CN112274631A - 重组蛋白Semaphorin3G在防治视网膜疾病中的医药用途 - Google Patents

Abstract

重组蛋白Semaphorin3G在防治视网膜疾病中的医药用途。本发明通过腺相关病毒介导的视网膜血管内皮细胞内Sema3G蛋白过表达或玻璃体腔注射Sema3G重组蛋白的方式提高视网膜内Sema3G蛋白水平，均能够有效改善OIR小鼠视网膜病变的病理进程，Sema3G蛋白可以减少视网膜病变中的血管闭塞区域面积，也可以减少病理性新生血管簇的面积，减轻病理表型。

Description

重组蛋白Semaphorin3G在防治视网膜疾病中的医药用途

技术领域

本发明属于眼科视网膜病变治疗领域，具体涉及重组蛋白Semaphorin3G在防治视网膜疾病中的医药用途。

背景技术

缺血性视网膜病变(ischemic retinopathy)是一类由视网膜缺血缺氧引起的病理性血管生成疾病，包括糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)，早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,ROP)等。DR和ROP分别是导致成年人和婴儿失明的主要原因。在糖尿病患者中，氧气运输的减少导致视网膜缺氧；在早产儿出生时，视网膜血管网络尚未完全形成，视网膜末端仍处于无血管的状态，由于视网膜内缺乏血管提供氧气，导致周边的视网膜处于缺氧状态。这些损害视网膜血管的病理过程使血管闭合，从而导致视网膜缺血和视网膜内皮细胞的屏障特性损害，进而导致过度的血管渗漏。因此，视网膜组织在DR和ROP中均会出现局部缺血和缺氧，缺氧导致病理性新生血管的发生。由于视网膜是由神经元和神经细胞组成的致密组织，因此缺氧导致视网膜神经元正常功能无法维持。此外，低氧诱导血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)产生和分泌，严重的视网膜缺血会导致视网膜病理性新生血管形成(neovascularization,NV)，该新生血管长入玻璃体腔后可能引起牵拉性视网膜脱离，导致视力下降。因此，开发针对缺血性视网膜病变的治疗方法，减少缺血性视网膜病变导致的视力丧失的发生率对于临床治疗是至关重要的。多年来，缺血性视网膜病变的主要治疗手段是通过冷冻疗法或光凝术破坏疾病视网膜组织。虽然这些治疗方法有效，但是如果用于治疗早产儿视网膜病变，可能会导致视网膜结构破坏进而引起并发症。并且有研究者发现，在治疗糖尿病视网膜病变时，这种疗法会导致视野，色觉和对比敏感度的降低。在后续的研究中，人们逐渐认识到VEGF在疾病发病机理中起关键作用，并且VEGF中和抗体成功治疗年龄相关性黄斑变性(age-related maculardegeneration,AMD)。由此，人们开始探讨在糖尿病视网膜病变和早产儿视网膜病变中靶向VEGF的可用性，后续临床试验也证明该方法有效。目前，VEGF中和抗体治疗已经成为临床上这些视网膜血管疾病的主要治疗方法；但是，众多的临床研究者发现，VEGF中和抗体治疗对视网膜神经元和神经胶质有潜在的毒性，并且对于某些患者的治疗效果并不理想。因此，阐明影响病理性新生血管形成和退行的分子机制非常重要，了解这些机制将有助于开发治疗缺血性视网膜病变的新策略。

高氧诱导的缺血性视网膜病变(Oxygen-induced retinopathy,OIR)小鼠模型，现已被广泛用于阐明视网膜病理性新生血管形成与退行的分子机制及用于抗新生血管药物的筛选。该高氧诱导视网膜病变模型的发病机理是将出生后第7天的新生小鼠置于高浓度氧气的环境中，阻止血管发育，并导致许多发育中的血管退化，产生大量的无血管区。在高氧环境中生活5天后，在出生后第12天将小鼠放回到室内常氧环境中进行饲养，此时，灌注不良的视网膜会变得相对缺氧，从而导致VEGF的过量产生，并刺激视网膜病理性新生血管形成，该模型模拟了人类缺血性视网膜病变的疾病进程。

缺血性视网膜病变的发病机制错综复杂，为了阐明其具体机制，我们需要进一步解析与疾病关联的病理性新生血管形成与退行这一关键环节。血管生成是指由先前存在的脉管系统形成新血管的过程，血管退行是指病理性新生血管的凋亡和消退以及形成正常血管网的再血管化过程。血管生成和退行对于许多生理过程至关重要，并且在视网膜病变和肿瘤生长在内的许多病理进程中也起着关键作用。血管生成受到促血管生成信号和抗血管生成信号之间的动态平衡控制，因此阐明正常和异常血管生成的潜在分子机制，可以为开发新的抗血管生成治疗策略提供新的理论基础。目前，研究最广泛的血管生成抑制剂是细胞外基质或血清成分的蛋白水解切割产物。多种细胞因子也可以通过抑制促血管生成因子的表达或诱导抗血管生成分子的表达而间接发挥抗血管生成作用。也有研究报道了受发育调节的抗血管生成分子，但是其确切的作用机理尚未得到完全阐明。

Semaphorins蛋白家族成员，在调控血管生成和肿瘤生长中显示出双重活性，在生理和病理性血管发育过程中对血管生成起着至关重要的作用。越来越多的研究发现，多种类型的细胞均表达Semaphorins受体，其中包括内皮细胞和多种类型的肿瘤细胞。随后的研究表明，Semaphorins可以调节肿瘤细胞和内皮细胞的行为，并且不同的Semaphorins可以通过不同的方式促进或抑制血管生成和肿瘤生长。迄今为止，人们对于Semaphorins蛋白如何发挥这些不同作用的分子机制仍然知之甚少，而阐明由不同Semaphorins激活的信号级联反应成为深入研究的重点。其中，第3亚家族Semaphorins蛋白是一类分泌型的Semaphorins蛋白，包括Sema3A至Sema3G等7种分泌蛋白。与其他亚型的Semaphorins一样，第3亚家族Semaphorins蛋白的N末端附近均包含Sema结构域和位于Sema结构域下游的PSI域。此外，它们的特征在于在其C末端包含一个免疫球蛋白样(immunoglobulin-like,Ig-like)结构域和位于PSI结构域下游的基本结构域。Semaphorin 3G(以下简称Sema3G)是在2005年首次被发现的第3类Semaphorins亚家族的一员，是一种来源于血管内皮细胞的分泌蛋白。但是，迄今为止，Sema3G的生物学功能研究仍然存在诸多空白，尤其是Sema3G在缺血性视网膜病变的病理过程中，对血管发育的作用及其细胞内分子机制仍然尚未阐明。本发明中发现Sema3G重组蛋白能够促进病理性新生血管簇退行以及促进视网膜血管正常血管化，减少视网膜病理性的渗漏，有效改善缺血性视网膜疾病的病理进程，缓解缺血性视网膜病变造成的视网膜损伤与功能障碍。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种重组蛋白Semaphorin3G在防治视网膜疾病中的医药用途，具体来说，本发明提供了缓解缺血性视网膜疾病症状的方法，包括向高氧诱导的缺血性视网膜病变(OIR)造模小鼠眼内给予有效量的重组蛋白Sema3G或靶向视网膜血管内皮细胞表达Sema3G蛋白的腺相关病毒。通过玻璃体腔局部注射重组Sema3G蛋白或腺相关病毒介导的靶向视网膜血管内皮细胞表达Sema3G蛋白，结果证明Sema3G参与调控病理性新生血管簇退行以及正常血管化的过程并在OIR的病理过程中发挥重要的作用，可以有效改善OIR小鼠病理进程，缓解缺血性视网膜病变造成的血管损伤。

本发明也提供了缓解脉络膜新生血管疾病症状的方法，包括向激光诱导脉络膜新生血管(Choroidal neovascularization,CNV)造模小鼠给予有效量的Sema3G重组蛋白。通过玻璃体腔局部注射Sema3G重组蛋白，能够促进脉络膜病理性新生血管的消退，也可以减少血管渗漏。

本发明也提供了保护VEGF诱导的病理性血管渗漏的方法，包括向含有VEGF的皮下基质胶的新生血管中给予Sema3G蛋白过表达腺病毒。通过腺病毒介导的Sema3G蛋白过表达，可以有效改善血管损伤和血管渗漏。

根据本文所示的方面，Sema3G蛋白能够有效改善缺血性视网膜病变的疾病程度，为Sema3G在治疗缺血性视网膜病变(如糖尿病视网膜病变及黄斑水肿、早产儿视网膜病变、年龄相关性黄斑变性)等新生血管性疾病的应用提供了重要的证据。

技术方案:Semaphorin3G(Sema3G)重组蛋白在制备防治缺血性视网膜病变眼科疾病的药物中的应用。

靶向侵染视网膜血管内皮细胞表达Semaphorin3G蛋白的腺相关病毒在制备治疗缺血性视网膜病变作为基因治疗药物中的应用。

过表达Semaphorin3G蛋白的腺病毒在制备防治病理性血管渗漏作为基因治疗药物中的应用。

所述缺血性视网膜病变为糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy)、早产儿视网膜病变(Retinopathy of prematurity)、年龄相关性黄斑变性(Age-related maculardegeneration)、糖尿病性黄斑水肿(Diabetic macular edema)、家族性渗出性玻璃体视网膜病变(familial exudative vitreoretinopathy)中的至少一种。

具体来说：

1、增殖性糖尿病视网膜病变患者玻璃体腔液Sema3G蛋白含量检测：采用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测患者玻璃体腔液中Sema3G蛋白的含量。这些数据为探讨Sema3G在缺血性视网膜病变背景下的作用提供了理论依据，提示血管内皮细胞来源的Sema3G在缺血性视网膜病变疾病过程中发挥重要的作用。

2、利用高氧动物饲养装置制作氧诱导的视网膜病变模型(OIR模型)：将出生后第7天的新生小鼠，在75％的氧气中饲养5天，到出生后第12天，由于高氧的作用，小鼠幼崽视网膜内表现出明显的血管丢失和中央的血管闭塞区。高氧饲养后，将小鼠放回正常氧气环境中饲养。在出生后第12天至第17天，这些小鼠幼崽视网膜内产生大量额外的病理性新生血管簇。随后，病理性新生血管簇逐渐消退并且视网膜血管重新进入血管闭塞区。收集造模小鼠的视网膜组织，并进行染色，分析视网膜血管的疾病程度和Sema3G蛋白作为防治视网膜病变药物的治疗效果。

3、利用OIR模型评价在腺相关病毒介导的视网膜血管内皮细胞Sema3G蛋白过表达对视网膜病变的保护作用：构建用于表达Sema3G蛋白的腺相关病毒载体，从数据库网站获得Sema3G(NCBI，NM_020163.3)的基因序列和质粒载体，通过利用分子克隆技术将Sema3G编码基因，构建至BR1血清型腺相关病毒骨架载体中。并且结合腺相关病毒包装的辅助载体，将质粒共转染到293T细胞中，包装出可以特异性地侵染中枢神经系统血管内皮细胞的BR1血清型腺相关病毒。将此病毒通过球后静脉丛注射到小鼠的体内，病毒感染小鼠视网膜血管内皮细胞后，表达Sema3G蛋白，评价对患有视网膜病变的OIR小鼠的视网膜血管疾病的治疗作用。

4.利用OIR模型评价玻璃体腔注射Sema3G蛋白对视网膜病变的保护作用：构建表达Sema3G重组蛋白的真核表达载体，通过PCR扩增得到Sema3G的DNA编码序列并克隆到pcDNA3.1表达载体；在Sema3G的DNA编码序列的氨基端和羧基端各插入用于蛋白亲和纯化的组氨酸(His)标签。构建得到重组质粒CD5-2×His-Sema3G载体，并转染到HEK293T细胞中。收集细胞培养的上清，将过滤后的细胞上清流过GE公司的His标签纯化柱，使蛋白结合在纯化柱上，结合AKATA蛋白纯化仪，用浓度梯度的咪唑溶液进行洗脱，得到Sema3G重组蛋白，后续经过超滤、透析等操作，得到纯化后Sema3G重组蛋白，对最终得到的蛋白进行蛋白浓度测定。通过Hamilton微量注射器对小鼠眼球进行玻璃体腔注射，注射Sema3G重组蛋白，评价对患有视网膜病变OIR小鼠的视网膜血管疾病的治疗作用。

5.利用激光诱发的脉络膜新生血管病变小鼠模型(CNV)评价玻璃体腔注射Sema3G蛋白对视网膜病变的保护作用：本模型使用60天雄性小鼠进行激光诱发的CNV小鼠模型的构建，将激光正确聚焦在Bruch膜，进行激光光凝，由于激光对Bruch膜的破坏作用，可以诱发脉络膜新生血管的形成。在激光造模后，通过Hamilton微量注射器对小鼠眼球进行玻璃体腔注射，注射Sema3G重组蛋白进行治疗。最后，利用眼底荧光素血管造影(FA)和吲哚菁绿血管造影(ICGA)对疾病程度和Sema3G的治疗效果进行评估。

6.利用皮下基质胶血管渗漏模型评价腺病毒介导的Sema3G蛋白过表达对血管渗漏的保护作用：将Sema3G编码基因克隆至腺病毒骨架载体，构建得到Sema3G过表达腺病毒载体，并与腺病毒包装的辅助载体共转染到293T细胞中，包装成可以表达Sema3G蛋白的腺病毒，用于在基质胶新生血管中过表达Sema3G。后续使用6至8周龄的雄性小鼠进行造模，具体操作为，在冰上配制含有一定浓度成纤维细胞生长因子(bFGF)或血管内皮生长因子(VEGF-A)的基质胶混合物，在上述基质胶混合物中，添加过表达Sema3G的腺病毒，将基质胶注入小鼠背部的皮下，一周后，给小鼠灌注2000kD FITC标记葡聚糖和10kD TRITC标记葡聚糖示踪剂，收集基质胶样本并进行冰冻切片，检测基质胶内血管生成和血管渗漏情况。

有益效果：本发明通过腺相关病毒介导的视网膜血管内皮细胞内Sema3G蛋白过表达或玻璃体腔注射Sema3G重组蛋白的方式提高视网膜内Sema3G蛋白水平，均能够有效改善OIR小鼠视网膜病变的病理进程，Sema3G蛋白可以减少视网膜病变中的血管闭塞区域面积，也可以减少病理性新生血管簇的面积，减轻病理表型。另外，Sema3G蛋白能够促进脉络膜病理性新生血管的消退，也可以减少血管渗漏。此外，腺病毒介导的内皮细胞Sema3G过表达能够改善VEGF诱导的血管渗漏，使血管渗漏减少从而生成稳定的血管。本发明中的研究成果将为缺血性视网膜病变(如糖尿病视网膜病变及黄斑水肿、早产儿视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等)药物的研发提供药物靶标和候选蛋白类药物以及提供基因治疗策略。

附图说明

图1为增殖性糖尿病视网膜病变患者与对照组患者的临床指标以及玻璃体腔液中Sema3G蛋白含量的检测。(A)增殖性糖尿病视网膜病变患者与对照组患者的血管造影，光谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)和三维(3D)视网膜图。(B)增殖性糖尿病视网膜病变患者的玻璃体腔液中Sema3G蛋白水平显著增加。

图2为用于Sema3G过表达的腺相关病毒载体。此载体包含启动Sema3G基因表达的CAG启动子，Sema3G基因编码序列以及Flag蛋白标签。此载体结合pxx2和p179质粒载体，可以包装成为靶向侵染中枢神经系统血管内皮细胞的BR1血清型腺相关病毒。

图3为腺相关病毒介导的在视网膜血管内皮细胞内Sema3G蛋白过表达策略。(A)通过球后静脉注射的方式在小鼠的视网膜血管内皮细胞中递送AAV-Sema3G病毒，其中AAV-对照病毒作为对照。(B)治疗过程示意图，将出生后第7天感染AAV-Sema3G病毒或AAV-对照病毒的新生小鼠，及其哺乳期母鼠，一起转移到高氧箱中，使其从出生后第7天至第12天暴露于75％的氧气环境中，在第12天转移到正常氧气饲养环境，并再次注射AAV-Sema3G病毒或AAV-对照病毒，在第19天对视网膜组织进行取样和染色，分析视网膜血管表型。

图4为腺相关病毒介导的视网膜血管内皮细胞Sema3G过表达能够改善OIR小鼠的疾病程度。(A)在第19天对感染AAV-对照病毒或AAV-Sema3G病毒的缺血性视网膜病变(OIR)的小鼠进行取样，使用IB4抗体(特异性标记血管抗体)对视网膜进行染色的结果。(B)定量分析和测定A中缺血性视网膜病变的血管闭塞区域面积和病理性新生血管簇区域面积。结果以平均值±SEM(Standard Error of Mean，标准误)表示，并使用t检验进行统计分析。**P＜0.01。比例尺：1000μm。

图5为玻璃体腔注射Sema3G重组蛋白治疗缺血性视网膜病变。(A)给予小鼠玻璃体腔内注射Sema3G重组蛋白的示意图。(B)治疗过程示意图，小鼠经过OIR造模后，在第15天给小鼠玻璃体腔内注射1μg Sema3G重组蛋白或IgG(IgG作为对照)。在注射2天后分析视网膜血管表型。

图6为玻璃体腔注射Sema3G蛋白有效改善OIR小鼠病理表型。(A)在第17天对注射了IgG或Sema3G重组蛋白的缺血性视网膜病变(OIR)的小鼠进行取样，并对视网膜进行IB4染色的结果。(B)定量分析和测定A中缺血性视网膜病变的血管闭塞区域面积和病理性新生血管簇区域面积。结果以平均值±SEM表示，并使用t检验进行统计分析。**P<0.01；***P＜0.001。比例尺：1000μm。

图7为玻璃体腔注射Sema3G蛋白对脉络膜新生血管疾病的治疗。(A)对出生后60天的小鼠视网膜用激光光凝进行处理。在激光造模后的第0天和第7天，经玻璃体腔注射Sema3G重组蛋白，1周后，通过荧光素血管造影(FA)，吲哚菁绿血管造影(ICGA)和IB4染色评估CNV的疾病程度。(B)在激光造模的小鼠中，通过计算FA与ICGA的比值(即渗漏面积/新生血管面积)，评估血管渗漏的严重程度。(C)通过IB4标记的病理性脉络膜新生血管体积，评估CNV的严重程度。结果以平均值±SEM表示，并使用t检验进行统计分析。*P<0.05。比例尺：100μm。

图8为腺病毒介导的Sema3G蛋白过表达能够抑制VEGF诱导的血管渗漏。(A)在小鼠静脉中灌注不同分子量的荧光标记葡聚糖示踪剂，对整个基质胶进行取样，通过共聚焦显微镜获取血管和示踪剂的图像，并通过Imaris进行3D渲染显示。(B)通过对充盈有2000kDFITC葡聚糖的血管外部渗漏的10kD TRITC葡聚糖的荧光强度进行定量来量化血管的渗透程度。结果以平均值±SEM表示，并使用t检验进行统计分析。**P<0.01；***P＜0.001。比例尺：50μm。

具体实施方式

(1)评估Sema3G蛋白在缺血性视网膜病变中的潜在功能：我们收集了10例患有增殖性糖尿病视网膜病变患者以及10例年龄等信息与之匹配的非血管性视网膜病变的对照患者的玻璃体腔液样本。对患者眼内进行了眼底血管造影观察以及光谱域光学相干断层扫描(spectral-domain optical coherence tomography,SD-OCT)，并生成了三维(3D)视网膜图以评估视网膜损伤的程度。从眼底血管造影的结果来看，对照患者血管形态并未发生明显改变，但是PDR患者的血管出现了一定面积的缺血区域，并且在缺血区域附近出现了明显的异常增生血管。我们采用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbentassay,ELISA)检测了患者玻璃体腔液中Sema3G的表达。这些数据为探讨Sema3G在缺血性视网膜病变背景下的作用提供了理论依据，提示血管内皮细胞来源的Sema3G在缺血性视网膜病变疾病过程中发挥重要的作用。

(2)小鼠视网膜病变OIR模型的构建，OIR小鼠模型是一个理想的表征缺血性视网膜病变的小鼠模型，它能够模拟包括PDR和ROP在内的多种人类缺血性视网膜病变的病理过程。我们采用了高氧诱导视网膜病变模型进行研究Sema3G蛋白在病理性血管新生和退行中的作用。在该模型中，我们将出生后第7天的新生小鼠幼崽以及哺乳期母鼠暴露于高氧环境中，在75％的氧气中饲养5天后放回正常氧气条件中饲养。对造模小鼠给予Sema3G蛋白进行药物治疗，在治疗后收集小鼠的视网膜样本，用免疫荧光染色的方法考察Sema3G蛋白对于视网膜血管疾病治疗的效果。

(3)靶向视网膜血管内皮细胞表达Sema3G蛋白的腺相关病毒在治疗缺血性视网膜病变药物中的应用。为了进一步确认血管内皮细胞Sema3G的表达水平是否与病理性血管退行和正常血管的血管化有直接的关联性，并且探索研发缺血性视网膜病变的基因治疗药物。我们构建了可以靶向侵染视网膜血管内皮细胞并且带有Sema3G基因编码序列的BR1血清型腺相关病毒(AAV-Sema3G)，试图在小鼠视网膜血管内皮细胞中过表达Sema3G蛋白。对OIR造模后的小鼠进行基因治疗，收集小鼠的视网膜样本，用免疫荧光染色的方法考察在基因治疗情况下视网膜血管的疾病表型。

(4)玻璃体腔注射Sema3G重组蛋白在治疗缺血性视网膜病变的应用。由于玻璃体腔局部注射，在眼科疾病治疗中应用广泛，可以起到快速有效治疗的效果，因此我们通过实验验证通过玻璃体腔注射Sema3G蛋白的方式，能够有效改善OIR小鼠病理表型，我们分别将出生后第7天的小鼠，暴露于高氧环境中，进行OIR造模，然后在出生后第15天，将单剂量1μgSema3G重组蛋白或对照蛋白IgG经玻璃体腔注射到小鼠眼球中，于出生后第17天分别收集视网膜样本，利用免疫荧光染色的方法考察Sema3G重组蛋白对于视网膜血管疾病的治疗效果。

(5)采用玻璃体腔注射Sema3G重组蛋白治疗脉络膜新生血管疾病的应用。本模型使用60天的雄性小鼠进行激光诱导的脉络膜新生血管(CNV)小鼠模型的构建，通过激光光凝器对Bruch膜进行激光光凝，在激光造模后的第0天和第7天，在玻璃体腔注射Sema3G重组蛋白，在造模后的第14天，利用眼底荧光素血管造影(FA)和吲哚菁绿血管造影(ICGA)对疾病程度和治疗效果进行评估。

(6)在体基质胶血管生成实验验证Sema3G蛋白对VEGF诱导的血管渗漏的保护性作用。本实验通过在小鼠背部皮下种植基质胶，在体模拟血管生成过程。在基质胶中有较高浓度的VEGF，一方面VEGF可以促进血管新生，另一方面，也可以诱导新生血管的渗漏。通过在此基质胶混合物中，添加过表达Sema3G的腺病毒。一周后，小鼠静脉灌注不同分子量的荧光标记葡聚糖示踪剂，收集基质胶样本进行冰冻切片，通过共聚焦显微镜获取示踪剂的图像，检测基质胶内血管的渗漏情况，验证Sema3G蛋白的治疗效果。

实施例1增殖性糖尿病视网膜病变患者玻璃体腔液中Sema3G蛋白含量检测

本实验涉及的糖尿病视网膜病变患者，由江苏省人民医院眼科医师根据中华医学会眼底病组制订的糖尿病视网膜病变分类标准，临床诊断为患有IV期至VI期的增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)，视网膜内伴有病理性新生血管生成。对照患者患有特发性黄斑裂孔(macular hole,MH)或特发性视网膜前膜(epiretinal membrane,ERM)等非血管病理性视网膜病变疾病。在进行玻璃体切除手术时收集得到上述PDR患者及对照患者的玻璃体腔液样本。本研究所有受试者均签署书面知情同意书，研究项目已获得江苏省人民医院医学研究伦理委员会对人体临床方案和知情同意书的批准。

玻璃体腔液中Sema3G蛋白含量通过蛋白酶联免疫吸附实验(ELISA)进行测定。

首先，配制标准样品：

(1)离心机以6000-10000rpm转速，将试剂盒中的标准样品管离心30秒。加入2mL样品稀释液，将标准液静置最少15分钟，配制标准液。此时，储液浓度为20ng/mL。

(2)移取250μL样品稀释液到每个EP管中。移取250μL储液加入至另一个EP管，彻底混匀，再移取第一个EP管250μL液体至下一EP管，依次对半稀释，加上储液、稀释液和空白共8个浓度梯度(20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0ng/mL)。

之后，进行样本检测：

(1)根据样本数量确定要使用的孔的数量，并将剩余的孔和干燥剂放回袋中并密封拉链，将未使用的孔保存在4℃。

(2)每孔加入100μL标准液和样品，用覆膜覆盖。在37℃下孵育2小时，记录标准品和测定的样品孔的位置。

(3)甩去每个孔中的液体。

(4)每孔中添加100μL 1×生物素抗体。盖上新的覆膜。在37℃下孵育1小时。

(5)吸出每孔中的液体，向每个孔中加入200μL清洗缓冲液进行清洗，并使其静置2分钟，重复3次。最后一次清洗后，倒置板，用干净的纸巾将其吸干。

(6)每孔中加入100μL 1×HRP-抗生物素蛋白。用新的覆膜覆盖。在37℃下孵育1小时。

(7)按步骤5重复五次清洗过程。

(8)向每个孔中加入90μL TMB底物。在37℃下避光孵育15-30分钟。

(9)向每个孔中加入50μL终止液，摇晃使其充分混合。

(10)将酶标仪检测波长设置为450nm，在5分钟内测定每个孔的光密度。再设置为540nm或570nm。从450nm的读数中减去540nm或570nm的读数，用以校正板中的光学缺陷。

(11)计算标准曲线，并进行样本中Sema3G蛋白浓度的换算。

实施例2表达Sema3G蛋白的腺相关病毒载体的构建

(1)基因序列获取：从数据库网站获得Sema3G(NCBI，NM_020163.3)的基因序列和质粒载体，通过利用分子克隆技术将Sema3G编码基因，构建至BR1血清型腺相关病毒骨架载体中。

(2)PCR扩增与酶切：利用表1.1中设计的基因序列特异的引物，利用Sema3G编码基因载体作为模板，对目的基因序列进行PCR扩增，得到Sema3G基因片段。扩增(Gflex PCR酶，takara公司)程序为：95℃，10min；95℃，10s；60℃，30s；68℃，2min；共进行35个循环；72℃，4min。对骨架载体用限制性内切酶EcoR I、Hind III(takara公司)进行酶切，在37℃水浴锅中反应2小时进行酶切。

表1.1

引物名称	引物序列(5’-3’)
		Sema3G-正向引物	ATGGCCCCCTCGGCCTGGGCCA
Sema3G-反向引物	CGTGGCCTCCACCTCCCGGGGCG

(3)PCR产物与酶切产物的纯化：将PCR产物和酶切产物，通过2％的琼脂糖凝胶电泳将条带进行分离，根据序列的碱基长度，割胶回收相应的DNA片段，后续使用Axygen凝胶回收试剂盒进行凝胶回收。

(4)重组质粒的连接：纯化后的PCR片段和线性化的质粒载体通过NanoDrop核酸测定仪测定浓度。根据克隆试剂盒(生工生物公司)推荐的载体：插入的基因片段的摩尔比例进行连接。连接体系为20微升：2×连接酶Mix试剂10微升，载体20ng，目的基因片段50ng，其中载体、目的基因片段根据浓度计算出体积，加水使反应终体积为20微升，40℃水浴1小时。

(5)感受态的转化：将感受态DH5α(生工生物公司)置于冰上融化；完全融化之后，用移液器将连接产物转移到感受态中，在冰上放置25分钟。然后在42℃水浴中热击90秒，继续置于冰上5分钟。随后加入不含抗生素的LB培养液1毫升，37℃摇床上培养60分钟后，4000转/分钟离心4分钟，弃上清。将沉淀的菌体用100微升LB培养液重悬，然后转移到含有氨苄霉素的LB培养皿上，用涂布棒涂匀菌液，倒扣于37℃孵箱中培养。

(6)单克隆菌落扩增：培养皿在37℃孵箱中培养12小时后，可以在LB培养板上观察到单克隆菌落。挑取单一菌落，加入含有氨苄霉素的LB培养液中，继续于37℃摇床中培养过夜。

(7)质粒提取：收集菌液，用通用的质粒提取试剂盒(生工生物公司)进行质粒提取。测定提取的质粒浓度，利用限制酶对质粒进行酶切确定阳性质粒，将质粒送金唯智公司测序，比对测序结果，确保插入片段正确，选取最终插入结果正确的质粒进行保存以及后续病毒包装实验。

实施例3表达Sema3G蛋白的腺相关病毒的包装

AAV包装过程中，包装质粒负责编码目的基因以及两个末端反向重复序列(ITR)，辅助质粒pxx2包含AAV包装所需的cap(编码病毒衣壳蛋白)和rep(参与病毒的复制)基因，p179为腺相关病毒包装的Helper质粒。我们使用的辅助质粒编码衣壳蛋白的基因有NRGTEWD突变，可以特异性地侵染中枢神经系统的血管内皮细胞。三种质粒共同转染293T细胞后，AAV病毒开始复制和包装，所获得的病毒颗粒经过超速离心纯化，并通过qPCR对病毒基因拷贝进行测定，根据病毒的滴度进行后续相关实验。病毒包装由和元生物技术(上海)公司完成。

实施例4表达Sema3G重组蛋白的真核表达载体的构建

通过PCR扩增从模板质粒中得到Sema3G的DNA编码序列(包含第23-782位氨基酸片段)并克隆到pcDNA3.1表达载体；在Sema3G的DNA编码序列前端添加CD5分泌信号肽(用于增加蛋白的分泌)，同时在Sema3G的DNA编码序列的氨基端和羧基端各插入用于蛋白亲和纯化的组氨酸(His)标签。构建得到重组质粒，并命名为CD5-2×His-Sema3G载体。

实施例5Sema3G重组蛋白的纯化

利用DNA转染试剂(汉恒生物)，对汇合度为80％的HEK293T细胞进行Sema3G重组蛋白表达质粒的瞬时转染。在质粒转染12小时之后，吸弃旧的细胞培养基，添加新的Opti-MEN培养基(Gibco)。在质粒转染24小时之后，在细胞培养上清中加入终浓度为5mM/L的正丁酸钠，用以促进蛋白的表达。在继续表达3天后收集HEK293T细胞的上清，1200rpm离心10分钟，用以除去死亡细胞或细胞杂质。将过滤后的细胞上清流过GE公司的His标签纯化柱，使蛋白结合在纯化柱上，结合AKATA蛋白纯化仪(GE Healthcare公司)，用浓度梯度的咪唑溶液进行洗脱，得到Sema3G重组蛋白，后续经过超滤、透析等操作，得到纯化后Sema3G重组蛋白，对最终得到的蛋白进行凝胶电泳并进行考马斯亮蓝染色，测定蛋白浓度后，小体积分装，保存在-80℃冰箱。

实施例6高氧诱导的缺血性视网膜病变小鼠模型的制备及腺相关病毒介导的Sema3G过表达病毒注射治疗

该小鼠模型制作的方法是：首先将出生后第7天的新生小鼠，用3％异氟烷麻醉后，在体视镜下，用33G注射针经球后静脉注射含有5×10¹⁰病毒颗粒的病毒液，后将幼崽暴露于高氧环境(高氧动物饲养箱)中，此新生小鼠在75％的氧气中饲养5天，由于高氧的作用，到出生后第12天，小鼠幼崽视网膜内表现出明显的血管丢失和中央的血管闭塞区域。在第12天将小鼠放回正常氧气环境中饲养并再次注射病毒。在出生后第12天至出生后第17天，由于视网膜血管丢失造成视网膜处在一个相对缺血缺氧的状态，这些小鼠幼崽视网膜内产生大量额外的病理性新生血管簇。随后，病理性新生血管簇逐渐消退并且视网膜血管重新进入血管闭塞区。在此实验中，我们选择出生后第19天对视网膜组织进行取样，免疫荧光染色分析视网膜血管的疾病程度和Sema3G过表达病毒的治疗效果。

附图4显示，在出生后第19天，对注射AAV-对照病毒或AAV-Sema3G病毒的缺血性视网膜病变(OIR)的小鼠分别进行取样，并对视网膜进行IB4(特异性标记血管抗体)染色。如图所示，图中视网膜铺片中间无血管分布的区域为血管闭塞区域，白色点状标识的区域为视网膜病理性新生血管簇区域，对血管闭塞区域和病理性新生血管簇区域分别进行定量。结果显示，相比于注射AAV-对照病毒的小鼠，感染AAV-Sema3G病毒的基因治疗组小鼠视网膜血管闭塞区域面积显著降低，病理性新生血管簇面积也显著降低，说明Sema3G基因治疗能够有效改善视网膜病变的疾病程度。

实施例7高氧诱导的缺血性视网膜病变小鼠模型的制备及Sema3G重组蛋白玻璃体腔注射治疗

该小鼠模型制备时的高氧造模的方法同实施例6，此外，不同于实施例6的基因治疗方法，此例通过玻璃体腔注射Sema3G重组蛋白进行治疗，具体为：使用3％异氟烷对OIR造模后第15天的小鼠进行麻醉，通过Hamilton微量注射器对小鼠眼球进行玻璃体腔注射，注射1μg Sema3G重组蛋白或IgG(IgG作为对照)。在此实验中，我们选择出生后第17天对视网膜组织进行取样，染色分析视网膜血管的疾病程度和Sema3G重组蛋白的治疗效果。

附图6显示，在出生后第17天，对注射Sema3G重组蛋白或IgG对照的缺血性视网膜病变(OIR)的小鼠取样，并对视网膜进行IB4(特异性标记血管抗体)染色。如图所示，图中视网膜铺片中间无血管分布的区域为血管闭塞区域，白色点状标识的区域为视网膜病理性新生血管簇区域，对血管闭塞区域和病理性新生血管簇区域分别进行定量。结果显示，相比于注射IgG对照的小鼠，注射Sema3G重组蛋白的治疗组小鼠视网膜血管闭塞区域面积显著降低，病理性新生血管簇面积也显著降低，说明Sema3G重组蛋白注射治疗能够有效改善视网膜病变的疾病程度。

实施例8激光诱发的脉络膜新生血管病变模型小鼠的制备及Sema3G重组蛋白玻璃体腔注射治疗

该小鼠模型制作的方法是：本模型使用60天雄性小鼠进行激光诱发的CNV小鼠模型的制备。用1％托吡卡胺进行局部瞳孔扩张和0.5％盐酸丙美卡因滴眼液进行局部麻醉，然后使用带有裂隙灯的激光光凝器(Novus Varia，LUMENIS)进行激光光凝。在此过程中，使用附着有人工泪液的玻璃盖玻片并附着在小鼠眼睛上作为眼镜，以便在裂隙灯下可视化视网膜。将激光正确聚焦在Bruch膜，对3、6、9和12点钟位置的视网膜进行激光光凝，以使每只眼睛有4次激光光凝位置，Bruch膜被击穿时，会立即形成气泡。在激光造模后的第0天和第7天，通过Hamilton微量注射器对小鼠眼球进行玻璃体腔注射，注射Sema3G重组蛋白或IgG(IgG作为对照)。

在激光造模后的第14天，利用眼底荧光素血管造影(FA)和吲哚菁绿血管造影(ICGA)对疾病程度进行评估。分别通过腹腔注射5mg荧光素钠(50mg/mL，生工生物公司)和静脉注射0.15mg吲哚菁绿(1mg/mL，生工生物公司)进行血管的标记。在注射后6分钟，使用共聚焦激光扫描系统(Heidelberg Spectralis HRA2)对小鼠眼底进行荧光成像，并分别获取FA和ICGA造影的实验图像。后续使用ImageJ测量血管泄漏程度，计算方法为：FA图像中测得的总荧光面积除以ICGA图像中测得的CNV总面积。为了量化CNV体积，用血管标记物IB4对脉络膜进行染色以标记CNV血管，并使用Imaris(Bitplane)软件进行三维分析。

附图7显示，在激光造模后的第14天，对注射Sema3G重组蛋白或IgG对照的脉络膜新生血管模型小鼠，先后进行荧光素钠和吲哚菁绿注射观察，并用血管标记物IB4对脉络膜进行染色分析。如图所示，眼底荧光素血管造影(FA)的白色区域指示脉络膜血管的荧光素渗漏程度，吲哚菁绿血管造影(ICGA)中的白色块状区域指示脉络膜病理性新生血管簇区域，IB4染色指示病理性脉络膜新生血管簇的体积。定量分析结果显示，相比于注射IgG对照的小鼠，注射Sema3G重组蛋白的治疗组小鼠，渗漏面积显著降低，以及病理性脉络膜新生血管体积显著降低，说明重组蛋白注射治疗能够有效改善脉络膜新生血管病变的疾病程度。

实施例9表达Sema3G蛋白的腺病毒载体的构建以及腺病毒的包装

用于体内基质胶血管生成实验的腺病毒载体的构建方法是，通过删除pAdeno-mCMV-eGFP-3×Flag载体中的eGFP序列，进一步将Sema3G编码基因克隆至此载体，构建得到了Sema3G过表达腺病毒载体pAdeno-mCMV-Sema3G-3×Flag，以实现后续包装成Sema3G蛋白过表达的腺病毒。该Sema3G蛋白过表达腺病毒载体和对照病毒的包装由和元生物技术(上海)公司完成。

实施例10腺病毒介导的Sema3G蛋白过表达对皮下基质胶血管渗漏的保护作用

(1)使用6至8周龄，体重约20g的正常雄性小鼠进行造模。

(2)在冰上配制含有一定浓度成纤维细胞生长因子(bFGF)或血管内皮生长因子(VEGF-A)的基质胶混合物。

(3)在上述基质胶混合物中，添加过表达Sema3G的腺病毒(Adv-Sema3G过表达)或对照病毒(Adv-对照)。

(4)使用异氟烷麻醉系统对小鼠进行麻醉，将基质胶注入小鼠背部的皮下，注射针头停留10秒钟后，移出针头。

(5)一周后，在小鼠静脉中灌注不同分子量的荧光标记葡聚糖示踪剂(2000kDFITC标记葡聚糖和10kD TRITC标记葡聚糖)，对整个基质胶进行取样进行冰冻切片，通过共聚焦显微镜获取血管和示踪剂的图像，并通过Imaris进行3D渲染显示，对灌注的血管外部存在的10kD TRITC标记葡聚糖荧光强度进行定量来量化血管的渗透性。

附图8显示，基质胶中添加bFGF，能诱导形成相对稳定的新生血管，大分子量的2000kD FITC标记葡聚糖和小分子量的10kD TRITC标记葡聚糖均分布在血管内，无渗漏；而基质胶中添加VEGF，能诱导形成不稳定状态的病理性新生血管，发现小分子量的10kDTRITC标记葡聚糖出现大面积的漏出。治疗结果显示，相比于基质胶中同时添加VEGF和Adv-对照病毒，基质胶中同时添加VEGF和Adv-Sema3G过表达病毒组中小分子量的10kD TRITC标记葡聚糖的渗漏面积显著降低，说明过表达Sema3G蛋白可以减少新生血管的渗漏程度，对新生血管起到保护性作用。

序列表

<110> 南京医科大学

<120> 重组蛋白Semaphorin3G在防治视网膜疾病中的医药用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccccct cggcctgggc ca 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgtggcctcc acctcccggg gcg 23

Claims (4)

1.Semaphorin3G（Sema3G）重组蛋白在制备防治缺血性视网膜病变眼科疾病的药物中的应用。

2.靶向侵染视网膜血管内皮细胞表达Semaphorin3G蛋白的腺相关病毒在制备治疗缺血性视网膜病变作为基因治疗药物中的应用。

3.过表达Semaphorin3G蛋白的腺病毒在制备防治病理性血管渗漏作为基因治疗药物中的应用。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述缺血性视网膜病变为糖尿病视网膜病变（Diabetic retinopathy）、早产儿视网膜病变（Retinopathy of prematurity）、年龄相关性黄斑变性（Age-related macular degeneration）、糖尿病性黄斑水肿（Diabeticmacular edema）、家族性渗出性玻璃体视网膜病变（familial exudativevitreoretinopathy）中的至少一种。

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