JP2021529550A - 可溶化アピラーゼ、方法及び使用 - Google Patents
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Abstract
Description
当業者が本発明を実施し易くするために、この記載全体を通じて次の用語を使用する。
野生型ヒトアピラーゼCD39(hCD39、UniProt P49961又は配列番号1)は、N末端の膜貫通ドメイン(推定aa17〜37)、中央の推定膜相互作用ループ(MIL推定aa193〜204)及びC末端膜貫通ドメイン(推定aa479〜499)により細胞膜において天然に係留される。哺乳動物宿主細胞を用いてCD39の可溶性変異体の発現を可能にするため、膜遊離型又は可溶化型タンパク質を得るためにCD39配列のいくつかのエレメントを修飾した。分泌リーダー及び精製タグ(配列番号133)によって、天然のリーダー配列及びN末端膜貫通領域を置換した。発現、精製及び活性パラメーターを最適化するために、CD39の細胞外ドメインの境界を変動させた(それぞれ配列番号1のアミノ酸番号38〜476、配列番号1のアミノ酸番号39〜469、配列番号1のアミノ酸46〜461及び配列番号1のアミノ酸46〜476)。システインをアラニンにより置換することによって、又はジスルフィド架橋により作られるループを短縮することによって、凝集傾向及び酵素活性に対するシステイン及びジスルフィド架橋の影響を体系的に評価した(配列番号107、109、111、113及び115)。疎水性アミノ酸のストレッチはラットCD39の構造研究に記載され(Zebisch et al,J.Mol.Biol.(2012),415,288−306,野生型ラットCD39,Uniprot P97687、配列番号2で示される)、このループは細胞膜(MIL)と相互作用し得ると考えられる。発明者らは、配列アライメントによりヒトCD39配列に対する知見を置き換えて、ループ欠失(CD39ΔMIL又はEP28、配列番号4で示されるとおり)を有するCD39変異体を作製した。機能的CD39の発現レベル及び熱安定性に対するMILの欠失(又はデルタ/Δ)の影響を評価した。
(a)発現プラスミドの作製
異なるhCD39境界変異体及び膜相互作用ループ(MIL)欠失をコードするDNA配列は、ホモサピエンスに対するコドン最適性を含めGeneArt(Life Technologies Inc.Regensburg,Germany)に注文した。hCD39変異体をコードする配列は、GeneArt由来ベクター又は内部で作製されたその変異体から哺乳動物細胞中での分泌に適切な発現ベクターへと、標準的な分子生物学的技術によりサブクローニングした。修飾されたオリゴヌクレオチドによってシステイン架橋欠失変異体中に存在するシステインからアラニンへの突然変異を標的とし、続くアセンブリーPCR段階後に、作製された断片を前に言及した同じ発現ベクターにサブクローニングした。発現ベクターのエレメントとしては、プロモーター(サイトメガロウイルス(CMV)エンハンサー−プロモーター)、分泌を促進するためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナル及び転写終結因子(ウシ成長ホルモン(BGH)遺伝子)、エピソーム複製及び原核生物における複製を可能にするエレメント(例えばSV40起点及びColE1又は当技術分野で公知の他のもの)及び選択を可能にするためのエレメント(アンピシリン耐性遺伝子及びゼオシンマーカー)が挙げられる。短縮型可溶化ヒトCD39バージョンのリストを表2で例示し、配列番号1を基準にしてアミノ酸修飾を付番した。
血清非存在下でのタンパク質の一過性発現のための好ましい宿主細胞株の1つとしてマイクロスケール実験のために293−6E細胞(参照により本明細書中に組み込まれる国際公開第2006096989A2号パンフレットで開示されるとおり)を選択した。遺伝子移入試薬としてFuGene HD(Roche Applied Science,Cat.No.04709705001)を使用して、遺伝子移入を行った。遺伝子移入及び細胞の増殖のために、V3血清不含培地(Bioconcept,Cat.No.V3−K)を使用した懸濁培養において293−6E細胞を培養した。5%CO2で加湿インキュベーターにおいてオービタル振盪機(100〜120rpm)上、Corning振盪フラスコ(Corning,Tewksbury,MA)中で細胞を増殖させた(シードフラスコ)。シード培養物中の細胞は、指数増殖期で維持し(5x105〜3x106/mLの細胞密度)、遺伝子移入に対する>90%の生存能を示すべきである。細胞密度がこの範囲外であると、希釈後に遅滞期となるか又は遺伝子移入効率が低下するかの何れかが起こる。
組み換えhCD39変異体の発現及び正しい形成を調べるために、マイクロスケール発現上清においてウエスタンブロット分析を行った。E−PAGE(商標)ローディング緩衝液(4x,Invitrogen,#EPBNF−01)中で8μLの上清を希釈し、非還元条件のE−Page48、8%ゲル(Invitrogen,#EP04808)上に載せた。E−baseマザー装置(mother device)(Invitrogen)上で23分間ゲルを泳動し、製造者の説明書に従い、iBlot system(Invitrogen)を使用して、タンパク質をニトロセルロース膜(Invitrogen IB301001)に転写した(7min稼働)。TBS/0.05Tween20(TBST)中で3回洗浄した後、穏やかに撹拌しながら5%ミルク/TBSTとともに膜を1時間温置し、続いて2%ミルク/TBST中で希釈した抗APPマウス抗体の4μg/mL溶液(Novartis内部で、タンパク質タグ付加のために使用したアミロイド前駆体タンパク質(APP)のペプチドストレッチに対して抗体を作製)とともに1時間温置した。さらなる3回の洗浄段階後、2%ミルク/TBST中で希釈した抗マウスIgG−アルカリホスファターゼ(Sigma−Aldrich、A5153−1ML)の1:1000希釈液とともに膜を温置し、TBST中で再び3回洗浄し、続いてTBS中ですすぎ段階を行った。製造者の説明書に従いSIGMAFAST(商標)BCIP(登録商標)/NBT(Sigma−Aldrich,#B5655−25TAB)を使用して1〜5分間シグナルを発色させ、水で膜をすすぐことによってシグナルを停止させた。
マイクロスケール発現上清からのプレート捕捉hCD39変異体に対してPi ColorLock Goldリン酸検出系(Innova Biosciences,cat n.303−0030)を使用して、ATPase、ADPase及びAMPase活性を判定した(固相Axpaseアッセイ)。この方法は、製造者により推奨される溶液に基づくアッセイ(液相Axpaseアッセイ)と比較して感度がより低いことが分かったが、マイクロスケール発現上清中に存在する可能性がある宿主細胞酵素が介在するAxPase活性を低下させるという長所がある。PBS中で希釈した20μLの抗APPマウス抗体10μg/mL溶液抗体(Novartis内部で、タンパク質タグ付加のために使用されるアミロイド前駆体タンパク質(APP)のペプチドストレッチに対して作製された抗体)をmaxisorp 384ウェルクリアプレート(Nunc)の各ウェルに添加し、4℃で一晩温置した。TBSTで3回洗浄した後、穏やかに撹拌しながら室温で100μLの5%ミルク/TBSTを使用してウェルを1時間ブロッキング処理した。さらなる3回の洗浄段階後、2%ミルク/TBST中の20μLの連続希釈マイクロスケール発現上清を3つ組でウェルに添加し、穏やかに撹拌しながら室温で2時間温置した。次に、ウェルを再び、100μLのTBSTで4回及び80μLの50mM Tris−Cl/5mM MgCl2 pH7.5で2回洗浄した。50mM Tris−Cl/5mM MgCl2 pH7.5(ATP:SIGMA A2383、ADP:SIGMA A2754)中で希釈した30μLの80μMアデノシンリン酸溶液をそれぞれ3つ組で添加し、37℃で24時間温置した。製造者の説明書に従い調製した7.5μLのGold試薬混合液を使用して10分間にわたりシグナルを発色させ、3μLの安定化剤を使用して反応を停止させた。TECAN Genios Pro機器を使用して620nmでの吸収を読み取った。
(a)hCD39発現レベルに対する境界、膜相互作用ループ(MIL)欠失及びシステイン架橋欠失の影響
異なるhCD39変異体の発現レベルを評価するために、0.5mLの293−6E細胞において対応する発現プラスミドを2つ組で遺伝子移入し、遺伝子移入の3日後に回収した上清においてウエスタンブロット(抗APP検出Ab)を行った。結果を図2A及び図2Bで例示する。
上記上清試料において固相AxPaseアッセイによってCD39酵素活性を測定した。結果を図3及び図4並びに表3で例示する。
候補の発現特性を向上させるために、様々な発現タグを試験した。
可溶性CD39の特徴を改善し、薬物開発に適切にするために、配列番号4で示される、CD39ΔMIL、EP28においてさらなる修飾を導入した。異なる突然変異及び突然変異した変異体は、表8で見られ、配列番号1で示されるような野生型CD39のアミノ酸位置に従い付番する。
上のEP14変異体に基づき、表9による点突然変異を導入することによってグリコシル化部位の効果を調べ、配列番号1で示されるような野生型CD39のアミノ酸位置に従い付番する。
クローニングのために発現ベクターpRS5a(図5)を使用した。表10で示されるようにプライマーを使用した。
SV40ラージT抗原(HEK293−T)を構成的に発現するヒト胚腎臓細胞、例えばATCC11268
ポリエチレンイミン”MAX”MW40.000(PEI)(Polysciences,Cat.24765)、RTにてH20中で溶解し、NaOHでpH7.05に調整。
M11V3血清不含培地(Bioconcept,CH,Cat:V3−K)
DNA:供給者により推奨されるプロトコールに従い、Qiagen DNA Kit、Midiprep−Kit(No.12943)を用いて調製。
分析的SECの収率及び単量体のピークに関する突然変異体の改善はなかった。配列番号137による発現タグ付きの親タンパク質(EP14)は、分析における最良の収率及び最大単量体のピークをもたらした。最低収率及びまた最低単量体のピークは突然変異体N371Qで得た。
試行し、さらに特性を改善するために、上の実施例3で導入された突然変異のうちいくつかを下の表15に従い組み合わせた。突然変異は、配列番号1で示されるような野生型CD39のアミノ酸位置に従い付番する。
表16によるプライマーを使用した。
5μLの10x反応緩衝液、
1μL ds−DNA−鋳型(保存濃縮液100ng/μL)、
1.5μLプライマー1、
1.5μLプライマー2、
1μL dNTP混合物、
1.5μL QuickSolution試薬、
35.5μL H2O(50μLの最終体積に対する)及び
1μL QuickChange Lightning Enzyme。
Nickel−NTA−Agarose、Qiagen,Cat No./ID:30230、Poly−Prep Chromatography Column,empty,BioRad,No.731−1550,IMAC A緩衝液pH7.4(20mM NaPO4−緩衝液及び50mMイミダゾール含有)。IMAC B緩衝液pH7.4(20mM NaPO4−緩衝液及び300mMイミダゾール含有)。TBS(MilliQ−Waterにより10x濃縮を1x濃縮に希釈)。Ultracel−10メンブレン、10K、UFC801096付きAmicon Ultra−4 Centrifugal Filter Unit。
1.Qiagenの1mL Nickel−NTA−Agarose(=0.5mL CV)でカラムを調製;
2.10CV IMAC Aで平衡化;
3.カラム上での15/45mL SNのローディング(フロースルーを回収);
4.10CV IMAC Aで洗浄(15mL Falconチューブ中で回収);
5.IMAC Bの6.5CV中で溶出;
6.溶出物の濃度の決定;
7.Amicon Ultra−4 Centrifugal Filter Unit 10Kを用いた約400μLへの3.5mL試料の濃縮;
8.TBS添加及び遠心分離5000することによる緩衝液交換。
結果を表18で示す。
マトリプターゼを挿入した場合、産生されなかった/収率が非常に低かった。フューリン部位で約40%収率があった(しかしフューリンプラスミドとの同時遺伝子移入であったので、遺伝子移入に対してDNAの50%のみを同様に使用した)。
aa1−3が含まれる全ての短縮が同等の結果を与え、他と比較してaa1−3のみが僅かにより低くなり得るが、これは、試料から試料への変動であり得る。短縮aa4−12ではタンパク質発現がなくなる。全ての他のEP−変異体のように、IL2−startとhCD39−タンパク質との間にTSSリンカーを含有するEP28の間で差は見られ得なかった。
EP19(L424Q)との組み合わせは、タンパク質発現の顕著な改善につながらなかった。
さらなる試験のために以下の表19で示されるような臨床候補の選択物を発現させた。
0.25μL DMSO、
20ngベクター
1.5μL挿入物(45ng/μL)、
2μL 5xHF緩衝液、
0.1μL Phusion pol、
0.08μL dNTP混合物
10−XμL ddH2O
(1)ヌル突然変異
インビボ実験用に陰性対照タンパク質を作製するために、1/2個の突然変異を親ヒトCD39ΔMILタンパク質(EP28)に挿入した。この突然変異は、このタンパク質の酵素活性を排除するか又は低下させることが文献に記載されている。突然変異位置はE174A及びS218Aである。
5μLの10x反応緩衝液、
1μL ds−DNA−鋳型(保管濃縮液100ng/μL)、
1.5μLプライマー1、
1.5μLプライマー2、
1μL dNTP混合液
1.5μL QuickSolution試薬、
35.5μL H2O(50μLの最終体積に対する)及び
1μL QuickChange Lightning Enzyme。
供給:50mL M11V3、合計100mL。
Nickel−NTA Agarose,Qiagen,Cat No./ID:30230,Poly−Prep Chromatography Column,empty,BioRad,No.731−1550,IMAC A緩衝液pH7.4(20mM NaPO4−緩衝液及び50mMイミダゾール含有)。IMAC B緩衝液pH7.4(20mM NaPO4−緩衝液及び300mMイミダゾール含有)。TBS(MilliQ−Waterで10x濃縮を1x濃縮に希釈)。Ultracel−10メンブレン、10K、UFC801096付きのAmicon Ultra−4 Centrifugal Filter Unit。
1.Qiagenの1mL Nickel−NTA−Agarose(=0.5mL CV)でカラムを調製;
2.10CV IMAC Aで平衡化;
3.カラム上で15/45mL SNをローディング(フロースルーを回収);
4.10CV IMAC Aで洗浄(15mL Falconチューブ中で回収);
5.6.5CVのIMAC B中で溶出;
6.溶出物の濃度の決定;
7.Amicon Ultra−4 Centrifugal Filter Unit 10Kを用いて約400μLまで3.5mL試料を濃縮;
8.TBSの添加及び遠心分離5000により緩衝液交換。
オーバーラップ伸長PCRで膜相互作用ループ(aa193−204)を用いてEP14aa1−3のクローニングを行った。
1.2μL Phusion Hot Start Polymerase、
24μL 5xHF−緩衝液、
0.96μL 100mM dNTP(各dNTP 25mM)、
0.6μL Fwプライマー、
0.6μL Revプライマー、
92.64μL DEPC H2O。
酵素活性アッセイを使用して、前の実施例で作製した候補の特徴を調べた。
(a)材料及び方法
製造者の説明書に従い、標準Pi検出キットから試薬を調製した。
候補に対する比較結果を表26で示す。
(a)材料及び方法
HPLC検証アッセイで候補を試験した。HPLCのために70μLの各試料をガラスバイアルに移した。
500μM 20μL 1mM+20μL H2O
100μM 10μL 1mM+90μL H2O
10μM 10μL 100μM+90μL H2O
1μM 10μL 10μM+90μL H2O
結果は図7、8、9及び11で見ることができ、これらは異なる実施形態による候補に対して、反応速度データ及びモデルフィットを示す。
IL2−リーダーなし及びIL2−startなしで、哺乳動物発現ベクターpRS5a_Leader_APP_His(図5)において、前の実施例に記載のCD39バージョンEP1〜EP24をクローニングした。
7日間にわたるHEK293(PEI−遺伝子移入)におけるEP−Hitsの小スケール発現(20/50mLスケール)を行い、続いてAPP−HPLC上でIPCを行った(上記のとおり)。
TBS、pH7.4中での精製タンパク質の濃縮及び再緩衝;
タンパク質ゲル、分析SECでのタンパク質の分析;
全ての変異体及び3つの対照(親hCD39−dMIL又はEP28、IL2−startあり及びなし、及び8M−バージョン、IL2−startなし)の送達:TBS、pH7.4中の90〜200uLの精製タンパク質。
結果を下の表29でまとめる。
2回目で12個の突然変異体のサブセットを試験したが、IL−2 startにより大きい発現スケールが可能となる。
15アミノ酸長のIL2−start、aa1−15付きの哺乳動物発現ベクターpRS5a_Leader_APP_His(配列番号133)(図5)。7日間にわたるHEK293(PEI−遺伝子移入)におけるEP−Hitsの小規模発現(50/100mLスケール)に続いて、APP−HPLC上でIPCを行った(上記のとおり)。
6CV IMAC B緩衝液(20mM NaPO4−緩衝液、300mMイミダゾール、pH7.4)で溶出
TBS、pH7.4中での精製タンパク質の濃縮及び再緩衝
タンパク質ゲル、分析SECでのタンパク質の分析
全ての変異体及び対照(親hCD39−dMIL又はEP28、IL2−start aa1−15あり(配列番号133))の送達:
TBS、pH7.4中の500μLの精製タンパク質。
結果を下の表30、表31及び表32でまとめる。
(a)材料及び方法
インビボPKの場合、4匹の意識のある雌C57BL/6マウスに対してPBS緩衝液中の10mg/mLの最終濃度の10mg/kg化合物を尾静脈に静脈内投与した(1mL/kg)。マウスはWIGAから入手し、体重は22g前後であった。生存中の実験は全てスイス動物福祉法の下で行った。POCT Minivettesを使用して小体積血清チューブに、投与後0.25、3、8、24及び48時間で全血を回収した(50μL/時間点)。血清を分離し、濃度決定のために使用した。
1)抗CD39(40035)及び抗APP(27431)は図10Aで見られる。
2)Fab(40035)及び抗Fc/抗CD39(40044)1:1プレミックス(全EP28aa1−16コンストラクト)は図10Bで見られる。アミンカップリングによりビオチン化された場合、抗体40044は活性を失い、従って抗体40035のみをビオチン化した。
結果を表34でまとめる。見られ得るように、全ての候補が同じPKを示す。従って候補の選択はPK特性に基づかなかった。
(a)材料及び方法
I/R設定の開始前に右腎臓の腎摘除術を行う。全体的な生体のダイナミクスを変化させる代償機序を避けるために第2の腎臓を摘出した。自発呼吸する麻酔動物を恒温性監視システムの恒温性ブランケット上に置き、滅菌ガーゼで被覆する。低体温を回避するために、直腸プローブを通じて体温を記録し、36.5〜37.5℃の範囲で調節する。動物に麻酔をかけ、剃毛し、消毒する(Betaseptic)。正中線切開/開腹手術後に、腹部の内容物を左に寄せ、右腎臓を摘出する。尿管及び血管を連絡切断し、結紮し(9−0Ethicon)、次いで腎臓を摘出する。
結果は図12で見られる。候補は、それらの特異的なインビトロ活性と相関するインビボでの用量反応を示す。図12Aは親EP28に対する結果を示し、図12BはEP1xEP17に対する結果を示し、図12CはEP14に対する結果を示す。見られ得るように、EP28及びEP1xEP17は同様の用量反応を示し、一方でインビトロ活性がより高いEP14は、より低い用量で十分な効果を示す。
商業的規模で選択候補を製造するために、比較的高収率でそれらを発現可能であることが重要である。治療用タンパク質の場合、これは、高産生クローンの選択を可能にする濃縮技術の欠如に加えて方式が複雑であるために、治療用抗体と比較してあまり容易ではない可能性がある。
P2X7Rを活性化する細胞外ATPは、移植片対宿主疾患を促進するなど、いくつかの疾患と明らかに関連している(Wilhelm et al.Graft−versus−host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R.Nature Medicine 16:12,pages 1434−1439(2010))。
治療用タンパク質は一般的に、即時投与の水性形態で又は投与前の適切な希釈剤での再構成用の凍結乾燥物としての何れかで処方される。タンパク質は、例えばプレフィルドシリンジ中で、凍結乾燥物として、又は水性組成物としての何れかで処方され得る。
一般的には、本発明によるタンパク質は、注射により、例えば静脈内、腹腔内又は皮下の何れかで投与される。この投与を遂行するための方法は当業者にとって公知である。局所若しくは経口投与され得るか又は粘膜を横断して通過可能であり得る組成物を得ることも可能であり得る。当業者により認識されるように、特定の選択された投与経路に適切なように、投与するための何らかの適切な投与のための手段を使用し得る。
本開示は、(場合に応じて)タンパク質で組織損傷がある患者を処置するためのキットも包含する。このようなキットは、タンパク質(例えば液体又は凍結乾燥形態)又はこのタンパク質(上記)を含む医薬組成物を含む。さらに、このようなキットは、本タンパク質を投与するための手段(例えばシリンジ及びバイアル、プレフィルドシリンジ、プレフィルドペン、パッチ/ポンプ)及び使用説明書を含み得る。この説明書は、具体的な投与計画の一部として患者にタンパク質を提供することを開示し得る。これらのキットは、例えば開示されるタンパク質と組み合わせた送達のために、乾癬を処置するためのさらなる治療剤(上記)も含有し得る。
本発明を実施するための有用なアミノ酸及びヌクレオチド配列を表35で開示する。
Claims (28)
- N末端欠失、C末端欠失及び中央部修飾からなるリストから選択される少なくとも2つの修飾を有する可溶化ヒトアピラーゼ。
- N末端欠失、C末端欠失及び中央部修飾を有する、請求項1に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
- a)前記N末端欠失が30〜50アミノ酸長であり、
b)前記C末端欠失が20〜40アミノ酸長であり、
c)前記中央部修飾が欠失及び/又は点突然変異を含む、
請求項1又は2に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。 - 前記中央部修飾が、10〜15個の連続アミノ酸の欠失を含む、請求項1〜3の何れか一項に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
- 中央部の欠失が、配列番号1に記載の野生型CD39配列に対する、アミノ酸番号193〜204の欠失である、請求項4に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
- 前記中央部修飾が、K71E、N73Q、V95A、G102D、Y104S、T106S、R113M、L149M、V151A、E173D、T229A、L254M、K258R、W263R、E276D、N292Q、R304G、I319T、N327Q、A362N、F365S、N371Q、K405N、Y412F、L424Q、H436D、I437N、F439S、G441D、N457Q、P463S及びS469Rからなる群から選択される、配列番号1に記載の野生型CD39配列に対する1、2、3、4又は5個の点突然変異を含む点突然変異を含む、請求項1〜5の何れか一項に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
- 配列番号4、配列番号6、配列番号32、配列番号54、配列番号56、配列番号70、配列番号76及び配列番号78からなる群から選択される配列を含む、請求項1〜6の何れか一項に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
- 配列番号131、配列番号133、配列番号135、配列番号137、配列番号139及び配列番号141からなる群から選択される配列を含む、請求項1〜7の何れか一項に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
- 配列番号213、配列番号227、配列番号219、配列番号225、配列番号217、配列番号209、配列番号221、配列番号72、配列番号215、配列番号223、配列番号211、配列番号58及び配列番号229からなる群から選択される配列を含むか又はそれらからなる、請求項8に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
- 配列番号58、配列番号72及び配列番号229からなる群から選択される配列からなる、請求項9に記載の可溶化ヒトアピラーゼ。
- 請求項1〜10の何れか一項に記載のアピラーゼの治療的有効用量と、1つ以上の薬学的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物。
- 1つ以上のさらなる有効成分をさらに含む、請求項11に記載の医薬組成物。
- 薬剤としての使用のための請求項1〜10の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
- 組織損傷の処置における使用のための請求項1〜10の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
- 前記組織損傷が、急性脳傷害(卒中発作);急性多臓器不全;腎臓又は他の固形臓器の移植後の臓器移植後臓器機能障害;火傷による損傷;放射線による損傷;外傷及び/又は急性呼吸窮迫症候群(ARDS)又は肺傷害などの低酸素による急性損傷;急性腎臓傷害、例えば胸部手術(例えば大動脈弁置換術、冠動脈バイパス術)又は敗血症又は横紋筋融解症又は抗生物質若しくは他の薬品の毒性効果に対する二次的な急性腎臓傷害など;急性心筋傷害である、請求項14に記載の使用のための単離アピラーゼ。
- 心臓手術に伴う急性腎臓傷害の処置での使用のための請求項1〜10の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
- 臓器移植後臓器機能障害(DGF)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、急性心筋梗塞(AMI)、外傷性脳傷害(TBI)/急性虚血性発作(AIS)、虚血再灌流傷害(IRI)又は多臓器不全(MOF)と呼ばれることが多いそれらの組み合わせの処置における使用のための、請求項1〜10の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
- 敗血症に付随する急性腎臓傷害の処置での使用のための、請求項1〜10の何れか一項に記載の単離アピラーゼ。
- 対象に対して可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、ヒト対象において組織損傷を処置する方法。
- 前記可溶化ヒトアピラーゼが請求項1〜10の何れか一項に記載のアピラーゼである、請求項19に記載の方法。
- 前記組織損傷が、急性脳傷害(卒中発作);急性多臓器不全;腎臓又は他の固形臓器移植後の臓器移植後臓器機能障害;火傷による損傷;放射線による損傷;外傷及び/又は急性呼吸窮迫症候群(ARDS)又は肺傷害などの低酸素による急性損傷;急性腎臓傷害、例えば胸部手術(例えば大動脈弁置換術、冠動脈バイパス術)又は敗血症又は横紋筋融解症又は抗生物質若しくは他の薬品の毒性効果に対する二次的な急性腎臓傷害など;急性心筋傷害である、請求項19又は20に記載の方法。
- 心臓手術に付随する急性腎臓傷害を処置する方法であって、このような処置を必要とする対象に可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、方法。
- 臓器移植後臓器機能障害(DGF)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、急性心筋梗塞(AMI)、外傷性脳傷害(TBI)/急性虚血性発作(AIS)虚血再灌流傷害(IRI)又は多臓器不全(MOF)と呼ばれることが多いそれらの組み合わせを処置する方法であって、このような処置を必要とする対象に可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、方法。
- 敗血症に付随する急性腎臓傷害を処置する方法であって、このような処置を必要とする対象に可溶化ヒトアピラーゼの治療的有効用量を投与することを含む、方法。
- 請求項1〜10の何れか一項に記載の何れかのアピラーゼをコードする単離核酸分子。
- 請求項1〜10の何れか一項に記載の単離アピラーゼの組み換え産生に適切である、請求項25に記載の1つ以上の核酸配列を含むクローニング又は発現ベクター。
- 請求項26に記載の1つ以上のクローニング又は発現ベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項27に記載の宿主細胞を培養し、アピラーゼを精製して回収することを含む、請求項1〜10の何れか一項に記載のアピラーゼの産生のための工程。
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