DE102018103924A1

DE102018103924A1 - Gentherapeutische Behandlung von Schwerhörigkeit

Info

Publication number: DE102018103924A1
Application number: DE102018103924.7A
Authority: DE
Inventors: Tobias Moser; Thomas Weber; Vladan Rankovic; Christian Vogl
Original assignee: Universitaetsmedizin Goettingen Georg August Universitaet
Current assignee: Universitaetsmedizin Goettingen Georg August Universitaet
Priority date: 2018-02-21
Filing date: 2018-02-21
Publication date: 2019-08-22
Also published as: CN111683688A; WO2019162396A1; EP3755378A1; US20210023242A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen viralen Vektor, insbesondere einen Adeno-assoziierten Virus (AAV)-Vektor, und dessen Verwendung bei der gentherapeutischen Behandlung von Schwerhörigkeit, insbesondere von Schwerhörigkeit, die auf einer oder mehreren Mutationen im Otoferlin-Gen (OTOF) beruht.

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen viralen Vektor, insbesondere einen Adeno-assoziierten Virus (AAV)-Vektor, und dessen Verwendung bei der gentherapeutischen Behandlung von Schwerhörigkeit, insbesondere von Schwerhörigkeit, die auf einer oder mehreren Mutationen im Otoferlin-Gen (OTOF) beruht.
Technischer Hintergrund der Erfindung
Das Hören ist ein komplexer Prozess, durch den akustische Signale über die Ohren und im Gehirn wahrgenommen und verarbeitet werden. Schwerhörigkeit ist eine Einschränkung des Hörvermögens, bis hin zur Gehörlosigkeit/Taubheit. Nach der Klassifikation der WHO kann die Schwerhörigkeit leicht (leiseste wahrnehmbare Töne zwischen 25-40 dB; WHO 1), mittel(gradig) (leiseste wahrnehmbare Töne zwischen 41-60 dB; WHO 2), stark/hochgradig (leiseste wahrnehmbare Töne zwischen 61-80 dB; WHO 3) und sehr stark bzw. an Taubheit grenzend (leiseste wahrnehmbare Töne über 81 dB; WHO 4) sein. Die Ursachen sind vielfältig und umfassen z.B. übermäßige Lärmbelastung (die häufigste Ursache), Alter, diverse Erkrankungen sowie genetische Ursachen. Die Inzidenz erblich bedingter Schwerhörigkeit liegt bei ca. 1 zu 650-1000, wobei derzeit über 100 verschiedene Gene bekannt sind, bei denen Defekte/Mutationen mit Schwerhörigkeit verbunden sind. Weltweit sind etwa 360 Millionen Menschen, in Deutschland etwa 16% der Bevölkerung über 18 Jahre nach der Klassifikation der WHO schwerhörig. Im Alter über 65 handelt es sich dabei um jeden zweiten Mann und jede dritte Frau.
Mutationen, die das Otoferlin-Gen (OTOF) betreffen, welches für das Multi-C2-Domänen-Protein Otoferlin kodiert, führen zu schweren, nicht-syndromischen Formen der prälingualen DFNB9-Schwerhörigkeit oder temperatursensitiven auditorischen Synaptopathie (siehe z.B. Yasunaga et al. Nat. Genet. 1999, 21:363-369; Varga et al. J. Med. Genet. 2006, 43:576-581; Shearer and Smith GeneReviews^® Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2018; Santarelli et al. Hear Res. 2015, 330:200-212; Pangršič et al. Trends Neurosci. 2012, 35(11):671-680; Rodriguez-Ballesteros et al. Hum Mutat 2008, 29:823-831). Aus klinischer Sicht handelt es sich in einigen westlichen Bevölkerungen bei 5-8% aller Fälle automal rezessiven nicht-syndromischen Gehörverlusts um OTOF-vermittelte Taubheit (Rodriguez-Ballesteros et al. Hum Mutat 2008, 29:823-831), welche somit einen Platz unter den Top-Fünf aller genetischen Gehörstörungen einnimmt, für die es noch immer keine Behandlungsmöglichkeit gibt (Angeli et al. Anat Rec (Hoboken) 2012, 295:1812-1829).
Was die molekulare Funktion von Otoferlin anbelangt, ist es inzwischen wohlbekannt, dass Otoferlin in sensorischen inneren Haarzellen (IHC) der Cochlea exprimiert wird und eine Schlüsselrolle bei den finalen Schritten der präsynaptischen Vesikelfusion an Synapsen der inneren Haarzellen der Cochlea mit afferenten Neuronen des Spiralganglions spielt (Roux et al. Cell 2006, 127:277-289). Hierbei wurden mehrere Funktionen für Otoferlin vorgeschlagen, wie etwa eine Rolle bei (i) präsynaptischer Ca²⁺-Bindung zur Auslösung vesikulärer Exozytose nach Haarzellen-Depolarisierung (siehe z.B. Roux et al. Hum Mol Genet 2009, 18:4615-4628; Beurg et al. J Neurosci 2010, 30:13281-13290; Johnson et al. Nat Neurosci 2010, 13:45-52; Michalski et al. Elife 2017, 6), und (ii) vesikulärem Priming und Wiederauffüllen der synaptischen Vesikel an der Freisetzungsstelle, um eine unermüdliche und zeitlich präzise Neurotransmitterfreisetzung auch bei längerer Stimulation zu gewährleisten (siehe z.B. Pangršič et al. Nat Neurosci 2010, 13:869-876; Vogl et al. J Cell Sci 2015, 128:638-644; Jung et al. EMBO J 2015, 34:2686-2702; Strenzke et al. EMBO J 2016, 35:2519-2535; Vogl et al. EMBO J 2016, 35:2536-2552).
Patienten mit erblich bedingten Beeinträchtigungen des Hörvermögens, wie zum Beispiel Schwerhörigkeit, die auf Mutationen im Otoferlin-Gen (OTOF) beruht, müssen in der Regel auf Hörgeräte oder Cochleaimplantate zurückgreifen, da bislang keine Medikamente, die das Hörvermögen wiederherstellen können, und auch keine anderen ursachenbekämpfenden Behandlungsverfahren zur Verfügung stehen. Gentherapie, d.h. die Einführung intakter Kopien defekter Gene in die betroffenen Zellpopulationen im Ohr, könnte einen großen Fortschritt hin zur Wiederherstellung des Hörvermögens in Fällen monogenen (aber auch erworbenen) Gehörverlusts darstellen - so zeigen zum Beispiel Tierstudien eine partielle Verbesserung des Hörvermögens bei Gentherapie in mutierten Mäusen (siehe z.B. Akil et al. Neuron 2012, 75:283-293; Askew et al. Sci. Transl. Med. 2015, 7:295ra108; Jung et al. EMBO J 2015, 34:2686-2702; Landegger et al. Nat Biotechnol 2017, 35:280-284). Jede monogene Gehörerkrankung erfordert die Entwicklung eines individuellen gentherapeutischen (viralen) Konstrukts, welches das fragliche reparierte Gen in die betroffenen Zellen einführt, und solche Konstrukte sind noch nicht allgemein verfügbar.
Bislang wurden mehrere Otof-Mausmutanten (Roux et al. Cell 2006, 127:277-289; Pangršič et al. Nat Neurosci 2010, 13:869-876; Strenzke et al. EMBO J 2016, 35:2519-2535) - sowie andere Mausmodelle, bei denen der Otoferlin-Proteinspiegel in sensorischen Haarzellen weitgehend abgesenkt wurde (z.B. AP2µ, Jung et al. EMBO J 2015, 34:2686-2702; Wrb, Vogl et al. EMBO J 2016, 35:2536-2552) - generiert, was die physiologische Bedeutung von Otoferlin bei der präsynaptischen Freisetzung an Haarzellen-Präsynapsen unterstreicht. Tatsächlich sind Otof-Deletionsmutanten (Otof-Knockout) völlig taub und stellen daher ein nützliches Modellsystem zur Untersuchung der genetischen Wiederherstellung (Rescue) durch korrektive virale Behandlungen mit der Wildtyp-Sequenz dar. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bereits virale Injektionen in postnatale murine Innenohren etabliert, eine Methodik, die eine anschließende In Vivo-Analyse (d.h. in Bezug auf Hirnstammaudiometrie [ABR]-Schwellenwerte und ABR-Amplituden usw.) sowie Ex Vivo-Einzelzellanalyse (präsynaptische Patch-Clamp-Elektrophysiologie, Immunhistochemie, etc.) zur Bestimmung und Validierung des therapeutischen Potenzials bestimmter Rescue-Konstrukte ermöglicht.
Aufgrund der Größe der Otoferlin-kodierenden Sequenz (>5,5 kb) und der begrenzten Verpackungsgröße von standardmäßigen Adeno-assoziierten viralen Vektoren (AAV; <4,4 kb; Grieger und Samulski J Virol 2005, 79:9933-9944), die aufgrund ihres günstigen Sicherheitsprofils häufig für gentherapeutische Anwendungen eingesetzt werden, stellt die Etablierung von Gentherapie mit Gesamtlängen-Otoferlin eine große Herausforderung dar.
Es war deshalb ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen gentherapeutischen viralen Vektor und ein entsprechendes gentherapeutisches Verfahren zur Behandlung von Schwerhörigkeit, die auf Mutationen im Otoferlin-Gen (OTOF) beruht, zur Verfügung zu stellen.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt einen viralen Vektor zur Verfügung, der eine Nukleinsäure umfasst, die einen Promotor und eine damit operativ verbundene kodierende Sequenz umfasst, die für Otoferlin oder ein funktionelles Fragment oder eine Variante davon kodiert.
In einer Ausführungsform ist der virale Vektor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adeno-assoziierter Virus Vektor (AAV-Vektor), Adenovirus Vektor, Lentivirus Vektor, Herpes Simplex Virus (HSV) Vektor, Vacciniavirus Vektor und Sendaivirus Vektor.
In einer Ausführungsform ist die Nukleinsäure DNA oder RNA, vorzugsweise DNA.
In einer Ausführungsform ist der virale Vektor ein AAV-Vektor oder ein Adenovirus Vektor.
In einer Ausführungsform ist der AAV-Vektor ein AAV-PHP.B Vektor oder ein AAV-Anc80 Vektor.
In einer Ausführungsform ist der Promotor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cytomegalovirus (CMV)-Promotor, humaner β-Actin/CMV-Hybridpromotor, Hühner β-Actin/CMV-Hybridpromotor, CMV-Actin-Globin (CAG)-Hybridpromotor, Math1-Promotor, VGLUT3-Promotor, Parvalbumin-Promotor, Calretinin-Promotor, Calbindin28k-Promotor, Prestin-Promotor, Otoferlin-Promotor und Myosin II-, V-, VI-, VIIa- oder XVa-Promotor.
In einer Ausführungsform ist der Promotor ein humaner β-Actin/CMV-Hybridpromotor.
In einer Ausführungsform kodiert die kodierende Sequenz für Gesamtlängen-Otoferlin.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die einen viralen Vektor der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger- oder Hilfsstoff umfasst.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen viralen Vektor der vorliegenden Erfindung oder eine pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zur Verwendung als Medikament zur Verfügung.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen viralen Vektor der vorliegenden Erfindung oder eine pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Schwerhörigkeit zur Verfügung.
In einer Ausführungsform ist die Schwerhörigkeit eine Schwerhörigkeit, die auf einer oder mehreren Mutationen im Otoferlin-Gen (OTOF) beruht.
In einer Ausführungsform ist die Schwerhörigkeit DFNB9-Schwerhörigkeit.
In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verabreichung des viralen Vektors in das Innenohr, insbesondere in die Gehörschnecke, insbesondere in innere Haarzellen der Gehörschnecke.
In einer Ausführungsform umfasst die Verabreichung die Injektion durch das runde Fenster, die Injektion in die Scala vestibuli über eine Stapedotomie, die Injektion in die Scala tympani über eine Cochleostomie und/oder die Applikation als Depot in die Rundfenster-Nische, z.B. als Bestandteil eines Gels, eines Schwamms oder über einen Applikations-Katheter.
In einer Ausführungsform führt die Verabreichung zu einer Expression von Otoferlin oder des funktionellen Fragmentes oder der Variante davon in inneren Haarzellen der Gehörschnecke.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines viralen Vektors der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Schwerhörigkeit zur Verfügung.
In einer Ausführungsform ist die Schwerhörigkeit eine Schwerhörigkeit, die auf einer oder mehreren Mutationen im Otoferlin-Gen (OTOF) beruht.
In einer Ausführungsform ist die Schwerhörigkeit DFNB9-Schwerhörigkeit.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Schwerhörigkeit zur Verfügung, welches die Verabreichung des viralen Vektors der vorliegenden Erfindung in das Innenohr, insbesondere in die Gehörschnecke, insbesondere in innere Haarzellen der Gehörschnecke umfasst.
In einer Ausführungsform ist die Schwerhörigkeit eine Schwerhörigkeit, die auf einer oder mehreren Mutationen im Otoferlin-Gen (OTOF) beruht.
In einer Ausführungsform ist die Schwerhörigkeit DFNB9-Schwerhörigkeit.
In einer Ausführungsform umfasst die Verabreichung die Injektion durch das runde Fenster, die Injektion in die Scala vestibuli über eine Stapedotomie, die Injektion in die Scala tympani über eine Cochleostomie und/oder die Applikation als Depot in die Rundfenster-Nische, z.B. als Bestandteil eines Gels, eines Schwamms oder über einen Applikations-Katheter.
In einer Ausführungsform führt die Verabreichung zu einer Expression von Otoferlin oder des funktionellen Fragmentes oder der Variante davon in inneren Haarzellen der Gehörschnecke.
Figurenliste

1 zeigt ein Schema zur Klonierungsstrategie für Gesamtlängen-Otoferlin (A) sowie die Vektorkarte des Cis-Plasmids mit Gesamtlängen-Otoferlin (B).
2 zeigt die Vektorkarten für die bei der Viruspartikelherstellung in HEK293T-Zellen verwendeten Plasmide pHelper (TakaralClontech; A) und tTA-iCAP-PHPb (Trans-Plasmid; B), welches das virale Kapsid PHP.B zur Verfügung stellt (Deverman et al. Nat. Biotechnol. 2016, 34:204-209).
3 zeigt die Virus-vermittelte Wiederherstellung des Hörvermögens in Otoferlin-Knockout-Mäusen, wobei A eine schematische Darstellung des für den AAV-PHP.B Vektor verwendeten Otoferlin-Rescue-Konstrukts ist (C₂A-F - C₂A-F-Domänen; CC - Coiled-Coil-Domäne; FerB - Ferlin B-Domäne; TM - Transmembrandomäne), B eine schematische Darstellung des AAV-PHP.B Vektorkonstrukts ist, welches die Otoferlin-cDNA unter der Kontrolle des humanen β-Actin/CMV-Hybridpromotors trägt, B' und B" das postnatale (p5-7) Virusinjektionsverfahren in die Gehörschnecke von Mäusen zeigen, C die AAV-PHP.B-vermittelte exogene Expression von Otoferlin in den inneren Haarzellen von OTOF-KO-Mäusen zeigt (Calretinin als Gegenfärbemittel zur spezifischen Markierung innerer Haarzellen; Maßstabsbalken 5 µm), und D, D' sowie D" Hirnstammaudiometrie (Auditory Brainstem Recording, ABR) an erwachsenen, postnatal injizierten OTOF-KO-Mäusen zeigen, welche die erfolgreiche Wiederherstellung von ABR-Amplituden und durchschnittlichen Klick-Schwellenwerten durch den AAV-PHP.B-Otoferlin Vektor zeigen (**p<0.005).

Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt einen viralen Vektor zur Verfügung, der eine Nukleinsäure umfasst, die einen Promotor und eine damit operativ verbundene kodierende Sequenz umfasst, die für Otoferlin oder ein funktionelles Fragment oder eine Variante davon kodiert.
In einer Ausführungsform ist die Nukleinsäure DNA oder RNA, vorzugsweise DNA. Die Nukleinsäure kann hierin auch als genetisches Konstrukt bezeichnet werden.
Der Begriff „viraler Vektor“ bezeichnet ein Viruspartikel, der dazu verwendet wird, genetisches Material (z.B. eine kodierende Sequenz, die für Otoferlin oder ein funktionelles Fragment oder eine Variante davon kodiert) in Zielzellen zu schleusen. Der Transport dieses genetischen Materials wird als „Transduktion“ bezeichnet.
In einer Ausführungsform ist der virale Vektor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adeno-assoziierter Virus Vektor (AAV-Vektor), Adenovirus Vektor, Lentivirus Vektor, Herpes Simplex Virus (HSV) Vektor, Vacciniavirus Vektor und Sendaivirus Vektor. Geeignete virale Vektoren werden zum Beispiel in Sacheli et al. Gene Therapy 2012, 1-11 beschrieben.
In einer Ausführungsform ist der virale Vektor ein AAV-Vektor oder ein Adenovirus Vektor (z.B. Ad5, Ad28 oder Hd-Ad).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der virale Vektor ein AAV-Vektor.
Der Begriff _„AVV-Vektor“ schließt AAV-Vektoren sämtlicher Serotypen ein, sowie AAV-Vektoren, die auf der Kombination verschiedener Serotypen beruhen (auch als „Hybrid-AAV-Vektoren“ oder „Pseudotyp-AAV-Vektoren“ bezeichnet). In einer Ausführungsform ist der AAV-Vektor ein AAV-Vektor mit einem Serotyp ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11 und Kombinationen davon. Ebenfalls eingeschlossen sind andere synthetische AAV-Vektoren, wie etwa AAV-PHP.B, AAV-PHP.B2, AAV-PHP.B3, AAV-PHP.A, AAV-PHP.eB und AAV-PHP.S (Deverman et al. Nature Biotechnol 2016, 34:204-209; Chan et al. Nature Neuroscience 2017, 20:1172-1179) oder AAV-Anc80 ( WO 2017/100791 A1 ; Landegger et al. Nat Biotechnol 2017, 35:280-284; Zinn et al. Cell Rep. 2015, 12(6):1056-1068). Geeignete AAV-Vektoren sind auch kommerziell erhältlich, z.B. von Penn Vector Core (PA, USA) und SignaGen Laboratories (MD, USA).
In einer Ausführungsform ist der AAV-Vektor ein synthetischer AAV-Vektor. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der AAV-Vektor ein AAV-PHP.B Vektor oder ein AAV-Anc80 Vektor.
In einer Ausführungsform ist der Promotor ein konstitutiver Promotor. Der Begriff „konstitutiver Promotor“, wie hierin verwendet, bezeichnet einen nicht-regulierten Promotor, der eine kontinuierliche Expression seines assoziierten Gens erlaubt.
In einer Ausführungsform ist der Promotor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cytomegalovirus (CMV)-Promotor, humaner β-Actin/CMV-Hybridpromotor, Hühner β-Actin/CMV-Hybridpromotor, CMV-Actin-Globin (CAG)-Hybridpromotor, Math1-Promotor, VGLUT3-Promotor, Parvalbumin-Promotor, Calretinin-Promotor, Calbindin28k-Promotor, Prestin-Promotor, Otoferlin-Promotor und Myosin II-, V-, VI-, VIIa- oder XVa-Promotor.
In einer Ausführungsform ist der Promotor ein humaner β-Actin/CMV-Hybridpromotor.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei Otoferlin um Wildtyp-Otoferlin. In einer Ausführungsform handelt es sich bei Otoferlin um humanes Otoferlin (siehe z.B. UniProt-Datenbank ID: Q9HC10). In einer Ausführungsform umfasst humanes Otoferlin eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 9, oder besteht aus dieser Aminosäuresequenz. In einer Ausführungsform umfasst humanes Otoferlin die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 oder besteht aus dieser Aminosäuresequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst humanes Otoferlin die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder besteht aus dieser Aminosäuresequenz.
Der Begriff „funktionelles Fragment“ bezeichnet ein Fragment von Otoferlin, welches die gleiche oder eine im Wesentlichen gleiche (z.B. +/- 20% oder +/- 10%) funktionelle Aktivität wie Otoferlin aufweist. In einer Ausführungsform ist das funktionelle Fragment eine N-terminal und/oder C-terminal trunkierte Form von Otoferlin. In einer Ausführungsform umfasst das funktionelle Fragment mindestens 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800 oder 1900 zusammenhängende Aminosäurereste von Otoferlin. Das funktionelle Fragment von Otoferlin ist vorzugsweise ein Fragment, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die lang genug ist, um das Fragment als ein Fragment von Otoferlin zu identifizieren und auszuschließen, dass es sich um das Fragment eines Proteins handelt, welches nicht Otoferlin ist.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Variante um eine funktionelle Variante von Otoferlin, z.B. eine Variante von Otoferlin, welche die gleiche oder eine im Wesentlichen gleiche (z.B. +/- 20% oder +/- 10%) funktionelle Aktivität wie Otoferlin aufweist.
In einer Ausführungsform umfasst die Variante eine oder mehrere Aminosäure-Insertionen, Aminosäure-Additionen, Aminosäure-Deletionen und/oder Aminosäure-Substitutionen. In einer Ausführungsform umfasst die Variante die Insertion, Addition, Deletion und/oder Substitution (z.B. konservative Substitution) von bis zu 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 oder 2 Aminosäuren.
Der Begriff „Variante“, wie hierin verwendet, kann sich auch auf natürlich vorkommende Mutanten, Varianten und Homologe (z.B. Orthologe) von Otoferlin beziehen. In einer Ausführungsform ist das natürlich vorkommende Homolog Mäuse-Otoferlin. In einer Ausführungsform umfasst Mäuse-Otoferlin eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 und SEQ ID NO: 17, oder besteht aus dieser Aminosäuresequenz. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst Mäuse-Otoferlin die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 11 oder besteht aus dieser Aminosäuresequenz.
In einer Ausführungsform umfasst die Variante eine Aminosäuresequenz, die mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% identisch ist mit einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 und SEQ ID NO: 17, bevorzugt SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3, noch bevorzugter SEQ ID NO: 1, oder besteht aus dieser Aminosäuresequenz.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei der oben genannten funktionellen Aktivität von Otoferlin um die Fähigkeit, die präsynaptische Neurotransmitterfreisetzung von inneren Haarzellen einer Otof-Knockout-Maus ganz oder teilweise wiederherzustellen, z.B. durch die depolarisations-bedingte Zunahme der elektrophysiologisch-gemessenen Membrankapazität (gleichbedeutend mit der Verschmelzung von synaptischen Botenstoff-Vesikeln mit der präsynaptischen Plasmamembran, d.h. „Exozytose“; Roux et al. Cell 2006, 127:277-289; Vogl et al. EMBO J 2016, 35:2536-2552). In einer Ausführungsform handelt es sich bei der oben genannten funktionellen Aktivität von Otoferlin um die Fähigkeit, Otoferlin-Expression in inneren Haarzellen von Otof-Knockout-Mäusen wiederherzustellen, z.B. nachweisbar im Cytosol bzw. der Haarzell-Plasmamembran mit immunhistochemischer Einzelzell- bzw. Gewebs-RNA-Sequenzierung oder Einzelzell- bzw. Gewebs-PCR-Analyse. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der oben genannten funktionellen Aktivität von Otoferlin um die Fähigkeit, das Hörvermögen einer Otof-Knockout-Maus ganz oder teilweise wiederherzustellen, z.B. bestimmt durch Hirnstammaudiometrie (Auditory Brainstem Recording, ABR), z.B. im Wesentlichen wie in Beispiel 2 beschrieben.
In einer Ausführungsform umfasst die kodierende Sequenz eine Nukleotidsequenz, die mindestens 70%, mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97%, mindestens 98% oder mindestens 99% identisch ist mit einer Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 18, bevorzugt SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4, noch bevorzugter SEQ ID NO: 2, oder besteht aus dieser Nukleotidsequenz. In einer Ausführungsform umfasst die kodierende Sequenz die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 18, bevorzugt SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 4, noch bevorzugter SEQ ID NO: 2, oder besteht aus dieser Nukleotidsequenz.
Die Ähnlichkeit zweier Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen, z.B. ausgedrückt durch den Prozentsatz Ihrer Identität, kann über Sequenz-Alignments bestimmt werden. Solche Alignments können mit verschiedenen, dem Fachmann bekannten Algorithmen durchgeführt werden, vorzugsweise mit den mathematischen Algorithmen von Karlin und Altschul (Karlin & Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993, 90:5873-5877), z.B. mit hmmalign (HMMER Package, http://hmmer.wustl.edu/), oder mit dem CLUSTAL Algorithmus (Thompson J.D. et al. Nucleic Acids Res. 1994, 22:4673-80), welcher zum Beispiel auf http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ oder auf http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html oder auf http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.html verfügbar ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform des viralen Vektors der vorliegenden Erfindung kodiert die kodierende Sequenz für Gesamtlängen-Otoferlin (full-length Otoferlin).
In einer Ausführungsform umfasst die im erfindungsgemäßen viralen Vektor, z.B. AAV-Vektor, enthaltene Nukleinsäure weitere Sequenzelemente. Solche Sequenzelemente umfassen zum Beispiel invertierte terminale Repeats (ITRs; z.B. AAV-2 ITRs), Kozak-Sequenzen, Resistenzgene (z.B. AmpR), Polyadenylierungssequenzen (z.B. die Polyadenylierungsequenz von bovinem Wachstumshormon, bGH) und regulatorische Elemente, wie das posttranskriptionale regulatorische Element des Murmeltier Hepatitis Virus (WPRE). Außerdem kann die Nukleinsäure weitere kodierende Sequenzen enthalten. Solche weiteren kodierenden Sequenzen können zum Beispiel für zusätzliche therapeutisch aktive Peptide/Proteine oder für Markerproteine (z.B. fluoreszierende Proteine, wie etwa EGFP) kodieren. In einer Ausführungsform umfasst die im erfindungsgemäßen viralen Vektor, z.B. AAV-Vektor, enthaltene Nukleinsäure ITRs, einen Promotor und eine damit operativ verbundene kodierende Sequenz, die für Otoferlin oder ein funktionelles Fragment oder eine Variante davon kodiert, eine WPRE-Sequenz und eine Polyadenylierungsequenz (siehe z.B. 3B).
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure (oder ein genetisches Konstrukt) zur Verfügung wie es hierin beschrieben wird.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle zur Verfügung, die einen viralen Vektor der vorliegenden Erfindung oder eine Nukleinsäure (oder ein genetisches Konstrukt) der vorliegenden Erfindung umfasst. Diese Wirtszelle kann prokaryotischer Natur (z.B. eine bakterielle Zelle) oder eukaryotischer Natur (z.B. eine Pilzzelle, Pflanzenzelle oder Tierzelle) sein. Vorzugsweise ist die Wirtszelle isoliert. In einer Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Produzentenzelle oder Produzentenzelllinie, die die Produktion des erfindungsgemäßen viralen Vektors (z.B. AAV-Vektors) ermöglicht, z.B. auf Basis der Nukleinsäure (oder des genetischen Konstrukts) der vorliegenden Erfindung und mittels Ko-Transfektion geeigneter Helferkonstrukte, z.B. Helferplasmide (siehe z.B. US 2004/0235174 A1 ). Geeignete Produzentenzellen oder Produzentenzelllinien sind dem Fachmann bekannt und schließen zum Beispiel HEK293-Zellen oder HEK293T-Zellen ein.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein nicht-humanes transgenes Tier zur Verfügung, das einen viralen Vektor der vorliegenden Erfindung oder eine Nukleinsäure (oder ein genetisches Konstrukt) der vorliegenden Erfindung umfasst. Der Begriff „nicht-humanes transgenes Tier“ bezieht sich insbesondere auf nicht-menschliche Primaten oder andere Tiere, insbesondere ein Säugetier wie Kuh, Pferd, Schwein, Schaf, Ziege, Hund, Katze, Affe, Halbaffe, Vogel wie Huhn oder Nagetier wie Maus, Ratte, Meerschwein, Hamster und Mongolische Rennmaus.
Verfahren zur Herstellung von viralen Vektoren sind dem Fachmann bekannt. Ein Verfahren zur Herstellung z.B. eines AAV-Vektors besteht in der Tripel-Transfektion einer geeigneten Produzentenzelllinie, z.B. HEK293 oder HEK293T, und anschließender Aufreinigung über Iodixanol- oder Cäsiumchlorid-Gradienten. Hierbei werden die Produzenten-Zellen mit drei Vektoren transfiziert: Auf einem ersten Vektor/Plasmid ist das Gen von Interesse kodiert (hier: Otoferlin), flankiert von entsprechenden Verpackungssignalen (siehe 1B); auf einem zweiten Vektor/Plasmid sind die benötigten AAV-Proteine, insbesondere Rep und Cap, kodiert (z.B. tTA-iCAP-PHPb; siehe 2B); und ein dritter/s Vektor/Plasmid stellt adenovirale Helferfunktionen bereit, ohne die eine AAV-Partikelproduktion nicht möglich ist (z.B. pHelper, TakaralClontech; siehe 2A). Geeignete Verfahren sind auch in Grieger et al. (Nature Protocols 2006, 1(3):1412-1428) beschrieben.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung, die einen viralen Vektor der vorliegenden Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger- oder Hilfsstoff umfasst.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist vorzugsweise steril und enthält eine therapeutisch wirksame Menge des viralen Vektors.
Eine „therapeutisch wirksame Menge“ betrifft die Menge, die alleine oder zusammen mit weiteren Dosen eine gewünschte Reaktion oder eine gewünschte Wirkung erzielt, z.B. eine Verbesserung bzw. teilweise oder vollständige Wiederherstellung des Hörvermögens. Eine therapeutisch wirksame Menge wird von dem zu behandelnden Zustand, der Schwere der Krankheit, den individuellen Parametern des Patienten, einschließlich Alter, physiologischer Zustand, Größe und Gewicht, der Dauer der Behandlung, der Art einer begleitenden Therapie (falls vorhanden), dem spezifischen Verabreichungsweg und ähnlichen Faktoren abhängen.
In einer Ausführungsform werden ca. 10⁸ bis ca. 10¹³ virale Partikel verabreicht, suspendiert in einem geeigneten Volumen eines Trägerstoffs.
Mögliche Trägerstoffe (z.B. Lösungsmittel) sind zum Beispiel künstliche Perilymphe, steriles Wasser, Ringerlösung, laktierte Ringerlösung, physiologische Salzlösung, bakteriostatische Salzlösung (z.B. 0,9% Benzylalkohol enthaltende Salzlösung), Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), Hanks-Lösung, fixierte Öle, Polyalkylenglykole, hydrierte Naphtaline und biokompatible Polylaktide, Laktid/Glykolid Kopolymere oder Polyoxyethylen/Polyoxy-Propylen-Kopolymere. Die entstehenden Lösungen oder Suspensionen sind vorzugsweise isotonisch. Geeignete Trägerstoffe und ihre Formulierung sind außerdem im Detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Ausgabe, 1985, Mack Publishing Co. beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Trägerstoff künstliche Perilymphe.
Der Begriff „Hilfsstoff“, wie hierin verwendet, schließt alle Substanzen ein, die in einer pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten sein können und selbst keine aktiven Wirkstoffe sind, wie etwa Salze, Bindemittel (z.B. Laktose, Dextrose, Saccharose, Trehalose, Sorbitol, Mannitol), Gleitmittel, Verdickungsmittel, oberflächenaktive Stoffe, Konservierungsmittel, Emulgatoren, Puffersubstanzen, Stabilisierungsmittel, Geschmackstoffe oder Farbstoffe.
Der Begriff „pharmazeutisch verträglich“ betrifft ein nicht-toxisches Material, das vorzugsweise nicht mit der Wirkung des aktiven Bestandteils der pharmazeutischen Zusammensetzung wechselwirkt. Insbesondere bedeutet der Begriff „pharmazeutisch verträglich“, dass die betreffende Substanz von einer staatlichen regulatorischen Behörde zur Verwendung in Tieren und insbesondere Menschen zugelassen wurde oder in der U.S. Pharmakopöe, Europäischen Pharmakopöe oder anderen anerkannten Pharmakopöen für die Verwendung in Tieren und insbesondere Menschen aufgeführt ist.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen viralen Vektor der vorliegenden Erfindung oder eine pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zur Verwendung als Medikament zur Verfügung.
Der Begriff „Medikament“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Substanz oder Zusammensetzung, die therapeutisch verwendet wird, d.h., bei der Behandlung, Verbesserung oder Prävention einer Krankheit oder gesundheitlichen Störung.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen viralen Vektor der vorliegenden Erfindung oder eine pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Schwerhörigkeit zur Verfügung.
Erfindungsgemäß ist der behandelte Patient oder das behandelte Individuum ein Mensch, nichtmenschlicher Primat oder ein anderes Tier, insbesondere ein Säugetier wie Kuh, Pferd, Schwein, Schaf, Ziege, Hund, Katze, Affe, Halbaffe, Vogel wie Huhn oder Nagetier wie Maus, Ratte, Meerschwein, Hamster und Mongolische Rennmaus. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der behandelte Patient oder das behandelte Individuum ein Mensch.
In einer Ausführungsform ist die Schwerhörigkeit eine Schwerhörigkeit, die auf einer oder mehreren Mutationen im Otoferlin-Gen (OTOF) beruht.
In einer Ausführungsform weist der behandelte Patient oder das behandelte Individuen eine oder mehrere Mutationen im Otoferlin-Gen auf, insbesondere Mutationen, die die Expression und oder die Funktion von Otoferlin inhibieren oder blockieren.
In einer Ausführungsform ist die Schwerhörigkeit DFNB9-Schwerhörigkeit.
In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verabreichung des viralen Vektors in das Innenohr, insbesondere in die Gehörschnecke, insbesondere in innere Haarzellen der Gehörschnecke.
In einer Ausführungsform umfasst die Verabreichung die Injektion durch das runde Fenster, die Injektion in die Scala vestibuli über eine Stapedotomie, die Injektion in die Scala tympani über eine Cochleostomie und/oder die Applikation als Depot in die Rundfenster-Nische, z.B. als Bestandteil eines Gels, eines Schwamms oder über einen Applikations-Katheter.
In einer Ausführungsform umfasst die Verabreichung intratympanale Injektion.
In einer Ausführungsform führt die Verabreichung zu einer Expression von Otoferlin oder des funktionellen Fragmentes oder der Variante davon in inneren Haarzellen der Gehörschnecke, z.B. in inneren Haarzellen der apikalen Windung der Gehörschnecke.
Der Begriff „Expression“ wird erfindungsgemäß in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst z.B. die Produktion von RNA oder von RNA und Protein.
In einer Ausführungsform ermöglichen der erfindungsgemäße virale Vektor, die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung und die erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen eine Expression von Otoferlin oder des funktionelles Fragmentes oder der Variante davon in mindestens 50%, in mindestens 60%, in mindestens 70%, in mindestens 80%, in mindestens 90% oder in mindestens 95% der inneren Haarzellen der Gehörschnecke, vorzugsweise der inneren Haarzellen der apikalen Windung der Gehörschnecke.
Der erfindungsgemäße virale Vektor und die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung werden in therapeutisch wirksamen Mengen verabreicht.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines viralen Vektors der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Schwerhörigkeit zur Verfügung.
In einer Ausführungsform ist die Schwerhörigkeit eine Schwerhörigkeit, die auf einer oder mehreren Mutationen im Otoferlin-Gen (OTOF) beruht.
In einer Ausführungsform ist die Schwerhörigkeit DFNB9-Schwerhörigkeit.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Schwerhörigkeit zur Verfügung, welches die Verabreichung des viralen Vektors der vorliegenden Erfindung in das Innenohr, insbesondere in die Gehörschnecke, insbesondere in innere Haarzellen der Gehörschnecke umfasst.
In einer Ausführungsform ist die Schwerhörigkeit eine Schwerhörigkeit, die auf einer oder mehreren Mutationen im Otoferlin-Gen (OTOF) beruht.
In einer Ausführungsform ist die Schwerhörigkeit DFNB9-Schwerhörigkeit.
In einer Ausführungsform umfasst die Verabreichung die Injektion durch das runde Fenster, die Injektion in die Scala vestibuli über eine Stapedotomie, die Injektion in die Scala tympani über eine Cochleostomie und/oder die Applikation als Depot in die Rundfenster-Nische, z.B. als Bestandteil eines Gels, eines Schwamms oder über einen Applikations-Katheter.
In einer Ausführungsform umfasst die Verabreichung intratympanale Injektion.
In einer Ausführungsform führt die Verabreichung zu einer Expression von Otoferlin oder des funktionellen Fragmentes oder der Variante davon in inneren Haarzellen der Gehörschnecke, z.B. in inneren Haarzellen der apikalen Windung der Gehörschnecke.
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung eines Gesamtlängen-Otoferlin exprimierenden viralen Vektors
Klonierungsverfahren und -strategie
Gesamtlängen-Otoferlin (full-length Otoferlin, flOtoferlin) aus der Maus (SEQ ID NO: 11/12) wurde von einem zuvor erzeugten cDNA-Klon (pcDNA3-mOtof-IRES-EGFP) in einen pAAV-Vektor subkloniert.

Aufgrund des Fehlens geeigneter Restriktionsstellen innerhalb der Otoferlin-kodierenden Nukleotidsequenz und der beträchtlichen Länge der Gesamtlängen-Otoferlin cDNA wurde auf den Einsatz traditioneller T4-Ligase-basierter Klonierungstechniken verzichtet. Stattdessen wurde eine Fusionsklonierungsstrategie verwendet, bei der der Zielvektor (pAAV) zunächst durch Verdau mit den Restriktionsenzymen Nhel und HindIII (Fermentas) linearisiert wurde. Dann wurden drei Otoferlin-Fragmente amplifiziert, die flOtoferlin komplementierten und die untereinander und mit dem linearisierten Zielvektor überlappende Sequenzen enthielten. Dieser Schritt erforderte die Optimierung von Fragmenten und Primern, z.B. durch die Bestimmung optimaler Fragmentgrößen und -verhältnisse und die Verwendung von „Split Overlaps“ zur Reduzierung der Primerlängen. Der NheI/HindIIIlinearisierte pAAV-Zielvektor, die Otoferlin-Fragmente A, B, C und die Lage der verwendeten Primer sind in 1A dargestellt. Primer A_F2 umfasste am 5'-Ende eine 15bp Überlappung mit dem Zielvektor sowie das Start-Codon für die Expression von Otoferlin, während C_R2 das Stop-Codon und eine 15bp Überlappung mit dem AAV-Vektor am 3'-Ende umfasste (siehe Tabelle 1).

Fragment A

A_F2: AATTCAAGCTGCTAGCATGGCCCTGATTGTTCACC (SEQ ID NO: 19)

A_R1: CGTTTGTTGTTGCTCATCATCCAAATG (SEQ ID NO: 20)

Fragment B

B_F1 GAGCAACAACAAACGTATCGCCTATGC (SEQ ID NO: 21)

B_R1 GCAGCTCGTACTTCTTGGGTTTCCTG (SEQ ID NO: 22)

Fragment C

C_F1 AGAAGTACGAGCTGCGGGTCATCGTG (SEQ ID NO: 23)

C_R2 GATTATCGATAAGCTTTTAGGCCCCTAGGAGCTT (SEQ ID NO: 24)

Tabelle 1 Für die Klonierung verwendete Primer. Die Primer sind in 5'-3'-Orientierung dargestellt, wobei überlappende Sequenzen unterstrichen und Start- und Stopp-Codons für die Transkription in Fett- und Kursivdruck wiedergegen sind.
Anschließend wurden der linearisierte Vektor und die drei Fragmente mit Hilfe des In-Fusion HD Cloning Kits (TakaralClontech) fusioniert, wobei die Anweisungen des Herstellers befolgt wurden. Dieser Ansatz ergab den finalen Gesamtlängen-Otoferlin-Virusvektor (pAAV-flOtoferlin), der für die nachfolgende Virusproduktion verwendet wurde. Die entsprechende Vektorkarte von pAAV-flOtoferlin mit dem ubiquitären humanen β-Actin/CMV-Hybridpromotor ist in 1B dargestellt. Zur Überprüfung des korrekten flOtoferlin-Inserts wurden Restriktionsenzymverdauung und Sanger-Sequenzierung (SeqLab, Deutschland) eingesetzt.
Virusproduktion und -aufreinigung
AAVs wurden in HEK293T-Zellen (ATCC) mittels Polyethylenimin-Transfektion (25.000MW, Polysciences, USA) erzeugt (Gray et al. Current Protocols in Neuroscience 2011, Hoboken NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc.; Deverman et al. Nat. Biotechnol. 2016, 34:204-209). Kurzgefasst wurde die dreifache Transfektion von HEK293T-Zellen mit Hilfe des pHelper-Plasmids (TakaralClontech, siehe 2A), eines Trans-Plasmids, welches das virale Kapsid PHP.B bereitstellt (Deverman et al. Nat. Biotechnol. 2016, 34:204-209; siehe 2B), und eines Cis-Plasmids, welches flOtoferlin bereitstellt (siehe 1B), durchgeführt. Die Zelllinie wurde regelmäßig auf Mykoplasmen getestet. Viruspartikel wurden 72 Stunden nach der Transfektion aus dem Medium und 120 Stunden nach der Transfektion aus den Zellen und dem Medium gewonnen. Viruspartikel aus dem Medium wurden mit 40% Polyethylenglykol 8000 (Acros Organics, Deutschland) in 500 mM NaCl für 2 Stunden bei 4 °C ausgefällt und dann nach Zentrifugation bei 4.000 g für 30 min mit Zellpellets zur Verarbeitung kombiniert. Die Zellpellets wurden in 500 mM NaCl, 40 mM Tris, 2,5 mM MgCl₂, pH 8 und 100 U/mL salzaktivierter Nuklease (Arcticzymes, USA) bei 37°C für 30 min suspendiert. Anschließend wurden die Zelllysate durch Zentrifugation bei 2.000 g für 10 min geklärt und dann über Iodixanol-Stufengradienten (Optiprep, Axis Shield, Norwegen; 15%, 25%, 40% und 60%) bei 58.400 U/min für 2,25 Stunden gereinigt (Zolotukhin et al. Gene Ther. 1999, 6:973-985; Nature Protocols 2006, 1(3): 1412-1428). Die Viren wurden mit Amicon-Filtern (EMD, UFC910024) konzentriert und in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), ergänzt mit 0,001 % Pluronic F-68 (Gibco, USA) formuliert. Die Virustiter wurden mit dem AAV-Titrationskit (TakaralClontech) nach Herstellerangaben gemessen, indem die Anzahl der DNase I-resistenten vg mit qPCR (StepOne, Applied Biosystems) bestimmt wurde. Die Reinheit der produzierten Viren wurde routinemäßig durch Silberfärbung (Pierce, Deutschland) nach Gel-Elektrophorese (Novex^TM 4-12% Tris-Glycine, Thermo Fisher Scientific) nach Herstellerangaben überprüft. Die Anwesenheit von viralen Kapsidproteinen wurde in allen Viruspräparaten positiv bestätigt. Die Virusbestände wurden bis zum Versuchstag bei -80 °C gehalten.
Beispiel 2: In vivo-Applikation des Gesamtlängen-Otoferlin exprimierenden viralen Vektors
Tiere und virale Übertragung
Die postnatale AAV-Injektion (ca. 1-1,5 µl der Virusformulierung; 1,29 × 10¹² GC/ml) in die Paukentreppe (Scala tympani) des linken Ohres über das runde Fenster erfolgte bei p5-p7 im Wesentlichen wie in der Studie von Akil et al. (Akil et al. Neuron 2012, 75:283-293) beschrieben. Es wurden Otoferlin-Knockout (Otof-l-) Mäuse verwendet, die hochgradig schwerhörig sind und keine ABR-Antworten für Schalldruckpegel bis zu 120 dB zeigen (Reisinger et al. J. Neurosci. 2011, 31:4886-4895). Vier Wochen nach der Injektion wurde das Hörvermögen (Funktion der inneren Haarzellen) mittels Hirnstammaudiometrie (Auditory Brainstem Recording, ABR) getestet. Die Tiere wurden dann in Narkose schmerzfrei getötet, und die extrahierten Cochleae wurden extrahiert und für eine immunhistochemische Analyse weiterverwendet. Alle Experimente wurden in Einklang mit den nationalen Tierpflegerichtlinien durchgeführt und vom Ausschuss für Tierschutz der Universität Göttingen und dem Büro für Tierschutz des Landes Niedersachsen genehmigt (AZ: 33.4-42502-04-14/1391).
Hirnstammaudiometrie (Auditory Brainstem Recording, ABR)
Für die ABR-Analyse wurden Mäuse mit einer Kombination aus Ketamin (125 mg/kg) und Xylazin (2,5 mg/kg) i.p. betäubt. Die Kerntemperatur wurde mit Hilfe einer Wärmedecke (Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH) konstant bei 37°C gehalten. Für die Stimulusgenerierung, Präsentation und Datenerfassung wurde das TDT III System (Tucker Davis Technologies) verwendet, das von einer individuell geschriebenen Matlab-Software (Mathworks) betrieben wird. Ton-Bursts (4/6/8/12/16/24/32 kHz, 10 ms Plateau, 1 ms cos² Steigung/Fall) oder 0,03 ms-Klicks wurden bei 40 Hz (Ton-Bursts) bzw. 20 Hz (Klicks) im freien Feld ipsilateral mit einem JBL 2402 Lautsprecher dargestellt. Das Differenzpotential zwischen Vertex- und Mastoid-Nadeln wurde 50.000-fach verstärkt, gefiltert (400-4.000 Hz) und mit einer Rate von 50 kHz für 20 ms 1.300-fach abgetastet, um zwei mittlere ABR-Spuren für jede Schallintensität zu erhalten. Die Hörschwellenwerte wurden mit einer Genauigkeit von 10 dB als niedrigste Stimulus-Intensität bestimmt, die durch visuelle Inspektion durch zwei unabhängige Beobachter eine reproduzierbare Antwort-Wellenform in beiden Spuren hervorrief. Ton-Burst-Schwellwerte, die den maximalen Lautsprecherausgang (100 dB SPL) überschreiten, wurden mit einem Wert von 110 dB bewertet. Für Rescue-Experimente wurde zunächst das injizierte Ohr der Otof-Knockout-Maus aufgenommen. Dann wurde das linke Ohr mit Elektrodengel (Pauli-Magnus et al. Neuroscience 2007, 149:673-684) und kleinen Zellulose-Gewebestreifen verschlossen und somit eine Schallleitungsschwerhörigkeit von 30-40 dB erreicht (Pauli-Magnus et al. Neuroscience 2007, 149:673-684), und das nicht-injizierte Ohr aufgenommen.
Immunhistochemie und konfokale Mikroskopie
Cochlea-Explantate wurden in 4% Formaldehyd in PBS auf Eis fixiert (je nach molekularem Target entweder für 10 min oder 1 Stunde), wie zuvor beschrieben (Khimich et al. Nature 2005, 434:889-894; Meyer et al. Nat. Neurosci. 2009, 12:444-453). Nach dem Waschen und einem Blockierungsschritt mit einem Ziegenserum-enthaltenden Puffer (16% normales Ziegenserum, 450 mM NaCl, 0,3% Triton X-100 und 20 mM Phosphatpuffer bei pH 7,4), wurden folgende primäre Antikörper bei 4°C über Nacht appliziert: Maus Anti-Otoferlin (Kat.-Nr. ab53233; Abcam), Hühner-Anti-Calretinin (Kat.-Nr. 214 106; Synaptic Systems). Zur Visualisierung wurden sekundäre AlexaFluor-488, -568 und -647-konjugierte Antikörper (Kat.-Nr. A-11034, A-11011 oder A-11075 und A-21236; Thermo Fisher Scientific) für 1 h bei Raumtemperatur appliziert. Nach Fixierung der Probe zwischen Deckglas und Objektträger in Mowiol wurde die Bildaufnahme an einem Abberior Instruments Expert Line STED-Mikroskop (basierend auf einem inversen Olympus IX83-Mikroskop) im konfokalen Modus durchgeführt, gesteuert von der Imspector-Software, mit Exzitationslasern bei 485 nm und 640 nm und einem 1,4 NA UPlanSApo 100x Öl-Immersionsobjektiv. Bildstapel wurden mit xy-Pixelgrößen von 60 x 60 nm und einer z-Schrittweite von 200 nm erfasst.
Ergebnisse
Die in 3 präsentierten experimentellen Daten zeigen, dass ein gentherapeutischer Ansatz mit Otoferlin-kodierenden viralen Vektoren tatsächlich machbar ist und klinisches Potenzial besitzt.
Die frühe postnatale Transduktion von Otoferlin-Knockout-Mäusen mit Gesamtlängen-Otoferlin erreichte klinisch relevante Transduktionsraten in inneren Haarzellen (IHC) der Cochlea (3C) und resultierte in erwachsene Tiere mit signifikant reduzierten ABR-Schwellenwerten (3D-D"), was gleichbedeutend ist mit einer starken Verbesserung des Hörvermögens. Nach AAV-Injektion in das linke Ohr waren ABR auf dem injizierten und dem nicht-injizierten Ohr ableitbar, während in den nicht-injizierten Tieren auch bei den höchsten Pegeln keine ABR ausgelöst werden konnten. Die Auslösung von ABR auf der nicht-injizierten Seite könnte durch Überhören auf das linke Innenohr (trotz der induzierten Schallleitungsschwerhörigkeit) bedingt sein. Außerdem waren keine unerwünschten Nebenwirkungen zu beobachten.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2017/100791 A1 [0039]
US 2004/0235174 A1 [0056]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Deverman et al. Nature Biotechnol 2016, 34:204-209 [0039]
Chan et al. Nature Neuroscience 2017, 20:1172-1179 [0039]
Landegger et al. Nat Biotechnol 2017, 35:280-284 [0039]
Zinn et al. Cell Rep. 2015, 12(6):1056-1068 [0039]
Khimich et al. Nature 2005, 434:889-894; Meyer et al. Nat. Neurosci. 2009, 12:444-453 [0097]

Claims

Viraler Vektor, umfassend eine Nukleinsäure, die einen Promotor und eine damit operativ verbundene kodierende Sequenz umfasst, die für Otoferlin oder ein funktionelles Fragment oder eine Variante davon kodiert.
Viraler Vektor nach Anspruch 1, wobei der virale Vektor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Adeno-assoziierter Virus Vektor (AAV-Vektor), Adenovirus Vektor, Lentivirus Vektor, Herpes Simplex Virus (HSV) Vektor, Vacciniavirus Vektor und Sendaivirus Vektor, wobei der virale Vektor vorzugsweise ein AAV-Vektor oder ein Adenovirus Vektor ist.
Viraler Vektor nach Anspruch 2, wobei der AAV-Vektor ein AAV-PHP.B Vektor oder ein AAV-Anc80 Vektor ist.
Viraler Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cytomegalovirus (CMV)-Promotor, humaner β-Actin/CMV-Hybridpromotor, Hühner β-Actin/CMV-Hybridpromotor, CMV-Actin-Globin (CAG)-Hybridpromotor, Math1-Promotor, VGLUT3-Promotor, Parvalbumin-Promotor, Calretinin-Promotor, Calbindin28k-Promotor, Prestin-Promotor, Otoferlin-Promotor und Myosin II-, V-, VI-, VIIa- oder XVa-Promotor.
Viraler Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Promotor ein humaner β-Actin/CMV-Hybridpromotor ist.
Viraler Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die kodierende Sequenz für Gesamtlängen-Otoferlin kodiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen viralen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger- oder Hilfsstoff.
Viraler Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7 zur Verwendung als Medikament.
Viraler Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Schwerhörigkeit, die auf einer oder mehreren Mutationen im Otoferlin-Gen (OTOF) beruht.
Viraler Vektor oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei die Schwerhörigkeit DFNB9-Schwerhörigkeit ist.
Viraler Vektor oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder 10, wobei das Verfahren die Verabreichung des viralen Vektors in das Innenohr umfasst, wobei die Verabreichung vorzugsweise die Injektion durch das runde Fenster, die Injektion in die Scala vestibuli über eine Stapedotomie, die Injektion in die Scala tympani über eine Cochleostomie und/oder die Applikation als Depot in die Rundfenster-Nische, z.B. als Bestandteil eines Gels, eines Schwamms oder über einen Applikations-Katheter, umfasst.
Viraler Vektor oder pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, wobei die Verabreichung zu einer Expression von Otoferlin oder des funktionellen Fragmentes oder der Variante davon in inneren Haarzellen der Gehörschnecke führt.