JP2020533002A - メラニン抗体及びその使用 - Google Patents
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Abstract
メラニンに特異的に結合するモノクローナル抗体が、本明細書において提供される。抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体であり得る。記載される抗体の使用方法及び作製方法もまた、本明細書において提供される。例えば、メラニン抗体は、メラノーマを処置又は予防するために、治療的に使用することができる。
Description
相互参照
本出願は、２０１７年９月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／５５８，２３０号の優先権の利益を主張し、これは、参照によりその全体が組み込まれる。
本出願は、２０１７年９月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／５５８，２３０号の優先権の利益を主張し、これは、参照によりその全体が組み込まれる。
皮膚がんのもっとも重篤な種類であるメラノーマは、メラニンを産生するメラノサイトにおいて生じる。メラノーマは、眼のブドウ膜、上部気道消化管を覆う粘膜上皮、及び腸管を起源とする場合もある。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙの推定によると、米国では、２０１７年に、約８７，０００件の新たなメラノーマが診断され、約９，７５０人が、メラノーマにより死亡すると予測されている（https://www.cancer.org/cancer/melanoma-skin-cancer/about/key-statistics.html）。全世界では、２０１２年に、約２３２，０００人がメラノーマを発症し、約５５，０００人が死亡に至った。
ステージ１及び２のメラノーマは、外科手術により処置することができるが、この悪性腫瘍の攻撃的な転移性質は、予後不良をもたらし、ステージIVのメラノーマを有する患者について、予測生存率は３年、５年、及び１０年で、それぞれ、１９％、１３％、及び９％である。（CM Balch, JE Gershenwald, SJ Soong, et al: Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification J Clin Oncol 27: 6199- 6206,2009）。変異型Ｂ−ＲＡＦタンパク質を阻害するベムラフェニブがＦＤＡによりが承認されたことは、この変異を有する４０〜６０％のメラノーマ患者に希望を与えている。潜在的な抗腫瘍免疫を回復させるための試みは、Ｔリンパ球上のＣＴＬ抗原４（ＣＴＬＡ−４）（Hodi FS, O’Day SJ, McDermott DF, et al: Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med 363:711-723, 2010）及びプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）並びに腫瘍細胞上のその主要リガンド（ＰＤ−Ｌ１）（Phillips GK, Atkins M. Therapeutic uses of anti-PD-1 and anti-PD-L1 antibodies. Int Immunol. 2015;27(1):39-46）を標的とするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に基づく介入を中心としてきた。抗ＣＴＬＡ−４又は抗ＰＤ−１いずれかの経路のチェックポイントインヒビター免疫療法に応答して、長期にわたる無増悪生存期間を経験する患者はごくわずかにすぎず、これらの薬剤には重篤な自己免疫毒性の重大な危険性が付随し、免疫療法の費用が高いため（Fellner, Chris. Ipilimumab (Yervoy) Prolongs Survival in Advanced Melanoma: Serious Side Effects and a Hefty Price Tag May Limit Its Use. Pharmacy &Therapeutics 2012:27(9):503-511）、メラノーマ、特に、転移性メラノーマと戦うための他のアプローチに対する切迫した必要性が残っている。
https://www.cancer.org/cancer/melanoma-skin-cancer/about/key-statistics.html
CM Balch, JE Gershenwald, SJ Soong, et al: Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification J Clin Oncol 27: 6199- 6206,2009
Hodi FS, O’Day SJ, McDermott DF, et al: Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med 363:711-723, 2010
Phillips GK, Atkins M. Therapeutic uses of anti-PD-1 and anti-PD-L1 antibodies. Int Immunol. 2015;27(1):39-46
Fellner, Chris. Ipilimumab (Yervoy) Prolongs Survival in Advanced Melanoma: Serious Side Effects and a Hefty Price Tag May Limit Its Use. Pharmacy &Therapeutics 2012:27(9):503-511
メラニンに特異的に結合するモノクローナル抗体が、本明細書において提供される。抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体であり得る。記載される抗体の使用方法及び作製方法もまた、本明細書において提供される。例えば、メラニン抗体は、メラノーマを処置又は予防するために、治療的に使用することができる。
したがって、一態様において、メラニンに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、抗体が、キメラ抗体又はヒト化抗体である、モノクローナル抗体が、本明細書において提供される。
一部の実施形態において、抗体は、キメラ抗体である。一部の実施形態において、抗体は、マウス−ヒトキメラ抗体である。一部の実施形態において、キメラ抗体は、マウス可変領域及びヒト定常領域を含む。一部の実施形態において、メラニン抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、メラニン抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態において、メラニン抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
一部の実施形態において、抗体は、ヒト化抗体である。一部の実施形態において、抗体は、マウスモノクローナル抗体の配列に由来するヒト化形態である。一部の実施形態において、抗体は、マウス８Ｃ３抗体に由来するヒト化形態である。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体の重鎖は、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０のＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体の軽鎖は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５のＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体の重鎖は、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０のＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含み、ヒト化メラニン抗体の軽鎖は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５のＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体の重鎖は、配列番号８、配列番号９、若しくは配列番号１０に由来するＣＤＲ配列を含み、及び／又は軽鎖は、配列番号３若しくは配列番号４に由来するＣＤＲ配列を含む。
一部の実施形態において、キメラ又はヒト化モノクローナルメラニン抗体は、抗原結合性フラグメントである。
一部の実施形態において、キメラ又はヒト化モノクローナルメラニン抗体は、二重特異性抗体である。一部の実施形態において、二重特異性抗体は、メラニンを標的とする第１のアーム及び免疫チェックポイントインヒビター（immune checkpoint inhibitor）を含む抗原を標的とする第２のアームを含む。一部の実施形態において、免疫チェックポイントインヒビターは、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、又はＰＤ−Ｌ１である。
一部の実施形態において、キメラ又はヒト化モノクローナルメラニン抗体は、薬剤にコンジュゲートされている。一部の実施形態において、薬剤は、放射性核種（radionuclide）である。一部の実施形態において、放射性核種は、２１３−Ｂｉである。一部の実施形態において、放射性核種は、１７７−Ｌｕである。一部の実施形態において、薬剤は、リンカーを介して抗体にコンジュゲートされている。
関連する態様において、本明細書において提供されるキメラ又はヒト化モノクローナルメラニン抗体のうちのいずれか１つと、薬理学的に許容される担体とを含む医薬組成物が、本明細書において提供される。
別の態様において、対象においてメラノーマを処置するための方法であって、治療有効量の本明細書に記載されるモノクローナルキメラ若しくはヒト化メラニン抗体のうちのいずれか１つ又はそのような抗体を含む組成物を投与するステップを含む方法が、本明細書において提供される。関連する態様において、メラノーマの処置における使用のための、治療有効量の本明細書に記載されるモノクローナルキメラ若しくはヒト化メラニン抗体のうちのいずれか１つ又はそのような抗体を含む組成物が、本明細書において提供される。
一部の実施形態において、メラノーマは、転移性である。一部の実施形態において、投与は、メラノーマ細胞の細胞死を選択的に誘導する。一部の実施形態において、本方法は、対象に、有効量の少なくとも１つの追加の薬剤を投与するステップを含む。一部の実施形態において、薬剤は、免疫チェックポイントインヒビターである。一部の実施形態において、免疫チェックポイントインヒビターは、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、及びＰＤＬ−１から選択される。一部の実施形態において、抗体又は組成物は、静脈内投与される。
別の態様において、コンジュゲートされたメラニン抗体を作製する方法であって、本明細書に記載されるキメラ又はヒト化モノクローナルメラニン抗体のうちのいずれか１つを、薬剤にコンジュゲートするステップを含む方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態において、薬剤は、放射性核種である。一部の実施形態において、放射性核種は、２１３−Ｂｉである。一部の実施形態において、放射性核種は、１７７−Ｌｕである。
別の態様において、本明細書において提供されるキメラ又はヒト化モノクローナルメラニン抗体のうちのいずれか１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドが、本明細書において提供される。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている。本明細書において提供されるキメラ又はヒト化モノクローナルメラニン抗体のうちのいずれか１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、及びそのようなベクターを含む細胞株もまた、本明細書において提供される。本明細書において提供されるキメラ又はヒト化モノクローナルメラニン抗体のうちのいずれか１つを発現するクローン細胞株もまた、本明細書において提供される。
別の態様において、キメラ若しくはヒト化モノクローナル抗体のうちのいずれか１つ、又はそのような抗体を含む医薬組成物を含むキットが、本明細書において提供される。
本明細書（任意の添付される特許請求の範囲、要約書、及び図面を含む）に記載される上述の特徴のすべて、及び／又はそこで開示される任意の方法若しくはプロセスのステップのすべては、任意の組合せで組み合わせることができるが、そのような特徴及び／又はステップのうちの少なくともいくつかが相互に排他的である組合せを除く。
本発明のより良好な理解のため、及びその実施形態をどのようにして実施することができるかを示すために、例として、添付の図面への参照がなされるであろう。
メラニンに特異的に結合する抗体が、本明細書において提供される。抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体であり得る。記載される抗体の使用方法及び作製方法もまた、本明細書において提供される。例えば、メラニン抗体は、メラノーマを処置又は予防するために、治療的に使用することができ、それを必要とする対象に、抗体又はその医薬組成物を投与することを含む。メラニン抗体は、診断目的で、対象から得られた試料においてメラノーマを検出するために使用することもできる。本明細書に記載されるメラニン抗体を産生する方法もまた、提供される。
本明細書において別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。
数値範囲は、その範囲を定める数を含む。
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合には、単数形で使用されている用語は、複数形も含み、逆もまた同様である。以下に記載されている任意の定義が、参照により本明細書に組み込まれている任意の文書と矛盾する場合には、記載されている定義が優先されるものとする。
本明細書において使用されるとき、単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、別途示されない限り、複数形の参照物を含む。
本明細書に記載される本発明の態様及び実施形態は、態様及び実施形態を「含むこと」、それら「からなること」、及びそれら「から本質的になること」を含むことが理解される。
「約」という用語は、本明細書において使用されるとき、当該技術分野の当業者に容易に理解される、それぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書において、「約」ある値又はパラメーターへの言及は、その値又はパラメーター自体を対象とする実施形態を含む（また、それについて記載する）。
用語の他の定義は、本明細書全体に出現し得る。
本明細書に記載される構造及び機能上の特徴のいずれについても、これらの特徴を決定する方法は、当該技術分野において公知である。
メラニン抗体
メラニンに特異的に結合する抗体が、本明細書において提供される。一部の実施形態において、メラニンは、哺乳動物メラニン、例えば、ヒトメラニン、又はマウスメラニンである。他の実施形態において、メラニンは、非哺乳動物メラニンである。
メラニンに特異的に結合する抗体が、本明細書において提供される。一部の実施形態において、メラニンは、哺乳動物メラニン、例えば、ヒトメラニン、又はマウスメラニンである。他の実施形態において、メラニンは、非哺乳動物メラニンである。
本明細書全体を通じて使用される「抗体」という用語は、もっとも広い意味であり、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、非ヒト抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体の抗原結合性フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’２フラグメント、ＣＤＲ、又はＳｃＦｖ）、抗体−薬物コンジュゲート、並びにメラニン抗原に対する特異性を保持する他の抗体フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。
抗体は、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ抗体、又はＩｇＭ抗体のうちのいずれであってもよい。ＩｇＡ抗体は、ＩｇＡ１抗体又はＩｇＡ２抗体であり得る。ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ２ａ抗体、ＩｇＧ２ｂ抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体であり得る。これらの抗体のうちのいずれかの組合せもまた、使用することができる。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、治療、検出、診断、視覚化、定量化、分類における使用、及び生物学的アッセイにおける使用を含むがこれらに限定されない様々な目的で、コンジュゲートされている。
一部の実施形態において、抗体は、メラニンに特異的に結合するヒト化抗体である。一部の実施形態において、ヒト化抗体は、マウスモノクローナル８Ｃ３ ＩｇＧ抗体のヒト化型である（ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＸ３４６２６４、Uran ME, Nosanchuk JD, Restrepo A, Hamilton AJ, Gomez BL, Cano LE. Detection of antibodies against Paracoccidioides brasiliensis melanin in in vitro and in vivo studies during infection. Clin Vaccine Immunol. 2011 Oct;18(10):1680-8）。
一部の実施形態において、抗体は、メラニンに特異的に結合するキメラ抗体である。例示的な実施形態において、抗体は、マウス−ヒトキメラ抗体である。マウス−ヒトキメラ抗体は、ヒト可変領域及びマウス定常領域を含み得る。一部の実施形態において、定常領域は、ＩｇＧ型のものであり、例えば、ＩｇＧ型のものである。一部の実施形態において、定常領域は、ＩｇＧ型のものではなく、例えば、ヒトＩｇＧ型のものではない。一部の実施形態において、定常領域は、ＩｇＭ型のものであり、例えば、ヒトＩｇＭ型のものである。一部の実施形態において、定常領域は、ＩｇＭ型のものではなく、例えば、ヒトＩｇＭ型のものではない。
表１は、本明細書において提供される抗体及び抗原結合性フラグメントの例示的な配列を提供する。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、表１に提供されている軽鎖配列のうちのいずれかの可変部分を含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、メラニン抗体は、表１に提供されている軽鎖配列のうちのいずれか１つの可変部分のみを含む軽鎖を含む。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、表１に提供されている軽鎖配列のうちのいずれか１つに含有されるＣＤＲを含む軽鎖を含む。一部の実施形態において、メラニン抗体は、表１に提供されている重鎖配列のうちのいずれか１つに含有されるＣＤＲを含む重鎖を含む。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、表１に提供されている重鎖配列のうちのいずれか１つの可変部分を含む重鎖を含む。一部の実施形態において、メラニン抗体は、表１に提供されている重鎖配列のうちのいずれか１つの可変部分のみを含む重鎖を含む。
一部の実施形態において、メラニン抗体の重鎖は、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列のうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態において、メラニン抗体の重鎖は、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む。
一部の実施形態において、メラニン抗体の軽鎖は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５のＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含む。一部の実施形態において、メラニン抗体の軽鎖は、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１５の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む。一部の実施形態において、メラニン抗体の軽鎖は、配列番号１１、配列番号１３、及び配列番号１５の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む。一部の実施形態において、メラニン抗体の軽鎖は、配列番号１１、配列番号１４、及び配列番号１５の相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、ＨＥ−１、ＨＥ−２、ＨＥ−３、ＨＥ−４、ＨＥ−５、及びＨＥ−６からなる群から選択されるヒト化抗体である。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、二重特異性抗体である。例えば、二重特異性抗体は、メラニンを標的とする第１のアーム、及び追加の治療標的、例えば、免疫チェックポイントインヒビターを含む抗原を標的とする第２のアームを含み得る。一部の実施形態において、二重特異性抗体は、メラニンを標的とする第１のアーム、及び免疫チェックポイントインヒビターを標的とする第２のアームを含み、例えば、第２のアームは、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、又はＰＤ−Ｌ１を標的とする。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、放射性核種（放射性の核種（radioactive nuclide）、放射性同位体（radioisotope）、又は放射性の同位体（radioactive isotope）とも称される）、細胞毒素、化学療法剤、薬物、酵素、検出可能な薬剤、サイトカイン、ホルモン、オリゴヌクレオチド、又は第２の抗体を含むがこれらに限定されない、薬剤にコンジュゲートされている。
別の例示的な実施形態において、メラニン抗体は、細胞毒素にコンジュゲートされている。
別の例示的な実施形態において、メラニン抗体は、微小管インヒビターにコンジュゲートされている。
別の例示的な実施形態において、メラニン抗体は、核酸損傷剤、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ切断剤、ＤＮＡ架橋剤、ＤＮＡインターカレート剤、又は他のＤＮＡ損傷剤にコンジュゲートされている。
別の例示的な実施形態において、メラニン抗体は、放射性核種にコンジュゲートされている。メラニン抗体がコンジュゲートされる具体的な放射性核種の選択肢は、組織における放出範囲及び半減期を考慮して、処置しようとするメラノーマ腫瘍のサイズ及び身体におけるそれの局在化によって判定することができる。放射性核種には、アルファ放出体、ベータ放出体、及びポジトロン放出体が含まれる。
例示的な放射性核種としては、アルファ放出体、ベータ放出体、及びポジトロン放出体が挙げられるが、これらに限定されない。
アルファ放出体の例としては、２１３−ビスマス（半減期４６分間）、２２３−ラジウム（半減期１１．３日間）、２２４−ラジウム（半減期３．７日間）、２２５−ラジウム（半減期１４．８日間）、２２５−アクチニウム（半減期１０日間）、２１２−鉛（半減期１０．６時間）、２１２−ビスマス（半減期６０分間）、２１１−アスタチン（半減期７．２時間）、２５５−フェルミウム（半減期２０時間）、及び２２７−トリウム（半減期１８．７日間）が挙げられる。
ベータ放出体の例としては、１８８−レニウム（半減期１６．７時間）、９０−イットリウム（半減期２．７日間）、３２−リン（半減期１４．３日間）、４７−スカンジウム（半減期３．４日間）、６７−銅（半減期６２時間）、６４−銅（半減期１３時間）、７７−ヒ素（半減期３８．８時間）、８９−ストロンチウム（半減期５１日間）、１０５−ロジウム（半減期３５時間）、１０９−パラジウム（半減期１３時間）、１１１−銀（半減期７．５日間）、１３１ヨウ素（半減期８日間）、１７７−ルテチウム（半減期６．７日間）、１５３−サマリウム（半減期４６．７時間）、１５９−ガドリニウム（半減期１８．６時間）、１８６−レニウム（半減期３．７日間）、１６６−ホルミウム（半減期２６．８時間）、１６６−ジスプロシウム（半減期８１．６時間）、１４０−ランタン（半減期４０．３時間）、１９４−イリジウム（半減期１９時間）、１９８−金（半減期２．７日間）、及び１９９金（半減期３．１日間）が挙げられる。
ポジトロン放出体の例としては（半減期を丸括弧内に示す）、５２Ｍｎ（２１．１分間）、６２Ｃｕ（９．７４分間）、６８Ｇａ（６８．１分間）、１１Ｃ（２０分間）、８２Ｒｂ（１．２７分間）、１１０Ｉｎ（１．１５時間）、１１８Ｓｂ（３．５分間）、１２２Ｉ（３．６３分間）、１８Ｆ（１．８３時間）、３４’’’Ｃｌ（３２．２分間）、３８Ｋ（７．６４分間）、５１Ｍｎ（４６．２分間）、５２Ｍｎ（５．５９日間）、５２Ｆｅ（８．２８時間）、５５Ｃｏ（１７．５時間）、６１Ｃｕ（３．４１時間）、６４Ｃｕ（１２．７時間）、７２Ａｓ（１．０８日間）、７５Ｂｒ（１．６２時間）、７６Ｂｒ（１６．２時間）、８２’’’Ｒｂ（６．４７時間）、８３Ｓｒ（１．３５日間）、８６Ｙ（１４．７時間）、８９Ｚｒ（３．２７日間）、９４’’’Ｔｃ（５２．０分間）、１２０Ｉ（１．３５時間）、１２４Ｉ（４．１８日間）が挙げられる。６４−銅は、ポジトロン、電子、及びオージェ電子の混合放出体である。
また、例示的な放射性核種としては、９９ｍＴｃ、２０１Ｔｌ、１３３Ｘｅ、１１Ｃ、６２Ｃｕ、１８Ｆ、６８Ｇａ、１３Ｎ、１５Ｏ、３８Ｋ、８２Ｒｂ、９９ｍＴｃ（テクネチウム）、１８８Ｒｅ、２１３Ｂｉ（２１３−ビスマス）、１２５Ｉ、１３１Ｉ、８９Ｚｒ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、及び１３１Ｉも挙げることができる。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、ヒト化抗体であり、２１３Ｂにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、メラニン抗体は、ＨＥ−１、ＨＥ−２、ＨＥ−３、ＨＥ−４、ＨＥ−５、及びＨＥ−６からなる群から選択されるヒト化抗体であり（表４を参照されたい）、２１３Ｂにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、２１３Ｂにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、２１３Ｂにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、２１３Ｂにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、２１３Ｂにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、２１３Ｂにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、２１３Ｂにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、２１３Ｂにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、２１３Ｂにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体の重鎖は、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０のＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含み、２１３Ｂにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体の軽鎖は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５のＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含み、２１３Ｂにコンジュゲートされている。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、ヒト化抗体であり、１７７Ｌｕにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、メラニン抗体は、ＨＥ−１、ＨＥ−２、ＨＥ−３、ＨＥ−４、ＨＥ−５、及びＨＥ−６からなる群から選択されるヒト化抗体であり（表４を参照されたい）、１７７Ｌｕにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含み、１７７Ｌｕにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号５、配列番号６、又は配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、１７７Ｌｕにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、１７７Ｌｕにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、１７７Ｌｕにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、１７７Ｌｕにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、１７７Ｌｕにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、１７７Ｌｕにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、１７７Ｌｕにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体の重鎖は、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０のＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含み、１７７Ｌｕにコンジュゲートされている。一部の実施形態において、ヒト化メラニン抗体の軽鎖は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５のＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含み、１７７Ｌｕにコンジュゲートされている。
異なる実施形態において、治療目的での、本明細書に記載される実施形態のうちのいずれか１つにおける放射性核種の線量は、１〜１０００ｍＣｉである。
一部の実施形態において、抗体は、１又は２当量以上の薬剤にコンジュゲートされている。一部の実施形態において、抗体は、１当量の薬剤にコンジュゲートされている。一部の実施形態において、抗体は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０当量を超える薬剤にコンジュゲートされている。一部の実施形態において、抗体の混合物は、それぞれの抗体にコンジュゲートされている薬剤の平均数が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０当量を超える薬剤となるように、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０を超える。
一部の実施形態において、抗体にコンジュゲートすることができる薬剤の数をモジュレートすることができるように、抗体は、１つ又は２つ以上の部位特異的アミノ酸配列修飾を含む。
別の例示的な実施形態において、メラニン抗体は、抗炎症剤にコンジュゲートされている。
別の例示的な実施形態において、メラニン抗体は、検出可能な薬剤（標識）にコンジュゲートされている。一部の実施形態において、検出可能な薬剤は、診断剤である。一部の実施形態において、メラニン抗体は、検出可能な標識、スピン標識、比色標識、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、又は磁気標識にコンジュゲートされている。
一部の実施形態において、薬剤は、リンカーを介して、メラニン抗体にコンジュゲートされている。一部の実施形態において、薬剤は、切断可能なリンカーを介して、メラニン抗体にコンジュゲートされている。一部の実施形態において、薬剤は、切断不可能なリンカーを介して、メラニン抗体にコンジュゲートされている。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、固体表面、例えば、ビーズ、樹脂、又はマイクロプレートにコンジュゲート又は結合されている。
任意の哺乳動物種及び非哺乳動物種に由来するメラニンに特異的な抗体が、本明細書において提供される。一部の実施形態において、メラニン抗体は、ヒトメラニンに特異的である。一部の実施形態において、メラニン抗体は、他の種に由来するメラニンと交差反応する。
本明細書において提供される抗体は、特異性でメラニンに結合する。一部の実施形態において、これらの抗体は、特異性及び選択性でメラニンに結合する。
ある特定の実施形態において、本明細書において提供される抗体は、０．０００１ｎＭ〜１μＭの範囲の解離定数（Ｋｄ）を有する。例えば、抗体のＫｄは、約１μＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．０５ｎＭ、約０．０１ｎＭ、約０．００５ｎＭ、約０．００１ｎＭ、約０．０００５ｎＭ、又はさらには約０．０００１ｎＭであり得る。
メラニン抗体の産生
様々なイムノアッセイ形式を、メラニンと特異的に免疫反応する抗体を選択するために使用することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイを、メラニンに特異的なモノクローナル抗体を選択するために使用することができる（例えば、特異的な免疫反応性を判定するために使用することができるイムノアッセイ形式及び条件の説明については、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照されたい）。
様々なイムノアッセイ形式を、メラニンと特異的に免疫反応する抗体を選択するために使用することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイを、メラニンに特異的なモノクローナル抗体を選択するために使用することができる（例えば、特異的な免疫反応性を判定するために使用することができるイムノアッセイ形式及び条件の説明については、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New Yorkを参照されたい）。
本明細書において提供される抗体の産生は、当業者に公知の任意の方法によるものであり得る。例えば、一部の実施形態において、メラニン抗体は、所望される抗体の所望される軽鎖及び重鎖を発現するように操作された組換え細胞によって、産生される。一部の実施形態において、抗体は、ハイブリドーマによって産生される。
一部の実施形態において、免疫原性担体に連結されていてもよい、メラニン抗原を含む任意のペプチドが、標準的なプロトコールを使用して免疫付与に使用される。
生成された抗体の品質及び力価は、当業者に公知の技法を使用してアセスメントすることができる。
結合及び発現の目的で、シグナルペプチド配列を、目的の抗体成分とインフレームで発現させてもよい。表２は、例示的なシグナルペプチドをコードする例示的なアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を示す。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、細胞株による抗体の分泌を補助する。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、「ＶＫ−Ｉ領域ウォーカー」と表記される。一部の実施形態において、シグナルペプチドは、多数のヒトＩｇカッパ鎖において見出される天然のシグナルペプチドである。一部の実施形態において、抗体は、細胞系において合成され、シグナルペプチド配列、例えば、配列番号１６の配列を含む。本明細書において提供されるように、表１において提供されている例示的なメラニン抗体配列のうちのいずれか１つは、シグナルペプチド配列をさらに含み得る。したがって、一部の実施形態において、本発明の抗体配列は、Ｎ末端シグナルペプチド配列、例えば、配列番号１６のシグナルペプチド配列と組み合わせた、配列番号１〜７のうちのいずれか１つを含む。
本明細書に記載される発明的組成物はまた、抗体をコードする核酸、抗体をコードする核酸のうちのいずれかを含むベクター、及び任意のそのようなベクターを含む宿主細胞も含む。例示的なヌクレオチド配列は、表３Ａに提供されている。一部の実施形態において、抗体をコードする核酸は、シグナルペプチドヌクレオチド配列、例えば、配列番号１７の配列をさらに含む。表３Ｂは、例示的なメラニン抗体を発現するプラスミドのヌクレオチド配列を提供する。
一部の実施形態において、配列番号１８に記載されるヌクレオチド配列は、メラニン抗体の重鎖を産生するために利用される。
一部の実施形態において、配列番号１９に記載されるヌクレオチド配列は、メラニン抗体の軽鎖を産生するために利用される。
一部の実施形態において、配列番号２０に記載されるヌクレオチド配列は、ヒト化メラニン抗体の軽鎖を産生するために利用される。
一部の実施形態において、配列番号２１に記載されるヌクレオチド配列は、ヒト化メラニン抗体の軽鎖を産生するために利用される。
一部の実施形態において、配列番号２２に記載されるヌクレオチド配列は、ヒト化メラニン抗体の軽鎖を産生するために利用される。
一部の実施形態において、配列番号２３に記載されるヌクレオチド配列は、ヒト化メラニン抗体の重鎖を産生するために利用される。
一部の実施形態において、配列番号２４に記載されるヌクレオチド配列は、ヒト化メラニン抗体の重鎖を産生するために利用される。
一部の実施形態において、配列番号２５に記載されるプラスミドヌクレオチド配列は、ヒト化メラニン抗体の軽鎖を産生するために利用される。
一部の実施形態において、配列番号２６に記載されるプラスミドヌクレオチド配列は、ヒト化メラニン抗体の軽鎖を産生するために利用される。
一部の実施形態において、配列番号２７に記載されるプラスミドヌクレオチド配列は、ヒト化メラニン抗体の軽鎖を産生するために利用される。
一部の実施形態において、配列番号２８に記載されるプラスミドヌクレオチド配列は、ヒト化メラニン抗体の重鎖を産生するために利用される。
一部の実施形態において、配列番号２９に記載されるプラスミドヌクレオチド配列は、ヒト化メラニン抗体の重鎖を産生するために利用される。
治療的使用
メラノーマの処置のための治療的使用のためのメラニン抗体が、本明細書において提供される。
メラノーマの処置のための治療的使用のためのメラニン抗体が、本明細書において提供される。
メラノーマを処置する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の治療用メラニン抗体を投与するステップを含む方法もまた、本明細書において提供される。一部の実施形態において、メラノーマは、原発性メラノーマである。一部の実施形態において、メラノーマは、転移性メラノーマである。
本明細書において使用される場合、対象は、哺乳動物として分類される任意の動物を指し、これには、ヒト、飼育動物及び家畜、並びに動物園、競技用、又は愛玩用の動物、例えば、イヌ、ウマ、ウサギ、畜牛、ブタ、ハムスター、アレチネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコなどが含まれる。対象は、雄性であっても雌性であってもよい。
任意の特定の理論に束縛されるものではないが、メラノーマ腫瘍及び転移においては、細胞の代謝回転が急速であり、メラニンがメラニン抗体にアクセス可能である漏出メラノーマ細胞の増加が生じる。
本明細書において提供される治療用メラニン抗体のいずれかの投与は、他の公知の薬物／処置（例えば、小分子薬又は生物製剤）と組み合わせて投与してもよい。一部の実施形態において、メラニン抗体は、免疫チェックポイントインヒビターとともに投与してもよく、一部の実施形態において、免疫チェックポイントインヒビターは、抗体に基づく免疫チェックポイントインヒビターである。一部の実施形態において、メラニン抗体は、ＭＥＫインヒビターとともに投与してもよい。一部の実施形態において、メラニン抗体は、Ｂｒａｆインヒビターとともに投与してもよい。一部の実施形態において、メラニン抗体は、化学療法剤とともに投与してもよい。一部の実施形態において、メラニン抗体は、がん細胞シグナル伝達経路を標的とする生物製剤に基づく療法とともに投与してもよい。一部の実施形態において、メラニン抗体は、マイクロバイオームモジュレーション療法、代謝若しくは栄養療法とともに投与してもよい。投与は、逐次的であっても同時であってもよい。
一部の実施形態において、転移性メラノーマの処置のために、メラニン抗体は、免疫療法（例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤＬ−１インヒビターなど、免疫チェックポイントインヒビター）と組み合わせて投与してもよい。一部の実施形態において、メラニン抗体は、薬剤にコンジュゲートされている。一部の実施形態において、メラニン抗体は、放射性核種にコンジュゲートされている。
本明細書に記載される治療用メラニン抗体のインビボ投与は、静脈内、腫瘍内、頭蓋内、病巣内（例えば、病巣内注射、直接接触拡散）、体腔内（腹腔内、胸膜内、子宮内、直腸内）、腹腔内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、埋込みにより、吸入により、髄腔内、脳室内、又は鼻腔内で行われ得る。例示的な実施形態において、投与の経路は、静脈内注射によるものである。
治療有効量の治療用抗体が、投与されるであろう。治療用抗体の適切な投薬量は、メラノーマの重症度、対象の臨床状態、対象の臨床病歴及び処置に対する応答、並びに担当医師の判断に基づいて、決定され得る。
本明細書において提供されるメラニン抗体の投薬量は、投与の経路に応じて、対象の体重を基準として１日当たり約１ｎｇ／ｋｇ〜最大約１０００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上で変動し得る。数日間又はそれ以上にわたる反復投与については、メラノーマの重症度に応じて、処置は、所望される症状抑制が達成されるまで、継続され得る。投薬レジメンは、医師が達成しようとする薬物動態的減衰パターンに応じて、有用であり得る。例えば、個体への１週間に１回〜２１回の投薬が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態において、投薬頻度は、１日につき３回、１日につき２回、１日につき１回、１日おきに１回、１週間に１回、２週間ごとに１回、４週間ごとに１回、５週間ごとに１回、６週間ごとに１回、７週間ごとに１回、８週間ごとに１回、９週間ごとに１回、１０週間ごとに１回、又は１カ月に１回、２カ月ごとに１回、３カ月ごとに１回、又はそれ以上である。治療の進行を、従来的な技法及びアッセイによってモニタリングしてもよい。投薬レジメンは、使用される用量とは無関係に、経時的に変動し得る。
医薬組成物
本開示は、治療用メラニン抗体を含む組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、無菌である。医薬組成物は、一般に、有効量の治療用抗体を、薬学的に許容される賦形剤において含む。
本開示は、治療用メラニン抗体を含む組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、無菌である。医薬組成物は、一般に、有効量の治療用抗体を、薬学的に許容される賦形剤において含む。
診断的使用
本明細書において提供されるメラニン抗体は、診断及び画像化の目的で使用することができる。用途に応じて、メラニン抗体は、インビボ又はインビトロで検出及び定量化され得る。
本明細書において提供されるメラニン抗体は、診断及び画像化の目的で使用することができる。用途に応じて、メラニン抗体は、インビボ又はインビトロで検出及び定量化され得る。
メラニン抗体は、メラノーマ腫瘍細胞又は正常組織におけるメラニン蓄積を検出、局在化、又は定量化することのいずれかによって、診断目的で使用することができる。
本明細書において提供されるメラニン抗体は、様々なイムノアッセイにおける使用のために変更可能である。これらのイムノアッセイとしては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、フローサイトメトリー、放射免疫測定法、免疫蛍光アッセイ、分光光度法、放射線撮影法、電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、又は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において提供されるメラニン抗体は、例えば、分光光度法、光化学的、生物化学的、免疫化学的、蛍光的、電気的、光学的、又は化学的な方法によって検出可能な標識を含み得る。本発明における有用な標識としては、蛍光色素、放射標識、酵素、比色標識、アビジン、又はビオチンが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、メラニン抗体は、核医学装置（ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、又はシンチグラフィー）による画像化に有用である同位体で放射標識される。
診断用メラニン抗体は、原発性メラノーマの診断、転移のモニタリング、又は処置に対する応答の判定に、使用することができる。
キット及び製品
本出願は、例えば、治療的又は診断的のいずれかの使用のための、メラニン抗体を含むキットを提供する。一部の実施形態において、キットは、二次抗体、免疫組織化学的分析のための試薬、薬学的に許容される賦形剤、及び取扱いマニュアル、並びにこれらの任意の組合せから選択される構成要素をさらに含有する。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載される治療用組成物のうちのいずれか１つ又は２つ以上を、１つ又は２つ以上の薬学的に許容される賦形剤とともに含む。
本出願は、例えば、治療的又は診断的のいずれかの使用のための、メラニン抗体を含むキットを提供する。一部の実施形態において、キットは、二次抗体、免疫組織化学的分析のための試薬、薬学的に許容される賦形剤、及び取扱いマニュアル、並びにこれらの任意の組合せから選択される構成要素をさらに含有する。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載される治療用組成物のうちのいずれか１つ又は２つ以上を、１つ又は２つ以上の薬学的に許容される賦形剤とともに含む。
本出願は、本明細書に記載される治療用若しくは診断用組成物又はキットのうちのいずれか１つを含む製品も提供する。製品の例としては、バイアル（例えば、密封バイアル）が含まれる。
例示的な実施形態
本発明は、以下の例示的な列挙されている実施形態への参照により、定義され得る。
本発明は、以下の例示的な列挙されている実施形態への参照により、定義され得る。
実施形態１． メラニンに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、抗体が、キメラ抗体又はヒト化抗体である、上記モノクローナル抗体。
実施形態２． キメラ抗体である、実施形態１に記載の抗体。
実施形態３． マウス−ヒトキメラ抗体である、実施形態２に記載の抗体。
実施形態４． キメラ抗体が、マウス可変領域及びヒト定常領域を含む、実施形態３に記載の抗体。
実施形態５． メラニン抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の抗体。
実施形態６． メラニン抗体が、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の抗体。
実施形態７． メラニン抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の抗体。
実施形態８． ヒト化抗体である、実施形態１に記載の抗体。
実施形態９． マウスモノクローナル抗体の配列のヒト化形態である、実施形態８に記載の抗体。
実施形態１０． マウス８Ｃ３抗体のヒト化形態である、実施形態９に記載の抗体。
実施形態１１． メラニン抗体が、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、実施形態１、及び８〜１０のいずれか１つに記載の抗体。
実施形態１２． 配列番号５、配列番号６、又は配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１、及び８〜１０のいずれか１つに記載の抗体。
実施形態１３． 配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１１及び１２のいずれか１つに記載の抗体。
実施形態１４． 配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１１又は１２のいずれか１つに記載の抗体。
実施形態１５． 配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１１及び１２のいずれか１つに記載の抗体。
実施形態１６． 配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１１及び１２のいずれか１つに記載の抗体。
実施形態１７． 配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１１及び１２のいずれか１つに記載の抗体。
実施形態１８． 配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、実施形態１１及び１２のいずれか１つに記載の抗体。
実施形態１９． メラニン抗体の重鎖が、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０のＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の抗体。
実施形態２０． メラニン抗体の軽鎖が、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５のＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の抗体。
実施形態２１． メラニン抗体の重鎖が、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０のＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含み、メラニン抗体の軽鎖が、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５のＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の抗体。
実施形態２２． メラニン抗体の重鎖が、配列番号８、配列番号９、若しくは配列番号１０に由来するＣＤＲ配列を含み、及び／又は軽鎖が、配列番号３若しくは配列番号４に由来するＣＤＲ配列を含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の抗体。
実施形態２３． 抗原結合性フラグメントである、実施形態１、又は８〜１０に記載の抗体。
実施形態２４． 二重特異性抗体である、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の抗体。
実施形態２５． 二重特異性抗体が、メラニンを標的とする第１のアーム及び免疫チェックポイントインヒビターを含む抗原を標的とする第２のアームを含む、実施形態２４に記載の抗体。
実施形態２６． 免疫チェックポイントインヒビターが、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、又はＰＤ−Ｌ１である、実施形態２５に記載の抗体。
実施形態２７． 薬剤にコンジュゲートされている、実施形態１〜２６のいずれか１つに記載の抗体。
実施形態２８． 薬剤が、放射性核種である、実施形態２７に記載の抗体。
実施形態２９． 放射性核種が、２１３−Ｂｉである、実施形態２８に記載の抗体。
実施形態３０． 放射性核種が、１７７−Ｌｕである、実施形態２８に記載の抗体。
実施形態３１． 薬剤が、リンカーを介して抗体にコンジュゲートされている、実施形態２７〜３０のいずれか１つに記載の抗体。
実施形態３２． 実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の抗体と、薬理学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
実施形態３３． 対象においてメラノーマを処置するための方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の実施形態１〜３２のいずれか１つに記載の抗体若しくは組成物、又は代替的に述べると、メラノーマの処置における使用のための治療有効量の実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の抗体又は実施形態３２に記載の組成物を投与するステップを含む、上記方法。
実施形態３４． メラノーマが、転移性である、実施形態３３に記載の方法、又は実施形態３３に記載の使用のための抗体若しくは組成物。
実施形態３５． 投与が、メラノーマ細胞の細胞死を選択的に誘導する、実施形態３３に記載の方法、又は実施形態３３若しくは３４に記載の使用のための抗体若しくは組成物。
実施形態３６． 対象に、有効量の少なくとも１つの追加の薬剤を投与するステップを含む、実施形態３３、３４、若しくは３５のいずれか１つに記載の実施形態に記載の方法、又は実施形態３３〜３５のいずれか１つに記載の使用のための抗体若しくは組成物。
実施形態３７． 薬剤が、免疫チェックポイントインヒビターである、実施形態３６に記載の方法又は使用のための抗体若しくは組成物。
実施形態３８． 免疫チェックポイントインヒビターが、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、及びＰＤＬ−１から選択される、実施形態３７に記載の方法又は使用のための抗体若しくは組成物。
実施形態３９． 抗体又は組成物が、静脈内投与される、実施形態３３〜３８のいずれか１つに記載の方法又は使用のための抗体若しくは組成物。
実施形態４０． コンジュゲート抗体を作製する方法であって、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の抗体を薬剤にコンジュゲートするステップを含む、上記方法。
実施形態４１． 薬剤が、放射性核種である、実施形態４０に記載の方法。
実施形態４２． 放射性核種が、２１３−Ｂｉである、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４３． 放射性核種が、１７７−Ｌｕである、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４４． 実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
実施形態４５． 配列番号１７のヌクレオチド配列を含む、実施形態４４に記載のポリヌクレオチド。
実施形態４６． 配列番号１８のヌクレオチド配列を含む、実施形態４４に記載のポリヌクレオチド。
実施形態４７． 配列が、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている、実施形態４４〜４６に記載のポリヌクレオチド。
実施形態４８． 実施形態４４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
実施形態４９． 実施形態４８に記載のベクターを含む細胞株。
実施形態５０． 実施形態１〜３１に記載の抗体のうちのいずれか１つを発現するクローン細胞。
実施形態５１． 実施形態１〜３２に記載の抗体又は組成物のうちのいずれか１つを含むキット。
以下の実施例は、例示目的で含まれるものであり、本発明の範囲を制限するように意図されるものではない。
［実施例］
［実施例］
キメラ及びヒト化メラニン抗体の構築及びインビトロでの試験
マウス−ヒトキメラ抗体を、８Ｃ３マウスモノクローナルＩｇＧメラニン抗体から生成した（ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＸ３４６２６４、Uran ME, Nosanchuk JD, Restrepo A, Hamilton AJ, Gomez BL, Cano LE. Detection of antibodies against Paracoccidioides brasiliensis melanin in in vitro and in vivo studies during infection. Clin Vaccine Immunol. 2011 Oct;18(10):1680-8）。キメラ抗体は、ヒト定常領域及びマウス可変領域を有する。キメラ８Ｃ３抗体は、本明細書において、「８Ｃ３キメラ」又は「キメラ８Ｃ３」又は「キメラ８Ｃ３ ｈＩｇＧ１」と互換可能に称される。
マウス−ヒトキメラ抗体を、８Ｃ３マウスモノクローナルＩｇＧメラニン抗体から生成した（ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＫＸ３４６２６４、Uran ME, Nosanchuk JD, Restrepo A, Hamilton AJ, Gomez BL, Cano LE. Detection of antibodies against Paracoccidioides brasiliensis melanin in in vitro and in vivo studies during infection. Clin Vaccine Immunol. 2011 Oct;18(10):1680-8）。キメラ抗体は、ヒト定常領域及びマウス可変領域を有する。キメラ８Ｃ３抗体は、本明細書において、「８Ｃ３キメラ」又は「キメラ８Ｃ３」又は「キメラ８Ｃ３ ｈＩｇＧ１」と互換可能に称される。
８Ｃ３−ｈＩｇＧ１キメラ抗体の重鎖及び軽鎖をコードする２つの組換え発現ベクターを産生した（pAB11-8C3-hIgG1及びpAB2-8C3-hKappa、図４）。これらのベクターを、次いで、標準的な技法を使用して、哺乳動物宿主細胞にトランスフェクトした。
ヒト化８Ｃ３抗体の２つのガンマ重鎖及び３つのカッパ軽鎖をコードする組換え発現ベクターを産生した。（図４）。
抗体の重鎖及び軽鎖部分を発現させると、哺乳動物宿主細胞は、得られたタンパク質を宿主培地に分泌した。次いで、宿主細胞を標準的な技法を使用して培養した宿主細胞培地から、抗体を回収した。
ヒト化８Ｃ３重鎖及び軽鎖の集合物が、生成された。
キメラ及びヒト化抗体のインビトロでの活性を、ＥＬＩＳＡアッセイによってアセスメントした。セピアオフィシナリス由来のメラニン（Sigma社、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、Sigma社カタログ番号Ｍ２６４９−１００ＭＧ、ロット番号１０３Ｈ１０２３Ｖ、ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ）。８回の５倍連続希釈を、８０ｕｇ／ｍＬで開始して、それぞれの試験試料に行った。（１０ｕｇメラニン／ウェル）。単一のアッセイプレートを使用して、６つすべてのヒト化抗体、マウス８Ｃ３親抗体、キメラ８Ｃ３抗体、並びにマウス及びヒトＩｇＧ１陰性対照抗体を試験した。ビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ及びヤギ抗マウス−Ｆｃ抗体を、使用した。ストレプトアビジン−ＨＲＰを使用して、マウス及びヒト化ビオチン化抗体の両方を検出し、これも使用して、ビオチン化キメラ８Ｃ３も検出した。ビオチン化キメラ８Ｃ３のメラニンへの結合を検出するために、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Thermo Fisher Scientific社、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を、１ｍｇ／ｍＬから１：１０００で希釈した。ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ（ABCAM社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）又はビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（ABCAM社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を、１ｍｇ／ｍＬから１：１０００で希釈して、それぞれ、マウス対照又はヒト８Ｃ３及びヒト対照に結合させ、ストレプトアビジン−ＨＲＰを検出に使用した。ウェル内容物の光学密度（ＯＤ）を、４５０ｎｍの放出フィルターを使用して、蛍光プレートリーダーで読み取った。曲線当てはめプログラムを使用して、標準曲線を生成し、これから、試料及び対照の濃度を内挿した。
表４は、試験試料を示す。（ＨＥは、ヒト化抗体を指す）。
図１及び２は、別個の実験においてアッセイした、キメラ８Ｃ３抗体及びヒト化８Ｃ３抗体のメラニンへの結合の結果を示す。これらのアッセイにおいて、キメラ８Ｃ３は、ヒト化８Ｃバリアント（８Ｃ３ ＨＥ−１から８Ｃ３ ＨＥ−６まで）よりも強力な、セピアオフィシナリス由来のメラニンへの結合を実証する。
表５は、１０μｇ／ｍＬの抗体濃度での平均吸光値の結果を表形式で示す。これらの結果は、図１に示されるアッセイに対応している。
表６は、１６μｇ／ｍＬの抗体濃度での平均吸光値の結果を表形式で示す。これらの結果は、図２に示されるアッセイに対応している。
図２及び３は、キメラ８Ｃ３及び親マウス８Ｃ３抗体の、セピアオフィシナリスに由来するメラニンへの結合を実証する。図３は、マウス８Ｃ３よりも強力な、メラニンへの結合を示し、試験試料の平均吸光値は、表７に示される。
図３は、マウス８Ｃ３のメラニンへの用量依存性結合を示すグラフである。
図４は、キメラ及びヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の発現に使用されるプラスミドのスキーム図を提供する。
図５は、キメラ８Ｃ３重鎖のアミノ酸配列（８Ｃ３−ｈＩｇＧ１キメラ）及び予測される相補性決定領域（ＣＤＲ、太字で示されている）の、２つのヒト化８Ｃ３重鎖（ＶＨ３Ａ及びＶＨ３Ｂ）のものとのアライメントを示す。図６は、キメラ８Ｃ３軽鎖（８Ｃ３−ｈＫａｐｐａキメラ）のアミノ酸配列及び予測される相補性決定領域（ＣＤＲ、太字で示されている）の、３つのヒト化８Ｃ３軽鎖（ＶＫ１Ａ、ＶＫ１Ｂ、ＶＫ４）のものとのアライメントを示す。重鎖及び軽鎖のそれぞれのコンセンサス配列は、配列アライメントの下に列挙されている。
表８は、ＥｘＰａｓｙ ＰｒｏｔＰａｒａｍツールを使用して、ヒト化抗体の化学的及び物理的特性を提供する。
インビボでの試験：抗体の組織生体分布の判定
１１１インジウムでの放射標識のために、抗メラニン抗体（ヒト化８Ｃ３（ＨＥ−５、表６を参照されたい）、マウス８Ｃ３、及びキメラ８Ｃ３）及び対照ＩｇＧ１抗体を、まず、標準的な方法を使用して、二官能性キレート剤ＣＨＸＡ”｛Ｎ−［２−アミノ−３−（ｐ−イソチオシアナトフェニル）プロピル］−ｔｒａｎｓ−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’，Ｎ’’’’−五酢酸｝とコンジュゲートさせた。ＣＨＸＡ”リガンドは、抗体に対して２倍モル過剰で使用した。抗体を、次いで、標準的な方法に従って、１１１インジウムで放射標識した。１１１インジウムは、２μＣｉ／μｇの比放射能を有した。
１１１インジウムでの放射標識のために、抗メラニン抗体（ヒト化８Ｃ３（ＨＥ−５、表６を参照されたい）、マウス８Ｃ３、及びキメラ８Ｃ３）及び対照ＩｇＧ１抗体を、まず、標準的な方法を使用して、二官能性キレート剤ＣＨＸＡ”｛Ｎ−［２−アミノ−３−（ｐ−イソチオシアナトフェニル）プロピル］−ｔｒａｎｓ−シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’，Ｎ’’’’−五酢酸｝とコンジュゲートさせた。ＣＨＸＡ”リガンドは、抗体に対して２倍モル過剰で使用した。抗体を、次いで、標準的な方法に従って、１１１インジウムで放射標識した。１１１インジウムは、２μＣｉ／μｇの比放射能を有した。
１００万個のＢ１６−Ｆ１０マウスメラノーマ細胞を、標準的なプロトコールに従って、Ｍａｔｒｉｇｅｌを含有する組織培養培地中に懸濁した。細胞を、標準的な手順に従って、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に注射した。（注射後）４日目に、触知可能な腫瘍を観察した。
放射標識したヒト化８Ｃ３ ＨＥ−５抗体、マウス８Ｃ３抗体、及びキメラ８Ｃ３抗体の組織生体分布を、腫瘍細胞生着の８日後に、様々な器官において測定した。取込みは、標準的な手順に従って、組織１グラム当たりの注射用量（ＩＤ／ｇ、％）として計算した。放射標識した抗体の取込みは、前述の抗体の静脈内注射後、４時間後及び２４時間後の２つの異なる時点で、測定した。
腫瘍に結合した、放射標識したヒト化８Ｃ３ ＨＥ−５抗体、マウス８Ｃ３抗体、及びキメラ８Ｃ３抗体、並びに対照ヒトＩｇＧ１抗体の量を、標準的な方法に従って、腫瘍対血液比として計算した。それぞれの腫瘍保持マウスに、３０μＣｉの１１１インジウム−ｍＡｂを受容させ、注射後の循環（すなわち、腫瘍に結合していない）放射標識抗体の量を、４時間及び２４時間の２つの異なる時間間隔で、判定した。
図７は、任意のｍＡＢに基づく抗メラニン処置又は対照処置を受ける前のＢ１６−Ｆ１０メラノーマ腫瘍（黒い円で示されている）を保持する代表的なＣ５７ＢＬ／６マウスを示す。図８Ａ〜８Ｄは、抗体注射後の２つの異なる時点（４時間及び２４時間）での、様々な器官における放射標識したメラニン結合抗体の取込みを非特異的ヒトＩｇＧ抗体対照のものと比較した、生体分布実験の結果を示す。取込みは、組織１グラム当たりの注射用量（ＩＤ／ｇ、％）として計算した。キメラ８Ｃ３及びヒト化８Ｃ３抗メラニン抗体の腫瘍取込み（いずれも類似であった）と比較して、マウス８Ｃ３抗体の腫瘍取込みは、より高かった。メラニン含有器官（例えば、眼及び尾部）において、マウス、ヒト化、及びキメラ８Ｃ３メラニン抗体の取込みは、ヒトＩｇＧ抗体対照のものと類似であった。
図９は、腫瘍に結合している放射標識化メラニン結合抗体の量のプロキシ測定値を提供する、腫瘍対血液比の計算の結果を示す。４時間の時点では、マウス８Ｃ３抗体の腫瘍対血液比が、ヒト化８Ｃ３抗体及びキメラ８Ｃ３抗体のものよりも高かったが、２４時間の時点では、マウス８Ｃ３抗体、ヒト化８Ｃ３抗体、及びキメラ８Ｃ３抗体は、類似の腫瘍対血液比を示した。
後続のマウス及びヒト線量計算のためのヒト化８Ｃ３ ＨＥ−５の詳細な生体分布
すべての動物研究は、Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｂｏａｒｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎによって承認されていた。画像化研究のために、Charles River Laboratories社（ＵＳＡ）から入手した６週齢のＣ５７ＢＬ６雌性マウスに、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Corning社、ＵＳＡ）中の５×１０５個のＢ１６−Ｆ１０マウスメラノーマ細胞を、右側腹部へ皮下注射した。
すべての動物研究は、Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｂｏａｒｄ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎによって承認されていた。画像化研究のために、Charles River Laboratories社（ＵＳＡ）から入手した６週齢のＣ５７ＢＬ６雌性マウスに、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Corning社、ＵＳＡ）中の５×１０５個のＢ１６−Ｆ１０マウスメラノーマ細胞を、右側腹部へ皮下注射した。
ＢＣＡ ＣＨＸＡ”の８Ｃ３ ＨＥ−５へのコンジュゲーション。１０倍コンジュゲーション緩衝液（０．０５Ｍ炭酸塩／重炭酸塩、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．６〜８．７）５ｍＬを、０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．０（０．５ｍＬ）と合わせ、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブにおいて、脱イオン水で希釈して５０ｍＬにし、１倍緩衝液を得た。Amicon Ultra 0.5mL遠心分離フィルター（３０Ｋ ＭＷカットオフ、Fisher社）に、２ｍｇのヒト化８Ｃ３ ＨＥ−５（ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５）抗体を充填した。抗体は、冷却遠心分離装置において、４℃で、Amicon濃縮装置を使用して、６×１．５ｍＬの洗浄を行うことによって、上述のコンジュゲーション緩衝液に交換した。最終体積は、約２５０μＬとなり、２ｍｇの抗体を含有するはずである。緩衝液交換が完了に近づいたときに、ＣＨＸＡ”をコンジュゲーション緩衝液に溶解させることによって、２ｍｇ／ｍＬの濃度の二官能性ＣＨＸＡ”リガンドの溶液を調製した。抗体を、Amiconから回収し、コンジュゲーション緩衝液中の２ｍｇ／ｍＬ ＣＨＸＡ”溶液２３．６μＬを添加して、抗体に対して５倍モル過剰ＣＨＸＡ”を得た。反応混合物を、３７℃で１．５時間インキュベートした。反応混合物を、次いで、冷却遠心分離装置において、４℃で、Amicon濃縮装置で６×１．５ｍＬの洗浄により、０．１５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ＝６．５〜７．０中に精製する。試料を、４℃で保管する。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを行って、タンパク質の回収及び濃度を判定した。
１１１インジウム（１１１Ｉｎ）による抗体−ＣＨＸＡ”コンジュゲートの放射標識。１１１Ｉｎによる抗体−ＣＨＸＡ”コンジュゲートの放射標識を行って、およそ５μＣｉ／μｇの比放射能の抗体を達成した。６００μＣｉの１１１Ｉｎ塩化物を、１０μＬの０．１５Ｍ 酢酸アンモニウム緩衝液に添加し、０．１５Ｍ 酢酸アンモニウム緩衝液中のｈ８Ｃ３ ＨＥ−５−ＣＨＸＡ”コンジュゲートを１２０μｇ含有する微量遠心チューブに添加した。反応混合物を、３７℃で６０分間インキュベートし、次いで、反応を、３μＬの０．０５Ｍ ＥＤＴＡ溶液の添加によってクエンチした。放射標識の割合を、０．１５Ｍ 酢酸アンモニウム緩衝液を溶離液として使用して、ＳＧ−ｉＴＬＣによって測定した（上部は、未標識１１１Ｉｎを含有し、下部は、タンパク質がコンジュゲートした１１１Ｉｎを含有する）。ＳＧ−ｉＴＬＣを、Perkin Elmer社2470 Automatic Gamma Counterで読み取った。
生体分布。マウスにおける腫瘍が、およそ２００ｍｍ３に達した場合、マウスを、５匹の動物の群にランダム化し、５０μＣｉの１１１Ｉｎ−ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５を尾静脈から静脈内注射した。放射標識した抗体を注射した１時間後、２時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後の所定の時点において、マウスを、人の手により屠殺し、主要な器官、血液、及び腫瘍を摘出し、計量し、Perkin Elmer社2470 Automatic Gamma Counterでカウントした（図１０を参照されたい）。生体分布の結果を、提案されている治療用放射性核種２１３Ｂｉ及び１７７Ｌｕのマウス及びヒトの線量計算に使用した。
２１３Ｂｉ及び１７７Ｌｕで標識したｈ８Ｃ３ ＨＥ−５のヒト線量計算
このフォローアップ実施例は、マウスデータから仮説的に外挿した、ヒトにおけるＢｉ−２１３及びＬｕ−１７７の線量の結果を示す。以下に記載される方法は、マウスからヒトへ、放射線量の結果を外挿するための方法である。
このフォローアップ実施例は、マウスデータから仮説的に外挿した、ヒトにおけるＢｉ−２１３及びＬｕ−１７７の線量の結果を示す。以下に記載される方法は、マウスからヒトへ、放射線量の結果を外挿するための方法である。
方法
外挿は、マウスモデルから、ヒトモデルの滞留時間を再計算し、ＯＬＩＮＤＡ１．１など、ＭＩＲＤスキームを実装するソフトウェアを使用してヒト線量を計算することによって行った。この方法は、種間における体重の違いに基づく比率性を想定している（Kirschner AS, Ice RD, Beierwaltes WH, “Radiation-dosimetry of I-131-19-iodocholesterol: J Nucl Med. 16:248-249; 1975）。
外挿は、マウスモデルから、ヒトモデルの滞留時間を再計算し、ＯＬＩＮＤＡ１．１など、ＭＩＲＤスキームを実装するソフトウェアを使用してヒト線量を計算することによって行った。この方法は、種間における体重の違いに基づく比率性を想定している（Kirschner AS, Ice RD, Beierwaltes WH, “Radiation-dosimetry of I-131-19-iodocholesterol: J Nucl Med. 16:248-249; 1975）。
ＯＬＩＮＤＡバージョン１．１を使用して、器官又は組織のＢｉ−２１３吸収線量（absorbed dose）を計算し、Ｌｕ−１７７については上述の方法により得られた再計算したヒト滞留時間を使用した。分岐崩壊系列（branching decay chain）を有するビスマス−２１３については、Ｂｉ−２１３からの線量とともに、娘産物Ｐｏ−２１３（９７．９％）及びＴｌ−２０９（２．１％）からの寄与を、合計した。この計算において、投与したミリキュリー当たりのセンチグレイ（ｃＧｙ／ｍＣｉ）での正常な器官及び組織に対する吸収線量は、Ｂｉ−２１３及びＰｏ−２１３からのアルファ放出に関する線質係数（quality factor）又は生物学的効果比のいずれの乗数も含まない。
腫瘍は、ＯＬＩＮＤＡ１．１からの出力結果における標的器官ではないが、正常な器官及び組織と同じ方法を使用して別個に計算してもよい。投与した単位ｍＣｉ当たりのセンチグレイ当量の単位で腫瘍線量を計算するために、アルファ放出に帰属する吸収線量のすべてに、任意係数５を乗じた（例えば、Sgouros et al., 1999 [Reference: Sgouros G, Ballangrud AM, Jurcic JG, McDevitt MR, Humm JL, Erdi YE, Mehta BM, Finn RD, Larson SM, Scheinberg DA, “Pharmacokinetics and dosimetry of an alpha-particle emitter labeled antibody: 213Bi-HuM195 (anti-CD33) in patients with leukemia,” J Nucl Med. 40(11):1935-46; 1999]及びJurcic et al., 2002 [Reference: Jurcic JG, Larson SM, Sgouros G, McDevitt MR, Finn RD, Divgi CR, Ballangrud ÅM, Hamacher KA, Ma D, Humm JL, Brechbiel MW, Molinet R, and Scheinberg DA, “Targeted α-particle immunotherapy for myeloid leukemia,” Blood 100:1233-1239; 2002]を参照されたい）。アルファ粒子が欠如しているルテチウム−１７７からの腫瘍組織に対する吸収線量を計算するためには、そのような乗数は必要ない。Ｂｉ−２１３の腫瘍組織に対する吸収線量を従来的な単位で得るために、センチグレイ当量の線量を係数５で除して、ｃＧｙ／投与ｍＣｉを得て、ｃＧｙ／ｍＣｉ単位の吸収線量を得ることができる。
さらなる懸念は、ヒトの胃、小腸、及び大腸に対する線量に関する。ＭＩＲＤスキームにおいて、これらの器官線量は、体腔組織ではなく体腔内容物における放射能から得られた滞留時間（すなわち、時間積分放射能係数（time-integrated activity coefficient）値）のみを使用して計算される。マウスのデータは、胃及び小腸組織（一時的な内容物ではなく）における放射能を表していたため、胃、小腸、及び大腸は、「残余」組織の一部であったと想定された。残余には、具体的な線量の測定がなかった、マウスにおけるすべての組織が含まれる。例えば、マウス尾部における放射能は、ヒト線量を計算するために上述の方法によって適用される全身からの残余の一部と考えられる。眼もまた、Ｉｎ−１１１を用いたマウス研究において具体的に分析されていなかったＯＬＩＮＤＡ１．１出力に列挙されているその他の器官であるため、残余の一部である。
血液は、輸送コンパートメントであり、ＭＩＲＤスキームにおいて指定される器官でも組織でもないため、ＯＬＩＮＤＡ１．１において血液に対する具体的な線量は計算しない。血液に対する線量は、マウスにおいて直接的に計算してもよいが、その線量を、ＯＬＩＮＤＡ１．１においてヒトに外挿しない。
以下の結果（表９）において、Ｂｉ−２１３（及び娘）及びＬｕ−１７７からの線量寄与を、アルファ粒子、ベータ粒子、光子、及び合計について示す。すべての結果は、指数表記で有効数字３桁で示す。選択した擬人モデルは、成人のヒトであった。数値のカラムは、合計のカラムのものに相当する。
２１３Ｂｉ及び１７７Ｌｕで標識したｈ８Ｃ３ ＨＥ−５のマウス線量計算
Ｉｎ−１１１トレーサー生物動態データ（減衰補正）を使用して、マウスにおけるＢｉ−２１３及びＬｕ−１７７からの放射線量を、Ｉｎ−１１１の代わりにＢｉ−２１３又はＬｕ−１７７のいずれかを想定して計算した。Ｂｉ−２１３及びＬｕ−１７７について再計算した有効データをプロットし、プロットしたデータ点について最適適合数学関数を得、それぞれの源器官又は組織について最適適合関数を積分し、平衡線量定数及び比吸収割合を乗じた。
Ｉｎ−１１１トレーサー生物動態データ（減衰補正）を使用して、マウスにおけるＢｉ−２１３及びＬｕ−１７７からの放射線量を、Ｉｎ−１１１の代わりにＢｉ−２１３又はＬｕ−１７７のいずれかを想定して計算した。Ｂｉ−２１３及びＬｕ−１７７について再計算した有効データをプロットし、プロットしたデータ点について最適適合数学関数を得、それぞれの源器官又は組織について最適適合関数を積分し、平衡線量定数及び比吸収割合を乗じた。
マウスのデータを、逆減衰補正して（組織１グラム当たりのパーセント投与放射能）、Ｂｉ−２１３（半減期は、４５．６分である）及びＬｕ−１７７（半減期は、１６０時間である）について、有効データ（実際のカウントに関する）を得た。それぞれの器官又は組織について、有効データ点を、サンプリング時間に対してプロットし、線形最小二乗回帰分析を行って、データに対する最適適合単一（又は二重）指数関数を、最適適合等式パラメーターで得た。
次に、Ｂｉ−２１３及びＬｕ−１７７の両方の場合について、指数関数を積分して、無限大（完全減衰）まで積分した、時間−放射能関数下面積によって表される、投与したマイクロキュリー当たりのマイクロキュリー−時間の概算値を得た。Ｂｉ−２１３吸収割合は、マウスの器官及び組織において、すべての放出について１．０であったと想定した。Ｌｕ−１７７放出のモデル値を、Miller et al.（Miller WH, Hartmann-Siantar C, Fisher DR, Descalle M-A, Daly T, Lehmann J, Lewis MR, Hoffman T, Smith J, Situ PD, and Volkert WA, “Evaluation of Beta Absorbed Fractions in a Mouse Model for 90Y, 188Re, 166Ho, 149Pm, 64Cu, and 177Lu Radionuclides.” Cancer Biother. & Radiopharm. 20(4):436-449; 2005）によって以前に開発されたマウスモデルを使用して、測定した器官又は組織から放出されたエネルギーが同じ器官又は組織において蓄積される割合について、計算した。
Ｂｉ−２１３及びＬｕ−１７７の平衡線量定数は、Eckerman KF and Endo A, MIRD Radionuclide Data and Decay Schemes, 2nd ed., Reston, Virginia: Society of Nuclear Medicine; 2008から得た。Ｂｉ−２１３については、平衡線量定数は、１９．４４ｇ ｃＧｙ ｕＣｉ−１ ｈｒ−１であり、Ｌｕ−１７７については、平衡線量定数は、０．３１５ｇ ｃＧｙ ｕＣｉ−１ ｈｒ−１である。平衡線量定数、放出されたベータエネルギーの吸収割合、及びすべての公知であるか又は計算された完全減衰による器官又は組織に滞留する積算放射能を用いて、投与したＢｉ−２１３及びＬｕ−１７７のマイクロキュリー当たりのｃＧｙ（センチグレイ）（ｃＧｙ／ｕＣｉ）での吸収線量を、次いで、計算して、以下の結果を得た（平均線量及び相関係数）：
マウス器官の結果を、表１０に示す。
マウス器官の結果を、表１０に示す。
ピアソンの積率相関係数（ｒ）は、２つの変数の共分散を標準偏差の積で除したものとして定義される、２つの変数間の線形関係の強度及び方向性の尺度であり、データと、器官又は組織において生じた放射性遷移の数を判定するために曲線下面積を積分（無限大まで積分）するために使用された数学関数との間の相関を示す。Ｂｉ−２１３のｒ値は、その非常に短い半減期に起因して高く、これにより、曲線適合の３つの時点が得られた。
２１３Ｂｉ標識ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５抗体と１７７Ｌｕ標識ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５抗体との対比によるＢ１６−Ｆ１０メラノーマ腫瘍の治療の比較
２１３Ｂｉ／２２５Ａｃジェネレーターを、Oak Ridge National Laboratory社（ＴＮ、ＵＳＡ）から購入し、１７７Ｌｕ塩化物については、Radiomedix社（ＴＸ、ＵＳＡ）から購入した。ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５抗体を、詳細な生体分布に記載されるように、ＣＨＸＡ”二官能性リガンドにコンジュゲートさせた。抗体を、放射標識する直前に２１３Ｂｉヨウ化物の形態で２１３Ｂｉ／２２５Ａｃジェネレーターから溶出した２１３Ｂｉ、又は１７７Ｌｕで、放射標識した。２１３Ｂｉ又はＬｕによる抗体−ＣＨＸＡ”コンジュゲートの放射標識を行って、およそ５μＣｉ／μｇの比放射能の抗体を達成した。「高」（４００μＣｉ）線量の２１３Ｂｉ標識抗体又は１７７Ｌｕ標識抗体を調製するために、０．１５Ｍ 酢酸アンモニウム緩衝液中の４００μＣｉの放射性核種溶液を、８０μｇの抗体−ＣＨＸＡ”コンジュゲートに添加し、「低」（２００μＣｉ）の線量の２１３Ｂｉ標識抗体又は１７７Ｌｕ標識抗体を調製するために、０．１５Ｍ 酢酸アンモニウム緩衝液中の２００μＣｉの放射性核種溶液を、４０μｇの抗体−ＣＨＸＡ”コンジュゲートに添加した。２１３Ｂｉでの標識については、反応混合物を、３７℃で５分間インキュベートし、１７７Ｌｕでの標識については、６０分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、３μＬの０．０５Ｍ ＥＤＴＡ溶液の添加によって、反応をクエンチした。放射標識の割合を、０．１５Ｍ 酢酸アンモニウム緩衝液を溶離液として使用して、ＳＧ−ｉＴＬＣによって測定した（上部は、遊離放射性核種を含有し、下部は、放射標識された抗体を含有する）。ＳＧ−ｉＴＬＣを、Perkin Elmer社2470 Automatic Gamma Counterで読み取った。
２１３Ｂｉ／２２５Ａｃジェネレーターを、Oak Ridge National Laboratory社（ＴＮ、ＵＳＡ）から購入し、１７７Ｌｕ塩化物については、Radiomedix社（ＴＸ、ＵＳＡ）から購入した。ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５抗体を、詳細な生体分布に記載されるように、ＣＨＸＡ”二官能性リガンドにコンジュゲートさせた。抗体を、放射標識する直前に２１３Ｂｉヨウ化物の形態で２１３Ｂｉ／２２５Ａｃジェネレーターから溶出した２１３Ｂｉ、又は１７７Ｌｕで、放射標識した。２１３Ｂｉ又はＬｕによる抗体−ＣＨＸＡ”コンジュゲートの放射標識を行って、およそ５μＣｉ／μｇの比放射能の抗体を達成した。「高」（４００μＣｉ）線量の２１３Ｂｉ標識抗体又は１７７Ｌｕ標識抗体を調製するために、０．１５Ｍ 酢酸アンモニウム緩衝液中の４００μＣｉの放射性核種溶液を、８０μｇの抗体−ＣＨＸＡ”コンジュゲートに添加し、「低」（２００μＣｉ）の線量の２１３Ｂｉ標識抗体又は１７７Ｌｕ標識抗体を調製するために、０．１５Ｍ 酢酸アンモニウム緩衝液中の２００μＣｉの放射性核種溶液を、４０μｇの抗体−ＣＨＸＡ”コンジュゲートに添加した。２１３Ｂｉでの標識については、反応混合物を、３７℃で５分間インキュベートし、１７７Ｌｕでの標識については、６０分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、３μＬの０．０５Ｍ ＥＤＴＡ溶液の添加によって、反応をクエンチした。放射標識の割合を、０．１５Ｍ 酢酸アンモニウム緩衝液を溶離液として使用して、ＳＧ−ｉＴＬＣによって測定した（上部は、遊離放射性核種を含有し、下部は、放射標識された抗体を含有する）。ＳＧ−ｉＴＬＣを、Perkin Elmer社2470 Automatic Gamma Counterで読み取った。
雌性Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、５×１０５個のＢ１６−１０メラノーマ細胞を、実施例３に記載されるように、右側腹部に注射した。マウスは、腫瘍がおよそ５０ｍｍ３に達したときに、治療に使用した。マウスを、５匹の動物の群にランダム化し、高線量の２１３Ｂｉ−ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５、若しくは低線量の２１３−ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５、又は高線量の１７７Ｌｕ−ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５、若しくは低線量の１７７Ｌｕ−ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５、又は８０μｇの未標識（「コールド」）ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５のいずれかで処置したか、又は未処置のままにした。腫瘍を、３日ごとに電子ノギスで測定して、２１日間、腫瘍体積を計算した（図１１Ａ及び１１Ｂ）。マウスの体重を、３日ごとに軽量した（図１４Ａ及び１４Ｂ）。血液を、１週間ごとに、白血球（１２Ａ及び１３Ａ）、赤血球（図１２Ｂ及び１３Ｂ）、及び血小板カウント（図１２Ｃ及び１３Ｃ）について分析した。実験の完了時に、マウスを屠殺し、血液を、ＡＬＴ（図１５Ａ）、ＡＳＴ（図１５Ｂ）、尿素（図１５Ｃ）、及びクレアチニン（図１５Ｄ）について分析した。
Ｂ１６−Ｆ１０メラノーマの放射線免疫療法における２１３Ｂｉ標識及び１７７Ｌｕ標識したｈ８Ｃ３ ＨＥ−５抗体の有効性を、比較した。実験の結果は、持続時間が短い（４６分間の物理的半減期）アルファ放出体２１３Ｂｉが、持続時間が長い（６．７日間の物理的半減期）ベータ放出体１７７Ｌｕよりも、メラノーマ細胞を死滅させるのにより有効であったことを示した。いずれの理論にも束縛されるものではないが、ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５によってメラノーマ腫瘍に送達された２１３Ｂｉの優れた効率性は、２１３Ｂｉ減衰の高速な線量率とＢ１６−Ｆ１０細胞の攻撃的な増殖（倍増時間７時間）との間のより良好な適合によって説明され得、一方、減衰が遅い１７７Ｌｕは、その放射線量を送達するのにより長い時間が必要であり、この細胞増殖に適合できない。２１３Ｂｉによって放出されるアルファ粒子の生物学的有効性比（ＲＢＥ）は、ベータ粒子のものよりも数倍高く、したがって、より効率的な腫瘍制御をもたらす。
２１３Ｂｉ−ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５を用いた分割療法
比較処置と同じマウスメラノーマモデルを使用した。ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５抗体を、比較処置におけるように、２１３Ｂｉで放射標識した。腫瘍保持マウスを、８匹の群にランダム化し、０日目に、単回投与の４００μＣｉの２１３−ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５、又は０日目及び３日目に、４００μＣｉの２１３−ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５、又は０日目、３日目、及び７日目に、４００μＣｉの２１３−ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５のいずれかで処置した。１６日目に、単回投与群におけるマウスを、別の４００μＣｉの２１３−ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５投与で処置した。腫瘍体積における変化を、図１６Ａ、１６Ｂ、及び１６Ｃに示す。マウス体重における変化を、図１７に示す。白血球、赤血球、及び血小板の血球数の比較を、それぞれ、図１８Ａ、１８Ｂ、及び１８Ｃに示す。腎臓及び肝臓に対する全身毒性を、図１９に示す。
比較処置と同じマウスメラノーマモデルを使用した。ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５抗体を、比較処置におけるように、２１３Ｂｉで放射標識した。腫瘍保持マウスを、８匹の群にランダム化し、０日目に、単回投与の４００μＣｉの２１３−ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５、又は０日目及び３日目に、４００μＣｉの２１３−ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５、又は０日目、３日目、及び７日目に、４００μＣｉの２１３−ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５のいずれかで処置した。１６日目に、単回投与群におけるマウスを、別の４００μＣｉの２１３−ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５投与で処置した。腫瘍体積における変化を、図１６Ａ、１６Ｂ、及び１６Ｃに示す。マウス体重における変化を、図１７に示す。白血球、赤血球、及び血小板の血球数の比較を、それぞれ、図１８Ａ、１８Ｂ、及び１８Ｃに示す。腎臓及び肝臓に対する全身毒性を、図１９に示す。
１１１Ｉｎ−ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５を用いたＢ１６−Ｆ１０メラノーマ腫瘍保持マウスのｍｉｃｒｏＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像化
マウスモデル及びｈ８Ｃ３ ＨＥ−５抗体の１１１Ｉｎでの放射標識を、記載されるように行った。ｍｉｃｒｏＳＰＥＣＴ／ＣＴ（マイクロ単一光子放射型コンピュータ断層撮影法／コンピュータ断層撮影法）画像を、MILabs VECTor4 （Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）microSPECT/CTスキャナで収集し、包括的画像分析ソフトウェアパッケージＰＭＯＤ（バージョン３．９、PMOD Technologies, Inc社、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して処理した。ＣＨＸＡ”にコンジュゲートしたｈ８Ｃ３ ＨＥ−５で５：１ｍＣｉ／ｍｇの比放射能の２００μＣｉの１１１Ｉｎを使用して、画像化研究を行った。２匹の腫瘍保持マウスに、尾静脈から静脈内注射を行い、注射の１時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、及び２１６時間後に、伏臥位置で画像化した（図２０）。らせん状の軌道を使用して、２０〜３５０ｋｅＶの範囲についてExtra Ultra High Sensitivity Mouse(XUHS-M)コリメーターを使用し、ＳＰＥＣＴデータを２０分間収集した。すべてのＳＰＥＣＴ画像は、ＭＩＬａｂｓ再構築ソフトウェアを用いて０．４ｍｍのボクセルグリッドにおいて２４５ｋｅＶ及び１７１ｋｅＶの両方の１１１Ｉｎガンマ放出を使用して、再構築した。
マウスモデル及びｈ８Ｃ３ ＨＥ−５抗体の１１１Ｉｎでの放射標識を、記載されるように行った。ｍｉｃｒｏＳＰＥＣＴ／ＣＴ（マイクロ単一光子放射型コンピュータ断層撮影法／コンピュータ断層撮影法）画像を、MILabs VECTor4 （Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）microSPECT/CTスキャナで収集し、包括的画像分析ソフトウェアパッケージＰＭＯＤ（バージョン３．９、PMOD Technologies, Inc社、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して処理した。ＣＨＸＡ”にコンジュゲートしたｈ８Ｃ３ ＨＥ−５で５：１ｍＣｉ／ｍｇの比放射能の２００μＣｉの１１１Ｉｎを使用して、画像化研究を行った。２匹の腫瘍保持マウスに、尾静脈から静脈内注射を行い、注射の１時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、及び２１６時間後に、伏臥位置で画像化した（図２０）。らせん状の軌道を使用して、２０〜３５０ｋｅＶの範囲についてExtra Ultra High Sensitivity Mouse(XUHS-M)コリメーターを使用し、ＳＰＥＣＴデータを２０分間収集した。すべてのＳＰＥＣＴ画像は、ＭＩＬａｂｓ再構築ソフトウェアを用いて０．４ｍｍのボクセルグリッドにおいて２４５ｋｅＶ及び１７１ｋｅＶの両方の１１１Ｉｎガンマ放出を使用して、再構築した。
８Ｃ３ ＨＥ−５抗体を発現する組換え細胞株の生成
ＣＨＯ ＤＧ４４宿主細胞に、ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５抗体をコードするベクターをトランスフェクトした。トランスフェクタントを選択し、限界希釈によって１回のサブクローニングに供した。３つのサブクローンを、研究用細胞バンク（「ＲＣＢ（Research Cell Bank）」）の生成に選択し、次の通りに表記した：サブクローン−２−３Ｈ２、サブクローン−２−２０Ｃ３、及びサブクローン−２−３Ｈ１１。
ＣＨＯ ＤＧ４４宿主細胞に、ｈ８Ｃ３ ＨＥ−５抗体をコードするベクターをトランスフェクトした。トランスフェクタントを選択し、限界希釈によって１回のサブクローニングに供した。３つのサブクローンを、研究用細胞バンク（「ＲＣＢ（Research Cell Bank）」）の生成に選択し、次の通りに表記した：サブクローン−２−３Ｈ２、サブクローン−２−２０Ｃ３、及びサブクローン−２−３Ｈ１１。
トランスフェクション並びにバルクプール及びミニプールの生成
ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ ＤＧ４４のトランスフェクション
本明細書に記載される組換え細胞株の宿主として使用するジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ ＤＧ４４細胞株は、Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのLarry Chasin博士によって開発された、ヒポキサンチン及びチミジン（ＨＴ）の栄養要求体である。ＤＨＦＲ−ＣＨＯ株は、ＣＨＯ Ｋ１細胞株ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１のＥＭＳ及びγ−照射に誘導される変異により導出された。ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１細胞株は、１９５８年にTed Puck博士によって、チャイニーズハムスター卵巣組織から樹立された細胞株のプロリン栄養要求体である。Chasin博士は、２回のγ−照射を使用して、ＤＨＦＲ遺伝子の両方のアレルが完全に欠損した細胞株を産生した。
ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ ＤＧ４４のトランスフェクション
本明細書に記載される組換え細胞株の宿主として使用するジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ ＤＧ４４細胞株は、Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのLarry Chasin博士によって開発された、ヒポキサンチン及びチミジン（ＨＴ）の栄養要求体である。ＤＨＦＲ−ＣＨＯ株は、ＣＨＯ Ｋ１細胞株ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１のＥＭＳ及びγ−照射に誘導される変異により導出された。ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１細胞株は、１９５８年にTed Puck博士によって、チャイニーズハムスター卵巣組織から樹立された細胞株のプロリン栄養要求体である。Chasin博士は、２回のγ−照射を使用して、ＤＨＦＲ遺伝子の両方のアレルが完全に欠損した細胞株を産生した。
ＤＨＦＲ−細胞株ＤＵＸＢ１１及びＤＧ４４は、１９８１年から、組換えタンパク質の産生に使用されている。より最近では、ＤＧ４４細胞株は、化学的に規定された無血清培地において懸濁細胞株として増殖するように適合されている。Aragen社は、２００８年に、Invitrogen社から凍結培養物として懸濁液適合ＤＧ４４細胞を得た（Gibco-Invitrogen社、カタログ１２６０９−０１２、ロット番号２８８８８５）。細胞を、化学的に規定された培地であるＣＨＯ ＤＧ４４培地（Invitrogen社）において増やし、その培地と７．５％細胞培養グレードのＤＭＳＯ（Sigma社）との混合物中で凍結させた。細胞を、抗生物質不含培地において３回継代させ、ＮＡＭＳＡによって、静細菌性／静真菌性及び滅菌性に関して、ＩＭＰＡＣＴ VII ＰＣＲプロファイルについてはResearch Animal Diagnostic Laboratory (RADIL)によって、及びマイコプラズマについてはBionique Testing Laboratories, Inc.社によって試験した。細胞は、指定された試験要件を満たした。
抗体の重鎖及び軽鎖を（それぞれ）コードするプラスミドpAB2-8C3-HE-LRLC (VK1) (625.82.2 [PvuI])及びpAB11-8C3-HE-LRMRHC (VH3) (625.85.5 [PvuI])は、本明細書に記載されている。プラスミドはまた、それぞれ、ＤＨＦＲ及びネオマイシン選択可能マーカーもコードする。プラスミドは、制限酵素PvuIによる終夜の消化、続いて、フェノール−クロロホルム及びエタノール沈降によって、線形化させた。プラスミドＤＮＡを、０．１倍ＴＥ緩衝液に再懸濁させ、濃度を、２６０ｎｍで測定した。ＤＮＡを、滅菌０．１倍ＴＥ緩衝液の添加によって、１μｇ／μＬに調節した。
１／１ベクター比を使用した９セットのＮｅｏｎエレクトロポレーションを、ＤＧ４４宿主細胞において行った。それぞれのトランスフェクションについて、総量１０μｇのＤＮＡを、４．０×１０６個の細胞／ｍＬの濃度で再懸濁緩衝液Ｒ中に懸濁したＣＨＯ ＤＧ４４細胞１００μＬに添加した。ＤＮＡ／細胞混合物を、Ｎｅｏｎチップ１００に取り、Invitrogen製のNeonエレクトロポレーションデバイスを使用して、１７００Ｖ×２０ｍｓ×１パルスのプログラムで、エレクトロポレーションした。これらの９つのトランスフェクションと並行して、１セットのトランスフェクションを、ＧＦＰ配列を有するＡｒａｇｅｎ ＡＢ２ベクターを使用して行った。エレクトロポレーションの直後に、トランスフェクトした細胞を、６ウェルプレートにおいて、８ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘを補充したＣＤ−ＤＧ４４培地２ｍＬ中に希釈し、静的条件下において、３７℃及び５％ ＣＯ２で培養した。トランスフェクションの７２時間後に、トランスフェクション効率を、ＧＦＰをトランスフェクトした細胞のＦＡＣＳ分析によって測定した。トランスフェクションの７２時間後では、ＧＦＰを保持するＤＮＡをトランスフェクトした細胞の４６パーセントが、ＦＡＣＳ分析によりＧＦＰについて陽性であり、これは、そのステージで予測される平均的な一過的トランスフェクション効率に相当していた。
エレクトロポレーションの３日後に、それぞれのトランスフェクションについて、９つのウェルから得た細胞をプールし、ＣＤ−ＯｐｔｉＣＨＯ（ＨＴ欠損）＋８ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ中に、培地交換した。次に、このプールを使用して、２種類の安定な選択したプール（バルクプール及びミニプール）を生成した。
バルクプールの生成
バルクプールは、比較的短期間（約３〜４週間）以内にＣＨＯ由来の材料を得る手段として生成した。１つのバルクプールを、静置フラスコにおいて、Ｇ４１８の漸増（０．２５ｍｇ／ｍＬから最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）及びＨＴ欠損培地での栄養要求性ＤＨＦＲ選択により生成した。バルクプールを、細胞生存率が約９０％に回復した後、振盪フラスコに適合させた。
バルクプールは、比較的短期間（約３〜４週間）以内にＣＨＯ由来の材料を得る手段として生成した。１つのバルクプールを、静置フラスコにおいて、Ｇ４１８の漸増（０．２５ｍｇ／ｍＬから最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）及びＨＴ欠損培地での栄養要求性ＤＨＦＲ選択により生成した。バルクプールを、細胞生存率が約９０％に回復した後、振盪フラスコに適合させた。
さらに、プールの性能を、１２５ｍＬの振盪フラスコに、８ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘを補充したＣＤ−ＯｐｔｉＣＨＯ培地５０ｍＬ中５×１０５個の細胞／ｍＬで播種することによって、振盪フラスコにおいてアセスメントした。振盪フラスコを、１２５ｒｐｍに設定した２５ｍｍのオービタルスローを備えるシェーカープラットフォームにおいて、３７℃及び５％ ＣＯ２で培養した。培養物に、３日目、６日目、及び８日目に、Hyclone社製の５％（初期培養体積）Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ａを、１０ｍｇ／Ｌ Invitrogen社組換えヒトインスリン、及び０．５％ Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ｂ（初期培養体積）とともに入れた。細胞数をカウントし（図２１）、条件培地を、３日目、６日目、８日目、及び９日目以降は毎日、採取した。培養物を、１１日目に、２５００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって、約８０％の生存率で採取した。条件培地におけるタンパク質濃度は、精製したＩｇＧ１抗体を標準物として使用して、プロテインＡセンサーを用いてForteBio Octet Redによって測定した。このプールから得られた発現レベルを、図２２に示す。
最後に、条件培地中の８Ｃ３ ＨＥ−５抗体を、プロテインＡドリップカラムで精製し、精製画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
ミニプールの生成
トランスフェクションの３日後に、トランスフェクトしたプールを、２００μｌの培地において、８ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘを補充したＣＤ−ＯｐｔｉＣＨＯ培地で栄養要求性ＤＨＦＲ選択下において、１ウェル当たり１，０００個の細胞でミニプールに播種することによって（１８×９６ウェルプレート）、ミニプールを生成し、プレートを、３７℃及び５％ ＣＯ２で培養した。播種の３日後に開始し、ミニプールを、４週間の期間にわたる培地交換による、Ｇ４１８濃度（０．２５ｍｇ／ｍＬから最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）及びメトトレキサート（ＭＴＸ）（１００ｎＭから２００ｎＭから最終濃度４００ｎＭ）の漸増に供した。細胞のコンフルエンスを、この期間中、顕微鏡によってモニタリングし、より高度な選択を、細胞増殖（すなわち、細胞コンフルエンスの増加）の際に適用した。約５週間後に、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ及びヤギ抗ヒトカッパ鎖−ＨＲＰを、それぞれ、コーティング抗体及び検出抗体として使用して、プレートをＥＬＩＳＡによってアッセイした（図２３）。
トランスフェクションの３日後に、トランスフェクトしたプールを、２００μｌの培地において、８ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘを補充したＣＤ−ＯｐｔｉＣＨＯ培地で栄養要求性ＤＨＦＲ選択下において、１ウェル当たり１，０００個の細胞でミニプールに播種することによって（１８×９６ウェルプレート）、ミニプールを生成し、プレートを、３７℃及び５％ ＣＯ２で培養した。播種の３日後に開始し、ミニプールを、４週間の期間にわたる培地交換による、Ｇ４１８濃度（０．２５ｍｇ／ｍＬから最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）及びメトトレキサート（ＭＴＸ）（１００ｎＭから２００ｎＭから最終濃度４００ｎＭ）の漸増に供した。細胞のコンフルエンスを、この期間中、顕微鏡によってモニタリングし、より高度な選択を、細胞増殖（すなわち、細胞コンフルエンスの増加）の際に適用した。約５週間後に、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ及びヤギ抗ヒトカッパ鎖−ＨＲＰを、それぞれ、コーティング抗体及び検出抗体として使用して、プレートをＥＬＩＳＡによってアッセイした（図２３）。
９６ウェルプレートのスクリーニングから得られた上位１２０個の発現体ミニプールを、２４ウェルプレートへと増やし、２４ウェルプレートにおいて発現について再スクリーニングした。細胞を、新しい２４ウェルプレートにおいて、８ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘを補充したＣＤ−ＯｐｔｉＣＨＯ中の新しい培地に、およそ２０％のコンフルエンスで播種した。条件培地を、７日目及び１１日目に採取した。条件培地におけるタンパク質濃度は、バルクプールから精製した８Ｃ３ ＨＥ−５抗体を標準物として使用して、プロテインＡセンサーを用いてForteBio Octet Redによって測定した（図２４）。
スクリーニングした後に、最上位の２４ウェルプレートの発現体ミニプールを、３つのスーパープールにおいてプールした。３つのスーパープールに選択したミニプールの一覧を、図２５に示す。スーパープール１は、１０６〜１２９μｇ／ｍＬの範囲の力価を有する上位３つの発現体ミニプールから構成され、スーパープール２は、６０〜７５μｇ／ｍＬの範囲の力価を有する５つのミニプールから構成され、スーパープール３は、４０〜５８μｇ／ｍＬの範囲の力価を有する７つのミニプールから構成されていた。
スーパープールを、８ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ、０．５ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８、及び４００ｎＭ ＭＴＸを補充したＣＤ−ＯｐｔｉＣＨＯ培地において、生存率が８５％に達するまで、およそ２週間継代させた。その時点で、スーパープールを、凍結保存し、限界希釈により処理し、発現について流加培養（fed batch）振盪フラスコにおいて評価した。
スーパープールの振盪フラスコ評価。
スーパープールを、流加培養振盪フラスコにおいて評価した。細胞を、２５０ｍｌの振盪フラスコにおいて、８ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充したＣＤ−ＯｐｔｉＣＨＯ培地５０ｍＬ中に、５×１０５個の細胞／ｍＬで播種した。振盪フラスコを、１２５ｒｐｍで回転する２５ｍｍのオービタルスローを備えるシェーカープラットフォームにおいて、３７℃及び５％ ＣＯ２で培養した。培養物に、３日目、６日目、８日目、及び１０日目の日ごとに、１０ｍｇ／Ｌ Invitrogen社組換えヒトインスリン及び０．５％ Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ｂを補充した５％ Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ａを供給した。グルコース及びＬ−グルタミンについて、モニタリング及び調節するために、ＮＯＶＡ読み取りを、３日目、６日目、８日目に、及び採取まで必要に応じて行った。細胞カウント、及び培養物の試料を、３日目、６日目、８日目、１０日目に、及びそれ以降は採取まで毎日、取得した。培養物を、８０％未満の生存率で採取した。増殖曲線及び生存率を、図２６及び２７に示す。スーパープール１は、スーパープール２及び３に由来する細胞よりも、振盪フラスコでの懸濁増殖への適合が遅く、結果として、２回の流加培養評価を、スーパープール１に行った。発現プロファイルを、以下の図２８に示す。もっとも高い発現である７９２．３ｍｇ／Ｌは、スーパープール１の反復で得られ、スーパープール２は、４６２ｍｇ／Ｌを有した。
スーパープールを、流加培養振盪フラスコにおいて評価した。細胞を、２５０ｍｌの振盪フラスコにおいて、８ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充したＣＤ−ＯｐｔｉＣＨＯ培地５０ｍＬ中に、５×１０５個の細胞／ｍＬで播種した。振盪フラスコを、１２５ｒｐｍで回転する２５ｍｍのオービタルスローを備えるシェーカープラットフォームにおいて、３７℃及び５％ ＣＯ２で培養した。培養物に、３日目、６日目、８日目、及び１０日目の日ごとに、１０ｍｇ／Ｌ Invitrogen社組換えヒトインスリン及び０．５％ Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ｂを補充した５％ Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ａを供給した。グルコース及びＬ−グルタミンについて、モニタリング及び調節するために、ＮＯＶＡ読み取りを、３日目、６日目、８日目に、及び採取まで必要に応じて行った。細胞カウント、及び培養物の試料を、３日目、６日目、８日目、１０日目に、及びそれ以降は採取まで毎日、取得した。培養物を、８０％未満の生存率で採取した。増殖曲線及び生存率を、図２６及び２７に示す。スーパープール１は、スーパープール２及び３に由来する細胞よりも、振盪フラスコでの懸濁増殖への適合が遅く、結果として、２回の流加培養評価を、スーパープール１に行った。発現プロファイルを、以下の図２８に示す。もっとも高い発現である７９２．３ｍｇ／Ｌは、スーパープール１の反復で得られ、スーパープール２は、４６２ｍｇ／Ｌを有した。
ミニプール由来のスーパープールの限界希釈
限界希釈及びＥＬＩＳＡスクリーニングクローン
３つのスーパープールを、限界希釈法によってクローニングした。それぞれの培養物を、９６ウェルプレートにおいて、０．５個の細胞／ウェルで播種した。それぞれのスーパープールについて、２０個の９６ウェルプレートに播種した。クローニング培地は、８ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ、２ｍＭグルタミン、５μｇ／ｍＬインスリン、１倍ＨＴ、及びバルクプール培養物から採取した等体積の条件培地を補充したＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯから構成されていた。プレートを、３７℃、５％ ＣＯ２で、１４日間、静置インキュベーターでインキュベートし、それぞれのウェルを、０日目、１日目、２日目、５日目、又は７日目、及び１３日目又は１４日目に、Solentim Imaging Systemによって画像化した。新しい培地１００μＬを、７日目にそれぞれのウェルに添加し、培地を、１４日目に交換した。１４日間又は１５日間のインキュベーションの後、すべてのプレートを、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ及びヤギ抗ヒトカッパ鎖−ＨＲＰを、それぞれ、コーティング抗体及び検出抗体として使用して、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。
限界希釈及びＥＬＩＳＡスクリーニングクローン
３つのスーパープールを、限界希釈法によってクローニングした。それぞれの培養物を、９６ウェルプレートにおいて、０．５個の細胞／ウェルで播種した。それぞれのスーパープールについて、２０個の９６ウェルプレートに播種した。クローニング培地は、８ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ、２ｍＭグルタミン、５μｇ／ｍＬインスリン、１倍ＨＴ、及びバルクプール培養物から採取した等体積の条件培地を補充したＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯから構成されていた。プレートを、３７℃、５％ ＣＯ２で、１４日間、静置インキュベーターでインキュベートし、それぞれのウェルを、０日目、１日目、２日目、５日目、又は７日目、及び１３日目又は１４日目に、Solentim Imaging Systemによって画像化した。新しい培地１００μＬを、７日目にそれぞれのウェルに添加し、培地を、１４日目に交換した。１４日間又は１５日間のインキュベーションの後、すべてのプレートを、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ及びヤギ抗ヒトカッパ鎖−ＨＲＰを、それぞれ、コーティング抗体及び検出抗体として使用して、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。
Solentimの画像及びＥＬＩＳＡのスクリーニング結果に基づいて、単一細胞を起源とする上位１３５個のクローンを、最大２４ウェルプレートへと、８ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ、０．５ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８、及び４００ｎＭ ＭＴＸを補充したＣＤ−ＯｐｔｉＣＨＯ培地において増やした。
２４ウェルプレートへと増やした上位１３５個のクローンを、顕微鏡を用いて周期的にモニタリングした。およそ７日後に、ウェルは、８０％のコンフルエンスに達した。この時点で、それぞれのクローンを、新しい２４ウェルプレートのウェルにおいて、新しい培地中に２０％のコンフルエンスで播種した。培養物を、３７℃及び５％ ＣＯ２で、静的条件において、１１日間インキュベートした。条件培地を、７日目及び１１日目に採取した。クローンを、１１日目に測定した発現レベルに基づいて、プロテインＡセンサーを用いてForteBio Octet Redを使用してランク付けし、バルクプールから精製した８Ｃ３ ＨＥ−５抗体で得られた標準曲線と比較した（図２９）。２４ウェルでの発現レベルプロファイルに基づいて、９５．７〜２２１．８μｇ／ｍＬの範囲の発現レベルを有する合計３６個のクローンを、Ｔ−７５へ、続いて、１２５ｍＬの振盪フラスコへと増やした。２４ウェルのステージにおける上位の３６個のクローンの発現レベルを、図３０に要約する。
振盪フラスコへと増やした上位３６個のクローンを、７．５％ ＤＭＳＯ及び９２．５％ ＣＤ−ＯｐｔｉＣＨＯ培地において、凍結保存した（それぞれ３つのバイアル）。バイアルを、Nalgene Cryo 1℃ Freezing Container（−１℃／分の冷却速度）に入れ、−８０℃で保管した。４８時間後に、バイアルを、液体窒素タンクに移し、そこで保管した。
上位クローンの振盪フラスコ評価
２４ウェルプレートのステージにおいて特定された３６個の上位発現体サブクローンのうちの３５個は、振盪フラスコにおける懸濁増殖への適合が成功した。これらの上位サブクローンを、流加培養条件において、２５０ｍＬの振盪フラスコにおける発現について評価した。振盪フラスコに、８ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充したＣＤ−ＯｐｔｉＣＨＯ培地５０ｍＬ中に、５×１０５個の細胞／ｍＬで播種した。振盪フラスコを、１２５ｒｐｍで回転する２５ｍｍのオービタルスローを備えるシェーカープラットフォームにおいて、３７℃及び５％ ＣＯ２で培養した。培養物に、３日目、６日目、８日目、及び１０日目に、５％のＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ａ及び０．５％のＣｅｌｌ Ｂｏｏｓ ７ｂを供給した。グルコース及びＬ−グルタミンについて、モニタリング及び調節するために、ＮＯＶＡ読み取りを、３日目、６日目、８日目に、及び採取まで必要に応じて毎日、行った。一方で、細胞カウント、及び培養物の試料を、３日目、６日目、８日目、１０日目、及びそれ以降採取まで毎日、取得した。培養物を、８０％未満の生存率で採取した。細胞を、２５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、条件培地を移し、−２０℃で保管した。
２４ウェルプレートのステージにおいて特定された３６個の上位発現体サブクローンのうちの３５個は、振盪フラスコにおける懸濁増殖への適合が成功した。これらの上位サブクローンを、流加培養条件において、２５０ｍＬの振盪フラスコにおける発現について評価した。振盪フラスコに、８ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充したＣＤ−ＯｐｔｉＣＨＯ培地５０ｍＬ中に、５×１０５個の細胞／ｍＬで播種した。振盪フラスコを、１２５ｒｐｍで回転する２５ｍｍのオービタルスローを備えるシェーカープラットフォームにおいて、３７℃及び５％ ＣＯ２で培養した。培養物に、３日目、６日目、８日目、及び１０日目に、５％のＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ａ及び０．５％のＣｅｌｌ Ｂｏｏｓ ７ｂを供給した。グルコース及びＬ−グルタミンについて、モニタリング及び調節するために、ＮＯＶＡ読み取りを、３日目、６日目、８日目に、及び採取まで必要に応じて毎日、行った。一方で、細胞カウント、及び培養物の試料を、３日目、６日目、８日目、１０日目、及びそれ以降採取まで毎日、取得した。培養物を、８０％未満の生存率で採取した。細胞を、２５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、条件培地を移し、−２０℃で保管した。
クローン２−３Ｈ２、２−３Ｈ１１、２−１１Ｈ１２、及び２−２０Ｃ３が、もっとも高い発現レベルを達成し、それぞれの発現レベルは、１．２９ｇ／Ｌ、１．２７ｇ／Ｌ、１．２６ｇ／Ｌ、及び１．２５ｇ／Ｌであった。Solentimの画像から分析した最大生存細胞密度（ＶＣＤ）、生存率プロファイル、採取時の力価、培養物の寿命、及びクローン性を、図３１に要約した。
クローン２−３Ｈ２、２−３Ｈ１１、及び２−２０Ｃ３を、図３１においてハイライトで示し、研究用細胞バンクの調製に選択した。
上位５つの発現体クローンから得られた採取条件培地を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。４マイクロリットルを、還元条件及び非還元条件下において、それぞれのバンドにロードした。予測される分子量のバンドを、還元条件及び非還元条件において、５つすべてのクローンで得た。
研究用細胞バンクの調製
クローン２−３Ｈ１１、２−３Ｈ３、及び２−２０Ｃ３を、Solentimから得られた採取時のそれらの発現レベル及びクローン性に基づいて、研究用細胞バンク（ＲＣＢ）の調製に選択した。
クローン２−３Ｈ１１、２−３Ｈ３、及び２−２０Ｃ３を、Solentimから得られた採取時のそれらの発現レベル及びクローン性に基づいて、研究用細胞バンク（ＲＣＢ）の調製に選択した。
それぞれのクローンを、２５０ｍＬへと増やし、１個のバイアルにつき７．５％がＤＭＳＯ及び９２．５％が８ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘを補充したＣＤ−ＯｐｔｉＣＨＯ培地である１ｍＬの体積に１×１０７個の生存細胞を有する、３６個のバイアルをバンクすることによって、ＲＣＢを調製した。バイアルを、Nalgene Cryo 1℃ Freezing Container（−１℃／分の冷却速度）に入れ、−８０℃で保管した。４８時間後に、すべてのバイアルを、液体窒素タンクに移し、そこで保管した。
Claims (52)
- メラニンに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、前記抗体が、キメラ抗体又はヒト化抗体である、前記モノクローナル抗体。
- キメラ抗体である、請求項１に記載の抗体。
- マウス−ヒトキメラ抗体である、請求項２に記載の抗体。
- キメラ抗体が、マウス可変領域及びヒト定常領域を含む、請求項３に記載の抗体。
- メラニン抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体。
- メラニン抗体が、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体。
- メラニン抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体。
- ヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
- マウスモノクローナル抗体の配列のヒト化形態である、請求項８に記載の抗体。
- マウス８Ｃ３抗体のヒト化形態である、請求項９に記載の抗体。
- メラニン抗体が、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を含む、請求項１、及び８〜１０のいずれかに記載の抗体。
- 配列番号５、配列番号６、又は配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１、及び８〜１０のいずれかに記載の抗体。
- 配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１１又は１２に記載の抗体。
- 配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１１又は１２に記載の抗体。
- 配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１１又は１２に記載の抗体。
- 配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１１又は１２に記載の抗体。
- 配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１１又は１２に記載の抗体。
- 配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項１１又は１２に記載の抗体。
- メラニン抗体の重鎖が、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０のＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体。
- メラニン抗体の軽鎖が、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５のＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体。
- メラニン抗体の重鎖が、配列番号８、配列番号９、又は配列番号１０のＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含み、前記メラニン抗体の軽鎖が、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５のＣＤＲ配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体。
- メラニン抗体の重鎖が、配列番号８、配列番号９、若しくは配列番号１０に由来するＣＤＲ配列を含み、及び／又は軽鎖が、配列番号１３若しくは配列番号１４に由来するＣＤＲ配列を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体。
- 抗原結合性フラグメントである、請求項１、及び８〜１０のいずれかに記載の抗体。
- 二重特異性抗体である、請求項１〜２３のいずれかに記載の抗体。
- 二重特異性抗体が、メラニンを標的とする第１のアーム及び免疫チェックポイントインヒビターを含む抗原を標的とする第２のアームを含む、請求項２４に記載の抗体。
- 免疫チェックポイントインヒビターが、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、又はＰＤ−Ｌ１である、請求項２５に記載の抗体。
- 薬剤にコンジュゲートされている、請求項１〜２６のいずれかに記載の抗体。
- 薬剤が、放射性核種である、請求項２７に記載の抗体。
- 放射性核種が、２１３−Ｂｉである、請求項２８に記載の抗体。
- 放射性核種が、１７７−Ｌｕである、請求項２８に記載の抗体。
- 薬剤が、リンカーを介して抗体にコンジュゲートされている、請求項２７〜３０のいずれかに記載の抗体。
- 請求項１〜３１のいずれかに記載の抗体と、薬理学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 対象においてメラノーマを処置するための方法であって、治療有効量の請求項１〜３２のいずれかに記載の抗体又は組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、前記方法。
- メラノーマの処置における使用のための、治療有効量の請求項１〜３１のいずれかに記載の抗体又は請求項３２に記載の組成物。
- メラノーマが、転移性である、請求項３３に記載の方法、又は請求項３４に記載の使用のための抗体若しくは組成物。
- 投与が、メラノーマ細胞の細胞死を選択的に誘導する、請求項３３若しくは３５に記載の方法、又は請求項３４若しくは３５に記載の使用のための抗体若しくは組成物。
- 対象に、有効量の少なくとも１つの追加の薬剤を投与するステップを含む、請求項３３、３５、及び３６のいずれかに記載の方法、又は請求項３４〜３６のいずれかに記載の使用のための抗体若しくは組成物。
- 薬剤が、免疫チェックポイントインヒビターである、請求項３７に記載の方法又は使用のための抗体若しくは組成物。
- 免疫チェックポイントインヒビターが、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、及びＰＤＬ−１から選択される、請求項３８に記載の方法又は使用のための抗体若しくは組成物。
- 抗体又は組成物が、静脈内投与される、請求項３３及び３５〜３９のいずれかに記載の方法、又は請求項３４〜３９のいずれかに記載の使用のための抗体若しくは組成物。
- コンジュゲート抗体を作製する方法であって、請求項１〜３１のいずれかに記載の抗体を薬剤にコンジュゲートするステップを含む、前記方法。
- 薬剤が、放射性核種である、請求項４１に記載の方法。
- 放射性核種が、２１３−Ｂｉである、請求項４２に記載の方法。
- 放射性核種が、１７７−Ｌｕである、請求項４２に記載の方法。
- 請求項１〜３１のいずれかに記載の抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号１７のヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号１８のヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載のポリヌクレオチド。
- 配列が、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている、請求項４５〜４７のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
- 請求項４８のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項４９に記載のベクターを含む細胞株。
- 請求項１〜３１に記載の抗体のうちのいずれかを発現するクローン細胞。
- 請求項１〜３１のいずれかに記載の抗体、又は請求項３２に記載の組成物を含むキット。
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