Referência ID de sequência ID de sequência ID de sequência de de aminoácidos de iniciador iniciador reverso dianteiro Etiqueta de SEQ ID NO: 131 n/a n/a expressão aa1-16 Etiqueta de SEQ ID NO: 133 SEQ ID NO: 157 SEQ ID NO: 158 expressão aa1-15 Etiqueta de SEQ ID NO: 135 SEQ ID NO: 159 SEQ ID NO: 158 expressão aa1-6 Etiqueta de SEQ ID NO: 137 SEQ ID NO: 161 SEQ ID NO: 158 expressão aa1-3
Etiqueta de SEQ ID NO: 139 SEQ ID NO: 162 SEQ ID NO: 158 expressão aa1-9 Etiqueta de SEQ ID NO: 141 SEQ ID NO: 163 SEQ ID NO: 158 expressão aa1-12 Etiqueta de SEQ ID NO: 143 SEQ ID NO: 164 SEQ ID NO: 158 expressão aa4-12
[0094] Todas as etiquetas de expressão foram testadas em relação ao CD39ΔMIL, conforme apresentado na SEQ ID NO: 4. Todos os construtos incluíram uma etiqueta de APP e uma etiqueta de His.
[0095] O vetor pRS5a, conforme apresentado na Figura 5, foi usado para a expressão. Pares de iniciador foram conforme apresentados na Tabela 4.
[0096] Temperatura de recozimento foi 64 °C em todos os casos.
[0097] Solução de PCR foi preparada misturando-se 1 µl de estoque de DNA Modelo, 25 µl de polimerase Kapa Hifi Hotstart (da kappa Biosystems/KK2602). 1,5 µl de Iniciador dianteiro, 1,5 µl de iniciador reverso, e ajuste do volume final para 50 µl com H2O.
[0098] A reação de PCR foi executada de acordo com a programação na Tabela 5. Tabela 5. Programação de PCR Temperatura Tempo (min) Ciclos (°C) Desnaturação 94 5 1 Desnaturação 94 0,5 35 Recozimento 64 1,5 Polimerização 72 0,5 Polimerização Final 72 5
[0099] Após conclusão de reação de PCR, a extração de DNA foi realizada com o uso de Gel SV Wizard® e Kit de Limpeza de PCR, Promega, nº 9282, 1 coluna, eluição em 30 µl de acordo com as instruções do fabricante.
[0100] Insertos e vetor foram cortados com a enzima fornecida pela New England Biolabs (NEB), NruI-HF (NEB, nº R3192) e NotI-HF (NEB, nº R3189), em tampão CutSmart(R). Tempo de reação foi de 3 h a 37°C.
[0101] Ligação foi realizada de um dia para o outro com Vector desfosforilado com Kit de Defosforilação e Ligação de DNA Rápidas, Fa. Roche, nº 04898117001 de acordo com o protocolo válido do produtor.
[0102] No dia seguinte, colônias únicas foram escolhidas para DNA- Miniprep e análise de sequência com Iniciador dianteiro P270 (SEQ ID NO: 165) e Iniciador reverso P271 (SEQ ID NO: 166).
[0103] Além disso, as poucas sequências de proteína conhecidas na técnica para aumentar expressão foram testadas, de acordo com a Tabela 6. Tabela 6. Etiquetas da técnica anterior Referência Identificador de sequência Ubiquitina SEQ ID NO: 167 CKappa SEQ ID NO: 168 Domínio de HSA I SEQ ID NO: 169 Domínio de HSA II SEQ ID NO: 170
[0104] As combinações resultantes testadas são apresentadas na Tabela 7. Tabela 7. Construtos testados Nome de Plasmídeo Sequência de aminoácidos resultante pRS5a_IL2 leader-APP6-Flag-hCD39 (aa38-476)_delta MIL SEQ ID NO: (aa193-204)_8M opt 145 pRS5a_IL2 leader-hsUbiquitin-hCD39 (aa38-476)_delta MIL SEQ ID NO: (aa193-204)_APP_His 149 pRS5a_IL2 leader-hsCKappa-hCD39 (aa38-476)_delta MIL SEQ ID NO: (aa193-204)_APP_His 147 pRS5a_IL2 leader-HSA-Dom.I-hCD39 (aa38-476)_delta MIL SEQ ID NO: (aa193-204)_APP_His 151 pRS5a_IL2 leader-HSA-Dom.II-hCD39 (aa38-476)_delta MIL SEQ ID NO: (aa193-204)_APP_His 153
[0105] Nenhuma das etiquetas de técnica anterior da Tabela 6 gerou a expressão de proteína (dados não mostrados). Isso foi inesperado, visto que a técnica anterior ensina que essas sequências devem aumentar a expressão.
4. Exemplo 3: Mutações adicionais
[0106] De modo a melhorar as características de CD39 solúvel, e torná-la adequada para desenvolvimento farmacêutico, modificações adicionais foram introduzidas no CD39ΔMIL, EP28, apresentado na SEQ ID NO: 4. As diferentes mutações e variantes mutadas são vistas na Tabela 8 e são numeradas de acordo com as posições de aminoácido da CD39 de tipo selvagem, conforme apresentado na SEQ ID NO: 1. Tabela 8. Mutações pontuais Nome nº de Posição de Posição Posição Posição Posição ID de abrevia- Muta- Mutação 1 de de de de sequên- do ções Mutação Mutação Mutação Mutação cia de 2 3 4 5 aminoá- cidos EP1 1 113: R->M SEQ ID NO: 6 EP2 2 113: R->M 149: L->M SEQ ID NO: 8 EP3 3 113: R->M 304: R- 469: S- SEQ ID >G >R NO: 10 EP4 3 95: V->A 113: R- 469: S- SEQ ID >M >R NO: 12 EP5 2 149: L->M 441: G- SEQ ID >D NO: 14 EP6 3 104: Y->S 149: L->M 263: W- SEQ ID >R NO: 16 EP7 4 71: K->E 106: T->S 151: V- 319: I->T SEQ ID >A NO: 18 EP8 1 151: V->A SEQ ID NO: 20
EP9 1 263: W->R SEQ ID NO: 22 EP10 1 319: I->T SEQ ID NO: 24 EP11 2 113: R->M 319: I->T SEQ ID NO: 26 EP12 2 276: E->D 319: I->T SEQ ID NO: 28 EP13 2 365: F->S 424: L->P SEQ ID NO: 30 EP14 1 365: F->S SEQ ID NO: 32 EP15 4 292: N->K 365: F->S 424: L- 463: P- SEQ ID >P >S NO: 34 EP17.1 1 412: Y->F SEQ ID NO: 38 EP17 2 405: K->N 412: Y->F SEQ ID No. 36 EP18 2 102: G->D 424: L->Q SEQ ID No. 40 EP19 2 424: L->Q 436: H->D SEQ ID No. 42 EP20 2 276: E->G 439: F->S SEQ ID No. 44 EP21 2 113: R->M 469: S->R SEQ ID No. 46 EP22 2 276: E->G 469: S->G SEQ ID No. 48 EP23 4 254: L->M 263: W- 439: F- 469: S- SEQ ID >R >S >R No. 50 EP24 3 113: R->K 424: L->Q 437: I- SEQ ID >N No. 52 EP28_8 8 173: E->D 258: K->R 362: A- 365: F- 404-411: SEQ ID M >N >Y VKEKYL No. 145 SE-> -
[0107] Duas mutações em sítio ativo resultaram em atividade superior (365 e 412).
5. Exemplo 4: Remoção de sítio de glicosilação
[0108] Com base na variante EP14 acima, o efeito de sítios de glicosilação foi verificado introduzindo-se mutações pontuais de acordo com a Tabela 9, numeradas de acordo com as posições de aminoácido da CD39 de tipo selvagem conforme apresentado na SEQ ID NO: 1. Tabela 9. Mutações de sítio de glicosilação Posição de mutação Sítio de glicosilação Iniciador N73Q NDT P928/P929 T229A NQT P930/P931 N292Q NVS P932/P933 N327Q NTS P934/P935 N371Q NLT P936/P937 N457Q NLT P938/P939 (a) Materiais e métodos
[0109] O vetor de expressão pRS5a (Figura 5) foi usado para a clonagem. Iniciadores foram usados conforme apresentados na Tabela
10. Tabela 10. Sequências de iniciador Iniciadores Sequência Descrição P928 SEQ ID NO: 171 Iniciador dianteiro para remoção de Sítio de glicosilação N73Q P929 SEQ ID NO: 172 Iniciador reverso para remoção de Sítio de glicosilação N73Q P930 SEQ ID NO: 173 Iniciador dianteiro para remoção de Sítio de glicosilação T229A P931 SEQ ID NO: 174 Iniciador reverso para remoção de Sítio de glicosilação T229A P932 SEQ ID NO: 175 Iniciador dianteiro para remoção de Sítio de glicosilação N292Q P933 SEQ ID NO: 176 Iniciador reverso para remoção de Sítio de glicosilação N292Q P934 SEQ ID NO: 177 Iniciador dianteiro para remoção de Sítio de glicosilação N327Q P935 SEQ ID NO: 178 Iniciador reverso para remoção de Sítio de glicosilação N327Q P936 SEQ ID NO: 179 Iniciador dianteiro para remoção de Sítio de glicosilação N371Q P937 SEQ ID NO: 180 Iniciador reverso para remoção de Sítio de glicosilação N371Q
P938 SEQ ID NO: 181 Iniciador dianteiro para remoção de Sítio de glicosilação N457Q P939 SEQ ID NO: 182 Iniciador reverso para remoção de Sítio de glicosilação N457Q
[0110] O Kit de Mutagênese direcionada ao Sítio QuikChange Lightning (Agilent, nº 210519-5) foi usado para a PCR, de acordo com as instruções do fabricante.
[0111] No dia seguinte, colônias únicas foram escolhidas para DNA- Miniprep e análise de sequência foi realizada com Iniciador dianteiro P270 (SEQ ID NO: 165) e Iniciador reverso P271 (SEQ ID NO: 166).
[0112] Para assegurar a correção da cadeia principal de vetor também (devido à mutagênese), o fragmento de inserto sequenciado foi clonado em uma nova cadeia principal de vetor de pRS5a (Figura 5) com o uso do seguinte método.
[0113] O vetor foi preparado com o uso da cadeia principal de vetor da SEQ ID NO: 36 com a etiqueta de expressão SEQ ID NO: 135, que contém uma etiqueta APP_HIS, concentração de estoque, 3,3 µg/µl.
[0114] Vetor foi digerido misturando-se 10 µg de vetor-DNA, 0,4 µl de HindIII (100 U/µl, NEB), 2 µl de EcoRI (20 U/µl, NEB), 5 µl de tampão Cutsmart 10x concentrado (NEB), H2O para o volume final de 50 µl. A digestão foi executada por 3 h a 37 °C.
[0115] Desfosforilação foi realizada com 10 U/µl de Fosfatase Alcalina de intestino de bezerro (CIP, NEB, nº M0290L). Diretamente após a digestão, 3 µl de CIP foram adicionados ao vetor digerido e incubados por 30 minutos a 37 °C. O vetor digerido e desfosforilado foi carregado em 0,8% de gel de agarose TAE preparativo, tamanho de banda correto de vetor com ~6100 bp foi cortado. Limpeza foi realizada com Gel SV Wizard® e Kit de Limpeza de PCR, Promega, nº 9282, 1 coluna, eluição em 100 ul. OD260nm mostrou uma concentração de 64 ng/µl.
[0116] Digestão de fragmentos de Inserto mutado foi realizada misturando-se 42,5 µl de DNA (~3 a 5 ug para cada DNA), 5 µl de tampão Cutsmart, 10x concentrada, NEB, nº B7204S, 0,4 µl de HindIII- HF, 100 U/µl, NEB, nº R3104S, 2 µl de EcoRI-HF, 20 U/µl, NEB, nº R3103L, e volume de ajuste para 50 µl com H2O. Digestão foi realizada por 3 h a 37 °C em máquina de PCR. Insertos digeridos foram carregados em 0,8% de gel de agarose de TAE preparativo, tamanho de banda correto de vetor com ~1.400 bp foi cortado. Limpeza foi realizada com Gel SV Wizard® e Kit de Limpeza de PCR, Promega, nº 9282, 1 coluna, eluição em 30 μl. OD260nm mostrou uma concentração de 1 a 25 ng/µl.
[0117] Ligação foi realizada com o uso de (razão de vetor:inserto de ~1:10), com Kit de Ligação de DNA Rápida, nº K1423, Fa. Thermo Scientific. 4 µl de Tampão de Ligação de 5x foram misturados com 1 µl de Ligase, 2 µl de fragmento de vetor, concentração de estoque de HindIII/EcoRI digerido 64 ng/µl, 13 µl de fragmento de inserto, concentração de estoque de HindIII/EcoRI digerido 1 a 25 ng/µl. Ligação foi executada por 10 minutos em RT.
[0118] Transformação foi realizada através da incubação de 10 µl de ligação com 80 µl de células XL1Blue competentes químicas (Novartis, FS/RL) por 30 min em gelo. Choque térmico por 45 segundos a 42 °C em incubadora de Eppendorf, seguido por incubação por 2 min em gelo. Após isso, 1 ml de meios de 2YT foi adicionado, seguido por incubação por 1,5 h a 37 °C em agitador de Eppendorf (800 rpm). Células foram centrifugadas por 3 min a 7.000 rpm e colônias colocadas em placas em LB/Carb/Gluc. Placas, seguidas por incubação de um dia para o outro a 37 °C.
[0119] No dia seguinte, colônias únicas foram escolhidas para DNA- Miniprep e análise de sequência foi realizada com Iniciador dianteiro P270 (SEQ ID NO: 165) e Iniciador reverso P271 (SEQ ID NO: 166).
[0120] As sequências corretas foram transfectadas em células
HEK293 de acordo com os 7 dias de expressão, escala de 200 ml.
[0121] O seguinte material foi usado:
[0122] Células de rim embriônicas humanas que expressam constitutivamente o antígeno T grande SV40 (HEK293-T), por exemplo, ATCC11268
[0123] Polietilenimina "MAX" MW 40,000 (PEI) (Polisciences, nº de categoria 24765), dissolvida em H20 a RT, ajustado com NaOH até pH 7,05.
[0124] Meio de cultura isento de soro M11V3 (Bioconcept, CH, nº de categoria: V3-K)
[0125] DNA: preparado com Kit de DNA Qiagen, Kit Midiprep (nº 12943) de acordo com protocolo recomendado pelo fornecedor
[0126] Todo o trabalho de cultura celular para as transfecções transientes é realizado com o uso de células T HEK293 adaptadas à suspensão que crescem em meio M11V3 isento de soro.
[0127] Células são cultivadas em frascos de agitação Corning (Corning, E.U.A.) em um agitador orbital (115 rpm) em uma incubadora de CO2 umidificada com 5% de CO2 (frascos de semente).
[0128] Células usadas estiveram em fase de crescimento exponencial (densidade celular entre 5x105 e 3x106/ml) e tiveram uma viabilidade de >90%.
[0129] Transfecção foi realizada em pequena escala (aqui 20/50 ou 100 ml), com o uso de células que foram contadas e a quantidade correspondente de células foi ajustada para 1,4x106 células/ml com meio M11V3. 36% de suspensão celular do volume de transfecção final é usado.
[0130] A solução de DNA (solução 1) é preparada diluindo-se DNA de 1 mg/l de volume final em M11V3 de 7% de volume final e mistura suave. Para evitar a contaminação das culturas devido ao DNA filtrado não estéril, Penc./Strep foi adicionado na transfecção após a alimentação. Então, solução de PEI de 3 mg/l de volume final é diluída em M11V3 de 7% de volume final e misturada suavemente (solução 2). Ambas as soluções são incubadas por 5 a 10 min em temperatura ambiente (RT). Depois disso a solução 2 é adicionada à solução 1 com mistura suave e incubada mais 5 a 15 minutos em RT. Após a incubação, a mistura de transfecção é adicionada às células e a cultura é cultivada por quatro horas (115 rpm, 37 °C, 5% de CO2).
[0131] Sobrenadante foi coletado após 7 dias de expressão.
[0132] Centrifugação a 4.500 rpm, 15 minutos, 4 °C (Heraeus, Multifuge 3 S-R)
[0133] Clarificação através de um filtro estéril, 0,22 µm (Stericup filter, Thermo Scientific, nº de Categoria 567-0020))
[0134] Entregar sobrenadante para purificação para etapas adicionais. 1 ml de amostra de sobrenadante é usado para IPC em coluna de APP de acesso aberto
[0135] Frascos de amostra eram frascos de prensa de vidro, 2 ml de Agilent, número de catálogo 5182-0543 e tampas: prensa de 11 mm, número de catálogo 5040-4667.
[0136] Proteína foi purificada com o uso de cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC) em Aekta Pure ou Aekta Avant (GE Healthcare), de acordo com o seguinte protocolo, com o uso de uma coluna Histrap HP de 5 ml (GE Life Sciences, nº de pedido 17- 5248-02). As especificações são apresentadas na Tabela 11. Tabela 11. Protocolo de IMAC CV Fluxo (ml/min) Tampão Equilíbrio 5 5 IMAC A Carga de amostra 3 Sobrenadante celular Lavagem de Coluna 10 3 IMAC A Eluição 10 3 Gradiente de 0 a 20% de IMAC B 10 3 100% de IMAC B Fracionamento Frações de 2 ml
[0137] Os tampões usados eram compostos de acordo com a Tabela 12 e a Tabela 13.
Tabela 12. IMAC A, tampão de equilíbrio e lavagem Concentração Química 10 mM Na2HPO4 10 mM NaH2PO4 500 mM NaCl 20 mM Imidazol (Merck) Tabela 13. IMAC B, tampão de eluição Concentração Química 10 mM Na2HPO4 10 mM NaH2PO4 500 mM NaCl 500 mM Imidazol (Merck)
[0138] A proteína resultante, de acordo com a Tabela 14, foi armazenada.
Tabela 14. Construtos Construto Posições de mutação C1140 N73A/F365S C1141 T229A/F365S C1142 N292Q/F365S C1143 N334Q/F365S C1144 F365S/N371Q C1145 F365S/N457Q C1058 F365S
(b) Resultados e interpretação
[0139] Não houve melhoramento de mutantes com relação ao pico monomérico e rendimento de SEC analítico. A proteína paterna (EP14) com etiqueta de expressão de acordo com a SEQ ID NO: 137 gerou o melhor rendimento e maior pico monomérico em análise. O menor rendimento e também o pior pico monomérico foram alcançados com o mutante N371Q.
6. Exemplo 5: Combinações
[0140] De modo a tentar e melhorar mais as propriedades, algumas das mutações introduzidas no Exemplo 3 acima foram combinadas de acordo com a Tabela 15, abaixo. Mutações são numeradas de acordo com as posições de aminoácido da CD39 de tipo selvagem conforme apresentado na SEQ ID NO: 1. Tabela 15. Combinação de construtos Construto Mutação Mutação 2 Mutação 3 Sem Iniciadores SEQ ID 1 EP14xEP19 365: F->S 424: L->Q 436: H->D P878/P879 SEQ ID NO: 64 EP17xEP19 424: L->Q 436: H->D 412: Y->F 405: K->N P880/P881 SEQ ID NO: 70 EP14xEP17 365: F->S 412: Y->F 405: K->N P880/P881 SEQ ID NO: 60 EP10xEP19_ 424: L->Q 436: H->D 319: I->T P882/P883 SEQ ID H436D NO: 62 EP19 sem 424: L->Q 436: H->D P884/P885 Sequên- H436D cia não incluída (a) Materiais e métodos Os iniciadores de acordo com a Tabela 16 foram usados.
Tabela 16. Iniciadores
Iniciador Sequência P878 SEQ ID NO: 183 P879 SEQ ID NO: 184 P880 SEQ ID NO: 185 P881 SEQ ID NO: 186 P882 SEQ ID NO: 187 P883 SEQ ID NO: 188 P884 SEQ ID NO: 189 P885 SEQ ID NO: 190
[0141] Uma reação de PCR foi configurada com o uso do seguinte esquema de pipetagem: 5 µl de tampão de reação de 10x, 1 µl de modelo de ds-DNA (concentração de estoque, 100 ng/µl), 1,5 µl de iniciador 1, 1,5 µl de iniciador 2, 1 µl de mistura de dNTP 1,5 µl de reagente QuickSolution, 35,5 µl de H2O (para volume final de 50 µl) e 1 µl de Enzima QuickChange Lightning.
[0142] Os parâmetros de ciclagem de PCR de acordo com a Tabela 17 foram usados.
Tabela 17. Parâmetros de ciclagem de PCR nº de ciclos Temperatura Tempo 1 1 96ºC 2 min 2 18 96ºC 20 s 60ºC 10 s 68ºC 3 min (30 s/kb) 3 1 68ºC 6 min
[0143] Diretamente após a reação, 2 µl de Enzima DpnI foram adicionados em cada reação, misturados e incubados por 5 min a 37°C.
[0144] Transformação em células ultra competentes XL10-gold foi realizada como a seguir. Células foram descongeladas no gelo. 45 µl/transformação foram usados, e 2 µl de B-ME foram adicionados em cada frasco. Então, 3 µl de produto de PCR de DpnI digerido foram adicionados e incubados por 30 min em gelo em tubos de BD de 15 ml. Depois disso, as amostras sofreram choque térmico por 40 segundos e foram incubadas em gelo por 2 min. A seguir, 950 µl de meio SOC foram adicionados, seguido por incubação por 1,5 h a 37°C em uma incubadora vibratória. Finalmente, células foram colocadas em placa em placas de LB-carb e incubadas de um dia para o outro a 37°C. No dia seguinte, colônias únicas foram escolhidas para análise de DNA- miniprep e sequência.
[0145] As sequências corretas foram transfectadas em células HEK293 conforme descrito no Exemplo 4.
[0146] Proteína foi purificada com o uso de cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC) de acordo com o seguinte. 95 ml de sobrenadante foram usados (~4 ml de tudo é mantido para análise (IPC)).
[0147] Material Usado:
[0148] Níquel-NTA-Agarose, Qiagen, nº de categoria/ID: 30230, Colunas de Cromatografia Poli-Prep, vazias, BioRad, nº 731-1550, Tampão de IMAC A de pH 7,4 (que contém 20 mM de tampão de NaPO4 e 50 mM de Imidazol). Tampão de IMAC B de pH 7,4 (que contém 20 mM de tampão de NaPO4 e 300 mM de Imidazol). TBS (10x concentrado, diluído em concentração de 1x com água MilliQ). Unidade de Filtro de Centrifugação Amicon Ultra-4 com membrana Ultracel-10, 10K, UFC801096.
[0149] Etapas de processo:
1. Colunas foram preparadas com 1 ml de Níquel-NTA-Agarose da Qiagen (= 0,5 ml de CV);
2. Equilíbrio com 10 CV de IMAC A;
3. Carregamento de 15/45 ml de SN em coluna (coletar fluxo passante);
4. Lavagem com 10 CV de IMAC A (coletar em tubo Falcon de 15 ml);
5. Eluição em 6,5 CV de IMAC B;
6. Determinação de concentração de eluato;
7. Concentração de 3,5 ml de amostra em ~400 µl com Unidade de Filtro de Centrífuga Amicon Ultra-4 10K;
8. Troca de tampão adicionando-se TBS e centrifugação 5000; Amostras foram analisadas com o uso de SEC analítica com 40 µl de cada amostra e com o uso de gel de proteína com 12 µl de cada amostra. A proteína resultante foi armazenada. (b) Resultados e interpretação
[0150] Os resultados são mostrados na Tabela 18: Tabela 18. Visão geral de resultado Nome Rendimento IPC (app, mg/l) Agregação (% (mg/l) de pico monomérico) EP14xEP19 6,85 4,5 75,1 EP17xEP19 13,35 11,5 68,9 EP14xEP17 17,27 11,5 69,2 EP10xEP19_H436D 7,42 4,3 74,3 EP19 sem H436D 8,28 2,5 55,6 EP1xEP17 13,46 13,2 77,4 EP28 7,8 2,8 57,5 Sítios de protease:
[0151] Não houve/houve rendimento muito baixo quando Matriptase foi inserida. Com sítio de Furin, houve ~40% de rendimento (porém para transfecção apenas 50% de DNA também foram usados, como foi uma cotransfecção com plasmídeo de Furin).
[0152] Truncações de IL2:
[0153] Todas as truncações em que aa1-3 está incluída dão um resultado comparável, aa1-3 pode ser apenas levemente inferior em comparação com os outros, porém, isso pode ser uma variação de amostra para amostra. Truncação aa4-12 não resultou em nenhuma expressão de proteína. Nenhuma diferença poderia ser encontrada entre EP28 que contenha, como todas as outras variantes de EP, um ligante de TSS entre o início IL2 e a proteína hCD39. Combinações:
[0154] Combinações com EP19 (L424Q) não resultam em um melhoramento significativo de expressão de proteína.
[0155] Combinação com EP1 (R113M) exibiram uma agregação inferior em SEC analítica. NEG726 foi bem expressa, porém, demonstrou agregação pior dentre todas testadas (~37%). Combinação de EP14xEP17 não resultou em nenhum melhoramento adicional (F365S + Y412F).
7. Exemplo 6: Clonagem de candidatos finais
[0156] Uma seleção de candidatos clínicos conforme apresentados na Tabela 19 abaixo, foi expressa para teste adicional. Tabela 19. Visão geral de candidatos finais. Construto Combinação de clones IL2 líder Sequência Principal 1 EP1xEP14xEP19aa1-3 SEQ ID NO: 137 SEQ ID NO: 233 2 EP1xEP17xEP19 aa1-3 SEQ ID NO: 137 SEQ ID NO: 217 3 EP14aa1-3 SEQ ID NO: 137 SEQ ID NO: 229 4 EP17aa1-3 SEQ ID NO: 137 SEQ ID NO: 237 5 EP19aa1-3 SEQ ID NO: 137 SEQ ID NO: 243 6 EP28aa1-3 (líder/paterna) SEQ ID NO: 137 SEQ ID NO: 58 7 EP1xEP14xEP19 aa1-6 SEQ ID NO: 135 SEQ ID NO: 235 8 EP1xEP17xEP19 aa1-6 SEQ ID NO: 135 SEQ ID NO: 219 9 EP14aa1-6 SEQ ID NO: 135 SEQ ID NO: 231
10 EP17aa1-6 SEQ ID NO: 135 SEQ ID NO: 239 11 EP19aa1-6 SEQ ID NO: 135 SEQ ID NO: 245 12 EP28aa1-6 (líder/paterna) SEQ ID NO: 135 SEQ ID NO: 80 Os seguintes iniciadores foram usados: Tabela 20. Iniciadores Iniciador Sequência R113Mtempl SEQ ID NO: 191 R113MFW SEQ ID NO: 192 R113MRev SEQ ID NO: 193 F330StempI SEQ ID NO: 194 F330SFW SEQ ID NO: 195 F330SRev SEQ ID NO: 196 Y377FtempI SEQ ID NO: 197 L389CtempI SEQ ID NO: 198 Y377F/L389QtempI SEQ ID NO: 199 FW SEQ ID NO: 200 Rev SEQ ID NO: 201 WT SEQ ID NO: 202
[0157] Uma reação de PCR foi configurada com o uso do seguinte esquema de pipetagem: 0,25 µl de DMSO, 20 ng de vetor 1,5 µl de inserto (45 ng/µl), Tampão de 5x de HF de 2 µl, 0,1 µl de Phusion pol, 0,08 µl de mistura de dNTP 10-X µl de ddH2O
[0158] Os parâmetros de ciclagem de PCR de acordo com a Tabela 17 foram usados. Tabela 21. Parâmetros de ciclagem de PCR nº de ciclos Temperatura Tempo 1 1 98ºC 3 min 2 25 98ºC 30 s 60ºC 30 s 72ºC 5 min 46 s 3 1 72ºC 10 min
[0159] Diretamente após a reação, 0,5 µl de Enzima DpnI foram adicionados em cada reação, misturados e incubados por 2 h a 37 °C.
[0160] Transformação em células ultra competentes XL10-gold foi realizada como a seguir. Células foram descongeladas no gelo. 45 µl/transformação foram usados, e 2 µl de B-ME foram adicionados em cada frasco. Então, 3 µl de produto de PCR de DpnI digerido foram adicionados e incubados por 30 min em gelo em tubos de BD de 15 ml. Depois disso, as amostras sofreram choque térmico por 40 segundos e foram incubadas em gelo por 2 min. A seguir, 950 µl de meio SOC foram adicionados, seguido por incubação por 1,5 h a 37°C em uma incubadora vibratória. Finalmente, células foram colocadas em placa em placas de LB-carb e incubadas de um dia para o outro a 37°C. No dia seguinte, colônias únicas foram escolhidas para análise de DNA- miniprep e sequência.
[0161] Todos os construtos foram subclonados em novo fundo de vetor para assegurar que as sequências fossem corretas. Para isso, todos os construtos foram amplificados com PCR, com ligantes G4S inseridos, seguido por digestão com HindIII/EcoRI.
[0162] A proteína resultante foi armazenada.
8. Exemplo 7: Geração de proteínas comparadoras (1) Mutações nulas
[0163] De modo a gerar proteínas de controle negativo para estudos in vivo, uma/duas mutações foram inseridas na proteína CD39ΔMIL humana paterna (EP28). Essas mutações foram descritas na literatura para remover ou diminuir a atividade enzimática dessa proteína. Posições de mutação são E174A e S218A.
[0164] Os seguintes iniciadores foram usados: Tabela 22. Iniciadores Iniciador Sequência P910 SEQ ID NO: 203 P911 SEQ ID NO: 204 P914 SEQ ID NO: 205 P915 SEQ ID NO: 206
[0165] Uma reação de PCR foi configurada com o uso do seguinte esquema de pipetagem: 5 µl de tampão de reação de 10x, 1 µl de modelo de ds-DNA (concentração de estoque, 100 ng/µl), 1,5 µl de iniciador 1, 1,5 µl de iniciador 2, 1 µl de mistura de dNTP 1,5 µl de reagente QuickSolution, 35,5 µl de H2O (para volume final de 50 µl) e 1 µl de Enzima QuickChange Lightning.
[0166] Os parâmetros de ciclagem de PCR de acordo com a Tabela 17 foram usados. Tabela 23. Parâmetros de ciclagem de PCR nº de ciclos Temperatura Tempo 1 1 96ºC 2 min 2 18 96ºC 20 s 60ºC 10 s 68ºC 3 min (30 s/kb) 3 1 68ºC 6 min
[0167] Diretamente após a reação, 2 µl de Enzima DpnI foram adicionados em cada reação, misturados e incubados por 5 min a 37°C.
[0168] Transformação em células ultra competentes XL10-gold foi realizada como a seguir. Células foram descongeladas no gelo. 45 µl/transformação foram usados, e 2 µl de B-ME foram adicionados em cada frasco. Então, 3 µl de produto de PCR de DpnI digerido foram adicionados e incubados por 30 min em gelo em tubos de BD de 15 ml. Depois disso, as amostras sofreram choque térmico por 40 segundos e foram incubadas em gelo por 2 min. A seguir, 950 µl de meio SOC foram adicionados, seguido por incubação por 1,5 h a 37°C em uma incubadora vibratória. Finalmente, células foram colocadas em placa em placas de LB-carb e incubadas de um dia para o outro a 37°C. No dia seguinte, colônias únicas foram escolhidas para análise de DNA- miniprep e sequência.
[0169] Sequências corretas foram transfectadas em células HEK293 de acordo com o seguinte protocolo.
[0170] Um tampão de digestão foi preparado, com o uso de 10 µg de DNA vetorial, 0,4 µl de HindIII (100 U/µl, NEB), 2 µl de EcoRI (20 U/µl, NEB), 5 µl de tampão Cutsmart 10x concentrado (NEB), e H2O em um volume final de 50 µl. A reação de digestão foi executada por 3 h a 37°C.
[0171] Imediatamente após a digestão, uma reação desfosforilação foi executada. Fosfatase alcalina de intestino de bezerro (10 U/µl, CIP, NEB, nº M0290L) foi adicionada (3 µl) à mistura de vetor digerida e incubada por 30 min a 37°C.
[0172] O vetor digerido e desfosforilado foi subclonado para verificar a sequência.
[0173] Sequências corretas foram transfectadas em células HEK293 de acordo com o seguinte protocolo.
[0174] 7 dias de expressão foram realizados com o uso do seguinte material; 1. Células de rim embriônicas humanas que expressam constitutivamente o antígeno T grande SV40 (HEK293-T, ATCC11268);
2. Polietilenimina "MAX" MW 40,000 (PEI) (Polisciences, nº de categoria 24765).
[0175] A solução de PEI é preparada dissolvendo-se cuidadosamente 1 g de PEI em 900 ml de água com grau de cultura celular em temperatura ambiente (RT). Então, a mesma é neutralizada com NaOH para um pH final de 7,05. Finalmente o volume é ajustado para 1 l e a solução filtrada através de um filtro de 0,22 µm, distribuído em alíquotas e congelado a -80°C até o uso adicional. Uma vez descongelada, uma alíquota pode ser congelada novamente até 3 vezes a -20°C, porém, não deveria ser armazenada a longo prazo a - 20°C.
[0176] Meio de cultura isento de soro M11V3 (Bioconcept, CH, nº de categoria: V3-K).
[0177] Todo o trabalho de cultura celular para as transfecções transientes é realizado com o uso de células T HEK293 adaptadas à suspensão que crescem em meio M11V3 isento de soro.
[0178] Para transfecções em pequena escala (<5 l), células são cultivadas em frascos de agitação Corning (Corning, E.U.A.) em um agitador orbital (100 rpm) em uma incubadora de CO2 umidificada com 5% de CO2 (frascos de semente).
[0179] Em geral, células nas culturas de semente deveriam estar na fase de crescimento exponencial (densidade celular entre 5x105 e 3x106/ml) e ter uma viabilidade de >90%. Densidades de célula fora dessa faixa resultarão em uma fase de latência após divisão ou eficácia de transfecção reduzida.
[0180] Para transfecção em pequena escala (aqui 2 l) uma alíquota de células é retirada das culturas de semente e ajustada para 1,4x10 6 células/ml em 36% do volume final com meio M11V3.
[0181] A solução de DNA (solução 1) é preparada diluindo-se DNA de 1 mg/l de volume final em M11V3 de 7% de volume final e mistura suave. Para evitar contaminação das culturas, essa solução pode ser filtrada com o uso de um filtro de 0,22 µm (por exemplo, Millipore Stericup). Aqui, devido ao pequeno volume nenhuma filtração estéril foi realizada. Então, solução de PEI de 3 mg/l de volume final é diluída em M11V3 de 7% de volume final e misturada suavemente (solução 2). Ambas as soluções são incubadas por 5 a 10 min em temperatura ambiente (RT). Depois disso a solução 2 é adicionada à solução 1 com mistura suave e incubada mais 5 a 15 minutos em RT (não misturar novamente durante tempo de incubação, conforme PEI cobre/condensa DNA em partículas positivamente carregadas, que se ligam aos resíduos de superfície celular aniônicos e são colocados na célula por meio de endocitose). Após a incubação, a mistura de transfecção é adicionada às células e a cultura é cultivada por quatro horas (10 rpm, 37 °C, 6% de CO2).
[0182] Finalmente, a cultura é alimentada com os 50% restantes de volume final de meio M11V3 de acordo com o seguinte exemplo: Volume de inoculação: 36 ml com 1,4x106 células/ml.
[0183] Solução 1: 7 ml de meio M11V3 com 100 µg de DNA de plasmídeo. Solução 2: 7 ml de meio M11V3 com 300 µg de PEI (300 µl)
[0184] Alimentação: 50 ml de M11V3, Total 100 ml.
[0185] Proteína foi purificada com o uso de cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC) de acordo com o seguinte. 95 ml de sobrenadante foram usados (~4 ml de tudo é mantido para análise (IPC)).
[0186] Material Usado:
[0187] Níquel-NTA-Agarose, Qiagen, nº de categoria/ID: 30230, Colunas de Cromatografia Poli-Prep, vazias, BioRad, nº 731-1550, Tampão de IMAC A de pH 7,4 (que contém 20 mM de tampão de NaPO4 e 50 mM de Imidazol). Tampão de IMAC B de pH 7,4 (que contém 20 mM de tampão de NaPO4 e 300 mM de Imidazol). TBS (10x concentrado, diluído em concentração de 1x com água MilliQ). Unidade de Filtro de Centrifugação Amicon Ultra-4 com membrana Ultracel-10, 10K, UFC801096.
[0188] Etapas de processo:
1. Colunas foram preparadas com 1 ml de Níquel-NTA-Agarose da Qiagen (= 0,5 ml de CV);
2. Equilíbrio com 10 CV de IMAC A;
3. Carregamento de 15/45 ml de SN em coluna (coletar fluxo passante);
4. Lavagem com 10 CV de IMAC A (coletar em tubo Falcon de 15 ml);
5. Eluição em 6,5 CV de IMAC B;
6. Determinação de concentração de eluato;
7. Concentração de 3,5 ml de amostra em ~400 µl com Unidade de Filtro de Centrífuga Amicon Ultra-4 10K;
8. Troca de tampão adicionando-se TBS e centrifugação 5000;
[0189] Amostras foram analisadas com o uso de SEC analítica com 40 µl de cada amostra e com o uso de gel de proteína com 12 µl de cada amostra.
[0190] A proteína resultante foi armazenada. (2) plusMIL
[0191] Clonagem de EP14aa1-3 com Laço de Interação de Membrana (aa193-204) com PCR de extensão de sobreposição foi realizada.
[0192] Os seguintes iniciadores foram usados: Tabela 24. Iniciadores Iniciador Sequência FW SEQ ID NO: 207 REV SEQ ID NO: 208 Rev-sense SEQ ID NO: 98
[0193] Uma reação de PCR foi configurada com o uso do seguinte esquema de pipetagem: 1,2 µl de Polimerase de Começo Quente Phusion, Tampão de 5x de HF de 24 µl, 0,96 µl de 100 mM de dNTPs (25 mM de cada dNTP), 0,6 µl de iniciador dianteiro, 0,6 µl de iniciador reverso, 92,64 µl de DEPC H2O.
[0194] Os parâmetros de ciclagem de PCR de acordo com a Tabela 17 foram usados. Tabela 25. Parâmetros de ciclagem de PCR nº de ciclos Temperatura Tempo 1 1 98ºC 30 s 2 30 98ºC 10 s 50-70ºC 30 s gradiente 72ºC 30 s 3 1 72ºC 10 min
[0195] Diretamente após a reação, 2 µl de Enzima DpnI foram adicionados em cada reação, misturados e incubados por 2 h a 37°C.
[0196] Transformação foi realizada transferindo-se 2 µl de produto de PCR para uma placa de PCR de 96 poços e resfriamento em gelo. 20 µl de bactérias de componente químico STELLAR foram adicionados e cuidadosamente misturados pipetando-se uma vez para cima e para baixo. As amostras foram incubadas 30 min em gelo e, então, 45 segundos a 42°C em uma máquina de PCR, seguido por mais 60 segundos de incubação em gelo. Finalmente, 90 µl de meio SOC foram adicionados e incubados 1 h a 37°C. A mistura de transfecção inteira foi colocada em placa de LB-Ampicilina ou LB-Carbencilina e cultivadas de um dia para o outro a 37°C.
[0197] A proteína resultante EP14_plusMIL, com uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 155, foi armazenada.
9. Exemplo 8: Atividade enzimática
[0198] Os candidatos gerados em exemplos precedentes, foram caracterizados com o uso de um ensaio de atividade enzimática.
[0199] Os seguintes reagentes foram usados: Tampão isento de Pi, uma solução salina fisiológica isenta de fosfato (140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 2 mM de CaCl2, 10 mM de Hepes, pH 7,4); e tampão isento de Pi + 2% de BSA, uma solução salina fisiológica isenta de fosfato com 20 mg/ml de BSA; proteína CD39 (de acordo com a SEQ ID NO: 1); ATP.
[0200] Solução de CD39 duplicada foi preparada a 2 µg/ml. Solução de ATP duplicada foi preparada a 1.000 µM de um estoque de ATP de 15 µl + 1.185 µl de tampão, total 1,2 ml.
[0201] A reação enzimática foi estudada misturando-se os 60 µl de ATP com 60 µl de CD39 ou 60 µl com tampão isento de Pi para os controles, em placas de PCR de 48 poços carregadas com 120 µl final/poço. A concentração final foi 500 µM de ATP e 1 µg/ml de CD39.
[0202] Amostras foram incubadas a 37 °C por 0, 5, 15, 30, 60, 90 e 150 minutos, respectivamente. Então, as amostras foram avaliadas por ensaio de liberação de Pi ou HPLC. (1) Ensaio de liberação de Pi (a) Materiais e métodos
[0203] Reagentes foram preparados a partir de um kit de detecção de Pi de acordo com as instruções de fabricantes.
[0204] Uma curva padrão com Pi foi preparada através de diluição em água. Uma diluição em série de 1:2 do estoque de Pi (100 µM) foi preparada: 450 µl + 450 µl de água. A concentração de curva padrão foi: 50 µM / 25 µM / 12,5 µM / 6,25 µM / 3,1 µM / 1,5 µM / 0 µM.
[0205] Mistura de reagente Gold foi preparada: 4 ml de reagente
Gold + 40 µl de acelerador (para 3 placas). Em uma placa de 96 poços, as amostras foram diluídas 1:10 em H2O (Diluição em água: 10 µl de amostra + 90 µl de H2O). 50 µl de amostra diluída em 1:10 foram distribuídos em cada poço de uma placa de 96 poços de meia área (Corning, 3690). 12,5 µl de mistura de reagente Gold foram adicionados em cada poço (25% em volume de amostra) e as amostras foram incubadas 10 min em temperatura ambiente. Absorção foi lida em 635 nm. (b) Resultados e interpretação
[0206] Resultados comparativos para candidatos são mostrados na Tabela 26. Tabela 26. Resultados comparativos para candidatos. Construto Início IL- SEQ ID Rendi- % Tempe- Atividade 2 mento mono- ratura enzimáti- após mérica de fusão ca in vitro ALC após (°C) (em ALC relação a EP28) 1 EP14aa1-3 SEQ ID SEQ ID 33,1 83,8 62 4 NO: 137 NO: 229 2 EP1xEP14aa SEQ ID SEQ ID 3,7 50,6 65,5 4 1-3 NO: 137 NO: 221 3 EP1xEP17aa SEQ ID SEQ ID 95,8 91,9 61 1,5 1-3 NO: 137 NO: 211 4 EP17xEP19 SEQ ID SEQ ID 3,5 38,9 60,5 1,5 aa1-3 NO: 137 NO: 227 5 EP1xEP17xE SEQ ID SEQ ID 153,2 89,7 60,75 1,5 P19aa1-3 NO: 137 NO: 217 6 EP1 aa1-3 SEQ ID SEQ ID 6,0 9,2 59,75 1 NO: 137 NO: 209 7 EP1xEP14 SEQ ID SEQ ID 148,8 91,8 64 4 aa1-6 NO: 135 NO: 223 8 EP1xEP17 SEQ ID SEQ ID 59,4 86,1 59,5 1,5 aa1-6 NO: 135 NO: 213 9 EP17xEP19 SEQ ID SEQ ID 2,7 13,7 60 1,5 aa1-6 NO: 135 NO: 227 10 EP1xEP17xE SEQ ID SEQ ID 30,9 88,4 60,75 1,5 P19 aa1-6 NO: 135 NO: 219
11 EP1xEP17_ SEQ ID SEQ ID 156,3 86,4 62,25 1,5 K405Naa1- NO: 133 NO: 215 15 12 EP28aa1-3 SEQ ID SEQ ID 2,7 10 60,5 1 NO: 137 NO: 58 13 EP28aa1-16 SEQ ID SEQ ID 4,7 45 61,8 1 NO: 131 NO: 72
[0207] Atividade enzimática foi medida adicionando-se 500 µM de ATP na enzima e analisando-se a concentração de ATP, ADP, AMP com HPLC (descrição do método abaixo) ao longo do tempo. As curvas cinéticas resultantes quando adequadas ao modelo na Figura 6 para obter as constantes enzimáticas. Em termos da constante enzimática Kcat as enzimas mostram a seguinte ordem (baixa atividade para alta atividade): EP28 (wt), EP17, EP14, EP15.
[0208] A Figura 7 mostra dados cinéticos e ajuste de modelo para EP28. A Figura 8 mostra dados cinéticos e ajuste de modelo para EP14. A Figura 9 mostra dados cinéticos e ajuste de modelo para EP15.
[0209] Uma visão geral de constantes enzimáticas para EP28 (wt), EP14, EP15 e EP17 é mostrada na Tabela 27. Em comparação com o tipo selvagem (WT) as três variantes inovadoras mostram atividade catalítica aumentada. Importantemente, as novas variantes mostram um aumento claro na eficiência catalítica (kcat/Km) de constante de taxa catalítica (kcat). Como a concentração de substrato de ATP e ADP relatada durante dano tecidual e trombose está acima da Km relatada, esse aumento em kcat e kcat/Km se traduzirá provavelmente em atividade superior in vivo. Tabela 27. Constantes enzimáticas ATP -> ADP + P ADP -> AMP + P inibição kTcat KTM kTcat/KTM kDcat KDM kDcat/KDM KMd WT 65,3 0,7 89,7 40,0 0,1 400,3 0,2 EP14 380,2 1,1 352,6 90,3 Fixado 903,0 556,8 em 0,1
EP15 734,9 1,1 658,1 128,7 0,1 1287,1 584,9 EP17 180,7 1,0 178,1 67,0 0,1 670,0 3,0 (2) Ensaio de validação de HPLC (resposta cinética e de dose) (a) Materiais e métodos
[0210] Os candidatos foram testados com ensaio de validação de HPLC. 70 µl de cada amostra foram transferidos para frascos de vidro para HPLC.
[0211] Amostras de calibragem foram preparadas com Soluções de Estoque de 5 mM conforme mostrado na Tabela 28. Tabela 28. Soluções de estoque 5 mM peso H2O Adenosina 1336,2 µg/ml 1,862 mg 1394 µl Inosina 1341,2 µg/ml 2,668 mg 1989 µl AMP 1736,1 µg/ml 2,182 mg 1257 µl ADP 2506,6 µg/ml 2,500 mg 997 µl ATP 2755,7 µg/ml 4,834 mg 1754 µl
1.000 µM 20 µl de cada solução de estoque foram misturados em um frasco de HPLC 500 µM 20 µl 1 mM + 20 µl de H2O 100 µM 10 µl 1 mM + 90 µl de H2O 10 µM 10 µl 100 µM + 90 µl de H2O 1 µM 10 µl 10 µM + 90 µl de H2O
[0212] Separação de HPLC foi realizada com o uso de um sistema Agilent 1100 com um CapPump (G1376A), Degasser (G1379A), ALS (G1329A), Thermostat (G1330B, ColComp (G1316A) e um DAD (G1315A). Solvente A: 10 mM de KH2PO4 (04243, Riedel-de Haën) + 2 mM brometo de TBA, pH 7,0 (86857-10G-F, Fluka) e Solvente B: 10 mM de KH2PO4/ACN 1/1 + 2 mM de brometo de TBA, pH 5,5. Coluna: Nucleodur 300-5 C18 ec, 2 x 150 mm, 5 µm, Macherey-Nagel 760185,20
Lote E14100258 36654055. A temperatura de coluna foi de 40 °C, volume de injeção 10 µl, taxa de fluxo foi de 0,3 ml/min e o gradiente foi de 0 a 3': 0% de B; 3 a 23': 0 a 95% de B, linear; 23 a 28': 95% de B, linear; 28 a 29': 95 a 0% de B, linear; 5’ Tempo Posterior". DAD: 247 nm e 259 nm.
[0213] Separação de UPLC foi realizada com o uso de uma classe de UPLC I Waters. Solvente A: 10 mM de KH2PO4 / 10 mM de K2HPO4 1/1 + 2 mM de brometo de TBA, pH 7,0 . Solvente B: 10 mM de KH2PO4 / ACN 1/1 + 2 mM de brometo de TBA, pH 5,5. Coluna: Fortis Bio C18, 2,1 x 50 mm, 5 µm, di2chrom BIO318-020301 SN H03161210-
2. Temperatura de coluna foi de 40 °C, volume de injeção foi de 10 µl, taxa de fluxo foi de 0,5 ml/min e gradiente foi de 0 a 1': 0% de B; 1 a 8': 0 a 55% de B, linear; 8 a 10': 55% de B; 10 a 11': 55 a 0% de B, linear; 14' Tempo de Parada. DAD foi de 247 nm e 259 nm. (b) Resultados
[0214] Os resultados podem ser vistos nas Figuras 7, 8, 9 e 11, que mostram dados cinéticos e ajuste de modelo para candidatos de acordo com diferentes modalidades.
10. Exemplo 9: Atividade in vitro, exame inicial
[0215] As versões de CD39 EP1 a EP24, descritas em exemplos precedentes, foram clonados em vetor de expressão de mamífero pRS5a_Leader_APP_His (Figura 5), sem IL2-líder e sem IL2-início. (a) Materiais e métodos
[0216] Uma expressão em pequena escala (escala de 20/50 ml) de EP-Hits em HEK293 (Transfecção de PEI) por 7 dias foi realizada, seguida por IPC em APP-HPLC (conforme descrito supra).
[0217] Purificação de proteína de sobrenadante celular de 15/45 ml com colunas de Ni-NTA (0,5 ml de CV); Eluição com tampão de IMAC B de 6 CV (20 mM de tampão de NaPO4, 300 mM de Imidazol, pH 7,4);
Concentração e tamponização repetida de proteína purificada em TBS, pH 7,4; Análise de proteína com gel de proteína, SEC analítica; Entrega de todas as variantes e três controles (hCD39-dMIL paterna, ou EP28, com e sem IL2-início, e versão de 8M sem IL2-início): 90 a 200 ul de proteína purificada em TBS, pH 7,4 (b) Resultados e interpretação
[0218] Os resultados estão resumidos na Tabela 29 abaixo.
[0219] Todas as amostras estão em TBS, pH 7,4, e têm uma etiqueta de APP (SEQ ID N: 247) e uma etiqueta de His (SEQ ID NO: 249)
[0220] Apenas CD39ΔMIL humana paterna (EP28) tem uma IL2- início com 15 aminoácidos de comprimento, aa1-15 (SEQ ID NO: 133).
[0221] Ensaio de liberação de Pi BOENKTH1-0252824, detecção dupla Para valores de 60 e 180 minutos Tabela 29. Atividade in vitro Ensaio de liberação de Pi, 0,25 ug/ml + 500 uM de ATP Data de Nome conc. conc. volum média média purificação [mg/ml] [μmolar] e total 0 min. 60 180 [ml] minutos minutos
17.06.2016 EP1 0,19 3,7 0,11 10,35 20,90 45,99
14.06.2016 EP2 0,15 2,8 0,10 11,35 23,65 53,92
14.06.2016 EP3 0,11 2,2 0,10 8,92 19,22 40,76
14.06.2016 EP4 0,25 4,8 0,10 7,99 18,59 37,47
14.06.2016 EP5 0,11 2,1 0,10 17,36 39,59 72,09
17.06.2016 EP6 0,14 2,7 0,15 11,57 32,73 69,63
21.06.2016 EP7 0,41 7,8 0,11 9,47 21,19 43,68
21.06.2016 EP8 0,31 5,9 0,11 7,92 15,23 33,94
14.06.2016 EP9 0,15 2,9 0,10 5,56 13,39 31,38
21.06.2016 EP10 0,33 6,3 0,11 9,32 21,91 54,07
14.06.2016 EP11 0,23 4,4 0,10 10,24 21,27 46,21
21.06.2016 EP12 0,37 7,1 0,11 10,55 21,99 50,80
21.06.2016 EP13 0,13 2,5 0,11 4,93 3,13 3,54
21.06.2016 EP14 0,34 6,5 0,11 19,07 66,35 104,80
14.06.2016 EP15 0,19 3,7 0,10 11,11 29,26 89,92
14.06.2016 EP17 0,28 5,3 0,10 12,49 30,30 102,81
14.06.2016 EP18 0,15 2,9 0,10 3,91 9,70 23,49
17.06.2016 EP19 0,55 10,6 0,12 14,36 26,38 69,93
14.06.2016 EP20 0,14 2,7 0,10 3,36 2,22 3,60
14.06.2016 EP21 0,22 4,2 0,10 7,17 16,37 24,27
17.06.2016 EP22 0,17 3,3 0,11 8,06 15,33 37,30
21.06.2016 EP23.1 0,28 5,4 0,11 12,62 23,58 62,78
17.06.2016 EP24 0,10 2,0 0,19 3,10 3,45 4,83 EP25 0,23 4,4 0,10 hCD39- 4,98 11,46 24,30 dMIL
14.06.2016 paterna EP26 0,19 3,7 0,15 3,66 8,41 24,15
17.06.2016 hCD39-8M EP28- 2,19 42,0 0,14 IL2start- 10,25 23,48 52,73
17.06.2016 hCD39 par
21.06.2016 EP1repet. 0,49 9,5 0,11 10,03 17,84 40,33
17.06.2016 EP2 repet. 0,55 10,6 0,12 12,80 28,22 66,88
17.06.2016 EP3 repet. 0,56 10,8 0,12 18,05 33,35 79,53
17.06.2016 EP4 repet. 0,61 11,7 0,16 15,98 29,47 68,39
17.06.2016 EP5 repet. 0,66 12,6 0,15 25,53 46,10 91,32
21.06.2016 EP23.4 0,29 5,5 0,11 10,43 22,45 56,53
11. Exemplo 10: Atividade in vitro, exame refinado
[0222] Um subconjunto de 12 mutantes foi testado uma segunda vez, porém, em que IL-2 início permite uma escala de expressão maior. (a) Materiais e métodos
[0223] O vetor de expressão de mamífero pRS5a_Leader_APP_His, com uma IL2-início com 15 aminoácidos de comprimento, aa1-15 (SEQ ID NO: 133) (Figura 5). Expressão em pequena escala (escala de 50/100 ml) de EP-Hits em HEK293 (Transfecção de PEI) por 7 dias, seguida por IPC em APP-HPLC (conforme descrito supra).
[0224] Purificação de proteína de sobrenadante celular de 45/95 ml com colunas de Ni-NTA (0,5 ml de CV)
[0225] Eluição com tampão de IMAC B de 6 CV (20 mM de tampão de NaPO4, 300 mM de Imidazol, pH 7,4)
[0226] Concentração e tamponização repetida de proteína purificada em TBS, pH 7,4,
[0227] Análise de proteína com gel de proteína, SEC analítica
[0228] Entrega de todas as variantes e controle (hCD39-dMIL paterna, ou EP28, com IL2-início aa1-15 (SEQ ID NO: 133)): 500 ul de proteína purificada em TBS, pH 7,4 (b) Resultados e interpretação
[0229] Os resultados são resumidos na Tabela 30, Tabela 31 e Tabela 32 abaixo. Tabela 30. Purificações de proteína de EP-Hits 06/07/2016, parte 1 Nome conc. conc. volume rendime Rendim IPC [mg/ml] [umolar] total nto/46 ento (APP, [ml] ou 16 ml (mg/l) mg/l) [mg] EP2 0,64 12,3 0,5 0,32 7,13 6,9 EP3 0,72 13,9 0,5 0,36 8,02 8,6 EP4 0,86 16,4 0,5 0,43 9,49 8,6 EP5 0,89 17,0 0,5 0,44 9,84 10,1 EP6 0,40 7,7 0,5 0,20 4,46 4,3 EP9 0,57 11,0 0,5 0,29 6,35 6,0 EP11 0,74 14,2 0,5 0,37 8,18 8,3 EP12 0,85 16,3 0,5 0,42 9,40 8,2 EP14 0,82 15,7 0,5 0,41 9,09 7,8 EP17 0,94 18,0 0,5 0,47 13,04 13,3 EP18 0,70 13,4 0,5 0,35 7,75 6,4 EP24 0,65 12,4 0,5 0,32 8,99 10,8 EP28 com 0,27 5,2 0,5 0,14 9,01 6,6 IL2-início
Tabela 31. Purificações de proteína de EP-Hits 06/07/2016, parte 2 Nome Volume Agregaçã Pico Degrada- Ensaio de Pi: de o (%) monoméri- ção (%) 1 ug/ml de expres- (SEC co (%) (SEC Enzima, 500 são (ml) analítica) (SEC analítica) uM de ATP, analítica) 60 min (1:10)
EP2 50 15,7 69,5 14,9 53,572 EP3 50 14,9 67,6 17,5 62,6725 EP4 50 11,3 72,5 16,3 52,1195 EP5 50 15,1 67,8 17 75,1995 EP6 50 17,2 59,3 23,5 72,517 EP9 50 21,7 57,5 20,8 63,7175 EP11 50 12,3 72,2 15,6 59,0205 EP12 50 19,9 63,1 17,1 48,358 EP14 50 14,9 66,6 18,5 88,3785 EP17 40 17,3 68,9 13,8 89,8415 EP18 50 15,4 67,2 17,4 61,495 EP24 40 8,9 73 18 74,713 EP28 com 20 17,8 56,4 25,8 53,6735 IL2-início
Tabela 32. Purificações de proteína EP-Hits 15/07/2016 Nome MW e conc. conc. volume quanti- Volume [kD] [M- [mg/ml] [μmolar] total dade de 1*cm-1] [ml] entre- expres- gue são (ml)
EP8 52,08 70875 0,02 0,5 0,5 0,01 50 EP10 52,08 70875 0,76 14,7 0,5 0,38 50 EP14 52,08 70875 0,21 4,0 0,5 0,10 50 EP15 52,08 70875 0,81 15,6 1 0,81 100 EP17 52,08 70875 0,22 4,3 0,5 0,11 40 EP19 52,08 70875 1,10 21,2 0,5 0,55 50 EP23 52,08 70875 0,46 8,8 0,5 0,23 50 Contro- 52,08 70875 0,77 14,7 1 0,77 100 le paterno EP28
Tabela 33. Mutações pontuais, em relação à sequência de CD39 de tipo selvagem de acordo com a SEQ ID NO: 1.
nº de Posição Posição Posição Posição Se- Ensaio de Muta- de de de de quência Pi: 1 ug/ml ções Mutação 1 Mutação Mutação Mutação encon- de 2 3 4 trada Enzima, 500 uM de ATP, 60 min, 1:10 1 151: V->A 2x 4,309 1 319: I->T 2x 54,866 1 365: F->S única 69,0195 4 292: N->K 365: F->S 424: L->P 463: P->S única 78,81 2 405: K->N 412: Y->F única 89,415 2 424: L->Q 436: H->D única 62,912 263: W- 88,282 4 254: L->M >R 439: F->S 469: S->R única
12. Exemplo 11: Atividade in vivo, pK (a) Materiais e métodos
[0230] Para PK in vivo, 10 mg/kg de composto, em uma concentração final de 10 mg/ml em tampão de PBS, foram administrados por via intravenosa (1 ml/kg) por meio da veia caudal em 4 camundongos C57BL/6 fêmeas conscientes. Camundongos foram obtidos a partir de WIGA e tiveram um peso corporal de cerca de 22 g. Todo o trabalho em vida foi conduzido sob a lei suíça de bem-estar dos animais.
[0231] Sangue total foi coletado (50 µl por ponto no tempo) 0,25, 3, 8, 24 e 48 h após dose em tubos de soro de pequeno volume com o uso de Minivettes POCT. Soro foi separado e usado para determinação de concentração.
[0232] A tecnologia Gyrolab é um imunoensaio automático em escala de nanolitro que usa um formato de passagem de fluxo de afinidade que funciona através de forças centrífugas e detecção de fluorescência induzida a laser. Microesferas revestidas por estreptavidina são pré-embaladas em colunas de afinidade em um CD da Gyrolab Bioaffy. Cada CD contém 112 colunas. As colunas de captura por afinidade por microestrutura compreendem 15 nl. As amostras injetadas entram por ação capilar. O reagente de capture biotinilado se liga às microesferas revestidas por estreptavidina. Depois disso, a solução de analito é injetada, que se liga às moléculas capturadas. Finalmente, o reagente de detecção identificado por fluoróforo é aplicado. No caso de CD39, duas diferentes leituras de ensaio foram usadas dependendo da disponibilidade de uma etiqueta de APP.
[0233] 1) anti-CD39 (40035) e anti-APP (27431) são vistos na Figura 10A.
[0234] 2) pré-mistura de 1:1 de Fab (40035) e anti-Fc/anti-CD39 (40044) (todos os construtos EP28aa1-16) é vista na Figura 10B. Anticorpo 40044 perde atividade quando biotinilado por acoplamento de amina, portanto, apenas anticorpo 40035 foi biotinilado.
[0235] Todas as curvas padrão para os construtos de CD39 foram diluídas em Rexxip A que contém 5% (em v/v) de soro de camundongo em uma série de diluição de 1:2. A faixa de concentração aplicada para os construtos de APP alvejado foi de 5.000 ng/ml a 9,77 ng/ml e para EP28aa1-16 foi de 10.000 ng/ml a 9,77 ng/ml. Todas as amostras séricas de camundongo foram diluídas 1:100 em Rexxip A que contém 5% (em v/v) de soro de camundongo. As amostras de QC dos construtos de CD39 foram diluídas em Rexxip A que contém 5% (em v/v) de soro de camundongo (50 e 500 ng/ml para construtos com etiqueta de APP, e 500 e 1.000 ng/ml para EP28aa1-16). A concentração final para todos os reagentes de captura biotinilados foi de 0,1 mg/ml e o anticorpo de detecção identificado com fluorescência foi diluído em 10 nM em Rexxip F. (b) Resultado e interpretação
[0236] Os resultados são resumidos na Tabela 33. Como pode ser visto, todos os candidatos mostram a mesma PK. Portanto, a seleção do candidato não foi com base nas propriedades de PK. Tabela 34. Valores de pK Construto SEQ ID Animal Animal 2 Animal 3 Animal 4 Média 1 t/2 (d) EP28aa1-16 SEQ ID NO: 1,1 1,3 1,0 1,1 1,1 72 EP1xEP14aa SEQ ID NO: 0,9 0,7 0,7 0,3 0,7 1-6 223 EP28aa1-3 SEQ ID NO: 0,6 0,7 0,9 0,8 0,8 58 EP14aa1-3 SEQ ID NO: 0,7 1,0 0,6 1,1 0,9 229 EP14aa1-6 SEQ ID NO: 0,7 0,7 0,7 0,8 0,7 231 EP17aa1-3 SEQ ID NO: 0,9 0,8 0,9 0,8 0,9 237 EP17aa1-15 SEQ ID NO: 0,8 0,9 0,9 0,6 0,8 241
13. Exemplo 12: Atividade in vivo, modelo AKI (a) Materiais e métodos
[0237] Uma nefrectomia do rim direito é realizada antes do início da definição de I/R. O segundo rim é removido para evitar mecanismos compensatórios que alteram a dinâmica inteira da biologia. Animais anestesiados que respiram espontaneamente são colocados no cobertor homeotérmico de um sistema de monitoramento homeotérmico e coberto por gaze esterilizada. A temperatura corporal é gravada através de uma sonda retal e controlada na faixa de 36,5 a 37,5°C para evitar hipotermia. Animais são anestesiados, raspados e desinfectados (Betaseptic). Depois da incisão de linha média/laparotomia o conteúdo abdominal é retraído para a esquerda e o rim direito é removido. O ureter e vasos sanguíneos são desconectados e ligados (9-0 Ethicon), o rim é, então, removido.
[0238] Indução de lesão de I/R: Imediatamente após a nefrectomia do rim direito, o conteúdo abdominal é retraído para a direita e a artéria renal esquerda é dissecada livre para indução de isquemia renal.
[0239] Clipes de microaneurisma são usados para prender o pedículo para bloquear o fluxo sanguíneo para o rim e induzir isquemia renal. A duração da isquemia renal começa a partir do momento de prisão. Isquemia bem-sucedida é confirmada através da alteração de cor do rim de vermelho para roxo escuro em alguns segundos. Após a isquemia, os clipes de microaneurisma são removidos e a reperfusão é indicada por uma alteração de cor do rim para vermelho. (b) Resultado e interpretação
[0240] O resultado é visto na Figura 12. Os candidatos mostram uma resposta de dose in vivo que se correlaciona com sua atividade in vitro específica. A Figura 12A mostra resultados para a EP28 paterna, a Figura 12B mostra resultados para EP1xEP17 e a Figura 12C mostra resultados para EP14. Como pode ser visto, EP28 e EP1xEP17 mostram respostas de dose similar, enquanto EP14 com maior atividade in vitro mostra eficácia completa com uma dose inferior.
14. Exemplo 13: Título, rendimento e capacidade de desenvolvimento
[0241] De modo a fabricar candidatos selecionados em uma escala comercial, é importante ter capacidade para expressar os mesmos com rendimento relativamente alto. Para proteínas terapêuticas, isso pode ser menos direto em comparação com anticorpos terapêuticos, devido à complexidade de formato além da falta de tecnologia de enriquecimento que permite seleção de clones de alta produção.
[0242] Ambos candidatos, EP14aa1-3 e EP28aa1-3, tiveram características técnicas comparáveis, que foram desafiadoras. Particularmente, títulos de baixa expressão de lotes de expressão iniciais (dados não mostrados) impactam nos custos de produção ou até podem ser ainda menores após aumento devido ao controle de proteínas de célula hospedeira não ser robusto.
[0243] De modo a tentar melhorar a expressão de proteína através da seleção de clone inicial para ambos candidatos, um processo de purificação adequado necessário foi exigido. Com essa finalidade, grupos de células que expressam os candidatos EP28aa1-3 e EP14aa1- 3 foram gerados.
[0244] Uma linhagem de células CHO paterna foi usada como linhagem de células hospedeiras para a produção da linhagem de células que expressam EP28aa1-16/EP14aa1-3. A linhagem de células hospedeiras foi derivada da linhagem de células CHO-K1, bem conhecida por uma pessoa versada na técnica, de um modo descrito, por exemplo, nos pedidos de patentes nº WO2015092737 e WO2015092735, ambos incorporados a título de referência na sua totalidade. Um único frasco da linhagem CHO foi usado para preparar a linhagem de células recombinantes para EP28aa1-16/EP14aa1-3.
[0245] As células cresceram em meio de cultura quimicamente definido. Um µg de DNA plasmídico linearizado com SwaI, vetor de expressão que codifica EP28aa1-16/EP14aa1-3, foi adicionado por transfecção. A reação de transfecção foi realizada em meio de cultivo quimicamente definido.
[0246] As transfecções foram realizadas por eletroporação com o uso de um AMAXA Gene Pulser, de acordo com as instruções do fabricante. As células CHO paternas usadas para a transfecção estavam na fase de crescimento exponencial com viabilidades celulares maiores do que 95%. No total, três transfecções foram realizadas com 5x106 células por transfecção. Imediatamente após a transfecção, células foram transferidas para Balões Agitadores, contendo meio de cultivo quimicamente definido.
[0247] Grupos de células foram incubados durante 48 horas a
36,5°C e 10% de CO2 antes do início do processo de seleção. Um procedimento de seleção foi realizado com o uso do marcador de seleção codificado no vetor de expressão. 48 horas após a transfecção e crescimento sob condições pobres em folato, foi aplicada pressão seletiva adicional por adição de MTX 10 nM ao meio de cultivo quimicamente definido. 21 dias após o início da seleção com MTX emergiram populações agrupadas que consistem predominantemente em células resistentes ao MTX. Após agrupamento, células de recuperação foram congeladas. Lotes alimentados padrão em meio de cultivo quimicamente definido foram preparados para a determinação da concentração de EP28aa1-16/EP14aa1-3. Uma cromatografia de fase reversa (RPC) foi usada para determinar a concentração de produto. Grupos de célula CHO que produzem EP28aa1-16/EP14aa1-3 foram usados para uma classificação de célula única FACS/procedimento de impressão celular para obter linhas de célula clonal individualizadas.
15. Exemplo 14: Uso terapêutico
[0248] ATP extracelular que ativa P2X7R, foi claramente ligada a diversas doenças, tal como aprimoramento de doença de enxerto contra hospedeiro (Wilhelm et al. Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R. Nature Medicine 16:12, páginas
1.434 a 1.439 (2010).)
[0249] Além disso, ambos estudos in vitro e in vivo indicam que CD39 representa uma apirase importante em saúde cardiovascular regulando-se níveis de ADP. Apirase é conhecida por inibir agregação de plaqueta metabolizando-se ADP extracelular.
[0250] Apirase humana não se liga covalentemente às plaquetas em oposição a outras terapias como clopidogrel (PlavixTM), que se ligam irreversivelmente ao receptor de ADP na plaqueta. Isso permite um desaparecimento mais rápido do bloqueio terapêutico e, portanto, uma abordagem mais segura para pacientes com ativação de plaqueta em excesso. Isso fornece uma abordagem mais segura aos pacientes com ativação de plaqueta em excesso.
[0251] Assim, há uma base clara para uso terapêutico de compostos que reduzem níveis de ATP extracelular, tal como os compostos de acordo com a invenção.
[0252] Exemplos sem limitação específicos de usos terapêuticos dos compostos de acordo com a invenção são em dano ao órgão agudo devido a trauma e/ou hipóxia, tal como síndrome de desconforto respiratório aguda (SDRA), lesão pulmonar, falha renal, lesão renal aguda (AKI), que inclui lesão renal aguda depois de cirurgia de enxerto de revascularização do miocárdio, função retardada do enxerto após transplante (que inclui xenotransplantação) de rim ou outros órgãos sólidos, ou doença vascular, tal como doença vascular oclusiva, transplante e xenotransplantação, tratamento de indivíduos que sofrem de derrame, doença ou lesão da artéria coronária resulta de infarto do miocárdio, aterosclerose, arteriosclerose, embolismo, pré-eclâmpsia, angioplastia, lesão de vaso, transplante, encefalopatia isquêmica hipóxica neonatal, distúrbios isquêmicos associados à plaqueta que incluem isquemia pulmonar, isquemia coronária e isquemia cerebral, distúrbios trombóticos de lesão de isquemia-reperfusão (LIR) que incluem, trombose de artéria coronária, trombose de artéria cerebral, trombose intracardíaca, trombose de artéria periférica e função retardada do enxerto por trombose venosa após transplante (que inclui xenotransplantação) de rim ou outros órgãos sólidos. Outros exemplos sem limitação de usos terapêuticos de compostos de acordo com a invenção são tratamento de queimaduras ou dano de radiação, sepse, melhoramento de cicatrização de ferida, diminuição de hemorragia ou do risco de hemorragia, prevenção de dano ao órgão, doença de enxerto contra hospedeiro ou prevenção de rejeição ao transplante.
[0253] Usos terapêuticos particularmente preferenciais dos compostos de acordo com a invenção são em lesão renal aguda (AKI), tal como lesão renal aguda depois de cirurgia de enxerto de revascularização do miocárdio ou sepse ou rabdomiólise. Essa afecção aumenta a mortalidade de paciente e não há padrão de cuidados (SoC). As causas principais de AKI na unidade de tratamento intensivo são: sepse (47,5%), cirurgia grande (34%), choque cardiogênico (27%), hipovolemia (26%) e compostos nefrotóxicos (19%). Além disso, AKI é um fator de risco forte independente para desenvolver doença renal crônica (CKD). 20 a 30% dos pacientes de cirurgias cardíacas grandes desenvolvem lesão renal aguda. Outra modalidade preferencial se refere ao use de uma apirase isolada, de acordo com a invenção, para o tratamento de lesão renal aguda associada à cirurgia cardíaca.
[0254] Em outra modalidade, a descrição se refere a uma apirase isolada, de acordo com a invenção, para uso no tratamento de função retardada do enxerto (FRE), síndrome de desconforto respiratório aguda (SDRA), infarto agudo do miocárdio (IAM), lesão cerebral traumática (LCT) / acidente vascular cerebral isquêmico agudo (AVCi) ou combinações dos mesmos frequentemente denominadas falências de múltiplos órgãos (FMO).
16. Lesão renal aguda (AKI) é uma complicação comum de sepse. 28% dos pacientes com sepse desenvolvem AKI. Em uma modalidade preferencial adicional, a descrição se refere ao uso de uma apirase isolada, de acordo com a invenção, para o tratamento de lesão renal aguda associada à sepse. Exemplo 15: Composições terapêuticas
[0255] Proteínas terapêuticas são tipicamente formuladas em forma aquosa pronta para administração ou como liofilizado para reconstituição com um diluente adequado antes da administração. Uma proteína pode ser formulada como um liofilizado, ou como uma composição aquosa, por exemplo, em seringas pré-carregadas.
[0256] A formulação adequada pode fornecer uma composição farmacêutica aquosa ou um liofilizado que pode ser reconstituído para gerar uma solução com uma alta concentração do ingrediente ativo de proteína terapêutica e um baixo nível de agregação de proteína para entrega a um paciente. As altas concentrações de proteína são úteis, visto que reduzem a quantidade de material que deve ser entregue a um paciente (a dose). Os volumes de dosagem reduzidos minimizam o tempo tomado para entregar uma dose fixada ao paciente. As composições aquosas da invenção com alta concentração de proteínas são particularmente adequadas para administração subcutânea.
[0257] Desse modo, a invenção fornece uma composição farmacêutica aquosa, adequada para administração em um indivíduo, por exemplo, para administração subcutânea, que compreende uma proteína terapêutica.
[0258] A proteína terapêutica pode ser usada como uma composição farmacêutica quando combinada com um veículo farmaceuticamente aceitável. Uma tal composição pode conter, além de uma proteína terapêutica, veículos, vários diluentes, cargas, sais, tampões, estabilizantes, solubilizantes e outros materiais bem conhecidos na técnica. As características do veículo dependerão da via de administração. As composições farmacêuticas para uso nos métodos divulgados podem também conter agentes terapêuticos adicionais para tratamento do distúrbio alvejado particular.
17. Exemplo 16: Via de administração
[0259] Tipicamente, as proteínas de acordo com a invenção são administradas por injeção, por exemplo, seja por via intravenosa, intraperitoneal ou subcutânea. Os métodos para realizar essa administração são conhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica. Também pode ser possível obter composições que podem ser administradas por via tópica ou oral, ou que podem ter a capacidade para transmissão através de membranas mucosas. Conforme será observado por uma pessoa versada na técnica, quaisquer meios adequados para administração podem ser usados, conforme apropriado para uma via de administração selecionada particular.
[0260] Exemplos de vias de administração possíveis incluem administração parenteral, (por exemplo, intravenosa (I.V. ou IV), intramuscular (IM), intradérmica, subcutânea (S.C. ou SC) ou infusão), oral e pulmonar (por exemplo, inalação), nasal, transdérmica (tópica), transmucosal, intra-arterial, infusão contínua e retal. As soluções ou suspensões usadas para aplicação parenteral, intradérmica ou subcutânea podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril, como água para injeção, solução salina, óleos fixados, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, como álcool benzílico ou metil parabenos; antioxidantes, como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, como ácido etilenodiaminatetra-acético; tampões, como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste de tonicidade, como cloreto de sódio ou dextrose. O pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parenteral pode estar contida em ampolas, seringas descartáveis, ou múltiplos frascos de dose feitos de vidro ou plástico.
[0261] Uma terapia de apirase pode ser iniciada administrando-se uma "dose de carregamento" das proteínas de acordo com a invenção ao indivíduo que necessita de terapia. Por "dose de carregamento" entende-se uma dose inicial das proteínas, de acordo com a invenção, que é administrada ao indivíduo, quando a dose das proteínas, de acordo com a invenção, administrada cai dentro da faixa de dosagem superior. A "dose de carregamento" pode ser administrada como uma administração única, por exemplo, uma única infusão em que as proteínas são administradas IV, ou como múltiplas administrações, por exemplo, múltiplas infusões em que as proteínas são administradas IV, enquanto a "dose de carregamento" completa é administrada dentro de um período de cerca de 24 horas (ou dento do primeiro mês se múltiplas administrações intravenosas forem necessárias, com base na gravidade da doença). Depois da administração da "dose de carregamento", o indivíduo recebe, então, uma ou mais doses terapeuticamente eficazes adicionais das proteínas de acordo com a invenção. As doses terapeuticamente eficazes subsequentes podem ser administradas, por exemplo, de acordo com uma programação de dosagem semanal, ou uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, ou uma vez a cada quatro semanas. Em tais modalidades, as doses terapeuticamente eficazes subsequentes caem, de modo geral, dentro da faixa de dosagem inferior.
[0262] Alternativamente, em algumas modalidades, após a "dose de carregamento", as doses terapeuticamente eficazes das proteínas de acordo com a invenção são administradas de acordo com uma "programação de manutenção", em que a dose terapeuticamente eficaz das proteínas de acordo com a invenção é administrada uma vez por mês, uma vez a cada 6 semanas, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada 10 semanas, uma vez a cada três meses, uma vez a cada 14 semanas, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada 18 semanas, uma vez a cada cinco meses, uma vez a cada 22 semanas, uma vez a cada seis meses, uma vez a cada 7 meses, uma vez a cada 8 meses, uma vez a cada 9 meses, uma vez a cada 10 meses, uma vez a cada 11 meses, ou uma vez a cada 12 meses. Em tais modalidades, as doses terapeuticamente eficazes das proteínas de acordo com a invenção estão na faixa de dosagem inferior, particularmente quando as doses subsequentes são administradas em intervalos mais frequentes, por exemplo, uma vez a cada duas semanas a uma vez a cada mês, ou dentro da faixa de dosagem superior, particularmente quando as doses subsequentes são administradas em intervalos menos frequentes, por exemplo, quando as doses subsequentes são administradas com um mês a 12 meses de intervalo.
[0263] A temporização da dosagem é geralmente medida a partir do dia da primeira dose do composto ativo, que também é conhecido como "base de referência". Entretanto, fornecedores de assistência médica diferentes usam convenções de nomeação diferentes.
[0264] De modo notável, a semana zero pode ser denominada como semana 1 por alguns fornecedores de assistência médica, enquanto o dia zero pode ser denominado como dia um por alguns fornecedores de assistência médica. Desse modo, é possível que médicos diferentes designem, por exemplo, uma dose como sendo dada durante a semana 3/no dia 21, durante a semana 3/no dia 22, durante a semana 4/no dia 21, durante a semana 4/no dia 22, enquanto se refere à mesma programação de dosagem. Para consistência, a primeira semana de dosagem será denominada no presente documento como semana 0, enquanto o primeiro dia de dosagem será denominado como dia 1. No entanto, será entendido por um versado na técnica que essa convenção de nomenclatura é usada simplesmente para consistência e não deve ser interpretada como limitante, ou seja, a dosagem semanal é o fornecimento de uma dose semanal da proteína, independentemente de o médico se referir a uma semana particular como "semana 1" ou "semana 2". Os exemplos de regimes de dosagem, conforme observado no presente documento, são encontrados nas Figuras 1 e 2. Será entendido que uma dose não precisa ser fornecida em um ponto no tempo exato, por exemplo, uma dose aproximadamente no dia 29 pode ser fornecida, por exemplo, no dia 24 ao dia 34, por exemplo, dia 30, enquanto for fornecida na semana apropriada.
[0265] Conforme usado no presente documento, a expressão
"recipiente que tem uma quantidade suficiente da proteína para permitir a entrega de [uma dose designada]" é usada para significar que um dado recipiente (por exemplo, frasco, caneta, seringa) tem disposto no mesmo um volume de uma proteína (por exemplo, como parte de uma composição farmacêutica) que pode ser usado para fornecer uma dose desejável. Como exemplo, se uma dose desejável é 500 mg, então, um clínico pode usar 2 ml de um recipiente que contém uma formulação de proteína com uma concentração de 250 mg/ml, 1 ml de um recipiente que contém uma formulação de proteína com uma concentração de 500 mg/ml, 0,5 ml de um recipiente que contém uma formulação de proteína com uma concentração de 1.000 mg/ml, etc. Em cada um desses casos, esses recipientes têm uma quantidade suficiente da proteína para permitir a entrega da dose de 500 mg desejada.
[0266] Conforme usada no presente documento, a expressão "formulada em uma dosagem para permitir a entrega [via de administração] de [uma dose designada]" é usada para se entender que uma dada composição farmacêutica pode ser usada para fornecer uma dose desejável de uma proteína por meio de uma via designada de administração (por exemplo, s.c. ou i.v.). Como um exemplo, se uma dose subcutânea desejável é 500 mg, então, um clínico pode usar 2 ml de uma formulação de proteína que tem uma concentração de 250 mg/ml, 1 ml de uma formulação de proteína que tem uma concentração de 500 mg/ml, 0,5 ml de uma formulação de proteína que tem uma concentração de 1.000 mg/ml, etc. Em cada um desses casos, essas formulações de proteína estão em uma concentração alta o suficiente para permitir a entrega subcutânea da proteína. A entrega subcutânea necessita tipicamente da entrega de volumes menores do que cerca de 2 ml, preferencialmente um volume de cerca de 1 ml ou menos. Entretanto, volumes superiores podem ser entregues ao longo do tempo com o uso de, por exemplo, um mecanismo de emplastro/bomba.
[0267] É revelado no presente documento o uso de uma proteína para a fabricação de um medicamento para o tratamento de dano tecidual em um paciente, em que o medicamento é formulado para compreender recipientes, em que cada recipiente tem uma quantidade suficiente da proteína para permitir a entrega de pelo menos cerca de 75 mg, 150 mg, 300 mg ou 600 mg de proteína por dose unitária.
[0268] É revelado no presente documento o uso de uma proteína para a fabricação de um medicamento para o tratamento de dano tecidual em um paciente, em que o medicamento é formulado em uma dosagem para permitir entrega sistêmica (por exemplo, entrega i.v. ou s.c.) de 75 mg, 150 mg, 300 mg ou 600 mg de proteína por dose unitária.
18. Exemplo 17: Kits
[0269] A descrição também engloba kits para tratamento de um paciente com dano tecidual (como pode ser o caso) com uma proteína. Tais kits compreendem uma proteína (por exemplo, em forma líquida ou liofilizada) ou uma composição farmacêutica que compreende a proteína (descrita supra). Adicionalmente, tais kits podem compreender meios para administrar a proteína (por exemplo, uma seringa e frasco, uma seringa pré-carregada, uma caneta pré-carregada, um emplastro/bomba) e instruções para uso. As instruções podem revelar o fornecimento da proteína ao paciente como parte de um regime de dosagem específico. Esses kits também podem conter agentes terapêuticos adicionais (descritos acima) para tratar psoríase, por exemplo, para entrega em combinação com a proteína envolvida.
[0270] A expressão "meios para administrar" é usada para indicar qualquer implantação disponível para administrar sistemicamente um fármaco a um paciente, incluindo, mas sem limitação, uma seringa pré- carregada, um frasco e seringa, uma caneta de injeção, um autoinjetor, uma bolsa de gotejamento i.v., uma bomba, uma bomba de emplastro, etc. Com tais itens, um paciente pode se autoadministrar o fármaco (isto é, administrar o fármaco por si próprio) ou um auxiliar de enfermagem ou um médico pode administrar o fármaco.
[0271] São revelados no presente documento kits para o tratamento de um paciente que tem dano tecidual, que compreendem: a) uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína; b) meios para administrar a proteína ao paciente; e c) instruções que fornecem administração por via subcutânea de uma proteína a um paciente que necessita da mesma.
[0272] Sequências de aminoácidos e nucleotídeos úteis para praticar a invenção são reveladas na Tabela 34. Tabela 35. Sequências úteis para praticar a invenção. SEQ ID NO Recurso Sequência CD39 humana de tipo selvagem SEQ ID NO: 1 Aminoácido MEDTKESNVKTFCSKNILAILGFSSIIAVIALLAVGL
FLMVLFSLVLFTVAIIGLLIFHKPSYFWKDMV CD39 de rato de tipo selvagem SEQ ID NO: 2 Aminoácido MEDIKDSKVKRFCSKNILIILGFSSVLAVIALIAVGL
STYISLMVLFSLVLVAMVITGLFIFSKPSYFWKEAV CD39L3 SEQ ID NO: 3 Aminoácido QIHKQEVLPPGLKYGIVLDAGSSRTTVYVYQWPA
EKEVGNSSIAWSLGYMLSLTNQIPAESPLIRLPIEP EP28 SEQ ID NO: 4 Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: 5 DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA
GCACC EP1 SEQ ID NO: 6 Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: 7 DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA
GCACC EP2 SEQ ID NO: 8 Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: 9 DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA
GCACC EP3 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 10 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLRTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 11 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP4 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 12 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFAQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLRTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 13 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP5 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 14 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 15 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP6 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 16 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGISL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 17 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP7 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEE 18 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 19 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP8 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 20 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 21 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP9 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 22 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 23 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP10 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 24 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 25 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP11 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 26 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 27 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP12 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 28 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 29 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP13
SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 30 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 31 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP14 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 32 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 33 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP15 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 34 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMISAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 35 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP17 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 36 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 37 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP17.1 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 38 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 39 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP18 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 40 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIDIYLT
TNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 41 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP19 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 42 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 43 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP20 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 44 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 45 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
CAGCACC EP21 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 46 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLRTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 47 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP22 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 48 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLGTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 49 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
CAGCACC EP23 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 50 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLRTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 51 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP24 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 52 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
LNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 53 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP1xEP17_K 405N SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 54 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 55 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP1xEP17 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 56 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 57 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP28aa1-3 SEQ ID NO: Aminoácido APTTQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWP 58 AEKENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIG
LNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGA 59 GAACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGACGCCG
CTGTCTCACTCCACC EP14xEP17 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 60 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 61 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP10xEP19_ H436D SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 62 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 63 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP14xEP19 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 64 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 65 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP28aa1-15 SEQ ID NO: Aminoácido APTSSSTKKTQLTSSTQNKALPENVKYGIVLDAG 66 SSHTSLYIYKWPAEKENDTGVVHQVEECRVKGP
SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCAGCAGCAGCACCAAGAAAACCCA 67 GCTGACCAGCAGCACCCAGAACAAGGCCCTGC
CTCTGAGCCACAGCACC EP17xEP19_ H436D SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 68 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 69 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP17xEP19 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 70 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 71 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP28aa1-16 SEQ ID NO: Aminoácido APTSSSTKKTQLTSSGTQNKALPENVKYGIVLDA 72 GSSHTSLYIYKWPAEKENDTGVVHQVEECRVKG
T SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCTCCTCCAGCACCAAGAAAACCCA 73 GCTGACCTCCAGCGGCACCCAGAACAAGGCC
CCCTCTGTCTCACTCCACC EP1xEP14xE P19
SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 74 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 75 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP1xEP17xE P19 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 76 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 77 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP1xEP14 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 78 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 79 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP28aa1-6 SEQ ID NO: Aminoácido APTSSSTQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYK 80 WPAEKENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVN
LGYMLNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCAGCAGCAGCACCCAGAACAAGGC 81 CCTGCCCGAGAACGTGAAGTACGGCATCGTGC
ACACCTCTGAGCCACAGCACC EP28_E174A SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 82 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 83 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP28_E174A _S218A SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 84 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 85 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
CAGCACC EP14_N73Q SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 86 EQDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 87 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP14_T229A SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 88 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 89 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP14_N292Q SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 90 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 91 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP14_N327Q SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 92 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 93 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP14_N371Q SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 94 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 95 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCACC EP14_N457Q SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 96 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
QLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 97 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
AGCACC SEQ ID NO: iniciador TGCCCTACGAGACAAACAATCAGGAAACCTTC 98 plusMILrev GGCGCCCTGGACCTGGGCGGAGCTTCTACCC sense AAGTGA CD39(aa39- 469) SEQ ID NO: Aminoácido QNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEKE 99 NDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYLT
GSDAGWTLGYMLNLTNMIPAEQPLS SEQ ID NO: DNA CAGAACAAAGCCCTGCCCGAGAACGTGAAGTA 100 CGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGCCAC
GCCGAGCAGCCCCTGAGC CD39(aa46- 476) SEQ ID NO: Aminoácido NVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEKENDTGVVH 101 QVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYLTDCMERAR
LNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA AACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCGG 102 CAGCAGCCACACCAGCCTGTACATCTACAAGT
CTCTGTCTCACAGCACC CD39(aa46- 461) SEQ ID NO: Aminoácido NVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEKENDTGVVH 103 QVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYLTDCMERAR
LNLTNM SEQ ID NO: DNA AACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCGG 104 CAGCAGCCACACCAGCCTGTACATCTACAAGT
CATG CD39(aa46- 461)_dMIL(1 93-204) SEQ ID NO: Aminoácido NVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEKENDTGVVH 105 QVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYLTDCMERAR
SEQ ID NO: DNA AACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCGG 106 CAGCAGCCACACCAGCCTGTACATCTACAAGT
ATG CD39(aa46- 461)_delta cys1 SEQ ID NO: Aminoácido NVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEKENDTGVVH 107 QVEEARVKGPGISKFVQKVNEIGIYLTDAMERAR
LNLTNM SEQ ID NO: DNA AACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCGG 108 CAGCAGCCACACCAGCCTGTACATCTACAAGT
CATG CD39(aa46- 461) _delta cys2 SEQ ID NO: Aminoácido NVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEKENDTGVVH 109 QVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYLTDCMERAR
LNLTNM SEQ ID NO: DNA AACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCGG 110 CAGCAGCCACACCAGCCTGTACATCTACAAGT
CATG CD39(aa46- 461) _delta cys3 SEQ ID NO: Aminoácido NVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEKENDTGVVH 111 QVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYLTDCMERAR
LNLTNM SEQ ID NO: DNA AACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCGG 112 CAGCAGCCACACCAGCCTGTACATCTACAAGT
ACATG CD39(aa46- 461) _delta cys4 SEQ ID NO: Aminoácido NVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEKENDTGVVH
113 EVIPRSQHQETPVYLGATAGMRLLRMESEELADR
LNLTNM SEQ ID NO: DNA AACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCGG 114 CAGCAGCCACACCAGCCTGTACATCTACAAGT
CD39(aa46- 461) _delta cys5 SEQ ID NO: Aminoácido NVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEKENDTGVVH 115 QVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYLTDCMERAR
LNLTNM SEQ ID NO: DNA AACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCGG 116 CAGCAGCCACACCAGCCTGTACATCTACAAGT
CATG CD39(aa46- 461) _dMIL(193- 204)_delta cys1 SEQ ID NO: Aminoácido NVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEKENDTGVVH 117 QVEEARVKGPGISKFVQKVNEIGIYLTDAMERAR
SWEHIHFIGKIQGSDAGWTLGYMLNLTNM SEQ ID NO: DNA AACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCGG 118 CAGCAGCCACACCAGCCTGTACATCTACAAGT
ATG CD39(aa46- 461) _dMIL(193- 204)_delta cys2 SEQ ID NO: Aminoácido NVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEKENDTGVVH 119 QVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYLTDCMERAR
SWEHIHFIGKIQGSDAGWTLGYMLNLTNM SEQ ID NO: DNA AACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCGG 120 CAGCAGCCACACCAGCCTGTACATCTACAAGT
ATG CD39(aa46- 461) _dMIL(193- 204)_delta cys3 SEQ ID NO: Aminoácido NVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEKENDTGVVH 121 QVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYLTDCMERAR
SWEHIHFIGKIQGSDAGWTLGYMLNLTNM SEQ ID NO: DNA AACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCGG 122 CAGCAGCCACACCAGCCTGTACATCTACAAGT
ATG CD39(aa46- 461) _dMIL(193- 204)_delta cys4 SEQ ID NO: Aminoácido NVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEKENDTGVVH 123 QVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYLTDCMERAR
SWEHIHFIGKIQGSDAGWTLGYMLNLTNM SEQ ID NO: DNA AACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCGG 124 CAGCAGCCACACCAGCCTGTACATCTACAAGT
ATG CD39(aa46- 461) _dMIL(193- 204)_delta cys5 SEQ ID NO: Aminoácido NVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEKENDTGVVH 125 QVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYLTDCMERAR
WEHIHFIGKIQGSDAGWTLGYMLNLTNM SEQ ID NO: DNA AACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCGG 126 CAGCAGCCACACCAGCCTGTACATCTACAAGT
CATG CD39(aa38- 476)_delta33 7-344 SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 127 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
GYMLNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACACAGAACAAAGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 128 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
CCTCTGTCTCACAGCACC CD39(aa38- 476)_C338A_ C343A SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 129 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
SDAGWTLGYMLNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACACAGAACAAAGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 130 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
CTCACAGCACC Etiqueta de expressão aa1-16 SEQ ID NO: Aminoácido APTSSSTKKTQLTSSG 131 SEQ ID NO: DNA GCCCCCACCAGCAGCAGCACCAAGAAGACCCA 132 GCTGACCAGCAGCGGC Etiqueta de expressão aa1-15 SEQ ID NO: Aminoácido APTSSSTKKTQLTSS 133 SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCAGCAGCAGCACCAAGAAAACCCA 134 GCTGACCAGCAGC Etiqueta de expressão aa1-6 SEQ ID NO: Aminoácido APTSSS 135
SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCAGCAGCAGC 136 Etiqueta de expressão aa1-3 SEQ ID NO: Aminoácido APT 137 SEQ ID NO: DNA GCCCCTACC 138 Etiqueta de expressão aa1-9 SEQ ID NO: Aminoácido APTSSSTKK 139 SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCAGCAGCAGCACCAAGAAA 140 Etiqueta de expressão aa1-12 SEQ ID NO: Aminoácido APTSSSTKKTQL 141 SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCAGCAGCAGCACCAAGAAAACCCA 142 GCTG Etiqueta de expressão aa4-12 SEQ ID NO: Aminoácido SSSTKKTQL 143 SEQ ID NO: DNA AGCAGCAGCACCAAGAAAACCCAGCTG 144 EP28_8M SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 145 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
NLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 146 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
ACC CD39(aa38- 476) _dMIL(193- 204)_CKAPP
A SEQ ID NO: Aminoácido TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE 147 AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS
AGWTLGYMLNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCC 148 CCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACC
CACCTCTGAGCCACAGCACC CD39(aa38- 476) _dMIL(193- 204)_UBI SEQ ID NO: Aminoácido MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGI 149 PPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVL
DAGWTLGYMLNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ATGCAAATCTTCGTGAAGACCCTGACTGGTAAG 150 ACCATCACCCTCGAGGTGGAGCCCAGTGACAC
CACCTCTGAGCCACAGCACC CD39(aa38- Domínio de 476) HSA I-G4S- _dMIL(193- CD39-dMIL 204)_HSAI SEQ ID NO: Aminoácido DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQS 151 PFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHT
PLSHST SEQ ID NO: DNA GACGCCCACAAGAGCGAGGTGGCCCACCGGT 152 TCAAGGACCTGGGCGAGGAAAACTTCAAGGCC
GAGCACACCTCTGAGCCACAGCACC CD39(aa38- 476)
_dMIL(193- 204)_HSAII SEQ ID NO: Aminoácido DEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARL 153 SQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLEC
AEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA GACGAGGGTAAGGCATCATCTGCCAAGCAGAG 154 ATTAAAATGTGCATCTTTGCAAAAATTTGGAGA
CCACAGCACC EP14_plusMI
L SEQ ID NO: Aminoácido TQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWPAEK 155 ENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIGIYL
GSDAGWTLGYMLNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA ACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGAGAACGTGAA 156 GTACGGCATCGTGCTGGATGCCGGCAGCAGC
GCCACAGCACC SEQ ID NO: Iniciador TCGCGATCCTGGAAGGCGTGCACTGCGCCCCT 157 dianteiro ACCAGCAGCAGCACCAAGAAAACCCAGCTGAC
CAGCAGCACCCAGAACAAGGCCCTGC SEQ ID NO: Iniciador TAGAAGGCACAGTCGAGG 158 reverso SEQ ID NO: Iniciador CTGGTCGCGATCCTGGAAGGCGTGCACTGCG 159 dianteiro CCCCTACCAGCAGCAGCACCCAGAACAAGGCC
CTG SEQ ID NO: Iniciador CTGGTCGCGATCCTGGAAGGCGTGCACTGCG 160 dianteiro CCCCTACCAGCAGCAGCACCCAGAACAAGGCC
CTG SEQ ID NO: Iniciador CTGGTCGCGATCCTGGAAGGCGTGCACTGCG 161 dianteiro CCCCTACCACCCAGAACAAGGCCCTG SEQ ID NO: Iniciador CTGGTCGCGATCCTGGAAGGCGTGCACTGCG 162 dianteiro CCCCTACCAGCAGCAGCACCAAGAAAACCCAG
AACAAGGCCCTG SEQ ID NO: Iniciador CTGGTCGCGATCCTGGAAGGCGTGCACTGCG 163 dianteiro CCCCTACCAGCAGCAGCACCAAGAAAACCCAG
CTGACCCAGAACAAGGCCCTG SEQ ID NO: Iniciador CTGGTCGCGATCCTGGAAGGCGTGCACTGCAG
164 dianteiro CAGCAGCACCAAGAAAACCCAGCTGACCCAGA
ACAAGGCCCTG SEQ ID NO: Iniciador CATACGATTTAGGTGA 165 P270 SEQ ID NO: Iniciador TAGAAGGCACAGTCGAGG 166 P271 SEQ ID NO: Etiqueta de MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGI 167 ubiquitina PPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVL
RLRGG SEQ ID NO: Etiqueta de TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPRE 168 CKappa AKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS
RGE SEQ ID NO: Etiqueta de DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQS 169 domínio I PFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHT de HSA LFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNEC
QAADKAACLLPKLDELR SEQ ID NO: Etiqueta de DEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARL 170 domínio II SQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLEC de HSA ADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSH
LEKCCAAADPHECYAKVFDEFKP SEQ ID NO: Iniciador CTGCCGAGAAAGAACAGGACACCGGCGTGG 171 P928 SEQ ID NO: Iniciador CCACGCCGGTGTCCTGTTCTTTCTCGGCAG 172 P929 SEQ ID NO: Iniciador CGTGCCCCAGAATCAGGCCATCGAGAGCC 173 P930 SEQ ID NO: Iniciador GGCTCTCGATGGCCTGATTCTGGGGCACG 174 P931 SEQ ID NO: Iniciador GGCTACAAGAAAGTCGTGCAGGTGTCCGACCT 175 P932 GTACAAGAC SEQ ID NO: Iniciador GTCTTGTACAGGTCGGACACCTGCACGACTTT 176 P933 CTTGTAGCC SEQ ID NO: Iniciador GCATCCTGGAACTGTTCCAGACCAGCTACTGC 177 P934 CCC SEQ ID NO: Iniciador GGGGCAGTAGCTGGTCTGGAACAGTTCCAGGA 178 P935 TGC SEQ ID NO: Iniciador CCGTGATGAAGTTCCTGCAGCTGACCAGCGAG 179 P936 AAG SEQ ID NO: Iniciador CTTCTCGCTGGTCAGCTGCAGGAACTTCATCA 180 P937 CGG SEQ ID NO: Iniciador CACTGGGCTACATGCTGCAGCTGACCAACATG 181 P938 ATCC
SEQ ID NO: Iniciador GGATCATGTTGGTCAGCTGCAGCATGTAGCCC 182 P939 AGTG SEQ ID NO: Iniciador CTACATCCTGAGCCTGCTGCAGCAGGGCTACC 183 P878 ACTTCAC SEQ ID NO: Iniciador GTGAAGTGGTAGCCCTGCTGCAGCAGGCTCAG 184 P879 GATGTAG SEQ ID NO: Iniciador GAGAAGTACCTGAGCGAGTTTTGCTTCAGCGG 185 P880 CACCTACATCC SEQ ID NO: Iniciador GGATGTAGGTGCCGCTGAAGCAAAACTCGCTC 186 P881 AGGTACTTCTC SEQ ID NO: Iniciador GTTCGAGATCCAGGGCACCGGCAATTACCAGC 187 P882 AGTG SEQ ID NO: Iniciador CACTGCTGGTAATTGCCGGTGCCCTGGATCTC 188 P883 GAAC SEQ ID NO: Iniciador CGCCGATAGCTGGGAGCACATCCACTTCATCG 189 P884 GCAAG SEQ ID NO: Iniciador CTTGCCGATGAAGTGGATGTGCTCCCAGCTAT 190 P885 CGGCG SEQ ID NO: R113Mtem GAGATCGGCATCTACCTGACCGACTGCATGGA 191 pl ACGGGCCATGGAAGTGATCCCCAGAAGCCAGC
GCCGGCATGAGACTGCTGAGAATG SEQ ID NO: R113MFW GAGATCGGCATCTACCTGACCGACT 192 SEQ ID NO: R113MRev CATTCTCAGCAGTCTCAT 193 SEQ ID NO: F330Stemp CTTCAGCGCCTTCTACTcCGTGATGAAGTTCCT 194 I GAACCTGACCAGCGAGAAGGTGTCCCAGGAAA
CAGCCCTGGGAGGAAATCAAGAC SEQ ID NO: F330S FW CTTCAGCGCCTTCTACTCC 195 SEQ ID NO: F330S Rev GGTCTTGATTTCCTCCCAG 196 SEQ ID NO: Y377F CTGGGAGGAAATCAAGACCTCCTACGCTGGCG 197 tempI TGAAAGAGAAGTACCTGAGCGAGTtCTGCTTCA
GGCTACCACTTCACCGCCGATA SEQ ID NO: L389C CTGGGAGGAAATCAAGACCTCCTACGCTGGCG 198 tempI TGAAAGAGAAGTACCTGAGCGAGTACTGCTTC AGCGGCACCTACATCCTGAGCCTGCTGCaGCA
GGGCTACCACTTCACCGCCGATA SEQ ID NO: Y377F/L38 CTGGGAGGAAATCAAGACCTCCTACGCTGGCG 199 9Q tempI TGAAAGAGAAGTACCTGAGCGAGTTCTGCTTC AGCGGCACCTACATCCTGAGCCTGCTGCaGCA
GGGCTACCACTTCACCGCCGATA SEQ ID NO: Iniciador CTGGGAGGAAATCAAGACC
200 FW SEQ ID NO: Iniciador TATCGGCGGTGAAGTGGTA 201 Rev SEQ ID NO: Iniciador CTGGGAGGAAATCAAGACCTCCTACGCTGGCG 202 WT TGAAAGAGAAGTACCTGAGCGAGTACTGCTTC
GGGCTACCACTTCACCGCCGATA SEQ ID NO: fwMut174 CACCGGCCAGGAAGCCGGCGCCTACG 203 SEQ ID NO: revMut174 CGTAGGCGCCGGCTTCCTGGCCGGTG 204 SEQ ID NO: fwMut218 GGACCTGGGCGGAGCTGCTACCCAAGTGACCT 205 TC SEQ ID NO: revMut218 GAAGGTCACTTGGGTAGCAGCTCCGCCCAGGT 206 CC SEQ ID NO: plusMILfw CTGGATCACCATCAACTACCTGCTGGGCAAGT 207 TCAGCCAGAAGACCAGATGGTTCAGCATCGTG
CCCTACGAGACAAACA SEQ ID NO: plusMILrev TCACTTGGGTAGAAGCTCCGCCCAGGTCCAGG 208 GCGCCGAAGGTTTCCTGATTGTTTGTCTCGTAG
GGCA EP1aa1-3 SEQ ID NO: Aminoácido APTTQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWP 209 AEKENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIG
LNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGA 210 GAACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCG
TGAGCCACAGCACC EP1xEP17aa 1-3 SEQ ID NO: Aminoácido APTTQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWP 211 AEKENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIG
LNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGA 212 GAACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCG
TGAGCCACAGCACC EP1xEP17aa 1-6 SEQ ID NO: Aminoácido APTSSSTQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYK 213 WPAEKENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVN
LGYMLNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCAGCAGCAGCACCCAGAACAAGGC 214 CCTGCCCGAGAACGTGAAGTACGGCATCGTGC
CACCTCTGAGCCACAGCACC EP1xEP17_K 405Naa1-15 SEQ ID NO: Aminoácido APTSSSTKKTQLTSSTQNKALPENVKYGIVLDAG 215 SSHTSLYIYKWPAEKENDTGVVHQVEECRVKGP
T SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCAGCAGCAGCACCAAGAAAACCCA 216 GCTGACCAGCAGCACCCAGAACAAGGCCCTGC
CTCTGAGCCACAGCACC EP1xEP17xE P19aa1-3 SEQ ID NO: Aminoácido APTTQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWP 217 AEKENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIG
SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGA 218 GAACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCG
TGAGCCACAGCACC EP1xEP17xE P19aa1-6 SEQ ID NO: Aminoácido APTSSSTQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYK 219 WPAEKENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVN
LGYMLNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCAGCAGCAGCACCCAGAACAAGGC 220 CCTGCCCGAGAACGTGAAGTACGGCATCGTGC
CACCTCTGAGCCACAGCACC EP1xEP14aa 1-3 SEQ ID NO: Aminoácido APTTQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWP 221 AEKENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIG
LNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGA 222 GAACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCG
GAGCCACAGCACC EP1xEP14aa 1-6 SEQ ID NO: Aminoácido APTSSSTQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYK 223 WPAEKENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVN
LGYMLNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCAGCAGCAGCACCCAGAACAAGGC 224 CCTGCCCGAGAACGTGAAGTACGGCATCGTGC
CACCTCTGAGCCACAGCACC EP17xEP19a a1-3
SEQ ID NO: Aminoácido APTTQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWP 225 AEKENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIG
LNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGA 226 GAACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCG
TCTGAGCCACAGCACC EP17xEP19a a1-6 SEQ ID NO: Aminoácido APTSSSTQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYK 227 WPAEKENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVN
LGYMLNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCAGCAGCAGCACCCAGAACAAGGC 228 CCTGCCCGAGAACGTGAAGTACGGCATCGTGC
ACACCTCTGAGCCACAGCACC EP14aa1-3 SEQ ID NO: Aminoácido APTTQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWP 229 AEKENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIG
LNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGA 230 GAACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGACGCCG
CTGTCTCACTCCACC EP14aa1-6 SEQ ID NO: Aminoácido APTSSSTQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYK 231 WPAEKENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVN
LGYMLNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCAGCAGCAGCACCCAGAACAAGGC 232 CCTGCCCGAGAACGTGAAGTACGGCATCGTGC
ACACCTCTGAGCCACAGCACC EP1xEP14xE P19aa1-3 SEQ ID NO: Aminoácido APTTQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWP 233 AEKENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIG
LNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGA 234 GAACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCG
TGAGCCACAGCACC EP1xEP14xE P19aa1-6 SEQ ID NO: Aminoácido APTSSSTQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYK 235 WPAEKENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVN
LGYMLNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCAGCAGCAGCACCCAGAACAAGGC 236 CCTGCCCGAGAACGTGAAGTACGGCATCGTGC
CACCTCTGAGCCACAGCACC EP17aa1-3 SEQ ID NO: Aminoácido APTTQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWP 237 AEKENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIG
LNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGA 238 GAACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCG
TCTGAGCCACAGCACC EP17aa1-6 SEQ ID NO: Aminoácido APTSSSTQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYK 239 WPAEKENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVN
LGYMLNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCAGCAGCAGCACCCAGAACAAGGC 240 CCTGCCCGAGAACGTGAAGTACGGCATCGTGC
ACACCTCTGAGCCACAGCACC EP17aa1-15 SEQ ID NO: Aminoácido APTSSSTKKTQLTSSTQNKALPENVKYGIVLDAG 241 SSHTSLYIYKWPAEKENDTGVVHQVEECRVKGP
T SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCAGCAGCAGCACCAAGAAAACCCA 242 GCTGACCAGCAGCACCCAGAACAAGGCCCTGC
CTCTGAGCCACAGCACC EP19aa1-3 SEQ ID NO: Aminoácido APTTQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYKWP 243 AEKENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVNEIG
LNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCACCCAGAACAAGGCCCTGCCCGA 244 GAACGTGAAGTACGGCATCGTGCTGGATGCCG
TCTGAGCCACAGCACC EP19aa1-6 SEQ ID NO: Aminoácido APTSSSTQNKALPENVKYGIVLDAGSSHTSLYIYK 245 WPAEKENDTGVVHQVEECRVKGPGISKFVQKVN
LGYMLNLTNMIPAEQPLSTPLSHST SEQ ID NO: DNA GCCCCTACCAGCAGCAGCACCCAGAACAAGGC 246 CCTGCCCGAGAACGTGAAGTACGGCATCGTGC
ACACCTCTGAGCCACAGCACC SEQ ID NO: Aminoácido EFRHDS 247 SEQ ID NO: DNA GAATTCCGGCACGACAGC 248 SEQ ID NO: Aminoácido HHHHHH 249 SEQ ID NO: DNA CATCATCATCATCATCAC 250
Claims (30)
1. Apirase humana solubilizada, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos duas modificações selecionadas a partir da lista que consiste em: deleção do N-terminal, deleção do C-terminal e modificação central.
2. Apirase humana solubilizada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que apresenta deleção do N- terminal, deleção do C-terminal e modificação central.
3. Apirase humana solubilizada, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que: a) a deleção do N-terminal é entre 30 e 50 aminoácidos de comprimento, b) a deleção do C-terminal é entre 20 e 40 aminoácidos de comprimento, e c) a modificação central compreende uma deleção e/ou uma mutação pontual.
4. Apirase humana solubilizada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a modificação central compreende uma deleção do 10 a 15 aminoácidos consecutivos.
5. Apirase humana solubilizada, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a deleção central é uma deleção dos aminoácidos número 193 a 204 em relação à sequência de CD39 tipo selvagem de acordo com SEQ ID NO: 1.
6. Apirase humana solubilizada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a modificação central compreende uma mutação pontual compreendendo uma, duas, três, quatro ou cinco mutações pontuais em relação à sequência de CD39 tipo selvagem de acordo com SEQ ID NO : 1, selecionado a partir do grupo que consiste em K71E, N73Q, V95A,
G102D, Y104S, T106S, R113M, L149M, V151A, E173D, T229A, L254M, K258R, W263R, E276D, N292Q, R304G, I319T, N292Q, R304G, I3193N327T36N327T, F365N36N36N36N327T, F365N327T, F365N36N36N36N36N327T, N3327T36N36N36N36N3327T, F336N336N3327T, N3327T336N36N36N3327T, N3327T, 36N327T. , N371Q, K405N, Y412F, L424Q, H436D, I437N, F439S, G441D, N457Q, P463S e S469R.
7. Apirase humana solubilizada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 76 e SEQ ID NO: 78.
8. Apirase humana solubilizada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139 e SEQ ID NO: 141.
9. Apirase humana solubilizada, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que compreende ou consisti em uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 58 e SEQ ID NO: 229.
10. Apirase humana solubilizada, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que consiste em uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 72 e SEQ ID NO: 229.
11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma dose terapeuticamente eficaz da apirase, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis.
12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais ingredientes ativos adicionais.
13. Apirase isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que é para uso como medicamento.
14. Apirase isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de danos teciduais.
15. Apirase isolada, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a dano tecidual é uma lesão cerebral aguda (acidente vascular cerebral); falência aguda de múltiplos órgãos; função retardada do enxerto após o transplante de rim ou outros órgãos sólidos; queimar danos; dano por radiação; dano agudo devido a trauma e/ou hipóxia, como síndrome do desconforto respiratório aguda (SDRA) ou lesão pulmonar; lesão renal aguda, como lesão renal aguda secundária a cirurgia torácica (por exemplo, substituição da válvula aórtica, cirurgia de revascularização do miocárdio) ou sepse ou rabdomiólise ou efeitos tóxicos de antibióticos ou outros medicamentos; lesão aguda do miocárdio.
16. Apirase isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de lesão renal aguda associada a cirurgia cardíaca.
17. Apirase isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de função retardada do enxerto (FRE), síndrome do desconforto respiratório aguda (SDRA), infarto agudo do miocárdio (IAM), lesão cerebral traumática (LCT)/acidente vascular cerebral isquêmico agudo (AVCi), lesão de isquemia-reperfusão (LIR), ou combinações dos mesmos, frequentemente referidas como falência de múltiplos órgãos (FMO).
18. Apirase isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de lesão renal aguda associada a sepse.
19. Método para tratamento de danos teciduais em um indivíduo humano, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma dose terapeuticamente eficaz de apirase humana solubilizada ao dito indivíduo.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a apirase humana solubilizada é uma apirase como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
21. Método, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que o dano tecidual é uma lesão cerebral aguda (acidente vascular cerebral); falência aguda de múltiplos órgãos; função retardada do enxerto após o transplante de rim ou outros órgãos sólidos; danos por queimadura; danos por radiação; dano agudo devido a trauma e/ou hipóxia, como síndrome do desconforto respiratório aguda (SDRA) ou lesão pulmonar; lesão renal aguda, como lesão renal aguda secundária a cirurgia torácica (por exemplo, substituição da válvula aórtica, cirurgia de revascularização do miocárdio) ou sepse ou rabdomiólise ou efeitos tóxicos de antibióticos ou outros medicamentos; lesão aguda do miocárdio.
22. Método para tratamento de lesão renal aguda associada à cirurgia cardíaca, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma dose terapeuticamente eficaz de apirase humana solubilizada a um indivíduo em necessidade do mesmo.
23. Método para tratamento da função retardada do enxerto (FRE), síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), infarto agudo do miocárdio (IAM), lesão cerebral traumática (LCT)/acidente vascular cerebral isquêmico agudo (AVCi) lesão de isquemia- reperfusão (LIR) ou combinações dos mesmos frequentemente denominadas como falência de múltiplos órgãos (FMO), caracterizados pelo fato de que compreende a administração de uma dose terapeuticamente eficaz de apirase humana solubilizada a um indivíduo com necessidade de tal tratamento.
24. Método para tratamento de lesão renal aguda associada à sepse, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma dose terapeuticamente eficaz de apirase humana solubilizada a um indivíduo em necessidade do mesmo.
25. Molécula de ácido nucleico isolado, caracterizada pelo fato de que codifica uma apirase, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
26. Vetor de clonagem ou expressão, caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais sequências de ácido nucleico como definidas na reivindicação 25, em que o vetor é adequado para a produção recombinante de apirase isolada, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
27. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais vetores de clonagem ou expressão, como definidos na reivindicação 26.
28. Processo para a produção de uma apirase, como definida em qualuquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar uma célula hospedeira, como definida na reivindicação 27, purificar e recuperar a dita apirase.
29. Uso de uma apirase, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido uso é para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma condição ou doença selecionada dentre dano tecidual, lesão renal aguda associada a cirurgia cardíaca, função de enxerto retardada (FRE), síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), infarto agudo do miocárdio (IAM), lesão cerebral traumática (LCT)/acidente vascular cerebral isquêmico agudo (AVCi), lesão de isquemia- reperfusão (LIR) ou combinações dos mesmos, frequentemente denominadas como falência de múltiplos órgãos (FMO), e lesão renal aguda associada à sepse.
30. Invenção, caracterizada por qualquer uma de suas modalidades ou quaisquer categorias de reivindicações aplicáveis, por exemplo, produto, processo ou uso englobado pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP18184269.1 | 2018-07-18 | ||
EP18184269 | 2018-07-18 | ||
PCT/IB2019/056117 WO2020016804A1 (en) | 2018-07-18 | 2019-07-17 | Solubilized apyrases, methods and use |
Publications (1)
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