CN111303303A - 诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白、表达载体、制备方法、VLPs及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白、表达载体、制备方法、VLPs及应用,该诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白,所述外源肽段为5‑24个氨基酸长度的多肽,外源肽段融合在VP1蛋白的N端。该诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白可自组装成大小均一的诺如病毒的VLPs。
Description
技术领域
本发明属于诺如病毒VP1蛋白技术领域,具体涉及一种诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白、表达载体、制备方法、VLPs及应用。
背景技术
诺如病毒(Noroviruses, NoVs)是引起急性非细菌性腹泻的主要病毒体,可以感染各年龄段人群[Ahmed S, Hall A, Robinson A, Verhoef L, Premkumar P, ParasharU, et al. Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: asystematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis. 2014;14(8):725-30]。世界范围内约50%的病毒性腹泻病例是由NoVs引起。在美国,NoVs每年引起超过2100万感染病例,导致约800人死亡[AJ H, BA L, DC P, MM P, PA G, J V, et al. Norovirusdisease in the United States. Emerging infectious diseases. 2013;19(8):1198-205]。在中国,NoVs仅次于轮状病毒,引起的病毒性腹泻病例数占比约10-20%[ J Y, H J,S L, W X, M L, J W, et al. Etiology of diarrhea among children under the agefive in China: Results from a five-year surveillance. The Journal ofinfection. 2015;71(1):19-27]。NoVs属于杯状病毒科,诺如病毒属单正链RNA病毒,5′端有共价结合的病毒编码蛋白(virus coded protein, VPg),3′端有多聚A尾巴,基因组全长7.5-7.7kb。人NoVs基因组含有三个开放阅读框(open reading frame, ORF),从5′端非编码区到3′端非编码区分别为ORF1、2和3。ORF1和ORF2有十几个碱基的重叠, ORF2和ORF3有一个碱基的重叠。ORF1编码一个非结构蛋白前体,在翻译时或者翻译后被3C-样蛋白酶(3CLpro)依次切割为p48、NTPase、p22、VPg、3CLpro和RNA依赖性RNA聚合酶(RNA dependentRNA polymerase,RdRp or Pol) (N端到C端)。ORF2编码主要衣壳蛋白(major capsidprotein, VP1),氨基酸数目530-555不等,分子量在58-60kDa之间。利用重组杆状病毒表达系统以及其它真核或原核表达系统表达的VP1蛋白可以在胞内自组装成形态和免疫原性与野毒株相似的病毒样颗粒(virus like particles, VLPs)[Jiang X, Wang M, Graham D,Estes M. Expression, self-assembly, and antigenicity of the Norwalk viruscapsid protein. J Virol. 1992;66(11):6527-32][ Huo Y, Wan X, Ling T, Wu J,Wang W, Shen S. Expression and purification of norovirus virus like particlesin Escherichia coli and their immunogenicity in mice. Mol Immunol. 2018;93:278-84]。ORF3编码次要衣壳蛋白(minor capsid protein, VP2),其功能目前尚不清楚,但研究表明与VP1共表达后它可以增强组装VLPs的稳定性,以及提高VP1的表达量[Bertolotti-Ciarlet A, Crawford S, Hutson A, Estes M. The 3' end of Norwalkvirus mRNA contains determinants that regulate the expression and stabilityof the viral capsid protein VP1: a novel function for the VP2 protein. JVirol. 2003;77(21):11603-15]。VP2蛋白具有较多的碱性氨基酸,可能在基因组包装过程中起重要作用。
根据VP1氨基酸序列的不同可以将NoVs分为至少7种不同的基因组(genogroup,GI-GVII), 每种基因组又可以继续分为多种不同的基因型(gneotype)[Vinjé J.Advances in laboratory methods for detection and typing of norovirus. J ClinMicrobiol. 2015;53(2):373-81]。感染人类的大部分分离株属于GI和GII[Vinjé J.Advances in laboratory methods for detection and typing of norovirus. J ClinMicrobiol. 2015;53(2):373-81],其中GII.4是目前的主要流行株,引起了约80%的感染病例。虽然近年来NoVs研究取得了显著的进展,如发现肠道细菌可以促进NoVs感染B细胞,鼠源性NoV蛋白受体的发现以及体外NoVs培养方法的建立等等,但NoVs的基因和抗原多样性仍然给疫苗和药物研发带来了巨大挑战[MK J, M W, S Z, CL G, LR K, KR G, et al.Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells.Science (New York, NY). 2014;346(6210):755-9][ RC O, CB W, JG D, MT B, BT M,YC L, et al. Discovery of a proteinaceous cellular receptor for a norovirus.Science (New York, NY). 2016;353(6302):933-6][ Jones M, Grau K, Costantini V,Kolawole A, de Graaf M, Freiden P, et al. Human norovirus culture in B cells.Nat Protoc. 2015;10(12):1939-47]。这主要是因为根据现有的临床研究数据,不同型别的NoVs免疫之后不具有交叉保护作用,且NoVs变异较快,这就要求研发疫苗需要涵盖尽可能多的不同亚型流行株,并根据流行情况实时更新加入新的变异株,这和流感病毒相似。考虑到NoVs感染的自限性和严重程度,高成本对NoVs疫苗研发可能不利。此外,目前还不能体外对NoVs进行高滴度培养,无法有效的进行体外药物筛选试验和药物有效性验证试验。在细胞水平上也还没有发现人NoVs特异性的蛋白受体,目前公认的人组织血型抗原(histo-blood group antigens, HBGAs)被认为是NoVs的受体或共受体。
结构生物学是一种通过物理学方法研究生物大分子结构的一门学科,已经成为当前生命科学的前沿和带头学科。从电子显微镜到冷冻电子显微镜,再到X-射线晶体衍射技术,人们对物质的结构解析也从大分子发展到了原子水平。1994年研究者初次报道了通过冷冻电镜技术三维重建的诺瓦克病毒(GI.1)VLPs结构[Prasad B, Rothnagel R, JiangX, Estes M. Three-dimensional structure of baculovirus-expressed Norwalkvirus capsids. J Virol. 1994;68(8):5117-25]。随后1999年研究者报道了通过X-射线晶体衍射技术解析的诺瓦克病毒VLPs结构,让我们更为详细的看到了VP1蛋白在VLPs中的构象[Prasad B, Hardy M, Dokland T, Bella J, Rossmann M, Estes M. X-raycrystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science. 1999;286(5438):287-90]。该结构解析大大促进了后续功能研究和疫苗研究,如将VP1蛋白分为相互独立的shell domain(壳区,S)和Protruding domain (突环区,P) 促进了对P区功能的研究[M T, P F, T C, M X, P H, Z F, et al. Noroviral P particle: structure,function and applications in virus-host interaction. Virology. 2008;382(1):115-23]。近来研究者还通过X-射线晶体衍射技术把结合有HBGAs的P颗粒进行了结构解析,发现来源于不同基因组的NoVs在结合HBGAs上具有空间结构保守性[W B, A M, M T, M X,X J, RS H. Structural basis for the receptor binding specificity of Norwalkvirus. Journal of virology. 2008;82(11):5340-7][ Cao S, Lou Z, Tan M, Chen Y,Liu Y, Zhang Z, et al. Structural basis for the recognition of blood grouptrisaccharides by norovirus. J Virol. 2007;81(11):5949-57][ M T, M X, S C, PH, T F, J M, et al. Elucidation of strain-specific interaction of a GII-4norovirus with HBGA receptors by site-directed mutagenesis study. Virology.2008;379(2):324-34]。这些研究结果对于探索NoVs进化和制定相应的预防和治疗策略都具有重要的意义,如针对保守的HBGAs结合位点的特异性药物和抗体设计研发,理论上这些设计的药物或抗体具有广谱抗病毒活性。
蛋白质结构解析之前首先需要获取蛋白结晶,而蛋白晶体制备已经成为众多蛋白质结构解析的瓶颈。蛋白质均一性是获取蛋白质晶体的一个重要前提,只有形态均一的蛋白质单体才能规则排列,生长高质量的晶体。目前只通过X射线晶体衍射技术对GI.1 NoVVLPs进行了结构解析,尚未看到关于通过该技术对其它型别来源的VLPs进行解析的报道,其主要原因即源于晶体制备困难,而这其中的首要问题即是VLPs均一性问题。VP1蛋白表达后在细胞内可自组装成VLPs,但颗粒大小不一(21-38 nm), 批间差异大,具体原因尚不清楚[LJ W, ME H, MK E. Biochemical characterization of a smaller form ofrecombinant Norwalk virus capsids assembled in insect cells. Journal ofvirology. 1997;71(10):8066-72]。多种不同的表达系统表达的VP1在N段经常会被酶切,且被酶切和未被酶切的VP1均等的出现在大颗粒和小颗粒中[Huo Y, Wan X, Ling T,Shen S. Biological and immunological characterization of norovirus majorcapsid proteins from three different genotypes. Microb Pathog. 2016;90:78-83]。研究发现将VP1蛋白N段的38个氨基酸删除后的截短VP1蛋白表达后形成了均一的小颗粒,直径约21nm,其与HBGAs结合特征与全长VP1蛋白组装的VLPs相似[Huo Y, Wan X, WangZ, Meng S, Shen S. Production of Norovirus VLPs to size homogeneity. VirusRes. 2015;204:1-5]。基于P区组装的P颗粒与HBGAs结合特征与全长VP1蛋白组装的VLPs也具有相似性。但以上两种颗粒都与真病毒颗粒大小相差甚远,且发现P颗粒在与HBGAs结合上与VLPs相比存在不一致情况。基于这些亚颗粒的晶体结构解析存在与真实情况不一致的风险。此外,均一性对于基于VLPs的疫苗来说也非常重要,因为首先大小不一致的VLPs可能诱导的免疫应答程度不同;其次,组装的VLPs不均一不利于后续的抗原含量测定。
利用重组杆状病毒表达系统表达的 NoV VP1可以自组装成VLPs,其大小,形态和真病毒相似。在酵母、细菌、植物和哺乳类动物细胞也可成功获得诺如病毒病毒样颗粒。但上述表达系统表达的全长VP1蛋白都不可避免的存在N末端被酶切的情况,且表达的VLPs存在大小两种不同的VLPs。N末端酶切的存在可能影响后续对VP1蛋白生物功能的鉴定,比如VLPs-受体结合实验、VLPs结构解析、VP1蛋白N端结构分析及功能分析。两种大小不同的VLPs并存,且比例批间差异大不利于后续疫苗浓度测定、质量分析和免疫原性比较等等。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白,该诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白可自组装成大小均一的诺如病毒的VLPs。
本发明的第二个目的是提供一种诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白的表达载体。
本发明的第三个目的是提供一种诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白的制备方法。
本发明的第四个目的是提供一种诺如病毒的VLPs。
本发明的第五个目的是提供一种诺如病毒的VLPs在诺如病毒疫苗中的应用。
为了实现以上目的,本发明采取的技术方案为:
诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白,所述外源肽段为5-24个氨基酸长度的多肽,外源肽段融合在VP1蛋白的N端。
进一步地,所述外源肽段为7-15个氨基酸长度的多肽。
进一步地,所述多肽序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ IDNO.4所示的多肽序列。
用于表达上述诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白的表达载体。
上述表达载体的构建方法,包括以下步骤:将上述多肽的编码序列连接到诺如病毒VP1的编码序列5′端进行全合成,合成的融合基因5′端和3′端分别带有SacI和NotI酶切位点,将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast-Bac Dual载体的polyhedrin启动子下游,制备得到质粒pFBD-VP1。
上述诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白的制备方法,构建载有上述诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白序列的质粒,用载有上述诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白序列的质粒制备重组杆状病毒,将制备的重组杆状病毒的质粒转染细胞,转染的细胞为防止融合有外源肽段的VP1蛋白N端出现酶切的细胞,收获细胞,即得。
也可以采用其他真核或原核系统制备上述诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白。如采用基于真核表达载体pcDNA3.1的表达系统制备上述诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白。
进一步地,制备所述重组杆状病毒时,用载有上述诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白序列的质粒转化DH10B感受态细胞,筛选阳性克隆,即得重组杆状病毒。
进一步地,所述重组杆状病毒的质粒转染的细胞为Sf9细胞。
诺如病毒的VLPs,由上述诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白自组装而成。
上述诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白在诺如病毒疫苗中的应用。
本发明的有益效果:
本发明的诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白,可自组装成大小均一的诺如病毒的VLPs。
本发明的诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白的表达载体,可表达融合有外源肽段的VP1蛋白。
本发明的诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白的制备方法,通过制备重组杆状病毒质粒,并转染防止融合有外源肽段的VP1蛋白N端出现酶切的细胞,可防止融合有外源肽段的VP1蛋白N端出现酶切,保证外源肽段连接的稳定性。
本发明的诺如病毒的VLPs,颗粒大小均一,对于基于VLPs的疫苗来说,诱导的免疫应答程度接近,同时也便于后续的抗原含量测定。
附图说明
图1为实施例1中纯化蛋白的SDS-PAGE结果;
图2为实施例1中VLPs电子显微镜测试结果;
图3为实施例2中纯化蛋白的SDS-PAGE结果;
图4为实施例2中VLPs电子显微镜测试结果;
图5为实施例3中纯化蛋白的SDS-PAGE结果;
图6为实施例3中VLPs电子显微镜测试结果;
图7为实施例4中纯化蛋白的SDS-PAGE结果;
图8为实施例4中VLPs电子显微镜测试结果;
图9为实施例5中纯化蛋白的SDS-PAGE结果;
图10为实施例5中VLPs电子显微镜测试结果;
图11为实施例6中纯化蛋白的SDS-PAGE结果;
图12为实施例6中VLPs电子显微镜测试结果;
图13为实施例7中纯化蛋白的SDS-PAGE结果;
图14为实施例7中VLPs电子显微镜测试结果;
图15为实施例8中纯化蛋白的SDS-PAGE结果;
图16为实施例8中VLPs电子显微镜测试结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例以及附图对本发明作进一步说明。
实施例1
1、材料
本发明实例中所用含有GII.4 VP1基因编码序列的载体为自行保存(GenBank登录号为KF306214);pFast-Bac Dual载体和DH10B感受态细胞购买于Invitrogen公司;Sf9细胞为自行保存,无血清培养基购自于苏州市沃美生物技术有限公司。
2、基因合成、载体构建和重组杆状病毒制备
根据昆虫细胞(S. frugiperda)密码子使用频率将SEQ ID NO.1所示的多肽序列进行密码子优化。将优化后的序列连接到GII.4 VP1的编码序列5′端进行全合成,同时合成的融合基因5′端和3′端分别带有SacI和NotI酶切位点。将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast-Bac Dual载体的polyhedrin启动子下游。制备的质粒命名为pFBD-VP1。用pFBD-VP1转化DH10B感受态细胞,筛选阳性克隆,制备重组质粒。将制备的重组质粒转染Sf9细胞,5-7天后收获细胞培养上清,保存毒种。
3、蛋白表达、纯化和鉴定
为了获取大量蛋白,将收获的含有重组杆状病毒的上清感染摇瓶中培养的高密度Sf9细胞,感染5-7天后收获细胞。通过氯化铯(celsium chloride, CsCl)密度梯度离心纯化目的蛋白。具体步骤如下:将收集的培养上清在4℃下以10,000×g离心30分钟去除细胞碎片,在上清中加入终浓度为7%(w/v)的聚乙二醇6000(PEG 6000)和2%(w/v)的氯化钠,4℃摇床上孵育过夜。将上清4℃下10,000×g离心30分钟收集沉淀的蛋白,用PBS重悬。将重悬的蛋白与等体积的CsCl(1.6 g /ml)混合,4℃下288,000×g离心18-24小时。利用注射器从离心管上方收集蛋白条带,PBS稀释到适当浓度后,4℃下141,000×g离心3小时去除CsCl。用0.22 µm滤膜滤过的PBS重悬沉淀,使用NanoDrop 2000测定蛋白浓度, 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定纯化蛋白的完整性和纯度。测试结果如图1所示。
图1可以看出,纯化的GII.4 VP1蛋白在电泳图上显示为单一条带,分子量大小在50-60kDa之间,与理论分子量(60kDa)大小相近。
1.4 形态观察
将纯化的蛋白稀释到200-400 μg/ml后吸附于铜网,然后采用磷钨酸进行负染,负染后电子显微镜观察VLPs大小形态和均一性情况。具体步骤为将纯化的稀释到合适浓度范围的蛋白滴、磷钨酸和超纯水分别加到干净的塑料薄膜上(50µl),用镊子取出铜网将涂有碳支持膜的一面向下覆盖到含有蛋白的液滴上,室温孵育5分钟。用镊子夹起铜网后用干净的滤纸轻轻吸净多余的水分。将铜网转移到磷钨酸液滴上室温孵育5分钟。然后将铜网转移到超纯水液滴上洗涤2-3次,每次用干净的滤纸轻轻吸净多余的水分。最后将铜网置于超净工作台中晾干后,电子显微镜下观察。结果如图2所示。
由图2可以看出,表达的N端含有多肽序列的GII.4 VP1蛋白组装的VLPs大小均一。
实施例2
1、材料
本发明实例中所用含有GII.6 VP1基因编码序列的载体为自行保存(GenBank登录号为KU935739);pFast-Bac Dual载体和DH10B感受态细胞购买于Invitrogen公司;Sf9细胞为自行保存,无血清培养基购自于苏州市沃美生物技术有限公司。
2、基因合成、载体构建和重组杆状病毒制备
方法和多肽序列同实例1中一致。
3、蛋白表达、纯化和鉴定
方法同实施例1一致。SDS-PAGE结果如图3所示。
由图3可以看出,纯化的N端含有多肽序列的GII.6 VP1蛋白在电泳图上显示为一深色条带,分子量大小在60kDa附近,与理论分子量(61kDa)大小相近。
4、形态观察
方法同实施例1一致。电子显微镜观察结果如图4所示。
由图4可以看出,表达的N端含有多肽序列的GII.6 VP1蛋白组装的VLPs大小均一。
实施例3
1、材料
本发明实例中所用含有GII.6 VP1基因编码序列的载体为自行保存(GenBank登录号为KU935739);pFast-Bac Dual载体和DH10B感受态细胞购买于Invitrogen公司;Sf9细胞为自行保存,无血清培养基购自于苏州市沃美生物技术有限公司。
2、基因合成、载体构建和重组杆状病毒制备
方法同实施例1中所述。其中将N端连接的多肽序列替换为SEQ ID NO.2所示的多肽序列。
3、蛋白表达、纯化和鉴定
方法同实施例1一致。SDS-PAGE结果如图5所示。
由图5可以看出,纯化的N端含有外源多肽序列的GII.6 VP1蛋白在电泳图上显示为一深色条带,分子量大小在60kDa附近,与理论分子量(61kDa)大小相近。
4、形态观察
方法同实施例1一致。电子显微镜观察结果如图6所示。
由图6可以看出,表达的N端含有外源多肽序列的GII.6 VP1蛋白组装的VLPs大小均一。
实施例4
1、材料
本发明实例中所用的含有GII.6 VP1基因编码序列的载体为自行保存(GenBank登录号为KU935739);pFast-Bac Dual载体和DH10B感受态细胞购买于Invitrogen公司;Sf9细胞为自行保存,无血清培养基购自于苏州市沃美生物技术有限公司。
2、 基因合成、载体构建和重组杆状病毒制备
方法同实施例1中所述。其中将N端连接的多肽序列替换为SEQ ID NO.3所示的多肽序列,相当于在VP1蛋白N端起始密码子甲硫氨酸(M)前面引入七个氨基酸。
3、蛋白表达、纯化和鉴定
方法同实施例1。SDS-PAGE结果如图7所示。
由图7可以看出,纯化的N端含有SEQ ID NO.3所示的多肽序列的GII.6 VP1蛋白在电泳图上显示为单一条带,分子量大小在60kD附近。
4、形态观察
方法同实施例1。电子显微镜观察结果如图8所示。
由图8可以看出,表达的N端含有SEQ ID NO.3所示的多肽序列的GII.6 VP1蛋白组装的VLPs大小均一。
实施例5
1、材料
本发明实例中所用的含有GII.6 VP1基因编码序列的载体为自行保存(GenBank登录号为KU935739);pFast-Bac Dual载体和DH10B感受态细胞购买于Invitrogen公司;Sf9细胞为自行保存,无血清培养基购自于苏州市沃美生物技术有限公司。
2、基因合成、载体构建和重组杆状病毒制备
方法同实施例1中所述。其中将N端连接的多肽序列替换为SEQ ID NO.4所示的多肽序列,相当于在VP1蛋白N端起始密码子甲硫氨酸(M)前面引入15个氨基酸。
3、蛋白表达、纯化和鉴定
方法同实施例1。SDS-PAGE结果如图9所示。
由图9可以看出,纯化的N端含有SEQ ID NO.4所示的多肽序列的GII.6 VP1蛋白在电泳图上显示为单一条带,分子量大小在60kD附近。
4、形态观察
方法同实施例1。电子显微镜观察结果如图10所示。
由图10可以看出,表达的N端含有SEQ ID NO.4所示的多肽序列的GII.6 VP1蛋白组装的VLPs大小均一。
实施例6
1、材料和方法
本发明实例中所用的含有GII.4 VP1基因编码序列的载体为自行保存(GenBank登录号为KF306214);pFast-Bac Dual载体和DH10B感受态细胞购买于Invitrogen公司;Sf9细胞为自行保存,无血清培养基购自于苏州市沃美生物技术有限公司。
2、基因合成、载体构建和重组杆状病毒制备
方法同实施例1中所述。其中将N端连接的多肽序列替换为SEQ ID NO.5所示的多肽序列,相当于在VP1蛋白N端起始密码子甲硫氨酸(M)后面引入四个氨基酸GSSG。
3、蛋白表达、纯化和鉴定
方法同实施例1。SDS-PAGE结果如图11所示。
由图11可以看出,纯化的N端含有如SEQ ID NO.5所示的多肽序列的GII.4 VP1蛋白在电泳图上显示为两个条带,分子量大小在55-75之间。
4、形态观察
方法同实施例1。电子显微镜观察结果如图12所示。
由图12可以看出,表达的N端含有SEQ ID NO.5所示的多肽序列的GII.4 VP1蛋白组装的VLPs大小不均一。
实施例7
1、材料和方法
本发明实例中所用的含有GII.4 VP1基因编码序列的载体为自行保存(GenBank登录号为KF306214);pFast-Bac Dual载体和DH10B感受态细胞购买于Invitrogen公司;Sf9细胞为自行保存,无血清培养基购自于苏州市沃美生物技术有限公司。
2、基因合成、载体构建和重组杆状病毒制备
方法同实施例1中所述。其中将N端连接的多肽序列替换为来源于GII.4 VP2 蛋白来源的SEQ ID NO.6所示的多肽序列,相当于在VP1蛋白N端起始密码子甲硫氨酸(M)前面引入25个氨基酸。
3、蛋白表达、纯化和鉴定
方法同实施例1。SDS-PAGE结果如图13所示。
由图13可以看出,纯化的N端含有SEQ ID NO.6所示的多肽序列的GII.4 VP1蛋白在电泳图上显示为两个条带,分子量大小在50-60kD之间。
4、形态观察
方法同实施例1。电子显微镜观察结果如图14所示。
由图14可以看出,表达的N端含有SEQ ID NO.6所示的多肽序列的GII.4VP1蛋白组装的VLPs大小不均一。
实施例8
1、材料
本发明实例中所用含有GII.4 VP1基因编码序列的载体为自行保存(GenBank登录号为KU935739);pFast-Bac Dual载体和DH10B感受态细胞购买于Invitrogen公司;TN5细胞为自行保存,无血清培养基购自于苏州市沃美生物技术有限公司。
2、基因合成、载体构建和重组杆状病毒制备
方法和多肽序列与实施例1一致。
3、蛋白表达、纯化和鉴定
方法同实施例1一致。SDS-PAGE结果如图15所示。
由图15可以看出,通过TN5细胞表达的蛋白经纯化后在电泳图上显示为两条带,分子量大小在50-75kDa之间,与理论分子量(60kDa)大小相近。
4、形态观察
方法同实施例1一致。电子显微镜观察结果如图16所示。
由图16可以看出,表达的蛋白组装的VLPs大小不均一,表明N端酶切影响其组装VLPs的均一性。
由实施例1-8可见:
实施例1表明在诺如病毒的VP1蛋白的N端添加11个氨基酸长度的多肽后,GII.4 VP1蛋白组装成了均一的VLPs。为了确认该多肽序列是否具有广泛通用性,实施例2中把该多肽序列连接到GII.6 NoV VP1 N末端融合表,达发现表达的VP1也组装成了均一的VLPs。
为了确定诺如病毒的VP1蛋白的N端融合的多肽序列是否具有序列特异性,实施例3选择来源于NoV VP2蛋白的序列进行融合表达,发现表达VP1仍然组装成了均一性的VLPs,表明均一性VLPs组装对N末端连入的多肽序列具有一定的耐受性。
为了确定添加不同长度的的多肽对VLPs均一性的影响,实施例4和实施例5在诺如病毒的VP1蛋白的N端分别引入了7和15个氨基酸长度的多肽,发现组装的VLPs大小均一。实施例6和实施例7在诺如病毒的VP1蛋白的N端分别引入了4和25个氨基酸长度的多肽,发现组装的VLPs大小不均一。N端外源片段超过24个氨基酸或小于5个氨基酸后,VLPs均一性消失。说明在在诺如病毒的VP1蛋白的N端分别引入了5-24个氨基酸长度的多肽VLPs大小均一。
实施例8表明通过采用TN5细胞表达实施例1中的GII.4 VP1促使其N末端出现酶切,表达后的融合诺如病毒的VP1蛋白不能组装成大小均一的VLPs,表明完整的诺如病毒的VP1蛋白是组装成均一性VLPs的充分条件。
综上所述,我们找到了一种利用,但不局限于重组杆状病毒表达系统制备均一性NoV VLPs的方法。该方法不仅可以用于诺如病毒疫苗制备,也可以用于诺如病毒基础研究。
序列表
<110> 郑州市第六人民医院
<120> 诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白、表达载体、制备方法、VLPs及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Asn His Lys Val His Met Gly Ser Ser Gly
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ser Ser Ser Ser Arg Thr Thr Ser Ser Ser
1 5 10
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Asn His Lys Val His Met
1 5
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Gly Ser Ser Gly Asn His Lys Val His Met Gly Ser Ser Gly
1 5 10 15
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Ser Ser Gly
1
<210> 6
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Gly Ser Ser Ser Lys Ser Ser Asn Ser Ser Thr Ala Thr Ser Val
1 5 10 15
Tyr Ser Asn Gln Thr Thr Ser Thr Arg
20 25
Claims (10)
1.诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白,其特征在于,所述外源肽段为5-24个氨基酸长度的多肽,外源肽段融合在VP1蛋白的N端。
2.根据权利要求1所述的诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白,其特征在于,所述外源肽段为7-15个氨基酸长度的多肽。
3.根据权利要求1所述的诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白,其特征在于,所述多肽序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的多肽序列。
4.用于表达如权利要求1所述的诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白的表达载体。
5.如权利要求4所述的表达载体的构建方法,其特征在于,包括以下步骤:将权利要求1所述的多肽的编码序列连接到诺如病毒VP1的编码序列5′端进行全合成,合成的融合基因5′端和3′端分别带有SacI和NotI酶切位点,将合成的带有酶切位点的基因酶切后连接到已经预先酶切的pFast-Bac Dual载体的polyhedrin启动子下游,制备得到质粒pFBD-VP1。
6.如权利要求1所述的诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白的制备方法,其特征在于,构建载有权利要求1所述的诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白序列的质粒,用载有权利要求1所述的诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白序列的质粒制备重组杆状病毒,将制备的重组杆状病毒的质粒转染细胞,转染的细胞为防止融合有外源肽段的VP1蛋白N端出现酶切的细胞,收获细胞,即得。
7.根据权利要求6所述的诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白的制备方法,其特征在于,制备所述重组杆状病毒时,用载有权利要求1所述的诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白序列的质粒转化DH10B感受态细胞,筛选阳性克隆,即得重组杆状病毒。
8.根据权利要求6所述的诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白的制备方法,其特征在于,所述重组杆状病毒的质粒转染的细胞为Sf9细胞。
9.诺如病毒的VLPs,其特征在于,由权利要求1所述的诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白自组装而成。
10.如权利要求1所述的诺如病毒的融合有外源肽段的VP1蛋白在诺如病毒疫苗中的应用。
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