JP2015091273A - レーバー先天性黒内障1(LCA1)を処置するためのrAAV−グアニル酸シクラーゼ組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2010年4月23日に出願された米国仮特許出願第61/327,521号(現在係属中)への優先権を主張し、上記米国仮特許出願の全容は、明示的に参考としてその全体が本明細書に具体的に援用される。
米国政府は、国立衛生研究所(NIH)からの助成金番号EY13729、EY11123、およびEY08571によって、本発明における一定の権利を有する。
該当なし。
本発明は、一般に、分子生物学およびウイルス学の分野ならびに特に、少なくとも1つの第1の処置用遺伝子産物をコードする少なくとも1つの第1の核酸セグメントを発現する組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)組成物を使用するための方法、特に、哺乳動物の眼の疾患、障害、傷害、外傷、または機能不全の1つまたは複数の症状の予防、処置、または改善において有用なそれらの産物に関する。特定の実施形態では、本発明は、たとえば、哺乳動物の眼の1つまたは複数の障害または疾患の処置を含む、1つまたは複数の治験用の、診断上の、および/または処置用のレジメンにおける使用のための、特に、ヒトにおける、レーバー先天性黒内障、1型(LCA1)などのような網膜ジストロフィーを含む、先天性の網膜の失明を処置するための、生物学的に機能的なグアニル酸シクラーゼペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を発現するrAAVベクターを含む組成物を提供する。ヒトにおけるグアニル酸シクラーゼ欠損の1つまたは複数の症状を処置するまたは改善させるためのrAAV−LCA1ベクターを含む、ウイルスベクターベースの遺伝子療法における使用のための、rAAVベクターベースのグアニル酸シクラーゼ医薬を調製するための方法もまた、提供される。
現在、ヒトにおいてLCA1を予防するまたは処置することができる有効な予防薬も治療薬もない。
第1の実施形態では、本発明は、そのようなベクターを用いて形質転換された適した宿主細胞において核酸セグメントを発現することができる、少なくとも1つの第1のプロモーターに作動可能に連結された、グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチド、特に、哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、もしくはポリペプチド(またはその生物学的に活性な断片もしくは誘導体)をコードする少なくとも1つの第1の核酸セグメントを含むポリペプチドを含むrAAVベクターを提供する。好ましい実施形態では、核酸セグメントは、哺乳動物、特に、ヒトグアニル酸シクラーゼペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質、特に、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、もしくは配列番号11において開示される1つもしくは複数のアミノ酸配列またはその生物学的に活性な断片もしくは変異体からの少なくとも1つの第1の30の連続したアミノ酸配列と少なくとも90%相同である少なくとも1つの第1の連続したアミノ酸配列を含むペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。
本発明の他の態様は、本発明のrAAVグアニル酸シクラーゼベクターを含むrAAV粒子およびビリオン、複数のそのような粒子およびビリオンならびに哺乳動物の選択された細胞、組織、または器官、たとえば、選択された哺乳動物の眼の1つまたは複数の領域への、筋肉内、静脈内、または直接的な注射によってなどのような、適した手段を通しての哺乳動物への投与が意図される、たとえば、rAAVグアニル酸シクラーゼベクターまたはビリオンの医薬処方物などのような、本明細書において開示される1つまたは複数のrAAVグアニル酸シクラーゼベクターを含む医薬組成物および宿主細胞に関する。典型的に、そのような組成物は、以下に記載されるように、薬学的に許容される賦形剤、緩衝剤、希釈剤、アジュバント、またはキャリアと共に処方されるであろう、また、処置効果が所望される、選択された器官、組織、および細胞への投与を促進するために、1つまたは複数のリポソーム、脂質、脂質複合体、マイクロスフェア、マイクロ粒子、ナノスフェア、またはナノ粒子処方物をさらに含んでいてもよい。
哺乳動物におけるグアニル酸シクラーゼ欠損から結果として生じる状態の症状を処置するまたは改善させるための処置用のキットもまた、本発明の一部である。例示的なキットは、好ましくは、本明細書において記載される1つまたは複数の開示されるAAVグアニル酸シクラーゼベクター構築物、ビリオン、または医薬組成物およびキットを使用するための説明書を含むものである。グアニル酸シクラーゼ、特に、網膜特異的グアニル酸シクラーゼ−1欠損の処置の方法におけるそのようなキットの使用は、retGC1欠陥または欠損の処置においておよび罹患哺乳動物におけるLCA−1などのような網膜ジストロフィーの処置において好ましい。
本発明はまた、その必要性がある哺乳動物に治療有効量のグアニル酸シクラーゼポリペプチドを送達するための方法を提供する。そのような方法は、一般に、本明細書において開示される1つまたは複数のグアニル酸シクラーゼ組成物をそのような哺乳動物に提供するまたは投与するステップを少なくとも含む。たとえば、方法は、本明細書において記載される1つまたは複数のrAAVベクター、ビリオン、ウイルス粒子、宿主細胞、または医薬組成物をそのような哺乳動物に提供するステップを含んでいてもよい。好ましくは、そのような提供またはそのような投与は、本明細書において開示される、治療有効量の1つまたは複数のグアニル酸シクラーゼポリペプチドを哺乳動物の選択された細胞、組織、または器官に、特に、処置的に有効なレベルを哺乳動物の眼の細胞に提供するのに有効な量およびその時間となるであろう。そのような方法は、薬(therapeuticum)の全身性の注射(複数可)を含んでいてもよいまたは哺乳動物の特定の細胞、組織、もしくは器官への処置用組成物の直接的なもしくは間接的な投与、注射、もしくは導入をさらに含んでいてもよい。
したがって本発明は以下の項目を提供する:
(項目1)
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターであって、
少なくとも1つの第1の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードする少なくとも1つの第1の核酸セグメント、および、
該第1の核酸セグメントに作動可能に連結された光受容体特異的ヒトロドプシンキナーゼプロモーターまたはユビキタス切断型キメラCMV−ニワトリβ−アクチンプロモーターを含む少なくとも1つの第1のポリヌクレオチド
を含む、rAAVベクター。
(項目2)
上記少なくとも1つの第1の核酸セグメントが、少なくとも1つの第1の連続したアミノ酸配列領域を含む少なくとも1つの第1の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードし、該少なくとも1つの第1の連続したアミノ酸配列領域が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、または配列番号11において記載される配列の少なくとも80の連続したアミノ酸の少なくとも1つの第1の配列領域と少なくとも約90%同一である、項目1に記載のrAAVベクター。
(項目3)
上記少なくとも1つの第1の核酸セグメントが、少なくとも1つの第1の連続したアミノ酸配列領域を含む少なくとも1つの第1の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードし、該少なくとも1つの第1の連続したアミノ酸配列領域が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、または配列番号11において記載される配列の少なくとも100の連続したアミノ酸の少なくとも1つの第1の配列領域と少なくとも約92%同一である、項目1または項目2に記載のrAAVベクター。
(項目4)
上記少なくとも1つの第1の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、少なくとも1つの第1の連続したアミノ酸配列領域を含み、該少なくとも1つの第1の連続したアミノ酸配列領域が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、または配列番号11において記載される配列の少なくとも120の連続したアミノ酸の少なくとも1つの第1の配列領域と少なくとも約95%同一である、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目5)
上記少なくとも1つの第1の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、少なくとも1つの第1の連続したアミノ酸配列領域を含み、該少なくとも1つの第1の連続したアミノ酸配列領域が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、または配列番号11において記載される配列の少なくとも140の連続したアミノ酸の少なくとも1つの第1の配列領域と少なくとも約98%同一である、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目6)
上記少なくとも1つの第1の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、少なくとも1つのアミノ酸配列を含み、該少なくとも1つのアミノ酸配列が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、または配列番号11のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも約98%同一である、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目7)
上記少なくとも1つの第1の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、または配列番号11のアミノ酸配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目8)
上記少なくとも1つの第1の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、または配列番号11の配列と少なくとも98%同一であるアミノ酸配列から本質的になる、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目9)
上記少なくとも1つの第1の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、生物学的に活性であり、かつ配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、または配列番号11からの少なくとも50のアミノ酸の連続した配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目10)
上記少なくとも1つの第1の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、生物学的に活性であり、かつ配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、または配列番号11からの少なくとも75のアミノ酸の連続した配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目11)
上記少なくとも1つの第1の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、生物学的に活性であり、かつ配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、または配列番号11からの少なくとも100のアミノ酸の連続した配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目12)
上記少なくとも1つの第1の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、生物学的に活性であり、かつ配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、または配列番号11からの少なくとも125のアミノ酸の連続した配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目13)
上記哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、生物学的に活性であり、かつ配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、または配列番号11の1つまたは複数からの一次アミノ酸配列と少なくとも95%同一である一次アミノ酸配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目14)
上記哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、生物学的に活性であり、かつ配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、または配列番号11の1つまたは複数からの一次アミノ酸配列と少なくとも99%同一である一次アミノ酸配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目15)
前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクターであって、該rAAVベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス血清型1(rAAV1)ベクター、組換えアデノ随伴ウイルス血清型2(rAAV2)ベクター、組換えアデノ随伴ウイルス血清型3(rAAV3)ベクター、組換えアデノ随伴ウイルス血清型4(rAAV4)ベクター、組換えアデノ随伴ウイルス血清型5(rAAV5)ベクター、組換えアデノ随伴ウイルス血清型6(rAAV6)ベクター、組換えアデノ随伴ウイルス血清型7(rAAV7)ベクター、組換えアデノ随伴ウイルス血清型8(rAAV8)ベクター、または組換えアデノ随伴ウイルス血清型9(rAAV)ベクターである、rAAVベクター。
(項目16)
自己相補的rAAV(scAAV)である、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目17)
上記光受容体特異的ヒトロドプシンキナーゼプロモーターが、配列番号12からの少なくとも30の連続した塩基対配列から本質的になる核酸配列を含むか、または上記切断型キメラCMV−ニワトリβ−アクチンプロモーターが、配列番号13からの少なくとも70の連続した塩基対配列から本質的になる核酸配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目18)
上記光受容体特異的ヒトロドプシンキナーゼプロモーターが、配列番号12からの少なくとも40の連続した塩基対配列から本質的になる核酸配列を含むか、または上記切断型キメラCMV−ニワトリβ−アクチンプロモーターが、配列番号13からの少なくとも90の連続した塩基対配列から本質的になる核酸配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目19)
上記光受容体特異的ヒトロドプシンキナーゼプロモーターが、配列番号12からの少なくとも60の連続した塩基対配列から本質的になる核酸配列を含むか、または上記切断型キメラCMV−ニワトリβ−アクチンプロモーターが、配列番号13からの少なくとも120の連続した塩基対配列から本質的になる核酸配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目20)
上記光受容体特異的ヒトロドプシンキナーゼプロモーターが、配列番号12の核酸配列を含むか、または上記切断型キメラCMV−ニワトリβ−アクチンプロモーターが、配列番号13の核酸配列を含む、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目21)
上記少なくとも1つの第1の核酸セグメントに作動可能に連結された少なくとも1つの第1のエンハンサーをさらに含む、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目22)
上記少なくとも1つの第1の核酸セグメントに作動可能に連結された少なくとも1つの第1の哺乳動物のイントロン配列をさらに含む、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目23)
上記少なくとも1つの第1の哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドが、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、エピン、ヤギ、またはオオカミ起源のものである、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目24)
上記少なくとも1つの第1の核酸セグメントが、ヒト起源の生物学的に活性なヒトグアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドをコードする、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目25)
上記切断型キメラCMV−ニワトリβ−アクチンプロモーターが、配列番号12の配列から本質的になる核酸配列を含むか、または上記少なくとも1つの第1の核酸セグメントが、配列番号1からの少なくとも100の連続したアミノ酸配列を含む哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、もしくはポリペプチドをコードする、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目26)
感染性アデノ随伴ウイルス粒子、ビリオン、または複数の感染性AAV粒子内に含まれる、前述の項目のいずれかに記載のrAAVベクター。
(項目27)
項目1〜26のいずれか一項目に記載のrAAVベクターを含む、ビリオンまたは感染性ウイルス粒子。
(項目28)
項目1〜26のいずれか一項目に記載のrAAVベクターから調製される、複数の感染性ウイルス粒子。
(項目29)
(a)項目1〜26のいずれか一項目に記載のrAAVベクター、
(b)項目27に記載のビリオンもしくは感染性ウイルス粒子、または
(c)項目28に記載の複数の感染性ウイルス粒子
を含む、単離哺乳動物宿主細胞。
(項目30)
ヒト宿主細胞である、項目27に記載の単離哺乳動物宿主細胞。
(項目31)
(1)
(a)項目1〜26のいずれか一項目に記載のrAAVベクター、
(b)項目27に記載のビリオンもしくは感染性ウイルス粒子、
(c)項目28に記載の複数の感染性ウイルス粒子、または
(d)該ベクター、該ビリオン、もしくは該感染性粒子を含む単離哺乳動物宿主細胞および
(2)薬学的に許容される緩衝剤、キャリア、ビヒクル、または希釈剤
を含む、組成物。
(項目32)
脂質、リポソーム、脂質複合体、エトソーム、ニオソーム、ナノ粒子、マイクロ粒子、リポスフィア、ナノカプセル、またはその任意の組み合わせをさらに含む、項目31に記載の組成物。
(項目33)
ヒトの眼への投与のために処方される、項目31または項目32に記載の組成物。
(項目34)
療法または予防における使用のための、項目31〜33のいずれか一項目に記載の組成物。
(項目35)
ヒト網膜ジストロフィー、疾患、または障害の療法または予防における使用のための、項目31〜34のいずれか一項目に記載の組成物。
(項目36)
レーバー先天性黒内障1(LCA1)の療法または予防における使用のための、項目31〜54のいずれか一項目に記載の組成物。
(項目37)
(1)
(a)項目1〜26のいずれか一項目に記載のrAAVベクター、
(b)項目27に記載のビリオンもしくは感染性ウイルス粒子、
(c)項目28に記載の複数の感染性ウイルス粒子、
(d)項目29もしくは項目30に記載の単離哺乳動物宿主細胞、または
(e)項目31〜36のいずれか一項目に記載の組成物
からなる群より選択される構成要素、および
(2)該構成要素を、ヒトにおける網膜ジストロフィー、疾患、障害、または異常状態の1つまたは複数の症状の診断、予防、処置、または改善において使用するための説明書を含む、キット。
(項目38)
上記網膜ジストロフィーが、レーバー先天性黒内障1(LCA−1)と診断されている、項目35に記載のキット。
(項目39)
哺乳動物の眼の疾患、障害、機能不全、もしくは異常状態またはその1つもしくは複数の症状を診断するか、予防するか、処置するか、または改善させるための医薬の製造における、項目31に記載の組成物の使用。
(項目40)
ヒトにおけるレーバー先天性黒内障1(LCA−1)の1つまたは複数の症状を処置するか、または改善させるための医薬の製造における、項目39に記載の使用。
(項目41)
哺乳動物における疾患、機能不全、障害、欠損、もしくは異常状態、またはその1つもしくは複数の症状を予防するか、処置するか、または改善させるための方法であって、該方法は、該哺乳動物における該疾患、機能不全、障害、欠損、もしくは異常状態、またはその1つもしくは複数の症状を予防するか、処置するか、または改善させるのに十分な量および時間で、項目1〜26のいずれか一項目に記載のrAAVベクターを含む組成物を該哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
(項目42)
上記哺乳動物が、少なくとも1つの第1の網膜障害、疾患、もしくはジストロフィーを有するか、少なくとも1つの第1の網膜障害、疾患、もしくはジストロフィーを有することが疑われているか、少なくとも1つの第1の網膜障害、疾患、もしくはジストロフィーを発症する危険性があるか、または少なくとも1つの第1の網膜障害、疾患、もしくはジストロフィーを有すると診断された、項目41に記載の方法。
(項目43)
上記哺乳動物が、生物学的に活性な網膜グアニル酸シクラーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドにおける欠損症を発症する危険性があるか、または該欠損症を有すると診断された、項目41または項目42に記載の方法。
(項目44)
上記哺乳動物が、ヒト新生児、新産児、幼児、または年少者であって、レーバー先天性黒内障1(LCA−1)などの先天性網膜ジストロフィーを発症する危険性があるか、またはレーバー先天性黒内障1(LCA−1)などの先天性網膜ジストロフィーを有すると診断された、ヒト新生児、新産児、幼児、または年少者である、項目41〜43のいずれか一項目に記載の方法。
(項目45)
治療有効量の生物学的に活性な哺乳動物グアニル酸シクラーゼペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を必要とする哺乳動物に、治療有効量の生物学的に活性な哺乳動物グアニル酸シクラーゼペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を提供するための方法であって、項目1〜26のいずれか一項目に記載の有効量のrAAVベクターを、十分な時間、治療有効量の生物学的に活性な哺乳動物グアニル酸シクラーゼペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を必要とする哺乳動物の適した細胞に導入して、該rAAVベクターが導入された該哺乳動物の細胞の少なくとも1つの第1の集団または少なくとも1つの第1の組織において、該rAAVベクターから生物学的に活性なグアニル酸シクラーゼペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を産生するステップを含む、方法。
(項目46)
上記治療有効量の生物学的に活性な哺乳動物グアニル酸シクラーゼペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を必要とする哺乳動物が、該哺乳動物の少なくとも1つの第1の組織において、正常な哺乳動物における生物学的に活性なretGC1タンパク質のレベルと比較した場合に、生物学的に活性なretGC1タンパク質の欠陥、欠損、または実質的な欠如を有する、項目45に記載の方法。
(項目47)
項目45または項目46に記載の方法であって、ここで、上記哺乳動物からの複数の細胞には、ex vivoまたはin vitroにおいて上記rAAVベクターが提供され、該方法は、該哺乳動物の身体内のまたは身体に関する少なくとも1つの第1の組織部位の中に、該複数の提供を受けた細胞を導入するステップをさらに含む、方法。
(項目48)
上記複数の得られた細胞が、上記哺乳動物の一方または両方の眼内の少なくとも1つの第1の部位の中に導入される、項目45〜47のいずれか一項目に記載の方法。
(項目49)
上記複数の得られた細胞が、網膜または周囲の組織の中への直接的な注射によって、上記哺乳動物の一方または両方の眼内の少なくとも1つの第1の部位の中に導入される、項目45〜48のいずれか一項目に記載の方法。
(項目50)
上記rAAVベクターの導入によって、上記哺乳動物の眼において、錐体光受容体が保持され、錐体媒介性の機能および視覚行動が修復された、項目45〜49のいずれか一項目に記載の方法。
(項目51)
上記哺乳動物の眼の中への上記rAAVベクターの1回の導入によって、少なくとも3か月の期間、該哺乳動物において、錐体光受容体が保持され、錐体媒介性の機能および視覚行動が修復された、項目45〜50のいずれか一項目に記載の方法。
(項目52)
上記哺乳動物の眼の中への上記rAAVベクターの1回の導入によって、少なくとも6か月の期間、該哺乳動物において、錐体光受容体が保持され、錐体媒介性の機能および視覚行動が修復された、項目45〜51のいずれか一項目に記載の方法。
(項目53)
上記哺乳動物の眼の中への上記rAAVベクターの1回の導入によって、少なくとも10か月の期間、該哺乳動物において、錐体光受容体が保持され、錐体媒介性の機能および視覚行動が修復された、項目45〜52のいずれか一項目に記載の方法。
(項目54)
LCA1を有するか、LCA1を有することが疑われているか、LCA1を有すると診断されているか、またはLCA1を発症する危険性がある哺乳動物の1つまたは複数の網膜細胞において、生物学的に活性なretGC1タンパク質のレベルを増加させるための方法であって、該哺乳動物の1つまたは複数の網膜細胞において生物学的に活性なretGC1タンパク質のレベルを増加させるのに有効な量および時間で、該哺乳動物の網膜細胞の少なくとも1つの第1の集団の中に、項目1〜26のいずれか一項目に記載のrAAVベクターを導入するステップを含む、方法。
(項目55)
哺乳動物における網膜ジストロフィーの1つまたは複数の症状を処置するかまたは改善させるための方法であって、該哺乳動物における網膜ジストロフィーの1つまたは複数の症状を処置するかまたは改善させるのに十分な量および時間で、項目1〜26のいずれか一項目に記載のrAAVベクターを該哺乳動物の網膜または網膜下スペースに直接投与するステップを含む、方法。
(項目56)
上記哺乳動物が、レーバー先天性黒内障1(LCA−1)と診断された、項目55に記載の方法。
アデノ随伴ウイルス−2(AAV)は、溶菌ウイルスおよびプロウイルスの両方として増やすことができるヒトパルボウイルスである(Cukorら、1984年;Hogganら、1972年)。ウイルスゲノムは、145塩基の末端逆位配列が側面に位置する(Lusbyら、1982年)、4679塩基長の(Srivastavaら、1983年)直線状一本鎖DNA(Roseら、1969年)からなる。溶菌成長のために、AAVは、ヘルパーウイルスとの同時感染を必要とする。アデノウイルス(Atchinsonら、1965年;Hoggan、1965年;Parksら、1967年)または単純ヘルペス(Bullerら、1981年)は、ヘルパー機能を提供することができる。ヘルパーなしで、AAV特異的な複製または遺伝子発現の証拠はない(RoseおよびKoczot、1972年;Carterら、1983年)。ヘルパーが利用可能でない場合、AAVは、統合プロウイルスとして存続することができる(Hoggan、1965年;Bernsら、1975年;Handaら、1977年;Cheungら、1980年;Bernsら、1982年)。
rAAVベクターを産生するための従来のプロトコールは、一般に、3つの構成要素の系に基づいてきた。この系の1つの構成要素は、rAAVとしてパッケージされることとなる組換えDNAをコードするプロウイルスプラスミドである。この組換えDNAは、ベクターの複製およびパッケージングを指示する最小のシス作用性AAV−2配列である145塩基対(bp)AAV−2末端逆位配列(ITR)の間に位置する。系の第2の構成要素は、AAV−2遺伝子、rep、およびcapをコードするプラスミドである。AAV−2 rep遺伝子は、rAAVゲノムを複製し、複製中間体を分離し、次いで、一本鎖rAAVゲノムをパッケージするようにトランスで作用する4つのRepタンパク質(Rep 78、68、52、および40)をコードする。AAV−2 cap遺伝子は、ウイルスカプシドを含む3つの構造タンパク質(VP1、VP2、およびVP3)をコードする。AAV−2が単独でうまく複製しないので、rAAVパッケージング系の第3の構成要素は、他のDNAウイルスからのヘルパー機能のセットとなる。これらのヘルパー機能は、rAAV複製およびパッケージングが効率的に起こることができる細胞環境を築く。アデノウイルス(Ad)によって提供されるヘルパー機能は、rAAVを産生するためにほとんど独占的に使用されてきており、遺伝子E1a、E1b、E2a、E4orf6、およびVA RNAによってコードされる。複製およびパッケージングがトランスフェクションによって起こる細胞の中に系の最初の2つの構成要素が一般に導入されるが、adヘルパー機能は、野生型Adウイルスによる重感染によって導入される。
ある実施形態では、本発明は、単独でまたは療法の1つまたは複数の他の様式と組み合わせて細胞または動物に投与するための、薬学的に許容される溶液における、本明細書において開示される1つまたは複数のrAAV−グアニル酸シクラーゼ組成物の処方物に関する。
配列比較および相同性決定のために、典型的に、一方の配列は、試験配列を比較する参照配列として果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列がコンピューターに入力され、必要ならば、部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比べた、試験配列(複数可)についての配列同一性パーセントを計算するために使用することができる。
本発明はまた、本明細書において記載されるように、特定のrAAV−グアニル酸シクラーゼ処方物の処方においてならびにLCA1のような網膜ジストロフィーなどのような、1つまたは複数のグアニル酸シクラーゼ欠損状態のための、哺乳動物および特にヒトへの投与のための処置剤の調製物において用いられてもよい1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、キャリア、希釈剤、アジュバント、および/または他の構成要素と一緒に1つまたは複数の組成物を包含する。特に、そのようなキットは、哺乳動物におけるそのような障害の処置においてウイルスベクターを使用するための説明書と組み合わせて1つまたは複数のrAAVベクターグアニル酸シクラーゼ組成物を含んでいてもよく、典型的に好都合な商業包装のために用意される容器をさらに含んでいてもよい。
発明者らは、本発明の処置用グアニル酸シクラーゼポリペプチドをコードする連続した核酸配列を含むポリヌクレオチドが、形質転換宿主細胞における1つまたは複数の細胞の欠陥を処置するために利用されてもよいことを企図する。そのような細胞は、好ましくは、ヒトもしくは非ヒト霊長類からまたは限定を伴うことなく、マウス、イヌ、ウシ、ウマ、エピン、ネコ、ヒツジ、ヤギ、オオカミ、ウサギ、ブタ、およびその他同種のものを含む1つもしくは複数の哺乳動物種から得られるものなどのような哺乳動物細胞を含む動物細胞である。そのような障害に罹患していることが疑われているまたはそのような状態を発症する危険性があるヒト対象におけるLCA1などのような網膜ジストロフィーのまたは関連する網膜または眼疾患、障害、状態、もしくは機能不全の1つまたは複数の症状の処置および/または改善のためのそのような構築物の使用は、特に、本発明者らによって企図される。
グアニル酸シクラーゼ(GC)(EC 4.6.1.2)は、3’,5’環状グアノシン一リン酸(cGMP)およびピロリン酸へのグアノシン三リン酸(GTP)の変換を触媒するリアーゼである。その代わりに、文献において「グアニルシクラーゼ」または「グアニリルシクラーゼ」と呼ばれるように、GCの膜結合(1型)および可溶性(2型)形態の両方が存在する。
レーバー先天黒内障(LCA)は、すべての遺伝性網膜ジストロフィーのうちで最も初期の最も多い重症の形態に相当する疾患の常染色体劣性群である。この遺伝的にかつ臨床的に異質性の疾患の発病において関係し、そのため、LCA1座に割り当てられた最初の遺伝子は、網膜特異的グアニル酸シクラーゼ−1(Gucy2d)であった(Perraultら、1996年)。Gucy2dは、光受容体外節膜において主に発現され、これらの細胞内のcGMPおよびCa2+のレベルの調節において役割を果たす網膜特異的タンパク質グアニル酸シクラーゼ(retGC1)をコードする。光刺激に続いて、光受容体外節内のcGMPのレベルは、cGMPホスホジエステラーゼ(PDE)による加水分解によって急速に下がる。cGMPのこの低下は、cGMP感受性チャネルの閉鎖、Ca2+流入の低下、および細胞の過分極に至る。細胞内Ca2+におけるこの減少は、GCの活性を調節するカルシウム結合タンパク質のファミリーであるグアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質(GCAP)とのその相互作用を介して、光に刺激された光受容体の暗状態への回復を刺激する。暗順応光受容体では、Ca2+結合GCAPは、GCの活性を阻害する。しかしながら、光刺激に際して、Ca2+なしのGCAPは、cGMPレベルの増加、cGMP感受性チャネルの再開、および脱分極状態への細胞の復帰をもたらすGCの活性を刺激する。LCA1における症例のように、GCが細胞内cGMPを補充し、cGMP感受性カチオンチャネルを再び開く能力を低下させるまたは消滅させる変異は、杆体および錐体光受容体において慢性の光暴露と生化学的に等価な状態を引き起こすと考えられる。
retGC1遺伝子中にヌル変異を保持する2つの動物モデル、天然に存在するGUCY1*Bニワトリおよびグアニル酸シクラーゼ−1(GC1)ノックアウトマウスは、遺伝子置換療法を評価するために使用されてきた(たとえばWilliamsら、2006年;Haireら、2006年を参照されたい)。GUCY1*Bニワトリは、孵化時に盲目であり、暗所視(杆体媒介性)および明所視(錐体媒介性)ERGの消滅ならびに網膜変性を示す(たとえばUlshaferら、1984年;Huangら、1998年;Semple−Rowlandら、1998年を参照されたい)。GUCY1*B網膜へのGucy2dのレンチウイルス媒介性の移行は、行動的な試験およびERGによって証明されるようにこれらの動物の視力を修復した(たとえばWilliamsら、2006年を参照されたい)。短期処置の成功にもかかわらず、この療法は、長期における網膜構造または機能の保持に至らなかった。卵内に送達された、統合ウイルスベクターにより非哺乳動物種において得られたこの結果の一時的な性質は、臨床適用の発展に向けたより適切でトランスレーショナルな研究の必要性を示唆した。
その他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものに類似するまたはそれと等価であるいかなる方法および組成物も、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および組成物が、本明細書において記載される。本発明の目的のために、以下の用語が下記に定義される。
vivoにおいて発現されるペプチドおよびポリペプチドの両方を含む。用語「ポリペプチド」は、好ましくは、長さが約2〜約20のアミノ酸残基の短いペプチド、長さが約10〜約100のアミノ酸残基のオリゴペプチド、および長さが約100〜約5,000以上のアミノ酸残基のポリペプチドのものを含む、すべてのアミノ酸鎖長を指すように意図される。用語「配列」は、アミノ酸について言及する場合、所与のアミノ酸鎖、たとえばポリペプチドまたはタンパク質内の、直線状のN末端〜C末端の順のアミノ酸のすべてまたは一部に関し、「部分配列」は、配列内のアミノ酸の任意の連続するストレッチ、たとえば、所与のタンパク質またはポリペプチド配列内の少なくとも3つの連続するアミノ酸を意味する。ヌクレオチドおよびポリヌクレオチド鎖に関して、「配列」および「部分配列」は、5’〜3’の順のヌクレオチドに関する同様の意味を有する。
situ環境においてそれらのポリヌクレオチドと通常関連する物質を含有しない。
AAV媒介性の遺伝子療法はLCA1のマウスモデルの視覚機能および行動を修復する
本実施例において、発明者らは、出生後のGC1KOマウスの錐体細胞へのretGC1種特異的なバージョン(つまりマウス)の送達が、これらの細胞の機能を修復することができるかどうかを評価した。血清型5AAVベクターは、出生後14日目(P14)のGC1KOマウスの光受容体にmGC1を送達するために使用した。網膜電位図(ERG)および行動的な試験は、視覚機能を評価するために使用し、免疫細胞化学は、処置および無処置眼における、処置用導入遺伝子発現、錐体アレスチン局在化、および錐体光受容体密度を検査するために使用した。
実験動物:
GC1+/−ヘテロ接合体胚は、Jackson Laboratory(Bar Harbor、ME、USA)で凍結保存株から取り出した。ヘテロ接合体は、GC1 KO(−/−)および同質遺伝+/+対照子を産生するために発明者らの施設で交配した。マウスはすべて、12時間/12時間の光/暗サイクル下で発明者らの機関の集中施設において飼育し、維持した。飼料および水は自由に動物が利用し得る形態とした。動物研究はすべて、地域のInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認されており、ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research and NIH regulationsに従って行った。
血清型5アデノ随伴ウイルス(AAV5)ベクターは、それらが、堅調な形質導入効率および他のAAV血清型よりも網膜光受容体における発現のより急速な開始を示すことが示されたので、マウスGC1(mGC1)を送達するために使用した(Yangら、2002年)。細胞特異的およびユビキタスプロモーターの両方は、mGC1の発現を駆動するために選択した。ロドプシンキナーゼプロモーターとしても公知である細胞特異的Gタンパク質共役受容体キナーゼ1(GRK1)は、AAVと共に使用された場合に杆体および錐体光受容体において堅調な導入遺伝子発現を特異的に標的にするその能力のために選んだ(Khaniら、2007年)。網膜における完全長CBAに類似する発現パターンを示すユビキタスsmCBAプロモーターは、神経網膜を効率的に標的にするその能力のために選んだ(Haireら、2006年)。
以下のフォワードプライマー:
1μLのAAV5−GRK1−mGC1(4.12×1010送達ベクターゲノム)またはAAV5−smCBA−mGC1(4.69×109送達ベクターゲノム)を、それぞれのGC1KOマウスの右眼に出生後14日目(P14)に網膜下に送達し、左眼は反対側の対照として残した。網膜下注射は、先に記載されるように実行した(Timmersら、2001年;Pangら、2006年)。さらに、分析は、比較可能で好結果の注射(>60%の網膜剥離および最小限の合併症)を受けた動物に対してのみ実行した。網膜剥離のエリアがウイルス形質導入のエリアに相当することは十分に立証される(Cideciyanら、2008年;Timmersら、2001年)。
処置GC1KO(n=14)および同質遺伝+/+対照(n=2)の網膜電位図(ERG)は、わずかな改良を伴う先に記載される方法に従って(Haireら、2006年)、PCベースの制御および記録ユニット(Toennies Multiliner Vision;Jaeger/Toennies、Hoechberg、Germany)を使用して記録した。最初のERG測定値は、注射後4週間目に、その後、続く2週間ごとに、注射後3か月まで(研究において評価した最も後の時点)記録した。年齢が一致する+/+同質遺伝対照は、すべての時点で処置動物と一緒に記録した。それぞれ、マウスは、一晩(12時間以上)、暗順応させ、1:1:5の比の100mg/kgケタミン、20mg/kgキシラジン、および生理食塩水の混合物を用いて麻酔をかけた。瞳孔は、1%トロピカミドおよび2.5%塩酸フェニレフリンを用いて散大させた。加熱した循環ウォーターバスは、38℃に体温を維持するために使用した。ヒドロキシプロピルメチルセルロース2.5%は、角膜の脱水を予防するためにそれぞれの眼に適用した。全視野ERGは、特注のゴールドワイヤループ角膜電極を使用して記録した。基準電極および接地電極(ground electrode)は、それぞれ、眼の間および尾中に、皮下に配置した。暗所視杆体記録は、7つの増加性の強度(0.01mcd/m2〜5cd/m2)の一連の白色の閃光を用いて誘発した。低強度刺激についての刺激間隔は、1.1秒とした。3つの最も高度な強度(100mcd/m2、1cd/m2、および5cd/m2)では、刺激間隔は、それぞれ、2.5、5.0、および20.0秒とした。10の応答を記録し、それぞれの強度で平均した。マウスは、次いで、2分間、100cd/m2の白色のバックグラウンドに光順応させた。明所視錐体反応は、一連の5つの増加性の光強度(100mcd/m2〜12cd/m2)を用いて誘発した。50の応答を記録し、それぞれの強度で平均した。刺激はすべて、100cd/m2のバックグラウンドの存在下において行った。b波振幅は、それぞれの波形のポジティブピークに対するa波トラフの間の差異として定義した。
処置および無処置GC1KOマウス眼の明所視視覚およびコントラスト感度は、先に記載されるように二者択一強制選択パラダイムを使用して測定した(たとえばUminoら、2008年;Alexanderら、2007年を参照されたい)。同じ動物からの個々の眼の感度を試験するために、発明者らは、マウス視力が最小限の両眼の重複を有し、左眼が時計回りにより敏感であり、右が反時計回りにより敏感であるという事実を利用した(Douglasら、2005年)。したがって、発明者らの「ランダム化した別々の」視運動のプロトコールでは、それぞれの眼の視力およびコントラスト感度の閾値は、時計回りおよび反時計回りの方向の両方における正確な応答について段階的な機能を介して別々にかつ同時に決定した。時計回りの方向に回転するパターンの正確な検出は、主として、左眼から生じる視覚的なシグナルによって行い、反時計回りの方向における正確な応答は、右眼から生じる視覚的なシグナルから導き出した。視力は、閾値応答を得る最も高度な空間周波数(100%コントラスト)として定義し、コントラスト感度は、閾値応答を得る最低パーセントのコントラストによって割った100として定義した。明所視力については、最初の刺激は、固定100%コントラストと共に0.200サイクル/度の正弦波パターンとした。明所視コントラスト感度測定については、最初のパターンは、0.128サイクル/度の固定空間周波数と共に100%コントラストで行った。明所視視力は、70cd/m2の平均輝度で測定した。視覚およびコントラスト感度は、1週間の期間、それぞれのマウスの両眼について4〜6回測定した。年齢が一致する同質遺伝+/+対照動物(M1、M2)およびナイーブGC1KOマウス(M3、M4)は、図3におけるsmCBA−mGC1処置(M5、M6、M7)およびhGRK1−mGC1処置マウス(M8、M9)と共に行った。すべてのマウス(M1〜M9)の12cd/m2の刺激から生成される錐体媒介性のERG振幅は、行動結果と一緒に行った。対応のないt検定は、結果の有意性を決定するために視力およびコントラスト値パーセントに対して実行した。
注射後3か月目に、P14処置GC1KOマウスおよび年齢が一致する同質遺伝+/+対照を、2時間、暗順応させた。暗順応直後に、マウスは、暗赤色光(>650nm)下で安楽死させた。注射および非注射眼の縁郭を、12:00位置で熱い針を用いてマークし、方向づけを容易にした。眼球除去は、暗赤色光下で実行し、眼は、4%パラホルムアルデヒド中に直ちに配置した。凍結切片法(cryosectioning)に使用されることになっていた眼は、先に記載される方法に従って調製した(Haireら、2006年)。手短かに言えば、角膜は、それぞれの眼から除去し、残りの眼杯の内部のレンズを残した。小さな「V」字形の切り込みを、方向づけを維持するために焼いた縁郭に隣接する強膜に行った。一晩の固定後、レンズおよび硝子体を除去した。残りの網膜/RPE含有眼杯は、4℃で少なくとも1時間、PBS中30%スクロース中に配置した。次いで、眼杯は、クライオスタット化合物(Tissue Tek OCT 4583;Sakura Finetek,Inc.、Torrance、CA、USA)中に配置し、ドライアイス/エタノールのバスにおいてスナップ凍結させた。眼は、クライオスタット(Microtome HM550;Walldorf、Germany)を用いて10μmで連続的に薄片を作った。ホールマウント分析の使用されることになっていた眼は、先に記載される方法に従って調製した(Pangら、2010年)。方向づけは、先に言及されるように達成した。一晩の固定後に、網膜を動かさずに、角膜、レンズ、硝子体、および網膜色素上皮をそれぞれの眼から除去した。切り込みは、方向づけを維持するために、もとの縁郭焼け跡に隣接する網膜の上部(背側)の部分に行った。
網膜凍結切片およびホールマウントは、1×PBS中で3×洗浄した。これらの洗浄の後に、試料は、室温で、暗中で、1時間、0.5% Triton X−100(登録商標)中でインキュベートした。次に、試料は、室温で、1時間、PBS中1%ウシ血清アルブミン(BSA)の溶液中でブロックした。網膜切片は、0.3%Triton X−100(登録商標)/1%BSA中で希釈したウサギポリクローナルGC1抗体(1:200、sc−50512、Santa Cruz Biotechnology,Inc.、Santa Cruz、CA、USA)およびウサギポリクローナル錐体アレスチン抗体(「Lumij」1:1000;Dr.Cheryl Craft、University of Southern California、Los Angeles、CA、USAによって提供)と共に37℃で一晩、インキュベートした。網膜ホールマウントは、0.3%Triton X−100(登録商標)/1%BSA中で1:1000に希釈した同じ錐体アレスチン抗体と共に室温で一晩、インキュベートした。一次インキュベーションの後に、網膜切片およびホールマウントは、1×PBSを用いて3×洗浄した。
TCS SP2 AOBS Spectral Confocal Microscopeを用いて分析した。画像はすべて、20×または63×の倍率で同一の露光設定を用いて撮った。DAPI、GC1、および錐体アレスチン染色のために使用した励起波長は、それぞれ、405nm、488nm、および594nmとした。放射スペクトルは、それぞれ、440〜470nm、500〜535nm、および605〜660nmとした。網膜ホールマウントは、QImaging Retiga 4000R CameraおよびQImaging QCapture Proソフトウェア(QImaging,Inc.、Surrey、BC、Canada)を装備した広視野蛍光顕微鏡(Axioplan 2)(Zeiss、Thornwood、NY、USA)を用いて分析した。それぞれのホールマウントの四半部は、同一の露光設定下で5×で画像処理し、次いで、Photoshop(登録商標)(バージョン7.0)(Adobe、San Jose、CA、USA)において相互にマージした。
錐体光受容体密度は、ImageJ(登録商標)ソフトウェア(National Institutes of Health、Bethesda、MD、USA)を使用して、中央および下位の網膜における、錐体アレスチン抗体に対して向けられた二次蛍光団により標識された細胞をカウントすることによって網膜ホールマウントにおいて分析した。これらの値は、図6に示す5×TIFFファイルにおいてズームすることによって得た。5つの正方形(500μm2)は、処置および無処置GC1KO眼の中央および下位の網膜において同一のエリアにわたり配置した。中央の網膜については、正方形は、すべての眼において視神経乳頭のまわりに等しい偏心距離で配置した(125μm)。錐体光受容体を各それぞれの網膜エリアにおいてカウントし、値を平均し、標準偏差を計算した。標準的なt検定は、所望の試料の間のP値を計算するために使用した。有意差は、P値<0.05として定義した。
光受容体機能(ERG)は、AAV処置GC1KOマウスにおいて修復された:
GC1KOマウスにおける錐体応答が、1月齢までわずかに検出可能であることが以前に報告された。本明細書で、発明者らは、光受容体特異的(hGRK1)またはユビキタス(smCBA)プロモーターの制御下にマウスGC1遺伝子を保持するAAVベクターを用いるこのマウスのP14処置が、ERGによって測定されるように、錐体光受容体機能の実質的な回復に至ったことを示した。代表的な錐体結果(図1)(ならびにhGRK1−mGC1処置、smCBA−mGC1処置、GC1KO、および同質遺伝+/+対照からの平均明所視b波振幅(図2Aおよび図2B))は、処置眼における錐体機能が注射後4週間で正常のおよそ45%まで修復されたことを示した。以前の報告と同様に、反対側の無処置眼における錐体応答はこの時点までに除去された。注射後4週間で、smCBA−mGC1処置眼における平均錐体媒介性b波振幅(65.1μV)は、無処置眼(3.9μV)よりも有意に高度であった(P=0.006)。hGRK1−mGC1処置眼における平均錐体媒介性b波振幅(59.1μV)は、無処置眼(3.2μV)よりも有意に高度であった(P<0.001)。光受容体特異的hGRK1−mGC1ベクターの送達後4週間で達成された回復のレベルは、ユビキタスプロモーター含有smCBA−mGC1ベクターを用いて達成されたものと有意に異なっていなかった(P=0.604)。注射後3か月で、smCBA−mGC1処置眼における平均錐体媒介性b波振幅(53.3μV)は、無処置眼(2.8μV)よりも有意に高度であった(P<0.001)。hGRK1−mGC1処置眼における平均錐体媒介性b波振幅(45.3μV)は、無処置眼(3.4μV)よりも有意に高度であった(P<0.001)。光受容体特異的GRK1−mGC1ベクターの送達後3か月で達成された回復のレベルは、ユビキタスプロモーター含有smCBA−mGC1ベクターを用いて達成されたものと有意に異なっていなかった(P=0.331)。両方のプロモーターは、短期で、GC1KOマウスの処置眼における錐体に対して同様のレベルの機能的な回復を与えた。重要なことには、錐体光受容体機能の回復は、3か月(本研究において評価した最も後の時点(図1、図2A、および図2Bを参照されたい))間、安定したままであった。処置後4週間〜3か月のsmCBA−mGC1処置またはhGRK1−mGC1処置眼の明所視b波振幅において有意差はなかった(それぞれP=0.174および0.125)。
視運動分析は、smCBA−mGC1(M5、M6、M7)またはhGRK1−mGC1(M8、M9)を用いて処置したGC1KOマウスの眼が、すべての明所視錐体媒介性条件下で無処置眼よりも有意によく応答することを明らかにした。無処置GC1KO眼は、機能が不十分であり、1度当たり0.163±0.040サイクルの視覚であった(図3Bおよび図3C、バー、平均±s.d.、n=9の眼)。同質遺伝GC1+/+対照眼(M1、M2)は、有意によりよく応答し、1度当たり0.418±0.046サイクルの平均視力を示した(n=4の眼)。AAV−mGC1処置眼(M5〜M9)は、1度当たり0.392±0.077サイクルの平均視力を有し(n=5の眼)、対照+/+眼と本質的に同一であり、かつ無処置GC1KO眼よりも有意によい(P<0.0001)レベルである。明所視コントラスト感度(図3Bおよび図3C)は、明所視力結果に類似し、AAV−mGC1処置眼(11.9±7.37のコントラスト感度、n=5の眼)は、+/+マウス(11.94±3.03、n=4の眼)とほぼ同一のコントラスト閾値を示した。さらに、AAV−mGC1を用いてP14に処置したGC1KO眼は、無処置眼よりも有意によく機能し、1.27±0.31の平均コントラスト感度を示した(n=9、P<0.0001)。すべての明所視試験において、無処置GC1KO眼は、機能が非常に不十分であり、本質的に、錐体媒介性の機能がないに等しかった。これらの測定値の統計比較を表1に示す。行動分析において使用したすべてのGC1+/+(M1、M2)、GC1KO(M3、M4)、smCBA−mGC1処置(M5、M5、M7)、およびhGRK1−mGC1処置(M8、M9)マウスの錐体媒介性のERG結果は、視覚機能(視運動行動)を網膜機能(電気生理学)に関連づけるために、図3Aに示す。
視運動行動によって測定される、WT、AAV−mGC1処置、および無処置GC1KO眼の明所視視覚機能の統計比較
GC1欠損は、LCA1患者において杆体および錐体光受容体の両方に影響を与える。そのため、光受容体特異的ヒトRKプロモーターおよびユビキタスsmCBAプロモーターを、両方の細胞型を標的にする手段としてこの研究のために選んだ。ヒトRKプロモーターはその小さなサイズおよび光受容体細胞において特異的に導入遺伝子発現を効率的に駆動する能力のために選んだ。AAV−hGRK1−mGC1を用いる処置後3か月のGC1KO網膜の免疫染色は、このプロモーターが光受容体外節において堅調なGC1発現を駆動することを明らかにした。この処置用ベクターを注射した眼からの網膜断面の代表的な画像(図4A)は、OS層において強いGC1染色を示すのに対して、同じマウスからの反対側の無処置眼は、GC1発現を欠く(図4B)。smCBAプロモーターもまた、光受容体細胞においてGC1発現を効率的に駆動した。光受容体OSは、反対側の無処置眼(図4D)に比べて、処置眼(図4C)において堅調なsmCBA媒介性のGC1発現を示した。hGRK1およびsmCBA媒介性のGC1発現のレベルは、同質遺伝+/+対照眼において見られたものに近かった(図4E)。hGRK1−mGC1処置眼におけるGC1発現は、OSに限られた。smCBA−mGC1処置眼では、GC1発現は、外顆粒層の光受容体細胞体において時々見出された(たとえば、図4Fの矢印を参照されたい)。しかしながら、特に、どちらのプロモーター構築物も、光受容体細胞の外側で処置用GC1の発現を駆動しなかった。オフターゲットの発現のこの欠乏は、将来の臨床の適用の発展に適切である。
AAV−mGC1処置は、処置GC1KO網膜において錐体光受容体の、光誘発性の錐体アレスチン移動を修復した。錐体アレスチンに対して生成される抗体を用いて免疫染色した、代表的な処置、無処置、および+/+網膜横断切片は、錐体アレスチンが、+/+、smCBA−mGC1処置、およびhGRK1−mGC1処置錐体光受容体の外節、内節、軸索、およびシナプス末端に局在化したことを示した(それぞれ図5A、図5C、および図5D)。これに反して、錐体アレスチンは、無処置GC1KO網膜において錐体の外節にほとんど局在化し続けた(図5B)。この結果は、GC1KOマウス網膜における錐体が慢性的に過分極化しているという考えと一致していた。暗順応処置網膜における錐体アレスチン局在化の回復が観察されただけでなく、タンパク質の明らかなアップレギュレーションが、無処置対照と比べて処置眼において見られた。有意に、錐体細胞密度もまた、無処置対照と比べて処置眼においてより高いように思われた(たとえば図5A、図5B、および図5Cを参照されたい)。
錐体アレスチンに対して向けられる抗体を用いて染色した、処置用ベクターを用いる注射後3か月の、smCBA−mGC1およびhGRK−mGC1処置ならびに非注射の反対側の網膜ホールマウントの分析は、処置用ベクターを用いる処置の結果として、錐体光受容体が保持されていることを明らかにした(図6)。処置および無処置網膜ホールマウントの両方の下位および中央の網膜における錐体光受容体のカウントは、処置対無処置眼の錐体細胞密度において統計的有意差があることを明らかにした。この結果は、堅調な電気生理学的および行動的な回復がはっきりと明白であったという観察と一致していた。各々の処置用構築物を用いるGC1KOマウスのP14処置は、少なくとも3か月間、錐体光受容体構造を保持することができた。
GC1/GC2ダブルノックアウトを含有する動物モデル
GC1KOマウスにおいて錐体光受容体のみが影響を与えられている(杆体は部分的な機能を失っているのみであり、それらは変性していない)が、LCA1患者は、杆体機能損失および杆体変性を示すことに注目することは重要である。この差異についての理由は、杆体光受容体において発現されるGC1の密接な類縁体であるGC2に対する依存性における種特異的な差異であると推測される。推定上、GC2が活性を再構成することができるので、マウス杆体は、GC1の非存在下において機能することができるが、ヒトでは、これは当てはまらない。GC1は、杆体機能、よって杆体変性に必要とされる。GC1/GC2ダブルノックアウトマウスモデルを生成し、杆体機能損失を有することが示された(GC1 K/Oにおいて見られるような錐体機能損失に加えて)(Baehrら、2007年)。GC2がGC1の非存在下において杆体機能を提供するものであることがこのモデルを用いる生化学的な研究を通して証明された。それでもやはり、ヒトの状態をより確実に模倣するのはGC1/GC2ダブルノックアウトマウスである(錐体および杆体の両方が影響を与えられている)(Karanら、2010年)。GC1/GC2ダブルノックアウトマウスにおいてrAAV−smCBA−mGC1およびrAAV−hGRK1−mGC1ベクターの両方を試験するために、rAAVベクターを、前述のGC1ノックアウト研究と正確に同じ様式および時間(出生後14日)で送達した。視力の回復の分析もまた、生理学的にまた行動的に、GC1ノックアウト研究について上記に記載されるものと同じ様式で実行する。杆体機能の測定可能な回復がGC1ベクター構築物を用いて処置したGC1/GC2ダブルノックアウトマウスにおいて期待されるので、暗所視(つまり杆体)応答が特に重要視される。
LCA1の「ヒト化」マウス動物モデル
本実施例は、LCA1の「ヒト化」マウス動物モデルの生成を記載する。一実施形態では、マウスモデルは、GC1/GC2/GCAP1ノックアウトを含有する。GCAP1は、GC1を活性化するタンパク質である。ヒトにおける使用のために設計した臨床グレードrAAVベクターから発現されるヒトGC1を機能について評価することができるin vivo系を生成するために、GC1/GC2/GCAP1トリプルノックアウトhGCAP1トランスジェニックマウスを利用した。このマウスでは、視覚機能は、hGCAP1のみと相互作用するrAAV媒介性のhGC1に頼る(つまり、内因性マウスGCAP1は存在しない)。この研究から、ヒトGCAP1タンパク質がマウスモデルにおいてヒトGC1活性を刺激するために必要とされるかどうかおよび2つのヒトポリペプチドが疾患の非ヒト(つまりマウス)モデルにおいて再構成され、発現される場合に、錐体および杆体の機能を修復することができるかどうかを決定することが可能である。GC1/GC2/GCAP1トリプルノックアウトhGCAP1トランスジェニックマウスを生成するために、GC1/GC2ダブルノックアウトマウス(Baehrら、2007年)をGCAP1ノックアウトマウス(Mendezら、2001年)と交雑した。次いで、GC1/GC2/GCAP1トリプルノックアウトhGCAP1トランスジェニックマウスを生成するために、ヒトGCAP1を、動物モデルにおいて遺伝子導入発現させる。rAAVベクターhGC1がこれらの動物に提供される研究は、GC1ノックアウト研究において使用される方法と実質的に同一の様式で行う。視力の回復の分析は、次いで、生理学的にまた行動的に、GC1ノックアウト研究において実行した同じ様式で実行する。
本発明の実施において有用な例示的なベクター構築物
2つの例証となるベクターのマップを図11に示す。一方は、非特異的プロモーターsmCBAを含有し、他方は、杆体/錐体に限られるプロモーターGRK1を有する。両方とも、血清型5 AAVの中にパッケージされている。現在まで試験したベクター用量はすべて、マウス網膜において安全である。次いで、GC1−/−マウスのコホートは、出生後の14日目(P14)に網膜下に注射し、次いで、ERGによっておよび明所視視動性(錐体媒介性)行動によって周期的に分析した。GC1−/−マウスが杆体媒介性のERGを維持するので、機能的な奪回のモニタリングは、主として、錐体機能の回復に集中した。smCBAベクターについては、ERGは、処置後4週間およびその後、処置後12〜13週間まで2週間ごとに評価した。9匹のマウスにおいて処置した9つの眼はすべて、処置に応答した。下記に示す結果は、対照無処置眼における本質的に記録可能でないものからの、パートナーのベクター処置眼における正常のおよそ50%までの明所視ERG振幅の有意な回復を実証する。
wtGC1の特異的な錐体ターゲティングは奪回を改善する
上記に示すデータは、杆体/錐体に限られるGRK1プロモーターにより錐体機能および錐体媒介性の行動を奪回することができることをはっきりと実証する。ヒトLCA1が杆体および錐体欠乏の両方を示すので(主として錐体欠乏を示すGC1−/−マウスと異なり)、発現は、純粋な錐体特異性を獲得するためにさらに限られる必要はない。しかしながら、研究するのに重要であるマウスモデルにおける1つの最終的な錐体表現型がある:暗順応条件では、錐体アレスチンは、野生型網膜でのように、錐体外節から内節、軸索、およびシナプス末端に通常移動しない。そのため、研究は、この細胞の生物学的表現型もまたベクター処置GC1−/−眼において修正されたかどうかを評価するために実行した。示す結果では、GC1−/−マウスはGRK1ベクターを用いて一方の眼を処置し、次いで、注射後7週間目にマウスを暗順応させた。次いで、処置(最下位のパネル)および対照(上位のパネル)網膜を免疫組織化学的検査によって錐体アレスチン局在化について分析した。無処置GC1−/−網膜(上位のパネル)では、錐体アレスチンは、ほとんど錐体外節(OS)およびシナプス層(SL)に残った。対照的に、反対側の処置網膜(最下位のパネル)では、実質的な画分(約50%)が内節およびシナプス末端に移動した。そのため、ベクター処置がまた錐体アレスチンの適切な移動を修復したことが結論付けられた。
rAAVベクター遺伝子構築物を使用するLCA1の長期処置効果
先の実施例は、マウスGC1 cDNA(光受容体特異的ヒトロドプシンキナーゼ[hGRK1]またはユビキタス[smCBA]プロモーターによって駆動される)を含有するrAAVベクターの網膜下注射が、少なくとも3か月間、GC1KOマウスにおいて錐体媒介性の機能および視覚的な行動を修復することができ、錐体光受容体を保持することができたことを実証した。
AAV5−hGRK1−mGC1、AAV5−smCBA−mGC1、または高度に効率的なカプシドチロシン変異体AAV8(Y733F)−hGRK1−mGC1の網膜下注射を、出生後14日(P14)〜P25に、GC1KOまたはGCdkoマウスの一方の眼において実行した。杆体および錐体光受容体機能を網膜電計で(electroretinographically)アッセイした。処置用GC1の発現の局在化および錐体光受容体保持の程度は、免疫組織化学的検査によって決定した。体内分布研究は、処置動物の視神経および脳におけるベクターゲノムの存在を評価するために使用した。
錐体光受容体機能は、すべてのベクターを用いて処置したGC1KOマウスにおいて修復され、AAV8(733)が最も効率的であった。応答は、処置後少なくとも10か月間、安定していた。処置用GC1は、光受容体外節において見出された。注射後10か月の間は、AAV5およびAAV8(733)ベクターゲノムは、GC1KOマウスの処置眼の視神経においてのみ検出された。AAV8(733)ベクターmGC1は、処置GCdkoマウスにおいて杆体および錐体の両方の機能を修復した。
長期処置効果は、本明細書において開示されるrAAVベクター構築物を使用すると、GC1欠損の哺乳動物モデルであるGC1KOマウスにおいて達成可能である。重要なことには、療法はまた、LCA1杆体/錐体表現型を模倣するGCdkoマウスにおいても達成可能であった。これらの結果は、網膜ジストロフィー、特にLCA1の処置のためのrAAVベースの遺伝子療法ベクターの使用のための証拠を提供する。
GC1KOマウスにおける遺伝子療法による錐体光受容体の長期の保持および錐体機能の回復
先の実施例では、光受容体特異的(hGRK1)またはユビキタス(smCBA)プロモーターによって駆動されるマウスGC1 cDNAを含有する網膜下AAV5ベクターが、3か月間、GC1KOマウスにおいて、錐体媒介性の機能および視覚的な行動を修復することができ、錐体光受容体を保持することができることが示された。本実施例では、長期処置効果を同じマウスモデルを使用して評価する。AAV5−hGRK1−mGC1、AAV5−smCBA−mGC1、または高度に効率的なカプシドチロシン変異体AAV8(Y733F)−hGRK1−mGC1を、出生後14日(P14)〜および出生後の日(P25)に、GC1KOマウスの網膜下に送達した。網膜機能は、網膜電位図(ERG)によってアッセイした。AAV媒介性のGC1発現の局在化および錐体存続は、免疫組織化学的検査を用いてアッセイした。網膜を越えるベクターゲノムの広がりは、視神経および脳組織のPCRによって定量化した。錐体機能は、試験したすべてのベクターにより修復され、AAV8(Y733F)が最も効率的であった。GC1のAAV媒介性の発現は、もっぱら光受容体において見出された。注射後10か月の間は、AAVゲノムは、処置眼の視神経においてのみ検出された。これらの結果は、長期処置効果が、GC1欠損の哺乳動物モデルにおいて達成可能であることを初めて実証する。
cDNAを含有する血清型5アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの網膜下注射が、3か月間、GC1KOマウスにおいて、錐体媒介性の機能および視覚的な行動を修復することができ、錐体光受容体を保持することができることが示された。本研究では、AAV媒介性の遺伝子置換療法は、長期にわたりGC1KOマウスに療法を提供するその能力について評価した。AAV5−hGRK1−mGC1およびAAV5−smCBA−mGC1および高度に効率的なカプシドチロシン変異体ベクターAAV8(Y733F)−hGRK1−mGC1を、出生後14日(P14)〜出生後25日(P25)に、GC1KOマウスの網膜下に送達した。これらの発見は、長期処置効果が、GC1欠損の哺乳動物モデルにおいて達成可能であることを初めて実証する。ベクターゲノム体内分布もまた、AAV5およびAAV8(733)ベースのベクターについて評価した。これらの発見は、LCA1(およびおそらく錐体杆体ジストロフィー)のためのAAVベースの遺伝子療法臨床試験の発展と直接的な関係があり、光受容体関連遺伝子における欠陥によって媒介される広範囲の劣性網膜変性のための標準化されたベクター設計を開発するのを支援する。
実験動物:
Jackson Laboratory(Bar Harbor、ME、USA)によって提供されたGC1+/−マウスのヘテロ接合性の交配から誘導したGC1KOおよび類遺伝子+/+対照を、12時間/12時間の光/暗サイクル下で発明者らの施設内の動物ケア施設において飼育し、維持した。飼料および水は自由に動物が利用し得る形態とした。研究はすべて、ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research and NIH regulationsに従って行った。
マウスGC1(mGC1)cDNAを駆動するユビキタス(smCBA)または光受容体特異的ヒトロドプシンキナーゼ(hGRK1)プロモーターを含有する血清型5アデノ随伴ウイルス(AAV5)ベクタープラスミドを、以前に記載される方法(Boyeら、2010年)に従って生成した。AAV2カプシド上の表面暴露チロシン残基の部位特異的変異誘発が報告されている(Zhongら、2008年)。同様の方法を、本明細書で記載されるAAV8(Y733F)カプシド変異体を生成するために使用した。ベクターはすべて、以前に記載される方法に従って、パッケージし、精製し、力価を測定した(Zolotukhinら、2002年;Jacobsonら、2006年)。AAV5−smCBA−mGC1、AAV5−hGRK1−mGC1、およびAAV8(Y733F)−hGRK1−mGC1についての結果として生じる力価は、それぞれ、1ml当たり4.69×1012ベクターゲノム(vg/mL)、4.12×1013vg/mL、および1.08×1013vg/mLであった。
AAV5−smCBA−mGC1(4.69×109ベクターゲノム)、AAV5−hGRK1−mGC1(4.12×1010ベクターゲノム)、またはAAV8(Y733F)−hGRK1−mGC1(1.08×1010ベクターゲノム)のうちの1μLを、出生後の14日(P14)〜出生後の25日(P25)に、GC1KOマウスの一方の眼の網膜下に注射した。反対側の対照眼には、注射しなかった。網膜下注射は、先に記載されるように実行した(Timmersら、2001年)。さらに、分析は、比較可能で好結果の注射(最小限の合併症を有する>60%の網膜剥離)を受けた動物に対してのみ実行した。すべてのコホートのおよそ75%は、「好結果の」注射を受けた。ベクター形質導入のエリアが少なくとも網膜剥離のエリアに相当することは十分に立証される(Timmersら、2001年;Cideciyanら、2008年)。
処置GC1KOおよび年齢が一致する類遺伝子(+/+)対照のERGは、わずかな改良を伴う先に記載される方法に従って(Haireら、2006年;Boyeら、2010年)、PCベースの制御および記録ユニット(Toennies Multiliner Vision;Jaeger/Toennies、Hoechberg、Germany)を使用して記録した。AAV5−smCBA−mGC1処置GC1KOマウス(n=10)、AAV5−hGRK1−mGC1処置GC1KOマウス(n=6)、AAV8(Y733F)処置GC1KOマウス(n=6)、および類遺伝子(+/+)対照(n=8)の記録は、異なる日に始め、そのため、マウスのサブセットはそれぞれ、長さがわずかに異なる時間、モニターした。処置GC1KOマウスのERGは、注射後4週間、その後、注射後1年(AAV5処置マウス)または注射後9か月(AAV8[Y733F]処置マウス)まで毎月記録した。年齢が一致する類遺伝子(+/+)対照マウスは、8か月間、続けた。マウスは、様々な死後の研究(体内分布研究、網膜免疫組織化学分析、網膜組織のリアルタイムRT−PCR)または予期しない疾病/死亡のために、実験を通じて異なる時点で研究から取り出した。ERGデータは、n>3を有する動物のグループにのみ行った。そのため、この研究は、AAV5処置マウスについての注射後9か月およびAAV8(Y733F)処置マウスについての注射後6か月の発見を比較する。処置マウスは、これらの時点を過ぎてもERG応答を示し続けたが、しかしながら、試料サイズは十分に低下し、統計分析はもはや役に立たなかった。この主張を立証するために、AAV5ベクターを用いる処置後1年およびAAV8(Y733F)を用いる処置後9か月の個々のマウスからの代表的な錐体媒介性の結果を示す。暗所視(杆体媒介性)および明所視(錐体媒介性)記録は、以前に記載される記録パラメーター(Boyeら、2010年)を使用して引き出した。b波振幅は、a波トラフおよびそれぞれの波形の続くポジティブピークの間の差異として定義した。無処置GC1KOマウスにおける杆体媒介性のERG応答は、動物によって多様であり(Yangら、1999年)、よって、異なる動物からの暗所視aおよびb波振幅を平均する場合、大きな標準偏差が観察された。杆体ERGデータは、比の形式で示す(個体内の処置対無処置杆体aおよびb波振幅の平均)。そのため、1を超えるいかなる値も、AAV−mGC1処置が杆体応答を改善したことを示す。比は、1cd/m2刺激を用いて生成された振幅を使用して計算した。12cd/m2で生成された処置GC1KOマウスおよび類遺伝子(+/+)対照マウスすべての注射および非注射眼における明所視錐体媒介性b波最大振幅は、それぞれの時点で平均し、標準誤差を生成するために使用した。データはすべて、最終的なグラフ表示のためにSigma Plotにインポートした。標準的なt検定は、データセットの間のP値を計算するために使用した。有意差は、P値<0.05として定義した。
処置GC1KOマウスの組織におけるベクターDNAの広がりは、わずかな改良を伴う以前に記載される方法(Jacobsonら、2006年)に従って、安楽死時に収集した試料において決定した。ベクター処置マウスは、以下の時点で安楽死させた:AAV8(Y733F)−hGRK1−mGC1処置マウス(注射後4か月:n=1;注射後7か月:n=1)、AAV5−smCBA−mGC1(注射後7か月:n=1;注射後10か月:n=5)、AAV5−hGRK1−mGC1(注射後7か月:n=1;注射後10か月:n=1)。注射後7か月または注射後10か月の時点と年齢が一致するGC1KOマウスからの対照組織もまた、実験動物と一緒に評価した。安楽死の後に、異なる新しいピンセットを、およそ0.5cmの近位視神経を保持する処置および無処置眼を摘出するために使用した。次いで、異なる新しい解剖はさみは、眼球から視神経を切り取るために使用し、この後、それらは、液体窒素中でスナップ凍結し、−80℃に移し、ここでそれらはDNA抽出の時間までそのままとした。眼球は、4%パラホルムアルデヒド(PAF)中に浸し、免疫組織化学的検査のために処理した(以下を参照されたい)。
安楽死時に、注射後7か月[AAV8(Y733F)−hGRK1−mGC1]ならびに10か月(AAV5−smCBA−mGC1およびAAV5−hGRK1−mGC1)に実行した体内分布研究と同時に、処置GC1KOマウス、年齢が一致する無処置GC1KOマウス、および年齢が一致する類遺伝子GC1+/+マウスの縁郭に、12時の位置に熱い針を用いてマークし、方向づけを容易にした。無処置GC1KOおよびGC1+/+対照は、AAV8(Y733F)処置マウスと年齢が一致した(安楽死時、8月齢)。凍結切片法のために指定した眼は、以前に記載される方法に従って処理し、免疫染色した(Haireら、2006年)。手短かに言えば、10μm網膜切片は、GC1(ウサギポリクローナル1:200、sc−50512 Santa Cruz Biotechnology、USA)またはマウス錐体アレスチン(ウサギポリクローナル「LUMIj」、1:1000、Dr.Cheryl Craft、University of Southern California、Los Angeles、CA、USAによって提供)に対して向けられる抗体と共にインキュベートした。一次インキュベーションの後に、IgG二次抗体Alexa−488またはAlexa−594は、それぞれ、室温で、1時間、適用した(1×PBS中1:500)。切片は、室温で、5分間、4’,6’−ジアミノ−2−フェニル−インドール(DAPI)を用いて対比染色した。注射後11か月目に、一方の眼にのみAAV5−smCBA−mGC1を用いる処置を受けたあるGC1KOマウスを安楽死させ、処置および無処置眼からの網膜ホールマウントを、以前に記載される方法に従って処理した(Pangら、2010年)。手短かに言えば、ホールマウントは、LUMIj(1:1000)、その後に続けてIgG二次Alexa−594(1×PBS中1:500)を用いて染色し、網膜の上部(背側)の部分を12時に方向づけてスライド上に置いた。網膜切片は、LCS Version 2.61、Build 1537ソフトウェアを装備した共焦点顕微鏡検査法(Leica TCS SP2 AOBS Spectral Confocal Microscope)によって分析した。画像は、20×の倍率で同一の露光設定で撮った。網膜ホールマウントは、QImaging Retiga 4000R CameraおよびQImaging
QCapture Proソフトウェアを装備した広視野蛍光顕微鏡(Zeiss Axioplan 2)を用いて分析した。それぞれのホールマウントの四半部は、同一の露光設定下で10×で画像処理し、次いで、Adobe Photoshopにおいて相互にマージした。
注射後7か月目に、AAV8(Y733F)−hGRK1−mGC1を注射したあるマウスおよび年齢が一致する類遺伝子GC1+/+(対照)マウスを安楽死させ、それらの眼を摘出し、1×PBS中に配置した。網膜は直ちに解剖し、以下のように処理した。個々の網膜は、4℃で、1時間、1%Triton X−100およびcomplete protease inhibitor(Roche)を有するPBS(137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4)において可溶性にし、その後に14000rpmでの遠心分離を続けた。上清のタンパク質濃度は、BCA(Pierce)によって決定し、15μgのそれぞれの試料を、12%ポリアクリルアミドゲル(Bio−Rad)上で分離し、15%メタノールを含有する移行緩衝剤(25mM Tris、192mMグリシン)において1時間、Immobilon−FL膜上に移した。ブロットは、ブロッキング緩衝剤(Li−Cor)を用いて処理し、GC1を認識するマウスモノクローナル抗体(IS4、1:3000、Dr.Kris Palcweski、Case Western University、USAによって提供)ならびにGCAP1(pAb UW14、1:25,000、Dr.Wolfgang Baehr、University of Utahによって提供)およびβ−アクチン(1:5000、Abcam)に対して産生されるウサギポリクローナル抗体を用いて1時間、標識した。二次抗体(CW800にコンジュゲートされたヤギ抗マウスIgおよびIR680とコンジュゲートされたヤギ抗ウサギ)を1時間、適用し、ブロットは、Odyssey Infrared Imaging System(Licor、Lincoln、NE、USA)を用いて画像処理した。
視神経が付属した個々の処置眼は、AAV8(Y733F)−hGRK1−mGC1またはAAV5−smCBA−mGC1および年齢が一致する無処置GC1+/+マウスと共に処置後1年のGC1KOマウスから収集した。網膜は、直ちに眼から切り分け、液体窒素中でスナップ凍結させた。視神経は、眼から分離し、4℃で、一晩、4%パラホルムアルデヒドにおいて固定し、4℃で、2時間、30%スクロース中に浸し、次いで、ドライアイス/エタノールのバスにおいてクライオスタット化合物(Tissue Tek(登録商標)OCT 4583;Sakura Finetek USA,Inc.、Torrance、CA、USA)中で速やかに凍結させた。視神経は、10μmで切片化し、以前に記載される方法に従って染色した(Boyeら、2010年)。網膜は、45秒間、350mLの緩衝剤RLT(RNeasy(登録商標)Protect Mini Kit、Qiagen,Inc.、Valencia、CA、USA)およびBMEにおいてホモジナイズした。試料は、遠心分離し、溶解物は、半分に分離した(一方の半分はゲノム回収および他方の半分はRNA抽出に指定した)(TraintおよびWhitehead、2009年)。ゲノム回収は、上記に記載されるように実行した。RNA抽出は、RNeasy(登録商標)Protect Mini Kit(Qiagen,Inc.)を用いて実行した。RNAは、以下の網膜特異的mRNAを測定するために、逆転写し(iScript(登録商標)cDNA synthesis kit、Biorad Laboratories、Hercules、CA、USA)、リアルタイムPCRにおいて使用した(iQ SYBR(登録商標)Green SupermixおよびiCycler(登録商標)thermal cycler、Biorad Laboratoriesと接続されたMyiQ real−time PCR detection system):グアニル酸シクラーゼ−1(GC1)、グアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質−1(GCAP1)、錐体トランスデューシンα(GNAT2)、杆体cGMP特異的3’,5’環状ホスホジエステラーゼサブユニットアルファ(PDE6α)、およびハウスキーピング遺伝子、グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)。
長期光受容体特異的GC1発現:
GC1に対して向けられる抗体を用いる免疫染色は、AAVベクター処置用タンパク質発現が、かなりの割合の動物の生涯の間、処置GC1KOマウスの光受容体においてもっぱら持続することを明らかにした;AAV8(Y733F)−hGRK1−mGC1は少なくとも7か月、AAV5−smCBA−mGC1は少なくとも10か月、およびAAV5−hGRK1−mGC1は少なくとも10か月(図21Aおよび図21B)。GC1発現は、AAV8(Y733F)−hGRK1−mGC1ベクターを用いて処置した杆体および錐体の外節に限られたのに対して、AAV5−smCBA−mGC1を用いて処置した眼の外節およびよりまれに光受容体細胞体の両方において見出され、光受容体特異的hGRK1と比べたこのユビキタスプロモーターの強さと一致する結果であった(Beltranら、2010年)。網膜菲薄化の2つの例が観察された。第1のものは、AAV5−smCBA−mGC1(送達された4.69×109の全ベクターゲノム)を用いて処置されたGC1KO網膜であった。外顆粒層(ONL)は、ナイーブGC1KOまたはGC1+/+対照網膜(両方とも8月齢)において見られたものに比べてわずかに薄くなった。これは、smCBAプロモーターによって媒介されたGC1の過剰発現の結果であるかもしれない(Beltranら、2010年)。
処置および無処置GC1KOマウスならびにGC1+/+対照における錐体光受容体は、マウス錐体アレスチンを染色することによって同定した。最終的な体内分布研究のために安楽死させたマウスからの網膜横断切片およびAAV5−smCBA−mGC1(右眼のみ)を用いる処置後11か月のGC1KOマウスからの網膜ホールマウントを分析した。本明細書で、錐体光受容体密度が、10月齢までに無処置GC1KO網膜において著しく低下したことが示され、錐体が、このマウスモデルにおいて組織分布的に特異的な様式で失われているという先の報告を確認する(Colemanら、2004年)(図21Aおよび図21B)。ホールマウント分析は、11月齢の無処置網膜がまばらな錐体密度を示し、残存性の錐体は、もっぱら、上部の網膜領域において見出されたことを明らかにするのに対して、パートナーのP14処置網膜は、おそらく網膜下注射の間にベクターに暴露されず、そのため、導入遺伝子産物を含有しなかった側頭の網膜のわずかな部分を除いて、非常に高度な錐体密度をあらゆる部分で保持した。AAV5処置網膜において見られたものと比較して、AAV8(Y733F)処置マウスの網膜横断切片における錐体密度および構造は、正常GC1+/+網膜において見られるものと質的に最も類似するように思われた(図21Aおよび図21B)。それらの密度は、無処置対照と比べて増加したが、AAV5処置網膜における錐体は、わずかに無秩序であるように思われ、これは、おそらく、これらのマウスにおける外顆粒層のわずかな、全体的な障害/菲薄化による結果である。
先の実施例では、AAV5−smCBA−mGC1またはAAV5−hGRK1−mGC1のP14送達の後に、3か月間、GC1KOマウスに錐体媒介性の機能を修復することができた(Boyeら、2010年)。処置マウスにおける平均明所視b波振幅は、注射後4週間で部分的に修復され、その研究を通じて安定したままであった。本実施例では、処置後9か月までの錐体媒介性の応答は、従来の研究において使用した同一のベクターをP14〜P25に注射したGC1KOマウスにおいて比較した。AAV5−mGC1ベクターを用いて処置した残りのマウスはすべて、処置後少なくとも1年間、測定可能な錐体媒介性の機能を示し続けた。AAV5−hGRK1−mGC1を用いて処置した個々のマウスから12cd/m2で誘発された代表的な結果を、図22Aおよび図22Bに示す。錐体応答は、ある期間にわたって安定し、無処置の反対側の対照から生成された応答よりも有意に高度であり(p<0.001)、錐体機能の回復が動物の生涯にわたり可能であることを示唆した(図22A)。先の実施例と一致して、光受容体特異的プロモーター(hGRK1)含有ベクターの送達の後に達成される回復のレベルは、あらゆる処置後の時点で、ユビキタスプロモーター(smCBA)含有ベクターを用いて達成されるものと有意に異なっていなかった。代表的な結果は、修復された錐体ERGの反応速度が、研究の経過を通じて正常であるように思われたことを明らかにする(図22B)。さらに、本実施例において、錐体光受容体機能が、AAV8(Y733F)−hGRK1−mGC1を用いる注射後の少なくとも6か月間、安定して修復されたことが示された。
体内分布研究は、AAV5またはAAV8(Y733F)送達ベクターゲノムを、数か月の期間の後に処置マウスの視神経および/または脳において検出することができたかどうかを立証するために、それぞれのベクターを用いて処置したGC1KOマウスにおいて実行した。AAV5ベクターを注射したマウスは、処置後7(n=2)および10(n=5)か月目に評価し、AAV8(Y733F)−hGRK1−mGC1を注射したマウスは、処置後4(n=1)および7(n=1)か月目に評価した。注射および非注射眼からの視神経ならびに視路を含有した左および右脳の一部を検査した。AAV5ベクターは、GC1KOマウスの右眼に注射した。したがって、ベクターゲノムは、注射後7および10か月目にAAV5処置マウスの右の視神経において検出された。注射後7か月目に、ベクターゲノムはまた、AAV5−hGRK1−mGC1を注射した1匹のマウスの左脳において検出された。ベクターゲノムは、その動物の右脳から検出されなかった。右の(注射した)視神経および左脳がポジティブであったという観察は、左半球が主に右眼に「つながっている」ので、解剖学的に矛盾しない。
AAV8(Y733F)−hGRK1−mGC1を用いる注射後7か月目に、1匹のGC1KOマウスからの処置および無処置網膜ならびに1匹の年齢が一致するGC1+/+対照マウスは、GC1およびGCAP1タンパク質発現のレベルをアッセイするために使用した。この実験の目標は、処置群にわたってGC1レベルを比較することではなく、ベクター媒介性のGC1発現のレベルを野生型動物におけるGC1のレベルと比較することであった。同様に、発明者らは、GCAP1発現に対するAAV送達GC1の効果を評価した。期待されるように、GC1タンパク質は、GC1KOマウスの無処置眼になかった。対照的に、AAV8(Y733F)処置眼におけるGC1のレベルは、正常GC1+/+対照において見られたものに近かった(図4)。GCAP1がGC1KOマウスにおいて翻訳後にダウンレギュレートされるという先の報告と一致して、発明者らは、GC1+/+対照に比べて無処置GC1KO網膜においてGCAP1がダウンレギュレートされたことを示す(39)。しかしながら、GC1のAAV8(Y733F)媒介性の送達は、処置GC1KOマウス網膜におけるGCAP1発現におけるアップレギュレーションに至る。GCAP1発現のレベルもまた、GC1+/+対照において見られるものに匹敵した。
例示的な哺乳動物GC1ポリペプチド配列
本発明の実施において有用な例示的なアミノ酸配列は、限定を伴うことなく、生物学的に活性な哺乳動物グアニル酸シクラーゼタンパク質をコードする、1つまたは複数のアミノ酸配列を含む。そのような配列は、限定を伴うことなく、下記に、配列番号1、配列番号2、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、および配列番号11において記載されるグアニル酸シクラーゼタンパク質などのような、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ウシ、およびイヌ起源のものを含む。
公知の哺乳動物GC1ポリペプチドの配列分析
以下の種についてのアミノ酸配列を使用して生成したすべてのGC1アライメントデータ:Bos taurus(ウシ;1110残基)、Canis lupus familiaris(イヌ;1109残基)、Mus musculus(マウス;1108残基)、およびHomo sapiens(ヒト;1103残基)。コンセンサスおよび可変領域の位置は、Bos taurusが、最も長いGC1タンパク質、1110残基であり、アライメントにおいてギャップを有していないので、Bos taurusに対応する数字で表した残基に基づく。
アミノ酸位置:44〜49、55〜90、98〜155、164〜321、464〜549、561〜604、620〜761、813〜1026、1045〜1054、および1060〜1110。
アミノ酸位置:4〜43、50〜54、91〜97、156〜163、322〜463、550〜560、605〜619、762〜812、1027〜1044、および1055〜1059。
(1)キナーゼ相同性ドメイン:コンセンサス配列のアミノ酸位置531〜541(光受容体における活性にとって不可欠であることが公知−たとえばBeretaら、2010年を参照されたい)
(2)マウスGC1タンパク質のキナーゼ相同性ドメイン内のリン酸化セリン残基(コンセンサス/括弧中に示すウシの位置):530(532)、532(534)、533(535)、および538(540)を含む。
SMCBAプロモーターのヌクレオチド配列
上記に記載する研究において使用した例証となるヒトGRK1(hGRK1)プロモーターの核酸配列を下記に示す。
以下の参考文献は、それらが、本明細書において記載されるものに対して補足的な、例示的な手順のまたは他の詳細を提供する程度まで、参照によって本明細書において明確に組み込まれる。
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