CN103690930B - 人白介素‑1受体拮抗剂的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人IL‑1Ra在预防和治疗溃疡性结肠炎癌变中的新用途。本发明建立了UC癌变的动物模型，考察人IL‑1Ra全程治疗和末期治疗的治疗效果，发现人IL‑1Ra全程治疗可有效减少结肠病灶部位的肿瘤数量，减轻肠道损伤程度，促进肿瘤上皮细胞的凋亡；人IL‑1Ra末期治疗能有效减少结肠病灶部位的肿瘤数量，缩减肿瘤体积，抑制肿瘤的形成。说明人IL‑1Ra可应用于制备预防和治疗溃疡性结肠炎癌变药物。

Description

人白介素-1受体拮抗剂的新用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体而言，本发明涉及人白介素-1受体拮抗剂(Interleukin-1ReceptorAntagonist，IL-1Ra)的新用途，更具体的而言，本发明涉及人IL-1Ra在预防和治疗溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)癌变的新用途。

背景技术

溃疡性结肠炎是一种结肠与直肠慢性非特异性炎症疾病，而病因尚不明确。该病的病变部位主要是在大肠黏膜以及黏膜下层，病程长久，复发率相当高。病症主要有反复性的腹痛、腹泻和长期炎症等多种并发症状。UC在欧美较为常见，患病率为40-100／10万，发病率为20-40／10万，多见于20-40岁年龄段。在我国，随着人民生活质量的不断改善和诊疗技术的不断提高，UC的发病率逐年升高，据多家医院的病例统计分析，UC的患病率为10-20／10万，在一些发达城市甚至接近欧美国家的水平。

UC相关结直肠癌(Colitis-associated Cancer，CAC)是溃疡性结肠炎的严重并发症，因为CAC占所有结肠癌的比例虽然不高，只有2％左右，但是却占UC患者死亡原因的15％左右。研究发现UC患者由炎症到不典型增生再到癌变的过程与一般肿瘤到癌变过程时间相比更加迅速。伴随着科技的发展，检测器材与医学治疗的完善，在临床上广泛应用结肠镜监测及早期预防性结肠切除术的普及，近期研究显示，UC的病程20年癌变的风险为2.5％，30年癌变的风险为7.6％，40年癌变的风险为10.8％。

目前对溃疡性结肠炎传统内科治疗常规药物有三类：氨基水杨酸类、类固醇糖皮质激素及免疫抑制剂。而这些药物均存在疗效欠佳及副作用较大的问题，如临床常用治疗中、轻度结肠炎的柳氮磺吡啶，约有近半数人不能耐受其副作用；类固醇糖皮质激素类药物包括氢化可的松、泼尼松、地塞米松等，这些药物不宜长期使用；免疫抑制剂主要有氨甲喋呤、硫唑嘌呤等，该类药物因毒性较大而限制了其应用。正是由于缺乏有效的治疗手段和该疾病自身的发展进程，UC具有病程长、易反复、难治愈、症状难以控制等特点。

人白介素-1受体拮抗剂是人体内存在的蛋白分子，在体内可与人白介素-1(Interleukin-1，IL-1)的受体特异性地结合，从而保护由IL-1引起的机体损伤。2001年底FDA批准美国Amgen公司人白介素-1受体拮抗剂上市，主要用于顽固性类风湿关节炎；也用于II型糖尿病、红斑狼疮和脓血症。但目前尚无报道其在CAC治疗中的应用。

发明内容

本发明一个目的是提供人IL-1Ra在预防和治疗溃疡性结肠炎癌变的新用途，将成为临床上预防和治疗UC癌变的有效候选药物，即CAC将成为人IL-1Ra临床治疗新的适应症。所述的人IL-1Ra(GenBank号：P18510.1)采用常规方法表达得到。

本发明的另一个目的是提供一种方案评价人IL-1Ra在预防UC癌变中的疗效：通过偶氮甲烷(AOM)和硫酸葡聚糖钠(DSS)的联合应用(AOM(12mg／kg)的一次注射+4轮2％DSS水喂饮)建立了UC癌变的动物模型，建模开始后进行治疗，分别在每轮喂饮DSS水的第1，3，5天腹腔注射人IL-1Ra，剂量为25mg／kg，观察时间为100天，结果显示，此方案能有效减少结肠病灶部位的肿瘤数量，减轻肠道损伤程度，促进肿瘤上皮细胞的凋亡。

本发明的另一个目的是提供一种方案评价人IL-1Ra在治疗UC癌变中的疗效：通过偶氮甲烷(AOM)和硫酸葡聚糖钠(DSS)的联合应用(AOM(12mg／kg)的一次注射+4轮2％DSS水喂饮)建立了UC癌变的动物模型，在末轮DSS水喂饮结束后1周，连续腹腔注射人IL-1Ra，剂量为25mg／kg，总观察时间为100天，对照小鼠注射磷酸盐缓冲生理盐水(PhosphateBuffered Saline，PBS)。该方案则能减少肿瘤数量，缩减肿瘤体积，从而抑制肿瘤的形成。

本发明治疗方法中所用的人IL-1Ra还可以为人白介素-1受体拮抗剂，以及所述两种拮抗剂的修饰形式，所述拮抗剂可以进一步含有一种或多种化学修饰以增加其在循环中的半衰期，例如交联于聚乙二醇(即聚乙二醇化)。

对本发明所述的人IL-1Ra和人白介素1受体拮抗剂的氨基酸或核苷酸序列进行浅显的或微小的修改，所得的突变体蛋白在预防和治疗UC癌变中的应用，也在本发明的保护范围之内。人IL-1Ra的功能保守变异体在预防和治疗UC癌变中的应用也在本发明的保护范围之内，所述“功能保守变异体”是指蛋白质中一个或多个氨基酸残基发生改变，但不影响此多肽的总体构象和功能，包括(但绝不限于)把一个氨基酸残基替换成另外一个具有类似特征的氨基酸。具有特征类似的氨基酸被本领域所熟知。例如可互相替换的极性／亲水氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；可互相替换的非极性／疏水氨基酸，包括甘胺酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；可互相替换的酸性氨基酸，包括天冬氨酸和谷氨酸；可以互相替换的碱性氨基酸，包括组胺酸、赖氨酸和精氨酸。

本发明的其它实施方案进一步包括一种或多种其它治疗，诸如免疫抑制剂、抗炎药、类固醇和免疫调节剂。所述的免疫抑制剂包括硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素和麦考酚酸吗乙酯。所述的抗炎药包括5-氨基水杨酸、柳氮磺吡啶和奥沙拉嗪。所述的类固醇包括皮质类固醇、糖皮质激素、泼尼松、泼尼松龙、氢化可的松、甲泼尼龙、地塞米松和ACTH。所述的免疫调节剂包括PVAC、抗CD40配体、抗CD40、那他珠单抗(AntegrenTM)、抗VCAMI和抗ICAMl。

如果需要，还可以将本发明拮抗剂和其他试剂联合给药，诸如其它蛋白质或多肽类或各种药物活性剂。实际上，对还可以包括的其它成分几乎没有限制，只要所述的其它试剂不会在接触靶细胞或宿主组织时产生显著的不良作用。由此可以将拮抗剂与如具体情况所要求的各种其它活性剂一起递送。

可药用载体是常规的，为本领域所熟知。例子包括生理相容的水性和非水性载体、稳定剂、抗氧化剂、溶剂、分散介质、外衣层、抗微生物剂、缓冲液、血清蛋白、等渗和吸收减缓剂等类似物。优选的载体要适于注射进入受试者体内。

可以通过任意合适的递药途经给予所述的拮抗剂以便确保合适的生物利用度。因此，在某些实施方案中，合适的给药途径可以包括静脉内快速浓注、静脉内缓慢浓注或输注。通过其它实施方案，可以通过皮下、肌内、透皮或真皮内注射给予所述的人IL-1Ra。备选的实施方案提供了可以通过粘膜递送，诸如通过吸入或通过鼻咽或口服给药实现的给药。

附图说明

图1.A：人IL-1Ra全程治疗后肿瘤数量，B：人IL-1Ra全程治疗后结肠形态；

图2.A：对照全程治疗后结肠病理图，B：人IL-1Ra全程治疗后结肠病理图；

图3.A：人IL-1Ra末期治疗后肿瘤数量，B：人IL-1Ra末期治疗后结肠形态；

图4.人IL-1Ra末期治疗后不同大小肿瘤的数量统计。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但绝不局限于实施例所述的范围。下面实施例中未表明具体条件的试验方法，通常按照常规的条件。

实施示例1人IL-1Ra全程治疗UC癌变动物模型

1.实验材料

Balb／c小鼠：vehicle组12只，人IL-1Ra组15只；偶氮甲烷(AOM)；2％硫酸葡聚糖钠(2％DSS)。

2.实验方法

取15只小鼠进行一次注射偶氮甲烷(AOM，12mg／kg)+4轮2％硫酸葡聚糖钠(DSS)水喂饮建立了UC癌变的动物模型，其中4轮2％硫酸葡聚糖钠(DSS)水喂饮具体方法为：实验小鼠喂饮DSS水1周后，换成喂饮清水2周，再喂饮DSS水1周，如此循环，总共喂饮4次DSS水。建模开始后进行治疗，分别在每轮喂饮DSS水的第1，3，5天腹腔注射人IL-1Ra，剂量为25mg／kg，观察时间为100天。对照Vehicle组的12只小鼠是注射同体积的缓冲液PBS。

通过肉眼观察实验组及对照组小鼠结直肠交界处的肿瘤数量以及结肠形态。

另外通过HE染色观察，小鼠肠道损伤情况，具体方法如下：

选取部分人IL-1Ra全程治疗后结肠组织和对照组结肠组织分别投入预先配好的固定液中使其蛋白质变性凝固，然后用从低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份，再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，待石蜡完全浸入组织块后进行包埋，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入事先备好的纸盒中，冷却凝固成块即成，将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5-8微米厚，切下的薄片如果皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性；伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。HE染色过程是：将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟；酸水及氨水中分色，各数秒钟；流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻；入70％和90％酒精中脱水各10分钟；入酒精伊红染色液染色2-3分钟；染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明；将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，贴上标笺。光镜检查，进行显微组织彩色照相。

3.实验结果

通过肉眼观察，统计各组小鼠结直肠交界处的肿瘤数量。结果显示本发明所述的人IL-1Ra全称治疗能有效减少结肠病灶部位的肿瘤数量，结果如图1A所示。结肠形态如图图1B所示，结果显示此方案能减轻肠道损伤程度，促进肿瘤上皮细胞的凋亡。

通过HE染色发现，人IL-1Ra全程治疗明显减轻肠粘膜的破坏程度，减少炎性细胞浸润，结果如图2A(对照组)和2B(人IL-1Ra全程治疗)所示。

从以上实验结果显示：人IL-1Ra能有效预防UC的癌变。

实施示例2人IL-1Ra末期治疗UC癌变动物模型

1.实验材料

Balb／c小鼠：vehicle组10只，人IL-1Ra组10只；偶氮甲烷(AOM)；2％硫酸葡聚糖钠(2％DSS)。

2.实验方法

取10只小鼠进行一次注射偶氮甲烷(AOM，12mg／kg)+4轮2％硫酸葡聚糖钠(DSS)水喂饮建立了UC癌变的动物模型，其中4轮2％硫酸葡聚糖钠(DSS)水喂饮具体方法为：实验小鼠喂饮DSS水1周后，换成喂饮清水2周，再喂饮DSS水1周，如此循环，总共喂饮4次DSS水。在末轮DSS水喂饮结束后1周，连续腹腔注射人IL-1Ra，剂量为25mg／kg，总观察时间为100天，对照Vehicle组的10只小鼠是注射同体积的缓冲液PBS。

实验结束后通过肉眼观察实验组及对照组小鼠结直肠交界处的肿瘤数量以及结肠形态，并且取出位于结直肠交界处的肿瘤置于带有刻度的平皿中，分别测量肿瘤的直径，最后统计不同大小肿瘤所占的百分率。

3.实验结果

通过肉眼观察，统计各组小鼠结直肠交界处的肿瘤数量。结果如图3A所示，人IL-1Ra能有效减少结肠病灶部位的肿瘤数量。结肠形态如图3B所示，结果显示人IL-1Ra能缩减肿瘤体积，从而抑制肿瘤的形成。

测量对照组合实验组位于结直肠交界处的肿瘤置肿瘤直径，最后统计不同大小肿瘤所占的百分率。结果如图4所示，经人IL-1Ra末期治疗后的小鼠肿瘤体积整体小于对照vehicle组，体积大于等于2mm的肿瘤比例明显下降，近50％的肿瘤体积小于等于1mm。

以上实验结果显示：人IL-1Ra能有效治疗UC的癌变。

Claims (2)

1.人白介素-1受体拮抗剂在制备治疗溃疡性结肠炎癌变药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述人白介素-1受体拮抗剂氨基酸序列为GenBank号P18510.1所述的序列。