CN101671389A - 无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素及其用途 - Google Patents

无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN101671389A
CN101671389A CN200810222103A CN200810222103A CN101671389A CN 101671389 A CN101671389 A CN 101671389A CN 200810222103 A CN200810222103 A CN 200810222103A CN 200810222103 A CN200810222103 A CN 200810222103A CN 101671389 A CN101671389 A CN 101671389A
Authority
CN
China
Prior art keywords
leu
ala
arg
glu
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN200810222103A
Other languages
English (en)
Inventor
曹国栋
陈俊
罗玉敏
吉训明
邢娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN200810222103A priority Critical patent/CN101671389A/zh
Publication of CN101671389A publication Critical patent/CN101671389A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素及其用途。本发明为在野生型人促红细胞生成素的下述三个区域中的至少一个区域及其它28个散在位点发生突变产生的变构体：(1)VLQRY：人促红细胞生成素的第11－15号氨基酸；(2)TKVNFYAW：人促红细胞生成素的第44－51号氨基酸；(3)SGLRSLTTL：人促红细胞生成素的第100－108号氨基酸。本发明具有神经保护作用，但无促红细胞生成作用，避免了常规促红细胞生成素导致继发性血栓形成，增加临床应用安全性；扩大了治疗群体，使血液粘稠度较高而不能用常规促红细胞生成素进行治疗的脑卒中患者得到治疗；本发明48小时后给药，仍具有明显改善神经功能作用。可以长期注射对血液系统没有刺激。

Description

无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素及其用途
技术领域
本发明涉及一种新型促红细胞生成素及其用途，更具体地说是提供一种具有神经保护作用，但无促红细胞生成的副作用的新型促红细胞生成素及其在制药中的用途，属于生物制药领域。
背景技术
促红细胞生成素(EPO)是由肾脏合成和分泌的一种生长因子，能促使红细胞生产和成熟(红细胞生成)。最初认为EPO仅仅与红细胞的生产和成熟有关，但最近的研究发现EPO除了具有促进红细胞生成的作用之外，还有很强的促进神经元生存(神经保护)的作用。体外实验表明，EPO可以减轻或抑制由缺糖缺氧NMDA毒性，自由基等多种因素引起的神经元损伤。大量动物实验表明，EPO注射可以减少缺血梗死面积，同时可以改善神经功能恢复。最近的一个临床实验结果令人鼓舞：在中风5小时给予大剂量EPO注射(33000U/次)，可以明显减少由大脑中动脉阻塞所致的脑梗死体积，同时可以明显提高病人的神经功能和临床结果。这一进展意义重大，其一，目前中风唯一有效的药物是t-PA，其治疗窗口为中风后3小时内，而EPO扩大了治疗窗口，从而使更多中风患者得到治疗；其二，EPO作为新型脑保护治疗试剂可以用于中风后神经功能康复治疗。然而，由于脑保护屏障的作用，只有不到1％EPO可穿过血脑屏障而进入大脑。因此，需要大剂量注射才内能在大脑内达到一定治疗浓度，其剂量远远高于治疗贫血所使用的剂量。同时，EPO的神经保护作用是通过激活一系列信号通道而实现的，比如PI3/Akt系统，而EPO诱导的PI3/Akt信号通常仅能维持48小时，因此需要多次注射来维持生存信号的激活。大剂量，多次注射EPO会产生一连串高风险的副作用，比如红细胞压积升高而使血液变得粘稠，同时EPO可刺激血小板的生成。这些高危因素可导致红色血栓形成从而增加脑卒中患者发生再次中风的可能。因此，若能选择性的降低或去除EPO的促红细胞生成作用，而维持其神经保护作用，将带来脑中风治疗的变革。本发明即是提供一种新型的无促红细胞生成作用，但有神经保护作用的新型EPO。
EPO与EPO受体结合后，激活一系列信号通路而促进细胞的生成和成熟。在EPO分子中，有三个区域与EPO受体结合有关，这三个区域分别是第11至15号氨基酸(详见SEQ ID No.4)，第44至51号氨基酸(SEQ ID No.5)以及第100至108号氨基酸(SEQ ID No.6)。研究发现，若在上述三个区域中发生点突变，EPO分子将失去与EPO受体结合的能力，从而失去刺激红细胞生成的功能。EPO具有神经保护作用，目前的研究认为EPO通过与神经元上的EPO受体结合，激活与促红细胞生成相同的信号通路而发挥神经保护作用。因此，从理论上来讲，破坏EPO受体结合位点后，EPO将不再具有神经保护作用。
因此现阶段制备具有神经保护作用无促红细胞作用的EPO是本领域技术人员研究的重点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种具有神经保护作用，但无促红细胞生成特性的新型促红细胞生成素。
本发明要解决的另一个技术问题是：提供这种具有神经保护作用，但无促红细胞生成特性的新型促红细胞生成素在制药领域的用途。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素，为野生型人促红细胞生成素在下述三个区域中至少一个区域进行突变而产生的变构体：
(1)VLQRY：人促红细胞生成素的第11-15号氨基酸；
(2)TKVNFYAW：人促红细胞生成素的第44-51号氨基酸；
(3)SGLRSLTTL：人促红细胞生成素的第100-108号氨基酸。
所述突变为：单点或多点突变、单个或多个氨基酸缺失、以及突变加缺失复合突变。
所述无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素为序列表SEQ IDNo.7至SEQ ID No.68中的任一氨基酸序列。
所述的无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素，特别是第14号精氨基突变为丙氨基(序列#14)，谷氨酰胺(序列#15)以及谷氨酸(序列#16)；第45号赖氨酸突变为丙氨基(序列#21)以及谷氨酸(序列#22)；第100号丝氨酸突变为丙氨基(序列#33)以及谷氨酸(序列#34)；第103号精氨基突变为丙氨基(序列#39)以及谷氨酸(序列#40)；第104号丝氨酸突变为丙氨基(序列#44)，异亮氨酸(序列#45)以及谷氨酸(序列#46)。
所述的无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素，除上述所述三个区域外，在人促红细胞生成素的第6，7，10，20，21，29，33，38，42，52，59，63，67，70，83，96，97，126，142，149，150，151，152，153，155，156，161号氨基酸位置至少发生一个突变而产生的变构体。
所述的无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素在制备、保持、增强神经保护作用，或用于神经功能康复治疗的药物的应用。
所述的无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素在制备用于中枢神经系统以外的脏器，如心脏、肾脏等脏器的缺血性损伤的治疗药物中的应用。
人类EPO cDNA(序列#1)编码193个氨基酸(序列#2)，EPO初级蛋白合成后，其氨基端含27个氨基酸残基的信号肽经切割后变为成熟EPO(序列#3)。因此成熟的人类EPO为166个氨基酸。下面所列出的突变型人类促红细胞生成素的氨基酸序列均为成熟后的氨基酸序列。
人类EPO cDNA用PCR方法进行定点突变，获得了62个新突变型EPO cDNA。这些突变主要集中在以下三个与EPO受体结合有关区域内：VLQRY(人促红细胞生成素的第11-15号氨基酸，序列SEQ ID No.4)，TKVNFYAW(人促红细胞生成素的第44-51号氨基酸，序列SEQ ID No.5)和SGLRSLTTL(人促红细胞生成素的第100-108号氨基酸，序列SEQ ID No.6)。将这些突变后的EPO cDNA装入真核表达载体并在人胚肾293细胞系中进行表达。通过筛选稳定高表达细胞株，我们成功制备了62个含有单个突变氨基酸的新型突变型EPO(mEPO)融合蛋白，这些mEPO融合蛋白的具体突变位点如下(其中第一和第三个字母分别为正常和突变后的氨基酸，两字母之间的数字为成熟促红细胞生成素的氨基酸序号，具体氨基酸序列详见序列表)：
I6A-EPO(序列#7)，   C7A-EPO(序列#8)，   C7S-EPO(序列#9)，
R10I-EPO(序列#10)， V11S EPO(序列#11)， L12A-EPO(序列#12)，
E13A-EPO(序列#13)， R14A-EPO(序列#14)， R14Q-EPO(序列#15)，
R14E-EPO(序列#16)， Y15A-EPO(序列#17)， Y15P-EPO(序列#18)，
Y15I-EPO(序列#19)， T44I-EPO(序列#20)， K45A-EPO(序列#21)，
K45E-EPO(序列#22)， V46A-EPO(序列#23)， N47A-EPO(序列#24)，
F48A-EPO(序列#25)， F48I-EPO(序列#26)， Y49A-EPO(序列#27)，
Y49S-EPO(序列#28)， W51E-EPO(序列#29)， W51F-EPO(序列#30)，
K52A-EPO(序列#31)， K97A-EPO(序列#32)， S100A-EPO(序列#33)，
S100E-EPO(序列#34)，S100T-EPO(序列#35)，G101A-EPO(序列#36)，
G101I-EPO(序列#37)，L102A-EPO(序列#38)，R103A-EPO(序列#39)，
R103E-EPO(序列#40)，R103H-EPO(序列#41)，R103N-EPO(序列#42)，
R103Q-EPO(序列#43)，S104A-EPO(序列#44)，S104I-EPO(序列#45)，
S104E-EPO(序列#46)，L105A-EPO(序列#47)，T106A-EPO(序列#48)，
T106I-EPO(序列#49)，T107A-EPO(序列#50)，T107I-EPO(序列#51)，
L108A-EPO(序列#52)，L108E-EPO(序列#53)，L108K-EPO(序列#54)，
L108S-EPO(序列#55)，S146A-EPO(序列#56)，N147A-EPO(序列#57)，
F148A-EPO(序列#58)，F148Y-EPO(序列#59)，L149A-EPO(序列#60)，
R150A-EPO(序列#61)，R150E-EPO(序列#62)，R150I-EPO(序列#63)，
G151A-EPO(序列#64)，K152A-EPO(序列#65)，K152W-EPO(序列#66)，
C161A-EPO(序列#67)，R162A-EPO(序列#68)
我们用体内和体外实验对这些mEPO是否具有促进红细胞生成的作用进行了研究，发现mEPO丧失了维持红细胞生成素依赖性细胞株(32D-EPOR)生存的特性；体内实验进一步证明大剂量、多次注射mEPO不增加小鼠的红细胞数量和血红蛋白值。这些实验数据表明mEPO丧失了促进红细胞生成的能力。令人兴奋的是这些突变体和野生型EPO一样，无论在体内还是体外都具有很强的神经保护作用，不仅能够抑制缺氧和缺葡萄糖或NMDA毒性有道德神经细胞死亡的作用，而且体内研究发现mEPO能够显著减少小鼠大脑中动脉阻塞模型脑梗死体积。此研究结果令人意外：因为目前的研究认为EPO具有神经保护作用，而神经保护作用是通过EPO与神经元上的EPO受体结合，激活与促红细胞生成相同的信号通路而发挥作用。因此，从理论上来讲，破坏EPO受体结合位点后，EPO将不再具有神经保护作用。令人意想不到的是，点突变破坏了EPO受体结合位点后，EPO仍具有神经保护作用，使这种突变型促红细胞生成素成为一种无促红细胞生成作用，但有神经保护作用的新型神经保护药物。
到目前为止所有治疗中风的试剂，若在中风48小时后给药，均无治疗效果。令人兴奋地是新型脑保护药物在48小时后给药(迟发性)，仍具有明显的改善神经功能的作用。此结果意义重大，目前中风唯一有效的药物是t-PA，其治疗窗口非常短，为中风后3小时内，因此只有不到10％的中风患者适合t-PA治疗。而EPO扩大了治疗窗口，从而使更多中风患者得到治疗。此外，新型脑保护药物可以长期注射而对血液系统没有刺激作用，特别适用于用于脑中风的康复治疗。
本发明的优点与效益：(1)新型脑保护药物具有神经保护作用，但无促红细胞生成作用，从而避免了常规促红细胞生成素有可能导致的继发性血栓形成，增加了临床应用的安全性；(2)新型脑保护药物扩大了治疗群体，使血液粘稠度较高而不能用常规促红细胞生成素进行治疗的脑卒中患者得到治疗；(3)到目前为止，所有治疗中风的试剂，若在中风48小时后给药，均无治疗效果，而新型脑保护药物48小时后给药，仍具有明显的改善神经功能的作用。这将使绝大多数脑卒中患者得到治疗；(4)新型促红细胞生成素可以长期注射而对血液系统没有刺激作用，特别适用于用于脑卒中的康复治疗。因此这种新型促红细胞生成素在脑卒中的治疗方面具有良好的临床应用前景：突变型促红细胞生成素扩大了脑卒中患者治疗群体，使更多脑卒中患者得到治疗；突变型促红细胞生成素可以长期注射而对血液系统没有刺激作用，特别适用于脑卒中的康复治疗。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1-1为mEPO全基因序列示意图。
图1-2为部分突变型EPO的DNA测序结果。
图2为表达质粒pcDNA-mEPO-his6的物理图。
图3为表达突变型EPO融合蛋白稳定细胞株的建立及其mEPO融合蛋白的制备及纯化：pcDNA-EPO-His6转染293细胞，用G418筛选高表达细胞株。取2ul培养基上清液用Western blot分析mEPO的表达。我们成功地分离纯化了62个含有单个突变氨基酸的新型突变型EPO融合蛋白。图3所示为S104I-EPO(序列#45)，其分子量约34-40kD(泳道2)，与野生型EPO的分子量相似(泳道1)。
图4为体内和体外实验，证明mEPO无促红细胞生成特性：(A)应用32D-EpoR细胞系进行体外红细胞生成活力检测。细胞(2x105)在含有1U/ml野生型EPO或含有1和100U/ml mEPO的培养基中进行孵育培养，72h后进行细胞计数。数据用平均值±标准误表示(n＝10)。图中所示为S104I-EPO(序列#45)，其它序列结果与此相似。(B)小鼠活体内红细胞生成活力检测。mEPO或野生型EPO以5000U/kg总量进行腹腔注射，每周2次，连续4周注射。每2周进行一次血中血红蛋白浓度检测。数据以平均值±标准误表示，n＝8。与野生型EPO注射组相比较*p＜0.05，**p＜0.01。图中突变体S104I-EPO(序列#45)，其它序列结果与此相似。
图5为体外实验，提示mEPO具有抗OGD和NMDA的脑保护作用：(A)为暴露于NMDA24小时后显微镜下(a-d)和烟酸己可碱染色后形态学表现(e-h)。对照组神经元见图a和e。NMDA导致凋亡样(f图内红箭头)和坏死样细胞死亡(f图内黄色箭头)。EPO(c，g)或mEPO(d，h)预处理24小时可减少神经元死亡。(B)为NMDA神经毒性导致的细胞死亡计数。EPO或mEPO预处理后暴露于NMDA可明显减少高密度细胞核形态细胞数量。(C)为单独NMDA处理后LDH释放量作为对照EPO和mEPO处理的神经元释放LDH的相对含量。(**＜0.01，数据用均值+SEM来表示，n＝12)。
图6为小鼠体内实验，证明mEPO能有效减少小鼠大脑中动脉阻塞模型脑梗死体积：成年C57/B6雄性小鼠，大脑中动脉栓塞60分钟再灌注72小时。再灌注即刻腹腔注射mEPO或EPO(5000U/kg)，分别在缺血24和48小时后再次给药。MCAO 72h后进行神经功能评分和TTC染色。(A)图为MCAO小鼠脑的冠状切面TTC染色照片。(B)图为梗死体积定量计算。(C)图为神经功能评分。数据用均数±标准差表示，每组N＝10。**p＜0.01与空白对照组比较，*p＜0.05与空白对照组比较。
图7为新生鼠缺氧缺血模型，提示mEPO具有促进神经功能恢复的功能：出生后7天的Sprague-Dawley新生鼠给予缺氧缺血130分钟，然后给予腹腔注射mEPO(5000U/kg)，用“脚踩空实验”检测神经功能。图7A为mEPO注射，神经功能检测及测定脑梗死体积时间表；尽管迟发性mEPO注射不能减少缺氧缺血所致的脑组织(图7B和7C)，但能显著提高神经功能(图7D，7E和7F)。
具体实施方式
实施例1：EPO cDNA定点突变
从人类肾脏cDNA文库中扩增人类EPO cDNA，用PCR方法进行定点突变，获得了62个新突变型EPO cDNA，并将这些突变后的EPO cDNA装入真核表达载体，详细步骤为：
一、人类EPO cDNA的扩增
人类EPO cDNA编码193个氨基酸，EPO初级蛋白合成后，其氨基端含27个氨基酸残基的信号肽经切割后变为成熟EPO。因此成熟的人类EPO为166个氨基酸。基于上述研究结果，将用于分离纯化的组氨酸标签(His-6)加于EPO cDNA的3’端。含有His-6标签的人类EPO cDNA用PCR方法从人类肾脏Marathon-ready cDNA文库(Clontech，Mountain View，美国)中扩增。引物设计依照已发表的人类EPOcDNA序列(基因序列号：NM000799)。其中上游序列含有BamHI及KOZAK序列(划线部分)5’-ACGGATCCGCCACCATGGGGGT GCACGAATGTCTTGC-3’。下游引物序列为：5’-
Figure A20081022210300091
gtcccctgccctgcaggcctcccctg-3’，从3’至5’次含有EPO下游序列(小写部分)，六个组氨酸组成的组氨酸标签(斜体部分)以及EcoRI克隆位点(方框部分)。在组氨酸标签及EPO之间加入甘氨酸残基(黑体部分)，便于肽段的自由旋转。PCR反应条件为：上述两引物各10pmol，Marathon cDNA 2μl，AccuprimeTMTaq DNA polymerase(Invitrogen，Carlsbad，美国)1μl。94℃预变性2分钟后，94℃变性30秒，62℃退火30秒，68℃延伸50秒，28个循环后用琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。克隆入AT克隆载体pGEM-T easy(Promega，Madison，美国)。质粒扩增及酶切鉴定后进一步进行DNA测序。mEPO全基因序列示意图见图1-1。
二、EPO cDNA定点突变
用此质粒为模板，用PCR方法进行定点突变。突变使用快速突变试剂盒(产品编号：200523，Stratagene，La Jolla，美国)按厂家说明进行操作。简言之，取上述质粒0.1ug为模板，加入上游及下游突变引物各10pmol，PfuUltraTM高保真Taq酶2U及dNTP 200μM。PCR反应条件为：94℃预变性2分钟后，94℃变性30秒，62℃退火30秒，68℃延伸5分钟。12个循环后加入20U DNaseI 37℃消化30分钟。琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物后，转化JM109感受态细菌。提取质粒后进一步进行DNA测序。所用突变引物序列如下(黑体为突变碱基，下划线碱基编码突变氨基酸)。
I6A-EPO(序列#7)上游：5’-ACCACGCCTC
Figure A20081022210300092
TGTGACAGCCGAGTCCTGGAGAG-3’
下游：5’-GCTGTCACA
Figure A20081022210300093
GAGGCGTGGTGGGGCGCCCAGGACTG-3’
C7A-EPO(序列#8)上游：5’-CACGCCTCATCGACAGCCGAGTCCTGGAGAGGTAC-3’
下游：5’-CTCGGCTGTC
Figure A20081022210300095
GATGAGGCGTGGTGGGGCGCCCAG-3’
C7S-EPO(序列#9)上游：5’-CACGCCTCATC
Figure A20081022210300096
GACAGCCGAGTCCTGGAGAGGTAC-3’
下游：5’-CTCGGCTGTC
Figure A20081022210300097
GATGAGGCGTGGTGGGGCGCCCAG-3’
R10I-EPO(序列#10)上游：5’-CTGTGACAGC
Figure A20081022210300098
GTCCTGGAGAGGTACCTCTTGGAG-3’
下游：5’-CTCTCCAGGAC
Figure A20081022210300099
GCTGTCACAGATGAGGCGTGGTGG-3’
V11S-EPO(序列#11)上游：5’-GTGACAGCCGA
Figure A200810222103000910
CCTGGAGAGGTACCTCTTGGAGGCC-3’
下游：5’-CCTCTCCAGG
Figure A200810222103000911
TCGGCTGTCACAGATGAGGCGTGG-3’
L12A-EPO(序列#12)上游：5’-CAGCCGAGTC
Figure A200810222103000912
GAGAGGTACCTCTTGGAGGCCAAG-3’
下游：5’-GAGGTACCTCTC
Figure A200810222103000913
GACTCGGCTGTCACAGATGAGGCG-3’
E13A-EPO(序列#13)上游：5’-CCGAGTCCTGG
Figure A200810222103000914
GAGGTACCTCTTGGAGGCCAAGGAG-3’
下游：5’-AGAGGTACCTC
Figure A20081022210300101
CCAGGACTCGGCTGTCACAGATGAG-3’
R14A-EPO(序列#14)上游：5’-GAGTCCTGGAG
Figure A20081022210300102
GTACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCC-3’
下游：5’-CCAAGAGGTAC
Figure A20081022210300103
CTCCAGGACTCGGCTGTCACAGATG-3’
R14Q-EPO(序列#15)上游：5’-GAGTCCTGGAG
Figure A20081022210300104
GTACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCC-3’
下游：5’-CCAAGAGGTAC
Figure A20081022210300105
CTCCAGGACTCGGCTGTCACAGATG-3’
R14E-EPO(序列#16)上游：5’-GAGTCCTGGAG
Figure A20081022210300106
AGTACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCC-3’
下游：5’-CCAAGAGGTACT
Figure A20081022210300107
CTCCAGGACTCGGCTGTCACAGATG-3’
Y15A-EPO(序列#17)上游：5’-TCCTGGAGAGG
Figure A20081022210300108
CCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAG-3’
下游：5’-CCTCCAAGAGG
Figure A20081022210300109
CCTCTCCAGGACTCGGCTGTCACAG-3’
Y15P-EPO(序列#18)上游：5’-TCCTGGAGAGG
Figure A200810222103001010
CCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAG-3’
下游：5’-CCTCCAAGAGG
Figure A200810222103001011
CCTCTCCAGGACTCGGCTGTCACAG-3’
Y15I-EPO(序列#19)上游：5’-TCCTGGAGAGG
Figure A200810222103001012
CCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAG-3’
下游：5’-CCTCCAAGAGG
Figure A200810222103001013
CCTCTCCAGGACTCGGCTGTCACAG-3’
T44I-EPO(序列#20)上游：5’-CTGTCCCAGAC
Figure A200810222103001014
CAAAGTTAATTTCTATGCCTGGAAGAG-3’
下游：5’-GAAATTAACTTTG
Figure A200810222103001015
GTCTGGGACAGTGATATTCTCATTC-3’
K45A-EPO(序列#21)上游：5’-TCCCAGACACC AGTTAATTTCTATGCCTGGAAGAGG-3’
下游：5’-TAGAAATTAACT
Figure A200810222103001017
GGTGTCTGGGAAGTGATATTCTC-3’
K45E-EPO(序列#22)上游：5’-TCCCAGACACC
Figure A200810222103001018
AAGTTAATTTCTATGCCTGGAAGAGG-3’
下游：5’-TAGAAATTAACTT
Figure A200810222103001019
GGTGTCTGGGAAGTGATATTCTC-3’
V46A-EPO(序列#23)上游：5’-CAGACACCAAAG TAATTTCTATGCCTGGAAGAGG-3’
下游：5’-GCATAGAAATTA
Figure A200810222103001021
CTTTGGTGTCTGGGACAGTGATATTC-3’
N47A-EPO(序列#24)上游：5’-GACACCAAAGTT TTTCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGG-3’
下游：5’-CAGGCATAGAAA
Figure A200810222103001023
AACTTTGGTGTCTGGGACAGTGATA-3’
F48A-EPO(序列#25)上游：5’-CCAAAGTTAAT
Figure A200810222103001024
CTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTC-3’
下游：5’-TCCAGGCATAG ATTAACTTTGGTGTCTGGGACAGTG-3’
F48I-EPO(序列#26)上游：5’-CCAAAGTTAAT
Figure A200810222103001026
CTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTC-3’
下游：5’-TCCAGGCATAG
Figure A200810222103001027
ATTAACTTTGGTGTCTGGGACAGTG-3’
Y49A-EPO(序列#27)上游：5’-AAGTTAATTTC
Figure A200810222103001028
TGCCTGGAAGAGGATGGAGGTCGGG-3’
下游：5’-CTCTTCCAGGCA
Figure A200810222103001029
GAAATTAACTTTGGTGTCTGGGAC-3’
Y49S-EPO(序列#28)上游：5’-AAGTTAATTTCT
Figure A200810222103001030
TGCCTGGAAGAGGATGGAGGTCGGG-3’
下游：5’-CTCTTCCAGGCA
Figure A20081022210300111
AGAAATTAACTTTGGTGTCTGGGAC-3’
W51E-EPO(序列#29)上游：5’-ATTTCTATGCC
Figure A20081022210300112
GAAGAGGATGGAGGTCGGGCAGCAG-3’
下游：5’-CCATCCTCTTC
Figure A20081022210300113
GGCATAGAAATTAACTTTGGTGTC-3’
W51F-EPO(序列#30)上游：5’-ATTTCTATGCC
Figure A20081022210300114
AAGAGGATGGAGGTCGGGCAGCAG-3’
下游：5’-CCATCCTCTT
Figure A20081022210300115
GGCATAGAAATTAACTTTGGTGTC-3’
K52A-EPO(序列#31)上游：5’-TCTATGCCTGG
Figure A20081022210300116
GAGGATGGAGGTCGGGCAGCAGGCC-3’
下游：5’-CCTCCATCCTC
Figure A20081022210300117
CCAGGCATAGAAATTAACTTTGGTG-3’
K97A-EPO(序列#32)上游：5’-GCATGTGGAT
Figure A20081022210300118
AGCCGTCAGTGGCCTTCGCAGCCTC-3’
下游：5’-CACTGACGGCT
Figure A20081022210300119
ATCCACATGCAGCTGCAGGGGCTC-3’
S100A-EPO(序列#33)上游：5’-GATAAAGCCGTC
Figure A200810222103001110
TGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTG-3’
下游：5’-CTGCGAAGGCCA
Figure A200810222103001111
GACGGCTTTATCCACATGCAGCTG-3’
S100E-EPO(序列#34)上游：5’-GATAAAGCCGTC
Figure A200810222103001112
GGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTG-3’
下游：5’-CTGCGAAGGCC
Figure A200810222103001113
GACGGCTTTATCCACATGCAGCTG-3’
S100T-EPO(序列#35)上游：5’-GATAAAGCCGTC
Figure A200810222103001114
TGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTG-3’
下游：5’-CTGCGAAGGCCA
Figure A200810222103001115
GACGGCTTTATCCACATGCAGCTG-3’
G101A-EPO(序列#36)上游：5’-AGCCGTCAGTG
Figure A200810222103001116
CCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTC-3’
下游：5’-GGCTGCGAAGG
Figure A200810222103001117
CACTGACGGCTTTATCCACATGCAG-3’
G101I-EPO(序列#37)上游：5’-AGCCGTCAGT
Figure A200810222103001118
CCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTC-3’
下游：5’-GGCTGCGAAGG
Figure A200810222103001119
ACTGACGGCTTTATCCACATGCAG-3’
L102A-EPO(序列#38)上游：5’-CGTCAGTGGC TCGCAGCCTCACCACTCTGCTTCGG-3’
下游：5’-GTGAGGCTGCGA GCCACTGACGGCTTTATCCACATG-3’
R103A-EPO(序列#39)上游：5’-TCAGTGGCCTT
Figure A200810222103001122
CAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTC-3’
下游：5’-TGGTGAGGCTG
Figure A200810222103001123
AAGGCCACTGACGGCTTTATCCACATG-3’
R103E-EPO(序列#40)上游：5’-TCAGTGGCCTT
Figure A200810222103001124
AGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTC-3’
下游：5’-TGGTGAGGCT
Figure A200810222103001125
AAGGCCACTGACGGCTTTATCCACATG-3’
R103H-EPO(序列#41)上游：5’-TCAGTGGCCTT
Figure A200810222103001126
CAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTC-3’
下游：’-TGGTGAGGCTG AAGGCCACTGACGGCTTTATCCACATG-3’
R103N-EPO(序列#42)上游：5’-TCAGTGGCCTT
Figure A200810222103001128
CAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTC-3’
下游：5’-TGGTGAGGCTG
Figure A200810222103001129
AAGGCCACTGACGGCTTTATCCACATG-3’
R103Q-EPO(序列#43)上游：5’-TCAGTGGCCTT
Figure A200810222103001130
AGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTC-3’
下游：5’-TGGTGAGGCT
Figure A20081022210300121
AAGGCCACTGACGGCTTTATCCACAT-3’
S104A-EPO(序列#44)上游：5’-GTGGCCTTCGC
Figure A20081022210300122
CCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTG-3’
下游：5’-GAGTGGTGAGG
Figure A20081022210300123
GCGAAGGCCACTGACGGCTTTATC-3’
S104I-EPO(序列#45)上游：5’-GTGGCCTTCGC
Figure A20081022210300124
CCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTG-3’
下游：5’-GAGTGGTGAGG
Figure A20081022210300125
GCGAAGGCCACTGACGGCTTTATC-3’
S104E-EPO(序列#46)上游：5’-GTGGCCTTCGC
Figure A20081022210300126
CTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTG-3’
下游：5’-GAGTGGTGAGGCGAAGGCCACTGACGGCTTTATC-3’
L105A-EPO(序列#47)上游：5’-GCCTTCGCAGC
Figure A20081022210300128
CACCACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAG-3’
下游：5’-GCAGAGTGGTG
Figure A20081022210300129
GCTGCGAAGGCCACTGACGGCTTTA-3’
T106A-EPO(序列#48)上游：5’-TCGCAGCCTC
Figure A200810222103001210
CCACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCC-3’
下游：5’-GAAGCAGAGTGG
Figure A200810222103001211
GAGGCTGCGAAGGCCACTGACGGC-3’
T106I-EPO(序列#49)上游：5’-TCGCAGCCTC
Figure A200810222103001212
CACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCC-3’
下游：5’-GAAGCAGAGTG
Figure A200810222103001213
GAGGCTGCGAAGGCCACTGACGGC-3’
T107A-EPO(序列#50)上游：5’-CAGCCTCACC
Figure A200810222103001214
CTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAG-3’
下游：5’-CCGAAGCAGAG
Figure A200810222103001215
GGTGAGGCTGCGAAGGCCACTGAC-3’
T107I-EPO(序列#51)上游：5’-CAGCCTCACC TCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAG-3’
下游：5’-CCGAAGCAGA
Figure A200810222103001217
GGTGAGGCTGCGAAGGCCACTGAC-3’
L108A-EPO(序列#52)上游：5’-CCTCACCACT
Figure A200810222103001218
GCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAG-3’
下游：5’-GAGCCCGAAGC
Figure A200810222103001219
AGTGGTGAGGCTGCGAAGGCCACT-3’
L108E-EPO(序列#53)上游：5’-CCTCACCACT
Figure A200810222103001220
GCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAG-3’
下游：5’-GAGCCCGAAGC
Figure A200810222103001221
AGTGGTGAGGCTGCGAAGGCCACT-3’
L108K-EPO(序列#54)上游：5’-CCTCACCACT GCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAG-3’
下游：5’-GAGCCCGAAGC
Figure A200810222103001223
AGTGGTGAGGCTGCGAAGGCCACT-3’
L108S-EPO(序列#55)上游：5’-CCTCACCACT
Figure A200810222103001224
GCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAG-3’
下游：5’-GAGCCCGAAGC
Figure A200810222103001225
AGTGGTGAGGCTGCGAAGGCCACT-3’
S146A-EPO(序列#56)上游：5’-CCGAGTCTAC
Figure A200810222103001226
CCAATTTCCTCCGGGGAAAGCTGAAG-3’
下游：5’-GGAGGAAATTGG
Figure A200810222103001227
GTAGACTCGGAAGAGTTTGCGGAA-3’
N147A-EPO(序列#57)上游：5’-GAGTCTACTCC
Figure A200810222103001228
TTTCCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTG-3’
下游：5’-CCCGGAGGAAA
Figure A200810222103001229
GGAGTAGACTCGGAAGAGTTTGCGG-3’
F148A-EPO(序列#58)上游：5’-CTACTCCAAT
Figure A200810222103001230
CCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTAC-3’
下游：5’-TTCCCCGGAGG
Figure A20081022210300131
ATTGGAGTAGACTCGGAAGAGTTTG-3’
F148Y-EPO(序列#59)上游：5’-CTACTCCAAT CCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTAC-3’
下游：5’-TTCCCCGGAGG ATTGGAGTAGACTCGGAAGAGTTTG-3’
L149A-EPO(序列#60)上游：5’-CTCCAATTTC
Figure A20081022210300134
CCGGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAG-3’
下游：5’-GCTTTCCCCGG
Figure A20081022210300135
GAAATTGGAGTAGACTCGGAAGAG-3’
R150A-EPO(序列#61)上游：5’-CCAATTTCCTC
Figure A20081022210300136
GGGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGG-3’
下游：5’-TCAGCTTTCCC
Figure A20081022210300137
GAGGAAATTGGAGTAGACTCGGAAG-3’
R150E-EPO序列#62)上游：5’-CCAATTTCCTC
Figure A20081022210300138
GGGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGG-3’
下游：5’-TCAGCTTTCCC
Figure A20081022210300139
GAGGAAATTGGAGTAGACTCGGAAG-3’
R150I-EPO(序列#63)上游：5’-CCAATTTCCTC
Figure A200810222103001310
GGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGG-3’
下游：5’-TCAGCTTTCC
Figure A200810222103001311
GAGGAAATTGGAGTAGACTCGGAAG-3’
G151A-EPO(序列#64)上游：5’-TTTCCTCCGG
Figure A200810222103001312
AAAGCTGAAGCTGTACACAGGGGAG-3’
下游：5’-GCTTCAGCTTT
Figure A200810222103001313
CCGGAGGAAATTGGAGTAGACTCGGAA-3’
K152A-EPO(序列#65)上游：5’-TCCTCCGGGGA
Figure A200810222103001314
GCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCC-3’
下游：5’-TACAGCTTCAGC
Figure A200810222103001315
TCCCCGGAGGAAATTGGAGTAGAC-3’
K152W-EPO(序列#66)上游：5’-TCCTCCGGGGA
Figure A200810222103001316
GCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCC-3’
下游：5’-TACAGCTTCAGC TCCCCGGAGGAAATTGGAGTAGAC-3’
C161A-EPO(序列#67)上游：5’-CAGGGGAGGCC CAGGACAGGGGACAGAGGCGGCCGC-3’
下游：5’-CCCTGTCCTG GGCCTCCCCTGTGTACAGCTTCAG-3’
R162A-EPO(序列#68)上游：5’-GGAGGCCTGC
Figure A200810222103001320
GACAGGGGACAGAGGCGGCCGCTAC-3’
下游：5’-GTCCCCTGTC GCAGGCCTCCCCTGTGTACAGCTT-3’
三、DNA测序
将突变后的质粒送至美国匹兹堡大学(University of Pittsburgh)基因组及蛋白组学中心进行DNA测序。所用测序引物为：上游引物为(M13F)：5’-ACGTTGTAAAACGACGGCCAGTG-3’；下游引物为(M13R)：5’-GGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3’。
测序结果见图1-2。
四、mEPO表达载体的构建
将上述测序后的突变型EPO cDNA全基因用BamHI及EcoRI双酶切后，亚克隆至pcDNA3.1(+)表达载体中(clontech，美国)，命名为pcDNA-mEPO-his6。
实施例2：mEPO融合蛋白制备及纯化
用转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen，美国)将载体pcDNA-mEPO-his6导入293细胞系。转染24h后，1∶12传代，加入G4181mg/ml(Invitrogen，美国)培养2周后挑选单个克隆转入6孔板继续培养。取10μl培养基用Western blot或稀释1000倍后用ELISA鉴定mEPO高表达细胞株。上清用Western blot和ELISA鉴定EPO的表达，结果见图2。mEPO高表达细胞株大量扩增后，收集培养基用Ni-NTA琼脂糖层析柱(QIAGEN，Valencia，美国)回收纯化mEPO融合蛋白。简言之，培养基用NaOH将其pH值调至8.0，加入5M NaCl至终浓度为300mM。将5ml Ni-NTA琼脂糖加入层析柱中，用PBS洗柱两遍后，将Ni-NTA琼脂糖加入培养基中。4℃振摇结合2小时后，将Ni-NTA琼脂糖培养基加入层析柱中，用磷酸盐缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑，pH8.0)洗柱6遍，然后加入洗脱液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，PH8.0)10ml洗脱mEPO融合蛋白。将洗脱的mEPO融合蛋白加入Slide-A-Lyzer透析盒中(PIERCE，Rockford，美国)，置于1000ml PBS中进行透析，每8小时更换一次PBS，透析6次后收集蛋白。纯化的蛋白经0.2μm滤器过滤后分装，冻存于-80℃或冷冻真空抽干备用。SDS-PAGE电泳后，用考马斯亮兰染色鉴定蛋白纯度。用ELISA试剂盒(R&D System，Minneapolis，美国)进行定量分析。
理论上讲未糖基化的mEPO分子量为23kD。Western blot法确定纯化的mEPO融合蛋白分子量为36至40kD(图3)，表明我们生产的mEPO为糖基化的。用此法提纯的mEPO纯度可达90％，浓度高达50U/μl。
实施例3：检测mEPO是否具有促红细胞生成特性
我们用体内和体外实验对这些mEPO是否具有促进红细胞生成的特性进行了研究。
一、mEPO促红细胞生成生物特性的体外分析
32D-EPOR细胞为小鼠骨髓来源的淋巴母细系32D细胞稳定转染EPO受体后形成的细胞系，其生存和增殖完全依赖于EPO的存在，被广泛用于EPO生物学活特性的体外分析。用IDEM培养基(Invitrogen)将32D-EPOR细胞接种于六孔板中，每孔约2x105个细胞。饥饿(无EPO存在)6小时后分别加入野生型EPO(1U/ml)或mEPO(1和100U/ml)或PBS(对照)，72小时后用胎盘蓝染色，计数活细胞的数量。在野生型EPO存在的条件下，32D-EPOR细胞在72小时内增殖了大约13倍(2.7x107)，而mEPO和PBS对照一样，只有0.1％细胞存活，即使增加mEPO浓度100倍后对32D-EPOR细胞的存活也没有任何影响，表明mEPO丧失了促红细胞生成的能力。
二、mEPO对小鼠血红蛋白浓度的影响
取体重25-30g，2-3月龄C3H/HEN雌性小鼠(Taconic Laboratories，Taconic，美国)，以每公斤体重5000单位的剂量腹腔内注射mEPO或野生型EPO，每周2次，连续注射4周。每2周隐静脉采血一次，用血红蛋白仪(HemoCue AB，
Figure A20081022210300151
瑞典)检测血液中血红蛋白浓度。隐静脉采血具体操作如下：采用气体麻醉，1.5％异氟烷混合70％N2O和30％O2经气管插管行吸入麻醉。将覆盖在小鼠后肢外侧隐静脉之上的毛发剃除，用右手拇指和食指挤压覆盖在外侧隐静脉之上的皮肤，使隐静脉充盈，酒精常规消毒后采用带有毛细软管的25号针头采血。当取够100μl静脉血后迅速拔出针头，用棉球按压穿刺点1～3分钟促进创口止血。C3H/HEN雌性小鼠血红蛋白的正常值为14.5±2.0g/100ml，长期大剂量mEPO注射对血红蛋白没有影响(14.3±1.8g/100ml)，而野生型EPO显著增加血红蛋白的含量，在第二周和第四周分别达到注射前的115％和130％，表明mEPO丧失了促红细胞生成的能力。
三、结果
体外实验发现mEPO丧失了维持促红细胞生成素依赖性细胞株(32D-EPOR)生存的特性；体内实验进一步证明大剂量，多次注射mEPO不增加小鼠的红细胞数量和血红蛋白值，表明mEPO丧失了促红细胞生成的能力。本发明的创造性之一在于新型脑保护药物无促红细胞生成作用，从而避免了常规促红细胞生成素有可能导致的继发性血栓形成，增加了临床应用的安全性。
实施例4：mEPO脑保护作用的体外研究
为了确定纯化的mEPO蛋白是否具有生物活性，我们验证了其在NMDA毒性诱导的神经细胞死亡中的作用。
一、大鼠皮层神经元原代培养：
按Cao等报道的方法进行(Cao G，J Neurosci.2001，21(13)：4678-90)。简言之，取怀孕16至17天的SD大鼠胚胎，用剪刀将大脑皮层组织剪成约1mm3小块，用0.01％胰酶缓冲液37℃消化30分钟后，加入马血清灭活胰酶，用吸管吹打后过滤190g离心10分钟后收集细胞，重悬于Neurobasal培养基(Invitrogen)后种于poly-D-lysine coated 24孔板(3×105)或100mm盘(5×106)中，同时加入50×B27(+)添加剂(invitrogen)，每72小时更换一次液体。用Neurobasal培养基所得神经元侧纯度为95％。
二、NMDA毒性模型
生长至11天的原代培养神经元更换新鲜培养基，同时加入B27(-)添加剂以及mEPO或野生型EPO(1U/ml)继续培养。24小时后加入200μM NMDA，作用15分钟后更换为新鲜培养基及B27(-)添加剂，同时加入mEPO或野生型EPO。24小时后取培养基上清检测LDH活性，作为细胞死亡的标记。同时用Hoechest染色细胞核，计数浓缩及片段化的细胞核比例。
三、结果
如图5所示，mEPO能显著降低由NMDA诱导的细胞凋亡及坏死，其效果与商用标准EPO(R&D System，Minneapolis，美国)相似。表明mEPO和野生型EPO一样，在抗NMDA所致神经毒性方面具有相同的保护作用。
实施例5：mEPO对小鼠大脑中动脉阻塞模型脑梗死体积的影响
一、小鼠短暂局部脑缺血模型的制作
利用单股尼龙缝合线栓塞左侧大脑中动脉制作局部脑缺血模型。取体重25-30g，2-3月龄雄性C57/B6小鼠(The Jackson Laboratory，Bar Harbor，美国)，1.5％异氟烷/70％N2O/30％O2混和气体气管插管吸入麻醉。手术全程动物的直肠温度通过反馈恒温加热毯维持在37.0±0.5℃之间，栓塞时使用鼠尾血压监测器监测小鼠的平均动脉压，于栓塞后15分钟取动脉血行血气分析。栓塞60分钟后于各指定时间点拔出线栓恢复血供造成再灌注。手术完毕解除麻醉，小鼠北方回笼内饲养在20℃恒温的空调屋内。
二、梗死体积测定
梗死体积的测定采用Yang所描述方法(Stroke.1994，25(1)：165-70)。概括如下：于再灌注不同时间点处死动物，快速取出脑组织，冠状位切片，共6片，每片厚2毫米，将切好的脑片放入用PBS配置的2％TTC(氯化2，3，5-三苯基四氮唑)溶液中，37.5℃水浴20分钟，然后将其放入4％的多聚甲醛中固定15分钟后取出拍照。使用图像分析系统(MCID，St.Catherine’s，加拿大)。计算机图像分析系统计算各层脑组织面积。公式为：梗塞面积＝非梗塞面积-梗塞侧正常脑组织面积，这样可以减小脑水肿对计算梗塞面积的影响。总的梗塞体积＝各层梗塞面积×层厚(2mm)。为了验证TTC染色测定梗死体积的准确性，实验室进行了组织学染色与之对比。将动物处死后快速取脑，将脑组织放入2-甲基-丁烷在30℃下冰冻。行冠状位连续冰冻切片，每片厚20μm，每隔0.5mm取一张脑片(每个脑组织大概可取22-24张脑片)。切好的脑组织切片进行甲酚紫染色，按上述的方法进行梗塞体积的计算。
三、结果
我们进一步证实了mEPO在小鼠脑缺血再灌注模型中的神经保护作用。C57/B6小鼠大脑中动脉栓塞60分钟再灌注72小时后造成同侧半球梗死，TTC染色显示梗死体积大约为32mm3。缺血后再灌注即刻使用5000U/kg mEPO可明显减少梗死体积(P＜0.01，与空白对照组比较)，其效果与野生型EPO相似(图6A和6B)，同时可以明显改善神经功能(图6C)。表明无论是体内或体外，mEPO都具有很强很的神经保护作用。此研究结果令人意外：因为目前的研究认为EPO具有神经保护作用，而神经保护作用是通过EPO与神经元上的EPO受体结合，激活与促红细胞生成相同的信号通路而发挥作用。因此，从理论上来讲，破坏EPO受体结合位点后，EPO将不再具有神经保护作用。令人意想不到的是，点突变破坏了EPO受体结合位点后，EPO仍具有神经保护作用，使这种突变型促红细胞生成素成为一种无促红细胞生成作用，但有神经保护作用的新型神经保护药物。
实施例6：mEPO促进神经功能恢复
到目前为止所有治疗中风的试剂，若在中风48小时后给药，均无治疗效果。令人兴奋地是新型脑保护药物在48小时后给药(迟发性)，仍具有明显的改善神经功能的作用。迟发性给药仍具有治疗效果，其机制目前尚不清楚，可能与新型脑保护药物诱导血管再生和神经再生，从而促进神经功能的恢复有关。为了证实新型脑保护药物是否通过诱导血管再生和神经再生而发挥作用，我们进一步研究了新型脑保护药物对新生鼠缺氧缺血模型所致的神经功能损伤影响。
一、新生鼠缺氧缺血模型
应用出生后7天的新生Sprague-Dawley大鼠(Charles River实验室，Wilmington，Mass)制备130分钟缺氧/再灌注模型。简而言之，在3％异氟烷麻醉下，结扎左侧颈总动脉，90分钟后将动物放置于缺氧环境中(含氧量为8％)。40分钟后将动物放放回正常环境中侍养。非缺血动物作为对照组。将野生型rEPO和变构型mEPO溶于0.1％牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液中，按照图7A所示剂量腹腔注射制备野生型rEPO(5000U/kg)和变构型mEPO(5000U/kg)。0.1％牛血清白蛋白磷酸盐缓冲溶液注射作为非治疗对照组。
二、神经功能检测
我们应用“脚踩空实验”检测神经功能。简言之，动物被放置在升高8.5毫米的网格地板上(34x29mm)。网眼面积为2.2x2.2cm。当大鼠在网格上移动的时候，未受损伤的动物可以将爪子放在网架，在网上移动时可以抓牢格子。缺氧损伤的动物不能准确地将一侧前或者后肢放置踩在格子上，甚至会将前肢后肢从网眼中跌落，即为1次“脚踩空”。观察1分钟，记录脚步的总数，“脚踩空”次数。图7D显示缺氧/再灌注之后感觉运动行为显著缺失。与对照组相比，非治疗组动物对侧的(图7E)和同侧的(图7F)肢体“脚踩空”次数均显著增高，EPO的应用可以减小这种神经功能缺失的程度(图7D，7E和7F)(图6B-D)。因此，外源性EPO在改善缺氧/再灌注后的神经损伤是有效的。
三、结果
出生后7天的Sprague-Dawley新生鼠给予缺氧缺血130分钟，2，4，6，9和13天后分别给予腹腔注射mEPO(5000U/kg)，然后检测神经功能的恢复。我们发现尽管迟发性mEPO注射不能减少缺氧缺血所致的梗死体积(图7B和7C)，但能显著提高神经功能的恢复(图7D，7E和7F)，其效果与野生型EPO相似，而且mEPO可以大剂量多次注射而不用担心野生型EPO所致的血液学副作用。此结果意义重大，目前中风唯一有效的药物是t-PA，其治疗窗口非常短，为中风后3小时内，因此只有不到10％的中风患者适合t-PA治疗。而EPO扩大了治疗窗口，从而使更多中风患者得到治疗。此外，新型脑保护药物可以长期注射而对血液系统没有刺激作用，特别适用于用于脑中风的康复治疗。
序列表
<110>曹国栋、陈俊、罗玉敏、吉训明、邢娟
<120>无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素及其用途
<130>
<160>68
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>582
<212>DNA
<213>人属，人种
<400>1(人类促红细胞生成素cDNA)
atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct     60
ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag    120
aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc    180
agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg    240
atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct    300
gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg    360
catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctgcga    420
gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc    480
actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg    540
aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat ga                       582
<210>2
<211>193
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>2(人类促红细胞生成素氨基酸序列)
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu Leu Ser Leu Pro
1               5                   10                  15                  20
Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu
                25                  30                  35                  40
Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys
                45                  50                  55                  60
Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
                65                  70                  75                  80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala
                85                  90                  95                  100
Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu
                105                 110                 115                 120
His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg
                125                 130                 135                 140
Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
                145                 150                 155                 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu
                165                 170                 175                 180
Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                185                 190
<210>3
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>3(成熟的人类促红细胞生成素氨基酸序列)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1               5                   10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>4
<211>5
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>4(成熟的人促红细胞生成素的第11-15号氨基酸)
Val Leu Gln Arg Tyr
<210>5
<211>8
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>5(成熟的人促红细胞生成素的第44-51号氨基酸)
Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>6(成熟的人促红细胞生成素的第100-108号氨基酸)
Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu
<210>7
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>7(I6A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ala Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>8
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>8(C7A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Ala Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>9
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>9(C7S-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Ser Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>10
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>10(R10I-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Ile Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>11
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>11(V11S-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Ser Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>12
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>12(L12A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Ala Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>13
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>13(E13A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Ala Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>14
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>14(R14A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Ala Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>15
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>15(R14Q-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>16
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>16(R14E-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Glu Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>17
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>17(Y15A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Ala Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>18
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>18(Y15P-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Pro Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>19
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>19(Y15I-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Ile Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>20
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>20(T44I-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Ile Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>21
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>21(K45A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Ala Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>22
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>22(K45E-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Glu Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>23
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>23(V46A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Ala Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>24
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>24(N47A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Ala Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>25
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>25(F48A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Ala Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>26
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>26(F48I-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Ile Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>27
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>27(Y49A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Ala Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
            165
<210>28
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>28(Y49S-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Ser Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>29
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>29(W51E-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Glu Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>30
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>30(W51F-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Phe Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>31
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>31(K52A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Ala Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>32
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>32(K97A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Ala Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>33
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>33(S100A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ala
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>34
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>34(S100E-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Glu
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>35
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>35(S100T-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Thr
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>36
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>36(G101A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Ala Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>37
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>37(G101I-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Ile Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>38
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>38(L102A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Ala Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>39
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>39(R103A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Ala Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>40
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>40(R103E-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Glu Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>41
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>41(R103H-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu His Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>42
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>42(R103N-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Asn Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>43
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>43(R103Q-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Gln Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>44
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>44(S104A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ala Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>45
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>45(S104I-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ile Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>46
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>46(S104E-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Glu Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>47
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>47(L105A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Ala Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>48
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>48(T106A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Ala Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>49
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>49(T106I-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Ile Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>50
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>50(T107A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Ala Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>51
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>51(T107I-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Ile Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>52
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>52(L108A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Ala Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>53
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>53(L108E-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Glu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>54
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>54(L108K-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Lys Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>55
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>55(L108S-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Ser Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>56
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>56(S146A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ala Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>57
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>57(N147A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Ala Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>58
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>58(F148A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Ala Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>59
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>59(F148Y-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Tyr Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>60
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>60(L149A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Ala Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>61
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>61(R150A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Ala Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>62
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>62(R150E-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Glu Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>63
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>63(R150I-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Ile Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>64
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>64(G151A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Ala Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>65
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>65(K152A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Ala Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>66
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>66(K152W-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Trp Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>67
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>67(C161A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Ala Arg Thr Gly Asp Arg
                165
<210>68
<211>166
<212>PRT
<213>人属，人种
<400>68(R162A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1                5                  10                  15                  20
Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr
                25                  30                  35                  40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala
                45                  50                  55                  60
Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu
                65                  70                  75                  80
Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
                85                  90                  95                  100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser
                105                 110                 115                 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
                125                 130                 135                 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
                145                 150                 155                 160
Cys Ala Thr Gly Asp Arg
                165

Claims (8)

1.一种无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素，为野生型人促红细胞生成素在下述三个区域中的至少一个区域进行突变而产生的变构体：
(1)VLQRY：人促红细胞生成素的第11-15号氨基酸；
(2)TKVNFYAW：人促红细胞生成素的第44-51号氨基酸；
(3)SGLRSLTTL：人促红细胞生成素的第100-108号氨基酸。
2.根据权利要求1所述的无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素，其特征在于：所述突变为单点或多点突变、单个或多个氨基酸缺失、以及突变加缺失复合突变。
3.根据权利要求1或2所述的无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素，其特征在于：所述无促红细胞生成特性的新型促红细胞生成素为序列表SEQ IDNo.7至SEQ ID No.68中的任一氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素，其特征在于，特别是第14号精氨基突变为丙氨基(序列#14)，谷氨酰胺(序列#15)以及谷氨酸(序列#16)；第45号赖氨酸突变为丙氨基(序列#21)以及谷氨酸(序列#22)；第100号丝氨酸突变为丙氨基(序列#33)以及谷氨酸(序列#34)；第103号精氨基突变为丙氨基(序列#39)以及谷氨酸(序列#40)；第104号丝氨酸突变为丙氨基(序列#44)，异亮氨酸(序列#45)以及谷氨酸(序列#46)。
5.一种无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素，其特征在于：除权利要求1中所述三个区域外，在人促红细胞生成素的第6，7，10，20，21，29，33，38，42，52，59，63，67，70，83，96，97，126，142，149，150，151，152，153，155，156，161号氨基酸位置进行突变而产生的变构体。
6.根据权利要求1或5所述的无促红细胞生成特性的新型促红细胞生成素，与其它蛋白或多肽进行融合、置换、化学交联而产生的新型融合蛋白。
7.一种无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素在制备保持、增强神经保护作用、或用于神经功能康复治疗的药物中的应用。
8.一种无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素在制备用于中枢神经系统以外的脏器，如心脏、肾脏等脏器的缺血性损伤的治疗药物中的应用。
CN200810222103A 2008-09-09 2008-09-09 无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素及其用途 Pending CN101671389A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200810222103A CN101671389A (zh) 2008-09-09 2008-09-09 无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200810222103A CN101671389A (zh) 2008-09-09 2008-09-09 无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101671389A true CN101671389A (zh) 2010-03-17

Family

ID=42018830

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200810222103A Pending CN101671389A (zh) 2008-09-09 2008-09-09 无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101671389A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106075392A (zh) * 2016-07-18 2016-11-09 滨州医学院 促红细胞生成素衍生物在听力保护上的应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106075392A (zh) * 2016-07-18 2016-11-09 滨州医学院 促红细胞生成素衍生物在听力保护上的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2005084711A1 (fr) Erythropoietine recombinante pegylee a activite in vivo
PT1813624E (pt) Métodos e composições para a prevenção e tratamento da anemia
CN102470156A (zh) 选择性作用于αvβ3整合素并缀合人血清白蛋白(HSA)变体的多肽及其药学用途
CN106632682A (zh) 融合蛋白ifn-elp及其应用
TWI579299B (zh) 去整合蛋白變異體及其醫藥用途
CN108220274B (zh) 一种高活性凝血因子xi突变体及其基因治疗/编辑载体、重组/融合蛋白的制备与应用
CN101134105B (zh) 用于治疗和/或预防脑梗塞的含有重组人胰激肽原酶的药物组合物
MX2014014505A (es) Agente para prevenir y/o tratar dolor neuropatico periferico causado por farmaco contra el cancer.
JP7425784B2 (ja) 可溶化アピラーゼ、方法及び使用
CN108440673A (zh) Fc融合蛋白PD1/FGFR1及其应用
CN110302362A (zh) 一种蛋白在制备预防和治疗糖尿病并发症的药物中的应用
CN101671389A (zh) 无促红细胞生成特性、具有神经保护作用的促红细胞生成素及其用途
CN108864258A (zh) 具有抑制肿瘤功能的peg化多肽及其制备方法与应用
CN101671388B (zh) 血脑屏障穿透性促红细胞生成素及其应用
KR20180095093A (ko) 뇌 신경 교종 치료용 약물 제조에서의 화합물의 용도
CN101906162A (zh) 成纤维细胞生长因子-1及其突变体的聚乙二醇修饰产物
CN105218683A (zh) 一种Tat PTD-Endostatin-RGD重组蛋白及其制备方法与应用
CN108299556B (zh) 一种治疗血液肿瘤的多肽
WO2009116529A1 (ja) ポリペプチドおよび当該ポリペプチドを含む医薬組成物
CN103936865B (zh) 一种抗血栓融合蛋白及编码该融合蛋白的基因
CN113583107B (zh) CRIg功能区蛋白变体及其应用
EP4386008A1 (en) New mutant of recombinant ganoderma lucidum immunoregulatory protein and application thereof
CN105420260A (zh) 重组靶向Wnt融合蛋白及其在制备抗癌药中的应用
CN101897959A (zh) 用于治疗和/或预防脑梗塞的含有重组人胰激肽原酶的药物
Foote Erythropoietins and Erythropoiesis 15 15 ed. by G. Molineux, MA Foote, and SG Elliott© 2003 Birkhäuser Verlag/Switzerland

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20100317