CN104710533A - sDR5-Fc融合蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及疾病的治疗，具体涉及一种sDR5-Fc融合蛋白及其用途，该sDR5-Fc融合蛋白包括：sDR5功能性序列的部分和免疫球蛋白Fc区，所述sDR5功能性序列的部分和免疫球蛋白Fc区之间直接连接和/或通过连接片段连接。本发明采用天然性蛋白DR5与抗体Fc段融合，在具有功能性蛋白的生物学活性的基础上延长了体内半衰期，无需频繁给药，降低了病人的痛苦和治疗成本。

Description

sDR5-Fc融合蛋白及其用途

【技术领域】

本发明属于生物技术领域，涉及疾病的治疗，具体涉及一种sDR5-Fc融合蛋白及其用途。

【背景技术】

肝炎是严重危害人民生命健康且死亡率较高的一种疾病，病因主要包括病毒感染、过度酒精摄入和服入化学毒物等造成肝脏实质细胞的破坏，其致病机制复杂，其致病因素包括病毒、细菌、寄生虫、化学毒物、药物和毒物、酒精等。肝炎通常可以分为多种不同的类型：根据病因来分，可以分为病毒性肝炎、药物性肝炎、酒精性肝炎、中毒性肝炎等；根据病程长短来分，可以分为急性肝炎、慢性肝炎等；根据病情轻重程度，慢性肝炎又可以分为轻度、中度、重度等。

临床上对肝炎的诊断，通常是结合了上述多种方法分类的，早期肝炎一般用五味子的养肝片可以恢复缓解。但这仅仅适用于肝炎发病初期，且炎症较轻没有组织坏死的情况，且作用非常有限，疗效极慢，不显著。近年来诊断肝炎的诊治有一些小分子化学药物涌现，如阿德福韦酯胶囊，但该类小分子药物对肝炎的作用仅仅是暂时缓解，治标不治本，且毒副作用较大。

已知肿瘤坏死因子（TNF）家族配体是最多效的细胞因子之一，它们诱导许多细胞应答，包括细胞毒性、抗病毒活性、免疫调节活性和对几种基因的转录调节。对TNF家族的配体的细胞应答不仅包括正常生理应答，还包括与细胞凋亡增加或细胞凋亡抑制相关联的疾病。细胞凋亡---程序化细胞凋亡是一种参与清除免疫系统外周T淋巴细胞的生理机制，其调节障碍导致许多不要的发病过程。与细胞存活增加或细胞凋亡抑制相关的疾病包括癌症、自身免疫失调、病毒感染、炎症、移植体对抗宿主疾病、急性移植体排斥和慢性移植体排斥。与细胞凋亡增加相关的疾病包括AIDS、神经性性疾病、骨髓发育不良综合症、局部缺血性损伤、毒素诱导的肝脏疾病、败血症性休克、恶病质和厌食。

因此，TNF家族的配体在治疗和预防肝炎中具有潜在应用价值。死亡受体5（death receptor5，DR5）是目前所发现的结构和功能比较清楚的死亡受体之一，属于TNFR（tumor necrosis factor receptor）超家族。DR5是与DR4（deathreceptor4）具有高度同源性的分子，属于Ⅰ型膜蛋白，在正常组织细胞表面中广泛低量表达，在炎症、缺血或癌变的组织细胞内高表达。DR5基因的编码框全长约1.4kb，编码411个氨基酸，由4个部分组成：1-55氨基酸是信号肽，84-179氨基酸残基为含有2个富含半胱氨酸的重复功能区的胞外区，184-206氨基酸为跨膜区，胞内区含有67个氨基酸的死亡结构域。DR5的mRNA有两种不同序列长度的亚型，长和短两种mRNA仅有87bp的差别。研究发现两种mRNA普遍存在于各种组织细胞中，长的片段表达占多数，而两个片段的比例变化取决于组织类型。DR5能特异性结合肿瘤坏死因子相关诱导配体从而诱导细胞凋亡。研究表明，在人体细胞最适培养温度37℃时，DR5相对于DR4、DcR1、DcR2等TRAIL的其他受体以最强的亲和力与TRAIL结合，在细胞凋亡中发挥重要的作用。目前，关于DR5介导的细胞凋亡信号通路已经研究比较清楚。DR5与配体相结合后引起DR5寡聚化而被激活，被激活的死亡受体募集FADD分子。FADD通过DED募集Caspase-8的前体（Pro-caspase-8），形成一个死亡信号复合体DISC（death-inducing signaling complex）。Pro-caspase-8被激活形成Caspase-8，Caspase-8通过非线粒体依赖途径和线粒体依赖途径引发细胞凋亡。

因此，如何将DR5应用于肝炎治疗成为亟待解决的问题。现有技术中，重组蛋白DR5在体内半衰期短，往往还未达到最佳治疗浓度和效果已被清除，必须频繁给药，增加了病人的痛苦和治疗成本。

【发明内容】

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种sDR5-Fc融合蛋白，解决现有技术中DR5蛋白体内半衰期短、需频繁给药的技术问题。

本发明为解决上述技术问题所采用的方案如下：

一种sDR5-Fc融合蛋白，包括：sDR5功能性序列的部分和免疫球蛋白Fc区，所述sDR5功能性序列的部分和免疫球蛋白Fc区之间直接连接和/或通过连接片段连接。

优选地，所述sDR5功能性序列具有：

SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1的氨基酸序列有至少80%同一性的氨基酸序列；或者

SEQ ID NO：2的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：2的核苷酸序列有至少80%同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

优选地，所述免疫球蛋白Fc区是人IgG的Fc区。

优选地，所述免疫球蛋白Fc区是人IgG1的Fc区。

优选地，所述免疫球蛋白Fc区为：

SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：3的氨基酸序列有至少80%同一性的氨基酸序列；或者

SEQ ID NO：4的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：4的核苷酸序列有至少80%同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

优选地，所述融合蛋白为：

SEQ ID NO：5的氨基酸序列；或者

SEQ ID NO：6的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

本发明还提供了一种编码sDR5-Fc融合蛋白的重组载体，为以真核表达载体pcDNA3.1（+）为载体，融合了sDR5-Fc DNA片段，所述sDR5-Fc DNA片段用Nhe I和Kpn I双酶切后插入真核表达载体pcDNA3.1（+）的Nhe I/Kpn I之间，所述sDR5-Fc DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：6所示。

优选地，所述重组载体具有SEQ ID NO：7的核苷酸序列。

本发明还提供了用上述重组载体转染的细胞，其中，所述细胞为293T细胞或CHO细胞。

本发明另外提供了一种制备sDR5-Fc融合蛋白的方法，通过在原核细胞或真核细胞中表达权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白来进行。

本发明还提供了一种药物组合物，包括上述的融合蛋白、核苷酸序列为SEQID NO：6所示的核酸分子、上述的重组载体或上述的细胞，以及可药用载体。

本发明还提供了上述的融合蛋白、上述的重组载体、上述的细胞或上述的药物组合物在制备用于治疗或预防肝炎的药物中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于，本发明采用天然性蛋白DR5与抗体Fc段融合，在具有功能性蛋白的生物学活性的基础上延长了体内半衰期，无需频繁给药，降低了病人的痛苦和治疗成本。

【附图说明】

图1是本发明实施例1的RT-PCR结果电泳图；

图2是本发明实施例2的重组载体pcDNA3.1-sDR5-Fc的结构图；

图3是本发明实施例2的重组载体转染细胞后的western blotting结果图；

图4是本发明实施例2的重组蛋白的测序结果图。

【具体实施方式】

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

除非另有定义，本发明使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员可参考Current Protocolsin Molecular Biology（Ausubel）。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。

尽管本发明的广义范围所示的数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自测量中存在的标准偏差所致。另外，本发明公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应理解为包含最小值1和最大值10之间（包含端点）的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。另外，任何称为“并入本文”的参考文献应理解为以其整体并入。

另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。术语“或”可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有清楚指明。

本文使用的术语“Fc”、“Fc区”、“Fc片段”或“免疫球蛋白Fc区”等表示免疫球蛋白的可结晶片段，在本发明中，所述Fc区优选人IgG1的Fc区。

术语“Fc融合蛋白”指将异源蛋白质的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能相结合的抗体样分子。从结构上来说，Fc融合蛋白包含具有所需结合特异性的氨基酸序列以及免疫球蛋白恒定结构域序列。Fc融合蛋白分子通常包含受体或配体的结合位点。所述免疫球蛋白恒定结构域序列可以获得自任何免疫球蛋白，例如IgG-1，IgG-2，IgG-3或IgG-4亚型，IgA（包括IgA-1和IgA-2），IgE，IgD或IgM。

术语“部分”和“片段”可互换的指代多肽、核酸或其他分子构建物的一部分。

具有与DR5片段的参照氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列指所述氨基酸序列在DR5片段的参照序列中每100个氨基酸中可以有不超过5个氨基酸改变，除此之外，该氨基酸序列与参照序列都相同，换句话说，要获得具有与参照氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列，参照序列中不超过95%的氨基酸残基可以被缺失或用其它氨基酸取代，或者可以向参照序列的这些改变可以发生在参照氨基酸序列的氨基或羧基末端，或者两个末端之间的任何位置，可以单个地或者以1或多个相连簇的形式分布在参照序列残基中。

事实上，任何具体氨基酸序列与SEQ ID No：？所示的氨基酸序列或其片段是否至少95%相同可以用已知的计算机程序（如Bestfit程序）来确定。当使用Bestfit或其它序列比对程序来确定一个具体序列与本发明参照序列是否95%相同时，要设置参数以便相对参照氨基酸序列的全长计算相同百分比，并且允许有同源性的缺口占参照氨基酸总数的不超过5%。

本发明的sDR5-Fc融合蛋白包括sDR5功能性序列的部分和免疫球蛋白Fc区，sDR5功能性序列的部分和免疫球蛋白Fc区之间直接连接和/或通过连接片段连接。

其中，sDR5功能性序列具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1的氨基酸序列有至少80%同一性的氨基酸序列。

在本发明的一个较佳方案中，sDR5功能性序列具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：2的核苷酸序列有至少80%同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

进一步地，免疫球蛋白Fc区是人IgG的Fc区；更近一步地，免疫球蛋白Fc区是人IgG1的Fc区。

具体地，免疫球蛋白Fc区具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO：3的氨基酸序列有至少80%同一性的氨基酸序列；在本发明的另一个较佳方案中，免疫球蛋白Fc区具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：4的核苷酸序列有至少80%同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

在本发明的最优选方案中，融合蛋白的sDR5功能性序列的部分和免疫球蛋白Fc区采用柔性肽序列连接，即：甘氨酸-丝氨酸（GS），以上连接方式可确保sDR5功能性序列的部分和免疫球蛋白Fc区自由折叠、互不影响，即本发明的最优选方案中，融合蛋白具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列；或者具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

为了保证功能蛋白的自然折叠，具有天然构象，且具有翻译后修饰，本发明的融合蛋白采用真核表达系统进行表达，为以真核表达载体pcDNA3.1（+）为载体，融合了sDR5-Fc DNA片段，构建了一种编码sDR5-Fc融合蛋白的重组载体，其中，所述sDR5-Fc DNA片段用Nhe I和Kpn I双酶切后插入真核表达载体pcDNA3.1（+）的Nhe I/Kpn I之间，sDR5-Fc DNA片段的核苷酸序列为SEQID NO：6所示。

实施例1

sDR5基因的获取：

分别提取肺癌细胞系A549、H1299、SPC-A1及肝癌细胞系HepG2的RNA，通过RT-PCR技术获取sDR5基因，并采用2%琼脂糖凝胶电泳检测基因大小，结果如图1所示，所得sDR5基因片段大小符合预期，经测序，所得sDR5基因序列为SEQ ID NO：2所示。

实施例2

sDR5-Fc DNA片段序列的重叠及真核表达载体的构建：

通过重叠PCR技术，将实施例1所得sDR5基因序列（SEQ ID NO：2）与Fc序列（SEQ ID NO：4）进行重叠，形成sDR5-Fc DNA片段（SEQ ID NO：6）；

将sDR5-Fc DNA片段和真核表达载体pcDNA3.1（+）分别用Nhe I和Kpn I进行双酶切，后用连接酶将sDR5-Fc DNA片段插入真核表达载体pcDNA3.1（+）的Nhe I/Kpn I之间，得到重组载体pcDNA3.1-sDR5-Fc，结果如图2所示，经测序，重组载体核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

重组蛋白表达：

用脂质体转染试剂jetPRIME将实施例2所得重组载体pcDNA3.1-sDR5-Fc转染293T或者CHO细胞，48小时后去细胞培养上清10μl，使用抗人类Fc抗体western blotting检测融合蛋白的表达，结果如图3所示，可见sDR5-Fc融合蛋白在CHO或293T细胞中均得到表达，重组蛋白大小为40kD，符合预期大小。对所得重组蛋白进行测序，结果如图4所示，上方为构建的sDR-Fc融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO：5），下方为重组蛋白部分片段的测序结果，两者序列完全匹配，本实施例的重组载体表达效果较好。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (12)

1.一种sDR5-Fc融合蛋白，其特征在于，包括：sDR5功能性序列的部分和免疫球蛋白Fc区，所述sDR5功能性序列的部分和免疫球蛋白Fc区之间直接连接和/或通过连接片段连接。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述sDR5功能性序列具有：

SEQ ID NO：1的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：1的氨基酸序列有至少80%同一性的氨基酸序列；或者

SEQ ID NO：2的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：2的核苷酸序列有至少80%同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白Fc区是人IgG的Fc区。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白Fc区是人IgG1的Fc区。

5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白Fc区为：

SEQ ID NO：3的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：3的氨基酸序列有至少80%同一性的氨基酸序列；或者

SEQ ID NO：4的核苷酸序列所编码的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO：4的核苷酸序列有至少80%同一性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为：

SEQ ID NO：5的氨基酸序列；或者

SEQ ID NO：6的核苷酸序列所编码的氨基酸序列。

7.一种编码sDR5-Fc融合蛋白的重组载体，其特征在于，为以真核表达载体pcDNA3.1（+）为载体，融合了sDR5-Fc DNA片段，所述sDR5-Fc DNA片段用Nhe I和Kpn I双酶切后插入真核表达载体pcDNA3.1（+）的Nhe I/Kpn I之间，所述sDR5-Fc DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：6所示。

8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体具有SEQ IDNO：7的核苷酸序列。

9.用权利要求7或8所述的重组载体转染的细胞，其特征在于，所述细胞为293T细胞或CHO细胞。

10.一种制备sDR5-Fc融合蛋白的方法，其特征在于，通过在原核细胞或真核细胞中表达权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白来进行。

11.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1至6任一项所述的融合蛋白、核苷酸序列为SEQ ID NO：6所示的核酸分子、权利要求7所述的重组载体或权利要求9所述的细胞，以及可药用载体。

12.权利要求1至6任一项所述的融合蛋白、权利要求7或8所述的重组载体、权利要求9所述的细胞或权利要求11所述的药物组合物在制备用于治疗或预防肝炎的药物中的用途。