CN110023332A - 包含sasp调节剂和衰老衰减剂的组合物及其用于调节细胞衰老的用途 - Google Patents

包含sasp调节剂和衰老衰减剂的组合物及其用于调节细胞衰老的用途 Download PDF

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Abstract

本文描述了用于调节细胞的细胞衰老或诱导细胞中衰老相关分泌表型(SASP)的组合物和方法。该方法通常包括将IRE1a的水平或活性调节为控制细胞衰老和诱导SASP的平均值。还描述了用于治疗和预防眼血管疾病的方法，其包括使受试者眼中的细胞与双胍化合物以及包含双胍化合物的眼用组合物接触。

Description

包含SASP调节剂和衰老衰减剂的组合物及其用于调节细胞衰 老的用途
相关申请的交叉引用
本申请是于2017年9月22日提交的序列号为PCT/CA2017/*并根据PCT第21条第2款以英文公布的PCT申请，该申请本身要求于2016年9月23日提交的美国临时申请序列号62/474,827、于2016年9月23日提交的美国临时申请序列号62/398,797和于2016年9月22日提交的美国临时申请序列号62/398,183的权益，这些申请的全部内容通过引用并入本文。
涉及序列表
该申请包含名称为“12810_651_SL_ST25.txt”的计算机可读形式的序列表，其在2017年9月22日创建并且具有大约249KB的大小。该计算机可读形式通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及用于调节细胞衰老的组合物和方法。更具体地，本发明涉及衰老相关分泌表型(SASP)在预防和治疗与细胞衰老相关的疾病和病症如血管性眼病中的调节。
背景技术
细胞衰老通常被定义为这样的细胞病症，其中细胞保持活力和代谢活性但丧失了增殖能力。细胞衰老可能由各种刺激或因素引起，包括由于DNA末端复制导致的端粒缩短、DNA损伤、肿瘤抑制基因和癌基因的活性改变、氧化应激、炎症、化疗剂以及暴露于紫外线照射和电离辐射(Kuilman等人,Genes&Development.(2010)24:2463-2479)。
已经描述了导致衰老表型的三种类型的细胞途径：复制衰老、过早衰老和分化后的衰老(SAD)。复制衰老是在大量细胞分裂后发生的衰老类型。例如，当在培养物中生长时，原代细胞在大约50次细胞分裂后经历细胞衰老。这种进一步增殖的障碍被认为是由于每次连续细胞分裂导致细胞端粒缩短，导致细胞达到触发DNA损伤应答的点(所谓的“Hayflick极限”)，最终导致诱导增殖停滞和衰老。
在没有端粒缺失或功能障碍的情况下也能够诱导细胞衰老。这种类型的细胞衰老被称为过早的细胞衰老，并且可能由多种刺激引起，包括例如化疗、放疗、暴露于DNA损伤化合物或刺激如阳光和紫外线引起的DNA损伤、氧化应激、炎症、强有丝分裂信号传导和核糖体应激。DNA损伤可以采取染色体功能障碍的形式，例如由有丝分裂期间不均匀的染色体分离引起的非整倍性、DNA链断裂或DNA的化学修饰(例如烷基化)。过早的细胞衰老也可能由DNA损伤应答(DDR)诱导，其可能反映或可能不反映实际的DNA损伤。
最近，已经很明显的是衰老过程不仅仅需要简单地停止细胞生长，因为终末分化的有丝分裂后细胞已经显示出在几种疾病中获得衰老样表型(包括SASP)。第三种类型的衰老被称为分化后的衰老(SAD)，并且可以由各种应激物诱导，包括遗传毒性、蛋白质毒性、氧化和核糖体应激物(参见例如Naylor RM等人,2013Clin.Pharmacol Ther.93(1):105-116)。
并非所有衰老细胞都表达所有可能的衰老因子。尽管如此，衰老细胞的显著特征包括(i)生长停滞，(ii)细胞形态增大和变平，(iii)细胞核中的DNA损伤灶，(iv)生长因子蛋白酶、细胞因子和其它因子的分泌，其定义为衰老相关的分泌表型(SASP)，(v)衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性(部分反映溶酶体物质的增加)，(vi)肿瘤抑制因子p16INK4a的表达(可能激活pRB并导致衰老相关的异染色质灶(SAHF)的形成)，和(vii)PML核体的数量和大小的增加。此外，尽管已知多种因子诱导细胞衰老，但已显示两种肿瘤抑制途径p53/p21和p16INK4/pRB在细胞衰老的调节中起关键作用。
最近的工作已经将细胞衰老的参与扩展到复杂的生理过程，如胚胎发生和组织修复(19-22)。相反，在慢性疾病和衰老中，衰老细胞的增加会加重组织功能障碍(23-25)。根据病情，细胞衰老已被证明是有益的或有害的(参见Rodier和Campisi,JCB,2011,192(4):547-556和Naylor等人,Clin Pharmacol Ther.201393(1):105-116关于细胞衰老的综述)。
细胞衰老已经与多种与年龄相关的疾病和病症的发病机制有因果关系，包括表皮变薄、皮肤皱纹、脱发和头发灰白、肌肉厚度和肌肉力量减少(肌肉减少症)、炎症发生率增加、代谢紊乱、耐力丧失、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、神经退行性疾病、骨关节炎、骨质疏松症、帕金森病和白内障。此外，认为细胞衰老有助于在化学疗法和/或放射疗法期间和之后经历的健康组织的损害，以及化学疗法和/或放射疗法后的不良健康影响。
细胞衰老也可能是有益的。例如，其作为响应DNA损伤的抗癌机制的作用已经建立了数十年。此外，衰老细胞已被证明对有效的组织修复和伤口愈合很重要。实际上，SASP的许多因素(例如参与伤口愈合的生长因子和蛋白酶，杀死病原体的免疫细胞的引诱剂和动员干细胞或祖细胞的蛋白质)对于组织修复是重要的。因此，如果需要，SASP还可用于向周围组织传递细胞损伤/功能障碍并刺激修复。最近的研究支持这一概念。例如，研究已表明，在伤口附近迅速建立衰老细胞，以帮助(通过SASP)产生炎症反应，从而在增殖阶段启动愈合过程。这种衰老的快速增强吸引并激活免疫细胞以对抗感染并清除死细胞和碎片。在重塑阶段，衰老细胞在溶解增殖期期间沉积的纤维蛋白质和限制瘢痕形成中起作用。在肝纤维化、心肌梗塞和心脏纤维化、动脉粥样硬化和肺动脉高压中也已报道了细胞衰老的有益作用。
因此，防止细胞经历细胞衰老，或防止DNA损伤、DNA损伤应答途径或将激活衰老(例如可导致SASP)的染色质变化，逆转或限制细胞衰老和/或减少经历细胞衰老的细胞中的旁分泌衰老，将有利于预防或治疗其中衰老有害的疾病和病症。相反，在受细胞衰老正面影响的疾病和病症中促进细胞衰老可以改善恢复或降低这些疾病或病症的严重程度。
肥胖及其随后的代谢综合征后遗症、2型糖尿病(TIIDM)和心血管并发症构成全球大流行。自1980年以来，全球肥胖人数已增加了一倍以上，2014年超过19亿成年人超重，其中6亿人肥胖(世界卫生组织(WHO)，2015年)。
超重和肥胖被定义为可能损害健康的异常或过多的脂肪堆积。体重指数(BMI)是一个简单的身高体重指数，通常用于对成人超重和肥胖进行分类。它被定义为一个人的体重(千克)除以他的身高(米)的平方(kg/m2)。WHO定义为：(i)BMI大于或等于25kg/m2是超重；和(ii)BMI大于或等于30kg/m2是肥胖。BMI为超重和肥胖提供了有用的人口水平的度量，因为它对于男女和所有年龄的成年人都是相同的。然而，它被认为是粗略的指导，因为它可能不对应于不同个体的相同程度的肥胖。
在一系列病症中观察到脂肪蓄积，例如肥胖、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、代谢综合征和脂肪营养不良综合征。BMI升高(体重过重或肥胖)是以下疾病和病症的主要危险因素，例如：心血管疾病((CVD)，主要是心脏病和中风)；和胰岛素抵抗(这增加了发展成TIIDM的风险)。过多的脂肪堆积也会增加患其它疾病或病症的风险，包括肌肉骨骼疾病(特别是骨关节炎)；和一些癌症(子宫内膜癌、乳腺癌和结肠癌)。随着BMI的增加，这些疾病的风险通常会增加。
代谢综合征(也称为X综合征)影响肥胖者和腹部脂肪量增加的人群，其特征是胰岛素抵抗、血脂异常(高甘油三酯血症、血清HDL胆固醇水平低、LDL胆固醇水平升高)和高血压。这些条件是相互关联的，并共享潜在的介质、机制和途径。脂肪分布的变化、腰臀比(WHR)和中央脂肪积累的增加与代谢风险指数的增加有关。
与代谢综合征相关的大多数病症都没有症状，但是腰围较大是一个明显的迹象。一些组织具有诊断代谢综合征的标准。NCEP ATP III定义是最广泛使用的代谢综合征标准之一。它结合了高血糖/胰岛素抵抗、内脏肥胖、致动脉粥样硬化血脂异常和高血压/内皮功能障碍的关键特征。根据美国国立卫生研究院使用的指南，如果存在以下三种或更多种特征或受试者正在服用药物来控制它们，则受试者患有代谢综合征：(i)内脏肥胖(即腰围较大——例如，女性腰围测量为至少35英寸(89厘米)，男性为40英寸(102厘米))；(ii)高甘油三酯水平——血液中发现的这类脂肪为150毫克/分升(mg/dL)，或1.7毫摩尔/升(mmol/L)，或更高；(iii)高密度脂蛋白(HDL)胆固醇降低——“好”胆固醇，男性低于40mg/dL(1.04mmol/L)或女性低于50mg/dL(1.3mmol/L)；(iv)血压升高——130/85毫米汞柱(mmHg)或更高；(v)空腹血糖升高——100mg/dL(5.6mmol/L)或更高。
目前公认的肥胖诱导代谢综合征的机制是脂肪脂质积累引发细胞因子释放、诱导M1激活和全身炎症(Olefsky和Glass,2010)。虽然慢性炎症和巨噬细胞活化被认为会导致胰岛素抵抗(Osborn和Olefsky,2012)，但是脂肪组织炎症是否是一种允许有效储存过量营养的适应性反应(Wernstedt Asterholm等人,2014)以及适当的血管发生是否是脂肪组织扩张的先决条件(Cullberg等人,2013)仍然存在争议。脂肪细胞耗氧量(Lee等人,2014)和脂肪组织血管重塑(Sung等人,2013)均控制脂肪组织的炎症状态，随后导致胰岛素不敏感和高血糖症。
尽管社会对肥胖相关问题的认识不断提高，但超重和肥胖受试者的比例仍在上升。因此，鉴于其高患病率和相关的发病率和死亡率，仍然需要开发用于预防和/或治疗与脂肪蓄积相关的疾病和病症的新方法。
本说明书涉及许多文献，其内容通过引用整体并入本文。
发明内容
缺血性视网膜病变中血管床的分解，无论是糖尿病视网膜病变(DR)中的血糖驱动还是早产儿视网膜病变(ROP)中的氧驱动，都会产生经历一系列损害细胞功能的生化和炎症应激源的缺氧/缺血性中枢神经系统(CNS)组织(1-3)。这些无血管区是介导病理性血管发生的促血管发生因子的来源(4)，这可以通过消融这些区域的激光光凝治疗的临床成功来证明(5)。虽然已经投入了大量精力来理解随后的大量病理性视网膜前血管发生，但在神经组织缺氧的前兆状态期间发挥作用的细胞过程相对知之甚少。更全面地了解在视网膜缺血的初始阶段运行的细胞反应可以提供治疗途径，使有可能面对DR的9300万人和每年出生的新生儿视网膜疾病的1500万早产儿中的一部分受益(6-8)。
中枢神经元如视网膜神经节细胞(RGC)直接与缺血性视网膜病变中的退变脉管系统相关，需要稳定的代谢供应以实现正常功能。有趣的是，在DR进展期间，视网膜血管病变程度(9)与RGC中观察到的相对微妙和持久的形态与功能畸变之间存在脱节(10-12)。此外，虽然有证据支持DR中的RGC凋亡(13-15)，神经元死亡的幅度和动态仍然是一个争论的话题(16-18)。DR中视网膜神经节神经元的相对弹性表明它们要么接受来自替代血管丛的代谢供应，要么启动保护机制，使它们对缺血诱导的细胞死亡更不敏感。
在缺血性损伤期间触发以保持神经组织完整性的机制赋予关键的生存优势并允许及时修复和恢复功能(44、61、62)。导致细胞衰老的机制可能与细胞凋亡的机制平行进化以限制肿瘤发生(21)，但对于有丝分裂后CNS神经元(例如在视网膜中发现的)，细胞衰老可预防应激源诱导的神经退变。虽然在衰老和疾病的背景下研究了将近60年(63)，但申请人的研究在本文中报道了CNS中风化缺血中细胞衰老的新作用。这些研究进一步揭示了SEMA3A在调节衰老中的先前未描述的作用，包括病理过程中的旁分泌衰老，并揭示了在与衰老相关的疾病和病症中调节SEMA3A活性的治疗益处。
更具体地，在一个方面，申请人已经鉴定了由血管化视网膜区域中的神经元触发的未预料到的机制，其中它们通过激活ER应激效应肌醇-需求酶-1α(IRE-1α)的内切核糖核酸酶活性而进入过早的细胞衰老状态并采用衰老相关分泌表型(SASP)。通过SASP产生的因子包括分泌的胚胎模式提示轴突导向因子3A(SEMA3A)，通过缺血性视网膜向神经元、小胶质细胞和上覆脉管系统(旁分泌衰老)传播衰老，促成破坏性视网膜前血管发生。
1、包含SASP调节剂和衰老衰减剂的组合物及其用于治疗和预防眼部疾病的用途。
在第一方面，本文描述的数据显示衰老途径最初作为体内平衡机制参与视网膜以便抵抗缺氧应激。然而，当持续时，衰老途径变得病理性并损害组织完整性。细胞衰老的结果是SASP通过分泌炎症因子阻碍了足够的血运重建。值得注意的是，如本文所示，对患有增殖性糖尿病性视网膜病的患者的分析显示其玻璃体中的SASP相关细胞因子。此外，用众所周知的双胍二甲双胍或对IRE1α的药理学或遗传干扰的SASP的药理学抑制限制衰老，增强修复性血管再生，防止破坏性新血管形成(图6H-J)，并且在体内停止视网膜病理学。这些数据为先前未描述的病理血管发生中细胞和旁分泌衰老的范例提供了证据，并揭示了SASP调节剂的眼部递送治疗眼部血管疾病(血管病)如视网膜病变以及年龄相关性黄斑退变(AMD)和黄斑水肿的治疗益处。
因此，根据本发明，提供了一种治疗或预防血管性眼病或病症(眼血管病变，特别是与衰老相关的眼病或病症，例如视网膜病变)的方法，其包括减少(减弱/抑制)受试者眼睛中的细胞衰老。通过使受试者的细胞与一种或多种减少细胞衰老的化合物(衰老抑制剂)接触，能够减少细胞衰老。在实施方式中，衰老抑制剂减少或抑制眼细胞中的SASP。
本发明还提供了一种抑制视网膜血管发生(病理性新血管形成)的方法，其包括向受试者施用衰老抑制剂(例如SASP抑制剂)。在实施方式中，视网膜血管发生继发于缺血。
本发明还提供了一种促进眼血管修复和/或减轻眼缺血的方法，其包括向受试者施用衰老抑制剂(例如SASP抑制剂)。
本发明还提供了一种预防或减少眼部细胞衰老的方法，其包括向受试者施用衰老抑制剂。在实施方式中，衰老抑制剂是SASP抑制剂。
本发明还提供了一种预防或减少眼部细胞衰老的方法，其包括使眼细胞与衰老抑制剂接触。在实施方式中，衰老抑制剂是SASP抑制剂。
在实施方式中，上述衰老是旁分泌衰老。在实施方式中，衰老是分化后的衰老。在实施方式中，衰老是过早衰老。在实施方式中，过早衰老的特征在于IRE1α的表达和/或RNA酶活性的增加。在实施方式中，衰老是视网膜衰老。在实施方式中，衰老的特征在于(i)P16INK4a、Tp53、IRE1a、Cdkn1a Cdkn2a的表达和/或活性和/或衰老相关的β-gal活性增加；(ii)γH2Ax和/或PML的表达；和/或(iii)衰老相关分泌表型(SASP)的表达。在实施方式中，SASP包含IL-1β、IL-6、Pai1、TGFβ1、IRE1a和/或VEGF-.a的分泌。在实施方式中，上述SASP继发于细胞缺血。
在实施方式中，细胞是人细胞。在实施方式中，细胞是视网膜细胞。在实施方式中，细胞是内皮细胞。在实施方式中，细胞是小胶质细胞。在实施方式中，细胞是神经元。在实施方式中，细胞是视网膜神经节细胞。在实施方式中，细胞是视网膜神经节神经元。在实施方式中，细胞是血管细胞。在实施方式中，细胞是血管内皮细胞。在实施方式中，细胞不是血管细胞(即它位于无血管区域/部位)。在实施方式中，细胞是成纤维细胞。在实施方式中，细胞是巨噬细胞。
在实施方式中，施用是区域或局部眼部施用。在实施方式中，局部眼部施用是结膜下(sub-tenons)、玻璃体内、眼球后、后巩膜下或前房内施用。在实施方式中，局部眼部施用玻璃体内施用。在具体实施方式中，局部眼部施用玻璃体内注射。
本发明还涉及一种包含用于本发明方法的衰老抑制剂或SASP抑制剂的组合物。在实施方式中，组合物是眼用组合物。在实施方式中，组合物包含合适的药物运载体、稀释剂或赋形剂。在实施方式中，合适的药物运载体、稀释剂或赋形剂通常不是与本文公开的抑制剂以混合物的形式存在(即是非天然存在的运载体或该组合物在自然界中不是天然存在的，即是合成的或人造的)。在实施方式中，该组合物用于治疗或预防血管性眼病或病症。在实施方式中，该组合物用于抑制视网膜血管发生。在实施方式中，该组合物用于促进眼血管修复和/或减少眼缺血。在实施方式中，该组合物用于预防或减少眼部细胞衰老。在实施方式中，该组合物用于制备用于(i)治疗或预防血管性眼病或病症；(ii)抑制视网膜血管发生(例如病理性视网膜新生血管形成)；(iii)促进眼部血管修复和/或减轻眼缺血；和/或(iv)预防或减少眼部细胞衰老的药物。
在实施方式中，上述SASP抑制剂不是IRE1α的抑制剂。在实施方式中，SASP抑制剂是双胍化合物。在实施方式中，双胍化合物是二甲双胍、苯乙双胍、丁二胍、氯胍、氯丙胍、癸烷双胍A或癸烷双胍B。在实施方式中，双胍化合物是二甲双胍。在实施方式中，SASP抑制剂是IRE1α的抑制剂。
在实施方式中，血管性眼病或病症是糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、缺血性视网膜病变、高血压性视网膜病变、药物诱导的视网膜血管病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关性黄斑退变、青少年黄斑退变、视网膜新生血管形成、视网膜中央静脉阻塞、分支视网膜静脉阻塞、脉络膜新生血管、息肉状脉络膜血管病变、眼部物理损伤、青光眼、孔源性视网膜脱离(RRD)、视网膜血管炎、视网膜巨大动脉瘤、视网膜微动脉瘤、Fuch氏营养不良、缺血性视神经病变、黄斑毛细血管扩张、视神经炎、引流综合征、视网膜色素变性、葡萄膜炎、缺血性视神经病变(ION)或斯坦加特病。在实施方式中，血管性眼病或病症是糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关性黄斑水肿、视网膜新生血管、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞或脉络膜新生血管形成。在实施方式中，血管性眼病是糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、干性(萎缩性)年龄相关性黄斑退变、湿性(渗出性)年龄相关性黄斑退变、分支视网膜静脉阻塞或黄斑性角膜扩张症。
在实施方式中，用SASP抑制剂或本发明的组合物治疗的受试者已被诊断患有上述血管性眼病或病症之一。在实施方式中，受试者已被诊断患有糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关性黄斑病变、病理性视网膜新生血管形成、视网膜中央静脉阻塞、分支视网膜静脉阻塞、脉络膜新生血管形成、息肉状脉络膜血管病变或黄斑性角膜扩张症。
2、用于调节细胞衰老的组合物和方法，包括IRE1α或SEMA3A调节剂。
(i)IRE1α调节剂
本发明还提供了抑制或预防(i)细胞的细胞衰老或(ii)细胞衰老相关分泌表型(和/或其诱导)的方法，包括降低IRE1α表达、活化或活性。本发明还涉及抑制或预防受试者的(i)细胞的细胞衰老或(ii)诱导细胞衰老相关分泌表型的方法，其包括向所述受试者施用IRE1α抑制剂。在实施方式中，本发明的方法减少所述细胞中的IRE1α活化；SA-β-gal活性；和/或Pai1、IL-6、Il-1b、TGF-β、tp53、XBP1和/或Vegfa的表达。
本发明进一步涉及包含IRE1α抑制剂的组合物，其用于(i)抑制或预防细胞的细胞衰老或(ii)在包含IRE1α抑制剂的细胞中诱导衰老相关分泌表型。在实施方式中，该组合物用于抑制或预防(i)细胞的细胞衰老或(ii)诱导细胞衰老相关分泌表型。在实施方式中，该组合物用于制备用于抑制或预防(i)细胞的细胞衰老或(ii)诱导细胞衰老相关分泌表型的药物。
在实施方式中，IRE1α抑制剂是：针对IRE1α、4u8c、硼替佐米、N-[(2-羟基-1-萘基)亚甲基]-2-噻吩磺酰胺(STF-083010)或MKC-3946的反义或shRNA。在实施方式中，抑制剂减少所述细胞中的IRE1α活化；SA-β-gal活性；和/或Pai1、IL-6、Il-1b、TGF-β、tp53、XBP1和/或Vegfa的表达。
本发明还提供了刺激或诱导(i)细胞衰老或(ii)细胞衰老相关分泌表型(SASP)(和/或其诱导)的方法，其包括增加IRE1α水平或活性。本发明还提供了一种改善伤口修复的方法，其包括增加IRE1α水平或活性，其中该方法增加或诱导(i)细胞的细胞衰老或(ii)细胞中衰老相关分泌表型(SASP)。本发明进一步提供了刺激或诱导受试者(i)细胞的细胞衰老或(ii)细胞衰老相关分泌表型的方法，其包括增加IRE1α水平或活性。在实施方式中，上述方法包括使所述细胞与增加IRE1α水平或活性的化合物接触。在实施方式中，上述方法增加所述细胞中的IRE1α活化；SA-β-gal活性；和/或Pai1、IL-6、Il-1b、TGF-β、tp53、XBP1和/或Vegfa的表达。
在实施方式中，IRE1α活性包括IRE1α核糖核酸酶活性和激酶活性。
本发明进一步提供了包含增加IRE1α水平或活性的化合物的组合物。在实施方式中，该组合物用于诱导(i)细胞的细胞衰老或(ii)细胞衰老相关分泌表型。在实施方式中，该组合物用于治疗或预防肝纤维化、肾纤维化、肺动脉高血压、心肌梗塞或心脏纤维化。在实施方式中，该组合物用于改善伤口愈合。在实施方式中，该组合物用于制备用于诱导(i)细胞的细胞衰老或(ii)细胞衰老相关分泌表型的药物。在实施方式中，该组合物用于制备用于治疗或预防肝纤维化、肾纤维化、肺动脉高血压、心肌梗塞或心脏纤维化的药物。在实施方式中，该组合物用于制备用于改善伤口愈合的药物。
在实施方式中，增加IRE1α水平或活性的化合物是Apy29或舒尼替尼。
在实施方式中，上述细胞是终末分化细胞。在实施方式中，细胞是神经元、小胶质细胞或内皮细胞。在实施方式中，细胞是视网膜细胞。在实施方式中，细胞是骨髓细胞。在实施方式中，细胞是视网膜神经节细胞。在实施方式中，细胞是视网膜神经节神经元。在实施方式中，细胞是血管细胞。在实施方式中，细胞是血管内皮细胞。在实施方式中，细胞不是血管细胞(即它位于无血管区域/部位)。在实施方式中，细胞是成纤维细胞。在实施方式中，细胞是巨噬细胞。在实施方式中，细胞是单核细胞。在实施方式中，细胞是肝细胞。在实施方式中，细胞是肝星状细胞。在实施方式中，细胞是人细胞。在实施方式中，细胞是人微血管内皮细胞。在具体实施方式中，细胞不是眼细胞。
在实施方式中，上述衰老是旁分泌衰老。在实施方式中，衰老是分化后的衰老。在实施方式中，衰老是过早衰老。在实施方式中，过早衰老的特征在于IRE1a的表达和/或RNA酶活性的增加。在实施方式中，衰老是视网膜衰老。在实施方式中，衰老的特征在于(i)P16INK4a、Tp53、IRE1a、Cdkn1a Cdkn2a的表达和/或活性和/或衰老相关的β-gal活性增加；(ii)γH2Ax和/或PML的表达；和/或(iii)衰老相关分泌表型(SASP)的表达。在实施方式中，SASP包含IL-1β、IL-6、Pai1、TGFβ1、IRE1a和/或VEGFa的分泌。在实施方式中，上述SASP继发于细胞缺血。在实施方式中，细胞来自患有肌肉减少症、神经退变、表皮变薄、皮肤皱纹、脱发、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、动脉粥样硬化、骨关节炎、骨质疏松症或帕金森病、肠道疾病、青光眼、椎间盘退变、脑动脉瘤、主动脉瘤、胰腺纤维化或囊性纤维化或具有患有这些疾病的风险的受试者。在实施方式中，细胞来自已经历癌症治疗或正在接受癌症治疗的受试者。在实施方式中，细胞不是视网膜细胞。在实施方式中，细胞衰老与视网膜血管疾病无关(即它在视网膜疾病的情况下不会出现)。在实施方式中，细胞衰老与血管性眼病无关(即它在眼病的情况下不会出现)。在实施方式中，细胞衰老与糖尿病性视网膜病变无关(即它在糖尿病性视网膜病变的情况下不会出现)。在实施方式中，细胞衰老与黄斑退变无关。在实施方式中，细胞来自患有肝纤维化、肾纤维化、肺动脉高血压、心肌梗塞或心脏纤维化或具有患有这些疾病的风险的受试者。在实施方式中，受试者受伤(例如具有皮肤/组织伤口(例如切口))。
(ii)SEMA3A调节剂
在另一方面，本文提供的数据提供了以下证据：揭示了SEMA3A在调节衰老中的先前未描述的作用，包括病理过程中的旁分泌衰老，并揭示了在与衰老相关的疾病和病症中调节SEMA3A活性的治疗益处。实际上，数据表明SEMA3A激活ER-应激效应肌醇-需求酶-1α(IRE-1α)和衰老效应子p53和p16。
因此，在一个方面，本发明提供了调节(i)细胞衰老或(ii)细胞衰老相关分泌表型(SASP)(和/或其诱导)的方法，其包括调节SEMA3A水平或活性。在实施方式中，调节SEMA3A水平或活性包括使细胞与SEMA3A拮抗剂或SEMA3A激动剂接触。
在相关方面，本发明提供了抑制或预防(i)细胞衰老或(ii)细胞衰老相关分泌表型(SASP)(和/或其诱导)的方法，其包括减少SEMA3A水平或活性。在实施方式中，减少SEMA3A水平或活性包括使细胞与SEMA3A拮抗剂接触。
本发明进一步提供了抑制或预防受试者(i)细胞衰老或(ii)细胞衰老相关分泌表型(SASP)(和/或其诱导)的方法，其包括减少SEMA3A水平或活性。在实施方式中，降低SEMA3A水平或活性包括向受试者施用(或使受试者的细胞接触)SEMA3A拮抗剂。
在另一方面，本发明涉及SEMA3A拮抗剂。在实施方式中，SEMA3A拮抗剂是(a)SEMA3A抗体；(b)SEMA3A反义或shRNA；和/或(c)可溶性NRP1多肽或其功能片段(NRP1捕获剂)。
本发明还涉及包含上述SEMA3A拮抗剂的组合物。这种拮抗剂或包含其的组合物可用于上述方法中(例如用于抑制或预防(i)细胞衰老或(ii)诱导细胞衰老相关分泌表型(SASP)。
在相关方面，本发明涉及本发明的SEMA3A拮抗剂或组合物在制备用于抑制或预防(i)细胞衰老或(ii)细胞衰老相关分泌表型(SASP)(和/或其诱导)的药物中的用途。在实施方式中，本文所述的方法和组合物用于治疗或预防衰老相关的疾病或病症，其为肌肉减少症、神经退变(例如阿尔茨海默病)、表皮变薄、皮肤皱纹、脱发、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、动脉粥样硬化、骨关节炎、骨质疏松症、帕金森病、肠道疾病、青光眼、椎间盘退变、脑动脉瘤、主动脉瘤、胰腺纤维化或囊性纤维化、代谢综合征和/或肥胖。在实施方式中，细胞不是视网膜细胞。在实施方式中，细胞不是视网膜神经节细胞。在实施方式中，细胞不是来自受试者的眼睛(眼细胞)。在实施方式中，细胞衰老与视网膜血管疾病无关。
在实施方式中，上述方法减少所述细胞中的IRE1α活化和Pai1、IL-6、Il-1b、TGF-β、tp53、XBP1和Vegfa的表达。
在实施方式中，细胞是终末分化细胞。在实施方式中，细胞是神经元、小胶质细胞或内皮细胞。在实施方式中，细胞是视网膜细胞。在实施方式中，细胞是骨髓细胞。在实施方式中，细胞是脂肪组织细胞。在实施方式中，细胞是视网膜神经节细胞。在实施方式中，细胞是视网膜神经节神经元。在实施方式中，细胞是血管细胞。在实施方式中，细胞是血管内皮细胞。在实施方式中，细胞不是血管细胞(即它位于无血管区域/部位)。在实施方式中，细胞是成纤维细胞。在实施方式中，细胞是巨噬细胞。在实施方式中，细胞是单核细胞。在实施方式中，细胞是肝细胞。在实施方式中，细胞是肝细胞。在实施方式中，细胞是人细胞。在实施方式中，细胞是人微血管内皮细胞。在具体实施方式中，细胞不是眼细胞。在实施方式中，上述衰老是旁分泌衰老。在实施方式中，衰老继发于细胞缺血。在实施方式中，SASP继发于细胞缺血。在实施方式中，衰老继发于葡萄糖不耐受。在实施方式中，SASP继发于葡萄糖不耐受。
在实施方式中，细胞来自患有衰老相关的疾病或病症，其为肌肉减少症、神经退变(例如阿尔茨海默病)、表皮变薄、皮肤皱纹、脱发、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、动脉粥样硬化、骨关节炎、骨质疏松症、帕金森病、肠道疾病、青光眼、椎间盘退变、脑动脉瘤、主动脉瘤、胰腺纤维化或囊性纤维化、代谢综合征和/或肥胖或具有患有这些疾病的风险的受试者。在实施方式中，细胞不是视网膜细胞。在实施方式中，细胞不是视网膜神经节细胞。在实施方式中，细胞不是来自受试者的眼睛(眼细胞)。在实施方式中，细胞衰老与视网膜血管疾病无关。在实施方式中，细胞衰老与眼病(眼细胞衰老)无关。在实施方式中，细胞衰老与阿尔茨海默病无关。在实施方式中，细胞衰老与糖尿病无关。在实施方式中，细胞衰老与癌症无关。在实施方式中，细胞衰老与脓毒症休克无关。
在另一方面，本发明涉及刺激或诱导(i)细胞衰老或(ii)细胞衰老相关分泌表型的方法，其包括使所述细胞与SEMA3A多肽或其功能变体或片段接触。
还提供了刺激或诱导受试者(i)细胞的细胞衰老或细胞衰老相关分泌表型的方法，其包括向所述受试者施用有效量的SEMA3A多肽或其功能变体或片段。
在另一方面，本发明涉及改善包含细胞的组织中伤口愈合的方法，该方法包括使细胞与SEMA3A多肽或其功能变体或片段接触。
在相关方面，本发明提供了SEMA3A多肽或其功能变体或片段或变体、编码其的核酸，用于递送和/或表达SEMA3A多肽或功能变体或片段的载体和包含此类多肽或功能变体或片段、核酸和/或载体的宿主细胞。
本发明还涉及包含上述SEMA3A多肽或其功能变体或片段、核酸、载体和/或宿主细胞的组合物。此类组合物、SEMA3A多肽或功能变体或片段、核酸、载体和宿主细胞可用于上述方法中(例如(a)用于诱导(i)细胞衰老或(ii)细胞衰老相关分泌表型，(b)制备用于诱导(i)细胞衰老或(ii)细胞中衰老相关分泌表型的药物，或(c)用于改善伤口愈合)。
在实施方式中，刺激或诱导(i)细胞衰老，(ii)SASP或(iii)伤口愈合的方法中的上述细胞是终末分化细胞。在实施方式中，细胞是神经元、小胶质细胞或内皮细胞。在实施方式中，上述衰老是旁分泌衰老。在实施方式中，SASP继发于细胞缺血。在实施方式中，细胞来自患有肝纤维化、肺动脉高血压、心肌梗塞、癌症、肾纤维化或心脏纤维化或具有患有这些疾病的风险的受试者。
在实施方式中，上述方法增加所述细胞中的IRE1α活化和Pai1、IL-6、Il-1b、TGF-β、tp53、XBP1和Vegfa的表达。
本发明还提供了编码本文公开的反义、shRNA等多肽(例如NRP1捕获剂、SEMA3A、IRE1α等)的核酸以及在本文中公开用于递送和/或表达核酸、多肽、反义、shRNA的载体和宿主细胞。
通过阅读以下仅通过示例的方式参考附图给出的本发明的具体实施方式的非限制性描述，本发明的其它目的、优点和特征将变得更加明显。
3、调节脂质参数
在另一方面，本发明涉及改变受试者的脂质参数的方法，所述方法包括向受试者施用：(a)可溶性NRP1多肽或其片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物，
其中所述改变脂质参数是(a)总胆固醇水平的降低；(b)非高密度脂蛋白胆固醇水平降低；(c)甘油三酯水平降低；(d)总胆固醇：高密度脂蛋白胆固醇的比例降低；(e)循环游离脂肪酸减少；(f)HDL胆固醇的增加或(f)(a)至(e)的任何组合。
在另一方面，本发明涉及用于预防或治疗受试者中与脂肪蓄积相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用：(a)可溶性NRP1多肽或其片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物。
在实施方式中，所述与脂肪蓄积相关的疾病或病症是高体重指数(BMI)；肥胖；代谢综合征；NAFLD；心血管疾病(CVD)；高血压和/或II型糖尿病(TIIDM)。
在实施方式中，所述心血管疾病是充血性心力衰竭、高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化。
在另一方面，本发明涉及改变受试者的身体组成参数的方法，包括向受试者施用：(a)可溶性NRP1多肽或其片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物，
其中所述身体组成参数是内脏脂肪面积(VFA)、体重指数(BMI)、腰臀比(WHR)；腰围与身高比(WHeR)、腰围(WC)；手臂周长(AC)、锥度指数、体脂百分比(PBF)、肱三头肌皮肤皱褶、肩胛下皮肤皱褶、白色脂肪组织(WAT)水平；和/或棕色脂肪(BAT)组织水平。
在实施方式中，所述可溶性NRP1多肽或其片段包含表2中所述或图7或9A中所示的NRP1多肽捕获剂或由其组成。
在实施方式中，全身施用所述可溶性NRP1多肽或其片段。
在另一方面，本发明涉及组合物，其包含：(a)可溶性NRP1多肽或其片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物，其用于改变受试者的脂质参数，
其中所述改变脂质参数是(a)总胆固醇水平的降低；(b)非高密度脂蛋白胆固醇水平降低；(c)甘油三酯水平降低；(d)总胆固醇：高密度脂蛋白胆固醇的比例降低；(e)循环游离脂肪酸减少；(f)HDL胆固醇的增加或(f)(a)至(e)的任何组合。
在另一方面，本发明涉及组合物，其包含：(a)可溶性NRP1多肽或其片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物，其用于预防或治疗受试者中与脂肪蓄积相关的疾病或病症。
在实施方式中，所述与脂肪蓄积相关的疾病或病症是高体重指数(BMI)；肥胖；代谢综合征；NAFLD；心血管疾病(CVD)；高血压和/或II型糖尿病(TIIDM)。
在实施方式中，所述心血管疾病是充血性心力衰竭、高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化。
在另一方面，本发明涉及组合物，其包含：(a)可溶性NRP1多肽或其片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物，其用于改变受试者的身体组成参数，
其中所述身体组成参数是内脏脂肪面积(VFA)、体重指数(BMI)、腰臀比(WHR)；腰围与身高比(WHeR)、腰围(WC)；手臂周长(AC)、锥度指数、体脂百分比(PBF)、肱三头肌皮肤皱褶、肩胛下皮肤皱褶、白色脂肪组织(WAT)水平；和/或棕色脂肪(BAT)组织水平。
在实施方式中，所述可溶性NRP1多肽或其片段包含表2中所述或图7或9A中所示的NRP1多肽捕获剂或由其组成。
在实施方式中，所述可溶性NRP1多肽或其片段用于全身施用。
在另一方面，本发明涉及(a)可溶性NRP1多肽或其片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物用于改变受试者的脂质参数的用途，
其中所述改变脂质参数是(a)总胆固醇水平的降低；(b)非高密度脂蛋白胆固醇水平降低；(c)甘油三酯水平降低；(d)总胆固醇:高密度脂蛋白胆固醇的比例降低；(e)循环游离脂肪酸减少；(f)HDL胆固醇的增加或(f)(a)至(e)的任何组合。
在另一方面，本发明涉及(a)可溶性NRP1多肽或其片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物用于预防或治疗受试者中与脂肪蓄积相关的疾病或病症的用途。
在实施方式中，所述与脂肪蓄积相关的疾病或病症是高体重指数(BMI)；肥胖；代谢综合征；NAFLD；心血管疾病(CVD)；高血压和/或II型糖尿病(TIIDM)。
在实施方式中，所述心血管疾病是充血性心力衰竭、高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化。
在另一方面，本发明涉及(a)可溶性NRP1多肽或其片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物用于改变受试者的身体组成参数的用途，
其中所述身体组成参数是内脏脂肪面积(VFA)、体重指数(BMI)、腰臀比(WHR)；腰围与身高比(WHeR)、腰围(WC)；手臂周长(AC)、锥度指数、体脂百分比(PBF)、肱三头肌皮肤皱褶、肩胛下皮肤皱褶、白色脂肪组织(WAT)水平；和/或棕色脂肪(BAT)组织水平。
在实施方式中，所述可溶性NRP1多肽或其片段包含表2中所述或图7或9A中所示的NRP1多肽捕获剂或由其组成。
在实施方式中，所述可溶性NRP1多肽或其片段用于全身施用。
在另一方面，本发明涉及(a)可溶性NRP1多肽或其片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物在制备用于改变受试者的脂质参数的药物中的用途，
其中所述改变脂质参数是(a)总胆固醇水平的降低；(b)非高密度脂蛋白胆固醇水平降低；(c)甘油三酯水平降低；(d)总胆固醇:高密度脂蛋白胆固醇的比例降低；(e)循环游离脂肪酸减少；(f)HDL胆固醇的增加或(f)(a)至(e)的任何组合。
在另一方面，本发明涉及(a)可溶性NRP1多肽或其片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物在制备用于预防或治疗受试者中与脂肪蓄积相关的疾病或病症的药物中的用途。
在实施方式中，所述与脂肪蓄积相关的疾病或病症是高体重指数(BMI)；肥胖；代谢综合征；NAFLD；心血管疾病(CVD)；高血压和/或II型糖尿病(TIIDM)。
在实施方式中，所述心血管疾病是充血性心力衰竭、高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化。
在另一方面，本发明涉及(a)可溶性NRP1多肽或其片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物在制备用于改变受试者的身体组成参数的药物中的用途，
其中所述身体组成参数是内脏脂肪面积(VFA)、体重指数(BMI)、腰臀比(WHR)；腰围与身高比(WHeR)、腰围(WC)；手臂周长(AC)、锥度指数、体脂百分比(PBF)、肱三头肌皮肤皱褶、肩胛下皮肤皱褶、白色脂肪组织(WAT)水平；和/或棕色脂肪(BAT)组织水平。
在实施方式中，所述可溶性NRP1多肽或其片段包含表2中所述或图7或9A中所示的NRP1多肽捕获剂或由其组成。
在实施方式中，所述药物用于全身施用。
附图说明
在所附附图中：
图1显示了视网膜缺血引发细胞衰老和衰老相关的分泌表型。(A)氧诱导的视网膜病(OIR)小鼠模型的示意图。(B)代表性基因集富集分析(GSEA)，其对应于来自P14常氧和OIR视网膜的大规模全基因组RNA-seq的炎症和细胞凋亡的特征。表示了与OIR表型呈正相关和负相关的基因表达谱。(C)P14OIR(左图)相对于常氧视网膜(右图)中的Fridman衰老相关基因(28)的热图和GSEA簇。(NES＝标准化富集评分，FDRq＝错误发现率)，颜色标度描绘log2(倍数变化)从低(-2，左)到高表达(2，右)的表达。(D)来自P14OIR和常氧小鼠的视网膜细胞裂解物的免疫印迹显示诱导衰老标记物。(E)RT-qPCR显示在P14OIR相对于常氧视网膜中诱导衰老相关基因Cdkn1a(p21)和Cdkn2a(p16)的表达。(F)P14常氧和OIR平板视网膜的代表性异亮氨酸蛋白B4(IB4)和衰老相关β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)。(G)P14OIR相对于常氧扁平视网膜中衰老相关的β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)百分比的定量。显示了视网膜的加框的中央(c)/外周(p)和血管/无血管区域的更高放大倍数视图(中枢与外周OIR视网膜相比***P<0.0001(n＝10)；无血管与中央P14常氧视网膜相比 (H)P14常氧和OIR视网膜的矢状切面的代表性IB4和SA-β-gal染色。在右图中显示了加框的中央无血管视网膜区域的更高放大倍数图像。显示了视网膜神经节细胞(GCL)、内核层(INL)和外核层(ONL)的取向。(I)在P14视网膜矢状切片中用SA-β-gal染色的面积百分比的定量(与含氧量正常的视网膜相比，*P<0.05(n＝10)，与视网膜的其它P14OIR层相比，ns＝没有显著性)。(J)P14OIR和含氧量正常的视网膜的TUNEL染色。比例尺为500μm(H)。对于更高放大率的图像和(H，J)比例尺为200μm。数据以平均值±SEM表示。
图2显示了细胞衰老在视网膜病变进展期间传播。(A)在OIR进展期间(P14、P17和P21)视网膜的同工凝集素B4(IB4)染色。(B)在整个OIR中细胞衰老传播的示意图，描绘了下图中的SA-β-gal染色的铺片OIR视网膜(比例尺50μm)。更高放大率的图像显示出明显的衰老细胞群(比例尺25μm)。(C)P14OIR视网膜的代表性共聚焦显微照片显示RGC中衰老标记物(γH2AX(顶行)和Pai1(中间行)的强染色(Brn3a染色(第2列))。插图是轮廓区域的高放大率图像。(D)P17OIR铺片视网膜的代表性共聚焦显微照片显示，衰老标记物(PML(底行)和γH2AX(顶行))与小胶质细胞(IBA1)和血管IB4共同标记。(E)两种不同样品的P14OIR相对于常氧视网膜中的旁分泌衰老相关基因的热图和GSEA簇。F)RT-qPCR显示了P14OIR相对于常氧视网膜中Pai1、Il1β、Tgf-β1、Il6、Vegf-a、Ire1α和Tp53的表达的诱导。β-肌动蛋白用作参考基因。C和D的比例尺为100μm。数据以平均值±SEM表示；
图3显示了SEMA3A介导衰老和旁分泌衰老。(A)与P10、P14、P17和P21的常氧对照相比，OIR期间SEMA3A蛋白表达水平的蛋白质印迹分析。β-肌动蛋白用作上样对照。(B)在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中Ras诱导的衰老期间SEMA3A蛋白水平的免疫印迹分析。在选择后14天收获来自用H-RasV12致癌基因逆转录病毒或对照空载体转导的MEF的细胞裂解物。(C)用空载体、单独的MEK1或MEK和人乳头瘤病毒癌蛋白E6和E7逆转录病毒转导的人正常二倍体成纤维细胞(IMR90)中的SEMA3A转录物水平。数据来自GEO profile GSE2487(77)(CT与MEK相比，**P<0.05，MEK与MEK/E6/E7相比，)。(D)增殖或衰老培养的原代人活化肝星状细胞(HSC)中的SEMA3A转录物水平(**P＝0.027)。数据来自GEO profile GSE11954(78)。(E)在P2处接受玻璃体内注射重组SEMA3A(100ng/ml)并在P5收获的P5幼仔的视网膜进行针对衰老标记的免疫印迹分析和矢状冷冻切片的SA-β-gal染色(F)。(G)处理后7天通过FACS分析获得的SEMA3A处理的(100和500ng/ml)HRMEC(人视网膜微血管内皮细胞)的细胞周期分布图(P<0.0001；双向ANOVA)。(H)通过电池阻抗感测(ECIS)实时测量的跨内皮电阻证明SEMA3A减少内皮细胞增殖(3-7天)(0.048>P>0.009))。(I)用重组SEMA3A(100ng/ml)或媒介物(CT)刺激HRMEC、视网膜神经元(661W)和J774(巨噬细胞样细胞)7天，针对SA-β-gal染色并在(J)中定量。(n＝3次独立实验),**P<0.005和***P<0.0001，来自双尾学生t检验J,(K)在H2O2刺激(150μM,2h)后，从衰老的视网膜神经元(661W)和巨噬细胞样J774细胞收集条件培养基(CM)。用SA-β-gal染色衰老细胞(右)，通过免疫印迹评估CM中分泌的SEMA3A(S3A)蛋白的水平(左)。(L)用指定载体(Lv.sh_GFP或Lv.sh_SEMA3A)感染并用H2O2或媒介物(CT)处理的神经元661W细胞的SA-β-gal染色。在处理7天后评估衰老。(M)如(J)中处理的SA-β-gal阳性细胞的百分比的定量。(n＝3次独立实验)。H2O2处理的sh_GFP细胞与未处理的sh_GFP细胞相比，*P<0.005；并且H2O2处理的sh_S3A细胞与H2O2处理的sh_GFP细胞相比，来自双尾学生t检验。数据以平均值±SEM表示。(N)通过SA-β-gal染色在7天后评价HRMEC中旁分泌衰老(来自衰老或非神经元前体细胞的CM((661W)参见图(I))的诱导。(O)用来自衰老的661W细胞的CM处理如(I)中处理的SA-β-gal阳性细胞的百分比的定量。(P)用Lv.sh_S3A或Lv.sh_GFP在P12玻璃体内注射P14OIR小鼠视网膜的IB4和SA-β-gal染色，并在(Q)中定量(***P<0.0001)；
图4显示了用于P14OIR相对于常氧视网膜中未折叠蛋白反应的特征的热图和GSEA。(A)表示了与OIR表型呈正相关和负相关的基因表达谱。(B)在P14和P17OIR的LysM-Cre/ROSA26EYFPfl/fl视网膜代表性的SA-β-gal和IB4染色。(C)来自P14和P17OIR的LysM-Cre/ROSA26EYFPfl/fl的中央区域中的代表性γH2AX染色和EYFP。白色箭头指向γH2AX和EYFP+小胶质细胞的共标记；
图5显示了SEMA3A由衰老细胞分泌并触发人视网膜微血管内皮细胞中的旁分泌衰老。通过RT-qPCR测量的P14(A)和P17、P21(B)视网膜(常氧相对于OIR)中SEMA3A的相对mRNA水平。(C)SEMA3A蛋白表达的蛋白质印迹分析，显示了神经元细胞中Sh-RNA下调的效率(661W)。(D)解释条件培养基(CM)实验的示意图，以梳理旁分泌衰老的贡献。来自用H2O2衰老的表达sh_GFP或sh_SEMA3A的视网膜神经元前体细胞系的CM，收获CM并应用于HRMEC。通过SA-β-gal染色在7天后评估HRMEC中旁分泌衰老的诱导。(E)通过免疫印迹评估来自用Lv.sh_GFP或Lv.sh_S3A感染的视网膜神经元前体细胞的CM中分泌的SEMA3A的水平。(F)暴露于来自衰老(或非)视网膜神经元前体细胞(H2O2或媒介物处理的)的CM的HRMEC中p53表达的免疫印迹分析。(G)暴露于来自用sh_GFP或sh_SEMA3A(sh_S3A)转染并用H2O2或媒介物处理的视网膜神经元前体细胞的CM的HRMEC的免疫印迹分析。(H)用重组SEMA3A(100ng/ml)或来自衰老J774细胞(Sen-J774)的CM处理并在7天后收获的HRMEC裂解物中的ER-应激效应物p-IRE1αS724的免疫印迹分析；
图6显示了SEMA3A诱导J774巨噬细胞/单核细胞的衰老。(A)P14将接受玻璃体内注射Lv.sh_GFP或Lv.sh-IRE1α的小鼠的视网膜裂解物针对抗IRE1α和Cre进行免疫印迹。(B)用SEMA3A(100ng/ml，7天)或H2O2作为阳性对照处理的J774巨噬细胞的SA-β-gal染色。显示了加框区域的更高放大率视图。(C)暴露于SEMA3A(100ng/ml，7天)或作为阳性对照的H2O2的J774巨噬细胞和用如虚线箭头所示的来自各个J774条件的条件培养基(CM)处理HRMEC的免疫印迹分析。(D)针对IRE1α的免疫印迹证明了HRMEC中慢病毒介导的IRE1α消耗的效率。(E)用指定的慢病毒载体(Lv.sh_GFP和Lv.sh_IRE1α)感染然后用重组SEMA3A(100ng/ml，7天)或媒介物(CT)处理的HRMEC的SA-β-gal染色。(F)用SEMA3A(100ng/ml，7天)或媒介物(CT)处理的J774中Cdkn1a、Cdkn2a的相对mRNA表达水平；
图7显示了IRE1α的RNA酶活性有助于衰老。(A)用SEMA3A(S3A)(100ng/mL)或媒介物刺激3或7天的J774细胞裂解物中衰老标记物的免疫印迹显示诱导p-IRE1αS724、p53、Pai1，(n＝3)。(B)J774巨噬细胞中的RT-qPCR显示在暴露于SEMA3A(100ng/mL)7天后，Pai1、Il6、Il1β、Tgf-β1和Tp53的mRNA表达增加。(C)用SEMA3A(100ng/mL)或媒介物刺激7天的J774巨噬细胞的γH2AX和DAPI的代表性共聚焦免疫荧光染色(比例尺为100μm)。显示了加框区域的更高放大率视图(比例尺为50μm)。在处理后第7天，用媒介物、S3A(100ng/ml)和/或4μ8c(1ng/ml)处理的J774细胞裂解物中的XBP1(s)(剪接异构体)的免疫印迹(D)和XBP1(s)和未剪接的XBP1(u)的PCR(E)。(F)RT-qPCR用于单独用SEMA3A或用4μ8c刺激的J774中Pai1、Il6、Il1β、Tgf-β1、Tp53、Ire1α和Tnfα的水平。β-肌动蛋白用作参考基因。***P<0.0001，*P<0.005。比例尺：C&G为100μm。高分辨率C为50μm。数据以平均值±SEM表示；
图8显示了二甲双胍消除SASP和病理性视网膜血管发生。(A)从选择用于研究的患者获得的血管造影、光谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)和3D视网膜图。将患有非血管性眼病的对照患者(CT)(n＝10)与患有增殖性糖尿病性视网膜病变(PDR)(n＝10)的患者进行比较。表1(实施例6)显示了患者的特征。(B)参与旁分泌衰老的细胞因子的患者玻璃体液的多重评估显示VEGF-A、Pai1、IL-6和IL-8的诱导。结果表示为对CT患者标准化的倍数变化。点代表单个值；**P<0.001，***P<0.0001。(C)在P12玻璃体内注射二甲双胍或媒介物的OIR小鼠的P14和P17的视网膜裂解物中的p-NFκBS536和p-IRE1αS724的免疫印迹分析。(D)RT-qPCR在P14OIR小鼠的视网膜中测量的Cdkn1a、Cdkn2a和Il6的水平，所述P14OIR小鼠在P12玻璃体内注射二甲双胍或媒介物(β-肌动蛋白用作参照基因)。在P12用玻璃体内注射二甲双胍或媒介物的小鼠的用IB4和SA-β-gal标记的代表性的P14(E)和P17(F)OIR铺片视网膜。(G)如在E和F中处理的P14和P17OIR小鼠中SA-β-gal染色面积百分比的定量。(在P14，**P＝0.0042(n＝9)；在P17，**P＝0.0013(n＝11)；二甲双胍与注射媒介物的视网膜相比)。(H)在P12玻璃体内注射二甲双胍或媒介物的P14和P17OIR小鼠的代表性的IB4染色铺片视网膜。在OIR的P14(I)和P17(J)处对无血管区域进行定量。在P17OIR评估视网膜前新血管形成(K)。结果表示为无血管或新血管面积相对于整个视网膜面积的百分比(***P<0.0001并且***P<0.001；二甲双胍与注射媒介物的视网膜相比(n＝13))。水平条代表百分比的平均值，圆点代表单个值。比例尺为500μm。数据以平均值±SEM表示；
图9显示了阿柏西普在不促进血管修复或细胞衰老的情况下消除病理性血管发生。在P12用玻璃体内注射阿柏西普或媒介物的小鼠的用IB4和SA-β-gal标记的代表性的P14(A)和P17(C)OIR铺片视网膜。在A或C中处理的P14(B)和P17(D)OIR小鼠中SA-β-gal染色面积百分比的定量。(在P14，P＝0.3087(n＝13-14)；在P17，P＝0.1580(n＝13)；阿柏西普与注射媒介物的视网膜相比)。在OIR的P14(P＝0.4897，n＝11-13)(E)和P17(P＝0.9502，n＝6-7)(F)的无血管区域的定量。在P17OIR评估视网膜前新血管形成(G)。结果表示为无血管或新血管面积相对于整个视网膜面积的百分比(*P＝0.0207,n＝5-6)；阿柏西普与注射媒介物的视网膜相比(n＝5-6))。水平条代表百分比的平均值，圆点代表单个值。比例尺为500μm。数据以平均值±SEM表示；
图10显示了在OIR期间和I型糖尿病的STZ模型中诱导视网膜细胞衰老。(A)在图1l中呈现的P14OIR和常氧下的全眼冷冻切片的同工凝集素B4(IB4)和TUNEL染色。(B)冷冻切片P14常氧和OIR视网膜上γH2AX(绿色；左列)、p-IRE1αS724(绿色；中间列)和Pai1(绿色；右列)、同工凝集素B4(IB4)(红色)和DAPI(蓝色)的代表性共聚焦免疫荧光。(C)冷冻切片P14OIR眼的PML(绿色；左列)、p16(绿色；右列)、IB4和DAPI的代表性共聚焦免疫荧光。(D)在P21OIR处铺片视网膜的针对PML、同工凝集素B4(IB4)和DAPI的代表性共聚焦免疫荧光。(E)来自柠檬酸盐和STZ视网膜的冷冻切片的代表性SA-β-gal染色。显示视网膜神经节细胞(GCL)、内核层(INL)和外核层(ONL)的取向。(F)来自成年小鼠柠檬酸盐(对照)或STZ(糖尿病)的铺片视网膜上的α-SMA或NG2、同工凝集素B4(IB4)的代表性共聚焦免疫荧光；
图11显示了OIR期间的血管覆盖。在常氧和OIR期间，在P17和P21处针对α-SMA(A)或NG2(B)、同工凝集素B4(IB4)染色的视网膜平坦的代表性共聚焦免疫荧光。比例尺表示200μm；
图12显示了二甲双胍抑制OIR期间的衰老。(A)来自用二甲双胍(10μg/μl，在P12)或媒介物(PBS)注射的P14和P17OIR视网膜的冷冻切片的代表性SA-β-gal染色。(B)对用二甲双胍处理或未用二甲双胍处理的冷冻切片P14OIR视网膜的TUNEL(左)和DAPI(中)的代表性共聚焦免疫荧光。显示视网膜神经节细胞(GCL)、内核层(INL)和外核层(ONL)的取向。(C)OIR期间切割的胱天蛋白酶-3蛋白表达水平的蛋白质印迹分析(P14、P17和P21)。β-肌动蛋白用作上样对照。比例尺为200μm；
图13显示了在OIR中不受二甲双胍和阿柏西普影响的基因。(A)RT-qPCR在P14OIR小鼠的视网膜中测量的Vegf-a、Vegf-c、Vegfr-1和Vegfr-2的水平，所述P14OIR小鼠在P12玻璃体内注射二甲双胍或媒介物(β-肌动蛋白用作参照基因)；(B)RT-qPCR在P14OIR小鼠的视网膜中测量的Cdkn2a、Tp53、Il1β、Tgf-β1和Sema3a的水平，所述P14OIR小鼠在P12玻璃体内注射阿柏西普或媒介物(β-肌动蛋白用作参照基因)；
图14显示了如何进行视网膜SA-β-gal的定量。使用Image J软件分析在铺片视网膜(或矢状眼切片)上定量SA-β-gal染色的示意图；
图15显示了示例性双胍化合物和IRE1α抑制剂的结构。(A)双胍(CAS#56-03-1)；(B)二甲双胍(N,N-二甲基亚氨基二羰基二酰胺；CAS#657-24-9)；(C)丁二胍(1-丁基双胍，CAS#692-13-7)；和(D)苯乙双胍(2-(N-苯乙基甲脒基)胍，CAS#114-86-3)；(E)“化合物3”IRE1α抑制剂，其抑制IRE1α的RNA酶活性(Wang等人,2012,Nat.Chem.Bio.8(12):982-989)；
图16显示了人SEMA3A前体蛋白的氨基酸序列。通过去除信号肽(氨基酸1-21)将该序列(SEQ ID NO：50)进一步加工成成熟形式；
图17A-B显示了大鼠(登录号EDL96784，NP_659566，SEQ ID NO：48)、人(登录号NM003873，SEQ ID NO：96)和小鼠(登录号NP_032763，SEQ ID NO：48)与NRP1共有序列一起的NRP1蛋白质序列(SEQ ID NO：47)之间的比对。鉴定了NRP1信号结构域(氨基酸1-20/1-21/1-27)、亚结构域a1(约aa22至约aa148)、亚结构域a2(约aa149至约aa275)、亚结构域b1(约aa276至约aa428)和亚结构域b2(约aa429到约aa589)、结构域c(约aa590到约aa859)、跨膜结构域(约aa860到约aa883)和细胞质结构域(约aa884到约aa923)；
图18A-G显示了本发明的示例性捕获剂之间的氨基酸序列比对(对于与所示的每个捕获剂对应的SEQ ID No，参见表2和9)；
图19显示了人可溶性神经纤毛蛋白-1(NRP1)蛋白质序列。(A)NRP1同种型b/s12(644个氨基酸；Ref seq:NP_001019799.1；NM_001024628.2；Uniprot:O-14786-2，SEQ IDNO：44)；(B)NRP1同种型c/Siv(609个氨基酸；Ref seq:NP_001019800.1；NM001024629.2；Uniprot:O14786，SEQ ID NO：45)；(C)NRP1同种型SIII(704个氨基酸；Ensembl:ENSP00000363956，SEQ ID NO：46)；并且
图20显示了通过单次注射NRP1捕获剂减弱细胞衰老。(A)在P12中玻璃体内注射Trap M和G的小鼠中用SA-β-gal标记的代表性P17OIR铺片视网膜。(B)当小鼠接受单次注射TrapM或TrapG时，SA-β-gal染色的定量揭示了细胞衰老的显著减弱。
图21显示了在饲料诱导的肥胖期间表达NRP1的巨噬细胞在脂肪组织中积累。(A)嗜酸性粒细胞(脂肪组织、外周血)、中性粒细胞(血液、滑液、骨髓)、单核细胞(经典：MHCII+、MHCII-、MHCII-LN，骨髓；非经典：MHCII中等、MHCII高、MHCII-，骨髓)、和巨噬细胞(脂肪组织、骨髓、红髓、肺驻留、肺CD11b+、中枢神经系统、稳态腹膜(高)、稳态腹膜(低)、小肠浆膜、小肠固有层)NRP1表达水平(每组n＝1-4)。(B)10周高脂肪饲料(HFD)的脂肪组织巨噬细胞(ATM)群体FACS，以及白色脂肪组织(WAT)中常规饲料(RD)C57BL/6的老化匹配对照；(C)在巨噬细胞(ATM)中NRP1表达水平(每组n＝9)。(D-G)NRP1配体的mRNA表达：(D)RD和10周HFD C57BL/6腹膜后白色脂肪组织(RPWAT)中的Sema3a；(E)Vegfa；(F)Vegfb；和(G)Tgfb1(每组n＝5)。数据以平均值±S.E.M.表示。学生非配对t检验(B-G)*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；
图22显示了NRP1促进FA摄取和吞噬作用。(A)对照和LysM-Cre-NRP1fl/fl巨噬细胞中的急性BODIPYTM摄取(每组n＝7-8)。(B)腹膜后白色脂肪组织(RPWAT)、(C)肝脏、(D)血浆和(E)HFD喂养对照和LysM-Cre-NRP1fl/fl小鼠的心脏中BODIPYTM摄取(每组n＝6)。脂肪细胞条件化培养基中培养的(F)对照和(G)LysM-Cre-NRP1fl/fl巨噬细胞的ORO(油红O)染色，(H)脂肪细胞条件化培养基中培养的对照和LysM-Cre-NRP1fl/fl巨噬细胞的ORO染色的定量(DMEM和胰岛素)，(I)DMEM和胰岛素，(J)DMEM，(K)巨噬细胞培养基(F12)(每组n＝18-35)。数据以平均值±S.E.M.表示。学生非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；
图23显示了缺乏NRP1的巨噬细胞具有降低的吞噬能力。用pHrodo绿色酵母聚糖生物颗粒缀合物在LysM-Cre-NRP1fl/fl和对照巨噬细胞中测量吞噬作用。在对照和LysM-Cre-NRP1fl/fl巨噬细胞中检测到pHrodo荧光(每组n＝8)。数据以平均值±S.E.M.表示。学生非配对t检验，**p<0.01；
图24显示了NRP1多肽捕获剂阻止喂食高脂肪饲料的小鼠体重增加(参见实施例4)。评估NRP1捕获剂对体重增加的影响。对雄性小鼠施用表达可溶性NRP1捕获剂的腺病毒(其包含NRP1的结构域a1、a2和b1(Trap M，图9A)；Adeno GFP；或盐水(对照)，同时将小鼠从常规饲料转换为高脂肪饲料(HFD，T0)。在10周的时间内监测体重增加。数据以平均值±SEM表示。学生非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，盐水对Adeno Trap M，双向Anova，Bonferroni事后检验，其中N＝5；
图25显示了表达Trap M的小鼠的葡萄糖耐量试验。(A)在腹膜内注射2g葡萄糖/kg小鼠后喂食HFD的小鼠的不同时间点的血糖(mM)。在6-8周龄的C57Bl6/J小鼠静脉内注射盐水或Adeno-Trap M(0.25×1010PFU/注射)。注射后立即给小鼠喂食高脂肪饲料。在腹膜内注射2g葡萄糖/kg小鼠后的不同时间点评估血糖。(B)在双向Anova Bonferroni事后检验中，(A)**P<0.01(Adeno GFP对Adeno Trap M)所示曲线下的面积，其中N＝5；
图26显示了全身注射后Trap M的药效学特性的分析。用纯化的Trap M(0.5mg/kg剂量)静脉内尾静脉注射C57B16小鼠(6-8周龄)，并在注射后6、24和48小时收集血清样品。使用IMAC琼脂糖凝胶从大约75μl血清中捕获的Trap M通过用抗人NRP1(cubAI结构域)进行免疫印迹来检测；
图27显示了用腺病毒原种转导后Trap G、A、D和M的Cos细胞表达。用指定的腺病毒原种转导Cos细胞。使用IMAC琼脂糖凝胶从转导的细胞上清液中纯化Trap G和M，同时使用蛋白A/G琼脂糖凝胶富集Trap A和D。通过用抗人NRP1(cubAI结构域)进行免疫印迹来检测Trap。图例：NI)来自未感染的Cos细胞的上清液，来自Adeno-Green荧光蛋白(GFP)的GFP上清液感染Cos细胞S1)LipofectamineTM 2000转染腺病毒原种，S2)Effectene转染腺病毒原种，S3)PEI转染腺病毒原种，A2)腺病毒原种扩增第2轮，A3)腺病毒原种扩增第3轮。其中规定用IMAC琼脂糖凝胶(IMAC)或蛋白A/G琼脂糖凝胶(A/G)进行纯化；
图28显示了用腺病毒-Trap M构建体全身感染后Trap M的药理学分布的分析。C57B16小鼠(6-8周龄)静脉内尾静脉注射腺病毒-Trap M或对照腺病毒-GFP原种。感染后2周处死小鼠，收集血清、肾脏和肝脏组织并储存在-80℃直至分析。使用IMAC琼脂糖凝胶从用PBS/2％triton x-100裂解的血清(大约75μl)或肾脏或肝脏组织裂解物(大约40mg)中捕获Trap M，并通过用抗人NRP1(cubAI结构域)进行免疫印迹检测。图例；1)未感染的小鼠，2)Adeno-GFP感染的小鼠和3)Adeno-Trap M感染的小鼠；并且
图29显示了腺病毒感染后两周的Trap M的表达。使用IMAC琼脂糖凝胶从用PBS/2％triton x-100裂解血液(大约25μl)中捕获Trap M，并通过用抗人NRP1(cubAI结构域)进行免疫印迹检测。图例；NI：未感染的小鼠。
具体实施方式
1、细胞衰老和SASP在眼部血管疾病中的作用
本文提供的数据在风化缺血和调节眼血管疾病中的血管发生中建立细胞衰老的新作用。实际上，在视网膜病的不同模型中在视网膜的不同亚细胞群中建立了衰老细胞的瞬时积累。更具体地，发现通过采用SASP，视网膜神经元刺激一系列旁分泌因子和炎症信号的产生，其将衰老传播至视网膜小胶质细胞以及内皮细胞并进一步加剧病理性视网膜前血管发生。申请人已经表明，通过抑制SASP调节细胞衰老(例如施用双胍化合物(例如二甲双胍)或IRE1α的药理学或遗传抑制)抑制缺血诱导的衰老，增加血管再生并抑制血管性眼病模型中病理性新血管形成。因此，SASP被证明参与介导病理性血管生长，缺血细胞进入过早衰老状态并分泌促进旁分泌衰老的炎性细胞因子，加剧破坏性血管发生并阻碍修复性血管再生。
本文提供的数据支持在视网膜病等眼血管疾病的情况下，细胞衰老在同一疾病中发挥二分作用，因为它首先可能保护神经元免于细胞死亡，同时阻止它们触发修复性血管发生程序。此外，在视网膜病中观察到的旁分泌衰老和相关的血管调节因子的产生有助于将新血管排斥到生理上的无血管玻璃体，并且可以促进视网膜脉管系统中的过早衰老相关的并发症。鉴于与年龄相关的新生血管性眼病的发病率增加，例如年龄相关性黄斑退变和糖尿病性视网膜病变，这尤其相关。因此，在病理性新血管形成阶段期间通过施用衰老调节剂来预防细胞衰老可以代表眼部血管疾病和病症如视网膜血管病的简单治疗方案。
2、治疗或预防涉及细胞衰老的血管性眼病的方法
因此，根据本发明的一个方面，提供了用于治疗和/或预防受试者中血管性眼病或病症的至少一种症状或指征的组合物和方法。根据本发明该方面的方法包括向受试者施用SASP抑制剂(例如双胍化合物，例如二甲双胍)。在某些方面，SASP的抑制剂局部施用于受试者的眼睛中(例如局部或玻璃体内，而不是例如全身性地)。在双胍化合物如二甲双胍的情况下，眼部施用是特别优选的，因为全身施用通常由于血液视网膜屏障的存而使化合物不能到达其靶位点。在实施方式中，血管性眼病或病症继发于细胞缺血。
可以受益于根据本发明的SASP抑制的血管性眼病或病症包括以异常血管发生为特征的任何疾病、病症或病况(例如病理性新血管形成和/或血管再生减少)。这些疾病可能是由于导致正常眼功能的细胞(例如眼血管细胞、视网膜细胞、神经元、小胶质细胞)的代谢供应(例如氧气、血液、营养素)减少(短暂或持续/慢性)而导致衰老细胞(或具有衰老表型的细胞)的存在。这种情况可能在缺血事件后出现，但不限于此。如本文所用，术语“血管性眼病或病症”或“血管性眼病或病况”因此是指影响眼睛中血管的正常生理学的疾病、病症或病况。这种血管性眼病或病况的非限制性实例包括：糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、缺血性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关性黄斑退变、视网膜新生血管形成、视网膜中央静脉阻塞、分支视网膜静脉阻塞、脉络膜新生血管、息肉状脉络膜血管病变、眼部物理损伤、青光眼、孔源性视网膜脱离(RRD)、视网膜血管炎、视网膜巨大动脉瘤、视网膜微动脉瘤、Fuch氏营养不良、缺血性视神经病变、青少年黄斑退变、黄斑毛细血管扩张、视神经炎、引流综合征、视网膜色素变性、葡萄膜炎、斯坦加特病、Leber氏先天性黑矇(LCA)。在实施方式中，血管性眼病或病症是缺血性视网膜病变。在实施方式中，缺血性视网膜病变与糖尿病性视网膜病变、视网膜病变或早产、眼静脉阻塞、视网膜中央静脉阻塞或分支视网膜静脉阻塞有关。
根据本发明抑制SASP的化合物或药剂包括双胍化合物(例如二甲双胍)、mTor抑制剂(例如雷帕霉素类似物、Torin 1)和/或IRE1α表达的抑制剂(例如反义、shRNA等)、IRE1α活化(S724磷酸化)和/或IRE1αRNA酶活性(例如药理学抑制剂/拮抗剂)。通常，根据本发明抑制SASP的“IRE1α抑制剂”是最终减少或消除IRE1αRNA酶活性的那些抑制剂。
在特定方面，在血管眼病和病症(例如涉及增殖性视网膜病变)的情况下抑制SASP并预防和/或减弱细胞衰老的化合物和药剂增加生理性血管发生(即有益的血管发生)并减少病理性血管发生(病理性新血管形成)从而促进组织修复。
IRE1α是一种在人类中由ERN1基因编码的酶(Entrez:2081,EnsemblENSG00000178607,Uniprot:O75460,Refseq mRNA:NM_152461,NM_001433,Refseq(蛋白质):NP_001424.3)。该蛋白质具有内在的激酶活性和内切核糖核酸酶活性，并且在改变基因表达作为对基于内质网的应激信号(主要是未折叠的蛋白质应答(UPR))的响应中是重要的。已经发现了该基因的编码不同同种型的两种可变剪接的转录物变体。IRE1α具有两个功能性酶结构域：内切核酸酶和反式自磷酸化激酶结构域。活化后，IRE1α寡聚化并进行非常规RNA剪接活性，从X盒结合蛋白1(XBP1)mRNA中去除内含子，并使其转化为功能性转录因子XBP1。XBP1上调ER伴侣蛋白和内质网相关降解(ERAD)基因，促进ER应激的恢复。抑制IRE1α的化合物(即抑制剂)也是本领域已知的。
如本文所用，术语“IRE1α抑制剂”或“IRE1α拮抗剂”是指能够减少或阻断与细胞衰老和SASP诱导相关的IRE1α介导的细胞信号传导(即IRE1α核糖核酸酶活性和XBP1加工)的试剂。非限制性实例包括减少或阻断IRE1α表达(转录或翻译)的试剂，即能够减少或阻断IRE1α活化(例如S724磷酸化和/或IRE1α二聚化)的试剂。不受此限制，该试剂可以是天然的或合成的，并且可以是小分子或蛋白质/多肽/核酸，例如但不限于对编码IRE1α蛋白质或本文所述的任何药理学抑制剂的IRE1α核酸序列特异的反义或shRNA。本发的IRE1α抑制剂或IRE1α拮抗剂与IRE1α核酸或IRE1α蛋白结合以降低IRE1α表达、活化或活性，并最终导致细胞内IRE1αRNA酶活性的降低。
已经描述了靶向RNA酶结构域的催化核心和/或激酶结构域的ATP结合口袋的抑制剂。靶向RNA酶结合口袋的抑制剂的非限制性实例包括水杨醛(例如3-甲氧基-6-溴水杨醛-Volkmann等人,2011,JBC 286(14):12743–12755,PMCID:PMC3069474)、4μ8C、MKC-3946、STF-083010和丰加霉素。通过激酶结构域抑制IRE1α的RNA酶活性的化合物也被鉴定并命名为“激酶抑制RNA酶衰减剂”(KIRA)，包括KIRA3和KIRA6(Cas#1589527-65-0)，它们抑制IRE1α的激酶和RNA酶的活性。舒尼替尼和APY29是抑制ATP结合口袋但是变构激活IRE1αRNA酶结构域的化合物的实例(Wang等人,2012,Nat.Chem.Bio.8(12):982-989)。在Wang(同上)中描述了IRE1α的其它激酶和/或RNA酶抑制剂和激活剂。在具体实施方式中，根据本发明使用的IRE1α抑制剂抑制IRE1α的RNA酶活性但不抑制其激酶活性。
双胍类是一类有机化合物，其分子式为HN(C(NH)NH2)2。这些化合物最初是在法国丁香(Galega officinalis)提取物中发现的，并显示出降低血糖水平。因此它们最初用于治疗2型糖尿病。各种双胍衍生物用作治疗糖尿病的药物，也用于其它疾病和病症，包括多囊卵巢综合征和癌症。非限制性实例包括二甲双胍(N,N-二甲基亚氨基二羰基二酰胺(IUPAC名称)；CAS 657-24-9；DrugBank DB00331；ChemSpider 3949；Glucophage XRTM；Carbophage SRTM；RiometTM；FortametTM；GlumetzaTM；ObimetTM；gluforminTM，DianbenTM，DiabexTM，DiaforminTM，SioforTM和MetfogammaTM)、丁二胍(1-丁基双胍,CAS#692-13-7)、苯乙双胍(2-(N-苯乙基甲酰亚胺基)胍,CAS#114-86-3)、氯胍(Proguanil)(1-[氨基-(4-氯苯胺基)亚甲基]-2-丙-2-基胍，也称氯胍(chlorguanide))、氯丙胍、癸烷双胍A(1,1'-癸烷-1,10-二基二胍,Cas#111-23-9)和癸烷双胍B(1,1'-十二亚甲基二胍二氯化物,Cas#61167-43-9)。图15显示了可以根据本发明使用的双胍和一些功能衍生物的结构。
本发明的SASP抑制剂可以与用于治疗血管性眼病和其它疾病的其它药物联合施用，包括血管生成素-2抑制剂(例如在WO2016/085750中描述)、VEGF拮抗剂(例如抗VEGF抗体(例如雷珠单抗/LUCENTISTM))、小分子VEGF抑制剂(例如舒尼替尼)、VEGF抑制性融合蛋白(例如阿柏西普/EYELEATM))和/或SEMA3A拮抗剂(例如下文描述(参见表2和图18)或者例如在WO 2016/033699中的SEMA3a抗体或NRP1捕获剂)。
3、通过抑制IRE1α减少或预防细胞衰老和SASP
本文提供的数据进一步确定了IRE1α在调节细胞衰老和SASP中的作用。通过降低IRE1α活性(即IRE1α活化和细胞信号传导)能够抑制或预防细胞衰老(包括自分泌和/或旁分泌)旁分泌衰老。
能够通过许多方法抑制IRE1α活性。可以通过减少细胞中的IRE1α(i)核酸或蛋白质表达，(ii)活化(丝氨酸724磷酸化)；和/或(iii)RNA酶活性(和任选地，其激酶活性)来直接抑制IRE1α细胞活性。如上所述，IRE1α抑制剂是本领域已知的并且包括抑制IRE1α表达(例如sh_RNA的IRE1α反义)、IRE1α活化(例如KIRA3，KIRA6)和/或IRE1α核糖核酸酶(和任选的激酶)活性的试剂(例如水杨醛、4μ8C、MKC-3946、STF-083010、KIRA3、KIRA6和丰加霉素)。
因此，本发明提供了抑制或预防细胞的细胞衰老或诱导细胞中衰老相关分泌表型(SASP)的方法，其包括降低IRE1α水平或活性。
因此，本发明还涉及抑制或预防细胞的细胞衰老或诱导细胞中衰老相关分泌表型(SASP)的方法，其包括使细胞与IRE1α的抑制剂接触。
还提供了抑制或预防受试者的细胞的细胞衰老或诱导细胞中衰老相关分泌表型的方法，其包括向所述受试者施用IRE1α的抑制剂。
上述方法可用于治疗或预防细胞衰老有害的疾病或病症，如各种年龄相关病症(例如肌肉减少症、神经退变、表皮变薄、皮肤皱纹、脱发和头发灰白、白内障、肥胖、代谢综合征和其它老年疾病)、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、动脉粥样硬化、骨关节炎、骨质疏松症、青光眼、帕金森病、肠道疾病、椎间盘退变、脑动脉瘤、主动脉瘤、胰腺纤维化、血管性眼病(例如，视网膜血管疾病(增生性视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、缺血性视网膜变、黄斑退变、青光眼)和囊性纤维化。在癌症治疗期间和/或之后抑制或预防细胞衰老也是有用的，以减轻化疗/放疗的副作用，包括例如代谢功能障碍，加速老化，生命后期癌症风险增加。在实施方式中，本发明包括的衰老相关疾病或病症排除一种或多种血管性眼病(例如视网膜血管疾病(增生性视网膜病变、糖尿病性视网膜病变、缺血性视网膜变、黄斑退变、青光眼))。
有多种方法可用于降低IRE1α表达，从而降低IRE1α介导的细胞衰老。非限制性实例包括使用小发夹shRNA(RNAi)、反义核酶、核酶、靶向IRE1α启动子的TAL效应子等。可以通过递送质粒或通过病毒(例如慢病毒载体、腺病毒载体等)或细菌载体获得细胞中shRNA或类似抑制性RNA的表达。
因此，在替代实施方式中，本发明提供了反义、shRNA分子和核酶用于外源施用以实现降解和/或抑制目的mRNA的翻译。本发明还提供了用于递送和/或表达本文公开的反义、shRNA分子、核酶等的载体和宿主细胞。反义、shRNA分子和核酶优选靶向哺乳动物(优选人)IRE1α。治疗性反义寡核苷酸应用的实例包括：1992年8月4日授予的美国专利号5,135,917；1992年3月24日授予的美国专利号5,098,890；1992年2月11日授予的美国专利号5,087,617；1992年11月24日授予的美国专利号5,166,195；1991年4月2日授予的美国专利号5,004,810；1993年3月16日授予的美国专利号5,194,428；1989年2月21日授予的美国专利号4,806,463；1994年2月15日授予的美国专利号5,286,717；美国专利号5,276,019和美国专利号5,264,423；BioWorld Today,1994年4月29日,p.3。
优选地，在反义分子中，与目标mRNA存在足够程度的互补性，以避免在需要特异性结合的条件下，例如在体内测定或治疗处理中的生理条件下或在其中进行测定的体外测定的条件下，反义分子与非靶序列的非特异性结合。用于反义结合的靶mRNA不仅可以包括编码蛋白质的信息，还可以包括相关的核糖核苷酸，其例如形成5'-非翻译区、3'-非翻译区、5'帽区和内含子/外显子连接区核糖核苷酸。在美国专利号5,932,435中公开了筛选可用于提供本发明的IRE1α抑制剂等分子的反义和核酶核酸的方法。
在一些实施方式中，根据本发明的反义寡核苷酸可包含约5至约100个核苷酸单位。可以理解，核苷酸单元是通过磷酸二酯或其它键形成主链结构而与相邻核苷酸单元适当结合的碱-糖组合(或类似结构的组合)。
在另一个实施方式中，可以使用RNA干扰(RNAi)技术(一种转录后基因沉默)抑制或预防编码目的多肽(IRE1α)或其片段的核酸的表达。RNAi可用于产生假“敲除”，即其中由基因或编码区域编码的产物的表达降低的系统，导致系统中编码产物的活性总体降低。因此，可以进行RNAi以靶向感兴趣的核酸或其片段或变体，从而降低其表达和其编码的产物的活性水平。这种系统可用于产品的功能研究，以及治疗与这种产品的活性有关的病症。RNAi描述于例如公开的美国专利申请20020173478(Gewirtz；公开于2002年11月21日)和20020132788(Lewis等人；公开于2002年11月7日)。用于进行RNAi的试剂和试剂盒可从例如Ambion Inc.(Austin，TX，USA)和New England Biolabs Inc.(Beverly，MA，USA)商购获得。
在一些系统中RNAi的初始试剂是对应于靶核酸的dsRNA分子。然后认为dsRNA(例如shRNA)被切割成长度为21-23个核苷酸的短干扰RNA(siRNA)(19-21bp双链体，每个具有2个核苷酸3'突出端)。被认为影响该第一次切割步骤的酶被称为“Dicer”，并且被归类为dsRNA特异性核糖核酸酶的RNA酶III家族的成员。或者，RNAi可以通过直接导入细胞，或通过向细胞中引入此类siRNA或siRNA样分子的合适前体(例如编码前体的载体等(病毒载体，如腺病毒载体))在细胞内产生来实现。然后siRNA可以与其它细胞内组分结合以形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。由此形成的RISC随后可以通过其同源性经由其siRNA组分和靶转录物之间的碱基配对相互作用靶向感兴趣的转录物，导致靶转录物从siRNA的3'末端切割约12个核苷酸。因此，靶mRNA被切割并且其编码的蛋白质产物的水平降低。
可以通过将合适的体外合成的siRNA(shRNA)或siRNA样分子引入细胞中来实现RNAi。可以例如使用化学合成的RNA进行RNAi。或者，合适的表达载体可用于在体外或体内转录此类RNA。有义链和反义链的体外转录(由存在于相同载体上或在不同载体上的序列编码)可以使用例如T7RNA聚合酶实现，在这种情况下，载体可以包含与T7启动子可操作地连接的合适的编码序列。在实施方式中，体外转录的RNA可以在体外加工(例如使用大肠杆菌RNA酶III)至有利于RNAi的大小。将有义和反义转录物组合以形成RNA双链体，将其引入感兴趣的靶细胞中。可以使用其它载体，其表达能够加工成siRNA样分子的小发夹RNA(shRNA)。本领域已知各种基于载体的方法和用于将这些载体在体外或体内(例如基因治疗)引入细胞的各种方法。
因此，在一个实施方式中，可以通过向细胞中引入或产生对应于编码感兴趣的多肽(例如IRE1α)的核酸或其片段或与其同源的核酸的siRNA或siRNA样分子来抑制编码目的多肽(IRE1α)或其片段的核酸的表达。“siRNA样分子”是指与siRNA类似的核酸分子(例如大小和结构)并且能够引发siRNA活性，即实现RNAi介导的表达抑制。在各种实施方式中，这种方法可能需要将siRNA或siRNA样分子直接施用到细胞中，或使用上述基于载体的方法。在一个实施方式中，siRNA或siRNA样分子的长度小于约30个核苷酸。在又一个实施方式中，siRNA或siRNA样分子的长度约21-23个核苷酸。在一个实施方式中，siRNA或siRNA样分子包含19-21bp的双链体部分，每条链具有2个核苷酸的3'突出端。在实施方式中，siRNA或siRNA样分子与编码目的多肽的核酸或其片段或变体(或变体的片段)基本相同。这种变体能够编码具有与目标多肽相似的活性的蛋白质。
4、通过增加IRE1a核糖核酸酶活性来促进细胞衰老的方法
在某些条件下，刺激细胞衰老可能是有益的。通过刺激或增加IRE1α活性(即IRE1αRNA酶活性和细胞信号传导)能够促进或诱导细胞衰老(包括自分泌和旁分泌衰老)。IRE1α活性可以通过多种方法增加，包括通过增加细胞中IRE1α的表达或通过使细胞与激活IRE1αRNA酶活性的化合物接触(例如APY29、舒尼替尼或Joshi等人,2015,6(15):1309-1335中描述的化合物3)。
促进细胞衰老的方法可用于衰老具有有益效果的疾病和病症，例如组织修复、伤口愈合、肝纤维化、肾纤维化、心肌梗塞、心肌纤维化、动脉粥样硬化、肺动脉高压和癌症。
5、用于调节细胞衰老的组合物和方法，包括SEMA3A调节剂。
3类轴突导向因子(Sema3s)是蛋白质的亚家族，其已知的生物学作用是多样的和不断增长的。Sema3s的作用机制需要与跨膜受体结合，所述跨膜受体包含神经纤毛蛋白、丛状蛋白和细胞粘附分子(CAM)的异聚复合物。SEMA3A基因(GeneCard ID:GC07M083955；Entrez Gene ID:10371；Ensembl:ENSG00000075213)编码771个氨基酸的蛋白质(NP_006071.1；UniprotKB:Q14563,SEQ ID NO:50)，其包含信号肽、Ig样C2型(免疫球蛋白样)结构域、PSI结构域和Sema结构域(信号传导所需)。这种分泌的蛋白质首先被描述为轴突导向提示，但现在已涉及各种生理和病理过程，包括器官发育、骨代谢、血管发生、血管通透性、生长锥塌陷、肌原性再生和神经肌肉接头的形成、调节免疫系统、炎症、精神分裂症和视网膜疾病，如糖尿病视网膜病变。
Sema3a通常通过包含神经纤毛蛋白-1(NRP1)和共同受体(例如A类丛状蛋白(例如PLXna1-Plxna4、Plxnd1)、L1cam、chL1、Robo1)的受体复合物发出信号。NRP1(Ensemble；ENSG00000099250；ENST00000265371；Uniprot:O14786；OMIM:602069；HGNC:8004；GeneCardID:GC10M033216,SEQ ID NO:44-47、95和96)是具有大细胞内结构域的单次跨膜受体。神经纤毛蛋白-1的基本结构包括5个结构域：三个细胞外结构域(a1a2(CUB)、b1b2(FV/FVIII)和c(MAM))、跨膜结构域和细胞质结构域。a1a2结构域与补体成分C1r和C1s(CUB)同源，其通常含有4个半胱氨酸残基，以形成二硫键。该结构域结合SEMA3A。结构域b1b2(FV/FVIII)与VEGF结合。亚结构域b1中的氨基酸Y297对于结合VEGF是重要的，因为Y297向丙氨酸的取代显著降低了VEGF与NRP1的结合。亚结构域b1也有助于SEMA3A配体结合。实际上，申请人已经惊讶地发现Y297(Y297A)的取代也显著降低了SEMA3A与NRP1的结合。晶体学证据表明VEGF165和Sema3A不直接竞争NRP1，而是可以在不同的非重叠位点同时结合NRP1。
除了跨膜形式(同种型1，923aa，图17，SEQ ID NO：47、95和96，NM003873；Uniprot：O14786-1)之外，仅含有细胞外结构域的一部分的天然存在的可溶性NRP1蛋白(sNRP1)可以由细胞分泌。已经描述了不同的可溶形式，范围从551至704个氨基酸(同种型b/s12NRP1(644aa；RefSeq:NP_001019799.1；NM_001024628.2,SEQ ID NO:44)、s11NRP1(704aa；ENSP00000363956,SEQ ID NO:46)、sIII NRP1(551aa)和c/sIV NRP1(609aa；RefSeq:NP_001019800.1；NM001024629.2,SEQ ID NO:45)(Cackowski等人,2004,Genomics,84(1):82-94；Rossignol M等人,Genomics 2000；70(2):211-222；和Gagnon ML等人,2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA；97(6):2573-2578))。蛋白质的全长形式包含所有17个外显子，而可溶性同种型通过NRP1基因的可变剪接或通过内含子读取而产生。b/s12和c/sIV NRP1同种型包含a1a2和b1b2结构域和大部分b/c接头但不含c-结构域。同种型sIII含有a1a2结构域、b1亚结构域但仅是b2亚结构域的一部分。s11NRP1同种型含有a1a2和b1b2结构域，接着是外显子11和83个新氨基酸编码的b/c接头部分。
在本发明的第二方面，在缺血性视网膜病模型中的研究之后，令人惊讶地将SEMA3A鉴定为细胞衰老的调节剂。实际上，确定了由血管化视网膜区域中的神经元触发的未预料到的机制，其中它们进入过早的细胞衰老状态并采用衰老相关分泌表型(SASP)。本文描述的数据显示衰老细胞分泌SEMA3A通过IRE1a驱动旁分泌衰老，并通过缺血组织传播衰老至各种细胞类型，包括神经元、小胶质细胞和上覆脉管系统(旁分泌衰老)。此外，持续暴露于SEMA3A显示激活IRE1a，诱导衰老并驱动已知对促进和增强衰老状态如Pai1、IL6、Il1β、TGF-β和Tp53至关重要的一组基因的表达。SEMA3A还显示出促进衰老相关的表达γH2AX的DNA损伤灶，这是细胞衰老的标志。值得注意的是，如本文所证明的，针对SEMA3A的遗传干扰限制了衰老并刺激组织修复。
发明人已经发现，调节SEMA3A水平或活性能够控制细胞衰老，以及在细胞衰老过程中释放的蛋白质(通常是SASP的促炎细胞因子)的分泌。发明人已经发现，通过抑制SEMA3A的表达或活性，能够防止、限制或减少细胞衰老，并且能够防止或减少SASP的诱导。类似地，增加SEMA3A活性(例如通过增加其表达或通过使细胞与SEMA3A多肽接触)促进衰老并诱导SASP。
这些数据为SEMA3A在病理过程中通过SASP调节自分泌和旁分泌衰老的先前未曾预料的作用提供了证据，并揭示了在与衰老相关的疾病和病症中调节SEMA3A活性的治疗益处。
(i)通过抑制SEMA3A信号传导来抑制或预防细胞衰老的方法
通过降低SEMA3A活性(即SEMA3A细胞信号传导)能够抑制或预防细胞衰老，包括自分泌和旁分泌衰老。能够通过许多方法抑制SEMA3A活性。SEMA3A细胞活性的抑制可以通过以下来直接进行：(i)降低SEMA3A核酸或蛋白质表达，(ii)通过抑制细胞分泌；或(iii)通过隔离分泌的SEMA3A以抑制其与细胞表面上的受体结合；从而防止细胞内信号传导、IRE1α的活化和细胞衰老的起始和/或传播。用于抑制SEMA3A活性的试剂和方法的非限制性实例包括(i)针对SEMA3A的抗体；(ii)针对其受体之一的抗体(即，与SEMA3A结合其受体竞争)；(iii)用于降低SEMA3A表达的反义和RNAi方法；和/或(iv)使用可溶性受体或其片段，充当功能性SEMA3A捕获剂。
因此，本发明提供了抑制或预防细胞的细胞衰老或诱导细胞中衰老相关分泌表型(SASP)的方法，其包括降低SEMA3A水平或活性。
因此，本发明还涉及抑制或预防细胞的细胞衰老或诱导细胞中衰老相关分泌表型(SASP)的方法，其包括使所述细胞与SEMA3A拮抗剂接触。
还提供了抑制或预防受试者的细胞衰老或诱导细胞中衰老相关分泌表型的方法，其包括向所述受试者施用有效量的SEMA3A拮抗剂。
如本文所用，术语“SEMA3A抑制剂”或“SEMA3A拮抗剂”是指能够减少或阻断与SASP的SEMA3A诱导和SEMA3A诱导的细胞衰老相关的SEMA3A介导的细胞信号传导的试剂。本发明的“SEMA3A抑制剂”或“SEMA3A拮抗剂”与SEMA3A多肽或SEMA3A核酸(SEMA3A基因或mRNA)结合或相互作用，以减少SEMA3A多肽表达或与其同源受体的相互作用，使得SEMA3A介导的细胞信号传导得到减少或消除。非限制性实例包括减少或阻断SEMA3A(能够减少或阻断SEMA3A分泌的试剂或能够减少或阻断SEMA3A与其受体NRP1的结合的试剂)的表达(转录或翻译)的试剂。不受此限制，所述试剂可以是天然的或合成的，并且可以是蛋白质/多肽，例如但不限于特异性结合SEMA3A或NRP1受体的抗体；可溶性NRP1多肽或其片段(例如结合SEMA3A的NRP1捕获剂)、肽、小分子、多核苷酸，例如但不限于对编码SEMA3A蛋白或功能变体或其片段的SEMA3A核酸序列特异的反义或shRNA。
上述方法可用于治疗或预防细胞衰老有害的疾病或病症，如各种年龄相关病症(例如肌肉减少症、神经退变、表皮变薄、皮肤皱纹、脱发和头发灰白、白内障和其它老年疾病)、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、动脉粥样硬化、骨关节炎、骨质疏松症和帕金森病、青光眼、肠道疾病、椎间盘退变、脑动脉瘤、主动脉瘤、胰腺纤维化和囊性纤维化。在癌症治疗期间和/或之后抑制或预防细胞衰老也是有用的，以减轻化疗/放疗的副作用，包括例如代谢功能障碍，加速老化，生命后期癌症风险增加。在实施方式中，本发明包括的衰老相关疾病或病症排除眼病(例如视网膜血管疾病(缺血性视网膜病变、黄斑水肿))、炎症、脑缺血、中风或癌症。
a、抗体
在本发明的一个特定方面，通过使用SEMA3A抗体能够抑制SEMA3A活性(例如SEMA3A诱导的IRE1α活化)。这些抗体以这样的方式与SEMA3A结合，即它抑制其与其同源受体NRP1的结合，从而阻止SEMA3A介导的细胞信号传导(79、80)。
或者，也可以使用直接靶向NRP1受体的抗体，其阻断SEMA3A与NRP1的结合。在本发明的特定方面，靶向NRP1的抗体阻断SEMA3A与受体的结合，但基本上不干扰VEGF与NRP1的结合。在一个实施方式中，NRP1抗体结合NRP1多肽的a1a2(A)结构域。
如本文所用，术语“SEMA3A抗体”是指与SEMA3A蛋白特异性结合(相互作用)并且与除了与SEMA3A蛋白共享相同抗原决定簇的蛋白质之外的其它天然存在的蛋白质基本上没有结合的抗体。类似地，术语“NRP1抗体”是指与NRP1蛋白特异性结合(相互作用)并且与除了与NRP1蛋白共享相同抗原决定簇的蛋白质之外的其它天然存在的蛋白质基本上没有结合的抗体。SEMA3A/NRP1抗体包括多克隆、单克隆、人源化和嵌合抗体。术语抗体或免疫球蛋白以最广义使用，并且涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性即可。抗体片段包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、双抗体、线性抗体、单链抗体分子、单结构域抗体(例如来自骆驼科动物)、鲨鱼NAR单结构域抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段还可以指包含CDR或抗原结合结构域的结合部分，包括但不限于VH区(VH，VH-VH)、anticalins、PepBodiesTM、抗体-T细胞表位融合体(Troybodies)或Peptibodies。
先前已经制备了抗人SEMA3A/NRP1抗体(80)，并且还可以从包括Santa Cruz在内的各种来源商购获得。通常，用于制备抗体(包括单克隆抗体和杂交瘤)和用于使用抗体检测抗原的技术是本领域熟知的，并且各种方案是公知的并且容易获得。
b、可溶性受体或其片段
通过使用天然存在的可溶性NRP1多肽或合成的NRP1多肽(例如在细胞系中体外产生(重组)或化学合成)，能够实现Sema3介导的细胞衰老的调节。如本文所用，术语“NRP1捕获剂”或“NRP1多肽捕获剂”包括天然存在的可溶性NRP1多肽(例如图17、19、表2和SEQ IDNO:44-47、95和96中所示的NRP1分泌的同种型)、非天然存在的可溶性NRP1多肽和合成的可溶性NRP1多肽，包括NRP1的任何功能性可溶性片段或NRP1的任何功能变体，其与内源(细胞、膜结合的)NRP1竞争SEMA3A配体结合。在一个实施方式中，本发明的NRP1捕获剂在自然界中不存在(即不是天然存在的)，而是从天然存在的NRP1多肽“衍生”(即它们是合成的；例如包含NRP1同种型1(例如跨膜(细胞)NRP1的氨基酸1-857)或其片段或变体的细胞外结构域的NRP1捕获剂)。通常，本发明的NRP1捕获剂最初在其N-末端包含信号肽(例如图17中所示的NRP1氨基酸序列的约1-21个氨基酸)，其在成熟时被切割并被细胞分泌。因此，当作为纯化的多肽施用时或当制备为包含纯化或基本上纯的形式的药物组合物时，本发明的NRP1多肽捕获剂缺少氨基酸1-21。类似地，编码本发明的NRP1捕获剂的核酸包含5'中的多核苷酸序列，其编码信号肽(例如编码N末端的前21个氨基酸的前63个核苷酸)，其将允许NRP1捕获剂由细胞合成和分泌。取决于条件和细胞类型，为分泌而去除的信号肽的长度可以变化。已经描述了aa 1-20、1-21和1-27的去除(参见图17-18和例如SEQ ID NO：47、95和96)。在具体实施方式中，信号肽对应于图17或SEQ ID NO：47、95或96中所示的NRP1多肽的前21个氨基酸。
表1：NRP1蛋白结构域
结构域 氨基酸(参考SEQ ID NO：47、95和96)
信号肽(SP) 1-20、1-21或1-27，取决于条件和/或细胞类型
a1(CUB 1) 从信号肽末端到约aa 141
a2(CUB 2) 从约aa 147到约aa 265
b1(F5/8C1) 从约aa 275到约aa 424
b2(F5/8C2) 从约aa 431到约aa 583
c(MAM) 从约aa 591到约aa 859
跨膜 从约aa 860到约882
细胞质 从约aa 883到aa 923
可根据本发明使用的NRP1捕获剂的非限制性实例包括SEQ ID NO：44-47、95和96中所示的天然存在的可溶性NRP1，在下表2中、图18中、WO 2016/03699(其通过引用并入本文)中描述的NRP1捕获剂。当然，施用于受试者或与细胞接触的成熟的活性形式的可溶性NRP1捕获剂缺乏对应于信号肽的aa酸序列部分以及通常存在于细胞、膜结合NRP1中的跨膜和细胞质结构域。
在一个实施方式中，本发明的NRP1捕获剂包括：(i)人NRP1多肽的氨基酸1-856(优选其成熟形式，从信号肽之后的aa(例如aa 21、22或28)至aa 856)；(ii)人NRP1多肽的氨基酸1至583(优选其成熟形式，从信号肽之后的aa(例如aa 21、22或28)至aa 583)；(iii)人NRP1多肽的氨基酸1至424(优选其成熟形式，从信号肽之后的aa(例如aa 21、22或28)至aa424)；(iv)人NRP1多肽的氨基酸1至265(优选其成熟形式，从信号肽之后的aa(例如aa 21、22或28)至aa 265)；(v)人NRP1多肽的氨基酸1至430和584至856(优选其成熟形式，从信号肽之后的aa(例如aa 21、22或28)至aa 430和aa 584至aa 856)；(vi)人NRP1多肽的氨基酸1至274和584至856(优选其成熟形式，从信号肽之后的aa(例如aa 21、22或28)至aa 274和aa584至aa 856)；(vii)人NRP1多肽的氨基酸1至430和584至856(优选其成熟形式，从信号肽之后的aa(例如aa 21、22或28)至aa 430和aa 584至aa 856)。在实施方式中，NRP1多肽包含图17、SEQ ID NO：44、45、46、47、95或96中所示的氨基酸序列或其等位基因变体或功能变体，或由组成。
鉴于NRP1明显调节其配体对信号转导和细胞应答的影响，特异性抑制SEMA3A的活性而不是其它的可能是有利的。在一个具体实施方式中，本发明的NRP1捕获剂可包含一种或多种突变，其降低NRP1结合例如VEGF的能力。这种突变可用于更具体地调节与SEMA3A结合相关的NRP1的活性，对与其它配体相关的内源NRP1活性的影响较小。
因此，在一个实施方式中，本发明的NRP1捕获剂是结合SEMA3A但不结合VEGF的多肽。例如，NRP1捕获剂可以包含与SEMA3A结合的a1和/或α2亚结构域但不包含与VEGF结合所需的b1和/或b2亚结构域(例如1.1，Trap M、Trap N、Trap Y-参见表2)。在一个实施方式中，NRP1衍生的捕获剂包含对应于图17中所示的人NRP1氨基酸序列的氨基酸22至275的结构域a1和a2。NRP1捕获剂还可以包含突变(例如缺失或取代)，与VEGF相比，它可以显著消除或显著降低VEGF与NRP1的结合，但不能显著降低SEMA3A与NRP1的结合，或者可能优先结合SEMA3A(例如Trap Z，-也参见表2和6)。这种突变的非限制性实例包括在NRP1的319位谷氨酸和320位天冬氨酸的取代(例如E319K和D320K，如在Trap AC和Z中)。
在一个实施方式中，可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段(即NRP1捕获剂)包含如图17、18、SEQ ID NO:44、45或46或表2所示的捕获剂或其结合SEMA3A的任何功能变体或由其组成。在实施方式中，可溶性NRP1多肽捕获剂包含SEQ ID NO：47、95或96中所示多肽的细胞外结构域或由其组成。在实施方式中，根据本发明使用的NRP1捕获剂对SEMA3A的结合亲和力是VEGF165的结合亲和力的至少3倍。在实施方式中，根据本发明使用的NRP1捕获剂对SEMA3A的结合亲和力是VEGF165的结合亲和力的至少4倍。在实施方式中，根据本发明使用的NRP1捕获剂对SEMA3A的结合亲和力是VEGF165的结合亲和力的至少5倍。在实施方式中，根据本发明使用的NRP1捕获剂对SEMA3A的结合亲和力是VEGF165的结合亲和力的至少10倍。在实施方式中，根据本发明使用的NRP1捕获剂对SEMA3A的结合亲和力是VEGF165的结合亲和力的至少15倍。在实施方式中，根据本发明使用的NRP1捕获剂对SEMA3A的结合亲和力是VEGF165的结合亲和力的至少18倍。在实施方式中，根据本发明使用的NRP1捕获剂对SEMA3A的结合亲和力是VEGF165的结合亲和力的至少10倍。在实施方式中，根据本发明使用的NRP1捕获剂对SEMA3A的结合亲和力是VEGF165的结合亲和力的至少20倍(参见例如表6)。
因为本发明的NRP1捕获剂是分泌的，它们通常缺乏跨膜结构域(例如对应于图17中所示的NRP1多肽序列的氨基酸残基860至883)和在例如人NRP1同种型1(SEQ ID NO：95、96和图17)中发现的胞质结构域(例如对应于图17中发现的NRP1多肽同种型1序列的氨基酸残基884-923)。在实施方式中，本发明的NRP1捕获剂缺乏NRP1的完全或部分结构域c。NRP1同种型1包含较大的c结构域(参见图17)，而同种型b和c则较短。
如上所述，本发明还包括本文所述的NRP1多肽捕获剂的功能变体和功能片段在本文所述方法中的用途。功能变体衍生自“野生型”(天然)人NRP1多肽序列(包括群体中天然存在的任何等位基因变异，即等位基因变体)。因此，如本文所用，“功能变体”或“功能片段”是指任何NRP1衍生物，其具有与本发明的NRP1捕获剂基本相同的细胞衰老生物活性(即能够减少或预防诱导SASP和细胞衰老)。因此，功能衍生物包括但不限于通过任何修饰与本文公开的NRP1多肽捕获剂不同的蛋白质，和/或氨基酸取代、缺失、添加(例如序列内插入)或羧基末端融合，其不显著降低本发明的NRP1捕获剂的预期生物学效应(例如抑制或预防SEMA3A介导的细胞衰老或抑制或预防通过SASP的细胞衰老的SEMA3A依赖性增殖并最终抑制IRE1α活化和RNA酶活性等)。修饰能够发生在任何地方，包括在多肽主链中(即氨基酸序列)、氨基酸侧链和氨基或羧基末端，只要这些修饰基本上不会对本发明NRP1捕获剂的预期功能产生负面影响(即变体是能够结合和隔离SEMA3A多肽的功能变体(例如天然存在的人可溶性NRP1同种型或对应于“野生型”人NRP1的细胞外结构域的多肽片段的NRP1捕获剂，例如表2和图18中所示的那些)。
表3提供了可在本发明的可溶性NRP1捕获剂中修饰(变化或改变)的氨基酸的非限制性实例。优选地，功能变体(i)中的修饰是根据下表3制备的保守取代，(ii)对应于在群体中发现的功能性等位基因或多态性变异；或(iii)对应于人NRP1多肽的直向同源物中发现的氨基酸变异。NRP1蛋白的几种直向同源物是本领域已知的。例如，通过将人NRP1多肽序列与来自其它已知直系同源物(例如小鼠和大鼠的NRP1多肽-参见图17)序列进行比较，本领域技术人员可以容易地鉴定保守残基和不同物种之间变化的保守残基，因此，能够鉴定可以被修饰的氨基酸而对所需的生物活性没有实质性影响(例如抑制或预防细胞衰老或抑制或阻止细胞衰老通过SASP传播)。表4中提供了这种氨基酸的非限制性实例。
表3：示例性保守取代
Trp Tyr
Tyr Trp；Phe
Val Ile；Leu
表4：可在本发明的可溶性NRP1多肽/NRP1捕获剂中改变的氨基酸的非限制性实例。
*参考图17和SEQ ID NO:96
本发明的NRP1捕获剂的其它功能变体可以通过引入对应于群体中检测到的天然(等位基因)变体的一个或多个突变来制备。这些天然变体能够使用众所周知的公开数据库容易地鉴定，例如通过NCBI、GeneCard、HOMIM和Ensembl网站。
在实施方式中，本发明的NRP1捕获剂的功能变体包含SEQ ID NO：47的氨基酸1-857或其功能片段或由其组成。在实施方式中，功能变体包含位于表4中列出的一个或多个氨基酸位置的一个或多个保守氨基酸取代。在实施方式中，氨基酸取代如表4中所示。在实施方式中，
本发明的可溶性NRP1多肽捕获物或其功能片段或变体(等位基因变体)可包含一个或多个另外的多肽域以增加合成、纯化、稳定性和/或生物利用度。例如，本发明的NRP1捕获剂可包括FC结构域(或其部分，例如人FC结构域)或纯化标签(例如6X-组氨酸标签)。此类另外的多肽域可以直接或间接(通过接头)与可溶性NRP1多肽或其功能片段或变体连接。在一个实施方式中，一个或多个另外的结构域位于NRP1多肽捕获剂的C末端。在一个实施方式中，一个或多个另外的结构域位于NRP1多肽捕获剂的N末端。
本发明的可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段可任选地包括一个或多个多肽接头。此类接头可用于将一个或多个另外的多肽结构域与本发明的可溶性多肽连接(例如增加多肽体内稳定性的多肽结构域和/或促进多肽纯化的结构域)。接头序列可任选地包括肽酶或蛋白酶切割位点，其可用于去除一个或多个多肽片段或结构域(例如在体内施用可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段之前去除纯化标签)。能够切割多肽和去除例如多肽结构域(例如6X其标签纯化结构域)的接头或结构域的一个非限制性实例包括含有TEV蛋白酶切割位点的多肽(例如EXXYXQ\G或S，其中\表示切割位点，SEQ ID NO：97和98)。许多其它TEV切割位点是已知的，并且许多其它蛋白酶/肽酶切割位点是本领域技术人员已知的，并且可以引入本发明的多肽中以任选地除去一个或多个多肽结构域或片段。
多肽接头也可用于取代通常在野生型NRP1多肽中发现但在本发明的可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段中不存在的全部或部分结构域。例如，在本发明的NRP1捕获剂中，合成接头可以完全或部分取代亚结构域a1、a2、b1、b2和c。接头的长度可以对应于移除的结构域的整个长度或其部分。此类接头可以增加蛋白质折叠、稳定性或与NRP1配体的结合。包含接头的NRP1捕获剂的非限制性实例描述于WO2016/033699中，其通过引用并入本文。有用的多肽接头的一个非限制性实例是聚精氨酸多肽。其它接头是本领域已知的并且可以根据本发明使用。
因此，本发明进一步提供了可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段，编码可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段的核酸，包含核酸的载体和包含核酸或载体的宿主细胞。
c、抑制SEMA3A表达
有多种方法可用于降低SEMA3A表达，从而降低SEMA3A介导的细胞衰老。非限制性实例包括使用小发夹shRNA(RNAi)、反义核酶、核酶、靶向SEMA3A启动子的TAL效应子或CRISPR/Cas9/Cpf1系统等。
可以通过递送质粒或通过病毒(例如慢病毒载体)或细菌载体获得细胞中shRNA或类似抑制性RNA的表达。表9中提供了可用于抑制SEMA3A表达的shRNA的非限制性实例(参见实施例11)。
因此，在替代实施方式中，本发明提供了反义、shRNA分子(iRNA)和核酶用于外源施用以实现降解和/或抑制目的mRNA的翻译。优选地，反义、shRNA分子和核酶靶向哺乳动物(优选人)SEMA3A。在美国专利号5,932,435中公开了筛选可用于提供本发明的SEMA3A抑制剂等分子的反义和核酶核酸的示例性方法。
在另一个实施方式中，可以使用RNA干扰(RNAi)技术(一种转录后基因沉默)抑制或预防编码目的多肽(SEMA3A或NRP1)或其片段的核酸的表达。以上关于IRE1α的抑制提供了治疗性反义寡核苷酸应用的实例和关于反义分子、shRNA和RNAi技术的额外信息，并且以相同程度应用于抑制SEMA3A表达。
因此，在一个实施方式中，可以通过向细胞中引入或产生对应于编码感兴趣的多肽(例如SEMA3A)的核酸或其片段或与其同源的核酸的siRNA或siRNA样分子来抑制编码目的多肽(SEMA3A或NRP1)或其片段的核酸的表达。
(ii)通过增加SEMA3A活性来促进细胞衰老的方法
通过刺激或增加SEMA3A活性(即SEMA3A细胞信号传导)能够促进或诱导细胞衰老(包括自分泌和旁分泌衰老)。SEMA3A活性可以通过许多方法增加，包括通过增加细胞中SEMA3A的表达或通过使细胞与SEMA3A多肽或其功能片段或变体接触。
促进细胞衰老的方法可用于衰老具有有益效果的疾病和病症，例如组织修复、癌症、肾纤维化、伤口愈合、肝纤维化、心肌梗塞、心肌纤维化、动脉粥样硬化和肺动脉高压。
6、调节脂质参数
申请人已发现NRP1基因参与脂质代谢的控制(脂肪摄取/储存/积累)，并且施用可溶性NRP1多肽或其片段(例如，NRP1捕获剂)显著减少饲料诱导的体重增加并改善脂质参数，对血糖水平和胰岛素敏感性有益(或伴有积极效应)。
因此，在另一方面，本发明提供了改变受试者中脂质参数的方法，其包括调节NRP1基因和/或其相关NRP1蛋白(例如跨膜同种型1)的表达和/或活性。在具体方面，该方法包括向受试者施用降低或抑制NRP1蛋白表达和/或活性的化合物或组合物。在实施方式中，该方法包括向受试者施用(a)可溶性NRP1多肽或其片段(例如NRP1捕获剂)；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物。
如本文所用，表述“与脂肪蓄积相关的疾病或病症”包括由脂肪蓄积或被认为对脂肪蓄积的共病(例如饲料诱导的超重或肥胖)引起的任何疾病或病症。合并症是一种医学病症，其存在率在原始病症(例如脂肪积累；超重或肥胖)的情况下高度增加(即患有这种额外疾病或病症的风险增加)。该术语能够表示与原始代谢状况同时存在的病症(例如脂肪蓄积)或发展这种合并病症的风险。据说与脂肪蓄积相关的疾病或病症是由受试者中的脂肪积累引起的，或者与其相关。与脂肪堆积相关的疾病和病症包括：高BMI；肥胖；代谢综合征；NAFLD；心血管疾病(心血管疾病；心脏病(如充血性心力衰竭)；冠状动脉疾病(高胆固醇血症和动脉粥样硬化)肺栓塞、血脂异常和中风)；高血压和II型糖尿病(TIIDM)。在实施方式中，脂肪积累对应于大于或等于25kg/m2的BMI。在另一实施方式中，脂肪积累对应于大于或等于30kg/m2的BMI。
与脂肪蓄积相关的身体组成参数在本领域中是公知的。此类身体组成参数包括内脏脂肪面积(VFA)、体重指数(BMI)、腰臀比；腰围与身高比(WHeR)、腰围(WC)；手臂周长(AC)、锥度指数、体脂百分比(PBF)、肱三头肌皮肤皱褶、肩胛下皮肤皱褶、白色脂肪组织(WAT)水平；和棕色脂肪(BAT)组织水平。
使用天然存在的可溶性NRP1多肽或本文所述的合成(例如重组产生的或化学合成的)NRP1多肽可以实现NRP1介导的脂质代谢的调节。
7、组合物/制剂
可以在药物组合物中提供活性成分(例如一种或多种SASP抑制剂，包括一种或多种IRE1α抑制剂，SEMA3A的抑制剂(例如NRP1捕获剂)等)。根据本发明使用的药物组合物可以使用一种或多种生理学上可接受的运载体以常规方式配制，所述运载体包括赋形剂和助剂，其有助于将活性化合物加工成可以药学上使用的制剂。药物组合物可包括其它药物或药剂、运载体、佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶液促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂。适当的制剂取决于所选择的施用途径。对于注射，本发明的试剂可以配制在水溶液中，优选在生理上相容的缓冲液中，例如Hanks溶液、Ringer溶液或生理盐水缓冲液。制备制剂的本领域熟知的方法可以在例如Remington:The Science and Practice ofPharmacy,(20th ed.)ed.A.R.Gennaro AR.,2000,Lippencott Williams&Wilkins中找到。
在实施方式中，配制本发明的组合物用于递送至眼睛，例如滴眼剂或眼部注射剂。对于眼部施用，如本领域所熟知的，通过将活性化合物与适于眼部施用的药学上可接受的运载体组合，能够容易地配制化合物。在实施方式中，运载体不是天然存在于与本发明的化合物/药剂/抑制剂的混合物中的运载体(即非天然存在的运载体)。
例如，药物组合物能够配制用于局部施用、玻璃体内施用、前房内施用、结膜下施用、眼球下施用、眼球后施用、后巩膜施用或其组合。在一些实施方式中，配制药物组合物用于局部施用。在一些实施方式中，配制药物组合物用于玻璃体内施用。
用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如在安瓿或多剂量容器中，并添加防腐剂。该组合物可以采取诸如油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
或者，可以使用其它药物化合物递送系统。脂质体和乳液是递送媒介物的众所周知的实例。用于眼周药物递送的特别有用的递送系统(例如在预防和/或治疗或诸如视网膜疾病的眼部疾病中)包括经巩膜吸收途径，其被认为是在后段内层中实现一致的治疗药物浓度的最安全的手段之一。
有效剂量。适用于本发明的药物组合物包括其中含有有效量的活性成分以达到预期目的的组合物。更具体地，治疗有效量是指有效预防所治疗受试者的至少一种现有症状的发展或减轻其的量。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。
在实施方式中，根据本发明使用的化合物的有效剂量抑制细胞衰老或细胞衰老的传播(通过SASP)足以减少或预防与本文描述的病症和病症(例如眼部血管疾病和本文所述的其它疾病和病症)中细胞衰老相关的至少一种症状或生理作用。具有这种活性的某些化合物可以通过确定SASP和/或IRE1α的剂量依赖性抑制的体外测定来鉴定。
或者，在其它实施方式中，根据本发明使用的化合物的有效剂量足以诱导或增加SASP并引起细胞衰老。
对于本发明方法中使用的任何化合物，最初可以从细胞测定估计治疗有效剂量。例如，能够在细胞和动物模型中配制剂量以达到循环浓度范围，其包括在细胞测定中测定的IC50(即实现SASP和/或IRE1α的细胞信号传导功能的半数最大抑制的测试化合物的浓度，(通常响应于炎症介质，例如IL-1β或其它激活刺激，例如缺氧、缺血、细胞应激、ER应激)。
治疗有效量是指导致受试者症状改善的化合物的量。类似地，预防有效量是指预防或延迟患者症状(例如血管通透性过高、斑点和/或视力模糊、周细胞丢失、黄斑水肿、视网膜肿胀、血液视网膜屏障渗漏、病理性新生血管形成、减少血管修复等)所需的量。这些化合物的毒性和治疗功效可通过细胞培养物或实验动物中的标准药学方法测定，例如确定最大耐受剂量(MTD)和ED(50％最大反应的有效剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且它能够表示为MTD和ED50之间的比率。具有高治疗指数的化合物是优选的。确切的制剂、施用途径和剂量可以由个体医生根据患者的病情选择。
可以单独调整剂量和间隔以提供足以维持所需调节作用的活性化合物水平，或最小有效浓度(MEC)。每种化合物的MEC会有所不同，但能够从体外数据中估算出来；例如实现对SASP和/或IRE1α表达或活性的实质性抑制所必需的浓度(例如与SASP相关的细胞因子、蛋白酶和生长因子的分泌，核糖核酸酶活性激活和XBP1s的加工)。实现MEC所需的剂量将取决于个体特征和施用途径。
定义
为了清楚和一致地理解本申请中的术语，提供了以下附加定义。
本文使用的冠词“一个”、“一种”和“该”是指该冠词的一个或多于一个(即至少一个)语法对象。
如在本说明书和权利要求中所使用的，词语“包含(comprising)”(和任何形式的包含，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和任何形式的具有，例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及任何形式的包括，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及任何形式的含有，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)都是包含式或开放式的并且不排除另外的、未列举的元素或方法步骤，并且可与术语“包括但不限于”和“包含但不限于”互换使用。
对于本文中数字范围的叙述，明确考虑了其间具有相同精度的每个中间数。例如，对于18-20的范围，明确考虑了数字18、19和20，而对于范围6.0-7.0，明确考虑了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。术语“例如”在本文中用于表示短语“例如但不限于”并且可与其互换使用。
除非本文另有定义，否则结合本公开使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。例如，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质和核酸化学和杂交相关的任何命名法和技术是本领域众所周知和常用的那些。这些术语的含义和范围应该是明确的；但是，如果存在任何潜在的歧义，本文提供的定义优先于任何字典或外在定义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。
除非另有说明，本文公开的方法以及制备和使用本文公开的产品和组合物的实践采用分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养、重组DNA和相关领域中的常规技术在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分的解释。参见例如Green和Sambrook MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,4th edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,2014；Ausubel等人,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,JohnWiley&Sons,New York,2003和定期更新；系列METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,AcademicPress,San Diego,1998；METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,"Chromatin"(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe编辑),Academic Press,San Diego,1999；和METHODS IN MOLECULARBIOLOGY,Vol.119,"Chromatin Protocols"(P.B.Becker编辑)Humana Press,Totowa,1999。
本文所用的术语“治疗”和“预防”分别指引发所需的生物反应，即治疗和预防效果。根据本发明，治疗效果包括在施用本发明的药物组合物或化合物(例如SASP抑制剂)后症状的改善和/或疾病或病症(例如血管性眼病)的严重性的降低。
如本文所用，关于与衰老相关的疾病或病症的术语“预防”意指与疾病或病症或细胞衰老的一个特征相关的至少一种症状的进展减少或延迟发作。
本文描述了用于调节细胞衰老的方法。如本文所用，“细胞衰老”是指细胞的病况，其中细胞是活的并且代谢活跃但是丧失了增殖能力或保持组织结构的一部分但是不能与组织的其余部分正常运作/交流(即它变成休眠状态)。细胞衰老可随着年龄的增长或暴露于诱导DNA损伤(例如突变或染色体损伤)或诱导DNA损伤应答或染色质结构破坏导致基因表达变化(例如与SASP相关的基因)的因素而增加。衰老被认为是DNA或染色体损伤的结果，包括端粒缩短、染色体非整倍性、DNA链断裂、DNA化学修饰(例如烷基化)或引发DNA损伤应答(DDR)。细胞衰老可能由例如缺血、致癌基因激活(通过DDR)DNA损伤化合物(例如化疗剂)或DNA损伤辐射(例如电离和UV辐射)引起。衰老可由各种其它治疗方案引起，例如皮质类固醇治疗、抗逆转录病毒治疗、用PPARγ激动剂治疗、用黄嘌呤氧化酶抑制剂治疗、用双膦酸盐治疗、用抗原虫剂治疗和用炎性剂治疗。衰老也可能由代谢失衡引起，如热量摄入增加、胰岛素抵抗、II型糖尿病、高胰岛素血症、高脂肪饲料、高蛋白饲料、ER-应激反应(UPR反应，如本文所示)和与这些疾病相关的肠道微生物群的变化。衰老细胞发展出一种独特的分泌组，包括金属蛋白酶、生长因子和炎性细胞因子，这一过程称为衰老相关分泌表型(SASP)(37)，它能够以细胞自主和非细胞自主(旁分泌)的方式将衰老传播到周围组织(38-40)。因此，由于衰老相关分泌表型(SASP)，可以在细胞中诱导旁分泌细胞衰老。旁分泌衰老是指衰老细胞高度分泌蛋白质例如促炎细胞因子(SASP)的状态。
在各种实施方式中，细胞衰老由以下因素引起：(a)缺血；(b)细胞老化；(c)细胞DNA损伤；(d)与化疗剂接触；(e)用DNA破坏性辐射照射细胞；(f)使细胞与抗逆转录病毒剂接触；(g)使细胞与促炎剂接触；(h)使细胞与DNA损伤剂接触；(i)使细胞与破坏染色质结构的试剂接触；(j)端粒侵蚀；(k)缺氧；(l)致癌基因激活；(m)端粒功能障碍和(o)(a)至(m)中至少两种的任何组合。
已经经历细胞衰老的细胞可以表现出一种或多种以下特征：生长停滞、形成γ-H2AX(组蛋白变体H2AX的磷酸化形式)核灶、pI6INK4A水平上升、p21(Cip1/Waf1)表达水平升高、增加衰老相关的β-半乳糖苷酶活性、产生衰老相关的异染色灶(SAHF)、不能增殖、组蛋白3赖氨酸9(H3K9me3)的三甲基化、内质网应激和诱导的未折叠蛋白反应(UPR)、增加tp53的水平和/或激活、增加PML核体的数量和大小、激活IRE1α、增加葡萄糖消耗、增加“衰老相关分泌表型”(SASP)(可能包括但不限于Pai1、IL-6、IL-7、IL-1α、IL-1β、IL-8、TGF-β1、MCP-2、MCP4、MIP-1α、MIP-3a、嗜酸细胞活化趋化因子-3、GM-CSF、MIF、EGF、FGF、HGF、VEGF、KGF、PIGH、NGF、MMP1、MMP3、MMP12、MMP13、MMP14、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP4、IGFBP6、IGFBP7、纤连蛋白、组织蛋白酶B、TIMP-2)、缺乏Ki67的表达、扩大和扁平的细胞形态、持续性DNA损伤应答(DDR)信号并且形成具有增强衰老的染色质改变的DNA片段(DNA-SCARS)，其是可以含有DDR蛋白质如磷酸-ATM和ATR底物的核灶。相对于未曾经历细胞衰老的细胞中P16INK4a表达水平，已经经历细胞衰老的细胞通常具有增加的p16INK4a表达水平。而且，相对于未曾经历细胞衰老的细胞中SA-β-Gal活性水平，已经经历细胞衰老的细胞通常具有增加的SA-β-Gal活性水平。
如本文所用，“衰老细胞”或“具有衰老表型的细胞”是指具有以下特征中的至少一个的细胞：(i)生长停滞，(ii)扩大和变平的细胞形态，(iii)DNA细胞核中的病灶，(iv)生长因子蛋白酶、细胞因子和其它因子的分泌，定义为衰老相关分泌表型(SASP)(例如PAI1、TNFAAIP2、IGFBP3、VIM、CDKN1A、FN1、CDKN2B、RRAS、IRF7)、HSPA2、TES、CTGF、CCND1、ESM1、THBS1、S100A11、RAB31、IGFBP5、IL6、IL1β、TGFβ1、VEGFA、TP53)，(v)衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性(部分反映溶酶体质量的增加)，(vi)肿瘤抑制因子p16INK4a的表达(其可能激活pRB并导致衰老相关的异染色质灶(SAHF)的形成)；(vii)SEMA3A表达；(viii)IRE1a激活(S724磷酸化)和增加XBP1的剪接和/或(ix)增加γH2AX、PML和/或p53激活的表达。在实施方式中，“衰老细胞”是至少具有以下特征的细胞：(i)、(ii)和/或(ii)、(v)、(vi)和(ix)。在实施方式中，衰老继发于细胞缺血。在实施方式中，衰老是旁分泌衰老。在实施方式中，衰老是分化后的衰老。在实施方式中，衰老是过早衰老。在实施方式中，过早衰老的特征在于IRE1α的表达和/或RNA酶活性的增加。在实施方式中，衰老是视网膜衰老。在实施方式中，衰老是小胶质衰老。在实施方式中，衰老的特征在于(i)P16INK4a、Tp53、IRE1a、Cdkn1aCdkn2a的表达和/或活性增加和/或衰老相关的β-gal活性；(ii)γH2Ax和/或PML的表达；和/或(iii)衰老相关分泌表型(SASP)的表达。在实施方式中，SASP包含IL-1β、IL-6、Pai1、TGFβ1、IRE1a和/或VEGF-.a的分泌。在实施方式中，上述SASP继发于细胞缺血。
在实施方式中，上述细胞是终末分化细胞。在实施方式中，细胞是神经元、小神经胶质细胞、骨髓细胞、单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、成纤维细胞和/或视网膜细胞。在实施方式中，细胞已经遭受细胞缺血。在实施方式中，细胞是视网膜神经节细胞。在实施方式中，细胞是视网膜神经节神经元。在实施方式中，细胞是血管细胞。在实施方式中，细胞是血管内皮细胞。在实施方式中，细胞是无血管细胞(即，它位于无血管区域/部位)。在实施方式中，细胞是肝星状细胞。在实施方式中，细胞是微血管内皮细胞。在具体实施方式中，细胞不是眼细胞。在具体实施方式中，细胞不是视网膜细胞。在实施方式中，细胞是哺乳动物细胞。在实施方式中，细胞是人细胞。
如本文所用，“细胞缺血”是指对细胞代谢所需的氧和/或营养物(例如葡萄糖)供应的限制(以保持组织存活)以及代谢废物的不充分去除。它包括身体特定部位的局部贫血症，有时是由于充血(如血管收缩、血栓形成或栓塞)引起的。缺血能够为部分(灌注不良)或全部。局部缺血通常由血管问题引起(例如栓塞、血栓形成(例如动脉粥样硬化动脉)、创伤、动脉瘤、心肌病、低血糖、放疗、低血压、贫血等)，导致组织损伤或功能障碍。
应用于本文所述的化合物、生物制剂和药物组合物的术语“有效量”是指产生所需治疗结果所需的量。例如，有效量是有效治疗、治愈或减轻施用了治疗化合物、生物制剂或组合物的疾病症状的水平。对所寻求的特定治疗目标有效的量将取决于各种因素，包括所治疗的病症及其严重性和/或发展/进展的阶段；生物利用度、所用特定化合物，生物制剂或药物组合物的活性；关于该受试者的施用和引入部位的途径或方法；特定化合物的清除率或生物和其它药代动力学特性；治疗时间；接种方案；与特定化合物、生物制剂或组合物组合使用或同时使用的药物；被治疗者的年龄、体重、性别、饮食、生理和一般健康状况；以及相关科学领域的技术人员所熟知的相似因素。剂量的一些变化能够根据所治疗的受试者的状况而发生，并且医生或其它个体施用治疗在任何情况下将确定个体患者的合适剂量。
“同源性”和“同源的”是指两个肽或两个核酸分子之间的序列相似性。通过比较比对序列中的每个位置能够确定同源性。核酸之间或氨基酸序列之间的同源性程度随着序列共有的位置上相同或匹配的核苷酸或氨基酸的数量而变化。如本文中使用的术语，如果两个序列基本上相同并且序列的功能活性是保守的，则核酸/多核苷酸序列与另一个序列是“同源的”(如本文所用，术语“同源的”不推断进化的关联)。如果在最佳比对(允许缺口)时，它们共享至少约50％的序列相似性或同一性，或者如果序列共享限定的功能基序，则认为两个核酸序列基本相同。在替代实施方式中，最佳比对的基本上相同的序列中的序列相似性可以是至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同。如本文所用，序列之间给定百分比的同源性表示最佳比对序列中的序列同一性程度。“不相关的”或“非同源的”序列与本文公开的任何核酸和多肽具有小于40％的同一性，但优选小于约25％的同一性。
基本上互补的核酸是其中一个分子的互补序列与另一个分子基本相同的核酸。如果在最佳比对时它们共享至少约70％的序列同一性，则认为两个核酸或蛋白质序列基本相同。在替代实施方式中，序列同一性可以是例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％。用于同一性比较的序列的最佳比对可以使用多种算法进行，例如Smith和Waterman的的局部同源性算法,1981,Adv.Appl.Math 2:482,Needleman和Wunsch的同源性比对算法,1970,J.Mol.Biol.48:443,Pearson和Lipman的搜索相似性的方法,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,和这些算法的计算机化实现(例如WisconsinGenetics Software Package,Genetics Computer Group,Madison,WI,U.S.A.的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)。序列同一性也可以使用Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-10中所述的BLAST算法确定(使用已发布的默认设置)。可以通过美国国家生物技术信息中心获得用于进行BLAST分析的软件(通过互联网http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。BLAST算法涉及首先通过在查询序列中识别长度为W的短词来识别高评分序列对(HSP)，所述短字在与数据库序列中的相同长度的字对齐时匹配或满足某个正值阈值评分T。T被称为邻域词得分阈值。最初的邻居单词命中作为启动搜索以找到更长的HSP的种子。只要能够增加累积比对评分，词的命中就沿着每个序列在两个方向上延伸。当满足以下参数时，停止在每个方向上的词的命中的扩展：累积比对评分从其最大实现值的数量X降低；由于一个或多个负得分残基排列的累积，累积得分为零或低于零；或达到任一序列的结尾。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLAST程序可以使用词长(W)为11，BLOSUM62评分矩阵(Henikoff and Henikoff,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919)对齐(B)为50，期望值(E)为10(或1或0.1或0.01或0.001或0.0001)，M＝5，N＝4，以及两条链的比较作为默认值。使用BLAST算法对两个序列之间的统计相似性的一种度量是最小和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。在本发明的备选实施方式中，如果测试序列比较中的最小总和概率小于约1，优选小于约0.1，更优选小于约0.01，并且最优选小于约0.001，则认为核苷酸或氨基酸序列基本相同。
两个核酸序列基本上互补的替代指示是两个序列在中等严格条件或优选严格条件下彼此杂交。在中等严格条件下与滤膜结合序列的杂交可以例如在0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，1mM EDTA中在65℃下进行，并在0.2×SSC/0.1％SDS中在42℃下洗涤(参见Ausubel，等人(编辑),1989,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,Green Publishing Associates,Inc.,and John Wiley&Sons,Inc.,New York,atp.2.10.3)。或者，在严格条件下与滤膜结合序列的杂交可以例如在65℃在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中进行，并在68℃在0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤(参见Ausubel，等人(编辑),1989,同上)。杂交条件可根据感兴趣的序列根据已知方法进行修改(参见Tijssen,1993,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter 2"Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays",Elsevier,New York)。通常，严格条件选择为在特定离子强度和pH下比特定序列的解链点低约5℃。例如，在实施方式中，本发明化合物是与NRP1或SEMA3A核酸序列(优选人序列)杂交的反义/RNAi或shRNA。
通过以下非限制性实施例进一步详细说明本发明。
实施例1
视网膜缺血触发细胞衰老
为了阐明缺血性视网膜病变后血管变性引发的细胞过程，我们使小鼠幼鼠成为氧诱导视网膜病变(OIR)模型，该模型产生类似于DR和ROP中观察到的无血管神经区域(27)。从出生后(P)第7天至第12天将小鼠幼鼠暴露于75％氧气以诱导血管闭塞并返回到环境空气，其中在P17达到最大视网膜前新血管形成(27)(图1A)。然后，我们通过在P14OIR(病理性视网膜前血管发生开始时)的视网膜的高通量RNA测序进行无偏倚的转录组学分析，并进行基因组富集分析(GSEA)以鉴定被调节的确定的基因表达模式。如所预期的，我们发现炎症簇(标准化富集评分(NES)＝1.58；错误发现率(FDRq)＝0.004)和细胞凋亡(NES＝1.63；FDRq＝0.002)中的强烈正相关(图1B)。鉴于神经视网膜的大量有丝分裂后性质，我们还意外地注意到Fridman衰老特征(28)簇中的显著富集(NES＝1.81；FDRq＝0.0)(图1C)。
细胞衰老是细胞周期永久停滞的状态，其中细胞保持活力和代谢活性(29)。在主要有丝分裂后组织如视网膜中，衰老可能是通过DNA损伤反应或肿瘤抑制网络的刺激引发的，据报道在缺血性视网膜中被激活(30)。因此，衰老状态可以保护视网膜细胞免于与缺血相关的低代谢供应并帮助逃避缺氧相关的细胞死亡。通过上调经典的衰老相关蛋白如p53、p16INK4a、Pai1、PML、γH2AX的诱导和需要ER-应激效应肌醇酶1α(IRE1α)的激活(已显示促进细胞衰老(31))(图1D)和OIR视网膜中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKi)Cdkn1a和Cdkn2a的转录水平显著增加(图1E)进一步支持OIR期间衰老。
为了确定哪些细胞在OIR期间触发衰老程序，我们在P14的视网膜铺片进行了衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色。与血管化区域相比，用同工凝集素B4(IB4)复染揭示了衰老细胞主要存在于无血管区(36.99％的细胞为SA-β-gal+)(18.79％；P<0.0001)。在对照常氧视网膜中也发现了少量的SA-β-gal+细胞(图1F和G)。与之一致的是，矢状面视网膜切片的分析显示视网膜神经节细胞层(GCL)的血管化区域中的SA-β-gal染色显著升高(10.77％对0.3％；P＝0.0167)，并且在内核层(INL)中染色程度较小(2.61％对0.45％；P＝0.0342)(图1H和I)。两层都与在缺血性视网膜病中退化的内部视网膜脉管系统密切相关。由于在图1B中缺血性视网膜(32)和凋亡基因的GSEA的缺氧/氧化和炎性性质，我们进一步寻求确定哪些细胞在OIR期间经历凋亡性死亡。末端脱氧核苷酸转移酶介导的生物素化的dUTP缺口末端标记(TUNEL)揭示INL中的凋亡细胞占优势(图1J)并且主要在外周(图10A)。总之(图1J)，这些数据揭示了视网膜细胞衰老和凋亡的相互排斥的模式，其中与中心区域相关的GCL细胞主要采用衰老表型，而INL细胞更易于凋亡。
实施例2
视网膜病变引发与衰老相关的分泌型表型，其传播细胞衰老
SASP通常会加强自分泌和旁分泌方式的衰老、增加炎症并对组织微环境具有不利影响(34)。我们探寻了在OIR期间最初在P14处的GCL中观察到的细胞衰老(图1J)是否传播到视网膜的其它细胞群。OIR中P14的初始SA-β-gal染色集中在无血管区域(图2A和B左图)并且以视网膜神经节神经元(RGC)为中心，这通过Brn3a+RGC与衰老标记物的共定位来证实(γH2AX、Pai1和p-IRE1αS724)(图2C)。在这个早期时间点，血管中没有与衰老相关的标记(图10B和C)。在P17，在最大新血管形成期间，细胞衰老定位于病理性血管簇(图2A和B中图)和视网膜小胶质细胞，如通过衰老标记物γH2AX或PML与IB4(血管)和IBA1(小胶质细胞)的共标记所证明的(图2D)。该脉管系统曲折且渗漏(35)并且较少稳定，周细胞覆盖较少(图11A、B)(36)。到OIR的P21为止，当视网膜脉管系统已经再生时，SA-β-gal染色主要局限于血管细胞(图2A和B右图，图10D)。在此后的时间点，重新进行周细胞覆盖(图11A、B)。此外，我们在链脲佐菌素诱导的I型糖尿病模型的第8周观察到小鼠GCL中的SA-β-gal染色的细胞(图10E、F)。鉴于OIR模型在小鼠幼崽中进行并且血管发生反应根据年龄而不同，STZ模型中视网膜衰老的存在尤为重要(37)。这些发现支持在广泛的眼血管病变中存在细胞衰老。鉴于OIR模型是众所周知且已建立的眼血管病变模型，在该模型中进行了进一步的研究。然而，我们在不同的视网膜病变模型中观察到视网膜的不同亚细胞群中衰老细胞的瞬时累积。随着疾病进展而变化的细胞衰老的动态演变模式支持旁分泌衰老。
衰老细胞发展出一种独特的分泌组，包括金属蛋白酶、生长因子和炎性细胞因子，这一过程称为衰老相关分泌表型(SASP)(39)，它能够以细胞自主和非细胞自主(旁分泌)的方式将衰老传播到周围组织(40-42)。OIR视网膜的热图和GSEA也鉴定了视网膜缺血和旁分泌衰老相关基因之间的正相关性(NES＝1.4；FDRq＝0.049)(图2E)。RT-qPCR对Pai1、Il6、Il1β、Tgf-β1、Vegf-a以及IRE1α和肿瘤抑制因子Tp53(图2F)证实了OIR中SASP相关细胞因子的表达升高，表明作为病理性血管发生的核心的几种细胞因子可能源于衰老的视网膜细胞。
实施例3
神经细胞分泌SEMA3A驱动旁分泌衰老
鉴于细胞衰老的扩散，我们试图找出在OIR中推动这一过程的因素。已经提出扰乱细胞周期的与视网膜缺血相关的效应分子(43)是经典的引导分子轴突导向因子3A(SEMA3A)。SEMA3A在OIR的血管闭塞和血管增殖阶段被诱导(44)，并由缺氧神经元分泌，以使再生血管和代谢供应偏向视网膜受影响较小的区域(44、45)。鉴于SEMA3A的表达在视网膜病变进展期间与衰老细胞相关的标志物在时间上一致(图3A、图5A和B)，我们质疑SEMA3A是否有助于传播旁分泌衰老。
首先，SEMA3A对旁分泌衰老的潜在贡献的证据源于观察到诱导衰老的致癌基因如RasV12(图3B)和MEK(图3C)引发SEMA3A的产生，应激诱导的衰老人肝星状细胞(HSC)也是如此(图3D)。此外，玻璃体内注射重组SEMA3A在P5幼仔中诱导p53、p16INK4a和IRE1α的显著增加(图3E)，伴随着SA-β-gal染色的显著增加(图3F)。
最终，将HRMEC暴露于SEMA3A 7天(模拟OIR的第一周)增加细胞周期停滞在G0/G1中，同时显著降低S期(图3G)并且通过电池阻抗感测(ECIS)测量阻碍正常的内皮细胞生长(图3H)。
SEMA3A在驱动衰老中的作用进一步证实了细胞直接暴露于重组SEMA3A，后者在巨噬细胞样J774细胞中(P<0.0001)、在视网膜神经细胞系中(用于模拟视网膜神经元的661W光感受器)(46)(P<0.001)和HRMEC(P<0.001)诱导衰老(图3I和J)。此外，H2O2驱动的衰老模拟视网膜病变中的氧化环境(3)，引发细胞系中SEMA3A的分泌，所述细胞系模拟视网膜病变进入衰老的群体例如巨噬细胞样J774细胞(J774)和神经元661W细胞(图3K)。
为了验证神经元衍生的SEMA3A在驱动旁分泌内皮细胞衰老中的潜在参与，我们将人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)暴露于来自衰老的661W细胞的条件培养基(CM)(图3L和M)，其中Sema3a被携带小发夹RNA(shRNA)的慢病毒(Lv)载体沉默(44、47)。证明了该方法的功效(图5C-E)。来自衰老的视网膜神经细胞系的CM，在68％的HRMEC中诱导SA-β-gal表达，以旁分泌方式有效繁殖衰老(P<0.005)(图3N左图，O)，突出显示由衰老细胞分泌的因子具有刺激邻近细胞衰老的倾向。相反，来自Sema3A缺陷的衰老视网膜神经元前体细胞的CM在HRMEC细胞中触发显著较少的旁分泌衰老(P<0.005)(图3N右图，O)。同时，HRMEC与来自衰老神经元前体的条件培养基(CM)的温育足以以SEMA3A依赖性方式激活p53(图5F和G)。有趣的是，通过玻璃体内施用Lv.sh_Sema3a在OIR的P12处下调SEMA3A在P14显著减少75％的衰老SA-β-gal阳性视网膜细胞的数量，强调了SEMA3A在OIR期间对衰老的关键贡献(图3P和Q)。总之，这些数据为细胞衰老过程中SEMA3A的产生及其在传播旁分泌衰老中的作用提供了证据。
实施例4
视网膜病变中ER应激转录物的富集
在ER应激条件下触发的未折叠蛋白反应(UPR)的途径能够为细胞提供在代谢失衡(例如缺血)期间存活的适应性机制(48、49)。在申请人的研究结果的支持下，ER应激的激活可能有助于过早衰老。经历OIR的视网膜的转录组学分析揭示了与UPR相关的转录物中的显著GSEA富集(NES＝1.41；FDRq＝0.047)(图4A)。鉴于SEMA3A显示激活UPR的IRE1α分支(图3E和图5H)，我们探寻了IRE1α对缺血性视网膜中过早衰老的贡献。
在缺血性视网膜病变期间，小胶质细胞和表达小胶质细胞标记物的髓样细胞的浸润存在实质性意义。我们用ROSA26EYFPfl/fl杂交髓系驱动LysM-Cre小鼠，并在富含EFYP+骨髓/小神经胶质细胞的无血管区域(图4B)中观察到SA-β-gal染色(图4C)。EFYP+小胶质细胞也用衰老相关的DNA损伤标记γH2AX染色，并且优先定位于P14OIR视网膜的血管/无血管边界和在P17优先定位于病理性血管发生(簇)的位点(图4C)。
实施例5
SEMA3A激活IRE1α和IRE1α的RNA酶活性有助于衰老
IRE1α是I型跨膜蛋白，在其胞质末端具有丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和不同的内切核糖核酸酶结构域两者(54、55)。通过其RNA酶活性，也称为IRE1α依赖性衰变(RIDD)，它优先靶向编码穿过ER-高尔基体分泌途径的蛋白质的mRNA(56)。鉴于SEMA3A通过IRE1α驱动衰老(图2、3)，我们接下来研究了哪个催化臂对这种生理反应负责。鉴于我们确定髓样细胞随视网膜缺血而衰老，我们使用J774巨噬细胞/单核细胞并证实持续暴露于SEMA3A激活IRE1α(图7A)，诱导衰老(图6B)并驱动一组已知对促进和增强衰老状态至关重要的基因的表达，例如Pai1、Il6、Il1β、TGF-β和Tp53(图7B)。此外，SEMA3A促进了表达γH2AX(其为细胞衰老的标志)的衰老相关的DNA损伤灶(图7C)(57)。类似地，shRNA介导的内皮细胞中IRE1α的敲低阻止了SEMA3A驱动的衰老(图6D和E)。
为了确定SEMA3A驱动的衰老是否通过IRE1α的激酶或RNA酶活性发生，使用4μ8c的IRE1α内切核糖核酸酶活性的选择性细胞渗透性香豆素o-羟基醛药理学抑制剂。暴露于4μ8c(图7D)阻止了SEMA3A诱导的生长停滞并消除了SEMA3A诱导的衰老(数据未显示)。在支持方面，4μ8c还阻止了SEMA3A介导的剪接和IRE1α效应子X-盒结合蛋白-1(XBP1)的激活(图7D和E)。最终，IRE1α的内切核糖核酸酶活性的药理学抑制抑制特定衰老相关基因Vegf-a、Tgf-β1、Il-1β、Il-6、Pai-1、Tp53的产生，而本身对Tnf-α或IRE1α没有影响(图7F)。这些数据突出了IRE1α的内切核糖核酸酶活性在触发衰老中的重要性。
实施例6
二甲酸胍消除了SASP和病理学视网膜血管发生
为了确定缺血性视网膜病变中SASP和旁分泌衰老的治疗性抑制的临床相关性，我们评估了患有活动性增殖性糖尿病性视网膜病变(PDR)的患者的玻璃体中关键SASP蛋白的水平。进行血管造影和光谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)，并且生成三维(3D)视网膜图以评估视网膜损伤的程度(图8A)。未经稀释的玻璃体来自患有PDR的患者和具有非血管病理学例如视网膜前膜和黄斑裂孔的对照患者，其仅显示非糖尿病相关的视网膜损伤。患者的详细特征包括在表1中。通过多重磁珠免疫测定评估玻璃质SASP蛋白显示患有PDR的患者的衰老相关因子Pai-1(P＝0.0004)、IL-6(P＝0.001)、IL-8(P＝0.0037)和VEGF-A(P＝0.0085)显著增加(图8B)。考虑到旁分泌衰老和视网膜病变之间的关联(图1C和3E)，我们寻求治疗性调节SASP并评估病理性视网膜血管发生的结果。在这方面，据报道广泛使用的双胍类抗糖尿病药物二甲双胍可以在不干扰生长停滞计划的情况下减少SASP(58)。在P12处单次玻璃体内注射二甲双胍减轻了经受OIR的小鼠视网膜中的NF-κB和IRE1α活化(图8C)。通过RT-qPCR(图8D)测定，这导致IL6、Cdkn1a、Cdkn2a和Sema3A的显著降低，并且在P14(P＝0.0086)(图8E和G和图12A)和P17(P＝0.0036)(图8F和G以及图12A)中转化为SA-β-gal的显著降低。VEGF信号传导途径的组分未受影响(图13A)。我们选择进行玻璃体内注射二甲双胍，因为全身施用会干扰小鼠体重增加，因此可能是一个混杂因素(32)。
表5：经历玻璃体活检的患者的临床特征。
我们接下来确定用二甲双胍治疗和随后抑制SASP是否会导致细胞凋亡增加。TUNEL染色显示，与载体处理的视网膜相比，用二甲双胍处理降低了INL层中凋亡细胞的数量，而没有加重GCL细胞中的细胞凋亡(图12B)。通过在视网膜病的不同阶段期间切割的胱天蛋白酶-3的视网膜的蛋白质印迹证实了这些发现(图12C)。最终，玻璃体内注射二甲双胍增强血管再生超过如在P17评估的2倍(P<0.0001)(图8H和J)和抑制病理性新血管形成的一半(P<0.0001)(图8H、K)。值得注意的是，通过系统途径施用二甲双胍对病理性视网膜血管发生没有任何益处，这强调了对局部玻璃体内施用的需要。总之，这些数据支持SASP与双胍类如二甲双胍治疗病理性眼部血管发生(病理性新血管形成)的治疗性抑制。
实施例7
VEGF捕获剂-眼消除病理性视网膜血管发生，但不会增加血管再生或减少神经
衰弱
我们接下来确定目前使用的抗VEGF治疗如VEGF捕获剂-眼(阿柏西普)(59、60)是否影响视网膜病变期间的视网膜衰老(60)。阿柏西普是由人VEGF受体1和2的细胞外结构域和Fc部分构成的重组融合蛋白。因此，它至少结合VEGF-A和胎盘生长因子(PLGF)(59)。在OIR的P12玻璃体内注射阿柏西普对P14(P＝0.3087)(图9A、B)或P17(P＝0.1580)(图9C、D)的SA-β-gal染色没有显著影响。有趣的是，与用二甲双胍治疗减少SASP和增加血管再生相反，阿柏西普不调节P14(P＝0.4897)(图9A、C)或P17(P＝0.9502)的血管再生率(图8B、D)，也不是衰老的驱动因子(图13B)。如所预期的，玻璃体内注射阿柏西普导致P17OIR的新血管形成显著减少(P＝0.0207)(图9G),(*P<0.001))。因此，用阿柏西普治疗不能缓解视网膜缺血或衰老，也不能增强视网膜血管修复，只能直接阻断病理性新生血管形成。总之，这些数据进一步加强了细胞衰老和缺血驱动的病理性血管发生之间的联系。
实施例8
中和捕获剂的可溶性SEMA3A的制备
产生抑制/中和SEMA3A的高亲和力捕获剂。这些捕获剂衍生自神经纤毛蛋白1(NRP1)并且任选地与6X-His标签或FC蛋白偶联(参见图18和表2)。产生包含整个NRP1细胞外结构域或能够维持SEMA3A结合的功能变体的各种变体。产生含有b1结构域(其结合VEGF)并包括中和VEGF165突变的捕获剂。显示了捕获剂在转化的人细胞中高度表达和分泌。开发了简单的纯化和制剂方案以产生用于结构-活性关系(SAR)和体内功效研究的捕获剂样品。
方法
细胞培养和材料。从Origene Inc.获得人神经纤毛蛋白1(GenBankTM登录号NM_003873,SEQ ID NO:66)。Origen克隆在氨基酸140处包含亮氨酸变成异亮氨酸的保守突变。293T(ATCC)细胞在补充有10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基中生长。pFUSE-hIgG1-Fc1载体购自InvivoGen Inc.。
克隆。使用PhusionTM高保真聚合酶(New England Biolabs)从Origene克隆RC217035PCR扩增神经纤毛蛋白-1的细胞外结构域(残基1-856)或其部分，并与人FC-1编码序列同框地克隆到pFUSE-hIgG1-Fc1的EcoR1-BglII中。通过插入编码TEV蛋白酶切割位点的序列，然后插入6X His残基和相应FC构建体的FC编码部分上游的终止密码子，以产生编码捕获剂的可溶形式的构建体。使用Q5定点诱变试剂盒(NEB)引入另外的缺失(b1、b1b2)或VEGF165结合突变(例如Y297A)。通过Sanger测序(Genome Quebec)验证所有构建体序列。
捕获剂在人体细胞中表达的评估。在293T细胞中转染编码小鼠和人类捕获剂的构建体。转染后，细胞在FreeStyle 293培养基(Invitrogen)中生长48小时。转染后48小时从293T细胞制备细胞裂解物。用PBS充分洗涤细胞，并在冰冷的补充有标准量的蛋白酶抑制剂(AEBSF、TPCK、TLCK、抑肽酶、亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制剂和E64，Sigma)的裂解缓冲液(50mMHEPES pH7.5、150mM NaCL、1.5mM MgCl2、1％Triton X-100和10％甘油)中裂解。通过微量离心(12000g，20分钟)澄清细胞裂解物。通过标准微量BCA(Sigma)测定裂解物浓度。将等量的蛋白质加载到5-20％的PAGE-SDS梯度凝胶上并转移至PVDF(Amersham)。对于FC或6xHis标签，将来自转染细胞的经澄清的条件培养基与蛋白A琼脂糖凝胶(Pharmacia)或Talon树脂(Clontech)一起温育。树脂用PBS洗涤，并在2X PAGE-SDS样品缓冲液中稀释，然后进行凝胶分离和转移。免疫印迹中使用的抗体是抗人神经纤毛蛋白-1(Cell signaling)、小鼠单克隆抗6X-HIS(In Vitrogen)和报告基因HRP连接的抗人、小鼠和兔IgG(BioRAD)。所有抗体均以1/2000稀释度使用。在用ECL(Amersham)温育膜后，使用Fuji成像系统捕获化学发光信号。
捕获剂表达和纯化。通过聚乙胺(PEI)或磷酸钙沉淀标准转染方法用编码各种捕获物的质粒转染293-T细胞。第二天，用无血清培养基洗涤细胞两次，并用无血清完全培养基(Free style 293培养基，InVitrogen)培养。条件培养基在无血清培养基中生长60-72小时后收集，并通过摇摆桶离心(2000RPM，20分钟)与细胞碎片澄清。通过蛋白A或G琼脂糖(Pharmacia)，然后用PBS充分洗涤并用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱，从转染的293T细胞的条件培养基中纯化FC捕获剂。通过加入1/10体积1M Tris pH 8和1/10体积的10X PBS pH 7.4立即中和洗脱级分。通过Talon琼脂糖(Clontech)，然后用PBS和逐步咪唑洗脱(通常为10-150μM)进行充分洗涤，从转染的293T细胞的条件培养基中纯化可溶性加6X HIS标签的捕获剂。在5-15％或5-20％梯度的PAGE-SDS凝胶上分析捕获剂的纯化级分样品。使用Safely Blue染色试剂盒(InVitrogen)染色凝胶。
用于体内注射的纯化捕获剂的无菌制剂。合并来自40ml条件培养基的纯化洗脱级分，并在PBS中稀释至总体积为10ml。通过0.2μM低蛋白结合滤器(Progene)过滤将稀释的捕获剂蛋白灭菌。浓缩蛋白质溶液并在无菌PES浓缩装置(Pierce，标称MWCO 30KD)上用PBS交换缓冲液。分析无菌浓缩的捕获样品(～30-50μl)并如上所述在PAGE-SDS上染色。
实施例9
针对SEMA3A的捕获剂的亲和性
AP-VEGF165的产生。将人VEGF165变体1(NM_001025366)的编码序列亚克隆到pAPtag5载体(GenHunter)中，与碱性磷酸酶结构域(AP-VEGF165)符合读框。使用聚乙烯亚胺(PEI)转染方法用AP-VEGF165构建体转染HEK293T细胞。在过夜转染步骤后，将细胞在无血清培养基(In vitrogen)中再培养60小时。收集细胞培养基并在PES装置(Pierce)上浓缩。在PAGE-SDS上分析浓缩的AP-VEGF165配体，并使用SimplyBlue安全染色(Lifetechnologies)定量。
Sema 3A和AP-VEGF165结合测定。如下获得用于测定与SEMA 3A或VEGF165结合的KD的饱和度曲线。将高蛋白结合96孔板(Maxisorp，Nunc)的孔用在PBS中稀释的纯化的捕获剂包被，然后用结合缓冲液(含有2％酪蛋白和0.05％Tween 20的PBS)封闭。将SEMA3A-FC(R&Dsystems)或AP-VEGF165配体在结合缓冲液中在很宽的浓度范围内稀释并加入孔中。温育过夜后，用含有0.05％吐温的PBS洗涤孔。使用HRP连接的抗人IgG(Biorad)和ECL底物(Pierce)检测结合的SEMA3a-FC。或者，使用CPD星形底物(Roche)检测结合的AP-VEGF165。在TECAN读数器上获得化学发光信号。使用Graph Pad prism软件通过非线性曲线拟合确定解离常数(KD)。
已经评估了本发明的捕获剂对SEMA3A和VEGF的相对亲和力。如实施例8中所述制备捕获剂。图18中还提供了测试的捕获剂(没有HIS或FC标签)的示意图。
表6：SEMA3A和VEGF对于各种捕获剂的解离常数
所测试的可溶性NRP1捕获剂通常比VEGF更有效地结合SEMA3A。发现对SEMA3A的这种偏好是令人惊讶的，因为认为SEMA3A和VEGF通常具有与NRP1相同的一般亲和力。申请人还惊奇地发现，在NRP1中第297位(Y297A)引入突变不仅抑制与VEGF的结合，还抑制与NRP1的结合。此前这种突变与SEMA3A的亲和力增加相关，在SEMA3A抑制优于VEGF抑制的条件下可能是有利的。由于使用VEGF抑制剂如贝伐单抗抑制VEGF在体外和体内诱导结肠直肠癌细胞中的细胞衰老(Hasan等人,2011Int.J.Cancer 1；129(9):2115-2123)，在衰老相关疾病和病症的背景下，优选使用对VEGF具有降低的亲和力的NRP1捕获剂。此外，预期优选与VEGF相比与Sema3a相互作用的NRP1捕获剂显示出与抑制VEGF细胞信号传导相关的副作用减少。
实施例10
NRP1捕获剂减弱细胞衰老
经受OIR的小鼠玻璃体内在P12注射NRP1捕获剂G或M或载体，并监测视网膜的细胞衰老。如图20所示，P17OIR铺片视网膜的SA-β-gal染色的定量揭示了当小鼠接受单次注射Trap M或Trap G时细胞衰老的显著减弱，其中Trap M在抑制细胞衰老方面更有效。有趣的是，Trap M的SEMA3A kd比VEGF高约20倍，而SEMA3A对Trap G的偏好则不那么重要(见表6)。
实施例11
实验程序
动物。所有研究均根据视力和眼科研究协会(ARVO)在眼科和视力研究中使用动物的声明进行，并经蒙特利尔大学动物护理委员会批准，与加拿大动物保护委员会制定的指南一致。C57B1/6野生型(WT)购自The Jackson Laboratory。LyzM-Cre(Lyz2tm1(cre)Iflo/J；编号004781)购自The Jackson Laboratory。(C57Bl/6WT、LysM-Cre和LysM-Cre/ROSA26EYFPfl/f,我们用表达EYFP的骨髓谱系细胞产生小鼠(71)。
O2诱导的视网膜病变。来自不同品系的小鼠幼崽(C57Bl/6WT、LyzM-Cre、LysM-Cre/IRE1fl/fl、LysM-Cre/IRE1+/+、IRE1fl/fl和LysM-Cre/ROSA26EYFPfl/fl)及其养育母亲(CD1,Charles River)从出生后第7天(P7)到第12天暴露于75％O2并返回室内空气。该模型可作为人类眼部新生血管疾病例如ROP和糖尿病视网膜病变的代用品，其特征在于破坏性病理性血管生成的晚期(72、73)。回到室内空气后，缺氧驱动的新血管形成(NV)从P14开始发展(27)。我们在不同的时间点摘除眼睛并解剖视网膜以进行mRNA、蛋白质测定或铺片。
RNA-Seq样品制备和测序。使用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)从视网膜中分离总RNA。然后使用mRNA DIRECTTMMicro Kit(Thermo Fisher SCIENTIFIC)从1μg总RNA纯化mRNA。使用Ion Total RNA-seq Kit v2制备全转录组文库。使用DNA 1000试剂盒，使用Agilent Bioanalyzer评估扩增文库的产量和大小分布。在Ion ChefTM仪器(IonTorrentTM,Thermo Fisher SCIENTIFIC)上进行测序。
cDNA文库构建与测序。使用Torrent Suite软件v4.4(Thermo Fisher)和全部转录组分析插件v 4.2-r7(Thermo Fisher)进行分析。全部转录组分析插件使用Tophat2将读数与小鼠参考基因组(mm10)比对，然后使用Bowtie2比对未映射的读数并合并在一起。使用Cufflinks计算FPKM。
基因集富集分析(GSEA)。使用由Broad Institute of MIT和Harvard University提供的GSEA v2.2.1软件进行基因集富集分析。我们使用GSEA来验证感兴趣的表型中的分子特征之间的相关性。使用ToPhat/Cuffdiff命令管道生成的每百万转录本log2标准化碎片每千克碱基(FPKM)数据进行富集分析：将FPKM值转换为比率(FPKM x/[FPKM常氧]平均值)，然后log2归一化(log2[比率])和中值居中(log2比率-[log2比率常氧]平均值)。
默认参数更改如下：在Molecular signature数据库(MSigDB)的功能性注释基因集目录中发现了感兴趣的基因组；表型排列1000次；表型标签被定义为‘OIR’与‘常氧’；从分析中排除小于15且大于500的基因组；用于评分命中的统计量被定义为“加权p2”，并且使用的类别分离度量是“t检验”。
半定量和实时PCR分析。我们使用GenEluteTM哺乳动物总RNA小量制备试剂盒(Sigma)分离RNA，并用DNA酶I进行消化以防止基因组DNA的扩增。我们使用M-MLV逆转录酶逆转录RNA，并使用SybrGreenTM在ABI Biosystems Real-Time PCR机中分析基因表达。β-肌动蛋白用作参考基因。引物序列如表7所示。我们通过将XBP-1半定量PCR产物与0.4U/μL的PstI酶在37℃温育5小时，然后在2.5％琼脂糖凝胶上分离来研究XBP-1的剪接。
流式细胞术分析。根据制造商的说明并如先前报道的那样进行人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)细胞周期分析(PI biolegend)(43)。简言之，将HRMEC(1×106)接种在6孔板中，并用100和500ng/ml的SEMA3A温育7天。通过流式细胞术分析样品。在LSRII(BDBiosciences)装置上进行FACS，并使用FlowJo软件(版本7.6.5)分析数据。
电池-基底阻抗感测(ECIS)增殖测定。通过将5000个HRMEC/ml铺板接种到8W10E+标准8孔阵列(Applied BioPhysics，NY)上进行跨内皮电阻的实时分析。使细胞生长，导致电容小于10nF。用内皮基础培养基(EBM-2，Lonza)将细胞饥饿5小时，然后用100ng/mlSEMA3A或载体(EBM-2)处理120小时，并使用ECISZθ阻抗仪器(Applied BioPhysics，NY)测量阻抗。在处理后120小时进行测量。
人类样品。我们获得Maisonneuve-Rosemont医院(HMR)伦理委员会(Ref.CER：10059)的人体临床方案和知情同意书的批准，并招募患者进行局部核心玻璃体活检取样，患者患有增殖性视网膜病变。整个手术是在Maisonneuve-Rosemont医院眼科门诊的小手术室进行的门诊手术。所有仪器都以无菌方式打开和处理。该研究符合赫尔辛基宣言的原则。
玻璃体切除术。所有先前被诊断患有PDR的患者被跟踪并由单个玻璃体视网膜外科医生(FAR)操作。对照组患者正在接受同一外科医生对非血管病变(ERM或MH)的手术治疗。在手术室环境中，患者在局部复视/球周麻醉下接受手术。使用5％聚维酮碘溶液清洁眼周皮肤并局部滴注到眼内，并在盲管(cul-de-sac)内放置5分钟。通过25号带阀门的套管(Alcon)进行三端口25规格跨结节睫状体平坦部玻璃体切除术。在使用广角观察系统(Resight，Zeiss)的显微镜可视化下，用25号玻璃体切除器收集未稀释的玻璃体。在玻璃体活组织检查后，打开输注线并以常规方式进行玻璃体切除术和膜剥离以治疗糖尿病性玻璃体出血和牵拉性视网膜脱离。然后进行全视网膜内切光凝固、流体-空气交换和玻璃体内抗VEGF注射。
通过多重化来定量细胞因子。将玻璃体样品在干冰上冷冻，并在活组织检查后立即储存在-80°。在分析之前，将玻璃体样品在4℃以15000×g离心5分钟。Pai1、VEGF、IL-6、IL-8。根据制造商的方案使用多重组(来自Bio-rad的Cancer Panel 1)。使用Bio-Plex 200阵列读数器(Bio-rad)分析Luminex测定。通过将从患者样品获得的原始数据与标准曲线进行比较，实现各个分析物的定量测定。由于检测限，必须排除总共4种细胞因子(Croa、Grob和IL-1β)。
免疫荧光(IF)。为了定位蛋白质表达，将眼睛从小鼠中摘出并在室温下在4％多聚甲醛中固定4小时，并在30％蔗糖中温育过夜，然后在OCT化合物中冷冻。然后我们将整个眼睛嵌入-20℃的最佳切割温度化合物中并进行12μm切片。我们用落射荧光显微镜(ZeissAxioImager)或共聚焦显微镜(Olympus confocal FV1000)进行IF实验和可视化切片。
为了观察泛视网膜脉管系统，将解剖的视网膜铺片并与罗丹明标记的Griffonia(Bandeiraea)Simplicifolia Lectin I(Vector Laboratories,Inc.)在用于视网膜脉管系统的PBS中的1mM CaCl2中温育过夜。使用ImageJ和SWIFT-NV方法进行在P17无血管区域或新血管形成区域的程度(74)。
对于蛋白质定位，将铺片的视网膜与所示的不同抗体一起温育。对于体外IF，将培养的细胞铺板在0.1％明胶包被的盖玻片上并血清饥饿过夜，并用SEMA3A(100ng/ml)刺激7天。用冷PBS短暂洗涤细胞，并在含有3.5％多聚甲醛的PBS中固定20分钟。用PBS冲洗细胞并用PBS中的0.3％Triton透化5分钟。用1％BSA封闭固定的细胞，然后用在PBS中的0.1％BSA中的一抗温育1小时。使用Alexa Fluor二抗温育1小时后观察结合的一抗。安装盖玻片，使用Fluoromount(Sigma-Aldrich)并通过共聚焦显微镜(Olympus confocal FV1000)进行分析。用x63/1.4NA油或30倍物镜观察样品。使用Photoshop CS4(Adobe Systems)组装图像。对于用于免疫组织化学的所有抗体，参见表8。
衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)测定。如前所述进行衰老相关β-半乳糖苷酶测定(57、55)
体内定量SA-β-gal。使用如图14中所述的Image J软件分析铺片视网膜或矢状眼切片中的衰老相关β-半乳糖苷酶染色。
慢病毒生产。通过转染HEK293T细胞HEK293T细胞(Invitrogen)制备慢病毒载体(HIV-1)，如我们和其它人(35、44、76)所述，其中含有Cre、绿色荧光蛋白GFP或小发夹RNA的载体质粒(Sh_RNA)与第三代包装质粒pV-SVG、pMDL和pREV(Open Biosystems)一起针对SEMA3A、IRE1α或GFP(参见下表9)。接种大约107个细胞，并在DMEM完全培养基(Invitrogen)中用上述质粒转染，并温育30小时。随后，用新鲜的完全DMEM培养基替换上清液并再温育30小时。收集分泌的病毒并在50000g下超速离心，重悬于PBS中，等分，并储存在-80℃。
玻璃体内注射。P2、P10或P12C57BL/6幼崽用3.0％异氟醚麻醉，并使用配有50号玻璃毛细管尖端的10-μL的Hamilton注射器在玻璃体腔内注射0.5μL慢病毒(参见“慢病毒生产”)、重组SEMA3A(100ng/μL)、二甲双胍(10μg/μL)或阿司匹林(10μg/μL)。注射大约254±11.0ng/μL的慢病毒Sh_GFP和323.3±15.3ng/μL含有Sh_Sema3a、Lv.Cre(15.0ng/mL)、Lv.GFP(15.0ng/mL)。用p24ELISA试剂盒(ZeptoMetrix)评估病毒滴度。使用的慢病毒滴度为(ng p24)LV.Sh_RNAIRE1α(8.52ng/mL)和LV.Sh_RNA.GFP(8.47ng/mL)。
条件培养基(CM)的制备。将人视网膜微血管内皮细胞(HRMEC)、视网膜神经元661W感光细胞和小鼠巨噬细胞(J774A.1细胞系)如在每个实验中指出的在转染后48小时与重组SEMA3A(100ng/μL)、H2O2(150μM，2小时)或没有温育7天。将上清液离心并过滤，然后冷冻用于后续使用。对于CM上的蛋白质印迹，使用来自Millipore的超离心超过滤器单元进行浓缩。
蛋白质印迹。我们在不同的时间点摘除眼睛并快速解剖和均质化视网膜以评估视网膜蛋白水平。通过BCA测定(Sigma)评估来自视网膜匀浆和细胞裂解物的蛋白质浓度，然后通过标准SDS-PAGE技术分析每种条件的30μg蛋白质。用于蛋白质印迹的抗体列于上表8中。
统计分析。在适当的情况下，我们使用了学生T检验和ANOVA。使用Prism，版本5软件(GraphPad)，分别认为P<0.005和P<0.05在统计学上是不同的。
使用的重组蛋白质。重组人Semaphorin 3A(来自鼠骨髓瘤细胞系，NS0)(R&DSystems)浓度在体外以100和500ng/ml使用并且体内为100ng/ml。
材料。二甲双胍、测定(RIPA)缓冲液、蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂购自Sigma Chemicals。阿柏西普(EyleaTM)购自Bayer。4μ8c抑制剂来自Torcis(Biosciences)。
质粒以及稳定细胞系和转染的产生。我们按照制造商的说明，使用LipofectamineTM 2000在37℃稳定转染661W细胞和HRMEC(Open Biosystems)细胞16小时，其中500ng Sh_RNA质粒分别靶向Sema3a、IRE1α和不相关的sh_RNA(sh_GFP)。我们通过在2周内选择2mg嘌呤霉素来产生稳定的细胞系。使用LipofectamineTM 2000，用于GFP、IRE1αWT、IRE1α的显性失活突变体(J774细胞中的RNA酶死亡突变体K907A)的表达质粒。IRE1α的质粒获自Addgene(Fumihiko Urano：质粒#20744和#20745)。
实施例12
实施例13-15的实验程序
小鼠。所有研究均按照加拿大动物保护协会的指导原则进行，并经蒙特利尔大学动物保护委员会批准。C57Bl/6野生型小鼠、LysM-Cre小鼠(B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J；编号004781)和神经纤毛蛋白-1插在lox p位点间(floxed)的小鼠(B6.129(SJL)-NRP1tm2Ddg/J；编号005247)购自The Jackson Laboratory并在内部饲养。饲料：HFD:60％脂肪热量,BioServ F3282；对照饲料：2018年Teklad Global 18％蛋白质啮齿动物饲料。
脂肪组织巨噬细胞的荧光激活细胞分选(FACS)收集腹膜脂肪垫，称重并在DMEMF12培养基中匀浆，然后与1mg/mL胶原酶D(Sigma)在37℃温育45分钟。然后以10mM的浓度加入EDTA并将混合物再温育5分钟。然后用70-μm细胞过滤器过滤匀浆物并离心。将沉淀重新悬浮并在裂解缓冲液(10mM KCHO3；150mM；NH4Cl；0.1mM EDTA)中在室温温育5分钟并离心。将沉淀重悬于1X PBS中并用100-μm细胞过滤器过滤。将细胞悬浮液与Zombie AquaFixable Viability Kit(BioLegend)在室温温育15分钟。然后将细胞与LEAF纯化的抗小鼠CD16/32(Biolegend)在室温温育15分钟以阻断Fc受体。然后将细胞在4℃与以下抗体一起温育25分钟：Brilliant Violet 785抗小鼠CD45.2(BioLegend)、Brilliant Violet 711抗小鼠/人CD11b(BioLegend)、APC/CY7抗小鼠Ly-6G(BioLegend)、Pe/Cy7抗小鼠F4/80(BioLegend)、PE抗小鼠CD11c(BioLegend)、FITC抗小鼠Ly-6C(BioLegend)和APC抗小鼠CD304(神经纤毛蛋白-1)或APC Rat IgG2a、κ同种型对照(BioLegend)。为了分析CD206表达，使用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Bioscience)在4℃进行细胞的透化和固定20分钟。然后将细胞与大鼠血清(Cedarlane)在4℃温育25分钟以阻断细胞内受体。最后用Brilliant Violet 421抗小鼠CD206(MMR)(BioLegend)在4℃染色细胞25分钟。在Fortessa(BD Biosciences)装置上进行FACS，并使用FlowJo软件(版本7.6.5)分析数据。
体内BODIPY摄取。对用HFD饲喂10周的LysM-Cre-NRP1+/+和LysM-Cre-NRP1fl/fl雄性小鼠进行体内BODIPY摄取测定。将小鼠饥饿4小时，然后在1％BSA中腹膜内注射100μL的在1％BSA中的30μM BODIPYTM 500/510C1,C12。在BODIPYTM注射后3小时对小鼠实施安乐死。通过心脏穿刺收集血液，随后通过离心分离血浆。收集心脏、肝脏和白色脂肪组织的样品，并在1X RIPA缓冲液(Cell Signaling)中匀浆。用Infinite M1000Pro读数器(Tecan)在488nm的波长发射和525nm激发下读取匀浆和血浆的BODIPYTM荧光，并针对蛋白质浓度(用来自Sigma的QuantiProTM BCA测定试剂盒定量)归一化。
原代巨噬细胞培养8-12周龄LysM-Cre-NRP1+/+和LysM-Cre-NRP1fl/fl小鼠用在2L/min氧气中的2％异氟烷麻醉，然后通过颈脱位实施安乐死。然后，在小鼠腹部皮肤切开小切口。将皮肤拉至每种尺寸的小鼠，并用5ml PBS加3％FBS洗涤腹膜腔2分钟。然后，将收获的细胞以1000rpm离心5分钟，重悬于培养基(DMEM F12加10％FBS和1％链霉素/青霉素)中并铺板。在37℃，5％CO2气氛下培养1小时后，更换培养基，在用于BODIPY摄取、pHrodo吞噬作用测定或油红O染色之前，在相同条件下培养细胞接下来的24小时。
定量RT-PCR(qPCR)分析。按照Trizol试剂方案(Invitrogen)，用100-500mg冷冻(-80℃)RP-WAT进行RNA提取。根据制造商的说明书(iScript cDNA合成试剂盒,Bio-Rad)逆转录总RNA(1μg)。使用SYBR Green(Bio-Rad)和每次反应40ng cDNA(7500Real-Time PCRSystem,Applied Biosystem)进行qPCR。将表达水平针对β-肌动蛋白的表达进行归一化。引物(Integrated DNA Technologies)序列如下：
表10：用于qRT-PCR的引物序列
ImmGen分类属性数据集。提取免疫基因组计划数据阶段1(GEO登录号GSE15907)和阶段2(GSE37448)并通过鲁棒多阵列平均值(RMA)在R中归一化，绘制反对数值。
免疫组化(IHC)。将RPWAT组织在4％PFA中固定48小时，然后在20％甲醇中温育10分钟并在PBS中漂洗。在3％BSA(Hyclone，GE)+0.3％TritonTM X-100(Sigma)中封闭1小时，然后与罗丹明标记的Griffonia(Bandeiraea)Simplicifolia Lectin I(VectorLaboratories Inc.)、抗大鼠F4/80(驴IgG；eBioscience)、抗兔Perilipin(Donkey IgG；Abcam)、抗大鼠神经纤毛蛋白-1抗体(驴IgG；R&D Systems)在4℃温育过夜。将Alexa-Fluor二抗在20℃温育两小时。然后将RPWAT安装在显微镜载玻片上，并通过共聚焦显微镜拍摄图像。
巨噬细胞BODIPY摄取。提取自LysMCRE-NRP1+/+和LysMCRE-NRP1fl/fl的巨噬细胞以1x105个细胞/孔接种于48孔板中。以0.5μg/mL和1μg/mL的浓度添加BODIPY 500/510 C1、C12(Life technologies)，在室温温育5分钟，然后置于冰上。用冷PBS洗涤孔，然后用1％多聚甲醛(Electron Microscopy Science)固定。用Infinite M1000Pro读数器(Tecan)在波长发射488nm和525nm激发下读取荧光。然后用浓度为1/20 000的DAPI(LifeTechnologies)染色细胞，并在358nm激发、461nm发射下测量荧光。
pHrodo吞噬作用测定。提取自LysMCRE-NRP1+/+和LysMCRE-NRP1fl/fl的巨噬细胞以1x105个细胞/孔接种于96孔板。Green Zymosan Bioparticles(Life Technologies)以0.5mg/mL的浓度重悬于FluoroBriteTMDMEM Media+10％FBS+1％PenStrep。将100μL生物颗粒重悬浮液加入细胞中，并将空孔作为阴性对照。将细胞在37℃温育90分钟，并在TECAN板读数器上在509nm激发和533nm发射下检测pH/吞噬作用依赖性荧光。通过从实验样品中减去阴性对照荧光来计算净吞噬作用。
油红O染色与定量。将培养的脂肪细胞和腹膜巨噬细胞在PBS中洗涤并在10％PFA中固定30分钟并冲洗。然后将细胞与两次过滤的0.3％油红O溶液一起温育60分钟并冲洗。在光学显微镜下拍摄照片，脂肪细胞放大10倍，巨噬细胞放大63倍。使用ImageJ的阈值限制法进行脂滴定量。
存在腺病毒Trap M方案时体重增加。将6-8周龄的C57B16/J小鼠分成6组(常规饲料+盐水、常规饲料+腺病毒Trap M、常规饲料+腺病毒GFP、高脂肪饲料+盐水、高脂肪饲料+腺病毒Trap M、高脂肪饲料+腺病毒GFP)。用盐水，腺病毒Trap M或腺病毒GFP(0.25×1010PFU/注射)静脉内注射(尾静脉)小鼠。这些小鼠中有一半喂食高脂肪饲料，另一半喂食常规饲料，每周称重一次。
注射后2周和8周，从尾巴取出一滴血。通过使用抗His抗体的免疫沉淀在血液中评估Trap M的存在(参见图26、28和29)。
葡萄糖耐量试验(GTT)。在6-8周龄的C57Bl6/J小鼠静脉内注射盐水或Adeno-TrapM(0.25×1010PFU/注射)。注射后立即给小鼠喂食高脂肪饲料。在腹膜内注射2g D-葡萄糖/kg后，在基线、15、30、60、120和240分钟处评估血糖。记录的测量结果如图25所示(N＝5，N.S表示在双向Anova Bonferroni事后检验中不显著)。
胰岛素耐量试验(ITT)。将小鼠(在早晨)饥饿5.5小时。在腹膜内注射0.75U/kg胰岛素后，在基线、30、60和120分钟处测量血糖。
体内BODIPYTM摄取。对用HFD饲喂10周的LysM-Cre-NRP1+/+和LysM-Cre-NRP1fl/fl雄性小鼠进行体内BODIPYTM摄取测定。将小鼠饥饿4小时，然后腹膜内注射100μL在1％BSA(Hyclone,GE)中的30μM BODIPY500/510 C1,C12(Life technologies)。在BODIPY注射后3小时对小鼠实施安乐死。通过心脏穿刺收集血液，随后通过离心分离血浆。收集心脏、肝脏和白色脂肪组织的样品，并在1X RIPA缓冲液(Cell Signaling)中匀浆。用InfiniteM1000Pro读数器(TECAN)在488nm的波长发射和525nm激发下读取匀浆和血浆的BODIPY荧光，并针对蛋白质浓度(用来自Sigma的QuantiProTM BCA测定试剂盒定量)归一化。
油红O染色与定量。将培养的脂肪细胞和腹膜巨噬细胞在PBS中洗涤并在10％PFA中固定30分钟并冲洗。然后将细胞与两次过滤的0.3％油红O(Sigma)溶液一起温育60分钟并冲洗。在光学显微镜下拍摄照片，脂肪细胞放大10倍，巨噬细胞放大63倍。使用ImageJ的阈值限制法进行脂滴定量。
腺病毒生产。通过使用Q5定点诱变试剂盒(New England Biolabs)引入VEGF 165结合突变体残基D320K，从Trap M和O(先前描述的WO2016/033699)衍生Trap AD和AE。通过首先将Trap M、G、A和D的编码序列亚克隆到pENTR1A(Life technologies)的EcoRI-EcoRV位点，然后在目的载体pAd/CMV/V5-DEST(Life technologies)中进行LR克隆酶同源重组，以产生腺病毒捕获构建体。目前的一组构建体称为pAdeno-Trap A、C、G或M和pAdeno-GFP。通过Sanger测序(Genome Quebec)验证所有构建体插入序列。在捕获编码序列重组到pAD/CMV/V5-dest后也测序产生的所有连接区。
统计分析。数据以平均值±SEM表示。在适当的情况下，使用双尾学生t检验和ANOVA来比较不同的组。P<0.05被认为在统计学上有所不同。
实施例13
饲料诱导的肥胖过程中脂肪组织中NRP1表达的巨噬细胞积累
在饲料诱导的肥胖症(DIO)中，坏死的脂肪细胞释放脂肪酸(FA)被周围的巨噬细胞部分吸收，形成冠状结构。鉴于巨噬细胞在脂质代谢和肥胖中的重要性，使用来自免疫联合会ImmGen(Heng and Painter，2008)的数据分析骨髓细胞中NRP1的表达谱。与其它稳态组织驻留的巨噬细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞相比，NRP1在脂肪组织巨噬细胞(ATM)中的表达最强(图21A)。该数据指出NRP1+巨噬细胞在脂肪组织稳态中的潜在作用。
因此，从生命的8周开始，将C57BL/6小鼠置于高脂肪饲料(HFD；60％脂肪卡路里)中10周，并通过荧光激活细胞分选(FACS)研究ATM群体。根据其它研究，与常规饲料中年龄匹配的对照(RD；18％脂肪卡路里)相比，在HFD喂养的小鼠的脂肪组织中检测到ATM的存在增加(图21B)。这与NRP1+ATM的成比例增加相平行(图21C)。来自10周HFD喂养的小鼠和年龄匹配的RD小鼠的腹膜后白色脂肪组织(RPWAT)的免疫组织化学(IHC)证实了NRP1在巨噬细胞和血管上的强烈表达(数据未显示)。在HFD 22周后，NRP1定位于冠状结构，其对应于死亡和死亡脂肪细胞周围的吞噬巨噬细胞簇(数据未显示)。在所研究的NRP1配体中，仅转化生长因子β1(Tgfb1)在HFD喂养的小鼠的腹膜后白色脂肪组织(RPWAT)中显著上升(图21G)，而轴突导向因子-3A(Sema3a)、血管内皮生长因子-A(Vegfa)或-B(Vegfb)未受影响(图21D-F)。总之，这些数据表明NRP1在ATM中的稳健表达，并表明在HFD诱导的体重增加期间脂肪组织中NRP1+巨噬细胞的增加。
实施例14
NRP1通过巨噬细胞促进脂肪酸吸收和吞噬作用
在肥胖症中，长链脂肪酸(FA)摄取在脂肪细胞中上调(Berk等人,1999；Petrescu等人,2005)。为了阐明NRP1+巨噬细胞在脂肪组织稳态和体重增加中的作用，用骨髓细胞系细胞中特异性消除的NRP1产生LysM-CRE-NRP1fl/fl小鼠系(Dejda等人,2014)。因此，在LysM-Cre-NRP1fl/fl和对照LysM-Cre-NRP1+/+巨噬细胞中测量长链FA类似物(C1-BODIPY-C12，18碳FA)的摄取。在急性暴露期间，NRP1缺陷的巨噬细胞比对照巨噬细胞显著减少了FA(图22A)。此外，与血浆和心脏(图22D、E)相比，C1-C12BODIPY的全身施用显示RPWAT和LysM-Cre-NRP1fl/fl小鼠肝脏中标记的FA水平显著升高(图22B、C)，这巩固了NRP1+巨噬细胞在脂质摄取中的作用。
为了确定NRP1是否影响巨噬细胞中的脂质螯合，将巨噬细胞内的中性脂质用油红O染色。在脂肪细胞条件培养基中培养的LysM-Cre-NRP1fl/fl巨噬细胞中油红O染色显著降低(图22F-G)。因为脂肪细胞和巨噬细胞培养基的葡萄糖和胰岛素浓度不同，我们评估了NRP1缺陷型巨噬细胞中内化脂质的减少是否也在非条件培养基中发生，包括有和没有胰岛素的脂肪细胞培养基，以及巨噬细胞培养基。在所有条件下，NRP1-巨噬细胞螯合的中性脂质明显少于对照(图22H-K)。
随着肥胖小鼠和人类脂肪细胞死亡的增加，它将巨噬细胞诱导到坏死部位，以吞噬细胞碎片并螯合释放的脂质(Cinti等人,2005)。观察到NRP1缺陷型巨噬细胞的脂质摄取减少，我们质疑它们的吞噬能力是否也受到损害。用LysM-Cre-NRP1fl/fl中的pHrodo绿酵母聚糖生物颗粒缀合物和对照巨噬细胞测量吞噬作用，发现缺乏NRP1的巨噬细胞具有降低的吞噬能力(图23)。
总之，上述结果表明NRP1缺陷型巨噬细胞具有受损的FA摄取和吞噬能力。
实施例15
NRP1捕获剂减少与高脂肪饲料相关的体重增加
评估NRP1捕获剂对体重增加的影响。对雄性小鼠施用表达可溶性NRP1捕获剂的腺病毒(其包含NRP1的结构域a1、a2和b1(Trap M，参见表2))；Adeno GFP；或盐水(对照)，同时将小鼠从常规饲料转换为高脂肪饲料(HFD，T0)。在10周的时间内监测体重增加。数据以平均值±SEM表示。学生非配对t检验，*p<0.05，**p<0.01，盐水对Adeno Trap M，双向Anova，Bonferroni事后检验，其中N＝5；
如图24所示，NRP1的施用阻止了小鼠体重增加。在第7周和第8周观察到的体重增加的增加与表达NRP1-捕获剂的循环腺病毒的减少一致。令人惊讶的是，在雄性小鼠中预防体重增加比在雌性小鼠中更重要(数据未显示)。.
还评估了NRP1捕获剂对葡萄糖耐量的影响。将六至高(6-8)周龄的C57Bl6/J小鼠静脉内注射盐水、Adeno GFP或Adeno Trap M，并在注射后立即喂食高脂肪饲料。在腹膜内注射2g葡萄糖/kg小鼠后的不同时间点评估血糖。如图25B所示，用Adeno Trap M处理的小鼠比用盐水或Adeno GFP处理的小鼠对葡萄糖的耐受性更强。
表11：本文中公开的序列的SEQ ID NO
权利要求书的范围不应受实施例中所述的优选实施方式的限制，而应给出与整个说明书一致的最广泛解释。
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<213> 智人
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<213> 智人
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<400> 47
Met Glu Arg Gly Leu Pro Leu Leu Cys Ala Xaa Leu Ala Leu Xaa Leu
1 5 10 15
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100 105 110
Val Ser Ser Gly Pro Phe Leu Phe Ile Lys Phe Val Ser Asp Tyr Glu
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Thr His Gly Ala Gly Phe Ser Ile Arg Tyr Glu Xaa Phe Lys Arg Gly
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Gly Arg Tyr Cys Gly Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser
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Gly Xaa Leu Ser Met Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu
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Gly Phe Ser Ala Asn Tyr Ser Val Leu Gln Ser Ser Xaa Ser Glu Asp
260 265 270
Phe Lys Cys Met Glu Ala Leu Gly Met Glu Ser Gly Glu Ile His Ser
275 280 285
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370 375 380
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Gly Xaa Ile Ile Gln Gly Gly Lys His Arg Glu Asn Lys Val Phe Met
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<210> 48
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 48
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Ala Leu Ala Gly Ala Phe Arg Ser Asp Lys Cys Gly Gly Thr Ile Lys
20 25 30
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785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
Ser Ala Leu Gly Val Leu Leu Gly Ala Val Cys Gly Val Val Leu Tyr
865 870 875 880
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885 890 895
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900 905 910
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<210> 49
<211> 922
<212> PRT
<213> 褐家鼠
<400> 49
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1 5 10 15
Ala Leu Ala Gly Ala Phe Arg Ser Asp Lys Cys Gly Gly Thr Ile Lys
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245 250 255
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645 650 655
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820 825 830
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850 855 860
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885 890 895
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<210> 50
<211> 771
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
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1 5 10 15
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20 25 30
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85 90 95
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100 105 110
Glu Cys Ala Asn Phe Ile Lys Val Leu Lys Ala Tyr Asn Gln Thr His
115 120 125
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130 135 140
Glu Ile Gly His His Pro Glu Asp Asn Ile Phe Lys Leu Glu Asn Ser
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Asp Lys Val Tyr Phe Phe Phe Arg Glu Asn Ala Ile Asp Gly Glu His
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Gln Ile Val Val Asp Arg Val Asp Ala Glu Asp Gly Gln Tyr Asp Val
435 440 445
Met Phe Ile Gly Thr Asp Val Gly Thr Val Leu Lys Val Val Ser Ile
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
Gln Phe Gln Arg Arg Asn Glu Glu Arg Lys Glu Glu Ile Arg Val Asp
610 615 620
Asp His Ile Ile Arg Thr Asp Gln Gly Leu Leu Leu Arg Ser Leu Gln
625 630 635 640
Gln Lys Asp Ser Gly Asn Tyr Leu Cys His Ala Val Glu His Gly Phe
645 650 655
Ile Gln Thr Leu Leu Lys Val Thr Leu Glu Val Ile Asp Thr Glu His
660 665 670
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Arg Ser Val
770
<210> 51
<211> 1308
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
atggagaggg ggctgccgct cctctgcgcc gtgctcgccc tcgtcctcgc cccggccggc 60
gcttttcgca acgataaatg tggcgatact ataaaaattg aaagccccgg gtaccttaca 120
tctcctggtt atcctcattc ttatcaccca agtgaaaaat gcgaatggct gattcaggct 180
ccggacccat accagagaat tatgatcaac ttcaaccctc acttcgattt ggaggacaga 240
gactgcaagt atgactacgt ggaagtcttc gatggagaaa atgaaaatgg acattttagg 300
ggaaagttct gtggaaagat agcccctcct cctgttgtgt cttcagggcc atttcttttt 360
atcaaatttg tctctgacta cgaaacacat ggtgcaggat tttccatacg ttatgaactt 420
ttcaagagag gtcctgaatg ttcccagaac tacacaacac ctagtggagt gataaagtcc 480
cccggattcc ctgaaaaata tcccaacagc cttgaatgca cttatattgt ctttgcgcca 540
aagatgtcag agattatcct ggaatttgaa agctttgacc tggagcctga ctcaaatcct 600
ccagggggga tgttctgtcg ctacgaccgg ctagaaatct gggatggatt ccctgatgtt 660
ggccctcaca ttgggcgtta ctgtggacag aaaacaccag gtcgaatccg atcctcatcg 720
ggcattctct ccatggtttt ttacaccgac agcgcgatag caaaagaagg tttctcagca 780
aactacagtg tcttgcagag cagtgtctca gaagatttca aatgtatgga agctctgggc 840
atggaatcag gagaaattca ttctgaccag atcacagctt cttcccagta tagcaccaac 900
tggtctgcag agcgctcccg cctgaactac cctgagaatg ggtggactcc cggagagaag 960
tcctaccgag agtggataca ggtagacttg ggccttctgc gctttgtcac ggctgtcggg 1020
acacagggcg ccatttcaaa agaaaccaag aagaaatatt atgtcaagac ttacaagatc 1080
gacgttagct ccaacgggga agactggatc accataaaag aaggaaacaa acctgttctc 1140
tttcagggaa acaccaaccc tacagatgtt gtggttgcag tattccccaa accactgata 1200
actcgatttg tccgaatcaa gcctgcaact tgggaaactg gcatatctat gagatttgaa 1260
gtatatggtt gcagatctgg atccaaggaa aacttgtatt tccagggc 1308
<210> 52
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Met Glu Arg Gly Leu Pro Leu Leu Cys Ala Val Leu Ala Leu Val Leu
1 5 10 15
Ala Pro Ala Gly Ala Phe Arg Asn Asp Lys Cys Gly Asp Thr Ile Lys
20 25 30
Ile Glu Ser Pro Gly Tyr Leu Thr Ser Pro Gly Tyr Pro His Ser Tyr
35 40 45
His Pro Ser Glu Lys Cys Glu Trp Leu Ile Gln Ala Pro Asp Pro Tyr
50 55 60
Gln Arg Ile Met Ile Asn Phe Asn Pro His Phe Asp Leu Glu Asp Arg
65 70 75 80
Asp Cys Lys Tyr Asp Tyr Val Glu Val Phe Asp Gly Glu Asn Glu Asn
85 90 95
Gly His Phe Arg Gly Lys Phe Cys Gly Lys Ile Ala Pro Pro Pro Val
100 105 110
Val Ser Ser Gly Pro Phe Leu Phe Ile Lys Phe Val Ser Asp Tyr Glu
115 120 125
Thr His Gly Ala Gly Phe Ser Ile Arg Tyr Glu Leu Phe Lys Arg Gly
130 135 140
Pro Glu Cys Ser Gln Asn Tyr Thr Thr Pro Ser Gly Val Ile Lys Ser
145 150 155 160
Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile
165 170 175
Val Phe Ala Pro Lys Met Ser Glu Ile Ile Leu Glu Phe Glu Ser Phe
180 185 190
Asp Leu Glu Pro Asp Ser Asn Pro Pro Gly Gly Met Phe Cys Arg Tyr
195 200 205
Asp Arg Leu Glu Ile Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile
210 215 220
Gly Arg Tyr Cys Gly Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser
225 230 235 240
Gly Ile Leu Ser Met Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu
245 250 255
Gly Phe Ser Ala Asn Tyr Ser Val Leu Gln Ser Ser Val Ser Glu Asp
260 265 270
Phe Lys Cys Met Glu Ala Leu Gly Met Glu Ser Gly Glu Ile His Ser
275 280 285
Asp Gln Ile Thr Ala Ser Ser Gln Tyr Ser Thr Asn Trp Ser Ala Glu
290 295 300
Arg Ser Arg Leu Asn Tyr Pro Glu Asn Gly Trp Thr Pro Gly Glu Lys
305 310 315 320
Ser Tyr Arg Glu Trp Ile Gln Val Asp Leu Gly Leu Leu Arg Phe Val
325 330 335
Thr Ala Val Gly Thr Gln Gly Ala Ile Ser Lys Glu Thr Lys Lys Lys
340 345 350
Tyr Tyr Val Lys Thr Tyr Lys Ile Asp Val Ser Ser Asn Gly Glu Asp
355 360 365
Trp Ile Thr Ile Lys Glu Gly Asn Lys Pro Val Leu Phe Gln Gly Asn
370 375 380
Thr Asn Pro Thr Asp Val Val Val Ala Val Phe Pro Lys Pro Leu Ile
385 390 395 400
Thr Arg Phe Val Arg Ile Lys Pro Ala Thr Trp Glu Thr Gly Ile Ser
405 410 415
Met Arg Phe Glu Val Tyr Gly Cys Arg Ser Gly Ser Lys Glu Asn Leu
420 425 430
Tyr Phe Gln Gly
435
<210> 53
<211> 1785
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
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ccggacccat accagagaat tatgatcaac ttcaaccctc acttcgattt ggaggacaga 240
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atcaaatttg tctctgacta cgaaacacat ggtgcaggat tttccatacg ttatgaactt 420
ttcaagagag gtcctgaatg ttcccagaac tacacaacac ctagtggagt gataaagtcc 480
cccggattcc ctgaaaaata tcccaacagc cttgaatgca cttatattgt ctttgcgcca 540
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gacgttagct ccaacgggga agactggatc accataaaag aaggaaacaa acctgttctc 1140
tttcagggaa acaccaaccc tacagatgtt gtggttgcag tattccccaa accactgata 1200
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<210> 54
<211> 595
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Met Glu Arg Gly Leu Pro Leu Leu Cys Ala Val Leu Ala Leu Val Leu
1 5 10 15
Ala Pro Ala Gly Ala Phe Arg Asn Asp Lys Cys Gly Asp Thr Ile Lys
20 25 30
Ile Glu Ser Pro Gly Tyr Leu Thr Ser Pro Gly Tyr Pro His Ser Tyr
35 40 45
His Pro Ser Glu Lys Cys Glu Trp Leu Ile Gln Ala Pro Asp Pro Tyr
50 55 60
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Asp Cys Lys Tyr Asp Tyr Val Glu Val Phe Asp Gly Glu Asn Glu Asn
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Gly His Phe Arg Gly Lys Phe Cys Gly Lys Ile Ala Pro Pro Pro Val
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile
165 170 175
Val Phe Ala Pro Lys Met Ser Glu Ile Ile Leu Glu Phe Glu Ser Phe
180 185 190
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195 200 205
Asp Arg Leu Glu Ile Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile
210 215 220
Gly Arg Tyr Cys Gly Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser
225 230 235 240
Gly Ile Leu Ser Met Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu
245 250 255
Gly Phe Ser Ala Asn Tyr Ser Val Leu Gln Ser Ser Val Ser Glu Asp
260 265 270
Phe Lys Cys Met Glu Ala Leu Gly Met Glu Ser Gly Glu Ile His Ser
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Ser Tyr Arg Glu Trp Ile Gln Val Asp Leu Gly Leu Leu Arg Phe Val
325 330 335
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340 345 350
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370 375 380
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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485 490 495
Gly Ile Ile Ile Gln Gly Gly Lys His Arg Glu Asn Lys Val Phe Met
500 505 510
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515 520 525
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545 550 555 560
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Phe Gln Gly
595
<210> 55
<211> 2154
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
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gcttttcgca acgataaatg tggcgatact ataaaaattg aaagccccgg gtaccttaca 120
tctcctggtt atcctcattc ttatcaccca agtgaaaaat gcgaatggct gattcaggct 180
ccggacccat accagagaat tatgatcaac ttcaaccctc acttcgattt ggaggacaga 240
gactgcaagt atgactacgt ggaagtcttc gatggagaaa atgaaaatgg acattttagg 300
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ggccctcaca ttgggcgtta ctgtggacag aaaacaccag gtcgaatccg atcctcatcg 720
ggcattctct ccatggtttt ttacaccgac agcgcgatag caaaagaagg tttctcagca 780
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<210> 56
<211> 718
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Met Glu Arg Gly Leu Pro Leu Leu Cys Ala Val Leu Ala Leu Val Leu
1 5 10 15
Ala Pro Ala Gly Ala Phe Arg Asn Asp Lys Cys Gly Asp Thr Ile Lys
20 25 30
Ile Glu Ser Pro Gly Tyr Leu Thr Ser Pro Gly Tyr Pro His Ser Tyr
35 40 45
His Pro Ser Glu Lys Cys Glu Trp Leu Ile Gln Ala Pro Asp Pro Tyr
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Cys Lys Tyr Asp Tyr Val Glu Val Phe Asp Gly Glu Asn Glu Asn
85 90 95
Gly His Phe Arg Gly Lys Phe Cys Gly Lys Ile Ala Pro Pro Pro Val
100 105 110
Val Ser Ser Gly Pro Phe Leu Phe Ile Lys Phe Val Ser Asp Tyr Glu
115 120 125
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130 135 140
Pro Glu Cys Ser Gln Asn Tyr Thr Thr Pro Ser Gly Val Ile Lys Ser
145 150 155 160
Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile
165 170 175
Val Phe Ala Pro Lys Met Ser Glu Ile Ile Leu Glu Phe Glu Ser Phe
180 185 190
Asp Leu Glu Pro Asp Ser Asn Pro Pro Gly Gly Met Phe Cys Arg Tyr
195 200 205
Asp Arg Leu Glu Ile Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile
210 215 220
Gly Arg Tyr Cys Gly Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser
225 230 235 240
Gly Ile Leu Ser Met Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu
245 250 255
Gly Phe Ser Ala Asn Tyr Ser Val Leu Gln Ser Ser Val Ser Glu Asp
260 265 270
Phe Lys Lys Ile Thr Asp Tyr Pro Cys Ser Gly Met Leu Gly Met Val
275 280 285
Ser Gly Leu Ile Ser Asp Ser Gln Ile Thr Ser Ser Asn Gln Gly Asp
290 295 300
Arg Asn Trp Met Pro Glu Asn Ile Arg Leu Val Thr Ser Arg Ser Gly
305 310 315 320
Trp Ala Leu Pro Pro Ala Pro His Ser Tyr Ile Asn Glu Trp Leu Gln
325 330 335
Ile Asp Leu Gly Glu Glu Lys Ile Val Arg Gly Ile Ile Ile Gln Gly
340 345 350
Gly Lys His Arg Glu Asn Lys Val Phe Met Arg Lys Phe Lys Ile Gly
355 360 365
Tyr Ser Asn Asn Gly Ser Asp Trp Lys Met Ile Met Asp Asp Ser Lys
370 375 380
Arg Lys Ala Lys Ser Phe Glu Gly Asn Asn Asn Tyr Asp Thr Pro Glu
385 390 395 400
Leu Arg Thr Phe Pro Ala Leu Ser Thr Arg Phe Ile Arg Ile Tyr Pro
405 410 415
Glu Arg Ala Thr His Gly Gly Leu Gly Leu Arg Met Glu Leu Leu Gly
420 425 430
Cys Glu Val Glu Ala Pro Thr Ala Gly Pro Thr Thr Pro Asn Gly Asn
435 440 445
Leu Val Asp Glu Cys Asp Asp Asp Gln Ala Asn Cys His Ser Gly Thr
450 455 460
Gly Asp Asp Phe Gln Leu Thr Gly Gly Thr Thr Val Leu Ala Thr Glu
465 470 475 480
Lys Pro Thr Val Ile Asp Ser Thr Ile Gln Ser Glu Phe Pro Thr Tyr
485 490 495
Gly Phe Asn Cys Glu Phe Gly Trp Gly Ser His Lys Thr Phe Cys His
500 505 510
Trp Glu His Asp Asn His Val Gln Leu Lys Trp Ser Val Leu Thr Ser
515 520 525
Lys Thr Gly Pro Ile Gln Asp His Thr Gly Asp Gly Asn Phe Ile Tyr
530 535 540
Ser Gln Ala Asp Glu Asn Gln Lys Gly Lys Val Ala Arg Leu Val Ser
545 550 555 560
Pro Val Val Tyr Ser Gln Asn Ser Ala His Cys Met Thr Phe Trp Tyr
565 570 575
His Met Ser Gly Ser His Val Gly Thr Leu Arg Val Lys Leu Arg Tyr
580 585 590
Gln Lys Pro Glu Glu Tyr Asp Gln Leu Val Trp Met Ala Ile Gly His
595 600 605
Gln Gly Asp His Trp Lys Glu Gly Arg Val Leu Leu His Lys Ser Leu
610 615 620
Lys Leu Tyr Gln Val Ile Phe Glu Gly Glu Ile Gly Lys Gly Asn Leu
625 630 635 640
Gly Gly Ile Ala Val Asp Asp Ile Ser Ile Asn Asn His Ile Ser Gln
645 650 655
Glu Asp Cys Ala Lys Pro Ala Asp Leu Asp Lys Lys Asn Pro Glu Ile
660 665 670
Lys Ile Asp Glu Thr Gly Ser Thr Pro Gly Tyr Glu Gly Glu Gly Glu
675 680 685
Gly Asp Lys Asn Ile Ser Arg Lys Pro Gly Asn Val Leu Lys Thr Leu
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<210> 57
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
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ttcaagagag gtcctgaatg ttcccagaac tacacaacac ctagtggagt gataaagtcc 480
cccggattcc ctgaaaaata tcccaacagc cttgaatgca cttatattgt ctttgcgcca 540
aagatgtcag agattatcct ggaatttgaa agctttgacc tggagcctga ctcaaatcct 600
ccagggggga tgttctgtcg ctacgaccgg ctagaaatct gggatggatt ccctgatgtt 660
ggccctcaca ttgggcgtta ctgtggacag aaaacaccag gtcgaatccg atcctcatcg 720
ggcattctct ccatggtttt ttacaccgac agcgcgatag caaaagaagg tttctcagca 780
aactacagtg tcttgcagag cagtgtctca gaagatttca aaaagataac agattatcct 840
tgctctggaa tgttgggtat ggtgtctgga cttatttctg actcccagat cacatcatcc 900
aaccaagggg acagaaactg gatgcctgaa aacatccgcc tggtaaccag tcgctctggc 960
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gaggagaaga tcgtgagggg catcatcatt cagggtggga agcaccgaga gaacaaggtg 1080
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<210> 58
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Met Glu Arg Gly Leu Pro Leu Leu Cys Ala Val Leu Ala Leu Val Leu
1 5 10 15
Ala Pro Ala Gly Ala Phe Arg Asn Asp Lys Cys Gly Asp Thr Ile Lys
20 25 30
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35 40 45
His Pro Ser Glu Lys Cys Glu Trp Leu Ile Gln Ala Pro Asp Pro Tyr
50 55 60
Gln Arg Ile Met Ile Asn Phe Asn Pro His Phe Asp Leu Glu Asp Arg
65 70 75 80
Asp Cys Lys Tyr Asp Tyr Val Glu Val Phe Asp Gly Glu Asn Glu Asn
85 90 95
Gly His Phe Arg Gly Lys Phe Cys Gly Lys Ile Ala Pro Pro Pro Val
100 105 110
Val Ser Ser Gly Pro Phe Leu Phe Ile Lys Phe Val Ser Asp Tyr Glu
115 120 125
Thr His Gly Ala Gly Phe Ser Ile Arg Tyr Glu Leu Phe Lys Arg Gly
130 135 140
Pro Glu Cys Ser Gln Asn Tyr Thr Thr Pro Ser Gly Val Ile Lys Ser
145 150 155 160
Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile
165 170 175
Val Phe Ala Pro Lys Met Ser Glu Ile Ile Leu Glu Phe Glu Ser Phe
180 185 190
Asp Leu Glu Pro Asp Ser Asn Pro Pro Gly Gly Met Phe Cys Arg Tyr
195 200 205
Asp Arg Leu Glu Ile Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile
210 215 220
Gly Arg Tyr Cys Gly Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser
225 230 235 240
Gly Ile Leu Ser Met Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu
245 250 255
Gly Phe Ser Ala Asn Tyr Ser Val Leu Gln Ser Ser Val Ser Glu Asp
260 265 270
Phe Lys Lys Ile Thr Asp Tyr Pro Cys Ser Gly Met Leu Gly Met Val
275 280 285
Ser Gly Leu Ile Ser Asp Ser Gln Ile Thr Ser Ser Asn Gln Gly Asp
290 295 300
Arg Asn Trp Met Pro Glu Asn Ile Arg Leu Val Thr Ser Arg Ser Gly
305 310 315 320
Trp Ala Leu Pro Pro Ala Pro His Ser Tyr Ile Asn Glu Trp Leu Gln
325 330 335
Ile Asp Leu Gly Glu Glu Lys Ile Val Arg Gly Ile Ile Ile Gln Gly
340 345 350
Gly Lys His Arg Glu Asn Lys Val Phe Met Arg Lys Phe Lys Ile Gly
355 360 365
Tyr Ser Asn Asn Gly Ser Asp Trp Lys Met Ile Met Asp Asp Ser Lys
370 375 380
Arg Lys Ala Lys Ser Phe Glu Gly Asn Asn Asn Tyr Asp Thr Pro Glu
385 390 395 400
Leu Arg Thr Phe Pro Ala Leu Ser Thr Arg Phe Ile Arg Ile Tyr Pro
405 410 415
Glu Arg Ala Thr His Gly Gly Leu Gly Leu Arg Met Glu Leu Leu Gly
420 425 430
Cys Arg Ser Gly Ser Lys Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
435 440 445
<210> 59
<211> 2256
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
atggagaggg ggctgccgct cctctgcgcc gtgctcgccc tcgtcctcgc cccggccggc 60
gcttttcgca acgataaaag aggtcctgaa tgttcccaga actacacaac acctagtgga 120
gtgataaagt cccccggatt ccctgaaaaa tatcccaaca gccttgaatg cacttatatt 180
gtctttgcgc caaagatgtc agagattatc ctggaatttg aaagctttga cctggagcct 240
gactcaaatc ctccaggggg gatgttctgt cgctacgacc ggctagaaat ctgggatgga 300
ttccctgatg ttggccctca cattgggcgt tactgtggac agaaaacacc aggtcgaatc 360
cgatcctcat cgggcattct ctccatggtt ttttacaccg acagcgcgat agcaaaagaa 420
ggtttctcag caaactacag tgtcttgcag agcagtgtct cagaagattt caaatgtatg 480
gaagctctgg gcatggaatc aggagaaatt cattctgacc agatcacagc ttcttcccag 540
tatagcacca actggtctgc agagcgctcc cgcctgaact accctgagaa tgggtggact 600
cccggagagg attcctaccg agagtggata caggtagact tgggccttct gcgctttgtc 660
acggctgtcg ggacacaggg cgccatttca aaagaaacca agaagaaata ttatgtcaag 720
acttacaaga tcgacgttag ctccaacggg gaagactgga tcaccataaa agaaggaaac 780
aaacctgttc tctttcaggg aaacaccaac cctacagatg ttgtggttgc agtattcccc 840
aaaccactga taactcgatt tgtccgaatc aagcctgcaa cttgggaaac tggcatatct 900
atgagatttg aagtatatgg ttgcaagata acagattatc cttgctctgg aatgttgggt 960
atggtgtctg gacttatttc tgactcccag atcacatcat ccaaccaagg ggacagaaac 1020
tggatgcctg aaaacatccg cctggtaacc agtcgctctg gctgggcact tccacccgca 1080
cctcattcct acatcaatga gtggctccaa atagacctgg gggaggagaa gatcgtgagg 1140
ggcatcatca ttcagggtgg gaagcaccga gagaacaagg tgttcatgag gaagttcaag 1200
atcgggtaca gcaacaacgg ctcggactgg aagatgatca tggatgacag caaacgcaag 1260
gcgaagtctt ttgagggcaa caacaactat gatacacctg agctgcggac ttttccagct 1320
ctctccacgc gattcatcag gatctacccc gagagagcca ctcatggcgg actggggctc 1380
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gggaacttgg tggatgaatg tgatgacgac caggccaact gccacagtgg aacaggtgat 1500
gacttccagc tcacaggtgg caccactgtg ctggccacag aaaagcccac ggtcatagac 1560
agcaccatac aatcagagtt tccaacatat ggttttaact gtgaatttgg ctggggctct 1620
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accagcaaga cgggacccat tcaggatcac acaggagatg gcaacttcat ctattcccaa 1740
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ggacaccaag gtgaccactg gaaggaaggg cgtgtcttgc tccacaagtc tctgaaactt 1980
tatcaggtga ttttcgaggg cgaaatcgga aaaggaaacc ttggtgggat tgctgtggat 2040
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aaaaagaacc cagaaattaa aattgatgaa acagggagca cgccaggata cgaaggtgaa 2160
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agatctggat ccaaggaaaa cttgtatttc cagggc 2256
<210> 60
<211> 752
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
Met Glu Arg Gly Leu Pro Leu Leu Cys Ala Val Leu Ala Leu Val Leu
1 5 10 15
Ala Pro Ala Gly Ala Phe Arg Asn Asp Lys Arg Gly Pro Glu Cys Ser
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Glu Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile Val Phe Ala Pro
50 55 60
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Asp Ser Asn Pro Pro Gly Gly Met Phe Cys Arg Tyr Asp Arg Leu Glu
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Gly Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser Gly Ile Leu Ser
115 120 125
Met Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu Gly Phe Ser Ala
130 135 140
Asn Tyr Ser Val Leu Gln Ser Ser Val Ser Glu Asp Phe Lys Cys Met
145 150 155 160
Glu Ala Leu Gly Met Glu Ser Gly Glu Ile His Ser Asp Gln Ile Thr
165 170 175
Ala Ser Ser Gln Tyr Ser Thr Asn Trp Ser Ala Glu Arg Ser Arg Leu
180 185 190
Asn Tyr Pro Glu Asn Gly Trp Thr Pro Gly Glu Asp Ser Tyr Arg Glu
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210 215 220
Thr Gln Gly Ala Ile Ser Lys Glu Thr Lys Lys Lys Tyr Tyr Val Lys
225 230 235 240
Thr Tyr Lys Ile Asp Val Ser Ser Asn Gly Glu Asp Trp Ile Thr Ile
245 250 255
Lys Glu Gly Asn Lys Pro Val Leu Phe Gln Gly Asn Thr Asn Pro Thr
260 265 270
Asp Val Val Val Ala Val Phe Pro Lys Pro Leu Ile Thr Arg Phe Val
275 280 285
Arg Ile Lys Pro Ala Thr Trp Glu Thr Gly Ile Ser Met Arg Phe Glu
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Val Tyr Gly Cys Lys Ile Thr Asp Tyr Pro Cys Ser Gly Met Leu Gly
305 310 315 320
Met Val Ser Gly Leu Ile Ser Asp Ser Gln Ile Thr Ser Ser Asn Gln
325 330 335
Gly Asp Arg Asn Trp Met Pro Glu Asn Ile Arg Leu Val Thr Ser Arg
340 345 350
Ser Gly Trp Ala Leu Pro Pro Ala Pro His Ser Tyr Ile Asn Glu Trp
355 360 365
Leu Gln Ile Asp Leu Gly Glu Glu Lys Ile Val Arg Gly Ile Ile Ile
370 375 380
Gln Gly Gly Lys His Arg Glu Asn Lys Val Phe Met Arg Lys Phe Lys
385 390 395 400
Ile Gly Tyr Ser Asn Asn Gly Ser Asp Trp Lys Met Ile Met Asp Asp
405 410 415
Ser Lys Arg Lys Ala Lys Ser Phe Glu Gly Asn Asn Asn Tyr Asp Thr
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595 600 605
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Gly His Gln Gly Asp His Trp Lys Glu Gly Arg Val Leu Leu His Lys
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Ser Leu Lys Leu Tyr Gln Val Ile Phe Glu Gly Glu Ile Gly Lys Gly
660 665 670
Asn Leu Gly Gly Ile Ala Val Asp Asp Ile Ser Ile Asn Asn His Ile
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Glu Ile Lys Ile Asp Glu Thr Gly Ser Thr Pro Gly Tyr Glu Gly Glu
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Gly Glu Gly Asp Lys Asn Ile Ser Arg Lys Pro Gly Asn Val Leu Lys
725 730 735
Thr Leu Asp Pro Arg Ser Gly Ser Lys Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
740 745 750
<210> 61
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
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ttccctgatg ttggccctca cattgggcgt tactgtggac agaaaacacc aggtcgaatc 360
cgatcctcat cgggcattct ctccatggtt ttttacaccg acagcgcgat agcaaaagaa 420
ggtttctcag caaactacag tgtcttgcag agcagtgtct cagaagattt caaatgtatg 480
gaagctctgg gcatggaatc aggagaaatt cattctgacc agatcacagc ttcttcccag 540
tatagcacca actggtctgc agagcgctcc cgcctgaact accctgagaa tgggtggact 600
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acttacaaga tcgacgttag ctccaacggg gaagactgga tcaccataaa agaaggaaac 780
aaacctgttc tctttcaggg aaacaccaac cctacagatg ttgtggttgc agtattcccc 840
aaaccactga taactcgatt tgtccgaatc aagcctgcaa cttgggaaac tggcatatct 900
atgagatttg aagtatatgg ttgcaagata acagattatc cttgctctgg aatgttgggt 960
atggtgtctg gacttatttc tgactcccag atcacatcat ccaaccaagg ggacagaaac 1020
tggatgcctg aaaacatccg cctggtaacc agtcgctctg gctgggcact tccacccgca 1080
cctcattcct acatcaatga gtggctccaa atagacctgg gggaggagaa gatcgtgagg 1140
ggcatcatca ttcagggtgg gaagcaccga gagaacaagg tgttcatgag gaagttcaag 1200
atcgggtaca gcaacaacgg ctcggactgg aagatgatca tggatgacag caaacgcaag 1260
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<210> 62
<211> 479
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
Met Glu Arg Gly Leu Pro Leu Leu Cys Ala Val Leu Ala Leu Val Leu
1 5 10 15
Ala Pro Ala Gly Ala Phe Arg Asn Asp Lys Arg Gly Pro Glu Cys Ser
20 25 30
Gln Asn Tyr Thr Thr Pro Ser Gly Val Ile Lys Ser Pro Gly Phe Pro
35 40 45
Glu Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile Val Phe Ala Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Ser Asn Pro Pro Gly Gly Met Phe Cys Arg Tyr Asp Arg Leu Glu
85 90 95
Ile Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile Gly Arg Tyr Cys
100 105 110
Gly Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser Gly Ile Leu Ser
115 120 125
Met Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu Gly Phe Ser Ala
130 135 140
Asn Tyr Ser Val Leu Gln Ser Ser Val Ser Glu Asp Phe Lys Cys Met
145 150 155 160
Glu Ala Leu Gly Met Glu Ser Gly Glu Ile His Ser Asp Gln Ile Thr
165 170 175
Ala Ser Ser Gln Tyr Ser Thr Asn Trp Ser Ala Glu Arg Ser Arg Leu
180 185 190
Asn Tyr Pro Glu Asn Gly Trp Thr Pro Gly Glu Asp Ser Tyr Arg Glu
195 200 205
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210 215 220
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Thr Tyr Lys Ile Asp Val Ser Ser Asn Gly Glu Asp Trp Ile Thr Ile
245 250 255
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260 265 270
Asp Val Val Val Ala Val Phe Pro Lys Pro Leu Ile Thr Arg Phe Val
275 280 285
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Val Tyr Gly Cys Lys Ile Thr Asp Tyr Pro Cys Ser Gly Met Leu Gly
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Met Val Ser Gly Leu Ile Ser Asp Ser Gln Ile Thr Ser Ser Asn Gln
325 330 335
Gly Asp Arg Asn Trp Met Pro Glu Asn Ile Arg Leu Val Thr Ser Arg
340 345 350
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355 360 365
Leu Gln Ile Asp Leu Gly Glu Glu Lys Ile Val Arg Gly Ile Ile Ile
370 375 380
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435 440 445
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450 455 460
Leu Gly Cys Arg Ser Gly Ser Lys Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
465 470 475
<210> 63
<211> 960
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
atggagaggg ggctgccgct cctctgcgcc gtgctcgccc tcgtcctcgc cccggccggc 60
gcttttcgca acgataaaag aggtcctgaa tgttcccaga actacacaac acctagtgga 120
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gactcaaatc ctccaggggg gatgttctgt cgctacgacc ggctagaaat ctgggatgga 300
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acggctgtcg ggacacaggg cgccatttca aaagaaacca agaagaaata ttatgtcaag 720
acttacaaga tcgacgttag ctccaacggg gaagactgga tcaccataaa agaaggaaac 780
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<210> 64
<211> 320
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
Met Glu Arg Gly Leu Pro Leu Leu Cys Ala Val Leu Ala Leu Val Leu
1 5 10 15
Ala Pro Ala Gly Ala Phe Arg Asn Asp Lys Arg Gly Pro Glu Cys Ser
20 25 30
Gln Asn Tyr Thr Thr Pro Ser Gly Val Ile Lys Ser Pro Gly Phe Pro
35 40 45
Glu Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile Val Phe Ala Pro
50 55 60
Lys Met Ser Glu Ile Ile Leu Glu Phe Glu Ser Phe Asp Leu Glu Pro
65 70 75 80
Asp Ser Asn Pro Pro Gly Gly Met Phe Cys Arg Tyr Asp Arg Leu Glu
85 90 95
Ile Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile Gly Arg Tyr Cys
100 105 110
Gly Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser Gly Ile Leu Ser
115 120 125
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130 135 140
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Glu Ala Leu Gly Met Glu Ser Gly Glu Ile His Ser Asp Gln Ile Thr
165 170 175
Ala Ser Ser Gln Tyr Ser Thr Asn Trp Ser Ala Glu Arg Ser Arg Leu
180 185 190
Asn Tyr Pro Glu Asn Gly Trp Thr Pro Gly Glu Asp Ser Tyr Arg Glu
195 200 205
Trp Ile Gln Val Asp Leu Gly Leu Leu Arg Phe Val Thr Ala Val Gly
210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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<210> 65
<211> 1797
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
atggagaggg ggctgccgct cctctgcgcc gtgctcgccc tcgtcctcgc cccggccggc 60
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gaagctctgg gcatggaatc aggagaaatt cattctgacc agatcacagc ttcttcccag 540
tatagcacca actggtctgc agagcgctcc cgcctgaact accctgagaa tgggtggact 600
cccggagagg attcctaccg agagtggata caggtagact tgggccttct gcgctttgtc 660
acggctgtcg ggacacaggg cgccatttca aaagaaacca agaagaaata ttatgtcaag 720
acttacaaga tcgacgttag ctccaacggg gaagactgga tcaccataaa agaaggaaac 780
aaacctgttc tctttcaggg aaacaccaac cctacagatg ttgtggttgc agtattcccc 840
aaaccactga taactcgatt tgtccgaatc aagcctgcaa cttgggaaac tggcatatct 900
atgagatttg aagtatatgg ttgcaagata acagattatc ctgaagtgga agcccctaca 960
gctggaccga ccactcccaa cgggaacttg gtggatgaat gtgatgacga ccaggccaac 1020
tgccacagtg gaacaggtga tgacttccag ctcacaggtg gcaccactgt gctggccaca 1080
gaaaagccca cggtcataga cagcaccata caatcagagt ttccaacata tggttttaac 1140
tgtgaatttg gctggggctc tcacaagacc ttctgccact gggaacatga caatcacgtg 1200
cagctcaagt ggagtgtgtt gaccagcaag acgggaccca ttcaggatca cacaggagat 1260
ggcaacttca tctattccca agctgacgaa aatcagaagg gcaaagtggc tcgcctggtg 1320
agccctgtgg tttattccca gaactctgcc cactgcatga ccttctggta tcacatgtct 1380
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cagctggtct ggatggccat tggacaccaa ggtgaccact ggaaggaagg gcgtgtcttg 1500
ctccacaagt ctctgaaact ttatcaggtg attttcgagg gcgaaatcgg aaaaggaaac 1560
cttggtggga ttgctgtgga tgacattagt attaataacc acatttcaca agaagattgt 1620
gcaaaaccag cagacctgga taaaaagaac ccagaaatta aaattgatga aacagggagc 1680
acgccaggat acgaaggtga aggagaaggt gacaagaaca tctccaggaa gccaggcaat 1740
gtgttgaaga ccttagaccc cagatctgga tccaaggaaa acttgtattt ccagggc 1797
<210> 66
<211> 599
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
Met Glu Arg Gly Leu Pro Leu Leu Cys Ala Val Leu Ala Leu Val Leu
1 5 10 15
Ala Pro Ala Gly Ala Phe Arg Asn Asp Lys Arg Gly Pro Glu Cys Ser
20 25 30
Gln Asn Tyr Thr Thr Pro Ser Gly Val Ile Lys Ser Pro Gly Phe Pro
35 40 45
Glu Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile Val Phe Ala Pro
50 55 60
Lys Met Ser Glu Ile Ile Leu Glu Phe Glu Ser Phe Asp Leu Glu Pro
65 70 75 80
Asp Ser Asn Pro Pro Gly Gly Met Phe Cys Arg Tyr Asp Arg Leu Glu
85 90 95
Ile Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile Gly Arg Tyr Cys
100 105 110
Gly Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser Gly Ile Leu Ser
115 120 125
Met Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu Gly Phe Ser Ala
130 135 140
Asn Tyr Ser Val Leu Gln Ser Ser Val Ser Glu Asp Phe Lys Cys Met
145 150 155 160
Glu Ala Leu Gly Met Glu Ser Gly Glu Ile His Ser Asp Gln Ile Thr
165 170 175
Ala Ser Ser Gln Tyr Ser Thr Asn Trp Ser Ala Glu Arg Ser Arg Leu
180 185 190
Asn Tyr Pro Glu Asn Gly Trp Thr Pro Gly Glu Asp Ser Tyr Arg Glu
195 200 205
Trp Ile Gln Val Asp Leu Gly Leu Leu Arg Phe Val Thr Ala Val Gly
210 215 220
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225 230 235 240
Thr Tyr Lys Ile Asp Val Ser Ser Asn Gly Glu Asp Trp Ile Thr Ile
245 250 255
Lys Glu Gly Asn Lys Pro Val Leu Phe Gln Gly Asn Thr Asn Pro Thr
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Asp Val Val Val Ala Val Phe Pro Lys Pro Leu Ile Thr Arg Phe Val
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Arg Ile Lys Pro Ala Thr Trp Glu Thr Gly Ile Ser Met Arg Phe Glu
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Gly Gly Thr Thr Val Leu Ala Thr Glu Lys Pro Thr Val Ile Asp Ser
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Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
595
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<211> 2604
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
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<211> 2604
<212> DNA
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<223> 合成构建体
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<210> 72
<211> 847
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 72
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1 5 10 15
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Tyr Ser Val Leu Gln Ser Ser Val Ser Glu Asp Phe Lys Cys Met Glu
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cgctaccaga agccagagga gtacgatcag ctggtctgga tggccattgg acaccaaggt 2280
gaccactgga aggaagggcg tgtcttgctc cacaagtctc tgaaacttta tcaggtgatt 2340
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aataaccaca tttcacaaga agattgtgca aaaccagcag acctggataa aaagaaccca 2460
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325 330 335
Tyr Lys Ile Asp Val Ser Ser Asn Gly Glu Asp Trp Ile Thr Ile Lys
340 345 350
Glu Gly Asn Lys Pro Val Leu Phe Gln Gly Asn Thr Asn Pro Thr Asp
355 360 365
Val Val Val Ala Val Phe Pro Lys Pro Leu Ile Thr Arg Phe Val Arg
370 375 380
Ile Lys Pro Ala Thr Trp Glu Thr Gly Ile Ser Met Arg Phe Glu Val
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Tyr Gly Cys Lys Ile Thr Asp Tyr Pro Cys Ser Gly Met Leu Gly Met
405 410 415
Val Ser Gly Leu Ile Ser Asp Ser Gln Ile Thr Ser Ser Asn Gln Gly
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625 630 635 640
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645 650 655
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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Gly Gly Lys His Arg Glu Asn Lys Val Phe Met Arg Lys Phe Lys Ile
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<211> 1785
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<223> 合成构建体
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
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atggaatcag gagaaattca ttctgaccag atcacagctt cttcccaggc tagcaccaac 900
tggtctgcag agcgctcccg cctgaactac cctgagaatg ggtggactcc cggagaggat 960
tcctaccgag agtggataca ggtagacttg ggccttctgc gctttgtcac ggctgtcggg 1020
acacagggcg ccatttcaaa agaaaccaag aagaaatatt atgtcaagac ttacaagatc 1080
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actcgatttg tccgaatcaa gcctgcaact tgggaaactg gcatatctat gagatttgaa 1260
gtatatggtt gcagatctgg atccaaggaa aacttgtatt tccagggc 1308
<210> 84
<211> 415
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 84
Phe Arg Asn Asp Lys Cys Gly Asp Thr Ile Lys Ile Glu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Tyr Leu Thr Ser Pro Gly Tyr Pro His Ser Tyr His Pro Ser Glu Lys
20 25 30
Cys Glu Trp Leu Ile Gln Ala Pro Asp Pro Tyr Gln Arg Ile Met Ile
35 40 45
Asn Phe Asn Pro His Phe Asp Leu Glu Asp Arg Asp Cys Lys Tyr Asp
50 55 60
Tyr Val Glu Val Phe Asp Gly Glu Asn Glu Asn Gly His Phe Arg Gly
65 70 75 80
Lys Phe Cys Gly Lys Ile Ala Pro Pro Pro Val Val Ser Ser Gly Pro
85 90 95
Phe Leu Phe Ile Lys Phe Val Ser Asp Tyr Glu Thr His Gly Ala Gly
100 105 110
Phe Ser Ile Arg Tyr Glu Leu Phe Lys Arg Gly Pro Glu Cys Ser Gln
115 120 125
Asn Tyr Thr Thr Pro Ser Gly Val Ile Lys Ser Pro Gly Phe Pro Glu
130 135 140
Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile Val Phe Ala Pro Lys
145 150 155 160
Met Ser Glu Ile Ile Leu Glu Phe Glu Ser Phe Asp Leu Glu Pro Asp
165 170 175
Ser Asn Pro Pro Gly Gly Met Phe Cys Arg Tyr Asp Arg Leu Glu Ile
180 185 190
Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile Gly Arg Tyr Cys Gly
195 200 205
Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser Gly Ile Leu Ser Met
210 215 220
Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu Gly Phe Ser Ala Asn
225 230 235 240
Tyr Ser Val Leu Gln Ser Ser Val Ser Glu Asp Phe Lys Cys Met Glu
245 250 255
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260 265 270
Ser Ser Gln Ala Ser Thr Asn Trp Ser Ala Glu Arg Ser Arg Leu Asn
275 280 285
Tyr Pro Glu Asn Gly Trp Thr Pro Gly Glu Asp Ser Tyr Arg Glu Trp
290 295 300
Ile Gln Val Asp Leu Gly Leu Leu Arg Phe Val Thr Ala Val Gly Thr
305 310 315 320
Gln Gly Ala Ile Ser Lys Glu Thr Lys Lys Lys Tyr Tyr Val Lys Thr
325 330 335
Tyr Lys Ile Asp Val Ser Ser Asn Gly Glu Asp Trp Ile Thr Ile Lys
340 345 350
Glu Gly Asn Lys Pro Val Leu Phe Gln Gly Asn Thr Asn Pro Thr Asp
355 360 365
Val Val Val Ala Val Phe Pro Lys Pro Leu Ile Thr Arg Phe Val Arg
370 375 380
Ile Lys Pro Ala Thr Trp Glu Thr Gly Ile Ser Met Arg Phe Glu Val
385 390 395 400
Tyr Gly Cys Arg Ser Gly Ser Lys Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
405 410 415
<210> 85
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 85
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gcttttcgca acgataaatg tggcgatact ataaaaattg aaagccccgg gtaccttaca 120
tctcctggtt atcctcattc ttatcaccca agtgaaaaat gcgaatggct gattcaggct 180
ccggacccat accagagaat tatgatcaac ttcaaccctc acttcgattt ggaggacaga 240
gactgcaagt atgactacgt ggaagtcttc gatggagaaa atgaaaatgg acattttagg 300
ggaaagttct gtggaaagat agcccctcct cctgttgtgt cttcagggcc atttcttttt 360
atcaaatttg tctctgacta cgaaacacat ggtgcaggat tttccatacg ttatgaactt 420
ttcaagagag gtcctgaatg ttcccagaac tacacaacac ctagtggagt gataaagtcc 480
cccggattcc ctgaaaaata tcccaacagc cttgaatgca cttatattgt ctttgcgcca 540
aagatgtcag agattatcct ggaatttgaa agctttgacc tggagcctga ctcaaatcct 600
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ggccctcaca ttgggcgtta ctgtggacag aaaacaccag gtcgaatccg atcctcatcg 720
ggcattctct ccatggtttt ttacaccgac agcgcgatag caaaagaagg tttctcagca 780
aactacagtg tcttgagatc tggatccaag gaaaacttgt atttccaggg c 831
<210> 86
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 86
Phe Arg Asn Asp Lys Cys Gly Asp Thr Ile Lys Ile Glu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Tyr Leu Thr Ser Pro Gly Tyr Pro His Ser Tyr His Pro Ser Glu Lys
20 25 30
Cys Glu Trp Leu Ile Gln Ala Pro Asp Pro Tyr Gln Arg Ile Met Ile
35 40 45
Asn Phe Asn Pro His Phe Asp Leu Glu Asp Arg Asp Cys Lys Tyr Asp
50 55 60
Tyr Val Glu Val Phe Asp Gly Glu Asn Glu Asn Gly His Phe Arg Gly
65 70 75 80
Lys Phe Cys Gly Lys Ile Ala Pro Pro Pro Val Val Ser Ser Gly Pro
85 90 95
Phe Leu Phe Ile Lys Phe Val Ser Asp Tyr Glu Thr His Gly Ala Gly
100 105 110
Phe Ser Ile Arg Tyr Glu Leu Phe Lys Arg Gly Pro Glu Cys Ser Gln
115 120 125
Asn Tyr Thr Thr Pro Ser Gly Val Ile Lys Ser Pro Gly Phe Pro Glu
130 135 140
Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile Val Phe Ala Pro Lys
145 150 155 160
Met Ser Glu Ile Ile Leu Glu Phe Glu Ser Phe Asp Leu Glu Pro Asp
165 170 175
Ser Asn Pro Pro Gly Gly Met Phe Cys Arg Tyr Asp Arg Leu Glu Ile
180 185 190
Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile Gly Arg Tyr Cys Gly
195 200 205
Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser Gly Ile Leu Ser Met
210 215 220
Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu Gly Phe Ser Ala Asn
225 230 235 240
Tyr Ser Val Leu Arg Ser Gly Ser Lys Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
245 250 255
<210> 87
<211> 2145
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 87
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ccggacccat accagagaat tatgatcaac ttcaaccctc acttcgattt ggaggacaga 240
gactgcaagt atgactacgt ggaagtcttc gatggagaaa atgaaaatgg acattttagg 300
ggaaagttct gtggaaagat agcccctcct cctgttgtgt cttcagggcc atttcttttt 360
atcaaatttg tctctgacta cgaaacacat ggtgcaggat tttccatacg ttatgaactt 420
ttcaagagag gtcctgaatg ttcccagaac tacacaacac ctagtggagt gataaagtcc 480
cccggattcc ctgaaaaata tcccaacagc cttgaatgca cttatattgt ctttgcgcca 540
aagatgtcag agattatcct ggaatttgaa agctttgacc tggagcctga ctcaaatcct 600
ccagggggga tgttctgtcg ctacgaccgg ctagaaatct gggatggatt ccctgatgtt 660
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ggcattctct ccatggtttt ttacaccgac agcgcgatag caaaagaagg tttctcagca 780
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<210> 88
<211> 694
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 88
Phe Arg Asn Asp Lys Cys Gly Asp Thr Ile Lys Ile Glu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Tyr Leu Thr Ser Pro Gly Tyr Pro His Ser Tyr His Pro Ser Glu Lys
20 25 30
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35 40 45
Asn Phe Asn Pro His Phe Asp Leu Glu Asp Arg Asp Cys Lys Tyr Asp
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85 90 95
Phe Leu Phe Ile Lys Phe Val Ser Asp Tyr Glu Thr His Gly Ala Gly
100 105 110
Phe Ser Ile Arg Tyr Glu Leu Phe Lys Arg Gly Pro Glu Cys Ser Gln
115 120 125
Asn Tyr Thr Thr Pro Ser Gly Val Ile Lys Ser Pro Gly Phe Pro Glu
130 135 140
Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile Val Phe Ala Pro Lys
145 150 155 160
Met Ser Glu Ile Ile Leu Glu Phe Glu Ser Phe Asp Leu Glu Pro Asp
165 170 175
Ser Asn Pro Pro Gly Gly Met Phe Cys Arg Tyr Asp Arg Leu Glu Ile
180 185 190
Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile Gly Arg Tyr Cys Gly
195 200 205
Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser Gly Ile Leu Ser Met
210 215 220
Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu Gly Phe Ser Ala Asn
225 230 235 240
Tyr Ser Val Leu Gln Ser Ser Val Ser Glu Asp Phe Lys Cys Met Glu
245 250 255
Ala Leu Gly Met Glu Ser Gly Glu Ile His Ser Asp Gln Ile Thr Ala
260 265 270
Ser Ser Gln Tyr Ser Thr Asn Trp Ser Ala Glu Arg Ser Arg Leu Asn
275 280 285
Tyr Pro Glu Asn Gly Trp Thr Pro Gly Glu Asp Ser Tyr Arg Glu Trp
290 295 300
Ile Gln Val Asp Leu Gly Leu Leu Arg Phe Val Thr Ala Val Gly Thr
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Glu Gly Asn Lys Pro Val Leu Phe Gln Gly Asn Thr Asn Pro Thr Asp
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370 375 380
Ile Lys Pro Ala Thr Trp Glu Thr Gly Ile Ser Met Arg Phe Glu Val
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Tyr Gly Cys Lys Ile Thr Asp Tyr Pro Glu Val Glu Ala Pro Thr Ala
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Ile Gln Ser Glu Phe Pro Thr Tyr Gly Phe Asn Cys Glu Phe Gly Trp
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485 490 495
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565 570 575
Leu Val Trp Met Ala Ile Gly His Gln Gly Asp His Trp Lys Glu Gly
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Arg Val Leu Leu His Lys Ser Leu Lys Leu Tyr Gln Val Ile Phe Glu
595 600 605
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645 650 655
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675 680 685
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
690
<210> 89
<211> 2145
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 89
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gcttttcgca acgataaatg tggcgatact ataaaaattg aaagccccgg gtaccttaca 120
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ccggacccat accagagaat tatgatcaac ttcaaccctc acttcgattt ggaggacaga 240
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ccagggggga tgttctgtcg ctacgaccgg ctagaaatct gggatggatt ccctgatgtt 660
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gacctggata aaaagaaccc agaaattaaa attgatgaaa cagggagcac gccaggatac 2040
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<210> 90
<211> 694
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 90
Phe Arg Asn Asp Lys Cys Gly Asp Thr Ile Lys Ile Glu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Tyr Leu Thr Ser Pro Gly Tyr Pro His Ser Tyr His Pro Ser Glu Lys
20 25 30
Cys Glu Trp Leu Ile Gln Ala Pro Asp Pro Tyr Gln Arg Ile Met Ile
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115 120 125
Asn Tyr Thr Thr Pro Ser Gly Val Ile Lys Ser Pro Gly Phe Pro Glu
130 135 140
Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile Val Phe Ala Pro Lys
145 150 155 160
Met Ser Glu Ile Ile Leu Glu Phe Glu Ser Phe Asp Leu Glu Pro Asp
165 170 175
Ser Asn Pro Pro Gly Gly Met Phe Cys Arg Tyr Asp Arg Leu Glu Ile
180 185 190
Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile Gly Arg Tyr Cys Gly
195 200 205
Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser Gly Ile Leu Ser Met
210 215 220
Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu Gly Phe Ser Ala Asn
225 230 235 240
Tyr Ser Val Leu Gln Ser Ser Val Ser Glu Asp Phe Lys Cys Met Glu
245 250 255
Ala Leu Gly Met Glu Ser Gly Glu Ile His Ser Asp Gln Ile Thr Ala
260 265 270
Ser Ser Gln Ala Ser Thr Asn Trp Ser Ala Glu Arg Ser Arg Leu Asn
275 280 285
Tyr Pro Glu Asn Gly Trp Thr Pro Gly Glu Asp Ser Tyr Arg Glu Trp
290 295 300
Ile Gln Val Asp Leu Gly Leu Leu Arg Phe Val Thr Ala Val Gly Thr
305 310 315 320
Gln Gly Ala Ile Ser Lys Glu Thr Lys Lys Lys Tyr Tyr Val Lys Thr
325 330 335
Tyr Lys Ile Asp Val Ser Ser Asn Gly Glu Asp Trp Ile Thr Ile Lys
340 345 350
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355 360 365
Val Val Val Ala Val Phe Pro Lys Pro Leu Ile Thr Arg Phe Val Arg
370 375 380
Ile Lys Pro Ala Thr Trp Glu Thr Gly Ile Ser Met Arg Phe Glu Val
385 390 395 400
Tyr Gly Cys Lys Ile Thr Asp Tyr Pro Glu Val Glu Ala Pro Thr Ala
405 410 415
Gly Pro Thr Thr Pro Asn Gly Asn Leu Val Asp Glu Cys Asp Asp Asp
420 425 430
Gln Ala Asn Cys His Ser Gly Thr Gly Asp Asp Phe Gln Leu Thr Gly
435 440 445
Gly Thr Thr Val Leu Ala Thr Glu Lys Pro Thr Val Ile Asp Ser Thr
450 455 460
Ile Gln Ser Glu Phe Pro Thr Tyr Gly Phe Asn Cys Glu Phe Gly Trp
465 470 475 480
Gly Ser His Lys Thr Phe Cys His Trp Glu His Asp Asn His Val Gln
485 490 495
Leu Lys Trp Ser Val Leu Thr Ser Lys Thr Gly Pro Ile Gln Asp His
500 505 510
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515 520 525
Gly Lys Val Ala Arg Leu Val Ser Pro Val Val Tyr Ser Gln Asn Ser
530 535 540
Ala His Cys Met Thr Phe Trp Tyr His Met Ser Gly Ser His Val Gly
545 550 555 560
Thr Leu Arg Val Lys Leu Arg Tyr Gln Lys Pro Glu Glu Tyr Asp Gln
565 570 575
Leu Val Trp Met Ala Ile Gly His Gln Gly Asp His Trp Lys Glu Gly
580 585 590
Arg Val Leu Leu His Lys Ser Leu Lys Leu Tyr Gln Val Ile Phe Glu
595 600 605
Gly Glu Ile Gly Lys Gly Asn Leu Gly Gly Ile Ala Val Asp Asp Ile
610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
690
<210> 91
<211> 1677
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 91
atggagaggg ggctgccgct cctctgcgcc gtgctcgccc tcgtcctcgc cccggccggc 60
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atcaaatttg tctctgacta cgaaacacat ggtgcaggat tttccatacg ttatgaactt 420
ttcaagagag gtcctgaatg ttcccagaac tacacaacac ctagtggagt gataaagtcc 480
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ccagggggga tgttctgtcg ctacgaccgg ctagaaatct gggatggatt ccctgatgtt 660
ggccctcaca ttgggcgtta ctgtggacag aaaacaccag gtcgaatccg atcctcatcg 720
ggcattctct ccatggtttt ttacaccgac agcgcgatag caaaagaagg tttctcagca 780
aactacagtg tcttgcagag cagtgtctca gaagatttca aagaagtgga agcccctaca 840
gctggaccga ccactcccaa cgggaacttg gtggatgaat gtgatgacga ccaggccaac 900
tgccacagtg gaacaggtga tgacttccag ctcacaggtg gcaccactgt gctggccaca 960
gaaaagccca cggtcataga cagcaccata caatcagagt ttccaacata tggttttaac 1020
tgtgaatttg gctggggctc tcacaagacc ttctgccact gggaacatga caatcacgtg 1080
cagctcaagt ggagtgtgtt gaccagcaag acgggaccca ttcaggatca cacaggagat 1140
ggcaacttca tctattccca agctgacgaa aatcagaagg gcaaagtggc tcgcctggtg 1200
agccctgtgg tttattccca gaactctgcc cactgcatga ccttctggta tcacatgtct 1260
gggtcccacg tcggcacact cagggtcaaa ctgcgctacc agaagccaga ggagtacgat 1320
cagctggtct ggatggccat tggacaccaa ggtgaccact ggaaggaagg gcgtgtcttg 1380
ctccacaagt ctctgaaact ttatcaggtg attttcgagg gcgaaatcgg aaaaggaaac 1440
cttggtggga ttgctgtgga tgacattagt attaataacc acatttcaca agaagattgt 1500
gcaaaaccag cagacctgga taaaaagaac ccagaaatta aaattgatga aacagggagc 1560
acgccaggat acgaaggtga aggagaaggt gacaagaaca tctccaggaa gccaggcaat 1620
gtgttgaaga ccttagaccc cagatctgga tccaaggaaa acttgtattt ccagggc 1677
<210> 92
<211> 538
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 92
Phe Arg Asn Asp Lys Cys Gly Asp Thr Ile Lys Ile Glu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Tyr Leu Thr Ser Pro Gly Tyr Pro His Ser Tyr His Pro Ser Glu Lys
20 25 30
Cys Glu Trp Leu Ile Gln Ala Pro Asp Pro Tyr Gln Arg Ile Met Ile
35 40 45
Asn Phe Asn Pro His Phe Asp Leu Glu Asp Arg Asp Cys Lys Tyr Asp
50 55 60
Tyr Val Glu Val Phe Asp Gly Glu Asn Glu Asn Gly His Phe Arg Gly
65 70 75 80
Lys Phe Cys Gly Lys Ile Ala Pro Pro Pro Val Val Ser Ser Gly Pro
85 90 95
Phe Leu Phe Ile Lys Phe Val Ser Asp Tyr Glu Thr His Gly Ala Gly
100 105 110
Phe Ser Ile Arg Tyr Glu Leu Phe Lys Arg Gly Pro Glu Cys Ser Gln
115 120 125
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130 135 140
Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile Val Phe Ala Pro Lys
145 150 155 160
Met Ser Glu Ile Ile Leu Glu Phe Glu Ser Phe Asp Leu Glu Pro Asp
165 170 175
Ser Asn Pro Pro Gly Gly Met Phe Cys Arg Tyr Asp Arg Leu Glu Ile
180 185 190
Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile Gly Arg Tyr Cys Gly
195 200 205
Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser Gly Ile Leu Ser Met
210 215 220
Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu Gly Phe Ser Ala Asn
225 230 235 240
Tyr Ser Val Leu Gln Ser Ser Val Ser Glu Asp Phe Lys Glu Val Glu
245 250 255
Ala Pro Thr Ala Gly Pro Thr Thr Pro Asn Gly Asn Leu Val Asp Glu
260 265 270
Cys Asp Asp Asp Gln Ala Asn Cys His Ser Gly Thr Gly Asp Asp Phe
275 280 285
Gln Leu Thr Gly Gly Thr Thr Val Leu Ala Thr Glu Lys Pro Thr Val
290 295 300
Ile Asp Ser Thr Ile Gln Ser Glu Phe Pro Thr Tyr Gly Phe Asn Cys
305 310 315 320
Glu Phe Gly Trp Gly Ser His Lys Thr Phe Cys His Trp Glu His Asp
325 330 335
Asn His Val Gln Leu Lys Trp Ser Val Leu Thr Ser Lys Thr Gly Pro
340 345 350
Ile Gln Asp His Thr Gly Asp Gly Asn Phe Ile Tyr Ser Gln Ala Asp
355 360 365
Glu Asn Gln Lys Gly Lys Val Ala Arg Leu Val Ser Pro Val Val Tyr
370 375 380
Ser Gln Asn Ser Ala His Cys Met Thr Phe Trp Tyr His Met Ser Gly
385 390 395 400
Ser His Val Gly Thr Leu Arg Val Lys Leu Arg Tyr Gln Lys Pro Glu
405 410 415
Glu Tyr Asp Gln Leu Val Trp Met Ala Ile Gly His Gln Gly Asp His
420 425 430
Trp Lys Glu Gly Arg Val Leu Leu His Lys Ser Leu Lys Leu Tyr Gln
435 440 445
Val Ile Phe Glu Gly Glu Ile Gly Lys Gly Asn Leu Gly Gly Ile Ala
450 455 460
Val Asp Asp Ile Ser Ile Asn Asn His Ile Ser Gln Glu Asp Cys Ala
465 470 475 480
Lys Pro Ala Asp Leu Asp Lys Lys Asn Pro Glu Ile Lys Ile Asp Glu
485 490 495
Thr Gly Ser Thr Pro Gly Tyr Glu Gly Glu Gly Glu Gly Asp Lys Asn
500 505 510
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515 520 525
Gly Ser Lys Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly
530 535
<210> 93
<211> 2115
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 93
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gcttttcgca acgataaatg tggcgatact ataaaaattg aaagccccgg gtaccttaca 120
tctcctggtt atcctcattc ttatcaccca agtgaaaaat gcgaatggct gattcaggct 180
ccggacccat accagagaat tatgatcaac ttcaaccctc acttcgattt ggaggacaga 240
gactgcaagt atgactacgt ggaagtcttc gatggagaaa atgaaaatgg acattttagg 300
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tattcccaga actctgccca ctgcatgacc ttctggtatc acatgtctgg gtcccacgtc 1740
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ctgaaacttt atcaggtgat tttcgagggc gaaatcggaa aaggaaacct tggtgggatt 1920
gctgtggatg acattagtat taataaccac atttcacaag aagattgtgc aaaaccagca 1980
gacctggata aaaagaaccc agaaattaaa attgatgaaa cagggagcac gccaggatac 2040
gaaggtgaag gagaaggtga caagaacatc tccaggaagc caggcaatgt gttgaagacc 2100
ttagacccca gatct 2115
<210> 94
<211> 682
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 94
Phe Arg Asn Asp Lys Cys Gly Asp Thr Ile Lys Ile Glu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Tyr Leu Thr Ser Pro Gly Tyr Pro His Ser Tyr His Pro Ser Glu Lys
20 25 30
Cys Glu Trp Leu Ile Gln Ala Pro Asp Pro Tyr Gln Arg Ile Met Ile
35 40 45
Asn Phe Asn Pro His Phe Asp Leu Glu Asp Arg Asp Cys Lys Tyr Asp
50 55 60
Tyr Val Glu Val Phe Asp Gly Glu Asn Glu Asn Gly His Phe Arg Gly
65 70 75 80
Lys Phe Cys Gly Lys Ile Ala Pro Pro Pro Val Val Ser Ser Gly Pro
85 90 95
Phe Leu Phe Ile Lys Phe Val Ser Asp Tyr Glu Thr His Gly Ala Gly
100 105 110
Phe Ser Ile Arg Tyr Glu Leu Phe Lys Arg Gly Pro Glu Cys Ser Gln
115 120 125
Asn Tyr Thr Thr Pro Ser Gly Val Ile Lys Ser Pro Gly Phe Pro Glu
130 135 140
Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile Val Phe Ala Pro Lys
145 150 155 160
Met Ser Glu Ile Ile Leu Glu Phe Glu Ser Phe Asp Leu Glu Pro Asp
165 170 175
Ser Asn Pro Pro Gly Gly Met Phe Cys Arg Tyr Asp Arg Leu Glu Ile
180 185 190
Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile Gly Arg Tyr Cys Gly
195 200 205
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210 215 220
Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu Gly Phe Ser Ala Asn
225 230 235 240
Tyr Ser Val Leu Gln Ser Ser Val Ser Glu Asp Phe Lys Cys Met Glu
245 250 255
Ala Leu Gly Met Glu Ser Gly Glu Ile His Ser Asp Gln Ile Thr Ala
260 265 270
Ser Ser Gln Tyr Ser Thr Asn Trp Ser Ala Glu Arg Ser Arg Leu Asn
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Gln Gly Ala Ile Ser Lys Glu Thr Lys Lys Lys Tyr Tyr Val Lys Thr
325 330 335
Tyr Lys Ile Asp Val Ser Ser Asn Gly Glu Asp Trp Ile Thr Ile Lys
340 345 350
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370 375 380
Ile Lys Pro Ala Thr Trp Glu Thr Gly Ile Ser Met Arg Phe Glu Val
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405 410 415
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420 425 430
Gln Ala Asn Cys His Ser Gly Thr Gly Asp Asp Phe Gln Leu Thr Gly
435 440 445
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450 455 460
Ile Gln Ser Glu Phe Pro Thr Tyr Gly Phe Asn Cys Glu Phe Gly Trp
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485 490 495
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500 505 510
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530 535 540
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545 550 555 560
Thr Leu Arg Val Lys Leu Arg Tyr Gln Lys Pro Glu Glu Tyr Asp Gln
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580 585 590
Arg Val Leu Leu His Lys Ser Leu Lys Leu Tyr Gln Val Ile Phe Glu
595 600 605
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Pro Gly Asn Val Leu Lys Thr Leu Asp Pro
675 680
<210> 95
<211> 923
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 95
Met Glu Arg Gly Leu Pro Leu Leu Cys Ala Thr Leu Ala Leu Ala Leu
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Ala Leu Ala Gly Ala Phe Arg Ser Asp Lys Cys Gly Gly Thr Ile Lys
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Gly Arg Leu Trp Gly Lys Phe Cys Gly Lys Ile Ala Pro Ser Pro Val
100 105 110
Val Ser Ser Gly Pro Phe Leu Phe Ile Lys Phe Val Ser Asp Tyr Glu
115 120 125
Thr His Gly Ala Gly Phe Ser Ile Arg Tyr Glu Ile Phe Lys Arg Gly
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Gly Arg Tyr Cys Gly Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser
225 230 235 240
Gly Ile Leu Ser Met Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu
245 250 255
Gly Phe Ser Ala Asn Tyr Ser Val Leu Gln Ser Ser Ile Ser Glu Asp
260 265 270
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Arg Ser Arg Leu Asn Tyr Pro Glu Asn Gly Trp Thr Pro Gly Glu Asp
305 310 315 320
Ser Tyr Arg Glu Trp Ile Gln Val Asp Leu Gly Leu Leu Arg Phe Val
325 330 335
Thr Ala Val Gly Thr Gln Gly Ala Ile Ser Lys Glu Thr Lys Lys Lys
340 345 350
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355 360 365
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Thr Arg Phe Val Arg Ile Lys Pro Ala Ser Trp Glu Thr Gly Ile Ser
405 410 415
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Gly Met Leu Gly Met Val Ser Gly Leu Ile Ser Asp Ser Gln Ile Thr
435 440 445
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485 490 495
Gly Val Ile Ile Gln Gly Gly Lys His Arg Glu Asn Lys Val Phe Met
500 505 510
Arg Lys Phe Lys Ile Ala Tyr Ser Asn Asn Gly Ser Asp Trp Lys Met
515 520 525
Ile Met Asp Asp Ser Lys Arg Lys Ala Lys Ser Phe Glu Gly Asn Asn
530 535 540
Asn Tyr Asp Thr Pro Glu Leu Arg Ala Phe Thr Pro Leu Ser Thr Arg
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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<211> 923
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 96
Met Glu Arg Gly Leu Pro Leu Leu Cys Ala Val Leu Ala Leu Val Leu
1 5 10 15
Ala Pro Ala Gly Ala Phe Arg Asn Asp Lys Cys Gly Asp Thr Ile Lys
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Ile Glu Ser Pro Gly Tyr Leu Thr Ser Pro Gly Tyr Pro His Ser Tyr
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Gly His Phe Arg Gly Lys Phe Cys Gly Lys Ile Ala Pro Pro Pro Val
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Val Ser Ser Gly Pro Phe Leu Phe Ile Lys Phe Val Ser Asp Tyr Glu
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Thr His Gly Ala Gly Phe Ser Ile Arg Tyr Glu Leu Phe Lys Arg Gly
130 135 140
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145 150 155 160
Pro Gly Phe Pro Glu Lys Tyr Pro Asn Ser Leu Glu Cys Thr Tyr Ile
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Asp Arg Leu Glu Ile Trp Asp Gly Phe Pro Asp Val Gly Pro His Ile
210 215 220
Gly Arg Tyr Cys Gly Gln Lys Thr Pro Gly Arg Ile Arg Ser Ser Ser
225 230 235 240
Gly Ile Leu Ser Met Val Phe Tyr Thr Asp Ser Ala Ile Ala Lys Glu
245 250 255
Gly Phe Ser Ala Asn Tyr Ser Val Leu Gln Ser Ser Val Ser Glu Asp
260 265 270
Phe Lys Cys Met Glu Ala Leu Gly Met Glu Ser Gly Glu Ile His Ser
275 280 285
Asp Gln Ile Thr Ala Ser Ser Gln Tyr Ser Thr Asn Trp Ser Ala Glu
290 295 300
Arg Ser Arg Leu Asn Tyr Pro Glu Asn Gly Trp Thr Pro Gly Glu Asp
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Ser Tyr Arg Glu Trp Ile Gln Val Asp Leu Gly Leu Leu Arg Phe Val
325 330 335
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340 345 350
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515 520 525
Ile Met Asp Asp Ser Lys Arg Lys Ala Lys Ser Phe Glu Gly Asn Asn
530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
Arg Met Glu Leu Leu Gly Cys Glu Val Glu Ala Pro Thr Ala Gly Pro
580 585 590
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595 600 605
Asn Cys His Ser Gly Thr Gly Asp Asp Phe Gln Leu Thr Gly Gly Thr
610 615 620
Thr Val Leu Ala Thr Glu Lys Pro Thr Val Ile Asp Ser Thr Ile Gln
625 630 635 640
Ser Glu Phe Pro Thr Tyr Gly Phe Asn Cys Glu Phe Gly Trp Gly Ser
645 650 655
His Lys Thr Phe Cys His Trp Glu His Asp Asn His Val Gln Leu Lys
660 665 670
Trp Ser Val Leu Thr Ser Lys Thr Gly Pro Ile Gln Asp His Thr Gly
675 680 685
Asp Gly Asn Phe Ile Tyr Ser Gln Ala Asp Glu Asn Gln Lys Gly Lys
690 695 700
Val Ala Arg Leu Val Ser Pro Val Val Tyr Ser Gln Asn Ser Ala His
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Cys Met Thr Phe Trp Tyr His Met Ser Gly Ser His Val Gly Thr Leu
725 730 735
Arg Val Lys Leu Arg Tyr Gln Lys Pro Glu Glu Tyr Asp Gln Leu Val
740 745 750
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885 890 895
Glu Asn Tyr Asn Phe Glu Leu Val Asp Gly Val Lys Leu Lys Lys Asp
900 905 910
Lys Leu Asn Thr Gln Ser Thr Tyr Ser Glu Ala
915 920
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> X可以为任意氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> X可以为任意氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> X可以为任意氨基酸
<400> 97
Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Gly
1 5
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> X是任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> X是任何氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> X是任何氨基酸
<400> 98
Glu Xaa Xaa Tyr Xaa Gln Ser
1 5
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NRP1正向引物
<400> 99
acccacattt cgatttggag 20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NRP1反向引物
<400> 100
ttcatagcgg atggaaaacc 20
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEMA3A正向引物
<400> 101
gctcctgctc cgtagcctgc 20
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEMA3A反向引物
<400> 102
tcggcgttgc tttcggtccc 20
<210> 103
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEMA3e正向引物
<400> 103
tctgcaacca tcca 14
<210> 104
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEMA3e反向引物
<400> 104
accacaagag ggaagcacag ac 22
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFb正向引物
<400> 105
ggactctcca cctgcaagac 20
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TGFb反向引物
<400> 106
catagatggc gttgttgcgg 20
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGFa正向引物
<400> 107
gccctgagtc aagaggacag 20
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGFa反向引物
<400> 108
ctcctaggcc cctcagaagt 20
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGFb正向引物
<400> 109
tctgagcatg gaactcatgg 20
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGFb反向引物
<400> 110
tctgcattca cattggctgt 20

Claims (143)

1.一种抑制或预防(i)细胞衰老或(ii)细胞衰老相关分泌表型(SASP)的方法，其包括降低SEMA3A水平或活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括使所述细胞与SEMA3A拮抗剂接触。
3.一种抑制或预防受试者中(i)细胞衰老或(ii)细胞衰老相关分泌表型的方法，其包括向所述受试者施用有效量的SEMA3A拮抗剂。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述SEMA3A拮抗剂是(a)SEMA3A抗体；(b)SEMA3A反义或shRNA；和/或(c)结合SEMA3A的可溶性NRP1多肽(NRP1捕获剂)或其功能变体或片段。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述可溶性NRP1多肽是表2中列出的NRP1捕获剂或其功能变体或片段。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述细胞是神经元、小神经胶质细胞、内皮细胞、骨髓细胞、单核细胞、巨噬细胞或脂肪组织细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述细胞是终末分化的细胞。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述衰老是旁分泌衰老。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述衰老继发于细胞缺血。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述方法减少所述细胞中的IRE1α活化及Pai1、IL-6、IL-1β、TGF-β、tp53、XBP1和/或Vegfa的表达。
11.一种用于抑制或预防(i)细胞衰老或(ii)细胞衰老相关分泌表型的组合物，其包含SEMA3A拮抗剂和运载体。
12.SEMA3A拮抗剂用于抑制或预防细胞衰老或细胞衰老相关分泌表型的用途。
13.根据权利要求11所述的组合物或权利要求12所述的用途，其中所述SEMA3A拮抗剂是(a)SEMA3A抗体；(b)SEMA3A反义或shRNA；和/或(c)(i)结合SEMA3A的可溶性NRP1多肽(NRP1捕获剂)或其功能变体或片段；或(ii)编码(i)的多肽的核酸或包含所述核酸的载体。
14.根据权利要求11或13所述的组合物或权利要求12或13所述的用途，其中所述细胞是神经元、小神经胶质细胞、内皮细胞、骨髓细胞、单核细胞、巨噬细胞或脂肪组织细胞。
15.根据权利要求11或13所述的组合物或权利要求12或13所述的用途，其中所述细胞是终末分化的细胞。
16.根据权利要求11和13至15中任一项所述的组合物或权利要求12-15中任一项所述的用途，其中所述衰老是旁分泌衰老。
17.根据权利要求11和13至16中任一项所述的组合物或权利要求12-16中任一项所述的用途，其中所述拮抗剂减少所述细胞中的IRE1α活化及Pai1、IL-6、Il-1b、TGF-β、tp53、XBP1和Vegfa的表达。
18.一种SEMA3A拮抗剂，其用于制备用于(i)抑制或预防细胞衰老；或(ii)细胞衰老相关分泌表型(SASP)的药物。
19.根据权利要求18所述使用的SEMA3A拮抗剂，其中所述拮抗剂是(a)SEMA3A抗体；(b)SEMA3A反义或shRNA；和/或(c)(i)可溶性NRP1多肽(NRP1捕获剂)或其功能变体或片段或(ii)编码(i)的多肽的核酸或包含所述核酸的载体。
20.根据权利要求1至10中任一项所述的方法、权利要求11和13-17中任一项所述的组合物、权利要求12至17中任一项所述的用途或权利要求18或19所述使用的SEMA3A拮抗剂，其中所述细胞来自患有肌肉减少症、神经退变、表皮变薄、皮肤皱纹、脱发、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、动脉粥样硬化、骨关节炎、骨质疏松症、帕金森病、肠道疾病、青光眼、椎间盘退变、脑动脉瘤、主动脉瘤、胰腺纤维化、囊性纤维化、肥胖或代谢综合征的受试者。
21.一种刺激或诱导细胞衰老或细胞衰老相关分泌表型(SASP)的方法，其包括增加SEMA3A水平或活性。
22.一种刺激或诱导细胞衰老或细胞衰老相关分泌表型的方法，其包括使所述细胞与SEMA3A多肽或其功能变体或片段接触。
23.一种刺激或诱导受试者的细胞衰老或细胞衰老相关分泌表型的方法，其包括向所述受试者施用SEMA3A多肽或其功能变体或片段或用于表达所述SEMA3A多肽的编码所述SEMA3A多肽或其功能变体或片段的核酸。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其用于改善伤口愈合(例如皮肤伤口愈合)。
25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，其中所述方法增加所述细胞中的IRE1α活化及Pai1、IL-6、Il-1b、TGF-β、tp53、XBP1和/或Vegfa的表达。
26.一种用于刺激或诱导细胞衰老或细胞衰老相关分泌表型的组合物，其包含SEMA3A多肽或其功能变体或片段或编码所述SEMA3A多肽或其功能变体或片段的核酸。
27.SEMA3A多肽或其功能变体或片段用于刺激或诱导细胞衰老或细胞衰老相关分泌表型的用途。
28.根据权利要求26所述的组合物或权利要求27所述的用途，其中所述细胞来自患有或有风险患有肝纤维化、肺动脉高血压、心肌梗塞、癌症、肾纤维化或心脏纤维化的受试者。
29.根据权利要求26或28所述的组合物或权利要求27或28所述的用途，其用于改善伤口愈合。
30.一种SEMA3A多肽或其功能变体或片段，其用于制备用于诱导细胞衰老或细胞衰老相关分泌表型的药物。
31.一种SEMA3A多肽或其功能变体或片段，其用于刺激或诱导细胞衰老或细胞衰老相关分泌表型。
32.根据权利要求30或31所述使用的SEMA3A多肽或其功能变体或片段，其中所述细胞来自患有或有风险患有肝纤维化、肺动脉高血压、心肌梗塞或心脏纤维化的受试者。
33.根据权利要求30或31所述使用的SEMA3A多肽或其功能变体或片段，其用于改善伤口愈合。
34.一种编码SEMA3A多肽或其功能变体或片段的核酸，其用于制备用于刺激或诱导细胞衰老或细胞衰老相关分泌表型的药物。
35.根据权利要求34所述的核酸，其中所述细胞来自患有或有风险患有肝纤维化、肺动脉高血压、心肌梗塞或心脏纤维化的受试者。
36.一种载体，其包含根据权利要求35或36所述的核酸。
37.一种细胞，其包含根据权利要求36所述的载体。
38.一种治疗或预防血管性眼病或病症的方法，其包括向受试者施用SASP抑制剂，其中所述SASP抑制剂是(i)IRE1α表达的抑制剂(ii)IRE1αRNA酶活性的抑制剂；(ii)双胍化合物；或(iii)mTOr抑制剂。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述血管性眼病或病症是糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、缺血性视网膜病变、高血压性视网膜病变、药物诱导的视网膜血管病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关性黄斑退变、青少年黄斑退变、视网膜新生血管形成、视网膜中央静脉阻塞、分支视网膜静脉阻塞、脉络膜新生血管、息肉状脉络膜血管病变、眼部物理损伤、青光眼、孔源性视网膜脱离(RRD)、视网膜血管炎、视网膜巨大动脉瘤、视网膜微动脉瘤、Fuch氏营养不良、缺血性视神经病变、黄斑毛细血管扩张、视神经炎、引流综合征、视网膜色素变性、葡萄膜炎、缺血性视神经病变(ION)或斯坦加特病。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述血管性眼病或病症是糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关性黄斑水肿、视网膜新生血管、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分支静脉阻塞或脉络膜新生血管形成。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述血管性眼病或病症是糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、干性(萎缩性)年龄相关性黄斑退变、湿性(渗出性)年龄相关性黄斑退变、分支视网膜静脉阻塞或黄斑性角膜扩张症。
42.一种抑制视网膜血管发生的方法，其包括向受试者施用SASP抑制剂，其中所述SASP抑制剂是(i)IRE1α表达的抑制剂(ii)IRE1αRNA酶活性的抑制剂；(iii)双胍化合物；或(iv)mTOr抑制剂。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述视网膜血管发生继发于细胞缺血。
44.根据权利要求38至43中任一项所述的方法，其中所述受试者已被诊断患有糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关性黄斑病变、视网膜新生血管形成、视网膜中央静脉阻塞、分支视网膜静脉阻塞、脉络膜新生血管形成、息肉状脉络膜血管病变、黄斑性角膜扩张症。
45.一种促进眼部血管修复和/或减少眼部缺血的方法，其包括向受试者施用SASP抑制剂，其中所述SASP抑制剂是(i)IRE1α表达的抑制剂(ii)IRE1αRNA酶活性的抑制剂；(iii)双胍化合物；或(iv)mTOr抑制剂。
46.一种预防或减少眼部细胞衰老的方法，其包括向受试者施用SASP抑制剂，其中所述SASP抑制剂是(i)IRE1α表达的抑制剂(ii)IRE1αRNA酶活性的抑制剂；(iii)双胍化合物；或(iv)mTOr抑制剂。
47.根据权利要求38至46中任一项所述的方法，其中所述施用是区域或局部眼部施用。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述局部眼部施用是结膜下(sub-tenons)、玻璃体内、眼球后、后巩膜下或前房内施用。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述局部眼部施用是玻璃体内施用。
50.根据权利要求38至49中任一项所述的方法，其中所述SASP抑制剂是双胍化合物。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述双胍化合物是二甲双胍、苯乙双胍、丁双胍、氯胍、氯丙胍、癸烷双胍A或癸烷双胍B。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述双胍化合物是二甲双胍。
53.一种眼用组合物，其包含双胍化合物和合适的药物载体。
54.根据权利要求53所述的眼用组合物，其中所述双胍化合物是(i)二甲双胍，(ii)苯乙双胍；(iii)丁双胍；(iv)氯胍；(v)氯丙胍；(vi)癸烷双胍A；(vii)癸烷双胍B或(iv)其任何组合。
55.根据权利要求54所述的眼用组合物，其中所述双胍化合物是二甲双胍。
56.根据权利要求53至55中任一项所述的眼用组合物，其用于治疗或预防血管性眼病或病症。
57.根据权利要求53至55中任一项所述的眼用组合物，其用于抑制视网膜血管发生。
58.根据权利要求53至55中任一项所述的眼用组合物，其用于促进眼部血管修复和/或减少眼部缺血。
59.一种包含SASP抑制剂的组合物，其用于治疗或预防血管性眼病或病症，其中所述SASP抑制剂是(i)IRE1α表达的抑制剂；(ii)IRE1αRNA酶活性的抑制剂；或(iii)mTOr抑制剂。
60.根据权利要求59所述的组合物，其中所述血管性眼病或病症是糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、缺血性视网膜病变、高血压性视网膜病变、药物诱导的视网膜血管病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关性黄斑退变、青少年黄斑退变、视网膜新生血管形成、视网膜中央静脉阻塞、分支视网膜静脉阻塞、脉络膜新生血管、息肉状脉络膜血管病变、眼部物理损伤、青光眼、孔源性视网膜脱离(RRD)、视网膜血管炎、视网膜巨大动脉瘤、视网膜微动脉瘤、Fuch氏营养不良、缺血性视神经病变、黄斑毛细血管扩张、视神经炎、引流综合征、视网膜色素变性、葡萄膜炎、缺血性视神经病变(ION)或斯坦加特病。
61.一种包含SASP抑制剂的组合物，其用于抑制视网膜血管发生，其中所述SASP抑制剂是(i)IRE1α表达的抑制剂；(ii)IRE1αRNA酶活性的抑制剂；或(iii)mTOr抑制剂。
62.一种包含SASP抑制剂的组合物，其用于促进眼部血管修复和/或减少眼部缺血，其中所述SASP抑制剂是(i)IRE1α表达的抑制剂；(ii)IRE1αRNA酶活性的抑制剂；或(iii)mTOr抑制剂。
63.一种包含SASP抑制剂的组合物，其用于预防或减少眼部细胞衰老，其中所述SASP抑制剂是(i)IRE1α表达的抑制剂；(ii)IRE1αRNA酶活性的抑制剂；或(iii)mTOr抑制剂。
64.根据权利要求59至63中任一项所述的组合物，其中所述组合物是眼用组合物。
65.根据权利要求53至55、59和60中任一项所定义的组合物的用途，其用于治疗或预防血管性眼病或病症。
66.根据权利要求53至55中任一项所定义的组合物的用途，其用于(i)抑制视网膜血管发生；(ii)抑制病理性视网膜新生血管形成；(iii)促进眼部血管修复；(iv)减少眼部缺血；和/或(v)预防或减少眼部细胞衰老。
67.根据权利要求53至55中任一项所定义的组合物，其用于制备用于治疗或预防血管性眼病或病症的药物。
68.根据权利要求53至55中任一项所定义的组合物，其用于制备用于(i)抑制视网膜血管发生；(ii)促进眼部血管修复和/或减少眼部缺血；和/或(iii)预防或减少眼部细胞衰老的药物。
69.包含SASP抑制剂的组合物用于(i)抑制视网膜血管发生；(ii)抑制病理性视网膜新生血管形成；(iii)促进眼部血管修复；(iv)减少眼部缺血；和/或(v)预防或减少眼部细胞衰老的用途，其中所述SASP是。
70.一种包含SASP抑制剂的组合物，其用于制备用于治疗或预防血管性眼病或病症的药物，其中所述SASP抑制剂是(i)IRE1α表达的抑制剂；(ii)IRE1αRNA酶活性的抑制剂；或(iii)mTOr抑制剂。
71.一种包含SASP抑制剂的组合物，其用于制备用于(i)抑制视网膜血管发生(病理性视网膜新血管形成)；(ii)促进眼部血管修复；(iii)减轻眼缺血；和/或(iv)预防或减少眼部细胞衰老的药物，所述组合物是(i)IRE1α表达的抑制剂；(ii)IRE1αRNA酶活性的抑制剂；或(iii)mTOr抑制剂。
72.一种抑制或预防(i)细胞衰老或(ii)细胞衰老相关分泌表型的方法，其包括降低IRE1α表达或活性。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述活性包括IRE1α核糖核酸酶活性。
74.根据权利要求72或73所述的方法，其中所述方法包括使所述细胞与IRE1α抑制剂接触。
75.一种抑制或预防受试者的(i)细胞衰老或(ii)细胞衰老相关分泌表型的方法，其包括向所述受试者施用IRE1α抑制剂。
76.根据权利要求72至75中任一项所述的方法，其中所述抑制剂是针对IRE1α、4u8c、硼替佐米、N-[(2-羟基-1-萘基)亚甲基]-2-噻吩磺酰胺(STF-083010)或MKC-3946的反义或shRNA。
77.根据权利要求72至76中任一项所述的方法，其中所述细胞是终末分化的细胞。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述细胞是神经元或小神经胶质细胞。
79.根据权利要求72至78中任一项所述的方法，其中所述衰老是旁分泌衰老。
80.根据权利要求72至79中任一项所述的方法，其中所述SASP继发于细胞缺血。
81.根据权利要求72至80中任一项所述的方法，其中所述方法减少所述细胞中的IRE1α活化；SA-β-gal活性；和/或Pai1、IL-6、Il-1b、TGF-β、tp53、XBP1和/或Vegfa的表达。
82.一种抑制或预防(i)细胞衰老或(ii)细胞衰老相关分泌表型的组合物，其包含IRE1α抑制剂。
83.IRE1α抑制剂用于抑制或预防(i)细胞衰老或(ii)细胞衰老相关分泌表型的用途。
84.根据权利要求82所述的组合物或权利要求83所述的用途，其中所述IRE1α抑制剂是针对IRE1α、4u8c、硼替佐米、N-[(2-羟基-1-萘基)亚甲基]-2-噻吩磺酰胺(STF-083010)或MKC-3946的反义或shRNA。
85.根据权利要求82或84所述的组合物或权利要求83或84所述的用途，其中所述细胞是终末分化的细胞。
86.根据权利要求85所述的组合物或用途，其中所述细胞是神经元或小神经胶质细胞。
87.根据权利要求82和84至86中任一项所述的组合物或权利要求83至86中任一项所述的用途，其中所述衰老是旁分泌衰老。
88.根据权利要求82和84至87中任一项所述的组合物或权利要求83至87中任一项所述的用途，其中所述SASP继发于细胞缺血。
89.根据权利要求82和84至88中任一项所述的组合物或权利要求83至88中任一项所述的用途，其中所述抑制剂减少所述细胞中的IRE1α活化；SA-β-gal活性；和/或Pai1、IL-6、Il-1b、TGF-β、tp53、XBP1和/或Vegfa的表达。
90.一种IRE1α抑制剂，其用于制备用于(i)抑制或预防细胞衰老或(ii)细胞衰老相关分泌表型的药物。
91.根据权利要求90所述使用的IRE1α抑制剂，其中所述抑制剂是针对IRE1α、硼替佐米、N-[(2-羟基-1-萘基)亚甲基]-2-噻吩磺酰胺(STF-083010)或MKC-3946的反义或shRNA。
92.根据权利要求72至81中任一项所述的方法、权利要求82和84至89中任一项所述的组合物、权利要求83至89中任一项所述的用途或权利要求90或91所述使用的IRE1α抑制剂，其中所述细胞来自患有或有风险患有肌肉减少症、神经退变、表皮变薄、皮肤皱纹、脱发、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、动脉粥样硬化、骨关节炎、骨质疏松症、帕金森病、肠道疾病、青光眼、椎间盘退变、脑动脉瘤、主动脉瘤、胰腺纤维化或囊性纤维化的受试者。
93.根据权利要求72至81和92中任一项所述的方法、权利要求82和84至89和92中任一项所述的组合物、权利要求83至89和92中任一项所述的用途或权利要求90至92中任一项所述使用的IRE1α抑制剂，其中所述细胞来自已经历癌症治疗或正在接受癌症治疗的受试者。
94.根据权利要求72至81、92和93中任一项所述的方法、权利要求82和84至89、92和93中任一项所述的组合物、权利要求83至89、92和93中任一项所述的用途或权利要求90至93中任一项所述使用的IRE1α抑制剂，其中所述细胞不是视网膜细胞，并且其中所述衰老与视网膜血管疾病无关。
95.一种刺激或诱导细胞衰老或细胞衰老相关分泌表型(SASP)的方法，其包括增加IRE1α水平或活性。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述方法包括使所述细胞与增加IRE1α水平或活性的化合物接触。
97.一种刺激或诱导受试者的细胞衰老或细胞衰老相关分泌表型的方法，其包括向所述受试者施用有效量的增加IRE1α水平或活性的化合物。
98.根据权利要求96或97所述的方法，其中所述化合物是Apy29或舒尼替尼。
99.根据权利要求96至98中任一项所述的方法，其中所述细胞来自患有或有风险患有肝纤维化、肾纤维化、肺动脉高血压、心肌梗塞或心脏纤维化的受试者。
100.根据权利要求96至99中任一项所述的方法，其用于改善伤口愈合。
101.根据权利要求96至100中任一项所述的方法，其中所述方法增加所述细胞中的IRE1α活化；SA-β-gal活性；和/或Pai1、IL-6、Il-1b、TGF-β、tp53、XBP1和/或Vegfa的表达。
102.一种用于刺激或诱导细胞衰老或细胞衰老相关分泌表型(SASP)的组合物，其包含增加IRE1α水平或活性的化合物。
103.根据权利要求102所述的组合物，其中所述化合物是Apy29或舒尼替尼。
104.增加IRE1α水平或活性的化合物用于刺激或诱导细胞衰老或细胞衰老相关分泌表型的用途。
105.根据权利要求102或103所述的组合物或权利要求67所述的用途，其中所述细胞来自患有或有风险患有肝纤维化、肾纤维化、肺动脉高血压、心肌梗塞或心脏纤维化的受试者。
106.根据权利要求102、103或105中任一项所述的组合物或权利要求67或68所述的用途，其用于改善伤口愈合。
107.一种增加IRE1α水平或活性的化合物，其用于制备用于诱导细胞衰老或细胞衰老相关分泌表型的药物。
108.一种增加IRE1α的化合物，其用于刺激或诱导细胞衰老或细胞衰老相关分泌表型。
109.根据权利要求107或108所述使用的化合物，其中所述细胞来自患有或有风险患有肝纤维化、肾纤维化、肺动脉高血压、心肌梗塞或心脏纤维化的受试者。
110.根据权利要求108至109中任一项所述使用的化合物，其用于改善伤口愈合。
111.一种改变受试者中脂质参数的方法，所述方法包括向所述受试者施用：(a)可溶性NRP1多肽或其变体或片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物，
其中所述改变脂质参数是(a)总胆固醇水平降低；(b)非高密度脂蛋白胆固醇水平降低；(c)甘油三酯水平降低；(d)总胆固醇：高密度脂蛋白胆固醇的比例降低；(e)循环游离脂肪酸减少；(f)HDL胆固醇增加或(f)(a)至(e)的任何组合。
112.一种用于预防或治疗受试者中与脂肪蓄积相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用：(a)可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述与脂肪蓄积相关的疾病或病症是高体重指数(BMI)；肥胖；代谢综合征；NAFLD；心血管疾病(CVD)；高血压和/或II型糖尿病(TIIDM)。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述心血管疾病是充血性心力衰竭、高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化。
115.一种用于改变受试者中身体组成参数的方法，其包括向所述受试者施用(a)可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物，
其中所述身体组成参数是内脏脂肪面积(VFA)、体重指数(BMI)、腰臀比(WHR)；腰围与身高比(WHeR)、腰围(WC)；手臂周长(AC)、锥度指数、体脂百分比(PBF)、肱三头肌皮肤皱褶、肩胛下皮肤皱褶、白色脂肪组织(WAT)水平；和/或棕色脂肪(BAT)组织水平。
116.根据权利要求111至115中任一项所述的方法，其中所述可溶性NRP1多肽或其片段包含表2中所述或图17或18中所示的NRP1多肽捕获剂或由其组成。
117.根据权利要求111至116中任一项所述的方法，其中全身施用所述可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段。
118.一种组合物，其包含：(a)可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物，其用于改变受试者的脂质参数，
其中所述改变脂质参数是(a)总胆固醇水平降低；(b)非高密度脂蛋白胆固醇水平降低；(c)甘油三酯水平降低；(d)总胆固醇：高密度脂蛋白胆固醇的比例降低；(e)循环游离脂肪酸减少；(f)HDL胆固醇增加或(f)(a)至(e)的任何组合。
119.一种组合物，其包含：(a)可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物，其用于预防或治疗受试者中与脂肪蓄积相关的疾病或病症。
120.根据权利要求119所述的组合物，其中所述与脂肪蓄积相关的疾病或病症是高体重指数(BMI)；肥胖；代谢综合征；NAFLD；心血管疾病(CVD)；高血压和/或II型糖尿病(TIIDM)。
121.根据权利要求120所述的组合物，其中所述心血管疾病是充血性心力衰竭、高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化。
122.一种组合物，其包含：(a)可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物，其用于改变受试者的身体组成参数，
其中所述身体组成参数是内脏脂肪面积(VFA)、体重指数(BMI)、腰臀比(WHR)；腰围与身高比(WHeR)、腰围(WC)；手臂周长(AC)、锥度指数、体脂百分比(PBF)、肱三头肌皮肤皱褶、肩胛下皮肤皱褶、白色脂肪组织(WAT)水平；和/或棕色脂肪(BAT)组织水平。
123.根据权利要求118至122中任一项所述的组合物，其中所述可溶性NRP1多肽包含表2中所述或图17或18中所示的NRP1多肽捕获剂或由其组成。
124.根据权利要求118至123中任一项所述的组合物，其中所述可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段用于全身施用。
125.(a)可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物用于改变受试者的脂质参数的用途，
其中所述改变脂质参数是(a)总胆固醇水平降低；(b)非高密度脂蛋白胆固醇水平降低；(c)甘油三酯水平降低；(d)总胆固醇：高密度脂蛋白胆固醇的比例降低；(e)循环游离脂肪酸减少；(f)HDL胆固醇增加或(f)(a)至(e)的任何组合。
126.(a)可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物用于预防或治疗受试者中与脂肪蓄积相关的疾病或病症的用途。
127.根据权利要求126所述的用途，其中所述与脂肪蓄积相关的疾病或病症是高体重指数(BMI)；肥胖；代谢综合征；NAFLD；心血管疾病(CVD)；高血压和/或II型糖尿病(TIIDM)。
128.根据权利要求127所述的用途，其中所述心血管疾病是充血性心力衰竭、高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化。
129.(a)可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物用于改变受试者的身体组成参数的用途，
其中所述身体组成参数是内脏脂肪面积(VFA)、体重指数(BMI)、腰臀比(WHR)；腰围与身高比(WHeR)、腰围(WC)；手臂周长(AC)、锥度指数、体脂百分比(PBF)、肱三头肌皮肤皱褶、肩胛下皮肤皱褶、白色脂肪组织(WAT)水平；和/或棕色脂肪(BAT)组织水平。
130.根据权利要求125至129中任一项所述的用途，其中所述可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段包含表2中所述或图7或9A中所示的NRP1多肽捕获剂或由其组成。
131.根据权利要求125至130中任一项所述的用途，其中所述可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段用于全身施用。
132.(a)可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物在制备用于改变受试者的脂质参数的药物中的用途，
其中所述改变脂质参数是(a)总胆固醇水平降低；(b)非高密度脂蛋白胆固醇水平降低；(c)甘油三酯水平降低；(d)总胆固醇：高密度脂蛋白胆固醇的比例降低；(e)循环游离脂肪酸减少；(f)HDL胆固醇增加或(f)(a)至(e)的任何组合。
133.(a)可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物在制备用于预防或治疗受试者中与脂肪蓄积相关的疾病或病症的药物中的用途。
134.根据权利要求133所述的用途，其中所述与脂肪蓄积相关的疾病或病症是高体重指数(BMI)；肥胖；代谢综合征；NAFLD；心血管疾病(CVD)；高血压和/或II型糖尿病(TIIDM)。
135.根据权利要求134所述的用途，其中所述心血管疾病是充血性心力衰竭、高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化。
136.(a)可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段；(b)NRP1抗体；或(c)包含(a)和/或(b)以及药学上可接受的运载体的组合物在制备用于改变受试者的身体组成参数的药物中的用途，
其中所述身体组成参数是内脏脂肪面积(VFA)、体重指数(BMI)、腰臀比(WHR)；腰围与身高比(WHeR)、腰围(WC)；手臂周长(AC)、锥度指数、体脂百分比(PBF)、肱三头肌皮肤皱褶、肩胛下皮肤皱褶、白色脂肪组织(WAT)水平；和/或棕色脂肪(BAT)组织水平。
137.根据权利要求132至136中任一项所述的用途，其中所述可溶性NRP1多肽包含表2中所述或图17或18中所示的NRP1多肽捕获剂或由其组成。
138.根据权利要求132至137中任一项所述的用途，其中所述药物用于全身施用。
139.SEQ ID NO:52、54、58、60、62、64、66或76中所示的可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段。
140.一种核酸，其编码根据权利要求139所述的可溶性NRP1多肽或其功能变体或片段。
141.一种载体，其包含根据权利要求140所述的核酸。
142.根据权利要求141所述的载体，其为病毒载体(优选慢病毒或腺病毒载体)。
143.一种宿主细胞，其包含根据权利要求140所述的核酸或权利要求142或142所述的载体。
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