CN109432404A - 一种含mg53蛋白/mg53突变体蛋白凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种含mg53蛋白/mg53突变体蛋白凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶及其制备方法和应用，本发明属于医药技术领域，所述含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶，其成分包括：凝胶基质、防腐剂、抗氧剂、蛋白保护剂、MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉。本发明所述的含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶以及含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶的制备方法确保MG53蛋白/MG53突变体蛋白蛋白活性成分长期室温储存的条件下能够保持蛋白稳定，有效确保糖尿病足、褥疮、烧伤烫伤等创合面的愈合，缩短病人的恢复期，有效的减缓病人的痛处。

Description

一种含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医学技术领域，特别涉及一种含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
MG53蛋白的相对分子量为53000，是由477个氨基酸组成的心肌/骨骼肌特异性的3个结构域tripartite motif(TRIM)的家族成员之一。经过多年的研究Weisleder等(Weisleder et al.,2012)发现MG53蛋白的分子结构具有3个结构域，从N端到C端依次是锌指结构域、2个B-box、1个卷曲螺旋结构，Zn也是其中成分之一，其羧基端含有1个SPRY结构(He et al.,2012)。它特异性表达于骨骼肌及心肌细胞。
糖尿病足、褥疮是临床常见的皮肤溃疡疾病，给患者带来极大的痛苦。足部是糖尿病这个多系统疾病的一个复杂的靶器官。糖尿病患者因周围神经病变与外周血管疾病合并过高的机械压力，可引起足部软组织及骨关节系统的破坏与畸形形成，进而引发一系列足部问题，从轻度的神经症状到严重的溃疡、感染、血管疾病、Charcot关节病和神经病变性骨折，由于局部组织长期受压，发生持续缺血、缺氧、营养不良而致组织溃烂坏死，而导致褥疮。目前，针对于糖尿病足、褥疮的恢复，市面上的辅助用药的是患者恢复的效果也较为缓慢，生物蛋白类药物可以有效促进患者伤口修复，但是蛋白的稳定性是长期一来困扰制剂开发人员的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶，用于解决MG53蛋白的稳定性，确保MG53蛋白/MG53突变体蛋白蛋白凝胶长期室温储存而蛋白活性得到有效的保证，有效确保糖尿病足、褥疮、烧伤烫伤等创合面的愈合的问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶，其成分包括：凝胶基质、防腐剂、抗氧剂、MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉。
进一步的，所述凝胶的配方组分为：55w/w％-60w/w％的凝胶基质、3w/w％-5w/w％防腐剂、5w/w％-10w/w％抗氧剂、2w/w％-3w/w％保湿剂、5w/w％-7w/w％蛋白保护剂、20w/w％-25w/w％MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉。
进一步的，所述凝胶基质包括：去离子水、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、甘油丙烯酸酯/丙烯酸共聚物、水解小核菌胶。
进一步的，所述防腐剂包括：羟苯乙酯、苯甲酸钠、山梨醇钾、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯的一种或多种；
所述抗氧剂包括：EDTA-2Na。
所述蛋白保护剂包括：甘油、丙二醇、人血白蛋白、葡聚糖、海藻糖的一种或多种；
所述保湿剂包括：透明质酸钠、甘油、1,2-戊二醇、丁二醇一种或多种。
进一步的，所述MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉包括：MG53蛋白/MG53突变体蛋白蛋白原液、甘露醇、蔗糖、组氨酸or吐温-80。
进一步的，所述MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉包括以下方法制备，
将甘露醇、蔗糖、组氨酸进行溶解，溶解后与的MMG53蛋白原液/MG53突变体蛋白原液进行混合形成第一混合液；
将第一混合液的PH值的范围调整为6.4-6.7之间；
将调整PH值后的第一混合液进行过滤除菌得到第二混合液；所述过滤除菌可通过滤膜进行过滤去除细菌；
将除菌过滤后的第二混合液进行冷冻干燥；干燥后即得MG53蛋白或MG53突变体蛋白的冻干粉。
进一步的，所述MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉的制备方法包括以下步骤，
将甘露醇、蔗糖、Tween-80进行溶解，溶解后与MG53蛋白原液/MG53突变体蛋白原液进行混合形成第一混合液；
将所述第一混合液的PH值的范围调整为7.2-7.4之间；
将调整PH值后的第一混合液进行过滤除菌得到第二混合液；
所述过滤除菌通过滤膜进行过滤去除细菌；
将除菌过滤后的第二混合液进行冷冻干燥；
干燥后即得MG53蛋白或MG53突变体蛋白的冻干粉。
相对于现有技术，本发明所述的一种含MG53蛋白/MG53突变体蛋白的凝胶，具有以下优势：
(1)本发明所述的含MG53蛋白/MG53突变体蛋白的凝胶，确保MG53蛋白/MG53突变体蛋白蛋白活性成分长期室温储存的条件下能够保持蛋白稳定，有效确保糖尿病足、褥疮、烧伤烫伤等创合面的愈合，缩短病人的恢复期，有效的减缓病人的痛处。
(2)本发明所述的含MG53蛋白/MG53突变体蛋白的凝胶，在恢复糖尿病足与褥疮的创合面的同时，对其受损的细胞能够进一步的恢复，促进新的细胞的增生，降低疤痕面。
本发明的另一目的在于提出一种含MG53蛋白/MG53突变体蛋白的凝胶的制备方法，已解决MG53蛋白的稳定性，确保MG53蛋白/MG53突变体蛋白蛋白凝胶长期室温储存而蛋白活性得到有效的保证，有效确保糖尿病足、褥疮、烧伤烫伤等创合面的愈合的问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种含MG53蛋白/MG53突变体蛋白的凝胶制备方法，包括以下步骤：
S1、凝胶基质的制备：在主乳化锅中加入去离子水，搅拌中将羟乙基纤维素粉末撒入，搅拌5-15分钟后，搅拌中加热至75℃-85℃，直至溶液完全透明；开始降温，至40-45℃，良好搅拌下将EDTA-2Na、甘油和甘油丙烯酸酯/丙烯共聚物和丙二醇透明质酸钠中组分依次加入主乳化锅中，保证一个组分溶解完全再加入下一个组分；最终得到凝胶基质；
S2、将凝胶基质、防腐剂、抗氧化剂、保湿剂及蛋白保护剂按照一定比例进行混合，形成第一混合液，将第一混合液进行高压灭菌；
S3、将高压、冷却后的第一混合液加入MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉以及保护剂，在无菌条件下，进行搅拌均匀形成凝胶。
进一步的，所述添加的保护剂为：3％甘露醇、1％蔗糖或3％甘露醇、1％蔗糖、0.5％人血白蛋白或3％甘露醇、1％蔗糖3％羟乙基淀粉40或3％甘露醇、1％蔗糖、1％HP-β-CD或3％甘露醇、1％蔗糖；1％HP-β-CD；0.5％人血白蛋白。所述的含MG53蛋白/MG53突变体蛋白的凝胶制备方法与上述的含MG53蛋白/MG53突变体蛋白的凝胶，相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。
本发明的另一目的在于提出一种含MG53蛋白/MG53突变体蛋白的凝胶在制备用于治疗糖尿病足或褥疮疾病上药物中的应用，用于解决MG53蛋白的稳定性，确保MG53蛋白/MG53突变体蛋白蛋白凝胶长期室温储存而蛋白活性得到有效的保证，有效确保糖尿病足、褥疮、烧伤烫伤等创合面的愈合的问题。
根据上述所述的含MG53蛋白/MG53突变体蛋白的凝胶在制备用于治疗糖尿病足、褥疮、烧伤、烫伤等疾病上药物中的应用。
所述的含MG53蛋白/MG53突变体蛋白的凝胶在制备用于治疗糖尿病足或褥疮疾病上药物中的应用与上述的含MG53蛋白/MG53突变体蛋白的凝胶，相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例所述的MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉在PH值为7.0、7.5、8.0下通过SDS-page检测方法下的还原(R)和非还原(N)俩种处理方法后检测后的胶图；
图2为本发明实施例所述的MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉在第六天的PH值7.0在温度为25℃、40℃的条件下通过SDS-page检测方法下的还原(R)和非还原(N)俩种处理方法后检测后的胶图；
图3为本发明实施例所述的MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉在第6天的PH值7.5、8.0在温度为25℃、40℃的条件下通过SDS-page检测方法下的还原(R)和非还原(N)俩种处理方法后检测后的胶图；
图4(a)为本发明实施例所述的MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉在第11天PH值7.0、7.5、8.0在温度为25℃、40℃的条件下通过SDS-page检测方法下的非还原(N)俩种处理方法后检测后的胶图；图4(b)为本发明实施例所述的MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉在第11天PH值7.0、7.5、8.0在温度为25℃、40℃的条件下通过SDS-page检测方法下还原(R)俩种处理方法后检测后的胶图；
图5(a)为本发明实施例所述的凝胶做成贴剂和凝胶剂两种类型，在0天时，通过还原(R)和非还原(N)两种SDS—PAGE法分别进行检测的检测结果胶图；
图5(b)为本发明实施例所述的凝胶做成凝胶剂时，在第6天，在温度为4℃、25℃、40℃时，通过还原(R)和非还原(N)两种SDS—PAGE法分别进行检测的检测结果胶图；
图5(c)为本发明实施例所述的凝胶做成凝胶剂时，在12天时，在温度为4℃、25℃、40℃时，通过还原(R)和非还原(N)两种SDS—PAGE法分别进行检测的检测结果胶图。；
图6(a)为本发明实施例所述的凝胶做成贴剂和凝胶剂两种类型，在0天时，通过还原(R)和非还原(N)两种SDS—PAGE法分别进行检测的检测结果胶图；
图6(b)为本发明实施例所述的凝胶做成贴剂时，在6天时，在温度为4℃、25℃、40℃时，通过还原(R)和非还原(N)两种SDS—PAGE法分别进行检测的检测结果胶图；
图6(c)为本发明实施例所述的凝胶做成贴剂时，在12天时，在温度为4℃、25℃、40℃时，通过还原(R)和非还原(N)两种SDS—PAGE法分别进行检测的检测结果胶图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
一种含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶，其成分包括：凝胶基质、防腐剂、抗氧剂、MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉。
凝胶基质包括：去离子水、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、甘油丙烯酸酯/丙烯酸共聚物、水解小核菌(SCLEROTIUM ROLFSSII)胶。
防腐剂包括：羟苯乙酯、苯甲酸钠、山梨醇钾、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯的一种或多种，本发明优选于，尼泊金甲酯、尼泊金丙酯的一种或两种。
抗氧剂包括：EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)。
所述保湿剂包括：透明质酸钠、甘油、1,2-戊二醇、丁二醇一种或多种。
所述蛋白保护剂包括：甘油、丙二醇、人血白蛋白、葡聚糖、海藻糖的一种或多种。
MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉包括：MG53蛋白原液/MG53突变体蛋白原液、甘露醇、蔗糖、组氨酸or吐温-80。本发明所述的含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶，能够有效的恢复糖尿病足与褥疮的创合面，缩短病人的恢复期，有效的减缓病人的痛处。
实施例2
本实施例与上述实施例的区别在于，一种含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶，其配方和成分为：55w/w％-66w/w％的凝胶基质、3w/w％-5w/w％防腐剂、5w/w％-10w/w％抗氧剂、2w/w％-3w/w％保湿剂、5w/w％-7w/w％蛋白保护剂、20w/w％-25w/w％MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉。
所述凝胶基质的组分包括：45w/w％-50w/w％去离子水、羧甲基纤维素钠、0.2w/w％羧甲基纤维素钠、5w/w％-10w/w％甘油、丙烯酸酯/丙烯酸共聚物、水解小核菌胶
所述防腐剂的组分包括：1.5w/w％-3w/w％尼泊金甲酯、1.5w/w％-3w/w％尼泊金丙酯的一种或两种。
抗氧剂的组分包括：5w/w％-10w/w％EDTA-2Na。
保湿剂的组分包括：0.5w/w％-3w/w％透明质酸钠、0.5w/w％-3w/w％甘油、0.5w/w％-3w/w％1,2-戊二醇、0.5w/w％-3w/w％丁二醇一种或多种。
蛋白保护剂的组分包括：1.5w/w％-7w/w％甘油、1w/w％-7w/w％丙二醇、1.5w/w％-7w/w％人血白蛋白、1w/w％-7w/w％葡聚糖、1w/w％-7w/w％海藻糖的一种或多种。
MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉的组分包括：MG53蛋白/MG53突变体蛋白原液、甘露醇、蔗糖、组氨酸or吐温-80。
本发明含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶，在恢复糖尿病足与褥疮的创合面的同时，对其受损的细胞能够进一步的恢复，促进新的细胞的增生，降低疤痕面。
实施例3
一种MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶的制备方法：包括以下步骤：
S1、凝胶基质的制备：
在主乳化锅中加入去离子水，搅拌中将羟乙基纤维素粉末撒入，搅拌10分钟后，搅拌中加热至75℃，直至溶液完全透明；开始降温，至45℃，良好搅拌下将EDTA二钠、甘油(和)甘油丙烯酸酯/丙烯共聚物(和)丙二醇透明质酸钠中组分依次加入主乳化锅中，保证一个组分溶解完全再加入下一个组分；最终得到凝胶基质。
S2、将凝胶基质、防腐剂、抗氧化剂、保湿剂、蛋白保护剂按照一定比例进行混合，形成第一混合液，将第一混合液进行高压灭菌，高压灭菌的条件为：121℃，30分钟。
S3、将高压、冷却后的第一混合液加入MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉以及保护剂，在无菌条件下，进行搅拌均匀形成凝胶。本发明制备方法制备的凝胶能够有效的防止创面的感染以及降低粘膜的粘附。
实施例4
本实施例与上述实施例的区别在于，所述添加的保护剂为：3％甘露醇、1％蔗糖或3％甘露醇、1％蔗糖、0.5％人血白蛋白或3％甘露醇、1％蔗糖3％羟乙基淀粉40或3％甘露醇、1％蔗糖、1％HP-β-CD或3％甘露醇、1％蔗糖；1％HP-β-CD；0.5％人血白蛋白；所述人血白蛋白是为了防止优先被吸附而保护蛋白质药物免遭吸附、羟乙基淀粉40是防止由于振动引起的蛋白沉淀、甘露醇视为了水分子围绕在蛋白质周围，提高蛋白稳定性、HP-β-CD(羟丙基-β-环糊精)是以交联作用能有效防止蛋白质药物的聚集和制备储存过程中外界环境对药物的影响。
实施例5
本实施例与上述实施例的区别在于，MG53蛋白/MG53突变体蛋白的冻干粉的制备方法，包括如下步骤：
S1、将25-60mg/ml甘露醇、20-40mg/ml蔗糖、20-40mg/ml组氨酸进行溶解，溶解后与0.2-0.8mg/ml的MG53蛋白原液/MG53突变体蛋白原液进行混合形成第一混合液；
S2、将第一混合液的PH值的范围调整为6.4-6.7之间；较佳的，将PH值调整为6.5。
S3、将调整PH值后的第一混合液进行过滤除菌得到第二混合液；所述过滤除菌可通过滤膜进行过滤去除细菌。
较佳的，所述滤膜为：火棉胶、硝化纤维素滤膜其中的一种。本实施例只是较佳的一种滤膜，本不仅限于上述滤膜。凡是能够达到本申请的过滤去除细菌的滤膜均可。
所述冷滤膜的孔径为：0.1-l nm。
S4、将除菌过滤后的第二混合液进行冷冻干燥；
预冻阶段：先将冻干机板层温度降至-45℃，保持2小时；预抽真空至12±2Pa,；
第一次阶段：用时1.5小时，板层温度-45℃的升至-6℃，并保持10小时；真空控制在12±2Pa之间。
第二次升华阶段：
用时1小时，板层温度-6℃升至15℃，并保持15小时；
升化完成后进行一步干燥；干燥后即得MG53蛋白或MG53突变体蛋白的冻干粉。
本方法的工艺简单，稳定性好，能够广泛应用，且本方法生产的凝胶能够减少对肤、粘膜的刺激。
实施例6
本实施例与上述实施例的区别在于，MG53蛋白/MG53突变体蛋白的冻干粉包括，MG53蛋白或MG53突变体蛋白的冻干粉的制备方法包括如下步骤：
S1、将40-60mg/ml甘露醇、5-15mg/ml蔗糖、0.02-0.06mg/ml Tween-80进行溶解，溶解后与100ml-200的1-2.5mg/ml的MG53蛋白原液/MG53突变体蛋白原液进行混合形成第一混合液；
S2、将第一混合液的PH值的范围调整为7.2-7.4之间；较佳的，将PH值调整为7.4；
S3、将调整PH值后的第一混合液进行过滤除菌得到第二混合液；所述过滤除菌可通过滤膜进行过滤去除细菌。
较佳的，所述滤膜为：火棉胶、硝化纤维素滤膜其中的一种。本实施例只是较佳的一种滤膜，本不仅限于上述滤膜。凡是能够达到本申请的过滤去除细菌的滤膜均可。
所述冷滤膜的孔径为：0.1-l nm。
S4、将除菌过滤后的第二混合液进行冷冻干燥；
预冻阶段：先将冻干机温度降至-45℃，保持2小时；预抽真空至12±2Pa,；
第一次升华阶段：用时1.5小时，冻干机的温度从-45℃的升至-6℃，并保持10小时；真空控制在12±2Pa之间。
第二次升华阶段：
用时1小时，冻干机的温度从-6℃升至15℃，并保持15小时；
升化完成后进行一步干燥；干燥后即得MG53蛋白或MG53突变体蛋白的冻干粉。
本方法生产工艺价格便宜，且生产的凝胶内药物释放时间长，具有较好的止血效果。
实施例7
上述含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶在制备用于治疗糖尿病足、褥疮、烧伤、烫伤等疾病上药物中的应用，能够在恢复糖尿病足与褥疮的创合面的同时，对其受损的细胞能够进一步的恢复，促进新的细胞的增生，降低疤痕面。
本发明下所述的含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶的实验数据提供了制备成贴剂，凝胶剂两种形式的数据；但本发明不仅仅局限于上述两种形式，只要能够用于实现本发明的有益效果均可。
实施例8
本实施例为pH值对蛋白稳定性实验。
1、实验准备
1、1仪器用具、试剂
名称 厂家 型号
药品稳定性试验箱 上海一恒医疗器械有限公司 LHH-250SD
药品稳定性试验箱 北京兰贝石恒温技术有限公司 Labonce-300CGS
药品稳定性试验箱 北京兰贝石恒温技术有限公司 Labonce-300CGS
凝胶制备和电泳装置 Bio-rad PowerPacTMBasic
凝胶成像分析仪 Bio-rad Chemi DocTM MP
单道手动可调移液器 Eppendorf 100～1000μl
单道手动可调移液器 Eppendorf 20～200μl
单道手动可调移液器 Eppendorf 2～20μl
单道手动可调移液器 Eppendorf 0.5～10μl
EP管 Axygene 1.5ml
分析天平 岛津 AY120
分析天平 Sartorius BT25S
表1主要仪器用具
表2主要试剂
1.2确认YB001冻干粉缓冲能力
配制系列不同pH值离子强度35mM的磷酸缓冲液，称取理论量的空白辅料，分别加上述缓冲液，测定加入空白辅料后的pH值。缓冲液离子强度35mM，加MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉本身的离子强度，样品溶液终浓度离子强度为50mM，结果见下表3。
离子强度 50mM
缓冲液pH值 空白辅料加入缓冲液后pH值
8.43 7.98
7.50 7.43
7.00 7.03
表3缓冲液pH值和加空白辅料后pH值对应关系
1.3样品制备
取MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉，分别加入相应pH值的缓冲液(经0.22μm的滤膜过滤，缓冲液离子强度为35mM)，待溶解后吹打混匀，分装，所有操作均在无菌条件下进行，配制情况见下表4。
表4样品配制表
1.4试验条件、检测方法和检测时间
表5试验条件、检测方法和检测时间列表
1.5pH值结果，如附图1-4所示
附图1为PH值为7.0、7.5、8.0下通过SDS-page检测方法下的还原(R)和非还原(N)俩种处理方法后检测后的胶图。从附图1的结果可以看出：0天结果显示，条带基本一致。
附图2为第六天的PH值7.0在温度为25℃、40℃的条件下通过SDS-page检测方法下的还原(R)和非还原(N)俩种处理方法后检测后的胶图。图3为第6天的PH值7.5、8.0在温度为25℃、40℃的条件下通过SDS-page检测方法下的还原(R)和非还原(N)俩种处理方法后检测后的胶图。
从附图2和附图3的结果可以看出：第6天时，pH7.0、pH7.5和8.0比较，主条带较为一致。
附图4(a)为第11天PH值7.0、7.5、8.0在温度为25℃、40℃的条件下通过SDS-page检测方法下的非还原(N)俩种处理方法后检测后的胶图。附图4(b)为第11天PH值7.0、7.5、8.0在温度为25℃、40℃的条件下通过SDS-page检测方法下的还原(R)俩种处理方法后检测后的胶图。
从附图4(a)和附图4(b)的结果可以看出：pH7.0、pH7.5和8.0比较，主条带较为一致。
1.5活性结果
条件 pH7.0 pH7.5 pH8.0
0天EC50 37.53 36.43 37.23
7天EC50 77.06 39.19 48.90
表6 25℃活性结果统计(EC50(半最大效应浓度))
1.6结论
通过上述实验及实验后的数据结果表明，在25℃条件下，YB001在pH7.0～pH8.0范围较为稳定。
实施例9
本实施例为本发明的凝胶制成成品的稳定性实验。目前本实施例的稳定性实验检测两种成品的剂型。
1、试验准备
1.1样品信息、仪器用具和试剂
剂型 规格 数量 代号 批号
贴剂 -- 5支 BT18070901A 20180807
胶剂 10ml/瓶 4支 BX18062503B 20180809
表7样品基本信息表
备注：“--”代表无此项信息。
表8主要仪器用具
表9主要试剂
备注：“--”代表无此项信息。
2、稳定性试验
2.1试验设计
表10试验设计
2.2取样及检测
贴剂：取样冷敷贴，挤出液体，照SDS—PAGE法检测(还原和非还原两种方法)。
凝胶剂：取0.2g，精密水稀释至5倍，摇匀，照SDS—PAGE法检测(还原和非还原两种方法)。
3.3结果分析
附图5(a)为贴剂和凝胶剂0天时，通过还原(R)和非还原(N)两种SDS—PAGE法分别进行检测的检测结果胶图；附图5(b)凝胶剂在6天时，在温度为4℃、25℃、40℃时，通过还原(R)和非还原(N)两种SDS—PAGE法分别进行检测的检测结果胶图；附图5(c)凝胶剂在12天时，在温度为4℃、25℃、40℃时，通过还原(R)和非还原(N)两种SDS—PAGE法分别进行检测的检测结果胶图。
通过附图5(a)、附图5(b)、附图5(c)的可以看出结果，在0天、6天、12天结果显示，25℃和40℃结果与4℃一致，本凝胶剂较为稳定。
附图6(a)为贴剂和凝胶剂0天时，通过还原(R)和非还原(N)两种SDS—PAGE法分别进行检测的检测结果胶图；附图6(b)贴剂在6天时，在温度为4℃、25℃、40℃时，通过还原(R)和非还原(N)两种SDS—PAGE法分别进行检测的检测结果胶图；附图6(c)贴剂在12天时，在温度为4℃、25℃、40℃时，通过还原(R)和非还原(N)两种SDS—PAGE法分别进行检测的检测结果胶图。
通过附图6(a)、附图6(b)、附图6(c)的可以看出结果，在0天、6天、12天结果显示，25℃和40℃结果与4℃一致，本贴剂较为稳定。
实施例10
本实施例为临床试验数据。
1、糖药病足患者
1.1患者情况：该患者糖尿病足掌部溃疡，疮口面积4-6cm2，疮口深度至真皮，肉芽红活、无脓液、疮周伤口红肿。
1.2使用本申请中的凝胶剂用药情况：
(1)、使用本申请凝胶剂的第12天的状态：未有脓液流出、伤口范围逐渐向内收缩变小，疮口深度变浅，无红肿。
(2)、使用本申请凝胶剂的第21天，肉芽伤口愈合、无脓液、无疮周红肿，伤口痊愈。
2、臁疮患者
2.1患者情况：患者腿部臁疮，疮口面积7-10cm2，疮口深度至皮下，肉芽淡红、血清样分泌物，疮周红肿。
2.2使用本申请中的凝胶剂用药情况：
(1)、使用本申请中的凝胶剂的第12天的状态：未有脓液流出、伤口范围逐渐向内收缩变小，疮口深度变浅，无红肿，无分泌物。
(2)、使用本申请中的凝胶剂的第25天，肉芽伤口愈合、无脓液、无疮周红肿，疮口深度愈合。
3、烧伤患者
3.1患者情况：患者因煤气管道连接管老换自然，造成双腿和手臂二度烧伤，糖尿病II型。
3.2使用本申请中的凝胶剂用药情况：
(1)、使用本申请凝胶剂的第6天的状态：未有脓液流出、无感染，疮口深度变浅，无红肿，无分泌物。
(2)、使用本申请凝胶剂的第12天，肉芽伤口愈合、无脓液、无疮周红肿，疮口深度愈合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶，其特征在于，其成分包括：凝胶基质、防腐剂、抗氧剂、蛋白保护剂、MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉。
2.根据权利要求1所述的含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶，其特征在于，所述凝胶的配方组分为：55w/w％-60w/w％的凝胶基质、3w/w％-5w/w％防腐剂、5w/w％-10w/w％抗氧剂、2w/w％-3w/w％保湿剂、5w/w％-7w/w％蛋白保护剂、20w/w％-25w/w％MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉。
3.根据权利要求1所述的含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶，其特征在于，所述凝胶基质包括：去离子水、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、甘油、丙烯酸酯/丙烯酸共聚物、水解小核菌胶。
4.根据权利要求1所述的含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶，其特征在于，所述防腐剂包括：羟苯乙酯、苯甲酸钠、山梨醇钾、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯的一种或多种；
所述抗氧剂包括：EDTA-2Na；
所述保湿剂包括：透明质酸钠、甘油、1,2-戊二醇、丁二醇一种或多种；
所述蛋白保护剂包括：甘油、丙二醇、人血白蛋白、葡聚糖、海藻糖的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶，其特征在于，所述MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉包括：MG53蛋白原液/MG53突变体蛋白原液、甘露醇、蔗糖、组氨酸or吐温-80。
6.根据权利要求5所述的含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶，其特征在于，所述MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉包括以下方法制备，
将甘露醇、蔗糖、组氨酸进行溶解，溶解后与MG53蛋白原液/MG53突变体蛋白原液进行混合形成第一混合液；
将第一混合液的PH值的范围调整为6.4-6.7之间；
将调整PH值后的第一混合液进行过滤除菌得到第二混合液；所述过滤除菌可通过滤膜进行过滤去除细菌；
将除菌过滤后的第二混合液进行冷冻干燥；干燥后即得MG53蛋白或MG53突变体蛋白的冻干粉。
7.根据权利要求5所述的含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶，其特征在于，所述MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉的制备方法包括以下步骤，
将甘露醇、蔗糖、Tween-80进行溶解，溶解后与MG53蛋白原液/MG53突变体蛋白原液进行混合形成第一混合液；
将所述第一混合液的PH值的范围调整为7.2-7.4之间；
将调整PH值后的第一混合液进行过滤除菌得到第二混合液；
所述过滤除菌通过滤膜进行过滤去除细菌；
将除菌过滤后的第二混合液进行冷冻干燥；
干燥后即得MG53蛋白或MG53突变体蛋白的冻干粉。
8.一种含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、凝胶基质的制备：在主乳化锅中加入去离子水，搅拌中将羟乙基纤维素粉末撒入，搅拌5-15分钟后，搅拌中加热至75℃-85℃，直至溶液完全透明；开始降温，至40-45℃，良好搅拌下将EDTA-2Na、甘油和甘油丙烯酸酯/丙烯共聚物和丙二醇透明质酸钠中组分依次加入主乳化锅中，保证一个组分溶解完全再加入下一个组分；最终得到凝胶基质；
S2、将凝胶基质、防腐剂、抗氧化剂、保湿剂及蛋白保护剂按照一定比例进行混合，形成第一混合液，将第一混合液进行高压灭菌；
S3、将高压、冷却后的第一混合液加入MG53蛋白/MG53突变体蛋白冻干粉以及保护剂，在无菌条件下，进行搅拌均匀形成凝胶。
9.根据权利要求6所述的含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶的制备方法，其特征在于，所述添加的保护剂为：3％甘露醇、1％蔗糖或3％甘露醇、1％蔗糖、0.5％人血白蛋白或3％甘露醇、1％蔗糖3％羟乙基淀粉40或3％甘露醇、1％蔗糖、1％HP-β-CD或3％甘露醇、1％蔗糖；1％HP-β-CD；0.5％人血白蛋白。
10.如权利要求1-7所述的含MG53蛋白/MG53突变体蛋白凝胶在制备用于治疗糖尿病足、褥疮、烧伤、烫伤等疾病上药物中的应用。
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