CN105821079A - 用于治疗莱伯氏先天性黑蒙-1（lca1）的raav-鸟苷酸环化酶组合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了病毒载体组合物，其包含表达一种或多种有生物活性的哺乳动物鸟苷酸环化酶蛋白的多核苷酸序列。还公开了将它们用于预防、治疗和/或改善至少部分源自于体内鸟苷酸环化酶缺陷的疾病、病症、异常状态或机能障碍的至少一种或多种症状的方法。在特定实施方案中，使用重组腺相关病毒(rAAV)载体来治疗或改善莱伯氏先天性黑蒙以及由功能性视网膜特异性鸟苷酸环化酶1(retGC1)的不存在或减少所引起的其他病症的症状。

Description

用于治疗莱伯氏先天性黑蒙-1（LCA1）的RAAV-鸟苷酸环化酶组合物及方法
本申请是申请日为2011年4月22日、申请号为201180020530.7、发明名称为“用于治疗莱伯氏先天性黑蒙-1(LCA1)的RAAV-鸟苷酸环化酶组合物及方法”的发明专利申请的分案申请。
发明背景
与相关申请的交叉引用
本申请要求2010年4月23日提交的目前待决的美国临时专利申请号61/327,521的优先权，所述临时专利申请的全部内容在此明确地以其全文引为参考。
关于联邦资助的研究或开发的陈述
依据国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)(NTH)的资助号EY13729、EY11123和EY08571，美国政府在本发明中享有一定权利。
联合研究协议各方的名称
不适用。
发明领域
总的来说，本发明涉及分子生物学和病毒学领域，具体来说，涉及使用表达至少第一核酸区段的重组腺相关病毒(rAAV)组合物的方法，所述核酸区段编码至少第一治疗性基因产物，特别是那些可用于预防、治疗或改善哺乳动物眼睛的疾病、病症、创伤、损伤或机能障碍的一种或多种症状的产物。在特定实施方案中，本发明提供了包括表达生物功能性鸟苷酸环化酶肽、多肽或蛋白的rAAV载体的组合物，其用于一种或多种研究性、诊断性和/或治疗性方法中，包括例如治疗哺乳动物眼睛的一种或多种病症或疾病，特别是用于在人类中治疗先天性视网膜失明，包括视网膜营养不良例如1型莱伯氏先天性黑蒙(LCA1)。此外还提供了用于制备基于rAAV载体的鸟苷酸环化酶药物的方法，所述药物用于基于病毒载体、包括例如rAAV-LCA1载体的基因疗法中，在人类中治疗或改善鸟苷酸环化酶缺陷的一种或多种症状。
相关技术描述
莱伯氏先天性黑蒙(LCA)在1869年由德国眼科医生TheodorLeber博士首次描述为一种先天类型的视网膜色素变性(RP)，并且是最早和最严重的遗传性视网膜病形式，占所有遗传性视网膜营养不良的约6％。LCA是一类视网膜的退化疾病，并且是儿童先天性失明的最常见病因。这种常染色体隐性病状通常在婴儿出生时或其生命的第一个月期间被识别，其特征为完全失明或视力极大受损、眼底正常和视网膜电图(ERG)熄灭(参见例如Perrault等，1996)。尽管具有这些功能缺陷，但LCA1患者在他们的黄斑和周边视网膜两者中多年保留有一些视杆和视锥光受体。疾病的症状包括视网膜机能障碍、眼球颤动(眼球震颤)、视力受损、瞳孔反射慢和最终失明。
通过遗传分析，已显示指派到LCA1基因座的鸟苷酸环化酶-1(Gucy2d)中的突变在所有报道的LCA病例中占20％(参见例如Milam等，2003；Perrault等，1996；Perrault等，2000)。患有LCA1的患者数量约为患有视网膜色素上皮特异性65-kDa蛋白(RPE65)缺陷的疾病形式(LCA2)的患者数量的两倍，后一种疾病形式近年中在基因疗法界内吸引了大量注意。
据估计有200,000美国人患有1型莱伯氏病。Gucy2d编码鸟苷酸环化酶(retGC1)，其在光受体外段膜中表达(参见例如Dizhoor等，1994；Liu等，1994)，并在光转导的恢复期中发挥作用。降低或废止该酶活性的突变被认为在视杆和视锥光受体中产生慢性曝光的生物化学等同物。LCA通常被视为光受体发育受损或已正常发育的细胞的极早退化的结果。LCA1基因座(GUCY2D)已通过纯合子定位法被定位于人类染色体17p13.1(LCA1)。
现有技术的缺点
目前没有有效的预防或治疗方法可用在人类中预防或治疗LCA1。
发明概述
本发明通过提供新的、并非显而易见并且有用的基于rAAV的遗传构建物，克服了现有技术中固有的限制，所述构建物编码一种或多种治疗性哺乳动物多肽，特别是鸟苷酸环化酶家族的蛋白、肽、多肽，用于预防、治疗和/或改善由有生物活性鸟苷酸环化酶多肽的活性的缺乏或缺陷而引起或加重的一种或多种哺乳动物疾病、病症或机能障碍，或其一种或多种症状。具体来说，本发明提供了编码一种或多种哺乳动物视网膜特异性鸟苷酸环化酶(retGC1)多肽的遗传构建物，所述构建物用于治疗诸如LCA1的病状以及由正常生理水平的鸟苷酸环化酶多肽的缺陷或缺乏所显示出的其他眼睛病状，例如隐性或显性形式的视锥-视杆营养不良。
在一个实施方案中，本发明提供了包括至少第一多核苷酸的重组腺相关病毒(rAAV)载体，所述第一多核苷酸包含与编码至少第一哺乳动物鸟苷酸环化酶蛋白、肽或多肽的至少第一核酸区段可操作地连接的启动子。优选情况下，所述启动子是光受体特异性启动子(例如人类视紫红质蛋白激酶启动子)或遍在的启动子(例如截短的嵌合CMV-鸡β-肌动蛋白启动子)。优选情况下，所述第一核酸区段编码至少第一哺乳动物鸟苷酸环化酶蛋白、肽或多肽，其包含至少第一连续氨基酸序列区域或基本上由其构成或可选地由其构成，所述至少第一连续氨基酸序列区域与SEQIDNO：l、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10或SEQIDNO：11中描述的任一种或多种哺乳动物鸟苷酸环化酶蛋白中所示的至少约60、约70、约80、约90、或约100个或更多个连续氨基酸序列的至少第一序列区域具有至少约80％、约85％、或约90％或以上的同一性。
在某些实施方案中，所述至少第一核酸区段优选编码包括至少第一连续氨基酸序列区域的至少第一哺乳动物鸟苷酸环化酶蛋白、肽或多肽，所述至少第一连续氨基酸序列区域在一级氨基酸序列上与SEQIDNO：l、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10和SEQIDNO：11中列出的任一种或多种哺乳动物鸟苷酸环化酶蛋白序列中所示的至少约100、约110、约120、约130、约140或约150个或更多个连续氨基酸序列具有至少约91％、约92％、约93％、约94％或约95％或以上的同一性。
优选情况下，所述至少第一核酸区段编码至少一种或多种哺乳动物鸟苷酸环化酶蛋白、肽或多肽，其各自优选包含至少第一连续氨基酸一级序列，所述一级序列与包括SEQIDNO：l、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10和SEQIDNO：11的一项或多项中所示的至少第一鸟苷酸环化酶蛋白的至少约90、约110、约130、约150或约170个或更多个连续氨基酸的至少第一序列区域具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的同一性。
优选情况下，本发明的rAAV载体包括编码至少第一哺乳动物鸟苷酸环化酶蛋白、肽或多肽的至少第一核酸区段，所述蛋白、肽或多肽包含SEQIDNO：l、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10和SEQIDNO：11的任一项或多项的氨基酸序列，或基本上由所述氨基酸序列构成或可选地由所述氨基酸序列构成，或者本发明的rAAV载体包括与一个或多个这样的序列互补或在严紧至高度严紧杂交条件下与这样的序列特异性杂交的多核苷酸序列。优选情况下，所述第一哺乳动物鸟苷酸环化酶蛋白、肽或多肽在体外和在转化的哺乳动物细胞内、优选在转化的人类宿主细胞内具有鸟苷酸环化酶活性。在特定情况下，当编码所述鸟苷酸环化酶肽、蛋白或多肽的核酸区段与能够在哺乳动物、优选为人类的宿主细胞中表达该序列的至少第一启动子可操作地连接时，所述蛋白、肽或多肽在体外和在转化的哺乳动物细胞内、优选在转化的人类宿主细胞内具有有显著生物活性的鸟苷酸环化酶活性。
尽管本发明的rAAV载体不必限于特定血清型，但在某些实施方案中，本发明人设想通过利用属于一种或多种下列已知血清型的rAAV载体可以获得有利结果：重组腺相关病毒血清型1型(rAAV1)，重组腺相关病毒血清型2型(rAAV2)，重组腺相关病毒血清型3型(rAAV3)，重组腺相关病毒血清型4型(rAAV4)，重组腺相关病毒血清型5型(rAAV5)，重组腺相关病毒血清型6型(rAAV6)，重组腺相关病毒血清型7型(rAAV7)，重组腺相关病毒血清型8型(rAAV8)或重组腺相关病毒血清型9型(rAAV)载体。在某些应用中，本发明的rAAV载体可以是自身互补型rAAV(scAAV)载体。
在需要光受体特异性启动子的实施方案中，本文公开的rAAV载体可以包括至少第一光受体特异性视紫红质蛋白激酶启动子。示例性的这种启动子包括人类视紫红质蛋白激酶启动子，其显示在SEQIDNO：12中。在本发明的某些情况下，当希望对治疗性构建物进行组织特异性(特别是光受体特异性)表达时，使用包括来自于SEQIDNO：12的至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45或至少约50个或更多个连续核苷酸的启动子序列是特别优选的。
同样地，在需要遍在启动子的实施方案中，本文公开的rAAV载体可以包括至少第一截短的嵌合CMV-鸡β-肌动蛋白启动子。示例性的这种启动子包括截短的嵌合CMV-鸡β-肌动蛋白启动子，其显示在SEQIDNO：13中。在本发明的某些情况下，当希望对治疗性基因进行非组织特异性表达时，使用包括来自于SEQIDNO：13的至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45或至少约50个或更多个连续核苷酸的启动子序列是特别优选的。
在某些实施方案中，在所公开的治疗性基因构建物中使用的启动子序列可以包含包括来自于SEQIDNO：12或SEQIDNO：13任一项中所示的启动子序列的至少55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约105、约110、约115或约120个或更多个连续核苷酸的核酸序列，或基本上由所述核酸序列构成或可选地由所述核酸序列构成。
本文公开的基因疗法载体还可以进一步任选包括一个或多个“上游”或“下游”调控序列，例如与所述至少第一核酸区段可操作地连接的第一增强子，或转录调控区例如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件。本发明的构建物还可以进一步任选包括与编码治疗剂的所述至少第一核酸区段可操作地连接的一个或多个内含子序列，
编码本发明的哺乳动物鸟苷酸环化酶蛋白、肽和多肽的核酸区段可以源自于天然、半合成或全合成序列，但是优选为哺乳动物来源的。示例性的哺乳动物来源包括但不限于人类、非人类灵长类、鼠类、猫类、犬类、猪类、绵羊类、牛类、马类、epines、山羊类和狼类等。
本文公开的rAAV载体可以任选被包含在一种感染性腺相关病毒粒子、感染性腺相关病毒体内或大量感染性AAV粒子的一个或多个内。因此，本发明也涵盖了含有一种或多种所公开的rAAV遗传构建物的病毒体、病毒粒子以及分离的重组宿主细胞。用于本发明实践的特别优选的宿主细胞包括但不限于包含rAAV载体、AAV病毒体或大量感染性病毒粒子中的一种或多种的分离的哺乳动物宿主细胞。
在其他情况下，本发明提供了新的并且有用的组合物，所述组合物包括下列一种或多种：一种rAAV载体，一种rAAV病毒体，一种rAAV感染性病毒粒子，大量这样的病毒体或感染性粒子，或包含所述载体、病毒体、感染性粒子或这些物质的多种的分离的哺乳动物宿主细胞。优选情况下，这样的组合物还任选包含一种或多种可药用缓冲液、载体、介质、稀释剂等，并可以进一步任选包括一种或多种脂类、脂质体、脂复合体、醇质体(ethosome)、类脂囊泡(niosome)、纳米粒子、微粒、脂质球(liposphere)、纳米囊或其任何组合。优选情况下，这样的组合物优选被配制成施用于人类的眼睛，并可用于治疗或预防方法中，特别是人类视网膜营养不良、疾病或病症(例如LCA1)的治疗或预防方法中。
正如下面提到的，本发明还包括诊断、治疗和预防用试剂盒，其包含本文公开的一种或多种rAAV载体构建物。这样的试剂盒可以进一步任选包括使用所述组分在人类中诊断、预防、治疗或改善视网膜营养不良、疾病、病症或异常状态的一种或多种症状的一种或多种方案、施用方法或说明书。在某些情况下，特别设想了用于治疗被诊断患有莱伯氏先天性黑蒙-1(LCA-1)的人类患者的治疗用试剂盒。
本发明还涵盖了一种或多种所公开的基于rAAV的组合物在哺乳动物疾病或病症的治疗或预防中的用途。同样地，本发明包括使用所公开的组合物制造药物，用于诊断、预防、治疗或改善哺乳动物眼睛的疾病、病症、机能障碍或异常状态的一种或多种症状，特别是用于在人类中治疗或改善莱伯氏先天性黑蒙-1(LCA-1)的一种或多种症状。
本发明还提供了用于在哺乳动物中预防、治疗或改善疾病、机能障碍、病症、缺陷或异常状态的一种或多种症状的方法。这样的方法一般来说包括向有需要的哺乳动物以足够长的时间施用有效量的本文公开的rAAV组合物，以在所述哺乳动物中预防、治疗和/或改善疾病、机能障碍、病症、缺陷或异常状态的一种或多种症状。这样的哺乳动物优选患有、被怀疑患有、有风险发生或已被诊断具有至少第一视网膜病症、疾病或营养不良，包括例如莱伯氏先天性黑蒙-1(LCA-1)，或者其中所述哺乳动物有风险发生或已被诊断具有有生物活性的功能性鸟苷酸环化酶蛋白、肽或多肽的一种或多种的缺陷、缺损或不存在。哺乳动物可以是任何年龄的，但优选为有风险发生或已被诊断患有先天性视网膜营养不良例如莱伯氏先天性黑蒙-1(LCA-1)的新生儿、婴儿、幼儿或青少年。
本发明还进一步包括向有需要的哺乳动物提供治疗有效量的有生物活性的哺乳动物鸟苷酸环化酶肽、多肽或蛋白的方法。这样的方法一般至少包括在有需要的哺乳动物的合适细胞中以足够长的时间导入有效量的一种或多种本文公开的rAAV载体的步骤，以在已导入所述rAAV载体的哺乳动物的至少第一细胞群体或至少第一组织中由此产生有生物活性的鸟苷酸环化酶肽、多肽或蛋白。在方法的实践中，有需要的哺乳动物在所述哺乳动物体内或周围的一个或多个组织中，与正常哺乳动物中有生物活性的retGC1蛋白的水平相比，优选具有功能性、生物活性retGC1蛋白的一种或多种缺陷、缺乏，或基本上或完全不存在所述功能性、生物活性retGC1蛋白。在方法的某些应用中，向来自于所述哺乳动物的大量细胞离体或体外提供所述rAAV载体，并且方法还包括随后将提供后的大量细胞导入哺乳动物体内或周围的至少第一组织位点中的步骤。例如，可以将获得的大量细胞导入到所述哺乳动物的一只或两只眼内的至少第一位点中，包括例如直接注射到视网膜、视网膜下空间中，或注射到视网膜周围的一个或多个组织，或注射到整个眼睛或眼睛周围的组织中。
在特定情况下，在细胞中导入rAAV载体化的鸟苷酸环化酶基因构建物及其随后的表达，允许功能性鸟苷酸环化酶肽、蛋白或多肽的翻译，并且作为结果，视锥光受体受到保护，视锥介导的功能得以恢复。重要的是，这样的方法提供了哺乳动物眼中正常视觉行为的恢复，优选为视力的恢复。
本发明的rAAV载体的施用可以是一次性疗法的一部分，或者可以是在被治疗对象生命期中重复两次或更多次的进行性疗法的一部分。在某些情况下，所述rAAV构建物的单次施用导致鸟苷酸环化酶蛋白持续形成，并在施用后至少一个月、至少两个月、至少三个月或更长时期内保护视锥光受体并恢复视锥介导的功能和视觉行为。更优选情况下，在几个月至几年的时期内利用向哺乳动物眼睛进行治疗性构建物的一次或多次后续施用，获得长期的治疗或预防。优选情况下，在施用后至少四个月、至少五个月、至少六个月或更长时期内，哺乳动物中的视锥光受体受到保护，并且视锥介导的功能和视觉行为得以恢复。在某些情况下，在包含本文公开的组合物的治疗方法完成后至少一年、至少两年、至少三年或至少四年或更长时期内，哺乳动物中光受体的保护、视锥介导的功能和视觉行为得以恢复。本发明还提供了在患有、被怀疑患有、被诊断患有或有风险发生LCA1的哺乳动物的一个或多个视网膜细胞中提高有生物活性的retGC1蛋白的水平的方法。这样的方法一般包括在有需要的哺乳动物的至少第一视网膜细胞群体中导入一种或多种所公开的rAAV-鸟苷酸环化酶病毒载体构建物，导入的量和导入持续的时间能够有效提高所述哺乳动物的一种或多种视网膜细胞中有生物活性的retGC1蛋白的水平。特别设想了将这样的方法用于在哺乳动物中预防、治疗或改善视网膜营养不良的一种或多种症状，并且可以优选包括向哺乳动物的视网膜、视网膜下空间或眼睛直接或间接施用一种或多种所公开的治疗性构建物，施用的量和施用持续的时间足以在所述哺乳动物中治疗或改善视网膜营养不良的一种或多种症状。
本发明还提供了用于在哺乳动物中预防、治疗或改善鸟苷酸环化酶蛋白缺陷的症状，特别是用于在表现出与有生物活性的鸟苷酸环化酶多肽的缺陷相关的一种或多种病症的人类中治疗或减轻缺陷的严重性或程度的组合物和方法。总的来说，所述方法包括向动物施用在可药用介质中的编码一种或多种鸟苷酸环化酶肽、多肽或蛋白的至少第一基于rAAV的遗传构建物，施用的量和施用持续的时间足以在被怀疑患有这样的病症或其一种或多种症状的动物中治疗或改善所述缺陷。可用于本发明的实践的示例性鸟苷酸环化酶多肽包括但不限于具有鸟苷酸环化酶活性的，并且在一级氨基酸序列上与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10或SEQIDNO：11中公开的任一序列基本上同一的肽、多肽和蛋白，及其生物功能性等同物或其衍生物。可用于本发明的实践的其他示例性鸟苷酸环化酶肽、蛋白和多肽包括但不限于包含编码哺乳动物鸟苷酸环化酶的氨基酸序列，特别是在SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10或SEQIDNO：11中公开的序列，以及基本上由所述序列构成或由所述序列构成的肽、蛋白和多肽，及其生物功能性等同物或其衍生物。
RAAV-鸟苷酸环化酶载体组合物
在第一实施方案中，本发明提供了一种rAAV载体，其包含一种多肽，所述多肽包含编码鸟苷酸环化酶蛋白、肽或多肽，特别是哺乳动物鸟苷酸环化酶蛋白、肽或多肽(或其有生物活性的片段或衍生物)的至少第一核酸区段，所述核酸区段与能够在用所述载体转化的适合宿主细胞中表达所述核酸区段的至少第一启动子可操作地连接。在优选实施方案中，所述核酸区段编码哺乳动物、特别是人类的鸟苷酸环化酶肽、多肽或蛋白，特别是包含至少第一连续氨基酸序列的肽、多肽或蛋白，所述连续氨基酸序列与来自于SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10或SEQIDNO：11中公开的一种或多种氨基酸序列的至少第一30个连续氨基酸的序列具有至少约90％的同源性，或者，所述核酸区段编码所述肽、多肽或蛋白的有生物活性的片段或变体。
优选情况下，所述多肽包含至少第一连续氨基酸序列，所述连续氨基酸序列与来自于SEQIDNO：1的至少30、至少40、至少50、至少60、至少70或至少80个连续氨基酸的序列具有至少90％、至少95％或至少98％的同源性，更优选情况下，所述多肽包含与来自于SEQIDNO：1的至少90个连续氨基酸的序列至少99％同源的至少第一连续氨基酸序列。
可选地，本发明的治疗性构建物可以包含编码任何哺乳动物来源的鸟苷酸环化酶多肽的核酸区段，例如鼠类、灵长类、绵羊类、猪类、牛类、马类、epines、山羊类、犬类、猫类和/或狼类来源的核酸、肽和多肽，或者可以包含最初从一种或多种哺乳动物物种获得，并进行了遗传修饰以在人类细胞中表达，使得它们的鸟苷酸环化酶活性得以保留的修饰后的或位点特异性诱变处理后的核酸区段。
在另一个优选实施方案中，用于本发明实践的优选核酸区段编码哺乳动物、特别是人类的鸟苷酸环化酶多肽或其有生物活性的片段或变体。
包含在本发明的载体和病毒粒子中的多核苷酸，优选包含与本文中所述的编码鸟苷酸环化酶的核酸区段可操作地连接的至少第一组成型或诱导型启动子。这样的启动子可以是同源或异源启动子，并可以可操作地置于编码鸟苷酸环化酶多肽的核酸区段的上游，使得编码鸟苷酸环化酶的区段的表达在所述启动子的控制之下。构建物可以包含单个启动子，或者可选地，可以使用两个或更多个启动子来促进编码鸟苷酸环化酶的DNA序列的表达。
可用于本发明实践的示例性启动子包括但绝不限于可以在哺乳动物、特别是人类的宿主细胞、组织和器官中操作的启动子序列，例如遍在启动子如CMV启动子、β-肌动蛋白启动子、杂合CMV启动子、杂合CMV-β-肌动蛋白启动子、截短的CMV启动子、截短的β-肌动蛋白启动子、截短的杂合CMV-P-肌动蛋白启动子、EF1启动子、U1a启动子或U1b启动子；或一种或多种细胞特异性或组织特异性启动子(包括例如光受体特异性启动子如视紫红质蛋白激酶启动子[hGRK1])或可诱导启动子例如Tet可诱导启动子或VP16-LexA启动子。
在示例性实施方案中，编码治疗性多肽的多核苷酸被置于遍在的截短的杂合鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子的控制之下，或置于光受体细胞特异性(hGRK1)启动子的控制之下，在用所述遗传构建物转化适合的宿主细胞、并且编码所述鸟苷酸环化酶多肽的DNA在这样的细胞中表达时，该多核苷酸被用于生产治疗有效水平的被编码的鸟苷酸环化酶多肽。适合的hGRK1启动子的实例显示在SEQIDNO：12中，而适合的遍在启动子例如截短的杂合鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子，显示在SEQIDNO：13中。
包含在本发明的载体和病毒粒子中的多核苷酸也可以进一步任选包含一个或多个本源的、合成的、同源的、异源的或杂合的增强子或5’调控元件，例如天然增强子如CMV增强子或可选的合成增强子。还设想了细胞特异性或组织特异性增强子、包括例如增加可操作地连接的基因序列的表达的增强子，在本发明的实践中特别有用。这样的增强子可以包括但不限于视网膜特异性增强子、视杆特异性增强子、视锥细胞特异性增强子等。
包含在本发明的载体和病毒粒子中的多核苷酸和核酸区段也可以进一步任选包含一个或多个内含子序列。在这样的情形中，内含子序列优选为哺乳动物来源的，更优选为人类来源的。
包含在本发明的载体、病毒体、病毒粒子、宿主细胞或组合物中的DNA序列、核酸区段和多核苷酸还可以进一步任选包含一个或多个本源的、合成的、同源的、异源的或杂合的转录后的或3’调控元件，其相对于本文公开的编码鸟苷酸环化酶的核酸区段被可操作放置，以提供被编码多肽的更高的表达、更高的稳定性和/或增强的翻译。一个这样的实例是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，其被可操作地置于鸟苷酸环化酶基因的下游。诸如这样的元件在这种情况下的使用，对于分子生物学技术领域的专业人员来说是公知的。
在示例性实施方案中，本发明涉及一种或多种有生物活性的鸟苷酸环化酶蛋白、肽或多肽的施用，所述蛋白、肽或多肽包含来自于下文中公开的多肽和肽序列、特别是来自于在SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10或SEQIDNO：11任一项中列出的多肽的至少约10、至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约55、至少约60、至少约65、至少约70、至少约75、至少约80、至少约85、至少约90、至少约95或至少约100个或更多个连续氨基酸的序列。
同样地，在其他示例性实施方案中，本发明涉及由核酸区段编码的一种或多种有生物活性的鸟苷酸环化酶蛋白、肽或多肽的施用，所述核酸区段包含来自于下文所公开的核酸区段、特别是来自于编码任一种或多种哺乳动物鸟苷酸环化酶蛋白、包括例如在SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10或SEQIDNO：11中列出的蛋白的DNA序列的至少约10、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190或至少约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750或甚至约800个或更多个连续核酸残基，或基本上由所述连续核酸残基构成，或由所述连续核酸残基构成。
本发明的示例性腺相关病毒载体构建物和多核苷酸，包括含有下述至少第一核酸区段、基本上由其构成或由其构成的构建物和多核苷酸，所述至少第一核酸区段编码与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10或SEQIDNO：11的序列有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％同一性的肽或多肽，其中所述肽或多肽当在所选哺乳动物细胞和/或组织中表达时具有鸟苷酸环化酶活性。
在某些实施方案中，本发明的病毒载体构建物和多核苷酸优选包括含有下述至少第一核酸区段、基本上由其构成或由其构成的载体和多核苷酸，所述至少第一核酸区段编码与SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10或SEQIDNO：11中公开的一个或多个序列有至少约82％、至少约84％、至少约86％、至少约88％、至少约92％或至少约94％同一性的肽或多肽。这样的构建物优选编码当在所选哺乳动物细胞和/或组织、特别是人类细胞和/或组织中表达时，具有鸟苷酸环化酶活性的一种或多种有生物活性的肽或多肽。
本发明的示例性多核苷酸还包括含有下述至少第一核酸区段、基本上由其构成或由其构成的序列，所述至少第一核酸区段与编码SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、SEQIDNO：10或SEQIDNO：11任一个的核酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的同一性，其中由所述核酸区段编码的肽或多肽当在所选哺乳动物细胞和/或组织中表达时，具有鸟苷酸环化酶活性。
RAAV病毒粒子和病毒体以及包含它们的宿主细胞
本发明的其他方面涉及包含本发明的rAAV-鸟苷酸环化酶载体的rAAV粒子和病毒体、大量这样的粒子和毒粒，以及包含一种或多种本文公开的rAAV-鸟苷酸环化酶载体的药物组合物和宿主细胞，例如目的在于通过适合的手段施用于哺乳动物的rAAV-鸟苷酸环化酶载体或病毒体的药物制剂，所述手段例如通过肌肉内、静脉内或直接注射到哺乳动物的所选细胞、组织或器官，例如所选哺乳动物的眼睛的一个或多个区域。典型情况下，这样的组合物将如下文中所述用可药用赋形剂、缓冲液、稀释剂、佐剂或载体来配制，并可以进一步包含一种或多种脂质体、脂类、脂复合体、微球、微粒、纳米球或纳米粒子制剂，以促进向需要治疗的所选器官、组织和细胞的施用。
本发明的其他方面包括包含本文公开的一种或多种rAAV载体、病毒体或感染性病毒粒子的哺乳动物宿主细胞和大量所述细胞。特别优选的细胞是人类宿主细胞，特别是人类眼组织、包括例如视网膜细胞。
治疗性试剂盒和药物组合物
用于在哺乳动物中治疗或改善由鸟苷酸环化酶缺陷引起的病状的症状的治疗性试剂盒，也是本发明的一部分。示例性的试剂盒优选包含一种或多种本文中描述的公开的AAV-鸟苷酸环化酶载体构建物、病毒体或药物组合物，以及使用所述试剂盒的说明书。这样的试剂盒在鸟苷酸环化酶缺陷、特别是视网膜特异性鸟苷酸环化酶-1缺陷的治疗方法中的使用，优选在患病哺乳动物中用于retGC1缺损或缺陷的治疗和视网膜营养不良例如LCA-1的治疗。
本发明的另一个重要方面涉及使用本文中描述的公开的载体、病毒体、组合物和宿主细胞制备药物，所述药物用于在哺乳动物、特别是人类中治疗或改善鸟苷酸环化酶缺陷的症状。这样的组合物在药物制备和神经和/或中枢神经系统缺损、包括例如由视网膜GC1的缺陷或缺损引起的病状、例如视网膜营养不良如LCA-1的治疗方法中的使用，一般包括向需要的哺乳动物、特别是人类施用一种或多种所公开的病毒载体、病毒体、宿主细胞或包含它们中的一种或多种的组合物，施用的量和施用持续的时间足以在患病哺乳动物中治疗或改善这种缺陷的症状。方法还可以包括对怀疑患有这样的病状的动物进行预防性治疗，或者在诊断之后或症状出现之前向有风险发生这样的病状的动物施用这样的组合物。
本发明的另一方面涉及包含本文所述的一种或多种公开的腺相关病毒载体、病毒体、病毒粒子和宿主细胞的组合物。特别设想了将包含这些物质的药物组合物用于疗法中，特别是用于制备药物以治疗患病哺乳动物、特别是人类。
治疗方法
本发明还提供了用于将治疗有效量的鸟苷酸环化酶多肽递送至有需要的哺乳动物的方法。这样的方法一般来说至少包括向这样的哺乳动物提供或施用一种或多种本文公开的鸟苷酸环化酶组合物的步骤。例如，方法可以包括向这样的哺乳动物提供本文描述的一种或多种rAAV载体、病毒体、病毒粒子、宿主细胞或药物组合物。优选情况下，这样的提供或这样的施用的量和持续的时间能够有效地向哺乳动物的所选细胞、组织或器官提供治疗有效量的本文公开的一种或多种鸟苷酸环化酶多肽，特别是向哺乳动物眼睛的细胞提供治疗有效的水平。这样的方法可以包括治疗剂的系统性注射，或甚至可以包括治疗性组合物向哺乳动物的特定细胞、组织或器官的直接或间接施用、注射或导入。
例如，治疗性组合物可以通过向眼睛的组织或向视网膜或向视网膜下空间或向哺乳动物眼内的一种或多种特定细胞类型直接注射，来提供给哺乳动物。
本发明还提供了在动物中治疗、改善鸟苷酸环化酶缺陷的症状以及降低其严重性的方法。这些方法一般来说至少包括向有需要的动物提供一种或多种本文公开的rAAV-鸟苷酸环化酶载体组合物的步骤，提供的量和提供的持续时间能够在动物中有效治疗retGC1多肽缺损或缺陷，或治疗由这样的积累引起的或由足量有生物活性的鸟苷酸环化酶多肽的表达不足或不存在所引起的机能障碍，包括视网膜营养不良例如LCA1等。如上所述，这样的方法可以包括治疗剂的系统性注射，或甚至可以包括治疗性组合物向动物的特定细胞、组织或器官的直接或间接施用、注射或导入。
本发明还涉及使用本文公开的腺相关病毒载体、病毒体、病毒粒子、宿主细胞和/或药物组合物制造药物，以在哺乳动物中治疗鸟苷酸环化酶缺损或缺陷、视网膜营养不良或LCA1或其他与GC1相关的眼科疾病、病症或机能障碍。这种应用可以包括向哺乳动物的一种或多种细胞、组织或器官系统性或局部注射、感染或施用。在患有、被怀疑患有或有风险发生一种或多种视网膜营养不良例如LCA-1的人类中，特别考虑到了这样的应用。
附图简述
下面的图构成了本说明书的一部分，包含这些图是为了进一步演示本发明的某些方面。通过结合附图来参考下面的描述，可以更好地理解本发明，在所述附图中同样的参考数字指示同样的元件，在所述附图中：
图1显示了来自于+/+(上部的波形)、未治疗的GC1KO(中间的波形)和AAV-mGC1治疗过的(下部的波形)小鼠的代表性的视锥细胞(左栏)和视杆(右栏)介导的ERG描记线。黑色描记线对应于注射有hGRK1-mGC1的眼(底部波形)和它们的未注射的对侧眼(中间波形)。红色描记线对应于注射有smCBA-mGC1的眼(底部波形)和它们的未注射的对侧眼(中间波形)。在AAV-mGC1治疗的眼中视锥响应恢复至正常值的约45％；
图2A和图2B显示了在GC1KO、同基因+/+对照、smCBA-mGC1治疗过的(图2A)和hGRK1-mGC1治疗过的(图2B)GC1KO小鼠中，明视b-波最大幅度随时间的平均值。在注射后至少3个月，smCBA-mGC1和hGRK1-mGC1治疗过的小鼠两者的视锥响应约为正常值的45％；
图3A、图3B和图3C通过视动分析显示，在用smCBA-mGC1或hGRK1-mGC1治疗的GC1KO小鼠中视觉诱发行为得以恢复。M1至M9对应于用于测试的9只小鼠。+/+对照小鼠(M1、M2)、原初GC1KO(M3、M4)、smCBA-mGC1(M5、M6、M7)和hGRK1-mGC1治疗过(M8、M9)的小鼠的明视敏锐度和对比敏感性揭示出治疗过的小鼠行为类似于视力正常的小鼠(图3B和图3C)。显示了所有+/+眼(n＝4)、GC1KO眼(n＝9)和AAV-mGC1治疗过的眼(n＝5)的平均值(图3C)。为了进行电生理比较，显示了来自于每只小鼠(M1-M9)的视锥介导的ERG应答(图3A)；
图4A、图4B、图4C、图4D、图4E和图4F显示AAV5-hGRK1-mGC1驱动GC1KO小鼠的光受体外段中GC1的表达(图4A)。在未治疗的对侧对照眼中没有观察到GC1表达(图4B)。AAV5-smCBA-mGC1驱动光受体外段中GC1的表达(图4C)，并有时驱动光受体细胞体中GC1的表达(图4F中的白色箭头)。在未治疗的对侧对照眼中没有观察到这样的GC1表达(图4D)。在AAV5-mGC1治疗过的眼中，治疗性转入基因的表达水平与在同基因+/+对照眼中观察到的相似(图4E)。所有视网膜从治疗后3个月的小鼠或年龄匹配的未治疗对照获取。图4A中的标尺条＝100μm；图4F中的标尺条＝25μm。OS＝外段，IS＝内段，ONL＝外部核层；
图5A、图5B、图5C和图5D显示了+/+、GC1KO、AAV5-smCBA-mGC1治疗过的和AAV5-hGRK1-mGC1治疗过的小鼠的视锥光受体中视锥抑制蛋白(arrestin)的表达。未治疗的GC1KO的视网膜含有特征性的混乱、分离的视锥外段(图5B)，而在治疗过的GC1KO(图5C和图5D)和+/+(图5A)的视网膜切片中视锥外段是完整的，并且视锥抑制蛋白的分布显得正常。所有视网膜从治疗后3个月的小鼠或年龄匹配的未治疗对照获取。图5D中的标尺条＝100μm。OS＝外段，IS＝内段，S＝突触末端；
图6A、图6B、图6C和图6D显示，AAV-mGC1治疗导致在治疗过的眼中视锥光受体在治疗后被保护了至少三个月。来自于hGRK1-mGC1研究(图6A：“未TX”＝未治疗的；图6C：“TX”＝治疗的)和smCBA-mGC1研究(图6B：“未TX”＝未治疗的；图6D：“TX”＝治疗的)和对侧未注射眼的对视锥抑制蛋白进行染色的代表性视网膜全固定，揭示出在用AAV-mGC1治疗过的GC1KO小鼠中视锥光受体在治疗后被保护了至少3个月。对治疗后和未治疗小鼠的中央(central)和下部(inferior)视网膜中视锥细胞的密度进行计数。在用任一种病毒载体治疗后，在两个区域中都发现了显著差异；
图7显示了脊椎动物光转导级联途径。在光刺激后，视紫红质(R)的构象变化刺激了级联事件，其包括转导素(T)和cGMP磷酸二酯酶(PDE)的活化，最终导致cGMP的水解。这种细胞内cGMP的降低引起光受体外段膜中环核苷酸门控的通道(CNG)的关闭。这些通道的关闭引起细胞的超极化，因此导致细胞内钙的急剧下降。当钙水平下降时，未结合的鸟苷酸环化酶活化蛋白(GCAP)自由刺激鸟苷酸环化酶(GC)。GC在光转导的恢复期中发挥作用，这是由于其目的是产生cGMP。当cGMP的水平被GC充分提高时，cGMP门控的通道重新开放，引起细胞的去极化并返回到暗适应状态；
图8显示了retGC1的预测结构和拓扑学，显示出与具有单一跨膜跨越区、细胞内和细胞外结构域的其他鸟苷酸环化酶的同源性。所述细胞内结构域被进一步分成“激酶样”区域和催化结构域。钙和retGC1的GCAP1依赖性调控是通过细胞内结构域(KHD)进行调控的。当光受体细胞中钙浓度高(处于暗/去极化状态)时，结合有钙的GCAP1阻止retGC1的活化。在光刺激后，钙水平降低。钙从GCAP1解离，从而允许GCAP1激活retGC1。retGC1的作用是产生cGMP；
图9显示了正常(WT)与GC1KO小鼠中视锥光受体的比较。在WT视锥中，GC1正常发挥作用以产生cGMP，其能够有效地重新打开CNG门控通道，并使细胞返回其暗适应/去极化状态。在GC1KO小鼠的视锥光受体中，GC1不能产生cGMP。这种故障阻止了CNG门控通道的重新开放。这些细胞基本上长期超极化(光适应)。它们不将光转导成视觉(正如由缺少ERG所证实的)，并且最终将退化；
图10显示了牛GC1(bovGC1)与小鼠GC1(mGC1)的氨基酸序列比对，其中包括了共有序列。位于N-端区域的可变区用红色矩形突出；
图11显示了两个示例性载体的图谱。一个载体含有遍在启动子smCBA，而另一个载体利用光受体特异性启动子hGRK1；
图12显示了来自于用AAV5-smCBA-mGC1注射的GC1KO眼的对GC1(红色)和PNA凝集素(绿色)进行染色的代表性视网膜切片，揭示出GC1表达在视锥外段(黄色重叠)以及视杆外段(单独的红色)中。hGRK1-mGC1注射的眼揭示出同样的模式；
图13A、图13B和图13C显示了GCIKO小鼠中AAV介导的视网膜功能的恢复。图13A：从在～P14时用AAV5-hGRK1-mGC1(红色)、AAV5-smCBA-mGC1(绿色)或AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1治疗的GCIKO小鼠或年龄匹配的同基因GC1+/+对照的眼记录到的代表性明视(视锥介导的)描记线。描记线在注射后4个月(左侧)、7个月(中间)和9个月(右侧)时产生。图13B：在治疗过的GCIKO小鼠、未治疗GCIKO和年龄匹配的同基因GC1+/+对照小鼠中每月使用12cds/m2刺激产生的视锥b-波的平均幅度。图13C：在治疗过与未治疗的GCIKO小鼠中随时间变化的暗视(视杆介导的)响应的比较。数值表示在治疗过与未治疗的眼中，在5cds/m2下产生的视杆b-波幅度的比率。所有三种载体都为GCIKO小鼠提供稳定长期的治疗，其中AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1是最有效的；
图14显示了用AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1治疗的GC1KO小鼠在注射后7个月被处死。AAV5-smCBA-mGC1和AAV5-hGRK1-mGC1治疗过的小鼠在注射后9个月被处死。将这些眼以及约11月龄的GC1+/+小鼠的眼制成切片，并将视网膜用针对GC1(绿色，顶排)和视锥抑制蛋白(红色，底排)产生的抗体进行染色。所有三种治疗性载体只在GC1KO小鼠的光受体中驱动GC1表达。在AAV5-hGRK1-mGC1治疗过的小鼠中观察到一些视网膜的变薄，这一结果可能是由该载体的高滴度造成的。在AAV8(Y733F)和AAV5-smCBA治疗过的小鼠中GC1的表达和视锥密度/形态与在年龄匹配的GC1+/+对照中观察到的类似。相反，年龄匹配的GC1KO小鼠的视网膜显示出不存在GC1表达和视锥细胞密度的显著降低；
图15显示在用AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1注射后7.5个月，一只GCIKO小鼠被处死，并将其视网膜用于western印迹。针对GC1的抗体显示，在治疗过的GC1KO眼中AAV介导的GC1的表达水平与在年龄匹配的同基因GC1+/+对照眼中观察到的类似。也在治疗后和未治疗的GC1KO以及GC1+/+对照眼中评估了鸟苷酸环化酶活化蛋白-1(GCAP1)(鸟苷酸环化酶的生物化学伙伴)的表达水平。与以前的报告一致，在未治疗的GC1KO眼中GCAP1蛋白被下调。AAV介导的GC1表达引起GCAP1表达增加，与在同基因GC1+/+对照中观察到的水平类似；
图16A和图16B显示了在用AAV5-smCBA-mGC1注射11个月后，将一只GC1KO小鼠处死，将其视网膜全固定并用针对视锥抑制蛋白产生的抗体进行染色的结果。免疫染色显示，除了在上视网膜中之外，在未治疗的GC1KO眼中不存在视锥(图16A)。在整个被治疗眼的视网膜中(图16B)，AAV介导的GC1表达保护视锥光受体至少11个月(研究的最后时间点)；
图17显示了一些数据，其中用AAV8(733)-hGRK1-mGC1注射的GC1KO小鼠在注射后4个月和7个月被处死。用AAV5-smCBA-mGC1和AAV5-hGRK1-mGC1注射的GC1KO小鼠在注射后7个月和10个月被处死。使用年龄匹配的原初GC1KO小鼠作为对照。分离来自于治疗后和未治疗的眼的视神经，以及含有视觉通路的右脑和左脑的部分，并将其用于回收载体基因组。注意，AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1被注射到GC1KO小鼠的左眼中，而两种AAV5载体被注射到GC1KO小鼠的右眼中。在所有情形中，只从治疗过的眼的视神经中回收到载体基因组。到AAV5载体注射后10个月时为止，没有从脑中回收到载体基因组。从注射了强的、快速作用的AAV8(733)载体的GC1KO小鼠回收到最高数量的载体基因组；
图18A和图18B显示了一些数据，其中OCT和视杆/视锥ERG来自于用AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1注射后两个月的GCdko小鼠；
图19A和图19B显示了一些数据，其中代表性的视杆和视锥ERG来自于用AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1注射后1个月的GCdko小鼠；
图20A和图20B显示了实时RT-PCR标准曲线。将荧光(Y-轴中的对数单位)对循环阈值Cτ值(X-轴)进行作图。每张图表示使用来自于野生型GC1+/+小鼠(a)或用AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1治疗后的GC1KO小鼠的视网膜cDNA获得的GC1和Gapdh转录本的标准曲线(通过总视网膜cDNA的连续稀释液产生)。使用任一模板通过GC1和Gapdh引物产生的标准曲线是平行的，表明扩增动力学相似。Cτ周期值随着模板量的降低而增加；
图21A和图21B显示了治疗后和未治疗的GC1KO小鼠和GC1+/+对照中GC1和视锥抑制蛋白的表达。图21A：使用冷冻的视网膜横断切片的免疫组织化学来定位GC1(绿色，顶排)和视锥抑制蛋白(红色，底排)在用AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1(注射后7个月)、AAV5-smCBA-mGC1(注射后10个月)或AAV5-hGRK1-mGC1(注射后10个月)载体治疗后的GC1KO小鼠以及来自于8月龄的未治疗GC1KO和GC1+/+对照小鼠的视网膜中的表达。细胞核用DAPI染色(蓝色)。所有切片以20X放大倍数成像并在相同设置下曝光。图21B：来自于用AAV5-smCBA-mGC1治疗(仅仅一只眼)后11个月的一只GC1KO小鼠的视网膜全固定物用针对视锥抑制蛋白的抗体进行的免疫染色，显示出在治疗后的眼中(底部右侧)与未治疗的对侧对照眼(底部左侧)相比对视锥光受体的显著保护。视网膜全固定物取向相同，它们的颞部部分处于12点钟位置。将全固定物的各个部分以10X放大倍数成像，并合并在一起获得最终的图像。OS＝外段；ONL＝外部核层；INL＝内部核层；
图22A和图22B显示了治疗后和未治疗的GC1KO以及未治疗的GC1+/+对照眼的视锥介导的视网膜电图(ERG)。图22A：来自于用AAV5-hGRK1-mGC1(红线)、AAV5-smCBA-mGC1(绿线)或AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1(黑线)治疗过的GC1KO眼或未治疗的年龄匹配的GC1+/+对照眼的由12cds/m2光刺激所引发的代表性视锥介导的描记线。显示了在治疗后4个月至1年之间产生的代表性描记线(顶图)。标度：y-轴＝50μV，x-轴＝20ms。图22B：在每个治疗组以及年龄匹配的未治疗的GC1KO和GC1+/+对照中，从每只小鼠计算视锥b-波最大幅度(在12cds/m2下产生的)并每月进行平均。在n>3的动物组之间作出比较。在治疗后6个月，对所有AAV治疗组进行统计学比较。在治疗后9个月，对AAV5载体治疗后的眼进行统计学比较；
图23A和图23B显示了治疗后和未治疗的GC1KO和GC1+/+对照眼的视杆介导的视网膜电图(ERG)。图23A：在用AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1(黑色圆圈)、AAV5-hGRK1-mGC1(红色圆圈)或AAV5-smCBA-mGC1(绿色三角形)载体治疗过的GC1KO小鼠的治疗后和未治疗的眼中，测定了在暗视条件下由1cds/m2刺激引发的视杆b-波幅度(顶部左侧)和a-波幅度(顶部右侧)。通过用治疗后的眼中a-或b-波的最大幅度除以未治疗眼中的最大幅度，产生治疗和未治疗眼的小鼠内的比率。在所有治疗组中对这些比率每月进行平均。在n>3的动物组之间作出比较。对所有AAV治疗组进行6个月的统计学比较。对AAV5载体也进行9个月的统计学比较。载体介导的提高由平均比率>0.8来定义。图23B：来自于一只GC1KO小鼠的代表性视杆介导的ERG描记线显示，来自于AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1治疗过的眼的视杆响应(黑线)高于从未治疗的对侧对照眼所记录到的(绿线)。该治疗过的视杆响应恢复到正常GC1+/+视杆响应(红线)的～50％；以及
图24A和图24B显示了治疗后和未治疗的GC1KO小鼠和GC1+/+对照中的蛋白质和转录本水平。图24A：来自于用AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1治疗后10个月时的一只GC1KO小鼠的眼的视网膜裂解液的用抗GC1和抗GCAP1抗体探测的免疫印迹。使用抗β-肌动蛋白抗体作为内部载样对照。图24B：在用AAV5-smCBA-mGC1治疗过的一只GC1KO的视网膜、用AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1载体治疗过的一只GC1KO的视网膜和单个未治疗的GC1KO或GC1+/+对照的视网膜中，几种转录本(GC1、GCAP1、GNAT2和PDE6α)的半定量实时RT-PCR。样品执行三份平行测定，使用Gapdh特异性引物作为标准品。数据以相对于GC1+/+对照的mRNA水平的倍数变化表示。
说明性实施方案的描述
下面对本发明的说明性实施方案进行描述。为了简明起见，没有将实际实施方式的所有特点都在本说明书中描述。当然，应该认识到，在任何这样的实际实施方案的开发中，必须做出大量实施方式特异性的决定以实现开发者的具体目标，例如符合与系统相关和与商业相关的限制，这些限制在不同实施方式之间是可变的。此外，应该认识到，这样的开发尝试可能是复杂并耗时的，但尽管如此，仍然是本公开所属技术领域的普通专业人员所从事的常规工作。
腺相关病毒
腺相关病毒-2(AAV)是可以以裂解病毒和原病毒两种形式繁殖的人类细小病毒(Cukor等，1984；Hoggan等，1972)。病毒基因组由线性单链DNA构成(Rose等，1969)，长为4679个碱基(Srivastava等，1983)，两侧带有145个碱基的末端反向重复序列(Lusby等，1982)。对于裂解生长来说，AAV需要与辅助病毒共感染。腺病毒(Atchinson等，1965；Hoggan，1965；Parks等，1967)或单纯性疱疹病毒(Buller等，1981)都能提供辅助病毒功能。没有辅助病毒时，没有AAV特异性复制或基因表达的迹象(Rose和Koczot，1972；Carter等，1983)。当没有辅助病毒可用时，AAV可以作为整合的原病毒留存(Hoggan，1965；Berns等，1975；Handa等，1977；Cheung等，1980；Berns等，1982)。
整合明显涉及AAV末端与宿主序列之间的重组，并且大部分AAV序列在原病毒中保持完整。AAV整合到宿主DNA中的能力显然是用于确保AAV序列在不存在辅助病毒的情况下存活的固有策略。当带有AAV原病毒的细胞在随后用辅助病毒重复感染时，整合的AAV基因组被挽救，并出现生产性裂解周期(Hoggan，1965)。
克隆在原核质粒中的AAV序列具有感染性(Samulski等，1982)。例如，当将野生型AAV/pBR322质粒pSM620在腺病毒存在下转染到人类细胞中时，AAV序列被从质粒中挽救出来，随即发生正常的AAV裂解周期(Samulski等，1982)。这使在重组质粒中修改AAV序列，然后通过将质粒转染到人类细胞中以生长突变体的病毒储用物成为可能(Samulski等，1983；Hermonat等，1984)。AAV含有至少3个表型上不同的区(Hermonat等，1984)。rep区编码用于DNA复制和用于从重组质粒中进行挽救所需的一种或多种蛋白，而cap和lip区似乎编码AAV衣壳蛋白，并且这些区中的突变体能够进行DNA复制(Hermonat等，1984)。已显示，AAV末端为DNA复制所需(Samulski等，1983)。
Laughlin等(1983)描述了两个大肠杆菌杂合质粒的构建，每个质粒都含有AAV的整个DNA基因组，并且在辅助腺病毒存在下将重组DNA转染到人类细胞系中以成功地挽救并复制AAV基因组(也参见Tratschin等，1984a；1984b)。
腺相关病毒(AAV)对于基因转移特别有吸引力，因为它不诱导任何病原性响应，并且能够整合到宿主细胞染色体中(Kotin等，1990)。AAV末端重复序列(TR)是染色体整合的唯一必需顺式组分(Muzyczka和McLaughin，1988)。据报道，这些TR具有启动子活性(Flotte等，1993)。它们可能促进从细胞质向细胞核的有效基因转移，或增加质粒DNA的稳定性并能进行更持久的基因表达(Bartlett和Samulski，1998)。使用含有AAVTR的重组质粒DNA进行的研究吸引了相当多的注意。已显示，在大多数细胞类型中，基于AAV的质粒与缺少AAV的TR的同样质粒相比，驱动更高水平和更长时间的转入基因表达(Philip等，1994；Shafron等，1998；Wang等，1998)。
有几种原因会促使研究人员研究使用rAAV作为表达载体的可能性。一种原因是对递送基因以整合到宿主染色体中的条件要求令人吃惊地少。必需具有145-bp的ITR，其仅为AAV基因组的6％。这在载体中留下了用于组装4.5-kbDNA插入片段的空间。尽管这种携带容量可能阻止AAV递送大基因，但它足够适合于递送本发明的反义构建物。
由于其安全性，AAV也是递送载体的良好选择。存在相对复杂的挽救机制：使rAAV移动不仅需要野生型腺病毒，而且需要AAV基因。同样地，AAV没有致病性并且不与任何疾病相关。病毒编码序列的移除使对病毒基因表达的免疫反应降至最低，因此rAAV不唤起炎性应答。因此AAV代表了用于递送本发明的编码鸟苷酸环化酶的多核苷酸的理想候选物。
rAAV载体的生产
生产rAAV载体的传统方案一般是基于三组分系统。该系统的一种组分是编码作为rAAV被包装的重组DNA的原病毒质粒。该重组DNA位于145个碱基对(bp)的AAV-2末端反向重复序列(ITR)之间，所述ITR是指导载体复制和包装的最小顺式作用AAV-2序列。该系统的第二种组分是编码AAV-2的基因rep和cap的质粒。AAV-2rep基因编码4个Rep蛋白(Rep78、68、52和40)，其以反式发挥作用，复制rAAV基因组，解开复制中间体，然后包装单链rAAV基因组。AAV-2cap基因编码构成病毒衣壳的三个结构蛋白(VP1、VP2和VP3)。因为AAV-2不能顺畅地靠自身复制，因此rAAV包装系统的第三种组分是来自于另一种DNA病毒的一组辅助病毒功能。这些辅助病毒功能产生rAAV复制和包装可以在其中有效发生的细胞环境。由腺病毒(Ad)提供的辅助病毒功能几乎专门用于生产rAAV，并由基因E1a、E1b、E2a、E4orf6和VARNA编码。系统的前两种组分一般通过转染导入到将要在其中发生复制和包装的细胞中，而辅助病毒功能通过用野生型Ad病毒重复感染来导入。
由于转染固有的低效性，传统的rAAV生产技术生产大量载体的能力受到限制。当转染规模扩大时也遇到严重困难。对野生型Ad的需要也可能减少产生的rAAV的量，因为Ad可能竞争病毒复制所需但仅以有限量存在的细胞和病毒底物。传统生产方案中遇到的另一个问题是使用Ad重复感染需要开发用于从产生的rAAV纯化Ad的高效流程。尽管这些纯化方法一般成功地消除rAAV制备物的Ad污染，但是它们也降低rAAV的滴度。还需要用于rAAV的Ad污染的严苛的测定法。
为了生产rAAV，使用双重共转染流程以1：1的摩尔比将rAAV转移载体质粒与带有AAVrep和cap基因以及rAAV复制和包装所需的Ad辅助病毒基因的pDG(Grimm等，1998)AAV辅助质粒一起导入。在转染中使用的质粒DNA通过常规的碱裂解/CsCl梯度方案进行纯化。转染按下述进行：在实验前一天将293细胞1：2分拆，使得在转染时细胞融合度约为75-80％。转染10块15-cm平板作为一批。为了产生CaPO4沉淀物，将0.7mgpDG与180μgrAAV转移载体质粒在总体积为12.5mL的0.25MCaCl2中混合。从细胞移除旧培养基，并通过向DNA-CaCl2溶液加入12.5ml预先加温至37℃的2XHBS(pH7.05)来引发CaPO4-沉淀物的形成。将DNA温育1min；将混合物转移到200mL预先加温的DMEM-10％FBS中，然后终止沉淀物的形成。立即在每块平板中分配22mL培养基，并将细胞在37℃温育48hr。在整个温育期间允许CaPO4-沉淀物保留在细胞上而不损害细胞的生存力。转染后48hr，通过以1,140xg离心10min收获细胞。然后将细胞在15ml0.15MMgCl、50mMTris-HCl(pH8.5)中，通过在干冰-乙醇和37℃水浴中的3个冷冻/融化循环进行裂解。向混合物加入Benzonase(NycomedPharmaA/S，高纯级)(终浓度为50U/mL)，并将裂解液在37℃温育30min。通过以3,700xg离心20min使裂解液澄清，并使用不连续密度梯度对含有病毒的上清液进行进一步纯化。
典型的不连续步级梯度通过将使用OptiPrep(Nycomed)的60％(wt./vol.)无菌溶液制备的碘克沙醇、即5,5”-[(2-羟基-1-3-丙二基)-双(乙酰基氨基)]双[N,N’-二(2,3-二羟基丙基-2-4,6-三碘-1,3-苯甲酰胺]置于底层并驱替密度较低的细胞裂解液来形成。具体来说，使用装备有1/27x89mm脊椎穿刺针的注射器，将15mL澄清的裂解液转移到Quick-SealUltra-Clear25x89-mm离心管(Beckman)中。注意避免气泡，因为气泡将会干扰随后管的装填和密封。使用EP-1型可变速蠕动泵(Bio-Rad)将下列物质依次铺于底层：9mL含15％碘克沙醇和1MNaCl的PBS-MK缓冲液，所述缓冲液含有酚红(每ml碘克沙醇溶液2.5μl0.5％的储用液)；5mL含40％碘克沙醇的PBS-MK缓冲液；最后是5mL含60％碘克沙醇和酚红(0.1μl/L)的PBS-MK缓冲液。将管密封，并在70Ti型转子(Beckman)中在18℃下以350,000xg离心1hr。在使用装备有截面朝向最上方的18号针头的注射器在侧面刺穿管后，吸取4mL澄清的40％步级。使用常规肝素琼脂糖亲和层析对碘克沙醇级份进行进一步纯化。
对于层析来说，典型地将2.5-mL肝素琼脂糖I型预装柱(Sigma)用20mLPBS-MK在重力下平衡。然后将rAAV碘克沙醇级份上样到预平衡过的柱，并用10mLPBS-MK洗柱。使用含有1MNaCl的相同缓冲液洗脱rAAV。在施加洗脱缓冲液后，舍弃前2ml洗脱液，病毒被收集在随后的3.5mL洗脱缓冲液中。
然后通过100K过滤器(Millipore,Bedford,MA,USA)按照制造商的说明书对病毒进行浓缩和脱盐。通过用乳酸林格氏液重复稀释浓缩的病毒来改变高盐缓冲液，并重复测定含基因组的粒子和感染性rAAV粒子两者的滴度。使用常规的点印迹法、竞争性定量PCR(QCPCR)测定法或更新的定量实时PCR(aRT-PCR)来测定粒子物理滴度(Zolotukhin等，2002；Jacobson等，2006)。感染性滴度通过感染性中心测定法(ICA)和对GFP的表达进行评分的荧光细胞测定法(FCA)(Zolotukhin等，2002)来测定。
QCPCR方法是基于一个反应管中的特定靶序列与已知浓度的内标质粒的竞争性共扩增。它提供了病毒粒子的精确快速定量。内标必须与特定模板共享引物识别位点。特定模板与内标必须以相同的效率被PCR扩增，并且必须能够分开地分析PCR扩增的产物。辨别模板与内标的最容易的方式是在两种产物中引入尺寸差异。这可以通过例如构建与特定靶具有相同序列但是含有缺失部分的标准物来实现。然后通过将特定模板的PCR信号与使用已知浓度的竞争物(内标)获得的PCR信号进行比较，来进行定量。定量实时PCR(qRT-PCR)是通过将PCR产物形成与已知DNA标准品进行实时比较，来评估未知样品的DNA浓度的标准方法。
纯化的病毒储用物首先用DNAseI进行处理，以消化任何污染的未包装DNA。将10μl纯化的病毒储用物与10UDNAsel(Boehringer,IngelheimamRhein,Germany)在含有50mMTris-HCl(pH7.5)、10mMMgCl2的100μL反应混合物中，在37℃温育1hr。在反应结束时，加入10μl10X蛋白酶K缓冲液(终浓度为10mMTris-HCl[pH8.0]，10mMEDTA，1％SDS)，然后加入1μL蛋白酶K(18.6mg/mL，Boehringer)。将混合物在37℃温育1hr。通过酚/氯仿抽提(两次)，然后用氯仿抽提并使用10μg糖原作为载体进行乙醇沉淀，对病毒DNA进行纯化。将DNA沉淀物溶解在100μl水中。QCPCR反应混合物各含1μL稀释的病毒DNA和内标质粒DNA例如pdl-GFP的两倍连续稀释液。已发现，标准DNA的最可靠范围在1至100pg之间。然后通过2％琼脂糖凝胶电泳对每个反应的等分试样进行分析，直到两种PCR产物被分辨开。使用ImageStore7500系统(UVP；Upland,CA,USA)将溴乙锭染色凝胶的模拟图像数字化。使用ZERO-Dscan图像分析系统1.0版(Scanalytics,Rockville,MD,USA)计算每条道中目标物和竞争物条带的密度，并将它们的比率作为标准DNA浓度的函数进行作图。使用1.0的比率来确定病毒储用物的DNA浓度，此时病毒DNA分子的数量等于竞争物DNA分子的数量。
使用以前发表的方案(McLaughlin等，1988)的改良方法来测量病毒感染C12细胞、脱壳和复制的能力。简单来说，将含有整合的wtAAVrep和cap基因的C2细胞(Clark等，1995)以约75％的融合率铺于96孔板中，然后用Ad5以20的M.O.I进行感染。使用荧光显微镜对1μL连续稀释的rAAV-sCNTF进行目测计数。使用高灵敏度CHROMA滤光片#41012HighQFITCLP(ChromaTechnology,BellowsFall,VA,USA)监测荧光。为了通过杂交计算滴度，基本上如以前所述对细胞进行收获和处理(McLaughlin等，1988)。
药物组合物
在某些实施方案中，本发明涉及本文公开的一种或多种rAAV-鸟苷酸环化酶组合物在可药用溶液中的制剂，将其单独用于、或与一种或多种其他治疗模式组合用于向细胞或动物的施用。
还应理解，如果需要，表达本文所公开的治疗性基因产物的核酸区段、RNA、DNA或PNA组合物，也可以与其他试剂例如蛋白质或多肽或各种药物活性剂组合施用，包括鸟苷酸环化酶多肽的一种或多种系统性或局部施用。事实上，对于还可以包含的其他组分实际上没有限制，只要附加的试剂在与靶细胞或宿主组织接触后不引起显著副作用即可。因此，rAAV载体化的鸟苷酸环化酶组合物可以与特定情况下所需的各种其他试剂一起递送。这样的组合物可以从宿主细胞或其他生物来源纯化得到，或者可选地可以如本文中所述化学合成得到。同样地，这样的组合物还可以包含取代的或衍生的RNA、DNA或PNA组合物。
可药用赋形剂和载体溶液的制剂对于本技术领域的专业人员来说是公知的，开发适合的给药剂量和治疗方案以在各种治疗方案中使用本文描述的特定组合物也同样是公知的，所述治疗方案包括例如口服、肠胃外、静脉内、鼻内、肌肉内和直接施用到动物中的一种或多种细胞或组织类型，包括例如眼、视网膜和视网膜下注射等。
典型情况下，这些制剂可以含有至少约0.1％或以上的活性化合物，尽管活性成分的百分率当然可以变化，并且在方便情况下可以在以全部制剂的重量或体积计约1或2％至约60％或70％或以上之间。自然，每种治疗上有用的组合物中活性化合物的量可以被制备成使得在化合物的任何给定单位剂量中都能获得适合的剂量。在制备这样的药物制剂时，本技术领域的普通专业人员将考虑到诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品储存期限等因素以及其他药理学考虑因素，因此，各种不同的剂量和治疗方案可能是合乎需要的。
在某些情况下，如所述通过肠胃外、静脉内、肌肉内或甚至腹膜内方式(参见例如美国专利号5,543,158、美国专利号5,641,515和美国专利号5,399,363，其每个在此明确地以其全文引为参考)递送本文公开的药物组合物，将是理想的。可以在与表面活性剂例如羟丙基纤维素适合地混合的水中，制备作为游离碱或可药用盐的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中和油中制备分散体。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
适合于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体，以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末(参见例如美国专利号5,466,468，在此明确地以其全文引为参考)。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，并且必须具有充足的流体性以便存在易注射性。它必须在制造和储存条件下稳定，必须被防腐以对抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。适合的流体性可以通过例如使用包衣如卵磷脂、在分散体的情形中通过维持所需粒径以及通过使用表面活性剂来维持。微生物作用的防止可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来产生。在许多情况下，优选包括等渗剂例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来产生。
例如，对于在水性溶液中的肠胃外施用来说，如果需要，溶液应该被适合地缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水性溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。就此而言，本技术领域的专业人员根据本公开将会知道可以使用的是无菌水性介质。例如，可以将一份剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，或加入到1000mL皮下灌注液中或注射到建议的输注位点处(参见例如《Remington药物学》(Remington'sPharmaceuticalSciences)第15版，第1035-1038和1570-1580页)。需要根据待治疗对象的状况对剂量进行一些改变。在任何情况下，用于个体对象的适合剂量将由负责施用的人决定。此外，对于人类施用来说，制剂应该满足美国食品和药物管理局(UnitedStatesFoodandDrugAdministration)(FDA)的生物制品标准办公室(OfficeofBiologiesStandards)所要求的无菌性、热原性和总体安全性和纯度标准。
无菌注射溶液通过将所需量的活性化合物掺入到在需要时含有本文列举的各种其他成分的适合溶剂中，然后进行过滤除菌来制备。一般来说，分散体通过将各种除菌过的活性成分掺入到含有基本分散介质和如上列举的所需其他成分的无菌介质中来制备。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，所述干燥技术产生活性成分加上来自于以前过滤除菌过的溶液的任何其他所需成分的粉末。
本文公开的组合物可以被配制成中性或盐形式。可药用盐包括酸加成盐(与蛋白的游离氨基形成的)，并且其使用无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。也可以从无机碱例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱例如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等产生与游离羧基形成的盐。在制剂后，将溶液以与剂型相容的方式和治疗有效的量进行施用。制剂以各种不同剂型例如注射溶液、药物释放胶囊等被容易地施用。
当在本文中使用时，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、介质、包衣、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲液、载体溶液、悬液、胶体等。将这样的介质和试剂用于药物活性物质在本技术领域中是公知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则都可以考虑用于治疗组合物中。补充活性成分也可以掺入到组合物中。
词组“可药用的”是指当施用于人类时不产生过敏或类似的不良反应的分子实体和组合物。含有蛋白质作为活性成分的水性组合物的制备在本技术领域中是公知的。典型情况下，这样的组合物被制备成可注射物，作为液体溶液或悬液；也可以制备适合在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。制剂也可以被乳化。
序列比较、同一性和同源性
对于序列比较和同源性确定来说，典型地将一个序列作为参比序列，将测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参比序列输入到计算机中，如果需要的话指定序列坐标，并指定序列算法程序的参数。然后可以使用序列比较算法根据指定的序列参数来计算测试序列相对于参比序列的序列百分同一性。
用于比较的序列的最适排列，可以例如通过局部同源性算法(参见例如Smith和Waterman，1981)、通过同源性比对算法(参见例如Needleman和Wunsch，1970)、通过搜索相似性比较方法(参见例如Pearson和Lipman，1988)、通过威斯康辛遗传学软件包(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,Madison,WI,USA)中的算法例如GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA的计算机化实施或通过目测检查来进行。适合用于确定序列百分同一性和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法(Altschul等，1990)和BLOSUM62评分矩阵(参见例如Henikoff和Henikoff，1989)。用于执行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。
除了计算序列百分同一性之外，BLAST算法还执行两个序列之间的相似性的统计分析(参见例如Karlin和Altschul，1993)。有用的序列比对算法的另一个实例是PILEUP程序，其使用渐进性成对排列从一组相关序列产生多序列排列。它也可以对显示出用于产生所述排列的聚类关系的树进行作图。PILEUP使用渐进性排列比较方法的简化形式(参见例如Feng和Doolittle，1987)，并利用与Higgins和Sharp(1989)所描述的相似的通用排列矩阵。
治疗和诊断试剂盒
本发明还包含与一种或多种可药用赋形剂、载体、稀释剂、佐剂和/或其他组分在一起的一种或多种组合物，其可用于配制特定的rAAV-鸟苷酸环化酶制剂，用于制备向哺乳动物、特别是向人类施用的用于本文所述的一种或多种鸟苷酸环化酶缺陷病状例如视网膜营养不良如LCA1的治疗剂。具体来说，这样的试剂盒可以包含一种或多种rAAV载体化的鸟苷酸环化酶组合物，并与使用所述病毒载体在哺乳动物中治疗这样的病症的说明书相组合，并且典型情况下还可以包括为了方便商业包装而准备的容器。
就此而言，对于本文公开的药物组合物的施用来说，优选的动物包括哺乳动物，特别是人类。其他优选动物包括非人类灵长类、鼠类、epines、牛类、绵羊类、马类、山羊类、狼类、兔类、狐狸类、猪类、犬类、猫类等。组合物可以包括部分纯化或显著纯化的rAAV-鸟苷酸环化酶组合物，其是单独的或与一种或多种其他活性成分组合的，所述其他活性成分可以从天然或重组来源获得，或者是可以天然地或化学合成地获得的，或者可选地从表达这样的其他活性成分的编码DNA区段的重组宿主细胞在体外生产。
还可以制备包含至少一种本文公开的组合物以及使用所述组合物作为治疗剂的说明书的治疗性试剂盒。用于这样的试剂盒的容器方式典型地可以包含至少一个小瓶(vial)、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器方式，所公开的rAAV组合物可以置于其中并优选适合地等分。当还提供第二鸟苷酸环化酶组合物时，试剂盒也可以含有第二个不同的容器方式，所述第二组合物可以置于其中。可选地，可以将多种鸟苷酸环化酶组合物制备在单一药物组合物中，并且可以包装在单一容器方式例如小瓶、烧瓶、注射器、瓶子或其他适合的容器方式中。本发明的试剂盒典型地还包括为用于商业销售将小瓶容纳在隔离限制空间中的手段，例如注模或吹模的塑料容器，所需的小瓶在其中得到防护。
在动物细胞中的表达
本发明人设想包含编码本发明的治疗性鸟苷酸环化酶多肽的连续核酸序列的多核苷酸可用于在转化的宿主细胞中治疗一种或多种细胞缺损。这样的细胞优选为动物细胞，包括哺乳动物细胞，例如从人类或非人类灵长动物或从包括但不限于鼠类、犬类、牛类、马类、epine、猫类、绵羊类、山羊类、狼类、兔类、猪类等的一种或多种哺乳动物获得的细胞。本发明人特别考虑到将这样的构建物用于在怀疑患有视网膜营养不良例如LCA1或相关的视网膜或眼疾病、病症、病状或机能障碍或有风险发生这样的病状的人类对象中治疗和/或改善所述病症的一种或多种症状。
可以将细胞用包含一种或多种所需治疗性鸟苷酸环化酶基因的一种或多种rAAV载体进行转化，以使导入到动物宿主细胞中并在其中表达的遗传构建物足以在离体、体外、外位、原位和/或体内改变、降低、改善或防止有害状况或疾病状况或其一种或多种症状。
鸟苷酸环化酶
鸟苷酸环化酶(GC)(EC4.6.1.2)是催化鸟苷三磷酸(GTP)转化成3’,5’-环鸟苷单磷酸(cGMP)和焦磷酸的裂合酶。在文献中可选地被称为“鸟苷酸环化酶(guanylcyclase)”或“鸟苷酸环化酶(guanylylcyclase)”，存在膜结合(1型)和可溶(2型)两种形式的GC。
莱伯氏先天性黑蒙
莱伯氏先天性黑蒙(LCA)是一类常染色体隐性疾病，是所有遗传性视网膜营养不良中最早和最严重的形式。与这种遗传和临床非均质性疾病的发生有关的第一个、因此被指派给LCA1基因座的基因是视网膜特异性鸟苷酸环化酶-1(Gucy2d)(Perrault等，1996)。Gucy2d编码视网膜特异性蛋白鸟苷酸环化酶(retGC1)，其主要表达在光受体外段膜中，并在这些细胞内cGMP和Ca2+水平的调控中发挥作用。在光刺激后，光受体外段中cGMP的水平由于被cGMP磷酸二酯酶(PDE)水解而快速下降。这种cGMP的降低导致cGMP门控通道的关闭、Ca2+内流减少和细胞的超极化。细胞内Ca2+的这种降低通过Ca2+与鸟苷酸环化酶活化蛋白(GCAP)的相互作用，刺激受到光刺激的光受体向暗状态恢复，所述GCAP是一类调控GC活性的钙结合蛋白。在暗适应光受体中，结合有Ca2+的GCAP抑制GC的活性。然而在光刺激后，无Ca2+的GCAP刺激GC活性，引起cGMP水平提高、cGMP门控通道的重新开放和细胞返回到去极化状态。降低或废止GC补充细胞内cGMP并重新打开cGMP门控阳离子通道的能力的突变，正如LCA1情形中那样，据认为在视杆和视锥光受体中产生了慢性曝光的生物化学等同物。
Gucy2d中的突变占所有LCA病例的～15％，使其成为这种疾病的首要病因。患有LCA1的患者数量约为患有该疾病的众所周知的RPE65形式(LCA2)的患者数量的两倍，对于后一种疾病形式来说，成功的AAV介导的基因疗法试验最近吸引了世界范围内的注意。LCA1的诊断典型地在婴儿生命的前几个月内，通过完全失明或严重视力受损、视网膜电图(ERG)熄灭和摆动性眼球震颤来做出(Perrault等，1999；Chung和Traboulsi，2009)。尽管具有这些功能性缺陷，但LCA1患者表现出正常的眼底(Perrault等，1999)，并在它们的黄斑和周边视网膜两者中将一些视杆和视锥光受体保留几年(Milam等，2003；Simonelli等，2007；Pasadhika等，2009)。最近的研究使用频域光学相干断层扫描术(SDOCT)扫描中央黄斑和中心凹周围区域，揭示出LCA1患者(年龄范围20-53岁)保留所有6个视网膜层，并具有可见的光受体内段/外段接合点。LCA1中视网膜结构的维持不同于表现出明显视网膜变薄并一般随着衰老而恶化的其他疾病形式(Pasadhika等，2009)。尽管在LCA1患者中对视网膜结构的保护不等于更好的视敏度，但说明它们更好地适合于将来的治疗策略。
动物模型
使用了在retGC1基因中携带无效突变的两种动物模型来评估基因替代疗法，即天然存在的GUCY1*B鸡和鸟苷酸环化酶-1(GC1)敲除小鼠(参见例如Williams等，2006；Haire等，2006)。GUCY1*B鸡在孵化时失明，表现出熄灭的暗视(视杆介导的)和明视(视锥介导的)ERG和视网膜退化(参见例如Ulshafer等，1984；Huang等，1998；Semple-Rowland等，1998)。慢病毒介导的Gucy2d向GUCY1*B视网膜的转移恢复了这些动物的视力，正如通过行为测试和ERG所证实的(参见例如Williams等，2006)。尽管短期治疗成功，但这种疗法不能实现视网膜结构和功能的长期保留。这种在具有卵内递送的整合病毒载体的非哺乳动物物种中获得的结果的短暂性质，表明为了开发临床应用需要更适当的翻译研究。
LCA1的哺乳动物模型、即GC1KO小鼠表现出视锥光受体退化(参见例如Yang等，1999；Coleman等，2004)。与LCA1患者相同，在这种小鼠模型中视锥功能的丧失早于视锥退化(Yang等，1999)。此外，光诱导的视锥抑制蛋白的易位被中断。在该模型中，视杆光受体不退化并继续对光产生电响应(Yang等，1999)，该结果可能是由于在这些细胞中存在GC2这种GC1的近缘物(参见例如Lowe等，1995；Yang等，1995；Yang和Garbers，1997；Karan等，2010)。AAV介导的Gucy2d向出生后GC1KO视网膜的转移，在被转导的细胞中恢复了光驱动的视锥抑制蛋白的易位，但是不能恢复视锥ERG响应或阻止视锥退化(Haire等，2006)。在由相同的研究人员进行的鸡和小鼠两者的研究中，治疗性cDNA是牛来源的，其是在历史上在评估GC1功能性的生物化学测定法中使用的蛋白质物质(Otto-Bruc等，1997；Williams等，2006)。
示例性定义
除非另有定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属技术领域的普通专业人员所通常理解的相同的意义。尽管与本文中描述的类似或等同的任何方法和组合物都可用于本发明的实践或试验，但在本文中描述了优选的方法和组合物。出于本发明的目的，下列术语定义如下：
根据长期存在的专利法惯例，当在本申请、包括权利要求书中使用时，没有具体数量的指称表示“一个或多个”。
当在本文中使用时，术语“约”应该被理解为适用于数值范围中的两个数字。例如，“约1至10”应该被理解为“约1至约10”。此外，本文中的所有数值范围应该被理解为包括所述范围内的每个整数以及十分之一的每个整数倍。当在本文中使用时，术语“约”一般应该被理解为是指“近似”，并且典型是指近似等于在数值范围内列举的给定数字的数字。此外，本文中的所有数值范围应该被理解为包括了所述范围内的每个整数。
根据本发明，多核苷酸、核酸区段、核酸序列等包括但不限于DNA(包括但不限于基因组或基因组外DNA)、基因、肽核酸(PNA)、RNA(包括但不限于rRNA、mRNA和tRNA)、核苷和适合的核酸区段，其从天然来源获得，或者是化学合成的、修饰的、或者完全或部分通过人工制备或合成的。
当在本文中使用时，术语“核酸”包括一种或多种类型的聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含有D-核糖)，以及任何其他类型的多核苷酸，其是嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷或修饰的嘌呤或嘧啶碱基(包括无碱基位点)的N-糖苷。当在本文中使用时，术语“核酸”还包括核糖核苷或脱氧核糖核苷的聚合物，其典型地通过亚基之间的磷酸二酯键共价键合，但在某些情况下通过硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等共价键合。“核酸”包括单链和双链DNA以及单链和双链RNA。示例性的核酸包括但不限于gDNA、hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA、微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、核仁小RNA(snORNA)、小核RNA(snRNA)和小时序RNA(stRNA)等，及其任何组合。
当在本文中使用时，术语“DNA区段”是指已被分离至不含特定物种的总基因组DNA的DNA分子。因此，从使用本文公开的组合物之一的生物样品中获得的DNA区段是指已与获得它们的特定物种的总基因组DNA分离开的，或纯化至不含所述总基因组DNA的一个或多个DNA区段。术语“DNA区段”中包含了DNA区段和这样的区段的更小的片段，以及重组载体包括例如质粒、黏粒、噬菌体、病毒等。
同样地，术语“RNA区段”是指已被分离至不含特定物种的总细胞RNA的RNA分子。因此，RNA区段可以是指已与其他RNA分离开或纯化至不含其他RNA的一个或多个RNA区段(本源的或合成来源的)。术语“RNA区段”中包含了RNA区段和这样的区段的更小的片段。
在本发明的情形中，术语“表达”打算包括细胞内过程的组合，其包括多核苷酸例如结构基因合成被编码的肽或多肽所经历的转录和翻译。
当在本文中使用时，术语“例如”仅仅用于示例而非限制的目的，并且不应被解释为仅仅指称在说明书中明确列举的条目。
当在本文中使用时，术语“启动子”打算一般描述调控转录的一个或多个核酸序列区域。
当在本文中使用时，术语“调控元件”打算一般描述调控转录的一个或多个核酸序列区域。示例性的调控元件包括但不限于增强子、转录后元件、转录控制序列等。
当在本文中使用时，术语“结构基因”打算一般描述被表达后用于产生被编码的肽、多肽、蛋白、核酶、催化性RNA分子或反义分子的多核苷酸，例如基因。
当在本文中使用时，术语“转化”打算一般描述将外源多核苷酸序列(例如病毒载体、质粒或重组DNA或RNA分子)导入到宿主细胞或原生质体中的过程，在所述宿主细胞或原生质体中外源多核苷酸被合并到至少第一染色体中，或者能够在被转化的宿主细胞内自主复制。转染、电穿孔和“裸”核酸摄入都是用一个或多个多核苷酸转化宿主细胞所使用的技术的实例。
当在本文中使用时，术语“被转化细胞”打算是指其核酸补充已通过将一个或多个外源多核苷酸导入到细胞中而发生改变的宿主细胞。
当在本文中使用时，术语“转基因细胞”一般打算指从被转化细胞衍生或再生或从另一个转基因细胞衍生的，或来自于这样的转化或转基因宿主细胞的任一代的后裔或后代的任何细胞。
当在本文中使用时，术语“载体”一般打算指能够在宿主细胞中复制的核酸分子，和/或另一个核酸区段可以与其可操作地连接以引起该附连区段的复制的核酸分子(典型地是DNA)。质粒、黏粒或病毒是示例性载体。
当在本文中使用时，术语“基本上对应于”、“基本上同源”或“基本上一致”是指核酸或氨基酸序列的特征，其中所选核酸或氨基酸序列当与所选参比核酸或氨基酸序列进行比较时，具有至少约70％或约75％的序列同一性。更典型情况下，所选序列与参比序列具有至少约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％或甚至约85％的序列同一性，更优选具有至少约86％的序列同一性、至少约87％的序列同一性、至少约88％的序列同一性、至少约89％的序列同一性、至少约90％的序列同一性、至少约91％的序列同一性、至少约92％的序列同一性、至少约93％的序列同一性、至少约94％的序列同一性或至少约95％或以上的序列同一性。更优选情况下，高度同源的序列通常在所选序列和与其进行比较的参比序列之间共有高于至少约96％的序列同一性、至少约97％的序列同一性、至少约98％的序列同一性或至少约99％的序列同一性。序列同一性的百分数可以在被比较的序列的整个长度上计算，或者可以通过在排除总共少于所选参比序列的约25％左右的少量缺失或添加后进行计算。参比序列可以是较大序列的子集，例如基因或侧翼序列的一部分或染色体的重复部分。
然而，在两个或更多个多核苷酸序列的序列同源性的情形中，参比序列和靶序列典型地包含至少约18至约25个连续的同一的核苷酸，更典型情况下至少约26至约35个连续核苷酸是同一的，更典型情况下至少约40、约50、约60、约70、约80、约90或甚至约100个左右的连续核苷酸是同一的。理想情况下，当需要高度同源的片段时，两个给定序列之间的总体序列百分同一性程度为至少约80％一致，优选至少约85％一致，更优选约90％一致、约91％一致、约92％一致、约93％一致、约94％一致或甚至约95％或以上一致，正如通过本技术领域的专业人员公知的一种或多种序列比较算法例如由Pearson和Lipman(1988)描述的FASTA程序分析容易地确定的。
在两个或更多个核酸或多肽序列的情形中，术语“同一的”或百分“同一性”是指两个或更多个序列或子序列是相同的，或者当进行比较并排列以获得最大对应性时，具有特定的相同氨基酸残基或核苷酸百分率，正如使用下面描述的序列比较算法之一(或普通专业人员可以获得的其他算法)或通过目测检查所计算的。
在两个核酸的情形中，词组“基本上同一的”是指两个或以上序列或子序列当进行比较并排列以获得最大对应性时，具有至少约90％、优选91％、最优选约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约98.5％、约99％、约99.1％、约99.2％、约99.3％、约99.4％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或约99.9％或更高的核苷酸残基同一性，正如使用序列比较算法或通过目测检查所计算的。这样的“基本上同一的”序列典型地被认为是“同源的”，而不是指称实际祖先。
当在本文中用于指称物体时，术语“天然存在的”是指物体可以在自然界中发现这一事实。例如，存在于可以从自然界中的来源分离到的生物体(包括病毒)中，并且没有在实验室中通过人工进行有意修改的多肽或多核苷酸序列，是天然存在的。当在本文中使用时，可能已经按照经典遗传学进行过选择性育种的实验室啮齿动物株系，被认为是天然存在的动物。
当在本文中使用时，“异源的”根据预定的参比基因序列来定义。例如，对于结构基因序列来说，异源启动子被定义为天然情况下不存在于参比结构基因附近，而是通过实验室操作来放置的启动子。同样地，异源基因或核酸区段被定义为天然情况下不存在于参比启动子和/或增强子元件附近的基因或区段。
当在本文中使用时，术语“同源性”是指两个或多个多核苷酸或多肽序列之间的互补性程度。当第一核酸或氨基酸序列与第二核酸或氨基酸序列具有完全相同的一级序列时，可以用单词“同一性”代替单词“同源性”。序列同源性和序列同一性可以通过用本技术领域已知的算法和计算机程序对两个或多个序列进行分析来确定。这样的方法可用于评估给定序列是否与另一个所选序列一致或同源。
当在本文中使用时，“同源的”在指称多核苷酸时是指序列尽管来自于不同来源，但具有同样的主要核苷酸序列。典型情况下，同源的核酸序列源自于近缘基因或具有一个或多个基本上类似的基因组序列的生物体。相反，“类似的”多核苷酸是与来自不同物种或生物体的多核苷酸共有相同功能，但是可能具有显著不同的编码为实现相似功能或具有相似生物活性的一个或多个蛋白或多肽的一级核苷酸序列的多核苷酸。类似的多核苷酸通常可能源自于非近缘(例如在遗传上或系统发生上)的两种或更多种生物体。
当在本文中使用时，术语“多肽”打算涵盖单个“多肽”以及多个“多肽”，并包括任意一条或多条具有两个或更多个氨基酸的链。因此，当在本文中使用时，包括但不限于“肽”、“二肽”、“三肽”、“蛋白质”、“酶”、“氨基酸链”和“连续氨基酸序列”的术语都包含在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可用于代替任何这些术语或可以与这些术语互换。术语还包括已经历过一次或多次翻译后修饰的多肽，所述修饰包括但不限于例如糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、衍生化、蛋白水解切割、翻译后加工或包含一个或多个非天然存在的氨基酸的修饰。本技术领域中存在用于多核苷酸和多肽结构的常规命名法。例如，单字母和三字母缩写被广泛用于描述氨基酸：丙氨酸(A；Ala)，精氨酸(R；Arg)，天冬酰胺(N；Asn)，天冬氨酸(D；Asp)，半胱氨酸(C；Cys)，谷氨酰胺(Q；Gln)，谷氨酸(E；Glu)，甘氨酸(G；Gly)，组氨酸(H；His)，异亮氨酸(I；Ile)，亮氨酸(L；Leu)，甲硫氨酸(M；Met)，苯丙氨酸(F；Phe)，脯氨酸(P；Pro)，丝氨酸(S；Ser)，苏氨酸(T；Thr)，色氨酸(W；Trp)，酪氨酸(Y；Tyr)，缬氨酸(V；Val)和赖氨酸(K；Lys)。本文描述的氨基酸残基优选采取“L”异构体形式。然而，采取“D”异构体形式的残基可以代替任何L-氨基酸残基，只要多肽的所需性质得以保留即可。
“蛋白”在本文中可以与“肽”和“多肽”互换使用，并包括合成、重组或体外生产的肽和多肽以及在将核酸序列施用到宿主动物或人类对象中之后在体内表达的肽和多肽两者。术语“多肽”优选打算指称所有的氨基酸链长，包括长度为约2至约20个氨基酸残基的短肽，长度为约10至约100个氨基酸残基的寡肽，以及长度为约100至约5,000个或更多个氨基酸残基的多肽。术语“序列”当指称氨基酸时，涉及给定氨基酸链例如多肽或蛋白中全部或一部分从N-端至C-端的线性氨基酸顺序；“子序列”是指序列内任何连续的氨基酸区段，例如给定蛋白或多肽序列内的至少3个连续氨基酸。对于核苷酸和多核苷酸链来说，“序列”和“子序列”具有与核苷酸的5’至3’顺序相关的类似意义。
当在本文中使用时，术语“基本上同源的”包含在一级核苷酸序列水平上明显彼此相似的两个或多个生物分子序列。例如，在两个或更多个核酸序列的情形中，“基本上同源的”可以是指至少约75％、优选至少约80％、更优选至少约85％或至少约90％一致、还更优选至少约95％、更优选至少约97％一致、更优选至少约98％一致、更优选至少约99％一致、还更优选完全一致(即100％或“不变的”)的序列。
同样地，当在本文中使用时，术语“基本上同一的”包含在核苷酸水平上表现出高度同一性的两个或更多个生物分子序列(特别是多核苷酸序列)。例如，在两个或更多个核酸序列的情形中，“基本上同一的”可以是指彼此至少约80％、更优选至少约85％或至少约90％一致、还更优选至少约95％、更优选至少约97％一致、更优选至少约98％一致、更优选至少约99％一致、还更优选完全一致(即100％一致或“非退化的”)的序列。
术语“重组的”表明材料(例如多核苷酸或多肽)已通过人类干预被人为或合成(非天然)地改变。改变可以在材料处于其天然环境或状态中时或从所述环境或状态中取出后执行。具体来说，例如，启动子序列当通过人为工程化改造的核酸区段的表达来产生时，是“重组的”。例如，“重组核酸”是通过在例如克隆、DNA改组或其他步骤期间对核酸进行重组或通过化学或其他诱变方法所制造的核酸；“重组多肽”或“重组蛋白”是通过重组核酸的表达而产生的多肽或蛋白；“重组病毒”例如重组AAV病毒通过重组核酸的表达而产生。
当在本文中使用时，术语“可操作地连接”是指以功能上关联的方式连接两个或更多个多核苷酸或两个或更多个核酸序列。当核酸被放置成与另一个核酸序列功能上关联时，该核酸是“可操作地连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的表达，则其与所述编码序列可操作地连接。“可操作地连接的”意味着被连接的核酸序列典型是邻接的或基本上邻接的，并且在需要连接两个蛋白编码区时，是邻接并且在阅读框内的。由于增强子通常在与启动子相隔几千碱基时发挥作用，并且内含子序列可能具有可变的长度，因此某些多核苷酸元件可能是可操作地连接的但并不邻接。
“转录调控元件”是指单独或与一个或多个其他核酸序列组合时激活转录的多核苷酸序列。转录调控元件可以包含例如一个或多个启动子、一个或多个响应元件、一个或多个负调控元件和/或一个或多个增强子。
当在本文中使用时，“转录因子识别位点”和“转录因子结合位点”是指多核苷酸序列或序列基元，其被鉴定为是用于一种或多种转录因子的序列特异性相互作用的位点，所述相互作用通常采取直接的蛋白质-DNA结合的形式。典型情况下，转录因子结合位点可以通过DNA足迹法、凝胶迁移率变动测定法等来鉴定，和/或可以在已知共有序列基元的基础上或者通过本技术领域的专业人员已知的其他方法来预测。
“转录单位”是指一个多核苷酸序列，其包含：至少第一结构基因，所述结构基因与至少第一顺式作用启动子序列可操作地连接，并且任选可操作地连接有所述结构基因序列的高效转录所需的一个或多个其他顺式作用核酸序列；可能为可操作地置于启动子和/或增强子元件控制之下的结构基因序列的适合的组织特异性和发育性转录所需的至少第一远端调控元件；以及高效转录和翻译必需的任何其他顺式序列(例如多腺苷化位点、mRNA稳定性控制序列等)。
术语“基本上互补的”当用于定义氨基酸或核酸序列时，是指特定主题序列例如寡核苷酸序列与所选序列的全部或一部分基本上互补，因此将与所选序列编码的mRNA的一部分特异性结合。就此而言，典型情况下序列将与mRNA“靶”序列高度互补，并且在序列的整个互补部分中具有不超过约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个左右的错配。在许多情况下，序列完全匹配，即与特异性结合于寡核苷酸的序列完全互补，从而沿着互补区段没有错配，将是理想的。因此，高度互补的序列典型情况下相当特异地结合于mRNA的靶序列区域，因此将高效地减少和/或甚至抑制靶mRNA序列翻译成多肽产物。
基本上互补的核酸序列与特异性结合所述核酸的相应核酸靶序列具有高于约80％的互补性(或“准确匹配百分数”)，更优选与特异性结合所述核酸的相应靶序列具有高于约85％的互补性。如上所述，在某些情况下，希望将更加基本上互补的核酸序列用于本发明的实践，并且在这样的情况下，核酸序列与特异性结合所述核酸的相应靶序列具有高于约90％的互补性，在某些实施方案中可能与特异性结合所述核酸的相应靶序列具有高于约95％的互补性，甚至与特异性结合所设计的核酸的靶序列的全部或一部分具有高达并包括约96％、约97％、约98％、约99％和甚至约100％的准确匹配互补性。
任何所公开的核酸序列的相似性百分数或互补性百分数，可以例如使用可以从威斯康辛大学遗传学计算机组(UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup)(UWGCG)获得的GAP计算机程序6.0版对序列信息进行比较来确定。GAP程序利用Needleman和Wunsch的比对方法(1970)。简单来说，GAP程序将相似性定义为相同的对齐符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列的较短者中符号的总数。用于GAP程序的优选缺省参数包括：(1)用于核苷酸的一元比较矩阵(包含表示同一的值1和表示不同一的值0)，以及Gribskov和Burgess(1986)的权重比较矩阵；(2)每个间隙罚分为3.0，每个间隙中的每个符号附加0.10罚分；以及(3)末端间隙不罚分。
当在本文中使用时，术语“蛋白”、“多肽”和“肽”可互换使用，并包括含有将两个或更多个氨基酸残基连接在一起的至少一个酰胺键的分子。尽管可互换使用，但一般来说肽是相对短(例如长度为2至约100个氨基酸残基)的分子，而蛋白或多肽是相对较长的聚合物(例如长度为100个或更多个的残基)。然而，除非由链长特别定义，否则术语肽、多肽和蛋白可互换使用。
当在本文中使用时，术语“患者”(也可互换地被称为“宿主”或“对象”)是指可作为本文讨论的一种或多种基于rAAV的鸟苷酸环化酶组合物的受者的任何宿主。在某些情况下，受着可以是旨在表示任何动物物种(优选为哺乳动物物种例如人类)的脊椎动物。在某些实施方案中，“患者”是指任何动物宿主，包括但不限于人类和非人类灵长类、牛类、犬类、山羊类、cavines、乌鸦类、epines、马类、猫类、山羊类、lapines、兔类、狼类、鼠类、绵羊类、猪类、racines、狐狸类等，包括但不限于驯养家畜、放牧或迁移动物、外来或动物园物种以及伴侣动物、宠物和兽医从业人员护理下的任何动物。
当在本文中使用时，术语“载体”打算包括制药学上可接受用于向相关动物施用或视情况而定可接受用于诊断目的的任何溶剂、分散介质、包衣、稀释剂、缓冲液、等渗剂、溶液、悬液、胶体、惰性物质等或其组合。将一种或多种递送介质用于基因疗法构建物、病毒粒子、载体等，对于制药和分子技术领域的普通专业人员来说是公知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则都可以考虑将其用于预防和/或治疗性组合物中。一种或多种补充活性成分也可以掺入到一种或多种本公开的组合物中，或者与其联合施用。
当在本文中使用时，“有效量”应该被本技术领域的普通专业人员理解为向受着患者提供治疗、预防或其他有益效果。
词组“分离的”或“生物纯的”是指材料基本上或实质上不含通常在天然状态下被发现伴随着所述材料的组分。因此，本发明的分离的多核苷酸优选不含在其天然或原位环境中通常伴随这些多核苷酸的材料。
“连接”或“联合”是指本技术领域中已知的用于将一个或多个蛋白、肽、核酸或多核苷酸进行功能性连接的任何方法，包括但不限于重组融合、共价键合、二硫键合、离子键合、氢键键合、静电键合等。
当在本文中使用时，术语“质粒”或“载体”是指由遗传物质(即核酸)构成的遗传构建物。典型情况下，质粒或载体含有在细菌宿主细胞中例如大肠埃希氏杆菌中有功能的复制原点以及用于检测包含质粒的细菌宿主细胞的可选择标志物。本发明的质粒和载体可以包括本文所述的一个或多个遗传元件，其被排列成使得插入的编码序列可以在适合的表达细胞中转录和翻译。此外，质粒或载体可以包括一个或多个核酸区段、基因、启动子、增强子、激活子、多克隆区域或其任何组合，包括从一个或多个天然和/或人造来源获得或衍生的区段。
术语“基本上如SEQIDNO：X中所示的序列”是指所述序列基本上对应于SEQIDNO：X的一部分并具有相对少的与SEQIDNO：X的核苷酸(或在多肽序列的情形中为氨基酸)不同一的核苷酸(或氨基酸)，或所述序列的核苷酸(或氨基酸)的有生物功能的等同物。术语“有生物功能的等同物”在本技术领域中是公知的，并且在本文中进一步详细定义。因此，具有约85％至约90％、或更优选约91％至约95％、或还更优选约96％至约99％的与本文提供的一个或多个核苷酸序列一致或功能上等同的核苷酸的序列，被具体设想用于本发明的实践。
用于本发明的适合的标准杂交条件包括例如在50％甲酰胺、5xDenhardts溶液、5xSSC、25mM磷酸钠、0.1％SDS和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA中，在42℃下杂交16h，然后用0.1xSSC、0.1％SDS溶液在60℃下连续洗涤1hr以除去所需量的背景信号。用于本发明的较低严紧性杂交条件包括例如在35％甲酰胺、5xDenhardts溶液、5xSSC、25mM磷酸钠、0.1％SDS和100μg/ml变性的鲑鱼精子DNA或大肠杆菌DNA中，在42℃下杂交16h，然后用0.8xSSC、0.1％SDS在55℃下连续洗涤。本技术领域的专业人员将会认识到，条件可以容易地进行调整以获得所需的严紧性水平。
当然，本发明还包括与本文中具体所示的至少一个或多个特定核苷酸序列互补、主要互补和/或基本上互补的核酸区段。“互补的”核酸序列是能够按照标准的Watson-Crick互补性规则进行碱基配对的序列。当在本文中使用时，术语“互补序列”是指基本上互补的核酸序列，其可以通过与上面提出的核苷酸比较相同的方法进行评估，或者被定义为能够在例如就在前面所述的相对严紧条件下与一个或多个本文公开的特定核酸区段杂交。
如上所述，本发明的探针和引物可以是任何长度。通过为序列指派数值，例如第一个残基为1，第二个残基为2等，可以提出算法来定义在给定序列中包含的所有探针或引物：
n至n+y，其中n是从1至序列的最后一个编号的整数，y是探针或引物的长度减去1，其中n+y不超过序列的最后一个编号。因此，对于25个碱基对的探针或引物(即“25-mer”)来说，探针或引物的集合对应于序列整个长度上的1至25位碱基、2至26位碱基、3至27位碱基、4至28位碱基等。同样地，对于35个碱基对的探针或引物(即“35-mer”)来说，示例性的引物或探针序列包括但不限于对应于序列整个长度上的1至35位碱基、2至36位碱基、3至37位碱基、4至38位碱基等的序列。同样地，对于40-mer来说，这样的探针或引物可以对应于从第一碱基对至bp40、从序列的第二bp至bp41、从第三bp至bp42等的核苷酸，而对于50-mer来说，这样的探针或引物可以对应于从bp1延伸至bp50、从bp2延伸至bp51、从bp3延伸至bp52、从bp4延伸至bp53等的核苷酸序列。
在某些实施方案中，有利的是使用本发明的一个或多个核酸区段与适合的可检测标志物(即“标记物”)的组合，例如在杂交测定法中使用标记的多核苷酸探针确定给定靶序列的存在的情形中。在本技术领域中已知大量各种用于标记寡核苷酸探针的适合的指示化合物和组合物，包括但不限于能够在适合的测定法中检测的荧光、放射活性、酶或其他配体例如亲和素/生物素等。在特定实施方案中，人们也可以利用一种或多种荧光标记物或酶标签例如脲酶、碱性磷酸酶或过氧化物酶代替放射活性或其他在环境上不太理想的试剂。在酶标签的情形中，已知比色、产色或产荧光指示底物可用于提供可以通过人眼观察或通过分析方法例如闪烁法、荧光测定法、分光光度测定法等检测样品，以鉴定与含有一个或多个互补或基本上互补的核酸序列的样品的特异性杂交的方法。在同时或顺序检测两个或多个标记探针的所谓的“多路”测定法的情形中，可能希望用具有第一检测性质或参数(例如发射和/或激发光谱最大值)的第一标记物来标记第一寡核苷酸探针，并用具有不同的(即可以与第一标记物区别或辨别的)第二检测性质或参数的第二标记物来标记第二寡核苷酸探针。多路测定法的使用，特别是在遗传扩增/检测方案情形中的使用，对于分子遗传学技术领域的普通专业人员来说是公知的。
实施例
包含了下面的实施例来演示本发明的优选实施方案。本技术领域的专业人员将会认识到，在下面的实施例中公开的技术代表了由本发明人发现的在本发明的实践中运行良好的技术，因此可以被认为构成了用于其实践的优选方式。然而，依照本公开，本技术领域的专业人员将会认识到可以在所公开具体实施方案中做出许多改变，并仍可以获得相同或类似结果，而不背离本发明的精神和范围。
实施例1–AAV介导的基因疗法恢复了小鼠LCA1模型的视力功能和行为
在本实施例中，本发明人评估了向新生GC1KO小鼠的视锥细胞递送种特异性形式的(即鼠类的)retGC1是否能够恢复这些细胞的功能。使用血清型5型AAV载体向出生后第14天(P14)的GC1KO小鼠的光受体递送mGC1。在治疗后和未治疗的眼中使用视网膜电图(ERG)和行为测试来评估视力功能，并使用免疫细胞化学来检测治疗性转入基因的表达、视锥抑制蛋白定位和视锥光受体密度。
本实施例证实了视网膜下递送到P14GC1KO小鼠的一只眼中的AAV载体促进野生型retGC1的表达，视力功能和行为的恢复以及对视锥光受体的保护。在注射后四周，在治疗后和未治疗的眼中分析视觉功能(ERG)。此后每两周执行ERG，直至注射后3个月(评估的最后时间点)。使用视动反射测试评估具有阳性ERG响应的小鼠以及同基因野生型和未注射对照小鼠的视觉行为的恢复。在注射后3个月时，将所有动物处死，并评估它们的治疗后和未治疗的视网膜中GC1的表达和视锥抑制蛋白的定位。
结果还证实，对于GC1KO小鼠的治疗过的眼来说，视锥介导的功能得以恢复(ERG幅度为正常值的～60％)。此外，至少在施用后3个月内，治疗效果稳定。行为测试显示出视锥介导的视觉行为显著改进，其中治疗过的小鼠的响应与野生型小鼠相似或一致。组织学研究揭示出在治疗过的小鼠中，光受体中AAV介导的GC1的表达和视锥抑制蛋白易位的恢复。此外，在治疗过的眼中视锥细胞密度高于未治疗的对侧对照。该结果表明治疗能够在治疗后至少3个月内保护视锥光受体。这是首次证实出生后基因疗法能够在LCA1的哺乳动物模型中恢复视觉功能和行为并保护视网膜结构。重要的是，结果是使用明确定性的、临床相关的AAV载体获得的；由此获得的体内动物模型数据为使用基于AAV的基因疗法载体治疗患有LCA1的儿童提供了基础。
材料和方法：
实验动物：
从TheJacksonLaboratory(BarHarbor,ME,USA)的低温保存的储用物中取出GC1+/-杂合体胚胎。将杂合体在本发明人的设施处进行交配，以产生GC1KO(-/-)和同基因+/+对照后代。所有小鼠在本发明人的研究所的中央设施中，在12hr/12hr光/暗周期下饲养和维持。食物和水随意取用。所有动物研究得到当地学术动物护理和使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)的批准，并按照“眼科和视觉研究中使用动物的ARVO声明”(ARVOStatementfortheUseofAnimalsinOphthalmicandVisionResearch)和NIH条例来进行。
AAV载体的构建：
使用血清型5型腺相关病毒(AAV5)载体来递送鼠GC1(mGC1)，因为已显示它们表现出强大的转导效率，并且与其他AAV血清型相比在视网膜光受体中的表达出现得更快(Yang等，2002)。选择了细胞特异性和遍在的启动子两者来驱动mGC1的表达。由于在与AAV联合使用时特异性靶向视杆和视锥光受体中强的转入基因表达的能力，选择了细胞特异性G蛋白偶联受体激酶1(GRK1)、也称为视紫红质蛋白激酶的启动子(Khani等，2007)。由于高效靶向神经视网膜的能力，选择了在视网膜中表现出与全长CBA类似的表达模式的遍在的smCBA启动子(Haire等，2006)。使用聚合酶链反应从含有mGC1-eGFP融合体的质粒(Bhowmick等，2009)扩增mGC1，所述聚合酶链反应利用了下列正向引物：5’-AAAAGCGGCCGCATGAGCGCTTGGCTCCTGCCAGCC-3’(SEQIDNO：14)和下列反向引物：5’-AAAAGCGGCCGCTCACTTCCCAGTAAACTGGCCTGG-3’(SEQIDNO：15)。将得到的片段克隆到pCRblunt质粒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中并验证序列。通过在质粒pTR-CBSB-hRPE65(Jacobson等，2006)中经EcoRI消化和随后的连接将全长CBA用smCBA代替，产生了含有驱动mGC1表达的smCBA的AAV载体质粒(pTR-smCBA-mGC1)。随后，通过NotI消化和连接将hRPE65用mGC1代替，导致产生pTR-smCBA-mGC1(图11)。通过NotI消化和连接从pTR-hGRK1-hGFP(Beltran等，2010)中移除hGFP并将其用mGC1代替，产生了含有驱动mGC1表达的人类GRK1启动子的AAV载体质粒pTR-GRK1-mGC1(图11)。AAV载体按照以前发表的方法(Haire等，2006)进行包装。将病毒粒子重悬浮在平衡盐溶液(Alcon,FortWorth,TX,USA)中，并通过定量实时PCR测定滴度(Jacobson等，2006)。对于AAV5-smCBA-mGC1和AAV5-hGRK1-mGC1来说，得到的滴度分别为4.69x1012个病毒基因组每毫升(vg/mL)和4.12x1013vg/mL。
视网膜下注射：
在出生后第14天(P14)，将1μLAAV5-GRK1-mGC1(4.12x1010个递送的载体基因组)或AAV5-smCBA-mGC1(4.69x109个递送的载体基因组)视网膜下递送至每只GC1KO小鼠的右眼，留下左眼作为对侧对照。视网膜下注射按照以前所述来进行(Timmers等，2001；Pang等，2006)。只对接受了可比的成功注射的动物(>60％视网膜脱离和最少的并发症)执行进一步分析。已确立，视网膜脱离的区域对应于病毒转导的区域(Cideciyan等，2008；Timmers等，2001)。
视网膜电图分析：
使用基于PC的控制和记录装置(ToenniesMultilinerVision；Jaeger/Toennies,Hochberg,Germany)，按照以前描述并进行少量修改的方法(Haire等，2006)，记录治疗过的GC1KO(n＝14)和同基因+/+对照(n＝2)的视网膜电图(ERG)。在注射后4周记录初始ERG测量图，随后每两周记录，直至注射后3个月(在本研究中评估的最后时间点)。在每个时间点，与治疗过的动物一起记录年龄匹配的+/+同基因对照。将小鼠暗适应过夜(超过12小时)，并用100mg/kg氯胺酮、20mg/kg甲苯噻嗪和盐水的比例分别为1：1：5的混合物进行麻醉。用1％托吡卡胺和2.5％苯肾上腺素盐酸盐散瞳。使用加热的循环水浴将体温维持在38℃。向每只眼施加2.5％羟丙基甲基纤维素以防止角膜脱水。使用定制的金导线环形角膜电极记录全视野ERG。参比和接地电极分别皮下放置在眼之间和尾巴中。使用一系列7个强度逐渐增加(0.01mcds/m2至5cds/m2)的白色闪光引发暗视视杆记录。对于低强度刺激来说，刺激间的间隔时间为1.1秒。在三种最高强度(100mcds/m2、1cds/m2和5cds/m2)下，刺激间的间隔时间分别为2.5、5.0和20.0秒。每个强度记录10次响应并进行平均。然后使小鼠光适应于100cds/m2的白色背景2min。使用一系列5个强度逐渐增加的光(100mcds/m2至12cds/m2)引发明视视锥响应。在每种强度下记录50次响应并进行平均。所有刺激都在100cds/m2背景存在下呈现。B-波幅度被定义为每个波形的a-波波谷至正峰值之间的差异。
将所有smCBA-mGC1治疗过(n＝6)和hGRK1-mGC1治疗过(n＝8)的GC1KO(治疗后和未治疗的眼两者)和同基因+/+对照小鼠的明视b-波最大幅度(在12cds/m2下产生的)进行平均，并用于产生标准误差。这些计算在每个时间点处(注射后4周-13周)进行。将该数据输入SigmaPlot用于最后的图形呈现。使用配对t-检验计算每个启动子组(smCBA或hGRK1)内治疗后和未治疗的眼之间以及每个启动子组的不同时间(注射后4周对注射后3个月)之间的P-值。使用标准t-检验计算smCBA-mGC1与hGRK1-mGC1治疗过的眼之间的P-值。显著差异被定义为P-值<0.05。由于来自每个治疗组的一些小鼠被暂时从研究中取出用于行为分析，因此在图2A和图2B中在每个时间点被平均和呈现出的小鼠的总数不同。来自于smCBA-mGC1治疗组的三只小鼠被送去进行视动测试，留下“n”等于3只小鼠在8、10和12周测量期间用于ERG分析(图2A)。来自于hGRK1-mGC1治疗组的两只小鼠被送去进行视动测试，留下“n”等于6只小鼠在6、8、10和12周测量期间用于ERG分析(图2B)。对送去进行行为分析的所有小鼠在其完成行为分析并回到本发明人的实验室后的注射后13周时进行测量(smCBA-mGC1：n＝3，hGRK1-mGC1：n＝2)。
视动测试：
使用以前所述的双选项强制选择范式(参见例如Umino等，2008；Alexander等，2007)，测量了治疗后和未治疗的GC1KO小鼠眼的明视视敏度和对比敏感性。为了测试来自于同一动物的单只眼的灵敏度，我们利用了小鼠视力具有极小双眼重叠以及左眼对顺时针转动更敏感，右眼对逆时针转动更敏感这一事实(Douglas等，2005)。因此，在本发明人的“随机分离”视动方案中，通过逐步功能(stepwisefunction)分开地和同时地测定每只眼的敏度和对比敏感性阈值，以获得顺时针和逆时针两个方向上的正确应答。在顺时针方向上转动的图案的正确检测，主要由源自于左眼的视觉信号驱动，而逆时针方向上的正确应答来自于源于右眼的视觉信号。敏度被定义为产生阈值应答的最高空间频率(对比度100％)，对比敏感性被定义为100除以产生阈值应答的最低对比度百分数。对于明视敏度来说，初始刺激物是具有固定的100％对比度的0.200周/度的正弦曲线图案。对于明视对比敏感性测量来说，初始图案以100％对比度呈现，并具有0.128周/度的固定空间频率。明视视力在70cd/m2的平均亮度下测量。在1周时间内对每只小鼠的两只眼进行4至6次视力敏度和对比敏感性测量。年龄匹配的同基因+/+对照动物(M1、M2)和原初GC1KO小鼠(M3、M4)与smCBA-mGC1治疗过的(M5、M6、M7)和hGRK1-mGC1治疗过的小鼠(M8、M9)一起显示在图3中。所有小鼠(M1-M9)的从12cds/m2刺激产生的视锥介导的ERG幅度与行为结果一起显示。对敏度和对比度百分数值进行未配对t-检验以确定结果的显著性。
组织制备：
在注射后3个月，将P14治疗过的GC1KO小鼠和年龄匹配的同基因+/+对照暗适应2hr。在暗适应后，立即将小鼠在暗淡红光(>650nm)下处死。将注射后和未注射的眼的异组织边缘在12点钟位置用热针标记，以便于定向。在暗淡红光下执行摘出术，并将眼立即置于4％聚甲醛中。将要用于冷冻切片的眼按照以前描述的方法来制备(Haire等，2006)。简单来说，从每只眼取出角膜，将晶状体留在剩余的视杯中。在与烧伤的异组织边缘相邻的巩膜中制造小的“V”型切口以维持定向。在过夜固定后，取出晶状体和玻璃体。将剩余的含有视网膜/RPE的视杯在含有30％蔗糖的PBS中在4℃下放置至少1hr。然后将视杯置于低温恒温化合物中(TissueTekOCT4583；SakuraFinetek,Inc.,Torrance,CA,USA)，并在干冰/乙醇浴中速冻。使用低温恒温器(MicrotomeHM550；Walldorf,Germany)以10μm厚度将眼连续切片。将要用于全固定分析的眼按照以前所描述的方法进行制备(Pang等，2010)。定向按照前面提到的来实现。在过夜固定后，将角膜、晶状体、玻璃体和视网膜色素上皮从每只眼中取出而不扰动视网膜。在与原始异组织边缘烧伤处相邻的视网膜的上侧(背侧)部分制造切口，以维持定向。
免疫组织化学和显微术：
将视网膜冷冻切片和全固定物在1XPBS中洗涤3次。在这些洗涤后，将样品在暗处、在室温下、在0.5％Triton中温育1hr。接下来，将样品在含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液中，在室温下阻断1hr。将视网膜切片与在0.3％Triton/1％BSA中稀释的兔多克隆GC1抗体(1：200，sc-50512，SantaCruzBiotechnology，Inc.,SantaCruz,CA,USA)或兔多克隆视锥抑制蛋白抗体(“Lumij”1：1000；由Dr.CherylCraft,UniversityofSouthernCalifornia,LosAngeles,CA,USA提供)在37℃下温育过夜。将视网膜全固定物与在0.3％Triton/1％BSA中1：1000稀释的相同的视锥抑制蛋白抗体在室温下温育过夜。在最初温育后，将视网膜切片和全固定物用1XPBS洗涤3次。
将视网膜切片与在1XPBS中1：500稀释的带有Alexa-594或Alexa-488荧光团标签的IgG第二抗体(MolecularProbes,Eugene,OR,USA)，在室温下温育1hr。在与第二抗体温育后，将切片和全固定物用1XPBS洗涤。将视网膜切片用4',6'-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)在室温下复染5min。在用1XPBS和水最后漂洗后，将切片固定在水基介质(DAKO)中，并加上盖玻片。通过将视网膜的上侧(背侧)部分置于12点钟位置，使视网膜全固定物在载玻片上定向。将样品固定在DAKO中并加上盖玻片。
使用装备有LCS2.61版Build1537软件(Bannockburn,IL,USA)的共聚焦显微镜(LeicaTCSSP2AOBSSpectralConfocalMicroscope)对视网膜切片进行分析。所有图像使用一致的曝光设置，以20x或63x放大倍数获取。用于DAPI、GC1和视锥抑制蛋白染色的激发波长分别为405nm、488nm和594nm。发射光谱分别为440-470nm、500-535nm和605-660nm。使用装备有QImagingRetiga4000R相机和QImagingQCapturePro软件(QImaging,Inc.,Surrey,BC,Canada)的广视野荧光显微镜(Axioplan2)(Zeiss,Thornwood,NY,USA)来分析视网膜全固定物。将每个全固定物的象限在相同的曝光设置下以5x放大倍数进行成像，然后在(7.0版)(Adobe,SanJose,CA,USA)中合并。
图像分析：
通过使用软件(NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,USA)对中央和下部视网膜中用针对视锥抑制蛋白抗体的第二荧光团标记的细胞进行计数，来分析视网膜全固定物中视锥光受体的密度。这些值通过在图6中显示的5XTIFF文件上进行放大来获得。将5个正方形(500μm2)置于治疗后和未治疗的GC1KO眼两者的中央和下部视网膜中的一致区域上。对于中央视网膜来说，正方形被置于所有眼中视神经头周围相等的偏心率处(125μm)。对每个相应视网膜区域中的视锥光受体进行计数，将值进行平均并计算标准偏差。使用标准t-检验来计算所需样品之间的P-值。显著差异被定义为P-值<0.05。
结果
在AAV治疗过的GC1KO小鼠中光受体功能(ERG)得以恢复：
以前报道，GC1KO小鼠中的视锥响应只能在1月龄之前检测到。在这里，本发明人显示，将这种小鼠用带有光受体特异性启动子(hGRK1)或遍在(smCBA)启动子控制之下的小鼠GC1基因的AAV载体进行P14治疗，导致视锥光受体功能的显著恢复，正如通过ERG测量的。代表性视锥描记线(图1)(以及来自于hGRK1-mGC1治疗过的、smCBA-mGC1治疗过的、GC1KO和同基因+/+对照的平均明视b-波幅度(图2A和图2B))显示，在注射后4周时，治疗过的眼中的视锥功能恢复至正常值的约45％。与以前的报告相同，到该时间点时，对侧未治疗眼中的视锥响应消失。在注射后4周时，smCBA-mGC1治疗过的眼中视锥介导的b-波平均幅度(65.1μν)显著高于(P＝0.006)未治疗的眼中的平均幅度(3.9μν)。hGRK1-mGC1治疗过的眼中视锥介导的b-波幅度(59.1μν)明显高于(P<0.001)未治疗的眼的平均幅度(3.2μν)。光受体特异性hGRK1-mGC1载体递送后4周时获得的恢复水平，与使用含有遍在启动子的smCBA-mGC1载体获得的水平没有显著差异(P＝0.604)。在注射后3个月时，smCBA-mGC1治疗过的眼中视锥介导的b-波平均幅度(53.3μν)明显高于(P<0.001)未治疗的眼的平均幅度(2.8μν)。hGRK1-mGC1治疗过的眼中视锥介导的b-波平均幅度(45.3μν)明显高于(P<0.001)未治疗的眼的平均幅度(3.4μν)。光受体特异性GRK1-mGC1载体递送后3个月时获得的恢复水平，与使用含有遍在启动子的smCBA-mGC1载体获得的水平没有显著差异(P＝0.331)。在GC1KO小鼠的治疗过的眼中，两种启动子在短时期内提供相近的功能恢复水平。重要的是，视锥光受体功能的恢复保持稳定3个月(在本研究中评估的最后时间点(参见图1、图2A和图2B)。在治疗后4周和3个月之间，smCBA-mGC1治疗过的或hGRK1-mGC1治疗过的眼的明视b-波幅度没有显著差异(分别为P＝0.174和0.125)。
还测定了作为在各种视网膜病症包括其他形式LCA的诊断中的重要特点的ERG隐含时间(Sun等，2010)。尽管不能从GC1KO眼获得这样的测量值(在这些眼中没有ERG响应)，但可以在AAV-mGC1治疗过的和同基因+/+对照小鼠中比较视锥b-波隐含时间。在注射后4周时，在治疗过的和+/+对照眼中的视锥b-波隐含时间之间没有显著差异(P＝0.884)；在该时间点，在AAV-mGC1治疗过的和+/+眼中的平均值分别为50.8ms和50.4ms。在注射后3个月时，在两个组之间也没有显著差异(P＝0.697)；在治疗过的和+/+对照眼中所有视锥b-波隐含时间的平均值分别为59.7ms和58.3ms。在治疗过的GC1KO视网膜中视锥的响应动力学(正如通过隐含时间测量所确定的)在短期内似乎是正常且稳定的。
以前报道，GC1KO小鼠中的视杆ERG到1月龄时显示出改变，其中视杆a-波和b-波两者显著降低(Yang等，1999)。这种降低在5月龄时达到平稳状态，并且响应约为野生型(WT)小鼠的50-70％。尽管相对于未治疗的对照，在GC1KO小鼠的治疗过的眼中观察到AAV-mGC1介导的改善的一些情况(参见图1中的实例)，但该结果与在视锥介导的响应中观察到的不一致。
在AAV治疗过的GC1KO小鼠中视觉行为得以恢复：
视动分析揭示，在所有明视的视锥介导的条件下，用smCBA-mGC1(M5、M6、M7)或hGRK1-mGC1(M8、M9)治疗过的GC1KO小鼠的眼的响应明显比未治疗的眼更好。未治疗的GC1KO眼表现不佳，视敏度为0.163±0.040周每度(图3B和图3C，条，平均值±s.d.，n＝9只眼)。同基因GC1+/+对照眼(M1、M2)响应明显更好，显示出0.418±0.046周每度的平均敏度(n＝4只眼)。AAV-mGC1治疗过的眼(M5-M9)具有0.392±0.077周每度的平均敏度(n＝5只眼)，该水平基本上与对照+/+眼一致，并显著好于未治疗的GC1KO眼(P<0.0001)。明视对比敏感性(图3B和图3C)与明视敏度结果平行，其中AAV-mGC1治疗过的眼(对比灵敏度为11.9±7.37，n＝5只眼)显示出与+/+小鼠(11.94±3.03，n＝4眼)接近同一的对比阈值。同样地，在P14时用AAV-mGC1治疗过的GC1KO眼的表现明显好于未治疗的眼，其显示出1.27±0.31的平均对比敏感性(n＝9，P<0.0001)。在所有明视测试中，未治疗的GC1KO眼表现极差，基本上等同于没有视锥介导的功能。这些测量值的统计学比较显示在表1中。在行为分析中使用的所有GC1+/+(M1、M2)、GC1KO(M3、M4)、smCBA-mGC1治疗过(M5、M5、M7)和hGRK1-mGC1治疗过的(M8、M9)小鼠的视锥介导的ERG描记线显示在图3A中，以将视觉功能(视动行为)与视网膜功能(电生理学)相关联。
在GC1KO小鼠中视杆视网膜功能(ERG)得到部分保留。研究显示，即使非常小的ERG幅度也转变成强有力的视觉行为(Williams等，2006)。事实上，发现接受AAV-RPE65疗法的LCA2患者尽管完全缺少ERG响应(Maguire等，2008)，但仍表现出行为恢复。视动测试揭示出GC1KO眼的暗视的、视杆介导的视敏度和对比敏感性与+/+对照非常类似。因此，不可能在行为水平上对治疗后与未治疗的眼的视觉恢复进行比较。这些测量值的统计学比较显示在表1中：
表1
通过视动行为测量的WT、AAV-MGC1治疗过的和未治疗的GC1KO眼的明视视觉功能的统计学比较
光受体特异性和遍在启动子两者驱动mGC1转入基因在GC1KO小鼠的视杆和视锥中的表达：
GC1缺陷在LCA1患者中影响视杆和视锥光受体两者。因此，为本研究选择了人类光受体特异性RK启动子和遍在的smCBA启动子作为靶向两种细胞类型的手段。选择人类RK启动子是由于它尺寸小并且能够高效驱动转入基因在光受体细胞中的特异性表达。用AAV-hGRK1-mGC1治疗后3个月时GC1KO视网膜的免疫染色揭示出该启动子驱动GC1在光受体外段中的强表达。来自于用这种治疗性载体注射的眼的视网膜横断切片的代表性图像(图4A)显示出OS层中的强GC1染色，而来自于相同小鼠的对侧未治疗的眼则缺乏任何GC1的表达(图4B)。smCBA启动子也在光受体细胞中高效驱动GC1表达。在治疗过的眼中(图4C)，相对于对侧未治疗的眼(图4D)，光受体OS表现出强的smCBA介导的GC1表达。hGRK1和smCBA介导的GC1表达的水平接近在同基因+/+对照眼中所观察到的(图4E)。在hGRK1-mGC1治疗过的眼中GC1的表达局限于OS。在smCBA-mGC1治疗过的眼中，偶尔在外部核层的光受体细胞体中发现GC1表达(参见例如图4F中的箭头)。然而应该指出，任一种启动子构建物都不驱动治疗性GC1在光受体细胞外表达。这种靶外表达的缺少适合于将来临床应用的开发。
在AAV-mGC1治疗过的GC1KO小鼠中视锥抑制蛋白易位得以恢复：
AAV-mGC1治疗在治疗过的GC1KO视网膜中恢复了光诱导的视锥抑制蛋白向视锥光受体的易位。用针对视锥抑制蛋白产生的抗体免疫染色的代表性的治疗过的、未治疗的和+/+的视网膜的横断切片显示，视锥抑制蛋白定位于+/+、smCBA-mGC1治疗过和hGRK1-mGC1治疗过的视锥光受体的外段、内段、轴突和突触末端(分别为图5A、图5C和图5D)。相反，在未治疗的GC1KO视网膜中，视锥抑制蛋白大部分保持定位于视锥的外段(图5B)。该结果与GC1KO小鼠视网膜中的视锥被缓慢超极化的想法相符。不仅在暗适应的治疗过的视网膜中观察到视锥抑制蛋白定位的恢复，而且在治疗过的眼中相对于未治疗的对照，观察到所述蛋白的明显上调。值得注意的是，相对于未治疗的对照，在治疗过的眼中视锥细胞密度也显得更高(参见例如图5A、图5B和图5C)。
在AAV-mGC1治疗过的GC1KO小鼠中视锥光受体得到保护：
在用治疗性载体注射后3个月时，用针对视锥抑制蛋白的抗体染色的smCBA-mGC1和hGRK-mGC1治疗过的和未治疗的对侧视网膜全固定物的分析显示，作为用治疗性抗体进行治疗的结果，视锥光受体得到保护(图6)。在治疗过的和未治疗的两种视网膜全固定物的下部和中央视网膜中视锥光受体的计数表明，治疗过的与未治疗的眼的视锥细胞密度存在统计学上的显著差异。该结果与强的电生理恢复和行为恢复是显而易见的这一观察相符。用任一种治疗性构建物对GC1KO小鼠进行P14治疗能够保护视锥光受体结构至少三个月。
实施例2-含有GC1/GC2双敲除的动物模型
重要的是注意到尽管在GC1KO小鼠中只有视锥光受体受到影响(视杆仅仅失去部分功能并且它们不退化)，但LCA1患者表现出视杆功能丧失和视杆退化。这种差异的原因据推测是对GC2的依赖性的种特异性差异，所述GC2是在视杆光受体中表达的GC1的近缘物。小鼠视杆能够在不存在GC1的情况下发挥作用，推测是由于GC2能够重建活性；然而在人类中情况不是如此。GC1为视杆功能所需，因此视杆退化。产生了GC1/GC2双敲除小鼠模型，其显示出具有视杆功能缺失(除了在GC1K/O中所观察到的视锥功能缺失之外)(Baehr等，2007)。通过使用该模型的生物化学研究，证明了在不存在GC1的情况下提供视杆功能的正是GC2。也就是说，GC1/GC2双敲除小鼠才更可靠地模拟了人类病状(视锥和视杆两者都受影响)(Karan等，2010)。为了在GC1/GC2双敲除小鼠中测试rAAV-smCBA-mGC1载体和rAAV-hGRK1-mGC1载体两者，以与上述GC1敲除研究完全相同的方式和时间(出生后第14天)递送rAAV载体。也以与上述GC1敲除研究相同的方式，在生理和行为两方面执行了视觉恢复的分析。需要特别强调的是暗视(即视杆)响应，因为预计在用GC1载体构建物治疗的GC1/GC2双敲除小鼠中将出现视杆功能的可测量到的恢复。
实施例3-LCA1的人源化鼠类动物模型
本实施例描述了LCA1的“人源化”鼠类动物模型的产生。在一个实施方案中，小鼠模型含有GC1/GC2/GCAP1敲除。GCAP1是激活GC1的蛋白。为了产生可以在其中评估从被设计用于人类的临床级rAAV载体表达的人类GC1的功能的体内系统，利用了GC1/GC2/GCAP1三敲除hGCAP1转基因小鼠。在该小鼠中，通过仅仅与hGCAP1相互作用(即不存在内源的鼠类GCAP1)的rAAV介导的hGC1恢复了视觉功能。从该研究可以确定在小鼠模型中是否需要人类GCAP1蛋白来刺激人类GC1活性，以及当两种人类多肽在该疾病的非人类(即鼠类)模型中重构并表达时是否能够恢复视锥和视杆的功能。为了产生GC1/GC2/GCAP1三敲除hGCAP1转基因小鼠，将GC1/GC2双敲除小鼠(Baehr等，2007)与GCAP1敲除小鼠(Mendez等，2001)进行杂交。然后将人类GCAP1在所述动物模型中转基因表达，以产生GC1/GC2/GCAP1三敲除的hGCAP1转基因小鼠。以与在GC1敲除研究中使用的方法基本上一致的方式，进行了其中将rAAV载体化的hGC1提供给这些动物的研究。然后以与GC1敲除研究中所执行的相同的方式，在生理和行为两方面执行了视觉恢复的分析。
实施例4-可用于本发明实践的示例性载体构建物
两个示例性载体的图谱显示在图11中。一个含有非特异性启动子smCBA，另一个具有视杆/视锥限制性启动子GRK1。两者都包装在血清型5型AAV中。到目前为止测试的所有载体剂量在小鼠视网膜中都是安全的。然后在出生后第14天(P14)对GC1-/-小鼠组群进行视网膜下注射，然后定期通过ERG和明视视动(视锥介导的)行为进行分析。由于GC1-/-小鼠维持视杆介导的ERG，因此监测功能性挽救主要集中于视锥功能的恢复。对于smCBA载体来说，在治疗后4周时以及随后每2周直至治疗后12-13周，对ERG进行评估。在9只小鼠中所有治疗过的9只眼对治疗有响应。下面显示的结果证实了明视ERG幅度从对照未治疗眼中的基本上不可记录，显著恢复到载体治疗的配对眼中的接近正常值的50％。
然后通过暗视视动行为对四只GC1-/-小鼠进行分析，以获得由治疗过的眼相对未治疗的配对眼所介导的差异(如下所示)。所有4只治疗过的眼(289、290、294、295，红色条)与它们的对照眼相比显示出视敏度的显著改进，并且4只中的3只显示出明显改进的对比敏感性。小鼠297和298是野生型对照，小鼠299是未治疗的GC1-/-小鼠。结果证实，在LCA1的动物模型中，载体实现了视锥介导的视觉的功能性和行为性恢复。
对于将表达限制于视杆和视锥的GRK1载体来说，在14只治疗过一只眼的GC1-/-小鼠中，在治疗后4周时以及随后每2周直至治疗后12-13周，对ERG进行评估。在12只动物中的、14只治疗过的眼中的12只眼，发生了响应。结果(如下所示)揭示出明视ERG幅度从对照未治疗眼中的基本上不可记录，显著恢复到载体治疗的配对眼中的接近正常值的40％。
然后通过暗视视动行为对一只GC1-/-小鼠(#293)进行分析，以获得治疗过的眼相对未治疗的配对眼中的差异(如下所示)。该小鼠在载体治疗过的右眼(红色条)中，相对于其对照左眼(蓝色条)显示出力敏度和对比敏感性两方面的显著改进。响应几乎等同于对照野生型小鼠(297和298)，并且与未治疗的GC1-/-小鼠(299)相比明显提高。因此得出结论，GRKl载体也在该LCA1模型中实现视锥介导的视觉的功能性和行为性恢复。
实施例5-野生型GC1的特异性视锥靶向提高了挽救
上面提呈的数据清楚地证实了使用视杆/视锥限制性GRK1启动子，视锥功能和视锥介导的行为可以得到挽救。由于人类LCA1显示出视杆和视锥两者的缺损(与主要显示出视锥缺损的GC1-/-小鼠不同),因此表达不必也限于获得纯视锥特异性。然而，在小鼠模型中存在一个对研究来说重要的最终视锥表型：在暗适应条件下，视锥抑制蛋白不像在野生型视网膜中那样从视锥外段正常移动到内段、轴突和突触末端中。因此进行了研究以评估该细胞生物学表型在载体治疗的GC1-/-眼中是否也得到矫正。在显示的结果中，在GC1-/-小鼠的一只眼中用GRK1载体进行治疗，然后在注射后7周时将小鼠进行暗适应。然后通过免疫组织化学分析治疗过的(底部图)和对照的(顶部图)视网膜的视锥抑制蛋白定位。在未治疗的GC1-/-视网膜(顶部图)中，视锥抑制蛋白大部分保留在视锥外段(OS)和突触层(SL)中。相反，在对侧治疗过的视网膜(底部图)中，显著部分(～50％)已易位到内段和突触末端中。因此得出结论，载体治疗也恢复了视锥抑制蛋白的正确易位。
实施例6-使用RAAV-载体化遗传构建物的LCA1长期疗法
前一个实施例证实了含有鼠类GC1cDNA(由光受体特异性人类视紫红质蛋白激酶[hGRK1]或遍在的[smCBA]启动子驱动)的rAAV载体的视网膜下注射，能够在GC1KO小鼠中恢复视锥介导的功能和视觉行为并保护视锥光受体至少3个月的时间。
在本实施例中，本发明人评估了在LCA1的啮齿动物模型中是否还能实现长期治疗。此外，本发明人研究了向GC1/GC2双敲除小鼠(GCdko)的光受体递送GC1是否能够为这些细胞提供治疗，所述双敲除小鼠是表现出视杆和视锥两者结构和功能的丧失并且在表型上类似人类LCA1的模型。
方法
在出生后第14天(P14)至P25之间，在GC1KO或GCdko小鼠的一只眼中进行AAV5-hGRK1-mGC1、AAV5-smCBA-mGC1或高效衣壳酪氨酸突变体AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1的视网膜下注射。通过视网膜电图分析视杆和视锥光受体功能。治疗性GC1表达的定位和视锥光受体保护的程度通过免疫组织化学来测定。使用生物分布研究来评估被治疗动物的视神经和脑中载体基因组的存在。
结果
在用所有载体治疗过的GC1KO小鼠中视锥光受体功能得以恢复，其中AAV8(733)是最有效的。响应在治疗后稳定至少10个月。在光受体外段中发现治疗性GC1。到注射后10个月时，仅仅在GC1KO小鼠的治疗过的眼的视神经中检测到AAV5和AAV8(733)载体基因组。AAV8(733)-载体化的mGC1在治疗过的GCdko小鼠中恢复了视杆和视锥两者的功能。
结论
使用本文公开的rAAV载体构建物，可以在GC1缺陷的哺乳动物模型即GC1KO小鼠中实现长期治疗。重要的是，也可以在模拟LVA1视杆/视锥表型的GCdko小鼠中实现治疗。这些结果为使用基于rAAV的基因疗法载体治疗视网膜营养不良、特别是LCA1，提供了证据。
实施例7-在GC1KO小鼠中通过基因疗法长期保护视锥光受体并恢复视锥功能
在前面的实施例中，显示了含有由光受体特异性(hGRK1)或遍在的(smCBA)启动子驱动的鼠类GC1cDNA的视网膜下AAV5载体，能够在GC1KO小鼠中恢复视锥介导的功能和视觉行为并保护视锥光受体达三个月。在本实施例中，使用同样的鼠类模型评估了长期疗法。在出生后第14天(P14)至出生后第25天(P25)之间，将AAV5-hGRK1-mGC1、AAV5-smCBA-mGC1或高效衣壳酪氨酸突变体AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1视网膜下递送至GC1KO小鼠。通过视网膜电图(ERG)分析视网膜功能。使用免疫组织化学分析AAV介导的GC1表达的定位和视锥存活性，并通过视神经和脑组织的PCR来定量载体基因组在视网膜之外的分布。使用所有测试的载体时，视锥功能都得到恢复，其中AAV8(Y733F)是最有效的。只在光受体中发现AAV介导的GC1表达。到注射后10个月时，只在治疗过的眼的视神经中检测到AAV基因组。这些结果第一次证明了可以在GC1缺陷的哺乳动物模型中实现长期治疗。
由GUCY2D编码的视网膜鸟苷酸环化酶-1(GC1)在脊椎动物光转导中发挥关键作用(Pugh等，1997)。在光刺激后，第二信使环GMP(cGMP)在光受体细胞内被磷酸二酯酶(PDE6)快速水解，引起cGMP门控阳离子通道的关闭和细胞的超极化。当细胞质[Ca2+]下降到低于50nM时，GC1被小的Ca2+结合蛋白GCAP(鸟苷酸环化酶活化蛋白)激活。GC1合成cGMP，其结合并重新打开cGMP门控通道，使光受体返回到“暗的”去极化状态(Pugh等，1997；Polans等，1996；Wensel，2008；Lamb和Pugh，2006；Arshavsky等，2002)。因此，GC1通过cGMP作用于联系细胞内钙水平和光受体的极化状态的反馈回路，在光-暗以及恢复的循环中发挥重要作用。
GC1表达在人类、猴和小鼠视网膜的视杆和视锥光受体的外段中(Dizhoor等，1994；Liu等，1994；Haire等，2006)。与其他膜鸟苷酸环化酶类似，它含有N’-端信号序列、细胞外结构域(ECD)、单次跨膜结构域、激酶样同源结构域(KHD)、二聚化结构域(DD)和C’-端催化结构域(CCD)，并可能作为同型二聚体存在(Yang和Garbers，1997)。GUCY2D中的突变与隐性莱伯氏先天性黑蒙-1(LCA1)以及显性和隐性形式的视锥-视杆营养不良、即分别为CORD6和CORD相关(Perrault等，1996；Perrault等，2000；Kelsell等，1998；Perrault等，1998；Gregory-Evans等，2000；Weigell-Weber等，2000；Ugur等，2010)。LCA1是严重的、早期发作的常染色体隐性失明病症，其特征为在光受体退化之前视网膜电图(ERG)熄灭(Perrault等，1999；Chung和Traboulsi，2009)。CORD6是以从视锥开始的光受体渐进性退化为特征的显性病症，引起视力敏度和颜色视力的早期丧失，随后是视杆退化，引起渐进性夜盲和外周视野丧失(Kelsell等，1998；Perrault等，1998)。CORD6突变局限于二聚化结构域(DD)，并且通常引起GCAP介导的GC1活化的增加(Payne等，2001；Downes等，2001；Wilkie等，2000)。最近发现的CORD引起的隐性突变位于GC1的催化结构域(CD)中，并被认为降低了总体酶功能(Ugur等，2010)。LCA1引起的突变分布在整个GC1的ECD、KHD、DD和CCD结构域中(Karan等，2010)。这些突变改变了酶结构和稳定性，可能影响其他外周膜相关蛋白的逆向运输，并通常是无效的。
GC1KO小鼠带有Gucy2e、即GUCY2D的鼠类同源物的无效突变。与LCA1患者类似，在该模型中视锥功能的丧失先于视锥退化(Timmers等，2001)。视杆保留其功能的30-50％，并且由于鼠类光受体中的另一种功能性鸟苷酸环化酶GC2的存在而不退化(Yang和Garbers，1997；Jacobson等，2006；Timmers等，2001；Cideciyan等，2008；Song等，2002)。在更早的实施例中，显示了含有由光受体特异性人类视紫红质蛋白激酶(hGRK1)或遍在的(smCBA)启动子驱动的鼠类GC1cDNA的血清型5型腺相关病毒(AAV)载体的视网膜下注射，能够在GC1KO小鼠中恢复视锥介导的功能和视觉行为并保护视锥光受体三个月的时间。在本研究中，评估了AAV介导的基因置换疗法在长时期内向GC1KO小鼠提供治疗的能力。在出生后第14天(P14)至出生后第25天(P25)，将AAV5-hGRK1-mGC1和AAV5-smCBA-mGC1以及高效衣壳酪氨酸突变体载体AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1视网膜下递送至GC1KO小鼠。这些发现第一次证明了在GC1缺陷的哺乳动物模型中可以实现长期治疗。还对基于AAV5和AAV8(733)的载体进行了载体基因组生物分布的评估。这些发现与基于AAV的用于LCA1(以及可能的视锥-视杆营养不良)的基因治疗临床试验的发展具有直接关系，并有助于开发用于由光受体相关基因中的缺损所介导的广范围隐性视网膜退化的标准化载体。
材料和方法
实验动物：
从TheJacksonLaboratory(BarHarbor,ME,USA)所提供的GC1+/-小鼠的杂合子杂交得到的GC1KO和同类系+/+对照，在12hr/12hr光/暗周期下在本发明人的研究动物护理设施中饲养和维持。食物和水随意取用。所有动物研究按照“眼科和视觉研究中使用动物的ARVO声明”(ARVOStatementfortheUseofAnimalsinOphthalmicandVisionResearch)和NIH条例来进行。
AAV载体的构建：
按照以前描述的方法(Boye等，2010)，产生含有遍在(smCBA)或光受体特异性人类视紫红质蛋白激酶(hGRK1)启动子驱动的鼠类GC1(mGC1)cDNA的血清型5型腺相关病毒(AAV5)载体质粒。AAV2衣壳上表面暴露的酪氨酸残基的定点突变已被报道(Zhong等，2008)。类似的方法被用于产生本文描述的AAV8(Y733F)衣壳突变体。所有载体按照以前描述的方法进行包装、纯化和滴度测定(Zolotukhin等，2002；Jacobson等，2006)。对AAV5-smCBA-mGC1、AAV5-hGRK1-mGC1和AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1得到的滴度分别为4.69x1012个载体基因组每毫升(vg/mL)、4.12x1013vg/mL和1.08x1013vg/mL。
视网膜下注射：
在出生后第14天(P14)和出生后第25天(P25)，将1μLAAV5-smCBA-mGC1(4.69x109个载体基因组)、AAV5-hGRK1-mGC1(4.12x1010个载体基因组)或AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1(1.08x1010个载体基因组)视网膜下注射到GC1KO小鼠的一只眼中。对侧对照眼保持不注射。视网膜下注射按照以前的描述进行(Timmers等，2001)。只对接受了可比的成功注射的动物(>60％视网膜脱离和最少的并发症)执行进一步分析。已确立，视网膜脱离的区域对应于病毒转导的区域(Cideciyan等，2008；Timmers等，2001)。所有组群的约75％接受了“成功的”注射。已确立，载体转导的区域至少对应于视网膜脱离的区域(Timmers等，2001；Cideciyan等，2008)。
视网膜电图分析：
使用基于PC的控制和记录装置(ToenniesMultilinerVision；Jaeger/Toennies,Hochberg,Germany)，按照以前描述并进行少量修改的方法(Haire等，2006；Boye等，2010)，记录治疗过的GC1KO和年龄匹配的同类系+/+对照的ERG。在不同日期开始AAV5-smCBA-mGC1治疗过的GC1KO小鼠(n＝10)、AAV5-hGRK1-mGC1治疗过的GC1KO小鼠(n＝6)、AAV8(Y733F)治疗过的GC1KO小鼠(n＝6)和同类系(+/+)对照(n＝8)的记录，因此每个小鼠子集被监测略微不同的时间长度。在注射后4周以及其后每个月直至注射后1年(AAV5治疗过的小鼠)或注射后9个月(AAV8[Y733F]治疗过的小鼠)，记录治疗过的GC1KO小鼠的ERG。年龄匹配的同类系(+/+)对照小鼠被跟踪8个月。在整个实验过程中，由于各种尸体解剖研究(生物分布研究，视网膜免疫组织化学分析，视网膜组织的实时RT-PCR)或意料之外的疾病/死亡，在不同时间点从研究中取出小鼠。只呈现了n>3的动物组的ERG数据。因此，本研究比较了对AAV5治疗过的小鼠来说直至注射后9个月以及对AAV8(Y733F)治疗过的小鼠来说直至注射后6个月的发现。在这些时间点之后，治疗过的小鼠继续表现出ERG响应，但是样本量显著减小，使得统计学分析不再现实。提呈了来自于用AAV5载体治疗后1年和用AAV8(Y733F)治疗后9个月的个体小鼠的代表性视锥介导的描记线，以支持这种主张。使用以前描述的记录参数(Boye等，2010)引发暗视(视杆介导的)和明视(视锥介导的)记录。B-波幅度被定义为每个波形的a-波波谷与随后的正峰值之间的差异。未治疗的GC1KO小鼠中视杆介导的ERG响应在不同动物中不同(Yang等，1999)，因此当对来自不同动物的暗视a-波和b-波幅度进行平均时，观察到大的标准偏差。视杆ERG数据以比率(个体内治疗过的相对未治疗的视杆a-波和b-波幅度的平均值)的形式呈现。因此，任何大于1的值表示AAV-mGC1治疗改进了视杆响应。比率使用在1cds/m2刺激下产生的幅度来计算。在每个时间点处，对在所有治疗过的GC1KO小鼠和同类系(+/+)对照小鼠的注射过的和未注射的眼中在12cds/m2下产生的明视、视锥介导的b-波最大幅度进行平均，并将其用于产生标准误差。将所有数据输入SigmaPlot用于最后的图形呈现。使用标准t-检验计算数据集之间的P-值。显著差异被定义为P-值<0.05。
生物分布：
按照以前描述过的方法并进行少量修改(Jacobson等，2006)，在处死时收集的样品中确定载体DNA在治疗过的GC1KO小鼠的组织中的分布。在下列时间点处死载体治疗过的小鼠：AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1治疗过的小鼠(注射后4个月，n＝1；注射后7个月，n＝l)，AAV5-smCBA-mGC1(注射后7个月，n＝l；注射后10个月，n＝5)，AAV5-hGRK1-mGC1(注射后7个月，n＝l；注射后10个月，n＝1)。来自于与注射后7个月或注射后10个月时间点时年龄匹配的GC1KO小鼠的对照组织也与实验动物一起进行评估。在处死后，使用不同的新钳状骨针摘除治疗过的和未治疗的眼，其保留约0.5cm的近端视神经。然后使用不同的新解剖剪从眼球上切下视神经，随后将它们在液氮中速冻并转移到-80℃，并将它们保留在那里直至进行DNA提取之时。将眼球浸泡在4％聚甲醛(PAF)中并进行处理，用于免疫组织化学(参见下文)。
取出脑，并使用不锈钢小鼠冠状脑基质(HarvardApparatus,Holliston,MA,USA)分离视觉特异性区域。从每个治疗组的一只小鼠(在最后一个时间点)收集右侧和左侧膝状核，并且在从脑回收载体基因组并且需要免疫组织化学分析的情形中，将其用福尔马林固定并保存。收集含有视觉通路的右脑和左脑的分开的部分，在液氮中速冻并转移至-80℃，并将它们保留在那里直至进行DNA提取之时。在收获组织时采取预防措施以避免交叉污染。按照制造商的方案(QiagenDNeasy组织试剂盒)从组织提取基因组DNA。使用EppendorfBiophotomoter(6131型；Eppendorf,Hamburg,Germany)测定得到的DNA的浓度。按照以前描述的方法并进行少量修改来执行定量PCR(Jacobson等，2006；Song等，2002；Poirier等，2004)。
针对每个载体基因组中的SV40聚腺苷化信号(SV40polyA)区域设计引物对，并使用含有同样SV40polyA靶序列的已知浓度的质粒DNA建立标准曲线。DNA样品进行三份平行测定。为了排除由PCR抑制造成的假阴性，第三份平行测定以100个拷贝/μg基因组DNA的比率“掺(spiked)”有含靶(SV40polyA)的质粒DNA。如果检测到掺入的(spike-in)DNA超过40个拷贝，样品被认为可接受用于报告载体基因组拷贝。在某些情况下，在PCR反应中使用少于1μg的基因组DNA对不能“掺入”的样品进行重新分析，由此稀释了在提取的组织中与DNA共纯化的PCR抑制剂。将掺入的拷贝数成比例减小，以维持100个拷贝/μgDNA的比率。报告载体基因组拷贝的标准按照以前描述的方法来建立(Jacobson等，2006)。简单来说，超过100个拷贝/μg被认为是阳性的，并且报告实测的拷贝数/μg。小于100个拷贝/μg被认为是阴性的。
组织制备、免疫组织化学和显微术：
与AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1注射后7个月以及AAV5-smCBA-mGC1和AAV5-hGRK1-mGC1注射后10个月时执行的生物分布研究同时，在处死时将治疗的GC1KO小鼠、年龄匹配的未治疗GC1KO小鼠以及年龄匹配的同类系GC1+/+小鼠的异组织边缘用热针在12点钟位置进行标记，以便于定向。未治疗的GC1KO和GC1+/+对照与AAV8(Y733F)治疗过的小鼠年龄匹配(在处死时为8月龄)。按照以前描述的方法对指定用于冷冻切片的眼进行加工和免疫染色(Haire等，2006)。简单来说，将10μm视网膜切片与针对GC1的抗体(兔多克隆抗体，1：200，sc-50512，SantaCruzBiotechnology，USA)或针对小鼠视锥抑制蛋白的抗体(兔多克隆“LUMIj”，1：1000，由Dr.CherylCraft,UniversityofSouthernCalifornia,LosAngeles,CA,USA提供)进行温育。在最初温育后，在室温下分别施用IgG第二抗体Alexa-488或Alexa-594达1小时(在1XPBS中1：500稀释)。将切片用4',6'-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)在室温下复染5min。在注射后11个月，将仅在一只眼中接受AAV5-smCBA-mGC1治疗的一只GC1KO小鼠处死，并按照以前描述的方法对来自于治疗过的和未治疗的眼的视网膜全固定物进行处理(Pang等，2010)。简单来说，将固定物用LUMIj(1：1000)染色，然后用IgG第二抗体Alexa-594(1：500，在1XPBS中)染色并定位在载玻片上，使视网膜的上侧(背侧)部分定向在12点钟位置。通过共聚焦显微镜(装备有LCS2.61版Build1537软件的LeicaTCSSP2AOBS光谱共焦显微镜)对视网膜切片进行分析。在相同的曝光设置下以20X放大倍数获取图像。使用装备有QImagingRetiga4000R相机和QImagingQCapturePro软件的广视野荧光显微镜(ZeissAxioplan2)来分析视网膜全固定物。将每个全固定物的象限在相同的曝光设置下以10X放大倍数进行成像，然后在AdobePhotoshop中合并在一起。
免疫印迹：
在注射后7个月时，将用AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1注射过的一只小鼠和年龄匹配的同类系GC1+/+(对照)小鼠处死，摘出它们的眼并置于1XPBS中。按照下面的描述立即解剖并处理视网膜。将各个视网膜在含有1％TritonX-100和全蛋白酶抑制剂(Roche)的PBS(137mMNaCl，2.7mMKC1，10mMNa2HPO4，1.8mMKH2PO4)中在4℃下溶解1小时，然后以14000rpm离心。上清液的蛋白浓度通过BCA(Pierce)来测定，并将15μg每种样品在12％聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)上分离，在含有15％甲醇的转移缓冲液(25mMTris，192mM甘氨酸)中经1小时转移到Immobilon-FL膜上。将印迹用阻断缓冲液(Li-Cor)处理，并用识别GC1的小鼠单克隆抗体(IS4，1：3000，由Dr.KrisPalcweski,CaseWesternUniversity,USA提供)和针对GCAP1产生的兔多克隆抗体(pAbUW14，1：25,000，由Dr.WolfgangBaehr,UniversityofUtah提供)以及针对β-肌动蛋白产生的兔多克隆抗体(1：5000，Abeam)标记1小时。施加第二抗体(与CW800结合的山羊抗小鼠Ig抗体和与IR680结合的山羊抗兔抗体)1小时，并使用Odyssey红外成像系统对印迹成像(Licor,Lincoln,NE,USA)。
mRNA的rtPCR定量、视网膜基因组回收和视神经IHC
从用AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1或AAV5-smCBA-mGC1治疗后1年的GC1KO小鼠和年龄匹配的未治疗GC1+/+小鼠收获附连有视神经的单个治疗的眼。立即从眼剖出视网膜并在液氮中速冻。从眼中分离视神经，在4％聚甲醛中在4℃下固定过夜，在30％蔗糖中在4℃下浸泡2小时，然后在低温恒温化合物(TissueOCT4583；SakuraFinetekUSA,Inc.,Torrance,CA,USA)中，在干冰/乙醇浴中快速冷冻。按照以前描述的方法将视神经以10μm切片并染色(Boye等，2010)。将视网膜在350mL含有BME的RLT缓冲液(ProtectMiniKit，Qiagen,Inc.,Valencia,CA,USA)中匀浆45秒。将样品离心，并将裂解液分成两半(一半指定用于基因组回收，另一半用于RNA提取)(Traint和Whitehead，2009)。基因组回收按照如上所述来进行。RNA提取使用ProtectMiniKit(Qiagen,Inc.)来进行。将RNA反转录(cDNA合成试剂盒；BioradLaboratories,Hercules,CA,USA)并用于实时PCR(iQGreenSupermix和MyiQ实时PCR检测系统，连接到热循环仪，BioradLaboratories)，以测量下述视网膜特性mRNA：鸟苷酸环化酶-1(GC1)，鸟苷酸环化酶活化蛋白-1(GCAP1)，视锥转导素α(GNAT2)，视杆cGMP特异性3',5'-环磷酸二酯酶α亚基(PDE6α)和看家基因甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。
用于GCAP1、GNAT2、PDEα和GAPDH的引物对与Baehr等(2007)所使用的一致。将用于鼠类GC1的引物(正向引物：5’-GACCCTTCCTGCTGGTTCGATCCA-3’[SEQIDNO：16]，反向引物5’-CTGCATGTGTAGCAGCCTGTGCCTC-3’[SEQIDNO：17])设计在GC1KO小鼠中基因破坏位点的外显子5(Yang等，1999)侧翼，并产生151bp的扩增子。PCR在GC1+/+和AAV-mGC1治疗过的GC1KO视网膜样品中产生尺寸相近的扩增子，但是正如预期的，在未治疗的GC1KO视网膜中不是如此。通过用在靶序列内切割以产生56bp和95bp片段的StuI(NEB)进行限制性酶切，来验证扩增子的同一性。在反转录DNA(来自于GC1+/+和AAV-mGC1治疗过的GC1KO视网膜样品两者)的连续稀释液上使用GC1和GAPDH引物进行的rtPCR产生相似的斜率，表明GC1引物适合用于内源的和载体介导的GC1信使两者的定量(图20A和图20B)。
结果是3份平行反应的平均值，并使用2-ΔΔCτ方法(Livak和Schmittgen，2001)来计算，其中使用GAPDH信号来归一化样品并将GC1+/+样品用作校正物。从对每个样品进行的3份平行反应来计算标准偏差。数据被提呈为mRNA水平相对于GC1+/+样品的倍数变化。
结果
光受体特异性GC1的长期表达：
使用针对GC1的抗体进行的免疫染色显示，只出现在治疗过的GC1KO小鼠的光受体中的AAV载体化的治疗性蛋白的表达在显著的一段动物寿命中得到保持；AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1保持了至少7个月，AAV5-smCBA-mGC1保持了至少10个月，AAV5-hGRK1-mGC1保持了至少10个月(图21A和图2IB)。GC1表达局限在用AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1载体治疗过的视杆和视锥的外段，然而它被发现在用AAV5-smCBA-mGC1治疗过的眼的外段、更罕见情况下在其光受体细胞体中，该结果与这种遍在启动子相对于光受体特异性启动子hGRK1的强度相一致(Beltran等，2010)。观察到视网膜变薄的两个实例。第一个实例是用AAV5-smCBA-mGC1治疗过(递送4.69x109个总载体基因组)的GC1KO视网膜。外部核层(ONL)相对于在原初GC1KO或GC1+/+对照视网膜(两者均为8月龄)中观察到的略微变薄。这可能是由smCBA启动子介导的GC1过表达的结果(Beltran等，2010)。
第二个实例涉及用更浓的AAV5-hGRK1-mGC1治疗过的GC1KO视网膜，如前所述，其显示出光受体特异性GC1表达，但是伴有外部核层的极大变薄。应该指出，该载体是在本研究中评估的三种载体中最浓的(递送4.12x1010个载体基因组，与此相比AAV5-smCBA-mGC1制备物和AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1分别为4.69x109和1.08x1010个)，并且同样突出了GC1的过表达可能是观察到的变薄的原因。至少，这些结果表明在小鼠中可能可以观察到剂量限制性毒性。在未治疗的GC1KO视网膜中不存在GC1表达(图21A和图21B).
通过AAV载体化的GC1实现视锥光受体的长期存活
通过针对小鼠视锥抑制蛋白的染色鉴定了治疗过的和未治疗的GC1KO小鼠以及GC1+/+对照中的视锥光受体。对来自于为最后一次生物分布研究而处死的小鼠的视网膜横断切片和来自于用AAV5-smCBA-mGC1治疗(仅仅右眼)后11个月的GC1KO小鼠的视网膜全固定物，进行了分析。这里显示，到10月龄时，未治疗的GC1KO视网膜中视锥光受体密度显著降低，并证实了以前的报道，即在该小鼠模型中视锥以拓扑学特异性方式丧失(Coleman等，2004)(图21A和图21B)。全固定物分析揭示，11月龄的未治疗视网膜表现出稀疏的视锥密度，并且只在上部视网膜区域中发现剩余的视锥，而P14治疗的配对视网膜在整个视网膜中保留了更高的视锥密度，除了在视网膜下注射期间可能未暴露于载体并因此不含转入基因产物的小片颞部视网膜之外。与在AAV5治疗过的视网膜中所观察到的相比，在AAV8(Y733F)治疗过的小鼠的视网膜横断切片中视锥的密度和结构在定性方面似乎最类似于在正常的GC1+/+视网膜中所观察到的(图21A和图21B)。尽管相对于未治疗的对照，在AAV5治疗过的视网膜中视锥的密度增加，但它们显得略微组织混乱，该结果可能是由这些小鼠中外部核层的略微总体无序/变薄造成的。
在AAV治疗过的GC1KO小鼠中光受体功能(ERG)的长期恢复
在前面的实施例中，对于GC1KO小鼠来说，在P14递送AAV5-smCBA-mGC1或AAV5-hGRK1-mGC1后，视锥介导的功能可以恢复3个月的时间(Boye等，2010)。在注射后4周时，治疗过的小鼠中平均明视b-波幅度得以部分恢复，并在整个研究中保持稳定。在本实施例中，在P14和P25之间用与前述研究中使用的相同载体注射过的GC1KO小鼠中，对直至治疗后9个月时的视锥介导的响应进行了比较。用AAV5-mGC1载体治疗过的所有剩余小鼠继续表现出可测量的视锥介导的功能，直至治疗后至少1年。来自于用AAV5-hGRK1-mGC1治疗过的个体小鼠的在12cds/m2下引发的代表性描记线，显示在图22A和图22B中。视锥响应随时间稳定，并且显著高于从未治疗的对侧对照产生的响应(p<0.001)，表明在动物的整个生命期中恢复视锥功能是可能的(图22A)。与前面的实施例相符，在任何治疗后时间点处，在递送含有光受体特异性启动子(hGRK1)的载体后获得的恢复水平与使用含有遍在启动子(smCBA)的载体所获得的没有显著差别。代表性描记线显示，恢复了的视锥的ERG的动力学在该研究的整个过程中显得正常(图22B)。此外，在本实施例中显示，在用AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1注射后，视锥光受体功能稳定恢复至少6个月。
在评估的任何时间点处，在用这种强的、快速作用的AAV8酪氨酸衣壳突变体注射过的GC1KO小鼠中，视锥b-波幅度高于在用任一种AAV5载体注射过的GC1KO小鼠中所观察到的。在治疗后6个月，即所有载体可以平行地进行比较的最后时间点时，在AAV8(Y733)-hGRK1-mGC1相对AAV5-hGRK1-mGC1治疗过的小鼠(p＝0.033)以及AAV(Y733F)-hGRK1-mGC1相对AAV5-smCBA-mGC1治疗过的小鼠(p＝0.025)中，视锥b-波幅度之间存在显著差异。用AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1(n＝1)注射后9个月时记录的代表性描记线，显著小于在注射后6个月时记录到的。
由于未治疗的GC1KO视杆响应中的小鼠间差异性(到5月龄时为野生型的50-70％(23))，因此治疗过的相对未治疗的眼的平均视杆响应的统计学比较成问题。然而，在动物中，在配对眼之间的视杆ERG幅度近似相等，因此我们为治疗过的与未治疗的眼计算了小鼠内视杆a-波和b-波平均幅度的比率，然后将这些比率随时间作图(图23A和图23B)。值大于1.0的比率指示了AAV介导的视杆功能的恢复。图23A和图23B显示，除了一个时间点(治疗后4个月)之外，在AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1治疗过的相对未治疗的眼中视杆b-波幅度的平均比率全都大于1.0。AAV5治疗过的相对未治疗的眼的比率仅仅偶尔大于1.0。同样地，在AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1治疗过的小鼠中，视杆a-波比率一贯较高，而在用任一种AAV5载体治疗后它们通常减小(图23B)。这些结果表明，尽管对视杆的治疗效果轻微，但AAV8(Y733F)为GC1KO小鼠提供了最强的视杆介导的功能提高(图23B)。在AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1治疗过的GC1KO小鼠(治疗后6个月)、未治疗的对侧对照眼和年龄匹配的GC1+/+对照中，展示出由1cds/m2刺激引发的代表性视杆介导的暗视ERG描记线。在本实施例中，AAV8(Y733F)介导的视杆ERG幅度的提高是明显的，并表明除了低于野生型的幅度之外，治疗过的眼的响应动力学类似于在GC1+/+对照中观察到的。
载体的生物分布：
在用每种载体治疗过的GC1KO小鼠中执行了生物分布研究，以确定AAV5或AAV8(Y733F)递送的载体基因组是否能够在几个月时间段后在治疗过的小鼠的视神经和/或脑中检测到。对用AAV5载体注射过的小鼠在治疗后7(n＝2)和10(n＝5)个月时进行评估，对用AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1注射过的小鼠在治疗后4(n＝1)和7(n＝1)个月时进行评估。检查了来自于注射过的和未注射的眼的视神经以及含有视觉通路的左脑和右脑部分。AAV5载体被注射到GC1KO小鼠的右眼中。因此，在注射后7和10个月两个时间时在AAV5治疗过的小鼠的右侧视神经中检测到载体基因组。在注射后7个月时，也在用AAV5-hGRK1注射过的一只小鼠的左脑中检测到载体基因组。没有从该动物的右脑检测到载体基因组。右侧(注射过的)视神经和左脑为阳性这一观察在解剖学上是相符的，因为左侧大脑半球主要“连线”到右眼。
到注射后10个月止，AAV5递送的载体基因组仍然可以在右侧(注射的)视神经中检测到，但是在两个脑半球中都不存在。AAV8(Y733)载体被注射到GC1KO小鼠的左眼中。因此，在注射后4和7个月两个时间时在左侧视神经中检测到AAV8(Y733F)递送的载体基因组。在任一脑半球中，在任何时间点处都没有在AAV8(733)治疗过的小鼠中检测到载体基因组。与AAV5-smCBA-mGC1相比，在用AAV5-GRK1-mGC1注射过的眼的视神经中检测到更高的载体基因组平均数量。该结果可能是由前者(4.12x1013vg/mL)与后者(4.69x1012vg/mL)相比滴度更高造成的。
此外，在该研究过程中只有AAV5-hGRK1-mGC1递送的基因组在脑组织中被检测到，这可能是由这种载体的相对高的滴度造成的另一个观察。尽管使用的AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1载体的滴度(1.08x1013vg/mL)低于AAV5-hGRK1-mGC1载体的滴度这一事实，但在AAV8(Y733F)治疗过的眼的视神经中检测到更高的载体基因组平均数量。尽管已知AAV5对于转导小鼠视网膜的神经节细胞无效(Stieger等，2008)，但已显示AAV8能够转导该细胞类型(Jacobson等，2006)。由于在视网膜下注射期间注射器横穿内部视网膜，并且由于在小鼠中注射体积与眼的总尺寸的比率高，因此预期将有一些载体暴露于视网膜神经节细胞。因此，在AAV8(Y733F)治疗过的眼的视神经中检测到的载体基因组的较高数量，可能是由AAV8(Y733F)相对于AAV5对视网膜神经节细胞的亲和性高造成的。正如预期的，没有从原初GC1KO对照小鼠的任何组织中回收到AAV载体基因组。
AAV-mGC1治疗使治疗过的GC1KO视网膜的GC1和GCAP1水平恢复到野生型水平
在用AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1注射后7个月时，使用来自于一只GC1KO小鼠的治疗过的和未治疗的视网膜以及一只年龄匹配的GC1+/+对照小鼠来测定GC1和GCAP1蛋白的表达水平。本实验的目标不是比较不同治疗组之间的GC1水平，而是比较载体介导的GC1表达水平与野生型动物中的GC1水平。同样，我们评估了AAV递送的GC1对GCAP1表达的影响。正如预期的，在GC1KO小鼠的未治疗的眼中不存在GC1蛋白。相反，AAV8(Y733F)治疗过的眼中GC1的水平接近在正常的GC1+/+对照中所观察到的(图4)。与以前的报告、即GCAP1在GC1KO小鼠中在翻译后被下调相符合，我们显示相对于GC1+/+对照，在未治疗的GC1KO视网膜中GCAP1被下调(39)。然而，在治疗过的GC1KO小鼠视网膜中，AAV8(Y733F)介导的GC1的递送导致GCAP1表达的上调。GCAP1的表达水平也与在GC1+/+对照中观察到的相当。
在治疗过的GC1KO小鼠中存在GC1mRNA，并且相对于未治疗的GC1KO小鼠GNAT2mRNA水平增加。使用位于GC1KO小鼠外显子5内的新霉素基因干扰片段两侧的GC1引物对(Timmers等，2001)，可以测量GC1+/+和载体治疗过的GC1KO小鼠两者中的GC1mRNA。有趣的是，靶向位于基因干扰片段下游的GC1的外显子18和19的第二GC1引物对，在未治疗的GC1KO小鼠中产生PCR产物，因此没有使用这些引物。在治疗后1年时，在治疗过的视网膜中GC1mRNA的水平比在年龄匹配的GC1+/+对照小鼠中观察到的高大约7倍(AAV5治疗过的)和14倍[AAV8(YY733F)治疗过的](图24A和图24B)。通过使用能够将样品均匀分配成两等份，一份用于RNA提取，另一份用于DNA的核酸回收技术(Pang等，2011)，可以在同一样品内测量mRNA水平并测定载体基因组的数量。已发现，在治疗过的视网膜中GC1mRNA的高水平对应于大量载体基因组的回收；对于AAV8(Y733F)来说为1.57x107个载体基因组/μgDNA，对于AAV5来说为4.7x106个载体基因组/μg。尽管在治疗过的视网膜中GC1mRNA的水平高，但在治疗过的眼的视神经中没有检测到GC1表达。该结果进一步支持了这一想法，即在本研究中评估的载体不引起靶外转入基因表达。与以前的报道、即GC1KO小鼠中GCAP1的减少是翻译后的(即mRNA水平不改变)相符合，我们发现在样品之间没有GCAP1mRNA水平的显著变化(图24A和图24B)。
为初步估计其他视锥特异性RNA对治疗的影响，还在这些样品中评估了几种其他转录本。为了为视锥转导素α(GNAT2)的水平建立基线，在未治疗的GC1KO样品中评估了GNAT2RNA，并发现其相对于GC1+/+对照降低，该结果可能是由这些视网膜中视锥光受体的丧失造成的(图24A和图24B)。相反，在用AAV5或AAV8(Y733F)载体治疗过的眼，存在GNAT2mRNA水平的显著增加，该结果进一步支持视锥光受体在AAV-mGC1治疗过的GC1KO小鼠中得以保留这一想法。在不同样品之间视杆PDE6α的水平相对不变，可能是由于在GC1KO小鼠中视杆光受体没有退化(图24A和图24B)。
结论是，这些研究证实了持久的AAV介导的GC1表达能够在GC1KO小鼠中恢复长期视网膜功能并保护视锥光受体。对AAV5和AAV8(Y733F)治疗过的GC1KO小鼠组群分别进行了注射后9个月和6个月的ERG恢复的评估。尽管由样本量的减小造成视锥ERG幅度的统计学比较不能继续到超出这些时间点之外，但所有治疗过的小鼠都继续表现出功能性(ERG)挽救。对这些剩余小鼠的子集进行的各种不同测定法都显示出持续性疗法的明显指示。这种治疗的长期性在许多不同水平上得到了验证：1)在治疗后10个月在治疗过的眼中存在GC1蛋白，2)在治疗后12个月时通过ERG测量到视锥功能的恢复，3)在治疗后11个月时在治疗过的眼中视锥存活性增加，以及4)在治疗后12个月时在视网膜中回收到载体基因组和GC1mRNA。当视为单个、离散的分析时，在这些测定法中使用的样本量通常小。然而当在表现出功能性挽救的明显征兆的小鼠中将全体视为治疗效果的关联物时，样本量显然大得多。因此，在这种情形中，显得疗法持续到超过对ERG挽救进行统计学评估的时间段。这是第一次证实在GC1缺陷的动物模型中的长期治疗。
在AAV5和AAV8(Y733)治疗过的GC1KO小鼠中，分别在治疗后至少9个月和6个月时间内观察到恢复的视锥ERG。在整个研究过程中，响应是稳定的并明显高于未治疗的GC1KO的视锥响应。在用AAV8(Y733F)载体治疗过的小鼠中，恢复最为显著。在AAV8(Y733F)治疗过的小鼠中视锥b-波平均幅度比从用标准AAV5载体治疗过的GC1KO小鼠记录到的(分别为～55μν与～35μν)始终高出～20μν。在治疗后6个月、即对所有载体进行统计学比较的最后时间点时，这种差异仍然明显。该结果证实，AAV8(Y733F)载体稳定地恢复rd10小鼠这种对标准AAV载体的治疗耐受的模型的视网膜结构和功能。
在GC1KO小鼠中对治疗过的和未治疗眼之间的视杆幅度差异进行定量，由于该模型中视杆功能受到鸟苷酸环化酶-2(GC2)的部分帮助这一事实(Sun等，2010)而变得复杂。因此视杆ERG响应在不同动物之间是可变的(正常值的30-50％)。因此，与治疗过的和未治疗的视锥响应的比较不同，不能将治疗过的视杆响应与零基线进行比较。然而，成对的GC1KO眼具有可比的视杆ERG幅度，并且一只经过治疗、另一只未治疗的配对眼中视杆ERG的动物内比率，为评估对视杆功能的治疗效果提供了有效的度量标准。从在AAV8(Y733F)治疗过的GC1KO小鼠中视杆介导的响应观察到比从AAV5治疗过的小鼠中记录到的更加一贯的提高，正如通过对来自于治疗过的和未治疗的眼的视杆a-波和b-波幅度的个体内比率进行比较所指示的。这表明GC1在GC1KO眼中的积极表达能够补充GC2对鼠类视杆功能的部分作用。
通过将来自于用AAV5-smCBA-mGC1治疗过的一只小鼠的治疗过的和未治疗的视网膜全固定物用针对视锥抑制蛋白的抗体进行免疫染色，证实了视锥光受体的长期存活(注射后11个月)。在整个治疗过的GC1KO视网膜中鉴定到视锥。AAV5-smCBA-mGC1治疗过的视网膜也明显含有比未治疗的眼更多的视锥，所述未治疗的眼，正如与以前的报告相一致的，仅在其上部半球中保留了少部分视锥(Provost等，2005)。尽管没有在超微结构水平上(例如电子显微术)对治疗过的GC1KO视网膜中保留的视锥进行检查，但通过ERG分析得到的视锥随时间保持功能性这一观察表明它们的结构是完整的。由治疗性AAV-GC1所介导的对视锥光受体的长期保护具有明显的临床相关性，因为它建议了为患有GC1缺陷的患者保留黄斑视锥和恢复可用的日间/颜色视觉的可能性。
AAV介导的GC1表达在注射后持续至少10个月(通过IHC评估的最后时间点)，并且只位于光受体中，与所使用的血清型或驱动其表达的是光受体特异性(hGRK1)还是遍在(smCBA)启动子无关。尽管转入基因的表达局限于靶细胞类型，但hGRK1启动子是更特异的，因为它只在靶细胞的正确区室(光受体外段)内引起表达。该结果与利用该启动子的其他成功的概念证明性研究一起，表明在靶向光受体的临床AAV载体的设计中应该考虑hGRK1启动子。
在用AAV5-smcBA-mGC1治疗后10个月时的横断GC1KO视网膜切片的免疫染色揭示出ONL相对于野生型和未治疗的GC1KO对照中度变薄。此外，在该视网膜中，有时在光受体的细胞体中发现GC1。有可能强的、遍在的smCBA启动子以超越某些光受体的运输机制的水平驱动GC1的表达，并且光受体细胞体中转入基因产物的积累构成了这些细胞中的由应激引发的凋亡。在用AAV5-hGRK1-mGC1注射过的一只小鼠中观察到更剧烈的ONL变薄。由于n等于1，因此不能确定地得出在用该抗体治疗的所有小鼠中存在视网膜变薄的结论。然而，与过表达毒性的想法相符，AAV5-hGRK1-mGC1载体的滴度是本研究中所评估的三种载体中最高的。然而，还应该注意到，在具有高滴度AAV5-hGRK1-mGC1载体的光受体细胞体中没有GC1的积累。
尽管AAV介导的GC1的表达具有光受体独占性质，但本发明人有兴趣评估载体基因组向视网膜下空间之外的组织的扩散。重要的是，这些数据从“患病”的动物收集得到。根据载体转导的模式在患病与健康视网膜中是不同的这一证据(Kolstad等，2010)，这是适切的。这表明，生物分布模式也可能是不同的。因此，重要的是评估基因组在被挽救动物模型自身中(即表现出明显的ERG恢复的对象中)的扩散。尽管样本量有限，但在视神经和脑中收集到了关于AAV5和AAV8(Y733F)递送的基因组的分布的有用信息。
这是含有衣壳表面暴露的酪氨酸突变的AAV载体的生物分布的首次评估。在评估的所有时间点时，在注射过的眼的视神经中检测到AAV5和AAV8(Y733F)递送的载体基因组。在仅仅一个时间点(注射后7个月)，在治疗过的GC1KO小鼠的脑中检测到AAV5载体基因组。仅仅在与注射眼相反的脑半球中回收到基因组。该结果与Provost等，2005的发现相反，Provost等报道了在视网膜下注射过的大鼠和狗的脑中缺少AAV5递送的序列。到注射后10个月为止，在任何时间点处都没有从AAV5治疗过的GC1KO小鼠的脑和从AAV8(Y733F)治疗过的小鼠的脑回收到载体基因组。然而，由于被分析的小鼠的数量相对小，因此不能肯定地排除在注射后10个月时在脑中存在AAV5递送的基因组，或者在任何时间AAV8(Y733F)递送的基因组绝不存在于治疗过的GC1KO小鼠的脑中。
尽管从治疗过的眼的视神经回收到载体基因组，但免疫染色显示在用AAV5-smCBA-mGC1或AAV8(Y733F)-hGRK1-mGC1载体治疗过的眼的视神经中缺少GC1表达。Stieger等，(2005)以前进行的研究在用含有绿色荧光蛋白(GFP)的AAV8视网膜下注射后2个月和4周时，在大鼠和狗的视神经和脑中检测到转入基因的表达。考虑到AAV8(Y733F)载体含有光受体特异性hGRK1启动子并且以前发现即使在遍在启动子如smCBA的控制下GC1表达也局限于光受体，因此在视神经中缺少GC1表达并不出乎意料。Stieger等，(2005)在他们的载体中掺入强的遍在的CMV启动子以驱动GFP，所述GFP是在通过病毒载体递送时能够在广泛的各种组织中稳定表达的蛋白。
尽管AAV5和AAV8(Y733F)两种载体都能为GC1KO小鼠提供长期治疗，但存在与使用AAV8(Y733F)相关的明显优点。首先和最重要的是，带有光受体特异性启动子的AAV8(Y733F)与任一种AAV5载体相比，向被治疗的小鼠提供了明显更高的视锥ERG响应。其原因可能是由于AAV8载体在啮齿动物视网膜中注射泡之外的区域转导的能力，而由AAV5转导的视网膜的区域主要保持局限于注射泡(47)。因此，AAV8(733F)相对于AAV5载体可以简单地转导平均更大的视网膜面积，并通过增加视锥总存活率和/或增加每个转导的视锥中光响应的水平中的任一者或两者，反过来引起更多的视锥转导和强烈的全视野视锥ERG响应。
实施例8-示例性的哺乳动物GC1多肽序列
可用于本发明的实践的示例性氨基酸序列包括但不限于编码有生物活性的哺乳动物鸟苷酸环化酶蛋白的一种或多种氨基酸序列。这样的序列包括但不限于人类、非人类灵长类、鼠类、牛类和犬类来源的序列，例如在下文中的SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8、SEQIDNO：9、EQIDNO：10和SEQIDNO：11中示出的鸟苷酸环化酶蛋白：
Homosapiens(人类：GenPept登录号：NP000171)
MTACARRAGGLPDPGLCGPAWWAPSLPRLPRALPRLPLLLLLLLLQPPALSAVFTVGVLGPWACDPIFSRARPDLAARLAAARLNRDPGLAGGPRFEVALLPEPCRTPGSLGAVSSALARVSGLVGPVNPAACRPAELLAEEAGIALVPWGCPWTQAEGTTAPAVTPAADALYALLRAFGWARVALVTAPQDLWVEAGRSLSTALRARGLPVASVTSMEPLDLSGAREALRKVRDGPRVTAVIMVMHSVLLGGEEQRYLLEAAEELGLTDGSLVFLPFDTIHYALSPGPEALAALANSSQLRRAHDAVLTLTRHCPSEGSVLDSLRRAQERRELPSDLNLQQVSPLFGTIYDAVFLLARGVAEARAAAGGRWVSGAAVARHIRDAQVPGFCGDLGGDEEPPFVLLDTDAAGDRLFATYMLDPARGSFLSAGTRMHFPRGGSAPGPDPSCWFDPNNICGGGLEPGLVFLGFLLVVGMGLAGAFLAHYVRHRLLHMQMVSGPNKIILTVDDITFLHPHGGTSRKVAQGSRSSLGARSMSDIRSGPSQHLDSPNIGVYEGDRVWLKKFPGDQHIAIRPATKTAFSKLQELRHENVALYLGLFLARGAEGPAALWEGNLAVVSEHCTRGSLQDLLAQREIKLDWMFKSSLLLDLIKGIRYLHHRGVAHGRLKSRNCIVDGRFVLKITDHGHGRLLEAQKVLPEPPRAEDQLWTAPELLRDPALERRGTLAGDVFSLAIIMQEVVCRSAPYAMLELTPEEVVQRVRSPPPLCRPLVSMDQAPVECILLMKQCWAEQPELRPSMDHTFDLFKNINKGRKTNIIDSMLRMLEQYSSNLEDLIRERTEELELEKQKTDRLLTQMLPPSVAEALKTGTPVEPEYFEQVTLYFSDIVGFTTISAMSEPIEVVDLLNDLYTLFDAIIGSHDVYKVETIGDAYMVASGLPQRNGQRHAAEIANMSLDILSAVGTFRMRHMPEVPVRIRIGLHSGPCVAGVVGLTMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPYRIHVNLSTVGILRALDSGYQVELRGRTELKGKGAEDTFWLVGRRGFNKPIPKPPDLQPGSSNHGISLQEIPPERRRKLEKARPGQFS(SEQIDNO∶1)
Musmusculus(小鼠；GenPept登录号：NP032218)
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Rattusnorvegicus(挪威大鼠；GenPept登录号：NP077356)
MSAWLLPAGGFPGAGFCIPAWQSRSSLSRVLRWPGPGLPGLLLLLLLPSPSAFSAVFKVGVLGPWACDPIFARARPDLAARLATDRLNRDLALDGGPWFEVTLLPEPCLTPGSLGAVSSALTRVSGLVGPVNPAACRPAELLAQEAGVALVPWGCPGTRAAGTTAPAVTPAADALYVLLKAFRWARVALITAPQDLWVEAGRALSTALPARGLPVALVTSMVPSDLSGAREALRRIRDGPRVRVVIMVMHSVLLGGEEQRYLLEAAEELGLTDGSLVFLPFDTLHYALSPGPEALAAFVNSSKLRRAHDAVLTLTRRCPPGGSVQDSLRRAQEHQELPLDLDLKQVSPLFGTIYDAVFLLAGGVTRARAAVGGGWVSGASVARQMREAQVFGFCGILGRTEEPSFVLLDTDAAGERLFTTHLLDPVLGSLRSAGTPVHFPRGAPAPGPDPSCWFDPDVICNGGVEPGLVFVGFLLVIVVGLTGAFLAHYLRHRLLHMQMVSGPNKIILTLEDVTFLHPQGGSSRKVAQGSRSSLATRSTSDIRSVPSQPQESTNIGLYEGDWVWLKKFPGEHHMAIRPATKMAFSKLRELRHENVALYLGLFLAGTADSPATPGEGILAVVSEHCARGSLHDLLAQRDIKLDWMFKSSLLLDLIKGMRYLHHRGVAHGRLKSRNCVVDGRFVLKVTDHGHGRLLEAQRVLPEPPSAEDQLWTAPELLRDPALERRGTLAGDVFSLGIIMQEVVCRSTPYAMLELTPEEVIQRVRSPPPLCRPLVSMDQAPMECIQLMAQCWAEHPELRPSMDLTFDLFKGINKGRKTNIIDSMLRMLEQYSSNLEDLIRERTEELEQEKQKTDRLLTQMLPPSVAEALKMGTSVEPEYFEEVTLYFSDIVGFTTISAMSEPIEVVDLLNDLYTLFDAIIGSHDVYKVETIGDAYMVASGLPQRNGQRHAAEIANMSLDILSAVGSFRMRHMPEVPVRIRIGLHSGPCVAGVVGLTMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPYRIHVNMSTVRILRALDQGFQMECRGRTELKGKGVEDTYWLVGRVGFNKPIPKPPDLQPGASNHGISLQEIPPERRKKLEKARPGQFTGK(SEQIDNO：3)
BostaurusGC1(牛类；GenPept登录号：NP776973)
MTACTFLAGGLRDPGLCAPTRWSPSPPGLPPIPPRPRLRLRPPLLLLLLLPRSVLSAVFTVGVLGPWACDPIFARARPDLAARLAASRLNHAAALEGGPRFEVALLPEPCRTPGSLGAVSSALTRVSGLVGPVNPAACRPAELLAQEAGVALVPWGCPGTRAAGTTAPVVTPAADALYALLRAFRWAHVALVTAPQDLWVEAGHALSTALRARGLPVALVTSMEPSDLSGAREALRRVQDGPRVRAVIMVMHSVLLGGEEQRCLLEAAEELGLADGSLVFLPFDTLHYALSPGPDALAVLANSSQLRKAHDAVLTLTRHCPLGGSVRDSLRRAQEHRELPLDLNLQQVSPLFGTIYDSVFLLAGGVARARVAAGGGWVSGAAVARHIRDARVPGFCGALGGAEEPSFVLLDTDATGDQLFATYVLDPTQGFFHSAGTPVHFPKGGRGPGPDPSCWFDPDTICNGGVEPSVVFIGFLLVVGMGLAGAFLAHYCRHRLLHIQMVSGPNKIILTLDDITFLHPHGGNSRKVAQGSRTSLAARSISDVRSIHSQLPDYTNIGLYEGDWVWLKKFPGDRHIAIRPATKMAFSKIRELRHENVALYLGLFLAGGAGGPAAPGEGVLAVVSEHCARGSLQDLLAQRDIKLDWMFKSSLLLDLIKGIRYLHHRGVAHGRLKSRNCVVDGRFVLKVTDHGHGRLLEAQRVLPEPPSAEDQLWTAPELLRDPVLERRGTLAGDVFSLGIIMQEVVCRSAPYAMLELTPEEVVKRVQSPPPLCRPSVSIDQAPMECIQLMKQCWAEQPELRPSMDRTFELFKSINKGRKMNIIDSMLRMLEQYSSNLEDLIRERTEELELEKQKTDRLLTQMLPPSVAEALKMGTPVEPEYFEEVTLYFSDIVGFTTISAMSEPIEVVDLLNDLYTLFDAIIGSHDVYKVETIGDAYMVASGLPQRNGHRHAAEIANMALDILSAVGTFRMRHMPEVPVRIRIGLHSGPCVAGVVGLTMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPYRIHVNRSTVQILSALNEGFLTEVRGRTELKGKGAEETYWLVGRRGFNKPIPKPPDLQPGASNHGISLHEIPPDRRQKLEKARPGQFSGK(SEQIDNO：4)
Canislupusfamiliaris(犬类；GenPept登录号：NP001003207)
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Macacamulatta(恒河猴；预测的序列，来自于XP001111670)
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Pongoabelii(苏门答腊猩猩；预测的序列，来自于XP002827037)
MTACARRAGGLPDPGLCGPARWAPSLPRLPRALPRLPLLLLLLLLQPPALSAVFTVGVLGPWACDPIFSRARPDLAARLAAARLNRDPGLAGGPRFEVALLPEPCRTPGSLGAVSSALARVSGLVGPVNPAACRPAELLADNPGIALVPWGCPWTQAEGTTAPCVTPAADALYALLRAFGWARVALVTAPQDLWVEAGRSLSTALRARGLPVASVTSMEPLDLSGAREALRKVRDGPRVTAVIMVMHSVLLGGEEQRYLLEAAEELGLTDGSLVFLPFDTIHYALSPGPEALAALANSSQLRRAHDAVLTLTRHCPSEGSVLDSLRRAQERRELPSDLNLQQVSPLFGTIYDAVFLLARGVAEAWAAAGGRWVSGAAVARHIRDAQVPGFCGDLGGDGEPPFVLLDTDAAGDRLFATYMLDPARGSFLSAGTRMHFPRGGSAPGPDPSCWFDPNNICGGGLEPGLVFLGFLLVVGMGLAGAFLAHYVRHRLLHIQMVSGPNKIILTVNDITFLHPHGGTSRKVAQGSRSSLAARSMSDIRSGPSQPLDSPNVGVYEGDRVWLKKFPGDQHIAIRPATKTAFSKLQELRHENVALYLGLFLARGAEGPAALWEGNLAVVSEHCTRGSLQDLLSQREIKLDWMFKSSLLLDLIKGIRYLHHRGVAHGRLKSRNCIVDGRFVLKITDHGHGRLLEAQKVLPEPPRAEDQLWTAPELLRDPALERRGTLAGDVFSLAIIMQEVVCRSAPYAMLELTPEEVVQRVRSPPPLCRPLVSMDQAPVECIHLMKQCWAEQPELRPSMDHTFDLFKNINKGRKTNIIDSMLRMLEQYSSNLEDLIRERTEELELEKQKTDRLLTQMLPPSVAEALKTGTPVEPEYFEQVTLYFSDIVGFTTISAMSEPIEVVDLLNDLYTLFDAIIGSHDVYKVETIGDAYMVASGLPQRNGQRHAAEIANMSLDILSAVGTFRMRHMPEVPVRIRIGLHSGPCVAGVVGLTMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPYRIHVNLSTVGILRALDSGYQVELRGRTELKGKGAEDTFWLVGRRGFNKPIPKPPDLQPGSSNHGISLQEIPPERRRKLEKARPGQFS(SEQIDNO：7)
Callithrixjacchus(白色簇绒耳狨猴；预测的序列，来自于XP_002747985)
MTACARRAGGLPDPGLCGPARWAPALSRLPRALPRLPLLLLLLLLQPPALSAQFTVGVLGPWACDPIFSRARPDLAARLAAARLNRDPSLAGGPRFEVALLPEPCRTPGSLGAVSSALARVSGLVGPVNPAACRPAELLAEEAGIALVPWGCPGTQAAGTTAPVVTPAADALYALLRAFGWARVALVTAPQDLWVEAGLSLSTALRARGLPVVSVTSMEPLDLSGAREALRKVRNGPRVTAVIMVMHSVLLGGEEQRYLLEAAEELGLTDGSLVFLPFDTIHYALSPGREALAALVNSSQLRRAHDAVLTLTRHCSSEGSVLDSLRKAQQRRELPSDLNLEQVSPLFGTIYDAVVLLARGVADAPAAVGGRWVSGAAVARHVWDAQASGFCGDLGRDEEPSFVLLDTDAAGDQLFATYMLDPARGSLLSAGTPMHFPRGGPAPGPDPSCWFDPNNICDGGLEPGFIFLGFLLVVGMGLAGALLAHYVRHQLLHIQMVSGPNKIILTVDDITFLHPHGGASRKVAQGSRSSLAAHSTSDIRSGPSQPSDSPNIGVYEGDRVWLKKFPGEQHIAIRPATKTAFSKLQELRHENVALYLGLFLAQGAEGPAALWEGNLAVVSEHCTRGSLQDLLAQREIKLDWMFKSSLLLDLIKGIRYLHHRGVAHGRLKSRNCIVDGRFVLKITDHGHGRLLEAQKVLPEPPKAEDQLWTAPELLRDPALERRGTLAGDVFSLGIIMQEVVCRSAPYAMLELTPDEVVQRVRSPPPLCRPFVSMDQAPVECIHLMKQCWAEQPELRPSMDLTFDLFKNINKGRKTNIIDSMLRMLEQYSSNLEDLIRERTEELELEKQKTDRLLTQMLPPSVAEALKTGTPVEPEYFEQVTLYFSDIVGFTTISAMSEPIEVVDLLNDLYTLFDAIIGSHDVYKVETIGDAYMVASGLPQRNGQRHAAEIANMSLDILSAVGTFRMRHMPEVPVRIRIGLHSGPCVAGVVGLTMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPYRIHVNLSTVGILRALDSGYQVELRGRTELKGKGAEDTFWLVGRRGFNKPIPKPPDLQPGASNHGISLQEIPPERRRKLEKARPGQFS(SEQIDNO：8)
Ailuropodamelanoleuca(大熊猫，预测的序列，来自于XP002921218)
MRACALLAGGLPYPRLCAPTRWAPARPGVSRALPWPRPRLRLLLLLLLRPPSVLSAVFTVGVLGPWACDPIFARARPDLXXXXXXXXXDALYVLLRAFRWARVALVTAPQDLWVEAGRALSAALRARGLPVALVTTMEPSDLSGAREALRRVQHGPRVSAVIMVMHSVLLGGEEQRCLLQAAEELGLADGSLVFLPFDTLHYALSPGPEALAALANSSQLRRAHDAVLTLTRHCPPGGSVMDSLRRAQERQELPSDLNLEQVSPLFGTIYDAVFLLAGGVARARAAAADSRVPGFCGALGGAEEPPFVLLDTDAAGDRFFATYVLDPTRGSLHSAGTPVHFPRGGGAPGPDPSCWFEPDSICNGGVEPGLVFTGFLLVVGMGLMGAFLAHYVRHRLLHIQMVSGPNKIILTLDDITFLHPQGGSARKVVQGSRSSLAARSTSDVRSVPSQPSDGGNIGLYEGDWVWLKKFPGSQHIAIRPATKTAFSKLRELRHENVALYLGLFLGGGEGGSAAAGGGMLAVVSEHCTRGSLHDLLAQRDIKLDWMFKSSLLLDLIKGMRYLHHRGVAHGRLKSRNCVVDGRFVLKVTDHGHGRLLEAQKVLAEPPSAEDQLWTAPELLRDPALERRGTLAGDVFSLGIIMQEVVCRSSPYAMLELSAREVVQRVRSPPPLCRPSVSVDQAPAECIQLMKQCWAEQPELRPSLDRTFDQFKSINKGRKTNIIDSMLRMLEQYSSNLEGLIRERTEELELEKRKTDRLRAASLPSSVAEALKMGTPVEPEYFEEVTLYFSDIVGFTTISAMSEPIEVVDLLNDLYTLFDAIIGSHDVYKVETIGDAYMVASGLPQRNGQRHAAEIANMALDILSAVGSFRMRHMPEVPVRIRIGLHSGPCVAGVVGLTMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPYRIHVNMSTVRILRALDEGFQTEVRGRTELKGKGAEDTYWLVGXXXXXXXXPIPKPPDLQPGASNHGISLQEIPLDRRQKLEKARPGQFSGK(SEQIDNO：9)
Monodelphisdomestica(灰色短尾负鼠；预测序列，来自于XP_001369029)
MLVPSINGLFHHPPWCFPPLPLPLFFLFLLLLLPVPVLPATFTIGVLGPWSCDPIFSRARPDLAARLAATRMNHDQALEGGPWFEVILLPEPCRTSGSLGALSPSLARVSGLVGPVNPAACHPAELLAQEAGVPLVPWGCPQGKARTTAPALPLALDALYALLRAFHWAKVALITAPQDLWVEAGQALAGGLRSRGLPVAMVTSLETTDLESAKNALKRVRDGPKVKVLIMVMHSVLLGGEEQRLLLEAAEELGLVEGTMVFLPFDTLHYALPPGPEALRPITNSSRLRKAHDAVLTLTRYCPKGSVSASLRQAQEHRELPLDLKPQQVSPLFGTIYDAIYLLAGAVAGAQVAGGGGWVSGAAVARHIPNTLVSGFCGDLGGTKEPPFVLLDTDGMRDQLLPTYTLDPAQGVLHHAGNPIHFPHGGQGPGPDPPCWFDPNVICSGGIEPRFILLVILIIIGGGLVVATLAYYVRRQLLHAQMVSGPNKMILTLEDITFFPRQGSSSRKATEGSRSSLIAHSASDMRSIPSQPPDNSNIGMYEGDWVWLKKFPGEHYTEIRPATKMAFSKLRELRHENVAVQMGLFLAGSMEGAAAGGLGGGILAVVSEYCSRGSLQDLLIQRDIKLDWMFKSSLLLDLIKGLRYLHHRGVAHGRLKSRNCVVDGRFVLKITDHAHGRLLEAQRVSLEPPQAEDRLWTAPELLRNEALERQGTLQGDVFSVGIIMQEVVCRCEPYAMLELTPEEIIQKVQSPPPMCRPSVSVDQAPMECIQLMKQCWAEQPDLRPNMDTTFDLFKNINKGRKTNIIDSMLRMLEQYSSNLEDLIRERTEELELEKQKTDKLLTQMLPPSVAEALKLGIPVEPEYFEEVTLYFSDIVGFTTISAMSEPIEVVDLLNDLYTLFDAIIGSHDVYKVETIGDAYMVASGLPKRNGQRHAAEIANMSLDILSSVGSFRMRHMPEVPVRIRIGLHSGPCVAGVVGLTMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPYRIHVNLSTVKILQGLNEGFQIEIRGRTELKGKGVEDTYWLVGRKGFDKPIPIPPDLLPGASNHGISLQEIPEDRRKKLEKARPGQPLGK(SEQIDNO：10)
Equuscaballus(马；预测序列，来自于XP001918412)
MVMHSVLLGGEEQRCLLEAAEELGLADGSLVFLPFDTLHYALSPGPEALAVLANNSQLRRAHDAVLTLTRHCPLGGSVLDSLRRAQEHQELPSDLNLQQVSPLFGTIYDAVYLLAGGVARARAAAGGSWVSGAAVAHHVRDAQVPGFCGALGGAEEPQFVLLDTDAAGDRLFATYMLDPTRGSLWSAGTPVHFPRGGRGPGPDPWCWFDPDDICNGGVEPRLVFIGFLLAVGMGLAGVFLAHYVRHRLLHIQMASGPNKIILTLDDITFLHPQGGSSRKVIQGSRSSLAARSVSDIRSVPSQPMDSSNIGLYEGDWVWLKKFPGDQHIAIRPATKTAFSKLRELRHENVALYLGLFLAGGSSGAAAPREGMLAVVSEHCARGSLHDLLAQRDIKLDWMFKSSLLLDLIKGMRYLHHRGVAHGRLKSRNCVVDGRFVLKVTDHGHGRLLEAQKVLPEPPSAEDQLWTAPELLRDPALERQGTLAGDVFSLGIIIQEVVCRSTPYAMLELTPEEVVQRLQSPPPLCRPSVSMDQAPMECIQLMKQCWAEQPDLRPSMDRTFDLFKSINKGRKTNIIDSMLRMLEQYSSNLEDLIRERTEELELEKQKTDRLLTQMLPPSVAEALKMGTPVEPEYFEEVTLYFSDIVGFTTISAMSEPIEVVDLLNDLYTLFDAIIGSHDVYKVETIGDAYMVASGLPQRNGQRHAAEIANMALDILSAVGSFRMRHMPEVPVRIRIGLHSGPCVAGVVGLTMPRYCLFGDTVNTASRMESTGLPYRIHVNMSTVRILRALDEGFQVEVRGRTELKGKGVEDTYWLVGRRGFNKPIPKPPDLQPGASNHGISLQEIPPERRQKLEKARPGQFSGK(SEQIDNO：11)
实施例9-已知哺乳动物GC1多肽的序列分析
使用下列物种的氨基酸序列产生GC1比对数据：Bostaurus(牛类；1110个残基)，Canislupusfamiliaris(犬类；1109个残基)，Musmusculus(鼠类；1108个残基)和Homosapiens(人类；1103个残基)。共有区域和可变区域的位置是基于与Bostaurus相对应的编号残基，因为它是最长的GC1蛋白，有1110个残基，并且在比对中没有间隙。
来自于Bostaurus、Canislupusfamiliaris、Musmusculus和Homosapiens的GC1蛋白的比对的相似性图。
GC1共有区域：
氨基酸位置：44-49，55-90，98-155，164-321，464-549，561-604620-761，813-1026，1045-1054和1060-1110。
可变区域：
氨基酸位置：4-43，50-54，91-97，156-163，322-463，550-560，605-619，762-812，1027-1044和1055-1059。
GC1共有比对的其他显著区域包括：
(1)激酶同源结构域：共有序列的531至541氨基酸位置(已知为光受体中的活性所必需的，参见例如Bereta等，2010)。
(2)鼠类GC1蛋白的激酶同源结构域中的磷酸化丝氨酸残基(共有/牛类的位置显示在括号中)：530(532)，532(534)，533(535)和538(540)。
实施例10-smCBA启动子的核苷酸序列
在上述研究中使用的示例性人类GRK1(hGRK1)启动子的核酸序列如下所示：
GGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGTCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCCGGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGC(SEQIDNO：12)
在上述研究中使用的示例性smCBA启动子的核酸序列如下所示：AATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAG(SEQIDNO：13)
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依照本公开，不需过多实验即可做出和执行本文所公开和要求的所有组合物和方法。尽管已根据优选实施方案对本发明的组合物和方法进行了描述，但对本技术领域的普通专业人员来说，显然可以对组合物和方法以及在本文描述的方法的步骤或步骤序列中做出改变，而不背离本发明的概念、精神和范围。
更具体来说，，显然可以用在化学和生理学两方面相关的某些试剂代替本文描述的试剂，同时获得相同或类似的结果。所有这样的对本技术领域的普通专业人员来说显而易见的相似替代物，都被视为在由随附的权利要求书所定义的本发明的精神、范围和概念之内。

Claims (11)

1.一种重组腺相关病毒(rAAV)载体，其包括含有光受体特异性人类视紫红质蛋白激酶启动子或遍在的截短的嵌合CMV-鸡β-肌动蛋白启动子的至少第一多核苷酸，所述启动子与编码至少第一哺乳动物鸟苷酸环化酶蛋白、肽或多肽的至少第一核酸区段可操作地连接。
2.一种病毒体或感染性病毒粒子，其包含权利要求1的rAAV载体。
3.大量感染性病毒粒子，其从权利要求1的rAAV载体制备而来。
4.一种分离的哺乳动物宿主细胞，其包含：
(a)权利要求1的rAAV载体；
(b)权利要求2的病毒体或感染性病毒粒子；或
(c)权利要求3的大量感染性病毒粒子。
5.一种组合物，其包含：
(1)(a)权利要求1的rAAV载体；
(b)权利要求2的病毒体或感染性病毒粒子；
(c)权利要求3的大量感染性病毒粒子；或
(d)包含所述载体、病毒体或感染性粒子的分离的哺乳动物宿主细胞；以及
(2)可药用缓冲液、载体、介质或稀释剂。
6.一种试剂盒，其包含：
(1)选自下列的组分：
(a)权利要求1的rAAV载体；
(b)权利要求2的病毒体或感染性病毒粒子；
(c)权利要求3的大量感染性病毒粒子；
(d)权利要求4的分离的哺乳动物宿主细胞；或
(e)权利要求5的组合物；以及
(2)使用所述组分在人类中诊断、预防、治疗或改善视网膜营养不良、疾病、病症或异常状态的一种或多种症状的说明书。
7.权利要求5的组合物在制造用于诊断、预防、治疗或改善哺乳动物眼睛的疾病、病症、机能障碍或异常状态或其一种或多种症状的药物中的应用。
8.一种在哺乳动物中预防、治疗或改善疾病、机能障碍、病症、缺陷或异常状态或其一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用包含权利要求1的rAAV载体的组合物，所述施用的量和时间足以在哺乳动物中预防、治疗或改善所述疾病、机能障碍、病症、缺陷或异常状态或其一种或多种症状。
9.一种用于向有需要的哺乳动物提供治疗有效量的有生物活性的哺乳动物鸟苷酸环化酶肽、多肽或蛋白质的方法，所述方法包括在有需要的哺乳动物的适合细胞中导入有效量的权利要求1的rAAV载体，所述导入的时间足以在已导入所述rAAV载体的哺乳动物的至少第一细胞群体或至少第一组织中产生有生物活性的鸟苷酸环化酶肽、多肽或蛋白。
10.一种用于在患有、被怀疑患有、被诊断为具有或有风险发生LCA1的哺乳动物的一个或多个视网膜细胞中提高有生物活性的retGC1蛋白水平的方法，所述方法包括将权利要求1的rAAV载体导入到所述哺乳动物的至少第一视网膜细胞群体中，所述导入的量和时间有效提高所述哺乳动物的一个或多个视网膜细胞中有生物活性的retGC1蛋白的水平。
11.一种用于在哺乳动物中治疗或改善视网膜营养不良的一种或多种症状的方法，所述方法包括向所述哺乳动物的视网膜或视网膜下空间直接施用权利要求1的rAAV载体，施用的量和时间足以在所述哺乳动物中治疗或改善视网膜营养不良的一种或多种症状。
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