CN106456721A - 调节wars2的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于调节WARS2表达、WARS2活性或其组合，从而调节血管发生的方法和试剂。本文还提供了用于鉴定可受益于调节WARS2表达、WARS2活性或其组合之试剂的个体的方法。

Description

调节WARS2的方法

背景技术

细胞的增殖是多种疾病的病理生理学的中心。例如，由内皮细胞的不受控制的增殖引起的血管发生在例如癌症、糖尿病性眼病、黄斑变性和关节炎中起重要作用。

需要检测病理状况并治疗与细胞的不受控增殖相关的病症或疾病的方法，所述细胞的不受控增殖包括例如有助于血管发生的内皮细胞增殖。

发明内容

如本文所述，已经确定线粒体色氨酸tRNA合成酶(WARS2)在调节细胞增殖，特别是内皮细胞增殖中发挥作用，表明在与血管发生相关的多种病症中调节WARS2的益处。如本文所述，本发明提供了通过使用多种试剂控制WARS2表达、WARS2活性或其组合来调节血管发生的方法，所述试剂包括但不限于核酸、小有机分子、抗体、适配体、突变体WARS2、或其任意组合。

在另一个方面，本发明提供了调节内皮细胞以外的细胞(例如癌细胞)增殖的方法。因此，本文描述了通过使用多种试剂控制WARS2表达、WARS2活性或其组合来调节例如癌细胞增殖的方法。

本文还提供了鉴定将受益于调节WARS2表达、WARS2活性或其组合之患有例如肿瘤或心血管病症的个体的方法。

附图简述

图1A-1C示出在三个(3)独立时间点的大鼠基因组冠脉血流的遗传作图鉴定控制冠脉血流的大鼠染色体2q34上的单个基因座。1A：F2杂交中的遗传作图。Y轴，显著相关的置信度(1＝100％，红线＝显著性阈值)；X轴，在大鼠基因组中的位置。1B：使用作图品系和其他品系(BN＝棕色挪威(Brown Norway)，SHR＝自发性高血压大鼠(spontaneouslyhypertensive rat)，LEW＝Lewis大鼠(Lewis rat)，WKY＝Wistar Kyoto大鼠(WistarKyoto rat))的该区域的单倍型精细化(haplotype refinement)。1C：基因座处基因表达的遗传控制。发现两个基因在强遗传控制下，Pex11b和Wars2。

图2A-2E示出了多种大鼠品系的冠脉血流。(2A)Lew、SHR和WKY品系中的低血流，(2B)在SHR.BN2同类系(congenic)中的低血流的拯救。(2C)在SHR.BN2同类系中的不同毛细血管密度。(2D)在冠脉血流(coronary flow，CF)基因座处带有SHR等位基因之基因型的基因型特异性效应，具有较低流量。(2E)与BN大鼠中的野生型等位基因(SEQ ID NO：8)(高血流)相比，在SHR(SEQ ID NO：5)、Lew(SEQ ID NO：6)和WKY(SEQ ID NO：7)(低血流)中，亮氨酸残基53突变为苯丙氨酸(F)。示出了从小鼠(SEQ ID NO：9)、人(SEQ ID NO：10)、鸡(SEQID NO：11)、果蝇(SEQ ID NO：12)、斑马鱼(SEQ ID NO：13)并回到酵母(SEQ ID NO：14)的该残基的保守性。

图3示出了野生型(wild-type，WT)和L53F WARS2在线粒体中的定位以及突变酶受损的酶促活性。WARS2细胞定位的共聚焦图像分析。用WT或L53F WARS2-GFP转染人胚肾细胞(human embryonic kidney cell，HEK293细胞)，并且在24小时后，将细胞固定，透化并用抗cox4标记(中间两个图)。在最右边两个图中示出了WARS2与cox4的共定位。条尺寸＝5μm。

图4示出WARS2结合WARS，该效应由人WARS2蛋白中的WARS2(L53F)突变减弱；即WARS2(L53F)与WARS的结合较不强烈。用无载体(模拟)、flag标记的野生型WARS2(WT)或flag标记的WARS2(L53F)突变体(MUT)转染人脐静脉内皮(HUVEC)细胞并分析免疫沉淀的flag蛋白质与WARS的相互作用。

图5示出WARS2调节HUVEC细胞培养基中的WARS分泌。使用siRNA的WARS2基因沉默(上)导致响应于IFNγ刺激的增加的WARS分泌。相反，使用腺病毒载体的WARS2过表达(下)抑制WARS分泌。

图6A和6B：图6A示出WARS2沉默(siWARS2)对剪接的WARS转录本表达没有影响。图6B示出在基线时和IFN-γ刺激后内皮细胞中的WARS亚细胞定位。

图7举例说明WARS2结合GAIT复合体的组分，该效应在L53F突变体中未见到。用Flag标记的WARS2或Flag标记的WARS2(L53F)转染HUVEC细胞并且将flag纯化的部分进行印迹检测与GAIT复合体蛋白质的相互作用。

图8示出WARS2过表达导致关键GAIT组分RPL13a的蛋白体降解，其可通过添加抑制剂MG132逆转。突变体WARS2(L53F)对L13a表达没有影响。

图9表明WARS在外泌体中从HUVEC分泌到培养基中，该效应不受布雷菲德菌素A(brefeldin A，BFA)抑制。AnnexA2＝膜联蛋白A。

图10示出使用针对Wars2起始密码子(ATG MO)的吗啉代沉默斑马鱼Wars2基因的剂量依赖性作用。该作用被人WARS2蛋白的过表达逆转。

图11示出使用针对Wars2起始密码子的吗啉代沉默斑马鱼Wars2基因对血流(左上)、存活(右上)和心脏功能(左下)的剂量依赖性作用。CO＝心输出量(cardiac output)；dpf＝受精后的天数(days post fertilization)。条，平均值；误差条，SEM。

图12示出用Wars2抑制的Flk-GFP鱼中的异常血管形成，以及剂量依赖性作用的量化(左下)。

图13是大鼠WARS2(SEQ ID NO：1)、小鼠WARS2(SEQ ID NO：2)和人WARS2(SEQ IDNO：3)的氨基酸序列比对。突出显示的序列“PTGIPHLGNYLGA”示出在突变体WARS2(L53F)中突变的赖氨酸残基L的位置。

图14示出人WARS2(SEQ ID NO：4)的cDNA序列。突出显示的序列是siRNA所靶向的区域。

图15是示出在存在三种不同WARS2 siRNA的情况下，HEK293细胞中WARS2 mRNA表达的敲低的柱状图。

图16是示出控制WARS2表达的WARS2 SNP也控制人血浆中WARS水平的图。＊＊，P＜0.01。

图17是共聚焦成像，其示出WARS在外泌体中分泌，并且WARS2的表达通过在细胞中捕获WARS来抑制这些外泌体的分泌。用干扰素γ(Interferonγ，IFN-γ)分别刺激用对照病毒(Ad.对照，示于左图)或用表达WARS2的病毒(Ad.WRS2，示于右图)感染的HUVEC细胞，然后染色。在对照细胞中，看到含有WARS的膜结合的外泌体/微囊泡从细胞的质膜出芽(箭头)。相比之下，在WARS2感染的细胞中，大量的WARS积累在质膜处(＊)，而不是在外泌体中。

图18A和18B示出使用锌指核酸酶在棕色挪威(BN)大鼠中有效靶向Wars2。图18A示出了使用锌指核酸酶产生的野生型BN(Wars2^+/+)和杂合基因靶向的BN(Wars2^-/+)大鼠中8bp缺失的基因分型。泳道1，纯合野生型Wars2^+/+；泳道2-6，杂合Wars2^-/+；泳道7，标志物(50bp、100bp和150bp)。图18B描绘了在BN和F1(Wars2^-/+)和F1(Wars2^-/L53F，复合亚效等位基因(compound hypomorphic))大鼠中Wars2的基因表达。＊，P＜0.05；＊＊，P＜0.01；＊＊＊，P＜0.001。

图19A-C是大鼠的体内数据，示出通过使用核酸酶技术靶向大鼠Wars2之锌指核酸酶介导的对血管密度的作用。图19A示出当Wars2低时毛细管血管密度低。图19B示出当Wars2低时，在心脏中毛细血管面积低。图19C说明取决于毛细血管密度的冠脉血流在具有低Wars2的心脏中低。条，平均值；误差条，SEM。＊＊，P＜0.01；＊＊＊，P＜0.001。

图20A和20B举例说明了WARS2活性抑制的另一些模式。图20A示出吲哚霉素抑制人线粒体WARS2，但不抑制人胞质WARS活性。图20B示出Wars2突变大鼠(具有L53F突变)中的活性降低。＊＊，P＜0.01；＊＊＊，P＜0.001。

图21示出使用胆固醇修饰的siRNA在眼睛中的Wars2体内敲低。“NT”表示非靶向siRNA。数据是来自三只大鼠的结果的平均值。＊＊，P＜0.01。

图22A-F举例说明了WARS2在血管发生的体外模型中的作用。图22A-C示出通过减少的EC管形成证明的WARS2功能丧失；图22D-F示出与GFP相比，使用腺病毒(Ad)介导的WARS2过表达的WARS2功能获得。总EC管(图22A和22D)，总EC管长度(图22B和22E)和总分支点(图22C和22F)。条，平均值；误差条，SD。＊＊＊，P＜0.001。

图23A和23B示出WARS2抑制对EC形态和细胞数目的作用。图23A示出用siNT或siWARS2转染并对肌动蛋白(左)、线粒体(中)染色和具有核染色的复合图像(右)的EC的超分辨率显微术(比例尺＝25μm)。在siWARS2的存在下，肌动蛋白应力纤维基本上全部消失，细胞边缘呈现褶皱的外观(左图和右图)，而线粒体变成块状(中间和右图)。图23B表示用siNT或siWARS2转染72小时的培养物中的EC数目。条，平均值；误差条，SD。＊，P＜0.01，＊＊＊，P＜0.001。

图24A和24B举例说明了WARS2抑制对细胞周期的作用。图24A示出siRNA介导的WARS2抑制在内皮细胞(EC)中产生具有两个或更多个不完全分离的核的多个细胞。核(楔形)；(条＝50μm)。图24B是用非靶向siRNA(siNT)或针对WARS2的siRNA(siWARS2)处理的增殖EC中细胞周期的FACS分析；结果示出siWARS2处理的S期中EC的显著减少，以及G2/M期的数目增加(见到4N从19.62％增加至30.81％)。重复实验(n＝3)，得到相似的结果。

图25举例说明在乳腺癌血管发生模型中抑制Wars2阻止血管生长。箭头指示从表达正常Wars2的动物，血管生长到血管内皮生长因子(VEGF)基质胶栓(matrigel plug)中的区域。相比之下，实际上从携带Wars2(L53F)突变的动物没有见到生长到栓中。

图26示出A549肺癌细胞系的细胞增殖可以通过降低WARS2的表达而减少。数据是三次实验的平均值；示出了标准偏差条。“＊＊＊”表示在P＜0.005时显著。

发明详述

以下为本发明的示例性实施方案的描述。

如本文所述，在实验大鼠杂交(棕色挪威x自发性高血压大鼠F2群体)中，对冠脉血流的遗传决定子作图，并鉴定在心脏中遗传控制血流的大鼠染色体2上的基因座。在已经将毛细血管密度降低的同类系大鼠中证实了该作用。单倍型作图和eQTL分析将色氨酸tRNA合成酶2(Wars2；线粒体定位)优先作为在基因座处的候选基因，并且Wars2的测序鉴定了在高度保守的ATP结合结构域中的L53F突变(参见图13)。

氨酰基tRNA合成酶可以形成异二聚体复合物，并且观察到WARS2结合WARS，从而当切割和分泌时，抑制VEGFA信号传导和血管发生。在L53F突变体形式中WARS2与WARS的结合被大大消除。在IFN-γ刺激的内皮细胞中，WARS2过表达限制了抗血管发生的WARS片段的分泌，而WARS2敲低增加其释放。WARS表现出非典型分泌，并且如本文所证明，WARS在外泌体中分泌。虽然WARS主要定位于胞质，但在线粒体隔室中发现了增加的WARS，并且在存在WARS2过表达的情况下观察到WARS细胞内保留和切割的降低。在斑马鱼模型中，吗啉代介导的Wars2抑制导致血管腔化减少、动脉结构瓦解和心脏功能的受损。此外，如本文所述，WARS2活性或表达的抑制导致内皮细胞增殖减少。

总之，本文中的数据将WARS2鉴定为用于调节血管发生的新基因。事实上，WARS2酶活性位点以及与WARS的结合影响血管形成。如本文所示，靶向WARS2生物地调节WARS的胞外囊泡(例如，外泌体)分泌，以及内皮细胞的增殖，并且这种作用可以用于抑制个体(例如人)疾病中的异常血管发生，所述疾病如癌症，特别是涉及WARS2的乳腺癌，眼部疾病和代谢病症如肥胖(其中WARS2突变涉及在这些疾病中的作用)。本文的数据证明WARS2的突变可以对WARS的功能、内皮细胞增殖以及由此对血管发生具有深远的影响。

在另一个方面，本文提供的数据示出WARS2的抑制也导致癌细胞数目的显著减少，表明其调节内皮细胞之外的细胞增殖的更广泛的作用，包括例如调节癌细胞本身的增殖。

如本文所用，术语“WARS2”指线粒体氨酰基-tRNA合成酶。氨酰基-tRNA合成酶催化tRNA氨酰化为其同源氨基酸。具体地，“WARS2”是线粒体色氨酸tRNA合成酶。存在两种形式的色氨酸-tRNA合成酶，即称为WARS的细胞质形式和称为WARS2的线粒体形式。

如本文所用，例如WARS2的人形式全部以大写字母表示，其中DNA/RNA形式是斜体的(WARS2)，且蛋白质形式不是斜体的(WARS2)。通常，非人形式(例如小鼠或大鼠)表示为除了第一个字母外为小写的Wars2，其中DNA/RNA形式是斜体的(Wars2)，且蛋白质形式不是斜体的(Wars2)。

因此，在一个方面，本发明涉及在有此需要的个体中调节血管发生的方法，其包括施用有效量的调节WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂(agent)。

如本文所用，“血管发生”指形成血管的内皮细胞的增殖。

如本文所用，术语“调节”血管发生指改变血管发生。例如，调节血管发生的方法包括抑制、增强或维持血管发生。因此，在另一个方面，本发明涉及在有此需要的个体中抑制血管发生的方法，其包括施用有效量的抑制WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂。

在一些方面，抑制血管发生的方法可用于抑制由一种或更多种病症或疾病引起的或作为其结果发生的血管发生。例如，所述方法可用于抑制具有视网膜病(例如，糖尿病性视网膜病)或黄斑变性(例如年龄相关的黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)，如湿性AMD或干性AMD)的个体中的血管发生。或者，抑制血管发生的方法可用于抑制癌症的血管发生(例如，抑制支持肿瘤生长的血管的生长)(Curtis，C.等，Nature，486：346-352(2012)；Aberg，UWN等，PLoS One，6e：25720(2011)；Damasceno M等Curr Opin Oncol，23Suppl：S3-9(2011)；Huana C-C等，PLoS One，8e：76421(2013))或者代谢病症如肥胖(Heid等，Nature Genetics，42：949-960(2010)；Rosen ED等，Cell，156：20-44(2014)；Koza，RA等，J Biol Chem，275：34486-34492(2000))。

在另一些方面，本发明涉及在有此需要的个体中治疗视网膜病的方法，其包括施用有效量的抑制WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂。在一个特定方面，所述视网膜病是糖尿病性视网膜病。

在另一些方面，本发明涉及在有此需要的个体中治疗黄斑变性(例如湿性AMD；干性AMD)的方法，其包括施用有效量的抑制WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂。

在另一些方面，本发明涉及在有此需要的个体中增强血管发生的方法，其包括施用有效量的增强WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂。

在一些方面，增强血管发生的方法可用于在正经历和/或已经历移植(例如，器官移植)或伤口愈合，或者呈现多种形式的心血管疾病的个体中增强血管发生。

如本文所用，“心血管疾病”包括但不限于：心绞痛、心肌梗死、心力衰竭、动脉粥样硬化和血管肉瘤。

在另一个方面，如本文所述，WARS2的调节可以调节内皮细胞之外的细胞(例如，癌细胞)的增殖(生长)。特别地，抑制WARS2表达或WARS2活性可以减少癌细胞的数目。因此，本发明涉及在有此需要的个体中调节癌细胞增殖的方法，其包括施用有效量的调节WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂。如本文所用，“癌细胞增殖”指癌细胞本身的增殖。

如本文所用，术语“调节”癌细胞增殖指改变癌细胞增殖的能力。例如，调节癌细胞增殖的方法包括抑制、增强或维持癌细胞的增殖。

在一个特定方面，本发明涉及在有此需要的个体中抑制癌细胞增殖的方法，其包括施用有效量的抑制WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂。

如本文所述，用于所述方法的试剂调节(例如，抑制、增强)WARS2的表达，WARS2的活性或其组合。WARS2的活性包括WARS2与一个或更多个伴侣的相互作用(例如，结合)。例如，如本文所示，WARS2与WARS和γ-干扰素激活的翻译抑制剂(Gamma-interferonActivated Inhibitor of Translation，GAIT)复合体的蛋白质相互作用。与WARS2相互作用的GAIT复合体的蛋白质的具体实例包括谷氨酰基-脯氨酰基tRNA合成酶(EPRS)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和核糖体蛋白L13a(RPL13a)。因此，在一些方面，所述方法中使用的试剂调节WARS2与WARS、EPRS、GAPDH、RPL13a、或其组合的相互作用。

在本文提供的方法中可以使用多种试剂中的任一种。例如，所述试剂可以是核酸(例如，DNA、RNA)，小有机分子、抗体、适配体、突变体WARS2、或其组合。这样的试剂可以容易地例如根据本文示例的方法测试，以评估其是否对WARS2表达、WARS2活性或其组合具有期望的作用(例如抑制或激活/增强)。

在一些特定方面，所述试剂是结合于以下核酸的核酸：编码WARS2的全部或部分、调节WARS2表达、编码与WARS2相互作用(例如，结合)的多肽的全部或部分和/或调节与WARS2相互作用的多肽的表达。调节与WARS2相互作用的多肽的表达或WARS2本身的表达的这类核酸的实例包括小干扰核糖核酸(small interfering ribonucleic acid，siRNA)、反义、短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)、适配体和/或吗啉代寡聚体。在另一些方面，所述试剂是指导WARS2和/或与WARS2相互作用(例如结合)的多肽的表达的载体。在一个方面，所述试剂是指导WARS2过表达的载体。本领域技术人员容易获得适用于本发明之抑制性核酸的其它实例和设计此类核酸的方法。参见例如美国专利申请号20150017091。在一个特定方面，如本文所示例，所述试剂是降低或抑制WARS2表达的siRNA。在一个方面，针对WARS2的siRNA对是SEQ ID NO：50和51；SEQ ID NO：52和53；或SEQ ID NO：54和55。在另一个方面，针对Wars2的siRNA对是SEQ ID NO：48和49。

在另一些方面，所述试剂是直接或间接影响WARS2表达、WARS2活性或其组合的小有机分子。可以调节WARS2表达和/或WARS2活性的小有机分子可以使用标准方法并且如本文示例的任何测定中所述来实现。如果与对照相比，在存在所述试剂的情况下WARS2表达和/或WARS2活性被改变，则该试剂调节WARS2表达和/或WARS2活性。在一个方面，所述试剂是吲哚霉素或其任何有效的衍生物。

在另一些方面，所述试剂是直接或间接影响WARS2表达、WARS2活性或其组合的抗体。用于鉴定、分离和产生针对任何合适靶标的抗体及其活性片段的方法是完善建立的并且是本领域中已知的。除非上下文另有说明，术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且具体涵盖抗体(包括全长单克隆抗体)和抗体片段，只要它们识别并结合WARS2即可。抗体分子通常是单特异性的，但也可以描述为异种特异性或多特异性的。抗体分子通过特异性结合位点与抗原上的特异性抗原决定簇或表位结合。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般是其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。因此，在一个方面，所述试剂是结合WARS2并通过例如调节其与WARS的结合来调节其活性的抗体。在另一些方面，抗体可靶向并结合调节WARS2表达的蛋白质，从而间接调节WARS2。用于筛选抗体对WARS2表达或WARS2活性之作用的方法可以使用标准方法，并且如本文示例的任何测定中所述来实现。

制备多克隆抗体的方法是本领域技术人员容易获得的。参见，例如Green，等，Production of Polyclonal Antisera，于：Immunochemical Protocols(Manson，编辑)，1-5页(Humana Press)；Coligan，等，Production of Polyclonal Antisera in Rabbits，Rats Mice and Hamsters，于：Current Protocols in Immunology，section 2.4.1(1992)。制备单克隆抗体的方法同样对于本领域技术人员可得。参见，例如，Kohler&Milstein，Nature，256：495(1975)；Coligan，等，2.5.1-2.6.7节；和Harlow，等，于：Antibodies：A Laboratory Manual，726页(Cold Spring Harbor Pub.(1988))，其通过引用并入本文。单克隆抗体可以通过多种完善建立的技术从杂交瘤培养物分离和纯化。这样的分离技术包括用蛋白-ASepharose的亲和色谱法、尺寸排阻色谱法和离子交换色谱法。参见例如，Coligan，等，2.7.1-2.7.12节和2.9.1-2.9.3节；Barnes，等，Purification ofImmunoglobulin G(IgG)，于：Methods in Molecular Biology，第10卷，79-104页(HumanaPress(1992)。本领域技术人员也可获得单克隆抗体的体外和体内操作方法。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过由Kohler和Milstein，Nature 256，495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组方法制备，例如，描述于美国专利号4,816,567中的方法。用于本发明的单克隆抗体也可以使用Clackson等，Nature 352：624-628(1991)以及Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)中所描述的技术，从噬菌体抗体文库分离。另外，通过重组方法人源化单克隆抗体以产生含有人特异性和可识别序列的抗体是为公知的。参见综述Holmes等，J.Immunol.，158：2192-2201(1997)和Vaswani等，Annals Allergy，Asthma&Immunol.，81：105-115(1998)。

在另一个方面，所述试剂是直接或间接影响WARS2表达、WARS2活性或其组合的适配体。“适配体”指能够以高亲和力和特异性结合特定目的分子的核酸分子。通常通过使用称为SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，以指数富集的配体的系统演化)的已知的体内或体外选择技术开发适配体以结合特定的配体。制备适配体的方法描述于，例如，Ellington和Szostak，Nature 346：818(1990)，Tuerk和Gold，Science 249：505(1990)，美国专利号5,582,981，PCT公开号WO 00/20040，美国专利号5,270,163，Lorsch和Szostak，Biochemistry，33：973(1994)，Mannironi等，Biochemistry36：9726(1997)，Blind，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 96：3606-3610(1999)，Huizenga和Szostak，Biochemistry，34：656-665(1995)，PCT公开号WO 99/54506，WO 99/27133，WO 97/42317和美国专利号5,756,291。在本发明中适当时可以使用适配体以激活或抑制WARS2的表达，或直接结合WARS2以调节其活性。用于筛选和设计适配体的方法对于本领域技术人员是完善建立的和容易获得的。

在另一些方面，所述试剂是影响WARS2表达、WARS2活性或其组合的突变体WARS2。例如，如本文所述，具有L53F替换的WARS2突变体调节野生型WARS2与WARS的结合。因此，如果希望抑制WARS2活性(例如，抑制内皮细胞增殖，从而抑制血管发生；或抑制癌细胞增殖)，则可以使用已知的基因递送方法体内靶向携带WARS2的L53F突变体形式的载体(参见例如，美国专利号8,741,279和Ramamoorth M和Narvekar A.Non-viral vectors in genetherapy-an overview.J.Clin Diagn Res.2015年1月；9(1)：GE01-6.doi：10.7860/JCDR/2015/10443.5394.Epub 2015年1月1日)。在另一个方面，可以使用已知的靶向基因破坏方法在体内完全破坏肿瘤中的WARS2表达。

不希望受限于任何一种特定的作用机制，本文描述的数据表明WARS2通过一种或更多种机制充当内皮细胞增殖(并因此作为血管发生)的调节剂。例如，WARS2的抑制导致内皮细胞迁移和分裂所需的应力纤维的显著丧失。纤维的缺乏可抑制和/或排除内皮细胞增殖和血管形成(血管发生)；有不完全的核分离且看到细胞在G2/M期积累。无法分裂最终导致细胞死亡。类似地，由于不完全的细胞分裂，WARS2可以充当其它细胞类型例如癌细胞的增殖的调节剂。

此外，WARS2可通过不利地影响线粒体中的能量产生而发挥功能。当WARS2被抑制时，氧消耗显著降低。细胞迁移和分裂所需的能量损失类似地可能导致细胞不能分裂，停滞在G2/M期，并最终死亡。在这两种情况下，结果是在内皮细胞分裂和增殖以形成血管失败的情形下抑制血管发生。本文数据证明在抑制的WARS2存在下，内皮细胞管形成的显著减少。在癌细胞的情形下，结果是细胞死亡和癌细胞增殖的减少。

同样，不希望受限于任何特定的作用机制，本文描述的另一些数据表明WARS2通过与外泌体相互作用并抑制从外泌体分泌WARS而充当血管发生的调节剂。在本文所述的实验中，WARS2的功能获得降低WARS分泌。WARS分泌的减少预期对血管发生具有下游作用。

因此，在另一些方面，本发明涉及鉴定在有此需要的个体中肿瘤的血管发生潜力的方法。如本文所使用，肿瘤的“血管发生潜力”指由于渗透到肿瘤中的血管增殖，并且例如向肿瘤提供营养物和氧气，和/或从肿瘤移除废物，身体刺激肿瘤生长的能力。在一个特定方面，肿瘤的血管发生潜力指肿瘤侵袭(侵袭潜力)和/或转移(转移潜力)进入组织(例如，肿瘤位置附近或远端的组织)的能力。

在一个方面，所述方法包括确定相比于对照的从个体获得的一个或更多个胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)(例如一个或更多个外泌体)和/或其内含物中的WARS水平。与对照相比，一个或更多个EV和/或其内含物中的WARS水平的提高表明渗透进入肿瘤(例如，向其提供营养物和氧气和/或从其中移除废物)的血管增殖的可能性较低，因此，在所述个体中的肿瘤具有低血管发生潜力。与对照相比，一个或更多个EV和/或其内含物中的WARS水平的降低表明渗透进入肿瘤(例如，向其提供营养物和氧气和/或从其中移除废物)的血管增殖的可能性较高，因此，在所述个体中的肿瘤具有高血管发生潜力。所述方法还可以包括从所述个体获得一个或更多个EV和/或其内含物。

在一个特定方面，鉴定在有此需要的个体中肿瘤的血管发生潜力的方法包括从所述个体获得一个或更多个EV(例如，外泌体)和/或其内含物；以及确定相比于对照的所述一个或更多个EV和/或其内含物中的WARS水平。与对照相比，一个或更多个EV和/或其内含物中WARS水平的提高表明渗透入肿瘤的血管增殖的可能性较低，因此，所述个体中为具有低血管发生潜力的肿瘤。与对照相比，一个或更多个EV和/或其内含物中WARS水平的降低表明渗透入肿瘤的血管增殖的可能性较高，因此，所述个体中为具有高血管发生潜力的肿瘤。

如本文所使用，胞外囊泡(EV)是由(一个或更多个)细胞释放(例如分泌)的囊泡。在一些特定方面，EV是外泌体，其是约30-100nm的内吞来源的膜囊泡，由大多数细胞类型分泌(例如，体内；体外)。在另一些方面，EV是外泌体，其是约100-1000nm的内吞来源的膜囊泡，由大多数细胞类型分泌(例如，体内；体外)。EV也在体液(例如，血、尿、羊水、恶性腹水、支气管肺泡灌洗液、滑液和乳汁)以及组织中体内发现。获得和分析EV和一个或更多个EV的内含物的方法是本领域技术人员已知的，参见例如，Wang等，J Biol Chem，在线发表于2013年9月3日，其整体并入本文。在一些特定方面，所述一个或更多个EV是分离的、纯化的、基本纯化的和/或部分纯化的。

鉴定肿瘤的血管发生潜力的方法可以进一步包括获得包含一个或更多个EV的样品(生物样品)。样品可以从生物流体、生物组织或其组合获得。用于该方法的生物样品的实例包括生物流体(例如血、血清、尿、羊水、恶性腹水、支气管肺泡灌洗液、滑液、乳汁)和生物组织(例如器官组织、肿瘤组织)等。

鉴定肿瘤的血管发生潜力的方法还可以包括基于肿瘤的血管发生潜力治疗个体。例如，所述方法还可以包括用抗血管发生治疗和/或除抗血管发生治疗之外的治疗来治疗患有具有高血管发生潜力之肿瘤的个体。或者，所述方法还可包括用除了抗血管发生治疗之外的治疗(例如，不抑制血管发生的化疗剂)治疗患有具有低血管发生潜力之肿瘤的个体，或用抗血管发生治疗和除抗血管发生治疗之外的治疗来治疗所述个体。在某些方面，如果与对照相比，所述一个或更多个EV和/或其内含物中的WARS水平降低，则用有效量的抑制WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂治疗所述个体。对于本领域技术人员明显的是，多种对照可用于鉴定肿瘤的血管发生潜力的方法。在一个方面，对照是从一个或更多个没有肿瘤的个体获得的一个或更多个EV中的WARS水平(例如，在包含来自无肿瘤个体例如一个或更多个健康个体之EV的一个或更多个样品中)。

在本发明的另一个方面，提供了鉴定患有心血管病症之个体中的血管发生潜力的方法。如本文所使用，心血管病症的“血管发生潜力”指由于向心脏提供冠脉血流的血管增殖，身体调节(即，提高或降低)心血管响应的能力。

在一个方面，所述方法包括确定以对照相比的从患有心血管病症的个体获得的一个或更多个胞外囊泡(EV)(例如一个或更多个外泌体)和/或其内含物中的WARS水平。与对照相比，一个或更多个EV和/或其内含物中的WARS水平的提高表明所述个体中低的或降低的血管发生潜力，并因此指示进入心脏的低冠脉血流，这可导致例如心绞痛和心力衰竭。与对照相比，一个或更多个EV和/或其内含物中WARS水平的降低表明所述个体中高或提高的血管发生潜力，这可导致例如动脉粥样硬化增加。在某些方面，高或提高的血管发生潜力与作为脂肪细胞生长的结果的肥胖有关。所述方法还可以包括从所述个体获得一个或更多个EV和/或其内含物。

在一个特定方面，鉴定患有心血管病症的个体中血管发生潜力的方法包括从所述个体获得一个或更多个EV(例如，外泌体)和/或其内含物；以及确定与对照相比的所述一个或更多个EV和/或其内含物中的WARS水平。所述对照可以是从没有心血管病症的一个或更多个个体获得的一个或更多个EV中的WARS水平。

鉴定患有心血管病症的个体中血管发生潜力的方法还可以包括获得包含一个或更多个EV的样品(生物样品)。样品可以从生物流体、生物组织或其组合获得。用于该方法的生物样品的实例包括生物流体(例如血、血清、尿、羊水、恶性腹水、支气管肺泡灌洗液、滑液、乳汁)和生物组织(例如器官组织、肿瘤组织)等。

鉴定患有心血管病症的个体中血管发生潜力的方法还可以包括基于所鉴定的患有心血管病症的个体之血管发生潜力来治疗所述个体。例如，所述方法还可以包括用合适的治疗剂治疗患有与对照相比具有低或降低的血管发生潜力的心血管病症的个体，以减轻或预防心绞痛或心力衰竭。在另一个实例中，所述方法还可以包括用合适的治疗剂治疗患有与对照相比具有高或提高的血管发生潜力的心血管病症的个体，以减轻或预防动脉粥样硬化的影响。在某些方面，如果与对照相比，在一个或更多个EV和/或其内含物中WARS水平提高，则用有效量的增强WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂治疗个体以治疗例如心绞痛或心力衰竭。在其它方面，如果与对照相比，在一个或更多个EV和/或其内含物中WARS水平降低，则用有效量的抑制WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂治疗个体以治疗例如动脉粥样硬化的影响。

在另一些方面，本发明涉及确定有此需要的个体是否将受益于抗血管发生治疗的方法。所述方法包括对所述个体染色体1的全部或部分进行基因组分析，其中所述部分包含

TTCATATTCTGTCGAGACACCCATC[C/G]CCCTGTGTTTCACTTGTCTGATTAC(SEQ ID NO：38)，并检测在SEQ ID NO：38的26位处的至少一个等位基因。如果至少一个等位基因在SEQID NO：38的26位处是G，则所述个体将受益于抗血管发生治疗。在一些方面，所述个体中SEQID NO：38的26位处的一个等位基因是G，而另一个等位基因是C(所述个体对于26位处的等位基因是杂合的，G：C)。在另一些方面，所述个体中SEQ ID NO：38的26位处的两个等位基因均是G(所述个体对于26位处的等位基因是纯合的，G：G)。在另一些方面，所述个体中SEQ IDNO：38的26位处的两个等位基因均是C(所述个体对于26位处的等位基因是纯合的，C：C)。在一个特定方面，所述个体患有肿瘤。

包含SEQ ID NO：38的染色体1的部分包含基于由Genome Reference Consortium产生的人(Homo sapiens)的人2009年2月(GRCh37/hg19)集合之染色体1的119,503,593-119,504,093位。

多种基因组分析方法可用于确定个体是否将受益于抗血管发生治疗的方法中。这样的方法的实例包括测序分析(下一代测序)、电泳(凝胶、毛细管、温度梯度凝胶电泳)、聚合酶链式反应(高分辨率熔解分析)、质谱法、单链构象多态性(single strandconformation polymorphism，SSCP)、电化学分析(使用二茂铁基萘二酰亚胺)、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)(变性HPLC)、酶分析(限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、瓣状核酸内切酶(flapendonuclease)、引物延伸、5′-核酸酶、寡核苷酸连接)、杂交分析(动态等位基因特异性杂交、等位基因特异性寡核苷酸(allele-specific oligonucleotide，aso)分析、分子信标、微阵列(SNP微阵列))、错配结合蛋白、或其组合。

确定有此需要的个体是否会受益于抗血管发生治疗的方法还可以包括将来自所述个体SEQ ID NO：38的26位处的至少一个等位基因的检测与对照进行比较。可以使用任何合适的对照，包括存在于响应于抗血管发生治疗、不响应于抗血管发生治疗的一个或更多个个体或其组合中的等位基因。

确定个体是否将受益于抗血管发生治疗的方法还可以包括从所述个体获得样品(生物样品)。所述样品可以从生物流体、生物组织或其组合获得。用于所述方法的生物样品的实例包括生物流体(例如血、血清、尿、羊水、恶性腹水、支气管肺泡灌洗液、滑液、乳汁)和生物组织(例如器官组织、肿瘤组织)等。

确定个体是否将受益于抗血管发生治疗的方法还可以包括用抗血管发生治疗来治疗在SEQ ID NO：38的26位处具有至少一个为G的等位基因的个体。多种抗血管发生治疗是本领域技术人员已知的，包括抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)、VEGF受体-2(VEGF receptor-2，VEGFR)、血小板衍生生长因子(plateletderived growth factor，PDGF)、Tie-1受体(Tie-1receptor，Tie-1R)、Tie-2受体(Tie-2receptor，Tie-2R)、胎盘生长因子(placental growth factor，PlGF)、或其组合。

如本文所使用的，“个体”指动物，并且在一个特定方面是哺乳动物。哺乳动物的实例包括灵长类动物、犬、猫、啮齿类动物等。具体实例包括人、狗、猫、马、牛、绵羊、山羊、兔、豚鼠、大鼠和小鼠。

术语“有此需要的个体”指如研究者、兽医、医生或其他临床医生所确定的需要治疗或预防的个体。在一个实施方案中，有此需要的个体是哺乳动物，例如人。

根据本发明方法的施用的需要或期望通过使用公知的风险因素来确定。在最终分析中，由负责病例的医师确定(一种或更多种)特定试剂(例如组合物)的有效量，但取决于以下因素：如待治疗的确切病症和/或疾病、患者所患病症和/或疾病的严重程度、所选择的施用途径、患者可能伴随地需要的其它药物和治疗、以及医师判断中的其它因素。

向有此需要的个体施用有效量的调节WARS2的试剂。如本文所使用的，“有效量”或“治疗有效量”意指将在组织、系统、对象或人中引起所需生物或医学响应的活性组合物的量，其包括减轻所治疗的病症和/或疾病的全部或部分症状。

组合物可以以单剂量(例如，在一天中)或多剂量施用。此外，组合物可以在一天或更多天(例如，连续几天或不连续几天)内施用。

调节WARS2表达和/或WARS2活性的核酸可以通过本领域技术人员已知的多种方法在体外和体内递送至细胞，包括与细胞直接接触(例如，“裸”siRNA)或通过与一种或更多种促进靶向或递送到细胞中的试剂组合。这样的试剂和方法包括脂复合物(lipoplexe)、脂质体、离子电渗疗法、水凝胶、环糊精、纳米胶囊、微球和纳米球、以及蛋白质载体(例如，Bioconjugate Chem.(1999)10：1068-1074和WO 00/53722)。核酸/载剂(vehicle)组合可以通过直接注射或通过使用输注泵在体内局部递送。核酸可以通过多种手段包括静脉内、皮下、肌内或皮内注射或者吸入在体内递送。

包含含有聚(乙二醇)脂质(PEG修饰的或长循环脂质体或隐形脂质体)之表面修饰脂质体的组合物的用途也是公知的。这些制剂提供通过防止其聚集和融合以提高脂质体或脂复合物溶液稳定性的方法。所述制剂还具有在体内的抵抗调理作用和通过单核吞噬系统(mononuclear phagocytic system，MPS或RES)消除的附加益处，从而使得包封的药物具有更长的血液循环时间和增强的组织暴露性。这样的脂质体也已示出在肿瘤中选择性地积累(Lasic等，Science 1995，267，1275-1276；Oku等，1995，Biochim.Biophys.Acta，1238，86-90)。长循环脂质体增强DNA和RNA的药代动力学和药效动力学。长循环脂质体还保护siRNA免受核酸酶降解。

调节WARS2表达和/或WARS2活性的核酸试剂可以配制为药物组合物。所述药物组合物可单独或与其它试剂组合用作药物或诊断剂。例如，本发明的一个或更多个siRNA可以与递送载剂(例如脂质体)和赋形剂(如载体、稀释剂)组合。脂质介导的核酸递送方法是公知的(参见例如美国专利申请号20150017091)。也可以添加其它试剂如防腐剂和稳定剂。用于递送核酸分子的方法是本领域中已知的，并且例如在Akhtar等，1992，Trends CellBio.，2，139；Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics，ed.Akhtar，1995，Maurer等，1999，Mol.Memb.Biol.，16，129-140；Hofland和Huang，1999，Handb.Exp.Pharmacol.，137，165-192；和Lee等，2000，ACS Symp.Ser.，752，184-192，美国专利号6,395,713和PCT WO 94/02595中描述。核酸也可以与其它治疗化合物组合施用(分开或同时施用)，例如作为组合的单位剂量。在一个实施方案中，本发明包括包含在生理学/药学上可接受的赋形剂(如稳定剂、防腐剂、稀释剂、缓冲液等)中的一个或更多个根据本发明之核酸(例如siRNA)的药物组合物。

可以将包含调节WARS2表达和/或WARS2活性的试剂的药物组合物与生理学上可接受的载体或赋形剂一起配制以制备药物组合物。所述载体和组合物可以是无菌的。所述制剂应适合于施用方式。

合适的可药用载体包括但不限于水、盐溶液(例如NaCl)、盐水、缓冲盐水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯树胶、植物油、苄醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、葡萄糖、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，以及其组合。如果需要，药物制剂可与不与活性化合物有害地反应的助剂，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色、矫味和/或芳香物质等混合。

如果需要，所述组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。所述组合物可以是液体溶液、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末。所述组合物可以配制成栓剂，使用传统的粘合剂和载体例如甘油三酯。经口制剂可以包含标准载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

调节WARS2表达和/或WARS2活性的药剂也可作为与其它化合物的联合疗法的一部分施用(例如，血管内皮生长因子(VEGF)；VEGF抑制剂如WARS、VEGF受体-2(VEGFR)、血小板衍生生长因子(PDGF)、Tie-1受体(Tie-1R)、Tie-2受体(Tie-2R)、YARS1(微Yars1)(Ewalt和Schimmel，Biochem，41(45)：13344-13349(2002))；胎盘生长因子(PlGF)、或其组合)。

所述试剂可以根据常规程序配制为适合施用于人的药物组合物。例如，用于静脉内施用的组合物通常是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。如果需要，该组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂以缓解注射部位的疼痛。一般地，成分以单位剂型单独或混合在一起提供，例如作为在密封容器如指示活性化合物量的安瓿或小药囊中的干的冻干粉末或无水浓缩物。当组合物通过输注施用时，其可以用含有无菌药物级水、盐水或葡萄糖/水的输注瓶分配。当组合物通过注射施用时，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿，以使得可以在施用之前混合成分。

化合物以治疗有效量施用。在治疗特定疾病或病症中治疗有效的化合物的量将取决于所述疾病或病症的性质，并且可以通过标准临床技术确定。此外，可以任选地使用体外或体内测定来帮助鉴定最佳剂量范围。在制剂中使用的精确剂量还将取决于施用途径和血管发生疾病、血管疾病、心脏病或循环系统疾病之症状的严重性，并应根据医师的判断和每个患者的情况决定。有效剂量可以从来自体外或动物模型测试系统的剂量-响应曲线推断。

在另一个方面，本发明涉及鉴定调节WARS表达和/或WARS活性的试剂的方法。所述方法包括测定从已经与待评估的试剂接触的细胞、组织和/或生物体获得的一个或更多个EV(例如，外泌体)中的WARS表达和/或WARS活性；并且将所述WARS表达和/或WARS活性与对照进行比较，其中如果在所述试剂存在下与所述对照相比，所述WARS表达和/或WARS活性被改变，则所述试剂调节WARS表达和/或活性。所述方法还可包括使细胞、组织和/或生物体与待评估的试剂接触。所述方法还可以进一步包括从已经与待评估的试剂接触的细胞、组织和/或生物体获得一个或更多个EV。

在一个特定方面，本发明涉及鉴定调节WARS表达和/或活性的试剂的方法，其包括使(一个或更多个)细胞、组织和/或生物体(其包含一个或更多个EV如外泌体)与待评估的试剂接触；在与所述试剂接触后从所述细胞、组织和/或生物体获得一个或更多个EV；确定在与所述试剂接触后从所述细胞、组织和/或生物体获得的一个或更多个EV中的WARS表达和/或活性；并且将所述WARS表达和/或活性与对照进行比较。如果与对照相比，在存在所述试剂的情况下WARS表达和/或活性被改变，则所述试剂调节WARS表达和/或活性。

EV的WARS表达的确定包括确定在EV内表达或从EV分泌的WARS的量。EV的WARS活性的确定包括确定WARS是否从EV分泌，以及WARS是否与WARS2相互作用(例如，结合于；缔合于)或者其程度。

在一些方面，与对照相比，在与试剂接触后EV的WARS表达和/或活性降低。在另一些方面，与对照相比，在与试剂接触后EV的WARS表达和/或活性提高。

对于本领域技术人员明显的是，在本发明的方法中可以使用多种对照。合适对照的一个实例是从未与试剂接触的细胞、组织和/或生物体获得的一个或更多个EV中的WARS表达和/或活性。

在一些方面，与待评估的试剂接触的细胞、组织和/或生物体可来自相同的个体。在另一些方面，细胞、组织和/或生物体可来自相同物种的不同个体。在另一些方面，细胞，组织和/或生物体可来自不同的物种。

实施例

实施例1

鉴定作为冠脉血流和毛细血管密度之新基因的WARS2

方法

大鼠亲本品系

研究了四种亲本品系：包括自发性高血压大鼠(SHR)作为高血压品系，而包括棕色挪威(BN)，Wistar Kyoto(WKY)和Lewis作为正常血压对照品系。以两只动物/天的速度对12至14周龄的雄性大鼠进行表型分型。所有大鼠均购自Charles River UK Limited(Margate，UK)。

BN-SHR F2群

通过单配交配系统繁殖大鼠。BN雌性与SHR雄性杂交以产生BN X SHR(BXH)Fl动物，并进行交互杂交以获得SHR x BN(HXB)动物。F1 BXH动物互交以产生F2BXH动物，并将F1HXB动物互交以产生F2 HXB动物。将动物保持在伦敦帝国学院的中央生物医学服务设施，并且每笼最多容纳5只。动物可随机接近标准大鼠食物和无菌水。除了繁殖目的，根据性别分隔动物。它们通过自动光切换保持12小时的日循环。通过使用保存在独立笼中的岗哨动物(sentinel)定期测试特定病原体的集落。所有程序根据1986年的英国动物(科学程序)法案(UK Animals(Scientific Procedures)Act)进行。

血压(blood pressure，BP)

在心脏切除用于离体表型分型前，在每只动物中使用颈动脉插管测量BP。使用超小型2mm压力导管(MPVS-Ultra Single Segment Foundation System(超单段基础系统)，ADI仪器)。在测量之前，对外部压力计校准压力导管。之后使用吸入的4％异氟烷麻醉动物。暴露颈动脉区域，进行动脉切开术并将导管放置到位。然后通过LabchartPro软件(ADI仪器)连续捕获数据并离线分析。在颈动脉插管之后，吸入的异氟烷的浓度从4％逐渐降低至1.5％，以允许BP达到生理水平。在记录BP数据之后，从血管中取出压力导管，然后在CF测量之前将其打结。

冠脉血流(coronary flow，CF)

使用Langendorff制剂测量CF。切除后，将心脏立即置于冰冷的Kreb缓冲液中，并转移至离体灌注装置。通过动脉夹将主动脉夹在套管上，并使用3/0丝固定。用改良的Krebs-Henseleit缓冲液灌注心脏，如Sutherland和Hearse所建议制备。将该溶液保持在37℃的夹套储器中，并持续用卡波金溶液(95％氧气，5％CO₂)充气以保持pH为7.35-7.45。在心脏切除后不超过三分钟内建立灌注。移除左心房(left atrium，LA)，并将充满流体的乳胶球放置在左心室(left ventricular，LV)腔中。LV收缩(LV dP/dtmax)和LV舒张(dP/dtmin)来自LV压力。将同轴双极电极放置在右心房上，并以每分钟360次开始起搏。将电极置于右心房和左心室上以记录连续的心电图。将整个制备物保持在维持37℃的容器内。将灌注液以恒定体积泵送到心脏，灌注压力为90mmHg。通过在靠近心室的组件中放置的在线超声波流量计测量CF，带有防止心脏空气栓塞的气泡捕集器。通过LabchartPro软件(ADI仪器)持续捕获血液动力学数据，并在实验后离线分析。在基线处研究分离的心脏制备物15分钟。这之后是短暂的一分钟全局缺血和再灌注，以评估最大充血。随后通过近端LAD的连接诱导心肌梗塞35分钟，然后再灌注一小时。在基线和前10分钟的再灌注期间收集心脏洗脱物以测量代谢物水平。

基因表达数据

对于F2大鼠的亚组，在CF测量后分离来自F2大鼠的非缺血性LV，并储存在-80℃以用于基因表达分析。使用Maxwell 16系统RNA纯化试剂盒(Southampton Science Park，Southampton，UK)将总共118个RNA样品以12个批次处理。在每个样品中，对于每25μg组织添加200μL裂解物，并且将样品均质化直到不能看到固体样品。然后将200μL样品裂解物在400μL RNA稀释缓冲液中稀释，并涡旋以确保完全溶解。将50μL澄清剂添加至样品裂解物以在70℃下结合DNA。然后冷却澄清剂-样品混合物，并在12,000rpm下离心2分钟。将底部相置于Maxwell机器人中，得到最终在无RNA酶的水中的40μL RNA样品。然后使用NanoDrop评估RNA纯度。使用Agilent 2100生物分析仪平台评估RNA完整性，并丢弃RNA完整性数值＜8的样品。

使用Affymetrix Rat GeneChip 1.0ST测量表达。然后通过减去具有相同GC含量的背景探针的平均值对原始探针强度进行背景校正。然后将VSN归一化步骤(Huber等)应用于数据，并且使用中值平滑来汇总每个转录本的探针组表达。

基因型数据

使用在Maxwell 16系统上的机器人DNA提取，从尾组织样品提取来自F2群的DNA。使用NanoDropTM和Invitrogen的Quant-it测定评估DNA的数量和质量。使用Illumina的GolgenGate测定在定制的基因分型珠芯片上进行高通量基因分型。从STAR联盟(http：//rgd.mcw.edu/)获得16,543个BN-SHR SNP，并且基于SHR基因组序列检索每个SNP周围的160bp序列(Atanur等，GenomeRes，20：791-803(2010))。SNP及其周围序列提交给Illumina进行生物信息学评估，并归于质量评分。然后选择在基因组上均匀分布且质量评分为0.95或更高的768个SNP以构成珠芯片。杂交和成像后，使用GenomeStudio软件和GenCall算法调用基因型。将亲本和F1样品添加至F2样品作为基因分型质量(亲本-亲本-子代误差/P-P-C)的对照；样品重复也被置于珠芯片上以估计再现性误差。排除具有不良簇分离、降低的平均归一化强度(R＜0.2)或低MAF(MAF＜0.1)的SNP。示出显著偏离Hardy Weinberg平衡(P＜10-3)的SNP也被排除。基因型过滤后，P-P-C精度为约97％，且复制误差率估计为约0.01％。总体调用率为93％。使用具有默认设置的fastPhase和两个奠基者(founder)单倍型推算缺失的基因型。

冠脉血流作图

使用HESS的matlab应用对冠脉血流QTL作图。所有6个冠脉血流表型(平均值和最大值，3个时间点)均包括在模型中作为因变量。在分析之前除去高LD(r2＞XX)中的标志物，并且在模型中使用SNP基因型作为回归量。默认参数用于层次演化随机搜索(HierarchicalEvolutionary Stochastic Search，HESS)。需要0.8的边际后验概率来通过SNP鉴定表型的遗传调节。通过取得由HESS选择的标志物周围的两个标志物之间的范围，获得相应的单倍型。

eQTL作图

使用ESS++程序对eQTL作图。模型中包括通过F2中的微阵列测量的三个mRNA表达水平作为因变量，并且基因型用作回归量。

结果

本研究将WARS2鉴定为冠脉血流和毛细血管密度的新基因。冠脉血流的遗传控制是未知的。本文描述的是使用与描述于McDermott-Roe等，Nature，478：114-118(2011)；Petretto，等，Nat Genet，40：546-552(2008)的方法相似的方法在大鼠中的大规模F2互交实验中对其的研究。

使用Langendorff制剂在棕色挪威-自发性高血压大鼠(BN-SHR)F2群中的172只大鼠的三个时间点测量冠脉血流。研究了广泛接受的在大鼠群中冠脉血流的决定因素的作用。虽然发现左心室松弛压((dp/dt)min)对冠脉血流的强烈作用(r＝-0.34，p＝4.6×10^-6)，但未观察到收缩或舒张血压的作用(分别p＝0.19和p＝0.36)，这表明调节大鼠群冠脉血流的血压非依赖性机制。

使用HESS(Bottolo等，Genetics，189：1449-1459(2011))在三个不同时间点对最大和平均冠脉血流作图。通过利用这些表型之间的相关性结构，HESS联合模拟多个表型。

观察到在基础水平、缺血后和梗死时测量的冠脉血流与位于大鼠染色体2q34上的单个基因座的强烈且一致的关联(如图1所示)。单倍型限制的上限源自两个相邻标志物的位置，表明致病性遗传变体可位于189.3和194.5Mb之间。

来自BN和SHR左心室组织中的RNA-seq分析在该区域中鉴定了42个表达的基因，其中三个具有显著的eQTL(图1)。发现两个基因Wars2和组织蛋白酶-S(Cathepsin-S)具有非同义变异。组织蛋白酶S在部分保守的蛋白质位点处具有变异，并且在心脏中低表达。另一方面，Wars2是在心脏中高度表达的线粒体氨酰基tRNA合成酶(aARS)，并且是核编码的和线粒体定位的；其将色氨酸转移至其同源tRNA。

许多aARS(酪氨酸ARS(YARS)，丝氨酸ARS(SARS)，细胞质色氨酸ARS(WARS))在演化过程期间在血管发生中获得了非典型的功能，并且WARS的切割产物已经示出抑制VEGF信号传导。因此，将Wars2优先作为大鼠2q34基因座处控制冠脉血流的候选基因。

小毛细血管的阻力极大地控制心脏中的血流量。检查了在互交中和对基因型条件化(condition)的F2互交动物中基因座的毛细血管密度，并且发现基因座的显著效应(P＝1.3x 10^-13)(见图2)。

实施例2

WARS2的表征及其与WARS的相互作用

材料与方法

抗L13a和膜联蛋白A来自Cell Signaling。Alexa-488/568山羊抗小鼠/兔IgG来自Molecular Probes。抗VEGF和GAPDH来自Santa Cruz，所有其他抗体来自Abcam。在用KMSKSD PDK LAT VC(SEQ ID NO：15)或CIL TSM KKV KSL RDP S(SEQ ID NO：16)肽免疫接种兔后获得多克隆抗WARS2兔抗血清。使用Eurogentec(England)的相应肽产生并色谱纯化它们。使用Quikchange II定点诱变试剂盒(Stratagene)根据制造商的说明使用含有具有C-末端myc-DDK或GFP的人WARS2 cDNA的质粒构建体(Origene)作为模板产生L53F突变体WARS2 cDNA。通过核苷酸测序验证L53F。腺病毒(Ad-GFP，Ad-WARS2)购自SignaGenLaboratories。从由人HUVEC细胞提取的RNA合成人WARS cDNA，并且使用引物PCR扩增编码区，所述引物在正向引物中含有EcoRI和Kosac序列，且在反向引物中含有flag序列和XbaI。验证序列后，将WARS克隆到pLVX-EF1a-IRES-Puro(Clontec)中。

细胞培养、转染和腺病毒转导

将人胚胎肾(human embryonic kidney，HEK)293细胞维持在补充有10％胎牛血清和100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中。人脐静脉内皮(HUVEC)细胞和培养基(EBM单季铵盐(single Quats)和EBM-2单季铵盐)购自Lonza并在第7代之前使用。对于质粒转染(用于HEK293)，在70％汇合前一天接种细胞，并根据公司的说明使用lipofectamine 200(InvitroGene)转染试剂。对于HUVEC转染，根据公司的说明使用Polyplus jetPEI-HUVEC转染试剂(POLYPLUS-TRANSFECTION Inc.New York)。对于基因转移，在6孔板或T75烧瓶中将HUVEC培养至80％汇合。在HUVEC生长培养基中在1ml(6孔板)或10ml(T75烧瓶)的总体积中以200个噬斑形成单位(plaque-forming unit，pfu)的感染复数(multiplicity ofinfection，MOI)进行细胞的转导。感染后24小时，将细胞在含有1％FBS的培养基中孵育1小时，然后补充500U/ml人重组IFN(R&D Systems)另外孵育24小时，之后处理以用于分析。

用于酶测定的GST融合蛋白

将WARS2和WARS2(L53F)cDNA克隆到市售载体(见表)中，使用IPTG诱导进行表达并使用标准测序基于GSH珠进行纯化。使用标准孔雀石绿测定(Cayman chemicals)对纯化的蛋白质进行定量。

从培养的细胞提取RNA

使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)根据制造商的说明提取总RNA。简言之，将细胞裂解于350μl RLT缓冲液中并应用于Shedder柱(Qiagen)，并以14,000rpm旋转1分钟。将裂解物与等体积的70％乙醇混合并且应用于RNeasy柱，然后将其离心并使用提供的RW1和RPE缓冲液洗涤。最后，在体积为30μl的无RNA酶的水中洗脱总RNA，并使用Nanodrop 1000(Thermo Fisher Scientific)通过在260nm处测量吸光度来定量。将RNA储存在-80℃直至需要。

定量实时PCR(QPCR)分析和WARS剪接PCR

使用iScript第一链cDNA合成方案(Bio-Rad)逆转录总RNA(1μg)。使用SYBR GreenJumpStart Taq ReadyMix(S4438，Sigma)，在20μl反应中对所得cDNA(1μl)进行QPCR，并在7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems)上运行。在每组至少三个独立实验中使用每个siRNA处理的三个独立6孔培养物，且每个样品一式两份地运行。使用2-ΔΔCT法分析所有数据。

表1.引物序列

为了检测WARS剪接变体，在50μl PCR反应中使用1μl WARS的cDNA和28S的1/20稀释的cDNA，并使用24次循环(根据QPCR中的解链曲线确定)。

蛋白质提取和Western印迹

在含有蛋白酶抑制剂(Sigma)和磷酸酶抑制剂(Halt磷酸酶抑制剂混合物，ThermoScientific)和PMSF(0.5mM，Active Motif)的细胞裂解缓冲液(9803，Cell Signaling)中裂解细胞。然后将细胞裂解物短暂超声，并在14,000g(4℃)下离心10分钟。保留上清液，并使用用牛血清白蛋白标准物的二辛可酸测定来测定蛋白质浓度。在10％或13％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质样品(20μg)，转移至硝酸纤维素膜，并如图例所述用抗体探测。使用过氧化物和LumiGlo试剂(Cell Signaling)，用辣根过氧化物酶缀合的二抗显现免疫反应条带。

siRNA介导的WARS2敲低

将HUVEC细胞接种在6孔板中。24小时后，根据制造商的说明，使用DharmaFECT-1(Thermo Scientific)用WARS2靶向的ON-TARGETplus SMARTpool转染细胞。对于给定的转染，将24μl DharmaFECT1和476μl opti-MEM(Invitrogen)在一个管中混合，同时将5μl的上述WARS2靶向或乱序的(scrambled)对照siRNA(20μM)与490μl opti-MEM在第二个管中混合。在室温下孵育5分钟后，将上述溶液混合，并在室温下再放置20分钟，然后添加至细胞。最终的siRNA浓度为25nM。转染后2天通过QPCR评估敲低效力，发现为至少85％。虽然我们制备的两种抗WARS2抗体可以检测来自表达WARS2-flag的细胞之裂解物中的WARS2，但是由于没有针对WARS2的抗体可以检测内源WARS2，所以通过western印迹不能确定敲低效力。

免疫荧光

将细胞以约80％汇合度接种到灭菌的盖玻片上。对于免疫荧光分析，将细胞在室温下在3％(w/v)多聚甲醛中固定15分钟，并在含有0.3％TritonX100的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中透化4分钟，并在含有1％(w/v)牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBS中封闭。将细胞与一抗孵育1小时(稀释1/40-100)，然后用Alexa 488/568缀合的山羊抗小鼠/兔IgG(高度交叉吸收；稀释1/100)孵育1小时，两者均在环境温度下进行。将盖玻片用含有DAPI的Vectashield抗褪色封片介质(Vector Laboratories Inc.)封片在载玻片上。使用60x油物镜在Leica共焦显微镜上观察细胞，并使用Leica共聚焦软件(LeicaMicrosystems(UK)Ltd，Milton Keynes，UK)分析图像。

L53F和野生型WARS2和WARS慢病毒的制备

使用EcoRI/XbaI位点，将用flag或GFP标记的WARS2(WT和L53F)或WARS-flag的cDNA亚克隆到pLVX-EF1α-IRES-zs Green(目录号631982，Clontec)或pLVX-EF1α-IRES-mCherry(目录号631987Clontec)或pLVX-EF1α-IRES-Puro载体(目录号632183，Clontec)中。根据制造商的方案(Clontec)，使用Lenti-X HTX包装系统(631247)在Lenti-X 293T细胞中产生特定病毒。

用于产生Wars cDNA的引物

F：gggaattcgccgccgcgatcgcCAAAGGATGAAATTGATTCTGCAGT(SEQ ID NO：25)(EcoRI，Kosac)

R：GctctagattacttatcgtcgtcatccttgtaatcCTGAAAGTCGAAGGACAGCTT(SEQ ID NO：26)(XbaI，flag).

用于产生Wars2-FLAG的引物

正向：GGGAATTCGTCGACTGGATCC(SEQ ID NO：27)

反向：GcteagaGCCGGCCGTTTAAACCTTATCG(SEQ ID NO：28)(XbaI)

用于产生Wars2-GFP的引物

正向：GGGAATTCGTCGACTGGATCC(SEQ ID NO：29)

反向：5′-GCtctagaGCCGGCCGTTTAAACTCTTTCT-3′(SEQ ID NO：30)(XbaI)

线粒体分级和外泌体分泌

为了分离胞质和线粒体，根据使用说明书使用线粒体分级试剂盒(ActiveMotif)。使用针对线粒体蛋白复合体I的抗体(Mitoscience)或可溶性胞质蛋白质微管蛋白(Sigma)的抗体来验证线粒体和胞质级分的纯度。使用试剂盒(Invitrogen，4478359)根据制造商的说明从HUVEC裂解物产生外泌体集合物。

免疫沉淀和质谱法

对于免疫沉淀，在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(Halt磷酸酶抑制剂混合物，Thermo Scientific)和PMSF(0.5mM)的裂解缓冲液(cell singaling)中制备细胞裂解物。根据公司的方案，将抗FLAG M2亲和凝胶(Sigma)用于纯化Wars2flag标记的蛋白质。在洗脱之前，用在PBS中的0.5％NP40洗涤蛋白质珠，然后在50mM碳酸氢铵中洗涤三次，并且在50mM碳酸氢铵中的200μg/mL FLAG肽(3xflag肽，Sigma)中洗脱结合的蛋白质。使用全溶液消化法的全定性加定量分析进行质谱法。

结果

在HEK细胞中WARS2和WARS2(L53F)定位于线粒体

WARS2是核编码的、线粒体定位的aARS。检查了人WARS2和突变的人WARS2(L53F)的定位，其具有与大鼠中相同的氨基酸变化。突变体和野生型均定位于线粒体(本文在图3中示出)。

WARS2与WARS结合，但突变体WARS2(L53F)不结合

aARS可以与它们自身和彼此形成影响其功能的更高度阶寡聚化。测试了WARS2是否结合其具有已知抗血管发生功能的胞质对应物WARS。发现在HUVEC细胞中WARS2与WARS结合。该作用被L53F突变减少(如图4所示)。

WARS2表达影响WARS分泌，其为一种在蛋白质水平介导的作用

WARS片段通过结合VE-钙黏着蛋白具有抗血管发生活性。不清楚WARS分泌的调节。WARS2过表达抑制WARS分泌，而WARS2基因沉默增加的WARS分泌。这种作用在蛋白质水平介导，并且没有发现与剪接或转录作用相关。

培养HUVEC细胞，并用编码WARS2的腺病毒感染或用针对WARS2的siRNA转染。在所有实验中使用对照病毒和siRNA。与对照相比，WARS2功能获得降低了WARS分泌。与对照相比，WARS2功能丧失增加了WARS分泌(见图5)。总之，这些数据示出WARS2调节将对血管发生具有下游作用的WARS分泌。虽然已知WARS转录由IFN-γ刺激增加并且存在WARS的可变剪接，但是在本文中没有示出WARS2对这些事件的作用(见图6A)。因此，WARS2对WARS的作用处于蛋白质水平。

WARS和WARS2相互作用的细胞定位

WARS主要是胞质蛋白质，但WARS的组分是线粒体定位的，并且在HUVEC中干扰素(IFN)-γ刺激后该亚库增加。

本文证明了WARS和WARS2之间的相互作用。在亚细胞分级实验中，在线粒体中检测到WARS，并且该亚库在IFN-γ刺激下增加。因此，预期该蛋白质-蛋白质相互作用发生在线粒体级分中，并且该线粒体级分可能在WARS从细胞分泌中起作用(参照图6B)。

WARS2与GAIT复合体的组分相互作用

为了进一步了解WARS2的蛋白质-蛋白质相互作用，进行了质谱法(massspectrometry，MS)。在本文的实验中，MS数据表明WARS2与EPRS(一种aARS)、GAPDH和RPL14a相互作用。这些蛋白质与NSAP1一起定义了GAIT复合体，其通过结合靶基因的3’UTR对于控制VEGF和炎性基因的蛋白质表达是重要的。

MS数据单独是不确定的，因为在这种类型的实验中鉴定了许多相互作用，并且需要下游证实。为了证实该相互作用，用WARS2和WARS2(L53F)突变体进行co-IP实验。记录到了WARS2(而非L53F突变体)与EPRS、GAPDH和RPL14a的相互作用(如图7所示)。

此外，如本文所示，WARS2的过表达通过将RPL14a靶向蛋白酶体而引起RPL14a的显著损失，这种作用可被蛋白酶体抑制剂MG132逆转(参照图8)。

这些数据示出，WARS2在控制VEGF活性方面在第二水平上起作用，这里通过调节GAIT复合体的活性起作用，该复合体除了控制许多细胞因子和趋化因子(例如，CXCL13、CCL22、CCL8和CCR3)的翻译外，还控制VEGF的翻译。

WARS经由外泌体/微囊泡途径进行非典型分泌

先前的研究已经示出WARS被分泌，但是分泌途径却是非典型的，且没有被表征。在HUVEC细胞中检查布雷菲德菌素A(抑制高尔基体介导的分泌的试剂)对WARS分泌的作用。如前所述，没有观察到作用。进一步的研究示出WARS分泌在外泌体中，该作用被WARS2抑制(图9)。这定义了在外泌体中WARS的新分泌途径。

实施例3

在斑马鱼中WARS2的功能丧失导致受损的血管发生和受损的心脏功能

方法

使用标准方法进行在斑马鱼中的吗啉代实验和斑马鱼血管形成的成像。

结果

为了检查Wars2对血管发生和心脏的体内作用，使用针对Wars2第一密码子的吗啉代抑制斑马鱼中Wars2的活性。对鱼形态和存活有显著作用，这是由于血管形成和心脏功能的缺陷，总结在图10-12中。

实施例4

人胚肾(HEK)293细胞中的siWARS2敲低

方法

在转染前一天将HEK细胞接种在10cm培养皿上。在约50％的密度下，使用RNAimax(制造商的方案)进行转染。通过使用120nM siRNA和20μl lipofectamin RNAimax在1mlOPTIMEM中的混合物制备siRNA。将细胞孵育，用PBS洗涤1X，然后用5ml OPTIMEM覆盖，并滴加lipofectamin/siRNA混合物。将细胞孵育(6小时)，然后将培养基更换为(DMEM/10％FBS)。按照方案(Qiagen)提取RNA。使用Nanodrop评估RNA定量，并基于OD比260nm/280um确定质量。使用1μg RNA(Biorad iScript TM cDNA合成方案)进行逆转录并使用QuantiFASTSYBR green方案进行QPCR。

用于人WARS2的引物

F GCCACCGTCCGAATAACAGA(SEQ ID NO：31)

R CATGCACCGCCACTATGTTG(SEQ ID NO：32)

用于人GAPDH的引物

F GGAGTCAACGGATTTGGTCG(SEQ ID NO：33)

R ATCGCCCCACTTGATTTTGG(SEQ ID NO：34)

循环条件：

95C 5分钟

95C 10秒]

60C 30秒]40x

95C 15秒

60C 1分钟

一式两份地分析所有样品，并测定平均值和标准偏差。通过范围为60-95℃的解链曲线确定扩增的特异性。使用标准ddCt法进行以GAPDH的归一化。

实验重复5次，以下结果如表2(和图15)所示。

表2.在HEK 293中siWAR2敲低的结果

实验	1	2	3	4	5	平均	标准偏差
								非靶向对照	1	1	1	1	1	1	0
siRNA 1	0.26	0.13	0.18	0.13	0.14	0.17	0.05
								siRNA 2	0.47	0.14	0.13	0.11	0.09	0.19	0.14
siRNA 3	0.43	0.22	0.43	0.37	0.30	0.35	0.08

WARS2 siRNA1：

正义：5′-GCAUUCAACCUACAGGAAU-3′(SEQ ID NO：50)

反义：5′-AUUCCUGUAGGUUGAAUGC-3′(SEQ ID NO：51)

WARS2 siRNA2：

正义：5′-CCGACAUUCUGUUGUACAA-3′(SEQ ID NO：52)

反义：5′-UUGUACAACAGAAUGUCGG-3′(SEQ ID NO：53)

WARS2 siRNA3：

正义：5′-GCUGGACAAGGACCAUUUA-3′(SEQ ID NO：54)

反义：5′-UAAAUGGUCCUUGUCCAGC-3′(SEQ ID NO：55)

这三个siRNA序列对分别靶向下述WARS2序列的区域。在一些方面，siRNA序列在siRNA对的正义链和反义链二者的3’末端均包含额外的胸腺嘧啶(T)，以提高siRNA对细胞内核酸酶活性的抗性。在一个特定方面，siRNA正义链和反义链在3’末端包含两个T(TT)。

siRNA1靶标 GCATTCAACCTACAGGAAT(SEQ ID NO：35)

siRNA2靶标 CCGACATTCTGTTGTACAA(SEQ ID NO：36)

siRNA3靶标 GCTGGACAAGGACCATTTA(SEQ ID NO：37)

图14显示了WARS2的cDNA，其指示了三种siRNA靶向的位置，如上所述。

实施例5

与更高WARS2表达相关的WARS2 SNP控制人血浆中的WARS水平

WARS ELISA

使用ELISA测定人血浆中的WARS并与WARS2的SNP基因型(rs984222)进行比较。根据制造商的说明(ABIN366223；Antibodies-online GmbH，Aachen，Germany)使用ELISA测定血浆中的WARS水平。从健康志愿者收集血浆，等分并储存在-70℃。每次测量使用100μl未稀释的血浆。一式两份进行标准曲线，并确定检测极限为0.078ng/ml。在微板读数器(uQuant；Biotek Instruments，UK)上读取450nm(在540nm校正)下的OD。

WARS2 SNP测定

在WARS2 SNP测定中使用了SNP ID：rs984222。

测定：Life Technologies测定ID：C__8699051_10

使用的系统：Life Technologies Stepone plus rtPCR

表3.PCR条件：

荧光序列：

TTCATATTCTGTCGAGACACCCATC[C/G]CCCTGTGTTTCACTTGTCTGATTAC(SEQ ID NO：38)

VIC染料C核苷酸，FAM染料G核苷酸

本研究探究了WARS2 SNP RS984222，其具有C/G颠换替换的多态性。为了研究健康志愿者组中这种多态性的比率，使用了Life Technologies的预制测定(测定ID：C__8699051_10)。该测定使用VIC/FAM染料混合物来测定存在的SNP。该测定使用LifeTechnologies Stepone Plus在实时PCR上进行，并用Stepone Plus软件v2.1进行分析，其产生等位基因鉴别图以确定SNP。

结果

数据示出，控制WARS2表达的WARS2 SNP也控制人血浆中的WARS水平。如本文所示，提高的WARS2表达降低了WARS分泌。使用夹心ELISA方法(参见上述方法部分)，确定与多种组织(包括脂肪)中更高水平的WARS2表达相关的WARS2 SNP rs984222是否与人血浆中WARS的循环水平降低有关。这揭示了SNP对人血浆中WARS的作用。与G:C等位基因(组织中的中等WARS2表达)相比，以及与C:C等位基因(组织中的低WARS2表达)相比，G:G等位基因纯合的个体(组织中的高WARS2)具有在人血浆中更低水平的WARS。见图16。

实施例6

WARS2表达调节外泌体中的WARS分泌

方法

细胞培养和免疫细胞化学

使用EBM-2培养基(Lonza)培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC；Lonza)。两次传代后，将细胞用TrypLETM(Life Tech)消化，并以5,000个细胞/cm²的密度接种到8孔室载玻片(ibidi)中。在50％汇合度时，以100的感染复数添加表达人WARS2或GFP的腺病毒(PRECISION TECHNOLOGIES)(48小时)。使用低血清EBM-2培养基，并用干扰素-γ(500单位/ml，48小时)刺激所选择的细胞。将细胞用4％甲醛固定15分钟，并用PBS洗涤三次。将细胞用0.1％Triton-100处理(10分钟)并用PBS洗涤三次。使用含1％BSA的PBS封闭(30分钟)。使用一抗(WARS，Abcam，1∶200于1％BSA中)，并将细胞在4℃下孵育过夜。然后在PBS中洗涤细胞(x3)，并与二抗(Alex Fluor缀合，Life Tech，1∶1000)孵育(30分钟)。用PBS洗涤(3x)后，将细胞与鬼笔环肽(Alex Fluor缀合，Life Tech，1比200)孵育30分钟。然后用PBS洗涤细胞(x3)，用DAPI孵育(Life Tech，1比1000，5分钟)，并用Gold Antifade(LifeTech)封片。使用激光扫描显微镜(LSM 710，Zeiss)使用相同设置获取图像。

结果

共焦图像示出WARS在外泌体中分泌。此外，WARS2的表达通过在细胞中捕获WARS而抑制这些外泌体的分泌(参照图17)。用对照病毒(示于图17中，左图)或表达WARS2的病毒(示于图17中，右图)感染HUVEC细胞，用干扰素γ刺激，然后对WARS、肌动蛋白和细胞核染色。在对照细胞中，看到含有WARS的膜结合外泌体微囊泡从细胞的质膜出芽(箭头)。相比之下，在WARS2感染的细胞中，大量的WARS积累在质膜上(＊)，而不是在外泌体中。

实施例7

锌指核酸酶破坏WARS2导致血管密度降低

方法

大鼠中Wars2的破坏

用针对ZFN靶位点的锌指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)靶向第一外显子的末端区域中的BN大鼠Wars2基因座：

ACCCACAGCTACTGCggctcCCCAGGTAACCCGAG(SEQ ID NO：39)(Sage laboratories，PA，USA)。通过测序筛选基因破坏并在ZFN靶位点的外显子1中鉴定到8bp的缺失。这导致在Wars2蛋白的氨基酸27之后的框移位和在Wars2的氨基酸53之后的外显子2中的提前停止。

突变品系的基因分型

使用E.Z.N.A组织DNA试剂盒(OMEGA bio-tek)根据制造商的方案从趾夹样品(toeclip sample)提取基因组DNA。纯化后，对由JumpStart Taq ReadyMix(Sigma)和1μM的以下引物组成的每个样品进行PCR：

(i)5’-GTGAGTGCTGGCGCTTCATC(SEQ ID NO：40)和

(ii)5’-GGCCTAAAGCAGAAGGTCGG(SEQ ID NO：41)。

PCR循环条件：(i)95℃5分钟；(ii)95℃30秒；(iii)65℃30秒；(iv)72℃30秒；(v)循环2至4重复30次；(vi)72℃5分钟；(vii)4℃保持。将PCR产物在5％琼脂糖凝胶上跑胶。预期的条带大小是(i)野生型＝92bp(ii)杂合缺失＝92bp和84bp(ii)纯合缺失＝84bp。

结果

这些大鼠体内结果示出Wars2水平影响毛细血管密度和冠脉血流。具体来说，当Wars2水平低时，毛细血管密度低。此外，当Wars2低时，心脏中的毛细血管面积也低。类似地，当Wars2水平低时，心脏中依赖于毛细血管密度的冠脉血流低。图19A-C说明了这些结果。图18示出使用锌指核酸酶有效破坏了Wars2。

实施例8

WARS2活性抑制

方法

WARS和WARS2 AMP-glo酶测定

使用基于用AMP-GloTM试剂(Promega)优化的化学发光的ATP耗尽测定，并使用96孔形式测定进行WARS和WARS2酶测定。反应缓冲液含有25mM Tris-HCL pH7.2、10mM MgCl₂、50mM KCl、2.5mM二硫苏糖醇、0.1mg/mL牛血清白蛋白、0.2mM精胺、10U/mL焦磷酸酶并且所用酶的浓度为200nM。底物浓度如下：L-色氨酸100μM、批量(bulk)大肠杆菌(E.coli)tRNA(Sigma)200μg/mL和ATP 100μM。反应在37℃下进行1小时，随后添加试剂I(AMP-glo试剂盒)。将板在室温下再孵育1小时。在该小时结束时，将AMP检测溶液添加至所有样品，并在室温下孵育1小时。通过用Infinite M200微板读数器(Tecan)测量发光来收集数据。根据指示添加10微摩浓度的吲哚霉素。

结果

合适的化合物可用于抑制WARS2活性。例如，本研究示出吲哚霉素抑制人线粒体WARS2，但不抑制人胞质WARS活性。WARS2活性的这种抑制可以与其他抑制模式组合。例如，WARS2突变体大鼠突变(L53F)与较低的血管生长和较低的WARS2酶活性相关。因此，使用例如基因治疗方法，可以将WARS2突变体形式L53F引入对象中以降低酶活性从而抑制血管生长。这样的靶向基因治疗方法还可以与其它WARS2抑制剂(例如吲哚霉素或相关化合物)组合以抑制血管生长。图20A和20B说明了这些结果。

实施例9

使用胆固醇修饰的siRNA在大鼠眼中体内敲低WARS2

方法

非靶向(non-targeting，NT)siRNA和siWars2两者均购自Dharmacon，并在所提供的无菌siRNA缓冲液中配制。将五十(50)μg的siWars2玻璃体内注射到三只F344大鼠中各自的一只眼中，总体积为5μl。将相同剂量的NT对照siRNA注射到每只动物的对侧眼睛中。48小时后收集视网膜和脉络膜，并通过Trizol(Ambion)提取总RNA。然后根据生产商的方案(BioRad)合成cDNA。

通过使用以下引物，用SYBRgreen mastermix(Qiagen)进行实时PCR反应以测量Wars2的表达，并以GAPDH mRNA水平归一化：

Wars2正向：5’-TTTCCAGCAGTCTCAGGTGTC-3’(SEQ ID NO：42)；

Wars2反向：5’TACAGGGTATGTGAGCAGGC-3’(SEQ ID NO：43)；

GAPDH正向：5’-AAAGGGTCATCATCTCCGCC-3’(SEQ ID NO：44)；

GAPDH反向：5’-CCTTCCACGATGCCAAAGTT-3’(SEQ ID NO：45)。

结果

使用胆固醇修饰的siRNA在大鼠眼中体内有效地敲低Wars2。与非靶向siRNA相比，Wars2靶向siRNA示出对Wars2表达的更强抑制。见图21。

NT-siRNA

正义：5′-UGGUUUACAUGUCGACUUU-3′(SEQ ID NO：46)

反义：5′-AGUCGACAUGUAAACCAUU-3′(SEQ ID NO：47)

Wars2 siRNA

正义：5′-GCUCCAAUCAGAAGUGAUU-3′(SEQ ID NO：48)

反义：5′-UCACUUCUGAUUGGAGCUU-3′(SEQ ID NO：49)。

实施例10

血管发生的体外模型

方法

管形成测定

siRNA转染48小时后或者腺病毒转导或siRNA基因敲低48小时后，收获HUVEC并以每孔8,000个细胞的密度接种于96孔板中，每孔用50μl基质胶(Corning Matrigel基质，生长因子降低)预包被。在完全EGM-2培养基中培养8小时后，以5X物镜(DM3000倒置显微镜，Leica)获取每个孔(中心位置)的图像。通过WimTube(Wimasis Image Analysis)分析图像。

结果

WARS2的调节导致血管形成(即血管发生)的增加和/或减少。WARS2功能的丧失导致血管发生非常显着的减少，如通过内皮细胞的管形成；总管长度；和分支点的数目所测量。数据可见于图22A-C中。相比之下，WARS2功能的获得(示于图22D-F中)导致这些血管发生量度的相应增加。

实施例11

siWARS2引起内皮细胞增殖的减少

方法

将在8孔室载玻片中培养的HUVEC用4％甲醛固定。将细胞用0.1％Triton x-100透化并与Alexa Fluor 488鬼笔环肽孵育(Molecular Probes，1比200于PBS中，30分钟)。将细胞核用DAPI染色(Molecular Probes，1比1000于PBS中，5分钟)并将细胞用ProLong金抗褪色封片剂(Molecular Probes)或VECTASHIELD封固介质(Vector Laboratories)封片。使用共聚焦激光扫描显微镜(LSM 710，Zeiss)和超分辨率结构照明显微镜(ELYRA PS.1，Zeiss)获取图像。将超分辨率图像根据制造商的说明通过具有SIM模块的ZEN软件(Zeiss)进行后期处理。

细胞计数：通过胰蛋白酶消化收获粘附的HUVEC，并使用自动化细胞计数器(Countess Automated Cell Counter；Invitrogen)计数。

结果

可在图23A的高分辨率显微照片中看到对细胞形态的作用。在抑制的WARS2存在下，肌动蛋白纤维全部消失，且线粒体形成团块。这降低了内皮细胞迁移和分裂的能力；存在核不完全分离，且细胞积累在G2/M期(参照图24A和B)。这些变化的下游作用是由于细胞死亡而减少的增殖。显著抑制的增殖能力可以在图23B所示的图中看出。

实施例12

Wars2的抑制在体力乳腺癌血管发生模型中阻止血管生长

方法

基质胶栓的血管发生测定

在冰上或在4℃冰箱中解冻Corning基质胶膜基质(无LDEV：5ml)(Fisher，目录号CB-40234A)。在将基质胶保持在冰上的同时，在基质胶中添加重组大鼠VEGF 164(R&DSystems，目录号564-RV-010/CF)的重构储液(0.5mg/ml，在无菌PBS中)至500ng/ml的终浓度。将500μl的冷VEGF/基质胶装到冷却的1ml注射器中，并盖有23或27号针头(其上有帽)。将注射器保持在冰上以保持冷却直到注射。

使用异氟烷或氯胺酮混合物麻醉大鼠。捏住最低和次低乳头之间的乳房脂肪垫(mammary fat pad，MFP)，略微提起，并将500μl的基质胶注射入MFP中。基质胶立即固化。在注射后5天，将大鼠安乐死并从脂肪组织小心地切除基质胶栓。将组织包裹在箔中并立即在液氮中冷冻。

结果

在受抑制的Wars2存在下，在乳腺癌血管发生模型中体内血管生长受阻。研究了具有正常Wars2的三只大鼠和携带Wars2(L53F)突变的三只大鼠(使用锌指核酸酶突变，如本文所述，还参见图18)。在具有和表达正常Wars2的大鼠中，在所检查的三只大鼠的每一只均中观察到血管生长至VEGF基质胶栓中。相比之下，在已通过使用锌指核酸酶的突变抑制Wars2的三只大鼠中，几乎没有看到血管生长到VEGF基质胶栓中。具有和不具有再生长的基质胶栓可以在图25中看到。因此，WARS2抑制有益于特征为增强的和/或不期望的血管生长的疾病(例如癌症和各种眼病)。

实施例13

在激光诱导的脉络膜新血管形成(choroidal neovascularization，CNV)的大鼠模型中评估Wars2 siRNA对减少损伤大小和渗漏的作用

方法

根据以下设计，将非靶向siRNA(阴性对照)、Wars2 siRNA(测试剂)和抗VEGF Ab(阳性对照)玻璃体内施用于6-8周龄的棕色挪威雌性大鼠的眼睛中：

第1天：双侧激光处理以产生每只眼三(3)个损伤

第3天：双侧玻璃体内注射阴性对照、阳性对照或测试剂

第22天：体内荧光素血管造影术

第22天：摘出眼睛并固定以用于将来的组织学分析

使用三(3)组，每组五(5)只大鼠，如表4所示。

表4.激光诱导的CNV实验详情

所有动物在标准动物护理条件下以三个一组饲养在保持于通风架中的大笼子中。

麻醉

利用20单位的氯胺酮(100mg/ml)和100单位的甲苯噻嗪(20mg/ml)，使用U-100注射器混合氯胺酮和甲苯噻嗪。通过IP注射以1μl/g(体重)施加麻醉混合物。

激光施加以产生CNV损伤

用1％环戊通(Cyclogyl)溶液使动物扩瞳(dilate)并避光。在可观察到的扩张后，将动物用氯胺酮/甲苯噻嗪镇静。使用Micron III小动物眼底镜(Phoenix Research)观察和记录镇静动物的眼底。使用通过Micron III定制激光附件连接的热激光器进行激光处理。使用520nm的波长，每只眼睛设置总共3个损伤。记录和评价所得到的眼底图像以确认激光已经成功地通过布鲁赫膜(Bruch’s membrane)产生气泡。

玻璃体内施用

用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉动物，并且表面施用Cyclogel和/或托吡卡胺扩大瞳孔。在镇静和扩张后，使用Hamilton注射器和33号针以每只眼睛总体积5μl在睫状体平坦部注射入玻璃体中。

NT-siRNA：

正义：5′-UGGUUUACAUGUCGACUUU-3′(SEQ ID NO：46)

反义：5′-AGUCGACAUGUAAACCAUU-3′(SEQ ID NO：47)

Wars2 siRNA

正义：5′-GCUCCAAUCAGAAGUGAUU-3′(SEQ ID NO：48)

反义：5′-UCACUUCUGAUUGGAGCUU-3′(SEQ ID NO：49)

荧光素血管造影术

用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉动物，之后使其接受以1μl/克体重IP注射的10％荧光素钠。然后使用Micron III和用于488nm目标波长激发器/屏障滤器将眼底图像捕获为8位TIFF文件。还为每只眼捕获标准彩色眼底照片。

成像和损伤定量

使用计算机化图像分析软件(ImageJ，NIH，USA)对所有TIFF图像进行定量。然后手动(free-hand)单独追踪损伤，从而以像素量化区域，并且将彩色眼底照片用作损伤位置的参照。损伤中心的无血管化区域不包括在面积计算中。如果存在出血或两个损伤重叠，则将这些损伤排除在分析之外。

组织收集

用氯胺酮/甲苯噻嗪(80/10mg/kg)麻醉动物，然后通过IP施用200mg/kg的Euthasol(戊巴比妥)使其安乐死。在安乐死后，摘出眼睛并单独固定在4％多聚甲醛中。在固定后，将所有眼睛储存在单独的2mL螺旋盖聚丙烯管中。将样品储存在室温下。

数据和统计学分析

用Graphpad Prism软件(4.0版)使用非配对t检验进行显著性的统计学分析。只有p值＜0.05的变化被认为具有统计学显著性。

实施例14

实施例13中进行的实验结果

在激光处理后，阴性对照动物(即，注射有非靶向siRNA的那些)中，脉络膜新血管形成如预期进行。然而，在治疗性干预对照(抗VEGF抗体)和测试剂(WARS2 siRNA)的情况下，观察到新血管形成的程度显著降低。

实施例15

WARS2敲低对人A549肺癌细胞数目的作用

方法

转染前一天，将A549肺癌细胞系(ATCC目录：CCL-185)在96孔板中以10⁴个细胞/孔培养。第二天，用非靶向siRNA对照(SN001-10D，10nmol，来自Singapore AdvancedBiologics Pte Ltd)或人WARS2 siRNA(5’-CCGACATTCTGTTGTACAA-3’-SEQ ID NO：36)转染该细胞。按照Life Technologies用于其Lipofectamine RNAiMAX方法的方案所述进行转染。

在转染后2、4和5天，使用发光细胞生存力测定(Promega)分析细胞数目。

结果

本研究证明，使用靶向WARS2的siRNA降低WARS2表达显著地减少了人A549肺癌中肺癌细胞的数目。如图26所示，非靶向siRNA没有作用，而在siRNA转染后仅两天就观察到细胞数目的显著减少，并且在转染后5天，数目减少了70％。因此，通过降低WARS2的表达减少或抑制了癌细胞的增殖。

本文引用的所有专利、公开的申请和参考文献的教导均通过引用以其整体并入。

尽管已经参照其示例性实施方案具体示出和描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，在不脱离由所附权利要求涵盖的本发明范围的情况下，可以在形式和细节上进行多种改变。

Claims (73)

1.在有此需要的个体中调节血管发生的方法，其包括施用有效量的调节WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂。

2.权利要求1所述的方法，其中所述试剂是核酸、小有机分子、抗体、适配体、突变体WARS2、或其组合。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述试剂抑制WARS2表达、WARS2活性或其组合，从而抑制血管发生。

4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述试剂是结合WARS2核酸的核酸。

5.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述小有机分子是吲哚霉素或其衍生物。

6.权利要求4所述的方法，其中所述核酸是特异性靶向WARS2的小干扰核糖核酸(siRNA)和/或吗啉代寡聚体。

7.权利要求1或2所述的方法，其中所述试剂增强WARS2表达，WARS2活性或其组合，从而增强血管发生。

8.权利要求1、2或7所述的方法，其中所述试剂是指导WARS2表达的载体。

9.在有此需要的个体中抑制血管发生的方法，其包括施用有效量的抑制WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂。

10.权利要求9所述的方法，其中所述试剂是核酸、小有机分子、抗体、适配体、突变体WARS2、或其组合。

11.权利要求9或10所述的方法，其中所述试剂是结合WARS2核酸的核酸。

12.权利要求10所述的方法，其中所述小有机分子是吲哚霉素或其衍生物。

13.权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述核酸是特异性靶向WARS2的小干扰核糖核酸(siRNA)和/或吗啉代寡聚体。

14.权利要求1至6或9至13中任一项所述的方法，其中所述个体患有视网膜病、黄斑变性、癌症、是肥胖的、或其组合。

15.权利要求14所述的方法，其中所述视网膜病是糖尿病性视网膜病。

16.权利要求14所述的方法，其中所述黄斑变性是年龄相关的黄斑变性(AMD)。

17.权利要求16所述的方法，其中所述AMD是湿性AMD或干性AMD。

18.在有此需要的个体中治疗视网膜病的方法，其包括施用有效量的抑制WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂。

19.权利要求18所述的方法，其中所述视网膜病是糖尿病性视网膜病。

20.在有此需要的个体中治疗黄斑变性的方法，其包括施用有效量的抑制WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂。

21.权利要求20所述的方法，其中所述黄斑变性是年龄相关的黄斑变性(AMD)。

22.权利要求21所述的方法，其中所述AMD是湿性AMD或干性AMD。

23.权利要求18至22中任一项所述的方法，其中所述试剂是核酸、小有机分子、抗体、适配体、突变体WARS2、或其组合。

24.权利要求18至23中任一项所述的方法，其中所述试剂是结合WARS2核酸的核酸。

25.权利要求24所述的方法，其中所述核酸是特异性靶向WARS2的小干扰核糖核酸(siRNA)和/或吗啉代寡聚体。

26.权利要求23所述的方法，其中所述小有机分子是吲哚霉素或其衍生物。

27.在有此需要的个体中抑制癌细胞增殖的方法，其包括施用有效量的抑制WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂。

28.权利要求27所述的方法，其中所述试剂是核酸、小有机分子、抗体、适配体、突变体WARS2、或其组合。

29.权利要求27或28所述的方法，其中所述试剂是结合WARS2核酸的核酸。

30.权利要求28所述的方法，其中所述小有机分子是吲哚霉素或其衍生物。

31.权利要求27至30中任一项所述的方法，其中所述核酸是特异性靶向WARS2的小干扰核糖核酸(siRNA)和/或吗啉代寡聚体。

32.权利要求27至31中任一项所述的方法，其中所述癌细胞是肺癌细胞。

33.在有此需要的个体中增强血管发生的方法，其包括施用有效量的增强WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂。

34.权利要求33所述的方法，其中所述试剂是核酸、或小有机分子、抗体、适配体、突变体WARS2、或其组合。

35.权利要求33或34所述的方法，其中所述试剂是指导WARS2表达的载体。

36.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述WARS2活性包括与WARS、EPRS、GAPDH、RPL14a、或其组合的相互作用。

37.在有此需要的个体中鉴定肿瘤的血管发生潜力的方法，其包括确定相比于对照的从所述个体获得的一个或更多个胞外囊泡(EV)和/或其内含物中的WARS水平，其中与所述对照相比，所述一个或更多个EV和/或其内含物中WARS水平的提高表明所述个体中的肿瘤具有低血管发生潜力，并且与所述对照相比，所述一个或更多个EV和/或其内含物中WARS水平的降低表明所述个体中的肿瘤具有高血管发生潜力。

38.权利要求37所述的方法，其中所述对照是从一个或更多个没有肿瘤的个体获得的一个或更多个EV中的WARS水平。

39.权利要求37或38所述的方法，其还包括从所述个体获得包含所述一个或更多个EV的样品。

40.权利要求39所述的方法，其中所述样品是所述个体的生物流体、所述个体的生物组织、或其组合。

41.权利要求40所述的方法，其中所述生物流体是血或血浆。

42.权利要求37至41中任一项所述的方法，其还包括从所述个体获得一个或更多个EV或其内含物。

43.权利要求37至42中任一项所述的方法，其还包括基于所鉴定的肿瘤血管发生潜力治疗所述个体。

44.权利要求43所述的方法，其中如果与对照相比，所述一个或更多个EV和/或其内含物中的WARS水平降低，则用有效量的抑制WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂治疗所述个体。

45.权利要求37至44中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个EV是外泌体。

46.在患有心血管病症的个体中鉴定血管发生潜力的方法，其包括确定相比于对照的从所述个体获得的一个或更多个胞外囊泡(EV)和/或其内含物中的WARS水平，其中与所述对照相比，所述一个或更多个EV和/或其内含物中WARS水平的提高表明所述个体中的低血管发生潜力，并且与所述对照相比，所述一个或更多个EV和/或其内含物中WARS水平的降低表明所述个体中的高血管发生潜力。

47.权利要求46所述的方法，其中所述对照是从一个或更多个没有心血管病症的个体获得的一个或更多个EV中的WARS水平。

48.权利要求46或47所述的方法，其还包括从所述个体获得包含所述一个或更多个EV的样品。

49.权利要求48所述的方法，其中所述样品是所述个体的生物流体、所述个体的生物组织、或其组合。

50.权利要求49所述的方法，其中所述生物流体是血或血浆。

51.权利要求46至50中任一项所述的方法，其还包括从所述个体获得一个或更多个EV或其内含物。

52.权利要求46至51中任一项所述的方法，其还包括基于所鉴定的心血管病症的血管发生潜力来治疗所述个体。

53.权利要求52所述的方法，其中如果与对照相比，所述一个或更多个EV和/或其内含物中的WARS水平提高，则用有效量的增强WARS2表达、WARS2活性或其组合的试剂治疗所述个体。

54.权利要求46至53中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个EV是外泌体。

55.确定有此需要的个体是否会受益于抗血管发生治疗的方法，其包括：

a)对所述个体染色体1的全部或部分进行基因组分析，其中所述部分包含：

TTCATATTCTGTCGAGACACCCATC[C/G]CCCTGTGTTTCACTTGTCTGATTA

C(SEQ ID NO：38)；并且

b)检测SEQ ID NO：38的26位处的至少一个等位基因，

其中如果至少一个等位基因在SEQ ID NO：38的26位处是G，则所述个体将受益于抗血管发生治疗。

56.权利要求55所述的方法，其中所述个体在所述等位基因处是G纯合的(G：G)，在所述等位基因处是G杂合的(G：C)或在所述等位基因处是C纯合的(C：C)。

57.权利要求55或56所述的方法，其中染色体1的所述部分包含染色体1的119,503,593-119,504,093位。

58.权利要求55至57中任一项所述的方法，其中将来自所述个体SEQ ID NO：38的26位处的所述至少一个等位基因的检测与对照进行比较。

59.权利要求58所述的方法，其中所述对照获自响应于抗血管发生治疗、不响应于抗血管发生治疗的一个或更多个个体或其组合。

60.权利要求55至59中任一项所述的方法，其中所述个体患有肿瘤。

61.权利要求55至60中任一项所述的方法，其还包括从所述个体获得样品。

62.权利要求61任一项所述的方法，其中所述样品获自所述个体的生物流体、所述个体的生物组织、或其组合。

63.权利要求62所述的方法，其中所述生物流体是血或血浆。

64.权利要求55至63中任一项所述的方法，其还包括用抗血管发生治疗来治疗在SEQID NO：38的26位处具有至少一个为G的等位基因的个体。

65.权利要求64所述的方法，其中所述抗血管发生治疗包括抑制血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF受体2(VEGFR)、血小板衍生生长因子(PDGF)、Tie-1受体(Tie-1R)、Tie-2受体(Tie-2R)、胎盘生长因子(PlGF)、VE-钙黏着蛋白、或其组合。

66.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述个体是人。

67.鉴定调节WARS表达、活性或其组合之试剂的方法，其包括：

a)测定从已经与待评估的试剂接触的细胞、组织和/或生物体获得的一个或更多个胞外囊泡(EV)的WARS表达和/或活性；并且

b)将a)中所述的WARS表达、活性或其组合与对照进行比较，

其中如果与所述对照相比，在所述试剂存在下WARS表达、活性或其组合改变，则所述试剂调节WARS表达、活性或其组合。

68.权利要求67所述的方法，其中所述对照是不存在所述药剂时的EV的WARS表达、活性或其组合。

69.权利要求67或68所述的方法，其中与所述对照相比，在所述试剂存在下所述EV的WARS表达、活性或其组合降低。

70.权利要求67或68所述的方法，其中与所述对照相比，在所述试剂存在下所述EV的WARS表达，活性或其组合提高。

71.权利要求67至70中任一项所述的方法，其还包括使所述细胞、组织和/或生物体与待评估的试剂接触。

72.权利要求67至71中任一项所述的方法，其还包括从已经与待评估的试剂接触的所述细胞、组织和/或生物体获得所述一个或更多个EV。

73.权利要求67至72中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个EV是外泌体。