CN112390863A

CN112390863A - 改造的新冠病毒Spike蛋白胞外结构域及其应用

Info

Publication number: CN112390863A
Application number: CN202011011213.6A
Authority: CN
Inventors: 林钰庭; 林高坤; 接振旺
Original assignee: Shenzhen Magnolia Biotechnology Co ltd; Hope Biological Technology Suzhou Co ltd
Current assignee: Shenzhen Magnolia Biotechnology Co ltd; Hope Biological Technology Suzhou Co ltd
Priority date: 2020-09-23
Filing date: 2020-09-23
Publication date: 2021-02-23
Anticipated expiration: 2040-09-23
Also published as: CN112390863B

Abstract

本发明提供了一种改造的新冠病毒Spike蛋白胞外结构域及其应用。本发明人针对新冠病毒Spike蛋白胞外结构域进行结构设计，获得可作为免疫原免疫个体的多肽结构域。所述多肽结构域经过优化的结构设计，提高了其表达量以及免疫效果。本发明人将所述的多肽结构域命名为HOPE‑V。

Description

改造的新冠病毒Spike蛋白胞外结构域及其应用

技术领域

本发明属于生物技术以及病毒学领域，更具体地，本发明涉及改造的新冠病毒Spike蛋白胞外结构域及其应用。

背景技术

2019新型冠状病毒(2019-nCoV)引起的肺炎，临床表现与病毒性肺炎极为相似；主要临床表现为发热、疲乏、干咳等，严重者可发生休克、脓毒血症、呼吸衰竭而死亡。其具有隐蔽性和高传染性，可导致一部分重症或死亡病理。目前，该病毒引起的肺炎尚缺乏有效的药物，为临床诊治和控制疫情带来极大困难。除了导致人体的疾病，根据世卫组织最新的披露，全球有近10亿人受到不同程度的精神健康问题影响，但是只有少数人能享受高质量的咨询和治疗。

冠状病毒粒子形状并不规则，直径约60-220nm。冠状病毒的核酸为正链单链RNA，其特点是可以以自身为模板，指导合成病毒相关蛋白质。病毒进入宿主细胞后，首先以病毒RNA为模板表达出RNA聚合酶，随后RNA聚合酶完成负链RNA的转录合成、各种结构蛋白mRNA的合成，以及病毒基因组RNA的复制。

冠状病毒具有包膜结构，上面有三种蛋白：刺突糖蛋白(S，Spike Protein)、小包膜糖蛋白(E，Envelope Protein)和膜糖蛋白(M，Membrane Protein)，少数种类还有血凝素糖蛋白(HE蛋白，Haemaglutinin-esterase)。Spike蛋白在识别并结合宿主细胞表面受体，并介导病毒包膜与细胞膜融合的过程中起到关键性作用；M蛋白则参与了病毒包膜的形成与出芽过程；HE蛋白则是构成包膜的短凸起，可能与冠状病毒早期吸附有关，某些冠状病毒的HE蛋白可引起红细胞的凝集以及对红细胞的吸附。S蛋白位于病毒表面，形成棒状结构；N蛋白包裹病毒基因组。

Spike蛋白是一类三聚体跨膜糖蛋白，有着大量糖基化的修饰，其在病毒表面形成特殊的花冠结构。它首先结合细胞表面的受体，然后发生“变形”，顺势将病毒包膜与细胞膜融为一体，从而将病毒内的遗传物质注入细胞，达到感染细胞的目的。Spike蛋白含有两个亚基S1和S2。其中S1主要包含有受体结合区(RBD)，负责识别细胞的受体；S2含有膜融合过程所需的基本元件。Spike蛋白承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能。

目前，人类仍缺乏有效的抗2019-nCoV的疫苗，在这种严峻的形势下，尽快开发安全、有效的针对2019-nCoV的疫苗用以保护易感人群，对于保护人民健康与国家安全具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改造的新冠病毒Spike蛋白胞外结构域及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种经优化改造的多肽，其为选自下组的多肽：

(a)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽；

(b)与(a)所限定的多肽的氨基酸序列有至少90％相同性(较佳地95％以上；更佳地98％以上；更佳99％以上)，且具有(a)所限定的多肽的功能(作为免疫原的功能)的多肽；

(c)将(a)所限定的多肽的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所限定的多肽的功能(作为免疫原的功能)的多肽；或

(d)(a)～(c)任一所述多肽的N或C末端添加标签序列，或在其N末端添加剪切信号后形成的多肽；

所述多肽的N端15～25个(如16、17、18、19、20、21、22、23、24个)氨基酸残基是保守的。

在一个优选例中，(a)中，所述多肽为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽；更佳地为SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种改造新冠病毒Spike蛋白胞外结构域的方法，包括：将Spike蛋白胞外结构域的N端序列改造为：SEQ ID NO:1中第1～19位，SEQ ID NO:2中第1～18位，SEQ ID NO:3中第1～15位，SEQ ID NO:4中第1～20位，SEQ ID NO:5中第1～15位所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，在所述N端序列之后，连接新冠病毒Spike蛋白胞外结构域片段，该片段的具有如SEQ ID NO:1中第20～689位的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码前面任一所述的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，其特征在于，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的表达载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种所述的多肽的方法，包括步骤：

(1)将所述的表达载体引入到宿主细胞，获得遗传工程化的宿主细胞；

(2)培养(1)的遗传工程化的宿主细胞，获得培养物；和

(3)从培养物中分离所述的多肽。

在一个优选例中所述的宿主细胞为真核细胞；较佳地，所述的宿主细胞为人胚胎肾细胞；更佳地为293T细胞。

在另一优选例中，步骤(1)中，利用聚乙烯亚胺(PEI)作为转染试剂；较佳地，所述表达载体的DNA与聚乙烯亚胺的比例为1:(2.5～3.5)；更佳地为1:(2.8～3.2)；最佳地为1:3。

在另一优选例中，利用AKTA pure进行蛋白纯化。

在本发明的另一方面，提供所述的多肽的用途，用于免疫个体，从而使得个体产生抗体；较佳地，产生高效价(高滴度)的抗体。

在本发明的另一方面，提供所述的遗传工程化的宿主细胞的用途，用于生产前述任一所述的多肽。

本发明其它方面由于本文的公开内容，对本领域技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、HOPE-V重组蛋白的表达优化，共进行3次重复实验，图中为3次实验的平均值。

图2、质粒酶切电泳图谱。图中，M：Maker(KB ladder)；1：HOPE-V重组蛋白的表达质粒；2：由EcoRI和HindIII酶切的HOPE-V重组蛋白质粒。

图3、293T细胞瞬时转染细胞图片。其中，B：空白对照细胞；HOPE-V：瞬时转染HOPE-V重组蛋白质粒；荧光对照-瞬时转染含GFP荧光质粒。

图4、ELISA实验柱状统计图。其中，图注：B：空白对照细胞；S-HOPE-V：瞬时转染HOPE-V重组蛋白质粒后细胞上清；C-HOPE-V：瞬时转染HOPE-V重组蛋白质粒后细胞裂解液。

图5、293T细胞Western Blot实验结果。B：空白对照细胞；S：瞬时转染HOPE-V重组蛋白质粒后细胞上清；C：瞬时转染HOPE-V重组蛋白质粒后细胞裂解液。

图6、纯化蛋白SDS-PAGE检测结果；其中，M-蛋白标准品对照；LS细胞培养基上清上样；B-空白细胞上清；HOPE-V-纯化蛋白样品。

图7、纯化蛋白Western Blot检测结果；其中，M-蛋白标准品对照；LS-293T细胞培养基转染HOPE-V质粒上清；B-293T空白细胞上清；HOPE-V-纯化蛋白样品。

图8、纯化蛋白ELISA检测结果；其中，M-蛋白标准品对照；LS-293T细胞培养基转染HOPE-V质粒上清；B-293T空白细胞上清；HOPE-V-纯化蛋白样品。

图9、质粒转染后不同时间点拍照图片；其中，B-空白对照细胞，质粒-重组HOPE-V质粒；PEI-转染试剂。

图10、培养基上清的ELISA检测结果；其中，BLANK为空白对照；24h、48h、72h、96h分别为瞬时转染质粒相应时间后，收集瞬时转染HOPE-V质粒细胞培养基上清，测定获得的HOPE-V蛋白量。

图11、培养基上清ELISA检测HOPE-V蛋白量的结果。

图12、抗原-抗体结合实验的测定结果。

图13、不同量的HOPE-V重组蛋白免疫个体后，个体体内测得的抗体滴度情况。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，针对新冠病毒Spike蛋白胞外结构域进行结构设计，获得可作为免疫原免疫个体的多肽。所述多肽经过优化的结构设计，提高了其表达量以及免疫效果。本发明人将所述的多肽命名为HOPE-V。

术语

如本文所用，术语“本发明的多肽”、“本发明的多肽结构域”、“本发明的蛋白”、“本发明的蛋白结构域”“HOPE-V”、“HOPE-V重组蛋白”等可互换使用，指本发明的经优化改造的多肽片段，或其保守性变异多肽或同源物。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的多肽(本发明中为HOPE-V)”是指所述HOPE-V基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的多肽纯化技术纯化所述HOPE-V。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。所述HOPE-V的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明中，所述“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

HOPE-V及其分离或表达

本领域中，目前不易于高效新冠病毒Spike蛋白，从而缺乏作为免疫原的原材料。本发明人经过深入研究，选择Spike蛋白胞外结构域进行改造和优化表达；在本发明的优选方式中，对其N端序列剂型改造，从而获得了更适于表达、更适于作为免疫原、能够在个体中产生高滴度的抗体的新型蛋白结构域。

本发明的HOPE-V多肽可以是重组多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主。

本发明还包括所述HOPE-V的衍生物和类似物。如本文所用，术语“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的HOPE-V相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“所述HOPE-V”指一种经改造的多肽，其分离自新型冠状病毒，经过本发明人的优化改造，其可被高效表达，且能够作为免疫原高效诱导产生疫苗。在本发明的优选方式中，所述HOPE-V包括选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5任一所示氨基酸序列的多肽。该术语还包括具有与所述HOPE-V相同功能的、SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5任一所示氨基酸序列的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变多肽的功能。比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变多肽的功能；因此该术语还包括所述HOPE-V的活性衍生物。例如，变异可以发生在SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5任一所示氨基酸序列的多肽的保守功能域之外。该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体。但是，较佳地，所述多肽的N端15～25个氨基酸残基是保守的。

发明还提供所述HOPE-V蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然所述HOPE-V的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。较佳地，所述多肽的N端15～25个氨基酸残基是保守的。

在一些优选方式中，“所述保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:1～5任一所示的氨基酸序列相比，有至多30个，较佳地至多20个，更佳地至多10个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。较佳地，所述多肽的N端15～25个氨基酸残基是保守的。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

根据本发明所提供的分离的HOPE-V信息，本领域人员可以进一步通过蛋白分子改造等手段进一步提高蛋白活力、或扩大其适用的PH值范围、温度范围、耐盐性及对于冷、热的稳定性等，因此其应用前景良好。采用这些技术改造本发明所述HOPE-V后生成的变体、衍生物及其混合制剂也被包含在本发明中。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链

编码SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:5任一的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

所述HOPE-V核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也提供了包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或所述HOPE-V编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的所述HOPE-V。一般来说有以下步骤：

(1).用编码所述HOPE-V的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化多肽。

本发明中，所述HOPE-V多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码所述HOPE-V的DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子后面，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。

作为本发明的优选方式，本发明中用于表达HOPE-V的表达载体为适合于进行真核宿主表达的表达载体。

本发明的多肽可在宿主细胞中表达。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293、293T、HEK293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。在本发明的优选方式中，所述的宿主细胞为真核细胞。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

作为本发明的优选方式，所述的表达载体在转染细胞时，运用PEI作为转染试剂，并且表达载体的DNA与PEI的比例为1:(2.5～3.5)；更佳地为1:(2.8～3.2)；最佳地为1:3

本发明所述的HOPE-V，也可通过培养宿主细胞，从宿主细胞的培养液、培养上清或裂解物中分离获得。HOPE-V的制备可以是实验室规模的或工业生产规模的。

在此前期工艺开发研究阶段，本发明人合成了HOPE-V多肽，并进行了基因鉴定，鉴定无误后本发明人使用人细胞系进行了蛋白表达，结果显示HOPE-V多肽进行了正确的表达和翻译后修饰、糖基化修饰，分子量在120KDa左右，此大分子量为后期有效的免疫原性提供了保证。

作为本发明的优选方式，采用293T作为宿主细胞来表达所述HOPE-V。通过体外构建重组HOPE-V瞬时表达质粒，并使用人体细胞(293T、293)正确瞬时表达此重组蛋白疫苗，这样可有效地保证疫苗刺激人体产生正确的中和抗体和细胞免疫来对抗疫苗的入侵，并具有更高的有效性和安全性。

本领域针对Spike蛋白的已有一些结果，有的针对全长蛋白来进行疫苗设计，虽然其决定簇较为全面，但是其缺陷是蛋白较大，不仅表达及纯化上工艺复杂，免疫个体后效果也不够理想。有的则片段过小，作为免疫原效果不理想，从而需要运用免疫佐剂来加以辅佐，但这使得工艺复杂且产生副作用，也不利于人体给药。

本发明改造后的HOPE-V，其蛋白大小适宜，有利于重组表达，另一方面其形成的抗体滴度高，效果优异。同时，本发明的HOPE-V当制备疫苗时，无需应用免疫佐剂，毒副作用低，适用于推广到人体的应用。

本发明获得HOPE-V免疫原性理想，能够诱导机体(个体)产生高滴度的抗体，有着广泛的应用潜力。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、蛋白序列改造

本实施例中，进行蛋白的序列改造，并通过重组表达来选择。

1、蛋白序列信息

为了获得可以高效表达且具有良好的免疫原性的蛋白片段，针对新型冠状病毒的基因组序列，本发明人进行了深入的研究和比较。在此基础上，将关注的蛋白区段聚焦于包含以下表2的基因序列1～5的蛋白片段等。

表2

上述表2蛋白序列的编码基因经密码子优化，插入到pcDNA3.4质粒的多克隆位点中，构建重组质粒。

2、细胞接种

(1)待293T细胞长到80％以上时进行传代，以T175细胞培养瓶为例：

(2)将含有10％FBS的DMEM培养基、胰酶、PBS在37℃水浴锅内预热；

(3)用移液管将培养皿内的上清弃掉，用5ml的PBS润洗一次；

(4)加入3ml胰酶(0.5％)，轻轻摇晃培养皿，使胰酶完全覆盖培养瓶细胞表面；

(5)消化1min左右，快速使用5ml左右含10％FBS的DMEM培养基终止消化；

(6)将消化好的细胞吹打下来收集至离心管内，1000r/min，3min；

(7)弃上清，加入适量新鲜的含10％FBS的DMEM培养基进行重悬，吹打均匀成单细胞悬液，计数，将6.5×10⁵个细胞与适量培养基均匀混合成细胞悬液至最终体系为3ml，接种在6cm皿中，待细胞长至50％即可进行转染；

(8)37℃，5％CO₂培养箱内，静置培养。

2、细胞转染

细胞接种第二天，进行转染实验

1.制备PEI-DNA转染复合物：①往500ul稀释液内加入2ug质粒DNA，低速混合/涡旋均匀；②往混合物内按照质粒DNA:PEI分别为2:3(质粒配比二)、1:3(质粒配比一)、4:3(质粒配比三)加入PEI工作液(1mg/ml)，低速涡旋5s；③无菌环境，室温静置10min以形成PEI-DNA转染复合物。④用移液枪上下吹打3次，轻轻混匀。

2.将PEI-DNA转染复合物转到6孔板中，轻轻晃动培养皿或轻微涡旋，使得复合物分散均匀。

3.37℃，5％CO₂培养箱内培养细胞，转染后6h，去除含PEI-DNA复合物的培养液，更换新鲜的生长培养基3ml。

4.转染后72/96收集细胞培养基上清存4℃冰箱。

5.收集细胞，加入裂解液(见WB操作SOP)，-20℃保存，进行下游检测。

3、实验结果

(1)质粒配比优化

本发明人从转染质粒量、质粒与PEI比例进行优化，通过ELISA反应检测上清中蛋白量。如图11，从结果可以看出，质粒DNA:PEI为1:3时，细胞培养基中的目标蛋白产量有显著的提升。此外，从图9也可见，DNA:PEI为1:3时，细胞状态理想。

(2)蛋白优化表达

蛋白优化表达的实验结果(质粒DNA:PEI为1:3)如表3和图1。

表3

	培养基上清(μg/L)
		蛋白序列1	270.77
蛋白序列2	129.52
		蛋白序列3	142.77
蛋白序列4	131.27
		蛋白序列5	139.93

根据上表3以及图1的结果，不管是上清中还是细胞中，蛋白序列1的表达效果最好，其它的序列则表达量比其显著低约一半。

实施例2、蛋白信息及其重组表达

本实施例中，进行蛋白的重组表达。

I.HOPE-V重组质粒构建

1、实验材料及试剂

Taq酶&pBO酶，dNTP，感受态细胞，实验用水，T4 DNA连接酶，重组酶(Clone EZEnzyme)，内切酶(NEB)，pcDNA3.4质粒，均获自金斯瑞(Genscript)。

2、质粒构建

将蛋白序列1(SEQ ID NO:1)的编码基因插入到pcDNA3.4质粒的多克隆位点中，构建重组质粒。

经测定，所述质粒内毒素含量低(低于0.01EU/ug)，超螺旋大于90％。

II.HOPE-V重组蛋白的瞬时表达

1、实验材料及试剂

D-Hank’s Solution，Trypsin-EDTA Solution(0.05％Trypsin-EDTA，Gibco)，PEI转染试剂(Polysciences)，DMEM(Gibco)，FBS(Gibco)，T175(Corning)，前述获得的重组的HOPE-V质粒，293T细胞。

2、表达方法

(1)293T细胞T25培养瓶中培养至80-90％融合时，倾去培养液，用2ml D-Hank’ssolution洗涤细胞两次；

(2)用移液管将培养瓶内的上清弃掉，用2ml的PBS润洗一次；

(3)加入1ml胰酶(0.5％)，轻轻摇晃培养皿，使胰酶完全覆盖培养瓶细胞表面；消化1min左右，快速使用3ml左右含10％FBS的DMEM培养基终止消化；

(4)将消化好的细胞吹打下来收集至离心管内，1000r/min，3min；弃上清，加入适量新鲜的含10％FBS的DMEM培养基进行重悬，吹打均匀成单细胞悬液，计数；

(5)将1×10⁷个细胞与培养基均匀混合成细胞悬液接种在T175中，细胞长至60％时，将前述获得的重组HOPE-V质粒转染细胞；37℃，5％CO₂培养箱内静置培养；

(6)细胞接种第二天，进行转染实验；

(7)转染72小时以后以后收集细胞上清以及细胞裂解液备用。

III.酶联免疫吸附测定

利用ELISA试剂盒(Sino Biological)对待检样品进行测定。

IV.Western Blot

利用如下试剂盒或材料进行：配胶试剂盒(碧云天)，Tris(sigma)，3.BeyoGel^TMPlus SDS-PAGE Hepes电泳液(20X)(碧云天)，甘氨酸(sigma)，BeyoColor^TM彩色预染蛋白分子量标准，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)，SDS(sigma)，Tween-20(碧云天)，RIPA Lysis and Extraction Buffer(Thermo Scientific)。

V.蛋白层析纯化

1、实验材料及试剂

层析柱(GE)，Tris(sigma)，Nacl(sigma)，咪唑(MACKLIN)，AKTA pure(GE)，CaptoQ(GE)，SP-HP(GE)，Superdex 200(GE)，

2、实验步骤

(1)样品的澄清过滤：使用50ml注射器以及0.22μm滤膜将准备好的细胞悬液上清进行澄清；

(2)采用蛋白层析柱，在AKTA上进行捕获、纯化；

(3)进行系统冲洗，再用平衡液冲洗AKTA的A1泵，洗脱液冲洗B1泵；

(4)设置好系统流速1ml/min，选择相应的柱位1号位连接蛋白层析柱，用平衡液对AKTA及柱子进行平衡，平衡结束后紫外调零；

(5)开始上样，将A1泵转移至上样离心管内上样；

(6)上样结束后，将A1泵转移至平衡缓冲液中，冲洗平衡液至检测波长稳定后分布洗脱，收集洗脱液；

(7)再用平衡液A冲洗，最后冲乙醇保存。

VI.结果

1、HOPE-V重组蛋白

采用前述实施例1中的“蛋白序列1”。

2、重组质粒和重组细胞鉴定

如前所述获得重组质粒，酶切电泳图谱如图2。因此，本发明人获得了正确的重组HOPE-V质粒。

根据图2，可以通过酶切切出的两条带的大小相差以大于0.5kb，且不超过3kb。条带大小适宜，分子量与预测分子量一致，且从测序结果来看，测序结果正确，说明重组HOPE-V质粒构建正确，可以用于后期实验与工艺研发。

如前所述进行细胞转染，293T细胞瞬时转染HOPE-V质粒后，分别每24小时拍照观察细胞状态，持续至72小时，分别收取细胞培养基上清以及裂解细胞收取细胞裂解液。

瞬时转染质粒后，24小时观察荧光图片，荧光对照高表达，大于90％的表达率，实验瞬转效率高，且每24小时拍照观察细胞状态。

结果如图3，从结果中可以看出，细胞状态非常好，细胞形态规则且增殖正常，适于瞬时转染质粒后蛋白的表达。

3、酶联免疫吸附测定

瞬转HOPE-V重组质粒72小时后，分别收集细胞裂解液(C-HOPE-V)以及细胞培养基上清(S-HOPE-V)，进行酶联免疫吸附测定。ELISA实验柱状统计图如图4。从实验结果中可以看出，与对照组相比，细胞裂解液C-HOPE-V以及细胞培养基上清S-HOPE-V样本中均有HOPE-V蛋白的高表达，且S-HOPE-V与C-HOPE-V测得浓度相一致。

4、Western Blot测定

为了验证不同细胞得表达量以及对目标蛋白进行准确鉴定，分别转染293T细胞后，分别在不同时间点收集不同细胞裂解液(C-HOPE-V)以及细胞培养基上清(S-HOPE-V)，进行Western Blot检测。293T细胞表达后的Western Blot实验结果如图5。

从结果看出，对照组没有HOPE-V蛋白的表达，而细胞裂解液(C-HOPE-V)以及细胞培养基上清(S-HOPE-V)均有HOPE-V蛋白的高表达，且目标条带清晰，分子量位置正确，还原条件下HOPE-V目标分子量大约在120KD左右，非还原条件下目标分子量分别在120KD左右以及>120KD也有目标条带，且延长转染后细胞培养时间，细胞上清中得目标蛋白HOPE-V表达量有明显增高。

以上结果说明，瞬转HOPE-V质粒后细胞上清以及细胞裂解液中均能够实现目标蛋白HOPE-V的良好表达。

5、AKTA蛋白纯化实验结果

利用AKTA进行蛋白纯化。从AKTA纯化结果来看，目标蛋白主要在20mM Tris下洗脱，有很明显的蛋白洗脱峰；阴离子交换柱很很强的富集能力，将蛋白牢牢挂柱，并且在低盐下洗脱杂蛋白，高盐下洗脱目标蛋白，能够有效地分离目标蛋白与杂带。可将目标蛋白提纯至95％以上。

AKTA纯化蛋白后，对不同样本进行SDS-PAGE与Western Blot检测。

纯化蛋白SDS-PAGE检测结果如图6。

纯化蛋白Western Blot检测结果如图7。

纯化蛋白ELISA检测结果如图8。

从结果中可以看出，上样(LS)与纯化后样本均能检测到阳性结果，且纯度高、无其余杂带。

综上，经多次结果证实，通过利用293T细胞瞬时转染HOPE-V重组质粒，在细胞培养基上清中能够高效表达HOPE-V蛋白，并且通过AKTA蛋白纯化得方式，拿到高纯度的洗脱样本，并且经验证为正确的HOPE-V蛋白。

实施例3、HOPE-V疫苗工艺开发研究

本实施例中，进行HOPE-V疫苗制备工艺开发研究。

I.HOPE-V重组蛋白的瞬时表达

1、实验材料及试剂

Polyethylenimine，linear(Polysciences)，PBS，磷酸盐缓冲液(Corning)，DMEM高糖培养基(Hyclone)，SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike ELISA Kit(义翘神州)，FBS(Gibco)，T175贴壁细胞培(Sarstedt)，250ml离心管(Corning)，15ml离心管(nunc)，50ml离心管(nunc)，10ml血清移液管(Corning)，25ml血清移液管(Corning)。

2、实验步骤

细胞接种

(1)待细胞长到80％以上时进行传代，以T175为例；

(3)用移液管将培养皿内的上清弃掉，用5ml的PBS润洗一次；

(6)将消化好的细胞吹打下来收集至离心管内，1000r/min，3min；

(7)弃上清，加入适量新鲜的含10％FBS的DMEM培养基进行重悬，吹打均匀成单细胞悬液，计数，将细胞与适量培养基均匀混合成细胞悬液至最终体系为3ml，接种在6cm皿中，待细胞长至50％即可进行转染；

(8)37℃，5％CO2培养箱内静置培养。

细胞转染

(1)制备PEI-DNA转染复合物(严格按照顺序进行)：①往500ul稀释液内加入不同剂量的质粒DNA(具体剂量见下图)，低速混合/涡旋均匀；②往混合物内加入不同剂量的PEI工作液(1mg/ml)，低速涡旋5s；③无菌环境，室温静置10min以形成PEI-DNA转染复合物。④用移液枪上下吹打3次，轻轻混匀；

(2)将PEI-DNA转染复合物转到6孔板中，轻轻晃动培养皿或轻微涡旋，使得复合物分散均匀；

(3)37℃，5％CO₂培养箱内培养细胞，转染后6h，去除含PEI-DNA复合物的培养液，更换新鲜的生长培养基3ml；

(4)转染后72/96收集细胞培养基上清存4℃冰箱；

(5)收集细胞，加入裂解液(见WB操作SOP)，-20℃保存，进行下游检测。

II.酶联免疫吸附测定

1、实验材料及试剂

利用ELISA试剂盒(Sino Biological)对待检样进行检测。

III.结果

1、质粒转染后细胞状态

293T细胞转染前状态良好，融合度在60％左右，在固定PEI转染实际的量为6ug时，质粒的量分别为2ug，4ug，8ug，分别在转染24h，48h，72h，96h时进行拍照并且分别收集不同时间段的细胞培养基上清。

质粒转染后不同时间点的照片如图9。从细胞图片来看，不同的转染时间24h，48h，72h，96h 293T细胞状态良好，到72小时以后，细胞融合度达到100％，96小时以后，细胞已经出现皱缩、聚团现象，无法继续培养。

2、酶联免疫吸附测定

培养基上清ELISA检测结果如图10。从结果中可以看出，转染相同量的质粒时，在不同的时间分别换液收集培养基上清，可以看到在24～48小时时，细胞培养基上清中的重组蛋白表达量最高，72～96小时时细胞培养基上清中的重组蛋白表达量最低。

实施例4、HOPE-V蛋白与ACE2结合实验

本实施例中，检测SARS-COV-2研发项目HOPE-V蛋白与ACE2结合实验。实验对象为：细胞培养基上清纯化后蛋白样本。

I.溶液配制

包被稀释液，封闭液，洗涤液，样本稀释液，酶标山羊抗兔IgG H&L(HRP)预吸附二抗浓度0.5ug/ml，底物液(TMB-过氧化氢尿素溶液)，终止液，0.9％生理盐水。

II.结合实验方法

(1)底板包被

将所用抗体(ACE2抗体)用包被稀释液稀释到2ug/ml，PH在9.9，每孔抗原(稀释好的ACE2蛋白)加入100μl，置4℃，24h；弃去孔中液体。

(2)封闭酶标反应孔

5％小牛血清置37℃封闭40min。封闭时将200ul封闭液加满各反应孔，并去除各孔中的气泡，封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。

(3)加入待检测样品

将样本按照下表中进行稀释，将稀释好的样品(HOPE-V)加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔作为复孔，每孔100μl，置于37℃，90min；用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。

(4)加入酶标抗体

酶标抗体：0.5mg/ml二抗；37℃，60min之间；每孔加100μl；洗涤同前。

(5)加入底物液

底物加入量：每孔100μl，置37℃，避光放置3-5分钟，加入终止液显色。

(6)终止反应

每孔加入终止液100μl终止反应，于20min内测定实验结果。

III.实验结果

结果如表4和图12。

表4

样品浓度(ug/ml)	OD(A450)
		0.1	-0.0125
0.2	0.0195
		0.5	0.0755
0.9	0.143
		1.8	0.491
3.7	0.809
		7.3	1.189
15.6	1.871
		31.3	2.352
62.5	2.51
		125.0	2.774
250.0	2.882
		500.0	2.871
1000	2.862
		2000	2.881

根据上述结果可见，本发明的HOPE-V结合ACE2的效果非常理想。

实施例5、HOPE-V重组蛋白抗体滴度实验

本实施例中，检测本发明的HOPE-V重组蛋白免疫小鼠后，小鼠血清中抗体滴度。检测对象为重组蛋白免疫小鼠后第7天的血清，检测其中的抗体滴度。

I.溶液配制

包被稀释液，封闭液，洗涤液，样本稀释液，酶标IgG二抗底物液(TMB-过氧化氢尿素溶液)，终止液，0.9％生理盐水。

II.检测方法

(1)底板包被

将所用抗原(标准品)用包被稀释液稀释到不同的浓度，每孔抗原加入100μl，置4℃，24h；弃去孔中液体；

(2)封闭酶标反应孔

5％小牛血清置37℃封闭60min；封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。

(3)加入待检测样品

将样本按照下表中进行稀释，将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每孔100μl，置于37℃，90min；用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。

(4)加入酶标抗体

按照说明书加入适宜浓度的二抗。37℃，60min之间；每孔加100μl.洗涤同前。

(5)加入底物液

底物加入量：每孔100μl，置37℃避光放置3-5分钟，加入终止液显色。

(6)终止反应

每孔加入终止液100μl终止反应，于20min内测定实验结果。

III.实验结果

HOPE-V重组蛋白抗体滴度结果如表5和图13。

表5

	1：100	1：200	1：400	1：800	1：1600	1：3200	1：6400	1：12800
									免疫前	0.5205	0.3625	0.2245	0.162	0.109	0.109	0.109	0.109
PBS	0.55925	0.36575	0.2335	0.159	0.10575	0.10575	0.10575	0.10575
									0.5ug/只	0.886	0.4135	0.206	0.143	0.0915	0.0915	0.0915	0.0915
5ug/只	0.937	0.542	0.374	0.262	0.165	0.15	0.14	0.13
									25ug/只	1.354	1.1985	0.9185	0.823	0.688	0.56	0.33	0.24

不同量HOPE-V重组蛋白免疫小鼠后，小鼠血清中均有抗体产生。随着HOPE-V重组蛋白免疫量的增加，其产生抗体的滴度也随之增加。

上述结果说明，本发明的HOPE-V重组蛋白能够在免疫个体7天时就产生高滴度的抗体，效果优异。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 厚朴生物科技（苏州）有限公司

<120> 改造的新冠病毒Spike蛋白胞外结构域及其应用

<130> 207010

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 689

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(689)

<223> 改造的蛋白序列1

<400> 1

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1 5 10 15

Ser Arg Ala Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr

20 25 30

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35 40 45

Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser

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65 70 75 80

Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe

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Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu

145 150 155 160

Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser

165 170 175

Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn

180 185 190

Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr

195 200 205

Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe

210 215 220

Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr

225 230 235 240

Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly

245 250 255

Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly

260 265 270

Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr

275 280 285

Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys

290 295 300

Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser

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325 330 335

Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala

340 345 350

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Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr

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405 410 415

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<221> VARIANT

<222> (1)..(688)

<223> 改造的蛋白序列2

<400> 2

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1 5 10 15

Tyr Ser Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr

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580 585 590

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595 600 605

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<210> 3

<211> 685

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(685)

<223> 改造的蛋白序列3

<400> 3

Met Lys Val Leu Ile Leu Ala Cys Leu Val Ala Leu Ala Leu Ala Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

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Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

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Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

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Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

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Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

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Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

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His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

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Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

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675 680 685

<210> 4

<211> 690

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> CONFLICT

<222> (1)..(690)

<223> 改造的蛋白序列4

<400> 4

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Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe

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Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe

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Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr

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Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala

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Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro

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Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser

545 550 555 560

Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp

565 570 575

Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile

580 585 590

Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn

595 600 605

Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Gly Val Asn Cys Thr Glu

610 615 620

Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val

625 630 635 640

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645 650 655

Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly

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675 680 685

Ala Arg

690

<210> 5

<211> 685

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(685)

<223> 改造的蛋白序列5

<400> 5

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

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Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

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325 330 335

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385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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580 585 590

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595 600 605

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610 615 620

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625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg

675 680 685

Claims

1.一种经优化改造的多肽，其特征在于，其为选自下组的多肽：

(b)与(a)所限定的多肽的氨基酸序列有至少90％相同性，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽；

(c)将(a)所限定的多肽的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)所限定的多肽的功能的多肽；或

所述多肽的N端15～25个氨基酸残基是保守的。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，(a)中，所述多肽为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽；更佳地为SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽。

3.一种改造新冠病毒Spike蛋白胞外结构域的方法，其特征在于，将Spike蛋白胞外结构域的N端序列改造为：SEQ ID NO:1中第1～19位，SEQ ID NO:2中第1～18位，SEQ ID NO:3中第1～15位，SEQ ID NO:4中第1～20位，SEQ ID NO:5中第1～15位所示的氨基酸序列。

4.分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1～2任一所述的多肽。

5.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的表达载体，或基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种生产权利要求1所述的多肽的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)将权利要求5所述的表达载体引入到宿主细胞，获得遗传工程化的宿主细胞；

(2)培养(1)的遗传工程化的宿主细胞，获得培养物；和

(3)从培养物中分离权利要求1所述的多肽。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞为真核细胞；较佳地，所述的宿主细胞为人胚胎肾细胞；更佳地为293T细胞。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，利用聚乙烯亚胺作为转染试剂；较佳地，所述表达载体的DNA与聚乙烯亚胺的比例为1:(2.5～3.5)；更佳地为1:(2.8～3.2)；最佳地为1:3。

10.权利要求1～2任一所述的多肽的用途，用于免疫个体，从而使得个体产生抗体；较佳地，产生高效价的抗体。