KR20200104343A - 라싸 백신 - Google Patents

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KR20200104343A
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KR1020207021052A
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마띠유 마데오
실뱅 배즈
프레데릭 땅귀
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앵스티띠 파스퇴르
썽뜨르 나쇼날르 드 라 르쉐르쉐 씨엉띠삐끄
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Abstract

본 발명은 라싸 바이러스 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 홍역 바이러스에 관한 것이며, 특히 라싸 바이러스의 단백질을 함유하는 홍역 바이러스 및/또는 바이러스 유사 입자(VLP)에 의해 발현된 면역원성 LASV 입자에 관한 것이다. 이러한 입자는 투여 후 숙주 내에서 복제할 수 있는 재조합 감염성 입자이다. 본 발명은 이러한 재조합 감염성 입자를 생산하기 위한 수단, 특히 핵산 작제물, 벡터, 세포 및 구제 시스템을 제공한다. 본 발명은 또한 라싸 바이러스에 의한 감염의 치료 또는 방지를 위한, 특히 조성물의 형태 하에서, 보다 특히 백신 제형으로서, 이러한 재조합 감염성 입자의 용도에 관한 것이다.

Description

라싸 백신
발명의 분야
본 출원은 일반적으로 재조합 홍역 바이러스를 포함하고 적어도 하나의 라싸 바이러스(Lassa virus) 폴리펩타이드, 단백질, 항원, 또는 이의 항원성 단편을 발현하는 재조합 유전 작제물(recombinant genetic construct)에 관한 것이다. 본 출원은 또한 유전 작제물 또는 바이러스의 용도, 및 보다 특히 라싸 바이러스(LASV), 및/또는 홍역 바이러스(MV 또는 MeV)에 대한 보호를 유도하기 위한 이들의 적용에 관한 것이다.
본 발명의 수단은 LASV의 보다 특히 다음의 폴리펩타이드 중 적어도 하나, 또는 이의 트렁케이트된 버젼(truncated version) 또는 이의 항원성 단편: 핵단백질(NP), 당단백질 전구체(GPC), 아연-결합 단백질(Z), 또는 천연 NP 단백질의 돌연변이된 버젼(돌연변이된 NP 또는 mNP) 중 적어도 하나의 발현을 허용하는 재조합 핵산 작제물에 관한 것이며, 여기서 NP 단백질의 엑소뉴클레아제 활성은 녹다운되었다.
본 발명은 또한 이미 언급된 LASV 폴리펩타이드, 이의 항원성 단편 또는 이의 항원 또는 이의 트렁케이트된 버젼, 즉, NP, mNP, GPC 및/또는 Z 중 적어도 하나를 발현하는 재조합 MeV-LASV 바이러스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 홍역 바이러스에 의해 발현되고 LASV 폴리펩타이드, 특히 적어도 GPC 폴리펩타이드, 또는 단백질, 또는 이의 항원성 단편 및/또는 적어도 Z 폴리펩타이드, 또는 단백질, 또는 이의 항원성 단편을 함유하는 감염성 바이러스-유사 입자(VLP)를 포함하는 면역원성 입자에 관한 것이며, 상기 면역원성 입자 및/또는 VLP는 LASV에 대한 세포 및/또는 체액성 반응, 특히 T 세포 반응, 특히 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 반응을 유발할 수 있다.
특히, 본 발명은 숙주 내에서 면역원성 또는 항원성 반응을 유도하기 위한 이러한 유전 작제물, 재조합 핵산 작제물, 발현 벡터, 예를 들면, 플라스미드 벡터 등, 재조합 바이러스 감염 입자, VLP의 용도에 관한 것이다.
발명의 배경
라싸 바이러스(LASV)는 아레나비리다에 과(family)의 구 세계 아레나바이러스이다. LASV는 엔벨로프된(enveloped), 단일-가닥의, 이중분절된 앰비센스(bisegmented ambisense) RNA 바이러스이다. 이들의 게놈은 총 4개의 바이러스 단백질에 대해, 각각의 의미에서 1개씩, 2개의 단백질을 각각 암호화하는 2개의 RNA 분절을 함유한다. 보다 큰 분절(대략 7kb)은 아연-결합 단백질 Z를 암호화한다. Z 단백질은 복제 및 전사를 조절한다. 보다 큰 분절은 또한 RNA 폴리머라제 L을 암호화한다. 작은 분절(대락 3.4kb)은 핵단백질(NP) 및 당단백질 전구체(GPC)를 암호화하며, 이는 해독후 엔벨로프 당단백질 GP1 및 GP2와 안정한 신호 펩타이드 SSP로 절단된다. 이러한 2개의 당단백질은 숙주 세포 도입을 매개한다. 아레나바이러스의 합성능은 L 폴리머라제 단백질 내에 함유된다. 이러한 단백질은 NP 단백질과 바이러스 리보핵단백질에 의해 캡시드화된 게놈 RNA로 이루어진 바이러스 RNA 주형(template)을 사용한다. 감염시, 바이러스는 숙주 세포의 세포질 내로 전달되며, L 폴리머라제 단백질은 각각의 게놈 RNA 분절의 3' 말단에 위치한 게놈 프로모터로부터의 전사를 개시한다. 주요 전사는 항원성 배향 내에 암호화된 바이러스 유전자, 즉, NP 및 L 유전자의 mRNA의 합성을 야기한다. 전사는 게놈간 영역 내에서 스템-루프 구조의 원위 말단(distal end)에서 종결된다. 이후에, L 폴리머라제는 게놈간 영역을 가로질러 이동하여 상보성의 항게놈 RNA를 생성한다. 이러한 RNA는 바이러스 유전자 GPC 및 Z의 mRNA의 합성을 위한 및 완전한 길이의 게놈성 RNA의 합성을 위한 주형으로서 제공된다.
LASV는 사람에게서 심각한 출혈열인, 라싸 열(Lassa fever)의 제제(agent)이다. 바이러스의 천연의 병원보유체(reservoir)는 아프리카 설치류 마스토마이스 나탈렌시스(Mastomys natalensis)이다. 라싸 바이러스는 설치류로부터 사람으로 전염되지만, 바이러스는 또한 사람으로부터 사람으로 전염되어, 지역 발생을 일으킬 수 있다.
100.000 내지 300.000 명의 환자, 및 때때로 500.000명까지의 환자가 서부 아프리카의 풍토성 지역, 특히 기니아, 라이베리아, 나이제리아 및 시에라 리온(Sierra Leone)에서 매년 라싸 열에 걸린 것으로 보고되었다. 따라서, 라싸열은 이들 지역에서 주요 공중 보건 문제이다. 질환의 중증도는 무증상 감염으로부터 치명적인 출혈열을 야기하는 심각한 합병증까지 다양하다. 임상 신호 및 증상은 열, 기침, 가슴 통증, 배뇨곤란, 두통, 오심, 설사, 인두염, 결막염, 출혈 및 안면 부종을 포함한다. LASV에 감염된 환자의 치사율은 높은데, LASV가 분포된 일부 지역에서는 대략 10% 치사율이다. 사망율은 어린 아이에서 50%로 높다. 더욱이, 생존자의 대략 20%는 청력 상실을 포함하는 장기간의 합병증을 나타낸다. 따라서, 라싸열은 이들 지역의 집단에서 심각한 영향을 미치며 주요 건강 문제이다. 최근에, 라싸 열 감염의 분포는 지난 10년 동안 말리, 가나, 아이보리 코스트 및 부르키나 파소에 보고된 이래로, 다른 서부 아프리카 국가들에서 확산되는 것으로 보인다.
나이제리아에서 1969년의 이의 발견에도 불구하고, 라싸 열에 대한 방지 또는 예방적 치료는 현재 존재하지 않는다. 환자들의 대부분은 항바이러스 약물인, 리바비린으로 치료된다. 불행하게도, 이러한 약물을 사용한 치료는 질병의 과정의 초기에 투여되는 경우에만 가장 효과적인 것으로 여겨지며 이것이 완전히 효율적이지는 않다. 치료는 또한 혈압의 유지 및 산소공급, 유액 및 전해질 균형, 및 임의의 다른 감염의 치료와 같은, 보조적 조치와 함께 완료되어야 한다. 따라서, 라싸 열이 확산하는 서부 아프리카의 풍토성 지역에서 환자를 효율적으로 치료하는 것이 어려울 수 있다.
감염이 심각한 질병 또는 사망을 야기하는지의 여부는 숙주 면역 반응에 의존하는 것으로 여겨진다. 심각한 경우의 대부분은 결함이 있는 세포 반응을 포함하며, 여기서 수지 세포 및 대식구는 LASV를 대량으로 방출하지만 활성화되어 있지 않으므로 사이토킨을 생산하지 않거나 충분하지 않다. 질환 중증도는, 바이러스의 진화 및 새로운 지리학적 지역으로의 확산 못지 않게, 해결될 필요가 있는 심각한 공중 보건 문제이다.
이와 관련하여, 예방 백신과 같은 예방적 치료의 개발이 이러한 집단의 필요성을 충족시키기 위한 주요 우선사항이다. 따라서, LASV 감염을 치료하거나 방지하는, 예를 들면, LASV의 주요 감염의 결과를 방지하고, 특히 라싸 열을 방지할 수 있는 충분히 효율적인 치료가 요구되고 있다.
LASV 감염을 방지하기 위한 가장 촉망되는 요법 중 하나는 예방학적 예방접종이지만 이러한 백신은 현재 이용가능하지 않다. 예방은 LASV 감염을 제어하고, 지역 인구를 보호하는 가장 쉽고 가장 안전한 방법일 수 있다. 이러한 긴급한 필요성에도 불구하고, 백신 후보물은 아직까지 임상 시험까지 성공적으로 진전되지 않았다.
따라서, 백신을 제조하기 위한 활성 성분과 같은 백신 및 생성물, 및 이러한 생성물 및 백신의 생산 방법이 요구되고 있다. 백신 후보물은 이를 필요로 하는 사람을 면역화시키는 경우, 유의적인 부작용없이 안전하고 효율적이어야 하며, LASV를 중화시키는 항체, 및 가능하게는 T 세포, 예를 들면 T 헬퍼 세포 및/또는 세포독성 T 세포의 생산을 유도하여야 한다. 다시 말해서, 백신은 강력한 세포 및/또는 체액성 반응을 유발시켜야 한다. 유리하게는, 백신은 단일 면역화 후 멸균화 면역성을 부여하여야 한다. 이를 위하여, LASV 단백질 및/또는 LASV VLP가 감염된 세포내, 특히 숙주의 감염된 세포내에서 생체내 생성할 수 있어서, 특히 단지 1회, 또는 2회 투여 단계 후에서 장기간 면역성을 유도하는, 효율적이고, 장기 지속하는 면역성을 제공하는 백신에 대한 요구가 존재한다.
다른 요구는 의료 센터 등에 거의 접근할 수 없는 집단의 예방접종을 촉진시키는 것이다. 2개의 질환 제제에 대해 면역화를 유발할 수 있는 백신 후보물은 이러한 집단의 전반적인 건강을 향상시킬 수 있다. 따라서, 단일 예방접종은 상기 언급한 지역에 존재하는 심각한 질환 제제에 대해 예방접종을 허용할 수 있다. 특히, 홍역 바이러스(MeV)를 전반적으로 근절시킬 목적의, MeV 및 LASV 둘 다에 대한 백신 면역화는 특히 서부 아프리카에서 2개의 주요 위협에 대해 이들 집단을 명확하게 보호할 수 있다.
홍역 바이러스는 1954년에 단리되었다(Enders, J. F., and T. C. Peebles. 1954. Propagation in tissue cultures of cytopathogenic agents from patients with measles. Proc. Soc. Exp. Biol. Med.86:277-286.). 홍역 바이러스는 모노네가비랄레스(mononegavirales) 목의 구성원, 즉, 비-분절된 음성-가닥 RNA 게놈을 지닌 바이러스이다. MeV의 비-분절화된 게놈은 정제된 경우 생체내 또는 시험관내에서 해독되지 않거나 감염성이 아닌 게놈 RNA를 생성하는 항메세지 양극성(antimessage polarity)을 갖는다. 비-분절화된(-) 가닥 RNA 바이러스의 전사 및 복제 및 바이러스 입자로의 이들의 조립이 연구되어 왔으며 특히 바이러스학 분야(Fields virology)(3rd edition, vol. 1, 1996, Lippincott-Raven publishers-Fields BN et al.)에 보고되어 있다. 홍역 바이러스의 전사 및 복제는 감염된 세포의 핵을 포함하지 않지만 오히려 LASV와 같은, 숙주 세포의 세포질 내에서 일어난다. MeV의 게놈은 N, P, M, F, H 및 L로 지정된 6개의 주요 구조 단백질, 및 P 유전자, C 및 V로부터의 추가의 2개의 비-구조 단백질을 암호화하는 유전자를 포함한다. 유전자 순서는 다음과 같다: 게놈 RNA의 3' 말단으로부터; 5' 말단에서 N, P(C 및 V 포함), M, F, H 및 L 거대 폴리머라제. 게놈은 또한 유전자간 영역 M/F내에서 비 암호화 영역을 포함한다. 이러한 비 암호화 영역은 해독되지 않은 RNA의 대략 100개의 뉴클레오타이드를 추가로 포함한다. 언급된 유전자 각각은 함께 게놈 RNA 주변에서 조립되어 핵캡시드, 헤마글루티닌(H), 융합 단백질(F) 및 매트릭스 단백질(M)을 제공하는 바이러스의 뉴클레오캡시드의 단백질 또는 핵단백질(N), 인단백질(P), 거대 단백질(L)을 암호화한다.
약독화된 바이러스(attenuated virus)는 MeV 바이러스로부터 유래되어 백신 균주를 제공하며 특히 슈바르츠 균주(Schwarz strain)로부터 유래되었다. 슈바르츠 홍역 백신은 홍역을 예방하는데 현재 이용가능한 안전하고 효율적인 백신이다. 백신을 제공하는 것 외에, 균주 약독화된 홍역 바이러스, 예를 들어, 슈바르츠 균주는 다른 바이러스, 예를 들면, 지카 바이러스(Zika virus) 또는 치쿤군야 바이러스(Chikungunya virus)에 대한 면역화에 효율적인 전달 벡터의 설계에 안정하고 적합한 것으로 밝혀졌다. 홍역 백신은 지난 30년에 걸쳐서 수억명의 어린이에게 투여되어 왔으며 이의 효능 및 안전성이 입증되었다. 이는 많은 국가에서 대규모로 생산되며 저 비용으로 유통된다.
발명의 요약
적어도 부분적으로, 당해 분야의 기술의 단점에 집중하여, 본 발명자는 재조합 유전 작제물을 기반으로, 및 특히 감염성의 복제성 홍역 바이러스 내에서, 라싸 바이러스 폴리펩타이드, 단백질 또는 항원, 또는 이의 항원성 단편을 암호화하는 클로닝된 폴리뉴클레오타이드(들)을 포함하는 재조합 핵산 작제물을 기반으로 백신에 대한 활성 구성성분(또는 성분)의 생산을 달성하였다. 백신은 재조합 홍역 바이러스가 투여 후 숙주 내에서 복제하는 경우 복구될 수 있다. 따라서, 본 발명은 LASV 백신, 특히 소아용 백신에 관한 것이며, 상업적으로 이용가능한 공지된 백신 균주, 특히 광범위하게 사용된 슈바르츠 홍역 백신과 같은 약독화된 홍역 바이러스 균주를 기반으로 한 활성 성분에 관한 것이다. 모든 이러한 이유를 위해, 본 발명자는 약독화된 홍역 바이러스를 사용하여 LASV의 구조적 항원, 특히 이의 면역원성 입자 및/또는 VLP를 안정하게 발현시키는 재조합 홍역 바이러스 입자를 생성하였다. 본 발명의 홍역 접근법은 미래의 LASV 백신의 관련 기준 모두를 충족한다.
본 발명의 하나의 목표는 핵산 작제물로부터 감염성 바이러스 및 LASV 입자를 발현하는 홍역 바이러스, 및 임의로 또한 LASV 바이러스 유사 입자(VLP)를 회수하기 위한 유전 작제물, 특히 재조합 유전 작제물, 특히 핵산 작제물을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 홍역 바이러스의 완전한 길이의 항게놈성 (+) RNA 가닥을 암호화하는 cDNA 분자, 및 라싸 바이러스의 적어도 하나의 폴리펩타이드, 또는 적어도 하나의 단백질, 또는 적어도 하나의 항원, 또는 적어도 하나의 이의 항원성 단편을 암호화하는 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 작제물에 관한 것이며, 라싸 바이러스의 상기 적어도 하나의 폴리펩타이드, 또는 적어도 하나의 단백질, 또는 적어도 하나의 항원, 또는 적어도 하나의 이의 항원성 단편은 핵단백질(NP), 돌연변이된 핵단백질(mNP), 아연-결합 단백질(Z) 및 당단백질 전구체(GPC)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드는 MeV의 항게놈성 (+) RNA 가닥의 cDNA 내에 삽입된 추가의 전사 단위(ATU) 내에서 작동적으로 클로닝된다. 이러한 구현예에 따른 특수한 핵산 작제물은 도 1 및 도 31 내지 도 36 및 실시예에 도시되어 있다.
상기 정의 내에서 표현 "암호화하는"은 완전한 길이의 항게놈성 (+) RNA의 전사를 허용하는 cDNA의 능력을 포함하며, 상기 cDNA는 특히 전사를 위한 및 적절한 해독의 경우 세포 또는 세포주 내로의 생성물 발현을 위한 적절한 해독의 경우 주형으로서 제공된다. 따라서, cDNA가 이중 가닥 분자인 경우, 가닥들 중 하나는 cDNA 내에 "T" 뉴클레오타이드에 의해 치환된 "U" 뉴클레오타이드를 제외하고는, 내부에 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드를 지닌 홍역 바이러스의 항게놈성 (+) RNA와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 본 발명의 핵산 작제물은 암호화 서열의 전사를 제어하는 조절 인자, 특히 전사용 프로모터 및 종결 서열, 및 가능하게는 인핸서(enhancer) 및 다른 시스-작용 성분을 포함할 수 있다. 이러한 조절 인자은 LASV 유전자(들)으로부터 유출되거나 유래된 이종 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 이종성일 수 있는데, 특히 홍역 바이러스 균주의 조절성 성분일 수 있다.
표현 "작동적으로 연결된"으로 대체될 수 있는, 표현 "작동적으로 클로닝된"은 본 발명의 핵산 작제물 내에서 이종 폴리뉴클레오타이드를 기능성 클로닝, 또는 삽입함으로써, 상기 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 작제물이 LASV의 적어도 하나의 폴리펩타이드, 또는 적어도 하나의 단백질, 또는 적어도 하나의 항원, 또는 적어도 이의 항원성 단편을 발현하는 재조합 감염성 MeV 입자 또는 MeV의 생산을 위한 구제 시스템의 일부로서 사용된 세포, 세포주, 숙주 세포 내에서 효과적으로, 또는 효율적으로 전사되고 적절하게는 해독되도록 함을 지칭한다. 다시 말해서, 본 발명의 핵산 작제물은 적절한 조건에 두는 경우, LASV의 적어도 하나의 폴리펩타이드, 또는 적어도 하나의 단백질, 또는 적어도 하나의 항원, 또는 적어도 하나의 이의 항원성 단편을 생산할 수 있는 감염성 항게놈성 (+) RNA의 생산을 허용한다.
본 발명의 특수한 구현예에서, MeV의 완전한 길이의 감염성 항게놈 (+) RNA 가닥의 뉴클레오타이드를 암호화하지만 작동적으로 클로닝된 이종 폴리뉴클레오타이드가 없는 cDNA를 포함하는 핵산 작제물은 홍역 바이러스 게놈의 6의 규칙에 부합한다. 다시 말해서, MeV의 완전한 길이의, 감염성 항게놈 (+) RNA 가닥의 뉴클레오타이드를 암호화하는 cDNA는 폴리헥사머릭(polyhexameric) cDNA이다.
홍역 바이러스의 게놈의 구조화 및 이의 복제 및 전사 공정은 선행 기술에 충분히 확인되었으며 특히 바이러스의 슈바르츠 예방접종 균주의 경우 문헌: Horikami S.M. and Moyer S.A. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1995) 191, 35-50 또는 Combredet C. et al (Journal of Virology, Nov 2003, p11546-11554)에, 또는 광범위하게 고려된 음성-센스 RNA 바이러스의 경우 문헌: Neumann G. et al (Journal of General Virology (2002) 83, 2635-2662)에 특히 개시되어 있다.
"6의 규칙"은 MeV (+) 가닥 RNA 게놈을 나타내는 핵산 내에 또는 이를 포함하는 핵산 작제물 내에 존재하는 뉴클레오타이드의 총 수가 6의 배수이라는 사실로 표현된다. "6의 규칙"은 홍역 바이러스의 게놈 내 뉴클레오타이드의 총 수에 관한 요건으로서 당해 분야의 기술에 인식되어 왔으며, 이는 MeV 게놈성 RNA의 효율적이거나 최적화된 복제를 가능하도록 한다. 6의 규칙을 충족시키는 핵산 작제물을 정의하는 본 발명의 구현예에서, 상기 규칙은 완전한 길이의 MV (+) 가닥 RNA 게놈을 암호화하는 cDNA를 규정하는 핵산 작제물에 적용된다. 이와 관련하여 6의 규칙은 개별적으로 홍역 바이러스의 완전한 길이의 감염성의 항게놈성 (+) RNA 가닥의 뉴클레오타이드 서열을 암호화하는 cDNA에 대해 개별적으로, 가능하게는 그러나 반드시 상기 cDNA내로 클로닝되고 LASV의 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 적용된다.
본 발명의 핵산 작제물은 특히 MeV의 적어도 하나의 폴리펩타이드와, 작동적으로 클로닝되거나 함께 연결된, LASV의 적어도 하나, 또는 수개의 폴리뉴클레오타이드의 조합에 의해 수득되거나 수득가능한 정제된 DNA 분자이다.
본 발명에 따라서, 핵산 작제물은 홍역 바이러스의 완전한 길이의 항게놈성 (+) RNA를 암호화하는 cDNA내에 LASV의 GPC 단백질, NP 단백질, mNP 단백질 및 Z 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 적어도 하나의 폴리펩타이드, 또는 단백질, 또는 항원, 또는 이의 항원성 단편을 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드, 또는 수개의 폴리뉴클레오타이드를 클로닝함으로써 제조된다. MeV 게놈은 도 1a에 나타내어져 있는 반면, 본 발명에 다른 수개의 핵산 작제물은 도 1b 및 도 31 내지 도 36에 나타내어져 있다. 대안적으로, 본 발명의 핵산 작제물은 PCR에 의함을 포함하는, 핵상 단편의 합성 또는 주형으로부터 중합화의 단계를 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드(들) 및 핵산 작제물은 당해 분야에서 임의의 공지된 방법에 따라 제조할 수 있고 특히 PCR 방법을 사용한 중합화에 의해 클로닝하여, 수득할 수 있거나 합성할 수 있다.
이종 폴리뉴클레오타이드는 수개의 다른 폴리뉴클레오타이드의 융합으로부터 생성될 수 있으며, 각각은 LASV의 특수한 폴리펩타이드, 또는 특수한 단백질, 항원 또는 이의 항원성 단편을 암호화한다. 예를 들면, 이종 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면, 단일 단백질, GPC 단백질 및 NP 단백질 또는 mNP 단백질을 각각 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 융합으로부터 생성될 수 있으며, 이들 2개의 폴리뉴클레오타이드는 링커 서열에 의해 핵산 작제물 내에서 연결된다. 링커 서열은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 홍역 바이러스의 조절 서열을 포함하거나 이로 이루어진 짧은 뉴클레오타이드 서열일 수 있다.
따라서, 이종 폴리뉴클레오타이드는 단일 폴리펩타이드, 2개의 상이한 폴리펩타이드, 2개의 동일한 폴리펩타이드, 3개의 상이한 폴리펩타이드, 2개의 동일한 폴리펩타이드 및 다른 폴리펩타이드, 4개의 상이한 폴리펩타이드, 2개의 동일한 폴리펩타이드 및 2개의 다른 동일한 폴리펩타이드, 2개의 동일한 폴리펩타이드 및 2개의 다른 상이한 폴리펩타이드, 3개의 상이한 폴리펩타이드 및 다른 상이한 폴리펩타이드를 암호화한다. 적어도 2개(동일하거나 상이한) 폴리펩타이드를 암호화하는 이러한 폴리뉴클레오타이드 중 임의의 하나는 수개의 폴리뉴클레오타이드의 융합으로부터 생성될 수 있거나 PCR에 의해서를 포함하는, 핵산 단편의 합성 또는 주형으로부터의 중합의 단계를 사용하여 제조할 수 있다. 대안적으로, 이러한 폴리뉴클레오타이드 중 임의의 하나는 라싸 바이러스의 게놈성 RNA로부터 생성된 cDNA일 수 있으며, 레트로전사(retrotranscription) 후, 상기 cDNA는 완전한 게놈성 cDNA 또는 이의 단편이며, LASV의 폴리펩타이드를 암호화한다.
이종 폴리뉴클레오타이드, 특히 LASV 유전자(들)은 MeV의 cDNA 내에 삽입된 추가의 전사 단위(ATU) 내에서 클로닝된다. ATU 서열은 기술자로부터 공지되어 있으며 MeV의 cDNA내로의 클로닝 단계에서 사용하기 위해, 이식유전자의 MeV-의존성 발현에 필수적인 시스-작용 서열, 예를 들면, MeV cDNA 내에서, 선행하는 유전자의 프로모터, 다중 클로닝 부위 카세트(cassette) 내로 삽입된 SASV 폴리펩타이드(들)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 나타낸 삽입체를 포함한다. ATU는 제WO 97/06270호에서 빌레터(Billeter) 등에 의해 개시된 바와 같이 추가로 정의될 수 있다. 3개의 ATU는 도 1a에 나타낸다. ATU는 또한 MeV의 cDNA 내에, 특히 MeV 게놈의 N-P 유전자간 영역 사이에, 및/또는 MeV 게놈의 유전자간 H-L 영역 사이에 삽입된 다중 클로닝 카세트로서 정의될 수 있다. ATU는 MeV의 P 유전자의 전사에 필수적인 시스-작동 서열을 함유할 수 있다. 특수한 ATU1 및 ATU2 내의 상이한 ATU는 이들의 핵산 서열과 관련하여 동일할 수 있다. ATU는 일반적으로 폴리머라제의 출발 및 정지 코돈에 각각 상응하는 2개의 CTT 코돈 사이에 국재화된다. ATU는 ATU 내에 클로닝된 이종 폴리뉴클레오타이드의 해독을 위한 출발 및 정지 코돈에 각각 상응하는 ATG 및 TAG 코돈을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, ATU는 ATU 내에 클로닝된 이종 폴리뉴클레오타이드의 해독을 위한 출발 및 정지 코돈에 각각 상응하는 ATG와 TAG 코돈 사이에 국재화된다. ATU는 ATU 내에 클로닝된 이종 폴리뉴클레오타이드의 해독을 위한 출발 및 정지 코돈에 대해 각각 상응하는 ATG 및 TAG 코돈을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, ATU는 서열 번호: 16을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오타이드이다.
서열 번호: 16
서열 번호: 16은 홍역 바이러스의 완전한 길이의 항게놈성 (+) RNA 가닥을 암호화하는 cDNA 분자 내에 국재화된 ATU 서열이다. 폴리머라제의 출발 및 정지 코돈에 각각 상응하는 CTT 코돈은 굵은 활자체이다. ATU 내에 클로닝된 이종 폴리뉴클레오타이드의 해독을 위한 출발 및 정지 코돈에 상응하는 ATG 및 TAG 코돈은 밑줄쳐져 있다.
CTTAGGAACCAGGTCCACACAGCCGCCAGCCCATCAacgcgtacgATG*TAGgcgcgcagcgcttagacgtctcgcgaTCGATACTAGTACAACCTAAATCCATTATAAAAAACTT 여기서 *는 적어도 하나의 LASV 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 코돈-최적화된 서열 폴리뉴클레오타이드에 상응한다.
GPC 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오타이드를 지닌 ATU는 예를 들면 서열 번호: 9의 아미노산 잔기 3487 내지 5071번 사이에 국재화된다. 서열 번호: 17은 GPC 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 이종 폴리뉴클레오타이드를 클로닝된 삽입체로서 포함하는 ATU에 상응한다.
ATU(참고 번호 ATU2 하에 공지됨)는 MeV의 P 유전자와 M 유전자 사이에 국재화되어 있다. 다른 ATU(참고 번호 ATU1 하에 공지됨)는 MeV의 유전자 N의 하부에 위치한다. 다른 ATU(참고 번호 ATU3 하에 공지됨)는 MeV의 유전자 H 및 L 사이에 위치한다. MeV의 바이러스 RNA의 전사는 5'로부터 3' 말단으로의 구배에 따르는 것이 관찰되었다. 이는 이종 폴리뉴클레오타이드가 삽입된 부위에 따라서, 이의 발현 수준이 변할 것이고 ATU1, ATU2 또는 ATU3 내에 삽입된 경우 보다 더 또는 덜 효율적일 것임을 설명한다.
용어 "폴리펩타이드"는 용어 "항원" 또는 "단백질" 또는 "항원성 단편"과 상호교환적으로 사용되며 아미노산 잔기의 연속으로부터 생성된 분자를 정의한다. 특히, 본원에 개시된 폴리펩타이드는 LASV로부터 기원하며 항원, 단백질, 구조 단백질, 또는 이의 항원성 단편이고, 이는 천연 단백질과 동일할 수 있거나 대안적으로 치환에 의해(특히 보존적 아미노산 잔기에 의해) 또는 아미노산 잔기의 첨가에 의해 또는 아미노산 잔기의 첨가에 의해 또는 해독 후 제2 변형에 의해 또는 참고의 천연 단백질과 관련하여 단축된 크기를 갖는 단편을 생성하는 천연 단백질(들) 중 일부의 결실에 의함을 포함하는, 돌연변이에 의해 이로부터 유래될 수 있다. 단편은 숙주, 특히 사람 숙주, 예를 들면, 어린이 숙주 내에서 면역 반응, 바람직하게는 LASV 감염에 대해 또는 LASV 관련 질환에 대해 보호가 가능하도록 하는 반응의 유발에 적합한 천연 단백질의 에피토프를 생성하는 정도로 본 발명에 포함된다. 에피토프는 특히 세포 매개된 면역 반응(CMI 반응)의 유발에 관여된 T 에피토프의 유형이다. T 에피토프는 MHC 제II 부류 분자 상에서 결합하여, T 세포의 활성화를 야기할 수 있는 T-세포 에피토프의 일부 부위의 제시를 통해 T 세포의 자극에 관여한다. 에피토프는 단백질이 투여되었거나 이것이 본 발명의 감염성의 복제성 입자의 투여 후 발현된 숙주 내에서 항체의 생산의 활성화에 관여하는 B형일 수 있다. 단편은 LASV 균주 조시아(Josiah)의 천연 단백질의 아미노산 서열 크기의 50% 이상, 바람직하게는 적어도 90% 또는 95%를 나타내는 크기를 가질 수 있다. 폴리펩타이드는 LASV 균주 조시아의 천연 단백질과 적어도 50% 동일성, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 85% 또는 적어도 95% 동일성을 가질 수 있다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 항게놈성 (+) RNA의 cDNA 내에 작동적으로 클로닝된 각각의 폴리뉴클레오타이드는 LASV 폴리펩타이드(들) 중 임의의 하나 내에 국재화된 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화한다. 이러한 구현예에 따라서, 에피토프 서열(들)은 천연의 LASV 단백질의 에피토프 서열(들)과 100% 동일성을 공유한다. 이러한 에피토프는 면역 에피토프 데이타베이스(Immune Epitope database) 및 분석원(analysis resource)(www.iedb.org)에 나열되어 있다. 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되고 본원에 정의된 에피토프 서열(들)을 갖는 LASV의 폴리펩타이드(들) 내에서, 임의의 에피토프에 속하지 않는 아미노산 잔기는 천연의 LASV 단백질(들)의 서열과는 상이할 수 있다.
"LASV의 폴리펩타이드"는 본원에 정의된 바와 같은 "폴리펩타이드"(폴리펩타이드, 항원, 단백질, 또는 이의 항원성 단편)를 의미하며, 이의 아미노산 서열은, LASV의 단백질의 천연의 성숙체 또는 전구체인 폴리펩타이드를 포함하는, LASV의 균주, 특히 LASV 균주 조시아 내 대응부와 동일하거나 본원에 정의된 바와 같은 이의 항원성 단편 또는 이의 돌연변이체, 특히 천연적으로 발생하는 LASV GPC, NP 또는 Z 단백질에 대해 적어도 50%, 적어도 80%, 특히 유리하게는 적어도 90% 또는 바람직하게는 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 항원성 단편 또는 돌연변이체이다. 아미노산 서열 동일성은 당해 분야의 기술자에 의한 수동 정렬에 의해 또는 이용가능한 다수의 정렬 프로그램(예를 들면, BLASTP - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)의 사용에 의해 측정될 수 있다. 본 발명의 LASV 폴리펩타이드의 단편 또는 돌연변이체는 본원에 나타낸 특수한 아미노산 서열, 특히, 서열 번호: 1, 서열 번호: 3, 서열 번호: 5 및 서열 번호: 7로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 관련하여 정의될 수 있다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 폴리펩타이드는 LASV 균주 조시아의 이의 천연 단백질과, 또는 서열 번호: 1; 서열 번호: 3; 서열 번호: 5; 또는 서열 번호: 7의 폴리펩타이드와 적어도 50%, 적어도 80%, 특히 유리하게는 적어도 90% 또는 바람직하게는 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다.
본 발명의 하나의 양태에 따라서, LASV의 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 이의 게놈이 전체적으로 또는 부분적으로 서열분석된 임의의 라싸 균주를 포함하는, LASV의 단리되고 정제된 야생형 균주(들)의 게놈으로부터 생성되거나 유래된다. 이러한 서열 중 적어도 일부는 NCBI 뉴클레오타이드 데이타베이스에서 발견될 수 있다. 특히, 적어도 하나의 LASV 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 문헌: Clinical Sequencing Uncovers Origins and Evolution of Lassa 바이러스 (Andersen Kristian G et al.; 2015; Cell. 2015 August 13; 162(4): 738-750. doi:10.1016/j.cell.2015.07.020), 특히 균주의 명칭 및 서열의 상응하는 수탁 참고번호가 나열된 공보의 보충 데이타에서 서열분석되고 참고된 임의의 라싸 균주로부터 유래되거나 생성될 수 있다. 우선적으로(preferably), 폴리뉴클레오타이드는 균주 조시아로부터 생성되거나 유래되며 2개의 RNA 분절의 이의 게놈 서열은 NP 단백질 및 GPC 단백질을 암호화하는 짧은 게놈성 RNA의 경우 GenBank 수탁 번호 J04324.1 하에, 및 Z 단백질 및 L 단백질을 암호화하는 긴 게놈성 RNA의 경우 유럽 뉴클레오타이드 기록보관소(European Nucleotide Archive) 수탁 번호 U73034.2 하에 발견될 수 있다. LASV 균주 조시아의 천연 단백질은 NP 단백질 및 GPC 단백질을 암호화하는 짧은 게놈성 RNA의 경우 GenBank 수탁 번호 J04324.1 하에, 및 긴 게놈성 RNA의 경우 유럽 뉴클레오타이드 기록보관소 수탁 번호 U73034.2 하에 발견된 RNA 분절로부터 생성된 서열을 갖는 것으로 정의될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 정의에서 나타나는 용어 "유래하다"는 단순히 상기 폴리뉴클레오타이드의 서열이 LASV 균주 내 상응하는 서열과 동일할 수 있거나 이것이 본 발명에 따른 "폴리펩타이드"의 정의를 충족시키는 폴리펩타이드, 항원, 단백질, 또는 이의 단편을 암호화하는 정도로 변할 수 있음을 규정한다. 특히, 폴리뉴클레오타이드는 이것이 이러한 서열과 관련하여 코돈-최적화된 경우 LASV 균주의 핵산으로부터 유래한다. 따라서, 이러한 용어는 폴리뉴클레오타이드의 생산 방식을 제한하지 않는다.
대안적으로, 단편은 적어도 10개의 아미노산 잔기를 지닌 짧은 폴리펩타이드일 수 있으며, 이는 면역 에피토프 데이타베이스(Immune Epitope database) 및 분석원(www.iedb.org)에 나열된 천연 단백질의 에피토프(들)을 지닌다. 이와 관련하여 단편은 또한 폴리에피토프를 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 따라서, 핵산 작제물은 LASV의 적어도 하나의 폴리펩타이드, 또는 이의 항원성 단편을 암호화하는 제2의 이종 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하며, 상기 적어도 하나의 폴리펩타이드 또는 이의 항원성 단편은 GPC 단백질, NP 단백질, mNP 단백질 및 Z 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 제2의 이종 뉴클레오타이드는 제1의 클로닝된 이종 폴리뉴클레오타이드의 위치로부터 구별되는 위치, 우선적으로, MeV의 N 유전자의 상부에서 다른 ATU 내에 작동적으로 클로닝되고, 다른 ATU는 특히 MeV의 N 유전자의 상부에 삽입된 ATU1이다. 제2의 이종 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 항원성 단편은 특히 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드(들)과는 상이한 적어도 하나의 폴리펩타이드 또는 이의 항원성 단편을 암호화한다.
구현예에 따라서, 다른 ATU(참고 ATU1 하에 공지됨)는 유리하게는 MeV의 N 유전자 상부의 MeV의 항게놈의 완전한 길이의 (+) RNA 가닥을 암호화하는 cDNA 분자의 N-말단 서열 내에 위치하지만, 다른 ATU(ATU2)는 우선적으로 바이러스의 P 유전자와 M 유전자 사이에 위치한다. MeV의 바이러스 RNA의 전사는 5' 말단으로부터 3' 말단까지의 구배에 따르므로, 본 발명자는 홍역 바이러스의 완전한 길이의 항게놈성 (+) RNA를 암호화하는 cDNA 내 상이한 위치에서 2개의 폴리뉴클레오타이드의 클로닝은 Z 단백질이 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 경우 항원성 입자 및/또는 LASV 바이러스 유사 입자(VLP)의 보다 높은 수율의 생산을 야기할 수 있지만, 이러한 생산은 폴리뉴클레오타이드가 모두 단일 및 동일한 위치 내에 클로닝된 경우 거의 중요하지 않을 수 있다. 또한, 상이한 위치에서 이종 폴리뉴클레오타이드의 클로닝은 암호화된 폴리펩타이드의 발현의 약화를 감소시킬 수 있다. 실제로, 몇개의 유전자가 단일 ATU 내에 클로닝된 경우, 이는 암호화된 폴리펩타이드의 발현의 감소를 초래할 수 있다. 이러한 구현예에 따른 특수한 핵산 작제물은 도 1b 및 실시예에 나타낸다.
다른 ATU 내에서, 제2의 폴리뉴클레오타이드는 LASV의 이미 나열된 폴리펩타이드, 또는 이의 항원성 단편 중 어느 하나를 암호화할 수 있다. 따라서, 다른 ATU 내에 국재화된 제2의 폴리뉴클레오타이드는 제1의 ATU 내에 삽입된 제1의 폴리뉴클레오타이드보다 동일한 폴리펩타이드(들)를 암호화할 수 있거나, 제2의 폴리뉴클레오타이드는 제1의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드(들)를 지닌 적어도 하나의 일반적인 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 제1의 폴리뉴클레오타이드 및 제2의 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 상이한 폴리펩타이드, 또는 이의 항원성 단편을 암호화한다.
MeV의 완전한 길이의 항게놈성 (+) RNA 가닥을 암호화하는 cDNA 분자는 MeV의 특징일 수 있거나 이의 약독화된 균주로부터 수득될 수 있다. MeV의 "약독화된 균주"는 동일한 숙주 내에서 모 균주보다 비병원성이거나 더 적은 독성이 있지만, 면역우세성 T 및 B 세포 에피토프를 보존하기 위해 숙주 내에 투여된 경우 면역원성 및 가능하게는 보조능(adjuvanticity) 및, 가능하게는 T 세포 공자극성 단백질 또는 사이토킨 IL-12의 유도와 같은 보조능을 유지하는 균주로서 정의된다.
따라서, 홍역 바이러스의 약독화된 균주는 선택된 세포 상에서 일련 계대배양되고, 가능하게는 다른 세포에 적응되어 사람 백신 균주의 제조에 적합한 씨드 균주(seed strain)를 생산하면서, 숙주 염색체 내에서 병원성이나 통합성에 대한 복귀(reversion)를 허용할 수 없는 안정한 게놈을 지닌 균주를 지칭한다. 백신용으로 승인된 균주인, 특수한 "약독화된 균주"는, 이것이 FDA(미국 식품 의약국)에 의해 정의된 기준을 충족하는 경우; 즉, 이것이 실험 및 임상 데이타(laboratory and clinical data)(www.fda.gov/cber/vaccine/vacappr.htm)의 엄격한 검토 후, 안전성, 효능, 품질 및 재생능 기준을 충족하는 경우 본 발명에 적합한 약독화된 균주이다.
특히, MeV의 완전한 길이의 항게놈성 (+) RNA 가닥을 암호화하는 cDNA 분자는 슈바르츠 균주(Schwarz strain), 자그렙 균주(Zagreb strain), AIK-C 균주, 모라텐 균주(Moraten strain), 필립스 균주(Philips strain), 벡켄햄(Beckenham) 4A 균주, 벡켄햄 16 균주, 에드몬스톤 씨드 A 균주(Edmonston seed A strain), 에드몬스톤 씨드 B 균주(Edmonston seed B strain), CAM-70 균주, TD 97 균주, 레닌그라드-16 균주(Leningrad-16 strain), 상하이 191 균주(Shanghai 191 strain) 및 벨그레이드 균주(Belgrade strain)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 약독화된 바이러스 균주로부터 수득된다. 모든 이러한 균주는 당해 분야에 기술되어 있다. 본 발명은 상업용 백신으로사 사용하도록 허용된 특수한 균주에서 사용한다. 특히, MeV의 완전한 길이의 항게놈성 (+) RNA 가닥을 암호화하는 cDNA는 슈바르츠 균주로부터 수득된다.
본 발명의 특수한 구현예에 따라서, cDNA 분자는 이종 발현 제어 서열의 제어 하에 위치한다.
cDNA의 발현을 위한 이러한 제어의 삽입은 cDNA의 발현이 이의 천연 제어 서열을 사용한 cDNA의 완전한 전사를 가능하게 하지 않는 세포형에서 고려되는 경우 선호된다.
본 발명의 특수한 구현예에 따라서, 이종 발현 제어 서열은 T7 프로모터 및 T7 종결인자 서열이다. 이러한 서열은 각각 MeV의 완전한 길이의 항게놈성 (+) RNA 가닥에 대한 암호화 서열 및 이러한 암호화 서열 주변의 인접한 서열로부터 5' 및 3'에 위치한다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 본원의 상기에 정의된, cDNA 분자는 변형되는데, 즉, 추가의 뉴클레오타이드 서열 또는 모티프(motif)를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 사용된 cDNA 분자는 이의 5'-말단에서, MeV 승인된 백신 균주의 완전한 길이의 항게놈성 (+) RNA 가닥을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 제1의 뉴클레오타이드에 인접하여, GGG 모티프에 이은 햄머헤드(hammerhead) 리보자인 서열을 추가로 포함하며, 이의 3' 말단에서, 완전한 길이의 항-게놈성 (+) RNA 가닥을 암호화하는 상기 뉴클레오타이드 서열의 마지막 뉴클레오타이드에 인접하여, 리보자임의 서열을 포함한다. 간염 델타 바이러스 리보자임(δ)은 이러한 바람직한 구현예를 수행하는데 적절하다.
상기 암호화 서열의 제1의 뉴클레오타이드에 인접하여, 5' 말단에 위치한 GGG 모티프는 상기 cDNA 암호화 서열의 전사 효율을 증진시킨다. 홍역 바이러스 입자의 적절한 조립을 위한 요건은 항게놈성 (+) RNA를 암호화하는 cDNA가 6의 규칙에 부합된다는 사실이므로, GGG 모티프를 가하는 경우, 리보자임은 또한 cDNA의 암호화 서열의 5' 말단, GGG 모티프로부터 3'에 첨가되어 MeV의 완전한 길이의 항게놈성 (+) RNA 가닥의 제1의 암호화 뉴클레오타이드에서 전사체의 절단을 가능하도록 한다.
본 발명의 핵산 작제물을 제조하기 위하여, 선행 기술에 개시된 홍역 바이러스의 완전한 길이의 항게놈성 (+) RNA를 암호화하는 cDNA 분자의 제조는 공지된 방법으로 달성된다. 수득된 cDNA는 특히 플라스미드와 같은 벡터 내로 삽입된 경우 재조합 홍역 바이러스 입자의 구조(rescue)에 관여된 게놈 벡터에 대한 기준을 제공한다.
본 발명의 핵산 작제물의 제조에 적합한 특수한 cDNA 분자는 홍역 바이러스의 슈바르츠 균주를 사용하여 수득된 것이다. 슈바르츠 MV 백신 균주의 항-게놈에 상응하는 감염성의 MeV cDNA를 함유하고 본 발명의 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터의 제조에 사용된 플라스미드 pTM-MVSchw는 다른 곳에 기술되어 있다(Combredet, C., et al., A molecularly cloned Schwarz strain of measles 바이러스 vaccine induces strong immune responses in macaques and transgenic mice. J Virol, 2003. 77(21): p. 11546-54). 따라서, 본 발명에서 사용된 cDNA는 제WO2004/000876호에 개시된 바와 같이 수득될 수 있거나 2002년 6월 12일자로 I-2889 하에 CNCM에 파스퇴르 연구소(Institut Pasteur)에 의해 기탁된 플라스미드 pTM-MVSchw로부터 수득될 수 있으며, 이의 서열은 본원에 참고로 포함된 제WO2004/000876호에 개시되어 있다. 플라스미드 pTM-MVSchw는 블루스크립트 플라스미드(Bluescript plasmid)로부터 수득되었으며 T7 RNA 폴리머라제의 프로모터의 제어 하에 위치한 슈바르츠 균주의 완전한 길이의 홍역 바이러스 (+) RNA 가닥에 대해 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이는 18967개의 뉴클레오타이드 및 서열 번호: 15로 나타낸 서열이다. 다른 MeV 균주로부터의 cDNA 분자(또한 편의상 홍역 바이러스의 cDNA 또는 MeV cDNA로 지정됨)는 본원에 기술된 것과 같은 약독화된 MeV의 바이러스 입자로부터 정제된 핵산으로부터 출발하여 유사하게 수득될 수 있다. 추가의 전사 단위는 문헌: Combredet et al., 2003에 설명된 바와 같이, 벡터 내에 이미 삽입된 다중-클로닝 부위 카세트일 수 있다. ATU는 삽입된 LASV 유전자의 전사에 필수적인 시스-작용 서열을 포함할 수 있다. 이종 폴리뉴클레오타이드(들)은 상기 본원에 정의된 바와 같은 추가의 전사 단위(ATU) 내에서 클로닝되거나 삽입된다.
이종 폴리뉴클레오타이드는 또한 다른 ATU 내에 클로닝되거나 삽입될 수 있다. 예로서, 제3의 ATU는 MeV의 H 유전자와 L 유전자 사이에 삽입될 수 있고, 제1 또는 제2의 이종 폴리뉴클레오타이드는 이러한 제3의 ATU 내에서 클로닝되거나 삽입될 수 있다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 핵산 작제물은 제1의 ATU 내에 삽입된 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드, 제1의 ATU로부터 별개의 위치에서 제2의 ATU 내로 삽입된 제2의 이종 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 제1 및 제2의 ATU로부터 별개의 위치에서 제3의 ATU 내에 삽입된 제3의 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 핵산 작제물은 특수한 돌연변이된 NP 단백질, 또는 이의 항원성 단편을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오타이드(들)을 포함한다. 천연의 NP 단백질은 돌연변이되어 NP 단백질의 엔소뉴클레아제 활성을 녹 다운할 수 있다. 이의 엑소뉴클레아제 활성에 대해 녹다운된 NP 단백질은 PMID: 21085117에 기술되고 도 29에 나타낸 바와 같은 IRF3 의존성 프로모터의 제어 하에 위치한 리포터 루시퍼라제 유전자를 사용한 루시퍼라제 검정에 의해 측정할 수 있다. NP는 제I형 IFN 신호전달(signaling)의 바이러스-유도된 억제에 관여된다(Martinez-Sobrido, 2006). 이러한 활성은 천연의 NP 단백질의 C-말단 도메인(domain)에 연결된다. 기능성 분석은 LASV NP의 엑소뉴클레아제 활성을 입증하였으며, 이는 이의 제I형 IFN 상호작용 기능을 위한 중요한 단계인 것으로 입증되었다(Qi, 2010). 따라서, 본 발명자는 NP 단백질의 엑소뉴클레아제 도메인 내에 2개의 돌연변이를 도입하였다. NP 단백질의 엑소뉴클레아제 도메인은 NP 단백질의 C-말단 도메인 내에, 특히 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 341 내지 569번 사이에 국재화된다. 따라서, 돌연변이된 NP 단백질은 특히 상기 본원에 정의된 바와 같은 엑소뉴클레아제 도메인 내에서 돌연변이(임의의 아미노산 잔기의 결실(들) 및/또는 첨가(들) 및/또는 치환(들)에 의해)되고, 상기 본원에 기술된 루시퍼라제 검정에 따라 녹 다운된 이의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 천연의 NP 단백질로부터 생성된다. 특히, 서열 번호: 3의 적어도 하나의 아미노산 잔기 D389, E391, D466, D533 및 H528의 치환(들)은 엑소뉴클레아제 활성없이 돌연변이된 NP 단백질을 생성할 수 있다. 특히, 서열번호:3의 389번 위치에서 아미노산 잔기는, 예를 들면 아스파르트산을 알라딘으로 치환시킴으로써 돌연변이될 수 있다. 대안적으로, 서열 번호: 3의 392번 위치에서 아미노산 잔기는 예를 들면, 글리신을 알라닌으로 치환함으로써 돌연변이될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 서열 번호: 3의 389번 및 392번 위치에서 아미노산 잔기 둘 다는 치환에 의해 돌연변이된다. 보다 바람직한 구현예에서, mNP 단백질은 서열 번호: 5의 서열을 갖는다.
이러한 구현예에 따라서, 폴리뉴클레오타이드(들)에 의해 암호화된 mNP 폴리펩타이드는 제I형 IFN의 유도를 허용한다. 다시 말해서, 천연의 NP의 면역 억제 기능은 mNP 내에서 셧 다운(shut down)된다. 따라서, 키메라 재조합 MeV-LASV 감염성 입자 면역원성의 효능을 증가시키는 폴리뉴클레오타이드(들)을 포함하는 핵산 작제물이 제공된다.
바람직한 구현예에 따라서, 본 발명은 또한 폴리뉴클레오타이드의 변형 및 특히 최적화로 숙주 세포내에서 LASV 폴리펩타이드, 단백질, 항원, 또는 이의 단편의 효율적인 발현을 허용하는 것에 관한 것이다.
따라서, 폴리뉴클레오타이드 서열의 최적화는 핵산 분자의 시스-활성 도메인: 내부 TATA-박스, 카이-부위(chi-site) 및 리보소옴 도입 부위; AT-풍부한 또는 GC-풍부한 서열 스트레치(stretch) ARE, INS, CRS 서열 성분; 반복 서열 및 RNA 제2 구조; 크립틱 스플라이스(cryptic splice) 공여체 및 수용체 부위, 측쇄 점(branch point)을 피하면서 작동될 수 있다.
최적화된 폴리뉴클레오타이드는 또한 특수한 세포형 내에서 발현을 위해 최적화된 코돈일 수 있으며, 특히 마카카(Maccaca) 코돈 사용을 위해 또는 사람 코돈 사용을 위해 변형될 수 있다. 이러한 최적화는 발현된 단백질(들)의 아미노산 조성에 영향을 미치지 않고 세포 내에서 키메라 감염성 입자 생산의 효율을 증가시키는 것을 허용한다.
특히, LASV 폴리펩타이드(들)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 최적화는 원래의 것과 관련하여 상기 코돈으로부터 해독된 아미노산 잔기의 동일성(identity)에 영향을 미치지 않고 코돈내 워블(wobble) 위치의 변형에 의해 수행될 수 있다.
최적화는 또한 홍역 바이러스로부터 편집-유사 서열을 피하도록 수행된다. 홍역 바이러스의 전사체의 편집은 홍역 바이러스의 P 유전자에 의해 암호화된 전사체 내에서 일어나는 공정이다. 이러한 편집은 P 전사체 내 특이적인 부위에서 여분의 G 잔기의 삽입에 의해, P 단백질과 비교하여 트렁케이트된 신규 단백질을생성한다. 단일의 G 잔기 만의 첨가는 V 단백질의 발현을 생성하며, 이는 독특한 카복실 말단을 함유한다(Cattaneo R et al., Cell. 1989 Mar 10;56(5):759-64).
본 발명의 특수한 구현예에 따른 폴리뉴클레오타이드에서, 홍역 바이러스로부터 다음의 편집-유사 서열이 돌연변이될 수 있다: AAAGGG, AAAAGG, GGGAAA, GGGGAA, 뿐만 아니라 이들의 상보성 서열: TTTCCC, TTTTCC, CCCTTT, CCCCTT. 예를 들면, AAAGGG는 AAAGGC 내에서 돌연변이될 수 있고, AAAAGG는 AGAAGG 또는 TAAAGG 또는 GAAAGG 내에서 돌연변이될 수 있으며, GGGAAA는 GCGAAA 내에서 돌연변이될 수 있다.
따라서, 이종 폴리뉴클레오타이드(들)은 다음 서열들 중 어느 하나, 또는 다수의 다음 서열, 또는 다음 서열들 중 적어도 2개, 또는 다음 서열들 중 적어도 3개, 또는 4개의 다음 서열을 포함할 수 있다:
- GPC 단백질을 암호화하는 서열 번호: 2; 및/또는
- NP 단백질을 암호화하는 서열 번호: 4; 및/또는
- mNP 단백질을 암호화하는 서열 번호: 6; 및/또는
- Z 단백질을 암호화하는 서열 번호: 8.
이종 폴리뉴클레오타이드(들) 내에서, 상기 본원에 정의된 각각의 서열은 1회, 또는 다수회 존재할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 각각의 서열은 단일의 이종 폴리뉴클레오타이드 내에 1회 존재하나 이와 함께 이종 폴리뉴클레오타이드 내에 1회 존재한다.
본 발명의 특수한 구현예 중 어느 하나에 따라서, 키메라 재조합 MeV-LASV 감염성 입자 생산의 효능을 증가시키는 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하는 핵산 작제물이 제공된다.
대안적으로, 또는 상보적으로, 이종 폴리뉴클레오타이드(들)은 다음의 폴리펩타이드 중 어느 하나, 또는 이의 항원성 단편, 또는 다음의 폴리펩타이드들 중 적어도 2개, 또는 다음의 폴리펩타이드들 중 적어도 3개, 또는 4개의 다음의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다:
- 서열 번호: 1의 GPC 단백질 또는 이의 항원성 단편; 및/또는
- 서열 번호: 3의 NP 단백질 또는 이의 항원성 단편; 및/또는
- 서열 번호: 5의 mNP 단백질 또는 이의 항원성 단편; 및/또는
- 서열 번호: 7의 Z 단백질 또는 이의 항원성 단편.
폴리뉴클레오타이드(들)은 상기 본원에 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 1회 또는 수회 암호화할 수 있음을 주목하여야 한다. 바람직한 구현예에서, 각각의 폴리펩타이드는 단일의 이종 폴리뉴클레오타이드 내에서 1회 암호화되며, 보다 우선적으로 각각의 폴리펩타이드는 다수의 폴리펩타이드 내에서 1회 암호화된다. 본 발명의 특수한 구현예에 따라서, 각각의 폴리뉴클레오타이드가 적어도 하나의 LASV 단백질을 암호화하는 수개의 폴리뉴클레오타이드는 조합되거나 융합되어 LASV의 수개의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 형성한다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 이들이 LASV의 다양한 균주의 단백질, 또는 LASV 균주의 상이한 단백질에 대해 암호화하고 있다는 사실에 의해 다른 것과 구별될 수 있다.
특수한 구현예에서, 본 발명의 핵산 작제물은 5'로부터 3' 말단으로 하기 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; 여기서 하기 폴리뉴클레오타이드는 핵산 작제물 내에서 및 MeV 리더 및 트레일러 서열(trailer sequence)(들)과 같은 바이러스 복제 및 전사 조절 인자의 제어 하에 작동적으로 연결된다:
(a) MeV의 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
(b) MeV의 P 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
(c) LASV의 GPC 단백질, NP 단백질, mNP 단백질 및 Z 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩타이드, 또는 이의 항원 단편을 암호화하거나, 특히 GPC 단백질 또는 이의 항원성 단편인 단일 폴리펩타이드를 암호화하거나, 또는 GPC 단백질 또는 이의 항원성 단편인 적어도 2개의 폴리펩타이드를 암호화하며, 특히 GPC 단백질 및 mNP 단백질을 암호화하는 NP 단백질 또는 mNP 단백질을 암호화하는 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드(여기서 제1의 폴리뉴클레오타이드는 특히 ATU, 특히 ATU2 내에서 작동적으로 클로닝되어 있다);
(d) Mev의 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
(e) Mev의 F 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
(f) MeV의 H 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
(g) MeV의 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명에 따라 수득된 이러한 구현예의 수개의 예는 도 1b에 개략적으로 나타나 있다: MeV-GPCLASV; MeV-NP+GPCLASV; MeV-NPExoN+GPCLASV로 명명된 작제물은 이러한 특수한 구현예에 속하지만, 도 1b에 나타내지 않은 다른 작제물은 예를 들면, MeV-GPCLASV+NP; MeV-GPCLASV+NPExoN; MeV-Z+GPCLASV; MeV-GPCLASV+Z; MeV-Z+NP; MeV-Z+NPExoN; MeV-NP+Z; MeV-NPExoN+Z; MeV-Z+GPCLASV+NP; MeV-Z+GPCLASV+NPExoN; MeV-Z-NP-GPCLASV; MeV-Z-NPExoN-GPCLASV; MeV-GPCLASV+NP+Z; MeV-GPCLASV+NPExoN+Z; MeV-GPCLASV+Z+NP; MeV-GPCLASV+Z+NPExoN; MeV-NP+GPCLASV+Z; MeV-NP-Z+GPCLASV; MeV-NPExoN+GPCLASV+Z; MeV-NPExoN-Z+GPCLASV를 또한 포함하고;
여기서
MeV는 홍역 바이러스(MeV)의 완전한 길이의 항게놈성 (+) RNA 가닥을 암호화하는 cDNA에 상응하며;
GPCLASV는 GPC 단백질, 또는 이의 항원성 단편의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 상응하고;
NP는 NP 단백질, 또는 이의 항원성 단편의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 상응하고;
NPExoN은 mNP 단백질, 또는 이의 항원성 단편의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 상응하고;
Z는 Z 단백질, 또는 이의 항원성 단편의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 상응한다.
표현 "N 단백질", "P 단백질", "M 단백질", "F 단백질", "H 단백질" 및 "L 단백질"은 각각 홍역 바이러스의 핵단백질(N), 인단백질(P), 매트릭스 단백질(M), 융합 단백질(F), 헤마글루티닌 단백질(H) 및 RNA 폴리머라제 거대 단백질(L)을 지칭하며 폴리펩타이드 또는 이의 항원성 단편에 대한 참고를 포함한다. 이러한 구성성분은 선행 기술에서 확인되며 특히 문헌: Fields, Virology (Knipe & Howley, 2001)에 개시되어 있다.
본 발명의 다른 특별한 구현예에서, 핵산 작제물은 5'로부터 3'까지 하기 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; 여기서 하기 폴리뉴클레오타이드는 핵산 작제물 내에서 및 MeV 리더 및 트레일러 서열(들)과 같은 바이러스 복제 및 전사 조절 인자의 제어 하에 작동적으로 연결된다:
(a) LASV의 GPC 단백질, NP 단백질, mNP 단백질 및 Z 단백질, 또는 이들의 항원성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하고, 특히 Z 단백질, 또는 이의 항원성 단편을 암호화하는 제2의 이종 폴리뉴클레오타이드(여기서 제2의 폴리뉴클레오타이드는 MeV의 N 유전자의 상부에 국재화된 ATU 내에서, 특히 ATU1 내에서 작동적으로 클로닝된다);
(b) MeV의 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
(c) MeV의 P 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
(d) LASV의 GPC 단백질, NP 단백질, mNP 단백질 및 Z 단백질, 또는 이들의 항원성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하거나, 특히 GPC 단백질 또는 이의 항원성 단편인 단일의 폴리펩타이드를 암호화하거나, GPC 단백질 또는 이의 항원성 단편 및 NP 단백질 또는 mNP 단백질, 또는 이의 항원성 단편인 적어도 2개의 폴리펩타이드를 암호화하거나, 특히 GPC 단백질 및 mNP 단백질을 암호화하는 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드(여기서 제1의 폴리뉴클레오타이드는 특히 ATU, 특히 ATU2 내에서 작동적으로 클로닝된다);
(e) MeV의 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
(f) MeV의 F 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
(g) MeV의 H 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
(h) MeV의 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
이러한 구현예의 수개의 실시예는 도 1b에 개략적으로 나타나 있다: Z-MeV-GPCLASV; Z-MeV-NP+GPCLASV; Z-MeV-NPExoN+GPCLASV로 명명된 작제물은 이러한 특수한 구현예 내에 포함된다. LASV의 단백질이 MeV 앞에 명명된 경우, 상기 단백질은 MeV의 N 유전자의 상부에 위치한 추가의 전사 단위 내에 클로닝된다. 수개의 나타내지 않은 작제물이 또한 이러한 구현예에 포함됨에 주목하여야 한다. 예로서, 이종 폴리뉴클레오타이드는 제3의 ATU 내에 클로닝될 수 있다. Z-MeV-GPCLASV(ATU2)+NP(ATU3), 또는 Z-MeV-NP(ATU2)- GPCLASV(ATU3), 또는 Z-MeV-GPCLASV(ATU2)+mNP(ATU3), 또는 Z-MeV-mNP(ATU2)-GPCLASV(ATU3)에 상응하는 핵산 작제물은 또한 본 발명에 포함된다. Z 폴리펩타이드, GPC 폴리펩타이드 및/또는 NP 또는 mNP 폴리펩타이드 중 적어도 하나 또는 임의의 하나를 암호화하는 이종 폴리뉴클레오타이드는 ATU3 내에 삽입될 수 있음을 주목하여야 한다.
본원에 사용된 다양한 용어는 앞서의 특수한 구현예에서 사용된 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 핵산 작제물은 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드 내에, NP 단백질, 우선적으로 서열 번호: 3의 NP 단백질, 또는 이의 항원성 단편을 암호화하는 핵산; 및 GPC 단백질, 우선적으로 서열 번호: 1의 GPC 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 이러한 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드는 MeV의 P 유전자와 M 유전자 사이, 우선적으로 상기 본원에 정의된 바와 같은 ATU2 내에 클로닝된다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 핵산 작제물은 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드 내에, NP 단백질을 암호화하는 서열 번호: 4의 핵산, 및 GPC 단백질을 암호화하는 서열 번호: 2의 핵산을 포함하며, 우선적으로 이러한 2개의 핵산은 링커 서열에 의해 분리된다. 바람직한 구현예에서, 서열 번호: 4의 핵산은 서열 번호: 2의 상부 핵산에 국재화된다. 이는 예를 들면, MeV-NP+GPCLASV로 명명된 작제물과 함께 도 1b에 나타나 있다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 핵산 작제물은 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드 내에 mNP 단백질, 우선적으로 서열 번호: 5의 mNP 단백질, 또는 이의 항원성 단편; 및 GPC 단백질, 우선적으로 서열 번호: 1의 GPC 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 핵산 작제물은 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드 내에서 mNP 단백질을 암호화하는 서열 번호: 6의 핵산, 및 GPC 단백질을 암호화하는 서열 번호: 2의 핵산을 포함하며, 우선적으로 이러한 2개의 핵산은 링커 서열에 의해 분리된다. 바람직한 구현예에서, 서열 번호: 6의 핵산은 도 1b에 나타낸 바와 같이 MeV-NPExoN+GPCLASV로 명명된 작제물과 함께, 서열 번호: 2의 상부(작제물의 5' 말단을 향해) 핵산에 위치한다. 바람직한 구현예에서, 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드는 상기 본원에 정의된 바와 같이, MeV의 P 유전자와 M 유전자 사이, 우선적으로 ATU2 내에서 클로닝된다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 핵산 작제물은 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드 및 제2의 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함하고:
- 제2의 이종 폴리뉴클레오타이드는 Z 단백질, 또는 이의 항원성 단편, 우선적으로 서열 번호: 7의 Z 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하며; 제2의 이종 폴리뉴클레오타이드는 상기 본원에 정의된 바와 같은 ATU1 내에 우선적으로 클로닝되고,
- 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드는 GPC 단백질, 또는 이의 항원성 단편, 우선적으로 서열 번호: 1의 GPC 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하며, 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드는 상기 본원에 정의된 바와 같이 ATU2 내에 우선적으로 클로닝된다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 핵산 작제물은 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드 및 제2의 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함하고:
제2의 이종 폴리뉴클레오타이드는 Z 단백질을 암호화하는 서열 번호: 8의 핵산을 포함하며, 제2의 이종 폴리뉴클레오타이드는 상기 본원에 정의된 바와 같이 ATU1 내에 우선적으로 클로닝되며,
제1의 이종 폴리뉴클레오타이드는 GPC 단백질을 암호화하는 서열 번호: 2의 핵산을 포함하고, 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드는 상기 본원에 정의된 바와 같이 ATU2 내에 우선적으로 클로닝된다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 핵산 작제물은 재조합 cDNA를 포함하며, 이의 서열은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
- 서열 번호: 9(MeV-GPC);
- 서열 번호: 10(MeV-NP-GPC);
- 서열 번호: 11(MeV-mNP-GPC);
- 서열 번호: 12(Z-MeV-GPC);
- 서열 번호: 13(Z-MeV-NP-GPC); 및
- 서열 번호: 14(Z-MeV-mNP-GPC),
여기서 상기 서열은 다음과 같이 기술되어 있다:
서열 번호: 9
서열 번호: 9는 본 발명의 특수한 구현예에 따른 핵산 작제물의 서열이며 여기서 상기 작제물은 pTM1-MVSchwarz 벡터를 포함하고 여기서 LASV 균주 조시아의 GPC 단백질을 암호화하는 서열은 추가의 전사 단위 2 내에 클로닝되었다.
서열 번호: 10
서열 번호: 10은 본 발명의 다른 특수한 구현예에 따른 핵산 잔제물의 서열이며 여기서 상기 작제물은 pTM1-MVSchwarz 벡터를 함유하고 여기서 LASV 균주 조시아의 GPC 단백질을 암호화하는 서열은 추가의 전사 단위 2 내에 클로닝되고, 여기서 LASV 균주 조시아의 NP 단백질을 암호화하는 서열은 추가의 전사 단위 2 내에 클로닝되었다.
서열 번호: 11
서열 번호: 11은 본 발명의 다른 특수한 구현예에 따른 핵산 작제물의 서열이며 여기서 상기 작제물은 pTM1-MVSchwarz 벡터를 포함하고 여기서 LASV 균주 조시아의 GPC 단백질을 암호화하는 서열은 추가의 전사 단위 2 내에 클로닝되고, 여기서 LASV 균주 조시아의 돌연변이된 NP 단백질을 암호화하는 서열은 추가의 전사 단위 2 내에 클로닝되었다.
서열 번호: 12
서열 번호: 12는 본 발명의 다른 특수한 구현예에 따른 핵산 작제물의 서열이며 여기서 상기 작제물은 pTM1-MVSchwarz 벡터를 포함하고 여기서 LASV 균주 조시아의 GPC 단백질을 암호화하는 서열은 추가의 전사 단위 2 내에 클로닝되고, 여기서 LASV 균주 조시아의 Z 단백질을 암호화하는 서열은 추가의 전사 단위 1 내에 클로닝되었다.
서열 번호: 13
서열 번호: 13은 본 발명의 다른 특수한 구현예에 따른 핵산 작제물의 서열이며 여기서 상기 작제물은 pTM1-MVSchwarz 벡터를 포함하고 여기서 LASV 균주 조시아의 GPC 단백질을 암호화하는 서열은 추가의 전사 단위 2 내에 클로닝되고, 여기서 LASV 균주 조시아의 NP 단백질을 암호화하는 서열은 추가의 전사 단위 2 내에 클로닝되며, 여기서 LASV 단백질 조시아의 Z 단백질을 암호화하는 서열은 추가의 전사 단위 1 내에 클로닝되었다.
서열 번호: 14
서열 번호: 14는 본 발명의 다른 특수한 구현예에 따른 핵산 작제물의 서열이며 여기서 상기 작제물은 pTM1-MVSchwarz 벡터를 포함하고 여기서 LASV 균주 조시아의 GPC 단백질을 암호화하는 서열은 추가의 전사 단위 2 내에 클로닝되고, 여기서 LASV 균주 조시아의 돌연변이된 NP 단백질을 암호화하는 서열은 추가의 전사 단위 2 내에 클로닝되며, 여기서 LASV 단백질 조시아의 Z 단백질을 암호화하는 서열은 추가의 전사 단위 1 내에 클로닝되었다.
본 발명은 또한 전달 벡터에 관한 것이며, 이는 헬퍼 세포 또는 생산 세포로부터 구조되는 경우 재조합 MeV-LASV 입자의 제조에 사용될 수 있다. 수개의 전달 벡터는 도 31 내지 36에 나타나 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 전달 벡터는 헬퍼 세포 또는 생산 세포의 형질감염에 적합하고, 본 발명에 따른 핵산 작제물을 포함하는 전달 벡터 플라스미드이다. 전달 벡터 플라스미드는 Bluescript 플라스미드로부터 수득될 수 있으며 상기 본원에 기술된 pTM-MVSchw 플라스미드 내에 본 발명의 이종 폴리뉴클레오타이드(들)를 클로닝시킴으로써 수득될 수 있다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 전달 플라스미드 벡터는 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13 또는 서열 번호: 14의 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 재조합 바이러스 MeV-LASV 입자의 구조에 적합한 세포를 형질전환시키기 위한, 특히 본 발명의 핵산 작제물을 지닌 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 사용하여 이러한 세포를 각각 형질감염시키거나 형질도입시키기 위한 전달 플라스미드 벡터의 용도 또는 본 발명에 따른 핵산 작제물의 용도에 관한 것이며, 상기 세포는 재조합의 감염성의, 복제성 재조합 MeV-LASV 입자 내에서 본 발명의 핵산 작제물에 상응하는 바이러스의 재조합 게놈의 적절한 복제, 전사 및 캡시드화(encapsidation)에 필요한 홍역 바이러스 단백질을 발현하는 이들의 능력에 대해 선택된다.
본 발명의 핵산 작제물 및 전달 플라스미드 벡터는 재조합 감염성의 복제성 재조합 홍역 - 라싸 바이러스(MeV-LASV)의 제조에 적합하고 이를 위해 의도되며 따라서 상기 핵산 작제물 및 전달 플라스미드 벡터는 결과적으로 상기 재조합 MeV-LASV 바이러스의 생산 및 LASV 폴리펩타이드(들)의 발현을 위한, 가능하게는 Z 단백질이 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 경우 LASV VLP로서 홍역 바이러스, 특히 슈바르츠 균주의 cDNA 분자를 포함하는 전달 게놈 벡터 내에 삽입하기 위해 의도된다. pTM-MVSchw 플라스미드는 LASV 폴리펩타이드(들), 단백질(들), 항원(들), 또는 이의 항원성 단편(들)의 발현에 필수적인 본원에 기술된 바와 같은 이종 폴리뉴클레오타이드(들)의 삽입에 의해, 전달 벡터를 제조하는데 적합하다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "바이러스-유사 입자"(VLP)는 적어도 하나의 기여에서 바이러스와 유사하지만 자체로서 감염성인 것으로 입증되지 않은 구조를 지칭한다. 본 발명에 따라서 바이러스 유사 입자는 바이러스 유사 입자의 단백질을 암호화하는 유전 정보를 수반하지 않는데, 일반적으로, 바이러스-유사 입자는 바이러스 게놈을 결여하므로, 비감염성이고 비-복제성이다. 본 발명에 따라서, 바이러스 유사 입자는 다량으로 생산될 수 있으며 MeV-LASV 재조합 입자와 함께 발현된다.
본 발명은 또한 본 발명의 전달 벡터에 의해서 및 헬퍼 기능을 제공하는 추가의 폴리뉴클레오타이드 및 단백질에 의해 이렇게 형질전환된 세포 또는 세포주에 관한 것이다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드는 상기 세포 내에 존재하며, 이는 특히 홍역 바이러스의 N, P 및 L 단백질을 포함하는 단백질(즉, 천연의 MeV 단백질 또는 리보핵단백질(RNP) 복합체를 형성할 수 있는 이의 기능성 변이체)을 포함하는 단백질, 바람직하게는 안정하게 발현된 단백질로서 적어도 재조합 바이러스 MeV-SASV 입자의 전사 및 복제시 기능성인 N 및 P 단백질을 포함하는 단백질을 암호화한다. N 및 P 단백질은 이들의 암호화 서열을 포함하는 플라스미드로부터 세포내에서 발현될 수 있거나 세포의 게놈 내에 삽입된 DNA 분자로부터 발현될 수 있다. L 단백질은 상이한 플라스미드로부터 발현될 수 있다. 이는 일시적으로 발현될 수 있다. 헬퍼 세포는 또한 가능하게는 안정하게 발현된 RNA 폴리머라제로서, 본 발명의 핵산 작제물로부터 유래된 재조합 RNA의 합성을 가능하게 하기에 적합한 RNA 폴리머라제를 발현할 수 있다. RNA 폴리머라제는 T7 파아지 폴리머라제 또는 이의 핵 형(nlsT7)일 수 있다.
일 구현예에서, 홍역 바이러스의 cDNA 클론은 N 단백질 및/또는 P 단백질 및/또는 L 단백질과 동일한 홍역 바이러스로부터 유래된다. 다른 구현예에서, 홍역 바이러스의 cDNA 클론은 N 단백질 및/또는 P 단백질 및/또는 L 단백질보다 바이러스의 상이한 균주로부터 유래된다.
본 발명에 따른 핵산 작제물로 형질전환되거나 형질감염된 세포는 Z 단백질이 적어도 하나의 이종 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 경우 재조합 홍역 바이러스 및/또는 LASV VLP를 생산할 수 있다. 따라서, 재조합 홍역 바이러스는 이의 게놈 내에 본 발명의 핵산 작제물을 포함하며 LASV의 적어도 하나의 폴리펩타이드, 단백질 또는 이의 항원성 단편을 발현할 수 있다. 따라서, 본 발명의 홍역 바이러스는 GPC 단백질, 또는 GPC 폴리펩타이드, 또는 이의 항원성 단편; 및/또는 NP 단백질, 또는 NP 폴리펩타이드, 또는 이의 항원성 단편; 및/또는 mNP 단백질, 또는 mNP 폴리펩타이드, 또는 이의 항원성 단편; 및/또는 Z 단백질, 또는 Z 폴리펩타이드, 또는 이의 항원성 단편을 발현할 수 있다. LASV VLP는 적어도 Z 단백질, 또는 이의 항원성 단편을 포함하며, LASV의 하나의 다른 폴리펩타이드; GPC 단백질, GP1 또는 GP2와 같은 GPC 단백질의 단편, NP 단백질 및/또는 mNP 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, LASV VLP는 Z 단백질, 또는 이의 항원성 단편, 및 GPC 단백질, 또는 이의 항원성 단편, 또는 GP1 및/또는 GP2와 같은 GPC 단백질의 단편을 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, LASV VLP는 Z 단백질, 또는 이의 항원성 단편, GPC 단백질, 또는 이의 항원성 단편, 및 mNP 단백질 또는 NP 단백질, 또는 이의 항원성 단편을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 재조합 홍역 바이러스는 LASV의 GPC 단백질 및 mNP 단백질을 발현한다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 재조합 홍역 바이러스는 LASV의 GPC 단백질 및 Z 단백질을 발현한다.
또한, 본 발명의 일부 구현예에 따라서, 재조합 홍역 바이러스는 또한 홍역 바이러스의 적어도 하나의 폴리펩타이드 또는 단백질, 또는 이의 항원성 단편을 포함한다. 다시 말해서, 재조합 홍역 바이러스는 다음 폴리펩타이드 중 적어도 하나를 발현한다: MeV의 N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, H 단백질 및 L 단백질.
이러한 구현예에 따라서, 재조합 바이러스는 홍역 바이러스 및 라싸 바이러스의 재조합 항원성 입자를 발현함으로써, 세포 반응, 또는 체액성 반응, 또는 LASV의 폴리펩타이드에 대한 및 MeV의 폴리펩타이드에 대한 세포 및 체액성 반응을 유발시킨다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 세포 반응의 유발은 T 세포 반응, 특히 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 반응의 유발을 포함한다.
따라서, 본 발명은:
(a) T7 RNA 폴리머라제 및 홍역 N 및 P 단백질을 안정하게 발현하는, 세포, 특히 헬퍼 세포, 특히 HEK293 세포를 본 발명에 따른 핵산 작제물 또는 본 발명에 따른 전달 플라스미드 벡터로 형질감염시키는 단계;
(b ) 재조합 홍역 바이러스 및/또는 LASV VLP의 생산에 적합한 조건에서 형질감염된 세포를 유지시키는 단계;
(c) 단계 (b)의 형질감염된 세포로 이를 공-배양함으로써 재조합 홍역 바이러스 및/또는 LASV VLP의 증식을 가능하게 하는 세포를 감염시키는 단계;
(d) 적어도 하나의 LASV 단백질, 우선적으로 적어도 GPC 단백질 및 임의로 NP 단백질, mNP 단백질 및/또는 Z 단백질을 발현하고, 우선적으로 GPC 단백질 및 mNP 단백질을 발현하는 재조합 홍역 바이러스, 및/또는 적어도 Z 단백질 및 가능하게는 GPC 단백질, NP 단백질 및/또는 mNP 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 다른 LASV 단백질을 발현하는 LASV VLP를 수거하는 단계를 포함하는, 재조합의 감염성 홍역 바이러스 입자의 제조 방법에 관한 것이다.
특수한 구현예에 따라서, 본 발명은:
a) 본 발명의 핵산 작제물 또는 이러한 핵산 작제물을 함유하는 전달 벡터를 이의 cDNA로부터 및 바이러스 입자 조립을 가능하게 하는 조건 하에서 MeV의 항게놈성 (+) RNA 서열의 전사, 복제 및 캡슐화에 필요한 단백질을 또한 발현하는 헬퍼 세포 주 내에서 이러한 핵산 작제물을 함유하는 전달 벡터를 전달, 특히 형질감염시키는 단계 및
b) LASV의 적어도 하나의 폴리펩타이드 또는 단백질, 또는 이의 항원성 단편을 발현하는 재조합의 감염성 MeV-LASV 바이러스를 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 감염성 홍역 바이러스의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 특수한 구현예에 따라서, 이러한 방법은:
a) 헬퍼 세포를 전달 플라스미드 벡터를 지닌 본 발명에 따른 핵산 작제물로 형질감염시키는 단계(여기서 상기 헬퍼 세포는 RNA 폴리머라제를 발현하고, MeV 바이러스의 N, P 및 L 단백질을 발현하는 헬퍼 기능을 발현할 수 있다);
b) 단계 1)의 상기 형질감염된 헬퍼 세포를 cDNA가 기원하는 MeV 약독화된 균주의 계대배양에 적합한 계대배양된 세포와 동시-배양하는 단계;
c) LASV의 적어도 하나의 폴리펩타이드를 발현하는 재조합의 감염성 MeV-LASV 바이러스를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 특수한 구현예에 따라서, 재조합의 감염성 MeV-LASV의 생산 방법은:
a) RNA 폴리머라제, 홍역 바이러스의 핵 단백질(N) 및 홍역 바이러스의 폴리머라제 보조인자 인단백질(P)을 안정하게 생산하는 세포 또는 세포의 배양물을 본 발명의 핵산 작제물 및 홍역 바이러스의 RNA 폴리머라제 거대 단백질(L)을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터로 재조합시키는 단계, 및
b) 상기 재조합 세포 또는 재조합 세포의 배양물로부터 감염성의, MeV-LASV 바이러스를 회수하는 단계를 포함한다.
방법의 특수한 구현예에 따라서, 재조합 MeV가 생산되며, 이는 적어도 GPC 단백질 및/또는 적어도 Z 단백질을 포함하는 LASV VLP를 포함하는 LASV 단백질(들)을 발현하며, 여기서 재조합 MeV 및/또는 VLP는 적어도 하나의 다른 LASV 단백질, 또는 항원, 또는 이의 항원성 단편, 예컨대, GPC 또는 이의 단편, 특히 GP1 및/또는 GP2, 및 임의로 LASV의 mNP를 발현할 수 있다. 다른 구현예에서, LASV VLP는 Z 단백질 또는 이의 단편, 및 임의로 GPC 단백질, 및 가능하게는 GP1 및/또는 GP2를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, LASV VLP는 Z 단백질, 또는 이의 항원성 단편, 및 GPC 단백질, 또는 이의 항원성 단편을 포함한다. 예로서, LASV 단백질, 특히 LASV VLP를 발현하는 재조합 MeV를 구조하는 방법은:
1) T7 RNA 폴리머라제, 및 홍역 N 및 P 단백질을 안정하게 발현하는 헬퍼 세포, 특히 HEK293 헬퍼 세포를 (i) 적어도 하나의 LASV 단백질을 암호화하는, 예를 들면, GPC 단백질, NP 단백질, mNP 단백질 및/또는 Z 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드로 재조합된 홍역 바이러스의 완전한 길이의 항게놈성 (+) RNA를 암호화하는 cDNA를 포함하는 전달 벡터, 특히 플라스미드, 및 (ii) MeV L 폴리머라제 cDNA를 암호화하는 벡터, 특히 플라스미드와 공형질감염시키는 단계;
2) 상기 공감염된 헬퍼 세포를 MV-LASV 재조합 바이러스의 생산을 가능하게 하는 조건 하에서 배양하는 단계;
3) 단계 2)의 상기 헬퍼 세포와 베로 세포(Vero cell)와 같은 상기 증식을 가능하도록 하는 세포를 공-배양함으로써 이렇게 생산된 재조합 바이러스를 증식시키는 단계;
4) 복제하는 MeV-LASV 재조합 바이러스 및 LASV 단백질(들), 특히 LASV 바이러스 유사 입자를 회수하는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "재조합하는"은 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로, 예를 들면, 벡터의 형태로 도입시킴을 의미하며, 상기 폴리뉴클레오타이드는 세포 내로 통합(전적으로 또는 부분적으로)되거나 통합되지 않는다. 특수한 구현예에 따라서, 재조합은 제1의 폴리뉴클레오타이드로 수득될 수 있으며, 이는 본 발명의 핵산 작제물이다. 재조합은 또한 또는 대안적으로 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 단계를 포함하며, 이러한 폴리펩타이드는 이의 발현의 정의, 특성 및 안전성이 본원에 기술된, 홍역 바이러스의 RNA 폴리머라제 거대 단백질(L)을 암호화하는 벡터이다.
본 발명에 따라서, RNA 폴리머라제, 홍역 바이러스의 핵단백질(N) 및 홍역 바이러스의 폴리머라제 보조인자 인단백질(P)을 안정하게 생산하는 세포 또는 세포주 또는 세포의 배양물은 본 명세서에 정의된 바와 같은 세포 또는 세포주 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 세포의 배양물이며, 즉, 또한 이들이 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 도입에 의해 형질전환된 정도의 재조합 세포이다. 본 발명의 특수한 구현예에서, RNA 폴리머라제, N 및 P 단백질을 안정하게 생산하는 세포 또는 세포주 또는 세포의 배양물은 홍역 바이러스의 L 단백질을 생산하지 않거나 예컨대, 이의 일시적인 발현 또는 생산을 가능하게 하는 홍역 바이러스의 L 단백질을 안정하게 생산하지 않는다. 본 발명의 재조합 MeV-LASV 바이러스의 생산은 본원에 기술된 바와 같이 형질전환된 세포의 전달을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "전달"은 재조합 세포를 상이한 유형의 세포, 및 특히 상이한 유형의 세포의 단층 위에 플레이팅(plating)함을 지칭한다. 이러한 후자의 세포는 감염성의 재조합 MeV-LASV 바이러스의 복제 및 생산, 즉, 각각 세포내 감염성 바이러스의 형성 및 가능하게는 LASV 면역원성 입자 및/또는 LASV VLP의 방출과 함께 세포의 외부에 이러한 감염성 바이러스의 방출 둘 다를 지속하기에 적격이다. 이는 앞서의 문장에 정의된 바와 같이 본 발명의 재조합 세포와 적격 세포(competent cell)의 공-배양을 생성한다. 상기 전달은 추가적, 즉, 재조합 세포가 효율적인 바이러스-생산 배양물이 아닌 경우, 즉, 감염성의 재조합 MeV-LASV가 이러한 재조합 세포로부터 효율적으로 회수될 수 없는 경우 선택적인 단계일 수 있다. 이러한 단계는 본 발명의 재조합 세포를 본 발명의 임의의 핵산 작제물, 및 임의로 홍역 바이러스의 RNA 폴리머라제 거대 단백질(L)을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 사용한 추가의 재조합 후 도입된다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 용이하게 재조합될 이들의 능력을 위해 일반적으로 선택된 재조합 세포가 재조합의 감염성 MeV-LASV 바이러스의 지속성 및 생산에 충분히 효율적이지 않으므로 전달 단계가 요구된다. 상기 구현예에서, 상기 정의된 방법의 단계 1)의 세포 또는 세포주 또는 세포의 배양물은 본 발명에 따른 재조합 세포 또는 세포주 또는 재조합 세포의 배양물이다.
본 발명의 재조합 세포의 제조에 적합한 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포, 특히 동물 또는 식물 세포, 및 보다 특히 포유동물 세포, 예를 들면, 사람 세포 또는 비-사람 포유동물 세포 또는 조류 세포 또는 효모 세포이다. 특수한 구현예에서, 이의 게놈의 재조합 전에, 세포는 1차 배양물 또는 세포주로부터 단리된다. 본 발명의 세포는 분열 또는 비-분열 세포일 수 있다.
바람직한 구현예에 따라서, 헬퍼 세포는 사람 배아 신장 세포주 293으로부터 유래되며, 이러한 세포주 293은 제WO2008/078198호에 개시되고 다음의 실시예에서 293T7/N/P로서 지칭된 세포주이다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 임의의 구현예에 따른 핵산 작제물로 형질감염 또는 형질전환되거나, 또는 전달 플라스미드 벡터로 형질감염된, 숙주 세포, 특히 조류 세포 또는 포유동물 세포에 관한 것이다. 적합한 세포는 VERO NK 세포(아프리카 녹색 원숭이 신장 세포), 및 MRC5 세포(의학 연구 심의회(Medical Research Council) 세포 균주 5)이다. 이러한 방법의 다른 양태에 따라서, 계대배양에 적합한 세포는 CEF 세포(닭 배아 섬유아세포)이다. CEF 세포는 EARL Morizeau(프랑스 28190 당저(Danger) 뤼 모링(ru Moulin) 8 소재)로부터 또는 수정된 달걀의 임의의 생산자로부터 수득된 바와 같은 수정된 달걀로부터 제조될 수 있다.
본 발명에 따라 개시된 방법은 면역화 조성물로서 사용하기에 적절한 감염성의 복제성 재조합 MeV-LASV 바이러스의 생산에 유리하게 사용된다. 따라서, 본 발명은 조성물, 특히 항원성 조성물에 관한 것이며, 이의 활성 원리는 본 발명의 핵산 작제물로부터 구조되고 특히 개시된 방법에 의해 수득된 감염성의 복제성 재조합 MeV-LASV 바이러스를 포함한다. 조성물은 이를 필요로 하는 사람, 특히 어린이에게 투여하기 위한 백신 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 LASV 감염에 대한 치료에 사용될 수 있다. 상기 조성물은 LASV에 대한 보호에 사용될 수 있다. 따라서, 조성물은 LASV 감염에 대해 보호적 또는 예방적 치료를 위한 면역원성 또는 항원성 조성물일 수 있다. 특히, 조성물 내 활성 성분 또는 활성 원리는 재조합 MeV-LASV 입자를 포함하며, 상기 재조합 MeV-LASV 입자는 본 발명에 따른 전달 플라스미드 벡터로부터 구조되며 임의로 Z 단백질 및 임의로 LASV의 다른 단백질(들), 또는 이의 항원성 단편(들)과 관련되어 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "관련된" 또는 "와 관련된"은 단일 조성물 내에, MeV-LASV 재조합 바이러스 입자 및 LASV 폴리펩타이드 또는 단백질, 특히 일반적으로 물리학적으로 별개의 실체로서 VLP로서의 존재를 지칭한다. 본 발명의 특수한 구현예에서, 조성물은 백신이다.
본 발명은 또한 대상체, 특히 사람 대상체, 특히 어린이에서 라싸 바이러스에 의한 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, LASV 폴리펩타이드(들) 또는 단백질(들), 또는 이의 항원성 단편(들)과 관련하여, 가능하게는 LASV VLP, 또는 본 발명에 따른 임의의 조성물과 관련된, 재조합 MeV-LASV 감염성의 복제 바이러스 입자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 투여 계획에서 및 특히 사람 대상체, 특히 어린이에서, LASV 바이러스 감염 또는 유도된 질환에 대해 면역 반응, 유리하게는 보호성 면역 반응을 유발하는 투여량 요법에 따라 사용하기 위한 재조합 MeV-LASV 감염성의, 복제성 바이러스 및 관련된 LASV 폴리펩타이드(들) 또는 단백질(들), 또는 이의 항원성 단편(들), 및 잠재적으로 관련된 LASV VLP에 관한 것이다.
본 발명의 특수한 구현예에서, 조성물 또는 조성물의 사용은 단일 주사 후, 대상체, 특히 사람 대상체, 특히 어린이의 면역화를 유발할 수 있다. 다시 말해서, 조성물 또는 조성물의 사용은 재조합 MeV-LASV 감염성의 복제성 바이러스의 선택된 용량의 단일 투여를 필요로 할 수 있다. 대안적으로, 이는 프라임-부스트 요법(prime-boost regimen)의 다중 용량 투여를 필요로 할 수 있다. 프라이밍 및 부스팅은 재조합 MeV-LASV 감염성의, 복제성 바이러스 및 관련된 LASV 폴리펩타이드(들) 및 단백질(들), 또는 이의 항원성 단편(들), 및/또는 LASV VLP로 이루어진 동일한 활성 성분으로 달성될 수 있다.
본 발명은 또한 이러한 성분들 중 하나로서, 재조합 MeV-LASV 감염성의, 복제성 바이러스 및 관련된 LASV 폴리펩타이드(들) 또는 단백질(들), 및/또는 LASV VLP를 포함하는 상이한 활성 성분의 조립체에 관한 것이다. 활성 성분의 조립체는 숙주, 특히 사람 숙주의 면역화에 사용하기에 유리하다.
본 발명자는 재조합 MeV-LASV 감염성의, 복제성 바이러스가 면역 반응을 유발하고 특히 LASV-관련된 폴리펩타이드에 대해 중화 항체의 생산을 유발함을 밝혔다. 따라서, 본 발명에 따른 활성 성분의 투여는 숙주의 면역화를 유발함을 밝혔다. 본 발명에 따른 백신은 안전하며, 숙주 내에서 면역 반응(immune answer)을 유도하며, 이는 특히 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 포함한다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 백신은 항원-특이적인 T 세포 반응을 유도한다. 면역화된 원숭이 숙주가 LASV의 치사 용량 챌린지에서 생존함이 밝혀졌다.
숙주의 면역화, 및 LASV 챌린지 후, 간 효소(ALT 및 AST), 락테이트 데하이드로게나제(LDH), C-반응성 단백질(CRP) 및 알부민의 수준은 면역화된 원숭이 숙주 내에서 정상으로 남거나 약간 증가하는 반면, 이러한 수준은 면역화되지 않은 숙주에서 수배 증가한다.
본 발명에 따른 조성물은 재조합 LASV-특이적인 면역글로불린, 특히 IgM 및 IgG, 및 중화 항체의 생산을 유발시킬 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 안전한 백신이며, 숙주 내에서 면역원성이고 효과적이다. 조성물 및 이의 사용은 적어도 T 세포 반응을 부여하며 예방접종된 숙주 내에서 라싸 바이러스 감염에 대한 면역성을 부여한다.
본 발명에 따른 조성물은 또한 MeV-특이적인 면역글로불린, 특히 IgM 및 IgG, 및 중화 항체의 생산을 유발시킬 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 안전한 백신이며, 숙주 내에서 면역원성이고 효과적이다. 조성물 및 이의 사용은 적어도 T 세포 반응을 부여하며 예방접종된 숙주 내에서 홍역 바이러스 감염에 대한 면역성을 부여할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 투여 스케쥴에서 사용하기 위해서 및 특히 사람 대상체, 특히 어린이에서 홍역 바이러스 감염 또는 유도된 질환에 대한 면역 반응, 유리하게는 보호성 면역 반응을 유발하는 투여량 요법에 따른 재조합 MeV-LASV 감염성의, 복제성 바이러스 및 관련된 LASV 폴리펩타이드(들) 또는 단백질(들), 또는 이의 항원성 단편(들), 및 잠재적으로 관련된 LASV VLP에 관한 것이다.
본 발명은 또한 특히 사람 대상체, 특히 어린이에서, 홍역 바이러스에 의한 감염의 치료 또는 예방시 사용하기 위한, 본 발명에 따른 LASV 폴리펩타이드(들) 또는 단백질(들), 또는 이의 항원성 단편(들), 및/또는 LASV VLP, 또는 본 발명에 따른 임의의 조성물과 관련된 재조합 MeV-LASV 감염성의 복제하는 바이러스 입자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 GPC 단백질, Z 단백질, NP 단백질 및/또는 mNP 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 서열 중 임의의 하나를 포함하는 이종 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 서열 번호: 2; 서열 번호: 4, 서열 번호: 6 및/또는 서열 번호: 8을 포함하거나 이로 이루어진 코돈-최적화된 폴리뉴클레오타이드에 대한 것이다.
도면의 설명
본 출원이 언급하는 도면들 중 일부는 컬러이다. 출원 시의 본 출원은 도면의 칼라 인쇄본을 포함하며, 따라서, 이는 특허청에서 출원 파일의 검열에 의해 접근될 수 있다.
도 1. 핵산 작제물의 개략적 표시. A: MeV 벡터. B: 본 발명에 따른 핵산 작제물. MeV 유전자는 회색으로 나타내며 LASV 유전자는 녹색, 청색 및 적색으로 나타낸다. MV 유전자의 경우: N(핵단백질); P/V/C(인단백질 및 V/C 단백질); M(매트릭스); F(융합 단백질); H(헤마글루티닌): L(폴리머라제). LASV 유전자의 경우: NP(핵단백질); NPExoN(또한 일부 도에서 NPKO로 지칭됨; 이의 엑소뉴클레아제 활성이 녹 다운된 돌연변이된 NP를 암호화하는 돌연변이된 서열); GPC(당단백질 전구체); Z(아연-결합 단백질). ATU는 검정색 화살표로 나타낸다. ATU1은 MeV의 N 유전자 상부의 좌측에 국재화되는 반면 ATU2는 P 유전자와 M MeV 유전자 사이에 중앙으로 국재화된다.
도 2. 베로(Vero) E6 세포에서 바이러스의 성장 역학. MeV-GFP는 작제물에 상응하며, 여기서 녹색 형광성 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 ATU2 내에 삽입되었다. MeV-GPCLASV는 작제물에 상응하며, 여기서 LASV의 GPC 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 ATU2 내에 삽입되었다. MeV-NP+GPCLASV는 작제물에 상응하며, 여기서 LASV의 GPC 단백질 및 NP 단백질은 ATU2 내에 삽입되었다. MeV-NPExoN+GPCLASV는 작제물에 상응하며, 여기서 LASV의 GPC 단백질 및 돌연변이된 NP 단백질(엑소뉴클레아제 활성은 녹 다운됨)을 암호화하는 뉴클레오타이드는 ATU2 내에 삽입되었다. MeV-Z+GPCLASV는 작제물에 상응하며, 여기서 GPC 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 ATU2 내에 삽입되었고, 여기서 Z 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 ATU1 내에 삽입되었다. 역가는 3개의 독립된 실험으로부터 TCID50에 의해 측정된, 대표적인 실험에서 수득하였다. 평균 및 표준 편차가 나타나 있다.
도 3. 감염된 베로 E6 세포 및 감염된 베로 E6 세포의 상층액 속에서 LASV 단백질(GPC, NP 및 Z) 및 MeV 단백질(F)의 발현. 각각의 작제물의 효과는 물질 및 방법에 상세히 설명된 바와 같이 웨스턴 블롯(Western blot)으로 평가되었다. NI: 감염되지 않은 세포. ns: 비 특이적임.
도 4. 사람 말초 혈액 단핵 세포로부터 유래된 면역 항원 제시 세포내에서 MeV-GFP 도입 및 복제.
도 5. 상이한 MeV-LASV 벡터로 감염된 사람 1차 단핵구 내에서 제I형 IFN의 발현. 제I형 IFN 반응(IFNa1, IFNa2 및 IFNb의 정량적 발현)의 qPCR에 의한 정량적 RNA 분석. 감염 24시간 후 발현. 모든 결과는 GAPDH 유전자에 대해 표준화되고 GAPDH에 대해 상대적인 배 유도(fold induction)로서 나타낸다.
도 6. 상이한 MeV-LASV 벡터로 감염된 대식구 내에서 분화 마커 CD80, CD86 및 CD83 CD40의 집단의 세포 표면 발현. 감염 48시간 후 공-활성화 분자의 세포 표면 발현을 위한 유동 세포분석법.
도 7. 상이한 MeV-LASV 벡터로 감염된 사람 1차 수지 세포 내에서 제I형 IFN의 발현. 제I형 반응(IFNa1, IFNa2 및 IFNb의 정량적 발현)의 qPCR 분석에 의한 정량적 RNA 분석. 감염 후 24시간 발현, 모든 결과는 GAPDH 유전자에 대해 표준화되며 GAPDH에 대해 상대적인 배 유도로서 나타낸다.
도 8. 상이한 MeV-LASV 벡터로 감염된 사람 1차 수지 세포 내에서 분화 마커 CD80, CD86, CD83 및 CD40의 집단의 세포 표면 발현. 감염 48시간 후 공-활성화 분자의 세포 표면 발현을 위한 유동 세포분석법.
도 9. 면역화 후 30일 동안 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey)(마카카 파스시쿨라리스( Macaca fascicularis ))에서 체온. 3, 4 및 4마리의 원숭이는 재조합 MeV 균주 슈바르츠 백신, 재조합 MeV-NPExoN-GPC 백신 및 재조합 Z-MeV-GPC 백신 각각의 2.106개의 조직 배양 감염성 용량 50(TCID50)으로 피하 면역화시켰다.
도 10. LASV 항원-특이적인 CD4 및 CD8 T 세포는 예방접종된 시노몰구스 원숭이(마카카 파스시쿨라리스)에서 반응한다. GPC, NP 및 Z에 대해 특이적인 펩타이드를 오버랩핑함에 의한 전혈의 자극 후 유동 세포분석법.
도 11. LASV 균주 조시아의 치사 용량으로 챌린지 후 시노몰구스 원숭이(마카카 파스시쿨라리스)에서의 임상 점수. 임상 점수는 체온, 체중, 일반적으로 먹거나 수화시키는 능력, 거동, 임상 신호를 기반으로 한다. 15의 점수는 사멸에 대한 종점이다. LASV 균주의 치사 용량은 동물에게 피하 주사된, 1.500 FFU의 LASV 균주 조시아로 이루어진다.
도 12. 치사 용량의 LASV 균주 조시아로 챌린지된 시노몰구스 원숭이(마카카 파스시쿨라리스)의 체온.
도 13. 면역화된 시노몰구스 원숭이의 혈장 속에서 간 효소(AST 및 ALT) 수준.
도 14. LASV 균주 조시아의 치사 용량으로 챌린지된 시노몰구스 원숭이(마카카 파스시쿨라리스)에서 LDH(A), CRP(B) 및 알부민(C)의 혈장 수준.
도 15. LASV 균주 조시아의 치사 용량으로 챌린지된 시노몰구스 원숭이의 바이러스혈증(RNA(A) 및 역가(B)). qPCR에 의한 RNA 정량화. 당해 분야에서 공지된 방법에 따른 적정(titration).
도 16. LASV 균주 조시아의 치사 용량으로 챌린지된 시노몰구스 원숭이의 비강(A) 및 경구 분비물(B) 및 뇨(C)에서 바이러스 RNA 정량화. qPCR에 의한 RNA 정량화.
도 17. 상이한 MeV-LASV로 이미 면역화된 챌린지된 시노몰구스 원숭이의 기관내에서 검출된 LASV RNA 수준.
도 18. 상이한 MeV-LASV로 이미 면역화된 챌린지된 시노몰구스 원숭이의 기관 내에서 검출된 LASV 감염성 역가.
도 19. LASV 균주 조시아의 치사 용량으로 챌린지된 시노몰구스 원숭이에서 LASV에 대한 IgM 및 IgG 반응. A. IgM LASV 특이적임. B: IgG LASV 특이적임. ELISA에 의해 측정된 면역글로불린 수준. 450 nM에서의 흡광도에 따라 계산된 광학 밀도.
도 20. 면역화 후 LASV GP- 및 NP- 특이적인 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응. 전체 LASV GP 및 NP를 포함하는 오버래핑 펩타이드로 자극 후 IFNg, TNFa 및/또는 IL-2를 생산한 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 퍼센트는 유동 세포 분석법으로 측정하였다.
도 21. LASV 균주 조시아의 치사 용량으로 챌린지된 면역화된 시노몰구스 원숭이의 LASV 항원-특이적인 CD4 및 CD8 T 세포 반응. GPC 및 NP에 대해 특이적인 오버래핑 펩타이드에 의한 전혈의 자극 후 유동 세포분석법.
도 22. LASV 균주 조시아의 치사 용량으로 챌린지된 시노몰구스 원숭이 내에서 CD4 및 CD8 T 세포의 증식 및 활성화. Ki67 염색 (A)에 의해 평가된 CD8 증식. 그랜자임 B 발현의 정량화에 의해 평가된 CD4 (B) 및 CD8 (C) 활성화.
도 23. LASV 챌린지 후 LASV GP- 및 NP-특이적인 CD8+ T 세포 반응. 전체 LASV GP (23A) 및 NP (23B)를 포함하는 오버래핑 펩타이드를 사용한 LASV 챌린지 후 IFNg, TNFa 및/또는 IL-2를 생산한 CD8+ T 세포의 퍼센트는 유동 세포분석법으로 측정하였다. 반응하는 T 세포의 상이한 아-집단(sub-population)의 비율은 파이 차트(pie chart)를 사용하여 나타낸다.
도 24. LASV 챌린지 후 LASV GP- 및 NP-특이적인 CD4+ T 세포 반응. 전체 LASV GP (23A) 및 NP (23B)를 포함하는 오버래핑 펩타이드를 사용한 LASV 챌린지 후 IFNg, TNFa 및/또는 IL-2를 생산한 CD4+ T 세포의 퍼센트는 유동 세포분석법으로 측정하였다. 반응하는 T 세포의 상이한 아-집단의 비율은 파이 차트를 사용하여 나타낸다.
도 25. MeV-NP ExoN -GPC LASV 로 면역화 후 상이한 시점에서 수집한 시노몰구스 원숭이 PBMC로부터 수득한 전사체학 데이타에서 수행한 KEGG 경로 분석.
도 26. MeV-Z+GPC LASV 로 면역화 후 상이한 시점에서 수집한 시노몰구스 원숭이 PBMC로부터 수득한 전사체학 데이타에서 수행한 KEGG 경로 분석.
도 27. LASV 챌린지 후 면역화된 원숭이의 혈장 속의 사이토킨의 정량화. 상이한 사이토킨을 LASV 챌린지 후 MeV-, MeV-NPExoN-GPCLASV, 및 MeV-Z+GPCLASV 면역화된 시노몰구스 원숭이의 혈장 속에서 정량화하였다. 상이한 조건 사이의 유의적인 차이(p<0.05)를 나타낸다: n-c(MeV-NPExoN-GPCLASV 및 MeV), n-z(MeV-NPExoN-GPCLASV 및 MeV-Z+GPCLASV) 및 n-cz(MeV-NPExoN-GPCLASV 및 MeV; MeV-NPExoN-GPCLASV 및 MeV-Z+GPCLASV).
도 28. LASV 균주 조시아의 치사량으로 챌린지한 시노몰구스 원숭이에서 MeV에 대한 IgM 및 IgG 반응. A: IgM MeV 특이적임. B: IgG MeV 특이적임. IgG 및 IgM MeV-특이적은 MeV 작제물로 면역화한 원숭이에 대해 7 및 14일째의 척도가 아니었다.
도 29. 천연의 및 돌연변이된 NP 단백질의 엑소뉴클레아제 활성의 측정. 루시퍼라제 활성 바이러스-유도된 및 면역자극성 RNA-유도된 인터페론-베타 활성화의 배 유도(fold induction). CT: 대조군. NPLASV: 천연 NP 단백질. NPExoNLASV: 서열 번호: 5의 돌연변이된 NP 단백질. SeV: moi=1에서 센다이 바이러스.
도 30. MeV-NP ExoN -GPC LASV 향성의 분석. CHO 세포주는 LASV GPC 또는 MeV-NPExoN-GPCLASV로 슈도타이핑된(psuedotyped) 모페이아 바이러스(Mopeia virus)로 감염시켰다. GPC의 발현은 항-GP1 항체를 사용한 염색으로 분석하였다. 핵은 청색인 반면, 염색된 항-GP1은 녹색이다.
도 31. 본 발명의 제1 구현예에 따른 전달 벡터 플라스미드의 개략적인 표시. 전달 벡터는 서열 번호: 9의 서열을 갖는다. N 단백질을 암호화하는 홍역 유전자는 뉴클레오타이드 189번과 1767번 사이에 국재화된다. P 단백질을 암호화하는 홍역 유전자는 뉴클레오타이드 1889번과 3412번 사이에 국재화된다. GPC를 암호화하는 서열 번호: 2의 코돈-최적화된 이종 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 3532번과 5007번 사이에 국재화된다. ATU2는 이종 폴리뉴클레오타이드 삽입체를 뺀 뉴클레오타이드 3487번과 5071번 사이에 국재화된다. M 단백질을 암호화하는 홍역 유전자는 뉴클레오타이드 5104번과 6111번 사이에 국재화된다.
도 32. 본 발명의 제2 구현예에 따른 전달 벡터 플라스미드의 개략적 표시. 전달 벡터는 서열 번호: 10의 서열을 갖는다. N 단백질을 암호화하는 홍역 유전자는 뉴클레오타이드 190번과 1767 사이에 국재화된다. P 단백질을 암호화하는 홍역 유전자는 뉴클레오타이드 1889번과 3412번 사이에 국재화된다. NP 단백질을 암호화하는 서열 번호: 4의 코돈-최적화된 이종 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 3532번과 5241번 사이에 국재화된다. GPC를 암호화하는 서열 번호: 2의 코돈-최적화된 이종 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 5386번과 6861번 사이에 국재화된다. 홍역 바이러스의 조절 서열을 포함하는 링커 서열은 뉴클레오타이드 5242번과 5385번 사이에 국재화된다. ATU2는 이종 폴리뉴클레오타이드 삽입체 및 링커 서열을 뺀 뉴클레오타이드 3487번과 6925번 사이에 국재화된다. M 단백질을 암호화하는 홍역 바이러스는 뉴클레오타이드 6958번과 7965번 사이에 국재화된다.
도 33. 본 발명의 제3의 구현예에 따른 전달 벡터 플라스미드의 개략적인 표시. 전달 벡터는 서열 번호: 11의 서열을 갖는다. N 단백질을 암호화하는 홍역 유전자는 뉴클레오타이드 190번과 1767번 사이에 국재화된다. P 단백질을 암호화하는 홍역 유전자는 뉴클레오타이드 1889번과 3412번 사이에 국재화된다. 돌연변이된 NP 단백질을 암호화하는 서열 번호: 6의 코돈-최적화된 이종 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 3532번 내지 5241번 사이에 국재화된다. GPC를 암호화하는 서열 번호: 2의 코돈-최적화된 이종 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 5386번과 6861번 사이에 국재화된다. 홍역 바이러스의 조절 서열을 포하하는 링커 서열은 뉴클레오타이드 5242번 내지 5385번 사이에 국재화된다. ATU2는 이종 폴리뉴클레오타이드 삽입체 및 링커 서열을 뺀 뉴클레오타이드 3487번과 6925번 사이에 국재화된다. M 단백질을 암호화하는 홍역 유전자는 뉴클레오타이드 6958번과 7965번 사이에 국재화된다.
도 34. 본 발명의 제4 구현예에 따른 전달 벡터 플라스미드의 개략적인 표시. 전달 벡터는 서열 번호: 12의 서열을 갖는다. Z 단백질을 암호화하는 서열 번호: 8의 코돈-최적화된 이종 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 193번과 504번 사이에 국재화된다. N 단백질을 암호화하는 홍역 유전자는 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 646번과 2223번 사이에 국재화된다. P 단백질을 암호화하는 홍역 유전자는 뉴클레오타이드 2345번과 3868번 사이에 국재화된다. GPC를 암호화하는 서열 번호: 2의 코돈-최적화된 이종 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 3988번과 5463번 사이에 국재화된다. M 단백질을 암호화하는 홍역 유전자는 뉴클레오타이드 뉴클레오타이드 5560번과 6567번 사이에 국재화된다.
도 35. 본 발명의 제5 구현예에 따른 전달 벡터 플라스미드의 개략적인 표시. 전달 벡터는 서열 번호: 13의 서열을 갖는다. Z 단백질을 암호화하는 서열 번호: 8의 코돈-최적화된 이종 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 193번과 504번 사이에 국재화된다. N 단백질을 암호화하는 홍역 유전자는 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 646번과 2223번 사이에 국재화된다. P 단백질을 암호화하는 홍역 유전자는 뉴클레오타이드 뉴클레오타이드 2345번과 3868번 사이에 국재화된다. NP 단백질을 암호화하는 서열 번호: 4의 코돈-최적화된 이종 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 3988번 내지 5697번 사이에 국재화된다. GPC 단백질을 암호화하는 서열 번호: 2의 코돈-최적화된 이종 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 5842번과 7317번 사이에 국재화된다. M 단백질을 암호화하는 홍역 유전자는 뉴클레오타이드 7414번과 8421번 사이에 국재화된다.
도 36. 본 발명의 제6 구현예에 따른 전달 벡터 플라스미드의 개략적 표시. 전달 벡터는 서열 번호: 14의 서열을 갖는다. Z 단백질을 암호화하는 서열 번호: 8의 코돈-최적화된 이종 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 193번과 504번 사이에 국재화된다. N 단백질을 암호화하는 홍역 유전자는 뉴클레오타이드 646번과 2223번 사이에 국재화된다. P 단백질을 암호화하는 홍역 유전자는 뉴클레오타이드 2345번과 3868번 사이에 국재화된다. NP 단백질을 암호화하는 서열 번호: 6의 코돈-최적화된 이종 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 3988번과 5697번 사이에 국재화된다. GPC를 암호화하는 서열 번호: 2의 코돈-최적화된 이종 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 5842번과 7317 사이에 국재화된다. M 단백질을 암호화하는 홍역 유전자는 뉴클레오타이드 7414번과 8421번 사이에 국재화된다.
실시예
물질 및 방법
세포 및 바이러스
T7 폴리머라제 및 홍역 N 및 P 단백질을 안정하게 발현하는 293T7/N/P 세포를 사용하여 재조합 홍역 바이러스를 구제하고 전술한 바와 같이 유지시켰다{Combredet, 2003 #76}. 베로 NK 세포를 5% FCS, 및 0.5% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 글루타막스 둘베코 변형 이글 배지(Glutamax Dulbecco Modified Eagle's Medium)(DMEM, Life Technologies) 속에서 성장시켰다. 혈액 샘플을 기관(Etablissement Francais du Sang)(EFS, 프랑스 리옹 소재)으로부터 수득하였다. 단핵 세포를 피콜 밀도 구배 원심분리(Ficoll density gradient centrifugation)(GE Healthcare)로 정제하였다. 단핵구를 PBS 중 50% 퍼콜(Percoll)(GE Healthcare, 프랑스 벨리지(Veligzy) 소재)의 쿠션 위에서 원심분리함으로써 말초 혈액 단핵 세포로부터 우선 분리한 다음 제조업자의 설명서(Miltenyi Biotec, 프랑스 파리 소재)에 따라 단핵구 단리 키트 II를 사용하여 정제하였다. 대식구는 단핵구를 6일 동안 RPMI, 10% SVF, 50 ng/mL의 M-CSF가 보충된 10% 자가 혈청을 항온처리함으로써 수득하였다. M-CSF를 2일마다 가하고 배양 배지의 40%를 교체하였다.
플라스미드 작제물
LASV GPC, NP 및 Z(LASV 균주 조시아)의 코돈-최적화된 ORF를 핵단백질(N)(Z의 경우 ATU1)의 상부 또는 전술한 바와 같이 슈바르츠 MV 게놈(ATU2, GPC 단독 또는 NP+GPC)의 인단백질(P) 유전자와 매트릭스(M) 유전자 사이에 위치한 추가의 전사 단위(ATU)의 pTM1-MVSchwarz 벡터 내에 클로닝하였다(Combredet, C., et al., A molecularly cloned Schwarz strain of measles virus vaccine induces strong immune responses in macaques and transgenic mice. J Virol, 2003. 77(21): p. 11546-54). 모든 플라스미드 작제물을 서열분석으로 확인하였다.
웨스턴 블롯 및 항체
재조합 MeV-GFP, MeV- GPCLASV, MeV-NP+GPCLASV, MeV-NPExoN+GPCLASV 또는 MeV-Z+GPCLASV로 감염된 베로 NK 세포를 Co-IP 완충액 속에 용해시키고 원심분리로 선명하게 하였다. 용해물 및 배양 상층액을 이후에 4 내지 12% 프리캐스트 겔(precast gel)(Biorad) 상에서 변성 조건 하에 분리하고 PVDF 막으로 이전시켰다. 막을 GP1(내부 마우스 모노클로날 생산), NP(마우스 항-LASV 혈청), Z(내부 토끼 폴리클로날 생산) 또는 F(토끼 폴리클로날 Fcyt, 알. 캐타네오(R. Cattaneo)의 선물)에 대한 1차 항체로 염색하였다. 세포 용해물을 또한 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 커플링된 항-액틴 항체로 염색하였다. HRP에 커플링된 제2 항체로 염색한 후, 막은 웨스트 두라 기질(West Dura substrate)(Pierce)을 사용하여 나타내었고 LAS4000 영상기(GE Healthcare)를 사용하여 사진을 찍었다.
바이러스 구조 및 적정
LASV 항원을 발현하는 재조합 홍역 바이러스를 전술한 바와 같이 구조하였다(Combredet, 2003; Radecke, F., et al., Rescue of measles viruses from cloned DNA. Embo J, 1995. 14(23): p. 5773-84; WO2008/078198). 요약하면, 293T7/N/P 세포를 홍역 L 폴리머라제 및 바람직한 MeV의 항게놈성 분절을 암호화하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 클론성 다핵질을 집어서 6-웰 플레이트 속에서 베로 NK 세포를 감염시키는데 사용하였다. 다핵질이 웰 슈퍼피시(well superficy)의 약 50%에 도달하면, 세포를 탈착시켜 10 cm 디쉬(dish) 속의 베로 NK 세포 위에 덮어서 계대배양 1(P1) 스톡을 생산하였다. 보다 높은 계대배양 바이러스 스톡을 제조하기 위하여, 베로 NK 세포를 0.01의 다중 감염도(MOI)로 감염시킨 다음 32℃에서 2 내지 3일 동안 항온처리하였다. 바이러스를 수거하기 위하여, 세포를 Opti-MEM I 환원된-혈청 배지 내로 긁어넣고 2회 동결건조시켰다. 역가를 베로 NK 세포 상에서 50% 조직 배양 감염 용량(TCID50) 적정으로 측정하였다.
정량적 RNA 분석
RT-qPCR 실험을 위해, 총 RNA를 모의(mock) 또는 감염된 세포로부터 라니시 미니 키트(Rneasy Mini Kit)(Qiagen, 프랑스 코우로타보위(Courtaboeauf) 소재)를 사용하여 제조업자의 설명서에 따라 단리하고, 보충적 DNase 단계를 터보 DNA 유리 키트 암비온(Turbo DNA free kit Ambion)(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 가하였다. cDNA의 합성을 SuperScript III을 사용하여 수행하고 증폭을 유전자 발현 마스터 믹스 키트(Gene Expression Master Mix kit)(Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 수행하였다. 제I형 IFN을 위해, 프라이머/프로브 혼합물을 실내에서 개발하였다. qPCR 검정의 작동(run)을 LightCycler 480(Roche Diagnostics, 프랑스 메일란(Maylan) 소재)에서 수행하였다. 모든 유전자의 발현을 GAPDH 유전자의 것에 대해 표준화하고, GAPDH에 대해 배 유도로 나타내었다. 바이러스 RNA 정량화를 위해, NP ORF의 771 내지 934pb 영역의 RNA 프로브를 pGEM 벡터(Promega) 내로 클로닝하여 T7 폴리머라제 구동된 전사체를 생성하였다. RNA 프로브(probe)를 DNAse 처리하고, 정제하며, 정량화하였다(Dropsense96, Trinean, 벨기에 겐트 소재). 바이러스 RNA에 대한 정량적 PCR을 EuroBioGreen qPCR Mix Lo-ROX(Eurobio, 프랑스 레 울리 소재)로 LASV 특이적인 프라이머를 사용하여 수행하였다.
MP 활성화, T 세포 활성화 및 증식을 위한 유동 세포분석법
모의 및 MOI 1-감염된 MP를 감염 48시간 후에 탈착시키고, 사람 IgG로 포화시키고 CD40, CD83, CD80, 및 CD86(BD Biosciences, 프랑스 르-퐁-드-클라이 소재)으로 표면 염색한 후 PBS/1% PFA 속에서 최종 고정시켰다. LASV 항원-특이적인 T 세포를 신선한 전혈로부터 분석하였다. 세포를 GPC, NP 또는 Z 오버랩핑 펩타이드의 혼주물(pool)과 함께 CD28 및 CD49d 항체(2 μg/ml) 및 브레펠딘 A(10 μg/ml)의 존재하에서 6시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. SEA(1μg/ml) 또는 PBS를 각각 활성화의 양성 및 음성 대조군으로서 사용하였다. 펩타이드는 15-머(15-mer) 아미노산 길이(각각 1 μg/ml)이며 11개의 잔기의 오버랩을 지니고 LASV 균주 조시아의 완전한 GPC, NP 또는 Z ORF를 스패닝(spanning)하였다. PBS-EDTA 20mM를 샘플에 가한 후 CD3, CD4 및 CD8(BD Biosciences)에 대해 세포-표면 염색시켰다. 적혈 세포를 이후에 PharmLyse(BD Biosciences)를 사용하여 용해하였다. 이후에, 세포를 고정시키고 IFNγ(Biolegend)에 대한 항체를 사용한 세포내 염색을 위해 투과시켰다. 증식 및 활성화를 위해, 웰(well)을 Ki67 또는 그랜자임 B에 대한 항체를 사용하여 염색시켰다. 세포를 유동 세포분석법으로 LSR 포테싸 세포측정기(Fortessa cytometer)(BD Biosciences) 또는 10-색상 갈리오스 세포측정기(Gallios cytometer)(Beckman Coulter)로 분석하였다. 데이타를 칼루자 소프트웨어(Kaluza software)(Beckman Coulter)를 사용하여 분석하였다.
LASV를 사용한 시노몰구스 원숭이 챌린지
4마리의 수컷 시노몰구스 원숭이(마카카 파스시쿨라리스(Macaca Fascicularis), 32 내지 39개월령, 3 내지 4 kg)를 A2 시설(SILABE, 프랑스) 속에서 2.106 TCID50의 MeV-NPExoN+GPCLASV 또는 MeV-Z+GPCLASV 각각의 피하 주사에 의해 면역화시켰다. 3마리의 원숭이의 다른 대조군 그룹을 MeV 백신 균주 슈바르츠로 면역화시켰다. 혈액 채취, 경구 및 비강 면봉 및 뇨 샘플링을 처음 2주 동안 2 내지 3일마다 수행한 다음 주당 1회씩 37일까지 수행하여 백신 복제 및 쉐딩(shedding), LASV GPC, NP 또는 Z에 대한 IgM 및 IgG 반응 및 T 세포 반응을 평가하였다. 37일 후, 원숭이를 BSL-4 시설(Laboratoire P4-Inserm Jean Merieux)로 이동시켰으며 여기서 이들을 1,500 FFU의 LASV 균주 조시아를 사용하여 피하 챌린지시켰다. 동물을 질환의 임상 신호에 대해 추적하고 체온, 체중, 사료섭취, 수화, 거동 및 임상 징후를 기반으로 이루어진 점수매김에 따라 안락사시켰다. 실험 종점을 챌린지 28일 후에 두고 이 시점에서 생존한 모든 동물을 입증된 실험 과정에 따라 안락사시켰다. 혈액 채취, 경구 및 비강 면봉 및 뇨 샘플링을 처음 2주 동안에 2 내지 3일마다에 이어서 주당 1회씩 28일까지 수행하여 LASV 바이러스 복제 및 쉐딩, LASV GPC, NP 또는 Z에 대한 IgM 및 IgG 반응 및 T 세포 반응을 평가하였다. 이러한 연구는 Comite Regional d'Ethique en Matiere d'Experimentation Animale de Strasbourg (APAFIS#6543-20160826144775) 및 Comite Regional d'Ethique pour l’Experimentation Animale Rhone Alpes (CECCAPP 20161110143954)에 의해 승인되었다.
천연 및 돌연변이된 NP 단백질의 엑소뉴클레아제 활성의 측정(도 29):
293T 세포를 IFN-베타 유전자의 공지된 기능성 프로모터 서열로부터의 개똥벌레 루시퍼라제(Fluc) 리포터 유전자(pIFNbeta-LUC), 다양한 양의 천연(야생형) 또는 돌연변이체 LASV NP 벡터, 및 50 ng의 형질감염 표준화를 위한 β-gal-발현 플라스미드를 발현하는 벡터 100ng으로 인산칼슘을 사용하여 공형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, 세포를 센다이(Sendai) 바이러스(moi = 1에서)로 감염시켜 IFN-β 발현을 유도시켰다. 24 hpi에서, 세포 용해물을 루시퍼라제 및 β-gal 검정을 위해 제조하였다. Fluc 활성을 β-gal 값으로 표준화하였다. NP가 엑소뉴클레아제 활성을 갖는지의 여부를 측정하기 위해, 면역자극성 RNA-유도된 IFN 생산의 억제에 대한 이의 효과를 분석하고, HEK293 세포를 pIFNbeta-LUC, 가변 양의 천연(WT) 또는 돌연변이체 LASV NP 벡터, 및 형질감염 표준화를 위한 베타-gal-발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 18 시간 후, 세포를 1 μg의 폴리(I:C) 또는 250 ng의 피친데 비리온(Pichinde virion) RNA로 리포펙타민 2000을 사용하여 형질감염시켰다. 루시퍼라제 활성을 면역자극성 RNA 형질감염 18시간 후에 측정하고 베타-gal 활성으로 표준화하였다. 이의 엑소뉴클레아제 활성이 녹 다운된 돌연변이된 NP 단백질은 면역자극성 RNA-유도된 IFN 생산을 억제하지 않는다.
실시예 1 - LASV 항원을 발현하는 재조합 MeV 바이러스의 생성
가장 우수한 면역원성을 수득하기 위해 MeV 벡터 내에 도입하기 위한 LASV 항원의 가장 우수한 조합이 무엇인지를 측정하기 위하여, 본 발명자는 GPC 단독 또는 NP(LASV NP 내에 함유된 면역억제성 기능을 폐지하기 위해 엑소뉴클레아제 도메인 내에서 돌연변이되거나 돌연변이되지 않음) 또는 GPC 및 Z와 함께 발현하여 생체내에서 항원성 LASV 바이러스-유사 입자(VLP)를 생산하는 슈바르츠 MeV 백신 플랫포옴을 사용하여 수개의 MeV/LASV 백신 후보물을 생성하였다. 본 발명자는 또한 엑소뉴클레아제 도메인 내에서 돌연변이되거나 돌연변이되지 않은 Z, GPC 및 NP를 발현하는 작제물을 제조하였다. GPC 및 NP 유전자를 추가의 전사체 단위 2(ATU2) 내에서 MeV P 유전자와 M 유전자 사이에서 클로닝하였다. Z 유전자는 ATU1 내 N 유전자의 상부에 클로닝하였다(도 1b).
모든 바이러스를 구제하고, 다른 작제물과 비교하여 대략의 log로 약독화된 MeV/LASV-Z+GPC를 제외하고는, ATU2로부터 GFP를 발현하는 대조군 MeV-GFP보다는 베로 E6 세포 상에서 유사한 역가로 성장시켰다.(도 2). 상이한 LASV 항원의 발현은 LASV GPC, NP 또는 Z에 대한, 또는 홍역 융합 단백질 F에 대한 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯으로 조절하였다(도 3). GPC의 발현은 MeV-GPCLASV, MeV-NP+GPCLASV, MeV-NPExoN+GPCLASV 및 MeV-Z+GPCLASV 감염된 베로 E6 세포 내에서; NP의 발현은 MeV-NP+GPCLASV, MeV-NPExoN+GPCLASV 및 MeV-Z+GPCLASV 감염된 베로 E6 세포 내에서; Z의 발현은 MeV-Z+GPCLASV 만으로 감염된 세포내에서 검출하였다. MeV F 발현은 모든 MeV 감염된 세포 내에서 검출하였다. 예측한 바와 같이, GPC는 또한 Z와 함께 MeV-Z+GPCLASV 감염된 세포의 상층액 속에서 검출되었으며, VLP의 형태 하에서 Z와 함께 GPC의 방출을 뒷받침한다. 모든 벡터를 LASV 항원 발현의 손실없이 10회 계대배양하였다.
실시예 2 - 사람 제1 항원 제시 세포 내에서 LASV 항원을 발현하는 MeV 바이러스의 면역원성
사람 면역 세포 내에서 상이한 MeV 벡터의 면역원성 특성을 특징화하기 위하여, 본 발명자는 단핵구 유래된 대식구 및 수지 세포를 감염시켰다. MeV는 도 4에서 GFP의 발현에 의해 밝혀진 바와 같이, 이러한 세포로 도입하여 이를 복제시킨다. 그러나, 바이러스는 감염성 역가가 감염 1일 후에 거의 검출가능하지 않았고 항바이러스 고유 반응의 유도로 인한 것과 같이, 시간에 따라 증가하지 않았으므로 이러한 세포 내에서 효율적으로 복제하지 않았다.
본 발명자는 활성화 마커의 유동 세포분석법 분석과 제1형 IFN 반응의 qPCR 분석을 조합함으로써 상이한 재조합 바이러스에 대한 대식구 및 수지 세포의 면역 반응을 분석하였다. 본 발명자는 감염 24시간 후 qPCR에 의해 상이한 벡터로 유도된 제I형 IFN 반응을 분석하였다(도 5). 대식구 내에서, MeV-GPCLASV 및 MeV-Z+GPCLASV는 대조군 MeV-GFP보다 동일한 수준의 IFN 알파-1, 알파-2 및 베타를 유도하였다. 그러나, LASV NP의 첨가는 거의 3 log까지 제I형 IFN(MeV-NP+GPCLASV)를 감소시켰지만, LASV NP의 ExoN 도메인의 돌연변이(MeV-NPExoN+GPCLASV)는 제I형 IFN의 유도를 MeV-GFP 및 -GPCLASV와 비교가능한 수준까지 회복하였다. 이러한 결과는 LASV NP가 MeV 복제 동안 발현된 dsRNA 분자를 소화시킴에 의해서와 같이(Son, 2015), 이의 ExoN 활성을 통해 제I형 IFN의 유도를 조절할 수 있음을 입증한다. 이후에, 본 발명자는 대식구 내에서 감염 48시간 후 상이한 벡터에 의한 공-활성화 분자의 유도를 검토하였다(도 6). 중요하게는, 공-배양물 분자의 세포 표면 발현은 T 세포 반응을 활성화시키는데 중요하다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 모든 벡터는 CD80, CD86 및 CD83의 강력한 세포 표면 발현을 유도하였다. 특히, 발현은 다른 벡터에 의해 감염된 대식구 내에서의 발현과 비교하여 MeV-NP+GPCLASV 감염된 대식구 내에서 감소되었지만 LASV NP의 EcoN 도메인이 돌연변이된 경우 회복되었다.
유사한 실험을 수지 세포에서 수행하였다(도 7 및 8). 대식구에서 관찰된 바와 같이, MeV-GPCLASV 및 MeV-Z+GPCLASV는 대조군 MeV-GFP보다 동일한 수준의 IFN 알파-1, 알파-2 및 베타를 유도하였다(도 7). LASV NP의 첨가는 또한 제I형 IFN의 유도를 감소시켰지만, LASV NP의 ExoN 도메인의 돌연변이는 MeV-GFP, MeV-Z+GPCLASV 및 MeV-GPCLASV와 비교가능한 수준까지 제I형 IFN의 유도를 회복하였다. 공-활성화 분자 CD80, CD86, CD83 및 CD40의 발현은 또한 MeV-GFP, MeV-Z+GPCLASV 및 MeV-GPCLASV로 감염된 수지 세포내에서 유사하게 유도되었다(도 8).
MeV-LASV의 백신 균주는 제I형 IFN 반응 및 공-활성화 분자의 세포 표면 발현을 유도한다; 야생형 NP의 존재는 이러한 효과를 유도하기 위한 백신의 능력을 강력하게 감소시키지만, ExoN 도메인내 돌연변이는 이러한 효과를 유도하는 백신의 능력을 회복시킨다.
실시예 3 - 시노몰구스 원숭이 내 2개의 백신의 안전성, 면역원성 및 효능
사람 대식구에서 수득된 결과를 기반으로 하여, 본 발명자는 LASV 발병을 연구하는 가장 좋은 표준 모델인 시노몰구스 원숭이에서 2개 백신 후보물을 시험하기로 결정하였다. 3개의 대조군 동물을 2.106 TCID50의 재조합 MeV 균주 스바르츠 백신으로 피하 면역화시키고 4마리 동물의 2개 그룹을 2.106 TCID50의 MeV-NPExoN+GPCLASV 및 MeV-Z+GPCLASV 각각으로 피하 면역화시켰다. 이후에, 동물의 건강을 면역화후 37일 동안 추적하였으며(체온, 체중, 호흡 속도) 부작용은 주목되지 않았다. 특히, 복강내 장치 덕분에 연속적으로 모니터링한, 동물 체온은 면역화로 변경되지 않았다(도 9).
본 발명자는 또한 면역화 후 2주 동안 2 내지 3일마다에 이어서 주당 1회 면역화된 동물 내에서 바이러스혈증을 평가하였으며 혈장내 또는 PBMC 중 어느 곳에서도, 어떠한 미량의 바이러스 RNA도 검출될 수 없었다. 유사하게, 본 발명자는 예방접종된 동물의 비강 및 경구 분비물 또는 뇨 속에서 어떠한 바이러스 RNA도 검출할 수 없었다. 따라서, 백신 후보물은 원숭이에서 안정하며 면역화 후 어느 순간에도 없어지지 않는다.
벡터의 면역원성을 평가하기 위하여, 본 발명자는 ELISA를 수행하여 LASV-특이적인 IgM 및 IgG를 검출하였다. 본 발명자는 MeV-Z+GPCLASV 면역화된 동물에서 특이적인 IgM 및 IgG를 검출할 수 없었으며 본 발명자는 면역화 37일 후 4마리의 4 MeV-NPExoN+GPCLASV 예방접종된 동물 중 3마리에서 낮은 수준의 LASV-특이적인 IgG 만을 검출하였다. 또한, 1마리의 MeV-NPExoN+GPCLASV 예방접종된 동물은 플라크 감소 중화 검정(1:100 역가)에 의해 입증된 바와 같이 중화 항체를 가졌다. 본 발명자는 또한 GPC, NP 또는 Z에 대해 특이적인 펩타이드를 오버랩핑함으로써 전혈의 자극 후 유동 세포분석법으로 LASV-특이적인 T 세포 반응을 평가하였다. MeV-NPExoN+GPCLASV 예방접종된 동물에서, 본 발명자는 7일째에 시작하여 면역화 14일 후까지 감소하는 GP에 대한 CD4 및 CD8 T 세포 반응 둘 다를 검출하였다(도 10a 및 10c, 오렌지색 바아). 이러한 동물에서, 본 발명자는 또한 면역화 10일 내지 21일 사이에 NP에 대한 CD4 및 CD8 T 세포 반응 둘 다를 검출하였다(도 10b 및 10d, 오렌지색 바아). MeV-Z+GPCLASV 면역화된 동물에서, GPC에 대한 CD4 T 세포 반응은 면역화 후 10일까지 출발하지만 접종 21일 후까지 지속하여, MeV-NPExoN+GPCLASV 예방접종된 동물과 비교해서 지연되었다(도 10a, 녹색 바아). GPC-특이적인 CD8 T 세포 반응은 낮은 수준에서 7일째에 출발하였지만 면역화 21일 후 최대가 되었다(도 10c, 녹색 바아). CD4 및 CD8 Z-특이적인 T 세포 반응 둘 다는 또한 7일에 시작하여 30일까지 검출되었으며, 면역화 21일 후 최대가 되었다(도 10b 및 10d, 녹색 바아). 중요하게는, LASV 항원에 대한 T 세포 반응은 MeV-예방접종된 대조군 동물에서 검출되지 않았다. 따라서, 백신 후보물 둘 다는 LASV 항원-특이적인 T 세포 반응을 유도하며, MeV-NPExoN+GPCLASV는 MeV-Z+GPCLASV보다 더 이른 반응을 유도한다.
실시예 4 - 백신의 효능
백신 후보물의 효능을 시험하기 위하여, 면역화된 동물을 치사 용량(1,500 ffu, 피하)의 LASV 균주 조시아를 사용하여 37일 면역화 후 챌린지하고 이들의 체온, 체중, 일반적으로 사료를 먹고 수화시키는 능력, 거동, 임상 신호를 기반으로 임상 점수를 매겼으며, 15의 점수는 사멸을 위한 종점이다. 3마리의 대조군 동물은 3일부타 증가하는 점수를 가졌으며 챌린지한지 12, 14 및 15일 후 각각 안락사시켰다(도 11a).
대조적으로, 모든 예방접종된 동물은 LASV 감염에서 생존하였지만 임상 결과는 백신에 따라 상이하였다. 실제로, MeV-NPExoN+GPCLASV 예방접종된 동물은 주로 승온으로 인하여(도 12, 중앙 그래프 참고), 5일까지 임상 점수가 약간 증가되었다(3의 최대 점수, 도; 11b). 대조적으로, MeV-Z+GPCLASV 면역화된 동물은 3일과 12일 사이에 고열과 같은 심각한 증상을 경험하였지만(도 12, 하부 그래프 참고) 2마리의 동물은 12일까지 전체적으로 회복되었고, 2마리의 다른 동물은 먹이공급 및 수화에 난점을 가졌으며, 탈진을 나타내었고 1마리의 동물은 균형 문제를 가졌으며 30일까지 체중의 7.5% 이상을 상실하여, 14의 점수에 도달하였다(도 11c).
본 발명자는 또한 감염 과정에 걸쳐 혈장 속에서 다른 매개변수 중 간 효소 수준(ALT 및 AST), 락테이트 데하이드로게나제(LDH), C-반응성 단백질(CRP) 및 알부민과 같은, 수개의 생물학적 매개변수를 추적하였다. 대조군 동물에서, 간 효소의 수준은 6일째에 출발하여 동물이 죽을 때까지 지속적으로 증가하였다(도 13, 좌측 패널). 대조적으로, 간 효소 수준은 MeV-NPExoN+GPCLASV 예방접종된 동물에서 어느 때에도 정상으로 유지되었으며(도 13, 중앙 패널) 6일과 15일 사이에 MeV-Z+GPCLASV 면역화된 동물에서 단지 약간 증가하였다.
LDH의 혈장 수준은 조직 손상의 마커이다. 대조군 동물에서, LDH 수준은 챌린지 6일 후 및 이에 따라 동물이 죽을 때까지 증가하기 시작하였다(도 14a, 좌측 패널). 감염 기간에 걸쳐 MeV-NPExoN+GPCLASV 예방접종된 동물에서 증가는 관찰되지 않았다(도 14a, 중앙 패널). 그러나, LDH 수준은 특히 9일째에 대조군 동물과 유사한 LDH 값을 갖는 2마리의 동물의 경우, 6일과 15일 사이에 MeV-Z+GPCLASV 면역화된 동물에서 상승되었는데(도 14a, 우측 패널), 이는 이러한 동물에서의 일부 조직 손상을 시사한다. 염증의 마커인, CRP의 수준은 또한 죽을 때까지 대조군 동물에서 신속하게 증가하였다(도 14b, 좌측 패널). CRP 값은 6일까지 CRP 수준에 있어서 일시적인 증가를 나타낸 1마리의 동물을 제외하고는 MeV-NPExoN+GPCLASV 그룹에서 낮게 유지되었다(도 14b, 중앙 패널). 대조적으로, MeV-Z+GPCLASV 그룹으로부터의 모든 동물은 3일과 15일 사이에 증가된 CRP 수준을 가졌다(도 14b, 우측 패널). 이러한 그룹에서, 1마리의 동물은 15일과 30일 사이에 CRP 합성의 2차 파동을 나타내었는데, 이는 LASV 바이러스가 이러한 동물에서 여전히 복제하였음을 시사한다(도 14b, 우측 패널, 연녹색). 본 발명자는 또한 면역화된 원숭이에서 신장 및 간 기능부전의 마커인, 알부민의 혈장 수준을 추적하였다. 대조군 동물에서, 알부민 수준은 3일에 출발하여 지속적으로 감소하였지만(도 14c, 좌측 패널) 이러한 수준은 MeV-NPExoN+GPCLASV 면역화된 동물에서 일정하게 남았다(도 14c, 중앙 패널). MeV-Z+GPCLASV 그룹에서, 모든 동물은 3일과 12일 사이에 알부민 혈장 수준의 감소를 경험하였지만 이러한 수준은 궁극적으로 15일까지 정상으로 돌아왔다(도 14c, 우측 패널).
챌린지된 동물에서의 바이러스혈증을 또한 qRT-PCR 및 적정 둘 다에 의한 챌린지 후 모니터링하였다. 도 15a에 나타낸 바와 같이, 감염된 대조군의 혈액 중 RNA 수준은 3일로부터 사멸일까지 맹렬하게 증가하였으며, 1마리의 동물에 대해 15일째에 mL당 109개의 RNA 카피에서 최대가 되었다(좌측 패널). 감염성 역가를 또한 이러한 동물에서 검출하였다(도 15b, 좌측 패널). MeV-NPExoN+GPCLASV 예방접종된 동물에서, 바이러스 RNA는 챌린지 6일 후에만 검출하였으며 낮은 수준에서 대조군 동물과 비교하였으며(도 15a, 중앙 패널) 관련된 바이러스혈증은 검출되지 않았다(도 15b, 중앙 패널). 바이러스 RNA의 수준은 MeV-Z+GPCLASV 면역화된 동물에서 더 높았으며, 6일째에 mL당 106개의 RNA 카피로 최대가 되었고 15일까지 감소하였다(도 15a, 우측 패널). 특히, 1마리의 동물은 15일까지 혈액 속에서 RNA 카피의 수가 되돌아왔으며(도 15a, 우측 패널, 담녹색), 이는 동일한 동물에서 관찰된 CRP의 회복(rebound)과 관련될 수 있다(도 14b, 우측 패널). 또한, 감염성 역가는 혈액 속에서 연장된 RNA 수준을 나타내는 동물의 경우 6일 내지 15일째에 모든 동물에서 검출되었다(도 15b, 우측 패널).
바이러스혈증 이외에, 본 발명자는 챌린지된 동물의 비강 및 경구 면봉 속에서 바이러스 RNA의 존재를 평가하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 바이러스 RNA의 수준은 대조군 동물의 비강 및 경구 분비물 속에서 9일째에 최대가 되었고(도 16a 및 b, 좌측 패널) 감소하였지만 사망시에 여전히 검출가능하였다. 유사하게, 바이러스 RNA의 수준은 MeV-Z+GPCLASV 면역화된 동물의 경우 이러한 분비물에서 9일째에 최대가 되었으며, 1 또는 2마리의 동물의 경우 15일까지 회복하였다(도 16a 및 b, 우측 패널). 대조적으로, 소량의 LASV RNA 만이 3일째에 1마리의 동물의 비강 면봉에서 및 6일째에 다른 동물에서 검출되었으며(도 16a 및 b, 중앙 패널) 감염성의 바이러스의 존재의 존재와 관련되지 않았다(데이타는 나타내지 않음). 또한, 본 발명자는 챌린지된 동물의 뇨 속에서 바이러스 RNA의 쉐딩을 추적하였다. LASV RNA 수준은 챌린지 후 9일째에 또는 15일째 각각 출발하여 대조군 및 MeV-Z+GPCLASV 면역화된 동물에서만 검출되었다(도 16c).
LASV RNA의 양(도 17) 뿐만 아니라 LASV 감염성 역가(도 18)도 MeV, MeV-NPExoN-GPCLASV 및 MeV-Z-GPCLASV로 면역화시킨 동물의 검시 시기에 수집한 상이한 기관에서 분석하였다. 모든 MeV 대조군 동물은 방광 내를 제외하고는, 시험한 각각의 기관 내에서 검출가능한 양의 LASV RNA 및 고 바이러스 역가를 나타내었으며, 여기서 1마리의 동물 만이 검출가능한 양의 LASV RNA를 나타내었다. 최대 감염성 역가는 비장, 간 및 폐 내에서 발견되었다. MeV-Z+GPCLASV로 면역화시킨 모든 동물에서, 검출가능한 양의 LASV RNA가 서혜부 림프절, 장간막 림프 및 비장에서 발견되었고, 검출가능한 양의 LASV RNA는 모든 기관에서 검출되었지만 이러한 그룹 내에서 단일 동물 내에서는 검출되지 않았다. 2마리의 동물은 서혜부 림프절 내에서 라싸 바이러스의 감염성 역가를 나타낸 반면, 1마리의 동물은 비장 내에서 라싸 바이러스의 감염성 역가를 나타내었지만, 다른 동물은 감염성의 바이러스를 지니지 않았다. MeV-NPExoN+GPCLASV로 면역화시킨 동물의 그룹에서, 검출가능한 양의 LASV RNA는 3마리의 동물 중 1마리의 림프 기관 및 폐 내에서 발견되었지만, RNA의 존재는 감염성 라싸 바이러스의 존재와 관련되지 않았다.
실시예 5 - LASV에 대한 면역 반응
감염에 대한 면역 반응을 측정하기 위하여, 본 발명자는 우선 LASV로 챌린지 후 생산된 LASV-특이적인 면역글로불린의 수준을 측정하였다. IgM 반응은 모든 동물에서 9일째에 출발하여, 12일째에 최대가 되었다(도 19a). 흥미롭게도, IgM 수준은 대조군 그룹으로부터 및 MeV-Z+GPCLASV 그룹으로부터의 동물에서 12일째에 더 높았고, 이는 IgM 반응 수준이 보호와 긍정적으로 관련되지 않고 오히려 바이러스 부하와 관련됨을 시사한다. IgG 반응의 측면에서, 본 발명자는 9일까지 모든 MeV-NPExoN+GPCLASV 예방접종된 동물에서 LASV-lgG이 강력히 유도되지만, MeV-Z+GPCLASV 면역화된 동물에서 IgG 반응은 단지 15일째에 유사한 수준에 도달하였다(도 19b). 대조군 동물에서 LASV-특이적인 IgG의 수준은 임의의 시점에서 매우 낮게 남았다. 또한, 혈청중화 역가를 면역화 후 상이한 시점에서 MeV-NPExoN-GPCLASV, MeV-Z+GPCLASV 및 MeV를 사용하여 면역화된 원숭이의 혈장 속에서 측정하였다(결과는 표 1에 나타낸다). 챌린지 시점에(즉, 면역화 37일 후, 표 1에서 JO), 그룹 당 적어도 1마리의 동물은 1/1 OOe의 중화 역가를 가졌다. 챌린지 15일 후, 및 검시일 까지, 모든 동물을 MeV-NPExoN-GPCLASV로 예방접종하였고 MeV-Z+GPCLASV는 MeV로 예방접종한 동물과는 대조적으로, 1/1 OOe과 1/500e 사이의 중화 항체를 가졌다. MeV-Z+GPCLASV로 예방접종한 원숭이는 30일째에 최대 역가를 가졌다. 중화 항체는 대조군 동물에서를 제외하고는 모든 동물에서 검출되었다.
Figure pct00001
LASV 항원에 대해 특이적인 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 유도를 또한 면역화 후 전체 LASV GP, NP 및 Z 단백질(도 20)을 포함하는 오버래핑 펩타이드에 대한 반응시 IFNg, TNFa 및/또는 IL-2를 생산하는 T 세포의 퍼센트를 정량화함으로써 모니터링하였다. T 세포는 Z 펩타이드에 반응하는데 실패하였다(데이타는 나타내지 않음). GP 및 NP 펩타이드에 대한 반응시 사이토킨-생산 T 세포의 수는 기본선 수준(0일째) 및 MeV-대조군 동물과 비교하여 보통으로만 증가하였으며, TNFa는 이러한 반응에 포함된 주요 사이토킨이었다. 그럼에도 불구하고, MeV-NPExon-GPCLASV를 사용한 면역화 21일 후 GP-특이적인 사이토킨-생산 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 퍼센트에 있어서 비-유의적인 증가가 관찰되나, MeV-Z+GPCLASV를 사용한 면역화 후에는 관찰되지 않았다. 또한, NP-특이적인 사이토킨-생산 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 면역화된 동물에서 14일 후 나타났으며 이후 22일째에 여전히 존재하였다.
유사하게, 본 발명자는 오버래핑 펩타이드를 사용하는 T 세포 활성화 검정에서 챌린지 후 LASV GPC, NP 또는 Z에 대한 T 세포 반응을 추적하였다. GPC 및 NP에 대한 CD8 및 CD4 반응은 MeV-NPExoN+GPCLAsv 예방접종된 동물에서 조기에 존재하고 풍부하였으며, 이후 9일째에 최대치가 되고 서서히 감소하였다(도 21, 오렌지색 바아). GPC에 대한 CD8 및 CD4 반응은 지연되었으며 MeV-Z+GPCLASV 면역화된 동물에서 거의 강하지 않았고, 12일째에 최대였다(도 21, 녹색 바아). 이러한 동물은 LASV-Z 특이적인 세포 반응을 나타내지 않았다. 대조군 동물은 매우 약하게만 경험하였으며 6일과 12일 사이에서 GPC 및 NP에 대해 매우 약하고 일시적인 CD8 및 CD4 반응 만을 경험하였다(도 21, 적색 바아).
CD8 반응의 강도는 Ki67 염색에 의해 평가된 이러한 세포의 증식과 관련되었으며(도 22a), 15일째에서만 중간의 증식 피크를 가진 대조군 동물 및 MeV-Z+GPCLASV 면역화된 동물과 비교하여 9일까지 MeV-NPExoN+GPCLASV 면역화된 동물에서는 CD8 T 세포가 강력히 증식하였다(오렌지색 바아를 적색 및 녹색 바아 각각과 비교함). 이러한 증식은 또한 면역화된 동물에서 그랜자임 B의 조기 및 풍부한 발현에 의해 나타난 바와 같이, CD8 및 CD4 T 세포 반응, 및 대조군 동물 및 MeV-NPExoN+GPCLASV 면역화된 동물에서의 지연된 반응의 세포독성 표현형과 관련되었다(도 22b 및 c, 오렌지색 바아와 녹색 바아를 비교).
LASV로 챌린지된 동물에서 LASV GP- 및 NP-특이적인 T 세포에 관한 데이터를 모니터링하였다. 사이토킨의 생산은 챌린지 후 LASV Z 펩타이드를 사용한 PBMC의 자극 후 관찰되지 않았다(데이타는 나타내지 않음). 챌린지된 동물에서 사이토킨을 생산하는 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 유도는 도 23 및 24 각각에 나타낸다. MeV로 면역화된 동물에서, 유의적인 양의 반응하는 세포는 발견되지 않았다. MeV-NPExoN+GPCLASV로 면역화된 동물에서 LASV GPC 펩타이드에 대한 반응에 있어서, GPC 펩타이드에 대한 반응시 사이토킨을 생산하는 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 퍼센트는 챌린지 12일 후에 각각 2% 및 0.6%로 상승한 후, 22일까지 기본 수준으로 회복되었다. IFNg 만으로 생산된 T 세포의 주요 부분, 그러나 적어도 2개의 사이토킨을 생산하는 다기능성 CD8+ 및 CD4+ T 세포(Pf-T)의 비율은 12일로부터 30일까지 증가하였다. CD4+ T 세포 그룹 내에서, IFNg-생산 세포의 퍼센트는 챌린지 30일 후까지 감소하였지만, 반대로 Pf-T에 대해서는 59%까지 증가하는 것이 관찰되었다. MeV-Z+GPCLASV로 면역화된 동물에서, 중간 수의 사이토킨 생산 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 15일 및 12일 각각으로부터 관찰되었다. 대부분의 T 세포는 IFNg 만을 생산하였으며, Pf-T의 비는 CD8+ T 세포의 경우 대략 20%로 남았지만, CD4+ T 세포의 경우 40%까지 상승하였다. 챌린지 30일 후에, 및 모든 면역화된 원숭이의 경우, T 세포의 인지가능한 부분은 TNFa 만을 생산하였다.
LASV NP 펩타이드에 대한 반응시, MeV로 면역화시킨 동물로부터 미량의 사이토킨-생산 T 세포는 챌린지 15일 후에만 검출되었다. MeV-Z+GPCLASV로 면역화시킨 동물로부터의 반응하는 T 세포는 챌린지 6일 후 바로 검출되었으며, 12일에 최고 반응을 나타내었다. T 세포의 표현형은 6일 후 다양하였지만, 9일째에, 주로 TNFa-분비 T 세포가 존재하였다. 12일 째에, IFNg-생산 T 세포가 우세했던 반면 Pf-T 비율은 30일까지 증가하였다.
MeV-NPExoN+GPCLASV 및 MeV-Z+GPCLASV로 면역화된 원숭이의 PBMC의 총 세포 RNA 함량을 또한 면역화 후 상이한 시점에 추출하여 RNAseq를 수행하였고 상이한 시점에서 PBMC 속의 유전자의 차등적인 발현을 분석하였다. 차등적으로 발현된 유전자에 있어서 농축 분석을 클러스터프로파일러(ClusterProfiler)(KEGG 분석)을 사용하여 수행함으로써 이러한 유전자와 관련된 경로를 확인하였다. MeV-N PExoN+GPCLASV 및 MeV-Z+GPCLASV로 면역화 후 시간을 통해 차등적으로 조절된 경로는 도 25 및 26에 각각 나타내었다. MeV-NPExoN+GPCLASV로 면역화된 동물에서, 면역 반응에 포함된 경로는 면역화 후 첫째주에 활성화된다(D2 대 DO, D4 대 DO 및 D7 대 DO). 조혈 세포 계통의 활성화 및 포스포리파제 D 경로는 식균작용 기능(FC 감마 R-매개된 식균작용) 및 케모킨 신호전달과 관련된 처음 4일 동안의 면역 세포의 강력한 증식을 시사한다. 7일까지 Th1, Th2 및 Th17의 증가된 반응은 T 세포 증식을 시사한다. 면역화 후 2번째 주 동안, 면역 반응의 조절과 관련된 경로, 특히 유비퀴틴-매개된 단백질분해, NF-kB 신호전달 및 11-17 신호전달 경로가 활성화된다. MeV-Z+GPCLASV를 사용한 면역화는 MeV-NPExoN+GPCLASV를 사용하여 면역화한 동물에서 관찰된 결과와 비교하여 면역화 4일 후 및 이후 NF-kB 및 IL-17 신호전달 경로의 이후 활성화(14일 째에)에서, 보다 약한 면역 반응을 유도하는 것으로 여겨진다. 이와 함께, 상이한 경로의 활성화는 면역화에 대해 활성적이고 효과적인 세포 반응을 뒷받침한다.
면역화 후 및 LASV 챌린지 후 동물의 혈장 속에서 가용성 매개인자의 방출이 관찰되었다. 루미넥스 검정(Luminex assay)을 사용하여 정량화된 29개의 분석물 중에서, 가용성 매개인자의 수준에 있어서의 차이는 면역화 후 동물들 사이에서 발견되지 않았다(데이타는 나타내지 않음). 챌린지된 동물(도 27)에서, IFNg의 일시적인 방출이 모든 동물의 혈장에서 검출되었으며, 이러한 수준은 면역화된 동물 및 MeV-대조군 각각에서 6일 9일 감염 후 최고이었다. 보다 낮은 농도는 그럼에도 불구하고 MeV-NPExoN+GPCLASV로 면역화된 원숭이의 혈장에서 관찰되었다. 퍼포린의 농도는 모든 동물에서 9일 또는 12일까지 상승하였으며, 이후 22일까지 낮은 수준으로 감소하였다. 다시 한번, MeV-NPEXON+GPCLASV로 면역화된 원숭이에서 관찰된 수준은 더 낮았다. 상승된 가용성 CD137(sCD137) 수준은 감염 9일 후 MeV 및 MeV-Z+GPCLASV로 면역화된 동물에서 관찰되었지만, 단지 중간 농도의 sCD137가 MeV-NPExoN+GPCLASV로 면역화된 동물에서 관찰되었다. IL-6는 6일까지 모든 동물의 혈장에서 나타났으며, MeV 및 MeV-Z+GPCLASV로 예방접종한 동물에서 9일째까지 여전히 존재한 반면, 이는 MeV-NPExoN+GPCLASV로 면역화시킨 동물의 혈장 속에서 더 이상 검출되지 않았다. IL-6 수준은 MeV-동물의 혈장 속에서 여전히 증가하였지만, 이러한 증가는 MeV-Z+GPCLASV로 면역화된 동물의 혈장 속에서 중간이었다. 상승된 양의 IL-8은 6일로부터 MeV 및 MeV-Z+GPCLASV로 면역화시킨 동물의 혈장에서 관찰되었지만, 낮은 농도 만은 9일과 12일 사이에 MeV-NPExoN+GPCLASV 원숭이에서 검출되었다. IL-18은 MeV-N PEXON+GPCLASV 원숭이에서는 검출되지 않았지만, 고 수준 및 저 수준은 MeV 및 MeV-Z+GPCLASV 각각으로 면역화시킨 동물에서 검출되었다. MCP1은 MeV-NPExoN+GPCLASV 원숭이에서 기본 수준으로 남아있다. 대조적으로, 고 농도는 6일 및 9일 각각으로부터 출발하여 MeV 및 MeV-Z+GPCLASV 동물에서 발견되었다. IL-10 및 IL-1 수용체 길항제(IL-1 RA)의 수준은 9일까지 MeV-Z+GPCLASV 원숭이에서 증가한 다음, 감소하여 22일째에 저 수준에 도달하였다. IL-10 및 IL-1 RA 수준은 MeV 동물에서 여전시 증가하였지만, 소량의 경우 6일 후에 검출되었고, IL-10 및 IL-1 RA는 MeV-NPExoN+GPCLASV로 면역화시킨 동물의 혈장에서 방출되지 않았다.
실시예 6: MeV에 대한 면역 반응
MeV-특이적인 면역글로불린에 대해 생산된 MeV-특이적인 면역글로불린의 수준을 또한 챌린지 후 ELISA로 평가하였다(도 28a: IgM 및 28b: IgG). IgM 및 IgG MeV-특이적인 것은 모든 동물에서 생산된다(MeV 그룹, MeV-NPExoN+GPCLASV 그룹; MeV-Z+GPCLASV 그룹). 유사한 MeV-특이적인 IgM 및 IgG 반응은 MeV-NPExoN-GPCLASV, MeV-Z+GPCLASV 및 MeV 백신에 의해 유도된다(도 28). 이러한 동물은 MeV로 예방접종하였으며(도 28), MeV-N PEXON+GPCLASV 또는 MeV-Z+GPCLASV로 예방접종한 동물은 LASV(참고: 도 15) 및 MeV(도 28)에 대해 예방접종하였다.
실시예 7: MeV-LASV의 백신 균주의 향성
MeV-LASV의 향성을 분석하였다. 라싸 바이러스는 수용체로서 α-다이스트로글리칸(α-DG)을 사용한다. MeV의 백신 균주는 수용체로서 CD46, SLAM 및 넥틴-4를 사용한다. 모페이아(Mopeia) 바이러스는 라싸 항원의 MeV 벡터내로의 도입이 MeV의 백신 균주의 향성에 영향을 갖는 경우에 분석에 대한 대조군으로서 사용하였다. 모페아 바이러스는 라싸 바이스와 밀접하게 관련된 아레나바이러스이며, 동일한 수용체를 사용한다. 라싸 바이러스 GPC와 슈도형(pseudotyped)인 모페이아 바이러스는 도 30에 나타낸 바와 같이, α-DC를 발현하는 CHO-K1 세포 내에서 및 α-DC와 사람 CD46을 발현하는 CHO-hCD46 세포내에서 복제하며, 여기서 항-GP1을 사용한 염색은 세포주 둘 다에서 양성이다. 대조적으로, MeV-NPExoN+GPCLASV는 CHO-K1 세포 내에서 복제하는 반면, 이는 CHO-hCD46 세포주 내에서 복제한다(도 30, 하부 사진). 따라서, 라싸 항원의 MeV 벡터 내로의 도입은 MeV의 향상을 연장시키지 않는다.
결론
결론적으로, MeV-NPExoN+GPCLASV 및 MeV-Z+GPCLASV 백신 둘 모두는 비-사람 영장류에서 안전하고, 면역원성이며 효율적이었다. 둘 모두는 단일 면역화 후 LASV 균주조시아를 사용한 치사 챌린지에 대해 시노몰구스 마카퀴를 보호하였다. 그러나, MeV-NPExoN+GPCLASV는 모든 예방접종된 원숭이에서 풍부한 T 세포 반응 및 거의 멸균화 면역성을 지닌 가장 우수한 보호를 부여하였다. 따라서, 이러한 벡터는 사람에서 임상 시험에 앞서 선택 후보물이다. 챌린지 전에 이러한 벡터의 면역원성은 프라임/부스트 전략에 의해 확실히 개선될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명자는 단일 면역화가 챌린지 동물의 100%를 보호할 수 있다는 원리의 증거를 본원에 제공한다. 또한, 이러한 벡터는 홍역에 대해 원숭이를 보호할 수 있으므로, 응급 백신 외에, LASV 및 MeV 둘 다가 주요 공중 보건 문제가 되는 풍토성 국가에서 2가 백신으로서 사용될 수 있다.
서열 번호: 1
서열 번호: 1은 서열 번호: 2의 코돈-최적화된 서열에 의해 암호화된 라싸 바이러스 균주 조시아의 재조합 GPC 단백질에 상응한다.
Figure pct00002
서열 번호: 2
서열 번호: 2는 서열 번호: 1의 GPC 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열에 상응한다.
Figure pct00003
서열 번호: 3
서열 번호: 3은 서열 번호: 4의 코돈-최적화된 서열에 의해 암호화된 라싸 바이러스 균주 조시아의 재조합 NP 단백질에 상응한다.
Figure pct00004
서열 번호: 4
서열 번호: 4는 서열 번호: 3의 NP 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열에 상응한다.
Figure pct00005
Figure pct00006
서열 번호: 5
서열 번호: 5는 서열 번호: 6의 코돈-최적화된 서열에 의해 암호화된 라싸 바이러스 균주 조시아의 재조합 돌연변이된 NP 단백질에 상응하며, 여기서 NP 단백질의 엑소뉴클레아제 활성은 녹 다운되어 있다. 아미노산 388번 및 아미노산 391번은 돌연변이되었다(M388D 및 E391G).
Figure pct00007
서열 번호: 6
서열 번호: 6은 서열 번호: 5의 돌연변이된 NP 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 뉴클레오타이드에 상응한다. 뉴클레오타이드 11661번, 1175번 및 1176번은 돌연변이되었다(C1166A, C1175G 및 C1176A).
Figure pct00008
Figure pct00009
서열 번호: 7
서열 번호: 7은 서열 번호: 8의 코돈-최적화된 서열에 의해 암호화된 라싸 바이러스 균주 조시아의 재조합 Z 단백질에 상응한다.
Figure pct00010
서열 번호: 8
서열 번호: 8은 서열 번호: 7의 Z 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 뉴클레오타이드 서열에 상응한다.
Figure pct00011
서지 참고문헌
Figure pct00012
Figure pct00013
SEQUENCE LISTING <110> INSTITUT PASTEUR CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE <120> LASSA VACCINE <130> IP20203837FR <140> PCT/FRXX XXX XXX <141> 2018-12-20 <150> US 62/609155 <151> 2017-12-21 <160> 17 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 491 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein GPC <400> 1 Met Gly Gln Ile Val Thr Phe Phe Gln Glu Val Pro His Val Ile Glu 1 5 10 15 Glu Val Met Asn Ile Val Leu Ile Ala Leu Ser Val Leu Ala Val Leu 20 25 30 Lys Gly Leu Tyr Asn Phe Ala Thr Cys Gly Leu Val Gly Leu Val Thr 35 40 45 Phe Leu Leu Leu Cys Gly Arg Ser Cys Thr Thr Ser Leu Tyr Lys Gly 50 55 60 Val Tyr Glu Leu Gln Thr Leu Glu Leu Asn Met Glu Thr Leu Asn Met 65 70 75 80 Thr Met Pro Leu Ser Cys Thr Lys Asn Asn Ser His His Tyr Ile Met 85 90 95 Val Gly Asn Glu Thr Gly Leu Glu Leu Thr Leu Thr Asn Thr Ser Ile 100 105 110 Ile Asn His Lys Phe Cys Asn Leu Ser Asp Ala His Lys Lys Asn Leu 115 120 125 Tyr Asp His Ala Leu Met Ser Ile Ile Ser Thr Phe His Leu Ser Ile 130 135 140 Pro Asn Phe 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acctgagaga cattatgggc 1080 atcccctact gtaattacag caagtattgg tacctgaacc acactacaac cgggagaaca 1140 tccctgccca agtgctggct ggtcagcaat gggagttatc tgaatgaaac ccatttcagc 1200 gacgatatcg aacagcaggc tgacaacatg atcacagaga tgctgcagaa agagtacatg 1260 gaaagacagg gcaagacacc actgggactg gtcgatctgt tcgtcttctc cactagcttc 1320 tatctgattt ccatcttcct gcacctggtg aagatcccca ctcataggca cattgtcggc 1380 aagagttgcc ctaaacccca taggctgaat cacatgggga tttgtagttg cggcctgtat 1440 aagcagcctg gcgtgcctgt gaaatggaag agatga 1476 <210> 3 <211> 569 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein NP <400> 3 Met Ser Ala Ser Lys Glu Ile Lys Ser Phe Leu Trp Thr Gln Ser Leu 1 5 10 15 Arg Arg Glu Leu Ser Gly Tyr Cys Ser Asn Ile Lys Leu Gln Val Val 20 25 30 Lys Asp Ala Gln Ala Leu Leu His Gly Leu Asp Phe Ser Glu Val Ser 35 40 45 Asn Val Gln Arg Leu Met Arg Lys Glu Arg Arg Asp Asp Asn Asp Leu 50 55 60 Lys Arg Leu Arg Asp Leu Asn Gln Ala Val Asn Asn Leu Val Glu Leu 65 70 75 80 Lys Ser Thr Gln Gln Lys Ser Ile Leu Arg Val Gly 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accagttcgg gaccatgcca 540 agtctgacac tggcatgcct gactaaacag ggccaggtgg atctgaatga tgcagtccag 600 gctctgaccg acctgggcct gatctacacc gccaagtacc ccaatactag cgacctggat 660 agactgaccc agagccaccc catcctgaac atgatcgaca ctaagaagtc ctcactgaac 720 atcagtggct ataatttctc cctgggggca gcagtcaagg ctggcgcatg catgctggac 780 ggcgggaata tgctggaaac catcaaagtg tctccccaga ccatggatgg catcctgaaa 840 tctattctga aagtcaagaa ggccctggga atgtttattt cagacacccc cggcgagagg 900 aatccatatg agaacattct gtataagatt tgcctgagtg gcgacgggtg gccatacatt 960 gcaagccgga catcaattac cggaagagct tgggagaata cagtcgtgga cctggaaagc 1020 gacggcaagc cccagaaggc cgactcaaac aactcctcaa agagtctgca gtcagctggc 1080 ttcacagcag ggctgactta ctcccagctg atgacactga aggacgcaat gctgcagctg 1140 gacccaaacg ctaagacatg gatggacatc gagggacggc cagaagatcc agtggaaatc 1200 gcactgtatc agccatcatc cggatgctat atccatttct tccgggaacc aactgatctg 1260 aagcagttca agcaggatgc aaagtactcc cacggaatcg atgtcaccga tctgttcgca 1320 acccagccag gactgacatc agccgtcatc gatgccctgc ctaggaacat 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atctgaatga tgcagtccag 600 gctctgaccg acctgggcct gatctacacc gccaagtacc ccaatactag cgacctggat 660 agactgaccc agagccaccc catcctgaac atgatcgaca ctaagaagtc ctcactgaac 720 atcagtggct ataatttctc cctgggggca gcagtcaagg ctggcgcatg catgctggac 780 ggcgggaata tgctggaaac catcaaagtg tctccccaga ccatggatgg catcctgaaa 840 tctattctga aagtcaagaa ggccctggga atgtttattt cagacacccc cggcgagagg 900 aatccatatg agaacattct gtataagatt tgcctgagtg gcgacgggtg gccatacatt 960 gcaagccgga catcaattac cggaagagct tgggagaata cagtcgtgga cctggaaagc 1020 gacggcaagc cccagaaggc cgactcaaac aactcctcaa agagtctgca gtcagctggc 1080 ttcacagcag ggctgactta ctcccagctg atgacactga aggacgcaat gctgcagctg 1140 gacccaaacg ctaagacatg gatggccatc gaggcccggc cagaagatcc agtggaaatc 1200 gcactgtatc agccatcatc cggatgctat atccatttct tccgggaacc aactgatctg 1260 aagcagttca agcaggatgc aaagtactcc cacggaatcg atgtcaccga tctgttcgca 1320 acccagccag gactgacatc agccgtcatc gatgccctgc ctaggaacat ggtcattact 1380 tgccagggct ccgacgatat taggaagctg ctggagagcc agggacggaa 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cgagtggcga ggtataccac aatctccaac 13260 gacaatctct catttgtcat atcagataag aaggttgata ctaactttat ataccaacaa 13320 ggaatgcttc tagggttggg tgttttagaa acattgtttc gactcgagaa agataccgga 13380 tcatctaaca cggtattaca tcttcacgtc gaaacagatt gttgcgtgat cccgatgata 13440 gatcatccca ggatacccag ctcccgcaag ctagagctga gggcagagct atgtaccaac 13500 ccattgatat atgataatgc acctttaatt gacagagatg caacaaggct atacacccag 13560 agccatagga ggcaccttgt ggaatttgtt acatggtcca caccccaact atatcacatt 13620 ttagctaagt ccacagcact atctatgatt gacctggtaa caaaatttga gaaggaccat 13680 atgaatgaaa tttcagctct cataggggat gacgatatca atagtttcat aactgagttt 13740 ctgctcatag agccaagatt attcactatc tacttgggcc agtgtgcggc catcaattgg 13800 gcatttgatg tacattatca tagaccatca gggaaatatc agatgggtga gctgttgtca 13860 tcgttccttt ctagaatgag caaaggagtg tttaaggtgc ttgtcaatgc tctaagccac 13920 ccaaagatct acaagaaatt ctggcattgt ggtattatag agcctatcca tggtccttca 13980 cttgatgctc aaaacttgca cacaactgtg tgcaacatgg tttacacatg ctatatgacc 14040 tacctcgacc tgttgttgaa 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gtgtagattg cttcaatttc atagttagta atatccctac ctctagtgtg 14940 gggtttatcc attcagatat agagaccttg cctgacaaag atactataga gaagctagag 15000 gaattggcag ccatcttatc gatggctctg ctcctgggca aaataggatc aatactggtg 15060 attaagctta tgcctttcag cggggatttt gttcagggat ttataagtta tgtagggtct 15120 cattatagag aagtgaacct tgtataccct agatacagca acttcatctc tactgaatct 15180 tatttggtta tgacagatct caaggctaac cggctaatga atcctgaaaa gattaagcag 15240 cagataattg aatcatctgt gaggacttca cctggactta taggtcacat cctatccatt 15300 aagcaactaa gctgcataca agcaattgtg ggagacgcag ttagtagagg tgatatcaat 15360 cctactctga aaaaacttac acctatagag caggtgctga tcaattgcgg gttggcaatt 15420 aacggaccta agctgtgcaa agaattgatc caccatgatg ttgcctcagg gcaagatgga 15480 ttgcttaatt ctatactcat cctctacagg gagttggcaa gattcaaaga caaccaaaga 15540 agtcaacaag ggatgttcca cgcttacccc gtattggtaa gtagcaggca acgagaactt 15600 atatctagga tcacccgcaa attctggggg cacattcttc tttactccgg gaacaaaaag 15660 ttgataaata agtttatcca gaatctcaag tccggctatc tgatactaga cttacaccag 15720 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gcggtatcag 16560 ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 16620 tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 16680 tccataggct cggcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 16740 gaaacccgac aggactataa agataccagg cgttcccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 16800 ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 16860 tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 16920 agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 16980 atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 17040 acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 17100 actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct 17160 tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt 17220 tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga 17280 tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca 17340 tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 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without insert <400> 16 cttaggaacc aggtccacac agccgccagc ccatcaacgc gtacgatgta ggcgcgcagc 60 gcttagacgt ctcgcgatcg atactagtac aacctaaatc cattataaaa aactt 115 <210> 17 <211> 1591 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATU sequence with codon-optimized cDNA GPC insert <400> 17 cttaggaacc aggtccacac agccgccagc ccatcaacgc gtacgatgat gggccagatt 60 gtcacattct ttcaggaagt gccacacgtc attgaggagg tcatgaacat cgtgctgatt 120 gctctgtcag tgctggcagt gctgaaagga ctgtacaact tcgctacctg tggactggtg 180 ggactggtca cattcctgct gctgtgcggc agaagttgca ctacctcact gtacaaagga 240 gtgtacgagc tgcagactct ggaactgaac atggagacac tgaatatgac aatgcctctg 300 agctgcacca agaataatag ccaccactat atcatggtcg ggaacgaaac cggcctggaa 360 ctgaccctga caaacaccag catcattaac cacaagttct gcaatctgag cgacgctcac 420 aagaagaacc tgtatgacca cgctctgatg tccatcatca gtacctttca cctgtccatc 480 cccaatttca accagtacga ggcaatgtca tgcgacttca acgggggcaa gatcagtgtc 540 cagtacaacc tgagccactc ctacgccggc gacgcagcca accactgcgg aactgtcgcc 600 aatggcgtgc tgcagacatt catgaggatg gcatgggggg gatcttacat cgcactggat 660 agcggcaggg gcaattggga ttgcatcatg acttcctatc agtatctgat tatccagaat 720 actacatggg aggatcattg ccagttcagt cggcccagcc ctattggata tctggggctg 780 ctgtcacaga gaacacggga tatctatatt tcaagacgcc tgctgggcac attcacttgg 840 acactgtcag acagtgaggg caaggatact ccagggggct actgcctgac acgatggatg 900 ctgatcgaag cagagctgaa atgcttcggc aataccgcag tggccaagtg caacgagaaa 960 cacgacgagg agttctgcga catgctgagg ctgttcgact tcaacaaaca ggctatccag 1020 agactgaagg cagaagccca gatgtcaatc cagctgatca acaaggcagt gaacgccctg 1080 atcaacgacc agctgatcat gaagaaccac ctgagagaca ttatgggcat cccctactgt 1140 aattacagca agtattggta cctgaaccac actacaaccg ggagaacatc cctgcccaag 1200 tgctggctgg tcagcaatgg gagttatctg aatgaaaccc atttcagcga cgatatcgaa 1260 cagcaggctg acaacatgat cacagagatg ctgcagaaag agtacatgga aagacagggc 1320 aagacaccac tgggactggt cgatctgttc gtcttctcca ctagcttcta tctgatttcc 1380 atcttcctgc acctggtgaa gatccccact cataggcaca ttgtcggcaa gagttgccct 1440 aaaccccata ggctgaatca catggggatt tgtagttgcg gcctgtataa gcagcctggc 1500 gtgcctgtga aatggaagag atgataggcg cgcagcgctt agacgtctcg cgatcgatac 1560 tagtacaacc taaatccatt ataaaaaact t 1591

Claims (30)

  1. 하기를 포함하는 핵산 작제물:
    (1) 홍역 바이러스(MeV)의 완전한 길이(full length)의 항게놈성 (+) RNA 가닥을 암호화하는 cDNA 분자;
    (2) 라싸 바이러스(Lassa virus(LASV))의 적어도 하나의 폴리펩타이드, 또는 이의 항원성 단편을 암호화하는 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드로, 상기 적어도 하나의 폴리펩타이드가 핵단백질(NP), 돌연변이된 핵단백질(mNP), 당단백질 전구체(GPC) 및 아연-결합 단백질(Z)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드,
    상기에서 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드는, 항게놈성 (+) RNA의 cDNA 내에 삽입된 추가의 전사 단위(ATU)내에, 특히 MeV의 P 유전자와 M 유전자 사이에 국재화된 ATU 내에, 특히 MeV의 P 유전자와 M 유전자 사이에 삽입된 ATU2 내에, 작동적으로 클로닝됨.
  2. 제1항에 있어서,
    LASV의 적어도 하나의 폴리펩타이드, 또는 이의 항원성 단편을 암호화하는 제2의 이종 폴리뉴클레오타이드를 추가로 포함하고, 상기 적어도 하나의 폴리펩타이드는 GPC 단백질, NP 단백질, mNP 단백질 및 Z 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 제2의 이종 폴리뉴클레오타이드는 제1의 클로닝된 이종 폴리뉴클레오타이드의 위치로부터 구별되는 위치, 우선적으로는(preferentially) MeV의 N 유전자의 상부에서의 다른 ATU 내에서 작동적으로 클로닝되며, 상기 다른 ATU는 특히 MeV의 N 유전자의 상부에 삽입된 ATU1이고, 특히 상기 제2의 이종 폴리뉴클레오타이드는 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 적어도 하나의 폴리펩타이드와는 상이한 적어도 하나의 폴리펩타이드 또는 이의 항원성 단편을 암호화하는, 핵산 작제물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, GPC 단백질, NP 단백질, mNP 및/또는 Z 단백질, 또는 이들의 항원성 단편을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오타이드(들)이 LASV 균주 조시아(Josiah)로부터이거나 LASV 균주 조시아로부터 유래되고, 특히 이종 폴리뉴클레오타이드(들)이 Genbank J04324.1 및/또는 U73034.2의 서열로부터 생성(issued)되거나 유래되는(derived), 핵산 작제물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 및/또는 제2의 이종 폴리뉴클레오타이드(들)이 mNP 단백질, 또는 이의 항원성 단편을 암호화하고, mNP 단백질은 돌연변이된 엑소뉴클레아제 도메인을 가지며, 특히 암호화된 mNP 단백질의 아미노산 서열은 우선적으로(preferentially) 서열 번호: 3의 아미노산 잔기 389번 및 392번 상에서의 치환에 의해, 아미노산 잔기 389번 및/또는 392번에서 돌연변이되고, 특히 암호화된 mNP 단백질은 서열 번호: 5의 서열이며, 특히 mNP 단백질을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호: 6을 포함하는, 핵산 작제물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, GPC 단백질, NP 단백질, mNP 단백질 및/또는 Z 단백질, 또는 이들의 항원성 단편을 암호화하는 이종 폴리뉴클레오타이드(들)이 코돈-최적화된 개방 판독 프레인(들)(ORF)을 갖고, 특히 이종 폴리뉴클레오타이드(들)이 다음 서열 중 적어도 하나를 포함하는, 핵산 작제물:
    - GPC 단백질을 암호화하는 서열 번호: 2; 및/또는
    - NP 단백질을 암호화하는 서열 번호: 4; 및/또는
    - mNP 단백질을 암호화하는 서열 번호: 6; 및/또는
    - Z 단백질을 암호화하는 서열 번호: 8.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 폴리뉴클레오타이드(들)이,
    서열 번호: 1의 GPC 단백질 또는 이의 항원성 단편; 및/또는
    서열 번호: 3의 NP 단백질 또는 이의 항원성 단편; 및/또는
    서열 번호: 5의 mNP 단백질 또는 이의 항원성 단편; 및/또는
    서열 번호: 7의 Z 단백질 또는 이의 항원성 단편,을 암호화하는, 핵산 작제물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 5'로부터 3' 말단으로 하기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 작제물:
    (a) MeV의 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
    (b) MeV의 P 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
    (c) LASV의 GPC 단백질, NP 단백질, mNP 단백질 및 Z 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩타이드 또는 이의 항원성 단편을 암호화, 특히 GPC 단백질 또는 이의 항원성 단편인 단일 폴리펩타이드를 암호화하거나, 또는 GPC 단백질 또는 이의 항원성 단편과 NP 단백질 또는 mNP 단백질, 또는 이들의 항원성 단편인 적어도 2개의 폴리펩타이드를 암호화, 특히 GPC 단백질과 mNP 단백질을 암호화하는 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드로, 상기 제1의 폴리뉴클레오타이드는 특히 ATU, 특히 ATU2 내에서 작동적으로 클로닝되는, 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드;
    (d) Mev의 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
    (e) Mev의 F 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
    (f) MeV의 H 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
    (g) MeV의 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,
    상기 폴리뉴클레오타이드는 핵산 작제물 내에서 및 MeV 리더 및 트레일러 서열(trailer sequence)(들)과 같은 바이러스 복제 및 전사 조절 인자의 제어 하에서 작동적으로 연결됨.
  8. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 5'로부터 3' 말단으로 하기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 핵산 작제물:
    (a) LASV의 GPC 단백질, NP 단백질, mNP 단백질 및 Z 단백질, 또는 이들의 항원성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화하고, 특히 Z 단백질, 또는 이의 항원성 단편을 암호화하는 제2의 이종 폴리뉴클레오타이드로, 상기 제2의 폴리뉴클레오타이드는 MeV의 N 유전자의 상부에 국재화된 ATU 내에서, 특히 ATU1 내에서 작동적으로 클로닝되는, 제2의 폴리뉴클레오타이드;
    (b) MeV의 N 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
    (c) MeV의 P 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
    (d) LASV의 GPC 단백질, NP 단백질, mNP 단백질 및 Z 단백질, 또는 이들의 항원성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩타이드를 암호화, 특히 GPC 단백질 또는 이의 항원성 단편인 단일의 폴리펩타이드를 암호화하거나, 또는 GPC 단백질 또는 이의 항원성 단편과 NP 단백질 또는 mNP 단백질 또는 이의 항원성 단편인 적어도 2개의 폴리펩타이드를 암호화, 특히 GPC 단백질과 mNP 단백질을 암호화하는, 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드로, 상기 제1의 폴리뉴클레오타이드는 특히 ATU, 특히 ATU2 내에서 작동적으로 클로닝되는, 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드;
    (e) MeV의 M 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
    (f) MeV의 F 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
    (g) MeV의 H 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드;
    (h) MeV의 L 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,
    상기 폴리뉴클레오타이드는 핵산 작제물 내에서 및 MeV 리더 및 트레일러 서열(들)과 같은 바이러스 복제 및 전사 조절 인자의 제어 하에서 작동적으로 연결됨.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드가 5'로부터 3' 말단으로:
    (a) LASV의 NP 단백질 또는 mNP 단백질, 또는 이의 항원성 단편을 암호화하고, 특히 이의 핵산이 NP 단백질의 경우 서열 번호: 4이고 mNP 단백질의 경우 서열 번호: 6인, 핵산; 및
    (b) LASV의 GPC 단백질, 또는 이의 항원성 단편을 암호화하고, 특히 서열 번호: 2인 핵산;
    을 포함하고 상기 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드가 MeV의 P 유전자와 M 유전자 사이, 특히 ATU, 특히 ATU2 내에 작동적으로 클로닝되는, 핵산 작제물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드가 5'로부터 3' 말단으로:
    (a) mNP 단백질을 암호화하는 서열 번호: 6의 핵산; 및
    (b) GPC 단백질을 암호화하는 서열 번호: 2의 핵산을 포함하고;
    여기서 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드 서열은 MeV의 P 유전자와 M 유전자 사이, 특히 ATU 내, 특히 ATU2 내에 작동적으로 클로닝되는, 핵산 작제물.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2의 이종 폴리뉴클레오타이드가 LASV의 Z 단백질, 또는 이의 항원성 단편을 암호화하고, 상기 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드가 LASV의 GPC 단백질, 또는 이의 항원성 단편을 암호화하며, 특히 제2의 이종 폴리뉴클레오타이드의 서열이 서열 번호: 8의 서열을 포함하고 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드의 서열이 서열 번호: 2의 서열을 포함하는, 핵산 작제물.
  12. 제11항에 있어서, 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드 및 제2의 이종 폴리뉴클레오타이드가 MeV의 cDNA 분자 내 상이한 위치에 위치한 ATU 내에 작동적으로 클로닝되고, 특히 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드가 ATU2와 작동적으로 클로닝되며 제2의 이종 폴리뉴클레오타이드가 ATU1 내에 작동적으로 클로닝되는 핵산 작제물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 홍역 바이러스가 슈바르츠 균주(Schwarz strain), 자그렙 균주(Zagreb strain), AIK-C 균주, 모라텐 균주(Moraten strain), 필립스 균주(Philips strain), 벡켄햄(Beckenham) 4A 균주, 벡켄햄 16 균주, 에드몬스톤 씨드 A 균주(Edmonston seed A strain), 에드몬스톤 씨드 B 균주(Edmonston seed B strain), CAM-70 균주, TD 97 균주, 레닌그라드-16 균주(Leningrad-16 strain), 상하이 191 균주(Shanghai 191 strain) 및 벨그레이드 균주(Belgrade strain)로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 특히 슈바르츠 균주인, 핵산 작제물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1의 이종 폴리뉴클레오타이드의 서열이 서열 번호: 2, 서열 번호: 4, 서열 번호: 6, 및/또는 서열 번호: 8 중 적어도 하나, 우선적으로(preferentially) 적어도 서열 번호: 2, 특히 서열 번호: 2 및 서열 번호: 6를 포함하는, 핵산 작제물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 작제물의 재조합 cDNA 서열이:
    - 서열 번호: 9(작제물 MeV-GPC);
    - 서열 번호: 10(작제물 MeV-NP-GPC);
    - 서열 번호: 11(작제물 MeV-mNP-GPC);
    - 서열 번호: 12(작제물 Z-MeV-GPC);
    - 서열 번호: 13(작제물 Z-MeV-NP-GPC); 및
    - 서열 번호: 14(작제물 Z-MeV-mNP-GPC)로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 핵산 작제물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물을 포함하고, 특히 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어지는, 전달 플라스미드 벡터(transfer plasmid vector):
    - 서열 번호: 9(Plasm MeV-GPC);
    - 서열 번호: 10(Plasm MeV-NP-GPC);
    - 서열 번호: 11(Plasm MeV-mNP-GPC);
    - 서열 번호: 12(Plasm Z-MeV-GPC);
    - 서열 번호: 13(Plasm Z-MeV-NP-GPC); 및
    - 서열 번호: 14(Plasm Z-MeV-mNP-GPC).
  17. 재조합 홍역 바이러스로서, 상기 바이러스가 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물, 또는 제16항에 따른 전달 플라스미드 벡터를 이의 게놈 내에 포함하거나, 이의 게놈이 제16항에 따른 전달 플라스미드 벡터로 이루어지는, 재조합 홍역 바이러스.
  18. 제17항에 있어서, LASV의 GPC 단백질, NP 단백질, mNP 단백질 및 Z 단백질, 또는 이들의 항원성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 폴리펩타이드를 발현하고, 특히 LASV의 GPC 단백질, NP 단백질, mNP 단백질 및 Z 단백질, 또는 이들의 항원성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 폴리펩타이드를 발현하는, 재조합 홍역 바이러스.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, LASV의 GPC 단백질 및 mNP 단백질, 또는 이들의 항원성 단편을 발현하는, 재조합 홍역 바이러스.
  20. 제17항 또는 제18항에 있어서, LASV의 GPC 단백질 및 Z 단백질, 또는 이들의 항원성 단편을 발현하는, 재조합 홍역 바이러스.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, MeV의 N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, H 단백질 및 L 단백질 중 적어도 하나를 추가로 발현하는, 재조합 홍역 바이러스.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 특히 단일 면역화 후, LASV의 GPC 단백질, NP 단백질, mNP 단백질 및/또는 Z 단백질의 항원성 단편(들)에 대해, 특히 MeV의 N 단백질, P 단백질, M 단백질, F 단백질, H 단백질 및/또는 L 단백질에 대해, 세포 및/또는 체액성 및 세포 반응을, 특히 T 세포 반응을, 특히 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 유발하는, 재조합 홍역 바이러스.
  23. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물 또는 제16항에 따른 전달 플라스미드 벡터로 형질감염되거나, 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 재조합 홍역 바이러스로 감염된 숙주 세포, 특히 포유동물 세포, VERO NK 세포, CEF 세포, 사람 배아 신장 세포주 293 또는 MRC5 세포인, 숙주 세포.
  24. LASV의 Z 단백질 및 임의로 GPC 단백질 및/또는 NP 단백질 및/또는 mNP 단백질, 또는 이들의 항원성 단편을 포함하고, 특히 적어도 Z 단백질 및 GPC 단백질, 또는 이들의 항원성 단편을 발현하며, 상기 단백질(들) 또는 이의 항원성 단편이 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물, 또는 제16항에 따른 전달 플라스미드 벡터, 또는 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 재조합 홍역 바이러스의 제1 및/또는 제2의 이종 폴리뉴클레오타이드(들)에 의해 암호화되거나, 제23항의 숙주 세포 내에서 생산되는, 재조합 바이러스 유사 입자(VLP).
  25. 제24항에 따른 재조합 VLP, 또는 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 재조합 홍역 바이러스, 또는 제24항에 따른 재조합 VLP와 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 재조합 홍역 바이러스를 포함하고, 약제학적으로 허용되는 비히클을 포함하는, 면역원성 조성물, 특히 바이러스 백신 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 이를 필요로 하는 숙주, 특히 사람 숙주, 특히 어린이에서, LASV 단백질(들) 또는 이의 항원성 단편(들)에 대해 지시된 항체의 유발에 의한 라싸 바이러스에 대한 보호성, 및 우선적으로 예방적, 면역 반응을, 및/또는 라싸 바이러스에 대한 체액성 및 세포 반응을 유발시키는데 사용하기 위한, 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 이를 필요로 하는 숙주, 특히 사람 숙주, 특히 어린이에서, 홍역 바이러스 단백질(들)에 대해 지시된 항체의 유발에 의한 홍역 바이러스에 대한 보호성, 및 우선적으로 예방적, 면역 반응, 및/또는 홍역 바이러스에 대한 체액성 및 세포 반응을 유발시키는데 사용하기 위한, 조성물.
  28. (a) T7 RNA 폴리머라제 및 홍역 바이러스 N 및 P 단백질을 안정하게 발현하는 세포, 특히 헬퍼 세포, 특히 HEK293 헬퍼 세포를 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 핵산 작제물 또는 제16항에 다른 전달 플라스미드 벡터로 형질감염시키는 단계;
    (b) 형질감염된 세포를 재조합 홍역 바이러스 및/또는 LASV VLP의 생산에 적합한 조건 하에서 유지시키는 단계;
    (c) 재조합 홍역 바이러스 및/또는 LASV VLP의 증식이 가능하도록 하는 세포를 단계 (b)의 형질감염된 세포와 공-배양함으로써 이들을 형질감염시키는 단계;
    (d) LASV의 GPC 단백질, NP 단백질, mNP 단백질 및/또는 Z 단백질 중 적어도 하나를 발현하고, 특히 적어도 GPC 단백질 및 다른 LASV 단백질을 발현하며, 특히 GPC 단백질 및 mNP 단백질을 발현하는 재조합 홍역 바이러스, 및/또는 적어도 Z 단백질 및 임의로 LASV의 GPC 단백질, NP 단백질 및/또는 mNP 단백질 중 적어도 하나를 발현하며, 특히 Z 단백질 및 GPC 단백질을 발현하는 LASV VLP를 수거(harvesting)하는 단계,
    를 포함하는, LASV의 GPC 단백질, NP 단백질, mNP 단백질 및 Z 단백질, 또는 이들의 항원성 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리펩타이드 중 적어도 하나를 발현하는 재조합 라싸 바이러스 유사 입자(VLP) 및/또는 재조합 홍역 바이러스를 구제(rescuing)하는 방법.
  29. 라싸 바이러스 관련 질환을 방지하는 방법으로서, 상기 방법이 제24항에 따른 재조합 라싸 바이러스 VLP, 및/또는 제17항 내지 제22항 중 어느 하나에 따른 홍역 바이러스의 주사, 특히 피하 주사에 의한, 포유동물, 특히 사람, 특히 어린이의 면역화를 포함하는 방법.
  30. 라싸 바이러스 관련 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 제24항에 따른 재조합 라싸 바이러스 VLP, 및/또는 제17항 내지 제22항 중 어느 하나에 따른 홍역 바이러스의 주사, 특히 피하 주사에 의한, 포유동물, 특히 사람, 특히 어린이의 면역화를 포함하는 방법.
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