KR20100084689A - Ｈｃｖ ｎｓ3 단백질분해효소 레플리콘 셔틀 벡터 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 HCV-감염된 환자의 샘플로부터 HCV 폴리뉴클레오타이드 서열을 클로닝하고 약물 감수성에 대해 생성된 레플리콘을 시험하는데 유용한 신규한 HCV NS3 단백질분해효소 레플리콘 셔틀 벡터를 제공한다.
Description
본 발명은 HCV 및 다른 플라비바이러스 단백질분해효소 억제제를 스크리닝하고, 시험하고, 평가하는데 유용한 신규한 HCV NS3 단백질분해효소 레플리콘 셔틀 벡터에 관한 것이다.
C형 간염 바이러스는 주요한 건강 문제이며 세계적인 만성 간 질환의 주 원인이다(문헌[Boyer, N. et al. J. Hepatol. 2000 32:98-112]). HCV로 감염된 환자는 간경화 및 후속 간세포성암종이 발병할 위험이 있으므로, HCV는 간 이식을 위한 주요 지표이다.
세계 보건 기구에 따르면, 세계적으로 2억명 이상의 감염된 개체가 존재하며, 3백만 내지 4백만 명의 사람들이 매년 감염되고 있다. 일단 감염되면, 약 20%의 사람들은 바이러스를 제거하지만 나머지 사람들은 그들의 간의 나머지에 HCV가 잠복할 수 있다. 결국 10 내지 20%의 만성적으로 감염된 개체는 간을 파괴하는 간경화 또는 암이 발병된다. 바이러스 질병은 오염된 혈액 및 혈액 제제 또는 오염된 주사기에 의해, 또는 감염된 모체 또는 보균자 모체로부터 그의 자손으로 성적으로 및 수직으로 비경구 전달된다. 재조합 인터페론-α 단독 또는 뉴클레오사이드 유사체 리바비린과 병용하는 면역요법으로 제한되는, HCV 감염에 대한 현행 치료는 특히 유전자형 1에 대해 제한된 임상 이점을 갖는다. 효과적으로 만성 HCV 감염을 제거하는 개선된 치료제에 대한 요구가 절박하다.
HCV는 속 플라비바이러스(flaviviruses), 페스티바이러스(pestiviruses), 및 C형 간염 바이러스를 포함한 헤파시바이러스(hepaciviruses)를 포함하는 바이러스 과 플라비바이러스과의 일원으로서 분류되어 왔다(문헌[Rice, C. M., Flaviviridae: The viruses and their replication, in: Fields Virology, Editors: Fields, B. N., Knipe, D. M., and Howley, P. M., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa., Chapter 30, 931-959, 1996]). HCV는 대략 9.4kb의 양성-센스 단일-가닥 RNA 게놈을 함유하는 외피보유 바이러스이다. 바이러스 게놈은 5'-비번역 영역(UTR), 대략 3011개의 아미노산의 폴리단백질 전구체를 암호화하는 긴 열린 해독틀, 및 짧은 3'UTR로 구성된다. 5'UTR은 가장 높게 보존된 HCV 게놈 부분이며 폴리단백질 번역의 개시 및 조절에 중요하다.
HCV의 유전적 분석에 의해 DNA 서열에서 30% 초과의 디버전스(divergence)를 보이는 6개의 주요 유전자형이 동정되었다. 각각의 유전자형은 뉴클레오타이드 서열에서 20 내지 25%의 디버전스를 보이는 보다 밀접하게 관련된 일련의 아형을 함유한다(문헌[Simmonds, P. 2004 J. Gen. Virol. 85:3173-88]). 30개 초과의 아형들이 구별되었다. 미국에서 대략 70%의 감염된 개체들은 유형 1a 및 1b 감염을 갖는다. 유형 1b는 아시아에서 가장 만연하는 아형이다(문헌[X. Forns and J. Bukh, Clinics in Liver Disease 1999 3:693-716; J. Bukh et al., Semin. Liv. Dis. 1995 15:41-63]). 불행하게도, 유형 1 감염은 유형 2 또는 3 유전자형보다 현행 요법에 대해 덜 반응한다(문헌[N. N. Zein, Clin. Microbiol. Rev., 2000 13:223-235]).
페스티바이러스 및 헤파시바이러스의 ORF의 비구조 단백질 부분의 유전적 구성 및 폴리단백질 프로세싱은 매우 유사하다. 이들 양성 가닥 RNA 바이러스는 바이러스 복제에 필요한 모든 바이러스 단백질을 암호화하는 단일의 커다란 열린 해독틀(ORF)을 지닌다. 이들 단백질은 세포 및 바이러스-암호화된 단백분해효소 둘 다에 의해 공동- 및 후-번역적으로 프로세싱된 폴리단백질로서 발현되어 성숙 바이러스 단백질을 산출한다. 바이러스 게놈 RNA의 복제를 담당하는 바이러스 단백질은 카복시-말단을 향해 위치한다. ORF의 3분의 2는 비구조(NS) 단백질로서 지칭된다. 페스티바이러스 및 헤파시바이러스 둘 다에 대하여, 성숙 비구조(NS) 단백질은 비구조 단백질 암호화 영역의 아미노-말단으로부터 ORF의 카복시-말단까지의 순차적 순서로 p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및 NS5B로 이루어진다.
페스티바이러스 및 헤파시바이러스의 NS 단백질은 특정 단백질 기능을 특징으로 하는 서열 도메인을 공유한다. 예를 들면, 그룹 둘 다에 대하여 바이러스의 NS3 단백질은 세린 단백분해효소 및 헬리케이스의 아미노산 서열 모티프 특징을 지닌다(문헌[Gorbalenya et al. Nature 1988 333:22; Bazan and Fletterick Virology 1989 171:637-639; Gorbalenya et al. Nucleic Acid Res. 1989 17.3889-3897]). 유사하게, 페스티바이러스 및 헤파시바이러스의 NS5B 단백질은 RNA-지시 RNA 중합효소의 모티프 특징을 갖는다(문헌[Koonin, E. V. and Dolja, V. V. Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol. 1993 28:375-430]).
바이러스의 생체주기에서 페스티바이러스 및 헤파시바이러스의 NS 단백질의 실제 역할 및 기능은 직접적으로 유사하다. 두 경우 모두, NS3 세린 단백분해효소는 ORF에서 그 위치의 하류에서 폴리단백질 전구체의 모든 단백분해적 프로세싱을 담당한다(문헌[Wiskerchen and Collett Virology 1991 184:341-350; Bartenschlager et al. J. Virol. 1993 67:3835-3844; Eckart et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1993 192:399-406; Grakoui et al. J. Virol. 1993 67:2832-2843; Grakoui et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993 90:10583-10587; Ilijikata et al. J. Virol. 1993 67:4665-4675; Tome et al. J. Virol. 1993 67:4017-4026]). 두 경우 모두, NS4A 단백질은 NS3 세린 단백질분해효소와의 보조인자로서 작용한다(문헌[Bartenschlager et al. J. Virol. 1994 68:5045-5055; Failla et al. J. Virol. 1994 68: 3753-3760; Xu et al. J Virol. 1997 71:53 12-5322]). 두 바이러스의 NS3 단백질은 또한 헬리케이스로서 작용한다(문헌[Kim et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1995 215: 160-166; Jin and Peterson Arch. Biochem. Biophys. 1995, 323:47-53; Warrener and Collett J. Virol. 1995 69:1720-1726]). 마지막으로, 페스티바이러스 및 헤파시바이러스의 NS5B 단백질은 예측된 RNS-의존 RNA 중합효소 활성을 갖는다(문헌[Behrens et al. EMBO 1996 15:12-22; Lechmann et al. J. Virol. 1997 71:8416-8428; Yuan et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1997 232:231-235; Hagedorn, PCT WO 97/12033; Zhong et al. J. Virol. 1998 72:9365-9369]).
HCV NS 단백질 3(NS3)은 대부분의 바이러스 효소의 프로세싱을 조장하는 세린 단백질분해효소 활성을 함유하며, 따라서 바이러스 복제 및 감염력에 필수적인 것으로 고려된다. 황열병 바이러스 NS3 단백질분해효소에서의 돌연변이는 바이러스 감염력을 감소시키는 것으로 공지되어 있다(문헌[Chambers et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:8898-8902]). NS3의 첫 번째 181개의 아미노산은 HCV 폴리단백질의 모든 4개의 하류 부위를 프로세싱하는 NS3의 세린 단백질분해효소 도메인을 함유하는 것으로 입증되었다(문헌[Lin et al., J. Virol. 1994 68:8147-8157]). HCV NS3 세린 단백질분해효소 및 그의 관련된 보조인자, NS4A는 모든 바이러스 효소의 프로세싱을 조장하며, 따라서 바이러스 복제에 필수적인 것으로 고려된다. 이러한 프로세싱은, 바이러스 단백질 프로세싱을 억제하는 인간에게서 잠재적인 항바이러스제인 HIV 단백질분해효소 억제제를 프로세싱하는 바이러스 효소와도 관련되는, 인간 면역결핍 바이러스 아스파르틸 단백질분해효소에 의해 수행되는 것과 유사한 것으로 보이며, 바이러스 생체주기의 상기 단계를 차단하여 치료 활성제가 생성되는 것으로 보인다. 따라서, 이는 약물 발견에 매력적인 표적이다.
현재, HCV 감염의 치료에 널리 이용되는 제한된 수의 승인된 요법이 존재한다. HCV의 치료 및 HCV NS5B 중합효소의 억제에 대한 신규한 치료 접근 및 기존 치료 접근이 다음과 같은 문헌에 개괄되어 있다: 문헌[R. G. Gish, Sem. Liver. Dis., 1999 19:5; Di Besceglie, A. M. and Bacon, B. R., Scientific American, October: 1999 80-85; G. Lake-Bakaar, Current and Future Therapy for Chronic Hepatitis C Virus Liver Disease, Curr. Drug Targ. Infect Dis. 2003 3(3):247-253; P. Hoffmann et al., Recent patents on experimental therapy for hepatitis C virus infection (1999-2002), Exp. Opin. Ther. Patents 2003 13(11):1707-1723; F. F. Poordad et al. Developments in Hepatitis C therapy during 2000-2002, Exp. Opin. Emerging Drugs 2003 8(1):9-25; M. P. Walker et al., Promising Candidates for the treatment of chronic hepatitis C, Exp. Opin. Investig. Drugs 2003 12(8):1269-1280; S.-L. Tan et al., Hepatitis C Therapeutics: Current Status and Emerging Strategies, Nature Rev. Drug Discov. 2002 1:867-881; R. De Francesco et al. Approaching a new era for hepatitis C virus therapy: inhibitors of the NS3-4A serine protease and the NS5B RNA-dependent RNA polymerase, Antiviral Res. 2003 58:1-16; Q. M. Wang et al. Hepatitis C virus encoded proteins: targets for antiviral therapy, Drugs of the Future 2000 25(9):933-8-944; J. A. Wu and Z. Hong, Targeting NS5B-Dependent RNA Polymerase for Anti-HCV Chemotherapy Cur. Drug Targ.-Inf. Dis. 2003 3:207-219].
바이러스의 유전적 구성 및 바이러스 단백질의 기능에 대한 향상된 이해에도 불구하고, HCV 복제 및 병인의 근본적인 양상은 알려져 있지 않다. HCV 복제에 대한 실험적 접근을 얻으려는 주요 도전은 감염성 바이러스 입자의 생성을 허용하는 효율적인 세포 주기 시스템이 부족하다. 1차 세포 배양물 및 특정 인간 세포주의 감염이 보고되었지만, 이들 시스템에서 생성된 바이러스의 양 및 HCV 복제의 수준은 너무 낮아서 상세한 분석이 허용되지 못하였다.
인간 간암 세포주 Huh-7에서 최소 효율로 복제되는 선택성 아게놈 HCV RNA의 구조가 보고되어 있다. 로만(Lohman) 등은 단백질-암호화 영역의 C-p7 또는 C-NS2 영역을 삭제함으로써 클로닝된 전장 HCV 공통 게놈(유전자형 1b)으로부터 유래된 레플리콘(I377/NS3-3')의 구조를 보고하였다(문헌[Lohman et al., Science 1999 285: 110-113]). 레플리콘은 다음과 같은 요소를 함유한다: (i) 캡시드 암호화 영역의 12개의 아미노산에 융합된 HCV 5'-UTR, (ii) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자(NPTII), (iii) NPTII 유전자의 하류에 삽입되고, HCV 단백질 NS2 또는 NS3에서 NS5B로의 번역을 지시하는, 뇌심근염 바이러스(EMCV)로부터의 IRES, 및 (iv) 3'-UTR. Huh-7 세포의 형질감염 후, HCV RNA 복제를 지지하는 세포만이 NPTII 단백질을 발현하고 약물 G418에 대한 내성이 나타난다. 상기 G418 내성 콜로니로부터 유래된 세포주는 상당 수준의 레플리콘 RNA 및 바이러스 단백질을 함유하지만, 106개의 형질감염된 Huh-7 세포들 중 단지 1개만이 HCV 복제를 지지한다.
유사한 선택성 HCV 레플리콘은 HCV-H 유전자형 1a 감염 클론을 기준으로 구조화된다(문헌[Blight et al., Science 2000 290:1972-74]). HCV-H 유래된 레플리콘은 효율적인 HCV 복제를 확립시킬 수 없으며, 이는 상기 로만(1999년)의 초기에-구조화된 레플리콘이 상기 실험에 사용되는 특정 유전자형 1b 공통 cDNA 클론에 의존한다는 것을 시사한다. 상기 브라이트(Blight) 등(2000년)은 PCR-기준 유전자 조립 절차를 수행함으로써 상기 로만 등(1999년)에 의해 제조된 레플리콘의 구조를 재현하였고 G418-내성 Huh-7 세포 콜로니를 얻었다.
독립적 G418-내성 세포 클론들이 서열화되어 높은 수준의 HCV 복제가 숙주 세포에 대한 레플리콘의 적응에 필요한 지의 여부를 결정하였다. HCV 비구조 단백질 NS5A에서 군집을 형성하는 다중 독립적 적응성 돌연변이가 동정되었다. 돌연변이는, 당해 분야에서 초기에-구조화된 레플리콘과 비교하여(예컨대, I377/NS3-3' 레플리콘은 0.0001% 형질도입 효능을 갖는다) 형질감염된 세포의 0.2 내지 10%에 이르는 형질도입 효능으로 시험관내 증가된 복제 능력을 부여하였다.
본 발명은 독특한 제한 효소 부위가 NS3 유전자의 단백질분해효소 도메인의 5' 및 3' 말단에서 도입되는 신규한 HCV 레플리콘 셔틀 벡터의 개발을 특징으로 하며, HCV-감염된 환자의 샘플로부터 유래된 NS3 단백질분해효소 서열이 상기 셔틀 벡터에서 클로닝되어, 생성된 레플리콘은 HCV NS3 단백질분해효소 억제제에 대한 복제 적합도 및 감수성에 대해 평가될 수 있다. 개별 HCV-감염된 환자는 전형적으로 NS5B RNA 중합효소의 높은 오차율로 인해 유전적으로 다양한 바이러스 집단을 함유하기 때문에, 본 발명의 셔틀 벡터의 사용은 특정 환자-유래된 NS3 단백질분해효소 변이체의 특징화 및 이들 변이체의 약물 치료에 대한 민감성 또는 내성을 허용할 것이다.
따라서, 본 발명은 순서대로, NS3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 5' 말단으로부터 10개의 뉴클레오타이드 5'와 10개의 뉴클레오타이드 3' 사이에 위치한, 독특한 제한 효소 서열; NS3 단백질의 단백질분해효소 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열; NS3 단백질의 단백질분해효소 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 3' 말단으로부터 10개의 뉴클레오타이드 5'와 10개의 뉴클레오타이드 3' 사이에 위치한 독특한 제한 효소 서열; NS3 단백질의 헬리케이스 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열; NS4A 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열; NS4B 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열; NS5A 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열; 및 NS5B 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, HCV 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 제공한다. 본 발명의 한 실시양태에서, NS3 단백질의 단백질분해효소 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 NS3 단백질의 단백질분해효소 도메인이 비기능성이도록 변형되거나 삭제되었다.
본 발명의 다른 실시양태에서, NS3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 5' 말단에서의 독특한 제한 효소 서열은 EcoRV를 인식하며, NS3 단백질의 단백질분해효소 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 3' 말단에서의 독특한 제한 효소 서열은 AsiSI를 인식한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, HCV 레플리콘 셔틀 벡터는 서열 식별 번호: 3 및 서열 식별 번호: 6으로부터 선택된 HCV 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 추가의 실시양태는 HCV로 감염된 대상으로부터 샘플을 제공받는 단계; 독특한 제한 효소 서열을 포함하는 센스-가닥 프라이머 및 상이한 독특한 제한 효소 서열을 포함하는 안티-센스 가닥 프라이머를 사용하여 샘플에 존재하는 복수개의 HCV 변종들로부터 NS3 단백질의 단백질분해효소 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 PCR-증폭하는 단계; 상기 PCR-증폭된 폴리뉴클레오타이드 서열을 HCV 레플리콘 셔틀 벡터로 클로닝하여 키메라 HCV 레플리콘 플라스미드를 생성시키는 단계; 상기 키메라 HCV 레플리콘 플라스미드를 선형화하고, 상기 선형화된 플라스미드를 시험관내 전사 처리하여 키메라 HCV 레플리콘 RNA를 생성시키는 단계; 및 상기 HCV 레플리콘 RNA로 Huh7 세포주를 형질감염시키고, HCV NS3 단백질분해효소 억제제의 존재 또는 부재하에 상기 HCV 레플리콘 RNA의 복제 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 대상에서 HCV 감염을 조절하는 HCV NS3 단백질분해효소 억제제의 효능을 평가하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 HCV로 감염된 대상으로부터 샘플을 제공받는 단계; 독특한 제한 효소 서열을 포함하는 센스-가닥 프라이머 및 상이한 독특한 제한 효소 서열을 포함하는 안티-센스 가닥 프라이머를 사용하여 샘플에 존재하는 복수개의 HCV 변종들로부터 NS3 단백질의 단백질분해효소 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 PCR-증폭하는 단계; 상기 PCR-증폭된 폴리뉴클레오타이드 서열을 HCV 레플리콘 셔틀 벡터로 클로닝하여 키메라 HCV 레플리콘 플라스미드를 생성시키는 단계; 상기 플라스미드를 세포로 형질전환시켜 복수개의 형질전환된 세포의 콜로니를 발생시키는 단계; 상기 콜로니를 풀링하고 풀링된 콜로니로부터 키메라 HCV 레플리콘 플라스미드를 단리하는 단계; 상기 키메라 HCV 레플리콘 플라스미드를 선형화하는 단계; 상기 선형화된 플라스미드를 시험관내 전사 처리하여 키메라 HCV 레플리콘 RNA를 생성시키는 단계; 및 상기 HCV 레플리콘 RNA로 Huh7 세포주를 형질감염시키고 HCV NS3 단백질분해효소 억제제의 존재 또는 부재하에 상기 HCV 레플리콘 RNA의 복제 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 대상에서 HCV 감염을 조절하는 HCV NS3 단백질분해효소 억제제의 효능을 평가하는 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 장점 및 다른 장점 및 특징, 및 이를 달성하는 방식은 예시적인 실시양태를 예시하는 하기 실시예와 함께 본 발명의 하기 상세한 설명을 고려하는 경우 보다 용이하게 자명해질 것이다.
도 1은 HCV 레플리콘 셔틀 벡터의 구성요소의 계략도이다.
도 2는 NS3 단백질분해효소 레플리콘 셔틀 벡터의 플라스미드 맵을 도시한다: (A) pSC_1b_NS3/단백질분해효소_EcoRV_AsiSI(서열 식별 번호: 3), (B) pSC_1b_NS3/단백질분해효소/LacZ_EcoRV_AsiSI(서열 식별 번호: 6)
도 3은 HCV 유전자형 1a 또는 유전자형 1b로부터의 환자-유래된 NS3 단백질분해효소를 함유하는 레플리콘뿐만 아니라 pSC_1b_NS3/단백질분해효소_EcoRV_AsiSI의 복제능을 도시한다. RLU는 형질감염 후 96 시간 후에 관찰된 반딧불이 루시퍼라제 신호의 수준을 나타낸다.
도 2는 NS3 단백질분해효소 레플리콘 셔틀 벡터의 플라스미드 맵을 도시한다: (A) pSC_1b_NS3/단백질분해효소_EcoRV_AsiSI(서열 식별 번호: 3), (B) pSC_1b_NS3/단백질분해효소/LacZ_EcoRV_AsiSI(서열 식별 번호: 6)
도 3은 HCV 유전자형 1a 또는 유전자형 1b로부터의 환자-유래된 NS3 단백질분해효소를 함유하는 레플리콘뿐만 아니라 pSC_1b_NS3/단백질분해효소_EcoRV_AsiSI의 복제능을 도시한다. RLU는 형질감염 후 96 시간 후에 관찰된 반딧불이 루시퍼라제 신호의 수준을 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 용어는 다음과 같이 정의된다.
용어 "HCV 레플리콘"은 그 자체의 카피의 발생을 지시할 수 있는 C형 간염 바이러스로부터의 핵산을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "레플리콘"은 DNA뿐만 아니라 RNA, 및 그의 하이브리드를 포함한다. 예를 들면, HCV 게놈의 이중-가닥 DNA 버전은 HCV 레플리콘을 구성하는 단일-가닥 RNA 전사물을 발생시키는데 사용될 수 있다. HCV 레플리콘은 전장 HCV 게놈 또는 "아게놈 레플리콘"으로도 지칭되는 HCV 아게놈 구조체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 HCV의 아게놈 레플리콘은 바이러스의 비구조 단백질에 대한 유전자 대부분을 함유하지만, 구조 단백질에 대해 암호화하는 유전자 대부분은 결여되어 있다. 아게놈 레플리콘은 바이러스 입자의 생성없이 바이러스 아게놈의 복제, 아게놈 레플리콘의 복제에 필요한 모든 바이러스 유전자의 발현을 지시할 수 있다.
기본적인 HCV 레플리콘은 HCV 5'-비번역된(UTR) 영역, HCV NS3-NS5B 폴리단백질 암호화 영역, 및 HCV 3'-UTR을 함유하는 아게놈 구조체이다. 다른 핵산 영역, 예컨대 HCV NS2, 구조 HCV 단백질 및 비-HCV 서열을 위해 제공되는 것이 존재할 수 있다.
HCV 5'-UTR 영역은 단백질 번역을 위한 내부 리보솜 엔트리 부위(IRES) 및 복제에 필요한 요소를 제공한다. HCV 5'-UTR 영역은 약 36개의 뉴클레오타이드가 HCV 코어 암호화 영역으로 연장된 천연 HCV 5'-UTR 및 그의 기능적 유도체를 포함한다. 5'-UTR 영역은 여러 위치, 예컨대 선택 단백질, 리포터, 단백질, 또는 HCV 폴리단백질을 암호화하는 서열로부터 하류인 부위에 존재할 수 있다.
HCV 5'-UTR-PC 영역 외에도, 또한 비-HCV IRES 요소들이 레플리콘에 존재할 수 있다. 비-HCV IRES 요소는 HCV 폴리단백질에 대한 암호화 영역의 바로 상류를 포함한 여러 위치에 존재할 수 있다. 사용될 수 있는 비-HCV IRES 요소들의 예는 EMCV IRES, 폴리오바이러스 IRES 및 소 바이러스성 설사 바이러스 IRES가 있다.
HCV 3'-UTR은 HCV 복제를 보조한다. HCV 3' UTR은 천연 HCV 3'-UTR 및 그의 기능적 유도체를 포함한다. 천연 3'-UTR은 폴리 U 트랙 및 약 100개의 뉴클레오타이드를 갖는 추가 영역을 포함한다.
NS3-NS5B 폴리단백질 암호화 영역은 상이한 단백질로 세포에서 프로세싱될 수 있는 폴리단백질에 대해 제공된다. 레플리콘의 일부일 수 있는 적합한 NS3-NS5B 폴리단백질 서열은 상이한 HCV 균주에 존재하는 것 및 NS3-NS5B의 프로세싱을 초래하는 그의 기능적 등가물을 포함하여 기능적 복제 절차를 제공한다. 적절한 프로세싱은, 예를 들면 NS5B RNA 의존 RNA 중합효소를 분석하기 위해 측정될 수 있다.
"벡터"는 DNA의 조각, 예컨대 플라스미드, 파지 또는 코스미드이며, 여기에 DNA 분절의 다른 조각이 부착되어 부착된 DNA 분절의 복제, 발현 또는 통합을 야기시킬 수 있다. "셔틀 벡터"는 DNA 분절이 특이적 제한 효소 부위에서 벡터로 삽입되거나 벡터로부터 삭제될 수 있는 벡터를 지칭한다. 셔틀 벡터로 삽입되는 DNA 분절은 일반적으로 관심있는 폴리펩타이드 또는 RNA를 암호화하고, 제한 효소 부위는 전사 및 번역에 적절한 해독틀에서 DNA 분절의 삽입을 보장하도록 고안된다.
다양한 벡터들이 핵산 분자를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 염색체, 에피솜 및 바이러스-유래된 벡터, 예컨대 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 이스트 에피솜, 이스트 인공 염색체를 포함한 이스트 염색체 요소, 바큘로바이러스, 파포바바이러스, 예컨대 SV40, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 폭스바이러스, 슈도레이비스 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스로부터 유래된 벡터를 포함한다. 또한, 벡터는 이들 공급원들의 조합, 예컨대 플라스미드 및 박테리오파지 유전적 요소로부터 유래된 것들, 예를 들면 코스미드 및 파지미드로부터 유래될 수 있다. 원핵 및 진핵 숙주에 대한 적절한 클로닝 및 발현 백터는 문헌[Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA]에 기재되어 있다.
적절한 핵산 분자를 함유하는 벡터가 공지된 기법을 사용하여 증식 및 발현을 위해 적절한 숙주 세포로 도입될 수 있다. 숙주 세포는 비제한적으로 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)을 비롯한 박테리아 세포, 이스트, 곤충 세포, 예컨대 초파리(Drosophila), 동물 세포, 예컨대 Huh-7, HeLa, COS, HEK 293, MT- 2T, CEM-SS 및 CHO 세포 및 식물 세포를 비롯한 진핵 세포를 포함한다.
벡터는 일반적으로 재조합 벡터 구조체를 함유하는 세포의 아집단의 선택을 가능하게 하는 선택 마커를 포함한다. 마커는 본원에 기재된 핵산 분자를 함유하는 동일한 벡터에 함유될 수 있거나, 별도의 벡터 상에 있을 수 있다. 마커는 원핵 숙주 세포에 대해 테트라사이클린- 또는 암피실린-내성 유전자 및 진핵 숙주 세포에 대해 다이하이드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성을 포함한다. 그러나, 표현형 특징에 대한 선택을 제공하는 임의의 마커가 효과적일 것이다.
"폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산 분자"는 일반적으로 임의의 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 지칭하며, 이들은 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다. "폴리뉴클레오타이드"는 비제한적으로 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥, 또는 보다 전형적으로 이중-가닥 또는 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 또한, "폴리뉴클레오타이드"는 RNA 또는 DNA, 또는 RNA 및 DNA 둘 다를 포함하는 삼중-가닥 영역을 지칭한다. 또한, "폴리뉴클레오타이드"는 종종 올리고뉴클레오타이드를 지칭하는 비교적 짧은 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
또한, 용어 "DNA 분자"는 분자의 1차 및 2차 구조 만을 지칭하며, 임의의 특정 3차 형태로 제한되지 않는다. 따라서, 상기 용어는 발견된 이중-가닥 DNA, 특히 선형 DNA 분자(예컨대, 제한 단편), 바이러스, 플라스미드 및 염색체에서 발견된 이중-가닥 DNA를 포함한다. 특정 이중-가닥 DNA 분자의 구조를 논의할 시에, 서열은 DNA의 비전사된 가닥(즉, mRNA와 상동성인 서열을 갖는 가닥)을 따라 5'에서 3' 방향의 서열만을 제공하는 정상적 관례에 따라 본원에서 기술될 수 있다.
"RNA 분자"는 단일-가닥 형태 또는 이중-가닥 나선 형태 중 한 형태의 리보뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 특정 RNA 분자의 구조를 논의할 시에, 서열은 5'에서 3' 방향의 서열을 제공하는 정상적 관례에 따라 본원에서 기술될 수 있다.
용어 "제한 효소 서열"은 박테리아 효소에 의해 인식되고 절단되는 특정 이중-가닥 DNA 서열을 지칭하며, 상기 박테리아 효소 각각은 특정 뉴클레오타이드 서열에서 또는 그 근처에서 이중-가닥 DNA를 절단한다. 제한 효소 "EcoRV"는 서열 
를 인식하며 표시된 뉴클레오타이드 위치(
로 도시됨)에서 이중-가닥 DNA를 절단한다. 제한 효소 "AsiSI"는 서열 
를 인식하며, 인식 서열 상의 T 잔기 뒤를 절단한다.
본원에서 사용되는 용어 "프라이머"는 제한 효소 분해에 의해 발생된 생물학적 시스템 또는 적절한 환경에 위치하는 경우 주형-의존적 핵산 합성의 개시제로서 기능적으로 작용할 수 있는 합성적으로 생성된 생물학적 시스템 중 어느 하나로부터 유래된 올리고뉴클레오타이드, RNA 또는 DNA 중 하나, 단일-가닥 또는 이중-가닥 중 하나를 지칭한다. 적절한 핵산 주형, 핵산의 적합한 뉴클레오사이드 트라이포스페이트 전구체, 중합효소 효소, 적합한 보조인자 및 조건, 예컨대 적합한 온도 및 pH와 함께 제시되는 경우, 프라이머는 중합효소의 작용 또는 유사한 활성에 의한 뉴클레오타이드의 첨가에 의해 그의 3' 말단에서 연장되어 프라이머 연장 산물을 산출할 수 있다. 프라이머는 적용의 특정 조건 및 요건에 따라 길이가 다양할 수 있다. 예를 들면, PCR 반응에서, 프라이머는 전형적으로 15 내지 25개 이상의 뉴클레오타이드 길이이다. 프라이머는 목적하는 연장 산물의 합성을 프라임하도록 목적하는 주형에 충분한 상보성을 가져야 한다, 즉 중합효소 또는 유사한 효소에 의한 합성의 개시에 사용되는 적절한 근접부위에서 프라이머의 3'-하이드록실 잔기를 제공하기에 충분한 방식으로 목적하는 주형 가닥으로 어닐링될 수 있어야 한다. 프라이머 서열이 목적하는 주형의 정확한 상보성을 나타낼 필요는 없다. 예를 들면, 비-상보성 뉴클레오타이드 서열(예컨대, 제한 효소 인식 서열)은 다른 상보성 프라이머의 5'-말단에 부착될 수 있다. 다르게는, 비-상보성 염기가 올리고뉴클레오타이드 프라이머 서열 내에 산재될 수 있되, 단 프라이머 서열은 연장 산물의 합성을 위한 주형-프라이머 복합체를 기능적으로 제공하도록 목적하는 주형 가닥의 서열과 충분한 상보성을 가져야 한다.
본원에서 사용되는 용어 "키메라"는 함께 융합되거나 스플라이싱된 2개 이상의 상이한 공급원으로부터의 DNA로부터 생성된 DNA 분자를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "변종"은 주된 HCV 게놈 서열(즉, 유전자형)의 미세변이체의 집단을 의미하며, 상기 미세변이체는 단일 감염된 대상 또는 심지어 단일 세포 클론 또는 심지어 HCV 복제 동안 높은 돌연변이율의 결과로서 단일 세포 클론에서 형성된다.
본원에서 사용되는 용어 "대상"은 척추 동물, 특히 포유류 종의 구성원을 지칭하며, 설치류, 토끼, 뾰족뒤쥐 및 영장류를 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 영장류는 인간을 포함한다.
용어 "샘플"은 대상으로부터 단리된 조직 또는 체액의 샘플을 포함하며, 예를 들면 비제한적으로 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 피부관, 호흡관, 장관 및 비뇨생식관의 외분비, 눈물, 침, 젖, 혈액 세포, 종양, 기관, 및 또한 시험관내 세포 배양 구성물의 샘플(배양된 세포, 잠정적 바이러스 감염된 세포, 재조합 세포 및 세포 성분의 성장으로부터 생성된 적응용 배지를 포함하지만, 이에 제한되지 않음)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
세포는 DNA 또는 RNA가 세포 내부에 도입되는 경우 외인성 또는 이종성 DNA 또는 RNA에 의해 "형질전환" 또는 "형질감염"된다. 형질전환 또는 형질감염 DNA 또는 RNA는 세포의 게놈을 구성하는 염색체 DNA로 (공유 결합하여) 통합될 수 있거나 될 수 없다. 예를 들면, 원핵세포, 이스트 및 포유류 세포에서, 형질전환 DNA는 에피솜 요소, 예컨대 플라스미드 상에 유지될 수 있다. 진핵 세포에 대해서, 안정하게 형질전환된 세포는 염색체 복제를 통해 딸 세포에 의해 유전되도록 형질전환 DNA가 염색체로 통합된 것이다. 이 안정성은 진핵 세포가 형질전환 DNA를 함유하는 딸 세포의 집단으로 구성된 클론 또는 세포주를 확립시키는 능력에 의해 입증된다. 본 발명에 기재된 포유류 세포를 형질전환하는 HCV 복제의 경우, RNA 분자, 예컨대 HCV RNA 분자는 반-자발적으로 복제되는 능력을 갖는다. HCV 레플리콘을 함유하는 Huh-7 세포는 레플리콘 상에 존재하는 리포터 유전자 또는 선택 마커의 존재에 의해 검출된다.
"클론"은 일반적으로 유사분열 과정에 의해 단일 세포 또는 공통 조상으로부터 유래된 세포의 집단을 지칭한다.
실시예
하기 제조예 및 실시예는 당해 분야의 숙련자가 본 발명을 보다 더 이해하고 실시하도록 하기 위해 제공된다. 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 간주되지 않고, 단지 본 발명을 예시하고 대표할 뿐이다.
실시예 1
플라스미드의 구조화
NS3 단백질분해효소 레플리콘 셔틀 벡터는 HCV NS3 레플리콘 셔틀 벡터, pSC_1b_NS3_EcoRV_XbaI를 발생시키는데 사용되는 중간 벡터이고 본원에서 그 전체가 참고로서 인용되는 추아(Chua) 등에 의해 2007년 9월 27일자로 출원된 "HCV NS3 레플리콘 셔틀 벡터"라는 명칭의 미국 특허 제 60/995,558 호에 개시되어 있는 HCV 레플리콘 셔틀 벡터, pSC_1b_NS3_EcoRV로부터 유래되었다. 레플리콘 셔틀 벡터의 구성요소는 도 1에 도시되어 있으며 5'-UTR, NS3 내지 NS5B 단백질 및 3'-UTR로부터의 HCV 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 또한, 벡터는 폴리오바이러스 내부 리보솜 엔트리 부위(IRES)를 포함하며, 이는 반딧불이 루시퍼라제 유전자의 번역을 조절한다. 반딧불이 루시퍼라제 유전자의 하류에서 뇌심근염 바이러스(EMCV)로부터의 IRES는 HCV 비구조 유전자(NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및 NS5B)의 번역을 조절한다.
제조자의 지시(미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타진(Stratagene))에 따른 퀵체인지(QuickChange) 부위-지시 돌연변이유발 키트를 사용하여 돌연변이를 pSC_1b_NS3_EcoRV_XbaI로 도입시켰다. NS3 유전자의 단백질분해효소 도메인의 3' 말단(아미노산 위치 Ser 181에 상응)에서 AsiSI 제한 효소 서열을 도입하기 위해, 다음과 같은 프라이머를 사용하였다.
센스 프라이머: 
안티-센스 프라이머: 
이들 돌연변이는 NS3 단백질의 아미노산 암호화 서열을 변화시키지 않으며, NS3 단백질분해효소 셔틀 벡터, pSC_1b_NS3/단백질분해효소_EcoRV_AsiSI(서열 식별 번호: 3, 도 2a)를 발생시킨다. 또 다른 NS3 단백질분해효소 레플리콘 셔틀 벡터를 발생시켰으며, 이에 의해 NS3 유전자의 단백질분해효소 도메인을 암호화하는 서열이 pUC19로부터 베타-갈락토시다제(lacZ) 암호화 서열에 의해 대체되었다(진벵크(GenBank) 수납 번호 M77789). lacZ 유전자의 5' 말단에서 EcoRV 제한 부위 및 3' 말단에서 AsiSI 제한 부위를 다음과 같은 프라이머를 사용하여 PCR 증폭에 의해 도입시켜 벡터, pSC_1b_NS3/단백질분해효소/LacZ_EcoRV_AsiSI(서열 식별 번호: 6, 도 2b)를 발생시켰다:
실시예 3(및 도 3)에 기재된 표현형 분석을 사용하여 NS3 단백질분해효소 레플리콘 셔틀 벡터의 복제 능력을 평가하였다.
실시예 2
감염된 환자로부터 NS3 단백질분해효소 레플리콘 셔틀 벡터로 증폭된 NS3 단백질분해효소 도메인 PCR 샘플의 클로닝
NS3 유전자의 단백질분해효소 도메인을 암호화하는 DNA 서열을, 제조자의 프로토콜에 따라 수퍼스크립(SuperScript) III 시스템(인비트로겐(Invitrogen))을 사용하여 HCV 유전자형 1a 및 유전자형 1b로 감염된 환자로부터 수득된 혈장으로부터 RNA의 역 전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 발생시켰다. 이러한 RT-PCR 단계에 사용되는 프라이머는 다음과 같다:
유전자형 1a:
센스 프라이머(NS2): 
안티센스 프라이머(NS3/헬리케이스):
유전자형 1b:
센스 프라이머(NS2): 
안티센스 프라이머(NS3/헬레케이스):
먼저, 50℃에서 어닐링을 수행한 후 94℃에서의 변성, 53℃에서의 어닐링 및 68℃에서의 연장의 PCR 주기를 수행하였다. 그 후, 증폭된 산물을, NS3 단백질의 단백질분해효소 도메인의 5' 및 3' 말단에서 독특한 제한 효소 서열을 도입하는 프라이머를 사용하여 푸시온(Phusion, 상표명) 하이-필델라이티(High-Fidelity) DNA 중합효소 시스템(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))에 의해 PCR의 2차 순환에 가하였다. 환자의 NS3 유전자 서열의 5' 말단 근처에서 EcoRV 제한 효소 서열을 도입하는데 사용되는 센스 프라이머는 다음과 같다:
유전자형 1a:
유전자형 1b:
NS3 유전자 서열의 단백질분해효소 도메인의 3' 말단(아미노산 위치 Ser 181에 상응) 근처에서 AsiSI 제한 효소 서열을 도입하는데 사용되는 안티센스 프라이머는 다음과 같다:
유전자형 1a:
유전자형 1b:
98℃에서의 변성, 53℃에서의 어닐링 및 72℃에서의 연장을 갖는 PCR 주기로 증폭을 수행하였다. 그 후, 증폭된 환자 NS3 단백질분해효소 DNA를 퀴아겐(Qiagen) PCR 정제 컬럼을 사용하여 정제하고 EcoRV 및 SgFI(AsiSI의 아이소스키조머)로 분해시켰다.
NS3 단백질분해효소 셔틀 레플리콘 벡터, pSC_1b_NS3/단백질분해효소_EcoRV_AsiSI 또는 pSC_1b_NS3/단백질분해효소/LacZ_EcoRV_AsiSI를 제한 엔도뉴클레아제, EcoRV 및 SgfI를 사용하여 이중 분해하여 제조하였다. 셔틀 벡터의 25 ng을 마이트믹스(MightMix) 결찰 키트(타카라 바이오 인코포레이티드(Takara Bio Inc.))를 사용하여 16℃에서 1.5시간 동안 분해된 환자 엠플리콘으로 결찰하였다. 1:2 내지 1:4 비율로 삽입되는 벡터를 일상적으로 사용하였다. 5㎕의 반응물을 50㎕의 Top10 세포(인비트로겐)로 형질전환시키고 37℃에서 표현형 발현 1시간 후에 플레이팅하였다.
96개의 개별 콜로니를 골라 50㎍/ml의 암피실린으로 보충된 200㎕의 테리픽 브로스(Terrific Broth, TB)에 접종하였다. 이 "원료" 96-웰 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 이 플레이트를 복제 플레이트를 제조하는데 사용하였다. 48 핀 스탬프를 사용하여 100㎍/ml 카베니실린이 보충된 2개의 LB 플레이트로 플레이트를 복제하였다. 또한, 96개의 개별 200㎕ 배양물을 50㎍/ml 암피실린이 보충된 1.5ml TB 배양물로 옮겨 DNA 제조에 사용하였다. 37℃에서 밤새 배양한 후, 복제 플레이트를 6ml LB로 스프레드하여 96 클론의 이질성 풀을 수득하였고, 그 후 이를 미니-DNA 제조에 사용하였다. 그 후, 이 DNA 환자 풀을 후속 레플리콘 표현형 분석에 사용하였다. 37℃에서 밤새 진탕시킨 후, 96개의 개별 1.5ml TB 배양물을 스핀 다운시키고, 경사분리하고, 플라스미드 DNA를 퀴아겐의 퀴아프레프(Qiaprep) 96 터보 미니-DNA 키트를 사용하여 추출하였다. 레플리콘 표현형 분석에 사용되는 복합 96 풀을 나타내는 이러한 개별 분자 클론을 서열화 반응에 사용하였다.
이질성 클론 풀 플라스미드 DNA 또는 개별 분자 클론을 서열화하여 환자 샘플의 동정을 확인하고 표현형 레플리콘 분석에서 억제제에 대한 민감성을 시험하였다.
실시예 3
표현형 레플리콘 분석
A. 시험관내 전사된 RNA의 제조
5㎍의 DNA 플라스미드를 Sca I 제한 효소(로슈(Roche))에 의해 선형화하였다. 37℃에서 밤새 분해한 후, DNA를 퀴아겐 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 1㎍의 선형화된 DNA를, 제조자의 프로토콜에 따라 T7 리보막스 익스프레스(T7 RiboMAX Express, 프로메가(Promega))를 사용하여 시험관내 전사에 사용하였다. 37℃에서 2시간 배양 후, 37℃에서 30분 동안 DNase 처리를 수행하여 DNA 주형을 제거하였다. 그 후, 시험관내 전사된 RNA를 제조자의 프로토콜에 따라 RNeasy 스핀 컬럼(퀴아겐)을 사용하여 정제하였다.
B. 간암 세포주
글루타막스(Glutamax, 상표명) 및 100mg/ml 나트륨 피루베이트가 보충된 둘베코의 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM))에서 5% CO2에 의한 습한 대기하에 37℃에서 간암 루네트(Lunet) Huh-7 세포주를 배양하였다. 배지를 10%(v/v) FBS 및 1%(v/v) 페니실린/스트렙토마이신으로 추가로 보충하였다. 모든 시약은 인비트로겐/깁코(Gibco)로부터의 것이다.
C. 일시적 레플리콘 복제 수준의 측정
전기천공을 사용하여 4백만 루네트 Huh7 세포를 5㎍의 시험관내 전사된 RNA로 형질감염하였다. 그 후, 세포를 5% FBS를 함유하는 7.2ml DMEM에서 재현탁하고 50000세포/웰(90㎕의 최종 부피)에서 96-웰 플레이트 중 플레이팅하였다. 억제제(사용되는 경우)를 첨가하여 1%의 최종 DMSO 농도에서 3배 희석액에 24시간 후-형질감염하고, 반딧불이 루시퍼라제 리포터 신호를 루시퍼라제 분석 시스템(프로메가)을 사용하여 억제제를 첨가한 후 72시간에 판독하였다. 화합물의 첨가가 없는 반딧불이 루시퍼라제 신호의 수준과 비교하여 반딧불이 루시퍼라제 리포터의 수준의 50% 감소가 관찰되는 억제제 농도로서 IC50 값을 평가하였다.
HCV 유전자형 1a 및 유전자형 1b 환자-유래된 NS3 단백질분해효소 도메인을 함유하는 레플리콘의 복제 능력뿐만 아니라 레플리콘 셔틀 벡터, pSC_1b_NS3/단백질분해효소_EcoRV_AsiSI의 복제 능력을 판독치로서 루시퍼라제 신호를 사용하여 시험하였고, 결과를 도 3에 나타내었다. 또한, 이들 레플리콘에 대한 HCV 단백질분해효소 억제제, BILN2061, VX-950 및 NM107의 억제 효과를 시험하였고, 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
SEQUENCE LISTING
<110> F.HOFFMANN-LA ROCHE AG
Ali, Samir
Jiang, Wen-Rong
<120> HCV NS3 Protease Replicon Shuttle Vectors
<130> R0382A-PRO
<140> PCT/EP2008/066417
<141> 2008-11-28
<150> US 61/005,792
<151> 2007-12-07
<160> 14
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector AsiSI sense primer
<400> 1
gagtctatgg gaaccactat gcgatcgccg gtcttcacgg acaactcgtc 50
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector AsiSI anti-sense primer
<400> 2
gacgagttgt ccgtgaagac cggcgatcgc atagtggttc ccatagactc 50
<210> 3
<211> 11516
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSC_1b_NS3/Protease_EcoRV_AsiSI
<400> 3
cctgcaggta atacgactca ctatagccag cccccgattg ggggcgacac tccaccatag 60
atcactcccc tgtgaggaac tactgtcttc acgcagaaag cgtctagcca tggcgttagt 120
atgagtgtcg tgcagcctcc aggacccccc ctcccgggag agccatagtg gtctgcggaa 180
ccggtgagta caccggaatt gccaggacga ccgggtcctt tcttggatca acccgctcaa 240
tgcctggaga tttgggcgtg cccccgcgag actgctagcc gagtagtgtt gggtcgcgaa 300
aggccttgtg gtactgcctg atagggtgct tgcgagtgcc ccgggaggtc tcgtagaccg 360
tgcaccgttt aaacccccgt gctgctggaa gtcgatttcg cttagggtaa ccgtggacct 420
cgaaaacaga cgcacaaaac caagttcaat agaagggggt acaaaccagt accaccacga 480
acaagcactt ctgtttcccc ggtgatgtcg tatagactgc ttgcgtggtt gaaagcgacg 540
gatccgttat ccgcttatgt acttcgagaa gcccagtacc acctcggaat cttcgatgcg 600
ttgcgctcag cactcaaccc cagagtgtag cttaggctga tgagtctgga catccctcac 660
cggtgacggt ggtccaggct gcgttggcgg cctacctatg gctaacgcca tgggacgcta 720
gttgtgaaca aggtgtgaag agcctattga gctacataag aatcctccgg cccctgaatg 780
cggctaatcc caacctcgga gcaggtggtc acaaaccagt gattggcctg tcgtaacgcg 840
caagtccgtg gcggaaccga ctactttggg tgtccgtgtt tccttttatt ttattgtggc 900
tgcttatggt gacaatcaca gattgttatc ataaagcgaa ttggattggc catccggtga 960
aagtgagact cattatctat ctgtttgctg gatccgctcc attgagtgtg tttactctaa 1020
gtacaatttc aacagttatt tcaatcagac aattgtatca taatggcggg cccagaagac 1080
gccaaaaaca taaaggaagg cccggcgcca ttctatcctc ttgaggatgg aaccgctgga 1140
gagcaactgc ataaggctat gaagagatac gccctggttc ctggaacaat tgcttttaca 1200
gatgcacata tcgaggtgaa catcacgtac gcggaatact tcgaaatgtc cgttcggttg 1260
gcagaagcta tgaaacgata tgggctgaat acaaatcaca gaatcgtcgt atgcagtgaa 1320
aactctcttc aattctttat gccggtgttg ggcgcgttat ttatcggagt tgcagttgcg 1380
cccgcgaacg acatttataa tgaacgtgaa ttgctcaaca gtatgaacat ttcgcagcct 1440
accgtagtgt ttgtttccaa aaaggggttg caaaaaattt tgaacgtgca aaaaaaatta 1500
ccaataatcc agaaaattat tatcatggat tctaaaacgg attaccaggg atttcagtcg 1560
atgtacacgt tcgtcacatc tcatctacct cccggtttta atgaatacga ttttgtacca 1620
gagtcctttg atcgtgacaa aacaattgca ctgataatga attcctctgg atctactggg 1680
ttacctaagg gtgtggccct tccgcataga actgcctgcg tcagattctc gcatgccaga 1740
gatcctattt ttggcaatca aatcattccg gatactgcga ttttaagtgt tgttccattc 1800
catcacggtt ttggaatgtt tactacactc ggatatttga tatgtggatt tcgagtcgtc 1860
ttaatgtata gatttgaaga agagctgttt ttacgatccc ttcaggatta caaaattcaa 1920
agtgcgttgc tagtaccaac cctattttca ttcttcgcca aaagcactct gattgacaaa 1980
tacgatttat ctaatttaca cgaaattgct tctgggggcg cacctctttc gaaagaagtc 2040
ggggaagcgg ttgcaaaacg cttccatctt ccagggatac gacaaggata tgggctcact 2100
gagactacat cagctattct gattacaccc gagggggatg ataaaccggg cgcggtcggt 2160
aaagttgttc cattttttga agcgaaggtt gtggatctgg ataccgggaa aacgctgggc 2220
gttaatcaga gaggcgaatt atgtgtcaga ggacctatga ttatgtccgg ttatgtaaac 2280
aatccggaag cgaccaacgc cttgattgac aaggatggat ggctacattc tggagacata 2340
gcttactggg acgaagacga acacttcttc atagttgacc gcttgaagtc tttaattaaa 2400
tacaaaggtt atcaggtggc ccccgctgaa ttggaatcga tattgttaca acaccccaac 2460
atcttcgacg cgggcgtggc aggtcttccc gacgatgacg ccggtgaact tcccgccgcc 2520
gttgttgttt tggagcacgg aaagacgatg acggaaaaag agatcgtgga ttacgtcgcc 2580
agtcaagtaa caaccgcgaa aaagttgcgc ggaggagttg tgtttgtgga cgaagtaccg 2640
aaaggtctta ccggaaaact cgacgcaaga aaaatcagag agatcctcat aaaggccaag 2700
aagggcggaa agtccaaatt gtaagcggcc gcgttgttaa acagaccaca acggtttccc 2760
tctagcggga tcaattccgc cccccccccc taacgttact ggccgaagcc gcttggaata 2820
aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt ttggcaatgt 2880
gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct 2940
cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc 3000
ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga 3060
caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc 3120
ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt 3180
attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg 3240
gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc taggcccccc 3300
gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatat caccatggcg cctattacgg 3360
cctactccca acagacgcga ggcctacttg gctgcatcat cactagcctc acaggccggg 3420
acaggaacca ggtcgagggg gaggtccaag tggtctccac cgcaacacaa tctttcctgg 3480
cgacctgcgt caatggcgtg tgttggactg tctatcatgg tgccggctca aagacccttg 3540
ccggcccaaa gggcccaatc acccaaatgt acaccaatgt ggaccaggac ctcgtcggct 3600
ggcaagcgcc ccccggggcg cgttccttga caccatgcac ctgcggcagc tcggaccttt 3660
acttggtcac gaggcatgcc gatgtcattc cggtgcgccg gcggggcgac agcaggggga 3720
gcctactctc ccccaggccc gtctcctact tgaagggctc ttcgggcggt ccactgctct 3780
gcccctcggg gcacgctgtg ggcatctttc gggctgccgt gtgcacccga ggggttgcga 3840
aggcggtgga ctttgtaccc gtcgagtcta tgggaaccac tatgcgatcg ccggtcttca 3900
cggacaactc gtcccctccg gccgtaccgc agacattcca ggtggcccat ctacacgccc 3960
ctactggtag cggcaagagc actaaggtgc cggctgcgta tgcagcccaa gggtataagg 4020
tgcttgtcct gaacccgtcc gtcgccgcca ccctaggttt cggggcgtat atgtctaagg 4080
cacatggtat cgaccctaac atcagaatcg gggtaaggac catcaccacg ggtgccccca 4140
tcacgtactc cacctatggc aagtttcttg ccgacggtgg ttgctctggg ggcgcctatg 4200
acatcataat atgtgatgag tgccactcaa ctgactcgac cactatcctg ggcatcggca 4260
cagtcctgga ccaagcggag acggctggag cgcgactcgt cgtgctcgcc accgctacgc 4320
ctccgggatc ggtcaccgtg ccacatccaa acatcgagga ggtggctctg tccagcactg 4380
gagaaatccc cttttatggc aaagccatcc ccatcgagac catcaagggg gggaggcacc 4440
tcattttctg ccattccaag aagaaatgtg atgagctcgc cgcgaagctg tccggcctcg 4500
gactcaatgc tgtagcatat taccggggcc ttgatgtatc cgtcatacca actagcggag 4560
acgtcattgt cgtagcaacg gacgctctaa tgacgggctt taccggcgat ttcgactcag 4620
tgatcgactg caatacatgt gtcacccaga cagtcgactt cagcctggac ccgaccttca 4680
ccattgagac gacgaccgtg ccacaagacg cggtgtcacg ctcgcagcgg cgaggcagga 4740
ctggtagggg caggatgggc atttacaggt ttgtgactcc aggagaacgg ccctcgggca 4800
tgttcgattc ctcggttctg tgcgagtgct atgacgcggg ctgtgcttgg tacgagctca 4860
cgcccgccga gacctcagtt aggttgcggg cttacctaaa cacaccaggg ttgcccgtct 4920
gccaggacca tctggagttc tgggagagcg tctttacagg cctcacccac atagacgccc 4980
atttcttgtc ccagactaag caggcaggag acaacttccc ctacctggta gcataccagg 5040
ctacggtgtg cgccagggct caggctccac ctccatcgtg ggaccaaatg tggaagtgtc 5100
tcatacggct aaagcctacg ctgcacgggc caacgcccct gctgtatagg ctgggagccg 5160
ttcaaaacga ggttactacc acacacccca taaccaaata catcatggca tgcatgtcgg 5220
ctgatctaga ggtcgtcacg agcacctggg tgctggtagg cggagtccta gcagctctgg 5280
ccgcgtattg cctgacaaca ggcagcgtgg tcattgtggg caggatcatc ttgtccggaa 5340
agccggccat cattcccgac agggaagtcc tttaccggga gttcgatgag atggaagagt 5400
gcgcctcaca cctcccttac atcgaacagg gaatgcagct cgccgaacaa ttcaaacaga 5460
aggcaatcgg gttgctgcaa acagccacca agcaagcgga ggctgctgct cccgtggtgg 5520
aatccaagtg gcggaccctc gaagccttct gggcgaagca tatgtggaat ttcatcagcg 5580
ggatacaata tttagcaggc ttgtccactc tgcctggcaa ccccgcgata gcatcactga 5640
tggcattcac agcctctatc accagcccgc tcaccaccca acataccctc ctgtttaaca 5700
tcctgggggg atgggtggcc gcccaacttg ctcctcccag cgctgcttct gctttcgtag 5760
gcgccggcat cgctggagcg gctgttggca gcataggcct tgggacggtg cttgtggata 5820
ttttggcagg ttatggagca ggggtggcag gcgcgctcgt ggcctttaag gtcatgagcg 5880
gcgagatgcc ctccaccgag gacctggtta acctactccc tgctatcctc tcccctggcg 5940
ccctagtcgt cggggtcgtg tgcgcagcga tactgcgtcg gcacgtgggc ccaggggagg 6000
gggctgtgca gtggatgaac cggctgatag cgttcgcttc gcggggtaac cacgtctccc 6060
ccacgcacta tgtgcctgag agcgacgctg cagcacgtgt cactcagatc ctctctagtc 6120
ttaccatcac tcagctgctg aagaggcttc accagtggat caacgaggac tgctccacgc 6180
catgctccgg ctcgtggcta agagatgttt gggattggat atgcacggtg ttgactgatt 6240
tcaagacctg gctccagtcc aagctcctgc cgcgattgcc gggagtcccc ttcttctcat 6300
gtcaacgtgg gtacaaggga gtctggcggg gcgacggcat catgcaaacc acctgcccat 6360
gtggagcaca gatcaccgga catgtgaaaa acggttccat gaggatcgtg gggcctagga 6420
cctgtagtaa cacgtggcat ggaacattcc ccattaacgc gtacaccacg ggcccctgca 6480
cgccctcccc ggcgccaaat tattctaggg cgctgtggcg ggtggctgct gaggagtacg 6540
tggaggttac gcgggtgggg gatttccact acgtgacggg catgaccact gacaacgtaa 6600
agtgcccgtg tcaggttccg gcccccgaat tcttcacaga agtggatggg gtgcggttgc 6660
acaggtacgc tccagcgtgc aaacccctcc tacgggagga ggtcacattc ctggtcgggc 6720
tcaatcaata cctggttggg tcacagctcc catgcgagcc cgaaccggac gtagcagtgc 6780
tcacttccat gctcaccgac ccctcccaca ttacggcgga gacggctaag cgtaggctgg 6840
ccaggggatc tcccccctcc ttggccagct catcagctag ccagctgtct gcgccttcct 6900
tgaaggcaac atgcactacc cgtcatgact ccccggacgc tgacctcatc gaggccaacc 6960
tcctgtggcg gcaggagatg ggcgggaaca tcacccgcgt ggagtcagaa aataaggtag 7020
taattttgga ctctttcgag ccgctccaag cggaggagga tgagagggaa gtatccgttc 7080
cggcggagat cctgcggagg tccaggaaat tccctcgagc gatgcccata tgggcacgcc 7140
cggattacaa ccctccactg ttagagtcct ggaaggaccc ggactacgtc cctccagtgg 7200
tacacgggtg tccattgccg cctgccaagg cccctccgat accacctcca cggaggaaga 7260
ggacggttgt cctgtcagaa tctaccgtgt cttctgcctt ggcggagctc gccacaaaga 7320
ccttcggcag ctccgaatcg tcggccgtcg acagcggcac ggcaacggcc tctcctgacc 7380
agccctccga cgacggcgac gcgggatccg acgttgagtc gtactcctcc atgccccccc 7440
ttgaggggga gccgggggat cccgatctca gcgacgggtc ttggtctacc gtaagcgagg 7500
aggctagtga ggacgtcgtc tgctgctcga tgtcctacac atggacaggc gccctgatca 7560
cgccatgcgc tgcggaggaa accaagctgc ccatcaatgc actgagcaac tctttgctcc 7620
gtcaccacaa cttggtctat gctacaacat ctcgcagcgc aagcctgcgg cagaagaagg 7680
tcacctttga cagactgcag gtcctggacg accactaccg ggacgtgctc aaggagatga 7740
aggcgaaggc gtccacagtt aaggctaaac ttctatccgt ggaggaagcc tgtaagctga 7800
cgcccccaca ttcggccaga tctaaatttg gctatggggc aaaggacgtc cggaacctat 7860
ccagcaaggc cgttaaccac atccgctccg tgtggaagga cttgctggaa gacactgaga 7920
caccaattga caccaccatc atggcaaaaa atgaggtttt ctgcgtccaa ccagagaagg 7980
ggggccgcaa gccagctcgc cttatcgtat tcccagattt gggggttcgt gtgtgcgaga 8040
aaatggccct ttacgatgtg gtctccaccc tccctcaggc cgtgatgggc tcttcatacg 8100
gattccaata ctctcctgga cagcgggtcg agttcctggt gaatgcctgg aaagcgaaga 8160
aatgccctat gggcttcgca tatgacaccc gctgttttga ctcaacggtc actgagaatg 8220
acatccgtgt tgaggagtca atctaccaat gttgtgactt ggcccccgaa gccagacagg 8280
ccataaggtc gctcacagag cggctttaca tcgggggccc cctgactaat tctaaagggc 8340
agaactgcgg ctatcgccgg tgccgcgcga gcggtgtact gacgaccagc tgcggtaata 8400
ccctcacatg ttacttgaag gccgctgcgg cctgtcgagc tgcgaagctc caggactgca 8460
cgatgctcgt atgcggagac gaccttgtcg ttatctgtga aagcgcgggg acccaagagg 8520
acgaggcgag cctacgggcc ttcacggagg ctatgactag atactctgcc ccccctgggg 8580
acccgcccaa accagaatac gacttggagt tgataacatc atgctcctcc aatgtgtcag 8640
tcgcgcacga tgcatctggc aaaagggtgt actatctcac ccgtgacccc accacccccc 8700
ttgcgcgggc tgcgtgggag acagctagac acactccagt caattcctgg ctaggcaaca 8760
tcatcatgta tgcgcccacc ttgtgggcaa ggatgatcct gatgactcat ttcttctcca 8820
tccttctagc tcaggaacaa cttgaaaaag ccctagattg tcagatctac ggggcctgtt 8880
actccattga gccacttgac ctacctcaga tcattcaacg actccatggc cttagcgcat 8940
tttcactcca tagttactct ccaggtgaga tcaatagggt ggcttcatgc ctcaggaaac 9000
ttggggtacc gcccttgcga gtctggagac atcgggccag aagtgtccgc gctaggctac 9060
tgtcccaggg ggggagggct gccacttgtg gcaagtacct cttcaactgg gcagtaagga 9120
ccaagctcaa actcactcca atcccggctg cgtcccagtt ggatttatcc agctggttcg 9180
ttgctggtta cagcggggga gacatatatc acagcctgtc tcgtgcccga ccccgctggt 9240
tcatgtggtg cctactccta ctttctgtag gggtaggcat ctatctactc cccaaccgat 9300
gaacggggag ctaaacactc caggccaata ggccatcctg tttttttccc tttttttttt 9360
tctttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttctcc tttttttttc ctcttttttt 9420
ccttttcttt cctttggtgg ctccatctta gccctagtca cggctagctg tgaaaggtcc 9480
gtgagccgct tgactgcaga gagtgctgat actggcctct ctgcagatca agtactacta 9540
gtagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 9600
cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 9660
cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 9720
accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 9780
acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 9840
cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 9900
acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 9960
atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 10020
agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 10080
acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 10140
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg 10200
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 10260
gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 10320
gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 10380
acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 10440
tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 10500
ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt 10560
catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat 10620
ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag 10680
caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct 10740
ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt 10800
tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg 10860
cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca 10920
aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt 10980
tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat 11040
gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac 11100
cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa 11160
aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt 11220
tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt 11280
tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa 11340
gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt 11400
atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa 11460
taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accatt 11516
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LacZ EcoRV sense primer
<400> 4
atcatcatcg atatcaccgc gttggccgat tcattaatg 39
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LacZ AsiSI anti-sense primer
<400> 5
gatgatgatg cgatcgccag ctcccggaga cggtcac 37
<210> 6
<211> 11590
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pSC_1b_NS3/Protease/LacZ_EcoRV_AsiSI
<400> 6
cctgcaggta atacgactca ctatagccag cccccgattg ggggcgacac tccaccatag 60
atcactcccc tgtgaggaac tactgtcttc acgcagaaag cgtctagcca tggcgttagt 120
atgagtgtcg tgcagcctcc aggacccccc ctcccgggag agccatagtg gtctgcggaa 180
ccggtgagta caccggaatt gccaggacga ccgggtcctt tcttggatca acccgctcaa 240
tgcctggaga tttgggcgtg cccccgcgag actgctagcc gagtagtgtt gggtcgcgaa 300
aggccttgtg gtactgcctg atagggtgct tgcgagtgcc ccgggaggtc tcgtagaccg 360
tgcaccgttt aaacccccgt gctgctggaa gtcgatttcg cttagggtaa ccgtggacct 420
cgaaaacaga cgcacaaaac caagttcaat agaagggggt acaaaccagt accaccacga 480
acaagcactt ctgtttcccc ggtgatgtcg tatagactgc ttgcgtggtt gaaagcgacg 540
gatccgttat ccgcttatgt acttcgagaa gcccagtacc acctcggaat cttcgatgcg 600
ttgcgctcag cactcaaccc cagagtgtag cttaggctga tgagtctgga catccctcac 660
cggtgacggt ggtccaggct gcgttggcgg cctacctatg gctaacgcca tgggacgcta 720
gttgtgaaca aggtgtgaag agcctattga gctacataag aatcctccgg cccctgaatg 780
cggctaatcc caacctcgga gcaggtggtc acaaaccagt gattggcctg tcgtaacgcg 840
caagtccgtg gcggaaccga ctactttggg tgtccgtgtt tccttttatt ttattgtggc 900
tgcttatggt gacaatcaca gattgttatc ataaagcgaa ttggattggc catccggtga 960
aagtgagact cattatctat ctgtttgctg gatccgctcc attgagtgtg tttactctaa 1020
gtacaatttc aacagttatt tcaatcagac aattgtatca taatggcggg cccagaagac 1080
gccaaaaaca taaaggaagg cccggcgcca ttctatcctc ttgaggatgg aaccgctgga 1140
gagcaactgc ataaggctat gaagagatac gccctggttc ctggaacaat tgcttttaca 1200
gatgcacata tcgaggtgaa catcacgtac gcggaatact tcgaaatgtc cgttcggttg 1260
gcagaagcta tgaaacgata tgggctgaat acaaatcaca gaatcgtcgt atgcagtgaa 1320
aactctcttc aattctttat gccggtgttg ggcgcgttat ttatcggagt tgcagttgcg 1380
cccgcgaacg acatttataa tgaacgtgaa ttgctcaaca gtatgaacat ttcgcagcct 1440
accgtagtgt ttgtttccaa aaaggggttg caaaaaattt tgaacgtgca aaaaaaatta 1500
ccaataatcc agaaaattat tatcatggat tctaaaacgg attaccaggg atttcagtcg 1560
atgtacacgt tcgtcacatc tcatctacct cccggtttta atgaatacga ttttgtacca 1620
gagtcctttg atcgtgacaa aacaattgca ctgataatga attcctctgg atctactggg 1680
ttacctaagg gtgtggccct tccgcataga actgcctgcg tcagattctc gcatgccaga 1740
gatcctattt ttggcaatca aatcattccg gatactgcga ttttaagtgt tgttccattc 1800
catcacggtt ttggaatgtt tactacactc ggatatttga tatgtggatt tcgagtcgtc 1860
ttaatgtata gatttgaaga agagctgttt ttacgatccc ttcaggatta caaaattcaa 1920
agtgcgttgc tagtaccaac cctattttca ttcttcgcca aaagcactct gattgacaaa 1980
tacgatttat ctaatttaca cgaaattgct tctgggggcg cacctctttc gaaagaagtc 2040
ggggaagcgg ttgcaaaacg cttccatctt ccagggatac gacaaggata tgggctcact 2100
gagactacat cagctattct gattacaccc gagggggatg ataaaccggg cgcggtcggt 2160
aaagttgttc cattttttga agcgaaggtt gtggatctgg ataccgggaa aacgctgggc 2220
gttaatcaga gaggcgaatt atgtgtcaga ggacctatga ttatgtccgg ttatgtaaac 2280
aatccggaag cgaccaacgc cttgattgac aaggatggat ggctacattc tggagacata 2340
gcttactggg acgaagacga acacttcttc atagttgacc gcttgaagtc tttaattaaa 2400
tacaaaggtt atcaggtggc ccccgctgaa ttggaatcga tattgttaca acaccccaac 2460
atcttcgacg cgggcgtggc aggtcttccc gacgatgacg ccggtgaact tcccgccgcc 2520
gttgttgttt tggagcacgg aaagacgatg acggaaaaag agatcgtgga ttacgtcgcc 2580
agtcaagtaa caaccgcgaa aaagttgcgc ggaggagttg tgtttgtgga cgaagtaccg 2640
aaaggtctta ccggaaaact cgacgcaaga aaaatcagag agatcctcat aaaggccaag 2700
aagggcggaa agtccaaatt gtaagcggcc gcgttgttaa acagaccaca acggtttccc 2760
tctagcggga tcaattccgc cccccccccc taacgttact ggccgaagcc gcttggaata 2820
aggccggtgt gcgtttgtct atatgttatt ttccaccata ttgccgtctt ttggcaatgt 2880
gagggcccgg aaacctggcc ctgtcttctt gacgagcatt cctaggggtc tttcccctct 2940
cgccaaagga atgcaaggtc tgttgaatgt cgtgaaggaa gcagttcctc tggaagcttc 3000
ttgaagacaa acaacgtctg tagcgaccct ttgcaggcag cggaaccccc cacctggcga 3060
caggtgcctc tgcggccaaa agccacgtgt ataagataca cctgcaaagg cggcacaacc 3120
ccagtgccac gttgtgagtt ggatagttgt ggaaagagtc aaatggctct cctcaagcgt 3180
attcaacaag gggctgaagg atgcccagaa ggtaccccat tgtatgggat ctgatctggg 3240
gcctcggtgc acatgcttta catgtgttta gtcgaggtta aaaaaacgtc taggcccccc 3300
gaaccacggg gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatat caccgcgttg gccgattcat 3360
taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 3420
aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 3480
atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 3540
tacgccaagc ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat ccccgggtac cgagctcgaa 3600
ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa 3660
tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga 3720
tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg cgcctgatgc ggtattttct 3780
ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc actctcagta caatctgctc 3840
tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg 3900
ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctggcg 3960
atcgccggtc ttcacggaca actcgtcccc tccggccgta ccgcagacat tccaggtggc 4020
ccatctacac gcccctactg gtagcggcaa gagcactaag gtgccggctg cgtatgcagc 4080
ccaagggtat aaggtgcttg tcctgaaccc gtccgtcgcc gccaccctag gtttcggggc 4140
gtatatgtct aaggcacatg gtatcgaccc taacatcaga atcggggtaa ggaccatcac 4200
cacgggtgcc cccatcacgt actccaccta tggcaagttt cttgccgacg gtggttgctc 4260
tgggggcgcc tatgacatca taatatgtga tgagtgccac tcaactgact cgaccactat 4320
cctgggcatc ggcacagtcc tggaccaagc ggagacggct ggagcgcgac tcgtcgtgct 4380
cgccaccgct acgcctccgg gatcggtcac cgtgccacat ccaaacatcg aggaggtggc 4440
tctgtccagc actggagaaa tcccctttta tggcaaagcc atccccatcg agaccatcaa 4500
gggggggagg cacctcattt tctgccattc caagaagaaa tgtgatgagc tcgccgcgaa 4560
gctgtccggc ctcggactca atgctgtagc atattaccgg ggccttgatg tatccgtcat 4620
accaactagc ggagacgtca ttgtcgtagc aacggacgct ctaatgacgg gctttaccgg 4680
cgatttcgac tcagtgatcg actgcaatac atgtgtcacc cagacagtcg acttcagcct 4740
ggacccgacc ttcaccattg agacgacgac cgtgccacaa gacgcggtgt cacgctcgca 4800
gcggcgaggc aggactggta ggggcaggat gggcatttac aggtttgtga ctccaggaga 4860
acggccctcg ggcatgttcg attcctcggt tctgtgcgag tgctatgacg cgggctgtgc 4920
ttggtacgag ctcacgcccg ccgagacctc agttaggttg cgggcttacc taaacacacc 4980
agggttgccc gtctgccagg accatctgga gttctgggag agcgtcttta caggcctcac 5040
ccacatagac gcccatttct tgtcccagac taagcaggca ggagacaact tcccctacct 5100
ggtagcatac caggctacgg tgtgcgccag ggctcaggct ccacctccat cgtgggacca 5160
aatgtggaag tgtctcatac ggctaaagcc tacgctgcac gggccaacgc ccctgctgta 5220
taggctggga gccgttcaaa acgaggttac taccacacac cccataacca aatacatcat 5280
ggcatgcatg tcggctgatc tagaggtcgt cacgagcacc tgggtgctgg taggcggagt 5340
cctagcagct ctggccgcgt attgcctgac aacaggcagc gtggtcattg tgggcaggat 5400
catcttgtcc ggaaagccgg ccatcattcc cgacagggaa gtcctttacc gggagttcga 5460
tgagatggaa gagtgcgcct cacacctccc ttacatcgaa cagggaatgc agctcgccga 5520
acaattcaaa cagaaggcaa tcgggttgct gcaaacagcc accaagcaag cggaggctgc 5580
tgctcccgtg gtggaatcca agtggcggac cctcgaagcc ttctgggcga agcatatgtg 5640
gaatttcatc agcgggatac aatatttagc aggcttgtcc actctgcctg gcaaccccgc 5700
gatagcatca ctgatggcat tcacagcctc tatcaccagc ccgctcacca cccaacatac 5760
cctcctgttt aacatcctgg ggggatgggt ggccgcccaa cttgctcctc ccagcgctgc 5820
ttctgctttc gtaggcgccg gcatcgctgg agcggctgtt ggcagcatag gccttgggac 5880
ggtgcttgtg gatattttgg caggttatgg agcaggggtg gcaggcgcgc tcgtggcctt 5940
taaggtcatg agcggcgaga tgccctccac cgaggacctg gttaacctac tccctgctat 6000
cctctcccct ggcgccctag tcgtcggggt cgtgtgcgca gcgatactgc gtcggcacgt 6060
gggcccaggg gagggggctg tgcagtggat gaaccggctg atagcgttcg cttcgcgggg 6120
taaccacgtc tcccccacgc actatgtgcc tgagagcgac gctgcagcac gtgtcactca 6180
gatcctctct agtcttacca tcactcagct gctgaagagg cttcaccagt ggatcaacga 6240
ggactgctcc acgccatgct ccggctcgtg gctaagagat gtttgggatt ggatatgcac 6300
ggtgttgact gatttcaaga cctggctcca gtccaagctc ctgccgcgat tgccgggagt 6360
ccccttcttc tcatgtcaac gtgggtacaa gggagtctgg cggggcgacg gcatcatgca 6420
aaccacctgc ccatgtggag cacagatcac cggacatgtg aaaaacggtt ccatgaggat 6480
cgtggggcct aggacctgta gtaacacgtg gcatggaaca ttccccatta acgcgtacac 6540
cacgggcccc tgcacgccct ccccggcgcc aaattattct agggcgctgt ggcgggtggc 6600
tgctgaggag tacgtggagg ttacgcgggt gggggatttc cactacgtga cgggcatgac 6660
cactgacaac gtaaagtgcc cgtgtcaggt tccggccccc gaattcttca cagaagtgga 6720
tggggtgcgg ttgcacaggt acgctccagc gtgcaaaccc ctcctacggg aggaggtcac 6780
attcctggtc gggctcaatc aatacctggt tgggtcacag ctcccatgcg agcccgaacc 6840
ggacgtagca gtgctcactt ccatgctcac cgacccctcc cacattacgg cggagacggc 6900
taagcgtagg ctggccaggg gatctccccc ctccttggcc agctcatcag ctagccagct 6960
gtctgcgcct tccttgaagg caacatgcac tacccgtcat gactccccgg acgctgacct 7020
catcgaggcc aacctcctgt ggcggcagga gatgggcggg aacatcaccc gcgtggagtc 7080
agaaaataag gtagtaattt tggactcttt cgagccgctc caagcggagg aggatgagag 7140
ggaagtatcc gttccggcgg agatcctgcg gaggtccagg aaattccctc gagcgatgcc 7200
catatgggca cgcccggatt acaaccctcc actgttagag tcctggaagg acccggacta 7260
cgtccctcca gtggtacacg ggtgtccatt gccgcctgcc aaggcccctc cgataccacc 7320
tccacggagg aagaggacgg ttgtcctgtc agaatctacc gtgtcttctg ccttggcgga 7380
gctcgccaca aagaccttcg gcagctccga atcgtcggcc gtcgacagcg gcacggcaac 7440
ggcctctcct gaccagccct ccgacgacgg cgacgcggga tccgacgttg agtcgtactc 7500
ctccatgccc ccccttgagg gggagccggg ggatcccgat ctcagcgacg ggtcttggtc 7560
taccgtaagc gaggaggcta gtgaggacgt cgtctgctgc tcgatgtcct acacatggac 7620
aggcgccctg atcacgccat gcgctgcgga ggaaaccaag ctgcccatca atgcactgag 7680
caactctttg ctccgtcacc acaacttggt ctatgctaca acatctcgca gcgcaagcct 7740
gcggcagaag aaggtcacct ttgacagact gcaggtcctg gacgaccact accgggacgt 7800
gctcaaggag atgaaggcga aggcgtccac agttaaggct aaacttctat ccgtggagga 7860
agcctgtaag ctgacgcccc cacattcggc cagatctaaa tttggctatg gggcaaagga 7920
cgtccggaac ctatccagca aggccgttaa ccacatccgc tccgtgtgga aggacttgct 7980
ggaagacact gagacaccaa ttgacaccac catcatggca aaaaatgagg ttttctgcgt 8040
ccaaccagag aaggggggcc gcaagccagc tcgccttatc gtattcccag atttgggggt 8100
tcgtgtgtgc gagaaaatgg ccctttacga tgtggtctcc accctccctc aggccgtgat 8160
gggctcttca tacggattcc aatactctcc tggacagcgg gtcgagttcc tggtgaatgc 8220
ctggaaagcg aagaaatgcc ctatgggctt cgcatatgac acccgctgtt ttgactcaac 8280
ggtcactgag aatgacatcc gtgttgagga gtcaatctac caatgttgtg acttggcccc 8340
cgaagccaga caggccataa ggtcgctcac agagcggctt tacatcgggg gccccctgac 8400
taattctaaa gggcagaact gcggctatcg ccggtgccgc gcgagcggtg tactgacgac 8460
cagctgcggt aataccctca catgttactt gaaggccgct gcggcctgtc gagctgcgaa 8520
gctccaggac tgcacgatgc tcgtatgcgg agacgacctt gtcgttatct gtgaaagcgc 8580
ggggacccaa gaggacgagg cgagcctacg ggccttcacg gaggctatga ctagatactc 8640
tgccccccct ggggacccgc ccaaaccaga atacgacttg gagttgataa catcatgctc 8700
ctccaatgtg tcagtcgcgc acgatgcatc tggcaaaagg gtgtactatc tcacccgtga 8760
ccccaccacc ccccttgcgc gggctgcgtg ggagacagct agacacactc cagtcaattc 8820
ctggctaggc aacatcatca tgtatgcgcc caccttgtgg gcaaggatga tcctgatgac 8880
tcatttcttc tccatccttc tagctcagga acaacttgaa aaagccctag attgtcagat 8940
ctacggggcc tgttactcca ttgagccact tgacctacct cagatcattc aacgactcca 9000
tggccttagc gcattttcac tccatagtta ctctccaggt gagatcaata gggtggcttc 9060
atgcctcagg aaacttgggg taccgccctt gcgagtctgg agacatcggg ccagaagtgt 9120
ccgcgctagg ctactgtccc agggggggag ggctgccact tgtggcaagt acctcttcaa 9180
ctgggcagta aggaccaagc tcaaactcac tccaatcccg gctgcgtccc agttggattt 9240
atccagctgg ttcgttgctg gttacagcgg gggagacata tatcacagcc tgtctcgtgc 9300
ccgaccccgc tggttcatgt ggtgcctact cctactttct gtaggggtag gcatctatct 9360
actccccaac cgatgaacgg ggagctaaac actccaggcc aataggccat cctgtttttt 9420
tccctttttt tttttctttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ctcctttttt 9480
tttcctcttt ttttcctttt ctttcctttg gtggctccat cttagcccta gtcacggcta 9540
gctgtgaaag gtccgtgagc cgcttgactg cagagagtgc tgatactggc ctctctgcag 9600
atcaagtact actagtagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac 9660
tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 9720
aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 9780
gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 9840
ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 9900
ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 9960
gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 10020
ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 10080
cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 10140
cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 10200
gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 10260
aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 10320
tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 10380
gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 10440
tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 10500
gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 10560
tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat 10620
ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg 10680
ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc 10740
tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc 10800
aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc 10860
gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc 10920
gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc 10980
ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa 11040
gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat 11100
gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata 11160
gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca 11220
tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag 11280
gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc 11340
agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc 11400
aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata 11460
ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta 11520
gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta 11580
agaaaccatt 11590
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT-PCR Genotype 1a aense primer (NS2)
<400> 7
cgtgcggtga catcatcaac gg 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT-PCR Genotype 1a anti-sense primer (NS3 helicase)
<400> 8
ctcgcccccg cagtctctgc 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT-PCR Genotype 1b sense primer (NS2)
<400> 9
gagaccaaga tcatcacctg g 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RT-PCR Genotype 1b anti-sense primer (NS3 helicase)
<400> 10
gtccaggact gtgccgatgc c 21
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense Primer Genotype 1a EcoRV
<400> 11
ctgtctgtct gatatcacca tggcgcccat cacggcgtac gcc 43
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sense Primer Genotype 1b EcoRV
<400> 12
ctgtctgtct gatatcacca tggcgcctat tacggcctac tc 42
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Anti-sense Primer Genotype 1a AsiSI
<400> 13
tagtagtagg cgatcgcatg gttgtcccta ggttctc 37
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Anti-sense Primer Genotype 1b AsiSI
<400> 14
tagtagtagg cgatcgcata gtggttccca tagactcg 38
Claims (34)
- (a) NS3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 5' 말단으로부터 10개의 뉴클레오타이드 5'와 10개의 뉴클레오타이드 3' 사이에 위치한, 독특한 제한 효소 서열;
(b) NS3 단백질의 단백질분해효소 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열;
(c) NS3 단백질의 단백질분해효소 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 3' 말단으로부터 10개의 뉴클레오타이드 5'와 10개의 뉴클레오타이드 3' 사이에 위치한 독특한 제한 효소 서열;
(d) NS3 단백질의 헬리케이스 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열;
(e) NS4A 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열;
(f) NS4B 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열;
(g) NS5A 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열; 및
(h) NS5B 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열
을 순서대로 포함하는, HCV 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCV 레플리콘 셔틀 벡터. - 제 1 항에 있어서,
NS3 단백질의 단백질분해효소 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 변형되거나 삭제되어 NS3 단백질의 단백질분해효소 도메인이 비기능성으로 되는 HCV 레플리콘 셔틀 벡터. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
NS3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 5' 말단에서의 독특한 제한 효소 서열이 EcoRV를 인식하고, NS3 단백질의 단백질분해효소 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 3' 말단에서의 독특한 제한 효소 서열이 AsiSI를 인식하는 HCV 레플리콘 셔틀 벡터. - 서열 식별 번호: 3 및 서열 식별 번호: 6으로부터 선택된 HCV 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HCV 레플리콘 셔틀 벡터.
- (a) HCV로 감염된 대상으로부터 샘플을 제공받는 단계;
(b) 독특한 제한 효소 서열을 포함하는 센스-가닥 프라이머 및 상이한 독특한 제한 효소 서열을 포함하는 안티-센스 가닥 프라이머를 사용하여 샘플에 존재하는 복수개의 HCV 변종들로부터 NS3 단백질의 단백질분해효소 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 PCR-증폭하는 단계;
(c) 상기 PCR-증폭된 폴리뉴클레오타이드 서열을 HCV 레플리콘 셔틀 벡터로 클로닝하여 키메라 HCV 레플리콘 플라스미드를 생성시키는 단계;
(d) 상기 키메라 HCV 레플리콘 플라스미드를 선형화하고, 상기 선형화된 플라스미드를 시험관내 전사 처리하여 키메라 HCV 레플리콘 RNA를 생성시키는 단계; 및
(e) 상기 HCV 레플리콘 RNA로 Huh7 세포주를 형질감염시키고, HCV NS3 단백질분해효소 억제제의 존재 또는 부재하에 상기 HCV 레플리콘 RNA의 복제 수준을 측정하는 단계
를 포함하는, 대상에서 HCV 감염을 조절하는 HCV NS3 단백질분해효소 억제제의 효능을 평가하는 방법. - 제 5 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 1 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - 제 5 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 2 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - 제 5 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 3 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - 제 5 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 4 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - (a) HCV로 감염된 대상으로부터 샘플을 제공받는 단계;
(b) EcoRV를 인식하는 제한 효소 서열을 포함하는 센스-가닥 프라이머 및 AsiSI를 인식하는 제한 효소 서열을 포함하는 안티-센스 가닥 프라이머를 사용하여 샘플에 존재하는 복수개의 HCV 변종들로부터 NS3 단백질의 단백질분해효소 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 PCR-증폭하는 단계;
(c) 상기 PCR-증폭된 폴리뉴클레오타이드 서열을 HCV 레플리콘 셔틀 벡터로 클로닝하여 키메라 HCV 레플리콘 플라스미드를 생성시키는 단계;
(d) 상기 키메라 HCV 레플리콘 플라스미드를 선형화하고, 상기 선형화된 플라스미드를 시험관내 전사 처리하여 키메라 HCV 레플리콘 RNA를 생성시키는 단계; 및
(e) 상기 HCV 레플리콘 RNA로 Huh7 세포주를 형질감염시키고 HCV NS3 단백질분해효소 억제제의 존재 또는 부재하에 상기 HCV 레플리콘 RNA의 복제 수준을 측정하는 단계
를 포함하는, 대상에서 HCV 감염을 조절하는 HCV NS3 단백질분해효소 억제제의 효능을 평가하는 방법. - 제 10 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 1 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - 제 10 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 2 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - 제 5 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 3 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - 제 5 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 4 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - (a) HCV로 감염된 대상으로부터 샘플을 제공받는 단계;
(b) 서열 식별 번호: 11 및 서열 식별 번호: 12로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 센스-가닥 프라이머 및 서열 식별 번호: 13 및 서열 식별 번호: 14로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 안티-센스 가닥 프라이머를 사용하여 샘플에 존재하는 복수개의 HCV 변종들로부터 NS3 단백질의 단백질분해효소 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 PCR-증폭하는 단계;
(c) 상기 PCR-증폭된 폴리뉴클레오타이드 서열을 HCV 레플리콘 셔틀 벡터로 클로닝하여 키메라 HCV 레플리콘 플라스미드를 생성시키는 단계;
(d) 상기 키메라 HCV 레플리콘 플라스미드를 선형화하고, 상기 선형화된 플라스미드를 시험관내 전사 처리하여 키메라 HCV 레플리콘 RNA를 생성시키는 단계; 및
(e) 상기 HCV 레플리콘 RNA로 Huh7 세포주를 형질감염시키고 HCV NS3 단백질분해효소 억제제의 존재 또는 부재하에 상기 HCV 레플리콘 RNA의 복제 수준을 측정하는 단계
를 포함하는, 대상에서 HCV 감염을 조절하는 HCV NS3 단백질분해효소 억제제의 효능을 평가하는 방법. - 제 15 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 1 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - 제 15 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 2 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - 제 15 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 3 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - 제 15 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 4 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - (a) HCV로 감염된 대상으로부터 샘플을 제공받는 단계;
(b) 독특한 제한 효소 서열을 포함하는 센스-가닥 프라이머 및 상이한 독특한 제한 효소 서열을 포함하는 안티-센스 가닥 프라이머를 사용하여 샘플에 존재하는 복수개의 HCV 변종들로부터 NS3 단백질의 단백질분해효소 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 PCR-증폭하는 단계;
(c) 상기 PCR-증폭된 폴리뉴클레오타이드 서열을 HCV 레플리콘 셔틀 벡터로 클로닝하여 키메라 HCV 레플리콘 플라스미드를 생성시키는 단계;
(d) 상기 플라스미드를 세포로 형질전환시켜 복수개의 형질전환된 세포의 콜로니를 발생시키는 단계;
(e) 상기 콜로니를 풀링하고 풀링된 콜로니로부터 키메라 HCV 레플리콘 플라스미드를 단리하는 단계;
(f) 상기 단계 (e)로부터의 상기 키메라 HCV 레플리콘 플라스미드를 선형화하고, 상기 선형화된 플라스미드를 시험관내 전사 처리하여 키메라 HCV 레플리콘 RNA를 생성시키는 단계; 및
(g) 상기 HCV 레플리콘 RNA로 Huh7 세포주를 형질감염시키고 HCV NS3 단백질분해효소 억제제의 존재 또는 부재하에 상기 HCV 레플리콘 RNA의 복제 수준을 측정하는 단계
를 포함하는, 대상에서 HCV 감염을 조절하는 HCV NS3 단백질분해효소 억제제의 효능을 평가하는 방법. - 제 20 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 1 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - 제 20 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 2 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - 제 20 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 3 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - 제 20 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 4 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - (a) HCV로 감염된 대상으로부터 샘플을 제공받는 단계;
(b) EcoRV를 인식하는 제한 효소 서열을 포함하는 센스-가닥 프라이머 및 AsiSI를 인식하는 제한 효소 서열을 포함하는 안티-센스 가닥 프라이머를 사용하여 샘플에 존재하는 복수개의 HCV 변종들로부터 NS3 단백질의 단백질분해효소 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 PCR-증폭하는 단계;
(c) 상기 PCR-증폭된 폴리뉴클레오타이드 서열을 HCV 레플리콘 셔틀 벡터로 클로닝하여 키메라 HCV 레플리콘 플라스미드를 생성시키는 단계;
(d) 상기 플라스미드를 세포로 형질전환시켜 복수개의 형질전환된 세포의 콜로니를 발생시키는 단계;
(e) 상기 콜로니를 풀링하고 풀링된 콜로니로부터 키메라 HCV 레플리콘 플라스미드를 단리하는 단계;
(f) 상기 단계 (e)로부터의 상기 키메라 HCV 레플리콘 플라스미드를 선형화하고, 상기 선형화된 플라스미드를 시험관내 전사 처리하여 키메라 HCV 레플리콘 RNA를 생성시키는 단계; 및
(g) 상기 HCV 레플리콘 RNA로 Huh7 세포주를 형질감염시키고 HCV NS3 단백질분해효소 억제제의 존재 또는 부재하에 상기 HCV 레플리콘 RNA의 복제 수준을 측정하는 단계
를 포함하는, 대상에서 HCV 감염을 조절하는 HCV NS3 단백질분해효소 억제제의 효능을 평가하는 방법. - 제 25 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 1 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - 제 25 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 2 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - 제 25 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 3 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - 제 25 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 4 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - (a) HCV로 감염된 대상으로부터 샘플을 제공받는 단계;
(b) 서열 식별 번호: 11 및 서열 식별 번호: 12로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 센스-가닥 프라이머 및 서열 식별 번호: 13 및 서열 식별 번호: 14로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 안티-센스 가닥 프라이머를 사용하여 샘플에 존재하는 복수개의 HCV 변종들로부터 NS3 단백질의 단백질분해효소 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 PCR-증폭하는 단계;
(c) 상기 PCR-증폭된 폴리뉴클레오타이드 서열을 HCV 레플리콘 셔틀 벡터로 클로닝하여 키메라 HCV 레플리콘 플라스미드를 생성시키는 단계;
(d) 상기 플라스미드를 세포로 형질전환시켜 복수개의 형질전환된 세포의 콜로니를 발생시키는 단계;
(e) 상기 콜로니를 풀링하고 풀링된 콜로니로부터 키메라 HCV 레플리콘 플라스미드를 단리하는 단계;
(f) 상기 단계 (e)로부터의 상기 키메라 HCV 레플리콘 플라스미드를 선형화하고, 상기 선형화된 플라스미드를 시험관내 전사 처리하여 키메라 HCV 레플리콘 RNA를 생성시키는 단계; 및
(g) 상기 HCV 레플리콘 RNA로 Huh7 세포주를 형질감염시키고 HCV NS3 단백질분해효소 억제제의 존재 또는 부재하에 상기 HCV 레플리콘 RNA의 복제 수준을 측정하는 단계
를 포함하는, 대상에서 HCV 감염을 조절하는 HCV NS3 단백질분해효소 억제제의 효능을 평가하는 방법. - 제 30 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 1 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - 제 30 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 2 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - 제 30 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 3 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법. - 제 30 항에 있어서,
단계 (c)의 HCV 레플리콘 셔틀 벡터가 제 4 항에 따른 HCV 레플리콘 셔틀 벡터를 포함하는 방법.
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