CN110892062A - 表达耳畸蛋白的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了表达耳畸蛋白的方法和组合物，例如，利用腺相关病毒(AAV)颗粒。这样的方法和组合物可用于治疗诸如常染色体隐性遗传性耳聋9(DFNB9)的疾病。

Description

表达耳畸蛋白的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年5月5日提交的美国临时申请号62/502,462的优先权，其全部公开内容通过引用并入本文。
联邦赞助的研究
本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)给予的基金EY000331、EY021721和DC012118的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
发明背景
非综合征型耳聋是听力丧失的一种形式，通常由内耳和/或中耳的缺陷或损伤引起。编码蛋白耳畸蛋白(Otoferlin)的OTOF基因的突变被认为引起一种非综合征型耳聋，称为常染色体隐性遗传性耳聋9(Deafness,Autosomal Recessive 9，DFNB9)。DFNB9和其他类似形式的耳聋的治疗目前涉及使用耳蜗植入体治疗重度或严重的听力丧失，以及使用助听器治疗程度较轻的听力丧失形式。仍然需要不依赖或不太依赖电子设备来恢复听力的替代治疗形式。
发明内容
本文提供了用于例如在细胞或受试者中表达耳畸蛋白的组合物和方法。如本文所述，已经发现通过含有OTOF cDNA的不同部分的双腺相关病毒(AAV)系统将OTOF cDNA递送至otof敲除小鼠能够将小鼠的听力拯救至接近野生型水平。
在一些方面，本公开提供增加细胞中耳畸蛋白表达的方法，该方法包括使细胞与包含第一多核苷酸的第一AAV颗粒接触；以及使细胞与包含第二多核苷酸的第二AAV颗粒接触，其中第一多核苷酸包含位于表达盒侧翼的反向末端重复序列，所述表达盒从5’至3’含有：(a)启动子，(b)编码耳畸蛋白多肽的N-末端部分的部分编码序列，(c)剪接供体位点，和(d)第一同源性区域，其含有与第二多核苷酸中的序列同源的序列，并且第二多核苷酸包含位于表达盒侧翼的反向末端重复序列，所述表达盒从5’至3’含有：(a)第二同源性区域，其含有与第一多核苷酸中的序列同源的序列，(b)剪接受体位点，(c)编码耳畸蛋白多肽的C-末端部分的部分编码序列，和(d)聚腺苷酸化(pA)信号序列。
在一些实施方案中，第一和第二多核苷酸中的同源性区域在50至500个核苷酸之间。在一些实施方案中，第一和第二多核苷酸中的同源性区域在50至300个核苷酸之间。在一些实施方案中，同源性区域包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。在一些实施方案中，启动子是嵌合CMVβ肌动蛋白(smcBA)启动子。在一些实施方案中，启动子包含SEQ ID NO:4的序列。在一些实施方案中，耳畸蛋白多肽包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，剪接供体位点包含SEQ ID NO:7的序列。在一些实施方案中，剪接受体位点包含SEQ ID NO:8的序列。在一些实施方案中，反向末端重复序列是AAV2反向末端重复序列。在一些实施方案中，第一和第二AAV颗粒是AAV2血清型颗粒。在一些实施方案中，细胞是离体的。在一些实施方案中，细胞是体内的。在一些实施方案中，细胞在哺乳动物受试者中。在一些实施方案中，受试者患有常染色体隐性遗传性耳聋9(DFNB9)。
在其他方面，本公开提供了一种组合物，其包含：包含第一多核苷酸的第一AAV颗粒；和包含第二多核苷酸的第二AAV颗粒，其中第一多核苷酸包含位于表达盒侧翼的反向末端重复序列，所述表达盒从5’至3’含有：(a)启动子，(b)编码耳畸蛋白多肽的N-末端部分的部分编码序列，(c)剪接供体位点，和(d)含有与第二多核苷酸中的序列同源的序列的第一同源性区域，并且第二多核苷酸包含位于表达盒侧翼的反向末端重复序列，所述表达盒从5’至3’含有：(a)含有与第一多核苷酸中的序列同源的序列的第二同源性区域，(b)剪接受体位点，(c)编码耳畸蛋白多肽的C-末端部分的部分编码序列，和(d)聚腺苷酸化(pA)信号序列。
在一些实施方案中，第一和第二多核苷酸中的同源性区域在50至500个核苷酸之间。在一些实施方案中，第一和第二多核苷酸中的同源性区域在50至300个核苷酸之间。在一些实施方案中，同源性区域包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。在一些实施方案中，启动子是嵌合CMVβ肌动蛋白(smcBA)启动子。在一些实施方案中，启动子包含SEQ ID NO:4的序列。在一些实施方案中，耳畸蛋白多肽包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，剪接供体位点包含SEQ ID NO:7的序列。在一些实施方案中，剪接受体位点包含SEQ ID NO:8的序列。在一些实施方案中，反向末端重复序列是AAV2反向末端重复序列。在一些实施方案中，第一和第二AAV颗粒是AAV2血清型颗粒。在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体。
在又一些方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含如本文所述的组合物或者包含如本文所述的第一AAV颗粒和如本文所述的第二AAV颗粒。
这些和其他方面在本文中更详细地描述。
附图简要说明
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步展示本公开的某些方面，通过参考这些附图中的一个或多个附图并结合本文给出的具体实施方式的详细描述，可以更好地理解本公开的这些方面。
图1A是含有位于CMV增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、小鼠耳畸蛋白cDNA的5’部分(耳畸蛋白NT)、剪接供体序列(APSD)和用于重组的同源序列(AP头)侧翼的AAV2反向末端重复序列(TR)的质粒的图。
图1B是含有位于用于重组的同源序列(AP头)、剪接受体序列(APSA)、小鼠耳畸蛋白cDNA的3’部分(耳畸蛋白CT)、牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH PolyA)侧翼的AAV2反向末端重复序列(TR)的质粒的图。
图2是图1A和1B的质粒中的两个表达盒的示意图。
图3A显示了带有注释的表达盒序列，包括图1A的质粒的反向末端重复序列(TR)。
图3B显示了带有注释的表达盒序列，包括图1B的质粒的反向末端重复序列(TR)。
图4是显示在用AAV2-OTOF-NT(AAV-NT)或AAV2-OTOF-NT和AAV2-OTOF-CT(AAV2-NT+CT)处理的HEK 293细胞中OTOF蛋白表达的一系列照片。
图5是显示在来自用AAV2-GFP处理的野生型小鼠的Corti表面制备物的耳蜗器官中GFP表达的一系列照片。
图6A-D是显示在P1-P3小鼠耳蜗中OTOF表达的一系列照片和图。图6A显示了在中弯中OTOF蛋白的表达。图6B显示了在尖端中OTOF蛋白的表达。图6C显示了在用AAV2-OTOF-NT和AAV2-OTOF-CT处理的野生型小鼠(WT，n＝6)和OTOF敲除小鼠(Res.KO NT+CT，n＝6)的基部、中弯和尖端中OTOF表达的差异。每对柱中左边的柱是WT，每对柱中右边的柱是Res.KONT+CT。图6D显示了在野生型(WT)、OTOF敲除小鼠(KO)和用AAV2-OTOF-NT和AAV2-OTOF-CT处理的OTOF敲除小鼠(Res.KO)中OTOF mRNA的RT-PCR数据。
图7A-D显示了小鼠的听力评估。图7A是在野生型小鼠(WT)、未用AAV2-OTOF-NT和AAV2-OTOF-CT处理(KO/KO NT)和用AAV2-OTOF-NT和AAV2-OTOF-CT处理(拯救的KO)的OTOF敲除小鼠中通过听觉刺激诱导的听性脑干反应(ABR)模式的迹线。图7B显示了在野生型小鼠(WT)、未经处理的耳畸蛋白敲除小鼠(KO)、用AAV2-OTOF-NT和AAV2-OTOF-CT处理的耳畸蛋白敲除小鼠(Res KO NT+CT)和用AAV2-OTOF-NT处理的耳畸蛋白敲除小鼠(KO+NT)中的听性脑干反应(ABR)阈值。图7C显示了在野生型小鼠(WT)、未经处理的OTOF敲除小鼠(KO)、用AAV2-OTOF-NT和AAV2-OTOF-CT处理的耳畸蛋白敲除小鼠(拯救的KO NT+CT)和用AAV2-OTOF-NT处理的耳畸蛋白敲除小鼠(KONT)中听力恢复的时间进程。图7D显示了在野生型小鼠(WT)、未经处理的耳畸蛋白敲除小鼠(KO)、用AAV2-OTOF-NT和AAV2-OTOF-CT处理的耳畸蛋白敲除小鼠(Res.KO(NT+CT))和用AAV2-OTOF-NT处理的耳畸蛋白敲除小鼠(KO+NT)中的短声ABR阈值。
图8A和B显示了在OTOF拯救的KO小鼠内毛细胞中耳畸蛋白的表达。图8A显示了在用AAV2-OTOF-NT和AAV2-OTOF-CT处理的P12和年龄更大的小鼠中OTOF蛋白的表达。图8B显示了在野生型小鼠(WT，n＝5)和用AAV2-OTOF-NT和AAV2-OTOF-CT处理的OTOF敲除小鼠(拯救的KO，n＝5)中表达OTOF的内毛细胞的百分比。每对柱中左边的柱是WT，每对柱中右边的柱是拯救的KO。
图9A和9B是示出听力评估的一系列图。图9A显示了在野生型小鼠(WT)、OTOF敲除小鼠(KO)和用AAV2-OTOF-NT和AAV2-OTOF-CT处理的OTOF敲除小鼠(拯救的KO)中的ABR阈值。图9B显示了WT、KO和拯救的KO小鼠的听力寿命。
图10是含有位于CMV增强子、鸡β-肌动蛋白启动子、人耳畸蛋白cDNA的5’部分(耳畸蛋白NT)、剪接供体序列(APSD)和用于重组的同源性序列(AP头)侧翼的AAV2反向末端重复序列(TR)的质粒的图。
图11是含有位于用于重组的同源性序列(AP头)、剪接受体序列(APSA)、编码耳畸蛋白的同种型1的人耳畸蛋白cDNA的3’部分(耳畸蛋白CT)、牛生长激素多腺苷酸化信号(bGH PolyA)侧翼的AAV2反向末端重复序列(TR)的质粒的图。
图12是含有位于用于重组的同源性序列(AP头)、剪接受体序列(APSA)、编码耳畸蛋白的同种型5的小鼠耳畸蛋白cDNA的3’部分(耳畸蛋白CT)、牛生长激素多腺苷酸化信号(bGH PolyA)侧翼的AAV2反向末端重复序列(TR)的质粒的图。
图13显示了带有注释的人OTOF N-末端表达盒序列，包括图10的质粒的反向末端重复序列(TR)。
图14显示了带有注释的同种型1的人OTOF C-末端表达盒序列，包括图11的质粒的反向末端重复序列(TR)。
图15显示了带有注释的同种型5的人OTOF C端表达盒序列，包括图12的质粒的反向末端重复序列(TR)。
发明详述
如本文所述，已经发现，通过用两种单独的AAV颗粒处理小鼠可以恢复耳畸蛋白敲除小鼠的听力，一种颗粒包含OTOF cDNA的5’部分，另一种包含OTOF cDNA的3’部分，并且每种颗粒均包含用于促进体内5’部分和3’部分之间的同源重组的同源性区域。该同源性区域的侧翼为在OTOFcDNA的5’部分内的5’侧的剪接供体序列和在OTOF cDNA的3’部分内的3’侧的剪接受体序列。因此，提供了用于增加耳畸蛋白表达的组合物和方法。
示例性定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文所述那些相似或等同的任何方法和组合物可以用于本发明的实践或测试中，但本文描述了优选的方法和组合物。为了本发明的目的，以下术语定义如下：
如本文所用，术语“核酸”和“多核苷酸序列”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另有限制，否则包括可以以与天然存在的核苷酸类似的方式起作用的天然核苷酸的已知类似物。
如本文所用，术语“基本上对应于”、“基本上同源”或“基本上同一性”表示核酸或氨基酸序列的特征，其中选择的核酸或氨基酸序列与选择的参考核酸或氨基酸序列相比具有至少约70或约75％的序列同一性。更通常地，选择的序列和参考序列将具有至少约76、77、78、79、80、81、82、83、84或甚至85％的序列同一性，并且更优选地，至少约86、87、88、89、90、91、92、93、94或95％的序列同一性。更优选地，高度同源的序列通常在选择的序列和与之比较的参考序列之间具有大于至少约96、97、98或99％的序列同一性。
序列同一性的百分比可以在待比较的序列的整个长度上进行计算，或者可以通过排除总计少于所选参考序列约25％左右的小缺失或添加而进行计算。参考序列可以是较大序列的子集，例如基因或侧翼序列的一部分，或染色体的重复部分。然而，在两个或更多个多核苷酸序列的序列同源性的情况下，参考序列将通常包含至少约18-25个核苷酸，更通常包含至少约26-35个核苷酸，甚至更通常包含至少约40、50、60、70、80、90或甚至100个左右的核苷酸。
当需要高度同源的片段时，两个序列之间的百分比同一性程度可以为至少约80％，优选至少约85％，并且更优选约90％或95％或更高，这很容易通过本领域普通技术人员熟知的一个或多个序列比较算法来确定，例如，Pearson和Lipman(1988)描述的FASTA程序分析。
多核苷酸
在一些方面，提供了用于将编码耳畸蛋白的OTOF基因的编码序列部分递送至细胞的多核苷酸。在一些实施方案中，编码序列来源于人OTOF基因(参见，例如，NCBI基因ID：9381和cDNA序列NM_001287489.1、NM_004802.3、NM_194248.2、NM_194322.2和NM_194323.2)。在一些实施方案中，编码序列来源于小鼠OTOF基因(参见例如NCBI基因ID83762和cDNA序列NM_001100395.1、NM_001286421.1、NM_001313767.1和NM_031875.2)。在一些实施方案中，提供了第一和第二多核苷酸。应当理解，除非另外明确指出，否则“第一”、“第二”、“第三”等并不意味着暗指特定的顺序或重要性。
在一些实施方案中，第一多核苷酸包含位于表达盒侧翼的反向末端重复序列，所述表达盒从5’至3’包含(a)启动子、(b)编码耳畸蛋白多肽的N-末端部分的部分编码序列、(c)剪接供体位点和(d)含有与第二多核苷酸中的序列同源的序列的第一同源性区域中的一个或多个。在一些实施方案中，第一多核苷酸包含(a)、(b)、(c)和(d)中的至少两个、至少三个或全部四个。
在一些实施方案中，第二多核苷酸包含位于表达盒侧翼的反向末端重复序列，该表达盒从5’至3’包含(a)含有与第一多核苷酸中的序列同源的序列的第二同源性区域、(b)剪接受体位点、(c)编码耳畸蛋白多肽C-末端部分的部分编码序列和(d)聚腺苷酸化(pA)信号序列中的一个或多个。在一些实施方案中，第二多核苷酸包含(a)、(b)、(c)和(d)中的至少两个、至少三个或全部四个。
可以对包含在本文所述的多核苷酸内的部分编码序列进行设计，使得在递送多核苷酸时，例如通过同源重组将部分编码序列连接在一起，并形成编码耳畸蛋白多肽的完整编码序列。
在一些实施方案中，多核苷酸是质粒(例如，包含复制起点、选择标志物和报告基因中的一个或多个的环型核酸)。在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸，如质粒，还可以包含标志物或报告基因，例如LacZ或荧光蛋白，以及复制起点。在一些实施方案中，将质粒转染到生产细胞中，该生产细胞产生含有包含在质粒内的表达盒的AAV颗粒。
在一些实施方案中，多核苷酸是核酸载体，如重组腺相关病毒(AAV)载体。根据本公开可用的示例性AAV核酸载体包括单链(ss)或自身互补(sc)AAV核酸载体。
在一些实施方案中，重组AAV颗粒包含多核苷酸，如单链(ss)或自身互补(sc)AAV核酸载体。在一些实施方案中，多核苷酸含有如本文所述的表达构建体和位于表达构建体侧翼的反向末端重复(ITR)序列(例如，野生型ITR序列或工程化的ITR序列)。在一些实施方案中，多核苷酸被病毒衣壳壳体化。
因此，在一些实施方案中，AAV颗粒包含病毒衣壳和如本文所述的被病毒衣壳壳体化的多核苷酸。在一些实施方案中，病毒衣壳包含60个衣壳蛋白亚基，其包含VP1、VP2和VP3。在一些实施方案中，VP1、VP2和VP3亚基分别以大约1:1:10的比例存在于衣壳中。
在一些实施方案中，如本文所述的多核苷酸(例如，第一和第二多核苷酸)包含同源性区域，以例如一旦被递送至细胞，促进多核苷酸之间的同源性重组(参见，例如，Ghosh等人，Efficient transgene reconstitution with hybrid dual AAV vectors carryingthe minimized bridging sequences.Hum Gene Ther.2011年1月；22(1):77-83)。在一些实施方案中，第一同源性区域和第二同源性区域彼此具有阈值水平的序列同一性，以促进同源性重组。在一些实施方案中，第一同源性区域与第二同源性区域具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性。除非另有说明，如本文所用，两个序列的百分比序列同一性和/或相似性可以使用Karlin和Altschul(1990)改良为Karlin和Altschul(1993)的算法来确定。这种算法被并入到Altschul等人(1990)的NBLAST和XBLAST程序中。可以采用NBLAST程序(得分＝100，字长＝12)来执行BLAST检索，以获得具有所需百分比序列同一性的序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如(Altschul等人，1997)描述的那样使用Gapped BLAST。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以根据已发布的方法使用相应程序(NBLAST和XBLAST)的默认参数。在一些实施方案中，每个同源性区域独立地在50至500、50至400、50至300、100至500、100至400、100至300、200至500、200至400或200至300个核苷酸之间。在一些实施方案中，同源性区域是相同的，并且每个同源性区域在50至500、50至400、50至300、100至500、100至400、100至300、200至500、200至400，或200至300个核苷酸之间。在一些实施方案中，同源性区域包含与以下核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列：CCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTC(SEQ ID NO:3)。
在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸可以包含一种或多种调控元件。本领域普通技术人员可以选择用于适当的宿主细胞(例如哺乳动物或人宿主细胞)的调控元件。调控元件包括例如启动子、转录终止序列、翻译终止序列、增强子和聚腺苷酸化元件。本文所述的多核苷酸可以包含与编码所需多肽如耳畸蛋白的核苷酸序列有效连接的启动子序列。预期用于本发明的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、嵌合CMV/鸡β肌动蛋白启动子(CBA)和CBA的截短形式(smCBA)(参见，例如，Haire等人2006和美国专利号8,298,818，其通过引用明确地以其整体并入本文)。在一些实施方案中，启动子是截短的嵌合CMVβ肌动蛋白(smcBA)启动子。在一些实施方案中，启动子包含与以下核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列：
GGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG(SEQ ID NO:4)。
在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸包含编码耳畸蛋白多肽的N-末端或C-末端部分的部分编码序列，其中所述部分编码序列可以在体内被剪接或以其他方式组合在一起以编码耳畸蛋白多肽。在一些实施方案中，耳畸蛋白多肽是人耳畸蛋白多肽。在一些实施方案中，耳畸蛋白多肽是人耳畸蛋白多肽的长同种型(参见，例如，Yasunaga等人，OTOFEncodes Multiple Long and Short Isoforms:Genetic Evidence That the Long OnesUnderlie Recessive Deafness DFNB9.Am.J.Hum.Genet.67:591–600,2000)。在一些实施方案中，耳畸蛋白多肽包含与以下氨基酸序列中的一个或两个具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列：
人OTOF同种型1–Genbank编号AF183185.1
MALLIHLKTVSELRGRGDRIAKVTFRGQSFYSRVLENCEDVADFDETFRWPVASSIDRNEMLEIQVFNYSKVFSNKLIGTFRMVLQKVVEESHVEVTDTLIDDNNAIIKTSLCVEVRYQATDGTVGSWDDGDFLGDESLQEEEKDSQETDGLLPGSRPSSRPPGEKSFRRAGRSVFSAMKLGKNRSHKEEPQRPDEPAVLEMEDLDHLAIRLGDGLDPDSVSLASVTALTTNVSNKRSKPDIKMEPSAGRPMDYQVSITVIEARQLVGLNMDPVVCVEVGDDKKYTSMKESTNCPYYNEYFVFDFHVSPDVMFDKIIKISVIHSKNLLRSGTLVGSFKMDVGTVYSQPEHQFHHKWAILSDPDDISSGLKGYVKCDVAVVGKGDNIKTPHKANETDEDDIEGNLLLPEGVPPERQWARFYVKIYRAEGLPRMNTSLMANVKKAFIGENKDLVDPYVQVFFAGQKGKTSVQKSSYEPLWNEQVVFTDLFPPLCKRMKVQIRDSDKVNDVAIGTHFIDLRKISNDGDKGFLPTLGPAWVNMYGSTRNYTLLDEHQDLNEGLGEGVSFRARLLLGLAVEIVDTSNPELTSSTEVQVEQATPISESCAGKMEEFFLFGAFLEASMIDRRNGDKPITFEVTIGNYGNEVDGLSRPQRPRPRKEPGDEEEVDLIQNASDDEAGDAGDLASVSSTPPMRPQVTDRNYFHLPYLERKPCIYIKSWWPDQRRRLYNANIMDHIADKLEEGLNDIQEMIKTEKSYPERRLRGVLEELSCGCCRFLSLADKDQGHSSRTRLDRERLKSCMRELENMGQQARMLRAQVKRHTVRDKLRLCQNFLQKLRFLADEPQHSIPDIFIWMMSNNKRVAYARVPSKDLLFSIVEEETGKDCAKVKTLFLKLPGKRGFGSAGWTVQAKVELYLWLGLSKQRKEFLCGLPCGFQEVKAAQGLGLHAFPPVSLVYTKKQAFQLRAHMYQARSLFAADSSGLSDPFARVFFINQSQCTEVLNETLCPTWDQMLVFDNLELYGEAHELRDDPPIIVIEIYDQDSMGKADFMGRTFAKPLVKMADEAYCPPRFPPQLEYYQIYRGNATAGDLLAAFELLQIGPAGKADLPPINGPVDVDRGPIMPVPMGIRPVLSKYRVEVLFWGLRDLKRVNLAQVDRPRVDIECAGKGVQSSLIHNYKKNPNFNTLVKWFEVDLPENELLHPPLNIRVVDCRAFGRYTLVGSHAVSSLRRFIYRPPDRSAPSWNTTVRLLRRCRVLCNGGSSSHSTGEVVVTMEPEVPIKKLETMVKLDATSEAVVKVDVAEEEKEKKKKKKGTAEEPEEEEPDESMLDWWSKYFASIDTMKEQLRQQEPSGIDLEEKEEVDNTEGLKGSMKGKEKARAAKEEKKKKTQSSGSGQGSEAPEKKKPKIDELKVYPKELESEFDNFEDWLHTFNLLRGKTGDDEDGSTEEERIVGRFKGSLCVYKVPLPEDVSREAGYDSTYGMFQGIPSNDPINVLVRVYVVRATDLHPADINGKADPYIAIRLGKTDIRDKENYISKQLNPVFGKSFDIEASFPMESMLTVAVYDWDLVGTDDLIGETKIDLENRFYSKHRATCGIAQTYSTHGYNIWRDPMKPSQILTRLCKDGKVDGPHFGPPGRVKVANRVFTGPSEIEDENGQRKPTDEHVALLALRHWEDIPRAGCRLVPEHVETRPLLNPDKPGIEQGRLELWVDMFPMDMPAPGTPLDISPRKPKKYELRVIIWNTDEVVLEDDDFFTGEKSSDIFVRGWLKGQQEDKQDTDVHYHSLTGEGNFNWRYLFPFDYLAAEEKIVISKKESMFSWDETEYKIPARLTLQIWDADHFSADDFLGAIELDLNRFPRGAKTAKQCTMEMATGEVDVPLVSIFKQKRVKGWWPLLARNENDEFELTGKVEAELHLLTAEEAEKNPVGLARNEPDPLEKPNRPDTSFIWFLNPLKSARYFLWHTYRWLLLKLLLLLLLLLLLALFLYSVPGYLVKKILGA(SEQ ID NO:5)
人OTOF同种型5–Genbank编号NP_001274418
MALLIHLKTVSELRGRGDRIAKVTFRGQSFYSRVLENCEDVADFDETFRWPVASSIDRNEMLEIQVFNYSKVFSNKLIGTFRMVLQKVVEESHVEVTDTLIDDNNAIIKTSLCVEVRYQATDGTVGSWDDGDFLGDESLQEEEKDSQETDGLLPGSRPSSRPPGEKSFRRAGRSVFSAMKLGKNRSHKEEPQRPDEPAVLEMEDLDHLAIRLGDGLDPDSVSLASVTALTTNVSNKRSKPDIKMEPSAGRPMDYQVSITVIEARQLVGLNMDPVVCVEVGDDKKYTSMKESTNCPYYNEYFVFDFHVSPDVMFDKIIKISVIHSKNLLRSGTLVGSFKMDVGTVYSQPEHQFHHKWAILSDPDDISSGLKGYVKCDVAVVGKGDNIKTPHKANETDEDDIEGNLLLPEGVPPERQWARFYVKIYRAEGLPRMNTSLMANVKKAFIGENKDLVDPYVQVFFAGQKGKTSVQKSSYEPLWNEQVVFTDLFPPLCKRMKVQIRDSDKVNDVAIGTHFIDLRKISNDGDKGFLPTLGPAWVNMYGSTRNYTLLDEHQDLNEGLGEGVSFRARLLLGLAVEIVDTSNPELTSSTEVQVEQATPISESCAGKMEEFFLFGAFLEASMIDRRNGDKPITFEVTIGNYGNEVDGLSRPQRPRPRKEPGDEEEVDLIQNASDDEAGDAGDLASVSSTPPMRPQVTDRNYFHLPYLERKPCIYIKSWWPDQRRRLYNANIMDHIADKLEEGLNDIQEMIKTEKSYPERRLRGVLEELSCGCCRFLSLADKDQGHSSRTRLDRERLKSCMRELENMGQQARMLRAQVKRHTVRDKLRLCQNFLQKLRFLADEPQHSIPDIFIWMMSNNKRVAYARVPSKDLLFSIVEEETGKDCAKVKTLFLKLPGKRGFGSAGWTVQAKVELYLWLGLSKQRKEFLCGLPCGFQEVKAAQGLGLHAFPPVSLVYTKKQAFQLRAHMYQARSLFAADSSGLSDPFARVFFINQSQCTEVLNETLCPTWDQMLVFDNLELYGEAHELRDDPPIIVIEIYDQDSMGKADFMGRTFAKPLVKMADEAYCPPRFPPQLEYYQIYRGNATAGDLLAAFELLQIGPAGKADLPPINGPVDVDRGPIMPVPMGIRPVLSKYRVEVLFWGLRDLKRVNLAQVDRPRVDIECAGKGVQSSLIHNYKKNPNFNTLVKWFEVDLPENELLHPPLNIRVVDCRAFGRYTLVGSHAVSSLRRFIYRPPDRSAPSWNTTVRLLRRCRVLCNGGSSSHSTGEVVVTMEPEVPIKKLETMVKLDATSEAVVKVDVAEEEKEKKKKKKGTAEEPEEEEPDESMLDWWSKYFASIDTMKEQLRQQEPSGIDLEEKEEVDNTEGLKGSMKGKEKARAAKEEKKKKTQSSGSGQGSEAPEKKKPKIDELKVYPKELESEFDNFEDWLHTFNLLRGKTGDDEDGSTEEERIVGRFKGSLCVYKVPLPEDVSREAGYDSTYGMFQGIPSNDPINVLVRVYVVRATDLHPADINGKADPYIAIRLGKTDIRDKENYISKQLNPVFGKSFDIEASFPMESMLTVAVYDWDLVGTDDLIGETKIDLENRFYSKHRATCGIAQTYSTHGYNIWRDPMKPSQILTRLCKDGKVDGPHFGPPGRVKVANRVFTGPSEIEDENGQRKPTDEHVALLALRHWEDIPRAGCRLVPEHVETRPLLNPDKPGIEQGRLELWVDMFPMDMPAPGTPLDISPRKPKKYELRVIIWNTDEVVLEDDDFFTGEKSSDIFVRGWLKGQQEDKQDTDVHYHSLTGEGNFNWRYLFPFDYLAAEEKIVISKKESMFSWDETEYKIPARLTLQIWDADHFSADDFLGAIELDLNRFPRGAKTAKQCTMEMATGEVDVPLVSIFKQKRVKGWWPLLARNENDEFELTGKVEAELHLLTAEEAEKNPVGLARNEPDPLEKPNRPDTAFVWFLNPLKSIKYLICTRYKWLIIKIVLALLGLLMLGLFLYSLPGYMVKKLLGA(SEQ ID NO:6)
在一些实施方案中，耳畸蛋白多肽是小鼠耳畸蛋白多肽。在一些实施方案中，耳畸蛋白多肽包含与以下氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列：
小鼠OTOF同种型1–Genbank编号NP_001093865.1
MALIVHLKTVSELRGKGDRIAKVTFRGQSFYSRVLENCEGVADFDETFRWPVASSIDRNEVLEIQIFNYSKVFSNKLIGTFCMVLQKVVEENRVEVTDTLMDDSNAIIKTSLSMEVRYQATDGTVGPWDDGDFLGDESLQEEKDSQETDGLLPGSRPSTRISGEKSFRSKGREKTKGGRDGEHKAGRSVFSAMKLGKTRSHKEEPQRQDEPAVLEMEDLDHLAIQLGDGLDPDSVSLASVTALTSNVSNKRSKPDIKMEPSAGRPMDYQVSITVIEARQLVGLNMDPVVCVEVGDDKKYTSMKESTNCPYYNEYFVFDFHVSPDVMFDKIIKISVIHSKNLLRSGTLVGSFKMDVGTVYSQPEHQFHHKWAILSDPDDISAGLKGYVKCDVAVVGKGDNIKTPHKANETDEDDIEGNLLLPEGVPPERQWARFYVKIYRAEGLPRMNTSLMANVKKAFIGENKDLVDPYVQVFFAGQKGKTSVQKSSYEPLWNEQVVFTDLFPPLCKRMKVQIRDSDKVNDVAIGTHFIDLRKISNDGDKGFLPTLGPAWVNMYGSTRNYTLLDEHQDLNEGLGEGVSFRARLMLGLAVEILDTSNPELTSSTEVQVEQATPVSESCTGRMEEFFLFGAFLEASMIDRKNGDKPITFEVTIGNYGNEVDGMSRPLRPRPRKEPGDEEEVDLIQNSSDDEGDEAGDLASVSSTPPMRPQITDRNYFHLPYLERKPCIYIKSWWPDQRRRLYNANIMDHIADKLEEGLNDVQEMIKTEKSYPERRLRGVLEELSCGCHRFLSLSDKDQGRSSRTRLDRERLKSCMRELESMGQQAKSLRAQVKRHTVRDKLRSCQNFLQKLRFLADEPQHSIPDVFIWMMSNNKRIAYARVPSKDLLFSIVEEELGKDCAKVKTLFLKLPGKRGFGSAGWTVQAKLELYLWLGLSKQRKDFLCGLPCGFEEVKAAQGLGLHSFPPISLVYTKKQAFQLRAHMYQARSLFAADSSGLSDPFARVFFINQSQCTEVLNETLCPTWDQMLVFDNLELYGEAHELRDDPPIIVIEIYDQDSMGKADFMGRTFAKPLVKMADEAYCPPRFPPQLEYYQIYRGSATAGDLLAAFELLQIGPSGKADLPPINGPVDMDRGPIMPVPVGIRPVLSKYRVEVLFWGLRDLKRVNLAQVDRPRVDIECAGKGVQSSLIHNYKKNPNFNTLVKWFEVDLPENELLHPPLNIRVVDCRAFGRYTLVGSHAVSSLRRFIYRPPDRSAPNWNTTGEVVVSMEPEEPVKKLETMVKLDATSDAVVKVDVAEDEKERKKKKKKGPSEEPEEEEPDESMLDWWSKYFASIDTMKEQLRQHETSGTDLEEKEEMESAEGLKGPMKSKEKSRAAKEEKKKKNQSPGPGQGSEAPEKKKAKIDELKVYPKELESEFDSFEDWLHTFNLLRGKTGDDEDGSTEEERIVGRFKGSLCVYKVPLPEDVSREAGYDPTYGMFQGIPSNDPINVLVRIYVVRATDLHPADINGKADPYIAIKLGKTDIRDKENYISKQLNPVFGKSFDIEASFPMESMLTVAVYDWDLVGTDDLIGETKIDLENRFYSKHRATCGIAQTYSIHGYNIWRDPMKPSQILTRLCKEGKVDGPHFGPHGRVRVANRVFTGPSEIEDENGQRKPTDEHVALSALRHWEDIPRVGCRLVPEHVETRPLLNPDKPGIEQGRLELWVDMFPMDMPAPGTPLDISPRKPKKYELRVIVWNTDEVVLEDDDFFTGEKSSDIFVRGWLKGQQEDKQDTDVHYHSLTGEGNFNWRYLFPFDYLAAEEKIVMSKKESMFSWDETEYKIPARLTLQIWDADHFSADDFLGAIELDLNRFPRGAKTAKQCTMEMATGEVDVPLVSIFKQKRVKGWWPLLARNENDEFELTGKVEAELHLLTAEEAEKNPVGLARNEPDPLEKPNRPDTAFVWFLNPLKSIKYLICTRYKWLIIKIVLALLGLLMLALFLYSLPGYMVKKLLGA(SEQ ID NO:9)
在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸包含剪接供体或剪接受体位点。在一些实施方案中，剪接供体和/或剪接受体位点含有剪接共有序列。在一些实施方案中，剪接供体和/或剪接受体位点包含来源于碱性磷酸酶的序列剪接共有序列的序列。在一些实施方案中，剪接供体位点包含与以下核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列：GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGA(SEQID NO:7)。在一些实施方案中，剪接受体位点包含与以下核苷酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的序列：TAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG(SEQ ID NO:8)。
在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸包含ITR序列。本文所述的多核苷酸的ITR序列可以来源于任何AAV血清型(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)或者可以来源于多于一种的血清型。在本文提供的多核苷酸的一些实施方案中，ITR序列来源于AAV2。ITR序列和含有ITR序列的质粒是本领域已知的并且是可商购获得的(参见，例如，可从Vector Biolabs,Philadelphia,PA；Cellbiolabs,San Diego,CA；Agilent Technologies,Santa Clara,Ca；和Addgene,Cambridge,MA获得的产品和服务；以及Gene delivery to skeletal muscleresults in sustained expression and systemic delivery of a therapeuticprotein.Kessler PD,Podsakoff GM,Chen X,McQuiston SA,Colosi PC,Matelis LA,Kurtzman GJ,Byrne BJ.Proc Natl Acad Sci U S A.1996年11月26日；93(24):14082-7；和Curtis A.Machida.Methods in Molecular MedicineTM.Viral Vectors for GeneTherapy Methods and Protocols.10.1385/1-59259-304-6:201
Figure BDA0002260551610000151
Humana PressInc.2003.第10章.Targeted Integration by Adeno-Associated Virus.MatthewD.Weitzman,Samuel M.Young Jr.,Toni Cathomen和Richard Jude Samulski；美国专利号5,139,941和5,962,313，所有这些文献通过引用并入本文)。用于位于表达构建体的5’端侧翼的示例性AAV2 ITR序列包含以下序列：
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTC(SEQ ID NO:10)。用于位于表达构建体的3’端侧翼的示例性AAV2 ITR序列包含以下序列：
ACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACC(SEQ ID NO:11)。
在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸还可以任选地包括一个或多个转录终止序列、一个或多个翻译终止序列、一个或多个信号肽序列、一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)和/或一个或多个增强子元件，或其任何组合。转录终止区通常可以从真核或病毒基因序列的3’非翻译区获得。转录终止序列可以位于编码序列的下游以提供有效的终止。信号肽序列是氨基末端肽序列，其编码负责将有效连接的多肽定位到一个或多个翻译后细胞目的地(包括例如特定细胞器区室)或者蛋白质合成和/或活性位点、甚至细胞外环境的信息。在一些实施方案中，如本文所述的多核苷酸包含牛生长激素聚腺苷酸化信号。
在一些实施方案中，包含在本文所述的多核苷酸内的表达构建体的大小不超过5千个碱基，不超过4千个碱基，或不超过3千个碱基。在一些实施方案中，表达构建体的大小为4至5千个碱基之间。
在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸包含在一个或多个重组AAV颗粒(例如，第一和第二AAV颗粒)内。AAV颗粒可以是任何AAV血清型(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)，包括任何衍生物(包括血清型的非天然存在的变体)或假型。衍生物和假型的非限制性实例包括AAV2-AAV3杂种、AAVrh.10、AAVhu.14、AAV3a/3b、AAVrh32.33、AAV-HSC15、AAV-HSC17、AAVhu.37、AAVrh.8、CHt-P6、AAV2.5、AAV6.2、AAV2i8、AAV-HSC15/17、AAVM41、AAV9.45、AAV6(Y445F/Y731F)、AAV2.5T、AAV-HAE1/2、AAV克隆32/83、AAVShH10、AAV2(Y->F)、AAV8(Y733F)、AAV2.15、AAV2.4、AAVM41和AAVr3.45。这些AAV血清型和衍生物/假型以及产生这些衍生物/假型的方法是本领域已知的(参见，例如，Mol Ther.2012Apr；20(4):699-708.doi:10.1038/mt.2011.287.Epub 2012年1月24日.The AAV vector toolkit:poisedat the clinical crossroads.Asokan A1,Schaffer DV,Samulski RJ.)。在一些实施方案中，第一和第二AAV颗粒是AAV2血清型颗粒。
产生AAV颗粒和多核苷酸的方法是本领域已知的并且是可商购获得的(参见，例如，Zolotukhin等人，Production and purification of serotype 1,2,and5recombinant adeno-associated viral vectors.Methods 28(2002)158–167；和美国专利公开号US20070015238和US20120322861，它们通过引用并入本文；以及从ATCC和CellBiolabs,Inc.获得的质粒和试剂盒)。例如，多核苷酸(例如，作为质粒)可以与一种或多种辅助质粒组合，例如，其包含rep基因(例如，编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和cap基因(编码VP1、VP2和VP3)，并转染到生产细胞系中，以使可以包装AAV颗粒，然后对其进行纯化。
在一些实施方案中，一种或多种辅助质粒包括包含rep基因和cap基因的第一辅助质粒和包含辅助AAV产生的其他基因(如E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因)的第二辅助质粒。在一些实施方案中，rep基因是来源于AAV2的rep基因。辅助质粒和制备此类质粒的方法是本领域已知的并且是可商购获得的(参见，例如，来自PlasmidFactory,Bielefeld,德国的pDM、pDG、pDP1rs、pDP2rs、pDP3rs、pDP4rs、pDP5rs、pDP6rs、pDG(R484E/R585E)和pDP8.ape质粒；获自Vector Biolabs,Philadelphia,PA；Cellbiolabs,SanDiego,CA；Agilent Technologies,Santa Clara,Ca；和Addgene,Cambridge,MA的其他产品和服务；pxx6；Grimm等人(1998),Novel Tools for Production and Purification ofRecombinant Adenoassociated Virus Vectors,Human Gene Therapy,Vol.9,2745-2760；Kern,A.等人(2003),Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2Capsids,Journal of Virology,Vol.77,11072-11081.；Grimm等人(2003),Helper Virus-Free,Optically Controllable,and Two-Plasmid-BasedProduction of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6,MolecularTherapy,Vol.7,839-850；Kronenberg等人(2005),A Conformational Change in theAdeno-Associated Virus Type 2 Capsid Leads to the Exposure of Hidden VP1 NTermini,Journal of Virology,Vol.79,5296-5303；以及Moullier,P.和Snyder,R.O.(2008),International efforts for recombinant adenoassociated viral vectorreference standards,Molecular Therapy,Vol.16,1185-1188)。
接下来描述示例性的非限制性的AAV颗粒产生方法。产生或获得一种或多种辅助质粒，该质粒包含用于所需AAV血清型的rep和cap ORF，以及在其天然启动子的转录控制下的腺病毒VA、E2A(DBP)和E4基因。HEK293细胞(获自
Figure BDA0002260551610000181
)通过CaPO4-介导的转染、脂质或聚合分子如聚乙烯亚胺(PEI)用辅助质粒和含有本文所述的多核苷酸的质粒进行转染。或者，在另一个非限制性实例中，用含有所述多核苷酸的单个重组杆状病毒感染基于Sf9的生产稳定型细胞系。作为另一个非限制性的替代方案，在另一实例中，用含有所述多核苷酸的HSV和任选的含有如本文所述的rep和cap ORF以及在其天然启动子的转录控制下的腺病毒VA、E2A(DBP)和E4基因的一种或多种辅助HSV感染HEK293或BHK细胞系。然后将HEK293、BHK或Sf9细胞孵育至少60小时，以产生AAV颗粒。然后可以使用本领域已知的或本文描述的任何方法，例如通过碘克沙醇逐步梯度、CsCl梯度、色谱法或聚乙二醇(PEG)沉淀来纯化AAV颗粒。
本公开还涉及包含至少一种所公开的AAV颗粒或多核苷酸的宿主细胞。这样的宿主细胞包括哺乳动物宿主细胞，优选人类宿主细胞，并且可以在细胞或组织培养物中分离。在遗传修饰的动物模型(例如小鼠)的情况下，转化的宿主细胞可以包含在非人动物本身的体内。
方法和受试者
在一些方面，提供了增加细胞中耳畸蛋白表达的方法。在一些实施方案中，该方法包括使细胞与如本文所述的包含如本文所述的第一多核苷酸的第一AAV颗粒接触；以及使细胞与如本文所述的包含如本文所述的第二多核苷酸的第二AAV颗粒接触。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，如小鼠或人细胞。在一些实施方案中，细胞是离体的。在一些实施方案中，细胞是体内的。在一些实施方案中，细胞是耳细胞(例如，人耳细胞)。在一些实施方案中，细胞是内耳细胞(例如人内耳细胞)。在一些实施方案中，细胞在受试者(例如，哺乳动物受试者，如人类受试者)中。
本公开的其他方面涉及对由耳畸蛋白的表达或活性降低或不存在引起的疾病或病况的治疗。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所述的包含如本文所述的第一多核苷酸的第一AAV颗粒以及治疗有效量的如本文所述的包含如本文所述的第二多核苷酸的第二AAV颗粒。在一些实施方案中，所述受试者是人类受试者，并且所述受试者患有常染色体隐性遗传性耳聋9(DFNB9)。在一些实施方案中，受试者是前庭功能受损或具有前庭病症的人类受试者(参见，例如，Dulon等人，Otoferlin is Criticalfor a Highly Sensitive and Linear Calcium Dependent Exocytosis at VestibularHair Cell Ribbon Synapses.J Neurosci.2009；29(34):10474–10487)。
如本文所用的术语“治疗”疾病是指降低受试者经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重性。上述或本文其他地方所述的组合物通常以有效量(即能够产生所需结果的量)施用于受试者。所需结果将取决于所施用的活性剂。例如，AAV颗粒的有效量可以是能够将表达构建体转移至宿主器官、组织或细胞的颗粒的量。治疗上可接受的量可以是能够治疗疾病例如DFNB9的量。如在医学和兽医学领域中众所周知的，任何一个受试者的剂量取决于许多因素，包括受试者的大小、体表面积、年龄、待施用的特定组合物、组合物中的(一种或多种)活性成分、施用时间和途径、总体健康状况和同时施用的其他药物。
AAV颗粒或多核苷酸可以以组合物的形式递送，如包含活性成分(如本文所述的AAV颗粒)和如本文所述的药学上可接受的载体的组合物。可以将AAV颗粒或多核苷酸制备在多种组合物中，也可以将其配制在适当的药物媒介物中以施用于人或动物受试者。在一些实施方案中，在使用第一和第二AAV颗粒的情况下，第一和第二AAV颗粒可以包含在相同的组合物内或包含在不同的组合物内，并且可以一起或分开施用。
在一些实施方案中，可以以下浓度在组合物中提供施用于受试者的AAV颗粒：范围为106至1014个颗粒/ml或103至1015个颗粒/ml或者任一范围之间的任何值，例如约106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014个颗粒/ml。在一个实施方案中，施用高于1013个颗粒/ml的AAV颗粒。在一些实施方案中，施用于受试者的AAV颗粒的数量可以在106至1014个载体基因组(vg)/ml或103至1015vg/ml的范围内，或任一范围之间的任何值，例如约106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014vg/ml。在一个实施方案中，施用高于1013vg/ml的AAV颗粒。AAV颗粒可以以单剂量施用，或根据实现所治疗的特定疾病或病症的治疗可能需要分为两次或多次施用。在一些实施方案中，将0.0001ml至10ml递送至受试者。在一些实施方案中，施用于受试者的AAV颗粒的数量可以在106-1014vg/kg的范围内，或介于它们之间的任何值，例如约106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014vg/kg。在一些实施方案中，当施用如本文所述的包含第一多核苷酸的第一AAV颗粒和如本文所述的包含第二多核苷酸的第二AAV颗粒时，这两种颗粒的施用量相同。在一些实施方案中，当施用如本文所述的包含第一多核苷酸的第一AAV颗粒和如本文所述的包含第二多核苷酸的第二AAV颗粒时，每种颗粒的施用量不同。
如果需要，也可以将AAV颗粒与其他药剂或治疗联合使用，例如蛋白质或多肽或各种药学上有活性的药剂，包括治疗性多肽、其生物活性片段或变体的一次或多次全身或局部施用。实际上，对也可以包括在内的其他组分几乎没有限制，只要该另外的药物在与靶细胞或宿主组织接触时不引起明显的不利影响。因此，AAV颗粒可以与特定情况下所需的各种其他药剂或治疗一起递送。在一些实施方案中，AAV颗粒治疗可以伴随使用助听器。
在某些情况下，期望以本文公开的适当配制的药物组合物的形式通过皮下、肠胃外、静脉内、肌肉内、腹膜内、经口或鼻吸入或通过直接注射到一种或多种细胞、组织或器官中递送AAV颗粒。在一些实施方案中，施用是适合全身递送的途径，例如通过静脉内注射或输注。在一些实施方案中，施用是例如通过耳蜗内施用至耳朵。适用于注射用途的AAV颗粒组合物的药物形式包括无菌水性溶液或分散体。在一些实施方案中，剂型在存在易于注射能力的程度上是无菌的且是流体的。在一些实施方案中，剂型在生产和储存条件下是稳定的，并且以抗诸如细菌和真菌的微生物的污染作用的方式保存。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、盐水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的合适的混合物和/或植物油。可以例如通过使用包衣如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
例如，为了施用可注射的水性溶液，可以在必要时适当地缓冲溶液，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释液等渗。这些特定的水性溶液特别适合用于静脉内、肌肉内、玻璃体内、视网膜下、皮下和腹膜内施用。在这方面，可以使用的无菌水性介质对于本公开所属领域技术人员是已知的。例如，可以将一剂溶解在1ml等渗NaCl溶液中，或者添加到1000ml皮下输液中，或者在建议的输注部位注射(参见例如，“Remington'sPharmaceutical Sciences”，第15版，第1035-1038页和第1570-1580页)。根据治疗受试者的状况，剂量必然会发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人都将为个体受试者确定合适的剂量。此外，对于人类施用，制剂应符合无菌性、热原性以及例如FDA生物制品标准局(FDA Office of Biologics standards)要求的一般安全性和纯度标准。
通过将所需量的AAV颗粒与需要时的上文列举的几种其他成分掺入适当的溶剂中，然后通过过滤灭菌或另一种灭菌技术，来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入到无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自上文列举的那些所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生来自其先前无菌过滤的溶液的活性成分和任何其他所需成分的粉末。
AAV颗粒或多核苷酸组合物的量以及此类组合物的施用时间将在受益于本教导的技术人员的能力范围内。然而，很可能的是，施用治疗有效量的所公开的组合物可以通过单次施用来实现，例如单次注射足够数量的感染性颗粒以向接受这种治疗的患者提供治疗益处。或者，在一些情况下，可能期望在相对较短或相对较长的时间段内提供多次或连续的AAV颗粒组合物施用，这可以由监督此类组合物施用的医学从业者确定。
组合物可以单独地或与一种或多种其他活性成分组合地包括AAV颗粒，所述其他活性成分可以从天然或重组来源获得或化学合成。
可以通过标准药学程序，使用培养的细胞或实验动物来测定LD50(使该群体的50％致死的剂量)，来确定本公开方法中使用的组合物的毒性和功效。毒性和功效之间的剂量比是治疗指数，其可以表示为LD50/ED50之比。表现出大的治疗指数的那些组合物是优选的。虽然可以使用表现出毒副作用的药物，但应当注意设计一种将此类副作用的潜在损害降至最低的递送系统。本文所述的组合物的剂量通常在包括ED50且具有很少毒性或没有毒性的范围内。剂量可以在此范围内变化，取决于所采用的剂型和所使用的施用途径。
本公开的多方面涉及供受试者(如人或非人灵长类动物受试者)使用的方法。非人灵长类动物受试者的非限制性实例包括猕猴(例如食蟹猴或恒河猴)、狨猴、绢毛猴、蜘蛛猴、猫头鹰猴、长尾黑颚猴、松鼠猴、狒狒、大猩猩、黑猩猩和猩猩。在一些实施方案中，受试者是人类受试者。其他示例性受试者包括家养动物，如狗和猫；家畜，如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；以及其他动物，如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。
在一些实施方案中，受试者患有或疑似患有可以用基因疗法治疗的疾病。在一些实施方案中，受试者患有或疑似患有常染色体隐性遗传性耳聋9(DFNB9)。DFNB9是耳聋的常染色体隐性遗传形式，被认为是由OTOF基因的突变引起的，该突变导致耳畸蛋白的表达、功能或这两者的降低。已显示耳畸蛋白对听觉带状突触处的胞吐作用是重要的(参见，例如，Roux等人，Otoferlin,defective in a human deafness form,is essential forexocytosis at the auditory ribbon synapse.(2006)Cell 127(2):277-89)。患有DFNB9的受试者可以由有技能的医师来鉴定，例如，使用听性脑干反应(ABR)的电生理学测试和基因测试的组合以鉴定OTOF基因中的突变(参见，例如，OMIM条目603681和601071)。在一些实施方案中，受试者是在OTOF基因中具有一个或多个以下无义或错义突变的人类受试者：TYR730TER、GLN829TER、PRO1825ALA、PRO50ARG、LEU1011PRO、ILE515THR、ARG1939GLN或GLY541SER。在一些实施方案中，受试者是在内含子8/外显子9接合处具有A-G转变(IVS8-2A-G)或在+1位(外显子5的剪接供体位点中的第一内含子核苷酸)具有G-A转变或在内含子39的供体剪接位点中具有G-C转化的人类受试者。在一些实施方案中，受试者是在外显子16中具有导致终止密码子的一个碱基对缺失(1778G)以及在外显子48中具有导致ARG-GLN取代的6141G-A改变的人类受试者。
组合物
本公开的其他方面涉及包含本文所述的AAV颗粒或多核苷酸的组合物。在一些实施方案中，将本文所述的AAV颗粒添加至组合物(例如药物组合物)中。
在一些实施方案中，组合物包含药学上可接受的载体。术语“载体”是指与AAV颗粒一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这样的药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油如矿物油，植物油如花生油、大豆油和芝麻油，动物油或合成来源的油的那些。盐水溶液以及右旋糖和甘油水性溶液也可以用作液体载体。药学上可接受的载体的非限制性实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水、糖浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚丙烯酸、润滑剂(如滑石、硬脂酸镁和矿物油)、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯、乙酯和丙酯)以及pH调节剂(如无机和有机酸和碱)。载体的其他实例包括磷酸盐缓冲盐水、HEPES缓冲盐水和注射用水，它们中的任何一种都可以任选地与以下成分中的一种或多种组合：二水氯化钙、无水磷酸二钠、六水合氯化镁、氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钠或蔗糖。可以使用的其他载体实例包括盐水(例如灭菌的、无热原的盐水)、盐水缓冲液(例如柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和碳酸氢盐缓冲液)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露糖醇、山梨糖醇和甘油。USP级载体和赋形剂对于将AAV颗粒递送至人类受试者是特别有用的。这样的组合物可以进一步任选地包含脂质体、脂质、脂质复合物、微球、微颗粒、纳米球或纳米颗粒，或者可以以其他方式配制以施用于有此需要的受试者的细胞、组织、器官或身体。制备此类组合物的方法是众所周知的，并且可以在例如以下文献中找到：Remington:TheScience and Practice of Pharmacy，第22版，Pharmaceutical Press,2012。
通常，此类组合物可以含有至少约0.1％的治疗剂(例如，AAV颗粒)或更多，尽管(一种或多种)活性成分的百分比当然可以变化并且可以方便地在总制剂重量或体积的约1或2％至约70％或80％或更多之间。自然地，可以以在化合物的任何给定单位剂量中获得合适剂量的方式来制备各种治疗上有用的组合物中的(一种或多种)治疗剂(例如，AAV颗粒)的量。制备此类药物制剂的领域的技术人员将考虑诸如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学考量因素等因素，因此，多种剂量和治疗方案可能是期望的。
在一些实施方案中，本文所述的组合物可以施用于有此需要的受试者，例如患有DFNB9的受试者。在一些实施方案中，本文所述的方法可以包括向有此需要的受试者施用包含本文所述的AAV颗粒的组合物或多种组合物。在一些实施方案中，受试者是人类受试者。在一些实施方案中，受试者患有或疑似患有可以用基因疗法治疗的疾病，如DFNB9。在一些实施方案中，受试者已被诊断患有DFNB9。
试剂盒
本公开的其他方面涉及在一个或多个容器中包含如本文所述的AAV颗粒或多核苷酸的试剂盒。试剂盒可以任选地包括药学上可接受的载体和/或稀释剂。在一些实施方案中，试剂盒包括说明书或包装材料，其描述了如何将试剂盒内含有的AAV颗粒或多核苷酸施用于选择的细胞或接受者。试剂盒的容器可以是任何合适的材料，例如玻璃、塑料、金属等，并且可以具有任何合适的尺寸、形状或构造。在一些实施方案中，试剂盒可以包括一个或多个安瓿或注射器，其含有合适的液体或溶液形式的AAV颗粒或多核苷酸。
实施例
使用腺相关病毒基因治疗方法拯救OTOF敲除小鼠的听力
介绍
耳畸蛋白是耳中神经递质释放的关键钙传感器(参见，例如，Roux2006)。耳畸蛋白主要在耳蜗的内毛细胞中表达，以及在中枢神经系统的仅几种其他细胞中表达(参见，例如，Yasunaga等人，1999&2000)。它是具有共有的C2结构域的跨膜蛋白的ferlin家族的一员，该共有的C2结构域也在突触结合蛋白、PKC和PLC中被发现。
编码人耳畸蛋白的人OTOF基因中的突变导致一种非综合征型耳聋，称为常染色体隐性遗传性耳聋9(DFNB9)。尽管存在正常的内毛细胞发育和听觉带状突触形成，但OTOF敲除小鼠也表现出严重的听力丧失(参见，例如，Roux等人(2006)Otoferlin,defective in ahuman deafness form,is essential for exocytosis at the auditory ribbonsynapse.Cell.127:277–289)。然而，由于完全消除了突触胞吐作用，并因此消除了从突触囊泡释放神经递质，Otof-/-小鼠在所有声音频率上都失去了听性脑干反应。
DFNB9在人中表现出两种表型，表现为在获得语言之前出现的非综合征型双侧听力丧失，而较少表现为温度敏感型非综合征型听觉神经病。它是在黎巴嫩的一个受感染的家庭中首次发现的(Chaib等人，1996)，此后在世界许多地方被发现(参见，例如，Adato等人，2000；Rodriguez-Ballesteros等人，2003；Choi等人，2009；Matsunaga等人，2012)。
目前患有DFNB9的人的治疗方法使用耳蜗植入体和助听器。此外，对于温度敏感型DFNB9，预防发热和其他可能导致体温升高的病况是重要的。申请人寻求使用腺相关病毒(AAV)作为恢复敲除小鼠中OTOF表达的手段，作为使用AAV递送OTOF作为DFNB9治疗的概念验证。小鼠OTOF cDNA的长度为5979个碱基对，而大多数AAV不能包装超过约4.8千碱基的基因组。结果，使用双载体系统将cDNA的5’部分和cDNA的3’部分作为单独的AAV构建体分别递送，使得一旦递送就可以在体内重新装配全长cDNA。
方法
双AAV载体构建体
将小鼠OTOF cDNA分成两个部分：5’和3’部分，并插入到两个含AAV ITR的质粒中。质粒中两个盒各自的序列如下所示，并且每种构建体的图谱显示在图1和2中。带有注释的盒版本在图3A和3B中示出。每个盒含有同源性区域，以促进体内cDNA的5’和3’端之间的同源性重组(参见Ghosh等人，2011)。一旦在体内重组，全长cDNA含有剪接供体/剪接受体对，其导致剪接出同源性区域。使用以前描述的标准质粒转染方法将载体包装到AAV2血清型颗粒中(参见Zolotukhin等人，Production and purification of serotype 1,2,and5recombinant adeno-associated viral vectors.Methods 28(2002)158–167)。通过以前描述的标准方法纯化病毒颗粒(参见Zolotukhin等人，Production and purification ofserotype 1,2,and 5recombinant adeno-associated viral vectors.Methods 28(2002)158–167)。携带OTOF cDNA的5’部分的病毒颗粒在本文中也称为“AAV2-OTOF-NT”。携带OTOFcDNA的3’部分的病毒颗粒在本文中也称为“AAV2-OTOF-CT”。
pTR22-smCBA-耳畸蛋白NT-APSD-AP头
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ID NO:1)
pTR22-AP头-APSA-耳畸蛋白CT
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ID NO:2)
HEK 293细胞的转染
HEK 293细胞在生长培养基中在聚赖氨酸包被的盖玻片上生长。将1μl的每种病毒如下用于每个孔：不含病毒的对照细胞、具有AAV2-OTOF n-末端部分的细胞(AAV2-OTOF-NT)、具有AAV2-OTOF c-末端部分的细胞(AAV2-OTOF-CT)以及带有这两种病毒的细胞(AAV2-OTOF-NT和AAV2-OTOF-CT)。用抗OTOF抗体将细胞染色并封固在载玻片上。
OTOF敲除小鼠
使用的OTOF敲除小鼠是在以前的研究中产生的(参见Roux等人(2006)Otoferlin,defective in a human deafness form,is essential for exocytosis at theauditory ribbon synapse.Cell.127:277–289)。简而言之，通过PCR扩增含有Otof的外显子14和15的5’和3’的基因组序列的两个片段。将5kb BamHI-XhoI-BssHII和6kb BssHII-SfiI-BamHI-NaeI 129/SvPas片段插入到先前通过插入BamHI-XhoI-BssHII-SfiI-NaeI-HindIII多接头修饰的pUC19(New England BioLabs)中。将loxP-hygro-loxP(在磷酸甘油酸激酶基因[Pgk-1]启动子控制下赋予对潮霉素的抗性的基因)盒插入到BssHII位点中。对所有构建体进行测序，并将获得的序列与129/SvPas基因组序列进行比较。通过Southern印迹分析筛选对潮霉素具有抗性的282CK35 ES细胞的同源性重组和单插入事件。将两个克隆注射到C57BL/6N胚泡中以创建嵌合动物。通过PCR在刺鼠幼仔中检测到突变的Otof等位基因的传递。在混合的C57BL/6-129/SvPas背景下，F1后代中的阳性幼崽与Pgk-1-cre小鼠杂交。使用引物5’-CACTTGCTTTGTCT CATCTCC-3’(SEQ ID NO:12)和5’-GTCACTTCTTCTGGGTATTTC-3’(SEQ ID NO:13)，通过PCR选择携带缺失潮霉素选择盒的等位基因(Otof tm1Ugds等位基因)的F2动物，产生507个碱基对的PCR产物。使杂合动物进行交配以产生Otof-/-、Otof+/-和Otof+/+小鼠。如上所述，在C57BL/6-129/SvPas背景中产生敲除小鼠。因为已知该背景品系具有一些与年龄有关的听力丧失，所以将小鼠与FVB小鼠品系回交至第10代以获得没有已知的与年龄有关的听力丧失的FVB同质遗传背景。
AAV递送至小鼠
如先前所述，使用圆窗膜(RWM)注射法对OTOF敲除小鼠(新生的和大于P10)注射1微升的两种AAV构建体中每一种的病毒颗粒(参见Akil等人(2012)Restoration ofHearing in the VGLUT3 Knockout Mouse Using Virally-Mediated GeneTherapy.Neuron.75(2):283–293和Akil等人(2015)Surgical Method for VirallyMediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round WindowMembrane.J.Vis.Exp.(97),e52187)。将AAV2-OTOF-NT(6.32x1012vg/ml)和AAV2-OTOF-CT(4.5x1012vg/ml)通过RWM递送至P1-3小鼠。将AAV2-OTOF-NT(1.43x1013vg/ml)和AAV2-OTOF-CT(3.12x1013vg/ml)通过RWM递送至P≥12小鼠。注射后7天进行ABR测试。通过使用抗-OTOF抗体标记在耳蜗整体封固物中的细胞来测量小鼠中OTOF蛋白的表达。使用逆转录酶(RT)-PCR来筛选小鼠耳蜗组织内OTOF mRNA的存在。还使用相同的技术对野生型小鼠注射AAV2-GFP，以评估病毒向AAV2血清型耳蜗的递送。将耳蜗整体封固并用抗-GFP抗体染色。
听性脑干反应(ABR)测试
如以前所述(Akil等人(2006)Progressive deafness and altered cochlearinnervation in knockout mice lacking prosaposin.J.Neurosci.26:13076–13088和Akil等人(2016)Mouse Auditory Brainstem Response Testing.Bio Protoc.6(6))对耳畸蛋白敲除(OTOF KO)小鼠、拯救的OTOF KO小鼠和野生型(WT)同窝仔进行听力测试。简而言之，所有听觉测试均在隔音室中进行。在进行声学测试之前，通过腹膜内注射盐酸氯胺酮(Ketaset，100mg/ml)和盐酸甲苯噻嗪(xyla-ject，10mg/ml)的混合物使小鼠麻醉，并按照要求用原始剂量的五分之一进行加强。在整个记录过程中，用加热垫保持体温，并用直肠探针进行监测。
从小鼠的头皮差异记录诱发的听性脑干反应(ABR)阈值。使用皮下针电极在尖端、左耳耳廓下方(参考)和对侧耳下方(背景)记录反应。所使用的声音刺激包括短声(持续时间5ms，31Hz)和8、16和32kHz的短音(持续时间10ms，cos2波形，21Hz)。使用TDT BioSig III系统(Tucker Davis Technologies)记录测量结果。对于每种刺激，记录20ms的脑电图(EEG)活动(采样速率为25kHz)并进行滤波(0.3–3kHz)。平均来自512个刺激的波形的短声反应。检查了来自1000个刺激的波形，以识别频率特异性短纯音刺激(8、16和32kHz)。从最大振幅向下以5dB声压级(SPL)间隔记录ABR波形。该阈值被定义为最低刺激水平，在该水平下目视检查时清晰且重复地出现波I-V的反应峰。这些阈值判断通过分析存储的波形而得到确认。使用单向ANOVA及Bonferroni事后检验来进行每组动物的比较。
结果
产生两种不同的AAV质粒构建体以将小鼠OTOF cDNA的5’半和3’半递送至OTOF敲除小鼠的内耳(OTOF N-末端病毒和OTOF C-末端病毒)。将两种构建体分别包装到AAV2颗粒中。然后将AAV2颗粒汇集在一起，并用于处理HEK 293细胞，或注射到OTOF敲除小鼠的内耳中。
已经显示，当用这两种病毒转染时，HEK 293细胞仅表达耳畸蛋白(图4)。在未经处理的细胞中或在仅用OTOF N-末端病毒(图4)或OTOF C-末端病毒转染的细胞中未观察到耳畸蛋白的表达。
接下来，使用AAV2-GFP报告病毒评估AAV2转导小鼠耳蜗的能力。已经显示，AAV2转染了许多细胞类型，包括Corti器官中的内毛细胞(IHC)、外毛细胞(OHC)、柱细胞(P)和其他支持细胞(SC)(图5)。因此，AAV2可以有效地转导小鼠耳蜗。
然后用合并的OTOF N-末端和C-末端病毒处理小鼠，并与各种对照进行比较。发现在用这两种病毒处理后均表达耳畸蛋白(图6)。在基部观察到最大数量的转染的内毛细胞(IHC)，而在中弯和尖端处观察到较少的数量(图6)。IHC计数表明总体上～11％的IHC被标记，在基部(～29％)、中弯(～8％)和尖端(～2％)之间存在显著差异。(图6)。使用RT-PCR显示OTOF mRNA在整个耳蜗提取物中，并且在用两种病毒处理的野生型和OTOF敲除小鼠中具有相同的大小(图6)。相比之下，未经处理的OTOF基因敲除小鼠耳蜗未显示OTOF mRNA表达。在不存在逆转录酶的情况下进行RT-PCR时未检测到产物。
接下来，进行听力测试，以确定通过传递N-末端和C-末端病毒二者表达的耳畸蛋白是否能够拯救听力功能。来自野生型和用这两种病毒处理的OTOF敲除小鼠的ABR波形相似，证明了在拯救的KO小鼠中听力恢复，而未经处理的OTOF敲除小鼠对照和仅用OTOF N-末端病毒转染的OTOF敲除小鼠显示听力没有恢复(图7)。在P70时，在用这两种病毒处理的OTOF敲除小鼠中在短声以及在8、16和32kHz的特定频率下观察到部分听力恢复(改善的ABR阈值)，而在8和16kHz下ABR阈值似乎略有升高，但是仍显著好于未经处理的OTOF敲除小鼠(图7)。值得注意的是，在用这两种病毒处理的OTOF敲除小鼠(KO NT+CT)中听力维持超过4个月的时间(图7)，尽管ABR阈值是略微可变的。未转染的KO对照和用OTOF NT转染的KO仍保持耳聋(图7)。
接下来，用这两种病毒处理大于P12的OTOF敲除小鼠。双转染的IHC表达OTOF，在基部(未显示)和尖端(图8)中可见同质的转染率。IHC计数表明总体上标记了～41％的IHC，在基部(～38％)、中弯(～42％)和尖端(～47％)之间可见细微差异(图8)。
在P60时，所有用这两种病毒处理的OTOF敲除小鼠均对短声刺激表现出正常的ABR阈值，而在8、16和32kHz的特定频率下，ABR阈值似乎略有升高，但是仍显著好于未经处理的OTOF敲除小鼠(图9)。将这两种病毒注射到年龄大于P12的OTOF敲除小鼠中后，听力恢复的时间进程表明，在经过处理的小鼠中听力保持超过30周，并且ABR阈值恢复到了WT水平(图9)。
这些结果表明，使用多于一种的AAV构建体递送OTOF cDNA的不同部分可以在体内产生功能性cDNA。这些结果还表明，可以通过使用AAV递送系统递送OTOF cDNA来治疗听力丧失。
实施例2：人OTOF双载体构建体
下面提供了用于表达人耳畸蛋白同种型1和5的示例性双载体序列。编码同种型1和5的cDNA含有相同的N-末端序列，使得相同的N-末端载体可用于表达这两个同种型。对应于以下序列的载体图和带有注释的序列在图10-15中示出。
pTR22-smCBA-耳畸蛋白NT Hs var 1+5-APSD-AP头
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pTR22-AP头-APSA-耳畸蛋白CT Hs var 1
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ID NO:15)
pTR22-AP头-APSA-耳畸蛋白CT Hs var 5
AGGGGGGGGGGGGGGGGGGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTCAGATCTGGCGCGCCCAATTGGCTTCGAATTCTAGCGGCCGCCCCCGGGTGCGCGGCGTCGGTGGTGCCGGCGGGGGGCGCCAGGTCGCAGGCGGTGTAGGGCTCCAGGCAGGCGGCGAAGGCCATGACGTGCGCTATGAAGGTCTGCTCCTGCACGCCGTGAACCAGGTGCGCCTGCGGGCCGCGCGCGAACACCGCCACGTCCTCGCCTGCGTGGGTCTCTTCGTCCAGGGGCACTGCTGACTGCTGCCGATACTCGGGGCTCCCGCTCTCGCTCTCGGTAACATCCGGCCGGGCGCCGTCCTTGAGCACATAGCCTGGACCGTTTCCTTAAGCGACGCATGCTCGCGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGAAAACATGGGGCAGCAGGCCAGGATGCTGCGGGCCCAGGTGAAGCGGCACACGGTGCGGGACAAGCTGAGGCTGTGCCAGAACTTCCTGCAGAAGCTGCGCTTCCTGGCGGACGAGCCCCAGCACAGCATTCCCGACATCTTCATCTGGATGATGAGCAACAACAAGCGTGTCGCCTATGCCCGTGTGCCCTCCAAGGACCTGCTCTTCTCCATCGTGGAGGAGGAGACTGGCAAGGACTGCGCCAAGGTCAAGACGCTCTTCCTTAAGCTGCCAGGGAAGCGGGGCTTCGGCTCGGCAGGCTGGACAGTGCAGGCCAAGGTGGAGCTGTACCTGTGGCTGGGCCTCAGCAAACAGCGCAAGGAGTTCCTGTGCGGCCTGCCCTGTGGCTTCCAGGAGGTCAAGGCAGCCCAGGGCCTGGGCCTGCATGCCTTCCCACCCGTCAGCCTGGTCTACACCAAGAAGCAGGCGTTCCAGCTCCGAGCGCACATGTACCAGGCCCGCAGCCTCTTTGCCGCCGACAGCAGCGGACTCTCAGACCCCTTTGCCCGCGTCTTCTTCATCAATCAGAGTCAGTGCACAGAGGTGCTGAATGAGACCCTGTGTCCCACCTGGGACCAGATGCTGGTGTTCGACAACCTGGAGCTCTATGGTGAAGCTCATGAGCTGAGGGACGATCCGCCCATCATTGTCATTGAAATCTATGACCAGGATTCCATGGGCAAAGCTGACTTCATGGGCCGGACCTTCGCCAAACCCCTGGTGAAGATGGCAGACGAGGCGTACTGCCCACCCCGCTTCCCACCTCAGCTCGAGTACTACCAGATCTACCGTGGCAACGCCACAGCTGGAGACCTGCTGGCGGCCTTCGAGCTGCTGCAGATTGGACCAGCAGGGAAGGCTGACCTGCCCCCCATCAATGGCCCGGTGGACGTGGACCGAGGTCCCATCATGCCCGTGCCCATGGGCATCCGGCCCGTGCTCAGCAAGTACCGAGTGGAGGTGCTGTTCTGGGGCCTACGGGACCTAAAGCGGGTGAACCTGGCCCAGGTGGACCGGCCACGGGTGGACATCGAGTGTGCAGGGAAGGGGGTGCAGTCGTCCCTGATCCACAATTATAAGAAGAACCCCAACTTCAACACCCTCGTCAAGTGGTTTGAAGTGGACCTCCCAGAGAACGAGCTGCTGCACCCGCCCTTGAACATCCGTGTGGTGGACTGCCGGGCCTTCGGTCGCTACACACTGGTGGGCTCCCATGCCGTCAGCTCCCTGCGACGCTTCATCTACCGGCCCCCAGACCGCTCGGCCCCCAGCTGGAACACCACGGTCAGGCTTCTCCGGCGCTGCCGTGTGCTGTGCAATGGGGGCTCCTCCTCTCACTCCACAGGGGAGGTTGTGGTGACTATGGAGCCAGAGGTACCCATCAAGAAACTGGAGACCATGGTGAAGCTGGACGCGACTTCTGAAGCTGTTGTCAAGGTGGATGTGGCTGAGGAGGAGAAGGAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGGGCACTGCGGAGGAGCCAGAGGAGGAGGAGCCAGACGAGAGCATGCTGGACTGGTGGTCCAAGTACTTTGCCTCCATTGACACCATGAAGGAGCAACTTCGACAACAAGAGCCCTCTGGAATTGACTTGGAGGAGAAGGAGGAAGTGGACAATACCGAGGGCCTGAAGGGGTCAATGAAGGGCAAGGAGAAGGCAAGGGCTGCCAAAGAGGAGAAGAAGAAGAAAACTCAGAGCTCTGGCTCTGGCCAGGGGTCCGAGGCCCCCGAGAAGAAGAAACCCAAGATTGATGAGCTTAAGGTATACCCCAAAGAGCTGGAGTCCGAGTTTGATAACTTTGAGGACTGGCTGCACACTTTCAACTTGCTTCGGGGCAAGACCGGGGATGATGAGGATGGCTCCACCGAGGAGGAGCGCATTGTGGGACGCTTCAAGGGCTCCCTCTGCGTGTACAAAGTGCCACTCCCAGAGGACGTGTCCCGGGAAGCCGGCTACGACTCCACCTACGGCATGTTCCAGGGCATCCCGAGCAATGACCCCATCAATGTGCTGGTCCGAGTCTATGTGGTCCGGGCCACGGACCTGCACCCTGCTGACATCAACGGCAAAGCTGACCCCTACATCGCCATCCGGCTAGGCAAGACTGACATCCGCGACAAGGAGAACTACATCTCCAAGCAGCTCAACCCTGTCTTTGGGAAGTCCTTTGACATCGAGGCCTCCTTCCCCATGGAATCCATGCTGACGGTGGCTGTGTATGACTGGGACCTGGTGGGCACTGATGACCTCATTGGGGAAACCAAGATCGACCTGGAGAACCGCTTCTACAGCAAGCACCGCGCCACCTGCGGCATCGCCCAGACCTACTCCACACATGGCTACAATATCTGGCGGGACCCCATGAAGCCCAGCCAGATCCTGACCCGCCTCTGCAAAGACGGCAAAGTGGACGGCCCCCACTTTGGGCCCCCTGGGAGAGTGAAGGTGGCCAACCGCGTCTTCACTGGGCCCTCTGAGATTGAGGACGAGAACGGTCAGAGGAAGCCCACAGACGAGCATGTGGCGCTGTTGGCCCTGAGGCACTGGGAGGACATCCCCCGCGCAGGCTGCCGCCTGGTGCCAGAGCATGTGGAGACGAGGCCGCTGCTCAACCCCGACAAGCCGGGCATCGAGCAGGGCCGCCTGGAGCTGTGGGTGGACATGTTCCCCATGGACATGCCAGCCCCTGGGACGCCTCTGGACATCTCACCTCGGAAGCCCAAGAAGTACGAGCTGCGGGTCATCATCTGGAACACAGATGAGGTGGTCTTGGAGGACGACGACTTCTTCACAGGGGAGAAGTCCAGTGACATCTTCGTGAGGGGGTGGCTGAAGGGCCAGCAGGAGGACAAGCAGGACACAGACGTCCACTACCACTCCCTCACTGGCGAGGGCAACTTCAACTGGCGCTACCTGTTCCCCTTCGACTACCTGGCGGCGGAGGAGAAGATCGTCATCTCCAAGAAGGAGTCCATGTTCTCCTGGGACGAGACCGAGTACAAGATCCCCGCGCGGCTCACCCTGCAGATCTGGGATGCGGACCACTTCTCCGCTGACGACTTCCTGGGGGCCATCGAGCTGGACCTGAACCGGTTCCCGCGGGGCGCAAAGACAGCCAAGCAGTGCACCATGGAGATGGCCACCGGGGAGGTGGACGTGCCCCTCGTGTCCATCTTCAAGCAAAAGCGCGTCAAAGGCTGGTGGCCCCTCCTGGCCCGCAATGAGAACGATGAGTTTGAGCTCACGGGCAAGGTGGAGGCTGAGCTGCATTTACTGACAGCAGAGGAGGCAGAGAAGAACCCAGTGGGCCTGGCCCGCAATGAACCTGACCCCCTAGAGAAACCCAACCGGCCCGACACGGCCTTCGTCTGGTTCCTCAACCCTCTCAAGTCCATCAAGTACCTCATCTGCACCCGGTACAAGTGGCTCATCATCAAGATCGTGCTGGCGCTGTTGGGGCTGCTCATGTTGGGGCTCTTCCTCTACAGCCTCCCTGGCTACATGGTCAAAAAGCTCCTTGGGGCATGAGCGGCCGCGGTACCAAGGGCGAATTCTGCAGTCGACTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGACTAGTCCGTCGACTGTTAATTAAGCATGCTGGGGAGAGATCTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACCCCCCCCCCCCCCCCCCTGCAGCCCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGAAATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCGCGCCATTCGCCATTCAGGCTACGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGGCTGC(SEQ ID NO:16)
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其他实施方案
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合方式组合。本说明书中公开的每个特征可以被用于相同、等同或类似目的的替代特征替换。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是通用的等同或类似特征系列的示例。
根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本公开的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本公开进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其他实施方案也在权利要求的范围内。
等同方案
虽然本文已经描述和说明了若干发明实施方案，但是本领域普通技术人员将容易想到用于执行本文描述的功能和/或获得本文描述的结果和/或一个或多个优点的各种其他装置和/或结构，并且，这些变化和/或修改中的每一个被认为是在本文描述的发明实施方案的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解，本文描述的所有参数、尺寸、材料和配置都是示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或配置将取决于特定应用或本发明教导用于的应用。本领域技术人员将认识到或者能够使用不超过常规的实验确定本文描述的具体发明实施方案的许多等同方案。因此，应该理解，前述实施方案仅作为示例呈现，并且在所附权利要求及其等同方案的范围内，本发明的实施方案能够以不同于具体描述和要求保护的方式实施。本公开的发明实施方案涉及本文描述的每个单独的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果这些特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法不相互矛盾，则两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合包括在本公开的发明范围内。
如本文定义和使用的所有定义，应理解为由字典定义、通过引用并入的文献中的定义和/或所定义术语的普通含义确定。
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请均就各自所引用的主题通过引用并入本文，其在某些情况下可以涵盖整个文件。
除非明确相反指出，否则本说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一个(种)”应理解为表示“至少一个(种)”。
本说明书和权利要求书中使用的短语“和/或”应理解为表示由如此结合的要素中的“一个或两个”，即在某些情况下要素共同存在，以及在其他情况下分开存在。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式解释，即，如此结合的要素中的“一个或多个”。除了“和/或”从句所具体标识的要素之外，可任选存在其他要素，而不论与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性示例，当与诸如“包含”的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的提及在一个实施方案中可以仅指A(任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，仅指B(任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，仅A和B两者(任选地包括其他要素)；等等。
如本说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为具有与如上文所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即包含许多要素或要素列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及任选的其他未列出的项目。只有术语明确相反地指出，如“仅一个”或“唯一一个”，或者当在权利要求中使用时，“由...组成”将指的是包含许多要素或要素列表中的唯一一个要素。一般而言，在排他性术语之前，如“任一”、“之一”、“仅一个”或“唯一一个”，本文所用的术语“或”仅应解释为表示排他性的替代方案(即“一个或另一个，而不是两个”)。“基本上由......组成”在用于权利要求时，应具有其在专利法领域中使用的普通含义。
如本说明书和权利要求书中所使用的，关于一个或多个要素的列表，短语“至少一个”应理解为表示从要素列表中任何一个或多个要素中选择的至少一个要素，但不一定包括要素列表内具体列出的每个要素中的至少一个要素和每一个要素，并且不排除要素列表中要素的任何组合。该定义还允许任选地存在短语“至少一个”所指要素列表内所具体标识的要素之外的要素，无论是与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性示例，“A和B中的至少一个”(或等同地“A或B中的至少一个”；或等同地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可以是指至少一个，任选地包括多于一个，A但不存在B(并且任选地包括除B之外的要素)；在另一个实施方案中，是指至少一个，任选地包括多于一个，B但不存在A(并且任选地包括除A之外的要素)；在又一个实施方案中，是指至少一个，任选地包括多于一个，A，以及至少一个，任选地包括多于一个，B(并且任选地包括其他要素)；等等。
还应理解，除非明确相反地指出，否则在本文要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不必限于所列举的方法的步骤或动作的顺序。
在权利要求书中以及在上述说明书中，所有过渡短语，如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“组成”(composed of)等应理解为开放式的，即表示包括但不限于。只有过渡短语“由......组成”和“基本上由......组成”应分别是封闭或半封闭的过渡短语，如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节所述。
序列表
<110> 佛罗里达大学研究基金会（University of Florida Research Foundation,Incorporated）
加利福尼亚州立大学董事会（The Regents of the University of California）
<120> 表达耳畸蛋白的组合物和方法
<130> U1197.70110WO00
<150> US 62/502,462
<151> 2017-05-05
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7009
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> pTR22-smCBA-耳畸蛋白NT-APSD-AP头
<400> 1
aggggggggg gggggggggt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 60
cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg 120
agcgcgcaga gagggagtgg ccaactccat cactaggggt tcctcagatc tggcgcgccc 180
aattcggtac cctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 240
tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 300
cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 360
ccattgacgt caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 420
gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 480
ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 540
catcgctatt accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc 600
cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg 660
ggcggggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg 720
ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt 780
tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt 840
cgctgcgacg ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900
ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960
gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020
ttgaggggct ccgggagcta gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct 1080
acagctcctg ggcaacgtgc tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattcta 1140
gcggccgcca ccatggccct gattgttcac ctcaagactg tctcagagct ccgaggcaaa 1200
ggtgaccgga ttgccaaagt cactttccga gggcagtctt tctactcccg ggtcctggag 1260
aactgcgagg gtgtggctga ctttgatgag acgttccggt ggccagtggc cagcagcatc 1320
gaccggaatg aagtgttgga gattcagatt ttcaactaca gcaaagtctt cagcaacaag 1380
ctgataggga ccttctgcat ggtgctgcag aaagtggtgg aggagaatcg ggtagaggtg 1440
accgacacgc tgatggatga cagcaatgct atcatcaaga ccagcctgag catggaggtc 1500
cggtatcagg ccacagatgg cactgtgggc ccctgggatg atggagactt cctgggagat 1560
gaatccctcc aggaggagaa ggacagccag gagacagatg ggctgctacc tggttcccga 1620
cccagcaccc ggatatctgg cgagaagagc tttcgcagca aaggcagaga gaagaccaag 1680
ggaggcagag atggcgagca caaagcggga aggagtgtgt tctcggccat gaaactcggc 1740
aaaactcggt cccacaaaga ggagccccaa agacaagatg agccagcagt gctggagatg 1800
gaggacctgg accacctagc cattcagctg ggggatgggc tggatcctga ctccgtgtct 1860
ctagcctcgg tcaccgctct caccagcaat gtctccaaca aacggtctaa gccagatatt 1920
aagatggagc ccagtgctgg aaggcccatg gattaccagg tcagcatcac agtgattgag 1980
gctcggcagc tggtgggctt gaacatggac cctgtggtgt gtgtggaggt gggtgatgac 2040
aagaaataca cgtcaatgaa ggagtccaca aactgccctt actacaacga gtactttgtc 2100
ttcgacttcc atgtctctcc tgatgtcatg tttgacaaga tcatcaagat ctcggttatc 2160
cattctaaga acctgcttcg gagcggcacc ctggtgggtt ccttcaaaat ggatgtgggg 2220
actgtgtatt cccagcctga acaccagttc catcacaaat gggccatcct gtcagacccc 2280
gatgacatct ctgctgggtt gaagggttat gtaaagtgtg atgtcgctgt ggtgggcaag 2340
ggagacaaca tcaagacacc ccacaaggcc aacgagacgg atgaggacga cattgaaggg 2400
aacttgctgc tccccgaggg cgtgcccccc gaacggcagt gggcacggtt ctatgtgaaa 2460
atttaccgag cagagggact gccccggatg aacacaagcc tcatggccaa cgtgaagaag 2520
gcgttcatcg gtgagaacaa ggacctcgtc gacccctatg tgcaagtctt ctttgctgga 2580
caaaagggca aaacatcagt gcagaagagc agctatgagc cgctatggaa tgagcaggtc 2640
gtcttcacag acttgttccc cccactctgc aaacgcatga aggtgcagat ccgggactct 2700
gacaaggtca atgatgtggc catcggcacc cacttcatcg acctgcgcaa gatttccaac 2760
gatggagaca aaggcttcct gcctaccctc ggtccagcct gggtgaacat gtacggctcc 2820
acgcgcaact acacactgct ggacgagcac caggacttga atgaaggcct gggggagggt 2880
gtgtccttcc gggcccgcct catgttggga ctagctgtgg agatcctgga cacctccaac 2940
ccagagctca ccagctccac ggaggtgcag gtggagcagg ccacgcctgt ctcggagagc 3000
tgcacaggga gaatggaaga attttttcta tttggagcct tcttggaagc ctcaatgatt 3060
gaccggaaaa atggggacaa gccaattacc tttgaggtga ccataggaaa ctacggcaat 3120
gaagtcgatg gtatgtcccg gcccctgagg cctcggcccc ggaaagagcc tggggatgaa 3180
gaagaggtag acctgattca gaactccagt gacgatgaag gtgacgaagc cggggacctg 3240
gcctcggtgt cctccacccc acctatgcgg ccccagatca cggacaggaa ctatttccac 3300
ctgccctacc tggagcgcaa gccctgcatc tatatcaaga gctggtggcc tgaccagagg 3360
cggcgcctct acaatgccaa catcatggat cacattgctg acaagctgga agaaggcctg 3420
aatgatgtac aggagatgat caaaacggag aagtcctacc cggagcgccg cctgcggggt 3480
gtgctagagg aactcagctg tggctgccac cgcttcctct ccctctcgga caaggaccag 3540
ggccgctcgt cccgcaccag gctggatcga gagcgtctta agtcctgtat gagggagttg 3600
gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 3660
cagagaagac tcttgcgttt ctgagctagc ccccgggtgc gcggcgtcgg tggtgccggc 3720
ggggggcgcc aggtcgcagg cggtgtaggg ctccaggcag gcggcgaagg ccatgacgtg 3780
cgctatgaag gtctgctcct gcacgccgtg aaccaggtgc gcctgcgggc cgcgcgcgaa 3840
caccgccacg tcctcgcctg cgtgggtctc ttcgtccagg ggcactgctg actgctgccg 3900
atactcgggg ctcccgctct cgctctcggt aacatccggc cgggcgccgt ccttgagcac 3960
atagcctgga ccgtttcgtc gactgttaat taagcatgct ggggagagat ctaggaaccc 4020
ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgcccgg 4080
gcaaagcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 4140
agagagggag tggccaaccc cccccccccc ccccctgcag ccctgcatta atgaatcggc 4200
caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 4260
tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 4320
cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 4380
aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 4440
gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 4500
agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 4560
cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca 4620
cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 4680
ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 4740
gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 4800
tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg 4860
acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 4920
tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 4980
attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 5040
gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 5100
ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 5160
taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 5220
ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 5280
ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 5340
gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 5400
ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 5460
gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 5520
tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 5580
atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 5640
gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 5700
tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 5760
atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 5820
agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 5880
ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 5940
tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 6000
aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 6060
tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 6120
aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa 6180
accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc 6240
gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca 6300
gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt 6360
ggcgggtgtc ggggctggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac 6420
catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggaaattg 6480
taaacgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta 6540
accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt 6600
tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca 6660
aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca ccctaatcaa 6720
gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat 6780
ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag 6840
gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg 6900
ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt cgcgccattc gccattcagg ctacgcaact 6960
gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccaggctgc 7009
<210> 2
<211> 7413
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> pTR22-AP头-APSA-耳畸蛋白CT
<400> 2
aggggggggg gggggggggt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 60
cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg 120
agcgcgcaga gagggagtgg ccaactccat cactaggggt tcctcagatc tggcgcgccc 180
aattggcttc gaattctagc ggccgccccc gggtgcgcgg cgtcggtggt gccggcgggg 240
ggcgccaggt cgcaggcggt gtagggctcc aggcaggcgg cgaaggccat gacgtgcgct 300
atgaaggtct gctcctgcac gccgtgaacc aggtgcgcct gcgggccgcg cgcgaacacc 360
gccacgtcct cgcctgcgtg ggtctcttcg tccaggggca ctgctgactg ctgccgatac 420
tcggggctcc cgctctcgct ctcggtaaca tccggccggg cgccgtcctt gagcacatag 480
cctggaccgt ttccttaagc gacgcatgct cgcgataggc acctattggt cttactgaca 540
tccactttgc ctttctctcc acaggagagc atgggacagc aggccaagag cctgagggct 600
caggtgaagc ggcacactgt tcgggacaag ctgaggtcat gccagaactt tctgcagaag 660
ctacgcttcc tggcggatga gccccagcac agcattcctg atgtgttcat ttggatgatg 720
agcaacaaca aacgtatcgc ctatgcccgc gtgccttcca aagacctgct cttctccatc 780
gtggaggagg aactgggcaa ggactgcgcc aaagtcaaga ccctcttcct gaagctgcca 840
gggaagaggg gcttcggctc ggcaggctgg acagtacagg ccaagctgga gctctacctg 900
tggctgggcc tcagcaagca gcgaaaggac ttcctgtgtg gtctgccctg tggcttcgag 960
gaggtcaagg cagcccaagg cctgggcctg cattcctttc cgcccatcag cctagtctac 1020
accaagaagc aagccttcca gctccgagca cacatgtatc aggcccgaag cctctttgct 1080
gctgacagca gtgggctctc tgatcccttt gcccgtgtct tcttcatcaa ccagagccaa 1140
tgcactgagg ttctaaacga gacactgtgt cccacctggg accagatgct ggtatttgac 1200
aacctggagc tgtacggtga agctcacgag ttacgagatg atccccccat cattgtcatt 1260
gaaatctacg accaggacag catgggcaaa gccgacttca tgggccggac cttcgccaag 1320
cccctggtga agatggcaga tgaagcatac tgcccacctc gcttcccgcc gcagcttgag 1380
tactaccaga tctaccgagg cagtgccact gccggagacc tactggctgc cttcgagctg 1440
ctgcagattg ggccatcagg gaaggctgac ctgccaccca tcaatggccc agtggacatg 1500
gacagagggc ccatcatgcc tgtgcccgtg ggaatccggc cagtgctcag caagtaccga 1560
gtggaggtgc tgttctgggg cctgagggac ctaaagaggg tgaacctggc ccaggtggac 1620
cgaccacggg tggacatcga gtgtgcagga aagggggtac aatcctccct gattcacaat 1680
tataagaaga accccaactt caacacgctg gtcaagtggt ttgaagtgga cctcccggag 1740
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gagccagtta agaagctgga gaccatggtg aaactggatg cgacttctga tgctgtggtc 1980
aaggtggatg tggctgaaga tgagaaggaa aggaagaaga agaaaaagaa aggcccgtca 2040
gaggagccag aggaggaaga gcccgatgag agcatgctgg attggtggtc caagtacttc 2100
gcctccatcg acacaatgaa ggagcaactt cgacaacatg agacctctgg aactgacttg 2160
gaagagaagg aagagatgga aagcgctgag ggcctgaagg gaccaatgaa gagcaaggag 2220
aagtccagag ctgcaaagga ggagaaaaag aagaaaaacc agagccctgg ccctggccag 2280
ggatcggagg ctcctgagaa gaagaaagcc aagatcgatg agcttaaggt gtaccccaag 2340
gagctggaat cggagtttga cagctttgag gactggctgc acaccttcaa cctgttgagg 2400
ggcaagacgg gagatgatga ggatggctcc acagaggagg agcgcatagt aggccgattc 2460
aagggctccc tctgtgtgta caaagtgcca ctcccagaag atgtatctcg agaagctggc 2520
tatgatccca cctatggaat gttccagggc atcccaagca atgaccccat caatgtgctg 2580
gtccgaatct atgtggtccg ggccacagac ctgcacccgg ccgacatcaa tggcaaagct 2640
gacccctata ttgccatcaa gttaggcaag accgacatcc gagacaagga gaactacatc 2700
tccaagcagc tcaaccctgt gtttgggaag tcctttgaca ttgaggcctc cttccccatg 2760
gagtccatgt tgacagtggc cgtgtacgac tgggatctgg tgggcactga tgacctcatc 2820
ggagaaacca agattgacct ggaaaaccgc ttctacagca agcatcgcgc cacctgcggc 2880
atcgcacaga cctattccat acatggctac aatatctgga gggaccccat gaagcccagc 2940
cagatcctga cacgcctctg taaagagggc aaagtggacg gcccccactt tggtccccat 3000
gggagagtga gggttgccaa ccgtgtcttc acggggcctt cagaaataga ggatgagaat 3060
ggtcagagga agcccacaga tgagcacgtg gcactgtctg ctctgagaca ctgggaggac 3120
atcccccggg tgggctgccg ccttgtgccg gaacacgtgg agaccaggcc gctgctcaac 3180
cctgacaagc caggcattga gcagggccgc ctggagctgt gggtggacat gttccccatg 3240
gacatgccag cccctgggac acctctggat atatccccca ggaaacccaa gaagtacgag 3300
ctgcgggtca tcgtgtggaa cacagacgag gtggtcctgg aagacgatga tttcttcacg 3360
ggagagaagt ccagtgacat ttttgtgagg gggtggctga agggccagca ggaggacaaa 3420
caggacacag atgtccacta tcactccctc acgggggagg gcaacttcaa ctggagatac 3480
ctcttcccct tcgactacct agcggccgaa gagaagatcg ttatgtccaa aaaggagtct 3540
atgttctcct gggatgagac ggagtacaag atccctgcgc ggctcaccct gcagatctgg 3600
gacgctgacc acttctcggc tgacgacttc ctgggggcta tcgagctgga cctgaaccgg 3660
ttcccgaggg gcgctaagac agccaagcag tgcaccatgg agatggccac cggggaggtg 3720
gacgtacccc tggtttccat ctttaaacag aaacgtgtca aaggctggtg gcccctcctg 3780
gcccgcaatg agaatgatga gtttgagctc acaggcaaag tggaggcgga gctacaccta 3840
ctcacggcag aggaggcaga gaagaaccct gtgggcctgg ctcgcaatga acctgatccc 3900
ctagaaaaac ccaaccggcc tgacacggca ttcgtctggt tcctgaaccc actcaaatct 3960
atcaagtacc tcatctgcac ccggtacaag tggctgatca tcaagatcgt gctggcgctg 4020
ctggggctgc tcatgctggc cctcttcctt tacagcctcc caggctacat ggtcaagaag 4080
ctcctagggg cctgagcggc cgcggtacca agggcgaatt ctgcagtcga ctagagctcg 4140
ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt 4200
gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat 4260
tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag 4320
caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gagagatctg aggactagtc 4380
cgtcgactgt taattaagca tgctggggag agatctagga acccctagtg atggagttgg 4440
ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 4500
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 4560
accccccccc ccccccccct gcagccctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 4620
gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 4680
ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 4740
caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 4800
aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 4860
atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 4920
cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 4980
ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca 5040
gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 5100
accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 5160
cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 5220
cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 5280
gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 5340
aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 5400
aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 5460
actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 5520
taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 5580
gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 5640
tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 5700
ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 5760
accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 5820
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acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 5940
tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 6000
cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 6060
tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 6120
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gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 6240
tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 6300
ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 6360
gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 6420
cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 6480
gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 6540
ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga 6600
cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg 6660
acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg 6720
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ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa 6840
taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggaa attgtaaacg ttaatatttt 6900
gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat 6960
cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt 7020
ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt 7080
ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag 7140
gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg 7200
aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc 7260
gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc 7320
gctacagggc gcgtcgcgcc attcgccatt caggctacgc aactgttggg aagggcgatc 7380
ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccaggc tgc 7413
<210> 3
<211> 287
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 3
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<210> 4
<211> 650
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 4
ggtaccctag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 60
agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 120
gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 180
gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 240
atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 300
cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 360
ctattaccat ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct 420
ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg 480
gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga 540
ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg 600
cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg 650
<210> 5
<211> 1997
<212> PRT
<213> 智人（H. sapiens）
<400> 5
Met Ala Leu Leu Ile His Leu Lys Thr Val Ser Glu Leu Arg Gly Arg
1 5 10 15
Gly Asp Arg Ile Ala Lys Val Thr Phe Arg Gly Gln Ser Phe Tyr Ser
20 25 30
Arg Val Leu Glu Asn Cys Glu Asp Val Ala Asp Phe Asp Glu Thr Phe
35 40 45
Arg Trp Pro Val Ala Ser Ser Ile Asp Arg Asn Glu Met Leu Glu Ile
50 55 60
Gln Val Phe Asn Tyr Ser Lys Val Phe Ser Asn Lys Leu Ile Gly Thr
65 70 75 80
Phe Arg Met Val Leu Gln Lys Val Val Glu Glu Ser His Val Glu Val
85 90 95
Thr Asp Thr Leu Ile Asp Asp Asn Asn Ala Ile Ile Lys Thr Ser Leu
100 105 110
Cys Val Glu Val Arg Tyr Gln Ala Thr Asp Gly Thr Val Gly Ser Trp
115 120 125
Asp Asp Gly Asp Phe Leu Gly Asp Glu Ser Leu Gln Glu Glu Glu Lys
130 135 140
Asp Ser Gln Glu Thr Asp Gly Leu Leu Pro Gly Ser Arg Pro Ser Ser
145 150 155 160
Arg Pro Pro Gly Glu Lys Ser Phe Arg Arg Ala Gly Arg Ser Val Phe
165 170 175
Ser Ala Met Lys Leu Gly Lys Asn Arg Ser His Lys Glu Glu Pro Gln
180 185 190
Arg Pro Asp Glu Pro Ala Val Leu Glu Met Glu Asp Leu Asp His Leu
195 200 205
Ala Ile Arg Leu Gly Asp Gly Leu Asp Pro Asp Ser Val Ser Leu Ala
210 215 220
Ser Val Thr Ala Leu Thr Thr Asn Val Ser Asn Lys Arg Ser Lys Pro
225 230 235 240
Asp Ile Lys Met Glu Pro Ser Ala Gly Arg Pro Met Asp Tyr Gln Val
245 250 255
Ser Ile Thr Val Ile Glu Ala Arg Gln Leu Val Gly Leu Asn Met Asp
260 265 270
Pro Val Val Cys Val Glu Val Gly Asp Asp Lys Lys Tyr Thr Ser Met
275 280 285
Lys Glu Ser Thr Asn Cys Pro Tyr Tyr Asn Glu Tyr Phe Val Phe Asp
290 295 300
Phe His Val Ser Pro Asp Val Met Phe Asp Lys Ile Ile Lys Ile Ser
305 310 315 320
Val Ile His Ser Lys Asn Leu Leu Arg Ser Gly Thr Leu Val Gly Ser
325 330 335
Phe Lys Met Asp Val Gly Thr Val Tyr Ser Gln Pro Glu His Gln Phe
340 345 350
His His Lys Trp Ala Ile Leu Ser Asp Pro Asp Asp Ile Ser Ser Gly
355 360 365
Leu Lys Gly Tyr Val Lys Cys Asp Val Ala Val Val Gly Lys Gly Asp
370 375 380
Asn Ile Lys Thr Pro His Lys Ala Asn Glu Thr Asp Glu Asp Asp Ile
385 390 395 400
Glu Gly Asn Leu Leu Leu Pro Glu Gly Val Pro Pro Glu Arg Gln Trp
405 410 415
Ala Arg Phe Tyr Val Lys Ile Tyr Arg Ala Glu Gly Leu Pro Arg Met
420 425 430
Asn Thr Ser Leu Met Ala Asn Val Lys Lys Ala Phe Ile Gly Glu Asn
435 440 445
Lys Asp Leu Val Asp Pro Tyr Val Gln Val Phe Phe Ala Gly Gln Lys
450 455 460
Gly Lys Thr Ser Val Gln Lys Ser Ser Tyr Glu Pro Leu Trp Asn Glu
465 470 475 480
Gln Val Val Phe Thr Asp Leu Phe Pro Pro Leu Cys Lys Arg Met Lys
485 490 495
Val Gln Ile Arg Asp Ser Asp Lys Val Asn Asp Val Ala Ile Gly Thr
500 505 510
His Phe Ile Asp Leu Arg Lys Ile Ser Asn Asp Gly Asp Lys Gly Phe
515 520 525
Leu Pro Thr Leu Gly Pro Ala Trp Val Asn Met Tyr Gly Ser Thr Arg
530 535 540
Asn Tyr Thr Leu Leu Asp Glu His Gln Asp Leu Asn Glu Gly Leu Gly
545 550 555 560
Glu Gly Val Ser Phe Arg Ala Arg Leu Leu Leu Gly Leu Ala Val Glu
565 570 575
Ile Val Asp Thr Ser Asn Pro Glu Leu Thr Ser Ser Thr Glu Val Gln
580 585 590
Val Glu Gln Ala Thr Pro Ile Ser Glu Ser Cys Ala Gly Lys Met Glu
595 600 605
Glu Phe Phe Leu Phe Gly Ala Phe Leu Glu Ala Ser Met Ile Asp Arg
610 615 620
Arg Asn Gly Asp Lys Pro Ile Thr Phe Glu Val Thr Ile Gly Asn Tyr
625 630 635 640
Gly Asn Glu Val Asp Gly Leu Ser Arg Pro Gln Arg Pro Arg Pro Arg
645 650 655
Lys Glu Pro Gly Asp Glu Glu Glu Val Asp Leu Ile Gln Asn Ala Ser
660 665 670
Asp Asp Glu Ala Gly Asp Ala Gly Asp Leu Ala Ser Val Ser Ser Thr
675 680 685
Pro Pro Met Arg Pro Gln Val Thr Asp Arg Asn Tyr Phe His Leu Pro
690 695 700
Tyr Leu Glu Arg Lys Pro Cys Ile Tyr Ile Lys Ser Trp Trp Pro Asp
705 710 715 720
Gln Arg Arg Arg Leu Tyr Asn Ala Asn Ile Met Asp His Ile Ala Asp
725 730 735
Lys Leu Glu Glu Gly Leu Asn Asp Ile Gln Glu Met Ile Lys Thr Glu
740 745 750
Lys Ser Tyr Pro Glu Arg Arg Leu Arg Gly Val Leu Glu Glu Leu Ser
755 760 765
Cys Gly Cys Cys Arg Phe Leu Ser Leu Ala Asp Lys Asp Gln Gly His
770 775 780
Ser Ser Arg Thr Arg Leu Asp Arg Glu Arg Leu Lys Ser Cys Met Arg
785 790 795 800
Glu Leu Glu Asn Met Gly Gln Gln Ala Arg Met Leu Arg Ala Gln Val
805 810 815
Lys Arg His Thr Val Arg Asp Lys Leu Arg Leu Cys Gln Asn Phe Leu
820 825 830
Gln Lys Leu Arg Phe Leu Ala Asp Glu Pro Gln His Ser Ile Pro Asp
835 840 845
Ile Phe Ile Trp Met Met Ser Asn Asn Lys Arg Val Ala Tyr Ala Arg
850 855 860
Val Pro Ser Lys Asp Leu Leu Phe Ser Ile Val Glu Glu Glu Thr Gly
865 870 875 880
Lys Asp Cys Ala Lys Val Lys Thr Leu Phe Leu Lys Leu Pro Gly Lys
885 890 895
Arg Gly Phe Gly Ser Ala Gly Trp Thr Val Gln Ala Lys Val Glu Leu
900 905 910
Tyr Leu Trp Leu Gly Leu Ser Lys Gln Arg Lys Glu Phe Leu Cys Gly
915 920 925
Leu Pro Cys Gly Phe Gln Glu Val Lys Ala Ala Gln Gly Leu Gly Leu
930 935 940
His Ala Phe Pro Pro Val Ser Leu Val Tyr Thr Lys Lys Gln Ala Phe
945 950 955 960
Gln Leu Arg Ala His Met Tyr Gln Ala Arg Ser Leu Phe Ala Ala Asp
965 970 975
Ser Ser Gly Leu Ser Asp Pro Phe Ala Arg Val Phe Phe Ile Asn Gln
980 985 990
Ser Gln Cys Thr Glu Val Leu Asn Glu Thr Leu Cys Pro Thr Trp Asp
995 1000 1005
Gln Met Leu Val Phe Asp Asn Leu Glu Leu Tyr Gly Glu Ala His
1010 1015 1020
Glu Leu Arg Asp Asp Pro Pro Ile Ile Val Ile Glu Ile Tyr Asp
1025 1030 1035
Gln Asp Ser Met Gly Lys Ala Asp Phe Met Gly Arg Thr Phe Ala
1040 1045 1050
Lys Pro Leu Val Lys Met Ala Asp Glu Ala Tyr Cys Pro Pro Arg
1055 1060 1065
Phe Pro Pro Gln Leu Glu Tyr Tyr Gln Ile Tyr Arg Gly Asn Ala
1070 1075 1080
Thr Ala Gly Asp Leu Leu Ala Ala Phe Glu Leu Leu Gln Ile Gly
1085 1090 1095
Pro Ala Gly Lys Ala Asp Leu Pro Pro Ile Asn Gly Pro Val Asp
1100 1105 1110
Val Asp Arg Gly Pro Ile Met Pro Val Pro Met Gly Ile Arg Pro
1115 1120 1125
Val Leu Ser Lys Tyr Arg Val Glu Val Leu Phe Trp Gly Leu Arg
1130 1135 1140
Asp Leu Lys Arg Val Asn Leu Ala Gln Val Asp Arg Pro Arg Val
1145 1150 1155
Asp Ile Glu Cys Ala Gly Lys Gly Val Gln Ser Ser Leu Ile His
1160 1165 1170
Asn Tyr Lys Lys Asn Pro Asn Phe Asn Thr Leu Val Lys Trp Phe
1175 1180 1185
Glu Val Asp Leu Pro Glu Asn Glu Leu Leu His Pro Pro Leu Asn
1190 1195 1200
Ile Arg Val Val Asp Cys Arg Ala Phe Gly Arg Tyr Thr Leu Val
1205 1210 1215
Gly Ser His Ala Val Ser Ser Leu Arg Arg Phe Ile Tyr Arg Pro
1220 1225 1230
Pro Asp Arg Ser Ala Pro Ser Trp Asn Thr Thr Val Arg Leu Leu
1235 1240 1245
Arg Arg Cys Arg Val Leu Cys Asn Gly Gly Ser Ser Ser His Ser
1250 1255 1260
Thr Gly Glu Val Val Val Thr Met Glu Pro Glu Val Pro Ile Lys
1265 1270 1275
Lys Leu Glu Thr Met Val Lys Leu Asp Ala Thr Ser Glu Ala Val
1280 1285 1290
Val Lys Val Asp Val Ala Glu Glu Glu Lys Glu Lys Lys Lys Lys
1295 1300 1305
Lys Lys Gly Thr Ala Glu Glu Pro Glu Glu Glu Glu Pro Asp Glu
1310 1315 1320
Ser Met Leu Asp Trp Trp Ser Lys Tyr Phe Ala Ser Ile Asp Thr
1325 1330 1335
Met Lys Glu Gln Leu Arg Gln Gln Glu Pro Ser Gly Ile Asp Leu
1340 1345 1350
Glu Glu Lys Glu Glu Val Asp Asn Thr Glu Gly Leu Lys Gly Ser
1355 1360 1365
Met Lys Gly Lys Glu Lys Ala Arg Ala Ala Lys Glu Glu Lys Lys
1370 1375 1380
Lys Lys Thr Gln Ser Ser Gly Ser Gly Gln Gly Ser Glu Ala Pro
1385 1390 1395
Glu Lys Lys Lys Pro Lys Ile Asp Glu Leu Lys Val Tyr Pro Lys
1400 1405 1410
Glu Leu Glu Ser Glu Phe Asp Asn Phe Glu Asp Trp Leu His Thr
1415 1420 1425
Phe Asn Leu Leu Arg Gly Lys Thr Gly Asp Asp Glu Asp Gly Ser
1430 1435 1440
Thr Glu Glu Glu Arg Ile Val Gly Arg Phe Lys Gly Ser Leu Cys
1445 1450 1455
Val Tyr Lys Val Pro Leu Pro Glu Asp Val Ser Arg Glu Ala Gly
1460 1465 1470
Tyr Asp Ser Thr Tyr Gly Met Phe Gln Gly Ile Pro Ser Asn Asp
1475 1480 1485
Pro Ile Asn Val Leu Val Arg Val Tyr Val Val Arg Ala Thr Asp
1490 1495 1500
Leu His Pro Ala Asp Ile Asn Gly Lys Ala Asp Pro Tyr Ile Ala
1505 1510 1515
Ile Arg Leu Gly Lys Thr Asp Ile Arg Asp Lys Glu Asn Tyr Ile
1520 1525 1530
Ser Lys Gln Leu Asn Pro Val Phe Gly Lys Ser Phe Asp Ile Glu
1535 1540 1545
Ala Ser Phe Pro Met Glu Ser Met Leu Thr Val Ala Val Tyr Asp
1550 1555 1560
Trp Asp Leu Val Gly Thr Asp Asp Leu Ile Gly Glu Thr Lys Ile
1565 1570 1575
Asp Leu Glu Asn Arg Phe Tyr Ser Lys His Arg Ala Thr Cys Gly
1580 1585 1590
Ile Ala Gln Thr Tyr Ser Thr His Gly Tyr Asn Ile Trp Arg Asp
1595 1600 1605
Pro Met Lys Pro Ser Gln Ile Leu Thr Arg Leu Cys Lys Asp Gly
1610 1615 1620
Lys Val Asp Gly Pro His Phe Gly Pro Pro Gly Arg Val Lys Val
1625 1630 1635
Ala Asn Arg Val Phe Thr Gly Pro Ser Glu Ile Glu Asp Glu Asn
1640 1645 1650
Gly Gln Arg Lys Pro Thr Asp Glu His Val Ala Leu Leu Ala Leu
1655 1660 1665
Arg His Trp Glu Asp Ile Pro Arg Ala Gly Cys Arg Leu Val Pro
1670 1675 1680
Glu His Val Glu Thr Arg Pro Leu Leu Asn Pro Asp Lys Pro Gly
1685 1690 1695
Ile Glu Gln Gly Arg Leu Glu Leu Trp Val Asp Met Phe Pro Met
1700 1705 1710
Asp Met Pro Ala Pro Gly Thr Pro Leu Asp Ile Ser Pro Arg Lys
1715 1720 1725
Pro Lys Lys Tyr Glu Leu Arg Val Ile Ile Trp Asn Thr Asp Glu
1730 1735 1740
Val Val Leu Glu Asp Asp Asp Phe Phe Thr Gly Glu Lys Ser Ser
1745 1750 1755
Asp Ile Phe Val Arg Gly Trp Leu Lys Gly Gln Gln Glu Asp Lys
1760 1765 1770
Gln Asp Thr Asp Val His Tyr His Ser Leu Thr Gly Glu Gly Asn
1775 1780 1785
Phe Asn Trp Arg Tyr Leu Phe Pro Phe Asp Tyr Leu Ala Ala Glu
1790 1795 1800
Glu Lys Ile Val Ile Ser Lys Lys Glu Ser Met Phe Ser Trp Asp
1805 1810 1815
Glu Thr Glu Tyr Lys Ile Pro Ala Arg Leu Thr Leu Gln Ile Trp
1820 1825 1830
Asp Ala Asp His Phe Ser Ala Asp Asp Phe Leu Gly Ala Ile Glu
1835 1840 1845
Leu Asp Leu Asn Arg Phe Pro Arg Gly Ala Lys Thr Ala Lys Gln
1850 1855 1860
Cys Thr Met Glu Met Ala Thr Gly Glu Val Asp Val Pro Leu Val
1865 1870 1875
Ser Ile Phe Lys Gln Lys Arg Val Lys Gly Trp Trp Pro Leu Leu
1880 1885 1890
Ala Arg Asn Glu Asn Asp Glu Phe Glu Leu Thr Gly Lys Val Glu
1895 1900 1905
Ala Glu Leu His Leu Leu Thr Ala Glu Glu Ala Glu Lys Asn Pro
1910 1915 1920
Val Gly Leu Ala Arg Asn Glu Pro Asp Pro Leu Glu Lys Pro Asn
1925 1930 1935
Arg Pro Asp Thr Ser Phe Ile Trp Phe Leu Asn Pro Leu Lys Ser
1940 1945 1950
Ala Arg Tyr Phe Leu Trp His Thr Tyr Arg Trp Leu Leu Leu Lys
1955 1960 1965
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Phe Leu
1970 1975 1980
Tyr Ser Val Pro Gly Tyr Leu Val Lys Lys Ile Leu Gly Ala
1985 1990 1995
<210> 6
<211> 1997
<212> PRT
<213> 智人（H. sapiens）
<400> 6
Met Ala Leu Leu Ile His Leu Lys Thr Val Ser Glu Leu Arg Gly Arg
1 5 10 15
Gly Asp Arg Ile Ala Lys Val Thr Phe Arg Gly Gln Ser Phe Tyr Ser
20 25 30
Arg Val Leu Glu Asn Cys Glu Asp Val Ala Asp Phe Asp Glu Thr Phe
35 40 45
Arg Trp Pro Val Ala Ser Ser Ile Asp Arg Asn Glu Met Leu Glu Ile
50 55 60
Gln Val Phe Asn Tyr Ser Lys Val Phe Ser Asn Lys Leu Ile Gly Thr
65 70 75 80
Phe Arg Met Val Leu Gln Lys Val Val Glu Glu Ser His Val Glu Val
85 90 95
Thr Asp Thr Leu Ile Asp Asp Asn Asn Ala Ile Ile Lys Thr Ser Leu
100 105 110
Cys Val Glu Val Arg Tyr Gln Ala Thr Asp Gly Thr Val Gly Ser Trp
115 120 125
Asp Asp Gly Asp Phe Leu Gly Asp Glu Ser Leu Gln Glu Glu Glu Lys
130 135 140
Asp Ser Gln Glu Thr Asp Gly Leu Leu Pro Gly Ser Arg Pro Ser Ser
145 150 155 160
Arg Pro Pro Gly Glu Lys Ser Phe Arg Arg Ala Gly Arg Ser Val Phe
165 170 175
Ser Ala Met Lys Leu Gly Lys Asn Arg Ser His Lys Glu Glu Pro Gln
180 185 190
Arg Pro Asp Glu Pro Ala Val Leu Glu Met Glu Asp Leu Asp His Leu
195 200 205
Ala Ile Arg Leu Gly Asp Gly Leu Asp Pro Asp Ser Val Ser Leu Ala
210 215 220
Ser Val Thr Ala Leu Thr Thr Asn Val Ser Asn Lys Arg Ser Lys Pro
225 230 235 240
Asp Ile Lys Met Glu Pro Ser Ala Gly Arg Pro Met Asp Tyr Gln Val
245 250 255
Ser Ile Thr Val Ile Glu Ala Arg Gln Leu Val Gly Leu Asn Met Asp
260 265 270
Pro Val Val Cys Val Glu Val Gly Asp Asp Lys Lys Tyr Thr Ser Met
275 280 285
Lys Glu Ser Thr Asn Cys Pro Tyr Tyr Asn Glu Tyr Phe Val Phe Asp
290 295 300
Phe His Val Ser Pro Asp Val Met Phe Asp Lys Ile Ile Lys Ile Ser
305 310 315 320
Val Ile His Ser Lys Asn Leu Leu Arg Ser Gly Thr Leu Val Gly Ser
325 330 335
Phe Lys Met Asp Val Gly Thr Val Tyr Ser Gln Pro Glu His Gln Phe
340 345 350
His His Lys Trp Ala Ile Leu Ser Asp Pro Asp Asp Ile Ser Ser Gly
355 360 365
Leu Lys Gly Tyr Val Lys Cys Asp Val Ala Val Val Gly Lys Gly Asp
370 375 380
Asn Ile Lys Thr Pro His Lys Ala Asn Glu Thr Asp Glu Asp Asp Ile
385 390 395 400
Glu Gly Asn Leu Leu Leu Pro Glu Gly Val Pro Pro Glu Arg Gln Trp
405 410 415
Ala Arg Phe Tyr Val Lys Ile Tyr Arg Ala Glu Gly Leu Pro Arg Met
420 425 430
Asn Thr Ser Leu Met Ala Asn Val Lys Lys Ala Phe Ile Gly Glu Asn
435 440 445
Lys Asp Leu Val Asp Pro Tyr Val Gln Val Phe Phe Ala Gly Gln Lys
450 455 460
Gly Lys Thr Ser Val Gln Lys Ser Ser Tyr Glu Pro Leu Trp Asn Glu
465 470 475 480
Gln Val Val Phe Thr Asp Leu Phe Pro Pro Leu Cys Lys Arg Met Lys
485 490 495
Val Gln Ile Arg Asp Ser Asp Lys Val Asn Asp Val Ala Ile Gly Thr
500 505 510
His Phe Ile Asp Leu Arg Lys Ile Ser Asn Asp Gly Asp Lys Gly Phe
515 520 525
Leu Pro Thr Leu Gly Pro Ala Trp Val Asn Met Tyr Gly Ser Thr Arg
530 535 540
Asn Tyr Thr Leu Leu Asp Glu His Gln Asp Leu Asn Glu Gly Leu Gly
545 550 555 560
Glu Gly Val Ser Phe Arg Ala Arg Leu Leu Leu Gly Leu Ala Val Glu
565 570 575
Ile Val Asp Thr Ser Asn Pro Glu Leu Thr Ser Ser Thr Glu Val Gln
580 585 590
Val Glu Gln Ala Thr Pro Ile Ser Glu Ser Cys Ala Gly Lys Met Glu
595 600 605
Glu Phe Phe Leu Phe Gly Ala Phe Leu Glu Ala Ser Met Ile Asp Arg
610 615 620
Arg Asn Gly Asp Lys Pro Ile Thr Phe Glu Val Thr Ile Gly Asn Tyr
625 630 635 640
Gly Asn Glu Val Asp Gly Leu Ser Arg Pro Gln Arg Pro Arg Pro Arg
645 650 655
Lys Glu Pro Gly Asp Glu Glu Glu Val Asp Leu Ile Gln Asn Ala Ser
660 665 670
Asp Asp Glu Ala Gly Asp Ala Gly Asp Leu Ala Ser Val Ser Ser Thr
675 680 685
Pro Pro Met Arg Pro Gln Val Thr Asp Arg Asn Tyr Phe His Leu Pro
690 695 700
Tyr Leu Glu Arg Lys Pro Cys Ile Tyr Ile Lys Ser Trp Trp Pro Asp
705 710 715 720
Gln Arg Arg Arg Leu Tyr Asn Ala Asn Ile Met Asp His Ile Ala Asp
725 730 735
Lys Leu Glu Glu Gly Leu Asn Asp Ile Gln Glu Met Ile Lys Thr Glu
740 745 750
Lys Ser Tyr Pro Glu Arg Arg Leu Arg Gly Val Leu Glu Glu Leu Ser
755 760 765
Cys Gly Cys Cys Arg Phe Leu Ser Leu Ala Asp Lys Asp Gln Gly His
770 775 780
Ser Ser Arg Thr Arg Leu Asp Arg Glu Arg Leu Lys Ser Cys Met Arg
785 790 795 800
Glu Leu Glu Asn Met Gly Gln Gln Ala Arg Met Leu Arg Ala Gln Val
805 810 815
Lys Arg His Thr Val Arg Asp Lys Leu Arg Leu Cys Gln Asn Phe Leu
820 825 830
Gln Lys Leu Arg Phe Leu Ala Asp Glu Pro Gln His Ser Ile Pro Asp
835 840 845
Ile Phe Ile Trp Met Met Ser Asn Asn Lys Arg Val Ala Tyr Ala Arg
850 855 860
Val Pro Ser Lys Asp Leu Leu Phe Ser Ile Val Glu Glu Glu Thr Gly
865 870 875 880
Lys Asp Cys Ala Lys Val Lys Thr Leu Phe Leu Lys Leu Pro Gly Lys
885 890 895
Arg Gly Phe Gly Ser Ala Gly Trp Thr Val Gln Ala Lys Val Glu Leu
900 905 910
Tyr Leu Trp Leu Gly Leu Ser Lys Gln Arg Lys Glu Phe Leu Cys Gly
915 920 925
Leu Pro Cys Gly Phe Gln Glu Val Lys Ala Ala Gln Gly Leu Gly Leu
930 935 940
His Ala Phe Pro Pro Val Ser Leu Val Tyr Thr Lys Lys Gln Ala Phe
945 950 955 960
Gln Leu Arg Ala His Met Tyr Gln Ala Arg Ser Leu Phe Ala Ala Asp
965 970 975
Ser Ser Gly Leu Ser Asp Pro Phe Ala Arg Val Phe Phe Ile Asn Gln
980 985 990
Ser Gln Cys Thr Glu Val Leu Asn Glu Thr Leu Cys Pro Thr Trp Asp
995 1000 1005
Gln Met Leu Val Phe Asp Asn Leu Glu Leu Tyr Gly Glu Ala His
1010 1015 1020
Glu Leu Arg Asp Asp Pro Pro Ile Ile Val Ile Glu Ile Tyr Asp
1025 1030 1035
Gln Asp Ser Met Gly Lys Ala Asp Phe Met Gly Arg Thr Phe Ala
1040 1045 1050
Lys Pro Leu Val Lys Met Ala Asp Glu Ala Tyr Cys Pro Pro Arg
1055 1060 1065
Phe Pro Pro Gln Leu Glu Tyr Tyr Gln Ile Tyr Arg Gly Asn Ala
1070 1075 1080
Thr Ala Gly Asp Leu Leu Ala Ala Phe Glu Leu Leu Gln Ile Gly
1085 1090 1095
Pro Ala Gly Lys Ala Asp Leu Pro Pro Ile Asn Gly Pro Val Asp
1100 1105 1110
Val Asp Arg Gly Pro Ile Met Pro Val Pro Met Gly Ile Arg Pro
1115 1120 1125
Val Leu Ser Lys Tyr Arg Val Glu Val Leu Phe Trp Gly Leu Arg
1130 1135 1140
Asp Leu Lys Arg Val Asn Leu Ala Gln Val Asp Arg Pro Arg Val
1145 1150 1155
Asp Ile Glu Cys Ala Gly Lys Gly Val Gln Ser Ser Leu Ile His
1160 1165 1170
Asn Tyr Lys Lys Asn Pro Asn Phe Asn Thr Leu Val Lys Trp Phe
1175 1180 1185
Glu Val Asp Leu Pro Glu Asn Glu Leu Leu His Pro Pro Leu Asn
1190 1195 1200
Ile Arg Val Val Asp Cys Arg Ala Phe Gly Arg Tyr Thr Leu Val
1205 1210 1215
Gly Ser His Ala Val Ser Ser Leu Arg Arg Phe Ile Tyr Arg Pro
1220 1225 1230
Pro Asp Arg Ser Ala Pro Ser Trp Asn Thr Thr Val Arg Leu Leu
1235 1240 1245
Arg Arg Cys Arg Val Leu Cys Asn Gly Gly Ser Ser Ser His Ser
1250 1255 1260
Thr Gly Glu Val Val Val Thr Met Glu Pro Glu Val Pro Ile Lys
1265 1270 1275
Lys Leu Glu Thr Met Val Lys Leu Asp Ala Thr Ser Glu Ala Val
1280 1285 1290
Val Lys Val Asp Val Ala Glu Glu Glu Lys Glu Lys Lys Lys Lys
1295 1300 1305
Lys Lys Gly Thr Ala Glu Glu Pro Glu Glu Glu Glu Pro Asp Glu
1310 1315 1320
Ser Met Leu Asp Trp Trp Ser Lys Tyr Phe Ala Ser Ile Asp Thr
1325 1330 1335
Met Lys Glu Gln Leu Arg Gln Gln Glu Pro Ser Gly Ile Asp Leu
1340 1345 1350
Glu Glu Lys Glu Glu Val Asp Asn Thr Glu Gly Leu Lys Gly Ser
1355 1360 1365
Met Lys Gly Lys Glu Lys Ala Arg Ala Ala Lys Glu Glu Lys Lys
1370 1375 1380
Lys Lys Thr Gln Ser Ser Gly Ser Gly Gln Gly Ser Glu Ala Pro
1385 1390 1395
Glu Lys Lys Lys Pro Lys Ile Asp Glu Leu Lys Val Tyr Pro Lys
1400 1405 1410
Glu Leu Glu Ser Glu Phe Asp Asn Phe Glu Asp Trp Leu His Thr
1415 1420 1425
Phe Asn Leu Leu Arg Gly Lys Thr Gly Asp Asp Glu Asp Gly Ser
1430 1435 1440
Thr Glu Glu Glu Arg Ile Val Gly Arg Phe Lys Gly Ser Leu Cys
1445 1450 1455
Val Tyr Lys Val Pro Leu Pro Glu Asp Val Ser Arg Glu Ala Gly
1460 1465 1470
Tyr Asp Ser Thr Tyr Gly Met Phe Gln Gly Ile Pro Ser Asn Asp
1475 1480 1485
Pro Ile Asn Val Leu Val Arg Val Tyr Val Val Arg Ala Thr Asp
1490 1495 1500
Leu His Pro Ala Asp Ile Asn Gly Lys Ala Asp Pro Tyr Ile Ala
1505 1510 1515
Ile Arg Leu Gly Lys Thr Asp Ile Arg Asp Lys Glu Asn Tyr Ile
1520 1525 1530
Ser Lys Gln Leu Asn Pro Val Phe Gly Lys Ser Phe Asp Ile Glu
1535 1540 1545
Ala Ser Phe Pro Met Glu Ser Met Leu Thr Val Ala Val Tyr Asp
1550 1555 1560
Trp Asp Leu Val Gly Thr Asp Asp Leu Ile Gly Glu Thr Lys Ile
1565 1570 1575
Asp Leu Glu Asn Arg Phe Tyr Ser Lys His Arg Ala Thr Cys Gly
1580 1585 1590
Ile Ala Gln Thr Tyr Ser Thr His Gly Tyr Asn Ile Trp Arg Asp
1595 1600 1605
Pro Met Lys Pro Ser Gln Ile Leu Thr Arg Leu Cys Lys Asp Gly
1610 1615 1620
Lys Val Asp Gly Pro His Phe Gly Pro Pro Gly Arg Val Lys Val
1625 1630 1635
Ala Asn Arg Val Phe Thr Gly Pro Ser Glu Ile Glu Asp Glu Asn
1640 1645 1650
Gly Gln Arg Lys Pro Thr Asp Glu His Val Ala Leu Leu Ala Leu
1655 1660 1665
Arg His Trp Glu Asp Ile Pro Arg Ala Gly Cys Arg Leu Val Pro
1670 1675 1680
Glu His Val Glu Thr Arg Pro Leu Leu Asn Pro Asp Lys Pro Gly
1685 1690 1695
Ile Glu Gln Gly Arg Leu Glu Leu Trp Val Asp Met Phe Pro Met
1700 1705 1710
Asp Met Pro Ala Pro Gly Thr Pro Leu Asp Ile Ser Pro Arg Lys
1715 1720 1725
Pro Lys Lys Tyr Glu Leu Arg Val Ile Ile Trp Asn Thr Asp Glu
1730 1735 1740
Val Val Leu Glu Asp Asp Asp Phe Phe Thr Gly Glu Lys Ser Ser
1745 1750 1755
Asp Ile Phe Val Arg Gly Trp Leu Lys Gly Gln Gln Glu Asp Lys
1760 1765 1770
Gln Asp Thr Asp Val His Tyr His Ser Leu Thr Gly Glu Gly Asn
1775 1780 1785
Phe Asn Trp Arg Tyr Leu Phe Pro Phe Asp Tyr Leu Ala Ala Glu
1790 1795 1800
Glu Lys Ile Val Ile Ser Lys Lys Glu Ser Met Phe Ser Trp Asp
1805 1810 1815
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1820 1825 1830
Asp Ala Asp His Phe Ser Ala Asp Asp Phe Leu Gly Ala Ile Glu
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1850 1855 1860
Cys Thr Met Glu Met Ala Thr Gly Glu Val Asp Val Pro Leu Val
1865 1870 1875
Ser Ile Phe Lys Gln Lys Arg Val Lys Gly Trp Trp Pro Leu Leu
1880 1885 1890
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1970 1975 1980
Tyr Ser Leu Pro Gly Tyr Met Val Lys Lys Leu Leu Gly Ala
1985 1990 1995
<210> 7
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 7
gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 60
cagagaagac tcttgcgttt ctga 84
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 8
taggcaccta ttggtcttac tgacatccac tttgcctttc tctccacag 49
<210> 9
<211> 1992
<212> PRT
<213> 小家鼠（M. musculus）
<400> 9
Met Ala Leu Ile Val His Leu Lys Thr Val Ser Glu Leu Arg Gly Lys
1 5 10 15
Gly Asp Arg Ile Ala Lys Val Thr Phe Arg Gly Gln Ser Phe Tyr Ser
20 25 30
Arg Val Leu Glu Asn Cys Glu Gly Val Ala Asp Phe Asp Glu Thr Phe
35 40 45
Arg Trp Pro Val Ala Ser Ser Ile Asp Arg Asn Glu Val Leu Glu Ile
50 55 60
Gln Ile Phe Asn Tyr Ser Lys Val Phe Ser Asn Lys Leu Ile Gly Thr
65 70 75 80
Phe Cys Met Val Leu Gln Lys Val Val Glu Glu Asn Arg Val Glu Val
85 90 95
Thr Asp Thr Leu Met Asp Asp Ser Asn Ala Ile Ile Lys Thr Ser Leu
100 105 110
Ser Met Glu Val Arg Tyr Gln Ala Thr Asp Gly Thr Val Gly Pro Trp
115 120 125
Asp Asp Gly Asp Phe Leu Gly Asp Glu Ser Leu Gln Glu Glu Lys Asp
130 135 140
Ser Gln Glu Thr Asp Gly Leu Leu Pro Gly Ser Arg Pro Ser Thr Arg
145 150 155 160
Ile Ser Gly Glu Lys Ser Phe Arg Ser Lys Gly Arg Glu Lys Thr Lys
165 170 175
Gly Gly Arg Asp Gly Glu His Lys Ala Gly Arg Ser Val Phe Ser Ala
180 185 190
Met Lys Leu Gly Lys Thr Arg Ser His Lys Glu Glu Pro Gln Arg Gln
195 200 205
Asp Glu Pro Ala Val Leu Glu Met Glu Asp Leu Asp His Leu Ala Ile
210 215 220
Gln Leu Gly Asp Gly Leu Asp Pro Asp Ser Val Ser Leu Ala Ser Val
225 230 235 240
Thr Ala Leu Thr Ser Asn Val Ser Asn Lys Arg Ser Lys Pro Asp Ile
245 250 255
Lys Met Glu Pro Ser Ala Gly Arg Pro Met Asp Tyr Gln Val Ser Ile
260 265 270
Thr Val Ile Glu Ala Arg Gln Leu Val Gly Leu Asn Met Asp Pro Val
275 280 285
Val Cys Val Glu Val Gly Asp Asp Lys Lys Tyr Thr Ser Met Lys Glu
290 295 300
Ser Thr Asn Cys Pro Tyr Tyr Asn Glu Tyr Phe Val Phe Asp Phe His
305 310 315 320
Val Ser Pro Asp Val Met Phe Asp Lys Ile Ile Lys Ile Ser Val Ile
325 330 335
His Ser Lys Asn Leu Leu Arg Ser Gly Thr Leu Val Gly Ser Phe Lys
340 345 350
Met Asp Val Gly Thr Val Tyr Ser Gln Pro Glu His Gln Phe His His
355 360 365
Lys Trp Ala Ile Leu Ser Asp Pro Asp Asp Ile Ser Ala Gly Leu Lys
370 375 380
Gly Tyr Val Lys Cys Asp Val Ala Val Val Gly Lys Gly Asp Asn Ile
385 390 395 400
Lys Thr Pro His Lys Ala Asn Glu Thr Asp Glu Asp Asp Ile Glu Gly
405 410 415
Asn Leu Leu Leu Pro Glu Gly Val Pro Pro Glu Arg Gln Trp Ala Arg
420 425 430
Phe Tyr Val Lys Ile Tyr Arg Ala Glu Gly Leu Pro Arg Met Asn Thr
435 440 445
Ser Leu Met Ala Asn Val Lys Lys Ala Phe Ile Gly Glu Asn Lys Asp
450 455 460
Leu Val Asp Pro Tyr Val Gln Val Phe Phe Ala Gly Gln Lys Gly Lys
465 470 475 480
Thr Ser Val Gln Lys Ser Ser Tyr Glu Pro Leu Trp Asn Glu Gln Val
485 490 495
Val Phe Thr Asp Leu Phe Pro Pro Leu Cys Lys Arg Met Lys Val Gln
500 505 510
Ile Arg Asp Ser Asp Lys Val Asn Asp Val Ala Ile Gly Thr His Phe
515 520 525
Ile Asp Leu Arg Lys Ile Ser Asn Asp Gly Asp Lys Gly Phe Leu Pro
530 535 540
Thr Leu Gly Pro Ala Trp Val Asn Met Tyr Gly Ser Thr Arg Asn Tyr
545 550 555 560
Thr Leu Leu Asp Glu His Gln Asp Leu Asn Glu Gly Leu Gly Glu Gly
565 570 575
Val Ser Phe Arg Ala Arg Leu Met Leu Gly Leu Ala Val Glu Ile Leu
580 585 590
Asp Thr Ser Asn Pro Glu Leu Thr Ser Ser Thr Glu Val Gln Val Glu
595 600 605
Gln Ala Thr Pro Val Ser Glu Ser Cys Thr Gly Arg Met Glu Glu Phe
610 615 620
Phe Leu Phe Gly Ala Phe Leu Glu Ala Ser Met Ile Asp Arg Lys Asn
625 630 635 640
Gly Asp Lys Pro Ile Thr Phe Glu Val Thr Ile Gly Asn Tyr Gly Asn
645 650 655
Glu Val Asp Gly Met Ser Arg Pro Leu Arg Pro Arg Pro Arg Lys Glu
660 665 670
Pro Gly Asp Glu Glu Glu Val Asp Leu Ile Gln Asn Ser Ser Asp Asp
675 680 685
Glu Gly Asp Glu Ala Gly Asp Leu Ala Ser Val Ser Ser Thr Pro Pro
690 695 700
Met Arg Pro Gln Ile Thr Asp Arg Asn Tyr Phe His Leu Pro Tyr Leu
705 710 715 720
Glu Arg Lys Pro Cys Ile Tyr Ile Lys Ser Trp Trp Pro Asp Gln Arg
725 730 735
Arg Arg Leu Tyr Asn Ala Asn Ile Met Asp His Ile Ala Asp Lys Leu
740 745 750
Glu Glu Gly Leu Asn Asp Val Gln Glu Met Ile Lys Thr Glu Lys Ser
755 760 765
Tyr Pro Glu Arg Arg Leu Arg Gly Val Leu Glu Glu Leu Ser Cys Gly
770 775 780
Cys His Arg Phe Leu Ser Leu Ser Asp Lys Asp Gln Gly Arg Ser Ser
785 790 795 800
Arg Thr Arg Leu Asp Arg Glu Arg Leu Lys Ser Cys Met Arg Glu Leu
805 810 815
Glu Ser Met Gly Gln Gln Ala Lys Ser Leu Arg Ala Gln Val Lys Arg
820 825 830
His Thr Val Arg Asp Lys Leu Arg Ser Cys Gln Asn Phe Leu Gln Lys
835 840 845
Leu Arg Phe Leu Ala Asp Glu Pro Gln His Ser Ile Pro Asp Val Phe
850 855 860
Ile Trp Met Met Ser Asn Asn Lys Arg Ile Ala Tyr Ala Arg Val Pro
865 870 875 880
Ser Lys Asp Leu Leu Phe Ser Ile Val Glu Glu Glu Leu Gly Lys Asp
885 890 895
Cys Ala Lys Val Lys Thr Leu Phe Leu Lys Leu Pro Gly Lys Arg Gly
900 905 910
Phe Gly Ser Ala Gly Trp Thr Val Gln Ala Lys Leu Glu Leu Tyr Leu
915 920 925
Trp Leu Gly Leu Ser Lys Gln Arg Lys Asp Phe Leu Cys Gly Leu Pro
930 935 940
Cys Gly Phe Glu Glu Val Lys Ala Ala Gln Gly Leu Gly Leu His Ser
945 950 955 960
Phe Pro Pro Ile Ser Leu Val Tyr Thr Lys Lys Gln Ala Phe Gln Leu
965 970 975
Arg Ala His Met Tyr Gln Ala Arg Ser Leu Phe Ala Ala Asp Ser Ser
980 985 990
Gly Leu Ser Asp Pro Phe Ala Arg Val Phe Phe Ile Asn Gln Ser Gln
995 1000 1005
Cys Thr Glu Val Leu Asn Glu Thr Leu Cys Pro Thr Trp Asp Gln
1010 1015 1020
Met Leu Val Phe Asp Asn Leu Glu Leu Tyr Gly Glu Ala His Glu
1025 1030 1035
Leu Arg Asp Asp Pro Pro Ile Ile Val Ile Glu Ile Tyr Asp Gln
1040 1045 1050
Asp Ser Met Gly Lys Ala Asp Phe Met Gly Arg Thr Phe Ala Lys
1055 1060 1065
Pro Leu Val Lys Met Ala Asp Glu Ala Tyr Cys Pro Pro Arg Phe
1070 1075 1080
Pro Pro Gln Leu Glu Tyr Tyr Gln Ile Tyr Arg Gly Ser Ala Thr
1085 1090 1095
Ala Gly Asp Leu Leu Ala Ala Phe Glu Leu Leu Gln Ile Gly Pro
1100 1105 1110
Ser Gly Lys Ala Asp Leu Pro Pro Ile Asn Gly Pro Val Asp Met
1115 1120 1125
Asp Arg Gly Pro Ile Met Pro Val Pro Val Gly Ile Arg Pro Val
1130 1135 1140
Leu Ser Lys Tyr Arg Val Glu Val Leu Phe Trp Gly Leu Arg Asp
1145 1150 1155
Leu Lys Arg Val Asn Leu Ala Gln Val Asp Arg Pro Arg Val Asp
1160 1165 1170
Ile Glu Cys Ala Gly Lys Gly Val Gln Ser Ser Leu Ile His Asn
1175 1180 1185
Tyr Lys Lys Asn Pro Asn Phe Asn Thr Leu Val Lys Trp Phe Glu
1190 1195 1200
Val Asp Leu Pro Glu Asn Glu Leu Leu His Pro Pro Leu Asn Ile
1205 1210 1215
Arg Val Val Asp Cys Arg Ala Phe Gly Arg Tyr Thr Leu Val Gly
1220 1225 1230
Ser His Ala Val Ser Ser Leu Arg Arg Phe Ile Tyr Arg Pro Pro
1235 1240 1245
Asp Arg Ser Ala Pro Asn Trp Asn Thr Thr Gly Glu Val Val Val
1250 1255 1260
Ser Met Glu Pro Glu Glu Pro Val Lys Lys Leu Glu Thr Met Val
1265 1270 1275
Lys Leu Asp Ala Thr Ser Asp Ala Val Val Lys Val Asp Val Ala
1280 1285 1290
Glu Asp Glu Lys Glu Arg Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly Pro Ser
1295 1300 1305
Glu Glu Pro Glu Glu Glu Glu Pro Asp Glu Ser Met Leu Asp Trp
1310 1315 1320
Trp Ser Lys Tyr Phe Ala Ser Ile Asp Thr Met Lys Glu Gln Leu
1325 1330 1335
Arg Gln His Glu Thr Ser Gly Thr Asp Leu Glu Glu Lys Glu Glu
1340 1345 1350
Met Glu Ser Ala Glu Gly Leu Lys Gly Pro Met Lys Ser Lys Glu
1355 1360 1365
Lys Ser Arg Ala Ala Lys Glu Glu Lys Lys Lys Lys Asn Gln Ser
1370 1375 1380
Pro Gly Pro Gly Gln Gly Ser Glu Ala Pro Glu Lys Lys Lys Ala
1385 1390 1395
Lys Ile Asp Glu Leu Lys Val Tyr Pro Lys Glu Leu Glu Ser Glu
1400 1405 1410
Phe Asp Ser Phe Glu Asp Trp Leu His Thr Phe Asn Leu Leu Arg
1415 1420 1425
Gly Lys Thr Gly Asp Asp Glu Asp Gly Ser Thr Glu Glu Glu Arg
1430 1435 1440
Ile Val Gly Arg Phe Lys Gly Ser Leu Cys Val Tyr Lys Val Pro
1445 1450 1455
Leu Pro Glu Asp Val Ser Arg Glu Ala Gly Tyr Asp Pro Thr Tyr
1460 1465 1470
Gly Met Phe Gln Gly Ile Pro Ser Asn Asp Pro Ile Asn Val Leu
1475 1480 1485
Val Arg Ile Tyr Val Val Arg Ala Thr Asp Leu His Pro Ala Asp
1490 1495 1500
Ile Asn Gly Lys Ala Asp Pro Tyr Ile Ala Ile Lys Leu Gly Lys
1505 1510 1515
Thr Asp Ile Arg Asp Lys Glu Asn Tyr Ile Ser Lys Gln Leu Asn
1520 1525 1530
Pro Val Phe Gly Lys Ser Phe Asp Ile Glu Ala Ser Phe Pro Met
1535 1540 1545
Glu Ser Met Leu Thr Val Ala Val Tyr Asp Trp Asp Leu Val Gly
1550 1555 1560
Thr Asp Asp Leu Ile Gly Glu Thr Lys Ile Asp Leu Glu Asn Arg
1565 1570 1575
Phe Tyr Ser Lys His Arg Ala Thr Cys Gly Ile Ala Gln Thr Tyr
1580 1585 1590
Ser Ile His Gly Tyr Asn Ile Trp Arg Asp Pro Met Lys Pro Ser
1595 1600 1605
Gln Ile Leu Thr Arg Leu Cys Lys Glu Gly Lys Val Asp Gly Pro
1610 1615 1620
His Phe Gly Pro His Gly Arg Val Arg Val Ala Asn Arg Val Phe
1625 1630 1635
Thr Gly Pro Ser Glu Ile Glu Asp Glu Asn Gly Gln Arg Lys Pro
1640 1645 1650
Thr Asp Glu His Val Ala Leu Ser Ala Leu Arg His Trp Glu Asp
1655 1660 1665
Ile Pro Arg Val Gly Cys Arg Leu Val Pro Glu His Val Glu Thr
1670 1675 1680
Arg Pro Leu Leu Asn Pro Asp Lys Pro Gly Ile Glu Gln Gly Arg
1685 1690 1695
Leu Glu Leu Trp Val Asp Met Phe Pro Met Asp Met Pro Ala Pro
1700 1705 1710
Gly Thr Pro Leu Asp Ile Ser Pro Arg Lys Pro Lys Lys Tyr Glu
1715 1720 1725
Leu Arg Val Ile Val Trp Asn Thr Asp Glu Val Val Leu Glu Asp
1730 1735 1740
Asp Asp Phe Phe Thr Gly Glu Lys Ser Ser Asp Ile Phe Val Arg
1745 1750 1755
Gly Trp Leu Lys Gly Gln Gln Glu Asp Lys Gln Asp Thr Asp Val
1760 1765 1770
His Tyr His Ser Leu Thr Gly Glu Gly Asn Phe Asn Trp Arg Tyr
1775 1780 1785
Leu Phe Pro Phe Asp Tyr Leu Ala Ala Glu Glu Lys Ile Val Met
1790 1795 1800
Ser Lys Lys Glu Ser Met Phe Ser Trp Asp Glu Thr Glu Tyr Lys
1805 1810 1815
Ile Pro Ala Arg Leu Thr Leu Gln Ile Trp Asp Ala Asp His Phe
1820 1825 1830
Ser Ala Asp Asp Phe Leu Gly Ala Ile Glu Leu Asp Leu Asn Arg
1835 1840 1845
Phe Pro Arg Gly Ala Lys Thr Ala Lys Gln Cys Thr Met Glu Met
1850 1855 1860
Ala Thr Gly Glu Val Asp Val Pro Leu Val Ser Ile Phe Lys Gln
1865 1870 1875
Lys Arg Val Lys Gly Trp Trp Pro Leu Leu Ala Arg Asn Glu Asn
1880 1885 1890
Asp Glu Phe Glu Leu Thr Gly Lys Val Glu Ala Glu Leu His Leu
1895 1900 1905
Leu Thr Ala Glu Glu Ala Glu Lys Asn Pro Val Gly Leu Ala Arg
1910 1915 1920
Asn Glu Pro Asp Pro Leu Glu Lys Pro Asn Arg Pro Asp Thr Ala
1925 1930 1935
Phe Val Trp Phe Leu Asn Pro Leu Lys Ser Ile Lys Tyr Leu Ile
1940 1945 1950
Cys Thr Arg Tyr Lys Trp Leu Ile Ile Lys Ile Val Leu Ala Leu
1955 1960 1965
Leu Gly Leu Leu Met Leu Ala Leu Phe Leu Tyr Ser Leu Pro Gly
1970 1975 1980
Tyr Met Val Lys Lys Leu Leu Gly Ala
1985 1990
<210> 10
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 10
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttc 143
<210> 11
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 11
acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc 60
ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc 120
gcgcagagag ggagtggcca acc 143
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 12
cacttgcttt gtctcatctc c 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 13
gtcacttctt ctgggtattt c 21
<210> 14
<211> 6967
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> pTR22-smCBA-耳畸蛋白NT Hs var 1 5-APSD-AP头
<400> 14
aggggggggg gggggggggt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 60
cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg 120
agcgcgcaga gagggagtgg ccaactccat cactaggggt tcctcagatc tggcgcgccc 180
aattcggtac cctagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 240
tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 300
cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 360
ccattgacgt caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 420
gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 480
ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 540
catcgctatt accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc 600
cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg 660
ggcggggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg 720
ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt 780
tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt 840
cgctgcgacg ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc cgcccgcccc 900
ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg 960
gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc 1020
ttgaggggct ccgggagcta gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct 1080
acagctcctg ggcaacgtgc tggttattgt gctgtctcat cattttggca aagaattcta 1140
gcggccgcca ccatggcctt gctcatccac ctcaagacag tctcggagct gcggggcagg 1200
ggcgaccgga tcgccaaagt gactttccga gggcaatcct tctactctcg ggtcctggag 1260
aactgtgagg atgtggctga ctttgatgag acatttcggt ggccggtggc cagcagcatc 1320
gacagaaatg agatgctgga gattcaggtt ttcaactaca gcaaagtctt cagcaacaag 1380
ctcatcggga ccttccgcat ggtgctgcag aaggtggtag aggagagcca tgtggaggtg 1440
actgacacgc tgattgatga caacaatgct atcatcaaga ccagcctgtg cgtggaggtc 1500
cggtatcagg ccactgacgg cacagtgggc tcctgggacg atggggactt cctgggagat 1560
gagtctcttc aagaggaaga gaaggacagc caagagacgg atggactgct cccaggctcc 1620
cggcccagct cccggccccc aggagagaag agcttccgga gagccgggag gagcgtgttc 1680
tccgccatga agctcggcaa aaaccggtct cacaaggagg agccccaaag accagatgaa 1740
ccggcggtgc tggagatgga agaccttgac catctggcca ttcggctagg agatggactg 1800
gatcccgact cggtgtctct agcctcagtc acagctctca ccactaatgt ctccaacaag 1860
cgatctaagc cagacattaa gatggagcca agtgctgggc ggcccatgga ttaccaggtc 1920
agcatcacgg tgatcgaggc ccggcagctg gtgggcttga acatggaccc tgtggtgtgc 1980
gtggaggtgg gtgacgacaa gaagtacaca tccatgaagg agtccactaa ctgcccctat 2040
tacaacgagt acttcgtctt cgacttccat gtctctccgg atgtcatgtt tgacaagatc 2100
atcaagattt cggtgattca ctccaagaac ctgctgcgca gtggcaccct ggtgggctcc 2160
ttcaaaatgg acgtgggaac cgtgtactcg cagccagagc accagttcca tcacaagtgg 2220
gccatcctgt ctgaccccga tgacatctcc tcggggctga agggctacgt gaagtgtgac 2280
gttgccgtgg tgggcaaagg ggacaacatc aagacgcccc acaaggccaa tgagaccgac 2340
gaagatgaca ttgaggggaa cttgctgctc cccgaggggg tgccccccga acgccagtgg 2400
gcccggttct atgtgaaaat ttaccgagca gaggggctgc cccgtatgaa cacaagcctc 2460
atggccaatg taaagaaggc tttcatcggt gaaaacaagg acctcgtgga cccctacgtg 2520
caagtcttct ttgctggcca gaagggcaag acttcagtgc agaagagcag ctatgagccc 2580
ctgtggaatg agcaggtcgt ctttacagac ctcttccccc cactctgcaa acgcatgaag 2640
gtgcagatcc gagactcgga caaggtcaac gacgtggcca tcggcaccca cttcattgac 2700
ctgcgcaaga tttctaatga cggagacaaa ggcttcctgc ccacactggg cccagcctgg 2760
gtgaacatgt acggctccac acgtaactac acgctgctgg atgagcatca ggacctgaac 2820
gagggcctgg gggagggtgt gtccttccgg gcccggctcc tgctgggcct ggctgtggag 2880
atcgtagaca cctccaaccc tgagctcacc agctccacag aggtgcaggt ggagcaggcc 2940
acgcccatct cggagagctg tgcaggtaaa atggaagaat tctttctctt tggagccttc 3000
ctggaggcct caatgatcga ccggagaaac ggagacaagc ccatcacctt tgaggtcacc 3060
ataggcaact atgggaacga agttgatggc ctgtcccggc cccagcggcc tcggccccgg 3120
aaggagccgg gggatgagga agaagtagac ctgattcaga acgcaagtga tgacgaggcc 3180
ggtgatgccg gggacctggc ctcagtctcc tccactccac caatgcggcc ccaggtcacc 3240
gacaggaact acttccatct gccctacctg gagcgaaagc cctgcatcta catcaagagc 3300
tggtggccgg accagcgccg ccgcctctac aatgccaaca tcatggacca cattgccgac 3360
aagctggaag aaggcctgaa cgacatacag gagatgatca aaacggagaa gtcctaccct 3420
gagcgtcgcc tgcggggcgt cctggaggag ctgagctgtg gctgctgccg cttcctctcc 3480
ctcgctgaca aggaccaggg ccactcatcc cgcaccaggc ttgaccggga gcgcctcaag 3540
tcctgcatga gggagctggt aagtatcaag gttacaagac aggtttaagg agaccaatag 3600
aaactgggct tgtcgagaca gagaagactc ttgcgtttct gagctagccc ccgggtgcgc 3660
ggcgtcggtg gtgccggcgg ggggcgccag gtcgcaggcg gtgtagggct ccaggcaggc 3720
ggcgaaggcc atgacgtgcg ctatgaaggt ctgctcctgc acgccgtgaa ccaggtgcgc 3780
ctgcgggccg cgcgcgaaca ccgccacgtc ctcgcctgcg tgggtctctt cgtccagggg 3840
cactgctgac tgctgccgat actcggggct cccgctctcg ctctcggtaa catccggccg 3900
ggcgccgtcc ttgagcacat agcctggacc gtttcgtcga ctgttaatta agcatgctgg 3960
ggagagatct aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg 4020
ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca 4080
gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaaccccc cccccccccc ccctgcagcc 4140
ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 4200
gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 4260
cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 4320
tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 4380
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 4440
aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 4500
cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 4560
gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 4620
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 4680
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 4740
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 4800
tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 4860
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 4920
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 4980
ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 5040
agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 5100
atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 5160
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 5220
ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 5280
ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 5340
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ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg 4560
cgacctttgg tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagagaggga gtggccaacc 4620
cccccccccc cccccctgca gccctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 4680
gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 4740
ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 4800
gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 4860
aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 4920
gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 4980
ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 5040
cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt 5100
cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 5160
gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 5220
cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 5280
agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg 5340
ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 5400
ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 5460
gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 5520
cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 5580
attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 5640
accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 5700
ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 5760
gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 5820
agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 5880
ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 5940
ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 6000
gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 6060
ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 6120
tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 6180
tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 6240
cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 6300
tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 6360
gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 6420
tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 6480
ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 6540
attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc 6600
cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt atcatgacat 6660
taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg 6720
gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg 6780
ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc 6840
ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac 6900
cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggaaatt gtaaacgtta atattttgtt 6960
aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg 7020
caaaatccct tataaatcaa aagaatagac cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg 7080
gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta 7140
tcagggcgat ggcccactac gtgaaccatc accctaatca agttttttgg ggtcgaggtg 7200
ccgtaaagca ctaaatcgga accctaaagg gagcccccga tttagagctt gacggggaaa 7260
gccggcgaac gtggcgagaa aggaagggaa gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct 7320
ggcaagtgta gcggtcacgc tgcgcgtaac caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct 7380
acagggcgcg tcgcgccatt cgccattcag gctacgcaac tgttgggaag ggcgatcggt 7440
gcgggcctct tcgctattac gccaggctgc 7470

Claims (28)

1.一种增加细胞中耳畸蛋白表达的方法，所述方法包括：
使细胞与包含第一多核苷酸的第一AAV颗粒接触；以及
使细胞与包含第二多核苷酸的第二AAV颗粒接触，其中
(i)第一多核苷酸包含位于表达盒侧翼的反向末端重复序列，所述表达盒从5’至3’含有：
(a)启动子，
(b)编码耳畸蛋白多肽N-末端部分的部分编码序列，
(c)剪接供体位点，和
(d)第一同源性区域，其含有与第二多核苷酸中的序列同源的序列，并且
(ii)第二多核苷酸包含位于表达盒侧翼的反向末端重复序列，所述表达盒从5’至3’含有：
(a)第二同源性区域，其含有与第一多核苷酸中的序列同源的序列，
(b)剪接受体位点，
(c)编码耳畸蛋白多肽C-末端部分的部分编码序列，和
(d)聚腺苷酸化(pA)信号序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中第一多核苷酸和第二多核苷中的同源性区域在50至500个核苷酸之间。
3.根据权利要求2所述的方法，其中第一多核苷酸和第二多核苷中的同源性区域在50至300个核苷酸之间。
4.根据权利要求3所述的方法，其中同源性区域包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中启动子是嵌合CMVβ肌动蛋白(smcBA)启动子。
6.根据权利要求所述5的方法，其中启动子包含SEQ ID NO:4的序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中耳畸蛋白多肽包含SEQ ID NO:5或SEQID NO:6的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中剪接供体位点包含SEQ ID NO:7的序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中剪接受体位点包含SEQ ID NO:8的序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中反向末端重复序列是AAV2反向末端重复序列。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中第一AAV颗粒和第二AAV颗粒是AAV2血清型颗粒。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中细胞是离体的。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中细胞是体内的。
14.根据权利要求13所述的方法，其中细胞在哺乳动物受试者中。
15.根据权利要求14所述的方法，其中受试者患有常染色体隐性遗传性耳聋9(DFNB9)。
16.一种组合物，其包含：
包含第一多核苷酸的第一AAV颗粒；和
包含第二多核苷酸的第二AAV颗粒，其中
(i)第一多核苷酸包含位于表达盒侧翼的反向末端重复序列，所述表达盒从5’至3’含有：
(a)启动子，
(b)编码耳畸蛋白多肽N-末端部分的部分编码序列，
(c)剪接供体位点，和
(d)第一同源性区域，其含有与第二多核苷酸中的序列同源的序列，并且
(ii)第二多核苷酸包含位于表达盒侧翼的反向末端重复序列，所述表达盒从5’至3’含有：
(a)第二同源性区域，其含有与第一多核苷酸中的序列同源的序列，
(b)剪接受体位点，
(c)编码耳畸蛋白多肽C-末端部分的部分编码序列，和
(d)聚腺苷酸化(pA)信号序列。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中第一多核苷酸和第二多核苷中的同源性区域在50至500个核苷酸之间。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中第一多核苷酸和第二多核苷中的同源性区域在50至300个核苷酸之间。
19.根据权利要求18所述的组合物，其中同源性区域包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的组合物，其中启动子是嵌合CMVβ肌动蛋白(smcBA)启动子。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中启动子包含SEQ ID NO:4的序列。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的组合物，其中耳畸蛋白多肽包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
23.根据权利要求16至22中任一项所述的组合物，其中剪接供体位点包含SEQ ID NO:7的序列。
24.根据权利要求16至23中任一项所述的组合物，其中剪接受体位点包含SEQ ID NO:8的序列。
25.根据权利要求16至24中任一项所述的组合物，其中反向末端重复序列是AAV2反向末端重复序列。
26.根据权利要求16至25中任一项所述的组合物，其中第一AAV颗粒和第二AAV颗粒是AAV2血清型颗粒。
27.根据权利要求16至26中任一项所述的组合物，还包含药学上可接受的载体。
28.一种试剂盒，其包含权利要求16至27中任一项所述的组合物。
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