CN114014940B

CN114014940B - 一种2019-nCoV表面蛋白受体结合区融合蛋白制备方法

Info

Publication number: CN114014940B
Application number: CN202111412511.0A
Authority: CN
Inventors: 安文琪; 王斌; 张静静; 邢体坤; 宋路萍; 杨振苹
Original assignee: Hualan Genetic Engineering Co ltd
Current assignee: Hualan Genetic Engineering Co ltd
Priority date: 2021-11-25
Filing date: 2021-11-25
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2041-11-25
Also published as: CN114014940A

Abstract

本发明公开了一种2019‑nCoV表面蛋白受体结合区融合蛋白制备方法。本发明公开的2019‑nCoV表面蛋白受体结合区融合蛋白制备方法，包括：将SEQ ID No.1所示的新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的编码基因通过含有所述编码基因的重组表达载体导入宿主细胞中，得到重组细胞，培养所述重组细胞，得到新型冠状病毒受体结合区二聚体。本发明采用Fc结构域与新型冠状病毒结构蛋白融合形成二聚体，维持受体结合区(RBD)间表位，用于新型冠状肺炎疫苗或诊断产品的开发。实验证明：新型冠状病毒结构蛋白，特别是受体结合区(RBD)能够有效形成二聚体，安全可控，纯化工艺简单，降低生产成本。

Description

一种2019-nCoV表面蛋白受体结合区融合蛋白制备方法

技术领域

本发明涉及疫苗制备领域中，一种2019-nCoV表面蛋白受体结合区融合蛋白制备方法。

背景技术

冠状病毒是一个大型病毒家族，严重程度从感冒到重症疾病不等，如中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)。新型冠状病毒(SARS-COV-2)感染后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。较严重病例中，可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。

新冠病毒肺炎(COVID-19)尚无特效药物或治疗方法，新冠肺炎疫苗成为公众最期待的防御武器。为了提升疫苗研发的成功率，科研攻关组布局了病毒灭活疫苗、核酸疫苗、重组蛋白疫苗、腺病毒载体疫苗和减毒流感病毒载体疫苗五条疫苗研发技术路线。除病毒灭活疫苗外，抗原种类选择和表达策略成为疫苗成功的核心要素。

新型冠状病毒表面蛋白(S)参与宿主细胞膜受体(ACE-2)结合及膜融合功能，成为疫苗开发的关键靶点。表面蛋白(S)全长1273个氨基酸，分子量超过130Kd，限制重组新冠疫苗产能。表面蛋白S1亚基或受体结合区(RBD)成为疫苗开发的理想抗原，截短后单体形成聚体和纯化工艺成为抗原生产中的瓶颈。1)形成聚体：天然表面蛋白(S)以三聚体形式存在，截短的S1亚基，氮端结构域(NTD)和受体结合区(RBD)均以单体形式存在，无法形成抗原之间空间表位。智飞生物的串联表达和三叶草生物的Trimer-Tag技术有效解决该问题。2)纯化工艺：S1亚基，氮端结构域(NTD)和受体结合区(RBD)无标签，纯化工艺开发困难。传统生产工艺采用离子交换，分子筛和疏水层析等非特异纯化方法，回收率低下。

发明内容

为了解决新冠疫苗开发上述瓶颈问题，发明人采用Fc融合技术制备新型冠状病毒疫苗抗原成分。

本发明首先提供了一种新型冠状病毒受体结合区二聚体的制备方法，所述方法包括：将SEQ ID No.1所示的新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的编码基因通过含有所述编码基因的重组表达载体导入宿主细胞中，得到重组细胞，培养所述重组细胞，得到新型冠状病毒受体结合区二聚体；

所述新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的编码基因为下述(a1)-(a4)中的任一种：

(a1)序列表中SEQ ID No.2所示的DNA分子；

(a2)序列表中SEQ ID No.3所示的DNA分子；

(a3)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的DNA分子杂交且编码所述新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的DNA分子；

(a4)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的DNA分子。

上述方法中，SEQ ID No.1的第1-19位所示为信号肽，第20-242位所示为新型冠状病毒受体结合区(RBD)，第243-469位所示为Fc标签。

同一性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)，检索一对核苷酸序列的同一性，进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNa₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

本发明还提供了一种新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的制备方法，所述方法包括：将所述新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的编码基因通过含有所述编码基因的重组表达载体导入宿主细胞中，得到重组细胞，培养所述重组细胞，得到新型冠状病毒受体结合区融合蛋白。

上述方法中，所述宿主细胞可为真核细胞。

所述真核细胞可为动物细胞，如HEK293细胞，CHO细胞，酵母细胞或昆虫细胞等。在本发明的一个实施例中，所述动物细胞为Expi293F细胞。

上述方法中，所述重组表达载体为将所述编码基因插入表达载体得到的能够表达所述新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的载体。

所述表达载体可为pCGS3载体。

所述重组表达载体可为pCGS3-M1或pCGS3-M2；

所述pCGS3-M1为将pCGS3载体的HindIII和PacI识别序列间的DNA片段替换为SEQID No.2所示的DNA分子得到的重组载体；

所述pCGS3-M2为将pCGS3载体的HindIII和PacI识别序列间的DNA片段替换为SEQID No.3所示的DNA分子得到的重组载体。

所述融合蛋白可利用Protein A亲合层析纯化。

SEQ ID No.1所示的新型冠状病毒受体结合区融合蛋白，也属于本发明的保护范围。

所述新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的编码基因，也属于本发明的保护范围。

含有所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞系，也属于本发明的保护范围。

所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达前文第二方面中所述融合蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

在本发明的具体实施方式中，所述重组载体为将SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示DNA片段(即编码SEQ ID No.1所示多肽，第1-57位为信号肽H的编码基因，58-726位为受体结合区蛋白，727-1407位为Fc融合蛋白)插入到pCGS3或其他CMV启动子表达载体的多克隆位点后得到的重组质粒。相应地，所述转基因细胞系为将所述重组质粒导入到Expi293F细胞后所得。

所述重组载体具体可为所述pCGS3-M1或所述pCGS3-M2。

本发明还提供了所述新型冠状病毒受体结合区融合蛋白，或所述编码基因，或所述表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞系的下述任一应用：

X1、制备新型冠状病毒疫苗；

X2、制备诊断新型冠状病毒产品。

上述应用中，所述疫苗可为核酸疫苗或病毒疫苗。

本发明采用Fc结构域与新型冠状病毒结构蛋白融合形成二聚体，维持受体结合区(RBD)间表位，用于新型冠状肺炎疫苗或诊断产品的开发。实验证明：新型冠状病毒结构蛋白，特别是受体结合区(RBD)能够有效形成二聚体，安全可控，纯化工艺简单，降低生产成本。

本发明有四大优势：1)抗原成分形成二聚体，维持抗原之间空间表位；2)采用Protein A亲合层析纯化，纯化收率高；3)增加抗原内半衰期，长期刺激机体免疫；4)Fc为内源性多肽已广泛用于蛋白长效化，相对Foldon多肽等技术更加安全可靠。

附图说明

图1为pCGS3-M1与pCGS3-M2表达质粒酶切鉴定图。其中，泳道1-3为表达质粒pCGS3-M1，泳道4-6为表达质粒pCGS3-M2，左侧DNA分子量标准的单位为bp。

图2为新冠病毒表面蛋白受体结合区融合蛋白的Expi293F细胞分泌上清SDS-PAGE鉴定图。其中，A为非还原SDS-PAGE，B为还原SDS-PAGE电泳；1为pCGS3-M1转染细胞的结果(白色箭头指示目标条带)，2为pCGS3-M2转染细胞的结果(白色箭头指示目标条带)，3为无标签对照重组载体转染细胞的结果(黑色箭头指示目标条带)。左侧数字为蛋白分子量标准，单位为KDa。

图3为新冠病毒表面蛋白受体结合区融合蛋白纯化SDS-PAGE鉴定图。其中，A为pCGS3-M1转染细胞的结果，B为pCGS3-M2转染细胞的结果；1和3为培养上清，2和4为纯化后蛋白；1和2为非还原SDS-PAGE，3和4为还原SDS-PAGE。左侧数字为蛋白分子量标准，单位为KDa，箭头标注均为RBD-Fc蛋白。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的主要试剂及其厂家信息如下：

pCGS3表达载体：Merck公司；

Expi293F^TMCells：Thermo公司；

Expi293^TM Expression Medium：Thermo公司；

ExpiFectamine^TM 293Transfection Kit：Thermo公司；该试剂盒含有ExpiFectamine293^TM Reagent、ExpiFectamine^TM293 Transfection Enhancer 1、ExpiFectamine^TM293 Transfection Enhancer 2；

Opti-MEM^TM I Reduced Serum Medium：Thermo公司；

Protein A预装色谱柱：生工生物工程(上海)股份有限公司；

Centrifugal Filters Ultracel-10K：Millipore公司；

Centrifugal Filters 0.5ml 10K Ultracel：Millipore公司；

PBS pH7.4(1×)：Gibco公司；

蛋白marker：南京金斯瑞生物科技有限公司；

Sure PAGE^TM,Bis-Tris,10x8,4-12％,12wells：南京金斯瑞生物科技有限公司；

5×Sample Buffer：南京金斯瑞生物科技有限公司；

4×LDS Sample Buffer：南京金斯瑞生物科技有限公司；

凝胶成像系统：Protein Simple公司；

细胞计数仪：Roche公司；

超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；

电热恒温水浴锅：Fisher Scientific公司；

eStain^TM L1蛋白染色仪：南京金斯瑞生物科技有限公司；

CO₂恒温摇床：CRYSTAL公司；

HYG-A全恒温摇瓶柜：太仓市实验设备厂；

DYY-6C型电泳仪：北京市六一仪器厂；

DYCP-31DN型水平电泳槽：北京市六一仪器厂；

微量移液器：Eppendorf公司。

实施例1、表达质粒构建

本实施例设计信号肽、新型冠状病毒受体结合区(RBD)与Fc标签的RBD融合蛋白(将该融合蛋白记为RBD-Fc)，其序列为序列表中SEQ ID No.1。对RBD-Fc编码基因进行HEK293细胞密码子优化，得到SEQ ID No.2，将SEQ ID No.2所示的DNA片段记为HEK293-RBD-Fc基因；对RBD-Fc编码基因进行CHO细胞密码子优化，得到SEQ ID No.3，将SEQ IDNo.3所示的DNA片段记为CHO-RBD-Fc基因。

其中，SEQ ID No.1的第1-19位所示为信号肽，第20-242位所示为新型冠状病毒受体结合区(RBD)，第243-469位所示为Fc标签；

SEQ ID No.2的第1-57位所示为信号肽的编码基因，第58-726位所示为RBD的编码基因，第727-1407位所示为Fc标签编码基因；

SEQ ID No.3的第1-57位所示为信号肽的编码基因，第58-726位所示为RBD的编码基因，第727-1407位所示为Fc标签编码基因。

合成SEQ ID No.2所示的HEK293-RBD-Fc基因，将pCGS3载体的HindIII和PacI识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.2所示的HEK293-RBD-Fc基因，得到重组载体，将得到的重组载体记为pCGS3-M1，pCGS3-M1能表达序列表中SEQ ID No.1所示的融合蛋白RBD-Fc。

合成SEQ ID No.3所示的CHO-RBD-Fc基因，将pCGS3载体的HindIII和PacI识别序列间的DNA片段替换为SEQ ID No.3所示的CHO-RBD-Fc基因，得到重组载体，将得到的重组载体记为pCGS3-M2，pCGS3-M2能表达序列表中SEQ ID No.1所示的融合蛋白RBD-Fc。

利用HindIII和PacI分别对pCGS3-M1与pCGS3-M2进行双酶切，酶切产物电泳结果如图1所示，表明得到了正确的重组载体。

合成SEQ ID No.2的第1-726位并在其3’末端添加终止密码子的DNA片段，将该DNA片段替换pCGS3载体的HindIII和PacI识别序列间的DNA片段，得到无标签受体结合区(RBD)的对照重组载体，无标签对照重组载体能表达序列表中SEQ ID No.1的第1-242位所示的重组蛋白(不含Fc标签，记为无标签对照重组蛋白)。

实施例2、受体结合区融合蛋白瞬转表达

一、宿主细胞

从液氮罐中取宿主细胞Expi293F(Expi293F^TMCells)的种子库细胞，于37℃水浴迅速解冻，将解冻后的细胞悬液无菌转移至装有30ml预热的完全生长培养基(即Expi293^TMExpression Medium)的125ml药瓶中，摇床培养，条件为：37℃，8％CO₂，120rpm，振幅25mm，湿度≥80％。摇床培养15～30min后取细胞悬液检测细胞密度与活率。

待细胞活率恢复90％以上，细胞密度达3～5×10⁶cells/ml，按0.3～0.5×10⁶cells/ml进行接种扩增。

二、细胞转染

将实施例1构建的pCGS3-M1和pCGS3-M2分别转染宿主细胞，步骤如下：

1、转染前一天

转染前24h将宿主细胞以2.5～3×10⁶cells/ml重新接种至完全生长培养基中，培养24h。

2、转染当天

(1)细胞密度应达到4.5～5.5×10⁶cells/ml，活率应≥95％。用新鲜预热的完全生长培养基将细胞稀释至3×10⁶cells/ml，得到细胞悬液。

(2)准备转染试剂和DNA复合物

1)DNA稀释

用无菌水将质粒(实施例1构建的pCGS3-M1或pCGS3-M2或对照重组载体)稀释至1μg/μl，按照1ml细胞转染1μg质粒的量，取转染50ml细胞所需质粒的量，即50μl质粒加入3mlOpti-MEM^TM I Reduced Serum medium，得到质粒稀释液，备用。

2)转染试剂稀释

使用前将转染试剂ExpiFectamine293^TM Reagent轻轻上下颠倒混匀，取转染50ml细胞所需转染试剂的量，即取160μl ExpiFectamine293^TM Reagent于2.8ml Opti-MEMTM I Reduced Serum medium中轻轻上下颠倒混匀，室温静置5min，得到稀释好的转染试剂。

3)将稀释好的转染试剂加入步骤1)得到的质粒稀释液中轻轻上下颠倒混匀，室温孵育10～20min，得到混合好的转染试剂和DNA复合物。

将混合好的转染试剂和DNA复合物5.8ml缓慢加入步骤(1)得到的细胞悬液中。37℃，8％CO₂，120rpm，振幅25mm，湿度≥80％条件培养。

3、转染后第一天

在转染后18-22h按照转染50ml细胞的量向所得细胞培养物中添加增强剂，即取300μl ExpiFectamine^TM293 Transfection Enhancer 1与3mlExpiFectamine^TM293Transfection Enhancer 2混匀后缓慢加入细胞培养物中，继续培养。

4、培养上清收集

转染后每天监测细胞活率，第4天活率降至65％～75％时终止培养收集培养物于3500g离心30min，收集上清并超滤，将所得滤液进行SDS-PAGE电泳，结果显示，融合蛋白RBD-Fc形成二聚体，且表达产量显著高于无标签RBD对照重组蛋白(图2)。灰度分析进行定量，RBD-Fc目标条带占比大于总蛋白25％，对照重组蛋白仅为9％。

实施例3、受体结合区融合蛋白纯化

一、超滤浓缩

收样上清(即实施例2步骤4中“收集培养物于3500g离心30min”后所得上清)进行4℃，10KD超滤膜6000g离心20min超滤浓缩，最终细胞上清浓缩至10-15ml，记为超滤浓缩上清，留样10μl用于SDS-PAGE蛋白电泳检测。

二、亲合纯化

利用Protein A预装色谱柱(生工生物工程(上海)股份有限公司)进行蛋白纯化，步骤如下：

(1)超滤浓缩上清和结合/洗涤缓冲液照体积比1：1混匀，静置20min充分孵育，待上柱纯化；

(2)用五倍柱体积的结合/洗涤缓冲液平衡柱子，缓冲液依靠重力流穿预装柱；

(3)将步骤(1)所得超滤浓缩上清和结合/洗涤缓冲液混匀液加入柱子依靠重力流穿预装柱。如有剩余样品可再次上样，重新流通一次，收集流穿液到离心管中；

(4)用10-15倍柱体积的结合/洗涤缓冲液清洗柱子并收集流穿液。使用一个新的收集管重复该步骤，直到流穿液的吸光度280nm接近基线；

(5)用5-10倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱柱上的重组蛋白。重复此步骤直到流穿液的吸光度280nm接近基线；收集流穿液，即为纯化后的蛋白溶液；

(6)采用A280(nm)紫外光吸收法，确定纯化后的蛋白溶液中蛋白浓度。

三、超滤置换

(1)纯化后的蛋白溶液加入Millipore(UFC5010BK，0.5ml，10K)，分批10000g离心3min，直至溶液剩余约150μl；

(2)轻轻加入300μl PBS(pH7.4)，10000g离心至剩余150μl，重复三次；

(3)PBS(pH7.4)洗脱超滤管收样，最终体积约1-2ml，留样5μl用于蛋白浓度测定和SDS-PAGE蛋白电泳检测；

(4)A280(nm)紫外光吸收法测定蛋白浓度，SDS-PAGE检测纯化样品纯度均大于90％(图3)，采用铝佐剂；或CpG佐剂；或脂质体佐剂；或油性佐剂即可产生新型冠状病毒免疫组合物，用于预防新型肺炎。

本发明中，SDS-PAGE电泳鉴定步骤如下：

一、样品处理

(1)还原样品处理：待测样品与5×Sample Buffer进行4：1混匀，75℃预热10min，10000g离心1min，取上清待测；

(2)非还原样品处理：待测样品与4×LDS Sample Buffer进行3：1混匀，75℃预热10min，10000g离心1min，取上清待测。

二、电泳检测

(1)取第一步处理待测样品，加样，待电泳，电压180V恒压电泳45min；

(2)eStain^TM L1蛋白染色仪染色3个循环，脱色一个循环染色；

(3)凝胶成像系统拍照，记录实验结果。

综合以上各实施例的结果可知，本发明Fc标签的融合促进新型冠状病毒结构蛋白形成二聚体，维持受体结合区(RBD)间表位，用于新型冠状肺炎疫苗或诊断产品的开发。实验证明：新型冠状病毒结构蛋白，特别是受体结合区(RBD)能够有效形成二聚体，安全性可控，纯化工艺简单，降低生产成本。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 华兰基因工程有限公司

<120> 一种2019-nCoV表面蛋白受体结合区融合蛋白制备方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 469

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Trp Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala

1 5 10 15

Ala Arg Ser Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn

20 25 30

Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe

35 40 45

Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala

50 55 60

Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys

65 70 75 80

Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val

85 90 95

Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala

100 105 110

Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp

115 120 125

Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser

130 135 140

Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser

145 150 155 160

Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala

165 170 175

Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro

180 185 190

Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro

195 200 205

Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr

210 215 220

Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val

225 230 235 240

Asn Phe Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

245 250 255

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

260 265 270

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

275 280 285

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

290 295 300

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser

305 310 315 320

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

325 330 335

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

340 345 350

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

355 360 365

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

370 375 380

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

385 390 395 400

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

405 410 415

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

420 425 430

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

435 440 445

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

450 455 460

Leu Ser Pro Gly Lys

465

<210> 2

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

atggccctgc ctgtgtggct gctggtgctg atgttctgga tcccagccgc tagatccaga 60

gtgcagccta ccgagtctat cgtgagattc cctaacatca caaacctgtg tcctttcggc 120

gaggtgttta acgccacaag attcgcctct gtgtacgcat ggaacagaaa gagaatctct 180

aactgtgtgg ccgattactc tgtgctgtac aacagcgcta gctttagcac attcaagtgt 240

tacggcgtga gccctacaaa gctgaacgat ctgtgtttta ccaacgtgta cgccgacagc 300

ttcgtgatca gaggcgatga ggtgaggcag atcgcccctg gccagaccgg aaagatcgcc 360

gattacaatt acaagctgcc cgatgatttt acaggctgtg tgatcgcctg gaactctaac 420

aacctggatt ctaaggtggg cggcaactac aactacctgt acagactgtt tagaaagagc 480

aatctgaagc cttttgagag agatatctcc acagagatct accaggccgg cagcacacca 540

tgtaatggcg tggagggctt taactgttac tttccactgc agtcttacgg atttcagcct 600

acaaacggcg tgggctacca gccatacaga gtggtggtgc tgagctttga gctgctgcac 660

gctcctgcta ccgtgtgtgg accaaagaag tctacaaacc tggtgaagaa caagtgcgtg 720

aacttcgata agacacacac ctgtccccct tgtcctgccc ctgagctgct gggcggccct 780

tccgtgtttc tgttccctcc taagcctaag gatactctga tgatctctcg gacacctgag 840

gtgacctgtg tggtggtgga tgtgagccac gaggatcctg aggtgaagtt taactggtac 900

gtggatggag tggaggtgca caacgctaag acaaagccta gagaggagca gtacgctagc 960

acatacaggg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgaa cggaaaggag 1020

tacaagtgta aggtgtctaa taaggccctg cctgccccaa ttgagaaaac catcagcaag 1080

gccaagggcc agcctagaga gccacaggtg tacaccctgc ctcctagcag agatgagctg 1140

accaagaacc aggtgtctct gacatgtctg gtgaagggct tctacccttc tgatatcgcc 1200

gtggagtggg agtctaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg 1260

gattctgatg gctccttctt cctgtactct aagctgacag tggacaagag cagatggcag 1320

cagggcaacg tgtttagctg ttctgtgatg catgaggccc tgcacaacca ctacacacag 1380

aagtctctgt ctctgtctcc tggcaagtag 1410

<210> 3

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

atggccctgc ccgtgtggct gctggtgctg atgttctgga tccccgccgc caggagcagg 60

gtgcagccca ccgagtccat cgtgcggttt cccaacatta ctaacctgtg ccccttcggc 120

gaggtgttta acgccacaag gttcgcctcc gtctacgcct ggaaccggaa gaggatcagc 180

aactgcgtgg ccgactacag cgtgctgtac aactccgcca gcttcagcac cttcaagtgc 240

tacggcgtgt cccccaccaa gctgaacgat ctctgcttca ccaacgtgta cgccgacagc 300

tttgtgatca ggggggacga ggtgcggcag atcgcccccg gccagaccgg gaagatcgcc 360

gattacaact acaagctgcc cgatgatttc accgggtgcg tgatcgcctg gaactccaac 420

aacctggact ccaaggtggg gggcaactac aactacctgt accggctctt caggaagagc 480

aacctgaagc ctttcgagcg ggatattagc acagagatct accaggccgg cagcacaccc 540

tgcaacgggg tggaggggtt caactgctac tttcccctgc agtcctacgg cttccagcca 600

acaaacggcg tcggctacca gccctacagg gtggtggtcc tgtccttcga gctgctgcac 660

gcccccgcca ccgtgtgcgg ccccaagaag agcacaaacc tggtgaagaa caagtgcgtg 720

aacttcgata agacacacac ctgccccccc tgccccgccc ccgagctgct ggggggcccc 780

tccgtgtttc tgtttccccc caagcccaag gacacactga tgatcagcag gacccccgag 840

gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac gaggaccccg aggtgaagtt caactggtac 900

gtcgatgggg tggaggtgca caacgccaag accaagccca gggaggagca gtacgccagc 960

acataccggg tggtgtccgt gctgacagtg ctgcaccagg attggctgaa cgggaaggag 1020

tacaagtgca aggtcagcaa caaggccctg cccgccccca tcgagaaaac catctccaag 1080

gccaaggggc agccacggga gccccaggtg tacaccctcc cccccagccg ggacgagctg 1140

accaagaacc aggtgagcct cacctgcctg gtgaagggct tctacccctc cgatatcgcc 1200

gtggagtggg agtccaacgg ccagcccgag aacaactaca agacaacacc ccccgtgctg 1260

gacagcgatg ggagcttctt cctgtacagc aagctgaccg tggataagag ccggtggcag 1320

caggggaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacacag 1380

aagagcctga gcctgagccc agggaagtag 1410

Claims

1.一种新型冠状病毒受体结合区二聚体的制备方法，包括：将SEQ ID No.1所示的新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的编码基因通过含有所述编码基因的重组表达载体导入宿主细胞中，得到重组细胞，培养所述重组细胞，得到新型冠状病毒受体结合区二聚体；所述宿主细胞为Expi293F细胞；

所述新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的编码基因为下述（a1）或（a2）：

（a1）序列表中SEQ ID No.2所示的DNA分子；

（a2）序列表中SEQ ID No.3所示的DNA分子。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体为将所述编码基因插入表达载体得到的能够表达所述新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的载体。

3.一种新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的制备方法，包括：将权利要求1中所述新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的编码基因通过含有所述编码基因的重组表达载体导入宿主细胞中，得到重组细胞，培养所述重组细胞，得到新型冠状病毒受体结合区融合蛋白。

4.SEQ ID No.1所示的新型冠状病毒受体结合区融合蛋白。

5.权利要求1中所述新型冠状病毒受体结合区融合蛋白的编码基因。

6.含有权利要求5所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或重组细胞系。