CN111465414A - 黑色素抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本文提供了特异性结合黑色素的单克隆抗体。该抗体可以是嵌合的或人源化的。本文还提供了使用方法和制备所述抗体的方法。例如,该黑色素抗体可以用于治疗或预防黑色素瘤。
Description
交叉引用
本申请要求于2017年9月13日提交的美国临时专利第62/558,230号的优先权,其全部内容通过参考并入本文。
背景技术
黑色素瘤是最严重的皮肤癌类型,在产生黑色素的黑色素细胞中发展。黑色素瘤也可以起源于眼睛的葡萄膜、上呼吸-消化道以及肠道内层的粘膜上皮。美国癌症协会估计,2017年美国经诊断有约87,000例新的黑色素瘤,且预期有约9,750人死于黑色素瘤(https://www.cancer.org/cancer/melanoma-skin-cancer/about/key- statistics.html)。在全球范围内,2012年约有232,000人患黑色素瘤,导致约55,000人死亡。
虽然可以通过手术治疗1期和2期黑色素瘤,但这种恶性肿瘤的侵袭性转移性质造成预后较差,对于3年、5年和10年的IV期黑色素瘤患者,其估计生存率分别为19%、13%和9%。(CM Balch,JE Gershenwald,SJ Soong,et al:Final version of 2009 AJCCmelanoma staging and classification J Clin Oncol 27:6199–6206,2009)。FDA批准了可抑制突变的B-RAF蛋白的维罗非尼(vemurafenib),这为携带这种突变的40-60%黑色素瘤患者带来希望。恢复潜在抗肿瘤免疫力的努力,集中在下述基于单克隆抗体(mAb)的干预措施上:靶向CTL抗原4(CTLA-4)(Hodi FS,O’Day SJ,McDermott DF,et al:Improvedsurvival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma.NEngl J Med363:711-723,2010),以及靶向T淋巴细胞的程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)及其在肿瘤细胞上的主要配体(PD-L1)(Phillips GK,Atkins M.Therapeutic uses of anti-PD-1andanti-PD-L1 antibodies.Int Immunol.2015;27(1):39-46)。由于仅少数患者响应抗CTLA-4或抗PD-1途径检查点抑制剂免疫疗法而经历长期无进展生存期(PFS),与这些药剂相关的严重自身免疫毒性的显著风险,以及免疫疗法的高昂费用(Fellner,Chris.Ipilimumab(Yervoy)Prolongs Survival in Advanced Melanoma:Serious Side Effects and aHefty Price Tag May Limit Its Use.Pharmacy&Therapeutics 2012:27(9):503-511),人们仍然迫切需要其他方法来对抗黑色素瘤,尤其是转移性黑色素瘤。
发明概述
本文提供了特异性结合黑色素的单克隆抗体。该抗体可以是嵌合的或人源化的。本文还提供了使用方法和制备所述抗体的方法。例如,该黑色素抗体可以用于治疗或预防黑色素瘤。
因此,本文在一个方面提供了特异性结合黑色素的单克隆抗体,其中该抗体是嵌合的或人源化的。
在一些实施方案中,该抗体是嵌合的。在一些实施方案中,该抗体是小鼠-人嵌合抗体。在一些实施方案中,该嵌合抗体包含小鼠可变区和人恒定区。在一些实施方案中,该黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中,该黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中,该黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链。
在一些实施方案中,该抗体是人源化的。在一些实施方案中,该抗体是来自小鼠单克隆抗体序列的人源化形式。在一些实施方案中,该抗体是来自小鼠8C3抗体的人源化形式。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链和含有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体的重链包含至少一个下述CDR序列:SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:10。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体的轻链包含至少一个下述CDR序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体的重链包含至少一个下述CDR序列:SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10,并且该人源化黑色素抗体的轻链包含至少一个下述CDR序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体的重链包含来自下述的CDR序列:SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10,和/或该轻链包含来自下述的CDR序列:SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。
在一些实施方案中,该嵌合或人源化单克隆黑色素抗体是抗原结合片段。
在一些实施方案中,该嵌合或人源化单克隆黑色素抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中,该双特异性抗体包含靶向黑色素的第一臂和靶向含有免疫检查点抑制剂的抗原的第二臂。在一些实施方案中,该免疫检查点抑制剂是CTLA4、PD-1或PD-L1。
在一些实施方案中,该嵌合或人源化的单克隆黑色素抗体与药剂缀合。在一些实施方案中,该药剂是放射性核素。在一些实施方案中,该放射性核素是213-Bi。在一些实施方案中,该放射性核素是177-Lu。在一些实施方案中,该药剂通过接头与抗体缀合。
在一个相关方面,本文提供了一种药物组合物,其包含本文提供的嵌合或人源化单克隆黑色素抗体中的任何一种,以及药理学上可接受的载体。
在另一方面,本文提供了一种治疗受试者的黑色素瘤的方法,包含施用治疗有效量的本文所述单克隆嵌合或人源化黑色素抗体或包含此类抗体的组合物中的任何一种。在一个相关方面,本文提供了治疗有效量的本文所述用于治疗黑色素瘤的单克隆嵌合或人源化黑色素抗体或包含此类抗体的组合物中的任何一种。
在一些实施方案中,该黑色素瘤是转移的。在一些实施方案中,该施用选择性地诱导黑色素瘤细胞的细胞死亡。在一些实施方案中,该方法包含向受试者施用有效量的至少一种其他药剂。在一些实施方案中,该药剂是免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中,该免疫检查点抑制剂选自CTLA-4、PD-1和PDL-1。在一些实施方案中,该抗体或组合物经静脉内施用。
在另一方面,本文提供了制备缀合的黑色素抗体的方法,其包含将本文所述的单克隆嵌合或人源化黑色素抗体中的任何一种与药剂缀合。在一些实施方案中,该药剂是放射性核素。在一些实施方案中,该放射性核素是213-Bi。在一些实施方案中,该放射性核素是177-Lu。
另一方面,本文提供了编码本文提供的嵌合或人源化单克隆黑色素抗体中的任何一种的氨基酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中,该多核苷酸包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列。在一些实施方案中,该多核苷酸包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列。在一些实施方案中,已经对该多核苷酸进行了密码子优化以在人中表达。本文还提供了包含编码本文提供的嵌合或人源化单克隆黑色素抗体中的任何一种的氨基酸序列的多核苷酸的载体,以及包含此类载体的细胞系。本文还提供了表达本文提供的嵌合或人源化单克隆黑色素抗体中的任何一种的克隆细胞系。
在另一方面,本文提供了一种试剂盒,其包含该嵌合或人源化单克隆抗体或包含此类抗体的药物组合物的任何一种。
本文描述的所有上述特性(包括任意的所附权利要求、摘要和附图)和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤,可以以任意组合方式进行组合,除非其中至少一些此类特性和/或步骤的组合是互相排斥的。
为了更好地理解本发明,并且为了示出本发明的实施方案如何工作,现在将通过示例的方式来参考附图。
附图说明
图1和2显示了在独立的实验中,体外测定的嵌合8C3和人源化8C3抗体与黑色素结合的结果。
图3比较了小鼠8C3和小鼠IgG1阴性对照抗体与来自乌贼(Sepia officinalis)的黑色素的结合。
图4提供了用于表达嵌合抗体和人源化抗体的质粒的示意图:图4A)pAB11-8C3-hIgG1-625.69.1,图4B)pAB2-8C3-hKappa-625.48.2,图4C)pAB2-8C3-HE-VK4-hKappa-625.85.1,图4D)pAB2-8C3-HE-VK1A-hKappa-625.85.2,图4E)pAB2-8C3-HE-VK1B-hKappa-625.85.3,图4F)pAB11-8C3-HE-VH3A-hIgG1-625.85.4,和图4G)pAB11-8C3-HE-VH3B-hIgG1-625.85.5。
图5显示了本文所述抗体的重链的比对。
图6显示了本文所述抗体的轻链的比对。
图7显示了在进行任何的基于mAB的抗黑色素治疗或对照处理之前,患有B16-F10黑色素瘤肿瘤(由黑圈表示)的代表性C57BL/6小鼠。
图8A-8D描述了生物分布实验的结果,该实验比较了在抗体注射后的两个不同时间点(4小时和24小时),在各个器官中放射性标记的黑色素结合抗体的摄取量与非特异性人IgG抗体对照的摄取量。
图9示出了肿瘤与血液之比的计算结果,其提供了已经结合肿瘤的放射性标记的黑色素结合抗体的量的间接测量。
图10是描述在注射放射性标记抗体后1、2、24、48和72小时的预定时间点处,111In-h8C3HE-5抗体在小鼠中的生物分布的图。
图11A和11B是描述用以下剂量处理的小鼠中肿瘤体积的图:高剂量的213Bi-h8C3HE-5,或低剂量的213Bi-h8C3 HE-5,或高剂量的177Lu-h8C3 HE-5,或低剂量的177Lu-h8C3HE-5,或80μg未标记的(“冷”)h8C3 HE-5,或余下未经处理的。每三天用电子卡尺测量它们的肿瘤以计算肿瘤体积。
图12和图13是一系列描述小鼠的血球计数的图,12A和13A)白细胞,12B和13B)红细胞,12C和13C)血小板,小鼠经以下处理:高剂量的213Bi-h8C3 HE-5,或低剂量的213Bi-h8C3 HE-5的高剂量,或高剂量的177Lu-h8C3 HE-5,或低剂量的177Lu-h8C3 HE-5,或80μg未标记的(“冷”)h8C3 HE-5,或余下未经处理的。
图14A和14B是一系列描述经以下处理的小鼠的体重的图:高剂量的213Bi-h8C3HE-5,或低剂量的213Bi-h8C3 HE-5,或高剂量的177Lu-h8C3 HE-5,或低剂量的177Lu-h8C3HE-5,或80μg未标记的(“冷”)h8C3 HE-5,或余下未经处理的。
图15是一系列描述小鼠的血液分析物浓度的图:15A)丙氨酸转氨酶(ALT),15B)天冬氨酸转氨酶(AST),15C)尿素和15D)肌酸酐,小鼠经以下处理:高剂量的213Bi-h8C3 HE-5,或低剂量的213Bi-h8C3 HE-5,或余下未经处理的。
图16A-16C是一系列描述荷瘤小鼠的肿瘤体积变化的图,小鼠随机分为8组并按如下处理:在第0天使用单剂量400μCi 213-h8C3 HE-5,或在第0天和第3天使用400μCi 213-h8C3 HE-5,或在第0天、第3天和第7天使用400μCi 213-h8C3 HE-5。在第16天,单剂量组的小鼠用另一次400μCi 213-h8C3 HE-5剂量处理。
图17是描述荷瘤小鼠的体重变化的图,小鼠随机分为8组并按如下处理:在第0天使用单剂量400μCi 213-h8C3 HE-5,或在第0天和第3天使用400μCi 213-h8C3 HE-5,或在第0天、第3天和第7天使用400μCi 213-h8C3 HE-5。在第16天,单剂量组的小鼠用另一次400μCi 213-h8C3 HE-5剂量处理。
图18是一系列描述荷瘤小鼠的血球计数图,18A)白细胞,18B)红细胞,18C)血小板,小鼠随机分为8组并按如下处理:在第0天使用单剂量400μCi 213-h8C3 HE-5,或在第0天和第3天使用400μCi 213-h8C3 HE-5,或在第0天、第3天和第7天使用400μCi 213-h8C3HE-5。在第16天,单剂量组的小鼠用另一次400μCi 213-h8C3 HE-5剂量处理。
图19是一系列描述荷瘤小鼠的血液分析物浓度的图,19A)丙氨酸转氨酶(ALT),19B)天冬氨酸转氨酶(AST),19C)尿素和19D)肌酸酐,小鼠随机分为8组并按如下处理:在第0天使用单剂量400μCi 213-h8C3 HE-5,或在第0天和第3天使用400μCi 213-h8C3 HE-5,或在第0天、第3天和第7天使用400μCi 213-h8C3 HE-5。在第16天,单剂量组的小鼠用另一次400μCi 213-h8C3 HE-5剂量处理。
图20是用缀合有CHXA”的h8C3 HE-5抗体以5:1mCi/mg的比活度注射200μCi 111In给小鼠,在注射后1h、4h、24h、48h、72h、96h和216h得到的一系列microSPECT/CT图像。
图21是描述批量池细胞生长的图。
图22是描述通过ForteBio Octet Red测量的批量池滴度特征的图。
图23是描述表达抗体的细胞的整个96孔板的滴度特征的图。
图24是描述来自图23的前120个表达池的滴度特征图,选择出它们用于在24孔板中生长。选择了三个超级池。超级池1由三个最高表达者的微型池组成,其滴度范围在106-129μg/mL,超级池2由五个微型池组成,其滴度范围在60-75μg/mL,而超级池3由七个微型池组成,其滴度范围在40-58μg/mL。
图25是对24孔板筛选中最高表达池进行排名的图表。选择了三个超级池。超级池1由三个最高表达者的微型池组成,其滴度范围在106-129μg/mL,超级池2由五个微型池组成,其滴度范围在60-75μg/mL,而超级池3由七个微型池组成,其滴度范围在40-58μg/mL。
图26是描述每个超级池的生长曲线的图。
图27是描述每个超级池的活力的图。
图28是描述每个超级池的滴度特征的图。
图29是描述来自24孔阶段的克隆的滴度特征的图,所述克隆基于在第11天使用带有蛋白质A传感器的ForteBio Octet Red测量的表达水平进行了排名,并与使用由批量池纯化的8C3 HE-5抗体获得的标准曲线进行了比较。
图30是突出显示来自24孔阶段的具有最高表达水平的36个克隆的图表。
图31是突出显示最高表达克隆的图表:克隆2-3H2、2-3H11、2-11H12和2-20C3,其各自的表达水平为1.29g/L、1.27g/L、1.26g/L和1.25g/L。
发明详述
本文提供了特异性结合黑色素的抗体。该抗体可以是嵌合的或人源化的。本文还提供了使用方法和制备所述抗体的方法。例如,该黑色素抗体可以用于治疗或预防黑色素瘤,包含向有需要的受试者施用抗体或其药物组合物。该黑色素抗体也可以用于诊断目的,以检测来自受试者的样品中的黑色素瘤。还提供了生产本文所述的黑色素抗体的方法。
除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
数值范围包括定义该范围的数字。
为了解释本说明书的目的,将应用以下定义,并且在适当时,单数形式使用的术语也将包括复数形式,反之亦然。如果以下提出的任何定义与通过参考并入本文的任何文件相抵触,则以提出的定义为准。
如本文所用,除非另外指出,否则单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数指涉。
应当理解,本文所述的本发明的方面和实施方案包括“包含/含有”,“组成”和“基本上由...组成”的方面和实施方案。
如本文所用,术语“约”是指本技术领域技术人员容易知道的各个值的通常误差范围。本文中对“约”值或参数的指涉包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。
术语的其他定义可能在整个说明书中出现。
对于本文描述的任何结构和功能特征,确定这些特征的方法是本领域已知的。
黑色素抗体
本文提供了特异性结合黑色素的抗体。在一些实施方案中,该黑色素是哺乳动物黑色素,例如人黑色素或鼠源黑色素。在其他实施方案中,该黑色素是非哺乳动物黑色素。
如本文全文所用,术语“抗体”是最广义的,包括但不限于:单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、非人抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体的抗原结合片段(例如Fab片段、Fab′2片段、CDR或ScFv)、抗体-药物缀合物和其他对黑色素抗原保留特异性的抗体片段。
该抗体可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体中的任何一种。IgA抗体可以是IgA1或IgA2抗体。IgG抗体可以是IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4抗体。也可以使用任何这些抗体的组合。
在一些实施方案中,为了多种目的缀合该黑色素抗体,所述目的包括但不限于:用于治疗、检测、诊断、可视化、定量、分选,以及用于生物测定。
在一些实施方案中,该抗体是特异性结合黑色素的人源化抗体。在一些实施方案中,该人源化抗体是小鼠单克隆8C3 IgG抗体的人源化形式(NCBI GenBank登录号KX346264;Urán ME,Nosanchuk JD,Restrepo A,Hamilton AJ,Gómez BL,CanoLE.Detection of antibodies against Paracoccidioides brasiliensis melanin inin vitro and in vivo studies during infection.Clin Vaccine Immunol.2011 Oct;18(10):1680-8)。
在一些实施方案中,该抗体是特异性结合黑色素的嵌合抗体。在一个示例性的实施方案中,该抗体是小鼠-人嵌合抗体。该小鼠-人嵌合抗体可以包含人可变区和小鼠恒定区。在一些实施方案中,该恒定区是IgG类型的,例如IgG类型的。在一些实施方案中,该恒定区不是IgG类型的,例如不是人IgG类型的。在一些实施方案中,该恒定区是IgM类型的,例如人IgM类型的。在一些实施方案中,该恒定区不是IgM类型的,例如不是人IgM类型的。
表1提供了本文提供的抗体和抗原结合片段的示例性序列。
在一些实施方案中,该黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中,该黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链。
在一些实施方案中,该黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链。
在一些实施方案中,该黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链。
在一些实施方案中,该黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ IDNO:7的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中,该黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中,该黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中,该黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中,该黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中,该黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中,该黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链。
在一些实施方案中,该黑色素抗体包含含有表1中提供的任何一个轻链序列的可变部分的轻链。在一些实施方案中,该黑色素抗体包含仅含有表1中提供的任何一个轻链序列的可变部分的轻链。
在一些实施方案中,该黑色素抗体包含含有表1中提供的任何一个轻链序列中的CDR的轻链。在一些实施方案中,该黑色素抗体包含含有表1中提供的任何一个重链序列中的CDR的重链。
在一些实施方案中,该黑色素抗体包含含有表1中提供的任何一个重链序列的可变部分的重链。在一些实施方案中,该黑色素抗体包含仅含有表1中提供的任何一个重链序列的可变部分的重链。
在一些实施方案中,该黑色素抗体的重链包含至少一个下述互补决定区(CDR)序列:SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。在一些实施方案中,该黑色素抗体的重链包含下述互补决定区(CDR)序列:SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
在一些实施方案中,该黑色素抗体的轻链包含至少一个下述CDR序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15。在一些实施方案中,该黑色素抗体的轻链包含下述互补决定区(CDR)序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ IDNO:15。在一些实施方案中,该黑色素抗体的轻链包含下述互补决定区(CDR)序列:SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:15。在一些实施方案中,该黑色素抗体的轻链包含下述互补决定区(CDR)序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。
在一些实施方案中,该黑色素抗体是选自下述的人源化抗体:HE-1、HE-2、HE-3、HE-4、HE-5和HE-6。
在一些实施方案中,该黑色素抗体是双特异性抗体。例如,双特异性抗体可以包含靶向黑色素的第一臂和靶向含有另外的治疗靶标(例如免疫检查点抑制剂)的抗原的第二臂。在一些实施方案中,双特异性抗体包含靶向黑色素的第一臂和靶向免疫检查点抑制剂的第二臂,例如,该第二臂靶向CTLA4、PD-1或PD-L1。
在一些实施方案中,该黑色素抗体缀合至下述药剂,其包括但不限于:放射性核素(也称为放射性的核素、放射性同位素或放射性的同位素)、细胞毒素、化疗药剂、药物、酶、可检测药剂、细胞因子、激素、寡核苷酸或第二抗体。
在另一个示例性的实施方案中,该黑色素抗体与细胞毒素缀合。
在另一个示例性的实施方案中,该黑色素抗体与微管抑制剂缀合。
在另一个示例性的实施方案中,该黑色素抗体与核酸破坏药剂(诸如DNA烷基化剂、DNA切割剂、DNA交联剂、DNA嵌入剂或其他DNA破坏药剂)缀合。
在另一个示例性的实施方案中,该黑色素抗体缀合至放射性核素。考虑到组织中的放射范围和半衰期,可以通过待治疗的黑色素瘤的大小及其在体内的定位来确定对与黑色素抗体缀合的特定放射性核素的选择。放射性核素包括:α发射体、β发射体和正电子发射体。
示例性放射性核素包括但不限于:α发射体、β发射体和正电子发射体。
α发射体的实例包括:213铋(半衰期46分钟)、223镭(半衰期11.3天)、224镭(半衰期3.7天)、225镭(半衰期14.8天)、225锕(半衰期10天)、212铅(半衰期10.6小时)、212铋(半衰期60分钟)、211砹(半衰期7.2小时)、255镄(半衰期20小时)和227钍(半衰期18.7天)。
β发射体的实例包括:188铼(半衰期16.7小时)、90钇(半衰期2.7天)、32磷(半衰期14.3天)、47钪(半衰期3.4天)、67铜(半衰期62小时)、64铜(半衰期13小时)、77砷(半衰期38.8小时)、89锶(半衰期51天)、105铑(半衰期35小时)、109钯(半衰期13小时)、111银(半衰期7.5天)、131碘(半衰期8天)、177镥(半衰期6.7天)、153钐(半衰期46.7小时)、159钆(半衰期18.6小时)、186铼(半衰期3.7天)、166钬(半衰期26.8小时)、166镝(半衰期81.6小时)、140镧(半衰期40.3小时)、194铱(半衰期19小时)、198金(半衰期2.7天)和199金(半衰期3.1天)。
正电子发射体的实例包括(括号内为半衰期):52Mn(21.1分钟)、62Cu(9.74分钟)、68Ga(68.1分钟)、11C(20分钟)、82Rb(1.27分钟)、110In(1.15小时)、118Sb(3.5分钟)、122I(3.63分钟)、18F(1.83小时)、34″′Cl(32.2分钟)、38K(7.64分钟)、51Mn(46.2分钟)、52Mn(5.59天)、52Fe(8.28小时)、55Co(17.5小时)、61Cu(3.41小时)、64Cu(12.7小时)、72As(1.08天)、75Br(1.62小时)、76Br(16.2小时)、82"Rb(6.47小时)、83Sr(1.35天)、86Y(14.7小时)、89Zr(3.27天)、94″′Tc(52.0分钟)、120I(1.35h)、124I(4.18天)。64铜是正电子、电子和俄歇电子的混合发射体。
示例性放射性核素还可以包括:99mTc、201Tl、133Xe、11C、62Cu、18F、68Ga、13N、15O、38K、82Rb、99mTc(锝)、188Re、213Bi(213-铋)、125I、131I、89Zr、111In、123I和131I。
在一些实施方案中,该黑色素抗体是人源化抗体,并与213B缀合。在一些实施方案中,该黑色素抗体是选自下述的人源化抗体:HE-1、HE-2、HE-3、HE-4、HE-5和HE-6(参见表4),并与213B缀合。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4的重链,并与213B缀合。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的轻链,并与213B缀合。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列重链和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列轻链,并与213B缀合。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链,并于213B缀合。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链,并与213B缀合。在一些实施方案中,人源化黑色素抗体包含含有SEQ IDNO:4的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链,并与213B缀合。在一些实施方案中,人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链和含有SEQ IDNO:6的氨基酸序列的轻链,并与213B缀合。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链,并与213B缀合。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体的重链包含至少一个下述CDR序列:SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10,并与213B缀合。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体的轻链包含至少一个下述CDR序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14或SEQ ID NO:15,并与213B缀合。
在一些实施方案中,该黑色素抗体是人源化抗体,并与177Lu缀合。在一些实施方案中,该黑色素抗体是选自下述的人源化抗体:HE-1、HE-2、HE-3、HE-4、HE-5和HE-6(参见表4),并与177Lu缀合。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:3或SEQID NO:4的氨基酸序列的重链,并与177Lu缀合。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链,并与177Lu缀合。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链,并与177Lu缀合。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链,并与177Lu缀合。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链,并与177Lu缀合。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链,并与177Lu缀合。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链,并与177Lu缀合。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链和含有SEQ IDNO:4的氨基酸序列的轻链,并与177Lu缀合。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体的重链包含至少一个下述CDR序列:SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10,并与177Lu缀合。在一些实施方案中,该人源化黑色素抗体的轻链包含至少一个下述CDR序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15,并与177Lu缀合。
在不同的实施方案中,出于治疗目的,本文所述的任何一个实施方案中放射性核素的剂量为1-1000mCi。
在一些实施方案中,该抗体与一个或多个当量的药剂缀合。在一些实施方案中,该抗体与一个当量的药剂缀合。在一些实施方案中,该抗体与两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或大于十个当量的药剂缀合。在一些实施方案中、抗体的混合物使得缀合于每个抗体的二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或大于十个当量的药剂的平均数为一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或大于十。
在一些实施方案中,该抗体包含一种或多种位点特异性氨基酸序列修饰,使得可以调节能与该抗体缀合的药剂的数量。
在另一个示例性的实施方案中,该黑色素抗体与消炎药剂缀合。
在另一个示例性的实施方案中,该黑色素抗体缀合至可检测药剂(标记)。在一些实施方案中,该可检测药剂是诊断药剂。在一些实施方案中,该黑色素抗体与可检测的标记、自旋标记、比色标记、放射性标记、酶标记、荧光标记或磁性标记缀合。
在一些实施方案中,所述药剂经由接头缀合至该黑色素抗体。在一些实施方案中,该药剂通过可切割接头与该黑色素抗体缀合。在一些实施方案中,该药剂通过不可切割接头与该黑色素抗体缀合。
在一些实施方案中,该黑色素抗体缀合或附着于固体表面(例如珠、树脂或微板)。
本文提供了对来自任何哺乳动物和非哺乳动物物种的黑色素具有特异性的抗体。在一些实施方案中,该黑色素抗体对人黑色素具有特异性。在一些实施方案中,该黑色素抗体与来自其他物种的黑色素交叉反应。
本文提供的抗体特异性地结合黑色素。在一些实施方案中,这些抗体以特异性和选择性结合黑色素。
在某些实施方案中,本文提供的抗体的解离常数(Kd)在0.0001nM至1μM范围。例如,抗体的Kd可以是约1μM、约100nM、约50nM、约10nM、约5nM、约1nM、约0.5nM、约0.1nM、约0.05nM、约0.01nM、约0.005nM、约0.001nM、约0.0005nM,或者甚至约0.0001nM。
黑色素抗体的生产
可以使用多种免疫测定方式来选择与黑色素发生特异性免疫反应的抗体。例如,固相ELISA免疫测定法可以用于选择对黑色素具有特异性的单克隆抗体(参见例如,Harlowand Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York,for a description of immunoassay formats and conditions that may beused to determine specific immunoreactivity)。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法生产本文提供的抗体。例如,在一些实施方案中,该黑色素抗体是由重组细胞生产的,所述重组细胞经工程改造以表达所需抗体的所需轻链和重链。在一些实施方案中,该抗体是由杂交瘤生产的。
在一些实施方案中,使用标准方案将包含可选地连接至免疫原性载体的黑色素抗原的任何肽用于免疫作用。
可以使用本领域技术人员已知的技术评估所产生抗体的质量和滴度。
为了结合和表达的目的,信号肽序列可以与目标抗体组分一起在框内表达。表2提供了编码示例性信号肽的示例性氨基酸和核苷酸序列。在一些实施方案中,该信号肽促进细胞系分泌抗体。在一些实施方案中,该信号肽被命名为“VK-I区行走者”(VK-I regionWalker)。在一些实施方案中,该信号肽是在许多人Igκ链中发现的天然信号肽。在一些实施方案中,该抗体在细胞系统中合成并且包含信号肽序列,例如SEQ ID NO:16的序列。如本文提供的,表1中提供的任何一种示例性黑色素抗体序列可以进一步包括信号肽序列。因而,在一些实施方案中,本发明的抗体序列包含SEQ ID NO:1-7中任何一个与N端信号肽序列(例如SEQ ID NO:16的信号肽序列)组合。
本文所述的本发明组合物还包括编码该抗体的核酸、包含编码该抗体的任何核酸的载体以及包含任何此类载体的宿主细胞。表3A提供了示例性的核苷酸序列。在一些实施方案中,编码该抗体的核酸进一步包括信号肽核苷酸序列,例如SEQ ID NO:17的序列。表3B提供了示例性的表达黑色素抗体的质粒核苷酸序列。
在一些实施方案中,SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列用于生产黑色素抗体的重链。
在一些实施方案中,SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列用于生产黑色素抗体的轻链。
在一些实施方案中,SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列用于生产黑色素人源化抗体的轻链。
在一些实施方案中,SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列用于生产黑色素人源化抗体的轻链。
在一些实施方案中,SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列用于生产黑色素人源化抗体的轻链。
在一些实施方案中,SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列用于生产黑色素人源化抗体的重链。
在一些实施方案中,SEQ ID NO:24所示的核苷酸序列用于生产黑色素人源化抗体的重链。
在一些实施方案中,SEQ ID NO:25所示的质粒核苷酸序列用于生产黑色素人源化抗体的轻链。
在一些实施方案中,SEQ ID NO:26所示的质粒核苷酸序列用于生产黑色素人源化抗体的轻链。
在一些实施方案中,SEQ ID NO:27所示的质粒核苷酸序列用于生产黑色素人源化抗体的轻链。
在一些实施方案中,SEQ ID NO:28所示的质粒核苷酸序列用于生产黑色素人源化抗体的重链。
在一些实施方案中,SEQ ID NO:29所示的质粒核苷酸序列用于生产黑色素人源化抗体的重链。
治疗用途
本文提供了把黑色素抗体用于治疗用途,用于治疗黑色素瘤。
本文还提供了治疗黑色素瘤的方法,其包含:向有需要的受试者施用治疗有效量的治疗性黑色素抗体。在一些实施方案中,该黑色素瘤是原发性黑色素瘤。在一些实施方案中,该黑色素瘤是转移性黑色素瘤。
如本文所用,受试者是指被分类为哺乳动物的任何动物,包括人、家养和农场动物,以及动物园、运动或宠物动物,诸如狗、马、兔、牛、猪、仓鼠、沙鼠、小鼠、雪貂、大鼠、猫等。受试者可以是男性或女性。
不受任何特定理论的束缚,在黑色素瘤肿瘤和转移瘤中,细胞更新迅速,导致渗漏的黑色素瘤细胞增加,其中黑色素抗体可接近黑色素。
本文提供的任何治疗性黑色素抗体的施用可以与其他已知药物/治疗(例如小分子药物或生物制剂)组合施用。在一些实施方案中,该黑色素抗体可以与免疫检查点抑制剂一起施用;在一些实施方案中,该免疫检查点抑制剂是基于抗体的免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中,该黑色素抗体可以与MEK抑制剂一起施用。在一些实施方案中,该黑色素抗体可以与Braf抑制剂一起施用。在一些实施方案中,该黑色素抗体可以与化疗药剂一起施用。在一些实施方案中,该黑色素抗体可以与靶向癌细胞信号传导途径的基于生物制剂的疗法一起施用。在一些实施方案中,该黑色素抗体可以与微生物组调节疗法、代谢或营养疗法一起施用。该施用可以是顺序的或并行的。
在一些实施方案中,为了治疗转移性黑色素瘤,可以将黑色素抗体与免疫疗法(例如免疫检查点抑制剂,诸如CTLA4、PD1、PDL-1抑制剂)组合施用。在一些实施方案中,该黑色素抗体与药剂缀合。在一些实施方案中,该黑色素抗体缀合至放射性核素。
本文所述的治疗性黑色素抗体的体内施用可以如下进行:静脉内、肿瘤内、颅内、病变内(例如病变内注射、直接接触扩散)、腔内(腹膜内、胸膜内、子宫内、直肠内)、腹膜内、肌内、皮下、局部、口服、经皮、植入、吸入、鞘内、心室内或鼻内。在一个示例性的实施方案中,施用途径是通过静脉内注射。
将施用治疗有效量的治疗性抗体。可以基于黑色素瘤的严重程度、受试者的临床状况、受试者的临床病史和对治疗的响应以及主治医师的判断来确定治疗性抗体的适当剂量。
根据施用途径,本文提供的黑色素抗体的剂量可以在每天约1ng/kg至约1000mg/kg受试者体重或更高的范围内改变。对于数天或更长时间的重复施用,取决于黑色素瘤的严重程度,可以持续治疗直至获得所需的症状抑制。根据医师希望达到的药代动力学衰减模式,剂量方案可能是有用的。例如,本文提供了:每周给个体一次至二十一次的给药。在某些实施方案中,给药频率是每天三次,每天两次,每天一次,隔日一次,每周一次,每两周一次,每四周一次,每五周一次,每六周一次,每七周一次,每八周一次,每九周一次,每十周一次,或每月一次,每两个月一次,每三个月一次,或更长时间一次。可以通过常规技术和测定法监测该疗法的进展。给药方案可以随时间改变而与所使用的剂量无关。
药物组合物
本公开提供了包含治疗性黑色素抗体的组合物。在一些实施方案中,该组合物是无菌的。该药物组合物通常在药学上可接受的赋形剂中包含有效量的治疗性抗体。
诊断用途
本文提供的黑色素抗体可以用于诊断和成像目的。根据应用,可以在体内或体外检测和定量黑色素抗体。
该黑色素抗体可以通过检测、定位或定量黑色素瘤肿瘤细胞或正常组织中的黑色素沉积物而用于诊断目的。
本文提供的黑色素抗体可修改用于多种免疫测定。这些免疫测定包括但不限于:酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、流式细胞术、放射免疫测定、免疫荧光测定、分光光度法、放射照相术、电泳、高效液相色谱(HPLC)或薄层色谱(TLC)。
本文提供的黑色素抗体可以包含:可检测标记,例如可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、荧光、电学、光学或化学方法检测。本发明中有用的标记包括但不限于:荧光染料、放射性标记、酶、色度标记、抗生物素蛋白或生物素。
在一些实施方案中,用同位素放射性标记黑色素抗体,该同位素可用于核医学设备(SPECT、PET或闪烁扫描术)成像。
该诊断性黑色素抗体可以用于诊断原发性黑色素瘤,监测转移,或确定对治疗的响应。
试剂盒和制品
本申请提供了包含例如用于治疗或诊断用途的黑色素抗体的试剂盒。在一些实施方案中,该试剂盒还包含选自以下任一种的组分:二抗、用于免疫组织化学分析的试剂、药学上可接受的赋形剂和使用说明书以及它们的任意组合。在一些实施方案中,该试剂盒包含本文所述的任何一种或多种治疗组合物,以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
本申请还提供了包含本文所述的任何一种治疗或诊断组合物或试剂盒的制品。制品的实例包括小瓶(例如密封小瓶)。
示例性的实施方案
可以通过参考以下示例性列举的实施方案来定义本发明。
实施方案1.特异性结合黑色素的单克隆抗体,其中所述抗体是嵌合的或人源化的。
实施方案2.实施方案1的抗体,其中所述抗体是嵌合的。
实施方案3.实施方案2的抗体,其中所述抗体是小鼠-人嵌合抗体。
实施方案4.实施方案3的抗体,其中所述嵌合抗体包含小鼠可变区和人恒定区。
实施方案5.实施方案1-4中任一项的抗体,其中所述黑色素抗体包含含有SEQ IDNO:1的氨基酸序列的轻链。
实施方案6.实施方案1-5中任一项的抗体,其中所述黑色素抗体包含含有SEQ IDNO:2的氨基酸序列的重链。
实施方案7.实施方案1-4中任一项的抗体,其中所述黑色素抗体包含含有SEQ IDNO:1氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:2氨基酸序列的重链。
实施方案8.实施方案1的抗体,其中所述抗体是人源化的。
实施方案9.实施方案8的抗体,其中所述抗体是小鼠单克隆抗体的序列的人源化形式。
实施方案10.实施方案9的抗体,其中所述抗体是小鼠8C3抗体的人源化形式。
实施方案11.实施方案1和8-10中任一项的抗体,其中所述黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链。
实施方案12.实施方案1和8-10中任一项的抗体,其中所述抗体包含含有SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链。
实施方案13.实施方案11和12中任一项的抗体,其中所述抗体包含含有SEQ IDNO:3氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:5氨基酸序列的轻链。
实施方案14.实施方案11和12中任一项的抗体,其中所述抗体包含含有SEQ IDNO:3氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:6氨基酸序列的轻链。
实施方案15.实施方案11和12中任一项的抗体,其中所述抗体包含含有SEQ IDNO:3氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:7氨基酸序列的轻链。
实施方案16.实施方案11和12中任一项的抗体,其中所述抗体包含含有SEQ IDNO:4的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链。
实施方案17.实施方案11和12中任一项的抗体,其中所述抗体包含含有SEQ IDNO:4氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:6氨基酸序列的轻链。
实施方案18.实施方案11和12中任一项的抗体,其中所述抗体包含含有SEQ IDNO:4氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:7氨基酸序列的轻链。
实施方案19.实施方案1-10中任一项的抗体,其中所述黑色素抗体的重链包含至少一个下述CDR序列:SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。
实施方案20.实施方案1-10中任一项的抗体,其中所述黑色素抗体的轻链包含至少一个下述CDR序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15。
实施方案21.实施方案1-10中任一项的抗体,其中所述黑色素抗体的重链包含至少一个下述CDR序列:SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10,并且其中黑色素抗体的轻链包含至少一个下述CDR序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15。
实施方案22.实施方案1-10中任一项的抗体,其中所述黑色素抗体的重链包含来自下述的CDR序列:SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10,和/或其中所述轻链包含来自下述的CDR序列:SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。
实施方案23.实施方案1或8-10的抗体,其中所述抗体是抗原结合片段。
实施方案24.实施方案1-23中任一项的抗体,其中所述抗体是双特异性抗体。
实施方案25.实施方案24的抗体,其中所述双特异性抗体包含靶向黑色素的第一臂和靶向含有免疫检查点抑制剂的抗原的第二臂。
实施方案26.实施方案25的抗体,其中所述免疫检查点抑制剂是CTLA4、PD-1或PD-L1。
实施方案27.实施方案1-26中任一项的抗体,其中所述抗体与药剂缀合。
实施方案28.实施方案27的抗体,其中所述药剂是放射性核素。
实施方案29.实施方案28的抗体,其中所述放射性核素是213-Bi。
实施方案30.实施方案28的抗体,其中放射性核素是177-Lu。
实施方案31.实施方案27-30中任一项的抗体,其中所述药剂通过接头与所述抗体缀合。
实施方案32.药物组合物,其包含实施方案1-31中任一项的抗体和药理学上可接受的载体。
实施方案33.一种治疗受试者的黑色素瘤的方法,其包含:向有此需要的受试者施用治疗有效量的实施方案1-32中任一项所述的抗体或组合物;或以另一种方式陈述:治疗有效量的实施方案1-31中任一项的抗体或实施方案32的组合物应用于治疗黑色素瘤。
实施方案34.实施方案33的方法,或根据实施方案33的应用的抗体或组合物,其中该黑色素瘤是转移的。
实施方案35.实施方案33的方法,或根据实施方案33或34的应用的抗体或组合物,其中所述施用选择性地诱导黑色素瘤细胞的细胞死亡。
实施方案36.实施方案33、34或35中任一项的实施方案的方法,或根据实施方案33-35中任一项的应用的抗体或组合物,其包含向受试者施用有效量的至少一种其他药剂。
实施方案37.根据实施方案36的方法或实施方案36的应用的抗体或组合物,其中所述药剂是免疫检查点抑制剂。
实施方案38.根据实施方案37的方法或实施方案37的应用的抗体或组合物,其中所述免疫检查点抑制剂选自CTLA-4、PD-1和PDL-1。
实施方案39.根据实施方案33-38中任一项的方法或实施方案33-38中任一项的应用的抗体或组合物,其中所述抗体或组合物经静脉内施用。
实施方案40.一种制备缀合抗体的方法,其包含:将实施方案1-31中任一项的抗体与药剂缀合。
实施方案41.实施方案40的方法,其中所述药剂是放射性核素。
实施方案42.实施方案41的方法,其中所述放射性核素是213-Bi。
实施方案43.实施方案41的方法,其中所述放射性核素是177-Lu。
实施方案44.编码实施方案1-31中任一项的抗体的氨基酸序列的多核苷酸。
实施方案45.实施方案44的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列。
实施方案46.实施方案44的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列。
实施方案47.实施方案44-46的多核苷酸,其中所述序列已经过密码子优化以在人中表达。
实施方案48.包含实施方案44的多核苷酸的载体。
实施方案49.包含实施方案48的载体的细胞系。
实施方案50.表达实施方案1-31的抗体中任何一种的克隆细胞。
实施方案51.试剂盒,其包含实施方案1-32的抗体或组合物中的任一种。
本文包括以下用于说明目的的实施例,并非意在限制本发明的范围。
实施例
实施例1:嵌合和人源化黑色素抗体的构建和体外测试
用8C3鼠源单克隆IgG黑色素抗体(NCBI GenBank登录号KX346264;Urán ME,Nosanchuk JD,Restrepo A,Hamilton AJ,Gómez BL,Cano LE.Detection of antibodiesagainst Paracoccidioides brasiliensis melanin in in vitro and in vivo studiesduring infection.Clin Vaccine Immunol.2011 Oct;18(10):1680-8)产生小鼠-人嵌合抗体。该嵌合抗体具有人恒定区和小鼠可变区。嵌合8C3抗体在本文中可互换地称为“8C3嵌合体”或“嵌合8C3”或“嵌合8C3hIgG1”。
生产了编码8C3-hIgG1嵌合抗体的重链和轻链的两个重组表达载体(pAB11-8C3-hIgG1和pAB2-8C3-hKappa,图4)。然后使用标准技术将这些载体转染到哺乳动物宿主细胞中。
生产了编码人源化8C3抗体的两个γ重链和三个κ轻链的重组表达载体(图4)。
表达该抗体的重链和轻链部分后,哺乳动物宿主细胞将所得蛋白质分泌到宿主培养基中。然后从使用标准技术在其中培养宿主细胞的宿主细胞培养基中回收该抗体。
产生了人源化的8C3重链和轻链的集合。
通过ELISA测定评估嵌合抗体和人源化抗体的体外活性。来源于乌贼(Sepiaofficinalis)的黑色素(Sigma St.Louis,MO,Sigma Cat#M2649-100MG,Lot#103H1023V,PBS中5mg/mL)。从80ug/mL开始,对每个测试样品进行八次五倍系列稀释。(10ug黑色素/孔)使用单个测定板测试所有六种人源化抗体、小鼠8C3亲本抗体、嵌合8C3抗体以及小鼠和人IgG1阴性对照抗体。使用了生物素化的山羊抗人IgG Fc和山羊抗小鼠Fc抗体。链霉亲和素-HRP用于检测小鼠和人源化的生物素化抗体两者,也用于检测生物素化的嵌合8C3。将链霉亲和素-HRP(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)从1mg/mL以1:1000稀释,以检测生物素化的嵌合8C3与黑色素的结合。将生物素化的山羊抗小鼠IgG-Fc(ABCAM,Cambridge,UK)或生物素化的山羊抗人IgG-Fc(ABCAM,Cambridge,UK)从1mg/mL以1:1000稀释,以分别地结合于小鼠对照或人8C3以及人对照,而链霉亲和素-HRP用于检测。使用450nm放射滤光片在荧光板读数器上读取孔内容物的光密度(OD)。使用曲线拟合程序产生标准曲线,样品和对照浓度插入于其中。
表4示出了测试样品。(HE是指人源化抗体)
表4
图1和2示出了嵌合8C3和人源化8C3抗体与黑色素的结合,如在独立的实验中所测定的。在这些测定中,相比人源8C变体(8C3 HE-6至8C3 HE-1),嵌合8C3表现出与来自乌贼(Sepia officinalis)的黑色素更强的结合。
表5示出了在10μg/mL抗体浓度下的平均吸收值的列表结果。这些结果对应于图1示出的测定。
表5
表6示出了在16μg/mL抗体浓度下的平均吸收值的列表结果。这些结果对应于图2示出的测定。
表6
图2和3示出了嵌合8C3和亲本小鼠8C3抗体与来自于乌贼(Sepia officinalis)的黑色素的结合。图3表现了比小鼠8C3更强的与黑色素的结合,而测试样品的平均吸收值在表7中提供。
表7
嵌合8C3-hIgG1(ng/ml)*
图3是显示小鼠8C3与黑色素的剂量依赖性结合的图。
图4提供了用于表达嵌合抗体和人源化抗体的重链和轻链的质粒的示意图。
图5显示了嵌合8C3重链的氨基酸序列(8C3-hIgG1嵌合体)和预测的互补决定区(CDR;以粗体显示)与两条人源化8C3重链(VH3A和VH3B)的氨基酸序列的比对。图6显示了嵌合8C3轻链(8C3-hKappa嵌合体)的氨基酸序列和预测的互补决定区(CDR;以粗体显示)与三个人源化8C3轻链(VK1A、VK1B、VK4)的氨基酸序列的比对。重链和轻链的共有序列分别列在序列比对的下方。
表8提供了人源化抗体的化学和物理性质(使用ExPasy ProtParam工具)。
表8:人源化抗体的化学和物理性质
实施例2:体内测试:确定抗体的组织生物分布
为了用111铟进行放射性标记,首先使用标准方法将抗黑色素抗体(人源化8C3 HE-5,参见表6,小鼠8C3和嵌合8C3)和对照IgG1抗体缀合至双功能螯合剂CHXA”{N-[2-氨基-3-(对-异硫氰酸苯基)丙基]-反式环己烷-1,2-二胺-N,N′,N”,N”′,N””-五乙酸}。CHXA”配体相对于所述抗体以2倍摩尔过量使用。然后根据标准方法用111铟对所述抗体进行放射性标记。111铟的比活度为2μCi/μg。
根据标准方案,将一百万个B16-F10鼠源黑色素瘤细胞悬浮在含有Matrigel的组织培养基中。按照标准程序将所述细胞注射到C57BL/6小鼠的右侧腹。在(注射后)第四天,观察到明显的肿瘤。
肿瘤细胞植入后八天,在各个器官中测量了放射性标记的人源化8C3 HE-5、小鼠8C3和嵌合8C3抗体的组织生物分布。根据标准程序,按照每克组织注射剂量(ID/g,%)计算摄取量。在静脉内注射上述抗体后的两个不同时间点,测量放射性标记抗体的摄取量:四个小时和二十四小时。
按照标准方法以肿瘤对血液的比率计算结合肿瘤的放射性标记的人源化8C3 HE-5、小鼠8C3和嵌合8C3抗体以及对照人IgG1抗体的量。每只荷瘤小鼠接受30μCi的111铟-mAb,并在两个不同的时间间隔(四个小时和二十四小时)确定注射后的循环(即非肿瘤结合的)放射性标记抗体的量。
图7显示了在进行任何的基于mAB的抗黑色素或对照处理之前,患有B16-F10黑色素瘤肿瘤(由黑圈表示)的代表性C57BL/6小鼠。图8A-8D描述了生物分布实验的结果,该实验比较了在抗体注射后的两个不同时间点(4小时和24小时),在各个器官中放射性标记的黑色素结合抗体的摄取量与非特异性人IgG抗体对照的摄取量。按照每克组织的注射剂量(ID/g,%)计算摄取量。与嵌合8C3和人源化8C3抗黑色素抗体(两者相似)的肿瘤摄取量相比,小鼠8C3抗体的肿瘤摄取量更高。在含有黑色素的器官(诸如眼睛和尾巴)中,小鼠、人源化和嵌合8C3黑色素抗体的摄取量与人IgG抗体对照的相似。
图9示出了肿瘤与血液之比的计算结果,其提供了已结合肿瘤的放射性标记的黑色素结合抗体的量的间接测量。尽管在4小时的时间点处鼠源8C3抗体的肿瘤与血液之比高于人源化和嵌合的8C3抗体,但在24小时的时间点处鼠源、人源化和嵌合的8C3抗体显示出相似的肿瘤与血液比值。
实施例3:人源化8C3
HE-5的详细生物分布,用于随后的小鼠和人类剂量学计算
所有动物研究均获得萨斯喀彻温大学动物研究伦理委员会的批准。为了进行成像研究,对从美国查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)获得的6周龄C57BL6雌性小鼠皮下注射在Matrigel基质胶(美国Corning)中的5x105B16-F10鼠源黑色素瘤细胞,注入右侧腹。
BCA CHXA”与8C3 HE-5的缀合。将5mL的10X缀合缓冲液(0.05M碳酸盐/碳酸氢盐,0.15M NaCl,5mM EDTA,pH 8.6-8.7)与0.5mL的0.5M EDTA(pH=8.0)组合,并在50mLFalcon管中用去离子水稀释至50mL,以得到1X缓冲液。在Amicon Ultra 0.5mL离心过滤器(截留值30K MW,Fisher)上加载2mg人源化8C3 HE-5(h8C3 HE-5)抗体。通过使用Amicon浓缩器在4℃的冷冻离心机中进行6x1.5mL洗涤,将抗体交换到上述缀合缓冲液中。最终体积应为约250μL(含有2mg抗体)。随着缓冲液交换接近完成,通过将CHXA”溶解至缀合缓冲液中来制备浓度为2mg/mL的双功能CHXA”配体溶液。从Amicon中回收抗体,然后添加23.6μL在缀合缓冲液中的2mg/mL CHXA”溶液,以提供相对于抗体5倍摩尔过量的CHXA”。将反应混合物在37℃下温育1.5小时。然后将反应混合物纯化至pH=6.5-7.0的0.15M乙酸铵缓冲液中,并在4℃的冷冻离心机中于Amicon浓缩器上进行6x1.5mL洗涤。样品在4℃下储存。进行Bradford测定以确定蛋白质的回收率和浓度。
用111铟(111In)对抗体-CHXA”缀合物进行放射性标记。进行抗体-CHXA”缀合物的111In放射性标记,以实现约5μCi/μg的抗体比活度。将600μCi的111In氯化物添加到10μL的0.15M乙酸铵缓冲液中,并添加到微离心管中,该离心管含有120μg在0.15M乙酸铵缓冲液中的h8C3 HE-5-CHXA”缀合物。将反应混合物在37℃下温育60分钟,然后通过添加3μL的0.05MEDTA溶液淬灭该反应。使用0.15M乙酸铵缓冲液作为洗脱液(顶部含有未标记的111In,底部含有缀合了蛋白质的111In),通过SG-iTLC测量放射性标记的百分比。在Perkin Elmer 2470自动伽玛计数器上读取SG-iTLC。
生物分布。当小鼠中的肿瘤达到约200mm3时,将小鼠随机分为5组,并通过尾静脉静脉注射50μCi的111In-h8C3 HE-5。在注射放射性标记抗体后1、2、24、48和72小时的预定时间点以人道方式处死小鼠,将其主要器官、血液和肿瘤摘除,称重并在Perkin Elmer 2470自动伽玛计数器中计数(见图10)。将生物分布的结果用于针对提议的治疗性放射性核素213Bi和177Lu进行小鼠和人的剂量学计算。
实施例4:213Bi和177Lu标记的h8C3
HE-5的人剂量学计算
此后续实施例示出了从小鼠数据假设外推出的人体内Bi-213和Lu-177的剂量学结果。以下描述的方法是一种从小鼠向人外推辐射剂量结果的方法。
方法
通过从小鼠模型重新计算人类模型的停留时间,并使用MIRD模式实现软件(诸如OLINDA1.1)来计算人类剂量,从而进行外推。该方法假定基于重量的比例在物种之间存在差异(Kirschner AS,Ice RD,Beierwaltes WH,“Radiation-dosimetry of I-131-19-iodocholesterol:J Nucl Med.16:248–249;1975),
Rn-Rm(Oh/Bh)/(Om/Bm) (1)
其中Rh是针对器官或组织的重新计算的人停留时间,Rm是原始计算的小鼠停留时间,Oh是人器官重量,Om是小鼠器官重量,Bh是人的体重,而Bm是小鼠体重。
使用OLINDA版本1.1,使用从上述方法获得的重新计算的人停留时间,计算了Bi-213和Lu-177的器官或组织吸收剂量。对于具有分支衰变链的铋213,将其子产物Po-213(97.9%)和Tl-209(2.1%)的剂量贡献与Bi-213的剂量相加。在此计算中,对正常器官和组织的吸收剂量(以施用的每毫居里的厘戈瑞为单位)(cGy/mCi)不包括质量因数的任何乘数或Bi-213和Po-213的α放射的相对生物学有效性。
在OLINDA1.1的输出结果中,肿瘤不是靶标器官,但可以使用与正常器官和组织相同的方法独立地计算。为了计算肿瘤剂量(以施用的每毫居里的厘戈瑞当量为单位),将所有归因于α发射的吸收剂量乘以任意因数5(例如,参见Sgouros等人,1999[参考文献:Sgouros G,Ballangrud AM,Jurcic JG,McDevitt MR,Humm JL,Erdi YE,Mehta BM,FinnRD,Larson SM,Scheinberg DA,“Pharmacokinetics and dosimetry of an alpha-particle emitter labeled antibody:213Bi-HuM195(anti-CD33)in patients withleukemia,”J Nucl Med.40(11):1935-46;1999]和Jurcic等人,2002年[参考文献:JurcicJG,Larson SM,Sgouros G,McDevitt MR,Finn RD,Divgi CR,BallangrudHamacherKA,Ma D,Humm JL,Brechbiel MW,Molinet R,and Scheinberg DA,“Targeted α-particleimmunotherapy for myeloid leukemia,”Blood 100:1233-1239;2002])。不需要这种乘数就可以计算出肿瘤组织对缺乏α粒子的镥-177的吸收剂量。为了获得以常规单位计算的肿瘤组织对Bi-213的吸收剂量,可以将厘戈瑞当量剂量除以因数5以得出施用的cGy/mCi,以获得cGy/mCi单位的吸收剂量。
另外需要高度关注的是人体胃、小肠和大肠的剂量。在MIRD模式中,仅使用从空腔内容物中而不是空腔组织中的放射性获得的停留时间(即,时间积分活度系数值)来计算这些器官剂量。小鼠数据代表了在胃和肠组织(不是临时内容物)中的活度,因此,假设胃、小肠和大肠是“剩余”组织的一部分。剩余部分包括小鼠中没有剂量学特定测量的所有组织。例如,按照上述方法计算人体剂量时,鼠尾中的活度将被视为全身剩余部分的一部分。眼睛也是剩余部分的一部分,因为OLINDA1.1输出中列出的其他器官也在使用In-111的小鼠研究中未经特别分析。
在MIRD模式中,血液是一个传递室而不是指定的器官或组织,因此在OLINDA1.1中不会计算血液的特定剂量。可以直接在小鼠中计算出血药剂量,但是在OLINDA1.1中并未将这一剂量外推给人。
在以下结果中(表9),针对α粒子、β粒子、光子和总计给出了Bi-213(加上子产物)和Lu-177的剂量贡献。所有结果均以E表示法以三位有效数字给出。选择的拟人模型是成人。数字列与“总计”列等效。
表9
实施例5:213Bi和177Lu标记的h8C3
HE-5的小鼠剂量学计算
使用In-111示踪剂生物动力学数据(已校正衰变),通过假设Bi-213或Lu-177代替了In-111,计算出Bi-213和Lu-177在小鼠中的辐射剂量。我绘制了Bi-213和Lu-177的重新计算的有效数据,获得了绘制的数据点的最佳拟合数学函数,整合了每个源器官或组织的最佳拟合函数,并乘以平衡剂量常数和比吸收分数。
小鼠数据经过反向衰减校正(每克组织的治疗活度百分比),以获得Bi-213(半衰期为45.6分钟)和Lu-177(半衰期为160小时)的有效数据(与实际计数有关)。对于每个器官或组织,将有效数据点相对于采样时间绘图,并进行线性最小二乘回归分析,以针对该数据获得具有最佳拟合方程参数的最佳拟合单(或双)指数函数。
接下来,针对Bi-213和Lu-177两种情况,对指数函数进行积分以获得施用的每个微居里的微居里小时数的估计值,该值由时间-活度函数下的面积表示,并积分到无穷大(完全衰减)。假设Bi-213的吸收分数对于小鼠器官和组织中的所有辐射都是1.0。使用Miller等人先前开发的小鼠模型,针对从测量的器官或组织辐射的能量分数计算出Lu-177辐射的模型值,这些能量沉积在同一器官或组织中。(Miller WH,Hartmann-Siantar C,Fisher DR,Descalle M-A,Daly T,Lehmann J,Lewis MR,Hoffman T,Smith J,Situ PD,and Volkert WA,“Evaluation of Beta Absorbed Fractions in a Mouse Model for90Y,188Re,166Ho,149Pm,64Cu,and 177Lu Radionuclides.”Cancer Biother.&Radiopharm.20(4):436-449;2005)。
Bi-213和Lu-177的平衡剂量常数可从以下文献获得:Eckerman KF and Endo A,MIRD Radionuclide Data and Decay Schemes,2nd ed.,Reston,Virginia:Society ofNuclear Medicine;2008。对于Bi-213,平衡剂量常数为19.44g cGy uCi-1hr-1;对于Lu-177,平衡剂量常数为0.315g cGy uCi-1hr-1。以完全已知或计算出的平衡剂量常数、辐射的β能量的吸收分数,以及通过完全衰变而存在于器官或组织中的积分活度,然后计算出以施用的Bi-213和Lu-177每微居里的cGy(厘戈瑞)(cGy/uCi)为单位的吸收剂量,以获得以下结果(平均剂量和相关系数):
小鼠器官的结果示于表10:
表10
皮尔逊积矩相关系数(r)是衡量两个变量之间线性关系的强度和方向的量度,所述两个变量定义为变量的协方差除以其标准偏差的乘积,其表明了数据与数学函数之间的相关性,所述数学函数用于积分曲线下的面积以确定器官或组织中发生的放射性跃迁数(积分至无穷大)。Bi-213的r值很高,因为其半衰期非常短,并且其给出了三个曲线拟合的时间点。
实施例6:213Bi-标记的相对于177Lu-标记的h8C3 HE-5抗体对B16-F10黑色素瘤肿瘤的治疗比较
213Bi/225Ac发生器购自橡树岭国家实验室(美国田纳西州),177Lu氯化物–购自Radiomedix(美国德克萨斯)。如上述“详细生物分布”中所述,将h8C3 HE-5抗体缀合至CHXA”双功能配体。将该抗体用213Bi进行放射性标记,213Bi从213Bi/225Ac发生器洗脱,然后立即以213Bi碘化物形式进行放射性标,或以177Lu进行放射性标记。用213Bi或Lu对抗体-CHXA”缀合物进行放射性标记,以实现约5μCi/μg抗体的比活度。为了制备“高”(400μCi)剂量的213Bi-或177Lu-标记的抗体,将400μCi在0.15M乙酸铵缓冲液中的放射性核素溶液添加到80μg抗体-CHXA”缀合物中;为了制备“低”(200μCi)剂量的213Bi-或177Lu-标记的抗体,将200μCi在0.15M乙酸铵缓冲液中的放射性核素溶液添加到40μg抗体-CHXA”缀合物中。为了用213Bi标记,将反应混合物在37℃下温育5分钟,用177Lu标记60分钟。温育后,通过加入3μL的0.05M EDTA溶液淬灭该反应。使用0.15M乙酸铵缓冲液作为洗脱液(顶部含有游离放射性核素,底部含有放射性标记的抗体),通过SG-iTLC测量放射性标记的百分比。在Perkin Elmer 2470自动伽玛计数器上读取SG-iTLC。
如实施例3中所述,向雌性C57B16小鼠注射5x105 B16-10黑色素瘤细胞至右侧腹。当小鼠的肿瘤达到约50mm3时,将其用于疗法。将小鼠随机分为五个动物组,并用以下处理:高剂量的213Bi-h8C3 HE-5,或低剂量的213-h8C3 HE-5,或高剂量的177Lu-h8C3 HE-5,或低剂量177Lu-h8C3 HE-5,或80μg未标记(“冷”)的h8C3 HE-5,或余下未经处理的。用电子卡尺每三天测量一次它们的肿瘤,以计算21天的肿瘤体积(图11A和11B)。每3天称重小鼠(图14A和14B)。每周分析其血液中的白细胞(图12A和13A),红细胞(图12B和13B)和血小板计数(图12C和13C)。在实验完成时,处死小鼠,并分析其血液中的ALT(图15A)、AST(图15B)、尿素(图15C)和肌酐(图15D)。
比较了213Bi-标记的和177Lu-标记的h8C3 HE-5抗体在B16-F10黑色素瘤放射免疫治疗中的功效。实验结果显示,短寿命(46分钟物理半衰期)的α-发射体213Bi在杀死黑色素瘤细胞方面比长寿命(6.7天物理半衰期)的β-发射体177Lu更有效。不受任何理论的束缚,通过h8C3 HE-5向黑色素瘤肿瘤中递送213Bi的优异效率,可以通过213Bi衰变的快速剂量速率与B16-F10细胞的侵袭性生长(倍增时间7小时)之间更好的匹配来解释;而衰变较慢的177Lu需要更长的时间来递送其辐射剂量,从而无法匹配于此细胞生长。213Bi辐射的α粒子的相对生物有效性(RBE)是β粒子的相对生物有效性的几倍,因而可以更有效地控制肿瘤。
实施例7:用213Bi-h8C3 HE-5进行分级治疗
使用与比较处理中相同的鼠源黑色素瘤模型。如比较处理中那样,用213Bi对h8C3HE-5抗体进行放射性标记。将荷瘤小鼠随机分为8组,并如下处理:在第0天使用单剂量400μCi 213-h8C3 HE-5,或在第0天和第3天使用400μCi的213-h8C3 HE-5,或在第0天,第3天和第7天使用400μCi 213-h8C3 HE-5。在第16天,单剂量组的小鼠用另一次400μCi 213-h8C3HE-5剂量处理。肿瘤体积的变化在图16A、16B和16C中描述。小鼠体重的变化在图17中描述。分别在图18A、18B和18C中描述了白血球、红血球和血小板的比较血细胞计数。对肾脏和肝脏的全身毒性在图19中描述。
实施例8:带有111In-h8C3 HE-5的B16-F10黑色素瘤荷瘤小鼠的microSPECT/CT成像
如所述将小鼠模型用h8C3HE-5抗体的111In进行放射性标记。在MILabs VECTor4(荷兰)microSPECT/CT扫描仪上收集microSPECT/CT(微型单光子发射计算机断层扫描/计算机断层扫描)图像,并使用综合图像分析软件包PMOD(版本3.9,PMOD Technologies,Inc,Switzerland)对其进行了加工。使用200μCi 111In和CHXA”缀合的h8C3 HE-5以5:1mCi/mg的比活度进行成像研究。通过尾静脉静脉内注射两只荷瘤小鼠,并在注射后1、24、48、72和216小时在俯卧位置成像(图20)。使用超级敏感性小鼠(XUHS-M)准直仪采用螺旋轨迹在20-350keV范围收集SPECT数据20分钟。使用MILabs重建软件,在0.4mm体素网格上使用245keV和171keV两者的111In伽马辐射来重建所有SPECT图像。
实施例9:表达8C3 HE-5抗体的重组细胞系的产生
用编码h8C3 HE-5抗体的载体转染CHO DG44宿主细胞。选择转染子,且其通过有限稀释经历一轮亚克隆。选择三个亚克隆(subclone)以产生研究细胞库(“RCB”)并命名如下:亚克隆-2-3H2,亚克隆-2-20C3和亚克隆-2-3H11。
批量池和微型池的转染和产生
DHFR缺陷型CHO DG44的转染
用作此处所述重组细胞系宿主的二氢叶酸还原酶(DHFR)缺陷型CHODG44细胞系是次黄嘌呤和胸苷(HT)的营养缺陷型菌,由哥伦比亚大学的Larry Chasin博士开发。该DHFR-CHO系来源于EMS和γ辐射诱导的CHO K1细胞系ATCC CCL-61的突变。ATCC CCL-61细胞系是特里·帕克(Ted Puck)博士于1958年从灰仓鼠(Cricetulus griseus)卵巢组织中建立的细胞系的脯氨酸营养缺陷型。Chasin博士使用了两轮γ辐射以生产完全缺乏DHFR基因的两个等位基因的细胞系。
自1981年以来,DHFR细胞系DUXB11和DG44已用于生产重组蛋白。最近,DG44细胞系已适应于在化学成分明确的无血清培养基中作为悬浮细胞系生长。Aragen于2008年从Invitrogen(Gibco-Invitrogen,Cat 12609-012,批号288885)获得了悬浮培养的DG44细胞作为冷冻培养物。将细胞在CHO DG44培养基(Invitrogen)、化学成分确定的培养基中扩增,并在该培养基和7.5%的细胞培养级DMSO(Sigma)的混合物中冷冻。使细胞在无抗生素培养基中传代三次,并通过NAMSA进行抑细菌/抑真菌和无菌测试,通过实验动物诊断实验室(Research Animal Diagnostic Laboratory,RADIL)进行IMPACT VII PCR特征分析,并通过Bionique Testing Laboratories公司进行支原体检测。该细胞满足特定的测试要求。
分别编码该抗体重链和轻链的质粒pAB2-8C3-HE-LRLC(VK1)(625.82.2[PvuI])和pAB11-8C3-HE-LRMRHC(VH3)(625.85.5[PvuI])在此描述。所述质粒还分别编码DHFR和新霉素选择性标志物。通过用限制酶PvuI消化过夜,然后用苯酚-氯仿和乙醇沉淀,使质粒线性化。将质粒DNA重新悬浮在0.1×TE缓冲液中,并在260nm处测量浓度。通过添加无菌的0.1XTE缓冲液将DNA调节至1μg/μL。
在DG44宿主细胞中使用1/1载体比值进行9组Neon电穿孔。对于每次转染,将总量为10μg的DNA添加到100μL悬浮在再悬浮缓冲液-R中的CHO DG44细胞中,细胞浓度为4.0x106细胞/mL。将DNA/细胞混合物吸入Neon吸头100中,并使用来自Invitrogen的Neon电穿孔装置以1700Vx 20ms x 1脉冲程序进行电穿孔。与这九次转染并行,使用带有GFP序列的Aragen AB2载体进行一组转染。电穿孔后,立即将转染的细胞在6孔板中稀释到2mL补充有8mM Glutamax的CD-DG44培养基中,并在37℃和5%CO2的静态条件下培养。转染72小时后,通过FACS分析GFP转染的细胞来测量转染效率。转染后72小时,通过FACS分析,用GFP-携带DNA转染的细胞中有46%为GFP阳性,这与该阶段预期的平均瞬时转染效率相对应。
电穿孔三天后,将每次转染的9个孔中的细胞合并在一起,并将培养基更换为CD-OptiCHO(HT缺陷型)+8mM Glutamax。接下来,这些池用于产生两种类型的稳定选定池(批量池和微型池)。
批量池的产生
批量池以在相对较短的时间段(约3-4周)内获得CHO来源材料的方式产生。在静态烧瓶中用HT缺乏培养基逐渐增加G418(最终浓度为0.25mg/mL→0.5mg/mL)并选择DHFR营养缺陷型,从而产生一个批量池。当细胞活力恢复至约90%时,将批量池适应于摇瓶中。
此外,通过在125mL摇瓶中以5x105个细胞/mL接种至补充有8mM Glutamax的50mLCD-OptiCHO培养基中,评估摇瓶中的池性能。将摇瓶在装备有设置为125rpm的25mm轨道投掷的摇床平台上,在37℃和5%CO2下培养。在第3天、第6天和第8天,向培养物中饲喂含有10mg/L Invitrogen重组人胰岛素的5%(初始培养体积)的Cell Boost 7a,以及0.5%来自Hyclone的Cell Boost 7b(初始培养体积)。对细胞数进行计数(图21),并在第3、6、8天和第9天后每天取样条件培养基。在第11天以2500rpm离心5分钟以约80%的活力收获培养物。使用纯化的IgG1抗体作为标准品,通过带有蛋白质A传感器的ForteBio Octet Red测量条件培养基中的蛋白质浓度。从所述池中获得的表达水平显示在图22中。
最后,将条件培养基中的8C3 HE-5抗体在Protein A滴注柱上纯化,并通过SDS-PAGE分析纯化级分。
微型池的产生
转染三天后,通过在200μl培养基中补充有8mM Glutamax(18x96孔板)的CD-OptiCHO培养基,在营养缺陷型DHFR选择下,将转染的池以每孔1,000个细胞铺板到微型池中,从而产生微型池,将板在37℃和5%CO2下培养。铺板后三天开始,经4周的时间通过培养基交换使微型池经历下述浓度逐渐增加:G418浓度(0.25mg/mL→0.5mg/mL的最终浓度)和甲氨蝶呤(MTX)(100nM→200nM→400nM的最终浓度)。在这段时间内用显微镜监测细胞汇合,对细胞生长进行更高的选择(即细胞汇合增加)。约5周后,分别使用山羊抗人IgG-Fc和山羊抗人κ链-HRP作为包被和检测抗体,通过ELISA来测定所述板(图23)。
从96孔板筛选获得的前120个表达者微型池扩展到24孔板,然后重新筛选以在24孔板中表达。在补充有8mM Glutamax的CD-OptiCHO中,在新鲜培养基中以约20%汇合度将细胞铺板在新的24孔板中。在第7天和第11天收集条件培养基。使用从批量池中纯化的8C3HE-5抗体作为标准品,通过带有Protein A传感器的ForteBio Octet Red测量条件培养基中的蛋白质浓度(图24)。
筛选后,将最高的24孔板表达者微型池汇集在三个超级池中。为三个超级池选择的微型池的列表在图25中显示。超级池1由三个最高表达者的微型池组成,其滴度范围为106-129μg/mL;超级池2由五个微型池组成,其滴度范围为60-75μg/mL;而超级池3由七个微型池组成,其滴度范围为40-58μg/mL。
将超级池在补充有8mM Glutamax、0.5mg/mL G418和400nM MTX的CD-OptiCHO培养基中传代约2周,直到活力达到85%。此时,将超级池冷冻保存,以有限稀释进行处理,并在分批补料摇瓶中评价其表达。
超级池的摇瓶评价
在分批补料摇瓶中评价超级池。将细胞在250ml摇瓶中以5x105细胞/mL的浓度接种至50mL补充有8mM L-谷氨酰胺的CD-OptiCHO培养基中。在装备有以125rpm旋转的25mm轨道投掷的摇床平台上,在37℃和5%CO2下培养这些摇瓶。在第3、6、8和10天每天向培养物中饲喂5%的补充有10mg/L Invitrogen重组人胰岛素的Cell Boost 7a,以及0.5%的CellBoost 7b。在第3、6、8天进行NOVA读数,并根据需要直至收获以监测和调节葡萄糖和L-谷氨酰胺。在第3、6、8、10天以及此后每天,取细胞计数以及培养样品,直至收获。以<80%的活力收获培养物。生长曲线和活力在图26和27中示出。超级池1在摇瓶中的悬浮生长要比超级池2和超级池3的细胞慢,因此对超级池1进行了两轮分批补料评价。表达特征显示在下面的图28中。重复超级池-1获得的最高表达为792.3mg/L,而超级池2的表达为462mg/L。
微型池来源的超级池的有限稀释
有限稀释和ELISA筛选克隆
通过有限稀释法克隆了三个超级池。将每种培养物以0.5个细胞/孔接种到96孔板中。每个超级池均铺板20个96孔板。克隆培养基由补充有8mM Glutamax、2mM谷氨酰胺、5μg/mL胰岛素、1X HT以及等体积收集自批量池培养物的条件培养基的CD OptiCHO组成。将板在静态培养箱中于37℃、5%CO2下温育14天,并在第0、1、2、5或7天以及第13或14天通过Solentim Imaging System对每个孔成像。在第7天将新鲜培养基100μL添加入每个孔中,并在第14天更换培养基。温育14或15天后,通过ELISA分别使用山羊抗人IgG-Fc和山羊抗人κ链-HRP作为包被和检测抗体来筛选所有板。
根据Solentim图像和ELISA筛选结果,将来自单细胞的前135个克隆在补充有8mMGlutamax、0.5mg/mL G418和400nM MTX的CD-OptiCHO培养基中扩增至24孔板。
用显微镜定期监测扩展到24孔板的前135个克隆。大约7天后,这些孔达到80%汇合。此时,将每个克隆以20%的汇合度接种到新的24孔板的孔中的新鲜培养基中。将培养物在静态条件下于37℃和5%CO2下温育11天。在第7天和第11天收集条件培养基。基于在第11天使用带有Protein A传感器的ForteBio Octet Red测量的表达水平对克隆进行排名,并与用从批量池中纯化的8C3 HE-5抗体获得的标准曲线进行比较(图29)。根据24孔表达水平特征,将总共36个表达水平范围为95.7-221.8μg/mL的克隆扩增到T-75,然后扩增到125mL摇瓶中。图30总结了在24孔阶段中前36个克隆的表达水平。
将扩展至摇瓶的前36个克隆在7.5%DMSO和92.5%CD-OptiCHO培养基中冷冻保存(每个3小瓶)。将这些小瓶置于Nalgene Cryo 1℃冷冻中。容器(–1℃/分钟的冷却速率),并在–80℃下存储。48小时后,将这些小瓶转移并储存在液氮罐中。
排在前列的克隆的摇瓶评价
在24孔板阶段鉴别出的前36个表达者亚克隆中的35个成功适应了摇瓶中的悬浮生长。在分批补料条件下,评价这些排在前列的亚克隆在250mL摇瓶中的表达。以5x105细胞/mL的浓度接种摇瓶,至50mL补充有8mM L-谷氨酰胺的CD-OptiCHO培养基中。在装备有以125rpm旋转的25mm轨道投掷的摇床平台上在37℃和5%CO2下培养这些摇瓶。在第3、6、8和10天每天向培养物中饲喂5%的Cell Boost 7a和0.5%的Cell Boost 7b。在第3、6、8天以及根据需要每天进行NOVA读数直到收获,以监测和调节葡萄糖和L-谷氨酰胺。同时,在第3、6、8、10天以及此后每天,取细胞计数和培养物样品直到收获。以<80%的活力收获这些培养物。将细胞以2500rpm离心5分钟,然后转移条件培养基并保存在-20℃。
克隆2-3H2、2-3H11、2-11H12和2-20C3达到最高表达水平,各自的表达水平为1.29g/L、1.27g/L、1.26g/L和1.25g/L。从Solentim图像分析得到的最大活细胞密度(VCD)、活力特征、收获时的滴度、培养物的寿命以及克隆性总结于图31中。
图31中突出显示了克隆2-3H2、2-3H11和2-20C3,且它们被选出用于制备研究细胞库。
通过SDS-PAGE分析获自前五个表达者克隆的收获条件培养基。在还原和非还原条件下,将四个微升加载到每个条带上。所有五个克隆在还原和非还原条件下均获得了预期的分子量条带。
制备研究细胞库
根据克隆2-3H11、2-3H3和2-20C3在收获时的表达水平和来自Solentim的克隆性,它们被选出用于制备研究细胞库(RCB)。
将每个克隆扩增至250mL,并通过对在1mL体积的7.5%DMSO和92.5%CD-OptiCHO培养基中含有1x107个活细胞的36个样品瓶排名来制备RCB,每个样品瓶中补充有8mMGlutaMax。将小瓶放入Nalgene Cryo 1℃冷冻容器(–1℃/分钟的冷却速率)中,并保存在–80℃下。48小时后,将所有小瓶转移并储存在液氮罐中。
Claims (52)
1.特异性结合黑色素的单克隆抗体,其中所述抗体是嵌合的或人源化的。
2.如权利要求1所述的抗体,其中所述抗体是嵌合的。
3.如权利要求2所述的抗体,其中所述抗体是小鼠-人嵌合抗体。
4.如权利要求3所述的抗体,其中所述嵌合抗体包含小鼠可变区和人恒定区。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗体,其中所述黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链。
6.如权利要求1-5中任一项所述的抗体,其中所述黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链。
7.如权利要求1-4中任一项所述的抗体,其中所述黑色素抗体包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的轻链和含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链。
8.如权利要求1所述的抗体,其中所述抗体是人源化的。
9.如权利要求8所述的抗体,其中所述抗体是小鼠单克隆抗体序列的人源化形式。
10.如权利要求9所述的抗体,其中所述抗体是小鼠8C3抗体的人源化形式。
11.如权利要求1和8-10中任一项所述的抗体,其中所述黑色素抗体包含含有SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链。
12.如权利要求1和8-10中任一项所述的抗体,其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链。
13.如权利要求11和12中任一项所述的抗体,其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链。
14.如权利要求11和12中任一项所述的抗体,其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链。
15.如权利要求11和12中任一项所述的抗体,其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链。
16.如权利要求11和12中任一项所述的抗体,其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链。
17.如权利要求11和12中任一项所述的抗体,其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链。
18.如权利要求11和12中任一项所述的抗体,其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链。
19.如权利要求1-10中任一项所述的抗体,其中所述黑色素抗体的重链包含至少一个下述CDR序列:SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10。
20.如权利要求1-10中任一项所述的抗体,其中所述黑色素抗体的轻链包含至少一个下述CDR序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15。
21.如权利要求1-10中任一项所述的抗体,其中所述黑色素抗体的重链包含至少一个下述CDR序列:SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10,且其中所述黑色素抗体的轻链包含至少一个下述CDR序列:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15。
22.如权利要求1-10中任一项所述的抗体,其中所述黑色素抗体的重链包含来自下述的CDR序列:SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10,和/或其中所述轻链包含来自下述的CDR序列:SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14。
23.如权利要求1或8-10所述的抗体,其中所述抗体是抗原结合片段。
24.如权利要求1-23中任一项所述的抗体,其中所述抗体是双特异性抗体。
25.如权利要求24所述的抗体,其中所述双特异性抗体包含靶向黑色素的第一臂和靶向含有免疫检查点抑制剂的抗原的第二臂。
26.如权利要求25所述的抗体,其中所述免疫检查点抑制剂是CTLA4、PD-1或PD-L1。
27.如权利要求1-26中任一项所述的抗体,其中所述抗体与药剂缀合。
28.如权利要求27所述的抗体,其中所述药剂是放射性核素。
29.如权利要求28所述的抗体,其中所述放射性核素是213-Bi。
30.如权利要求28所述的抗体,其中所述放射性核素是177-Lu。
31.如权利要求27-30中任一项所述的抗体,其中所述药剂通过接头与所述抗体缀合。
32.药物组合物,其包含如权利要求1-31中任一项所述的抗体和药理学上可接受的载体。
33.治疗受试者的黑色素瘤的方法,其包含:向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1-32中任一项所述的抗体或组合物。
34.治疗有效量的权利要求1-31中任一项所述的抗体或权利要求32所述的组合物,应用于治疗黑色素瘤。
35.如权利要求33所述的方法,或如权利要求34所述应用的抗体或组合物,其中所述黑色素瘤是转移的。
36.如权利要求33或35的方法,或如权利要求34或35所述应用的抗体或组合物,其中所述施用选择性诱导黑色素瘤细胞的细胞死亡。
37.如权利要求33、35或36中任一项所述的方法,或如权利要求34-36中任一项所述应用的抗体或组合物,其包含:向所述受试者施用有效量的至少一种其他药剂。
38.如权利要求37所述的方法或所述应用的抗体或组合物,其中所述药剂是免疫检查点抑制剂。
39.如权利要求38所述的方法或所述应用的抗体或组合物,其中所述免疫检查点抑制剂选自CTLA-4、PD-1和PDL-1。
40.如权利要求33或35-39中任一项所述的方法,或如权利要求34-39中任一项所述应用的抗体或组合物,其中所述抗体或组合物是经静脉内施用的。
41.制备缀合抗体的方法,其包含:将如权利要求1-31中任一项所述的抗体缀合至药剂。
42.如权利要求41所述的方法,其中所述药剂是放射性核素。
43.如权利要求42所述的方法,其中所述放射性核素是213-Bi。
44.如权利要求42所述的方法,其中所述放射性核素是177-Lu。
45.编码权利要求1-31中任一项所述抗体的氨基酸序列的多核苷酸。
46.如权利要求45所述的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:17的核苷酸序列。
47.如权利要求45所述的多核苷酸,其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:18的核苷酸序列。
48.如权利要求45-47所述的多核苷酸,其中所述序列已经密码子优化以在人中表达。
49.一种载体,其包含权利要求48中任一项所述的多核苷酸。
50.一种细胞系,其包含权利要求49所述的载体。
51.一种表达权利要求1-31中任一项所述的抗体的克隆细胞。
52.一种试剂盒,其包含权利要求1-31中任一项所述的抗体或权利要求32所述的组合物。
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