JP2023070682A - オトフェルリンを発現させるための組成物および方法 - Google Patents

オトフェルリンを発現させるための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

【課題】本明細書において提供されるのは、例として、アデノ随伴ウイルス(AAV)粒子を利用した、オトフェルリンを発現させるための方法および組成物である。【解決手段】かかる方法および組成物は、難聴、常染色体劣性9(DFNB9)などの疾患の処置のために有用であり得る。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、2017年5月5日に出願された米国仮特許出願番号62/502,462への優先権を主張し、その全開示が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究
この発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号EY000331、EY021721、およびDC012118の下、政府の支援によりなされた。政府は発明において一定の権利を有する。
発明の背景
非症候性難聴は、一般的に内耳および/または中耳の欠陥または損傷によって引き起こされる聴力喪失の型である。タンパク質オトフェルリンをコードするOTOF遺伝子における突然変異は、「難聴、常染色体劣性9(DFNB9)」と呼ばれる非症候性難聴のタイプを引き起こすと考えられる。DFNB9および他の類似した形の難聴の処置は、現在、重症または重度の聴力喪失のための蝸牛移植、およびより軽症型の聴力喪失のための補聴器を使用することが関与するものである。聴力を復元させるための電子デバイスに頼らないかまたは頼る度合いが少ない代替的な処置の形へのニーズが残っている。
本明細書において提供されるのは、オトフェルリンを、例として、細胞または対象中において、発現させるための組成物および方法である。本明細書に記載のとおり、OTOF cDNAの異なる部分を含有する二重(dual)アデノ随伴ウイルス(AAV)系を介した、OTOFノックアウトマウスへのOTOF cDNAの送達は、マウスの聴力を野生型のレベル近くまでレスキューする能力があったということが見出されている。
いくつかの側面において、本開示は、細胞においてオトフェルリンの発現を増加させる方法に関し、方法は、細胞を、第1のポリヌクレオチドを含む第1のAAV粒子に接触させること;および、細胞を、第2のポリヌクレオチドを含む第2のAAV粒子に接触させること、を含み、ここで、第1のポリヌクレオチドは、5’から3’へ向かって:(a)プロモーター、(b)オトフェルリンポリペプチドのN末端部分をコードする部分コード配列、(c)スプライスドナー部位、および(d)第2のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第1の相同の領域、を含有する発現カセットに隣接する逆方向末端反復配列を含み、第2のポリヌクレオチドは、5’から3’へ向かって:(a)第1のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第2の相同の領域、(b)スプライスアクセプター部位、(c)オトフェルリンポリペプチドのC末端部分をコードする部分コード配列、および(d)ポリアデニル化(pA)シグナル配列、を含有する発現カセットに隣接する逆方向末端反復配列を含む。
いくつかの態様において、第1および第2のポリヌクレオチドにおける相同の領域は、50~500ヌクレオチドの間である。いくつかの態様において、第1および第2のポリヌクレオチドにおける相同の領域は、50~300ヌクレオチドの間であるいくつかの態様において、相同の領域は、配列番号3のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、プロモーターは、キメラCMVβアクチン(smcBA)プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、配列番号4の配列を含む。いくつかの態様において、オトフェルリンポリペプチドは、配列番号5または配列番号6のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、スプライスドナー部位は、配列番号7の配列を含む。いくつかの態様において、スプライスアクセプター部位は、配列番号8の配列を含む。いくつかの態様において、逆方向末端反復配列は、AAV2逆方向末端反復配列である。いくつかの態様において、第1および第2のAAV粒子は、AAV2血清型粒子である。いくつかの態様において、細胞は、ex vivoである。いくつかの態様において、細胞は、in vivoである。いくつかの態様において、細胞は、哺乳動物対象中にある。いくつかの態様において、対象は、難聴、常染色体劣性9(DFNB9)を有する。
他の側面において、本開示は、第1のポリヌクレオチドを含む第1のAAV粒子;および第2のポリヌクレオチドを含む第2のAAV粒子、を含む組成物を提供し、ここで、第1のポリヌクレオチドは、5’から3’へ向かって:(a)プロモーター、(b)オトフェルリンポリペプチドのN末端部分をコードする部分コード配列、(c)スプライスドナー部位、および(d)第2のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第1の相同の領域、を含有する発現カセットに隣接する逆方向末端反復配列を含み、第2のポリヌクレオチドは、5’から3’へ向かって:(a)第1のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第2の相同の領域、(b)スプライスアクセプター部位、(c)オトフェルリンポリペプチドのC末端部分をコードする部分コード配列、および(d)ポリアデニル化(pA)シグナル配列、を含有する発現カセットに隣接する逆方向末端反復配列を含む。
いくつかの態様において、第1および第2のポリヌクレオチドにおける相同の領域は、50~500ヌクレオチドの間である。いくつかの態様において、第1および第2のポリヌクレオチドにおける相同の領域は、50~300ヌクレオチドの間である。いくつかの態様において、相同の領域は、配列番号3のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、プロモーターは、キメラCMVβアクチン(smcBA)プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、配列番号4の配列を含む。いくつかの態様において、オトフェルリンポリペプチドは、配列番号5または配列番号6のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、スプライスドナー部位は、配列番号7の配列を含む。いくつかの態様において、スプライスアクセプター部位は、配列番号8の配列を含む。いくつかの態様において、逆方向末端反復配列は、AAV2逆方向末端反復配列である。いくつかの態様において、第1および第2のAAV粒子は、AAV2血清型粒子である。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容し得る担体をさらに含む。
さらにまた他の側面において、本開示は、本明細書に記載のとおりの組成物を含むか、または本明細書に記載のとおりの第1のAAV粒子および本明細書に記載のとおりの第2のAAV粒子を含む、キットを提供する。
これらおよび他の側面は、本明細書において、より詳細に記載される。
図面の簡単な説明
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、および、これらの図面の1つ以上と本明細書に提示された具体的な実施形態の詳細な記載を組み合わせて参考にすることによってより良く理解されることができる、本開示のある側面を、さらに実証するために包含される。
図1Aは、CMVエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーター、マウスオトフェルリンcDNAの5’区間(オトフェルリンNT)、スプライスドナー配列(APSD)、および組み換えのための相同配列(APhead)、に隣接するAAV2逆方向末端反復(TR)を含有する、プラスミドのマップである。 図1Bは、組み換えのための相同配列(APhead)、スプライスアクセプター配列(APSA)、マウスオトフェルリンcDNAの3’区間(オトフェルリンCT)、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(bGHポリA)、に隣接するAAV2逆方向末端反復(TR)を含有する、プラスミドのマップである。 図2は、図1Aおよび1Bにおけるプラスミド中の2つの発現カセットの概略である。
図3Aは、図1Aにおけるプラスミドについての、逆方向末端反復(TR)を包含する、発現カセットのアノテーションされた配列を示す。 図3Aは、図1Aにおけるプラスミドについての、逆方向末端反復(TR)を包含する、発現カセットのアノテーションされた配列を示す。 図3Aは、図1Aにおけるプラスミドについての、逆方向末端反復(TR)を包含する、発現カセットのアノテーションされた配列を示す。 図3Bは、図1Bにおけるプラスミドについての、逆方向末端反復(TR)を包含する、発現カセットのアノテーションされた配列を示す。 図3Bは、図1Bにおけるプラスミドについての、逆方向末端反復(TR)を包含する、発現カセットのアノテーションされた配列を示す。 図3Bは、図1Bにおけるプラスミドについての、逆方向末端反復(TR)を包含する、発現カセットのアノテーションされた配列を示す。
図4は、AAV2-OTOF-NT(AAV-NT)、またはAAV2-OTOF-NTおよびAAV2-OTOF-CT(AAV2-NT+CT)で処置されたHEK 293細胞中のOTOFタンパク質の発現を示す一連の写真である。 図5は、AAV2-GFPで処置された野生型マウスからの蝸牛のコルチ器官の表面プレパレーション(surface preparations)におけるGFPの発現を示す一連の写真である。 図6A~Dは、P1~P3マウスの蝸牛におけるOTOF発現を示す一連の写真およびグラフである。図6Aは、中回転(mid-turn)におけるOTOFタンパク質の発現を示す。図6Bは、頂(apex)におけるOTOFタンパク質の発現を示す。 図6Cは、野生型マウス(WT、n=6)とAAV2-OTOF-NTおよびAAV2-OTOF-CTで処置されたOTOFノックアウトマウス(Res. KO NT+CT、n=6)とにおける、基底(base)、中回転および頂におけるOTOF発現の違いを示す。棒の各対における左の棒はWTであり、棒の各対における右の棒はRes. KO NT+CTである。図6Dは、野生型(WT)、OTOFノックアウトマウス(KO)、ならびにAAV2-OTOF-NTおよびAAV2-OTOF-CTで処置されたOTOFノックアウトマウス(Res. KO)におけるOTOF mRNAのRT-PCRを示す。
図7A~Dは、マウスにおける聴力評価を示す。図7Aは、野生型マウス(WT)、未処置のもの(KO/KO NT)かまたはAAV2-OTOF-NTおよびAAV2-OTOF-CTで処置されたもの(レスキューされたKO)のいずれかであるOTOFノックアウトマウスにおける、聴性刺激により誘導された聴性脳幹反応(ABR)パターンのトレースである。 図7Bは、野生型マウス(WT)、未処置のオトフェルリンノックアウトマウス(KO)、AAV2-OTOF-NTおよびAAV2-OTOF-CTで処置されたオトフェルリンノックアウトマウス(Res KO NT+CT)、ならびにAAV2-OTOF-NTで処置されたオトフェルリンノックアウトマウス(KO +NT)における聴性脳幹反応(ABR)閾値を示す。 図7C は、野生型マウス(WT)、未処置のOTOFノックアウトマウス(KO)、AAV2-OTOF-NTおよびAAV2-OTOF-CTで処置されたオトフェルリンノックアウトマウス(レスキューされたKO NT+CT)、ならびにAAV2-OTOF-NTで処置されたオトフェルリンノックアウトマウス(KONT)における聴力回復の経時変化を示す。 図7Dは、野生型マウス(WT)、未処置のオトフェルリンノックアウトマウス(KO)、AAV2-OTOF-NTおよびAAV2-OTOF-CTで処置されたオトフェルリンノックアウトマウス(Res. KO(NT+CT))、ならびにAAV2-OTOF-NTで処置されたオトフェルリンノックアウトマウス(KO+NT)におけるクリックABR閾値を示す。
図8AおよびBは、OTOFレスキューされたKOマウス内有毛細胞におけるオトフェルリンタンパク質発現を示す。図8Aは、P12およびそれよりも高齢の、AAV2-OTOF-NTおよびAAV2-OTOF-CTで処置されたマウスにおける、OTOFタンパク質発現を示す。図8Bは、野生型マウス(WT、n=5)、ならびにAAV2-OTOF-NTおよびAAV2-OTOF-CTで処置されたOTOFノックアウトマウス(レスキューされたKO、n=5)における、OTOFを発現している内有毛細胞の割合を示す。棒の各対における左の棒はWTであり、棒の各対における右の棒はレスキューされたKOである。 図9Aおよび9Bは、聴力評価を示す一連のグラフである。図9Aは、野生型マウス(WT)、OTOFノックアウトマウス(KO)、ならびにAAV2-OTOF-NTおよびAAV2-OTOF-CTで処置されたOTOFノックアウトマウス(レスキューされたKO)におけるABR閾値の数値を示す。図9Bは、WT、KOおよびレスキューされたKOマウスにおける聴力の寿命を示す。 図10は、CMVエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーター、ヒトオトフェルリンcDNAの5’区間(オトフェルリンNT)、スプライスドナー配列(APSD)、および組み換えのための相同配列(APhead)、に隣接するAAV2逆方向末端反復(TR)を含有する、プラスミドのマップである。 図11は、組み換えのための相同配列(APhead)、スプライスアクセプター配列(APSA)、オトフェルリン1のアイソフォームをコードするヒトオトフェルリンcDNAの3’区間(オトフェルリンCT)、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(bGHポリA)、に隣接するAAV2逆方向末端反復(TR)を含有する、プラスミドのマップである。
図12は、組み換えのための相同配列(APhead)、スプライスアクセプター配列(APSA)、オトフェルリン5のアイソフォームをコードするマウスオトフェルリンcDNAの3’区間(オトフェルリンCT)、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル(bGHポリA)、に隣接するAAV2逆方向末端反復(TR)を含有する、プラスミドのマップである。 図13は、図10におけるプラスミドについての、逆方向末端反復(TR)を包含する、ヒトOTOF N末端発現カセットのアノテーションされた配列を示す。 図13は、図10におけるプラスミドについての、逆方向末端反復(TR)を包含する、ヒトOTOF N末端発現カセットのアノテーションされた配列を示す。 図13は、図10におけるプラスミドについての、逆方向末端反復(TR)を包含する、ヒトOTOF N末端発現カセットのアノテーションされた配列を示す。
図14は、図11におけるプラスミドについての、逆方向末端反復(TR)を包含する、アイソフォーム1のためのヒトOTOF C末端発現カセットのアノテーションされた配列を示す。 図14は、図11におけるプラスミドについての、逆方向末端反復(TR)を包含する、アイソフォーム1のためのヒトOTOF C末端発現カセットのアノテーションされた配列を示す。 図14は、図11におけるプラスミドについての、逆方向末端反復(TR)を包含する、アイソフォーム1のためのヒトOTOF C末端発現カセットのアノテーションされた配列を示す。 図15は、図12におけるプラスミドについての、逆方向末端反復(TR)を包含する、アイソフォーム5のためのヒトOTOF C末端発現カセットのアノテーションされた配列を示す。 図15は、図12におけるプラスミドについての、逆方向末端反復(TR)を包含する、アイソフォーム5のためのヒトOTOF C末端発現カセットのアノテーションされた配列を示す。 図15は、図12におけるプラスミドについての、逆方向末端反復(TR)を包含する、アイソフォーム5のためのヒトOTOF C末端発現カセットのアノテーションされた配列を示す。
発明の詳細な記載
本明細書に記載のとおり、オトフェルリンノックアウトマウスにおける聴力を、1つがOTOF cDNAの5’部分を含み、および、1つがOTOF cDNAの3’部分を含み、および、各々がin vivoにおける5’部分と3’部分との間の相同的組み換えを促進するための相同の領域を含む、2つの別々のAAV粒子で、マウスを処置することによって、回復させることができるということが見出されている。この相同の領域には、OTOF cDNAの5’部分内の5’側にあるスプライスドナー配列、およびOTOF cDNAの3’部分内の3’側にあるスプライスアクセプター配列が隣接している。したがって、組成物および方法は、オトフェルリンの発現を増加させるために提供される。
例示の定義
別様に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似のまたは同等のあらゆる方法および材料を、本発明の実施または試験のために使用することができるが、好ましい方法および材料が本明細書に記載される。本発明の目的のために、以下の用語は、下記に定義される:
本明細書で使用される用語「核酸」および「ポリヌクレオチド配列」は、一本鎖型または二本鎖型のいずれかにおける、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、および、別様に限定されない限り、自然発生のヌクレオチドと同じように機能することができる天然のヌクレオチドの知られているアナログを網羅する。
用語「実質的に~に対応する」、「実質的に相同」、または「実質的に同一」は、本明細書で使用されるとき、選択された核酸またはアミノ酸配列が、選択された参照核酸配列または参照アミノ酸配列の配列と比較すると、少なくとも約70もしくは約75パーセントの配列同一性を有するという、核酸またはアミノ酸配列の特徴を指し示す。より典型的には、選択された配列と参照配列とが、少なくとも約76、77、78、79、80、81、82、83、84または85パーセントもの配列同一性を有し、および、より好ましくは、少なくとも約86、87、88、89、90、91、92、93、94、または95パーセントの配列同一性を有する。なおもより好ましくは、高度に相同な配列は、しばしば、選択された配列とそれが比較される参照配列との間で少なくとも約96、97、98、または99パーセントよりも、大きな配列同一性を共有する。
配列同一性の割合は、比較される配列の全体の長さにわたって算出されてもよいし、または、選ばれた参照配列の約25パーセントくらいよりも合計が少ない小さな欠失または不可を除外することにより算出されてもよい。参照配列は、遺伝子もしくは隣接配列の部分、または染色体の反復部分などの、より大きな配列のサブセットであってもよい。しかしながら、2つ以上のポリヌクレオチド配列の配列相同性の場合、参照配列は、典型的には、少なくとも約18~25ヌクレオチド、より典型的には26~35ヌクレオチド、および、なおもより典型的には、少なくとも約40、50、60、70、80、90、または100くらいものヌクレオチドを含む。
高度に相同なフラグメントが望ましいとき、2つの配列の間のパーセント同一性の程度は、例として、PearsonおよびLipmanによって記載されたFASTAプログラム分析などの、当業者に周知である1つ以上の配列比較アルゴリズムによって容易に決定されるとおり、少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約85%、およびより好ましくは約90%または95%、またはそれより高いものであり得る。
ポリヌクレオチド
いくつかの側面において、ポリヌクレオチドは、オトフェルリンタンパク質をコードするOTOF遺伝子のコード配列の部分を細胞へ送達するために提供される。いくつかの態様において、コード配列は、ヒトOTOF遺伝子に由来する(例として、NCBI遺伝子ID:9381およびcDNA配列 NM_001287489.1、NM_004802.3、NM_194248.2、NM_194322.2、およびNM_194323.2を参照)。いくつかの態様において、コード配列は、マウスOTOF遺伝子に由来する(例として、NCBI遺伝子ID 83762およびcDNA配列 NM_001100395.1、NM_001286421.1、NM_001313767.1、およびNM_031875.2を参照)。いくつかの態様において、第1および第2のポリヌクレオチドが提供される。「第1」、「第2」、「第3」等は、別様に明示的に述べられていない限り、特定の順序または重要性を暗示することを意味するものではないということが理解されるべきである。
いくつかの態様において、第1のポリヌクレオチドは、5’から3’へ向かって、(a)プロモーター、(b)オトフェルリンポリペプチドのN末端部分をコードする部分コード配列、(c)スプライスドナー部位、および(d)第2のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第1の相同の領域、の1つ以上を含有する、発現カセットに隣接する、逆方向末端反復配列を含む。いくつかの態様において、第1のポリヌクレオチドは、(a)、(b)、(c)および(d)の少なくとも2つ、少なくとも3つ、または4つ全てを含む。
いくつかの態様において、第2のポリヌクレオチドは、5’から3’へ向かって、(a)第1のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第2の相同の領域 第2の相同の領域、(b)スプライスアクセプター部位、(c)オトフェルリンポリペプチドのC末端部分をコードする部分コード配列、および(d)ポリアデニル化(pA)シグナル配列、の1つ以上を含有する、発現カセットに隣接する、逆方向末端反復配列を含む。いくつかの態様において、第2のポリヌクレオチドは、(a)、(b)、(c)および(d)の少なくとも2つ、少なくとも3つ、または4つ全てを含む。
本明細書に記載のポリヌクレオチドの内に含有される部分コード配列は、ポリヌクレオチドが送達されると部分コード配列が、例として、相同的組み換えを通して、一緒になって繋ぎ合わされ、およびオトフェルリンポリペプチドをコードする完全コード配列を形成するように、設計され得る。
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、プラスミド(例として、複製の起点、選択可能なマーカー、およびレポーター遺伝子の1つ以上を含む環状核酸)である。いくつかの態様において、プラスミドなどの、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、マーカーまたはレポーター遺伝子、例として、LacZまたは蛍光タンパク質、および、複製の起点をもまた、含有してもよい。いくつかの態様において、プラスミドは、プラスミド内に含有された発現カセットを含有するAAV粒子を生産するプロデューサー細胞中へと、トランスフェクトされる。
いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターなどの核酸ベクターである。本開示による有用である例示のAAV核酸ベクターは、一本鎖(ss)または自己相補的(sc)AAV核酸ベクターを包含する。
いくつかの態様において、組換えAAV粒子は、一本鎖(ss)または自己相補的(sc)AAV核酸ベクターなどのポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のとおりの発現コンストラクト、および、発現コンストラクトに隣接する逆方向末端反復(ITR)配列(例として、野生型ITR配列または人工的に作り出されたITR配列)を、含有する。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、ウイルスカプシドによってカプシド化されている。
したがって、いくつかの態様において、AAV粒子は、ウイルスカプシド、および、ウイルスカプシドによってカプシド化された本明細書に記載のとおりのポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ウイルスカプシドは、VP1、VP2およびVP3を含む60のカプシドタンパク質サブユニットを含む。いくつかの態様において、VP1、VP2、およびVP3サブユニットは、それぞれ、およそ1:1:10の比率でカプシド中に存在する。
いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりのポリヌクレオチド(例として、第1および第2のポリヌクレオチド)は、相同の領域を、例として、ひとたび細胞へ送達されるとポリヌクレオチド間の相同的組み換えを促進するために、含んでいる(例として、Ghosh et al. Efficient transgene reconstitution with hybrid dual AAV vectors carrying the minimized bridging sequences. Hum Gene Ther. 2011 Jan;22(1):77-83を参照)。いくつかの態様において、第1の相同の領域および第2の相同の領域は、相同的組み換えを促進するための互いとの配列同一性の閾値レベルを有する。いくつかの態様において、第1の相同の領域は、第2の相同の領域と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%または100%の同一性を有する。
別様に特定しない限り、本明細書で使用されパーセント配列同一性および/または2つの配列の類似度は、KarlinおよびAltschul (1990)のアルゴリズムの、KarlinおよびAltschul (1993)におけるとおりに改変されたものを使用して決定することができる。かかるアルゴリズムは、Altschul et al. (1990)のNBLASTおよびXBLASTプログラム中へと組み込まれている。BLASTサーチは、所望のパーセント配列同一性を有する配列を得るために、NBLASTプログラム、score=100、wordlength=12にて行うことができる。比較の目的のためにギャップを考慮したアラインメントを得るためには、Gapped BLASTを、記載されているとおり使用することができる(Altschul et al., 1997)。BLASTおよびGapped BLASTを利用する場合には、それぞれのプログラム(NBLASTおよびXBLAST)のデフォルトのパラメータを、公開されている方法に従って使用することができる。いくつかの態様において、各々の相同の領域は、独立して、50~500、50~400、50~300、100~500、100~400、100~300、200~500、200~400、または200~300ヌクレオチドの間である。 いくつかの態様において、相同の領域は同一であり、および各々の相同の領域は、50~500、50~400、50~300、100~500、100~400、100~300、200~500、200~400、または200~300ヌクレオチドの間である。
いくつかの態様において、相同領域(region homology)は、ヌクレオチド配列
Figure 2023070682000001

と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100同一である配列を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、1つ以上の調節要素を含んでもよい。当業者は、適切な宿主細胞、例えば、哺乳動物またはヒト宿主細胞における使用のための調節要素を選択することができる。調節要素は、例えば、プロモーター、転写終結配列、翻訳終結配列、エンハンサー、およびポリアデニル化要素である。本明細書に記載のポリヌクレオチドは、オトフェルリンなどの所望のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、プロモーター配列を含んでもよい。主題の発明における使用のために企図されるプロモーターは、これらに限定されないが、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、SV40プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、キメラCMV/ニワトリβアクチンプロモーター(CBA)および切断された(truncated)型のCBA(smCBA)を包含する(例として、それへの明確な参照によって本明細書中にその全体が具体的に組み込まれる、Haire et al. 2006および米国特許第8,298,818号を参照)。いくつかの態様において、プロモーターは、切断されたキメラCMVβアクチン(smcBA)プロモーターである。
いくつかの態様において、プロモーターは、ヌクレオチド配列
Figure 2023070682000002

と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100同一である配列を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりのポリヌクレオチドは、オトフェルリンポリペプチドのN末端またはC末端部分をコードする部分コード配列を含み、ここで、部分コード配列は、オトフェルリンポリペプチドをコードするためにin vivoでスプライシングされるかまたはそうでなければ一緒になって組み合わせられることができる。いくつかの態様において、オトフェルリンポリペプチドは、ヒトオトフェルリンポリペプチドである。いくつかの態様において、オトフェルリンポリペプチドは、ヒトオトフェルリンポリペプチドの長アイソフォームである(例として、Yasunaga et al. OTOF Encodes Multiple Long and Short Isoforms: Genetic Evidence That the Long Ones Underlie Recessive Deafness DFNB9. Am. J. Hum. Genet. 67:591-600, 2000を参照)。
いくつかの態様において、オトフェルリンポリペプチドは、以下のアミノ酸配列の一方または両方と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100同一である配列を含む:
ヒトOTOFアイソフォーム1 - Genbank番号AF183185.1
Figure 2023070682000003

Figure 2023070682000004
ヒトOTOFアイソフォーム5 - Genbank番号NP_001274418
Figure 2023070682000005

Figure 2023070682000006
いくつかの態様において、オトフェルリンポリペプチドは、マウスオトフェルリンポリペプチドである。いくつかの態様において、オトフェルリンポリペプチドは、以下のアミノ酸配列と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100同一である配列を含む:
マウスOTOFアイソフォーム1 - Genbank番号NP_001093865.1
Figure 2023070682000007

Figure 2023070682000008
いくつかの態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、スプライスドナーまたはスプライスアクセプター部位を含む。いくつかの態様において、スプライスドナーおよび/またはスプライスアクセプター部位は、スプライスコンセンサス配列を含有する。いくつかの態様において、スプライスドナーおよび/またはスプライスアクセプター部位は、アルカリホスファターゼに由来するスプライスコンセンサス配列の配列を含有する。
いくつかの態様において、スプライスドナー部位は、ヌクレオチド配列
Figure 2023070682000009

と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100同一である配列を含む。
いくつかの態様において、スプライスアクセプター部位は、ヌクレオチド配列
Figure 2023070682000010

と少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100同一である配列を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、ITR配列を含む。本明細書に記載のポリヌクレオチドのITR配列は、いずれかのAAV血清型(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10)に由来する可能性があるか、または1つより多い血清型に由来する可能性がある。本明細書で提供されるポリヌクレオチドのいくつかの態様において、ITR配列は、AAV2に由来する。ITR配列、およびITR配列を含有するプラスミドは、当該技術分野において知られており、商業的に利用可能である(例として、Vector Biolabs, Philadelphia, PA;Cellbiolabs, San Diego, CA;Agilent Technologies, Santa Clara, Ca;およびAddgene, Cambridge, MAから入手可能な商品およびサービス;ならびに「Gene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein.」Kessler PD, Podsakoff GM, Chen X, McQuiston SA, Colosi PC, Matelis LA, Kurtzman GJ, Byrne BJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Nov 26;93(24):14082-7;およびCurtis A. Machida. 「Methods in Molecular MedicineTM.」 「Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols.」 10.1385/1-59259-304-6:201 (C) Humana Press Inc. 2003. 第10章「Targeted Integration by Adeno-Associated Virus.」 Matthew D. Weitzman, Samuel M. Young Jr., Toni CathomenおよびRichard Jude Samulski;米国特許第5,139,941号および5,962,313号を参照、その全てが参照により本明細書に組み込まれる。)。
発現コンストラクトの5’端に隣接するものについての例示のAAV2 ITR配列は、配列:
Figure 2023070682000011

を含む。
発現コンストラクトの3’端に隣接するものについての例示のAAV2 ITR配列は、配列:
Figure 2023070682000012

を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチドはさらに、1つ以上の転写終結配列、1つ以上の翻訳終結配列、1つ以上のシグナルペプチド配列、1つ以上の内部リボソーム進入部位(IRES)、および/または1つ以上のエンハンサー要素、またはそれらのあらゆる組み合わせを、任意に包含してもよい。転写終結領域は、典型的には、真核生物またはウイルスの遺伝子配列の3’非翻訳領域から得ることができる。転写終結配列は、効率のよい終結を可能にするために、コード配列の下流に位置することができる。シグナルペプチド配列は、1つ以上の翻訳後の細胞の行き先(例えば、具体的な細胞小器官の区画、または、タンパク質合成および/または活性の部位、およびさらには細胞外環境を包含する)に作動可能に連結されたポリペプチドの配置の責任を担う情報をコードする、アミノ末端ペプチド配列である。いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりのポリヌクレオチドは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチドの内に含有される発現コンストラクトは、サイズが5キロベース以下、4キロベース以下、または3キロベース以下である。いくつかの態様において、発現コンストラクトは、サイズが4~5キロベースの間である。
いくつかの態様において、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、1つ以上の組換えAAV粒子(例として、第1および第2のAAV粒子)の内に含有される。rAAV粒子は、あらゆる派生型(血清型の自然発生でないバリアントを包含する)または偽型を包含する、あらゆるAAV血清型(例として、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10)のものであり得る。派生型および偽型の非限定的な例は、AAV2-AAV3ハイブリッド、AAVrh.10、AAVhu.14、AAV3a/3b、AAVrh32.33、AAV-HSC15、AAV-HSC17、AAVhu.37、AAVrh.8、CHt-P6、AAV2.5、AAV6.2、AAV2i8、AAV-HSC15/17、AAVM41、AAV9.45、AAV6(Y445F/Y731F)、AAV2.5T、AAV-HAE1/2、AAVクローン32/83、AAVShH10、AAV2 (Y->F)、AAV8 (Y733F)、AAV2.15、AAV2.4、AAVM41、およびAAVr3.45を包含する。かかるAAV血清型および派生型/偽型、およびかかる派生型/偽型を生産する方法は、当該技術分野において知られている(例として、Mol Ther. 2012 Apr;20(4):699-708. doi: 10.1038/mt.2011.287. Epub 2012 Jan 24.「The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads.」Asokan A1, Schaffer DV, Samulski RJ.を参照)。いくつかの態様において、第1および第2のAAV粒子は、AAV2血清型粒子である。
AAV粒子およびポリヌクレオチドを生産する方法は、当該技術分野において知られており、および商業的に利用可能である(例として、Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167;および参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開番号US20070015238およびUS20120322861;ならびにATCCおよびCell Biolabs, Inc.から入手可能なプラスミドおよびキットを参照)。例えば、ポリヌクレオチド(例として、プラスミドとしての)は、例として、rep遺伝子(例として、Rep78、Rep68、Rep52およびRep40をコードするもの)およびcap遺伝子(VP1、VP2、およびVP3をコードするもの)を含有する1つ以上のヘルパープラスミドと組み合わせられて、プロデューサー細胞株中へとトランスフェクトされることで、AAV粒子がパッケージ化され、続いて精製されることができるようにしてもよい。
いくつかの態様において、1つ以上のヘルパープラスミドは、rep遺伝子およびcap遺伝子を含む第1のヘルパープラスミド、ならびに、E1a遺伝子、E1b遺伝子、E4遺伝子、E2a遺伝子、およびVA遺伝子などのAAV生産の助けとなる他の遺伝子を含む第2のヘルパープラスミドを包含する。いくつかの態様において、rep遺伝子は、AAV2に由来するrep遺伝子である。ヘルパープラスミド、およびかかるプラスミドを作る方法は、当該技術分野において知られており、および商業的に利用可能である(例として、pDM、pDG、pDP1rs、pDP2rs、pDP3rs、pDP4rs、pDP5rs、pDP6rs、pDG(R484E/R585E)、およびpDP8.ape プラスミド(PlasmidFactory, Bielefeld, Germanyからのもの);Vector Biolabs, Philadelphia, PA;Cellbiolabs, San Diego, CA;Agilent Technologies, Santa Clara, Ca;およびAddgene, Cambridge, MA、から入手可能な他の製品およびサービス;pxx6;Grimm et al. (1998), Novel Tools for Production and Purification of Recombinant Adenoassociated Virus Vectors, Human Gene Therapy, Vol. 9, 2745-2760;Kern, A. et al. (2003), Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids, Journal of Virology, Vol. 77, 11072-11081.;Grimm et al. (2003), Helper Virus-Free, Optically Controllable, and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6, Molecular Therapy,Vol. 7, 839-850;Kronenberg et al. (2005), A Conformational Change in the Adeno-Associated Virus Type 2 Capsid Leads to the Exposure of Hidden VP1 N Termini, Journal of Virology, Vol. 79, 5296-5303;およびMoullier, P.およびSnyder, R.O. (2008), International efforts for recombinant adenoassociated viral vector reference standards, Molecular Therapy, Vol. 16, 1185-1188を参照)。
非限定的な、例示のAAV粒子生産方法は、次に記載される。所望のAAV血清型のためのrepおよびcapのORF、および生来のプロモーターの転写制御下にあるアデノウイルスVA、E2A(DBP)およびE4遺伝子を含む1つ以上のヘルパープラスミドが、生産または取得される。HEK293細胞(ATCC(登録商標)から入手可能)が、CaPOに媒介されるトランスフェクション、脂質またはポリエチレンイミン(PEI)などのポリマー分子を介して、ヘルパープラスミド(単数または複数)および本明細書に記載のポリヌクレオチドを含有するプラスミドでトランスフェクトされる。代替的に、別の非限定的な例においては、Sf9系プロデューサー安定細胞株が、ポリヌクレオチドを含有する単一の組換えバキュロウイルスに感染させられる。さらなる非限定的な代替として、別の例においては、HEK293またはBHK細胞株が、ポリヌクレオチドを含有するHSVに、ならびに任意に、本明細書に記載のとおりのrepおよびcapのORF、および生来のプロモーターの転写制御下にあるアデノウイルスVA、E2A(DBP)およびE4遺伝子を含有する1つ以上のヘルパーHSVに、感染させられる。HEK293、BHK、またはSf9細胞は次に、AAV粒子生産が可能となるように、少なくとも60時間インキュベートされる。AAV粒子は、次に、当該技術分野において知られているかまたは本明細書に記載されているいずれかの方法を使用して、例として、イオジキサノール段階的勾配、CsCl勾配、クロマトグラフィー、またはポリエチレングリコール(PEG)沈殿によって、精製されることができる。
本開示は、開示されたAAV粒子またはポリヌクレオチドの少なくとも1つを含む宿主細胞をもまた企図する。かかる宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞を包含し、ヒト宿主細胞が好ましく、および、単離されていても、細胞もしくは組織培養の中にあっても、いずれでもよい。遺伝的に改変された動物モデル(例として、マウス)の場合、形質転換された宿主細胞は、非ヒト動物それ自体の体内にあってもよい。
方法および対象
いくつかの側面において、細胞におけるオトフェルリンの発現を増加させる方法が提供される。いくつかの態様において、方法は、細胞を、本明細書に記載のとおりの第1のポリヌクレオチドを含む本明細書に記載のとおりの第1のAAV粒子に接触させること;および、細胞を、本明細書に記載のとおりの第2のポリヌクレオチドを含む本明細書に記載のとおりの第2のAAV粒子に接触させることを含む。いくつかの態様において、細胞は、マウスまたはヒト細胞などの哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ex vivoである。いくつかの態様において、細胞は、in vivoである。いくつかの態様において、細胞は、耳の細胞(例として、ヒトの耳の細胞)である。いくつかの態様において、細胞は、内耳の細胞(例として、ヒトの内耳の細胞)である。いくつかの態様において、細胞は、対象(例として、ヒト対象などの哺乳動物対象)中にある。
本開示の他の側面は、オトフェルリンの発現もしくは活性の減少または不在によって引き起こされる疾患または状態の処置に関する。いくつかの態様において、方法は、治療有効量の、本明細書に記載のとおりの第1のポリヌクレオチドを含む第1のAAV粒子、および本明細書に記載のとおりの第2のポリヌクレオチドを含む第2のAAV粒子を、対象へ投与することを含む。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象であり、および対象は、難聴、常染色体劣性9(DFNB9)を有する。いくつかの態様において、対象は、損なわれた前庭機能、または前庭障害を有する、ヒト対象である(例として、Dulon et al. Otoferlin is Critical for a Highly Sensitive and Linear Calcium Dependent Exocytosis at Vestibular Hair Cell Ribbon Synapses. J Neurosci. 2009; 29(34): 10474-10487を参照)。
疾患を「処置する」ことは、本明細書において用語が使用されるとおり、対象が経験する疾患または障害の少なくとも1つの兆候または症状の、頻度または重症度を低減させることを意味する。上記にまたは本明細書における他の場所に記載された組成物は、典型的には、有効量で、つまり、望ましい結果を生じる能力がある量で、対象へ投与される。望ましい結果は、投与される活性な剤に依存する。例えば、AAV粒子の有効量は、宿主器官、組織、または細胞へ発現コンストラクトを移動させる能力がある、粒子の量であり得る。治療的に許容し得る量は、疾患を、例として、DFNB9を、処置する能力がある量であり得る。医学および獣医学の分野において周知のとおり、ある対象に対する投薬量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の組成物、組成物中の活性成分(単数または複数)、投与時間および経路、全身健康状態、および同時に投与される他の薬物を包含する多くの要因に依存する。
AAV粒子またはポリヌクレオチドは、本明細書に記載のAAV粒子などの活性成分および本明細書に記載のとおりの薬学的に許容し得る担体を含む組成物などの、組成物の形態にて送達されてもよい。AAV粒子またはポリヌクレオチドは、様々な組成物にて調製され得、および、ヒトまたは動物対象への投与のための適切な医薬ビヒクルでもまた製剤化され得る。いくつかの態様において、第1および第2のAAV粒子が利用される場合、第1および第2のAAV粒子は、同じ組成物の内に含有されてもよいし、あるいは異なる組成物の内に含有されてもよく、および、一緒にまたは別々に投与されてもよい。
いくつかの態様において、対象へ投与されるAAV粒子は、10~1014粒子/mlまたは10~1015粒子/mlの範囲にわたるオーダーにある濃度を有する組成物にて、または、例えば、約10、10、10、10、1010、1011、1012、1013、もしくは1014粒子/mlなどの、いずれかの範囲の間にあるあらゆる値で、提供されてもよい。一態様において、1013粒子/mlを上回るAAV粒子が投与される。いくつかの態様において、対象へ投与されるAAV粒子の数は、10~1014ベクターゲノム(vgs)/mlまたは10~1015 vgs/mlの範囲にわたるオーダーにあってもよく、または、例えば、約10、10、10、10、1010、1011、1012、1013、もしくは1014vgs/mlなどの、いずれかの範囲の間にあるあらゆる値であってもよい。一態様において、1013vgs/mlを上回るAAV粒子が投与される。AAV粒子は、単回用量として投与することができ、または、処置される特定の疾患または障害の治療にを達成するために要求され得るとおり、2回以上の投与に分けることができる。いくつかの態様において、0.0001ml~10mlsが、対象へ送達される。
いくつかの態様において、対象へ投与されるAAV粒子の数は、10~1014 vg/kgの範囲にわたるオーダーにあってもよく、または、例えば、約10、10、10、10、1010、1011、1012、1013、もしくは1014vgs/kgなどの、いずれかの範囲の間にあるあらゆる値であってもよい。いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの第1のポリヌクレオチドを含む第1のAAV粒子、および本明細書に記載のとおりの第2のポリヌクレオチドを含む第2のAAV粒子が、投与される場合には、投与される量は、両方の粒子について同じである。いくつかの態様において、本明細書に記載のとおりの第1のポリヌクレオチドを含む第1のAAV粒子、および本明細書に記載のとおりの第2のポリヌクレオチドを含む第2のAAV粒子が、投与される場合には、投与される量は、各粒子について異なる。
望ましい場合には、AAV粒子は、例として、タンパク質またはポリペプチドまたは様々な薬学的に活性な剤などの、他の剤または処置(治療的ポリペプチド、生物学的に活性なフラグメント、またはそれらのバリアントの1つ以上の全身または局所投与を包含する)との組み合わせでもまた同様に、投与されてもよい。実際に、また包含してもよい他の成分には、追加の剤が標的細胞または宿主組織との接触で有意な有害作用を引き起こさないことを前提とすれば、事実上は限定がない。よって、特定の場合における要求に応じて様々な他の剤または処置と共に、AAV粒子が送達されてもよい。いくつかの態様において、AAV粒子の処置は、補聴器の使用を伴ってもよい。
ある状況においては、皮下で、非経口で、静脈内で、筋肉内で、腹腔内で、経口または経鼻吸入により、または直接注射により、のいずれかで、1つ以上の細胞、組織、または器官へ、好適に製剤化された本明細書に記載の医薬組成物にてAAV粒子を送達することが好ましい。いくつかの態様において、投与は、静脈注射または注入によるなどの全身送達のために好適な経路である。いくつかの態様において、投与は、耳へのものであり、例として、蝸牛内投与を介してである。注射可能な使用のために好適なAAV粒子組成物の医薬形態は、滅菌された水溶液または分散液を包含する。いくつかの態様において、形態は、滅菌されており簡単な注射可能性が存在する程度には流動性を持つ。いくつかの態様において、形態は、製造および保存の条件化において安定であり、ならびに、細菌および菌類などの微生物の汚染作用から守られる。担体は、例えば、水、生理食塩水、エタノール、ポリオール(例として、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等)、これらの好適な混合物、および/または植物油を含有する、溶媒または分散媒とすることができる。適正な流動性は、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には要求される粒子サイズの維持によって、および、界面活性剤の使用によって、維持され得る。
注射可能な水溶液の投与のためには、例えば、必要ならば溶液を好適に緩衝化し、および液体希釈剤をまず十分な生理食塩水またはグルコースで等張状態にしてもよい。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、硝子体内、網膜下、皮下および鼻腹腔内投与にとりわけ好適である。これに関連して、本開示に照らすと、採用することができる無菌水性媒体が当業者には知られる。例えば、1つの投薬量を、等張NaCl溶液1mlに溶解し、1000mlの皮下注入用流体に加えるか、または提案注入部位に注射するかのいずれかをしてもよい(例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」15th Edition、1035~1038および1570~1580頁を参照)。処置される対象の状態に依存して、投薬のいくらかの変動は必然的に起こる。いずれにしても、投与の責任を負う者が、個々の対象のための適切な用量を決定する。そのうえ、ヒトへの投与のためには、調製は、例として、FDAの生物系審査部の規格によって要求されるとおりの、滅菌性、発熱性、および一般的安全性および純度の規格を満たさなければならない。
滅菌された注射可能な溶液は、AAVを必要量で適切な溶媒中に、必要に応じて、上記に列挙した他の成分のいくつかとともに、組み込むことによって調製され、これに続いて濾過滅菌またはその他の滅菌技法がなされる。一般的に、分散液は、基本的な分散媒および上に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌された媒体に、様々な滅菌された活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌された注射可能な溶液の調製のための滅菌された粉末の場合、好ましい調製の方法は、予め濾過滅菌したその溶液から活性成分および何らかのさらなる所望の成分の粉末を得る、真空乾燥および凍結乾燥技法である。
AAV粒子またはポリヌクレオチド組成物の量およびかかる組成物の投与の時間は、本教示の利益を有する当業者の知識の範囲内である。しかしながら、開示された組成物の治療有効量の投与は、かかる治療を受けている患者に治療上の利益を提供するために、例えば、十分な数の感染性粒子の単回注射などの単回投与によって、達成され得る可能性がある。代替的に、いくつかの状況では、かかる組成物の投与を監督する医師によって決定され得るとおり、比較的短い期間または比較的長い期間のいずれかにわたって、AAV粒子組成物の複数回の、または連続的な投与を提供することが望ましいことがあり得る。
組成物は、AAV粒子を、単独でも、あるいは、天然もしくは組み換えソースから得られるかまたは化学的に合成され得る1つ以上の追加の活性成分との組み合わせでも、包含してよい。
本開示の方法において利用される組成物の毒性および有効性は、培養細胞または実験動物のいずれかを使用することでLD50(集団の50%に対して致死性である用量)を決定する、標準的な製薬手順によって決定することができる。毒性と有効性との間の用量比は、治療指数であり、これは、比率LD50/ED50として表現することができる。大きな治療指標を呈する組成物が好ましい。有毒な副作用を呈するものも使用され得るが、かかる副作用による潜在的な損傷を最小限にする送達系を設計するように注意を払わなければならない。本明細書に記載のとおりの組成物の投薬量は、一般的には、ほとんどあるいは全く毒性を伴わないED50を包含する範囲内にある。投薬量は、この範囲内で、採用される投薬形態および利用される投与経路に依存して変動し得る。
本開示の側面は、ヒトまたは非ヒト霊長類対象などの対象についての使用のための方法に関する。非ヒト霊長類対象の非限定的な例は、マカク(例えば、カニクイザルまたはアカゲザル)、マーモセット、タマリン、クモザル、ヨザル、ベルベットモンキー、リスザル、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジー、およびオランウータンを包含する。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。他の例示の対象は、イヌおよびネコなどの飼い慣らされた動物;ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびニワトリなどの家畜;ならびにマウス、ラット、モルモット、およびハムスターなどの他の動物を包含する。
いくつかの態様において、対象は、遺伝子治療にて処置され得る疾患を有するかまたは有する疑いがある。いくつかの態様において、対象は、難聴、常染色体劣性9(DFNB9)を有するかまたは有する疑いがある。DFNB9は、オトフェルリンタンパク質の発現、機能、または両方の減少をもたらすOTOF遺伝子における突然変異によって引き起こされると考えられている、常染色体劣性型の難聴である。オトフェルリンタンパク質は、聴覚リボンシナプスでのエクソサイトーシスのために重要であることが示されている(例として、Roux et al. Otoferlin, defective in a human deafness form, is essential for exocytosis at the auditory ribbon synapse. (2006) Cell 127(2):277-89を参照)。DFNB9を有する対象は、熟練した医師が、例として、聴性脳幹反応(ABR)の電気生理学的検査と、OTOF遺伝子中の突然変異(例として、OMIMエントリー603681および601071を参照)を同定するための遺伝子検査との組み合わせを使用して、同定することができる。
いくつかの態様において、対象は、以下のナンセンスもしくはミスセンス突然変異の1つ以上をOTOF遺伝子中に有するヒト対象である:TYR730TER、GLN829TER、PRO1825ALA、PRO50ARG、LEU1011PRO、ILE515THR、ARG1939GLN、またはGLY541SER。いくつかの態様において、対象は、イントロン8/エキソン9ジャンクションでのAからGへのトランジション(IVS8-2A-G)、または、エキソン5のスプライスドナー部位における最初のイントロンヌクレオチドである位置+1でのGからAへのトランジション、または、イントロン39のドナースプライス部位におけるGからCへのトランスバージョン、を有するヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、エキソン16における1塩基対欠失(1778G)、これは終止コドンへと導く、および、6141G-Aの変化、これはエキソン48におけるARGからGLNへの置換をもたらす、を有するヒト対象である。
組成物
本開示の他の側面は、本明細書に記載のAAV粒子またはポリヌクレオチドを含む組成物に関する。いくつかの態様において、本明細書に記載のAAV粒子は、組成物に、例として、医薬組成物に、加えられる。
いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容し得る担体を含む。用語「担体」は、これとともにAAVが投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。かかる医薬担体は、水または油、これは鉱油などの石油、ピーナッツ油、ダイズ油およびゴマ油などの植物油、動物油、または合成起源の油を包含する、などの滅菌液体とすることができる。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体担体として採用することができる。薬学的に許容し得る担体の非限定的な例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩水、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリアクリル酸、潤滑剤(タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油など)、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、防腐剤(ヒドロキシ安息香酸メチル、-エチル、および-プロピルなど)およびpH調整剤(無機および有機の酸および塩基など)を包含する。
担体の他の例は、リン酸緩衝生理食塩水、HEPES緩衝生理食塩水、および注射のための水を包含し、これらのいずれも、塩化カルシウム二水和物、無水リン酸二ナトリウム、塩化マグネシウム六水和物、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、またはスクロースの1つ以上と任意に組み合わせられてもよい。使用することがあり得る他の担体の例は、生理食塩水(例として、滅菌された、発熱物質を含まない生理食塩水)、塩緩衝液(saline buffers)(例として、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、および重炭酸塩緩衝液)、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質(例えば、血清アルブミン)、EDTA、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールを包含する。USPグレードの担体および賦形剤は、ヒト対象へのAAV粒子の送達のために特に有用である。かかる組成物は、さらに任意に、リポソーム、脂質、脂質複合体、ミクロスフェア、微粒子、ナノスフェア、またはナノ粒子を含んでもよく、あるいは、細胞、組織、器官、またはこれを必要とする対象の体への投与のために別様に製剤化されていてもよい。かかる組成物を作るための方法は、周知であり、および、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd edition, Pharmaceutical Press, 2012において見出すことができる。
典型的には、かかる組成物は、少なくとも約0.1%の治療剤(例として、AAV粒子)またはそれ以上を含有し得るが、活性成分(単数または複数)の割合は、もちろん変動してもよく、および好都合に全製剤の重量または体積の約1または2%と約70%または80%との間、またはそれ以上であってもよい。当然ながら、各々の治療上有用な組成物の中の治療剤(単数または複数)(例として、AAV粒子)の量は、化合物の何らかの所与の単位用量にて好適な用量が得られるようなやり方で調製され得る。可溶性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与の経路、製品の有効期間などの要因、ならびに他の薬理学的配慮が、かかる医薬処方物の調製についての技術分野における当業者によって企図されることとなり、そのため、様々な用量および処置レジメンが、望ましいものとなり得る。
いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、DFNB9を有する対象などの、これを必要とする対象へ、投与されてもよい。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のとおりのAAV粒子を含む1つまたは複数の組成物を、これを必要とする対象へ投与することを含んでもよい。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。いくつかの態様において、対象は、DFNB9などの、遺伝子治療で処置され得る疾患を有するか、または有する疑いがある。いくつかの態様において、対象は、DFNB9と診断されている。
キット
本開示の他の側面は、1つ以上の容器中での本明細書に記載のとおりのAAV粒子またはポリヌクレオチドを含む、キットに関する。キットは、薬学的に許容し得る担体および/または希釈剤を、任意に包含することができる。いくつかの態様において、キットは、キットの内に含有されるAAV粒子またはポリヌクレオチドをいかにして選択された細胞またはレシピエントへ投与するかを説明する、指示または包装材料を包含する。キットの容器は、あらゆる好適な材料(例として、ガラス、プラスチック、金属等々)とすることができ、およびあらゆる好適なサイズ、形状、または構成とすることができる。いくつかの態様において、キットは、AAV粒子またはポリヌクレオチドを好適な液体または溶液形態で含有する1つ以上のアンプルまたはシリンジを包含してもよい。

アデノ随伴ウイルス遺伝子治療アプローチを使用したOTOFノックアウトマウスにおける聴力のレスキュー
イントロダクション
オトフェルリンは、耳における神経伝達物質放出のための重要なカルシウムセンサーである(例として、Roux 2006を参照)。オトフェルリンは、主に蝸牛の内有毛細胞において、および、中枢神経系のごく少数の他の細胞において発現する(例として、Yasunaga et al. 1999 & 2000を参照)。それは、シナプトタグミン、PKCおよびPLCにも見出されるC2ドメインと共通のものを共有する、膜貫通タンパク質のフェルリンファミリーの一員である。
ヒトオトフェルリンをコードするヒトOTOF遺伝子における突然変異は、「難聴、常染色体劣性9(DFNB9)」と呼ばれる非症候性難聴のタイプを引き起こす。OTOFノックアウトマウスは、正常な内有毛細胞の発達および聴覚リボンシナプス形成にもかかわらず、重症の聴力喪失を有することもまた、示されている(例として、Roux et al. (2006) Otoferlin, defective in a human deafness form, is essential for exocytosis at the auditory ribbon synapse. Cell. 127:277-289を参照)。しかしながら、Otof-/-マウスは、シナプス開口放出の完全な無効化、および結果的にシナプス小胞からの神経伝達物質放出の無効化に起因して、聴性脳幹反応を全ての音周波数にわたって喪失する。
DFNB9は、ヒトにおいては2つの表現型として、言葉の習得の前の非症候性の両側性の聴力の喪失として、およびそれより少ない頻度で温度感受性の非症候性のオーディトリーニューロパチーとして現れる。これは、罹患したレバノン人の家族において最初に発見され(Chaib et al. 1996)、およびそれ以来世界の多数の部分で見出されている(例として、Adato et al. 2000、Rodriguez-Ballesteros et al. 2003、Choi et al. 2009、Matsunaga et al. 2012を参照)。
DFNB9を持つヒトにおける現在の処置は、蝸牛移植および補聴器を利用する。加えて、温度感受性型のDFNB9のためには、発熱およびその他の体温の上昇を引き起こす状態の予防が重要である。本出願人らは、DFNB9のための処置としてOTOFを送達するのにAAVを使用することについての概念実証として、ノックアウトマウスにおけるOTOFの発現を復元する手段としてアデノ随伴ウイルス(AAV)を使用することを目指した。マウスOTOF cDNAは、長さが5979塩基対であり、他方、ほとんどのAAVは、およそ4.8キロベースを超えるゲノムをパッケージ化することができない。その結果として、ひとたび送達されたときに全長cDNAがin vivoで再組み立てされることができるように、cDNAの5’部分とcDNAの3’部分とを別々のAAVコンストラクトとして別々に送達するために二重ベクター系を使用した。
方法
二重AAVベクターコンストラクト
マウスOTOF cDNAを、2つの区間、5’および3’区間に分け、および、2つのAAV ITR含有プラスミド中へと挿入した。プラスミド中の2つのカセットの各々の配列は、下記に示され、および、各コンストラクトのマップは、図1および2に示される。カセットの、アノテーションされたバージョンは、図3Aおよび3Bに示される。各カセットは、in vivoにおいてcDNAの5’および3’端の間の相同的組み換えを促進させるための相同の領域を含有する(see Ghosh et al., 2011を参照)。ひとたびin vivoで組み換えられると、全長cDNAは、相同の領域からのスプライシングによる切り出しを引き起こすスプライスドナー/スプライスアクセプター対を含有する。ベクターを、以前に記載されたとおりの標準的なプラスミドトランスフェクション法を使用して、AAV2血清型粒子中へとパッケージ化した(Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167を参照)。ウイルス粒子を、以前に記載されたとおりの標準的な方法により精製した(Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167を参照)。OTOF cDNAの5’部分を保有するウイルス粒子は、本明細書において「AAV2-OTOF-NT」とも称される。OTOF cDNAの3’部分を保有するウイルス粒子は、本明細書において「AAV2-OTOF-CT」とも称される。
pTR22-smCBA-オトフェルリンNT-APSD-APhead
Figure 2023070682000013

Figure 2023070682000014

Figure 2023070682000015

Figure 2023070682000016

Figure 2023070682000017
pTR22-APhead-APSA-オトフェルリンCT
Figure 2023070682000018

Figure 2023070682000019

Figure 2023070682000020

Figure 2023070682000021

Figure 2023070682000022
HEK 293細胞のトランスフェクション
HEK 293細胞を、培養培地中のポリリシンコートされたカバースリップ上で育てた。1μlの各ウイルスを、各ウェルについて以下のとおり使用した:ウイルスなしのコントロール細胞、AAV2-OTOFのn末端部分を有する細胞(AAV2-OTOF-NT)、AAV2-OTOFのc末端部分を有する細胞(AAV2-OTOF-CT)、および両方のウイルスを有する細胞(AAV2-OTOF-NTおよびAAV2-OTOF-CT)。細胞を、抗OTOF抗体で染色し、およびスライドガラス上に標本化した。
OTOFノックアウトマウス
使用したOTOFノックアウトマウスは、以前の研究において作り出した(Roux et al. (2006) Otoferlin, defective in a human deafness form, is essential for exocytosis at the auditory ribbon synapse. Cell. 127:277-289を参照)。手短にいうと、Otofのエキソン14および15までのゲノム配列5’および3’を含有する2つのフラグメントを、PCRによって増幅させた。5kbのBamHI-XhoI-BssHIIおよび6kbのBssHII-SfiI-BamHI-NaeI 129/SvPasフラグメントを、BamHI-XhoI-BssHII-SfiI-NaeI-HindIIIポリリンカーを挿入することによって前もって改変されているpUC19(New England BioLabs)へと挿入した。loxP-hygro-loxP(ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子[Pgk-1]プロモーターの制御下でハイグロマイシンへの耐性を付与する遺伝子)カセットを、BssHII部位へと挿入した。全てのコンストラクトについて配列決定し、および、得られた配列を、129/SvPasゲノム配列と比較した。ハイグロマイシンに対して耐性の282 CK35 ES細胞を、相同的組み換えおよびモノインサーション(monoinsertion)事象について、サザンブロット分析によりスクリーニングした。
キメラ動物を作製するために、2つのクローンを、C57BL/6N胚盤胞中へと注射した。突然変異Otofアレルの伝播を、アグーチの仔においてPCRにより検出した。F1子孫における陽性の仔を、混合C57BL/6-129/SvPasバックグラウンドにおけるPgk-1-creマウスと交配させた。ハイグロマイシンカセットが欠失したアレル(Otof tm1Ugdsアレル)を保有するF2動物を、507塩基対のPCR産物を作り出した、プライマー 5’-CACTTGCTTTGTCT CATCTCC-3’ (配列番号12)および 5’-GTCACTTCTTCTGGGTATTTC-3’ (配列番号13)を使用したPCRによって、選択した。ヘテロ接合の動物を、Otof-/-、Otof+/-、およびOtof+/+マウスを作り出すために同系交配(interbred)させた。ノックアウトマウスを、上記のとおりのC57BL/6-129/SvPasバックグラウンドにて作り出した。このバックグラウンド株は、いくらか加齢に関連した聴力喪失を有することが知られているので、マウスを第10世代までFVBマウス株と戻し交配させることで、知られている加齢に関連した聴力喪失がないFVBの同種の遺伝的バックグラウンドを得た。
マウスへのAAVの送達
OTOFノックアウトマウス(新生およびP10より高齢)に、2つのAAVコンストラクトの各々のウイルス粒子1マイクロリットルを、以前に記載されたとおりに円窓膜(RWM)注射を使用して注射した(Akil et al. (2012) Restoration of Hearing in the VGLUT3 Knockout Mouse Using Virally-Mediated Gene Therapy. Neuron. 75(2): 283-293およびAkil et al. (2015) Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane. J. Vis. Exp. (97), e52187を参照)。AAV2-OTOF-NT(6.32×1012vg/ml)およびAAV2-OTOF-CT(4.5×1012vg/ml)を、RWMを通して、P1~3マウスへ送達した。AAV2-OTOF-NT(1.43×1013vg/ml)およびAAV2-OTOF-CT(3.12×1013vg/ml)を、RWMを通して、P≧12マウスへ送達した。ABR試験を、注射7日後に実施した。マウスにおけるOTOFタンパク質の発現を、蝸牛の全載標本中の細胞を標識するための抗OTOF抗体を使用して測定した。逆転写酵素(RT)-PCRを、マウスの蝸牛組織の内にあるOTOF mRNAの存在をスクリーニングするために使用した。野生型マウスにもまた、同じ技法でAAV2-GFPを、AAV2での蝸牛へのウイルス送達を評価するために注射した。蝸牛を、全載標本にし、および抗GFP抗体で染色した。
聴性脳幹反応(ABR)試験
聴力試験を、以前に記載したとおりに(Akil et al. (2006) Progressive deafness and altered cochlear innervation in knockout mice lacking prosaposin. J. Neurosci. 26:13076-13088およびAkil et al. (2016) Mouse Auditory Brainstem Response Testing. Bio Protoc. 6(6))、オトフェルリンノックアウト(OTOF KO)マウス、レスキューされたOTOF KOマウスおよび野生型(WT)同腹子について行った。手短にいうと、全ての聴覚試験は、防音室の中で行った。聴覚試験の前に、マウスをケタミン塩酸塩(Ketaset、100mg/ml)とキシラジン塩酸塩(xyla-ject、10mg/ml)との混合物の腹腔内注射によって麻酔し、および、必要に応じ、当初の用量の5分の1でブーストした。記録の間中にわたって、体温を温熱パッドで維持し、および直腸プローブでモニターした。
誘発された聴性脳幹反応(ABR)閾値を、マウスの頭皮から、別個に記録した。応答は、頭頂、左耳の耳介の下(参照)、および反対側の耳の下(グランド)で皮下針電極を使用して記録した。使用した音刺激は、クリック(5msの持続時間、31Hz)ならびに8、16、および32kHzでのトーンピップ(10msの持続時間、cos2整形、21Hz)を包含した。測定結果は、TDT BioSig III system(Tucker Davis Technologies)を使用して記録した。各刺激について、脳波(EEG)活動を20msの間(25kHzのサンプリングレートにて)記録し、およびフィルタリングした(0.3~3kHz)。クリック応答について、512の刺激からの波形を平均した。周波数特異的なトーンバースト刺激(8、16、および32kHz)を同定するために、1000の刺激からの波形を検査した。ABR波形を、最大振幅から5dB音圧レベル(SPL)の間隔おきに下げたところで記録した。閾値は、目視検査で波I-Vについての応答ピークが明確にかつ繰り返し存在する最も低い刺激レベルとして定義した。これらの閾値判断は、保存波形の分析により確認した。各々の動物の群の比較は、一元配置ANOVAとBonferroniの事後検定を使用して行った。
結果
2つの異なるAAVプラスミドコンストラクトを、マウスOTOF cDNAの5’側半分および3’側半分をOTOFノックアウトマウスの内耳へ送達するために作り出した(OTOF N末端ウイルスおよびOTOF C末端ウイルス)。2つのコンストラクトを、AAV2粒子中へと別々にパッケージ化した。AAV2粒子を、つぎに、一緒にプールし、HEK 293細胞を処置するのに使用したか、またはOTOFノックアウトマウスの内耳中へと注射した。
HEK 293細胞は、両方のウイルスでトランスフェクトされたときにのみオトフェルリンタンパク質を発現したということが示された(図4)。未処置の細胞においては、またはOTOF N末端(図4)もしくはOTOF C末端ウイルスのみでトランスフェクトされた細胞においては、オトフェルリンタンパク質の発現は観察されなかった。
次に、AAV2の、マウスの蝸牛に形質導入をする能力を、AAV2-GFPレポーターウイルスを使用して評価した。AAV2は、内有毛細胞(IHC)、外有毛細胞(OHC)、柱細胞(P)および他の指示細胞(SC)を包含する数々の細胞タイプをトランスフェクトするということが示された(図5)。よって、AAV2は、マウスの蝸牛に、効果的に形質導入をすることができる。
マウスを、次に、プールされたOTOF N末端およびC末端ウイルスで処置し、および様々なコントロールと比較した。オトフェルリンタンパク質は、両方のウイルスでの処置で発現することが見出された(図6)。トランスフェクトされた内有毛細胞(IHC)の最大の数は、基底において観察され、中回転および頂においてはより少数であった(図6)。IHCの計数は、全体としてほぼ11%のIHCが標識されており、基底(ほぼ29%)、中回転(ほぼ8%)、および頂(ほぼ2%)の間で有意な違いが見られたということを実証した(図6)。RT-PCRを使用したことで、OTOF mRNAが全蝸牛抽出物中にあり、および、野生型と、両方のウイルスで処置されたOTOFノックアウトマウスとの両方において同じサイズであったということが示された(図6)。対照的に、未処置のOTOFノックアウトマウスの蝸牛では、OTOF mRNA発現が実証されなかった。逆転写酵素の非存在下でRT-PCRを行ったときには、産物は検出されなかった。
次に、NおよびC末端ウイルスの両方の送達によって発現したオトフェルリンに聴力機能をレスキューする能力があったかどうかを決定するために、聴力試験を行った。野生型と、両方のウイルスで処置されたOTOFノックアウトマウスとからのABR波形は類似しており、レスキューされたKOマウスにおける聴力回復を立証したが、他方、未処置のOTOFノックアウトマウスコントロール、およびOTOF N末端ウイルスだけでトランスフェクトしたOTOFノックアウトマウスは、聴力回復を示さなかった(図7)。P70では、両方のウイルスで処置されたOTOFノックアウトマウスにおいて、部分的な聴力回復(改善されたABR閾値)がクリックに対しておよび特定の周波数8、16および32kHzで見られ、とはいえ8および16kHzではABR閾値はわずかに上昇したように見えたが、それでもなお、未処置のOTOFノックアウトマウスよりも有意に良好であった(図7)。 注目すべきことに、ABR閾値に若干変動はあったものの、両方のウイルスで処置されたOTOFノックアウトマウス(KO NT+CT)においては4か月を超えて聴力が維持された(図7)。トランスフェクトされていないKOコントロール、およびOTOF NTでトランスフェクトされたKOは、難聴のままであった(図7)。
次に、P12よりも高齢のOTOFノックアウトマウスを、両ウイルスで処置した。二重にトランスフェクトされたIHCは、OTOFを発現し、これには基底(図示せず)と頂(図8)とで均一なトランスフェクション率が見られた。IHCの計数は、全体としてほぼ41%のIHCが標識されており、基底(ほぼ38%)、中回転(ほぼ42%)、および頂(ほぼ47%)の間でわずかな違いが見られたということを実証した(図8)。
P60では、両方のウイルスで処置された全てのOTOFノックアウトマウスは、クリック刺激に対する正常なABR閾値を実証し、とはいえ特定の周波数8、16および32kHzでは、ABR閾値はわずかに上昇したように見えたが、それでもなお、未処置のOTOFノックアウトマウスよりも有意に良好であった(図9)。P12より高齢のOTOFノックアウトマウスへの両方のウイルスの注射に続く聴力回復の経時変化は、処置されたマウスにおいて聴力が30週間以上維持され、およびABR閾値が、WTのレベルまで復元されたということを示した(図9)。
これらの結果は、OTOF cDNAの異なる部分を送達するための1つより多いAAVコンストラクトの使用が、in vivoにおける機能的なcDNAをもたらすことができるということを実証する。これらの結果はまた、AAV送達系を使用したOTOF cDNAの送達によって聴力喪失を処置することができるということも実証する。
例2:ヒトOTOF二重ベクターコンストラクト
下記に提供されるのは、ヒトオトフェルリンタンパク質アイソフォーム1および5を発現させるための二重ベクター配列の例である。両アイソフォーム1および5をコードするcDNAは、両アイソフォームを発現させるために同じN末端ベクターを使用することができるように、同じN末端配列を含有する。下記の配列に対応するベクターマップおよびアノテーションされた配列は、図10~15に示される。
pTR22-smCBA-オトフェルリンNT Hs var 1+5-APSD-APhead
Figure 2023070682000023

Figure 2023070682000024

Figure 2023070682000025
Figure 2023070682000026
pTR22-APhead-APSA-オトフェルリンCT Hs var 1
Figure 2023070682000027

Figure 2023070682000028

Figure 2023070682000029

Figure 2023070682000030

Figure 2023070682000031
pTR22-APhead-APSA-オトフェルリンCT Hs var 5
Figure 2023070682000032

Figure 2023070682000033

Figure 2023070682000034

Figure 2023070682000035

Figure 2023070682000036
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他の態様
本明細書に開示されているすべての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されている各特徴は、同じ、同等、または類似の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。よって、別様に明示的に述べられていない限り、開示された各特徴は、包括的な一連の同等または類似の特徴の一例にすぎない。
上記の説明から、当業者は本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に適合させるために開示の様々な変更および修正をすることができる。よって、他の態様も特許請求の範囲内にある。
均等物
本明細書ではいくつかの発明の態様が説明され、例示されたが、当業者は、機能を実行し、および/または結果を得るための様々な他の手段および/または構造および/または本明細書に説明した利点のうちの1つ以上を容易に想到するであろう。かかる変形および/または修正の各々は、本明細書に記載の発明の態様の範囲内にあるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および/または構成は発明の教示が使用されている特定の用途(単数または複数)に依存することを容易に理解するであろう。当業者であれば、本明細書に記載の特定の発明の態様に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを用いて確かめることができるであろう。したがって、前述の態様は例としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、発明の態様は具体的に説明および特許請求の範囲に記載されるもの以外の方法で実施され得ることを理解されたい。本開示の発明の態様は、本明細書に記載されている個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および/または方法のそれぞれに関する。さらに、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および/または方法が互いに矛盾していない場合、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および/または方法の2つ以上の任意の組み合わせも本開示の発明の範囲内に含まれる。
本明細書で定義および使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書中の定義、および/または定義された用語の通常の意味を支配すると理解されるべきである。
本明細書に開示されているすべての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれており、場合によっては文書の全体を包含し得る。
本明細書および特許請求の範囲で使用される不定冠詞「a」および「an」は、そうでないことが明確に示されていない限り、「少なくとも1つ」を意味すると理解されるべきである。
本明細書および特許請求の範囲で使用される「および/または」なる句は、そのように結合された要素、すなわち場合によっては結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および/または」で列挙された複数の要素は、同じように、すなわち、そのように結合された要素の「1つ以上」であるものと解釈されるべきである。具体的に識別された要素に関連しているかどうかにかかわらず、「および/または」なる節によって具体的に識別された要素以外の他の要素が任意に存在してもよい。よって、非限定的な例として、「含む」などのオープンエンド言語と共に使用されるときの「Aおよび/またはB」への言及は、一態様において、Aのみ(任意にB以外の要素を含む)を、別の態様では、Bのみ(任意にA以外の要素を含む)を、さらに別の態様では、AとBの両方(任意に他の要素を含む)等を指し得る。
本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、「または」は、上記で定義されたような「および/または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分離するとき、「または」または「および/または」は包括的、すなわち、少なくとも1つを含むが、複数の数またはリストの要素も含み、任意にリストに含まれていない追加の項目も含むものとして解釈されるものとする。「のうちの1つのみ」または「のうちの正確に1つ」、または、特許請求の範囲で使用される場合「からなる」などの反対に明確に示された用語のみが、正確に1つの数の要素または要素のリストの包含を指すであろう。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、「どちらか」、「の1つ(one of)」、「の1つのみ(only one of)」、または「の正確に1つ(exactly one of)」などの排他性の用語が先行するときに排他的な選択肢(すなわち「一方または他方、両方ではない」)を示すと解釈されるに過ぎない。「から本質的になる(consisting essentially of)」は、特許請求の範囲において使用されるとき、特許法の分野において使用されるその通常の意味を有するものとする。
明細書および特許請求の範囲で使用されるように、1つ以上の要素のリストに関する句「少なくとも1つ」は、要素のリストにおける任意の1つ以上の要素から選択される少なくとも1つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素のリスト内に具体的に列挙された各要素の少なくとも1つおよびすべての要素を含まず、要素のリストにおける要素の任意の組み合わせを除外しない。この定義はまた、「少なくとも1つ」という句が指す要素のリスト内で具体的に識別された要素以外の要素が、具体的に識別されたそれらの要素に関係するか関係しないかに関わらず、任意に存在し得ることを可能にする。よって、非限定的な例として、「AおよびBの少なくとも1つ」(または同等に「AまたはBの少なくとも1つ」、または同等に「Aおよび/またはBの少なくとも1つ」)は、一態様において、少なくとも1つ(任意に1つより多いものを含む)のA(Bは存在しない(そして、任意にB以外の要素を含む))を、別の態様において、少なくとも1つ(任意に1つより多いものを含む)のB(Aは存在しない(そして、任意にA以外の要素を含む))を、さらに別の態様において、少なくとも1つ(任意に1つより多いものを含む)のA、および、少なくとも1つ(任意に1つより多いものを含む)のB(そして、任意に他の要素を含む)等を指し得る。
反対に明確に示されていない限り、1つより多いステップまたは行為を含む特許請求の範囲の任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも方法のステップまたは行為が列挙されている順序に限定されないことも理解されるべきである。
特許請求の範囲ならびに上記の明細書において、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「保有する(carrying)」、「有する(having)」、「含有する(containing)」、「伴う(involving)」、「保持する(holding)」、「から構成される(composed of)などのすべての移行句は、オープンエンドである、すなわち、限定するものではないが含むことを意味すると理解されるべきである。「からなる(consisting of)」および「から本質的になる(consisting essentially of)」という移行句のみが、それぞれ、米国特許庁の特許審査手続、第2111.03節に記載されているように、クローズまたはセミクローズの移行句であるものとする。

Claims (28)

  1. 細胞においてオトフェルリンの発現を増加させる方法であって:
    細胞を、第1のポリヌクレオチドを含む第1のAAV粒子に接触させること;および
    細胞を、第2のポリヌクレオチドを含む第2のAAV粒子に接触させること、を含み、ここで、
    (i)第1のポリヌクレオチドは、5’から3’へ向かって:
    (a)プロモーター、
    (b)オトフェルリンポリペプチドのN末端部分をコードする部分コード配列、
    (c)スプライスドナー部位、および
    (d)第2のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第1の相同の領域、
    を含有する発現カセットに隣接する逆方向末端反復配列を含み、および
    (ii)第2のポリヌクレオチドは、5’から3’へ向かって:
    (a)第1のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第2の相同の領域、
    (b)スプライスアクセプター部位、
    (c)オトフェルリンポリペプチドのC末端部分をコードする部分コード配列、および
    (d)ポリアデニル化(pA)シグナル配列、
    を含有する発現カセットに隣接する逆方向末端反復配列を含む、前記方法。
  2. 第1および第2のポリヌクレオチドにおける相同の領域が、50~500ヌクレオチドの間である、請求項1に記載の方法。
  3. 第1および第2のポリヌクレオチドにおける相同の領域が、50~300ヌクレオチドの間である、請求項2に記載の方法。
  4. 相同の領域が、配列番号3のヌクレオチド配列を含む、請求項3に記載の方法。
  5. プロモーターが、キメラCMVβアクチン(smcBA)プロモーターである、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
  6. プロモーターが、配列番号4の配列を含む、請求項5に記載の方法。
  7. オトフェルリンポリペプチドが、配列番号5または配列番号6のアミノ酸配列を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
  8. スプライスドナー部位が、配列番号7の配列を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
  9. スプライスアクセプター部位が、配列番号8の配列を含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 逆方向末端反復配列が、AAV2逆方向末端反復配列である、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 第1および第2のAAV粒子が、AAV2血清型粒子である、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 細胞が、ex vivoである、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
  13. 細胞が、in vivoである、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
  14. 細胞が、哺乳動物対象中にある、請求項13に記載の方法。
  15. 対象が、難聴、常染色体劣性9(DFNB9)を有する、請求項14に記載の方法。
  16. 第1のポリヌクレオチドを含む第1のAAV粒子;および
    第2のポリヌクレオチドを含む第2のAAV粒子
    を含み、ここで、
    (i)第1のポリヌクレオチドは、5’から3’へ向かって:
    (a)プロモーター、
    (b)オトフェルリンポリペプチドのN末端部分をコードする部分コード配列、
    (c)スプライスドナー部位、および
    (d)第2のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第1の相同の領域、
    を含有する発現カセットに隣接する、逆方向末端反復配列を含み、および
    (ii)第2のポリヌクレオチドは、5’から3’へ向かって:
    (a)第1のポリヌクレオチドにおける配列と相同な配列を含有する第2の相同の領域、
    (b)スプライスアクセプター部位、
    (c)オトフェルリンポリペプチドのC末端部分をコードする部分コード配列、および
    (d)ポリアデニル化(pA)シグナル配列、
    を含有する発現カセットに隣接する、逆方向末端反復配列を含む、組成物。
  17. 第1および第2のポリヌクレオチドにおける相同の領域が、50~500ヌクレオチドの間である、請求項16に記載の組成物。
  18. 第1および第2のポリヌクレオチドにおける相同の領域が、50~300ヌクレオチドの間である、請求項17に記載の組成物。
  19. 相同の領域が、配列番号3のヌクレオチド配列を含む、請求項18に記載の組成物。
  20. プロモーターが、キメラCMVβアクチン(smcBA)プロモーターである、請求項16~19のいずれか一項に記載の組成物。
  21. プロモーターが、配列番号4の配列を含む、請求項20に記載の組成物。
  22. オトフェルリンポリペプチドが、配列番号5または配列番号6のアミノ酸配列を含む、請求項16~21のいずれか一項に記載の組成物。
  23. スプライスドナー部位が、配列番号7の配列を含む、請求項16~22のいずれか一項に記載の組成物。
  24. スプライスアクセプター部位が、配列番号8の配列を含む、請求項16~23のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 逆方向末端反復配列が、AAV2逆方向末端反復配列である、請求項16~24のいずれか一項に記載の組成物。
  26. 第1および第2のAAV粒子が、AAV2血清型粒子である、請求項16~25のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項16~26のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 請求項16~27のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。
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