CN107266551B - 一种mg53突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种mg53突变体及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107266551B
CN107266551B CN201610210731.8A CN201610210731A CN107266551B CN 107266551 B CN107266551 B CN 107266551B CN 201610210731 A CN201610210731 A CN 201610210731A CN 107266551 B CN107266551 B CN 107266551B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mutant
protein
ulcer
mg53s189a
column chromatography
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610210731.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107266551A (zh
Inventor
慎东
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mudanjiang Youbo Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Mudanjiang Youbo Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mudanjiang Youbo Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Mudanjiang Youbo Pharmaceutical Co Ltd
Priority to CN201610210731.8A priority Critical patent/CN107266551B/zh
Priority to CN202110181974.4A priority patent/CN112940098A/zh
Publication of CN107266551A publication Critical patent/CN107266551A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107266551B publication Critical patent/CN107266551B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/12—Aerosols; Foams
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/141—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers
    • A61K9/145—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers with organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供一种MG53的突变体及其制备方法。这种突变体为MG53蛋白在Coiled‑coil结构域中的丝氨酸位点突变体，导致了MG53磷酸化的失活。同时，这种MG53蛋白突变体可用于预防或治疗与细胞膜损伤相关疾病，例如与心肌细胞损伤相关疾病、与溃疡相关疾病、具有伤口特别是难愈合伤口的外伤、肠漏和肾脏损伤等。与心肌细胞损伤相关的疾病可包括选自与以下症状相关的疾病中的一种或多种：心肌缺血、心脏缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常和心脏破裂。与溃疡相关疾病包括选自以下的一种或多种：慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病足坏疽、慢性胃溃疡。此外，本申请还提供了包含MG53或其突变体的干粉制剂、喷雾制剂、凝胶制剂和乳剂及它们的制备方法。

Description

一种MG53突变体及其制备方法和应用
发明领域
本发明涉及一种MG53突变体(也可称为MG53蛋白突变体)，以及该MG53突变体预防或治疗与细胞膜损伤相关疾病中的用途，例如与心肌细胞损伤相关疾病、与溃疡相关疾病、具有伤口特别是难愈合伤口的外伤、肠漏和肾脏损伤等。与心肌细胞损伤相关的疾病可包括选自与以下症状相关的疾病中的一种或多种：心肌缺血、心脏缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常和心脏破裂。并且与溃疡相关疾病包括选自以下的一种或多种：慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病足坏疽、慢性胃溃疡。该MG53突变体在保护心脏、治疗细胞死亡导致的心脏疾病方面的同时，避免了同样具有心脏保护功效的MG53所带来的同时伴有的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用，并且这种MG53突变体在溃疡，尤其是慢性溃疡和消化性溃疡，例如糖尿病足溃疡、糖尿病足坏疽、慢性胃溃疡的治疗中尤其有效。
发明背景
MG53是骨骼肌特异性蛋白mitsugumin53，简称MG53或TRIM72。MG53是一种肌肉特异性tripartitemotiffamily(TRIM)家族蛋白。该家族蛋白常含三个特定基序结构，分别称为RING，B-BOX和卷曲结构域(Coiled coil结构域)。它们共同作用结合在细胞不再需要的蛋白质上，将这些蛋白质带上泛素标记以便降解。MG53也是一种细胞膜修复机制的重要组成部分。
在医学应用方面，MG53治疗由细胞凋亡引起的心脏疾病的功效已被接受并成为业内前沿领域的公知。MG53能够对心脏产生保护作用，也就是说可以通过增加MG53的含量保护心脏损伤。但是，MG53同时存在着不可忽视并被视为一大危害的负面效果，MG53含量的增加在保护心脏的同时，会引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征。也就是说MG53在保护心脏的同时，伴有胰岛素抵抗、肥胖和糖尿病等副作用。这是业内所关心的且不希 望其正负面作用共存的一个问题，至今没有解决渠道。
发明概述
本发明提供一种MG53的突变体，其为MG53蛋白在Coiled-coil结构域中的丝氨酸位点突变体。这种MG53蛋白突变体导致了MG53磷酸化的失活。这种MG53蛋白突变体可用于预防或治疗与细胞膜损伤相关疾病，例如与心肌细胞损伤相关疾病、与溃疡相关疾病、具有伤口特别是难愈合伤口的外伤、肠漏和肾脏损伤等。与心肌细胞损伤相关的疾病可包括选自与以下症状相关的疾病中的一种或多种：心肌缺血、心脏缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常和心脏破裂。与溃疡相关疾病包括选自以下的一种或多种：慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病足坏疽、慢性胃溃疡。
特别地，我们发现此种MG53蛋白突变体在保护心脏的同时，避免了同样具有心脏保护功效的MG53所带来的同时伴有的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用。这种MG53突变体在溃疡，例如慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病足坏疽、慢性胃溃疡的治疗中尤其有效。
MG53能够对心脏产生保护作用，也就是说可以通过增加MG53的含量保护心脏损伤。但之后发现，MG53含量的增加在保护心脏的同时，会引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征。也就是说MG53在保护心脏的同时，伴有胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用。为促进MG53蛋白在保护心脏方面能进一步去劣存优，本申请进行大量的科研工作，最主要目的是对MG53蛋白进一步突变，希望能在不引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用等前提下，使突变体保留行使心脏保护功能，但不伴随相应的副作用。
本发明提供一种MG53的突变体，其中在MG53蛋白的Coiled-coil结构域中的丝氨酸突变为除苏氨酸和酪氨酸以外的氨基酸。在一个实施方案中，Coiled-coil结构域中的丝氨酸突变为非极性氨基酸。
在大多数胰岛素靶器官中，人们已经基本认清胰岛素信号网络的大致骨架结构，即IR/IRSs-PI3K-Akt通路；然而，对于影响此信号途径的具体分子机制，人们的研究目前却刚刚起步。MG53能够有效地泛素化胰岛素受体(IR)和胰岛素受体底物1(IRS1)，其中的MG53的RING结构域，特别是氨基酸序列上第十四位的半胱氨酸，对于MG53催化IR和IRS1泛素化是必需的 (CN103965342A)。目前用于治疗溃疡，尤其是慢性皮肤溃疡的现有药物的效果都不太理想。尽管在一些文献，例如CN103275980A和CN101511181B中提示包含MG53的组合物有可能用于治疗溃疡。但现有技术中未进行MG53治疗溃疡的试验研究。
MG53蛋白的Coiled-coil结构域是目前研究比较透彻的一类介导蛋白间相互作用的结构域，在序列上呈现独特的重复单元，在分布上非常广泛，参与膜融合、膜泡转运等许多重要的生命过程。在功能上coiled coil结构域在膜泡转运过程中为蛋白的头部和尾部结构提供足够的空间。此外，Coiled coil结构域还可以作为骨架，招募蛋白形成复合物。调节细胞增值、分化和凋亡信号转到的MAP激酶模块中，组成信号通路。
申请人认为Coiled coil结构域在MG53蛋白参与囊泡运输、信号通路转导中起着重要的作用。因此，申请人选择了MG53蛋白的Coiled coil结构域作为研究对象。MG53Coiled coil结构域中的丝氨酸位点为MG53中的S150、S189和S211三个位点。
并且，申请人发现，在胰岛素信号的调控中，最重要的是磷酸化修饰，蛋白质磷酸化主要发生在两种氨基酸上，一种是丝氨酸(包括苏氨酸)，另一种是酪氨酸。这两类酸磷酸化的酶不一样，功能也不一样，丝氨酸的结构末端含有羟基，可以与磷酸基团结合。磷酸化的过程就是传递磷酸基团。考虑到MG53 Coiled coil结构域非常保守，申请人大胆设想MG53 Coiled coil结构域中的丝氨酸位点极有可能参与体内胰岛素代谢及/或脂代谢，因此发明人构建了MG53 Coiled coil结构域中的丝氨酸位点突变体。
本申请证明了，Coiled coil结构域中的丝氨酸位点突变为除苏氨酸和酪氨酸以外的氨基酸都能实现本发明的预期目的和有益效果。
在一个实施方案中，本发明提供的上述MG53蛋白突变体导致了MG53磷酸化失活，它们在保护心脏的同时，避免了同样具有心脏保护功效的MG53所带来的同时伴有的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用。并且这种MG53突变体还可以用于治疗溃疡，例如慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病足坏疽、慢性胃溃疡。
在一个实施方案中，在MG53突变体中，所述的非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、或蛋氨酸。优选地，非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸和 异亮氨酸。最优选地，该非极性氨基酸为丙氨酸。
在一个实施方案中，当MG53突变体中非极性氨基酸为丙氨酸时，所述的MG53突变体选自选自MG53S150A、MG53S189A、MG53S211A中的任意一种或多种。
在一个实施方案中，MG53突变体的序列的属种包括灵长类动物、大鼠和小鼠。
在一个实施方案中，本申请提供了一种制备MG53突变体的方法，其包括以下步骤：
(1)对野生型MG53进行突变，得到MG53突变体，克隆到质粒中；
(2)在细胞中表达所述MG53突变体质粒；
(3)使用层析例如DEAE柱层析和CM柱层析，任选地Source 30Q柱层析纯化产生的MG53突变体蛋白。
在一个优选的实施方案中，利用定点突变试剂盒对野生型MG53质粒的全长序列进行定点诱变，得到MG53突变体质粒。更优选地，所述野生型MG53质粒是经过经密码子优化的。
在一个优选的实施方案中，在制备MG53突变体的方法中，在DEAE柱层析中，结合液A为20mM Tris，pH 8.0，洗脱液B为20mM Tris和1.0M NaCl，pH 8.0，任选地用A和B的混合物中洗脱液B为5％(体积比)的溶液和/或洗脱液B洗脱。
在一个优选的实施方案中，在制备MG53突变体的方法中，在CM柱层析中，结合液A为20mM PB，pH 6.0，洗脱液B为20mM PB和1.0M NaCl，pH 6.0,任选地用A和B的混合物中洗脱液B为10％的溶液和/或A和B的混合物中洗脱液B为10％-30％(体积比)的梯度的溶液和/或洗脱液B洗脱。
在一个优选的实施方案中，在制备MG53突变体的方法中，在Source 30Q柱层析中，结合液A为20mM Tris，pH 8.5，洗脱液B为20mM Tris和1.0M NaCl，pH 8.5，任选地用洗脱液B洗脱。
在一个方面，本申请提供了包含MG53突变体的药物组合物。优选地，该药物组合物中包含可药用的赋形剂或载体。
在另一个方面，本申请提供的MG53突变体可用于制备用于预防和/或治疗与细胞膜损伤相关疾病的药物组合物。
在一个实施方案中，与细胞膜损伤相关疾病包括选自以下的一种或多 种：与心肌细胞损伤相关疾病、与溃疡相关疾病、具有伤口特别是难愈合伤口的外伤、肠漏和肾脏损伤。
在一个优选的实施方案中，与心肌细胞损伤相关的疾病包括选自与以下症状相关的疾病中的一种或多种：心肌缺血、心脏缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常和心脏破裂。
在一个优选的实施方案中，与溃疡相关疾病包括选自以下的一种或多种：慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病足坏疽、慢性胃溃疡。
在一个方面，本申请提供了包含MG53或本申请的MG53突变体的干粉制剂及其制备方法。在一个实施方案中，制备包含MG53或本申请的MG53突变体的干粉制剂的方法包括以下步骤：
(1)溶解辅料，并将其与MG53或本申请的MG53突变体溶液混合，调整PH值至6.5-8.0，获得包含0.1-2.0mg/ml的蛋白质溶液；
(2)通过过滤除菌和在合适的冷冻干燥条件下冷冻干燥所述包含0.5-2mg/ml的MG53或本申请的MG53突变体溶液获得干粉制剂。
在一个实施方案中，辅料包含选自以下的一种或多种：多羟基化合物、糖类、表面活性剂和聚合物。
在一个优选的实施方案中，多羟基化合物包含选自以下的一种或多种：甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇和聚乙二醇。
在一个优选的实施方案中，糖类包含选自以下的一种或多种：蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、甘露糖和麦芽糖。
在一个优选的实施方案中，表面活性剂包含选自以下的一种或多种：Tween80、十二烷基硫酸钠。
在一个优选的实施方案中，聚合物包含选自以下的一种或多种：聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮。
在一个优选的实施方案中，辅料是甘露醇、组氨酸、蔗糖。更优选地，在包含0.5mg/ml蛋白质的溶液中包含50mg/ml甘露醇、25mg/ml蔗糖和25mg/ml组氨酸。在另一个优选的实施方案中，辅料是蔗糖、甘露醇和Tween-80。
在一个优选的实施方案中，合适的冷冻干燥条件为：
(1)预冻到-45℃保持2个小时，预抽真空至12±2Pa,
(2)90分钟升温至-6℃，保持10个小时，
(3)1小时升温至15℃，保持5小时，
(4)进一步干燥。
在一个方面，本申请提供了包含MG53或本申请的MG53突变体的水针制剂及其制备方法。
在一个实施方案中，制备包含MG53或本申请的MG53突变体的水针制剂的方法包含以下步骤：
(1)用溶剂溶解冻干的MG53或本申请的MG53突变体，
(2)调整PH值，并过滤，
(3)封口并灭菌，从而制成包含MG53或本申请的MG53突变体的水针制剂。在一个实施方案中，溶剂是医学常用溶剂，优选水，例如注射用水或生理盐水。
在一个方面，本申请提供了包含MG53或本申请的MG53突变体的喷雾制剂及其制备方法。在一个实施方案中，制备包含MG53或本申请的MG53突变体的喷雾制剂的方法包括以下步骤：
(1)冻干MG53或本申请的MG53突变体，
(2)用溶剂溶解所述冻干的MG53或本申请的MG53突变体，以配制成包含50ng-100μg/ml MG53或本申请的MG53突变体的喷雾制剂。在一个实施方案中，溶剂是医学常用溶剂，优选水，例如纯化水或生理盐水。
在一个方面，本申请提供了包含MG53或本申请的MG53突变体的凝胶制剂及其制备方法。在一个实施方案中，制备包含MG53或本申请的MG53突变体的凝胶制剂的方法包括以下步骤：
(1)冻干MG53或本申请的MG53突变体，
(2)用溶剂溶解所述冻干MG53或本申请的MG53突变体，配制成凝胶溶剂。
在一个实施方案中，溶剂是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物或卡波姆、甘油、壳聚糖和尼泊金乙酯的混合物。在一个优选的实施方案中，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物是在低温例如4-8℃保存的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。
在一个方面，本申请提供了包含MG53或本申请的MG53突变体的乳剂及其制备方法。在一个实施方案中，制备包含MG53或本申请的MG53突变体的乳剂的方法包括以下步骤：
(1)冻干MG53或本申请的MG53突变体，
(2)用壳聚糖溶液溶解所述冻干MG53或本申请的MG53突变体，加入乳剂基质和甘油，配制成乳剂。在一个优选的实施方案中，乳剂基质包含硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、白凡士林、Tween-80、甘油和水等。
附图简述
图1.MG53结构图及使用的PET-22b载体图谱。图1A,MG53结构图。MG53从N端至C端分别为具有E3连接酶活性的RING结构域(也称作RING手指区域)、B-BOX结构域、Coiled-coil结构域和SPRY结构域。图1B,在构建MG53突变体中使用的载体PET-22b的图谱。PET-22b大小为5.5KB。由图谱可知，PET-22b具有NdeI和XhoI多克隆位点。
图2,将经密码子优化的MG53合成序列和PET-22b质粒进行酶切的琼脂糖凝胶电泳图。图2A中，用NotI单酶切PET-22b质粒的琼脂糖凝胶电泳图，结果验证PET-22b质粒大小正确，为5.5KB，其中MK是1Kb标记(Solarbio)。图2B，将经密码子优化的MG53合成序列(克隆号YB001-1)进行NdeI和XhoI双酶切的琼脂糖凝胶电泳图。MK是1Kb标记(Solarbio)，箭头代表将经密码子优化的MG53合成序列酶切后获得的MG53酶切后片段，大小为1.47Kb。
图3.MG53的密码子优化。在共有序列中大写字母表示的碱基为相同碱基，小写字母表示的碱基为不同碱基。比较野生型MG53和经优化的MG53核苷酸碱基。在不改变氨基酸序列的基础上根据大肠杆菌偏爱密码子对MG53进行密码子优化。密码子采用最优密码子，然后参考mRNA的二级结构进行局部调整，尤其二级结构较为密集的地方，使mRNA的自由能尽可能高，从而易于翻译。
图4.野生型MG53和MG53 S189A核苷酸序列的比较。野生型MG53在565-567位的TCC(对应于189位的丝氨酸)突变为GCC(丙氨酸)。
图5.IPTG诱导后，MG53 S189A在LB培养基中诱导表达的SDS-PAGE图。泳道1为诱导前总蛋白；泳道2-3为IPTG诱导2h和4h后总蛋白表达谱，泳道4为MG53标准品(分子量53kd)，泳道5为蛋白质标记，泳道6为诱导前上清液蛋白，泳道7-8为IPTG诱导2h和4h后上清蛋白表达谱，泳道9为诱导前包涵体，泳道10为诱导4h包涵体蛋白。由此图可以看出在5L的发酵体积下，MG53 S189A诱导表达水平较高，在上清液和包涵体均有表达。
图6.用DEAE柱层析纯化MG53 S189A蛋白的层析图和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图。图6A,用DEAE柱层析纯化MG53 S189A蛋白的层析图，其中的Cond表示电导率，ConcB表示A和B的混合物中洗脱液B的浓度。图6B.用DEAE柱层析纯化MG53 S189A蛋白的SDS-PAGE图。其中的泳道1为离心过滤后样品，泳道2为穿透峰，即指目标蛋白已经被吸附到柱上后流出层析柱的样品，泳道3为A和B的混合物中洗脱液B为5％(体积比)的溶液洗脱获得的样品，泳道4为蛋白质标记；泳道5为MG53标准品，泳道6为A和B的混合物中洗脱液B为5％(体积比)的溶液洗脱获得的样品，泳道7为洗脱液B洗脱获得的样品。
图7.用CM柱层析纯化MG53 S189A蛋白的层析图和SDS-PAGE图。图7A,用CM柱层析纯化MG53 S189A蛋白的层析图，其中的Cond表示电导率，Conc B表示A和B的混合物中洗脱液B的浓度。将在DEAE柱层析纯化MG53 S189A蛋白的过程中，用pH8.0，A和B的混合物中洗脱液B为5％(体积比)的溶液洗脱得到的洗脱峰用CM柱层析纯化得到此层析图。图7B.用CM柱层析纯化MG53 S189A蛋白的SDS-PAGE图。其中的泳道1为上样样品，泳道2为穿透峰，即目标蛋白已经被吸附到柱上后流出层析柱的样品，泳道3-4分别为A和B的混合物中洗脱液B为10％(体积比)的溶液洗脱获得的洗脱峰A、B，泳道5为蛋白质标记；泳道6-8分别为A和B的混合物中洗脱液B为20％(体积比)的溶液洗脱获得的洗脱峰A、B和C，泳道9为A和B的混合物中洗脱液B为30％(体积比)的溶液洗脱获得的洗脱峰，泳道10为洗脱液B洗脱获得的样品。
图8.用Source 30 Q柱层析纯化MG53 S189A蛋白的层析图和SDS-PAGE图。图8A,用Source 30 Q层析纯化MG53 S189A蛋白的层析图。将在CM柱层析纯化MG53 S189A蛋白的过程中，用A和B的混合物中洗脱液B为20％(体积比)的溶液洗脱获得的洗脱峰A、B合并后用Source 30 Q柱层析纯化得到层析图，其中的Cond表示电导率，Conc B表示A和B的混合物中洗脱液B的浓度。图8B.用Source 30 Q柱层析纯化MG53 S189A蛋白的SDS-PAGE图。其中的泳道1为上样样品，泳道2为穿透，指目标蛋白已经被吸附到柱上后流出层析柱的样品，泳道3-4分别为A和B的混合物中洗脱液B为5％(体积比)的溶液洗脱获得的洗脱峰A、B，泳道5为洗脱液B洗脱获得的样品，泳道6为NaOH洗脱获得的洗脱峰，泳道7为蛋白质标记，泳道8为MG53标准品。
图9：MG53标准品和MG53 S189A蛋白对经机械损伤的293T细胞的乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响。
图10：相比于野生型MG53,MG53 S189A蛋白导致AKT S473磷酸化水平降低。各泳道具体为：3和6,野生型MG53；2和5,MG53 S189A蛋白；1和4，BSA，并且，1-3代表未注射胰岛素的大鼠，4-6代表注射胰岛素10min钟后的大鼠。在未注射胰岛素的大鼠中(泳道1-3)，未显示AKT S473磷酸化水平的升高。在注射胰岛素后的大鼠中，相比于野生型MG53(泳道6)和BSA(泳道4)，MG53 S189A蛋白(泳道5)导致AKT S473磷酸化水平显著降低。
图11：相对于对照组,MG53 S189A蛋白导致SD大鼠血糖各个时间点均无显著差异，从而有效地避免了胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用。
图12.相对于对照组，MG53 S189A蛋白促进糖尿病足溃疡成纤维细胞增殖。
图13：MG53 S189A蛋白可治疗糖尿病足部溃疡和坏疽。使用MG53S198A蛋白凝胶制剂后，全部病例足部坏疽情况好转，有效率100％。
发明详述
本发明提供一种MG53突变体，其为MG53蛋白在Coiled-coil结构域中的丝氨酸位点突变体。这种MG53蛋白突变体导致了MG53磷酸化的失活。这种MG53蛋白突变体可用于预防或治疗与细胞膜损伤相关疾病，例如与心肌细胞损伤相关疾病、与溃疡相关疾病、具有伤口特别是难愈合伤口的外伤、肠漏和肾脏损伤等。与心肌细胞损伤相关的疾病可包括选自与以下症状相关的疾病中的一种或多种：心肌缺血、心脏缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常和心脏破裂。与溃疡相关疾病包括选自以下的一种或多种：慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病足坏疽、慢性胃溃疡。
特别地，我们发现此种MG53蛋白突变体在保护心脏的同时，避免了同样具有心脏保护功效的MG53所带来的同时伴有的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用。这种MG53突变体在溃疡，例如慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病足坏疽、慢性胃溃疡的治疗中尤其有效。
MG53
MG53是TRIM家族(The superfamily of tripartite motif-containingproteins)中新发现的一个蛋白质。与其他家族成员不同，它只在骨骼肌和心肌表达。MG53蛋白是由公认具有E3连接酶活性的RING结构域(也可叫做RING手指区域)、B-BOX结构域、Coiled-coil结构域和SPRY结构域组成(图1A)。MG53的主要功能是细胞膜修复，理论上可用于治疗与细胞膜损伤相关疾病，例如与心肌细胞损伤相关疾病、与溃疡相关疾病、具有伤口特别是难愈合伤口的外伤、肠漏和肾脏损伤等。现有技术已经报道了MG53可用于修复伤口，不留疤痕。
MG53与心脏保护
心脏血液流动的堵塞导致急性心肌梗死，产生两种不同类型的心肌损伤，包括由于血流的初始损失引起的缺血性损伤和氧合血流恢复引起的再灌注损伤。尽管通过将代谢转变为无氧酵解和脂肪酸利用以及减少收缩性，心肌可耐受短暂暴露于局部缺血(约20分钟)，但是持续的局部缺血导致不可逆的心肌损伤，造成严重的肌细胞死亡和收缩量(contractilemass)的永久性损失。缺血性心脏的及时再灌注是保持心脏细胞活力的唯一途径。但是由于经活性氧类(ROS)-诱导的氧化应激、线粒体通透性转变通道(MPEP)的诱导、过度收缩和凋亡以及坏死的心肌细胞死亡，再灌注可能激发对心肌的进一步损伤，即缺血/再灌注(IR)损伤。
初期的研究表明，在骨骼肌和心肌中MG53能够作为一种结构蛋白促进细胞膜损伤的修复，同时也能够调节细胞内小泡的转运和骨骼肌细胞再生；另外在心肌中，MG53还参与了缺血预适应过程，它将两条重要的缺血预适应(IPC)分子通路，即PI3K-Akt-GSK3β通路和CaV3通路联系起来，通过促进CaV3和PI3K-p85的相互作用，来活化Akt/GSK3β通路，对心脏缺血/再灌损伤产生保护作用，进而在心脏缺血预处理中发挥重要保护功能(CN101797375A)。因此，MG53具有细胞膜修复功能，参与保护心肌细胞和/或组织，避免由于心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、具有对心力衰竭的修复作用。
MG53与胰岛素代谢
胰岛素是糖与脂肪能量代谢过程中主要的调控激素。胰岛素首先与细胞 表面胰岛素受体(INSR)结合，激活其B亚基的蛋白酪氨酸激酶(protein Tyrosine kinase，PTK)。胰岛素受体底物蛋白(insuin receptor substrate，IRS)作为一种锚定蛋白(dockingprotein)，与含肉瘤同源区段2(srchomology 2domain，SH2)结构域的信号分子结合激活已知至少两条信号途径结合：一条是通过IRS激活磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途径，即IR/IRSs-PI3K-Akt通路；另一条是通过Grb2/SOS和RAS蛋白活化丝裂原激活蛋白激酶(Miogenactivated protein kinase，MAPK)途径。磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)家族，是生长因子超家族信号传导过程中的重要分子，可被多种细胞因子和理化因素激活，是一类特异性地催化磷酯酰肌醇3位羟基磷酸化，产生具有第二信使作用的肌醇脂物质的激酶。在以上两条途径中，胰岛素主要通过IR/IRSs-PI3K-Akt途径介导代谢的调节。AKT处于这一通路的中心环节，AKTSer磷酸化水平可以作为检测对糖代谢，胰岛素抵抗的关键标志物。
随着科学技术的发展，人们已经认识到胰岛素抵抗是II型糖尿病的主要特征和中心环节，胰岛素抵抗是指机体不能利用胰岛素有效地激活胰岛素受体信号通路(1，2)。正常情况下，如上所述，一旦胰岛素与胰岛素受体结合，会催化受体的两聚体化和自身磷酸化，使之充分激活，然后招募并磷酸化胰岛素受体底物(IRSs)(3)，进而导致细胞内广泛的下游信号通路被激活(4)。这些信号通路以协同的方式共同调控着细胞囊泡转运、蛋白质合成、酶的激活与失活以及基因表达等生物过程，从而最终对糖、脂肪和蛋白质这三大营养物质的代谢进行控制(4)。
在II型糖尿病中，由于胰岛素作用缺陷，导致糖、脂肪和蛋白质代谢异常，随病程延长，可致眼、肾、神经、心脏和血管等多系统进行性损害，引起功能衰竭，使患者的生活质量降低，寿命缩短，病死率增高。在我国，II型糖尿病的发病日趋低龄化，给社会和经济发展带来沉重的负担，严重危害人民的生命健康。为此，一定要对其积极防治，而防治的关键就在于改善胰岛素抵抗。
已知MG53基因表达的MG53蛋白仅在心脏和骨骼肌(全身最大的胰岛素靶器官)中表达(5)，推测MG53基因的表达很可能与胰岛素的功能有关。已经发现，MG53基因的表达与胰岛素抵抗之间存在的相互关系：在胰岛素抵抗的情况下，MG53的表达明显上调；MG53的过表达会导致胰岛素抵抗的发生；MG53缺陷显著抑制了高脂饮食诱导的各种病症、促进葡萄糖代谢并且 增强胰岛素敏感性(CN101912617A)。此外，MG53能够有效地泛素化胰岛素受体(IR)和胰岛素受体底物1(IRS1)。MG53的RING结构域，特别是氨基酸序列上第十四位的半胱氨酸，对于MG53催化IR和IRS1泛素化是必需的(CN103965342A)。
MG53能够对心脏产生保护作用，也就是说可以通过增加MG53的含量保护心脏损伤。但随后发现，MG53含量的增加在保护心脏的同时，会引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征。也就是说MG53在保护心脏的同时，伴有胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用。本领域均希望能保留MG53蛋白在保护心脏方面的功能，但同时不引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用。
MG53与溃疡
皮肤溃疡是由各种原因引起的局部组织缺损。患溃疡2周以上创面未愈合者，为慢性皮肤溃疡。慢性皮肤溃疡通常病程较长，治疗进展缓慢，对患者的机体和精神都带来很大的痛苦，并且对患者的生活质量造成很大的影响。糖尿病患者和下肢血管性疾病患者是慢性皮肤溃疡的高发人群。皮肤溃疡按不同的致病因素可分为创伤感染溃疡、压迫性溃疡、静脉性溃疡、糖尿病足及腿部溃疡等。
慢性皮肤溃疡治疗的主要方法是进行全身药物治疗(如使用抗生素和使用中药等)、创面的外科处理(如局部清创和抗感染用药等)及局部促进创面愈合措施。促进体表创面愈合的方法较多，如生长因子药物的使用，激光等物理疗法，局部使用中药外敷等，但这些治疗方法的临床疗效不尽人意。
消化性溃疡是一种粘膜、粘膜肌层及粘膜下层的慢性溃烂，一般涉及胃溃疡和十二指肠溃疡，是一种多发病和常见病。目前，治疗消化性溃疡的药物主要包括降低胃酸的药物、根除幽门螺杆菌感染的药物和增强胃粘膜保护作用的药物。但是目前用于治疗溃疡，尤其是慢性皮肤溃疡的现有药物的效果都不太理想。尽管在一些文献，例如CN103275980A和CN101511181B中提示包含MG53的组合物有可能用于治疗溃疡，但现有技术中未进行MG53治疗溃疡的试验研究。
肠漏
肠漏症是肠道渗透性增加导致的病症，因此也与肠上皮细胞的损伤有关。在肠漏症患者中，用于控制营养物从肠道中释放的细胞被分解，导致肠道渗透的效率下降。在肠漏症患者中，消化过的食物的多数颗粒，通过肠壁进入血液循环。这些颗粒被人体视为传染性病原体，从而触发免疫系统的免疫应答，具体表现为白血细胞的增加、发炎、肿胀和精疲力竭。触发的免疫应答可能会导致更多的病理症状，例如溃疡、疼痛和痉挛等，从而有损机体的健康。
许多情况会导致肠漏，例如一些肠道手术、衰老、某些类型的食物过敏、麸质过敏症和肠易激综合征等。目前，还没有办法彻底治愈肠漏症。已经发现，肠漏通常不是连续的，而是间歇性的突发症状。
具体实施方式
MG53蛋白的Coiled-coil结构域是目前研究比较透彻的一类介导蛋白间相互作用的结构域，在序列上呈现独特的重复单元，在分布上非常广泛，参与膜融合、膜泡转运等许多重要的生命过程。在功能上coiled coil结构域在膜泡转运过程中为蛋白质的头部和尾部结构提供足够的空间。此外，Coiled coil结构域还可以作为骨架，招募蛋白质形成复合物。将细胞增殖、分化和凋亡信号转入MAP激酶模块中，组成信号通路。
申请人认为Coiled coil结构域在MG53蛋白参与囊泡运输、信号通路转导中起着重要的作用。因此，申请人选择了MG53蛋白的Coiled coil结构域作为研究对象。并且，申请人发现，在胰岛素信号的调控中，最重要的是磷酸化修饰，蛋白质磷酸化主要发生在两种氨基酸上，一种是丝氨酸(包括苏氨酸)，另一种是酪氨酸。这两类酸磷酸化的酶不一样，功能也不一样。丝氨酸的结构末端含有羟基，可以与磷酸基团结合，而磷酸化的过程就是传递磷酸基团。Coiled coil结构域中的丝氨酸位点为MG53中的S150、S189和S211三个位点。
考虑到MG53 Coiled coil结构域非常保守，申请人大胆设想MG53 Coiled coil结构域中的丝氨酸位点极有可能参与体内胰岛素代谢及/或脂代谢，因此申请人构建了MG53Coiled coil结构域中的丝氨酸位点突变体。这些丝氨酸位点突变体能导致MG53磷酸化的失活。如上面提到的，胰岛素主要通过IR/IRSs-PI3K-Akt途径介导其代谢调节作用。AKT处于这一通路的中心环节，AKT Ser磷酸化水平可以作为检测是否对糖代谢，胰岛素抵抗的关键标志 物。
申请人发现，这些MG53突变体能导致IR/IRSs-PI3K-Akt通路中的AKT Ser磷酸化水平降低。因此，本申请第一次发现MG53 Coiled coil结构域中的丝氨酸位点参与体内胰岛素代谢及/或脂代谢。
同时，这些丝氨酸位点突变体在保护心脏的同时，避免了同样具有心脏保护功效的MG53所带来的同时伴有的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用。并且这种MG53突变体还可以用于治疗溃疡，尤其是慢性溃疡，消化性溃疡，例如糖尿病足溃疡、糖尿病足坏疽、慢性胃溃疡等。
因此，在一个方面，本发明提供一种MG53的突变体，其中在MG53蛋白的Coiled-coil结域中丝氨酸取代为除苏氨酸和酪氨酸以外的氨基酸。只要这种突变导致MG53Coiled coil结构域中的丝氨酸不能被磷酸化就可以。优选地，MG53 Coiled coil结构域中的丝氨酸突变为非极性氨基酸。在一个实施方案中，在本申请的MG53突变体中，突变的非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、或蛋氨酸。优选地，非极性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。最优选地，该非极性氨基酸为丙氨酸。
在一个优选的实施方案中，当MG53突变体中突变的非极性氨基酸为丙氨酸时，所述的MG53突变体选自选自MG53S150A、MG53S189A、MG53S211A中的任意一种或多种。
在一个实施方案中，MG53突变体的序列的属种包括灵长类动物、大鼠和小鼠。
MG53突变体的表达和纯化
在另一个方面，本申请提供了一种制备本申请的MG53突变体的方法，其包括以下步骤：
(1)对野生型MG53进行突变，得到MG53突变体，克隆到质粒中；
(2)在细胞中表达所述MG53突变体质粒；
(3)使用层析例如DEAE柱层析和CM柱层析，任选地Source 30Q柱层析纯化产生的MG53突变体蛋白。
利用本申请的方法制备的MG53突变体能得到很高的纯度，适合用于直 接制备药物组合物。
1.MG53突变体质粒的构建
获得已知蛋白质的突变体的方法是本领域技术人员公知的。
在一个优选的实施方案中，利用定点突变试剂盒，例如QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit Catalog对野生型MG53质粒的全长序列进行定点诱变，得到MG53突变体质粒。更优选地，所述野生型MG53质粒是经过经密码子优化的。
在一个实施方案中，可以设计合适的引物，在引物中引入突变位点的氨基酸序列，从而在聚合酶链反应(PCR)中对野生型MG53质粒的全长序列进行定点诱变，得到MG53突变体质粒。
为促进MG53突变体的表达和方便其纯化，可以对野生型MG53质粒的全长序列的密码子进行优化。在一个优选的实施方案中，根据大肠杆菌偏爱密码子将MG53进行密码子优化，大肠杆菌密码子使用频率参考Codon Usage Database(http://www.kazusa.or.jp/codon/)。在不改变氨基酸序列的基础上使用Synthetic Gene Designer(http://www.evolvingcode.net/codon/sgd/index.php)，密码子采用最优密码子，然后参考mRNA的二级结构进行局部调整，尤其二级结构较为密集的地方，使mRNA的自由能尽可能高，从而易于翻译(野生型MG53和经优化的MG53密码子的比较参见图3)。
可以使用本领域已知的多种软件设计PCR引物，例如使用Agilent公司在线引物设计软件。优选地，设计的引物满足以下条件：
1)引物在25-45bp之间
2)Tm＝81.5+0.41(％GC)-(675/N)-％错配
3)末端为C或G
4)引物不能被磷酸化(引物合成的时候，一般默认为非磷酸化，如果需要磷酸化，需要3’末端加入磷酸基团)
5)引物可用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)方式纯化。
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是基于凝胶的尺寸和DNA的构象原理来分类DNA，可以分离相差一个碱基的引物，从而实现全长产物和失败序列之间的分离。然后从凝胶中回收目的DNA(引物)，同时配合质谱对DNA进行定性 分析，以保证回收片段(引物)的正确性。
通过使用突变试剂盒，在合适的PCR条件下，进行聚合酶链反应，以得到MG53突变体产物。之后，将得到的MG53突变体产物装载到合适的表达载体中。包含了目的基因序列的载体在转化到感受态细胞后，在合适的抗生素抗性条件下培养，会得到可见的菌落。挑选其中的单菌落，并通过测序从而得到MG53突变体质粒。优选地，所述抗生素抗性是氨苄青霉素抗性。
优选的表达载体是本领域已知的，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、PET-22b、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogene)或pSPORT1(GIBCOBRL)。在一个优选的实施方案中，使用表达载体PET-22b质粒。PET-22b质粒大小为5.5KB，图1B中显示了PET-22b质粒图谱。由图谱可知，PET-22b具有NdeI和XhoI多克隆位点。
在一个优选的实施方案中，使用经密码子优化过的质粒作为模板和高保真DNA聚合酶，分别用相应的突变引物进行PCR反应。在一个实施方案中，PCR反应条件如下：
95℃2min，
进行以下的18个循环：95℃20秒，60℃10秒，68℃3.5min
最后，68℃5min。
优选地，对得到的PCR产物进行限制性酶消化，例如用DPNI消化。之后将PCR产物转化到感受态细胞中。
将得到的PCR产物转化到感受态细胞中的方法是本领域已知的，例如热激法。
2.MG53突变体蛋白的表达
表达蛋白质的方法是本领域技术人员公知的。为了表达MG53突变体蛋白，例如可将MG53突变体基因装载到合适的表达载体。通过表达载体在合适的宿主细胞进行表达。宿主细胞可以是真核或原核细胞。优选地宿主细胞是原核细胞。更优选地宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。在相关实施方案中，宿主细胞是真核细胞。优选地真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。更优选地宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于，CHO、COS或HEK293-F(HEK293-FreeStyle)细胞；或真菌细胞例如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)；或昆虫细胞例如Sf9。
优选的表达载体是本领域已知的，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogene)或pSPORT1(GIBCO BRL)。典型的融合表达载体的其他实例为pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith,D.B.和Johnson,K.S.(1988)Gene67:31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其中谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白和蛋白A分别与重组靶蛋白融合。合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的例子尤其为pTrc(Amann 1988，Gene 69：301-315)和pET 11d(Studier 1999，Methods in Enzymology 185，60-89)。pTrc载体的靶基因表达是基于通过宿主RNA聚合酶进行的杂合trp-lac融合启动子的转录。来自pET 11d载体的靶基因表达是基于T7gn10-lac融合启动子的转录，其由共表达的病毒RNA聚合酶(T7gn1)介导。来自定居的λ-原噬菌体的病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供，所述λ-原噬菌体携带了受lacUV 5启动子转录控制的T7gn1基因。适用于原核生物的其它载体为技术人员所知，这类载体是例如大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR系列如pBR322、pUC系列如pUC18或pUC19、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI，链霉菌属中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361，芽孢杆菌属中的pUB110、pC194或pBD214，棒杆菌属中的pSA77或pAJ667。用于酿酒酵母中表达的载体的实例包括pYep Sec1(Baldari 1987，Embo J.6：229-234)、pMFa(Kurjan 1982，Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz 1987，Gene 54：113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。适用于其它真菌(如丝状真菌)的载体和载体的构建方法，包含在van den Hondel,C.A.M.J.J.,&Punt,P.J.(1991)“Gene transfersystems and vector development for filamentous fungi,in:Applied MolecularGenetics of fungi,J.F.Peberdy等人编著，第1-28页，Cambridge University Press:Cambridge中，或者在More Gene Manipulations in Fungi(J.W.Bennet&L.L.Lasure编著，第396-428页:Academic Press:San Diego)中详细描述的那些载体和载体的构建方法。其它合适的酵母载体是，例如pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23。在一个优选的实施方案中，使用表达载体PET-22b。
在一个优选的实施方案中，在大肠杆菌中表达MG53突变体蛋白。更优 选地，表达条件是在有氧条件下,37℃培养至OD约为6.5时，加入0.5mM IPTG在28℃诱导表达4h。
3.MG53突变体蛋白的纯化
如图5所示，MG53突变体蛋白在诱导表达后的细菌上清液和细菌细胞中均有很高程度的表达。但无论在上清液和细菌细胞中，除MG53突变体蛋白之外，还存在许多的杂质蛋白。因此，需要对表达的MG53突变体蛋白进行纯化，以用于后续的功能研究或用于制备药物组合物。
纯化蛋白质的方法是本领域技术人员公知的，并且可以单独地或者组合地使用。此类方法是例如，使用微生物衍生蛋白质的亲和层析(例如A蛋白或G蛋白亲和层析)、离子交换层析(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子(氨乙基树脂)和混合模式的交换层析)、亲硫吸附(例如用β-巯基乙醇和其他SH配体)、疏水相互作用或芳族吸附层析(例如用苯基-琼脂糖、氮杂嗜砂(aza-arenophilic)树脂或间-氨基苯硼酸(m-aminophenyl boronicacid)、金属螯合亲和层析(例如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和物质)、大小排阻层析，以及预制的电泳方法(例如凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
在一个优选的实施方案中，使用层析例如DEAE柱层析和CM柱层析(参见图6-7)，任选地Source 30Q柱层析纯化MG53突变体蛋白(参见图8)。本申请中采用DEAE柱层析和CM柱层析组合，任选地结合Source 30Q柱层析纯化能得到纯度非常高的MG53突变体蛋白(参见图6-8)，可用于进行各种功能实验和制备药物组合物，及其干粉制剂、喷雾制剂或凝胶制剂。
在一个实施方案中，通过DEAE柱层析初步纯化诱导表达后的包含MG53突变体蛋白的细菌上清液，以收集MG53突变体蛋白。在一个优选的实施方案中，在DEAE柱层析中，结合液A为20mM Tris，pH 8.0，洗脱液B为20mM Tris和1.0M NaCl，pH 8.0，任选地用A和B的混合物中洗脱液B为5％的溶液和/或洗脱液B洗脱。在一个实施方案中，利用GE AKTA PURE 150M全自动层析系统进行DEAE柱层析纯化。
在进行DEAE柱层析纯化后，得到的MG53突变体蛋白能达到的80％的纯度。
为了进一步提高MG53突变体蛋白的纯度，在一个实施方案中，将DEAE 柱层析纯化得到的主要的洗脱峰(pH8.0，A和B的混合物中洗脱液B为5％(体积比)的溶液洗脱得到的洗脱峰)进行CM柱层析。
在一个优选的实施方案中，在CM柱层析中，结合液A为20mM PB，pH6.0，洗脱液B为20mM PB和1.0M NaCl，pH 6.0,任选地用A和B的混合物中洗脱液B为10％的溶液和/或A和B的混合物中洗脱液B为10％-30％的梯度的溶液和/或洗脱液B洗脱。
DEAE柱层析纯化得到的主要的洗脱峰在进行CM柱层析纯化后，得到的MG53突变体蛋白能达到85％以上的纯度。
为了进一步提高MG53突变体蛋白的纯度，在一个优选的实施方案中，将CM柱层析纯化得到的洗脱峰(A和B的混合物中洗脱液B为20％(体积比)的溶液洗脱获得的洗脱峰)进行Source 30Q柱层析纯化。
在一个优选的实施方案中，在Source 30Q柱层析中，结合液A为20mM Tris，pH8.5，洗脱液B为20mM Tris和1.0M NaCl，pH 8.5，任选地用洗脱液B洗脱。
在一个实施方案中，通过DEAE柱层析和CM柱层析纯化后的MG53突变体蛋白可用于制备干粉制剂和/或喷雾制剂和/或凝胶制剂。在另一个实施方案中，通过DEAE柱层析和CM柱层析纯化后的MG53突变体蛋白可用于制备用于预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤所致疾病的药物组合物，或用于预防和/或治疗与溃疡相关疾病的药物组合物。
在Source 30Q柱层析后得到的MG53突变体蛋白能达到的95％以上的纯度，经检测物热源物质和生物活性测定，符合国家注射用蛋白的质量标准。在一个实施方案中，通过DEAE柱层析、CM柱层析和Source 30Q柱层析纯化后的MG53突变体蛋白可用于制备干粉制剂和/或喷雾制剂和/或凝胶制剂。在另一个实施方案中，通过DEAE柱层析、CM柱层析和Source30Q柱层析纯化后的MG53突变体蛋白可用于制备用于预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤所致疾病的药物组合物，或用于预防和/或治疗与溃疡相关疾病的药物组合物。
包含MG53突变体蛋白的药物组合物
在一个方面，本申请提供了包含本发明的MG53突变体蛋白的药物组合物。将本发明的药物组合物与合适的载体、赋形剂及提供改善的转移、递送、 耐受等的其他试剂一起配制。多种适合的制剂可以在所有药剂师已知的处方中发现：Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA。这些制剂包括例如粉剂、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含有小泡(诸如LIPOFECTINTM)的脂质(阳离子的或阴离子的)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(多种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶、和含有碳蜡的半固体混合物。还参见Powell等人，Compendium ofexcipients for parenteral formulations PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。
向患者施用的MG53突变体蛋白的剂量可以根据患者的年龄和尺寸、目标疾病、状况、施用途径等而变化。通常根据体重或体表面积计算优选的剂量。根据病症的严重性，可以调整治疗的频率和持续时间。施用MG53突变体蛋白的有效剂量和时间表可以根据经验来确定；例如，可以通过定期评估监测患者病程，并相应地调整剂量。此外，可以使用本领域中众所周知的方法进行剂量的种间类推(例如,Mordenti等,1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。
多种递送系统是已知的并且可用于施用本发明的药物组合物，例如，脂质体中封装、微粒、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的内吞作用(参见，例如,Wu等,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。导入的方法包括但不限于真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。组合物可以通过任何常规途径施用，例如通过输注或团注、通过上皮或皮肤粘膜(例如，口腔粘膜、直肠粘膜和肠粘膜等)施用，并可以与其他生物学上有活性的试剂一同施用。施用可以是全身性的或局部的。
MG53蛋白突变体在制备用于预防或治疗与细胞膜损伤相关疾病的药物组合物中的用途
如上所述，MG53具有细胞膜修复功能，可用于预防或治疗与细胞膜损伤相关疾病，例如与心肌细胞损伤相关疾病、与溃疡相关疾病、具有伤口特别是难愈合伤口的外伤、肠漏和肾脏损伤等。其中与心肌细胞损伤相关的疾病可包括选自与以下症状相关的疾病中的一种或多种：心肌缺血、心脏缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常和心脏破裂。并且与溃疡相关疾病包括选自以下的一种或多种：慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病足坏疽、慢性胃溃疡。
MG53突变体在制备用于预防和/或治疗与心肌细胞损伤相关疾病的药物组合物中的用途
MG53突变体具有显著的保护心肌缺血再灌注损伤作用
特别地，我们发现此种MG53蛋白突变体在保护心脏的同时，避免了同样具有心脏保护功效的MG53所带来的同时伴有的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用。
MG53蛋白参与保护心肌细胞和/或组织，避免由于心血管疾病和/或心脏缺血/再灌注损伤、低氧损伤、具有心力衰竭的修复作用。申请人发现，本申请提供的MG53突变体具有与MG53相当的对机械损伤的293T细胞的细胞膜的修复作用(参见实施例8，图9)。
由于很多文献报道了MG53对心脏缺血/再灌损伤具有保护作用，我们对本申请的MG53突变体在心脏缺血/再灌损伤中的作用进行了研究。结果显示，与MG53类似，本申请的MG53突变体可以减少心肌缺血梗死区面积，在心肌缺前施用或再灌前施用均有显著的保护心肌缺血再灌注损伤作用(参见实施例9)。
因此，在另一个方面，本申请提供的MG53突变体可用于制备用于预防和/或治疗与心肌细胞损伤相关疾病的药物。在一个优选的实施方案中，与心肌细胞损伤相关的疾病包括选自以下的一种或多种：心肌缺血、心脏缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常、心脏破裂。
MG53突变体不引起胰岛素抵抗等副作用
如上所述，MG53能够对心脏产生保护作用，也就是说可以通过增加MG53的含量保护心脏损伤。但之后发现，MG53含量的增加在保护心脏的同时，会引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征。因此，MG53在保护心脏的同时，伴有胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用。本领域均希望能保留MG53蛋白在保护心脏方面的功能，但同时不引起胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用。
申请人大胆设想MG53 Coiled coil结构域中的丝氨酸位点(MG53中的S150、S189和S211三个位点)极有可能参与体内胰岛素代谢及/或脂代谢，并构建了本申请的MG53Coiled coil结构域中的丝氨酸位点突变体。这些丝氨酸位点突变体能导致MG53磷酸化的失活。此外申请人还研究了MG53突变体对于MG53导致的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用的影响。
胰岛素主要通过IR/IRSs-PI3K-Akt途径介导其代谢调节作用。AKT处于这一通路的中心环节，AKT上Ser磷酸化水平可以作为检测是否对糖代谢，胰岛素抵抗的关键标志物。申请人发现，相比于野生型MG53,本申请的MG53突变体导致AKT的473位的Ser磷酸化水平显著降低(参见实施例10，图10)，从而显著降低了MG53的胰岛素抵抗作用。同时，本申请的MG53突变体不会导致血糖的升高(参见实施例11，图11)。
由此可知，本申请的MG53突变体在行使心脏保护功能的同时，不会导致胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用。
MG53突变体在制备用于预防和/或治疗与溃疡相关疾病中的药物组合物中的用途
如上所述，皮肤溃疡是由各种原因引起的局部组织缺损。患溃疡2周以上创面未愈合者，为慢性皮肤溃疡。慢性皮肤溃疡通常病程较长，治疗进展缓慢，对患者的机体和精神都带来很大的痛苦，对患者的生活质量造成很大的影响。糖尿病患者和下肢血管性疾病患者是慢性皮肤溃疡的高发人群。皮肤溃疡按不同的致病因素可分为创伤感染溃疡、压迫性溃疡、静脉性溃疡、糖尿病足及腿部溃疡等。
慢性皮肤溃疡治疗的主要方法是进行全身药物治疗(如使用抗生素和使用中药等)、创面的外科处理(如局部清创和抗感染用药等)及局部促进创面愈合措施。促进体表创面愈合的方法较多，如生长因子药物的使用，激光等物理疗法，局部使用中药外敷等，但现有的治疗方法的临床疗效不尽人意。
糖尿病足坏疽的病因复杂，其可以由营养不良、动脉粥样硬化和外伤引起。糖尿病血管病变虽然广泛，但病理发展缓慢，有利于与侧支循环的形成，若能在坏疽形成早期进行积极治疗，促进血管和表皮细胞的新生，能有效缓 解或者治愈坏疽。目前所使用的局部药物，如庆大霉素，能抑制局部细菌滋生，但是不能很好促进伤口愈合，而且中药生肌作用周期长，效果欠佳。表皮生长因子虽然有一定的效果，但是很多患者使用，临床表现仍然无效。
目前用于治疗溃疡，尤其是慢性皮肤溃疡的现有药物的效果都不太理想。尽管在一些文献，例如CN103275980A和CN101511181B中提示包含MG53的组合物有可能用于治疗溃疡，但现有技术中未进行MG53治疗溃疡的试验研究。
申请人发现，本申请提供的MG53突变体对溃疡尤其是慢性溃疡和消化性溃疡具有非常好的治疗效果。例如，MG53突变体具有以下作用：
1)能有效地促进糖尿病足溃疡处成纤维细胞增殖，有利于糖尿病足溃疡和腿部溃疡愈合；
2)促进慢性胃溃疡伤口愈合；
3)治疗糖尿病足部溃疡和坏疽，不但安全，而且起效十分迅速，使用方便，是目前治疗糖尿病足部溃疡和坏疽的最佳选择。
因此，本申请提供的MG53突变体可用于制备用于预防和/或治疗与溃疡相关疾病中的药物。在一个优选的实施方案中，与溃疡相关疾病是慢性溃疡和消化性溃疡。在一个优选的实施方案中，慢性溃疡和消化性溃疡包括选自以下的一种或多种：糖尿病足溃疡、糖尿病足坏疽、慢性胃溃疡。
此外，本申请提供的MG53突变体可用于制备用于预防和/或治疗与细胞膜损伤相关疾病，例如具有伤口特别是难愈合伤口的外伤、肠漏和肾脏损伤等的药物组合物。
MG53突变体的干粉制剂、喷雾制剂、凝聚制剂和乳剂的制备
本申请还提供了MG53或本申请的MG53突变体的干粉制剂、喷雾制剂、凝聚制剂和乳剂。同时，还提供了这些制剂的制备方法。这些蛋白质制剂形式可以更方便地运输和保存。
在一个方面，本申请提供了包含MG53或本申请的MG53突变体的干粉制剂及其制备方法。在一个实施方案中，制备包含MG53或本申请的MG53突变体的干粉制剂的方法包括以下步骤：
(1)溶解辅料，并将其与MG53或本申请的MG53突变体溶液混合，调 整PH值至6.5-8.0，获得包含0.1-2.0mg/ml的蛋白质溶液；
(2)通过过滤除菌和在合适的冷冻干燥条件下冷冻干燥所述包含0.5-2mg/ml的MG53或本申请的MG53突变体溶液获得干粉制剂。
本领域已知使蛋白质溶液稳定的常用辅料。具体有以下几类：
1.多羟基化合物
作用机理：使蛋白质表面形成一层水膜，保护蛋白质不受外部疏水基团的侵扰，从而达到保护溶液中蛋白质的目的。
具体辅料例如：甘油，甘露醇，山梨醇，肌醇，聚乙二醇。
2.糖类
作用机理：阻止蛋白质二级结构的改变，对多肽链的伸展和聚集起保护作用。
具体辅料例如：蔗糖，葡萄糖，乳糖，海藻糖，甘露糖，麦芽糖等。
3.表面活性剂
作用机理：离子型表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)可影响蛋白质的变性；但是非离子型表面活性剂(如Tween 80)可防止蛋白质吸附于表面，因而能抑制蛋白质的凝聚和沉淀。
具体辅料例如：Tween 80，十二烷基硫酸钠。
4.聚合物
作用机理：防止蛋白质或其他辅料结晶析出，限制分子的扩散
具体辅料：聚乙二醇，聚乙烯比咯烷酮。
因此，这些常用辅料可用作制备包含MG53或本申请的MG53突变体的干粉制剂的辅料。
在一个实施方案中，辅料包含选自以下的一种或多种：多羟基化合物、糖类、表面活性剂和聚合物。
在一个优选的实施方案中，多羟基化合物包含选自以下的一种或多种：甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇和聚乙二醇。
在一个优选的实施方案中，糖类包含选自以下的一种或多种：蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、甘露糖和麦芽糖。
在一个优选的实施方案中，表面活性剂包含选自以下的一种或多种：Tween80、十二烷基硫酸钠。
在一个优选的实施方案中，聚合物包含选自以下的一种或多种：聚乙二 醇、聚乙烯比咯烷酮。
在一个优选的实施方案中，辅料是甘露醇、组氨酸、蔗糖。更优选地，在包含0.5mg/ml蛋白质的溶液中包含50mg/ml甘露醇、25mg/ml蔗糖和25mg/ml组氨酸。在另一个优选的实施方案中，辅料是蔗糖、甘露醇和Tween-80。
在一个优选的实施方案中，合适的冷冻干燥条件为：
(1)预冻到-45℃保持2个小时，预抽真空至12±2Pa,
(2)90分钟升温至-6℃，保持10个小时，
(3)1小时升温至15℃，保持5小时，
(4)进一步干燥。
在一个方面，本申请提供了包含MG53或本申请的MG53突变体的水针制剂及其制备方法。
水针制剂，指已经溶解了药物的注射液。它是注射剂的一种，一般都装在容器例如安瓿瓶中，使用时，敲开容器进行静脉或者肌肉注射。
在一个实施方案中，制备包含MG53或本申请的MG53突变体的水针制剂的方法包含以下步骤：
(1)用溶剂溶解冻干的MG53或本申请的MG53突变体，
(2)调整PH值，并过滤，
(3)封口并灭菌，从而制成包含MG53或本申请的MG53突变体的水针制剂。在一个实施方案中，溶剂是医学常用溶剂，优选水，例如注射用水或生理盐水。
在一个方面，本申请提供了包含MG53或本申请的MG53突变体的喷雾制剂及其制备方法。在一个实施方案中，制备包含MG53或本申请的MG53突变体的喷雾制剂的方法包括以下步骤：
(1)冻干MG53或本申请的MG53突变体，
(2)用溶剂溶解所述冻干的MG53或本申请的MG53突变体，以配制成包含50ng-100μg/ml MG53或本申请的MG53突变体的喷雾制剂。在一个实施方案中，溶剂是医学常用溶剂，优选水，例如纯化水或生理盐水。
在一个方面，本申请提供了包含MG53或本申请的MG53突变体的凝胶制剂及其制备方法。在一个实施方案中，制备包含MG53或本申请的MG53突变体的凝胶制剂的方法包括以下步骤：
(1)冻干MG53或本申请的MG53突变体，
(2)用溶剂溶解所述冻干MG53或本申请的MG53突变体，配制成凝胶溶剂。
在一个实施方案中，溶剂是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物或卡波姆、甘油、壳聚糖和尼泊金乙酯的混合物。在一个优选的实施方案中，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物是在低温例如4-8℃保存的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。
在一个方面，本申请提供了包含MG53或本申请的MG53突变体的乳剂及其制备方法。在一个实施方案中，制备包含MG53或本申请的MG53突变体的乳剂的方法包括以下步骤：
(1)冻干MG53或本申请的MG53突变体，
(2)用壳聚糖溶液溶解所述冻干MG53或本申请的MG53突变体，加入乳剂基质和甘油，配制成乳剂。在一个优选的实施方案中，乳剂基质包含硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、白凡士林、Tween-80、甘油和水等。
实施例
提供了以下实施例，以帮助理解本发明，在所附权利要求中给出了本发明的真正的范围。应当理解，在不背离本发明精神的情况下，可以对给出的方法进行修改。
实施例1：MG53突变体质粒MG53 S189A的构建
1.MG53基因优化，合成以及MG53 S189A亚克隆和质粒的制备：
以下是在构建MG53 S189A质粒中使用的试剂及其来源：
试剂：T4DNA连接酶来源：NEB批号：00309971，
PET-22b质粒，来源：Novagen公司，
感受态细胞来源：天根生化科技(北京)有限公司(CB105-02)，
实验用水来源：ddH2O批号：10/13/2015，
内切酶NdeI来源：NEB货号：R0111S，
内切酶XhoI来源：NEB货号：R5146S。
此外，表1中列出了在构建MG53 S189A质粒中使用的设备及其来源
表1,在构建MG53 S189A质粒中使用的设备
仪器名称 型号 厂家
离心机 MEGAFUGE 8R Thermo
电泳仪 DYY-8C型电泳仪 北京君意东方
凝胶成像系统 JY04S-3C型 北京君意东方
电泳槽 DYCP-31DN型电泳槽
电热恒温培养箱 DHP-9082上海恒科
超净工作台 DL-CJ-2ND 东联哈尔；
单道精密移液器 0.5-10ul/20-200ul/100-1000ul Eppendorf
PCR仪 伯乐 T100
TS-1摇床 TS-1 其林贝尔
1.1经密码子优化的野生型MG53质粒的构建
1.11野生型MG53质粒的密码子优化
根据大肠杆菌偏爱密码子将MG53进行密码子优化，大肠杆菌密码子使用频率参考Codon Usage Database(http://www.kazusa.or.jp/codon/)。在不改变氨基酸序列的基础上使用Synthetic Gene Designer(http://www.evolvingcode.net/codon/sgd/index.php)，密码子采用最优密码子，然后参考mRNA的二级结构进行局部调整，尤其二级结构较为密集的地方，使mRNA的自由能尽可能高，从而易于翻译。
详细的克隆方案和优化的基因序列如下：
NdeI----密码子优化序列—XhoI
MG53天然密码子序列：
ATGTCGGCTGCGCCCGGCCTCCTGCACCAGGAGCTGTCCTGCCCGCTGTGCCTGCAGCTGTTCGACGCGCCCGTGACAGCCGAGTGCGGCCACAGTTTCTGCCGCGCCTGCCTAGGCCGCGTGGCCGGGGAGCCGGCGGC GGATGGCACCGTTCTCTGCCCCTGCTGCCAGGCCCCCACGCGGCCGCAGGCACTCAGCACCAACCTGCAGCTGGCGCGCCTGGTGGAGGGGCTGGCCCAGGTGCCGCAGGGCCACTGCGAGGAGCACCTGGACCCGCTGAGCATCTACTGCGAGCAGGACCGCGCGCTGGTGTGCGGAGTGTGCGCCTCACTCGGCTCGCACCGCGGTCATCGCCTCCTGCCTGCCGCCGAGGCCCACGCACGCCTCAAGACACAGCTGCCACAGCAGAAACTGCAGCTGCAGGAGGCATGCATGCGCAAGGAGAAGAGTGTGGCTGTGCTGGAGCATCAGCTGGTGGAGGTGGAGGAGACAGTGCGTCAGTTCCGGGGGGCCGTGGGGGAGCAGCTGGGCAAGATGCGGGTGTTCCTGGCTGCACTGGAGGGCTCCTTGGACCGCGAGGCAGAGCGTGTACGGGGTGAGGCAGGGGTCGCCTTGCGCCGGGAGCTGGGGAGCCTGAACTCTTACCTGGAGCAGCTGCGGCAGATGGAGAAGGTCCTGGAGGAGGTGGCGGACAAGCCGCAGACTGAGTTCCTCATGAAATACTGCCTGGTGACCAGCAGGCTGCAGAAGATCCTGGCAGAGTCTCCCCCACCCGCCCGTCTGGACATCCAGCTGCCAATTATCTCAGATGACTTCAAATTCCAGGTGTGGAGGAAGATGTTCCGGGCTCTGATGCCAGCGCTGGAGGAGCTGACCTTTGACCCGAGCTCTGCGCACCCGAGCCTGGTGGTGTCTTCCTCTGGCCGCCGCGTGGAGTGCTCGGAGCAGAAGGCGCCGCCGGCCGGGGAGGACCCGCGCCAGTTCGACAAGGCGGTGGCGGTGGTGGCGCACCAGCAGCTCTCCGAGGGCGAGCACTACTGGGAGGTGGATGTTGGCGACAAGCCGCGCTGGGCGCTGGGCGTGATCGCGGCCGAGGCCCCCCGCCGCGGGCGCCTGCACGCGGTGCCCTCGCAGGGCCTGTGGCTGCTGGGGCTGCGCGAGGGCAAGATCCTGGAGGCACACGTGGAGGCCAAGGAGCCGCGCGCTCTGCGCAGCCCCGAGAGGCGGCCCACGCGCATTGGCCTTTACCTGAGCTTCGGCGACGGCGTCCTCTCCTTCTACGATGCCAGCGACGCCGACGCGCTCGTGCCGCTTTTTGCCTTCCACGAGCGCCTGCCCAGGCCCGTGTACCCCTTCTTCGACGTGTGCTGGCACGACAAGGGCAAGAATGCCCAGCCGCTGCTGCTCGTGGGTCCCGAAGGCGCCGAGGCCTGA
MG53密码子优化序列：
ATGAGCGCAGCACCGGGTCTGCTGCATCAAGAACTGAGCTGTCCG CTGTGTCTGCAGCTGTTTGATGCACCGGTTACCGCAGAATGTGGTCATAGCTTTTGTCGTGCATGTCTGGGTCGTGTTGCCGGTGAACCGGCAGCAGATGGCACCGTTCTGTGTCCGTGTTGTCAGGCACCGACCCGTCCGCAGGCACTGAGCACCAATCTGCAGCTGGCACGTCTGGTTGAAGGTCTGGCACAGGTTCCGCAGGGTCATTGTGAAGAACATCTGGACCCGCTGAGCATTTATTGTGAACAGGATCGTGCACTGGTTTGTGGTGTTTGTGCAAGCCTGGGTAGCCATCGTGGTCATCGTCTGCTGCCTGCAGCCGAAGCACATGCACGTCTGAAAACCCAGCTGCCGCAGCAGAAACTGCAGCTGCAAGAAGCATGTATGCGTAAAGAAAAAAGCGTTGCAGTTCTGGAACATCAGCTGGTTGAAGTTGAAGAAACCGTTCGTCAGTTTCGTGGTGCAGTTGGTGAACAGCTGGGTAAAATGCGTGTTTTTCTGGCAGCACTGGAAGGTAGCCTGGATCGTGAAGCAGAACGTGTTCGTGGTGAAGCCGGTGTTGCACTGCGTCGTGAACTGGGTAGCCTGAATAGCTATCTGGAACAGCTGCGTCAGATGGAAAAAGTTCTGGAAGAAGTTGCAGATAAACCGCAGACCGAATTTCTGATGAAATATTGTCTGGTTACCAGCCGTCTGCAGAAAATTCTGGCAGAAAGTCCGCCTCCGGCACGTCTGGATATTCAGCTGCCGATTATTAGTGATGATTTTAAATTTCAGGTGTGGCGCAAAATGTTTCGTGCACTGATGCCTGCACTGGAAGAACTGACCTTTGATCCGAGCAGCGCACATCCGAGCCTGGTTGTTAGCTCTAGCGGTCGTCGTGTTGAATGTAGCGAACAGAAAGCACCTCCGGCAGGCGAAGATCCGCGTCAGTTTGATAAAGCAGTTGCAGTTGTTGCCCATCAGCAGCTGAGCGAAGGTGAACATTATTGGGAAGTTGATGTTGGTGATAAACCGCGTTGGGCACTGGGTGTTATTGCAGCGGAAGCACCGCGTCGTGGTCGTCTGCATGCAGTTCCGAGCCAGGGTCTGTGGCTGCTGGGTCTGCGTGAAGGTAAAATTCTGGAAGCCCATGTTGAAGCAAAAGAACCGCGTGCACTGCGTAGTCCGGAACGTCGTCCGACCCGTATTGGTCTGTATCTGAGCTTTGGTGATGGTGTTCTGAGCTTTTATGATGCAAGTGATGCAGATGCATTAGTACCGCTGTTTGCATTTCATGAACGTCTGCCTCGTCCGGTTTATCCGTTTTTTGATGTTTGCTGGCATGATAAAGGCAAAAATGCACAGCCGCTGCTGCTGGTTGGTCCGGAAGGTGCAGAAGCATAA
根据上述MG53密码子优化序列，委托南京金斯瑞生物公司进行经密码 子优化后MG53序列全合成。野生型MG53和经优化的MG53密码子的比较可见于图3。
1.12经密码子优化的野生型MG53质粒的构建
设计经密码子优化的MG53正向引物FP1和反向引物FP2，利用PCR从合成的经密码子优化的MG53序列扩增密码子优化片段，并且引入NdeI和XhoI酶切位点。PCR反应条件为：94℃5min；94℃40秒，54℃40秒，72℃5min，30个循环；72℃延伸10min。
用于扩增经密码子优化的MG53的正向引物FP1(5’-3’):
GGAGATCATATGATGAGCGCAGCACCGGGTCT
用于扩增经密码子优化的MG53的反向引物FP2(5’-3’):
TGGTGGTGCTCGAGTTATTATGCTTCTGCAC
使用PET-22b质粒作为载体进行经密码子优化的野生型MG53和突变体质粒MG53S189A的构建。PET-22b质粒大小为5.5KB，图1B中显示了PET-22b质粒图谱。由图谱可知，PET-22b具有NdeI和XhoI多克隆位点。
PET-22b质粒购买自Novagen公司，购买后转化到BL-21感受态细胞中，涂平板(氨苄青霉素抗性)，挑选单克隆，按照天根质粒提取说明书步骤提取质粒。用NotI单酶切PET-22b质粒，之后进行0.8％琼脂糖凝胶，验证PET-22b质粒的大小正确，为5.5KB(图2A)。
同时将PET-22b质粒和合成的经优化的MG53序列进行NdeI和XhoI双酶切，然后参照上海生工胶回收试剂盒(货号SK8131 100BP-10KB)说明书回收酶切后的MG53序列和PET-22b质粒(图2B)。胶回收步骤如下：
1)从琼脂糖胶中割下5.5kb和1.47kb左右的目的片段，称重约为0.2g；
2)加入3倍的Buffer B2,50℃水浴5min溶胶；。
3)将溶胶液移入吸附柱，8,000×g离心30秒，倒掉收集管中液体；
4)加入500ul wash solution 9,000×g离心30秒，倒掉收集管中液体；
5)空吸附柱于9,000×g离心1min；
6)将吸附柱放于一个灭菌的1.5ml离心管中，加入50ul Elution buffer,室温静置1min,保存待用。
用T4连接酶连接酶切后的经优化的MG53和PET-22b，将连接产物进行转化和菌落筛选，并对筛选到的菌落进行双酶切和测序分析，确定是否是经优化的MG53序列。
将构建好的质粒送北京三博远志生物公司进行测序，结果证明得到的质粒是经优化的MG53质粒。至此完成了野生型MG53质粒的优化，合成，亚克隆和质粒制备。
1.2.MG53 S189A质粒的构建
设计用于构建MG53 S189A质粒的引物，利用突变试剂盒通过PCR获得MG53 S189A质粒。
1.21通过PCR获得MG53 S189A突变体
引物设计：
利用Agilent公司在线引物设计软件：
引物原则：
1)引物在25-45bp之间
2)Tm＝81.5+0.41(％GC)-(675/N)-％错配
3)末端为C或G
4)引物不能被磷酸化(引物合成的时候，一般默认为非磷酸化，如果需要磷酸化，需要在3’末端加入磷酸基团)
5)引物可用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)方式纯化。
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是基于凝胶的尺寸和DNA的构象原理来分类DNA，可以分离相差一个碱基的引物，从而实现全长产物和失败序列之间的分离。然后从凝胶中回收目的DNA(引物)，同时配合质谱对DNA进行定性分析，以保证回收片段(引物)的正确性。
设计的引物为：
用于扩增MG53 S189A的正向引物(5’-3’):
Ctggcagcactggaaggtgccctggatcgtg
用于扩增MG53 S189A的反向引物(5’-3’):
Cacgatccagggcaccttccagtgctgccag
通过北京六合华大基因科技股份有限公司合成上述引物。采用 QuikChangeSite-Directed Mutagenesis Kit Catalog#2and 200519(10reactions)突变试剂盒经密码子优化的的MG53质粒进行突变，得到第189位丝氨酸突变为丙氨酸的MG53突变体。
具体步骤如下：
1)引物稀释：将引物于4000rpm离心5min，10D干粉质量约为33ug，因此每OD加入33ul无菌水，配成100ng/ul浓度。取50ul作为实验用，其余保存于-20℃。
2)以上述构建的经密码子优化的MG53质粒250ng作为模板，使用高保真DNA聚合酶，用于扩增MG53 S189A的正向引物和反向引物进行PCR反应。反应体系为25ul
PCR反应条件为：
95℃2min，
进行以下的18个循环：95℃20秒，60℃10秒，68℃3.5min
最后，68℃5min。
1.22MG53 S189A质粒的转化和鉴定
对得到的PCR产物进行DPNI酶切以消除PCR过程中添加的模板(经密码子优化的MG53质粒)，确保转化的都是阳性克隆，从而提高成功率。DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切。经密码子优化的MG53质粒是从大肠杆菌里提取出来的双链超螺旋质粒并具有甲基化，而PCR产物均未被甲基化。因此DpnI酶能够特异性地切割模板(经密码子优化的MG53质粒)而不会影响PCR产物，从而去掉模板(经密码子优化的MG53质粒)同时保留PCR产物(MG53S189A)。
将DPNI酶切产物转化到感受态细胞中。具体地，每个PCR反应体系加入1ul DPNI酶，轻轻均匀混匀后，37℃孵育5min，即进行了PCR产物的DPNI消化。
然后通过热激法将经酶切后的PCR产物转化到感受态细胞XL10-Gold。具体步骤如下：感受态细胞XL10-Gold于冰上溶解，分装于4个15ml Polypropylene Tube(提前预冷)，每管加入2ulβ-ME，混匀后冰上孵育2min，加入4ul经DPNI酶切后的样品，混匀后，冰上孵育30min，42℃热激30秒，冰上放置2min，加入500ul预热的NZY+培养基，37℃220rpm孵育1h，涂氨 苄青霉素抗性LB平板。37℃过夜培养。
最后，通过测序鉴定构建的MG53 S189A质粒。具体地，将MG53 S189A质粒涂布在氨苄青霉素抗性LB平板后第二天挑选单菌落，摇菌，提取质粒送北京三博远志生物公司进行测序。测序正确的MG53 S189A质粒序列：
MG53 S189A序列：
ATGAGCGCAGCACCGGGTCTGCTGCATCAAGAACTGAGCTGTCCGCTGTGTCTGCAGCTGTTTGATGCACCGGTTACCGCAGAATGTGGTCATAGCTTTTGTCGTGCATGTCTGGGTCGTGTTGCCGGTGAACCGGCAGCAGATGGCACCGTTCTGTGTCCGTGTTGTCAGGCACCGACCCGTCCGCAGGCACTGAGCACCAATCTGCAGCTGGCACGTCTGGTTGAAGGTCTGGCACAGGTTCCGCAGGGTCATTGTGAAGAACATCTGGACCCGCTGAGCATTTATTGTGAACAGGATCGTGCACTGGTTTGTGGTGTTTGTGCAAGCCTGGGTAGCCATCGTGGTCATCGTCTGCTGCCTGCAGCCGAAGCACATGCACGTCTGAAAACCCAGCTGCCGCAGCAGAAACTGCAGCTGCAAGAAGCATGTATGCGTAAAGAAAAAAGCGTTGCAGTTCTGGAACATCAGCTGGTTGAAGTTGAAGAAACCGTTCGTCAGTTTCGTGGTGCAGTTGGTGAACAGCTGGGTAAAATGCGTGTTTTTCTGGCAGCACTGGAAGGTGCCCTGGATCGTGAAGCAGAACGTGTTCGTGGTGAAGCCGGTGTTGCACTGCGTCGTGAACTGGGTAGCCTGAATAGCTATCTGGAACAGCTGCGTCAGATGGAAAAAGTTCTGGAAGAAGTTGCAGATAAACCGCAGACCGAATTTCTGATGAAATATTGTCTGGTTACCAGCCGTCTGCAGAAAATTCTGGCAGAAAGTCCGCCTCCGGCACGTCTGGATATTCAGCTGCCGATTATTAGTGATGATTTTAAATTTCAGGTGTGGCGCAAAATGTTTCGTGCACTGATGCCTGCACTGGAAGAACTGACCTTTGATCCGAGCAGCGCACATCCGAGCCTGGTTGTTAGCTCTAGCGGTCGTCGTGTTGAATGTAGCGAACAGAAAGCACCTCCGGCAGGCGAAGATCCGCGTCAGTTTGATAAAGCAGTTGCAGTTGTTGCCCATCAGCAGCTGAGCGAAGGTGAACATTATTGGGAAGTTGATGTTGGTGATAAACCGCGTTGGGCACTGGGTGTTATTGCAGCGGAAGCACCGCGTCGTGGTCGTCTGCATGCAGTTCCGAGCCAGGGTCTGTGGCTGCTGGGTCTGCGTGAAGGTAAAATTCTGGAAGCCCATGTTGAAGCAAAAGAACCGCGTGCACTGCGTAGTCCGGAACGTCGTCCGACCCGTATTGGTCTGTAT CTGAGCTTTGGTGATGGTGTTCTGAGCTTTTATGATGCAAGTGATGCAGATGCATTAGTACCGCTGTTTGCATTTCATGAACGTCTGCCTCGTCCGGTTTATCCGTTTTTTGATGTTTGCTGGCATGATAAAGGCAAAAATGCACAGCCGCTGCTGCTGGTTGGTCCGGAAGGTGCAGAAGCATAA
此外，图4中显示了野生型MG53和MG53 S189A核苷酸序列的比较结果。
实施例2：MG53突变体质粒MG53 S189A的表达和纯化
2.1MG53突变体质粒MG53 S189A的表达
在表达时使用的培养基如下：
1)摇床培养基(400ml)：LB培养基(胰蛋白胨2％；酵母粉1％；氯化钠2％；100μg/mlAmp 1％)；
2)发酵培养基(5L)：(胰蛋白胨12％；酵母粉24％；甘油4ml/L；磷酸氢二钾16.4％；磷酸二氢钾2.32％；100μg/ml Amp 1％)。
3)补料培养基：50％甘油。补料培养基用于补充发酵后期菌体所需要的碳源和能源。
在发酵过程的中后期，在发酵培养基中的碳源和能源消耗完后使用补料培养基补充菌体所需要的碳源和能源。
根据以下步骤表达MG53 S189A：
1)活化MG53 S189A菌种
以0.2％接种量将MG53 S189A质粒接种到摇床培养基，在160rpm，36℃过夜培养至OD约0.6左右。之后将所得到的菌液接种至发酵罐。
2)MG53 S189A的表达
在发酵罐中以以下条件培养MG53 S189A菌液：转速300rpm，培养温度37℃，起始空气流量2L/min，维持溶氧量(DO)在20％以上，pH7.0左右。当菌液的OD值达到约为6.5左右，降温至28℃；加入0.5mM IPTG诱导4h。
3)使用SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS PAGE)电泳检测MG53 S189A蛋白的表达
制备SDS-PAGE上样的样品：
取诱导前菌液，诱导后2h和4h的菌液，并通过离心分离，得到菌体沉淀。用20～40μl PBS(pH＝8.0)重悬，加入等体积的2×SDS上样缓冲液，煮 沸加热5min；
进行SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离；
考马斯亮蓝染色3小时后，脱色观察结果。结果如图5所示。由SDS-PAGE可知，在5L的发酵体积下，MG53 S189A蛋白诱导表达水平较高，在诱导表达后的细菌上清液和细菌细胞(包涵体)中均有很高程度的表达。
2.2MG53突变体MG53 S189A蛋白的纯化
由上可知，MG53突变体蛋白在诱导表达后的细菌上清液和细菌细胞中均有很高程度的表达。但无论在上清液和细菌细胞中，除MG53突变体蛋白之外，还存在许多的杂质蛋白。因此，需要对表达的MG53突变体蛋白进行纯化，以用于后续的功能研究。
2.21通过DEAE柱层析纯化MG53 S189A蛋白
首先用DEAE柱层析纯化在诱导表达后的包含MG53 S189A蛋白细菌上清液。利用GEAKTA PURE 150M全自动层析系统进行DEAE柱层析进行初步纯化，以收集MG53 S189A蛋白。
在DEAE柱层析中使用的试剂和装置：
层析柱：体积50ml(预装柱26*20cm)
层析缓冲液：
结合液A：20mM Tris，pH 8.0
洗脱液B：20mM Tris+1.0M NaCl，pH 8.0
通过以下步骤进行DEAE柱层析纯化：
制备样品：
取上述诱导表达后的M53 S189A菌体189g于1900ml结合液A中混匀。每杯加入结合液A 370ml、在8℃以10000rpm离心15min，一共离心5次，取上清液制备样品；
DEAE柱层析：
样品用0.45um滤膜过滤后上样，上样流速2ml/min。用A和B的混合物中 洗脱液B为5％(体积比)的溶液、洗脱液B洗脱，获得了A和B的混合物中洗脱液B为5％(体积比)的溶液pH8.0的洗脱峰分别为380ml和190ml；
SDS-PAGE
如上所述对DEAE柱层析获得的洗脱峰进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，以鉴定DEAE柱层析后M53 S189A蛋白的纯度。
如图6所示，通过DEAE柱层析纯化，去除了大部分的杂质蛋白，得到的MG53 S189A蛋白能达到80％的纯度。
2.22通过CM柱层析纯化MG53 S189A蛋白
为了进一步提高MG53突变体蛋白的纯度，将DEAE柱层析纯化得到的主要的洗脱峰(pH8.0，A和B的混合物中洗脱液B为5％(体积比)的溶液洗脱得到的洗脱峰)进行CM柱层析。
在CM柱层析中使用的试剂和装置：
层析柱：体积25ml(预装柱26*20cm)
层析缓冲液：
结合液A：20mM PB，pH 6.0
洗脱液B：20mM PB+1.0M NaCl，pH 6.0
通过以下步骤进行CM柱层析纯化：
CM柱层析：
将在DEAE柱层析纯化中获得的pH8.0、A和B的混合物中洗脱液B为5％(体积比)的溶液洗脱峰合并后上样，以8ml/min的流速进行上样和/或洗脱。以A和B的混合物中洗脱液B为10％的溶液冲洗，之后以A和B的混合物中洗脱液B为10％-30％的梯度的溶液洗脱6个柱体积(6CV)共300ml，最后用洗脱液B洗脱。用A和B的混合物中洗脱液B为20％(体积比)的溶液洗脱获得的洗脱峰A、B的体积分别为42ml和51ml。
SDS-PAGE
如上所述对CM柱层析获得的洗脱峰进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，以鉴定CM柱层析后M53 S189A蛋白的纯度。
如图7所示，通过CM柱层析进一步纯化，MG53 S189A蛋白的纯度进一步提高，能达到85％的纯度。通过DEAE柱层析和CM柱层析纯化后的MG53S189A蛋白可用于制备干粉制剂和/或喷雾制剂和/或凝胶制剂，也可用于制备用于预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤所致疾病的药物组合物，或用于预防和/或治疗与溃疡相关疾病的药物组合物。
2.23通过SOURCE 30Q柱纯化MG53 S189A蛋白
为了进一步提高MG53突变体蛋白的纯度，将CM柱层析纯化得到的洗脱峰(A和B的混合物中洗脱液B为20％(体积比)的溶液洗脱获得的洗脱峰)进行Source 30Q柱层析纯化。
在SOURCE 30Q柱中使用的试剂和装置：
层析柱：体积5ml
层析缓冲液：
结合液A：20mM Tris，pH 8.5
洗脱液B：20mM Tris+1.0M NaCl，pH 8.5
通过以下步骤进行SOURCE 30Q柱层析纯化：
SOURCE 30Q柱：
将在CM柱层析纯化中以A和B的混合物中洗脱液B为20％(体积比)的溶液洗脱获得的洗脱峰A、B的体积合并后上样，以4ml/min的流速进行上样和/或洗脱。用B冲洗。用洗脱液B洗脱获得的洗脱峰A、B的体积分别为42ml和47ml。
SDS-PAGE
如上所述对SOURCE 30Q柱获得的洗脱峰进行SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，以鉴定SOURCE 30Q柱层析后获得的M53 S189A蛋白的纯度。
如图8所示，通过SOURCE 30Q柱进一步纯化，MG53 S189A蛋白的纯度进一步提高，能达到95％以上的纯度。通过DEAE柱层析、CM柱层析和 SOURCE 30Q柱纯化后的MG53 S189A蛋白可用于制备干粉制剂和/或喷雾制剂和/或凝胶制剂，也可用于制备用于预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤所致疾病的药物组合物，或用于预防和/或治疗与溃疡相关疾病的药物组合物。
2.24测序验证经纯化的MG53 S189A蛋白的氨基酸序列
通过上述纯化方法，可以得到95％以上纯度的MG53 S189A蛋白。我们通过测序验证经纯化的MG53 S189A蛋白的氨基酸序列是否正确。
按照Edman法测MG53 S189A蛋白的N-末端序列，其序列如下：
MSAAPGLLHQELSCPLCLQLFDAPVTAECGHSFCRACLGRVAGEPAADGTVLCPCCQAPTRPQALSTNLQLARLVEGLAQVPQGHCEEHLDPLSIYCEQDRALVCGVCASLGSHRGHRLLPAAEAHARLKTQLPQQKLQLQEACMRKEKSVAVLEHQLVEVEETVRQFRGAVGEQLGKMRVFLAALEGALDREAERVRGEAGVALRRELGSLNSYLEQLRQMEKVLEEVADKPQTEFLMKYCLVTSRLQKILAESPPPARLDIQLPIISDDFKFQVWRKMFRALMPALEELTFDPSSAHPSLVVSSSGRRVECSEQKAPPAGEDPRQFDKAVAVVAHQQLSEGEHYWEVDVGDKPRWALGVIAAEAPRRGRLHAVPSQGLWLLGLREGKILEAHVEAKEPRALRSPERRPTRIGLYLSFGDGVLSFYDASDADALVPLFAFHERLPRPVYPFFDVCWHDKGKNAQPLLLVGPEGAEA*
此测序结果证明得到的蛋白为重组MG53 S189A蛋白。
通过检测物热源物质和生物活性测定，证明MG53 S189A蛋白符合国家注射用蛋白的质量标准。
实施例3.MG53 S189A蛋白的干粉制剂的制备
3.1使用甘露醇、组氨酸、蔗糖等制备MG53 S189A蛋白的干粉制剂
辅料：甘露醇、组氨酸、蔗糖等。
制备方法：
溶解辅料，同时将溶解的辅料与相应的MG53 S189A蛋白原液混合，调整PH值到6.5，从而得到包含0.5mg/ml的MG53 S189A蛋白、50mg/ml甘露醇、25mg/ml蔗糖、25mg/ml组氨酸的溶液。将得到的溶液过滤除菌，在下述冻干条件下冷冻干燥，即为冻干制剂，按照需要确定分装规格。
冻干条件：
1)预冻到-45℃保持2个小时，预抽真空至12±2Pa,
2)90分钟升温至-6℃，保持10个小时，
3)1小时升温至15℃，保持5小时，
4)进一步干燥，即为冻干制品。
3.2使用甘露醇、蔗糖、Tween-80等制备MG53 S189A蛋白的干粉制剂
此外，我们还使用其他的辅料例如甘露醇、蔗糖、Tween-80等得到了稳定性更好的MG53 S189A蛋白的干粉制剂。
辅料：甘露醇、蔗糖、Tween-80等。
制备方法：
在200ml 2mg/ml的MG53 S189A蛋白原液中加入2g蔗糖,6g甘露醇,10mg Tween-80，充分混匀后，调整PH值到7.4。经过滤除菌,在下述冷冻干燥条件下冷冻干燥，即为冻干制剂，按照需要确定分装规格。
冷冻干燥条件：
1、预冻到-45℃保持2个小时，预抽真空至12±2Pa,
2、90分钟升温至-6℃，保持10个小时，
3、1小时升温至15℃，保持5小时，
4、进一步干燥，即为冻干制品。
3.3不同辅料配方的稳定性比较
为比较不同辅料配方对得到的MG53 S189A蛋白干粉制剂的复溶性的影响，我们进行了以下实验。仪器设备：冻干试验机、10ml瓶、塞、盖、天平
试验过程：制备样品4ml/瓶，8种辅料配方，8瓶样品。
分别使用以下各组辅料配方，按照3.2的方法冻干MG53 S189A蛋白。
配方1：仅含蔗糖0.5％ 20mg
配方2：仅含蔗糖1％ 40mg
配方3：仅含甘露醇0.5％ 20mg
配方4：仅含甘露醇1％ 40mg
配方5：仅含甘露醇0.25％ 10mg
配方6：含Tween-80 0.005％ 0.2mg，蔗糖1％ 40mg，甘露醇3％ 120mg
配方7：仅含蔗糖1％ 40mg，但不加样品
配方8：仅含甘露醇1％ 40mg，但不加样品
之后，加入生理盐水溶解获得的冻干制剂。经过滤震摇后，配方1-5号均有絮状、针状物质析出，配方6得到澄清的溶液。此实验说明，使用辅料配方6制备的MG53 S189A蛋白冻干制剂的复溶性和稳定性最优。
实施例4.MG53 S189A蛋白的喷雾制剂的制备
将MG53 S189A蛋白的干粉制剂用生理盐水或医学常用溶剂溶解。溶解后的MG53S189A蛋白浓度为50ng～100ug/ml，将其装入符合要求的喷雾器中，即可喷雾使用。
实施例5.MG53 S189A蛋白的凝胶制剂的制备
5.1利用聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物制备制备MG53 S189A蛋白的凝胶制剂
利用聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物(Pluronic)的低温呈液态，体温凝聚成胶的特点，将其配制成MG53 S189A蛋白的干粉制剂的凝胶伴侣。
通过以下步骤制备MG53 S189A蛋白的凝胶制剂：
1.将MG53 S189A蛋白制成干粉制剂
2.用低温优选地4-8℃保存的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物溶解所述MG53S189A蛋白干粉制剂，配制成MG53 S189A蛋白的凝胶溶剂。
使用时，注射器吸出凝胶溶剂涂抹患处，体温作用即形成凝胶覆盖患处，并释放MG53 S189A产生治疗作用。
凝胶伴侣与MG53 S189A蛋白干粉制剂溶解配制方法与上述喷雾制剂中生理盐水溶解干粉制剂的配制方法相同。
5.2利用卡波姆、甘油和壳聚糖溶液制备MG53 S189A蛋白的凝胶溶剂
之后，我们对凝胶溶剂的配方进行了优化得到了性能更好的MG53 S189A蛋白的凝胶制剂。
具体制备方法如下：
1.加50g水溶胀0.5g的卡波姆934，用10％NaOH调节pH至7.0，
2.加入10g甘油，混合均匀，作为凝胶基质；
3.用5ml 2％的壳聚糖溶液搅拌溶解MG53S189A蛋白的冻干制剂1.83g(相当于60mg MG53S189A蛋白)和尼泊金乙酯0.12g后，将其加入到凝胶基质中，混合均匀，即得到MG53 S189A蛋白的凝胶制剂。
实施例6.MG53 S189A蛋白的水针制剂的制备
我们还制备了MG53 S189A蛋白的水针制剂。
制备时使用的试剂如下：
MG53 S189A蛋白 1g
注射用水 2000ml
制成 1000支
具体制备方法如下：
1.在洁净条件下，用适量注射用水全部溶解1g MG53 S189A蛋白，
2.用少量活性炭处理，过滤，加注射用水至2000ml，调PH值，
3.精滤，灌装，封口并灭菌，从而制成规格为2ml：2mg的MG53S189A小容量水针制剂。
实施例7.MG53 S189A蛋白乳剂的制备
我们还制备了MG53 S189A蛋白乳剂。
具体制备方法如下：
1.取硬脂酸15g、单硬脂酸甘油酯8.5g和白凡士林10g在水浴中加热至80℃混匀，获得油相；
2.将3g Tween-80、7.5g甘油和90g水分别加热至80℃，获得水相；
3.将油相慢慢加入水相中，边加边搅拌搅拌，冷凝，得乳剂基质(pH6.9)；
4.用5ml2％的壳聚糖溶液溶解冻干粉1.125g(相当于36mgMG53S189A蛋白)，加入乳剂基质30g，5g甘油并混合均匀，从而得到了MG53 S189A蛋白乳剂。
实施例8.MG53 S189A蛋白对机械损伤的293T细胞的细胞膜的修复作 用
实验原理：在体外培养的细胞中加入适量玻璃珠，在摇床上摇动，玻璃珠会对细胞的细胞膜造成物理损伤，释放细胞内乳酸脱氢酶(LDH)。MG53可以修复细胞膜。因此可以根据LDH释放水平判断MG53突变体MG53 S189A蛋白对细胞膜的修复功能。
实验材料：玻璃珠(400目)；293T细胞；LDH试剂盒(TaKaRa-MK401)；DPBS；DMEM培养基；胰酶；96孔板；板式离心机；移液枪(100μL，1000μL)；排枪(100μl)；酶标仪；摇床。
实验方法
1)293T细胞培养30h。
2)铺96孔板
a.实验组每孔加入30μl含玻璃珠的DPBS和20μl的系列稀释梯度的MG53或MG53S189A蛋白溶液，蛋白质系列稀释梯度的浓度为200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、25ug/ml、12.5ug/ml、6.75ug/ml；
b.背景组每孔加入30μl的DPBS和20μl的系列稀释梯度的MG53或MG53 S189A蛋白溶液，蛋白质系列稀释梯度的浓度为200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、25ug/ml、12.5ug/ml、6.75ug/ml。
c.消化293T细胞并计数(密度为1.2-1.5*106细胞/ml)，每孔加入50μl细胞悬液。
3)室温下将96孔板置于120rpm的摇床上作用15分钟。
4)振摇后立即在4400rpm下离心5分钟。
5)离心后将50μl上清液转移至新96孔板中；
6)根据LDH试剂盒说明书配置LDH试剂，每孔加入50μlLDH试剂。
7)室温4400rpm下离心1分钟(去气泡，以免影响读数)。
8)避光反应15min，使用酶标仪于490nm下，检测OD值。
结果如图9所示。这些结果证明，在处于对数生长期的293T细胞中加入不同浓度的标准品和MG53 S189A蛋白，MG53标准品和MG53 S189A的LDH活性无明显差异。因此，MG53S189A具有与MG53相当的对293T细胞的机械损伤的细胞膜的修复作用。
实施例9.MG53 S189A蛋白对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用
1.药物：MG53 S189A，2mg/瓶，冻干粉剂，4℃冰箱保存。
2.分组与施用
动物分为假手术组(NS 1ml/只)、模型组。将在不同时间经静脉施用MG53 S189A的动物分为3个亚组，即MG53 S189A蛋白1组(缺血前30分钟施用组)，MG53 S189A蛋白2组(再灌注前30分钟施用组)，MG53 S189A蛋白3组(再灌注后1小时施用组)，每组6只。
使用的动物：SD大鼠，即Sprague Dawley)远交群大鼠。SD大鼠是由美国的Sprague&Dawley农场的R.W.Dawley用杂合的雄性大鼠和Wistar雌性大鼠杂交后育成的白化封闭群大鼠。
3.实验方法
通过结扎雄性SD大鼠(220-260g)的冠状动脉左前降支(LAD)来制备急性心肌损伤模型，水合氯醛腹腔注射麻醉各大鼠。直肠监测体温并采用热调节的爪垫保持大鼠的体温为37℃。开胸手术后，6-0丝线结扎左冠状动脉45分钟造成心肌缺血，然后打开进行再灌注。关闭胸腔，使大鼠恢复清醒。24小时后，沿上次的切口再次开胸，同样的位置再次结扎左冠状动脉，剪下心脏，进行主动脉插管，1％依文思蓝溶液3ml缓慢注入主动脉，去掉右心房和右心室，将左心室从心尖部冠状切面切成5片，每片厚度为2mm。认为经依文思蓝染色的区域为非缺血区，没有被依文思蓝染色的区域是危险区(AAR)。采用数码相机对依文思蓝染色后心肌两面拍照。拍照后将心脏置于1.5％TTC溶液，37℃温育8～10min，对AAR中活的心肌细胞区域染色(TTC染色后，梗死区域为灰白色，而活的心肌为红色)。再次采用数码相机对每张心肌切片的两面拍照，使用Motic images advanced 3.2Image软件进行分析。计算梗死区域、AAR、非缺血占左心室百分比，评估MG53 S189A蛋白在缺血前30分钟施用、再灌注前15分钟施用、再灌注后1小时施用对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用。
缺血前，再灌注后6h、24h收集血清，检测血清中乳酸脱氢酶(LDH)的水平。
4.实验结果
如下表2所示，模型组梗死区面积(％)与危险区面积(％)基本相近，而MG53 S189AB30min组、L45min组、R60min组梗死区面积(％)明显小于相对应组的危险区面积(％)，其中B30min、L45min组梗死区面积(％)显著低于模型对照组(p<0.01，p<0.05)。
表2，MG53 S189A对心肌缺血再灌注损伤的影响
Figure BDA0000959104950000441
注：B30min表示缺血前30分钟施用
L45min表示灌注前45分钟施用
R60min表示再灌注后60分钟施用
由以上实验数据可知，与MG53相似，MG53 S189A蛋白可以减少心肌缺血梗死区面积，在心肌缺前施用或再灌前施用均有显著的保护心肌缺血再灌注损伤作用。
实施例10.MG53 S189A蛋白降低了AKT的磷酸化水平
以前的研究发现MG53在保护心脏的同时，伴有胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用。胰岛素主要通过磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)途径参与糖和脂肪代谢，而AKT处于PI3K途径的中心环节，因此AKT的Ser磷酸化水平可以作为检测是否对糖代谢，胰岛素抵抗的关键标志物。为了检验MG53 S189A是否也会类似于MG53，在保护心脏的同时，也会导致胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用，我们通过蛋白免疫印迹，检测了MG53S189A对AKT的Ser磷酸化水平的影响。
采用随机分组法，用Excel软件给予30只颈静脉插管SD大鼠中的每一只动物一个随机数，按照随机数从小到大的顺序排序，将动物分为6组。前三组为不注射胰岛素组，后三组为最后一次施用结束10min腹腔注射胰岛素。前三组和后三组又分别分为对照组(BSA),MG53 S189A(S189A)蛋白组,MG53野生型组(WT)。施用蛋白质的浓度为0.01mg/mL，施用剂量为0.037mg/kg，施用容积为3.7ml/kg。实验结束后，取动物心脏组织做蛋白免疫印迹，检测P-AKT S473磷酸化(P-AKT S473)水平。p-Akt抗体来自Cell SignalingTechnology公司。
实验结果显示于图10中。这些结果显示在未注射胰岛素的大鼠(泳道1-3)中，未显示AKT S473磷酸化水平的升高。在注射胰岛素后，相比于野生型MG53(泳道6)和BSA(泳道4)，MG53 S189A(泳道5)导致AKT S473磷酸化水平显著降低，从而证明了相比于MG53，MG53S189A在保护心脏的同时显著降低了胰岛素抵抗的副作用。
实施例11.MG53 S189A蛋白不会导致大鼠血糖升高
以前的研究发现MG53在保护心脏的同时，会伴有胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用。同时，我们还进行了MG53 S189A蛋白静脉注射到SD大鼠中的血糖探索实验，以评估MG53 S189A蛋白导致的血糖升高水平是否达到病理标准。
供试品:
名称：MG53 S189A蛋白
批号：2014-5-16
包装：西林瓶
规格：2.0mg/瓶
性状：白色冻干粉
保存条件：2～8℃，干燥。
对照品
名称：牛血清白蛋白
批号：201421
规格：20.5mg/瓶
性状：白色冻干粉
保存条件：-20℃
溶剂1
名称：氯化钠注射液(生理盐水)
生产单位：山东华鲁制药有限公司
批号：D13102301
浓度：0.9％
规格：100mL:0.9g，100mL/瓶
性状：无色澄明液体，味微咸。
保存条件：密闭保存
溶剂2
名称：盐酸
生产单位：北京化工厂
批号：20140311
浓度：36％～38％
规格：100mL，0.9g，100mL/瓶
性状：无色澄明液体
保存条件：室温密闭保存
牛胰岛素
名称：牛胰岛素
批号：I5500
生产单位：SIGMA
规格：25mg/瓶
性状：白色或米色粉末
保存条件：-20℃
溶液配制及分析
MG53 S189A蛋白溶液：MG53 S189A蛋白干粉放至室温，用注射器吸取生理盐水2.0mL直接打入西林瓶中(不要打开瓶塞)，轻轻涡旋混合，以便完全溶解。最终配制浓度为1mg/mL的MG53 S189A蛋白溶液，配制完成后， 采用0.22μm的滤膜过滤。
牛血清白蛋白溶液对照：将牛血清白蛋白干粉取出后放至室温，用一次性注射器吸取氯化钠注射液适量，直接打入西林瓶中(不要打开瓶塞)。轻轻涡旋混合，以便牛血清白蛋白完全溶解于氯化钠注射液。溶解后用氯化钠注射液稀释至浓度为1mg/mL的牛血清白蛋白溶液，配制完成后，采用0.22μm的滤膜过滤。
胰岛素：先用超纯水稀释盐酸至pH＝2～3，用0.22μm的滤膜过滤。再用pH为2～3的无菌稀盐酸将放至室温的胰岛素干粉稀释至2mg/mL。用氯化钠注射液将一部分的2mg/mL的胰岛素溶液稀释至0.01mg/mL(无菌配制)。剩余的2mg/mL的胰岛素溶液保存在-20℃备用。
配制溶液保存与处置：MG53 S189A蛋白溶液及牛血清白蛋白溶液对照在施用前于2～8℃或冰盒中保存运输。施用结束后剩余的MG53 S189A蛋白溶液、对照品及胰岛素按照医疗垃圾进行处理。
实验系统：
实验动物
种属&品系：颈静脉插管SD大鼠及正常SD大鼠
等级：SPF级
实验动物来源：北京维通利华实验动物技术有限公司
计划施用开始周龄：6～8周龄
动物数及性别：预计订购颈静脉插管SD大鼠购入17只，雄性，试验使用15只，雄性。预计订购正常SD大鼠17只，雄性，试验使用15只，雄性。
多余动物处理：购买的未使用动物在施用后2天内转交兽医统一处理。
选择理由
实验动物选择的理由：本试验没有其他已知可以替代活体动物实验的方法；本试验选用SD大鼠，是目前公认的可以作为已用于或拟用于人类的药物进行毒理学研究试验的标准动物模型，其具备有大量的背景数据，并且在研究相同或类似供试品时发现是合适的动物模型。
动物数量选择的理由：在满足研究目的、科学标准和法规要求的前提下，使用尽可能少的动物。
主要适应症：急性心肌梗塞
施用途径：静脉注射
临床拟用疗程：单次施用
动物分组和施用剂量
采用随机分组法，用Excel软件对15只颈静脉插管SD大鼠中的每只动物分配一个随机数，按照随机数从小到大的顺序排序，将动物分为2组(1～2组)，每组5只动物。按同样的方法将15只正常SD大鼠随机分为3组(4～6组)，每组5只动物。
表3，各组动物施用剂量和分组后的动物号
Figure BDA0000959104950000481
注：*表示1～2组首次施用剂量为12mg/kg，首次施用约24h后，再次施用剂量为6mg/kg。
#表示1～2组首次施用容量为12mL/kg，首次施用约24h后，再次施用容量 为6mL/kg。
施用
施用途径：尾静脉注射，按照约2～3ml/min的速度推注。
施用剂量及容量：按照上表信息进行
施用方法：根据动物施用前体重，确定施用量。使用合适规格的一次性无菌注射器吸取供试品或对照品，在动物尾静脉注射给予相应剂量的供试品或对照品。
施用频率及周期：1～3组分2次施用，施用间隔约24h；4～6组单次施用。
胰岛素注射：1～3组所有动物末次施用结束10min及4～6组所有动物施用结束10min后，腹腔注射胰岛素，施用浓度为0.01mg/mL，施用剂量为0.037mg/kg，施用容积为3.7ml/kg。
施用途径选择理由：根据委托单位提供的信息和相关指导原则，选择尾静脉注射施用，与临床拟用途径接近。
体重
检测动物：1～6组所有动物
检测时间：动物接收后，分组前、首次施用前测定体重。动物施用前称重用于施用量的计算。
禁食
1～3组所有动物在首次及末次施用前禁食过夜，1～3组动物首次施用后2h内禁食。4～6组动物施用前及采集心脏前禁食过夜。
血糖检测
检测动物：1～3组所有动物
检测时间：0min(首次施用前)、首次施用后15min、30min、1h、2h、8h、24h。
测定方法：将试纸插入测量口，确保三个接触条朝向操作者，试纸条要推到底，注意不能弯曲。此时仪器自动打开。按▲或▼按钮来更改血糖仪显示的代码，使其与试纸瓶上的代码相匹配。通过颈静脉插管取血。当显示屏 上闪烁血滴符号时，将试纸与血滴对齐，使试纸顶部的狭小通道几乎碰触血滴边缘。通道轻轻碰触血滴边缘后，血液将被吸入狭小通道内。当确认窗口变满，血糖仪的读数从5变为1后，血糖测量结果将会显示在屏幕上。屏幕上还将显示血糖测量单位、测量日期和时间。
检测仪器：血糖仪，其厂家及型号为美国强生公司生产的ONETOUCH Ultra Easy稳豪倍易型血糖仪。
检测到的动物血糖数据如表4中所示
表4，检测到的动物血糖数据
Figure BDA0000959104950000501
同时，对得到的动物血糖数据进行了分析，结果显示于图11中。表4和图11显示，相对于牛血清白蛋白对照组，在注射MG53 S189A蛋白的动物中的血糖各个时间点均无显著差异。这些数据表明MG53 S189A蛋白在保护心脏的同时有效地避免了MG53导致的胰岛素抵抗、肥胖、糖尿病和代谢综合征等副作用。
实施例12：MG53 S189A蛋白促进糖尿病足溃疡处成纤维细胞增殖，有利于糖尿病足溃疡和腿部溃疡愈合
目前用于治疗溃疡，尤其是慢性皮肤溃疡的现有药物的效果都不太理想。尽管在一些文献，例如CN103275980A和CN101511181B中提示包含MG53的组合物有可能用于治疗溃疡，但现有技术中未进行MG53治疗溃疡的试验研究。
我们研究了MG53突变体MG53 S189A蛋白在溃疡，尤其是慢性溃疡和消化性溃疡中的作用。
首先，我们利用了糖尿病足溃疡处成纤维细胞模型研究了MG53 S189A蛋白在治疗糖尿病溃疡中的作用。
材料和方法：用含10％的新生小牛血清的RPMI1640培养基将对数生长期的单层糖尿病足溃疡成纤维细胞配制成单细胞悬液。之后以每孔2*105个细胞接种96孔板，每孔体积200ul。实验分5组，其中第一组空白对照组，第二组阴性对照组，第3-5组分别为0.1、10、100μg/ml MG53 S189A蛋白，将每组中的物质加入到成纤维细胞中。培养7天，每组设两个重复孔，在490nm测定各孔光吸收值，取平均值；绘制生长曲线。
试验结果如图12所示。由这些结果可知，添加MG53 S189A蛋白的成纤维细胞的生长曲线最高，其生长较对照组和阴性对照组明显增强。由此可知，MG53 S189A蛋白促进糖尿病足溃疡成纤维细胞增殖，有利于糖尿病足溃疡和腿部溃疡愈合。
实施例13：MG53 S189A蛋白促进大鼠糖尿病足溃疡处伤口愈合
我们利用大鼠糖尿病溃疡模型研究了MG53 S189A蛋白在治疗糖尿病足溃疡中的作用。
构建大鼠糖尿病溃疡模型
利用磁片循环压迫的方法，构建大鼠糖尿病溃疡模型。首先用2％的戊巴比妥钠以30mg/kg腹腔麻醉大鼠，然后对大鼠进行脱毛，再用碘酒和酒精对脱毛区进行消毒。每只大鼠在手术前肌肉注射8-10IU的青霉素进行预防性治疗，然后在大鼠背部前端正宗线做一深至筋膜的切口，置入磁片于大鼠左 前肢或右前肢的皮下，第二切口位于背部后端正中线。磁片植入后的大鼠随机分5组，空白对照组，假模型组，MG53 S189A蛋白低剂量组、中剂量、高剂量组。通过外源磁片于内体移植磁片相互吸引，形成压力，造成皮肤表面区部缺血，每次缺血2小时后，再将外源磁片拿下，让局部血流恢复30min，如此进行一个循环。每只大鼠每日进行3个连续循环，连续进行4天。判断溃疡的标准是皮肤变黑、变硬，针刺不出血。
施用MG53 S189A蛋白
以MG53 S189A蛋白干粉伴以凝胶伴侣制剂的形式施用MG53 S189A蛋白。用注射器混匀低剂量组(0.1mg/ml MG53 S189A蛋白)、中剂量(0.5mg/ml MG53 S189A蛋白)、高剂量组(5mg/ml MG53 S189A蛋白)涂于溃疡部位。每天施用一次，疗程1个月，一个月后评价疗效。取溃疡皮肤和对照皮肤，10％甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，光学显微镜下观察。
结果证明，使用不同剂量的MG53 S189A蛋白，均能导致患糖尿病溃疡大鼠的恢复，有效率100％。所有病例1周之内溃疡明显好转，在施用10天至1月中，溃疡基本痊愈。这些实验证明MG53 S189A蛋白促进了糖尿病足溃疡处伤口愈合。
实施例14：MG53 S189A蛋白促进大鼠慢性胃溃疡的伤口愈合
为了研究MG53 S189A蛋白在治疗其他类型的慢性溃疡中的作用，我们利用大鼠慢性胃溃疡溃疡模型研究了MG53 S189A蛋白在治疗慢性胃溃疡中的作用。
构建大鼠慢性胃溃疡模型
用微量注射器吸取0.05ml 20％醋酸溶液，经胃窦前壁透过肌层注射胃粘膜。注射后3-4天，可形成界限清楚的溃疡。溃疡深达肌层，与人类消化性溃疡相似，从而构建了大鼠慢性胃溃疡模型。慢性胃溃疡模型大鼠随机分5组，空白对照组、假模型组、MG53 S189A蛋白低剂量组、中剂量、高剂量组。
施用MG53 S189A蛋白
将慢性胃溃疡模型大鼠随机分5组，分别为空白对照组，假模型组，MG53 S189A蛋白低剂量组、中剂量和高剂量组。使用注射器将低剂量(0.1mg/ml)、中剂量(0.5mg/ml)和高剂量(5mg/ml)的MG53 S189A蛋白灌注到对应组的大鼠胃中。每天灌胃1次，持续2个月。2个月后评价疗效。取各组大鼠的胃粘膜，10％甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，光学显微镜下观察。
结果证明，使用不同剂量的MG53 S189A蛋白，均能导致患慢性胃溃疡大鼠的恢复，有效率100％。所有病例在1月之内溃疡明显好转，施用MG53 S189A的45天至2月中，慢性胃溃疡基本痊愈。这些实验证明MG53 S189A蛋白促进了慢性胃溃疡的伤口愈合。
实施例15：MG53 S189A蛋白促进人糖尿病足部溃疡和坏疽的伤口愈合
我们研究了MG53 S189A蛋白在治疗人慢性溃疡，例如糖尿病足部及腿部溃疡中的作用。
糖尿病足的诊断标准
糖尿病足的诊断标准，按照国际wagner的分级及1995年中华医学会第一届全国糖尿病足学术会制定的分级标准，共分为0-V级。0级：肢端供血不足；I级：皮肤有开放性病灶；II级：感染病灶已侵犯深部肌肉组织；III级：肌腱韧带破坏；IV级：骨质缺损；V级：大部分或者全足坏疽，甚至累计踝关节和小腿。
患者情况
10例患者均为常规换药方法无效和应用表皮生长因子无效或过敏的病例。男性5例，女性5例；年龄最大75岁，最少40岁；糖尿病史最长30年，最短5年，均为2型糖尿病。诊断分级病例：I级3例，II级5例，III级2例。
施用MG53 S189A蛋白
局部治疗，凡有感染灶、溃烂坏疽者，外科清创去除溃烂坏疽，然后在创面上均匀涂抹1mg/ml MG53 S189A凝胶制剂，也可以按照相同剂量使用冻干制剂，然后无菌纱布覆盖，每天施用一次，疗程一个月，一个月评价疗效。
疗效判定标准
显效：7-15天溃烂伤口好转及愈合；
有效：10-20天伤口好转及愈合；
无效：在治疗30天内病情无好转，反而继续加重及恶化或者15天以上局部伤口无变化。
结果显示于图13中。这些实验显示，使用MG53S198A蛋白凝胶制剂后，全部病例足部坏疽情况好转，有效率100％，其中显著有效率95％。III级病例2例，曾经尝试多种治疗方法无效，患者使用MG53 S189A蛋白之后1个月，创面90％以上愈合。所有病例1周之内小创面明显愈合，大创面好转，施用14天左右，大创面渗液、溃烂情况消失，逐渐形成新鲜肉芽肿。并且在使用MG53 S189A蛋白凝胶制剂后，患者未出现明显不良反应，耐受良好。
由上可知MG53 S189A蛋白可以有效地治疗糖尿病足部溃疡和坏疽，并且无任何副作用。
糖尿病足坏疽的病因复杂，可以由营养不良、动脉粥样硬化和外伤引起。糖尿病血管病变虽然广泛，但病理发展缓慢，有利于与侧支循环的形成，若能在坏疽形成早期进行积极治疗，促进血管和表皮细胞的新生，能有效缓解或者治愈坏疽。目前所使用的局部药物，如庆大霉素，谁让能抑制局部细菌滋生，但是不能很好促进伤口愈合，而且中药生肌作用周期长，效果欠佳。表皮生长因子虽然有一定的效果，但是很多患者使用，临床表现仍然无效。
MG53 S189A蛋白是人体内自身分泌蛋白，特异存在于骨骼肌和心肌，具有很强的细胞修复功能，其干粉制剂可以保证无菌，局部用药，不但安全，而且起效十分迅速，使用方便，是目前治疗糖尿病足部溃疡和坏疽的最佳选择。
参考文献：
1.S.Matthaei，M.Stumvoll，M.Kellerer，H.U.Haring，Endocr Rev 21，585(Dec，2000).
2.C.M.Taniguchi，B.Emanuelli，C.R.Kahn，Nat Rev Mol Cell Biol 7，85(Feb，2006).
3.X.J.Sun et al.，Nature 352，73(Jul 4，1991).
4.A.R.Saltiel，C.R.Kahn，Nature 414，799(Dec 13，2001).
5.C.X.Cai et al.，Nature Cell Biology 11，56(Jan，2009)。
Figure IDA0000959105020000011
Figure IDA0000959105020000021
Figure IDA0000959105020000031
Figure IDA0000959105020000041
Figure IDA0000959105020000051
Figure IDA0000959105020000061
Figure IDA0000959105020000071
Figure IDA0000959105020000081
Figure IDA0000959105020000091

Claims (42)

1.mitsugumin 53 (MG53)突变体，其特征在于，MG53的Coiled-coil 结构域中的丝氨酸位点S189突变为选自以下的任意一种：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或蛋氨酸。
2.制备权利要求1的MG53突变体的方法，其包括以下步骤：
（1）对野生型MG53的基因进行突变，将得到的突变体MG53的基因克隆到质粒中；
（2）在细胞中表达所述MG53突变体质粒；
（3）使用层析纯化产生的MG53突变体蛋白。
3.根据权利要求2的方法，其中所述层析为选自以下的任一种或多种：DEAE柱层析、CM柱层析和Source 30Q柱层析。
4.根据权利要求2的方法，其中所述突变是利用定点突变试剂盒对野生型MG53质粒的全长序列进行定点诱变，得到所述MG53突变体质粒。
5.根据权利要求4的方法，其中所述野生型MG53质粒是经密码子优化的。
6.根据权利要求3的方法，其中在所述DEAE柱层析中，结合液A为20mM Tris，pH 8.0，洗脱液B为20mM Tris 和1.0 M NaCl，pH 8.0。
7.根据权利要求6的方法，其中在所述DEAE柱层析中，用A和B的混合物中洗脱液B为体积比5%的溶液和/或洗脱液B洗脱。
8.根据权利要求3的方法，其中在所述CM柱层析中，结合液A为20mM PB，pH 6.0，洗脱液B为20mM PB和1.0 M NaCl，pH 6.0。
9.根据权利要求8的方法，其中在所述CM柱层析中，用A和B的混合物中洗脱液B为体积比10%的溶液和/或A和B的混合物中洗脱液B为体积比10%-30%的梯度的溶液和/或洗脱液B洗脱。
10.根据权利要求3的方法，其中在所述Source 30Q柱层析中，结合液A为20mM Tris，pH8.5，洗脱液B为20mM Tris 和1.0M NaCl，pH 8.5。
11.根据权利要求10的方法，其中在所述Source 30Q柱层析中，用洗脱液B洗脱。
12.药物组合物，其包含权利要求1的MG53突变体。
13.根据权利要求12中的药物组合物，其还包括可药用的赋形剂或载体。
14.权利要求1的MG53突变体在制备用于预防和/或治疗与细胞膜损伤相关疾病的药物组合物中的用途，其中所述与细胞膜损伤相关疾病包括选自以下的一种或多种：与心肌细胞损伤相关疾病、与溃疡相关疾病、具有伤口的外伤、肠漏和肾脏损伤。
15.根据权利要求14的用途，其中所述具有伤口的外伤是具有难愈合伤口的外伤。
16.根据权利要求14的用途，其中所述与心肌细胞损伤相关的疾病包括选自与以下症状相关的疾病中的一种或多种：心肌缺血、心脏缺血/再灌损伤、心肌梗塞、心力衰竭、心律失常和心脏破裂。
17.根据权利要求14中的用途，其中所述与溃疡相关疾病包括选自以下的一种或多种：慢性溃疡、消化性溃疡、糖尿病足溃疡、糖尿病足坏疽。
18.根据权利要求17中的用途，其中所述慢性溃疡是慢性胃溃疡。
19.根据权利要求17中的用途，其中所述消化性溃疡是慢性胃溃疡。
20.包含权利要求1的MG53突变体的干粉制剂。
21.制备包含权利要求1的MG53突变体的干粉制剂的方法，其包括以下步骤：
（1）溶解辅料，并将其与权利要求1的MG53突变体溶液混合，调整PH值至6.5-8.0，获得包含0.1-2.0 mg/ml 的蛋白质溶液；
（2）通过过滤除菌和在合适的冷冻干燥条件下冷冻干燥所述包含0.5-2mg/ml的权利要求1的MG53突变体溶液获得干粉制剂。
22.根据权利要求21的方法，其中所述辅料包含选自以下的一种或多种：多羟基化合物、糖类、表面活性剂和聚合物。
23.根据权利要求22的方法，其中所述多羟基化合物包含选自以下的一种或多种：甘油、甘露醇、山梨醇、肌醇和聚乙二醇，所述糖类包含选自以下的一种或多种：蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、甘露糖和麦芽糖，所述表面活性剂包含选自以下的一种或多种：Tween80、十二烷基硫酸钠，和/或所述聚合物包含选自以下的一种或多种：聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮。
24.根据权利要求22的方法，其中所述辅料为蔗糖、甘露醇和组氨酸。
25.根据权利要求22的方法，其中所述辅料为蔗糖、甘露醇和Tween-80。
26.根据权利要求21的方法，其中所述合适的冷冻干燥条件为：
（1）预冻到-45℃保持2个小时，预抽真空至12±2Pa,
（2）90分钟升温至-6℃，保持10个小时，
（3）1小时升温至15℃，保持5小时，和
（4）进一步干燥。
27.包含权利要求1的MG53突变体的水针制剂。
28.制备包含权利要求1的MG53突变体的水针制剂的方法，其包括以下步骤：
（1） 用溶剂溶解冻干的权利要求1的MG53突变体，
（2）调整PH值，并过滤，
（3）封口并灭菌，从而制成包含权利要求1的MG53突变体的水针制剂。
29.根据权利要求28的方法，其中所述溶剂是医学常用溶剂。
30.根据权利要求29的方法，其中所述医学常用溶剂是水或生理盐水。
31.包含权利要求1的MG53突变体的喷雾制剂。
32.制备包含权利要求1的MG53突变体的喷雾制剂的方法，其包括以下步骤：
（1）冻干权利要求1的MG53突变体，
（2）用溶剂溶解所述冻干的权利要求1的MG53突变体，以配制成包含50ng-100μg/ml 权利要求1的MG53突变体的喷雾制剂。
33.根据权利要求32的方法，其中所述溶剂是医学常用溶剂。
34.根据权利要求33的方法，其中所述医学常用溶剂是水或生理盐水。
35.包含权利要求1的MG53突变体的凝胶制剂。
36.制备包含权利要求1的MG53突变体的凝胶制剂的方法，其包括以下步骤：
（1）冻干权利要求1的MG53突变体，
（2）用溶剂溶解所述冻干权利要求1的MG53突变体，配制成凝胶溶剂。
37.根据权利要求36的方法，其中所述溶剂是聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物或卡波姆、甘油、壳聚糖的混合物。
38.根据权利要求37的方法，其中所述聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物是在低温保存的聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物。
39.根据权利要求38的方法，其中所述低温是4-8℃。
40.包含权利要求1的MG53突变体的乳剂。
41.制备包含权利要求1的MG53突变体的乳剂的方法，其包括以下步骤：
（1）冻干权利要求1的MG53突变体，
（2）用壳聚糖溶液溶解所述冻干权利要求1的MG53突变体，加入乳剂基质和甘油，配制成乳剂。
42.根据权利要求41的方法，其中所述乳剂基质包含硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、白凡士林、Tween-80、甘油和水。
CN201610210731.8A 2016-04-06 2016-04-06 一种mg53突变体及其制备方法和应用 Active CN107266551B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610210731.8A CN107266551B (zh) 2016-04-06 2016-04-06 一种mg53突变体及其制备方法和应用
CN202110181974.4A CN112940098A (zh) 2016-04-06 2016-04-06 一种mg53突变体及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610210731.8A CN107266551B (zh) 2016-04-06 2016-04-06 一种mg53突变体及其制备方法和应用

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110181974.4A Division CN112940098A (zh) 2016-04-06 2016-04-06 一种mg53突变体及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107266551A CN107266551A (zh) 2017-10-20
CN107266551B true CN107266551B (zh) 2021-03-05

Family

ID=60051752

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610210731.8A Active CN107266551B (zh) 2016-04-06 2016-04-06 一种mg53突变体及其制备方法和应用
CN202110181974.4A Pending CN112940098A (zh) 2016-04-06 2016-04-06 一种mg53突变体及其制备方法和应用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110181974.4A Pending CN112940098A (zh) 2016-04-06 2016-04-06 一种mg53突变体及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN107266551B (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3492491A4 (en) * 2016-08-01 2020-02-19 Peking University MUTANT TO MG53, PREPARATION METHOD THEREOF AND USES THEREOF
CN107937459A (zh) * 2017-12-06 2018-04-20 慎东 一种可规模化产trim72蛋白的高密度发酵方法
CN107760644A (zh) * 2017-12-06 2018-03-06 慎东 一种饲用大肠杆菌高密度发酵的培养基及其应用
CN108478800A (zh) * 2018-04-02 2018-09-04 慎东 含mg53/其突变体的组合物在制备炎症性肠病药物的应用
CN108310365A (zh) * 2018-04-23 2018-07-24 慎东 一种含mg53突变体的组合物在制备神经保护药物中的应用
CN108721601A (zh) * 2018-07-26 2018-11-02 海南博芝康医疗科技有限公司 一种预防和/或治疗肾损伤和肾衰竭的组合物
CN109432404A (zh) * 2018-12-26 2019-03-08 牡丹江友搏药业有限责任公司 一种含mg53蛋白/mg53突变体蛋白凝胶及其制备方法和应用
EP4003388A4 (en) * 2019-07-25 2024-05-22 Ohio State Innovation Foundation COMPOSITION AND METHOD FOR IMPROVING TISSUE PERFORMANCE
CN119486750A (zh) * 2022-06-28 2025-02-18 神济昌华(北京)生物科技有限公司 用于治疗帕金森氏病的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101797375A (zh) * 2009-12-02 2010-08-11 北京大学 Mg53蛋白预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤的用途
CN103965342A (zh) * 2013-01-25 2014-08-06 北京博雅和瑞科技有限公司 一种mg53突变体及其突变方法和应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9139630B2 (en) * 2006-07-11 2015-09-22 Rutgers, The State University Of New Jersey Compositions and methods for preparing recombinant MG53 and methods for optimizing same
EP2635908B1 (en) * 2010-11-05 2015-08-19 University of Medicine and Dentistry of New Jersey Serum mg53 as a diagnostic marker for tissue injury
WO2012134478A1 (en) * 2011-03-31 2012-10-04 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Compositions and methods for the treatment and prevention of cardiac ischemic injury
EP2753363A4 (en) * 2011-09-07 2015-03-11 Univ New Jersey Med MG53 COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF RESPIRATORY INFLUENZES

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101797375A (zh) * 2009-12-02 2010-08-11 北京大学 Mg53蛋白预防和/或治疗心脏缺血/再灌损伤的用途
CN103965342A (zh) * 2013-01-25 2014-08-06 北京博雅和瑞科技有限公司 一种mg53突变体及其突变方法和应用
EP2949664A1 (en) * 2013-01-25 2015-12-02 Beijing Boyalife Pharmaceuticals Ltd. Mg53 mutant and mutation method and use thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MG53———肌细胞损伤的"分子绷带";伊木清;《中国运动医学杂志》;20121225;第31卷(第12期);第1117-1121页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112940098A (zh) 2021-06-11
CN107266551A (zh) 2017-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107266551B (zh) 一种mg53突变体及其制备方法和应用
JP6788663B2 (ja) 癌処置のための天然痘ワクチン
ES2805094T3 (es) Inmunoterapia WT1 para enfermedad angiogénica intraocular
KR20190135470A (ko) 방사능 상해 방지 및 조직 재생 촉진을 위한 조성물 및 방법
JP7005019B2 (ja) 組織修復のための二重特異性治療用タンパク質
JP2008526749A (ja) 自己アセンブリするペプチドナノファイバーを用いたｐｄｇｆの徐放性の送達
WO2007112675A1 (fr) Protéine de fusion du récepteur du vegf et son utilisation
KR20170031251A (ko) 플라젤린 조성물 및 용도
KR20200039677A (ko) 몬테루카스트 및 홍합 접착 단백질과의 조합물을 포함하는 국소 제형
US20210290539A1 (en) Engineered hemichannels, engineered vesicles, and uses thereof
RU2764630C2 (ru) Способы и композиции для предотвращения или минимизации эпителиально-мезенхимального перехода
Gupte et al. Chronic neuregulin-1β treatment mitigates the progression of postmyocardial infarction heart failure in the setting of type 1 diabetes mellitus by suppressing myocardial apoptosis, fibrosis, and key oxidant-producing enzymes
US9422352B2 (en) PTD-SMAD7 therapeutics
BR112020001101A2 (pt) composição farmacêutica do complexo de proteína il-15 e usos da mesma
JP7102026B2 (ja) 合成ペプチドｓｐ２
Acosta et al. Treatment of corneal ulcers with platelet rich plasma
Akbari-Gharalari et al. Improvement of spinal cord injury symptoms by targeting the Bax/Bcl2 pathway and modulating TNF-α/IL-10 using Platelet-Rich Plasma exosomes loaded with dexamethasone
JP6958913B2 (ja) 心停止の処置のためのペプチドおよび方法
CN110167564A (zh) 调节tjp1表达以调节心脏细胞的再生
EP3930757A1 (en) Methods and compositions for protein delivery
CN107987147B (zh) 一种mg53多聚体制备方法及其用途
CA3043687A1 (en) Pharmaceutical composition for use in the treatment of cancer
EP4180059A1 (en) Use of phosphatidylserine in preparation of drug for treating inflammatory bowel disease
Parhizkari et al. The effect of oral treatment of royal jelly on the expression of the PDGF-β gene in the skin wound of male mice
Quagliata et al. Therapeutic applications of thymosin peptides: a patent landscape 2018-present

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1242704

Country of ref document: HK

TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20180929

Address after: 570311 Haikou 4 C7 3-4C house, No. 267, Nanhai Road, Xiuying District, Hainan.

Applicant after: Hainan Bo Zhi Kang Medical Technology Co., Ltd.

Address before: 710068 room 1509, block A, Zhongtian Residence Internazionale, 269 Taibai South Road, Yanta District, Xi'an, Shaanxi.

Applicant before: Shen Dong

TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20190219

Address after: 157013 288 Yumin Road, Yangming District, Mudanjiang City, Heilongjiang Province

Applicant after: Mudanjiang Youbo Pharmaceutical Co.,Ltd.

Address before: 570311 Haikou 4 C7 3-4C house, No. 267, Nanhai Road, Xiuying District, Hainan.

Applicant before: Hainan Bo Zhi Kang Medical Technology Co., Ltd.

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant