JP2023527816A - インターロイキン-1受容体アンタゴニスト及びそれを含む融合タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
特に説明しない限り、下記定義は本発明の全文に適用される。未定義の用語は本分野で約束された定義に基づいて理解することができる。
中国特許出願公開第1829739号明細書に開示されたエタネルセプト(etanercept)(TNFR2-FC)のアミノ酸配列に基づいてそのヌクレオチド配列を設計すると共にコドン最適化を行う。人工的に合成されたTNFR2-FC遺伝子をベクターpEE12.4にクローニングする。構築された組換えプラスミドに配列決定を行い、挿入配列が設計配列と完全に一致することを確認する。PvuIで組換えプラスミドを線形化し、次にCHO-K1細胞をトランスフェクトし、MSX(L-メチオニンスルホキシミン(L-Methionine Sulfoximine))を用いて目的タンパク質を安定的に発現するCHO細胞株をスクリーニングする。スクリーニングされた細胞株を振とうフラスコで培養する。発酵が完了した後に遠心分離により発酵液中の細胞及び細胞断片を除去し、次に0.22μMの濾過膜で濾過し、清澄な発酵液が得られる。発酵液についてProteinAでアフィニティークロマトグラフィーを行い、MabSelect SuRe(商標)(GE Healthcare)を充填剤として抽出する。充填剤は結合緩衝液(20mM PB、0.15M NaCl、pH7.2)で平衡化する。サンプリングを完了した後、サンプルをベースラインまで洗浄する。最後に、溶出緩衝液(50mM クエン酸ナトリウム、pH3.3)で目的タンパク質を溶出する。アフィニティークロマトグラフィー溶出物を濃縮し、さらにゲル濾過クロマトグラフィー(充填剤がSuperdex 200(GE Healthcare)であり、緩衝液がPBSである)で精製する。ゲル濾過クロマトグラフィーの各溶出ピークを収集し、非還元SDS-PAGE分析を行い、電気泳動純度が高くかつ分子量がTNFR2-Fcと一致する溶出ピークを選択して生物学的活性分析に用い、それによりTNFR2-Fc融合タンパク質を製造して得る。
まず、目的タンパク質のアミノ酸配列に基づいてヌクレオチド配列にコドン最適化を行い、遺伝子合成会社に送ってDNA合成を行い、次に合成された配列決定が正確な目的遺伝子をpEE12.4ベクターに挿入する。該ベクターは強力プロモーターhCMV-MIE、レプリコンpEE6 ori、ターミネーターSV40 poly(A)シグナル、複製開始点SV40(ori)、HindIII/EcoRI制限部位、及びグルタミン合成酵素遺伝子を含む。構築された組換えプラスミドに配列決定を行い、挿入配列が設計配列と完全に一致することを確認する。制限エンドヌクレアーゼPvuIで組換えプラスミドを線形化し、次にCHO-K1細胞をトランスフェクトし、MSX(L-メチオニンスルホキシミン)を用いて目的タンパク質を安定的に発現するCHO細胞株をスクリーニングする。
CHO-K1細胞を予め用意し、トランスフェクションの前日に、細胞密度を0.5×106個の細胞/mLに調整する。1.43×107個の細胞を取り、洗浄し、遠心分離し、培地中のGlutaMAXを除去する。0.7mLのCD CHO培地で細胞を懸濁し、40μgの酵素切断線形化されたプラスミドを添加し、均一に混合し、0.4cmの電気回転カップに移す。電気回転計を調整し、容量1000μF、電圧300Vで電撃を行う。電撃した後に細胞を37℃で予熱された150mLの培地に迅速に移し、50μL/ウェルで、96ウェルプレートに接種し、5%CO2、37℃で静置培養する。24時間トランスフェクションした後、各ウェルに150μLのCD CHO培地(66.6μMのMSXを含む)を追加し、MSXの最終濃度は50μMであり、5%CO2、37℃で培養し続ける。トランスフェクションした後に21~28日間培養し、成長したモノクローナルを選び出し、増幅培養した後、上清を収穫してSDS-PAGE還元電気泳動検出を行い、タンパク質バンドの染色の深さはタンパク質濃度と正相関する。
本実施例におけるインターロイキン-1受容体アンタゴニスト融合タンパク質の精製方法は、以下のステップを含む。
1.深層濾過した後、得られたCHO細胞培養物をまずMabselect SuReアフィニティークロマトグラフィーで精製し、融合タンパク質液を捕捉する。
1.1 4つのカラム体積の平衡溶液(20mmol/LPB、0.15mol/L NaCl pH7.2)で平衡させ、pH及び導電率の監視値は平衡緩衝液と一致する。
1.2 サンプルをロードする前に、紫外線吸収値をゼロに設定する。深層濾過された培養上清を直接サンプリングし、サンプル保持時間は9分間であり、サンプリング量は15mg/mlである。
1.3 サンプリングした後、3つのカラム体積のアフィニティークロマトグラフィー平衡溶液で洗浄し、次に洗浄液1(20mmol/LPB、1.5mol/L NaCl、2.0mol/L尿素、pH7.2)で洗浄する。
1.4 洗浄液2(100mmol/Lのクエン酸、0.3mol/Lのグリシン、10%のソルビトール、pH5.5)でカラムを洗浄する。表示されたpH及び導電率の監視値は洗浄液2と一致する。
1.5 溶出液(100mmol/Lのクエン酸塩、0.3mol/Lのグリシン、15%のトレハロース、30%のソルビトール、pH3.7)はサンプルを溶出するために用いられ、280nmUVでタンパク質の主ピークを収集する。UVが120mAUに達したときに収集を開始し、UVが120mAUであるときに収集を停止する。
1.6 3つのカラム体積の水酸化ナトリウムで洗浄し、次に平衡溶液を使用してカラムのpHを中性に平衡させて安定させ、次に3つのカラム体積のエタノールを使用してカラムを保存する。
1.7 図1に示すように、黒い四角印は目的タンパク質のMabselect SuReクロマトグラムを示す;図2に示すように、黒い四角印はHPLCにより測定された目的タンパク質の純度を示す。
2.1 サンプル前処理:親和性溶出されたタンパク質溶液をサンプル希釈液(20mmol/L PB、3.0mol/L NaCl、pH7.1)で1:5の体積比で希釈することにより、pH7.1に調整し、導電率は165~175mS/cmである。
2.2 4つのカラム体積の平衡緩衝液(20mmol/L PB、2.2mol/LNaCl pH7.1)でカラムを平衡化する。pH及び導電率の監視値は平衡緩衝液と一致する。
2.3 サンプルをロードする前に、UV吸収値をゼロに設定する。サンプルはステップ1においてMabselect SuReアフィニティークロマトグラフィーにより溶出されたタンパク質液であり、サンプルの保持時間は9分間であり、サンプリング量は15mg/mlである。
2.4 サンプルのロードが完了した後、3つのカラム体積の平衡溶液でクロマトグラフィーカラムを洗浄することにより、未結合の成分を完全に洗浄する。
2.5 さらに2つのカラム体積の洗浄緩衝液(20mmol/L PB、1.8mol/L NaCl、pH7.1)で洗浄することにより、いくつかの弱い結合の不純物を除去する。
2.6 溶出緩衝液(20mmol/L PB、0.1mol/L NaCl pH7.1)でサンプルを溶出し、280nmのUVでタンパク質の主ピークを収集する。UVが100mAUに達したときに収集を開始し、次にUVが100mAUであるときに収集を停止する。
2.7 3つのカラム体積の再生緩衝液(0.1mol/L NaOH)で洗浄し、次に中性になるまで水で洗浄し、クロマトグラフィーカラムを3つのカラム体積の20%エタノールに保存する。
2.8 図3に示すように、目的タンパク質のCapto Phenyl(HS)クロマトグラムは黒い四角で示されている。図4に示すように、黒い四角印はHPLCにより測定された目的タンパク質の純度図を示す。
3.1 平衡緩衝液(20mmol/L PB、0.5mol/L NaCl pH5.9)で5CVカラムを平衡化する。pH及び導電率の監視値は平衡緩衝液と一致する。
3.2 ステップ2で溶出されたタンパク質溶液サンプルをロードする。サンプルを平衡緩衝液と一致する条件に調整した後、サンプルをロードし始める。サンプリング時間は4.5分間であり、サンプリング量は115mg/mlである。サンプルをロードした後、サンプルが収集されるまで、平衡緩衝液でサンプルを平衡化する。
3.3 収集されたタンパク質の主ピークは280nmの紫外線吸収箇所にある。UVが80mAUに達したときに収集を開始し、UVが100mAUであるときに収集を停止する。
3.4 再生:5つのカラム体積の500mmol/L NaOH及び2.0mol/L NaClで洗浄し、次に中性になるまで水で洗浄し、カラムを3つのカラム体積の20%エタノールに保存する。
3.5 図5に示すように、黒い四角印は目的タンパク質のCapto adhereクロマトグラムを示す。図6に示すように、黒い四角印はHPLCにより測定された目的タンパク質の純度図を示す。
上記Mabselect SuRe/Capto Phenyl(HS)/Capto adhereの3段階精製プロセス条件により、CHO細胞により発現された組換え形式のIL-1RNを含む融合タンパク質を精製する。タンパク質の総収率は50%より大きく、かつSEC-HPLCにより測定された目的タンパク質の純度は98.5%より大きい。
全てのSPR計測はいずれもBIAcore 3000装置(GE Biosciences,Piscataway,N.J.)で行われる。BIAcoreソフトウェア-BIAcore 3000制御ソフトウェアV3.2を使用してBIAcore 3000機器を操作し制御する。評価ソフトウェアV4.1を使用し、BIAcore 3000機器からのSPRデータを分析し、Graph Pad Prismソフトウェアバージョン5を使用してデータを描画する。親和性研究において、25℃で、HBS-EP緩衝液(10mM HEPES、15Mm NaCl、3.4nM EDTA、0.005%P20)を使用し、流速が30μL/分である。示された融合タンパク質はリガンドとして用いられ、チップの基準チャネルを構築するために用いられる。固定された受容体と結合する分析物IL-1RN-Fcを計測し、濃度が1.2~100nM(3倍希釈度)である。各サンプルを30μL/minの流速で3分間注入することにより、チップに結合された融合タンパク質と結合する。次に、分析物を含まない結合緩衝液を同じ流速でチップを通過させることにより、結合された分析物を解離させる。500s後、再生溶液(1Mギ酸)を注入することにより残留された結合分析物を除去する。Kinetics Guidelines及びBiaEvaluationソフトウェアV4.1付属の手動フィッティングプログラムを用いてデータを分析する。
IL-1RNタンパク質がIL-1βにより誘導されたA375.s2アポトーシス過程を抑制する原理に基づいて、前記融合タンパク質の生物学的活性を検出する。A375.s2細胞をMEMに10%FBS培地を加えて培養する。A375.s2細胞を1.5×105個の細胞/ml、80μl/ウェルで96ウェルプレートに敷いた。IL-1β(R&D systems)の濃度を10μg/mlに調整し、各ウェルに10μlを添加する。さらにIL-1RN-Fc融合タンパク質の濃度を100μg/mlに調整し、これを最高濃度とし、4倍勾配で8つの濃度に希釈し、各ウェルに10μlを添加する。37℃で96時間培養した後、各ウェルに20μlのMTS検出試薬(Promega)を添加し、37℃で0.5時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーで490nmの波長での読み取り値を読み取る。検出結果は以下のとおりである。
1.マウスCIAモデルの調製
(1)初回免疫
3.3mlの完全フロイントアジュバントを3回に分けてコラーゲンに添加して乳化する。各マウスに0.4mlの麻酔剤を腹腔内注射する。マウスを麻酔した後、電気かみそりで尾部の被毛を除去し、尾部の皮内に100μlの乳化コラーゲンを注射する。
(2)強化免疫
初回免疫21日後に2回目の強化免疫を行い、免疫前日にマウスの二回目免疫の麻酔剤及びコラーゲンを準備する。抗原を乳化する過程において、3.3mlの不完全フロイントアジュバントを3回に分けてコラーゲンに添加して乳化する。各マウスに0.4mlの麻酔剤を腹腔内注射する。マウスを麻酔した後に電気かみそりで尾部の被毛を除去し、尾部の皮内に50μlの乳化コラーゲンを注射する。
(1)マウスは2回免疫後の4~10日に発症し始める。モデル作成マウスを発症後の24時間以内にランダムにグループ分け、腹腔内注射投与を行い、21日間連続的に観察する。投薬治療期間に1日ごとに1回の関節採点及び体重秤量を行う。
(2)実験グループ
ブランク対照群のマウス以外に、全てのマウスはいずれもCIAモデル作成を行う。発症後の24時間内に、マウスを採点して治療群にランダムに分ける。薬物治療を21日間継続する。
Claims (16)
- SEQ ID NO:1とは少なくとも70%の同一性を有し、かつN末端から第5、14、74位の少なくとも一つの突然変異部位を含むことを特徴とするインターロイキン-1受容体アンタゴニスト(IL-1RN)タンパク質又はその変異体又は類似体。
- 前記突然変異部位はR5T、R14T及びD74Nから選択される少なくとも一つである請求項1に記載のタンパク質又はその変異体又は類似体。
- 請求項1又は2に記載のタンパク質又はその変異体又は類似体をコードするヌクレオチド。
- 前記IL-1RNタンパク質の半減期を延長するためのドメインを含み、前記ドメインは請求項1又は2に記載のIL-1RNタンパク質又はその変異体又は類似体に接続される、融合タンパク質又はその変異体又は類似体。
- 腫瘍壊死因子受容体2(TNFR2)又はその断片又は変異体をさらに含み、好ましくは、前記断片は腫瘍壊死因子受容体2(TNFR2)の細胞外ドメインである、請求項4に記載の融合タンパク質又はその変異体又は類似体。
- 前記ドメインはFcドメイン、血清アルブミン及びトランスフェリンから選択される一種又は複数種である、請求項4又は5に記載の融合タンパク質又はその変異体又は類似体。
- 前記FcドメインはIgG1Fc、IgG2Fc、IgG3Fc、IgG4Fc、IgMFc、IgAFc、IgDFc及びその変異体から選択される一種又は複数種である、請求項6に記載の融合タンパク質又はその変異体又は類似体。
- 前記IL-1RNタンパク質の半減期を延長するためのドメイン、前記IL-1RNタンパク質及び前記TNFR2はリンカーにより接続される、請求項4又は5に記載の融合タンパク質又はその変異体又は類似体。
- 前記リンカーは一般式(GnS)mを有し、ここで、nは0~6の整数であり、好ましくは、nは0、1、2、3、4、5又は6であり、mは1~4の整数であり、好ましくは、mは1、2、3又は4であり、好ましくは、前記一般式は(GlyGlyGlyGlySer)mであり、ここで、mは1~3の整数であり、好ましくは、mは1、2又は3である、請求項8に記載の融合タンパク質又はその変異体又は類似体。
- 前記IL-1RNタンパク質又はその変異体又は類似体、融合タンパク質又はその変異体又は類似体を発現するベクター。
- 請求項10に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 少なくとも2種類の請求項1に記載のタンパク質又はその変異体又は類似体、又は請求項4~9のいずれか一項に記載の融合タンパク質又はその変異体又は類似体を含むポリペプチド複合体。
- 各複合体中の少なくとも2種類のタンパク質又はその変異体又は類似体、又は融合タンパク質又はその変異体又は類似体は同じであるか又は異なる、請求項12に記載のポリペプチド複合体。
- 請求項1又は2に記載のタンパク質又はその変異体又は類似体、請求項4~9のいずれか一項に記載の融合タンパク質又はその変異体又は類似体、請求項10に記載のベクター、請求項11に記載の細胞又は請求項12又は13に記載のポリペプチド複合体、及び薬学的に許容可能な担体又は添加剤を含む、医薬組成物。
- 請求項1又は2に記載のタンパク質又はその変異体又は類似体、請求項4~9のいずれか一項に記載の融合タンパク質又はその変異体又は類似体、請求項10に記載のベクター、請求項11に記載の細胞又は請求項12又は13に記載のポリペプチド複合体、請求項14に記載の医薬組成物の炎症性関連疾患の治療及び予防における用途。
- 前記炎症性関連疾患は関節炎、腸炎、喘息、肺線維症、糸球体腎炎、移植片対宿主反応、急性肺損傷、重篤な角膜火傷、リウマチ様関節炎、クリオピリン関連周期性症候群(CAPS)、アトピー性皮膚炎、化膿性汗腺炎、心血管疾患及び非小細胞肺癌から選択される一種又は複数種である、請求項15に記載の用途。
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