CN115707779A - 重组柯萨奇病毒a16病毒样颗粒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，特别是涉及重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒及其用途，所述重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒由基因组中整合有编码柯萨奇病毒A16的VP0、VP1和VP3衣壳蛋白的细胞系产生。本发明还提供所述重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒在制备预防手足口病产品中的用途。所述预防手足口病产品为药物组合物，例如为疫苗组合物。在免疫原性研究中发现本发明的柯萨奇病毒A16VLP可在小鼠体内诱导良好的免疫反应，提示该VLP可作为柯萨奇病毒A16的候选疫苗。

Description

重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒及其用途

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒及其用途。

背景技术

手足口病是一种常见的婴幼儿传染病，主要临床表现为手、足和口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，少数患儿可引起肺水肿、无菌性脑膜脑炎、心肌炎等一系列并发症甚至导致死亡。手足口病是由人肠道病毒属的柯萨奇病毒A组16、4、5、7、9、10，B组2、5型以及肠道病毒71型和埃可病毒30感染引起的，其中肠道病毒71和柯萨奇病毒A16是导致手足口病暴发的主要病原体。目前，肠道病毒A71已有商品化的灭活疫苗，这将大大降低了肠道病毒A71相关手足口病的发病率，而对于柯萨奇病毒A16的疫苗还处于临床前研究。

柯萨奇病毒A16属于小RNA病毒科肠道病毒属A，是无包膜的二十面立体对称球形颗粒，直径约30nm，其基因组是单股正链RNA，两端为保守的非编码区，中间为含有1个开放阅读框的编码区，编码一个蛋白前体，这个蛋白前体可以进一步加工成结构蛋白P1和非结构蛋白P2和P3，而P1可被病毒编码的蛋白酶加工成为病毒衣壳蛋白VP0，VP1和VP3，这些病毒衣壳蛋白与病毒RNA一起组装为成熟的病毒，并伴随着VP0切割为VP2和VP4。据报道，柯萨奇病毒A16的结构蛋白P1与非结构蛋白3CD共表达，可切割为VP0、VP3和VP1衣壳蛋白，并进一步组装成柯萨奇病毒A16病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)与成熟病毒结构上相似，具有良好的免疫原性。VLP免疫后可保护小鼠免于柯萨奇A16病毒的攻击，但通过该方式获得的VLP^-P1/3CD存在着P1切割不完全的现象，影响其组成的均一性。3CD是病毒的蛋白酶，其残留也存在潜在的安全性因素。此外，柯萨奇病毒A16 VLP的组分VP1衣壳蛋白易发生降解，也严重影响了其组成的一致性，这对产品的质量控制造成较大的潜在风险。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒及其用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包括编码柯萨奇病毒A16的VP0、VP1和VP3衣壳蛋白的核苷酸，所述多核苷酸不包括RBS序列和编码柯萨奇病毒A16其他衣壳蛋白的核苷酸。

本发明还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体所述多核苷酸。

本发明还提供一种细胞系，所述细胞系中包括所述核酸构建体，或基因组中整合有所述多核苷酸。

本发明还提供一种重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒，所述重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒包括VP0、VP1和VP3衣壳蛋白，不包括柯萨奇病毒A16其他衣壳蛋白。

本发明还提供所述重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒在制备预防手足口病产品中的用途。

本发明还提供一种用于预防手足口病的药物组合物，所述药物组合物包括所述重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒和药学上可接受的载体。

如上所述，本发明的重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒及其用途，具有以下有益效果：病毒样颗粒与病毒在形态与组成上相似，可诱导较好的免疫反应，为柯萨奇病毒A16疫苗的开发提供了解决方案，为预防柯萨奇病毒A16感染提供有效方法。

附图说明

图1显示为本发明的表达框示意图，PAOX1为AOX1启动子，CYC1 TT为CYC1终止子，VP0、VP3和VP1为柯萨奇病毒A16衣壳蛋白序列。

图2显示为SDS-PAGE分析各A16 VLPs，(A)A16 VLP^-P1/3CD的SDS-PAGE分析，(B)A16VLP^-full的SDS-PAGE分析，(C)A16 VLP^-N50的SDS-PAGE分析，(D)A16 VLP^-N72的SDS-PAGE分析。

图3显示为柯萨奇病毒A16 VLPs粒径分析图，图中Bar＝100nm，(A)A16 VLP^-P1/3CD电镜分析(B)A16 VLP^-full电镜分析，(C)A16 VLP^-full的动态光散射分析，(D)A16 VLP^-N50的动态光散射分析，(E)A16 VLP^-N72的动态光散射分析。

图4显示为柯萨奇病毒A16 VLPs免疫血清特异抗体滴度，(A)二免后血清滴度(VLP^-P1/3CD与VLP^-full免疫原性比较)；(B)二免后血清滴度(VLP^-full、VLP^-N50及VLP^-N72免疫原性比较)；(C)三免后血清滴度(VLP^-full、VLP^-N50及VLP^-N72免疫原性比较)。为了方便统计，将OD450nm吸光值大于0.15的最高稀释倍数的倒数定位该样品的特异抗体滴度，横线显示为几何平均值。

具体实施方式

为解决结构蛋白P1的不完全切割问题，本发明构建了含有柯萨奇病毒A16 VP0、VP3和VP1三个串联表达框的毕赤酵母表达菌株，并成功纯化了VLP^-full；动物免疫结果显示，VLP^-full的免疫原性与共表达P1和3CD获得的VLP^-P1/3CD免疫原性相当。

为了解决VP1的降解问题，本发明在串联表达柯萨奇病毒A16 VP0、VP3和VP1的基础上，对VP1 N端进行50个和72个氨基酸的截短，并分别获得了毕赤酵母表达菌株和纯化后的VLP^-N50和VLP^-N72；SDS-PAGE显示VLP^-N50和VLP^-N72的VP1均无明显降解，且免疫小鼠发现不论VLP^-N50还是VLP^-N72诱导的免疫水平均与VLP^-full相当。因此，经串联表达衣壳蛋白VP0、VP3和截短VP1获得的柯萨奇病毒A16 VLP不仅解决了P1不完全切割和VP1降解的组成均一性问题，同时兼具良好的免疫原性，为柯萨奇疫病毒A16疫苗的研发提供了新思路。在进一步的免疫原性研究发现柯萨奇病毒A16 VLP^-N50和A16 VLP^-N72均可在小鼠体内诱导良好的中和抗体水平，提示这两种VLP可作为柯萨奇病毒A16的候选疫苗。

本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包括编码柯萨奇病毒A16的VP0、VP1和VP3衣壳蛋白的核苷酸，所述多核苷酸不包括RBS序列和编码柯萨奇病毒A16其他衣壳蛋白的核苷酸。

在一种实施方式中，所述多核苷酸中编码柯萨奇病毒A16的VP0、VP1和VP3衣壳蛋白的核苷酸的排列顺序为：VP0-VP3-VP1。

如图1所示的实施方式中，表达VP0、VP1和VP3的三个表达框在所述多核苷酸中串联。所述多核苷酸中编码柯萨奇病毒A16的VP0、VP1和VP3衣壳蛋白的核苷酸的串联排列顺序为：VP0-VP3-VP1。具体的串联方式为启动子-VP0-终止子-启动子-VP3-终止子-启动子-VP1-终止子。当然，在其他实施方式中，三个表达框的串联方式也可以是以下中的任一种：启动子-VP0-终止子-启动子-VP1-终止子-启动子-VP3-终止子、启动子-VP3-终止子-启动子-VP0-终止子-启动子-VP1-终止子、启动子-VP3-终止子-启动子-VP1-终止子-启动子-VP0-终止子、启动子-VP1-终止子-启动子-VP3-终止子-启动子-VP0-终止子、启动子-VP1-终止子-启动子-VP0-终止子-启动子-VP3-终止子。在一种实施方式中，所述启动子为AOX1启动子，所述终止子为CYC1终止子。由于各蛋白均为独立的开放阅读框，因此不同的串联方式均能达到与实施例相同的效果。

所述编码柯萨奇病毒A16的VP0衣壳蛋白的核苷酸为VP0全长核苷酸序列或截短的核苷酸，所述编码柯萨奇病毒VP1衣壳蛋白的核苷酸为VP1全长核苷酸序列或截短的核苷酸，所述编码柯萨奇病毒VP3衣壳蛋白的核苷酸为编码柯萨奇病毒A16的VP3衣壳蛋白的全长核苷酸序列或截短的核苷酸序列。

在一种实施方式中，所述截短的核苷酸可以是VP1截短0-216个核苷酸，VP0截短0-243个核苷酸，VP3截短0-171个核苷酸。

在一种实施方式中，所述多核苷酸编码的柯萨奇病毒A16的VP1衣壳蛋白为截短45-75个氨基酸的VP1衣壳蛋白。优选的，为截短50～72个氨基酸。具体的，例如为以下中的任一：截短45～50个氨基酸、截短50～55个氨基酸、截短55～60个氨基酸、截短60～65个氨基酸、截短65～70个氨基酸、截短70～72个氨基酸、截短72～75个氨基酸。

在一种实施方式中，编码柯萨奇病毒A16的VP0衣壳蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO:8所示。编码柯萨奇病毒A16的VP3衣壳蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。编码柯萨奇病毒A16的VP1衣壳蛋白的核苷酸序列的如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示。

SEQ ID NO:2所示的序列中，1-969为VP0核苷酸序列，970-1695为VP3核苷酸序列，1696-2586为VP1核苷酸序列。所述多核苷酸中不包括编码3CD蛋白的核苷酸。

所述多核苷酸的序列为经过密码子优化后得到的序列。

在一种实施方式中，所述编码柯萨奇病毒A16的VP0衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的VP0衣壳蛋白；所述编码柯萨奇病毒A16的VP3衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的VP3衣壳蛋白；所述编码柯萨奇病毒A16的VP1衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的VP1衣壳蛋白。

在一种实施方式中，所述柯萨奇病毒A16的VP1衣壳蛋白的氨基酸序列选自以下任一项：1)如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的序列；2)与SEQ ID NO.5或SEQID NO:6或SEQ ID NO:7所示序列的同源性在95％、96％、97％、98％或99％以上的序列；3)与前两项任一所述的序列互补的序列。

本发明还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包括所述多核苷酸。

术语“核酸构建体”是指可以被引入靶细胞或组织中的人工构建的核酸区段，所述核酸构建体包括载体骨架即表达载体与表达框，所述核酸构建体可以为质粒。

所述核酸构建体中VP0、VP3和VP1三个表达框可以是各自独立的单拷贝或多拷贝。较佳的，所述核酸构建体中VP0、VP3和VP1三个表达框均为单拷贝。

所述核酸构建体中不包括编码柯萨奇病毒A16除VP0、VP1和VP3衣壳蛋白外的其他衣壳蛋白。

在一种实施方式中，所述核酸构建体还包括表达载体。所述表达载体可以是现有技术中任意适于表达柯萨奇病毒的表达载体，例如为酵母表达载体。较佳的为毕赤酵母表达载体pPink-HC(厂家：Invitrogen)。

在一种实施方式中，所述核酸构建体核苷酸序列如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示。

本发明还提供一种细胞系，所述细胞系中包括所述核酸构建体，或基因组中整合有所述多核苷酸。

所述细胞系为真核细胞。在一种实施方式中，所述细胞系为将所述核酸构建体转导入毕赤酵母细胞得到。

本申请的所述细胞系中所含的多核苷酸中不包括编码3CD蛋白的核苷酸，而是细胞系能够在胞内直接表达柯萨奇病毒A16的VP0、VP1、VP3衣壳蛋白，然后组装为直径约30nm的病毒样颗粒(VLP)，并非细胞系表达P1结构蛋白而后再被3CD切割加工成VP0、VP1、VP3衣壳蛋白。

本发明还提供一种重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒，所述重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒包括VP0、VP1和VP3衣壳蛋白，不包括柯萨奇病毒A16其他衣壳蛋白。

所述重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒由所述细胞系产生。

重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒的直径(指电镜下直径)为25nm～35nm。所述重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒的大小均一。

本发明还提供所述重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

1)培养所述细胞系，使其表达重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒；

2)分离出所述细胞系表达的重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒。

在一种实施方式中，培养所述细胞系的条件为28℃-30℃，250-300rpm。

在一种实施方式中，所述细胞系通过将所述核酸构建体转导入宿主细胞得到。在一种实施方式中，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞。

在一种实施方式中，所述核酸构建体的制备方法包括如下步骤：

1)将密码子优化后的表达VP0、VP1、VP3衣壳蛋白的核苷酸分别克隆入三个表达载体中，获得中间构建体；

2)将步骤1)获得的三个中间构建体重组后获得所述核酸构建体。

本发明还提供所述重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒在制备预防手足口病产品中的用途。

在一种实施方式中，所述手足口病为柯萨奇病毒A16感染的手足口病。

所述预防手足口病产品为药物组合物。所述药物组合物例如为疫苗组合物。

本发明还提供一种用于预防手足口病的药物组合物，所述药物组合物包括所述重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒和药学上可接受的载体。

所述药物组合物可以是单价的(仅含有一种病毒样颗粒)，也可以是多价的(含有多种病毒样颗粒)。

所述药物组合物可制备成各种常规剂型，例如：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。

所述药物组合物包括预防或治疗有效量的本发明病毒样颗粒或多核苷酸。

术语“预防或治疗有效量”指药物组合物治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。即病毒样颗粒的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。

在一种实施方式中，为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至1000毫克/千克，较佳地约0.01毫克/千克至100毫克/千克体重的病毒样颗粒。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于药物组合物(例如本发明的重组病毒样颗粒)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物，尤其是人。

所述药物组合物例如为疫苗组合物。疫苗组合物可用已知的方法将本发明的病毒样颗粒直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。

给予本发明药物组合物的途径包括：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。实施例1柯萨奇病毒A16表达质粒的构建

为了使表达达到最优，将柯萨奇病毒A16 P1氨基酸序列根据毕赤酵母密码子偏好性进行优化合成；利用EcoRI和KpnI位点连入pPinK-HC质粒中，得到质粒pPink/HC-A16 P1。柯萨奇病毒A16P1氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中1-323为VP0氨基酸序列(SEQ IDNO:3)，324-565为VP3氨基酸序列(SEQ ID NO:4)，566-862为VP1氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。同时合成相应的3CD序列(核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)，并利用EcoRI和KpnI位点连入pPinK-HC质粒中，得到质粒pPink/HC-A16 3CD。柯萨奇病毒A16 P1优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。VP0的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，即SEQ ID NO:2中的1-969。VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，即SEQ ID NO:2中的970-1695。VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，即SEQ ID NO:2中的1696-2586。VP1 N50的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。VP1 N72的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。VP1 N50的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。VP1 N72的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

质粒pPink/HC-A16 P1/3CD的构建：用BglⅡ和BamHⅠ对质粒pPink/HC-A16 3CD进行双酶切，获取3CD表达框；然后将3CD表达框连入用BglⅡ和CIP酶处理pPink/HC-A16 P1中，最终获得质粒pPink/HC-A16 P1/3CD(核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示)。

根据优化后柯萨奇病毒A16衣壳蛋白VP0、VP1、VP3及表达载体pPink-HC(购自Invitrogen)多克隆位点核苷酸处序列设计合成重组PCR引物(表1，其中N50-R和N72-R与HS1VP1-R序列相同，表1中未重复列出)，使用同源重组试剂盒(购自诺唯赞)中的同源重组酶将VP0、VP3、VP1、VP1 N50和VP1 N72分别以重组的方式连接到载体pPinK-HC中，分别得到中间质粒pPink/HC-A16 VP0、pPink/HC-A16 VP3、pPink/HC-A16 VP1、pPink/HC-A16VP1-N50和pPink/HC-A16 VP1 N72；利用同尾酶BglⅡ和BamHⅠ以酶切连接的方法依次将中间质粒中A16 VP3表达框和A16 VP0表达框连入pPink/HC-A16 VP1、pPink/HC-A16 VP1N50或pPink/HC-A16 VP1 N72中，分别得到终质粒pPink/HC-A16 VPN^-full(核苷酸序列如SEQ IDNO:15所示)、pPink/HC-A16 VPN^-N50(核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示)和pPink/HC-A16VPN^-N72(核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示)，示意图如图1所示。

表1重组PCR引物序列

引物名称	引物序列	序列号
			HS16 VP0-F	5’-caactaattattcgaaacggaattcaccatgggttctcaagtttctactc-3’	SEQ ID NO:18
HS16VP0-R	5’-ctgtatttaaatggccggccggtacctcattattgcttaacagcttgtctc-3’	SEQ ID NO:19
			HS16 VP3-F	5’-caactaattattcgaaacggaattcaccatgggtattccaactgaattg-3’	SEQ ID NO:20
HS16VP3-R	5’-cctgtatttaaatggccggccggtacctcattattgaatattagcagtttgct-3’	SEQ ID NO:21
			HS16VP1-F	5’-caactaattattcgaaacggaattcaccatgggagatccaatcgctgatatg-3’	SEQ ID NO:22
HS16VP1-R	5’-cctgtatttaaatggccggccggtacctcattacaaagtagtaattttatctc-3’	SEQ ID NO:23
			HS16VP1<sup>-N50</sup>-F	5’-aacaactaattattcgaaacggaattcaccatggagactggtgcttcttc-3’	SEQ ID NO:24
HS16VP1<sup>-N72</sup>-F	5’-aacaactaattattcgaaacggaattcaccatgcactctactcaagagac-3’	SEQ ID NO:25

实施例2柯萨奇病毒A16高表达菌株的筛选、表达与纯化

高表达菌株的筛选

将终质粒pPink/HC-A16 P1/3CD、pPink/HC-A16VPN^-full、pPink/HC-A16 VPN^-N50或pPink/HC-A16 VPN^-N72使用内切酶酶AflⅡ进行线性化，并用乙醇沉淀法进行纯化回收；利用电转的方法将线性化质粒导入毕赤酵母中进行基因重组，涂布PAD平板与30℃进行培养；3天后，挑取大的白色菌落与24孔深孔板中进行甲醇诱导表达，诱导表达48h后收取诱导菌体使用夹心ELISA的方法进行表达检测，经过筛选，将表达量高的作为高表达株A16 VLP^-P1/3CD、A16 VLP^-full、A16 VLP^-N50和A16 VLP^-N72，各高表达菌株目的基因序列经测序分析与理论核苷酸序列一致。

夹心ELISA方法所用的兔抗柯萨奇病毒A16多抗血清和柯萨奇病毒A16特异的鼠单抗均为本公司自制，制备步骤如下：(1)兔抗柯萨奇病毒A16多抗血清：将纯化后的柯萨奇病毒A16 VLP(500μg/只)与弗氏佐剂1:1混合乳化后皮下多点注射成年的新西兰大白兔(1ml/只)，两次免疫间隔4周共免疫4次，第4次免疫2周后采取兔血清备用；(2)柯萨奇病毒A16特异的鼠单抗：将纯化后的柯萨奇病毒A16 VLP(5μg/只)与铝佐剂(500μg/只)充分混合后，腹腔注射小鼠，两次免疫间隔2周共免疫4次，第4次免疫后2周取脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合后筛选得到柯萨奇病毒A16特异的鼠单抗细胞株，将该细胞株腹腔注射小鼠后获得腹水，经protein G填料纯化后获得A16特异的鼠单抗备用。夹心ELISA操作步骤如下：将兔抗柯萨奇病毒A16多抗血清按1:2000进行稀释包被于96孔酶标板中，50μl/孔，4℃包被过夜后用5％脱脂奶粉进行封闭；将菌体用PBS重悬，加入等体积玻璃珠后70HZ破碎120s，离心后取上清备用；破菌上清和柯萨奇病毒A16 VLP自制标品用2％脱脂奶粉进行适当的稀释后加到封闭后的酶标板中，于37℃进行孵育；2h后，加入柯萨奇病毒A16特异的鼠单抗，于37℃进行孵育；2h后，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗鼠二抗，37℃孵育1h后进行显色并读取450nm吸光值，并根据标曲计算VLP含量。

表达与纯化

将筛选得到的高表达株A16 VLP^-P1/3CD、A16 VLP^-full、A16 VLP^-N50和A16 VLP^-N72分别接种于BMGY培养基，培养24h后更换为BMMY培养基进行诱导表达，诱导48h后离心收获菌体。将菌体用PBS重悬后使用高压均浆机1200bar进行破菌，离心后收集上清进行PEG沉降，复溶后的上清使用DEAE填料进行纯化，最终分别获得纯化后的柯萨奇病毒A16VLP^-P1/3CD、A16VLP^-full、A16 VLP^-N50和A16 VLP^-N72。

将柯萨奇病毒A16 VLPs分别进行SDS-PAGE分析(图2)，结果显示各VLP均由VP0、VP1和VP3组成，A16 VLP^-P1/3CD(图2A)和A16 VLP^-full(图2B)的VP1均出现不同程度的降解，而VLP^-N50(图2C)和A16 VLP^-N72(图2D)无明显降解。此外，由于是串联表达VP0、VP3和VP1(全长与N端截短)衣壳蛋白，故A16 VLP^-full、A16 VLP^-N50和A16 VLP^-N72不存在切割不完全的问题，也不存在3CD残留问题。

实施例3柯萨奇病毒A16 VLP的形态研究

负染：将纯化后的各柯萨奇病毒A16 VLP用PBS稀释至50-200ng/μl，进行电子显微镜分析，具体步骤如下：上样到铜网后使用醋酸铀进行染色，然后使用120kV冷冻电镜进行观察其形态，如图3(A)、(B)所示，电镜下A16 VLP^-P1/3CD与A16 VLP^-full形态相似，均呈规则的球形结构，直径约为30nm。因此，在毕赤酵母中串联表达柯萨奇病毒A16衣壳蛋白VP0、VP3和VP1可自发组装成VLP。

粒径测定：采用动态光散射的方法测定其水合直径，具体步骤如下：将待分析样品用PBS稀释至50-200ng/μl，取1ml加入样品池中，避免产生气泡，将样品池放入Zetasizer设备中进行检测和数据分析。动态光散射结果如图3(C)至(E)所示，显示A16 VLP^-N50和A16VLP^-N72的水合直径与A16 VLP^-full相似均为40nm左右，故A16 VLP^-P1/3CD、A16 VLP^-full、A16VLP^-N50和A16 VLP^-N72均组装良好。

实施例4柯萨奇病毒A16 VLP的免疫原性

1.为了比较A16 VLP^-P1/3CD和A16 VLP^-full的免疫原性，将A16 VLP^-P1/3CD、A16 VLP^-full分别与铝佐剂混合后，按照下述方法进行小鼠免疫：

通过肌肉注射的方式免疫6-8周龄雌性Balb/C小鼠，共分为2组，每组10只。将VLP^-P1/3CD(5μg/只)或VLP^-full(5μg/只)与铝佐剂(500μg/只)室温振荡吸附1-2h，然后进行肌肉注射，共免疫2次，两次免疫之间间隔4周。第二次免疫后2周(即第6周)采取小鼠血清按照下述方法进行特异性抗体水平检测：将兔抗柯萨奇病毒A16 VLP包被于96孔酶标板中，20ng/孔，4℃包被过夜后用5％脱脂奶粉进行封闭；将血清样品用2％脱脂奶粉进行倍比稀释后加到封闭后的酶标板中，于37℃进行孵育；2h后，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗鼠二抗，37℃孵育1h后进行显色并读取450nm吸光值。

结果如图4A所示，A16 VLP^-P1/3CD、A16 VLP^-full均可以诱导较高的特异性抗体，且两者水平相当。因此，利用酵母表达系统串联表达柯萨奇病毒A16 VP0、VP3和VP1衣壳蛋白获得VLP的方式可替代共表达P1和3CD获取VLP的方法用于进一步柯萨奇病毒A16疫苗的研发。

2.为了确定VP1 N端的截短是否影响柯萨奇病毒A16 VLP的免疫原性，

通过肌肉注射的方式免疫6-8周龄雌性ICR小鼠，共分为2组，每组5-6只。将VLP^-full(10μg/只)、VLP^-N50(10μg/只)或VLP^-N72(10μg/只)分别与Al佐剂(80μg/只)室温振荡吸附1-2h，然后分别进行腹腔注射免疫小鼠，共免疫3次，每次免疫之间间隔2周。分别于第二次和第三次免疫后2周采取小鼠血清测定特异性抗体水平检测(方法同上)。如图4B-C所示，不论免疫2次(图4B)还是3次(图4C)VLP-^N50和VLP-^N72均可诱导与VLP^-full相当水平的特异性抗体。

本发明的数据均使用GraphPad Prism 8.3.0进行数据处理。

本发明将含柯萨奇病毒A16 VP0、VP1与VP3串联表达框的表达载体导入毕赤酵母，以达到同时表达柯萨奇病毒A16 VP0、VP1与VP3衣壳蛋白的目的，经检测发现VP0、VP1与VP3衣壳蛋白可成功表达且可自发组装成VLP。与共表达P1和3CD获得的VLP^-P1/3CD相比，VLP^-full不存在P1切割不完全的问题，亦可在小鼠体内诱导与VLP^-P1/3CD相当的的特异抗体反应，但VLP^-full仍存在VP1不同程度降解的问题。为解决该问题，我们在衣壳蛋白串联表达的基础上对VP1 N端进行不同程度的截短，SDS-PAGE结果显示VLP^-N50和VLP^-N72的VP1均无明显的降解；此外，VLP^-N50和VLP^-N72，亦可诱导良好的免疫反应，且抗体水平与VLP^-full相当。

综上，VLP^-N50和VLP^-N72组成均一且免疫原性良好，可用于柯萨奇病毒A16进一步的疫苗研发。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 华淞（上海）生物医药科技有限公司

<120> 重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒及其用途

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 862

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Ser Gln Val Ser Thr Gln Arg Ser Gly Ser His Glu Asn Ser

1 5 10 15

Asn Ser Ala Ser Glu Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ala Tyr Ala Ala Ser Ala Gly Arg Gln Asp Met Ser Gln

35 40 45

Asp Pro Lys Lys Phe Thr Asp Pro Val Met Asp Val Met His Glu Met

50 55 60

Ala Pro Pro Leu Lys Ser Pro Ser Ala Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Arg Val Ala Gln Leu Thr Ile Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu

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Ala Ala Asn Ile Val Ile Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro

100 105 110

Asp Thr Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser

115 120 125

Val Asn Arg Phe Phe Thr Leu Asp Thr Lys Ser Trp Ala Lys Asp Ser

130 135 140

Lys Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Thr Glu Val Gly Val

145 150 155 160

Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys

165 170 175

Val His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu

180 185 190

Val Ala Val Leu Pro Glu Tyr Val Leu Gly Thr Ile Ala Gly Gly Thr

195 200 205

Gly Asn Glu Asn Ser His Pro Pro Tyr Ala Thr Thr Gln Pro Gly Gln

210 215 220

Val Gly Ala Val Leu Thr His Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly Ile Pro

225 230 235 240

Leu Ser Gln Leu Thr Val Cys Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr

245 250 255

Asn Asn Cys Ala Thr Ile Ile Val Pro Tyr Met Asn Thr Val Pro Phe

260 265 270

Asp Ser Ala Leu Asn His Cys Asn Phe Gly Leu Leu Val Ile Pro Val

275 280 285

Val Pro Leu Asp Phe Asn Thr Gly Ala Thr Ser Glu Ile Pro Ile Thr

290 295 300

Val Thr Ile Ala Pro Met Cys Ala Glu Phe Ala Gly Leu Arg Gln Ala

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Val Lys Gln Gly Ile Pro Thr Glu Leu Lys Pro Gly Thr Asn Gln Phe

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Leu Thr Thr Asp Asp Gly Val Ser Ala Pro Ile Leu Pro Gly Phe His

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<210> 2

<211> 2586

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggttctc aagtttctac tcaaagatcc ggttctcacg aaaactctaa ttctgcttct 60

gagggttcta ctattaacta cactactatt aattactaca aggatgctta cgctgcttct 120

gctggtagac aagatatgtc tcaagatcca aagaagttta ctgatccagt tatggatgtt 180

atgcatgaaa tggctccacc tttgaaatct ccatctgctg aggcttgtgg ttactctgat 240

agagttgctc aattgactat cggtaactct actatcacta ctcaagaagc tgctaatatt 300

gttattgctt acggtgaatg gccagagtat tgtcctgata ctgatgctac tgctgttgat 360

aagccaacta gacctgatgt ttctgttaac agatttttca ctttggatac taagtcttgg 420

gctaaggatt ctaaaggttg gtactggaaa ttcccagatg ttttgactga ggttggtgtt 480

tttggtcaaa acgctcaatt ccactacttg tatagatccg gtttttgtgt tcacgttcaa 540

tgtaatgctt ctaaattcca tcaaggtgct ttgttggttg ctgttttgcc tgaatatgtt 600

ttgggtacta ttgctggtgg tactggtaac gaaaactctc acccacctta cgctactact 660

caaccaggtc aagttggtgc tgttttgact catccatatg ttttggatgc tggtattcct 720

ttgtctcaat tgactgtttg tccacaccaa tggattaact tgagaactaa caactgtgct 780

actatcatcg ttccatacat gaacactgtt cctttcgatt ctgctttgaa ccattgtaac 840

ttcggtttgt tggttattcc agttgttcct ttggatttta acactggtgc tacttctgaa 900

atcccaatca ctgttactat tgctcctatg tgtgctgagt tcgctggttt gagacaagct 960

gttaagcaag gtattccaac tgaattgaaa cctggtacta accaattctt gactactgat 1020

gatggtgttt ctgctccaat tttgcctggt ttccatccaa ctccacctat tcacattcct 1080

ggtgaagttc ataacttgtt ggagatttgt agagttgaaa ctatcttgga ggttaacaat 1140

ttgaagacta acgaaactac tccaatgcaa agattgtgtt ttcctgtttc tgttcaatct 1200

aaaactggag agttgtgtgc tgctttcaga gctgatccag gtagagatgg tccttggcaa 1260

tctactattt tgggtcaatt gtgtagatac tatactcaat ggtctggttc tttggaagtt 1320

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gattttggtt tgcaatcttc tgttactttg gttgttccat ggatttctaa cactcattac 1500

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tatcaaacta actacgttgt tccaatcggt gctcctacta ctgcttatat tgttgctttg 1620

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gttaacagat ccttgactgc tatgcaagtt ttgcctactg ctgctaatac tgaagcttct 1800

tctcatagat tgggtactgg tgttgttcca gctttgcaag ctgctgagac tggtgcttct 1860

tctaacgctt ctgataagaa tttgatcgaa actagatgtg ttttgaacca tcactctact 1920

caagagactg ctattggtaa ctttttctct agagctggtt tggtttctat catcactatg 1980

ccaactatgg gtactcaaaa cactgatggt tacgttaatt gggatattga tttgatgggt 2040

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actttcgttg ttgctaaacc aaacggtgaa ttggttcctc aattgttgca atacatgtat 2160

gttccacctg gtgctccaaa gcctacttct agagattctt ttgcttggca aactgctact 2220

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actttg 2586

<210> 3

<211> 323

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Gly Ser Gln Val Ser Thr Gln Arg Ser Gly Ser His Glu Asn Ser

1 5 10 15

Asn Ser Ala Ser Glu Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ala Tyr Ala Ala Ser Ala Gly Arg Gln Asp Met Ser Gln

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Asp Pro Lys Lys Phe Thr Asp Pro Val Met Asp Val Met His Glu Met

50 55 60

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65 70 75 80

Arg Val Ala Gln Leu Thr Ile Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu

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Ala Ala Asn Ile Val Ile Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro

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Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys

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Val Ala Val Leu Pro Glu Tyr Val Leu Gly Thr Ile Ala Gly Gly Thr

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Gly Asn Glu Asn Ser His Pro Pro Tyr Ala Thr Thr Gln Pro Gly Gln

210 215 220

Val Gly Ala Val Leu Thr His Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly Ile Pro

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245 250 255

Asn Asn Cys Ala Thr Ile Ile Val Pro Tyr Met Asn Thr Val Pro Phe

260 265 270

Asp Ser Ala Leu Asn His Cys Asn Phe Gly Leu Leu Val Ile Pro Val

275 280 285

Val Pro Leu Asp Phe Asn Thr Gly Ala Thr Ser Glu Ile Pro Ile Thr

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Val Thr Ile Ala Pro Met Cys Ala Glu Phe Ala Gly Leu Arg Gln Ala

305 310 315 320

Val Lys Gln

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<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gly Ile Pro Thr Glu Leu Lys Pro Gly Thr Asn Gln Phe Leu Thr

1 5 10 15

Thr Asp Asp Gly Val Ser Ala Pro Ile Leu Pro Gly Phe His Pro Thr

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Pro Pro Ile His Ile Pro Gly Glu Val His Asn Leu Leu Glu Ile Cys

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Arg Val Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Leu Lys Thr Asn Glu Thr

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165 170 175

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180 185 190

Gly Ile Ile Thr Ile Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro Ile Gly

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210 215 220

Phe Thr Met Lys Leu Cys Lys Asp Thr Glu Asp Ile Glu Gln Thr Ala

225 230 235 240

Asn Ile Gln

<210> 5

<211> 298

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Gly Asp Pro Ile Ala Asp Met Ile Asp Gln Thr Val Asn Asn Gln

1 5 10 15

Val Asn Arg Ser Leu Thr Ala Met Gln Val Leu Pro Thr Ala Ala Asn

20 25 30

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Gln Ala Ala Glu Thr Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Lys Asn Leu

50 55 60

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Ile Gly Asn Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Ser Ile Ile Thr Met

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100 105 110

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Gly Glu Leu Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro Pro Gly

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180 185 190

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Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Leu Gln Ala Asn Asp Leu Asp Tyr Gly

210 215 220

Gln Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Ile Arg Thr Val Gly

225 230 235 240

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245 250 255

Lys His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Leu Arg Asn Gln Pro Tyr

260 265 270

Leu Phe Lys Thr Asn Pro Asn Tyr Lys Gly Asn Asp Ile Lys Cys Thr

275 280 285

Ser Thr Ser Arg Asp Lys Ile Thr Thr Leu

290 295

<210> 6

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Glu Thr Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Lys Asn Leu Ile Glu

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Thr Arg Cys Val Leu Asn His His Ser Thr Gln Glu Thr Ala Ile Gly

20 25 30

Asn Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Ser Ile Ile Thr Met Pro Thr

35 40 45

Met Gly Thr Gln Asn Thr Asp Gly Tyr Val Asn Trp Asp Ile Asp Leu

50 55 60

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65 70 75 80

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Leu Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala Pro

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Thr Phe Gly Glu His Leu Gln Ala Asn Asp Leu Asp Tyr Gly Gln Cys

165 170 175

Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Ile Arg Thr Val Gly Thr Glu

180 185 190

Lys Ser Pro His Ser Ile Thr Leu Arg Val Tyr Met Arg Ile Lys His

195 200 205

Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Leu Arg Asn Gln Pro Tyr Leu Phe

210 215 220

Lys Thr Asn Pro Asn Tyr Lys Gly Asn Asp Ile Lys Cys Thr Ser Thr

225 230 235 240

Ser Arg Asp Lys Ile Thr Thr Leu

245

<210> 7

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met His Ser Thr Gln Glu Thr Ala Ile Gly Asn Phe Phe Ser Arg Ala

1 5 10 15

Gly Leu Val Ser Ile Ile Thr Met Pro Thr Met Gly Thr Gln Asn Thr

20 25 30

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180 185 190

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225

<210> 8

<211> 969

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgggttctc aagtttctac tcaaagatcc ggttctcacg aaaactctaa ttctgcttct 60

gagggttcta ctattaacta cactactatt aattactaca aggatgctta cgctgcttct 120

gctggtagac aagatatgtc tcaagatcca aagaagttta ctgatccagt tatggatgtt 180

atgcatgaaa tggctccacc tttgaaatct ccatctgctg aggcttgtgg ttactctgat 240

agagttgctc aattgactat cggtaactct actatcacta ctcaagaagc tgctaatatt 300

gttattgctt acggtgaatg gccagagtat tgtcctgata ctgatgctac tgctgttgat 360

aagccaacta gacctgatgt ttctgttaac agatttttca ctttggatac taagtcttgg 420

gctaaggatt ctaaaggttg gtactggaaa ttcccagatg ttttgactga ggttggtgtt 480

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tgtaatgctt ctaaattcca tcaaggtgct ttgttggttg ctgttttgcc tgaatatgtt 600

ttgggtacta ttgctggtgg tactggtaac gaaaactctc acccacctta cgctactact 660

caaccaggtc aagttggtgc tgttttgact catccatatg ttttggatgc tggtattcct 720

ttgtctcaat tgactgtttg tccacaccaa tggattaact tgagaactaa caactgtgct 780

actatcatcg ttccatacat gaacactgtt cctttcgatt ctgctttgaa ccattgtaac 840

ttcggtttgt tggttattcc agttgttcct ttggatttta acactggtgc tacttctgaa 900

atcccaatca ctgttactat tgctcctatg tgtgctgagt tcgctggttt gagacaagct 960

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<210> 9

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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gtttctgctc caattttgcc tggtttccat ccaactccac ctattcacat tcctggtgaa 120

gttcataact tgttggagat ttgtagagtt gaaactatct tggaggttaa caatttgaag 180

actaacgaaa ctactccaat gcaaagattg tgttttcctg tttctgttca atctaaaact 240

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attttgggtc aattgtgtag atactatact caatggtctg gttctttgga agttactttt 360

atgttcgctg gttcttttat ggctactggt aaaatgttga ttgcttacac tccacctggt 420

ggttctgttc ctgctgatag aattactgct atgttgggta ctcacgttat ttgggatttt 480

ggtttgcaat cttctgttac tttggttgtt ccatggattt ctaacactca ttacagagct 540

cacgctagag ctggttattt cgattactat actactggta tcatcactat ctggtatcaa 600

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gctcaagata acttcactat gaagttgtgt aaggatactg aagatattga gcaaactgct 720

aatattcaa 729

<210> 10

<211> 894

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgggagatc caatcgctga tatgatcgat caaactgtta acaaccaagt taacagatcc 60

ttgactgcta tgcaagtttt gcctactgct gctaatactg aagcttcttc tcatagattg 120

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<210> 11

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggagactg gtgcttcttc taacgcttct gataagaatt tgatcgaaac tagatgtgtt 60

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<210> 12

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgcactcta ctcaagagac tgctattggt aactttttct ctagagctgg tttggtttct 60

atcatcacta tgccaactat gggtactcaa aacactgatg gttacgttaa ttgggatatt 120

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<210> 13

<211> 1941

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgggaccga gcttggactt tgccttatcc cttctaaggc gcaacatcag acaggtgcaa 60

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<210> 14

<211> 13434

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

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caaatatgta ggaaataccc tgcatgagcc tgatgagtat gtgacacagg ctgctctcca 1740

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atgctacggc actaaatttc tagaggctat agacttgcac accagtgccg ggtaccccta 1860

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cggcataccg tttgtcttgt ttggtattga ttgacgaatg ctcaaaaata atctcattaa 3780

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ctacttgaca gcaatatata aacagaagga agctgccctg tcttaaacct ttttttttat 4020

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tgtttttggt caaaacgctc aattccacta cttgtataga tccggttttt gtgttcacgt 4680

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agctgttaag caaggtattc caactgaatt gaaacctggt actaaccaat tcttgactac 5160

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tccacctggt ggttctgttc ctgctgatag aattactgct atgttgggta ctcacgttat 5580

ttgggatttt ggtttgcaat cttctgttac tttggttgtt ccatggattt ctaacactca 5640

ttacagagct cacgctagag ctggttattt cgattactat actactggta tcatcactat 5700

ctggtatcaa actaactacg ttgttccaat cggtgctcct actactgctt atattgttgc 5760

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ttcttctcat agattgggta ctggtgttgt tccagctttg caagctgctg agactggtgc 6000

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tactcaagag actgctattg gtaacttttt ctctagagct ggtttggttt ctatcatcac 6120

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aattaaacat gttagagctt ggattccaag acctttgaga aaccaaccat acttgtttaa 6660

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tactactttg taatgaggta ccggccggcc atttaaatac aggccccttt tcctttgtcg 6780

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tatgttagta ttaagaacgt tatttatatt tcaaattttt cttttttttc tgtacaaacg 6960

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caagaccaca tcgacggatc attcaaagat gaggaggcta tcgccaagtt agctgccaaa 7260

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aatgagattg ctccaaggcc ccacaattct ggtcactata caatcgatgc atgtgtaaca 7920

tctcagttcg aagcacatgt aagagccata actggtctgc caatgccact agatttcacc 7980

aaactatcta cttccaacac caacgctatt atgctcaatg ttttgggtgc tgaaaaatct 8040

cacggggaat tagagttttg tagaagagcc ttagaaacac ccggtgcttc tgtatatctg 8100

tacggaaaga ccacccgatt ggctcgtaag atgggtcata tcaacataat aggatcttcc 8160

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atactactaa ccatttacct gtagcgtatt tcttttccct cttcgcgaaa gctcaagggc 9060

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agacttctta acgcctcatc tggcttatat caagcttacc aacagttcag aaactcccag 9360

tccaagtttc ttgcttgaaa gtgcgaagaa tggtgacacc gttgacaggt acacctttat 9420

gggacattcc cccagaaaaa taatcaagac tgggccttta gagggtgctg aagttgaccc 9480

cttggtgctt ctggaaaaag aactgaaggg caccagacaa gcgcaacttc ctggtattcc 9540

tcgtctaagt ggtggtgcca taggatacat ctcgtacgat tgtattaagt actttgaacc 9600

aaaaactgaa agaaaactga aagatgtttt gcaacttccg gaagcagctt tgatgttgtt 9660

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cgatcaatga acggaggacg taagtaggaa tttatggttt ggccataatg gcctagcttg 10800

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aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc 10920

acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 10980

cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct 11040

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tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 11160

gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 11220

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ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 11340

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ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 11520

cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 11580

attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 11640

ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 11700

aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 11760

gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 11820

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taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 12000

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gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 12360

gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 12420

gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 12480

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caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 12840

ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 12900

gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 12960

cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 13020

aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc 13080

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gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac 13260

cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg 13320

gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg 13380

gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga attg 13434

<210> 15

<211> 12759

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180

agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

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gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660

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atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840

actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900

caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg gaattcacca tgggttctca 960

agtttctact caaagatccg gttctcacga aaactctaat tctgcttctg agggttctac 1020

tattaactac actactatta attactacaa ggatgcttac gctgcttctg ctggtagaca 1080

agatatgtct caagatccaa agaagtttac tgatccagtt atggatgtta tgcatgaaat 1140

ggctccacct ttgaaatctc catctgctga ggcttgtggt tactctgata gagttgctca 1200

attgactatc ggtaactcta ctatcactac tcaagaagct gctaatattg ttattgctta 1260

cggtgaatgg ccagagtatt gtcctgatac tgatgctact gctgttgata agccaactag 1320

acctgatgtt tctgttaaca gatttttcac tttggatact aagtcttggg ctaaggattc 1380

taaaggttgg tactggaaat tcccagatgt tttgactgag gttggtgttt ttggtcaaaa 1440

cgctcaattc cactacttgt atagatccgg tttttgtgtt cacgttcaat gtaatgcttc 1500

taaattccat caaggtgctt tgttggttgc tgttttgcct gaatatgttt tgggtactat 1560

tgctggtggt actggtaacg aaaactctca cccaccttac gctactactc aaccaggtca 1620

agttggtgct gttttgactc atccatatgt tttggatgct ggtattcctt tgtctcaatt 1680

gactgtttgt ccacaccaat ggattaactt gagaactaac aactgtgcta ctatcatcgt 1740

tccatacatg aacactgttc ctttcgattc tgctttgaac cattgtaact tcggtttgtt 1800

ggttattcca gttgttcctt tggattttaa cactggtgct acttctgaaa tcccaatcac 1860

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tagttatgtc acgcttacat tcacgccctc ctcccacatc cgctctaacc gaaaaggaag 2040

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taacttgttg gagatttgta gagttgaaac tatcttggag gttaacaatt tgaagactaa 3360

cgaaactact ccaatgcaaa gattgtgttt tcctgtttct gttcaatcta aaactggaga 3420

gttgtgtgct gctttcagag ctgatccagg tagagatggt ccttggcaat ctactatttt 3480

gggtcaattg tgtagatact atactcaatg gtctggttct ttggaagtta cttttatgtt 3540

cgctggttct tttatggcta ctggtaaaat gttgattgct tacactccac ctggtggttc 3600

tgttcctgct gatagaatta ctgctatgtt gggtactcac gttatttggg attttggttt 3660

gcaatcttct gttactttgg ttgttccatg gatttctaac actcattaca gagctcacgc 3720

tagagctggt tatttcgatt actatactac tggtatcatc actatctggt atcaaactaa 3780

ctacgttgtt ccaatcggtg ctcctactac tgcttatatt gttgctttgg ctgctgctca 3840

agataacttc actatgaagt tgtgtaagga tactgaagat attgagcaaa ctgctaatat 3900

tcaataatga ggtaccggcc ggccatttaa atacaggccc cttttccttt gtcgatatca 3960

tgtaattagt tatgtcacgc ttacattcac gccctcctcc cacatccgct ctaaccgaaa 4020

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agtattaaga acgttattta tatttcaaat ttttcttttt tttctgtaca aacgcgtgta 4140

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catcgaaaaa ccagcccagt tattgggctt gattggagct cgctcattcc aattccttct 4440

attaggctac taacaccatg actttattag cctgtctatc ctggcccccc tggcgaggtt 4500

catgtttgtt tatttccgaa tgcaacaagc tccgcattac acccgaacat cactccagat 4560

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ggtgggaata ctgctgatag cctaacgttc atgatcaaaa tttaactgtt ctaaccccta 4980

cttgacagca atatataaac agaaggaagc tgccctgtct taaacctttt tttttatcat 5040

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catgggagat ccaatcgctg atatgatcga tcaaactgtt aacaaccaag ttaacagatc 5220

cttgactgct atgcaagttt tgcctactgc tgctaatact gaagcttctt ctcatagatt 5280

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tactcaaaac actgatggtt acgttaattg ggatattgat ttgatgggtt atgctcaatt 5520

gagaagaaag tgtgaattgt ttacttacat gagattcgat gctgagttta ctttcgttgt 5580

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tactgagaag tctccacact ctatcacttt gagagtttac atgagaatta aacatgttag 5940

agcttggatt ccaagacctt tgagaaacca accatacttg tttaagacta accctaacta 6000

caagggtaac gatatcaagt gtacttctac ttctagagat aaaattacta ctttgtaatg 6060

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gtagagattg agcatgtcaa cacagatgct ctaaagagag ttcaagacag aactggaatc 6660

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aaaggttgcg atattttaaa acagtttggt gttccattcg aagttactat tgtctctgct 7680

catagaacac cacagagaat gaccagatat gcctttgaag ccgctagtag aggtatcaag 7740

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tcatctggct tatatcaagc ttaccaacag ttcagaaact cccagtccaa gtttcttgct 8700

tgaaagtgcg aagaatggtg acaccgttga caggtacacc tttatgggac attcccccag 8760

aaaaataatc aagactgggc ctttagaggg tgctgaagtt gaccccttgg tgcttctgga 8820

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catgttctat attgactatc tagacttcca agttgttggt gcttcacctg aattactagt 9420

taaatccgac aacaacaaca aaatcatcac acatcctatt gctggaactc ttcccagagg 9480

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caccagtacc acggttgatc gtttattgac tgtggagaga ttttctcatg tgatgcatct 9660

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cgataggttg gccagagacg agaatcaaag tgaatccgaa gaaaacgatc aatgaacgga 10080

ggacgtaagt aggaatttat ggtttggcca taatggccta gcttggcgta atcatggtca 10140

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taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 11340

ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 11400

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agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 12000

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cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt 12720

tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgaattg 12759

<210> 16

<211> 12609

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180

agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420

gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

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actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900

caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg gaattcacca tgggttctca 960

agtttctact caaagatccg gttctcacga aaactctaat tctgcttctg agggttctac 1020

tattaactac actactatta attactacaa ggatgcttac gctgcttctg ctggtagaca 1080

agatatgtct caagatccaa agaagtttac tgatccagtt atggatgtta tgcatgaaat 1140

ggctccacct ttgaaatctc catctgctga ggcttgtggt tactctgata gagttgctca 1200

attgactatc ggtaactcta ctatcactac tcaagaagct gctaatattg ttattgctta 1260

cggtgaatgg ccagagtatt gtcctgatac tgatgctact gctgttgata agccaactag 1320

acctgatgtt tctgttaaca gatttttcac tttggatact aagtcttggg ctaaggattc 1380

taaaggttgg tactggaaat tcccagatgt tttgactgag gttggtgttt ttggtcaaaa 1440

cgctcaattc cactacttgt atagatccgg tttttgtgtt cacgttcaat gtaatgcttc 1500

taaattccat caaggtgctt tgttggttgc tgttttgcct gaatatgttt tgggtactat 1560

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tccatacatg aacactgttc ctttcgattc tgctttgaac cattgtaact tcggtttgtt 1800

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tagttatgtc acgcttacat tcacgccctc ctcccacatc cgctctaacc gaaaaggaag 2040

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taacttgttg gagatttgta gagttgaaac tatcttggag gttaacaatt tgaagactaa 3360

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gggtcaattg tgtagatact atactcaatg gtctggttct ttggaagtta cttttatgtt 3540

cgctggttct tttatggcta ctggtaaaat gttgattgct tacactccac ctggtggttc 3600

tgttcctgct gatagaatta ctgctatgtt gggtactcac gttatttggg attttggttt 3660

gcaatcttct gttactttgg ttgttccatg gatttctaac actcattaca gagctcacgc 3720

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ctacgttgtt ccaatcggtg ctcctactac tgcttatatt gttgctttgg ctgctgctca 3840

agataacttc actatgaagt tgtgtaagga tactgaagat attgagcaaa ctgctaatat 3900

tcaataatga ggtaccggcc ggccatttaa atacaggccc cttttccttt gtcgatatca 3960

tgtaattagt tatgtcacgc ttacattcac gccctcctcc cacatccgct ctaaccgaaa 4020

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agtattaaga acgttattta tatttcaaat ttttcttttt tttctgtaca aacgcgtgta 4140

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cttgacagca atatataaac agaaggaagc tgccctgtct taaacctttt tttttatcat 5040

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tactttcggt gaacatttgc aagctaatga tttggattat ggtcaatgtc caaacaatat 5700

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tgctgaagtt gaccccttgg tgcttctgga aaaagaactg aagggcacca gacaagcgca 8700

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<210> 19

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctgtatttaa atggccggcc ggtacctcat tattgcttaa cagcttgtct c 51

<210> 20

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat gggtattcca actgaattg 49

<210> 21

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cctgtattta aatggccggc cggtacctca ttattgaata ttagcagttt gct 53

<210> 22

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat gggagatcca atcgctgata tg 52

<210> 23

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cctgtattta aatggccggc cggtacctca ttacaaagta gtaattttat ctc 53

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aacaactaat tattcgaaac ggaattcacc atggagactg gtgcttcttc 50

<210> 25

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aacaactaat tattcgaaac ggaattcacc atgcactcta ctcaagagac 50

Claims (18)

1.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包括编码柯萨奇病毒A16的VP0、VP1和VP3衣壳蛋白的核苷酸，所述多核苷酸不包括RBS序列和编码柯萨奇病毒A16其他衣壳蛋白的核苷酸。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸中编码柯萨奇病毒A16的VP0、VP1和VP3衣壳蛋白的核苷酸的排列顺序为：VP0-VP3-VP1。

3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸中各核苷酸的排列顺序为：启动子-VP0-终止子-启动子-VP3-终止子-启动子-VP1-终止子。

4.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，还包括以下中的任一项或多项：

1)所述编码柯萨奇病毒A16的VP0衣壳蛋白的核苷酸为VP0全长核苷酸序列或截短的核苷酸；

2)所述编码柯萨奇病毒A16的VP1衣壳蛋白的核苷酸为VP1全长核苷酸序列或截短的核苷酸；

3)所述编码柯萨奇病毒A16的VP3衣壳蛋白的核苷酸为VP3衣壳蛋白的全长核苷酸序列或截短的核苷酸序列。

5.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码的柯萨奇病毒A16的VP1衣壳蛋白为截短45-75个氨基酸的VP1衣壳蛋白。

6.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，还包括以下中的一项或几项：

1)编码柯萨奇病毒A16的VP0衣壳蛋白的核苷酸的序列如SEQ ID NO:8所示；

2)编码柯萨奇病毒A16的VP1衣壳蛋白的核苷酸的序列如SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示；

3)编码柯萨奇病毒A16的VP3衣壳蛋白的核苷酸的序列如SEQ ID NO:9所示。

7.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，还包括以下中的一项或几项：

1)所述编码柯萨奇病毒A16的VP0衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的VP0衣壳蛋白；

2)所述编码柯萨奇病毒A16的VP3衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的VP3衣壳蛋白；

3)所述编码柯萨奇病毒A16的VP1衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的VP1衣壳蛋白。

8.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:2所示。

9.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包括权利要求1-8任一所述的多核苷酸。

10.根据权利要求9所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体的表达载体为酵母表达载体。

11.根据权利要求9所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示。

12.一种细胞系，其特征在于，所述细胞系中包括权利要求9-11任一所述的核酸构建体，或基因组中整合有权利要求1-8任一所述的多核苷酸。

13.根据权利要求12所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系为毕赤酵母细胞系。

14.一种重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒，其特征在于，所述重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒包括VP0、VP1和VP3衣壳蛋白，不包括柯萨奇病毒A16其他衣壳蛋白。

15.根据权利要求14所述的重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒，其特征在于，所述重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒由权利要求12或13所述的细胞系产生。

16.权利要求14或15所述的重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒在制备预防手足口病产品中的用途。

17.一种用于预防手足口病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求14或15所述的重组柯萨奇病毒A16病毒样颗粒和药学上可接受的载体。

18.根据权利要求17所述的药物组合物，所述药物组合物为疫苗组合物。

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