KR20200044968A - 멜라닌 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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예카테리나 다다쵸바
데이비드 제이. 리클스
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라디뮨 테라퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

본원은 멜라닌에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공한다. 상기 항체는 키메라 또는 인간화된 항체일 수 있다. 본원은 기재된 상기 항체를 사용하는 방법 및 제조하는 방법도 제공한다. 예를 들면, 멜라닌 항체는 흑색종을 치료하거나 예방하기 위해 치료적으로 사용될 수 있다.

Description

멜라닌 항체 및 이의 용도
교차참조
본원은 참조에 의해 전체적으로 도입된, 2017년 9월 13일자로 출원된 미국 가특허출원 제62/558,230호의 우선권 이익을 주장한다.
가장 심각한 유형의 피부암인 흑색종은 멜라닌 생성 멜라닌세포에서 발생한다. 흑색종은 눈의 포도막, 상부 호흡소화관 내벽의 점막 상피 및 장관에서도 비롯될 수 있다. 미국 암학회는 미국에서 2017년 약 87,000명의 신규 흑색종이 진단될 것이고 약 9,750명의 사람들이 흑색종으로 인해 사망할 것으로 예상된다고 추정한다(https://www.cancer.org/cancer/melanoma-skin-cancer/about/key-statistics.html). 전세계적으로, 2012년에 흑색종이 약 232,000명의 사람들에서 발생하였고 약 55,000명의 사망을 초래하였다.
1 기 및 2 기 흑색종은 수술에 의해 치료될 수 있지만, IV 기 흑색종을 가진 환자의 경우 이 악성종양의 공격적 전이성은 3년, 5년 및 10년에서 각각 19%, 13% 및 9%의 추정된 생존율로 좋지 않은 예후를 제공한다(CM Balch, JE Gershenwald, SJ Soong, et al: Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification J Clin Oncol 27: 6199-6206, 2009). 돌연변이된 B-RAF 단백질을 억제하는 베무라페닙(vemurafenib)의 FDA 승인은 이 돌연변이를 보유하는 40% 내지 60%의 흑색종 환자에게 희망을 준다. 잠복 항종양 면역을 회복시키고자 하는 노력은 CTL 항원 4(CTLA-4)(Hodi FS, O'Day SJ, McDermott DF, et al: Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med 363:711-723, 2010), 및 T 림프구의 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1(PD-1) 및 이의 주요 종양 세포 리간드(PD-L1)(Phillips GK, Atkins M. Therapeutic uses of anti-PD-1 and anti-PD-L1 antibodies. Int Immunol. 2015;27(1):39-46)를 표적화하는 단일클론 항체(mAb) 기반 중재시술에 초점을 맞추었다. 항-CTLA-4 또는 항-PD-1 경로 체크포인트 억제제 면역요법에 반응하여 장기간 무진행 생존을 경험하는 단지 소수의 환자들, 이들 제제(agent)와 관련된 심각한 자가면역 독성의 상당한 위험, 및 면역요법의 고비용 때문에(Fellner, Chris. Ipilimumab (Yervoy) Prolongs Survival in Advanced Melanoma: Serious Side Effects and a Hefty Price Tag May Limit Its Use. Pharmacy &Therapeutics 2012:27(9):503-511), 흑색종, 특히 전이성 흑색종과 싸우는 다른 방식에 대한 절실한 필요성이 있다.
본원은 멜라닌에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 제공한다. 상기 항체는 키메라 또는 인간화된 항체일 수 있다. 본원은 기재된 상기 항체를 사용하는 방법 및 제조하는 방법도 제공한다. 예를 들면, 멜라닌 항체는 흑색종을 치료하거나 예방하기 위해 치료적으로 사용될 수 있다.
따라서, 한 양태에서, 본원은 멜라닌에 특이적으로 결합하는 키메라 또는 인간화된 단일클론 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 항체는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 키메라 마우스-인간 항체이다. 일부 실시양태에서, 키메라 항체는 마우스 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간화된 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 마우스 단일클론 항체의 서열로부터의 인간화된 형태이다. 일부 실시양태에서, 항체는 마우스 8C3 항체로부터의 인간화된 형태이다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체의 중쇄는 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 CDR 서열들 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체의 경쇄는 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 또는 서열번호 15의 CDR 서열들 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체의 중쇄는 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 CDR 서열들 중 적어도 하나를 포함하고, 인간화된 멜라닌 항체의 경쇄는 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 또는 서열번호 15의 CDR 서열들 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체의 중쇄는 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10으로부터의 CDR 서열을 포함하고/하거나, 경쇄는 서열번호 3 또는 서열번호 4로부터의 CDR 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 또는 인간화된 단일클론 멜라닌 항체는 항원 결합 단편이다.
일부 실시양태에서, 키메라 또는 인간화된 단일클론 멜라닌 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 멜라닌을 표적화하는 제1 아암 및 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 항원을 표적화하는 제2 아암을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 CTLA4, PD-1 또는 PD-L1이다.
일부 실시양태에서, 키메라 또는 인간화된 단일클론 멜라닌 항체는 제제에 접합된다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 방사성핵종이다. 일부 실시양태에서, 방사성핵종은 213-Bi이다. 일부 실시양태에서, 방사성핵종은 177-Lu이다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 링커를 통해 항체에 접합된다.
관련 양태에서, 본원은 본원에서 제공된 키메라 또는 인간화된 단일클론 멜라닌 항체들 중 어느 한 항체 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본원은 치료 유효량의 본원에 기재된 단일클론 키메라 또는 인간화된 멜라닌 항체들 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물들 중 어느 한 항체 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 흑색종을 치료하는 방법을 제공한다. 관련 양태에서, 본원은 흑색종을 치료하는 데 사용하기 위한 치료 유효량의 본원에 기재된 단일클론 키메라 또는 인간화된 멜라닌 항체들 또는 이러한 항체를 포함하는 조성물들 중 어느 한 항체 또는 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 흑색종은 전이된다. 일부 실시양태에서, 투여는 흑색종 세포의 세포 사멸을 선택적으로 유도한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 유효량의 적어도 하나의 추가 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 면역 체크포인트 억제제이다. 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 CTLA-4, PD-1 및 PDL-1로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 항체 또는 조성물은 정맥내로 투여된다.
또 다른 양태에서, 본원은 본원에 기재된 단일클론 키메라 또는 인간화된 멜라닌 항체들 중 어느 한 항체를 제제에 접합시키는 단계를 포함하는, 접합된 멜라닌 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 방사성핵종이다. 일부 실시양태에서, 방사성핵종은 213-Bi이다. 일부 실시양태에서, 방사성핵종은 177-Lu이다.
또 다른 양태에서, 본원은 본원에서 제공된 키메라 또는 인간화된 단일클론 멜라닌 항체들 중 어느 한 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 인간에서 발현되도록 코돈 최적화되어 있다. 본원은 본원에서 제공된 키메라 또는 인간화된 단일클론 멜라닌 항체들 중 어느 한 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 및 이러한 벡터를 포함하는 세포주도 제공한다. 본원은 본원에서 제공된 키메라 또는 인간화된 단일클론 멜라닌 항체들 중 어느 한 항체를 발현하는 클론 세포주도 제공한다.
또 다른 양태에서, 본원은 키메라 또는 인간화된 단일클론 항체들 또는 이러한 항체를 포함하는 약학 조성물들 중 어느 한 항체 또는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
(임의의 첨부된 청구범위, 요약서 및 도면을 포함하는) 본원에 기재된 상기 특징들 전부, 및/또는 개시된 임의의 방법 또는 과정의 단계들 전부는, 이러한 특징들 및/또는 단계들 중 적어도 일부가 상호 배타적인 조합을 제외하고 임의의 조합으로 조합될 수 있다.
본 발명을 더 잘 이해하고 이의 실시양태가 어떻게 수행될 수 있는 지를 예로써 보여주기 위해, 지금부터 첨부된 도면을 참고할 것이다.
도 1 및 2는 시험관내에서 어세이될 때, 별도의 실험에서 키메라 8C3 및 인간화된 8C3 항체와 멜라닌의 결합의 결과를 보여준다.
도 3은 마우스 8C3 및 마우스 IgG1 음성 대조군 항체와 세피아 오피시날리스(Sepia officinalis)로부터의 멜라닌의 결합을 비교한다.
도 4는 키메라 항체 및 인간화된 항체의 발현을 위해 사용된 플라스미드의 개략도를 제공한다: 도 4a) pAB11 8C3hIgG1 625.69.1, 도 4b) pAB2-8C3 hKappa-625.48.2, 도 4c) AB2-8C3-HE-VK4-hKappa 625.85.1, 도 4d) pAB2-8C3-HE-VK1A-hKappa-625.85.2, 도 4e) pAB2-8C3-HE-VK1B-hKappa-625.85.3, 도 4f) pAB11-8C3-HE-VH3A-hIgG1 625.85.4, 및 도 4g) pAB11-8C3-HE-VH3B-hIgG1 625.85.5.
도 5는 본원에 기재된 항체의 중쇄의 정렬을 보여준다.
도 6은 본원에 기재된 항체의 경쇄의 정렬을 보여준다.
도 7은 임의의 mAB 기반 항-멜라닌 또는 대조군 치료를 받기 전 B16-F10 흑색종 종양(흑색 원으로 표시됨)을 보유하는 대표적 C57BL/6 마우스를 보여준다.
도 8a 내지 8d는 항체 주사 후 2개의 상이한 시점(4시간 및 24시간)에서 다양한 장기들에서의 방사성표지된 멜라닌 결합 항체의 흡수를 비-특이적 인간 IgG 항체 대조군의 흡수와 비교한 생체분포 실험의 결과를 보여준다.
도 9는 종양에 결합한 방사성표지된 멜라닌 결합 항체의 양의 대용물 측정을 제공하는 종양-대-혈액 비 계산의 결과를 보여준다.
도 10은 방사성표지된 항체의 주사 후 1시간, 2시간, 24시간, 48시간 및 72시간인 소정의 시점에서 마우스 내의 111In-h8C3 HE-5 항체의 생체분포를 보여주는 그래프이다.
도 11a 및 11b는 고선량의 213Bi-h8C3 HE-5 또는 저선량의 213Bi-h8C3 HE-5, 또는 고선량의 177Lu-h8C3 HE-5 또는 저선량의 177Lu-h8C3 HE-5, 또는 80 ㎍의 표지되지 않은("저온") h8C3 HE-5로 치료받은 마우스, 또는 치료받지 않은 상태로 방치된 마우스에서 종양 부피를 보여주는 그래프이다. 이들의 종양을 전자 칼리퍼로 3일마다 측정하여 종양 부피를 계산하였다.
도 12 및 도 13은 고선량의 213Bi-h8C3 HE-5 또는 저선량의 213Bi-h8C3 HE-5, 또는 고선량의 177Lu-h8C3 HE-5 또는 저선량의 177Lu-h8C3 HE-5, 또는 80 ㎍의 표지되지 않은("저온") h8C3 HE-5로 치료받은 마우스, 또는 치료받지 않은 상태로 방치된 마우스에서 백혈구 세포(도 12a 및 13a), 적혈구 세포(도 12b 및 13b) 및 혈소판(도 12c 및 13c)의 혈액 카운트를 보여주는 일련의 그래프이다.
도 14a 및 14b는 고선량의 213Bi-h8C3 HE-5 또는 저선량의 213Bi-h8C3 HE-5, 또는 고선량의 177Lu-h8C3 HE-5 또는 저선량의 177Lu-h8C3 HE-5, 또는 80 ㎍의 표지되지 않은("저온") h8C3 HE-5로 치료받은 마우스, 또는 치료받지 않은 상태로 방치된 마우스의 체중을 보여주는 일련의 그래프이다.
도 15는 고선량의 213Bi-h8C3 HE-5 또는 저선량의 213Bi-h8C3 HE-5로 치료받은 마우스 또는 치료받지 않은 상태로 방치된 마우스에서 혈액 분석물의 농도를 보여주는 일련의 그래프이다: 도 15a) 알라닌 트랜스아미나제(transaminase)(ALT), 도 15b) 아스파르테이트 트랜스아미나제(AST), 도 15c) 우레아, 및 도 15d) 크레아티닌.
도 16a 내지 16c는 8개의 군으로 무작위 배정되었고 0일째 날 단회 선량 400 μCi 213-h8C3 HE-5, 또는 0일째 날 및 3일째 날 400 μCi 213-h8C3 HE-5, 또는 0일째 날, 3일째 날 및 7일째 날 400 μCi 213-h8C3 HE-5로 치료받은 종양 보유 마우스에서 종양 부피의 변화를 보여주는 일련의 그래프이다. 16일째 날, 단회 선량 군의 마우스를 또 다른 400 μCi 213-h8C3 HE-5 선량으로 치료하였다.
도 17은 8개의 군으로 무작위 배정되었고 0일째 날 단회 선량 400 μCi 213-h8C3 HE-5, 또는 0일째 날 및 3일째 날 400 μCi 213-h8C3 HE-5, 또는 0일째 날, 3일째 날 및 7일째 날 400 μCi 213-h8C3 HE-5로 치료받은 종양 보유 마우스에서 체중의 변화를 보여주는 그래프이다. 16일째 날, 단회 선량 군의 마우스를 또 다른 400 μCi 213-h8C3 HE-5 선량으로 치료하였다.
도 18은 8개의 군으로 무작위 배정되었고 0일째 날 단회 선량 400 μCi 213-h8C3 HE-5, 또는 0일째 날 및 3일째 날 400 μCi 213-h8C3 HE-5, 또는 0일째 날, 3일째 날 및 7일째 날 400 μCi 213-h8C3 HE-5로 치료받은 종양 보유 마우스에서 백혈구 세포(도 18a), 적혈구 세포(도 18b) 및 혈소판(도 18c)의 혈액 카운트를 보여주는 일련의 그래프이다. 16일째 날, 단회 선량 군의 마우스를 또 다른 400 μCi 213-h8C3 HE-5 선량으로 치료하였다.
도 19는 8개의 군으로 무작위 배정되었고 0일째 날 단회 선량 400 μCi 213-h8C3 HE-5, 또는 0일째 날 및 3일째 날 400 μCi 213-h8C3 HE-5, 또는 0일째 날, 3일째 날 및 7일째 날 400 μCi 213-h8C3 HE-5로 치료받은 종양 보유 마우스에서 혈액 분석물의 농도를 보여주는 일련의 그래프이다: 도 19a) 알라닌 트랜스아미나제(ALT), 도 19b) 아스파르테이트 트랜스아미나제(AST), 도 19c) 우레아, 및 도 19d) 크레아티닌. 16일째 날, 단회 선량 군의 마우스를 또 다른 400 μCi 213-h8C3 HE-5 선량으로 치료하였다.
도 20은 CHXA" 접합된 h8C3 HE-5 항체와 함께 5:1 mCi/mg 비활성에서 200 μCi 111In을 주사한 후 1시간, 4시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 216시간에서 마우스의 일련의 microSPECT/CT 영상이다.
도 21은 벌크 풀(pool) 세포 생장을 보여주는 그래프이다.
도 22는 포르테바이오 옥테트 레드(ForteBio Octet Red)에 의해 측정된 벌크 풀 역가 프로파일을 보여주는 그래프이다.
도 23은 항체를 발현하는 세포의 96웰 플레이트에 걸친 역가 프로파일을 보여주는 그래프이다.
도 24는 24웰 플레이트에서 생장하도록 선택된, 도 23으로부터의 상위 120개 발현 풀들의 역가 프로파일을 보여주는 그래프이다. 3개의 수퍼-풀을 선택하였다. 수퍼-풀 1은 106 내지 129 ㎍/㎖의 역가를 가진 3개의 가장 높은 발현자 미니-풀들로 구성되었고, 수퍼-풀 2는 60 내지 75 ㎍/㎖의 역가를 가진 5개의 미니-풀들로 구성되었고, 수퍼-풀 3은 40 내지 58 ㎍/㎖의 역가를 가진 7개의 미니-풀들로 구성되었다.
도 25는 24웰 플레이트 스크리닝으로부터 가장 높은 발현 풀의 순위를 매기는 도표이다. 3개의 수퍼-풀들을 선택하였다. 수퍼-풀 1은 106 내지 129 ㎍/㎖의 역가를 가진 3개의 가장 높은 발현자 미니-풀들로 구성되었고, 수퍼-풀 2는 60 내지 75 ㎍/㎖의 역가를 가진 5개의 미니-풀들로 구성되었고, 수퍼-풀 3은 40 내지 58 ㎍/㎖의 역가를 가진 7개의 미니-풀들로 구성되었다.
도 26은 각각의 수퍼-풀의 생장 곡선을 보여주는 그래프이다.
도 27은 각각의 수퍼-풀의 생존율을 보여주는 그래프이다.
도 28은 각각의 수퍼-풀의 역가 프로파일을 보여주는 그래프이다.
도 29는 단백질 A 센서와 함께 포르테바이오 옥테트 레드를 사용함으로써 11일째 날에 측정된 발현 수준을 기반으로 순위를 매기고 벌크 풀로부터 정제된 8C3 HE-5 항체를 사용함으로써 수득된 표준 곡선과 비교한, 24웰 단계로부터의 클론의 역가 프로파일을 보여주는 그래프이다.
도 30은 24웰 단계로부터 가장 높은 발현 수준을 가진 36개의 클론들을 강조하는 도표이다.
도 31은 각각 1.29 g/ℓ, 1.27 g/ℓ, 1.26 g/ℓ 및 1.25 g/ℓ의 발현 수준을 가진 가장 높은 발현 클론들인 클론 2-3H2, 2-3H11, 2-11H12 및 2-20C3을 강조하는 도표이다.
본원은 멜라닌에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 상기 항체는 키메라 또는 인간화된 항체일 수 있다. 본원은 기재된 항체를 사용하는 방법 및 제조하는 방법도 제공한다. 예를 들면, 멜라닌 항체는 항체 또는 이의 약학 조성물을, 흑색종의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 흑색종의 치료 또는 예방을 위해 치료적으로 사용될 수 있다. 멜라닌 항체는 대상체로부터의 샘플에서 흑색종을 검출하기 위해 진단 목적으로 사용될 수도 있다. 본원에 기재된 멜라닌 항체를 제조하는 방법도 제공한다.
본원에서 달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해된 의미와 동일한 의미를 가진다.
수치 범위는 이 범위를 한정하는 수치를 포함한다.
본 명세서를 해석하기 위해, 하기 정의가 적용될 것이고, 적절할 때마다, 단수형으로 사용된 용어는 복수형도 포함할 것이고 역의 경우도 마찬가지일 것이다. 이하에 기재된 임의의 정의가 참조에 의해 본원에 도입된 임의의 문헌과 불일치하는 경우, 기재된 정의가 우선할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 달리 표시되어 있지 않은 한, 단수형은 복수 지시대상을 포함한다.
본원에 기재된 본 발명의 양태 및 실시양태는 "포함하는", "구성된" 및 "본질적으로 구성된" 양태 및 실시양태를 포괄하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용된 용어 "약"은 본 기술분야에서 숙련된 자에게 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 통상의 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 "약" 값 또는 파라미터의 언급은 그 값 또는 파라미터 그 자체에 대한 실시양태를 포괄한다(그리고 기술한다).
용어의 다른 정의는 본 명세서 전체에 걸쳐 등장할 수 있다.
본원에 기재된 구조적 및 기능적 특성들 중 임의의 특성의 경우, 이 특성들을 확인하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다.
멜라닌 항체
본원은 멜라닌에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 멜라닌은 포유동물 멜라닌, 예를 들면, 인간 멜라닌 또는 뮤린 멜라닌이다. 다른 실시양태에서, 멜라닌은 비-포유동물 멜라닌이다.
본원 전체에서 사용된 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 비-인간 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 항체의 항원 결합 단편(예를 들면, Fab 단편, Fab'2 단편, CDR 또는 ScFv), 항체-약물 접합체, 및 멜라닌 항원에 대한 특이성을 보유하는 다른 항체 단편을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 항체 중 임의의 항체일 수 있다. IgA 항체는 IgA1 또는 IgA2 항체일 수 있다. IgG 항체는 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 또는 IgG4 항체일 수 있다. 이 항체들 중 임의의 항체들의 조합도 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 치료, 검출, 진단, 가시화, 정량, 분류 및 생물학적 어세이에서의 사용을 포함하나, 이들로 한정되지 않는 다양한 목적으로 접합된다.
일부 실시양태에서, 항체는 멜라닌에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체이다. 일부 실시양태에서, 인간화된 항체는 마우스 단일클론 8C3 IgG 항체의 인간화된 버전이다(NCBI GenBank accession number KX346264; Uran ME, Nosanchuk JD, Restrepo A, Hamilton AJ, Gomez BL, Cano LE. Detection of antibodies against Paracoccidioides brasiliensis melanin in in vitro and in vivo studies during infection. Clin Vaccine Immunol. 2011 Oct;18(10):1680-8).
일부 실시양태에서, 항체는 멜라닌에 특이적으로 결합하는 키메라 항체이다. 예시적 실시양태에서, 항체는 키메라 마우스-인간 항체이다. 키메라 마우스-인간 항체는 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 IgG형, 예를 들면, IgG형의 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 IgG형의 불변 영역, 예를 들면, 인간 IgG형의 불변 영역이 아니다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 IgM형, 예를 들면, 인간 IgM형의 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 IgM형, 예를 들면, 인간 IgM형의 불변 영역이 아니다.
표 1은 본원에서 제공된 항체 및 항원 결합 단편에 대한 예시적 서열을 제공한다.
[표 1]
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 표 1에서 제공된 경쇄 서열들 중 어느 한 경쇄 서열의 가변 부분을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 표 1에서 제공된 경쇄 서열들 중 어느 한 경쇄 서열의 가변 부분만을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 표 1에서 제공된 경쇄 서열들 중 어느 한 경쇄 서열에 함유된 CDR을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 표 1에서 제공된 중쇄 서열들 중 어느 한 중쇄 서열에 함유된 CDR을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 표 1에서 제공된 중쇄 서열들 중 어느 한 중쇄 서열의 가변 부분을 포함하는 중쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 표 1에서 제공된 중쇄 서열들 중 어느 한 중쇄 서열의 가변 부분만을 포함하는 중쇄를 포함한다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체의 중쇄는 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 상보성 결정 영역(CDR) 서열들 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체의 중쇄는 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10의 상보성 결정 영역(CDR) 서열들을 포함한다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체의 경쇄는 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 또는 서열번호 15의 CDR 서열들 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체의 경쇄는 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 15의 상보성 결정 영역(CDR) 서열들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체의 경쇄는 서열번호 11, 서열번호 13 및 서열번호 15의 상보성 결정 영역(CDR) 서열들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체의 경쇄는 서열번호 11, 서열번호 14 및 서열번호 15의 상보성 결정 영역(CDR) 서열들을 포함한다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 HE-1, HE-2, HE-3, HE-4, HE-5 및 HE-6으로 구성된 군으로부터 선택된 인간화된 항체이다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 이중특이적 항체이다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 멜라닌을 표적화하는 제1 아암, 및 추가 치료 표적, 예를 들면, 인간 체크포인트 억제제를 포함하는 항원을 표적화하는 제2 아암을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 멜라닌을 표적화하는 제1 아암, 및 면역 체크포인트 억제제를 표적화하는 제2 아암, 예를 들면, CTLA4, PD-1 또는 PD-L1을 표적화하는 제2 아암을 포함한다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 (방사성 핵종, 방사성동위원소 또는 방사성 동위원소로서도 지칭되는) 방사성핵종, 세포독소, 화학요법제, 약물, 효소, 검출가능한 제제, 사이토카인, 호르몬, 올리고뉴클레오타이드 또는 제2 항체를 포함하나, 이들로 한정되지 않는 제제에 접합된다.
또 다른 예시적 실시양태에서, 멜라닌 항체는 세포독소에 접합된다.
또 다른 예시적 실시양태에서, 멜라닌 항체는 마이크로튜불 억제제에 접합된다.
또 다른 예시적 실시양태에서, 멜라닌 항체는 핵산 손상제, 예컨대, DNA 알킬화제, DNA 절단제, DNA 가교결합제, DNA 인터칼레이터 또는 다른 DNA 손상제에 접합된다.
또 다른 예시적 실시양태에서, 멜라닌 항체는 방사성핵종에 접합된다. 멜라닌 항체에 접합되는 특정 방사성핵종의 선택은 조직에서의 방출 범위 및 반감기를 고려하여, 치료될 흑색종 종양의 크기 및 이의 체내 국소화에 의해 결정될 수 있다. 방사성핵종은 알파 방출제, 베타 방출제 및 양전자 방출제를 포함한다.
예시적 방사성핵종은 알파 방출제, 베타 방출제 및 양전자 방출제를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
알파 방출제의 예로는 213-비스무쓰(반감기 46분), 223-라듐(반감기 11.3일), 224-라듐(반감기 3.7일), 225-라듐(반감기 14.8일), 225-악티늄(반감기 10일), 212-납(반감기 10.6시간), 212-비스무쓰(반감기 60분), 211-아스타틴(반감기 7.2시간), 255-페르뮴(반감기 20시간) 및 227-토륨(반감기 18.7일)이 있다.
베타 방출제의 예로는 188-레늄(반감기 16.7시간), 90-이트륨(반감기 2.7일), 32-인(반감기 14.3일), 47-스칸듐(반감기 3.4일), 67-구리(반감기 62시간), 64-구리(반감기 13시간), 77-비소(반감기 38.8시간), 89-스트론튬(반감기 51일), 105-로듐(반감기 35시간), 109-팔라듐(반감기 13시간), 111-은(반감기 7.5일), 131-요오드(반감기 8일), 177-루테튬(반감기 6.7일), 153-사마륨(반감기 46.7시간), 159-가돌리늄(반감기 18.6시간), 186-레늄(반감기 3.7일), 166-홀뮴(반감기 26.8시간), 166-디스프로슘(반감기 81.6시간), 140-란타늄(반감기 40.3시간), 194-이리듐(반감기 19시간), 198-금(반감기 2.7일) 및 199-금(반감기 3.1일)이 있다.
양전자 방출제의 예로는 52Mn(21.1분); 62Cu(9.74분); 68Ga(68.1분); 11C(20분); 82Rb(1.27분); 110In(1.15시간); 118Sb(3.5분); 122I(3.63분); 18F(1.83시간); 34"'Cl(32.2분); 38K(7.64분); 51Mn(46.2분); 52Mn(5.59일); 52Fe(8.28시간); 55Co(17.5시간); 61Cu(3.41시간); 64Cu(12.7시간); 72As(1.08일); 75Br(1.62시간); 76Br(16.2시간); 82"'Rb(6.47시간); 83Sr(1.35일); 86Y(14.7시간); 89Zr(3.27일); 94"'Tc(52.0분); 120I(1.35시간); 124I(4.18일)이 있다(가로안의 반감기). 64-구리는 혼합된 양전자, 전자 및 오제 전자 방출제이다.
예시적 방사성핵종은 99mTc, 201Tl, 133Xe, 11C, 62Cu, 18F, 68Ga, 13N, 15O, 38K, 82Rb, 99 mTc(테크네튬), 188Re, 213Bi(213-비스무쓰), 125I, 131I, 89Zr, 111In, 123I 및 131I도 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 인간화된 항체이고 213B에 접합된다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 HE-1, HE-2, HE-3, HE-4, HE-5 및 HE-6으로 구성된 군으로부터 선택된 인간화된 항체(표 4 참조)이고 213B에 접합된다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고 213B에 접합된다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고 213B에 접합된다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고 213B에 접합된다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고 213B에 접합된다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고 213B에 접합된다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고 213B에 접합된다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고 213B에 접합된다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고 213B에 접합된다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체의 중쇄는 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 CDR 서열들 중 적어도 하나를 포함하고 213B에 접합된다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체의 경쇄는 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 또는 서열번호 15의 CDR 서열들 중 적어도 하나를 포함하고 213B에 접합된다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 인간화된 항체이고 177Lu에 접합된다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 HE-1, HE-2, HE-3, HE-4, HE-5 및 HE-6으로 구성된 군으로부터 선택된 인간화된 항체이고(표 4 참조) 177Lu에 접합된다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고 177Lu에 접합된다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고 177Lu에 접합된다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고 177Lu에 접합된다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고 177Lu에 접합된다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고 177Lu에 접합된다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고 177Lu에 접합된다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고 177Lu에 접합된다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하고 177Lu에 접합된다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체의 중쇄는 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 CDR 서열들 중 적어도 하나를 포함하고 177Lu에 접합된다. 일부 실시양태에서, 인간화된 멜라닌 항체의 경쇄는 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 또는 서열번호 15의 CDR 서열들 중 적어도 하나를 포함하고 177Lu에 접합된다.
상이한 실시양태에서, 치료 목적으로 본원에 기재된 실시양태들 중 어느 한 실시양태에서 방사성핵종의 선량은 1 내지 1000 mCi이다.
일부 실시양태에서, 항체는 1 이상 당량의 제제에 접합된다. 일부 실시양태에서, 항체는 1 당량의 제제에 접합된다. 일부 실시양태에서, 항체는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10 초과 당량의 제제에 접합된다. 일부 실시양태에서, 항체들의 혼합물은 각각의 항체에 접합된 제제의 평균 수가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10 초과이거나, 제제의 당량이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 10 초과인 혼합물이다.
일부 실시양태에서, 항체는 항체에 접합될 수 있는 제제의 수가 조절될 수 있도록 하나 이상의 부위 특이적 아미노산 서열 변형을 포함한다.
또 다른 예시적 실시양태에서, 멜라닌 항체는 소염제에 접합된다.
또 다른 예시적 실시양태에서, 멜라닌 항체는 검출가능한 제제(표지)에 접합된다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 제제는 진단제이다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 검출가능한 표지, 스핀 표지, 비색 표지, 방사성 표지, 효소 표지, 형광 표지 또는 자기 표지에 접합된다.
일부 실시양태에서, 상기 제제는 링커를 통해 멜라닌 항체에 접합된다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 절단가능한 링커를 통해 멜라닌 항체에 접합된다. 일부 실시양태에서, 상기 제제는 절단불가능한 링커를 통해 멜라닌 항체에 접합된다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 고체 표면, 예를 들면, 비드, 수지 또는 마이크로플레이트에 접합되거나 부착된다.
본원은 임의의 포유동물 및 비-포유동물 종으로부터의 멜라닌에 특이적인 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 인간 멜라닌에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 다른 종으로부터의 멜라닌과 교차반응한다.
본원에서 제공된 항체는 특이적으로 멜라닌에 결합한다. 일부 실시양태에서, 이 항체는 특이적 및 선택적으로 멜라닌에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 0.0001 nM 내지 1 μM의 해리 상수(Kd)를 가진다. 예를 들면, 상기 항체의 Kd는 약 1 μM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 5 nM, 약 1 nM, 약 0.5 nM, 약 0.1 nM, 약 0.05 nM, 약 0.01 nM, 약 0.005 nM, 약 0.001 nM, 약 0.0005 nM 또는 심지어 약 0.0001 nM일 수 있다.
멜라닌 항체의 생성
다양한 면역어세이 포맷들을 이용하여, 멜라닌과 특이적으로 면역반응하는 항체를 선택할 수 있다. 예를 들면, 고체-상 ELISA 면역어세이를 이용하여, 멜라닌에 특이적인 단일클론 항체를 선택할 수 있다(예를 들면, 특이적 면역반응성을 확인하는 데 사용될 수 있는 면역어세이 포맷 및 조건의 설명에 대해서는 문헌(Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York) 참조).
본원에서 제공된 항체의 생성은 당분야에서 숙련된 자에게 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 원하는 항체의 원하는 경쇄 및 중쇄를 발현하도록 조작된 재조합 세포에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 항체는 하이브리도마에 의해 생성된다.
일부 실시양태에서, 임의적으로 면역원성 담체에 연결된, 멜라닌 항원을 포함하는 임의의 펩타이드가 표준 프로토콜을 이용한 면역화를 위해 이용된다.
생성된 항체의 품질 및 역가는 당분야에서 공지된 기법을 이용함으로써 평가될 수 있다.
결합 및 발현을 위해, 신호 펩타이드 서열은 관심 있는 항체 성분과 인 프레임(in frame)으로 발현될 수 있다. 표 2는 예시적 신호 펩타이드를 암화화하는 예시적 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩타이드는 항체의 분비에 있어서 세포주를 보조한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩타이드는 "VK-I 영역 워커(Walker)"로서 표기된다. 일부 실시양태에서, 신호 펩타이드는 많은 인간 Ig 카파 쇄들에서 발견된 천연 신호 펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 항체는 세포 시스템에서 합성되고 신호 펩타이드 서열, 예를 들면, 서열번호 16의 서열을 포함한다. 본원에서 제공된 바와 같이, 표 1에서 제공된 예시적 멜라닌 항체 서열들 중 어느 한 항체 서열은 신호 펩타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 서열은 N-말단 신호 펩타이드 서열, 예를 들면, 서열번호 16의 신호 펩타이드 서열과 함께 서열번호 1 내지 7 중 어느 한 서열을 포함한다.
[표 2]
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본원에 기재된 본 발명의 조성물은 항체를 코딩하는 핵산, 항체를 코딩하는 핵산들 중 임의의 핵산을 포함하는 벡터, 및 임의의 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포도 포함한다. 예시적 뉴클레오타이드 서열은 표 3A에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체를 코딩하는 핵산은 신호 펩타이드 뉴클레오타이드 서열, 예를 들면, 서열번호 17의 서열을 추가로 포함한다. 표 3B는 예시적 멜라닌 항체 발현 플라스미드 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
[표 3A]
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[표 3B]
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일부 실시양태에서, 서열번호 18로 기재된 뉴클레오타이드 서열은 멜라닌 항체의 중쇄를 생성하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 19로 기재된 뉴클레오타이드 서열은 멜라닌 항체의 경쇄를 생성하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 20으로 기재된 뉴클레오타이드 서열은 멜라닌 인간화된 항체의 경쇄를 생성하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 21로 기재된 뉴클레오타이드 서열은 멜라닌 인간화된 항체의 경쇄를 생성하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 22로 기재된 뉴클레오타이드 서열은 멜라닌 인간화된 항체의 경쇄를 생성하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 23으로 기재된 뉴클레오타이드 서열은 멜라닌 인간화된 항체의 중쇄를 생성하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 24로 기재된 뉴클레오타이드 서열은 멜라닌 인간화된 항체의 중쇄를 생성하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 25로 기재된 플라스미드 뉴클레오타이드 서열은 멜라닌 인간화된 항체의 경쇄를 생성하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 26으로 기재된 플라스미드 뉴클레오타이드 서열은 멜라닌 인간화된 항체의 경쇄를 생성하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 27로 기재된 플라스미드 뉴클레오타이드 서열은 멜라닌 인간화된 항체의 경쇄를 생성하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 28로 기재된 플라스미드 뉴클레오타이드 서열은 멜라닌 인간화된 항체의 중쇄를 생성하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, 서열번호 29로 기재된 플라스미드 뉴클레오타이드 서열은 멜라닌 인간화된 항체의 중쇄를 생성하는 데 사용된다.
치료 용도
본원은 흑색종의 치료를 위해 치료적으로 사용될 멜라닌 항체를 제공한다.
본원은 치료 유효량의 치료 멜라닌 항체를, 흑색종의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 흑색종 치료 방법도 제공한다. 일부 실시양태에서, 흑색종은 원발성 흑색종이다. 일부 실시양태에서, 흑색종은 전이성 흑색종이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 대상체는 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대, 개, 말, 토끼, 소, 돼지, 햄스터, 게르빌루스쥐, 마우스, 흰담비, 래트, 고양이 등을 비롯한 포유동물로서 분류된 임의의 동물을 지칭한다. 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있다.
임의의 특정 이론에 구속받고자 하지는 않지만, 흑색종 종양 및 전이에서 세포 전환은 신속함으로써, 멜라닌이 멜라닌 항체에 접근할 수 있는 누출성 흑색종 세포의 증가를 초래한다.
본원에서 제공된 치료 멜라닌 항체들 중 임의의 치료 멜라닌 항체는 다른 공지된 약물/치료(예를 들면, 소분자 약물 또는 생물제제)와 함께 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 면역 체크포인트 억제제와 함께 투여될 수 있고; 일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제는 항체 기반 면역 체크포인트 억제제이다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 MEK 억제제와 함께 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 Braf 억제제와 함께 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 암 세포 신호전달 경로를 표적화하는 생물제제 기반 요법과 함께 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 마이크로바이옴 조절 요법, 대사 또는 영양 요법과 함께 투여될 수 있다. 투여는 순차적일 수 있거나 동시적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 전이성 흑색종의 치료를 위해, 멜라닌 항체는 면역요법(예를 들면, 면역 체크포인트 억제제, 예컨대, CTLA4, PD1, PDL-1 억제제)과 함께 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 제제에 접합된다. 일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 방사성핵종에 접합된다.
본원에 기재된 치료 멜라닌 항체의 생체내 투여는 정맥내, 종양내, 두개내, 병변내(예를 들면, 병변내 주사, 직접적인 접촉 확산), 강내(복강내, 흉막내, 자궁내, 직장내), 복강내, 근육내, 피하, 국소, 경구, 경피, 이식, 흡입, 척추강내, 심실내 또는 비내로 수행될 수 있다. 예시적 실시양태에서, 투여 경로는 정맥내 주사이다.
치료 유효량의 치료 항체가 투여될 것이다. 치료 항체의 적절한 용량은 흑색종의 중증도, 대상체의 임상적 상태, 대상체의 임상적 이력 및 치료에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 기반하여 결정될 수 있다.
본원에서 제공된 멜라닌 항체의 용량 양은 투여 경로에 따라 하루에 대상체의 체중 kg당 약 1 ng 내지 약 1000 mg, 또는 더 많은 양일 수 있다. 수일 또는 더 오랜 기간에 걸친 반복된 투여를 위해, 흑색종의 중증도에 따라, 치료는 증상의 원하는 억제가 달성될 때까지 지속될 수 있다. 용법은 의사가 달성하고자 하는 약물동력학적 붕괴의 패턴에 따라 유용할 수 있다. 예를 들면, 개체에게 주마다 1회 내지 21회 투약하는 것이 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 투약 빈도는 하루에 3회, 하루에 2회, 하루에 1회, 이틀마다 1회, 주마다 1회, 2주마다 1회, 4주마다 1회, 5주마다 1회, 6주마다 1회, 7주마다 1회, 8주마다 1회, 9주마다 1회, 10주마다 1회, 또는 월마다 1회, 2개월마다 1회 또는 3개월마다 1회이거나 더 길다. 요법의 진행은 통상적인 기법 및 어세이에 의해 모니터링될 수 있다. 용법은 사용된 용량과 관계없이 시간에 따라 변경될 수 있다.
약학 조성물
본 개시는 치료 멜라닌 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 멸균 조성물이다. 상기 약학 조성물은 일반적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 중에 유효량의 치료 항체를 포함한다.
진단 용도
본원에서 제공된 멜라닌 항체는 진단 및 영상화 목적으로 사용될 수 있다. 적용에 따라, 멜라닌 항체는 생체내 또는 시험관내에서 검출될 수 있고 정량될 수 있다.
멜라닌 항체는 흑색종 종양 세포, 또는 정상 조직 내의 멜라닌 침착물을 검출하거나, 위치를 확인하거나 정량함으로써 진단 목적으로 사용될 수 있다.
본원에서 제공된 멜라닌 항체는 다양한 면역어세이들에서 사용되도록 개량될 수 있다. 이 면역어세이들은 효소-연결 면역흡착 어세이(ELISA), 웨스턴 블롯, 방사면역어세이(RIA), 유세포분석, 방사면역어세이, 면역형광 어세이, 분광광도측정, 방사선촬영, 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 또는 박층 크로마토그래피(TLC)를 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 제공된 멜라닌 항체는 예를 들면, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 형광, 전기적, 광학적 또는 화학적 방법에 의해 검출될 수 있는 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 본 발명에서 유용한 표지는 형광 염료, 방사성표지, 효소, 비색 표지, 아비딘 또는 바이오틴을 포함하나, 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 멜라닌 항체는 핵의학 장치(SPECT, PET 또는 신티그래피)에 의한 영상화에 유용한 동위원소로 방사성표지된다.
진단 멜라닌 항체는 원발성 흑색종의 진단, 전이의 모니터링, 또는 치료에 대한 반응의 확인을 위해 사용될 수 있다.
키트 및 제 품
본원은 예를 들면, 치료 또는 진단 용도를 위한, 멜라닌 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 키트는 임의의 이차 항체, 면역조직화학 분석을 위한 시약, 약학적으로 허용가능한 부형제 및 설명서 매뉴얼로부터 선택된 구성요소, 및 이들의 임의의 조합을 추가로 함유한다. 일부 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께, 본원에 기재된 치료 조성물들 중 어느 하나 이상의 치료 조성물을 포함한다.
본원은 본원에 기재된 치료 또는 진단 조성물들, 또는 키트들 중 어느 한 조성물 또는 키트를 포함하는 제품도 제공한다. 제품의 예로는 바이알(예를 들면, 밀봉된 바이알)이 있다.
예시적 실시양태
본 발명은 하기 나열된 예시적 실시양태들을 참조함으로써 정의될 수 있다.
실시양태 1. 멜라닌에 특이적으로 결합하는 키메라 또는 인간화된 단일클론 항체.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, 키메라 항체인 항체.
실시양태 3. 실시양태 2에 있어서, 키메라 마우스-인간 항체인 항체.
실시양태 4. 실시양태 3에 있어서, 키메라 항체가 마우스 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 것인 항체.
실시양태 5. 실시양태 1 내지 4 중 어느 한 실시양태에 있어서, 멜라닌 항체가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 것인 항체.
실시양태 6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 한 실시양태에 있어서, 멜라닌 항체가 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 항체.
실시양태 7. 실시양태 1 내지 4 중 어느 한 실시양태에 있어서, 멜라닌 항체가 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 항체.
실시양태 8. 실시양태 1에 있어서, 인간화된 항체인 항체.
실시양태 9. 실시양태 8에 있어서, 마우스 단일클론 항체의 서열의 인간화된 형태인 항체.
실시양태 10. 실시양태 9에 있어서, 마우스 8C3 항체의 인간화된 형태인 항체.
실시양태 11. 실시양태 1 및 8 내지 10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 멜라닌 항체가 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 것인 항체.
실시양태 12. 실시양태 1 및 8 내지 10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
실시양태 13. 실시양태 11 또는 12에 있어서, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
실시양태 14. 실시양태 11 또는 12에 있어서, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
실시양태 15. 실시양태 11 또는 12에 있어서, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
실시양태 16. 실시양태 11 또는 12에 있어서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
실시양태 17. 실시양태 11 또는 12에 있어서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
실시양태 18. 실시양태 11 또는 12에 있어서, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
실시양태 19. 실시양태 1 내지 10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 멜라닌 항체의 중쇄가 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 CDR 서열들 중 적어도 하나를 포함하는 것인 항체.
실시양태 20. 실시양태 1 내지 10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 멜라닌 항체의 경쇄가 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 또는 서열번호 15의 CDR 서열들 중 적어도 하나를 포함하는 것인 항체.
실시양태 21. 실시양태 1 내지 10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 멜라닌 항체의 중쇄가 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 CDR 서열들 중 적어도 하나를 포함하고, 멜라닌 항체의 경쇄가 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14 또는 서열번호 15의 CDR 서열들 중 적어도 하나를 포함하는 것인 항체.
실시양태 22. 실시양태 1 내지 10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 멜라닌 항체의 중쇄가 서열번호 8, 서열번호 9 또는 서열번호 10으로부터의 CDR 서열을 포함하고/하거나, 경쇄가 서열번호 3 또는 서열번호 4로부터의 CDR 서열을 포함하는 것인 항체.
실시양태 23. 실시양태 1 및 8 내지 10 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항원 결합 단편인 항체.
실시양태 24. 실시양태 1 내지 23 중 어느 한 실시양태에 있어서, 이중특이적 항체인 항체.
실시양태 25. 실시양태 24에 있어서, 이중특이적 항체가 멜라닌을 표적화하는 제1 아암, 및 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 항원을 표적화하는 제2 아암을 포함하는 것인 항체.
실시양태 26. 실시양태 25에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 CTLA4, PD-1 또는 PD-L1인 항체.
실시양태 27. 실시양태 1 내지 26 중 어느 한 실시양태에 있어서, 제제에 접합된 항체.
실시양태 28. 실시양태 27에 있어서, 제제가 방사성핵종인 항체.
실시양태 29. 실시양태 28에 있어서, 방사성핵종이 213-Bi인 항체.
실시양태 30. 실시양태 28에 있어서, 방사성핵종이 177-Lu인 항체.
실시양태 31. 실시양태 27 내지 30 중 어느 한 실시양태에 있어서, 제제가 링커를 통해 항체에 접합된 것인 항체.
실시양태 32. 실시양태 1 내지 31 중 어느 한 실시양태의 항체 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
실시양태 33. 치료 유효량의 실시양태 1 내지 32 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 조성물을, 흑색종의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 흑색종을 치료하는 방법; 또는 대안적으로, 흑색종의 치료에 사용하기 위한 치료 유효량의 실시양태 1 내지 31 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 실시양태 32의 조성물.
실시양태 34. 실시양태 33에 있어서, 흑색종이 전이된 것인 방법, 항체 또는 조성물.
실시양태 35. 실시양태 33에 있어서, 투여가 흑색종 세포의 세포 사멸을 선택적으로 유도하는 것인 방법, 항체 또는 조성물.
실시양태 36. 실시양태 33 내지 35 중 어느 한 실시양태에 있어서, 유효량의 적어도 하나의 추가 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법, 항체 또는 조성물.
실시양태 37. 실시양태 36에 있어서, 제제가 면역 체크포인트 억제제인 방법, 항체 또는 조성물.
실시양태 38. 실시양태 37에 있어서, 면역 체크포인트 억제제가 CTLA-4, PD-1 및 PDL-1로부터 선택된 것인 방법, 항체 또는 조성물.
실시양태 39. 실시양태 33 내지 38 중 어느 한 실시양태에 있어서, 항체 또는 조성물이 정맥내로 투여되는 것인 방법, 항체 또는 조성물.
실시양태 40. 실시양태 1 내지 31 중 어느 한 실시양태의 항체를 제제에 접합시키는 단계를 포함하는, 접합된 항체를 제조하는 방법.
실시양태 41. 실시양태 40에 있어서, 제제가 방사성핵종인 방법.
실시양태 42. 실시양태 41에 있어서, 방사성핵종이 213-Bi인 방법.
실시양태 43. 실시양태 41에 있어서, 방사성핵종이 177-Lu인 방법.
실시양태 44. 실시양태 1 내지 31 중 어느 한 실시양태의 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
실시양태 45. 실시양태 44에 있어서, 서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
실시양태 46. 실시양태 44에 있어서, 서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
실시양태 47. 실시양태 44 내지 46 중 어느 한 실시양태에 있어서, 서열이 인간에서 발현되도록 코돈 최적화된 것인 폴리뉴클레오타이드.
실시양태 48. 실시양태 44의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
실시양태 49. 실시양태 48의 벡터를 포함하는 세포주.
실시양태 50. 실시양태 1 내지 32 중 어느 한 실시양태의 항체 또는 조성물을 포함하는 키트.
하기 실시예는 예시 목적으로 포함되고 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아니다.
실시예
실시예 1: 키메라 및 인간화된 멜라닌 항체의 구축 및 시험관내 시험
8C3 뮤린 단일클론 IgG 멜라닌 항체(NCBI GenBank accession number KX346264; Uran ME, Nosanchuk JD, Restrepo A, Hamilton AJ, Gomez BL, Cano LE. Detection of antibodies against Paracoccidioides brasiliensis melanin in in vitro and in vivo studies during infection. Clin Vaccine Immunol. 2011 Oct;18(10):1680-8)로부터 마우스-인간 키메라 항체를 생성하였다. 상기 키메라 항체는 인간 불변 영역 및 마우스 가변 영역을 가진다. 키메라 8C3 항체는 본원에서 "8C3 키메라" 또는 "키메라 8C3" 또는 "키메라 8C3 hIgG1"로서 상호교환가능하게 지칭된다.
8C3-hIgG1 키메라 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 2개의 재조합 발현 벡터들을 생성하였다(pAB11-8C3-hIgG1 및 pAB2-8C3-hKappa, 도 4). 그 다음, 표준 기법을 이용하여 이 벡터들을 포유동물 숙주 세포 내로 형질감염시켰다.
인간화된 8C3 항체의 2개의 감마 중쇄 및 3개의 카파 경쇄를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 생성하였다(도 4).
항체의 중쇄 부분 및 경쇄 부분을 발현하였을 때, 포유동물 숙주 세포는 생성된 단백질을 숙주 배지 내로 분비하였다. 그 후, 표준 기법을 이용하여 숙주 세포가 배양된 숙주 세포 배지로부터 상기 항체를 회수하였다.
인간화된 8C3 중쇄 및 경쇄의 집합체를 생성하였다.
ELISA 어세이로 키메라 및 인간화된 항체의 시험관내 활성을 평가하였다. 세피아 오피시날리스로부터 유래한 멜라닌(시그마(Sigma), 미조리주 세인트 루이스 소재, 시그마 Cat#M2649-100MG, Lot#103H1023V, PBS 중의 5 ㎎/㎖). 80 ㎍/㎖에서 시작하는 8회 5배 연속 희석을 각각의 시험 샘플에 대해 수행하였다. (10 ㎍ 멜라닌/웰) 단일 어세이 플레이트를 이용하여 모든 6개의 인간화된 항체들, 마우스 8C3 모 항체, 키메라 8C3 항체, 및 마우스 및 인간 IgG1 음성 대조군 항체를 시험하였다. 바이오티닐화된 염소 항-인간 IgG Fc 및 염소 항-마우스-Fc 항체를 사용하였다. 스트렙타비딘-HRP를 사용하여 마우스 바이오티닐화된 항체 및 인간화된 바이오티닐화된 항체 둘 다를 검출하였고 바이오티닐화된 키메라 8C3도 검출하였다. 스트렙타비딘-HRP(써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), 매사추세츠주 왈쌈 소재)를 1 ㎎/㎖부터 1:1000으로 희석하여, 바이오티닐화된 키메라 8C3과 멜라닌의 결합을 검출하였다. 바이오티닐화된 염소 항-마우스 IgG-Fc(ABCAM, 영국 캠브리지 소재) 또는 바이오티닐화된 염소 항-인간 IgG-Fc(ABCAM, 영국 캠브리지 소재)를 1 ㎎/㎖부터 1:1000으로 희석하여, 마우스 대조군 또는 인간 8C3 및 인간 대조군을 각각 결합시켰고, 스트렙타비딘-HRP를 검출에 사용하였다. 450 nm 방출 필터를 이용하여 형광 플레이트 판독기에서 웰 내용물의 광학 밀도(OD)를 판독하였다. 곡선-피트 프로그램을 이용하여 표준 곡선을 생성하였고, 이 곡선으로부터 샘플 및 대조군 농도를 내삽하였다.
표 4는 시험 샘플을 보여준다(HE는 인간화된 항체를 지칭한다).
[표 4]
Figure pct00025
도 1 및 2는 별도의 실험에서 어세이된, 키메라 8C3 및 인간화된 8C3 항체와 멜라닌의 결합의 결과를 보여준다. 이 어세이에서, 키메라 8C3은 인간화된 8C 변이체(8C3 HE-1 내지 8C3 HE-6)보다 세피아 오피시날리스로부터의 멜라닌에 더 강한 결합을 나타낸다.
표 5는 10 ㎍/㎖의 항체 농도에서 평균 흡광도 값을 표로 작성한 결과를 보여준다. 이 결과는 도 1에서 제시된 어세이에 상응한다.
[표 5]
Figure pct00026
표 6은 16 ㎍/㎖의 항체 농도에서 평균 흡광도 값을 표로 작성한 결과를 보여준다. 이 결과는 도 2에서 제시된 어세이에 상응한다.
[표 6]
Figure pct00027
도 2 및 3은 키메라 8C3 및 마우스 8C3 모항체와 세피아 오피시날리스로부터의 멜라닌의 결합을 보여준다. 도 3은 마우스 8C3보다 더 강한 멜라닌에의 결합을 입증하고, 시험 샘플에 대한 평균 흡광도 값은 표 7에서 제공되어 있다.
[표 7]
Figure pct00028
도 3은 마우스 8C3과 멜라닌의 용량 의존적 결합을 보여주는 그래프이다.
도 4는 키메라 및 인간화된 항체의 중쇄 및 경쇄의 발현을 위해 사용된 플라스미드의 개략도를 제공한다.
도 5는 키메라 8C3 중쇄의 아미노산 서열(8C3-hIgG1 키메라) 및 예측된 상보성 결정 영역(CDR; 굵은 글자체로 표시됨)과, 2개의 인간화된 8C3 중쇄(VH3A 및 VH3B)의 아미노산 서열 및 예측된 상보성 결정 영역의 정렬을 보여준다. 도 6은 키메라 8C3 경쇄의 아미노산 서열(8C3-hKappa 키메라) 및 예측된 상보성 결정 영역(CDR; 굵은 글자체로 표시됨)과, 3개의 인간화된 8C3 경쇄(VK1A, VK1B, VK4)의 아미노산 서열 및 예측된 상보성 결정 영역의 정렬을 보여준다. 중쇄 및 경쇄 각각에 대한 컨센서스 서열은 서열 정렬 아래에 나열되어 있다.
표 8은 ExPasy ProtParam 수단을 이용하여 인간화된 항체의 화학적 및 물리적 성질을 제공한다.
[표 8]
Figure pct00029
Figure pct00030
실시예 2: 생체내 시험: 항체 조직 생체분포의 확인
111인듐으로 방사성표지하기 위해, 표준 방법을 이용하여 항-멜라닌 항체(인간화된 8C3(HE-5, 표 6 참조, 마우스 8C3, 및 키메라 8C3) 및 대조군 IgG1 항체를 먼저 이작용성 킬레이팅제 CHXA"{N-[2-아미노-3-(p-이소티오시아네이토페닐)프로필]-트랜스-사이클로헥산-1,2-디아민-N,N',N",N"',N""-펜타아세트산}에 접합시켰다. CHXA" 리간드는 항체에 비해 2배 몰 과량으로 사용되었다. 그 다음, 상기 항체를 표준 방법에 따라 111인듐으로 방사성표지하였다. 111인듐은 2 μCi/㎍의 비활성을 가졌다.
백만 개의 B16-F10 뮤린 흑색종 세포를 표준 프로토콜에 따라 매트리겔을 함유하는 조직 배양 배지에 현탁하였다. 상기 세포를 표준 절차에 따라 C57BL/6 마우스들의 우측 옆구리에 주사하였다. (주사 후) 4일째 날, 촉진가능한 종양이 관찰되었다.
종양 세포 생착 후 8일째 날, 다양한 장기들에서 방사성표지된 인간화된 8C3 HE-5, 마우스 8C3 및 키메라 8C3 항체의 조직 생체분포를 측정하였다. 표준 절차에 따라 조직 그램당 주사된 선량(ID/g, %)의 관점에서 흡수를 계산하였다. 상기 언급된 항체의 정맥내 주사 후 2개의 상이한 시점, 즉 4시간 및 24시간에서 방사성표지된 항체의 흡수를 측정하였다.
종양에 결합한 방사성표지된 인간화된 8C3 HE-5, 마우스 8C3 및 키메라 8C3 항체, 및 대조군 인간 IgG1 항체의 양을 표준 방법에 따라 종양-대-혈액 비의 관점에서 계산하였다. 각각의 종양 보유 마우스는 30 μCi의 111인듐-mAb를 제공받았고, 주사 후 2개의 상이한 시간 간격, 즉 4시간 및 24시간에서 순환(즉, 종양에 결합되지 않은) 방사성표지된 항체의 양을 측정하였다.
도 7은 임의의 mAB 기반 항-멜라닌 또는 대조군 치료를 받기 전 B16-F10 흑색종 종양(흑색 원으로 표시됨)을 보유하는 대표적인 C57BL/6 마우스를 보여준다. 도 8a 내지 8d는 항체 주사 후 2개의 상이한 시점(4시간 및 24시간)에서 다양한 장기들에서의 방사성표지된 멜라닌 결합 항체의 흡수를 비-특이적 인간 IgG 항체 대조군의 흡수와 비교한 생체분포 실험의 결과를 보여준다. 흡수는 조직 그램당 주사된 선량(ID/g, %)의 관점에서 계산되었다. 마우스 8C3 항체의 종양 흡수는 키메라 8C3 및 인간화된 8C3 항-멜라닌 항체의 종양 흡수(둘 다 유사함)에 비해 더 높았다. 멜라닌 함유 장기(예컨대, 눈 및 꼬리)에서, 마우스 8C3, 인간화된 8C3 및 키메라 8C3 멜라닌 항체의 흡수는 인간 IgG 항체 대조군의 흡수와 유사하였다.
도 9는 종양에 결합한 방사성표지된 멜라닌 결합 항체의 양의 대용물 측정을 제공하는 종양-대-혈액 비 계산의 결과를 보여준다. 비록 뮤린 8C3 항체의 종양-대-혈액 비가 4시간 시점에서 인간화된 8C3 및 키메라 8C3 항체의 종양-대-혈액 비보다 더 높았을지라도, 뮤린 8C3, 인간화된 8C3 및 키메라 8C3 항체는 24시간 시점에서 유사한 종양-대-혈액 비를 나타내었다.
실시예 3: 후속 마우스 및 인간 선량측정 계산을 위한 인간화된 8C3 HE-5의 상세한 생체분포
모든 동물 연구들은 사스캐처원 대학의 동물 연구 윤리위원회에 의해 승인받았다. 영상화 연구를 위해, 매트리겔(코닝(Corning), 미국 소재) 중의 5x105개의 B16-F10 뮤린 흑색종 세포를 찰스 리버 래보러토리스(Charles River Laboratories)(미국 소재)로부터 입수된 6주령 C57BL6 암컷 마우스들의 우측 옆구리에 피하 주사하였다.
BCA CHXA"와 8C3 HE-5의 접합. 10X 접합 완충제(0.05 M 탄산염/중탄산염, 0.15 M NaCl, 5 mM EDTA, pH 8.6-8.7) 5 ㎖를 0.5 M EDTA(pH = 8.0)(0.5 ㎖)와 조합하고 탈이온수로 50 ㎖ 팔콘 튜브에 50 ㎖까지 희석하여 1X 완충제를 제공하였다. 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 0.5 ㎖ 원심분리 필터(30K MW 컷오프, 피셔(Fisher))를 2 mg의 인간화된 8C3 HE-5(h8C3 HE-5) 항체로 적재하였다. 4℃에서 아미콘 농축기를 이용하여 냉장된 원심분리기에서 1.5 ㎖ 세척을 6회 수행함으로써 상기 항체를 상기 접합 완충제 내로 교환하였다. 최종 부피는 2 mg의 항체를 함유하는 약 250 ㎕이어야 한다. 완충제 교환이 거의 완료되었을 때, CHXA"를 접합 완충제에 용해시킴으로써 2 ㎎/㎖ 농도를 가진 이작용성 CHXA" 리간드 용액을 제조하였다. 상기 항체를 아미콘으로부터 회수하였고, 접합 완충제 중의 2 ㎎/㎖ CHXA" 용액 23.6 ㎕를 첨가하여 항체에 비해 5배 몰 과량의 CHXA"를 제공하였다. 반응 혼합물을 1.5시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 그 다음, 4℃에서 냉장된 원심분리기에서 아미콘 농축기로 1.5 ㎖ 세척을 6회 수행함으로써 반응 혼합물을 0.15 M 아세트산암모늄 완충제(pH = 6.5-7.0) 내로 정제하였다. 샘플을 4℃에서 저장하였다. 브래드포드 어세이를 수행하여 단백질 회수 및 농축을 확인하였다.
111 인듐( 111 In)을 사용한 항체-CHXA" 접합체의 방사성표지. 항체-CHXA" 접합체 111In의 방사성표지를 수행하여, 항체 ㎍당 대략 5 μCi의 비활성을 달성하였다. 600 μCi의 111In 염화물을 10 ㎕의 0.15 M 아세트산암모늄 완충제에 첨가하였고 0.15 M 아세트산암모늄 완충제 중의 120 ㎍ h8C3 HE-5-CHXA" 접합체를 함유하는 마이크로원심분리 튜브에 첨가하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 60분 동안 항온처리한 후, 3 ㎕의 0.05 M EDTA 용액을 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 0.15 M 아세트산암모늄 완충제를 용출제로서 사용하여 SG-iTLC로 방사성표지의 백분율을 측정하였다(표지되지 않은 111In을 함유하는 상층, 단백질 접합된 111In을 함유하는 하층). 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 2470 자동 감마 카운터에서 SG-iTLC를 판독하였다.
생체분포. 마우스 내의 종양이 대략 200 mm3에 도달하였을 때, 마우스들을 5개의 동물 군들로 무작위 배정하였고 50 μCi의 111In- h8C3 HE-5를 꼬리 정맥을 통해 IV 주사하였다. 방사성표지된 항체의 주사 후 소정의 시점, 즉 1시간, 2시간, 24시간, 48시간 및 72시간에서, 마우스를 인도적으로 희생시켰고, 그의 주요 장기, 혈액 및 종양을 제거하여 중량을 측정하였고 퍼킨 엘머 2470 자동 감마 카운터에서 카운팅하였다(도 10 참조). 생체분포의 결과를 제안된 치료 방사성핵종 213Bi 및 177Lu에 대한 마우스 및 인간 선량측정 계산에 사용하였다.
실시예 4: 213Bi- 및 177Lu-표지된 h8C3 HE-5에 대한 인간 선량측정 계산
이 후속 실시예는 마우스 데이터로부터 가설적으로 외삽된, 인간에서의 Bi-213 및 Lu-177에 대한 선량측정 결과를 제공한다. 이하에 기재된 방법은 마우스로부터의 방사선 선량 결과를 인간에 외삽하는 방법이다.
방법
인간 모델에 대한 체류 시간을 마우스 모델로부터 재계산하고 OLINDA1.1과 같은 MIRD 스키마(schema) 실행 소프트웨어를 이용하여 인간 선량을 계산함으로써 외삽을 수행하였다. 방법은 종들 사이의 중량 차이에 기반을 둔 비례를 가정한다(Kirschner AS, Ice RD, Beierwaltes WH, "Radiation-dosimetry of I-131-19-iodocholesterol: J Nucl Med. 16:248-249; 1975):
Figure pct00031
상기 식에서, R h 는 장기 또는 조직에 대한 재계산된 인간 체류 시간이고, R m 은 최초 계산된 마우스 체류 시간이고, O h 는 인간 장기 중량이고, O m 은 마우스 장기 중량이고, B h 는 인간 체중이고, B m 은 마우스 체중이다.
OLINDA 버전 1.1을 이용하여, 상기 언급된 방법으로부터 수득된 재계산된 인간 체류 시간을 이용하여 Bi-213 및 Lu-177에 대한 장기 또는 조직 흡수된 선량을 계산하였다. 분지 붕괴 쇄를 가진 비스무쓰-213의 경우, 자손 생성물 Po-213(97.9%) 및 Tl-209(2.1%)로부터의 기여분을 Bi-213으로부터의 선량과 합산하였다. 이 계산에서, 투여된 밀리큐리당 센티그레이(cGy/mCi)로 정상 장기 및 조직에 흡수된 선량은 선질 계수(quality factor)에 대한 임의의 승수 또는 Bi-213 및 Po-213으로부터의 알파 방출에 대한 상대적 생물학적 효과를 포함하지 않는다.
종양은 OLINDA1.1로부터의 출력 결과에서 표적 장기가 아니지만, 정상 장기 및 조직에 대한 방법과 동일한 방법을 이용하여 이를 별도로 계산할 수 있다. 투여된 유닛 mCi당 센티그레이-당량의 유닛으로 종양 선량을 계산하기 위해, 알파 방출에 기인한 흡수된 모든 선량을 임의 계수 5와 곱하였다(예를 들면, 문헌(Sgouros et al., 1999[Reference: Sgouros G, Ballangrud AM, Jurcic JG, McDevitt MR, Humm JL, Erdi YE, Mehta BM, Finn RD, Larson SM, Scheinberg DA, "Pharmacokinetics and dosimetry of an alpha-particle emitter labeled antibody: 213Bi-HuM195 (anti-CD33) in patients with leukemia," J Nucl Med. 40(11):1935-46; 1999]) 및 문헌(Jurcic et al., 2002 [Reference: Jurcic JG, Larson SM, Sgouros G, McDevitt MR, Finn RD, Divgi CR, Ballangrud ÅM, Hamacher KA, Ma D, Humm JL, Brechbiel MW, Molinet R, and Scheinberg DA, "Targeted α-particle immunotherapy for myeloid leukemia," Blood 100:1233-1239; 2002]) 참조). 알파 입자를 결여하는 루테튬-177로부터 종양 조직에 흡수된 선량을 계산하기 위해서는 이러한 승수가 필요하지 않다. 통상적인 유닛으로 Bi-213에 대해 종양 조직에 흡수된 선량을 수득하기 위해, 센티그레이-당량 선량을 계수 5로 나누어 투여된 cGy/mCi를 산출함으로써, 흡수된 선량을 cGy/mCi로 수득할 수 있다.
추가 주의사항은 인간 위, 소장 및 대장의 선량에 관한 것이다. MIRD 스키마에서, 강(cavity) 조직이 아닌 강 내용물에서의 방사성으로부터 수득된 체류 시간(즉, 시간-적분된 활성 계수 값)만을 사용하여 이 장기 선량을 계산한다. 마우스 데이터는 위 및 장 조직(일시적 내용물이 아님)에서의 활성을 대표하므로, 위, 소장 및 대장은 "나머지" 조직의 일부인 것으로 가정되었다. 나머지는 선량측정을 위한 구체적 측정이 없는 마우스의 모든 조직들을 포함한다. 예를 들면, 마우스 꼬리에서의 활성은 인간 선량측정을 계산하기 위해 상기 방법에 의해 적용될 때 전신의 나머지의 일부로서 간주될 것이다. In-111을 사용한 마우스 연구에서 구체적으로 분석되지 않은, OLINDA1.1 출력물에 나열된 다른 장기들과 마찬가지로, 눈도 나머지의 일부이다.
혈액은 MIRD 스키마에서 전달 구획이고 특정된 장기 또는 조직이 아니므로, OLINDA1.1에서 혈액의 구체적인 선량을 계산하지 않는다. 혈액의 선량은 마우스에서 직접적으로 계산될 수 있으나, OLINDA1.1에서 그 선량을 인간에 외삽하지 않는다.
하기 결과(표 9)에서, 알파 입자, 베타 입자, 광자 및 총계에 대해 Bi-213(플러스 자손 생성물) 및 Lu-177로부터의 선량 기여분이 제공되어 있다. 모든 결과는 E-표기법으로 3자리 유효 숫자까지 제공되어 있다. 선택된 의인관(anthropomorphic) 모델은 인간 성인이었다. 수치 열은 총계 열과 동등하다.
[표 9]
Figure pct00032
Figure pct00033
실시예 5: 213Bi- 및 177Lu-표지된 h8C3 HE-5에 대한 마우스 선량측정 계산
In-111 트레이서 생물동력학(tracer biokinetic) 데이터(보정된 붕괴)를 사용하여, In-111 대신에 Bi-213 또는 Lu-177을 가정함으로써 마우스에서 Bi-213 및 Lu-177로부터의 방사선 선량을 계산하였다. Bi-213 및 Lu-177에 대한 재계산된 유효 데이터를 작도하였고, 작도된 데이터 점에 대한 최적-피트 수학 함수를 수득하였고, 각각의 선원 장기 또는 조직에 대한 최적-피트 함수를 적분하였고, 평형 선량 상수 및 고유 흡수율과 곱하였다.
마우스 데이터를 역 붕괴 보정하여(조직 그램당 퍼센트 투여된 활성), Bi-213(반감기는 45.6분임) 및 Lu-177(반감기는 160시간임)에 대한 유효 데이터(실제 카운트와 관련됨)를 수득하였다. 각각의 장기 및 조직에 대해, 샘플링 시간과 대비하여 유효 데이터 점을 작도하였고, 최적-피트 방정식 파라미터로 선형 최소 제곱 회귀 분석을 수행하여 데이터에 대한 최적-피트 단일(또는 이중) 지수 함수를 수득하였다.
그 다음, 지수 함수를 적분하여, Bi-213 경우 및 Lu-177 경우 둘 다에 대해 무한대(완전한 붕괴)까지 적분된 시간-활성 함수하면적으로 표시된, 투여된 마이크로큐리당 마이크로큐리-시간의 추정치를 수득하였다. 마우스 장기 및 조직에서 모든 방출에 대한 Bi-213 흡수율은 1.0인 것으로 가정되었다. 문헌(Miller WH, Hartmann-Siantar C, Fisher DR, Descalle M-A, Daly T, Lehmann J, Lewis MR, Hoffman T, Smith J, Situ PD, and Volkert WA, "Evaluation of Beta Absorbed Fractions in a Mouse Model for 90Y, 188Re, 166Ho, 149Pm, 64Cu, and 177Lu Radionuclides." Cancer Biother. & Radiopharm. 20(4):436-449; 2005)의 저자들(Miller et al.)에 의해 앞서 개발된 마우스 모델을 사용하여, 측정된 장기 또는 조직으로부터 방출되어 동일한 장기 또는 조직에서 침착된 에너지의 비율에 대해 Lu-177 방출에 대한 모델 값을 계산하였다.
Bi-213 및 Lu-177에 대한 평형 선량 상수를 문헌(Eckerman KF and Endo A, MIRD Radionuclide Data and Decay Schemes, 2nd ed., Reston, Virginia: Society of Nuclear Medicine; 2008)으로부터 수득하였다. Bi-213에 대한 평형 선량 상수는 19.44 g cGy μCi-1 hr-1이고, Lu-177에 대한 평형 선량 상수는 0.315 g cGy μCi-1 hr-1이다. 그 다음, 공지되어 있거나 계산된 평형 선량 상수, 방출된 베타 에너지의 흡수율, 및 완전한 붕괴를 통해 장기 또는 조직에서 체류하는 고유 활성을 사용하여, 투여된 Bi-213 및 Lu-177의 마이크로큐리당 cGy(센티그레이)(cGy/μCi)의 유닛으로 흡수된 선량을 계산함으로써 하기 결과(평균 선량 및 상관계수)를 수득하였다.
마우스 장기에 대한 결과는 표 10에 제시되어 있다:
[표 10]
Figure pct00034
피어슨 적률 상관계수(r)는 변수들의 공분산을 이들의 표준 편차의 곱으로 나눔으로써 정의된, 2개의 변수들 사이의 선형 관계의 강도 및 방향의 측정치이고, 장기 또는 조직에서 일어나는 방사성 전이의 수를 확인하기 위해 곡선하면적을 적분(무한대까지 적분)하는 데 사용된, 데이터와 수학 함수 사이의 상관관계를 표시한다. Bi-213에 대한 r 값은 이의 매우 짧은 반감기 때문에 높고 곡선-피팅을 위해 3개의 시점을 제공하였다.
실시예 6: 177Lu-표지된 h8C3 HE-5 항체에 비해 213Bi-표지된 h8C3 HE-5 항체를 사용한 B16-F10 흑색종 종양의 비교 요법
213Bi/225Ac 생성기를 오크 리지 네이셔날 래보러토리(Oak Ridge National Laboratory)(미국 테네시주 소재)로부터 구입하였고, 177Lu 염화물을 라디오메딕스(Radiomedix)(미국 테네시주 소재)로부터 구입하였다. h8C3 HE-5 항체를 "상세한 생체분포" 단락에 기재된 바와 같이 CHXA" 이작용성 리간드에 접합시켰다. 213Bi 요오드화물의 형태로 방사성표지하기 직전에 213Bi/225Ac 생성기로부터 용출된 213Bi 또는 177Lu로 항체를 방사성표지하였다. 213Bi 또는 Lu을 사용한 항체-CHXA" 접합체의 방사성표지를 수행하여, 상기 항체의 대략 5 μCi/㎍의 비활성을 달성하였다. "고"선량(400 μCi)의 213Bi- 또는 177Lu-표지된 항체를 제조하기 위해, 0.15 M 아세트산암모늄 완충제 중의 400 μCi 방사성핵종 용액을 80 ㎍의 항체-CHXA" 접합체에 첨가하였고; "저"선량(200 μCi)의 213Bi- 또는 177Lu-표지된 항체를 제조하기 위해, 0.15 M 아세트산암모늄 완충제 중의 200 μCi 방사성핵종 용액을 40 ㎍의 항체-CHXA" 접합체에 첨가하였다. 213Bi로 표지하기 위해, 반응 혼합물을 37℃에서 5분 동안 항온처리하였고, 177Lu로 표지하기 위해 60분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 3 ㎕의 0.05 M EDTA 용액을 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 0.15 M 아세트산암모늄 완충제를 용출제로서 사용하여 SG-iTLC로 방사성표지의 백분율을 측정하였다(유리 방사성핵종을 함유하는 상층, 방사성표지된 항체를 함유하는 하층). SG-iTLC를 퍼킨 엘머 2470 자동 감마 카운터에서 판독하였다.
실시예 3에 기재된 바와 같이 5x105개의 B16-10 흑색종 세포를 암컷 C57Bl6 마우스들의 우측 옆구리에 주사하였다. 이들의 종양이 대략 50 mm3에 도달하였을 때, 요법을 위해 상기 마우스들을 사용하였다. 상기 마우스들을 5개의 동물 군들로 무작위 배정하고 고선량의 213Bi-h8C3 HE-5, 또는 저선량의 213-h8C3 HE-5, 또는 고선량의 177Lu-h8C3 HE-5, 또는 저선량의 177Lu-h8C3 HE-5, 또는 80 ㎍의 표지되지 않은("저온") h8C3 HE-5로 치료하였거나 치료되지 않은 상태로 방치하였다. 21일 동안 전자 칼리퍼로 3일마다 이들의 종양을 측정하여 종양 부피를 계산하였다(도 11a 및 11b). 마우스들의 체중을 3일마다 측정하였다(도 14a 및 14b). 백혈구 세포(도 12a 및 13a), 적혈구 세포(도 12b 및 13b) 및 혈소판 카운트(도 12c 및 13c)에 대해 이들의 혈액을 주마다 분석하였다. 실험의 완료 시, 마우스들을 희생시켰고, ALT(도 15a), AST(도 15b), 우레아(도 15c) 및 크레아티닌(도 15d)에 대해 이들의 혈액을 분석하였다.
B16-F10 흑색종의 방사면역요법에서 213Bi- 및 177Lu-표지된 h8C3 HE-5 항체 효능을 비교하였다. 실험의 결과는 흑색종 세포를 사멸시키는 데 있어서 짧은 수명(46분의 물리적 반감기) 알파 방출제 213Bi가 긴 수명(6.7일의 물리적 반감기) 베타 방출제 177Lu보다 훨씬 더 효율적이라는 것을 입증하였다. 임의의 이론에 구속받고자 하지는 않지만, h8C3 HE-5에 의해 흑색종 종양으로 전달된 213Bi의 현저한 효율은 213Bi 붕괴의 빠른 선량 속도와 B16-F10 세포의 공격적 생장(배가 시간 7시간) 사이의 보다 더 우수한 일치에 의해 설명될 수 있는 반면, 더 느리게 붕괴하는 177Lu는 그의 방사선 선량을 전달하기 위해 더 긴 시간을 필요로 하고 이 세포 생장과 일치할 수 없다. 213Bi에 의해 방출된 알파 입자의 상대적인 생물학적 효과(RBE)는 베타 입자의 RBE보다 몇배 더 높음으로써, 더 효율적인 종양 제어를 야기한다.
실시예 7: 213Bi-h8C3 HE-5를 사용한 분획화 요법
비교 치료에서 사용된 모델과 동일한 뮤린 흑색종 모델을 사용하였다. h8C3 HE-5 항체를 비교 치료에서와 같이 213Bi로 방사성표지하였다. 종양 보유 마우스들을 8개의 군들로 무작위 배정하고 0일째 날 단회 선량 400 μCi 213-h8C3 HE-5, 또는 0일째 날 및 3일째 날 400 μCi 213-h8C3 HE-5, 또는 0일째 날, 3일째 날 및 7일째 날 400 μCi 213-h8C3 HE-5로 치료하였다. 16일째 날, 단회 선량 군의 마우스들을 또 다른 400 μCi 213-h8C3 HE-5 선량으로 치료하였다. 종양 부피의 변화는 도 16a, 16b 및 16c에 표시되어 있다. 마우스 체중의 변화는 도 17에 표시되어 있다. 백혈구 세포, 적혈구 세포 및 혈소판에 대한 비교 혈액 카운트는 각각 도 18a, 18b 및 18c에 표시되어 있다. 신장 및 간에 대한 전신 독성은 도 19에 표시되어 있다.
실시예 8: 111In-h8C3 HE-5를 사용한 B16-F10 흑색종 종양 보유 마우스의 microSPECT/CT 영상화
h8C3 HE-5 항체의 마우스 모델 및 111In을 사용한 방사성표지를 기재된 바와 같이 수행하였다. microSPECT/CT(마이크로 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영/컴퓨터 단층촬영) 영상을 MILabs VECTor4(네덜란드) microSPECT/CT 스캐너에서 수집하였고, 포괄적 영상 분석 소프트웨어 팩키지 PMOD(버전 3.9, PMOD 테크놀로지스 인코포레이티드(PMOD Technologies, Inc), 스위스 소재)를 이용하여 프로세싱하였다. CHXA" 접합된 h8C3 HE-5로 5:1 mCi/mg 비활성에서 200 μCi 111In을 사용하여 영상화 연구를 수행하였다. 꼬리 정맥을 통해 2마리의 종양 보유 마우스들에게 정맥내로 주사하였고 주사 후 1시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 216시간에서 엎드린 자세에서 영상화하였다(도 20). 나선 궤도를 사용하여 20 내지 350 keV 범위 동안 초고성능 민감성 마우스(XUHS-M) 시준기를 이용하여 20분 동안 SPECT 데이터를 수집하였다. MILabs 재구축 소프트웨어로 0.4 mm 복셀 격자에서 245 keV 및 171 keV 111In 감마 방출 둘 다를 이용하여 모든 SPECT 영상들을 재구축하였다.
실시예 9: 8C3 HE-5 항체를 발현하는 재조합 세포주의 생성
h8C3 HE-5 항체를 코딩하는 벡터로 CHO DG44 숙주 세포를 형질감염시켰다. 형질감염체를 선택하였고 제한 희석으로 1 라운드의 서브클로닝을 수행하였다. 다음과 같이 표기된 연구 세포 보관물("RCB")의 생성을 위해 3개의 서브클론들을 선택하였다: SUBCLONE-2-3H2, SUBCLONE-2-20C3 및 SUBCLONE-2-3H11.
벌크 풀 및 미니-풀의 형질감염 및 생성
DHFR 결핍 CHO DG44의 형질감염
여기에 기재된 재조합 세포주를 위한 숙주로서 사용된 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 결핍 CHO DG44 세포주는 콜롬비아 대학의 래리 채신 박사(Dr. Larry Chasin)에 의해 개발된, 하이포잔틴 및 타이미딘(HT)에 대한 영양요구체이다. DHFR- CHO 세포주는 CHO K1 세포주 ATCC CCL-61의 EMS 및 γ-방사선-유도된 돌연변이로부터 유래하였다. ATCC CCL-61 세포주는 1958년 테드 퍽 박사(Dr. Ted Puck)에 의해 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus) 난소 조직으로부터 확립된 세포주의 프롤린 영양요구체이다. 채신 박사는 2 라운드의 γ-방사선을 사용하여 DHFR 유전자의 대립유전자들 둘 다를 완전히 결여하는 세포주를 생성하였다.
DHFR- 세포주 DUXB11 및 DG44는 1981년 이후 재조합 단백질의 생성을 위해 사용되어 왔다. 보다 최근에, DG44 세포주를 화학적으로 규정된 무혈청 배지에서 현탁 세포주로서 생장하도록 적응시켰다. 아라겐(Aragen)은 2008년에 인비트로겐(Invitrogen)으로부터 냉동된 배양물로서 현탁-적응된 DG44 세포를 입수하였다(깁코-인비트로겐(Gibco-Invitrogen), 카탈로그 12609-012, 로트 번호 288885). 상기 세포를 화학적으로 규정된 배지인 CHO DG44 배지(인비트로겐)에서 증폭시켰고, 그 배지와 7.5% 세포 배양 등급 DMSO(시그마)의 혼합물에서 냉동시켰다. 상기 세포는 항생제 무함유 배지에서 3회 계대배양되었고 NAMSA에 의해 세균발육저지작용/진균발육저지작용 및 멸균성에 대해 시험되었고 연구 동물 진단 실험실(RADIL)에 의해 IMPACT VII PCR 프로파일에 대해 시험되었고, 바이오니크 테스팅 래보러토리스 인코포레이티드(Bionique Testing Laboratories, Inc.)에 의해 마이코플라스마에 대해 시험되었다. 상기 세포는 특정된 시험 요건을 충족시켰다.
(각각) 항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 플라스미드인 pAB2-8C3-HE-LRLC(VK1)(625.82.2 [PvuI]) 및 pAB11-8C3-HE-LRMRHC(VH3)(625.85.5 [PvuI])는 본원에 기재되어 있다. 상기 플라스미드들은 각각 DHFR 및 네오마이신 선택 마커도 코딩한다. 상기 플라스미드들을 제한효소 PvuI로 하룻밤 동안 분해하여 선형화한 후, 페놀-클로로포름 및 에탄올 침전을 수행하였다. 플라스미드 DNA를 0.1 x TE 완충제에 재현탁하였고 260 nm에서 농도를 측정하였다. 멸균 0.1 x TE 완충제를 첨가하여 DNA를 1 ㎍/㎕로 조절하였다.
1/1 벡터 비를 이용하여 아홉 세트의 네온(Neon) 전기천공을 DG44 숙주 세포에서 수행하였다. 각각의 형질감염을 위해, 10 ㎍ 총량의 DNA를 4.0x106개 세포/㎖의 농도로 재현탁 완충제 R에 현탁된 100 ㎕의 CHO DG44 세포에 첨가하였다. DNA/세포 혼합물을 네온 팁 100 내로 뽑아내었고 1700 V x 20 ms x 1 펄스 프로그램으로 인비트로겐의 네온 전기천공 디바이스를 이용하여 전기천공하였다. 이들 9회의 형질감염과 동시에, GFP 서열을 보유하는 아라겐 AB2 벡터를 사용하여 한 세트의 형질감염을 수행하였다. 전기천공 직후, 형질감염된 세포를 6웰 플레이트에서 8 mM 글루타맥스(Glutamax)로 보충된 2 ㎖의 CD-DG44 배지로 희석하였고 37℃ 및 5% CO2에서 정적 조건에서 배양하였다. 형질감염시킨 지 72시간 후, GFP 형질감염된 세포의 FACS 분석으로 형질감염 효율을 측정하였다. 형질감염시킨 지 72시간 후, GFP 보유 DNA로 형질감염된 세포의 46%가 FACS 분석에 의해 GFP에 대한 양성을 나타내었는데, 이것은 그 단계에서 예상된 평균 일시적 형질감염 효율에 상응하였다.
전기천공시킨 지 3일 후, 각각의 형질감염에 대한 9개의 웰들로부터 세포를 풀링하였고, 배지를 CD-OptiCHO(HT 결핍) + 8 mM 글루타맥스로 교환하였다. 그 다음, 풀을 사용하여 2종의 안정한 선택된 풀(벌크 풀 및 미니-풀)을 생성하였다.
벌크 풀의 생성
상대적으로 짧은 기간(약 3주 내지 4주) 이내에 CHO 유래의 물질을 수득하기 위한 방식으로서 벌크 풀을 생성하였다. G418을 점진적으로 증가시키고(0.25 ㎎/㎖ → 0.5 ㎎/㎖) 정적 플라스크에서 HT 결핍 배지로 영양요구성 DHFR 선택을 수행하여 1개의 벌크 풀을 생성하였다. 세포 생존율이 약 90%로 회복되었을 때 상기 벌크 풀을 진탕 플라스크에 적응시켰다.
추가로, 125 ㎖의 진탕 플라스크를 8 mM 글루타맥스로 보충된 50 ㎖의 CD-OptiCHO 배지에 5x105개 세포/㎖로 시딩함으로써 상기 풀의 성능을 진탕 플라스크에서 평가하였다. 상기 진탕 플라스크를 125 rpm으로 설정된 25 mm 궤도 녹로(orbital throw)를 갖춘 진탕기 플랫폼 위에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 3일째 날, 6일째 날 및 8일째 날, 하이클론(Hyclone)으로부터 입수된, 10 ㎎/ℓ 인비트로겐 재조합 인간 인슐린을 가진 5%(초기 배양 부피)의 셀 부스트(Cell Boost) 7a 및 0.5%(초기 배양 부피)의 셀 부스트 7b를 배양물에 공급하였다. 세포 수를 카운팅하였고(도 21), 컨디셔닝된 배지를 3일째 날, 6일째 날 및 8일째 날, 그리고 9일째 날 이후 매일 채취하였다. 배양물을 11일째 날 5분 동안 2500 rpm에서 원심분리함으로써 약 80% 생존율에서 수거하였다. 정제된 IgG1 항체를 표준물로서 사용하는 단백질 A 센서를 이용하여 포르테바이오 옥테트 레드로 컨디셔닝된 배지 중의 단백질 농도를 측정하였다. 풀로부터 수득된 발현 수준은 도 22에 제시되어 있다.
마지막으로, 컨디셔닝된 배지 중의 8C3 HE-5 항체를 단백질 A 드립 컬럼에서 정제하였고, 정제 분획을 SDS-PAGE로 분석하였다.
미니-풀의 생성
형질감염된 풀을, 200 ㎕ 배지 중의 8 mM 글루타맥스로 보충된 CD-OptiCHO 배지(18 x 96웰 플레이트)에서 영양요구성 DHFR 선택 하에서 웰당 1,000개 세포로 미니-풀로 플레이팅하고 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 배양함으로써, 형질감염시킨 지 3일 후 미니-풀을 생성하였다. 플레이팅한 지 3일 후부터, 4주 기간에 걸쳐 배지 교환을 통해 미니-풀의 G418 농도(0.25 ㎎/㎖ → 0.5 ㎎/㎖ 최종) 및 메토트렉세이트(MTX)(100 nM → 200 nM → 400 nM 최종)를 점진적으로 증가시켰다. 세포 생장(즉, 세포 컨플루언스(confluence)의 증가) 시 적용된 보다 더 높은 선택으로 이 시간 동안 현미경으로 세포 컨플루언스를 모니터링하였다. 약 5주 후, 코팅 항체 및 검출 항체로서 각각 염소-항-인간 IgG-Fc 및 염소-항-인간 카파 쇄-HRP를 사용하여 ELISA로 플레이트를 어세이하였다(도 23).
96웰 플레이트 스크리닝으로부터 수득된 상위 120개의 발현자 미니-풀들을 24웰 플레이트로 확장시키고 24웰 플레이트에서의 발현에 대해 재스크리닝하였다. 세포를 8 mM 글루타맥스로 보충된 CD-OptiCHO 중의 신선한 배지에서 대략 20% 컨플루언스로 새로운 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 컨디셔닝된 배지를 7일째 날 및 11일째 날 수집하였다. 벌크 풀로부터 정제된 8C3 HE-5 항체를 표준물로서 사용하는 단백질 A 센서를 이용하여 포르테바이오 옥테트 레드로 컨디셔닝된 배지 중의 단백질 농도를 측정하였다(도 24).
스크리닝 후, 가장 높은 24웰 플레이트 발현자 미니-풀들을 3개의 수퍼-풀들로 풀링하였다. 3개의 수퍼-풀들을 위해 선택된 미니-풀들의 목록은 도 25에 제시되어 있다. 수퍼-풀 1은 106 내지 129 ㎍/㎖의 역가를 가진 3개의 가장 높은 발현자 미니-풀들로 구성되었고, 수퍼-풀 2는 60 내지 75 ㎍/㎖의 역가를 가진 5개의 미니-풀들로 구성되었고, 수퍼-풀 3은 40 내지 58 ㎍/㎖의 역가를 가진 7개의 미니-풀들로 구성되었다.
생존율이 85%에 도달할 때까지 대략 2주 동안 8 mM 글루타맥스, 0.5 ㎎/㎖ G418 및 400 nM MTX로 보충된 CD-OptiCHO 배지에서 수퍼-풀을 계대배양하였다. 그 때, 수퍼-풀들을 냉동보존하였고 제한 희석으로 프로세싱하였고 유가 진탕기 플라스크에서 발현에 대해 평가하였다.
수퍼-풀의 진탕 플라스크 평가
수퍼-풀을 유가 진탕 플라스크에서 평가하였다. 세포를 250 ㎖ 진탕 플라스크에서 8 mM L-글루타민으로 보충된 50 ㎖의 CD-OptiCHO 배지에 5x105개 세포/㎖로 시딩하였다. 상기 진탕 플라스크를 125 rpm으로 회전하는 25 mm 궤도 녹로를 갖춘 진탕기 플랫폼 위에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 3일째 날, 6일째 날, 8일째 날 및 10일째 날, 10 ㎎/ℓ 인비트로겐 재조합 인간 인슐린으로 보충된 5%의 셀 부스트 7a 및 0.5%의 셀 부스트 7b를 배양물에 공급하였다. 글루코스 및 L-글루타민에 대해 모니터링하고 조절하기 위해 3일째 날, 6일째 날, 8일째 날, 그리고 수거할 때까지 필요할 때마다 NOVA 판독을 수행하였다. 3일째 날, 6일째 날, 8일째 날, 10일째 날, 그리고 그 후 수거할 때까지 매일 세포 카운트 및 배양물의 샘플을 수득하였다. 배양물을 80% 미만의 생존율에서 수거하였다. 생장 곡선 및 생존율은 도 26 및 27에 제시되어 있다. 수퍼-풀 1은 진탕 플라스크에서의 현탁 생장에 수퍼-풀 2 및 수퍼-풀 3으로부터의 세포보다 더 느리게 적응하였고, 그 결과 수퍼-풀 1에 대해 2회 실행의 유가 평가를 수행하였다. 발현 프로파일은 하기 도 28에 제시되어 있다. 수퍼-풀 1 반복으로 가장 높은 발현인 792.3 ㎎/ℓ를 수득하였고 수퍼-풀 2는 462 ㎎/ℓ를 가졌다.
미니-풀 유래의 수퍼-풀의 제한 희석
제한 희석 및 ELISA 스크리닝 클론
3개의 수퍼-풀들을 제한 희석 방법으로 클로닝하였다. 각각의 배양물을 0.5개 세포/웰로 96웰 플레이트에 시딩하였다. 각각의 수퍼-풀에 대해 20개의 96웰 플레이트를 플레이팅하였다. 클로닝 배지는 8 mM 글루타맥스로 보충된 CD OptiCHO, 2 mM 글루타민, 5 ㎍/㎖ 인슐린, 1X HT, 및 벌크 풀 배양물로부터 채취된 동등한 부피의 컨디셔닝된 배지로 구성되었다. 플레이트를 14일 동안 5% CO2와 함께 37℃에서 정적 항온처리기 내에서 배양하였고, 각각의 웰을 0일째 날, 1일째 날, 2일째 날, 5일째 날 또는 7일째 날, 및 13일째 날 또는 14일째 날 솔렌팀(Solentim) 영상화 시스템으로 영상화하였다. 신선한 배지 100 ㎕를 7일째 날 각각의 웰에 첨가하였고, 배지를 14일째 날 바꾸었다. 14일 또는 15일 항온처리 후, 코팅 항체 및 검출 항체로서 각각 염소-항-인간 IgG-Fc 및 염소-항-인간 카파 쇄-HRP를 사용하여 ELISA로 모든 플레이트들을 스크리닝하였다.
솔렌팀 영상 및 ELISA 스크리닝 결과를 기반으로, 단일 세포로부터 유래한 상위 135개의 클론들을 8 mM 글루타맥스, 0.5 ㎎/㎖ G418 및 400 nM MTX로 보충된 CD-OptiCHO 배지에서 24웰 플레이트까지 확장시켰다.
24웰 플레이트까지 확장된 상위 135개의 클론들을 현미경으로 주기적으로 모니터링하였다. 대략 7일 후, 웰은 80% 컨플루언스에 도달하였다. 이 때, 새로운 24웰 플레이트의 웰에서 신선한 배지로 각각의 클론을 20% 컨플루언스로 시딩하였다. 배양물을 37℃ 및 5% CO2에서 정적 조건에서 11일 동안 항온처리하였다. 컨디셔닝된 배지를 7일째 날 및 11일째 날 채취하였다. 단백질 A 센서와 함께 포르테바이오 옥테트 레드를 사용하여 11일째 날 측정한 발현 수준을 기반으로 클론의 순위를 매겼고 벌크 풀로부터 정제된 8C3 HE-5 항체로 수득한 표준 곡선과 비교하였다(도 29). 24웰 발현 수준 프로파일을 기반으로, 95.7 내지 221.8 ㎍/㎖의 발현 수준을 가진 총 36개의 클론들을 T-75로 확장시킨 후 125 ㎖ 진탕 플라스크로 확장시켰다. 24웰 단계에서 상위 36개의 클론들의 발현 수준은 도 30에 요약되어 있다.
진탕 플라스크까지 확장된 상위 36개의 클론들을 7.5% DMSO 및 92.5% CD-OptiCHO 배지에서 냉동보존하였다(각각 3개의 바이알). 상기 바이알들을 날진 크리오(Nalgene Cryo) 1℃ 냉동 용기에 넣고(-1℃/분 냉각률) -80℃에서 저장하였다. 48시간 후, 상기 바이알들을 액체 질소 탱크로 옮겨 저장하였다.
상위 클론의 진탕 플라스크 평가
24웰 플레이트 단계에서 확인된 36개의 상위 발현자 서브클론들 중 35개의 서브클론들은 진탕 플라스크에서의 현탁 생장에 성공적으로 적응하였다. 이 상위 서브클론들을 유가 조건에서 250 ㎖ 진탕 플라스크에서 발현에 대해 평가하였다. 진탕 플라스크를 8 mM L-글루타민으로 보충된 50 ㎖의 CD-OptiCHO 배지에 5x105개 세포/㎖로 시딩하였다. 진탕 플라스크를 125 rpm에서 회전하는 25 mm 궤도 녹로를 갖춘 진탕기 플랫폼 위에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 3일째 날, 6일째 날, 8일째 날 및 10일째 날 5%의 셀 부스트 7a 및 0.5%의 셀 부스트 7b를 배양물에 공급하였다. 글루코스 및 L-글루타민에 대해 모니터링하고 조절하기 위해 3일째 날, 6일째 날, 8일째 날, 그리고 수거할 때까지 필요할 때마다 매일 NOVA 판독을 수행하였다. 한편, 3일째 날, 6일째 날, 8일째 날, 10일째 날, 그리고 그 후 수거할 때까지 매일 세포 카운트 및 배양물의 샘플을 수득하였다. 배양물을 80% 미만의 생존율에서 수거하였다. 세포를 5분 동안 2500 rpm에서 원심분리하였고, 컨디셔닝된 배지를 옮기고 -20℃에서 저장하였다.
클론 2-3H2, 2-3H11, 2-11H12 및 2-20C3은 각각 1.29 g/ℓ, 1.27 g/ℓ, 1.26 g/ℓ 및 1.25 g/ℓ의 발현 수준으로 최고 발현 수준에 도달하였다. 솔렌팀 영상으로부터 분석된 최대 생존 세포 밀도(VCD), 생존율 프로파일, 수거 시 역가, 배양물의 수명 및 클론성은 도 31에 요약되어 있다.
클론 2-3H2, 2-3H11 및 2-20C3은 도 31에 강조되어 있고 연구 세포 보관물의 제조를 위해 선택되었다.
상위 5개의 발현자 클론들로부터 수득된 수거 컨디셔닝된 배지를 SDS-PAGE로 분석하였다. 4 ㎕를 환원 조건 및 비환원 조건에서 각각의 밴드 위에 로딩하였다. 모든 5개의 클론들을 사용하여 환원 조건 및 비환원 조건에서 예상된 분자량 밴드를 수득하였다.
연구 세포 보관물의 제조
솔렌팀으로부터의 수거 시 발현 수준 및 클론성을 기반으로 연구 세포 보관물(RCB)의 제조를 위해 클론 2-3H11, 2-3H3 및 2-20C3을 선택하였다.
각각의 클론을 250 ㎖로 확장시켰고 바이알당 8 mM 글루타맥스로 보충된 1 ㎖ 부피의 7.5% DMSO 및 92.5% CD-OptiCHO 배지에 1x107개의 생존 세포를 가진 36개의 바이알들을 보관함으로써 RCB를 제조하였다. 상기 바이알들을 날진 크리오 1℃ 냉동 용기(-1℃/분 냉각률)에 넣고 -80℃에서 저장하였다. 48시간 후 모든 바이알들을 액체 질소 탱크로 옮겨 저장하였다.
<110> RADIMMUNE THERAPEUTICS, INC. <120> MELANIN ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 2020-FPA-9896 <150> US 62/558,230 <151> 2017-09-13 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain of a melanin Chimeric Antibody (8C3-hIgG1) <400> 1 Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala His Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Gly Phe Phe Ala Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 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gtccctgggt 600 actcagacct acatttgcaa cgtcaaccac aagccttcaa acacgaaagt ggacaagaag 660 gtcgagccga agtcctgcga caaaacccat acttgccctc cttgtccggc tcccgaactg 720 ctgggcggac cttccgtgtt cctcttcccg cctaagccga aagacaccct gatgatcagc 780 aggactccgg aagtgacatg cgtggtggtg gacgtgtcgc acgaggaccc ggaggtcaag 840 tttaattggt acgtggacgg agtggaagtc cacaacgcca agaccaagcc acgggaagaa 900 cagtacaatt ccacctatcg cgtggtgtcc gtgcttaccg tgcttcacca agactggctg 960 aacggaaagg agtacaagtg caaagtgtca aacaaagccc tgcctgcccc aatcgaaaag 1020 accatcagca aggccaaggg gcagcctcgg gaaccccaag tgtacactct cccgccgtca 1080 agagatgaac tgaccaagaa ccaagtgtcc ctcacttgtc tcgtgaaggg attctacccc 1140 tccgatatcg ccgtggagtg ggaatccaac gggcaacccg agaacaacta caagaccacc 1200 cctccggtgc ttgattccga tggctccttc ttcctctact ccaagctgac cgtggacaag 1260 tcaagatggc agcaggggaa cgtgttctcc tgctccgtca tgcacgaggc cctgcacaac 1320 cattacaccc agaagtctct gtcgctgagc ccgggaaaat aa 1362 <210> 19 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAB2 625.48.2 light chain of a chimeric melanin antibody gene (8C3-hKappa) <400> 19 gacatcctga tgactcagtc acccgctagc cttgcggtgt ccctcggaca acgcgccacc 60 atctcctgtc gggcctccga atccgtggac tcctacggca cctccttcat gcactggtac 120 cagcagaagc caggacagcc tcccaagctg ttgatctatc tggcctcgaa tctggaatca 180 ggagtgccgg ctcggttcag cggctccgga tcacgcactg acttcacgct gaccattgac 240 cccgtggagg cagatgacgc cgcgacctac tactgccagc agaacaacga atacccttac 300 actttcggcg ggggtaccaa gctcgaaatc aagcggacag tggcagcccc atcggtgttc 360 attttcccgc cgtcggatga gcagctcaag tccggtactg cctccgtggt ctgcctgctg 420 aacaactttt accctcgcga agcgaaggtc caatggaaag tggataacgc cctccagtcc 480 ggaaactccc aggagtctgt caccgagcag gactcaaagg acagcactta ctccctgtcc 540 tcgactctga ccctgtcgaa ggcagattac gagaagcaca aagtgtacgc ctgcgaagtg 600 acccatcaag gcctttccag cccggtcacc aagagcttca atcgggggga gtgttag 657 <210> 20 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain of a melanin Humanized Antibody (8C3-HE-VK4-hKappa) <400> 20 atggacatga gagtgccggc gcaactgctc ggcctgctgt tgctgtggct gaggggagcc 60 agatgcgaca tcgtgatgac tcagtcaccc gatagccttg cggtgtccct cggagaacgc 120 gccaccatca actgtaaagc ctccgaatcc gtggactcct acggcacctc cttcatgcac 180 tggtaccagc agaagccagg acagcctccc aagctgttga tctatctggc ctcgaatcgg 240 gaatcaggag tgccggaccg gttcagcggc tccggatcac gcactgactt cacgctgacc 300 attagccccg tgcaagcaga ggacgtggcg acctactact gccagcagaa caacgaatac 360 ccttacactt tcggccaggg taccaagctc gaaatcaagc ggacagtggc agccccatcg 420 gtgttcattt tcccgccgtc ggatgagcag ctcaagtccg gtactgcctc cgtggtctgc 480 ctgctgaaca acttttaccc tcgcgaagcg aaggtccaat ggaaagtgga taacgccctc 540 cagtccggaa actcccagga gtctgtcacc gagcaggact caaaggacag cacttactcc 600 ctgtcctcga ctctgaccct gtcgaaggca gattacgaga agcacaaagt gtacgcctgc 660 gaagtgaccc atcaaggcct ttccagcccg gtcaccaaga gcttcaatcg gggggagtgt 720 tagtaa 726 <210> 21 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain of a melanin Humanized Antibody (8C3-HE-VK1A-hKappa) <400> 21 atggacatga gagtgccggc gcaactgctc ggcctgctgt tgctgtggct gaggggagcc 60 agatgcgaca tccagatgac tcagtcaccc tcgagcctta gcgtgtccct cggagatcgc 120 gccaccatca cctgtcgggc ctccgaatcc gtggactcct acggcacctc cttcatgcac 180 tggtaccagc agaagccagg aaagcctccc aagctgttga tctatctggc ctcgaatctg 240 gaatcaggag tgccgtcgcg gttcagcggc tccggatcac gcactgactt cacgctgacc 300 attagccccg tgcaagcaga ggactttgcg acctactact gccagcagaa caacgaatac 360 ccttacactt tcggccaggg taccaagctc gaaatcaagc ggacagtggc agccccatcg 420 gtgttcattt tcccgccgtc ggatgagcag ctcaagtccg gtactgcctc cgtggtctgc 480 ctgctgaaca acttttaccc tcgcgaagcg aaggtccaat ggaaagtgga taacgccctc 540 cagtccggaa actcccagga gtctgtcacc gagcaggact caaaggacag cacttactcc 600 ctgtcctcga ctctgaccct gtcgaaggca gattacgaga agcacaaagt gtacgcctgc 660 gaagtgaccc atcaaggcct ttccagcccg gtcaccaaga gcttcaatcg gggggagtgt 720 tagtaa 726 <210> 22 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain of a melanin Humanized Antibody (8C3-HE-VK1B-hKappa) <400> 22 atggacatga gagtgccggc gcaactgctc ggcctgctgt tgctgtggct gaggggagcc 60 agatgcgaca tccagatgac tcagtcaccc tcgagcctta gcgtgtccgt gggagatcgc 120 gccaccatca cctgtcgggc ctccgaatcc gtggactcct acggcacctc cttcatgcac 180 tggtaccagc agaagccagg aaagcctccc aagctgttga tctatctggc ctcgaatctg 240 cagtcaggag tgccgtcgcg gttcagcggc tccggatcac gcactgactt cacgctgacc 300 attagccccg tgcaagcaga ggactttgcg acctactact gccagcagaa caacgaatac 360 ccttacactt tcggccaggg taccaagctc gaaatcaagc ggacagtggc agccccatcg 420 gtgttcattt tcccgccgtc ggatgagcag ctcaagtccg gtactgcctc cgtggtctgc 480 ctgctgaaca acttttaccc tcgcgaagcg aaggtccaat ggaaagtgga taacgccctc 540 cagtccggaa actcccagga gtctgtcacc gagcaggact caaaggacag cacttactcc 600 ctgtcctcga ctctgaccct gtcgaaggca gattacgaga agcacaaagt gtacgcctgc 660 gaagtgaccc atcaaggcct ttccagcccg gtcaccaaga gcttcaatcg gggggagtgt 720 tagtaa 726 <210> 23 <211> 1428 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain of a melanin Humanized Antibody (8C3-HE-VH3A-hIgG1) <400> 23 atggacatgc gcgtgccggc 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gaaaggagta caagtgcaaa gtgtcaaaca aagccctgcc tgccccaatc 1080 gaaaagacca tcagcaaggc caaggggcag cctcgggaac cccaagtgta cactctcccg 1140 ccgtcaagag atgaactgac caagaaccaa gtgtccctca cttgtctcgt gaagggattc 1200 tacccctccg atatcgccgt ggagtgggaa tccaacgggc aacccgagaa caactacaag 1260 accacccctc cggtgcttga ttccgatggc tccttcttcc tctactccaa gctgaccgtg 1320 gacaagtcaa gatggcagca ggggaacgtg ttctcctgct ccgtcatgca cgaggccctg 1380 cacaaccatt acacccagaa gtctctgtcg ctgagcccgg gaaaataa 1428 <210> 25 <211> 6833 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid encoding the Light Chain of a melanin Humanized Antibody (8C3-HE-VK4-hKappa) <400> 25 tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt 60 tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg 120 tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctgg 180 gaaattgtaa acgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca 240 ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagaccgag 300 atagggttga gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc 360 aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc 420 taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc 480 ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa 540 gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc 600 acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtccc attcgccatt caggctgcgc 660 aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg 720 ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt 780 aaaacgacgg ccagtgagcg cgcgtaatac gactcactat agggcgaatt gggtaccggg 840 ccccccctcg aggtcgacgg tatcgataag cttgatatcg aattcgctgg gctgagaccc 900 gcagaggaag acgctctagg gatttgtccc ggactagcga gatggcaagg ctgaggacgg 960 gaggctgatt gagaggcgaa ggtacaccct aatctcaata caacccttgg agctaagcca 1020 gcaatggtag agggaagatt ctgcacgtcc cttccaggcg gcctccccgt caccacccac 1080 cccaacccgc cccgaccgga gctgagagta attcatacaa aaggactcgc ccctgccttg 1140 gggaatccca gggaccgtcg ttaaactccc actaacgtag aacccagaga tcgctgcgtt 1200 cccgccccct cacccgcccg ctctcgtcat cactgaggtg gagaagagca tgcgtgaggc 1260 tccggtgccc gtcagtgggc agagcgcaca tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga 1320 ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat 1380 gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta 1440 gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg tttgccgcca gaacacaggt aagtgccgtg 1500 tgtggttccc gcgggcctgg cctctttacg ggttatggcc cttgcgtgcc ttgaattact 1560 tccacgcccc tggctgcagt acgtgattct tgatcccgag cttcgggttg aaagtgggtg 1620 ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg 1680 gcttgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac cttcgcgcct atctcgctgc 1740 tttcgataag tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg 1800 gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc 1860 cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg 1920 agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc 1980 tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc 2040 agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc cggccctgct gcagggagct caaaatggag 2100 gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc 2160 gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga 2220 ttagttctcg agcttttgga gtacgtcgtc tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat 2280 ggagtttccc cacactgagt gggtggagac tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta 2340 attctccttg gaatttgccc tttttgagtt tggatcttgg ttcattctca agcctcagac 2400 agtggttcaa agttttttcc ttccatttca ggtgtcgtga aaactacccc taaaagccaa 2460 atctagagcc accatggaca tgagagtgcc ggcgcaactg ctcggcctgc tgttgctgtg 2520 gctgagggga gccagatgcg acatcgtgat gactcagtca cccgatagcc ttgcggtgtc 2580 cctcggagaa cgcgccacca tcaactgtaa agcctccgaa tccgtggact cctacggcac 2640 ctccttcatg cactggtacc agcagaagcc aggacagcct cccaagctgt tgatctatct 2700 ggcctcgaat cgggaatcag gagtgccgga ccggttcagc ggctccggat cacgcactga 2760 cttcacgctg accattagcc ccgtgcaagc agaggacgtg gcgacctact actgccagca 2820 gaacaacgaa tacccttaca 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atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc 3720 cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc 3780 atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat 3840 tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaaa gctagcttcc 3900 cgctgccatc atggttcgac cattgaactg catcgtcgcc gtgtcccaaa atatggggat 3960 tggcaagaac ggagacctac cctggcctcc gctcaggaac gagttcaagt acttccaaag 4020 aatgaccaca acctcttcag tggaaggtaa acagaatctg gtgattatgg gtaggaaaac 4080 ctggttctcc attcctgaga agaatcgacc tttaaaggac agaattaata tagttctcag 4140 tagagaactc aaagaaccac cacgaggagc tcattttctt gccaaaagtt tggatgatgc 4200 cttaagactt attgaacaac cggaattggc aagtaaagta gacatggttt ggatagtcgg 4260 aggcagttct gtttaccagg aagccatgaa tcaaccaggc caccttagac tctttgtgac 4320 aaggatcatg caggaatttg aaagtgacac gtttttccca gaaattgatt tggggaaata 4380 taaacttctc ccagaatacc caggcgtcct ctctgaggtc caggaggaaa aaggcatcaa 4440 gtataagttt gaagtctacg agaagaaaga ctaacaggaa gatgctttca agttctctgc 4500 tcccctccta aagctatgca 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aaaaaggatc ttcacctaga 6120 tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 6180 ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt 6240 catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat 6300 ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag 6360 caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct 6420 ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt 6480 tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg 6540 cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca 6600 aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt 6660 tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat 6720 gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac 6780 cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa 6840 aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt 6900 tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg 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Val 165 170 175 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 180 185 190 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 210 215 220 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240 <210> 38 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light Chain Alignment Consensus <400> 38 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ala Val Ser Leu Gly Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Thr Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Pro Val Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe 130 135 140 Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys 145 150 155 160 Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 165 170 175 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 180 185 190 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser 195 200 205 Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His 210 215 220 Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 240

Claims (52)

  1. 멜라닌에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체로서, 상기 항체는 키메라 또는 인간화된 것인 단일클론 항체.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체는 키메라인 항체.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 항체는 키메라 마우스-인간 항체인 항체.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 키메라 항체는 마우스 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 항체.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 멜라닌 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 멜라닌 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체.
  7. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 멜라닌 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 항체는 인간화된 것인 항체.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 항체는 마우스 단일클론 항체의 서열의 인간화된 형태인 항체.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 항체는 마우스 8C3 항체의 인간화된 형태인 항체.
  11. 청구항 1 및 청구항 8 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 멜라닌 항체는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체.
  12. 청구항 1 및 청구항 8 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 5, 서열번호 6, 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
  13. 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
  14. 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
  15. 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
  16. 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
  17. 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
  18. 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서,
    상기 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
  19. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 멜라닌 항체의 중쇄는 서열번호 8, 서열번호 9, 또는 서열번호 10의 CDR 서열들 중 적어도 하나를 포함하는 항체.
  20. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 멜라닌 항체의 경쇄는 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 또는 서열번호 15의 CDR 서열들 중 적어도 하나를 포함하는 항체.
  21. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 멜라닌 항체의 중쇄는 서열번호 8, 서열번호 9, 또는 서열번호 10의 CDR 서열들 중 적어도 하나를 포함하고, 상기 멜라닌 항체의 경쇄는 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 또는 서열번호 15의 CDR 서열들 중 적어도 하나를 포함하는 항체.
  22. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 멜라닌 항체의 중쇄는 서열번호 8, 서열번호 9, 또는 서열번호 10의 CDR 서열을 포함하고/하거나, 상기 경쇄는 서열번호 13 또는 서열번호 14의 CDR 서열을 포함하는 항체.
  23. 청구항 1 및 청구항 8 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 항원 결합 단편인 항체.
  24. 청구항 1 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 이중특이적 항체인 항체.
  25. 청구항 24에 있어서,
    상기 이중특이적 항체는 멜라닌을 표적화하는 제1 아암(arm) 및 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 항원을 표적화하는 제2 아암을 포함하는 항체.
  26. 청구항 25에 있어서,
    상기 면역 체크포인트 억제제는 CTLA4, PD-1, 또는 PD-L1인 항체.
  27. 청구항 1 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 제제에 접합된 항체.
  28. 청구항 27에 있어서,
    상기 제제는 방사성핵종인 항체.
  29. 청구항 28에 있어서,
    상기 방사성핵종은 213-Bi인 항체.
  30. 청구항 28에 있어서,
    상기 방사성핵종은 177-Lu인 항체.
  31. 청구항 27 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제제는 링커를 통해 상기 항체에 접합되는 항체.
  32. 청구항 1 내지 청구항 31 중 어느 한 항의 항체 및 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  33. 치료 유효량의 청구항 1 내지 청구항 32 중 어느 한 항의 항체 또는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 흑색종을 치료하는 방법.
  34. 흑색종의 치료에 사용하기 위한 치료 유효량의 청구항 1 내지 청구항 31 중 어느 한 항의 항체 또는 청구항 32의 조성물.
  35. 청구항 33 또는 청구항 34에 있어서,
    상기 흑색종은 전이된 것인 방법, 항체 또는 조성물.
  36. 청구항 33 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 투여는 흑색종 세포의 세포 사멸을 선택적으로 유도하는 방법, 항체 또는 조성물.
  37. 청구항 33 내지 청구항 36 중 어느 한 항에 있어서,
    유효량의 적어도 하나의 추가 제제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법, 항체 또는 조성물.
  38. 청구항 37에 있어서,
    상기 제제는 면역 체크포인트 억제제인 방법, 항체 또는 조성물.
  39. 청구항 38에 있어서,
    상기 면역 체크포인트 억제제는 CTLA-4, PD-1, 및 PDL-1로부터 선택되는 방법, 항체 또는 조성물.
  40. 청구항 33 내지 청구항 39 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 조성물은 정맥내로 투여되는 방법, 항체 또는 조성물.
  41. 청구항 1 내지 청구항 31 중 어느 한 항의 항체를 제제에 접합시키는 단계를 포함하는 접합된 항체의 제조 방법.
  42. 청구항 41에 있어서,
    상기 제제는 방사성핵종인 방법.
  43. 청구항 42에 있어서,
    상기 방사성핵종은 213-Bi인 방법.
  44. 청구항 42에 있어서,
    상기 방사성핵종은 177-Lu인 방법.
  45. 청구항 1 내지 청구항 31 중 어느 한 항의 항체의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  46. 청구항 45에 있어서,
    서열번호 17의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  47. 청구항 45에 있어서,
    서열번호 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  48. 청구항 45 내지 청구항 47 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 서열은 인간에서 발현하기 위해 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드.
  49. 청구항 48의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  50. 청구항 49의 벡터를 포함하는 세포주.
  51. 청구항 1 내지 청구항 31 중 어느 한 항의 항체를 발현하는 클론 세포.
  52. 청구항 1 내지 청구항 31 중 어느 한 항의 항체 또는 청구항 32의 조성물을 포함하는 키트.
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