CN106062194A

CN106062194A - 用于调整肌腱愈合的材料和方法

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Publication number: CN106062194A
Application number: CN201580004551.8A
Authority: CN
Inventors: D·S·吉尔克里斯特; N·L·米勒
Original assignee: University of Glasgow
Current assignee: University of Glasgow
Priority date: 2014-01-14
Filing date: 2015-01-14
Publication date: 2016-10-26
Also published as: US9932582B2; NO3094727T3; TR201802656T4; SA516371485B1; AU2015207351A1; HK1226093B; WO2015107340A1; JP6845589B2; RU2699706C2; RS56915B1; HUE036049T2; DK3094727T3; JP6665107B2; RU2016131870A3; CA2935623C; EP3094727B1; US20180155724A1; AU2015207351B2; SI3094727T1; PL3094727T3

Abstract

本发明涉及微小RNA 29及其前体和模拟物用于调整肌腱损伤和肌腱的生物力学特性的用途。具体而言，本发明来源于以下发现：肌腱细胞中的1型胶原的合成对miR‑29的敏感度低于3型胶原的合成，因而使得能够将胶原亚型之间的平衡调整成有利于1型胶原，从而缓解愈合期间生物力学特性的降低。

Description

用于调整肌腱愈合的材料和方法

发明领域

本发明涉及微小RNA 29及其前体和模拟物用于治疗肌腱损伤和调整肌腱的生物力学特性的用途。

发明背景

许多常见的包括肌腱病症的肌骨骼病变的特征是调节异常的组织修复和炎症¹。肌腱病代表了肌骨骼初级护理会诊的常见疾病(precipitant)^2-3并且占所有运动损伤的30％-50％³。肌腱病的特征在于胶原产生从亚型1变为亚型3，从而导致抗张强度降低，这能够预示临床肌腱断裂⁴。

炎症介质被认为对于肌腱病的发作和持续存在来说是至关紧要的⁵。炎症细胞谱系和肌腱细胞中已经展现了各种细胞因子的表达，从而表明浸润群体和居留群体两者都参与病变^6-9。IL-6缺陷的小鼠体内愈合的肌腱的机械特性要较正常对照相逊色¹⁰，而TNF-α阻断提高了大鼠肌腱损伤模型中肌腱-骨愈合的强度¹¹。虽然这些数据产生了细胞因子靶向可以提供治疗效用的令人感兴趣的可能性，但是当前对肌腱疾病的细胞因子/基质生物学的机制理解还不足以在实践中体现这种可能性。

白细胞介素33是IL-1细胞因子家族的成员，进而在先天免疫应答中起着重要作用。IL-33被表达在内皮细胞和成纤维细胞中，与核中的染色质共同定位¹²。IL-33的释放伴随细胞损伤¹³和生物力学过载¹⁴，且因此IL-33被认为是‘警戒素(alarmin)’¹⁵。它牵涉多种炎症病变，包括肺部、皮肤和关节疾病¹⁶。IL-33经由其同源受体ST2(其以膜结合形式(mST2)或可溶形式(sST2)存在)起作用并且经由经典IL-1R信号级联发出信号。细胞因子经常通过微小RNA(miRNA)调节在转录后水平，所述微小RNA通过翻译抑制和靶mRNA的去稳定来控制基因表达¹⁷。微小RNA网络出现作为组织修复的关键稳态调节物，其中基础作用体现在干细胞生物学、炎症、低氧反应以及血管发生中¹⁸。

微小RNA(miR)是小的非编码RNA，它通过阻遏翻译(通过抑制翻译或诱导mRNA降解)而对细胞功能产生显著影响。微小RNA衍生自通过RNA聚合酶II合成的初级RNA转录物(pri-miRNA)，所述初级RNA转录物的长度可以是数千个核苷酸。单一pri-miRNA转录物可以产生多于一个活性miRNA。

在核中，III型RNA酶Drosha将pri-miRNA转录物处理为前体miRNA(pre-miRNA)，所述前体miRNA由茎-环或发夹结构组成，长度正常为70至100个核苷酸左右。pre-miRNA之后运送到细胞质，在其中所述pre-miRNA进一步通过RNA酶Dicer处理，从而去除环并且产生成熟的双链miRNA分子，活性“引导”链(长度典型地为15至25个核苷酸)与全部或部分互补的“过客”链杂交。

成熟的双链miRNA之后结合到RNA诱导沉默复合体中，在其中引导链与靶mRNA中的结合位点杂交。

引导链与靶结合位点可能不完全互补。然而，引导链中指定为“种子”序列的区域通常与靶结合位点的对应序列完全互补。种子序列的长度典型地为2至8个核苷酸，并且所述种子序列位于引导链的5’端处或其附近(在其1或2个核苷酸范围内)。

认为单一未配对的引导链还可能能够结合到RISC中。还认为阻止过客链结合到RISC中的对过客链(例如，糖、碱基或主链结构)的修饰也可以提高双链miRNA靶抑制的效率。

发明概述

肌腱损伤的愈合往往欠佳，这至少部分是因为胶原合成在肌腱病期间从1型转变为3型。3型胶原在力学上不如1型胶原，从而导致肌腱具有较低的抗张强度。如果胶原亚型之间的平衡可以往回朝向1型胶原调整，那么肌腱的生物力学特性将会得到改进。

先前已将miR-29鉴别为是多种生物过程诸如纤维化和硬皮病中胶原合成的调节物。然而，发明人已发现(为首次)肌腱细胞包含1型胶原转录物的替代性剪接形式。1a1型和1a2型胶原的主要转录物具有短的不包含miR-29结合位点的3’未翻译区域(UTR)，而存在的绝大多数3型胶原转录物是长的miR-29敏感形式。

因此，肌腱细胞中1型胶原的合成受miR-29影响的程度远远低于3型胶原的合成。出人意料地是，之后通过上调miR-29活性，有可能将胶原亚型之间的平衡调整成有利于1型胶原，从而缓解或消除肌腱的抗张强度的降低，并且调整其生物力学特性诸如其最终的断裂强度。

在最广泛的形式中，本发明涉及微小RNA 29(miR-29)及其前体、模拟物和激动剂用于调整肌腱愈合和肌腱的生物力学特性的用途。

因此，本发明提供一种用于调整肌腱愈合的方法，所述方法包括提高肌腱细胞中的miR-29的表达或活性。这可以通过以下方式来实现：向靶细胞直接递送miR-29；递送miR-29模拟物；或递送前体分子，所述前体分子在靶细胞内经处理成为活性miR-29或miR-29模拟物。

所述方法可以包括向肌腱细胞递送miR-29、其模拟物、或它们任一者的前体的步骤。

miR-29、模拟物或前体可以联合合适的载体分子，诸如药学上可接受的脂质或聚合物(例如，与之复合或由其胶囊化)一起递送。

载体分子还可以包含能够结合至靶细胞的表面的靶向剂。

所述方法可以包括以下步骤：向肌腱细胞递送编码miR-29、其模拟物或它们任一者的前体的核酸，以使得所述miR-29、模拟物或前体被表达在肌腱细胞中。

可替代地，所述方法可以包括向肌腱细胞递送能够上调内源性miR-29活性的激动剂的步骤。

所描述的任何方法可以体外、体内或离体执行。最典型的是，所述方法将是通过向受试者施用合适的组合物来体内执行。

本发明还提供用于调整肌腱愈合的方法中的miR-29、其模拟物或它们任一者的前体。

本发明还提供miR-29、其模拟物或它们任一者的前体在制造用于调整肌腱愈合的药剂中的用途。

本发明还提供一种用于调整肌腱愈合的方法中的编码miR-29、其模拟物或它们任一者的前体的核酸。

本发明还提供编码miR-29、其模拟物或它们任一者的前体的核酸在制造用于调整肌腱愈合的药剂中的用途。

在任何方面，miR-29可以是miR-29a、miR-29b(b1和/或b2)、miR-29c或其任何组合。可能希望miR-29是miR-29a或包含miR-29a的组合。

编码miR-96、模拟物或前体的核酸可以作为裸露的核酸递送。可替代地，它们可以联合合适的载体分子，诸如药学上可接受的脂质或聚合物或其组合(例如，与之复合或由其胶囊化)一起递送。在任一种情况下，核酸典型地是DNA。

载体分子还可以包含能够结合至靶细胞的表面的靶向剂。

可替代地，编码miR-96、模拟物或前体的核酸可以通过病毒载体来递送。

可以采用任何合适类型的病毒载体，包括腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒(尤其是慢病毒)以及疱疹病毒载体。腺病毒和慢病毒可能是特别优选的，因为它们有能力实现未活跃地分裂的细胞中递送的基因的表达。

miR-29及其前体

人体中的三个主要同工型是miR-29a、miR-29b1、miR-29b2以及miR-29c。

术语“miR-29”在本说明书中用于指代由这三种同工型中的任一种的成熟的“引导链”序列组成的RNA寡核苷酸。

成熟的人miR-29a(“hsa-miR-29a”)具有以下序列：

UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA。

成熟的miR-29b1和miR-29b2(“hsa-miR-29b1”和“hsa-miR-29b2”)是相同的并且具有以下序列：

UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU。

成熟的人miR-29c(“hsa-miR-29c”)具有以下序列：

UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA。

在微小RNA命名中习惯上包括指定微小RNA起源的物种的三个字母前缀。因此，“hsa”代表智人。已发现这些成熟的miR29序列在包括马的大多数哺乳动物中是相同的。

所有四个成熟的引导链共用同一个“种子”区域，所述种子区域结合至靶mRNA，并且具有以下序列：

AGCACCA。

miR-29引导链寡核苷酸可以是单链的，或它可以与称为“过客链”的第二RNA寡核苷酸杂交。引导链和过客链在杂交复合体中彼此反平行延伸，所述杂交复合体可以被称为“双链miR-29”。(引导链在单独存在时可以被称为“单链miR-29”。)

过客链和引导链可以包含多个错配，结果是一个或两个链中的并非所有核苷酸都与另一个链中的互补核苷酸杂交。因此，双链miR-96可以包含一个或多个突起(突起是仅一个链中未配对的核苷酸，或多个连续未配对的核苷酸)或内环(两个链中对置的未配对的核苷酸)。末端处的一个或多个核苷酸也可以是未配对的。

过客链可以与引导链的种子序列100％互补。

天然人过客链具有以下序列：

ACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAG(miR29a)

GCUGGUUUCAUAUGGUGGUUUAGA(miR-29b1)；

CUGGUUUCACAUGGUGGCUUAG(miR-29b2)；以及

UGACCGAUUUCUCCUGGUGUUC(miR-29c)。

双链miR-29中的一个或两个链可以包含例如具有1、2或3个核苷酸的3’突出部分。也就是说，链的3’端处的一个或两个核苷酸延伸超过互补链的最5’核苷酸(包括任何未配对的末端核苷酸)，并且因此在互补链中不具有对应的核苷酸。例如，两个链可以包含具有1、2或3个核苷酸的3’突出部分。可替代地，复合体在一端或两端处可以是平端的。在一些实施方案中，过客链的长度与引导链的长度相同，或者长度不同，例如，有多达五个核苷酸或甚至更多不同，这取决于两个链之间的错配程度以及任何3’突出部分的长度。

miR-29的前体包括三种同工型中任一种的pre-mir-29和pri-mir-29，以及其可以处理为成熟的miR-29(无论是单链还是双链)的片段和变体。

术语“pre-mir-29”用于指代由任何全长哺乳动物pre-mir-29序列组成的RNA寡核苷酸、或其片段或变体，它们包含通过环序列连接至对应的过客序列的成熟的miR-29引导序列，过客序列与引导序列完全或部分互补，并且其中寡核苷酸能够形成茎-环结构(或“发夹”)，其中引导序列和过客序列彼此杂交。

pre-mir-29能够充当双链RNA特异性核糖核酸酶(III型RNA酶)Dicer的底物，借此所述pre-mir-29被处理为成熟的双链miR-29。

全长哺乳动物pre-mir-29序列包括人序列：

AUGACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAGAGUCAAUAUAAUUUUCUAGCACCAUCUGAAAUCGGUUAU(hsa-pre-mir-29a：替代物(i))；

AUGACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAGAGUCAAUAUAAUUUUCUAGCACCAUCUGAAAUCGGUUAUAAUGAUUGGGG(hsa-pre-mir-29a：替代物(ii))；

CUUCAGGAAGCUGGUUUCAUAUGGUGGUUUAGAUUUAAAUAGUGAUUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUCUUGGGGG(hsa-pre-mir-29b1)；

CUUCUGGAAGCUGGUUUCACAUGGUGGCUUAGAUUUUUCCAUCUUUGUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUUUUAGGAG(hsa-pre-mir-29b2)；以及

AUCUCUUACACAGGCUGACCGAUUUCUCCUGGUGUUCAGAGUCUGUUUUUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCGGUUAUGAUGUAGGGGGA(hsa-pre-mir-29c)

对应的成熟的引导链序列以下划线标注。

与所示的序列相比较，pre-mir-29可以具有成熟序列之外的一个或多个修饰。

成熟序列上游(5’)的序列与对应的人序列可以具有例如至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。

例如，miR-29a成熟序列上游(5’)的序列与对应的5’人序列在它们最优地比对时可以有多达20个核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸不同。

miR-29b1或b2成熟序列上游的序列与对应的5’人序列在它们最优地比对时可以有多达25个核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸不同。

miR-29c成熟序列上游的序列与对应的5’人序列在它们最优地比对时可以有多达25个核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸不同。

成熟序列下游(3’)的序列与对应的人序列可以具有例如至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。

miR-29a成熟序列下游(3’)的序列可以与3’人序列相同，或可以不同。该序列可以是与上文所示两个序列中的较短序列即替代物(i)中存在的核苷酸不同的核苷酸。该序列可以比替代物(i)中所示的序列更长。例如，该序列与上文所示的替代物(ii)的对应的3’序列可以有多达6个核苷酸不同。

miR-29b1或b2成熟序列下游(3’)的序列与对应的3’人序列在它们最优地比对时可以有多达4个核苷酸，例如，1、2、3、或4个核苷酸不同。

miR-29c成熟序列下游(3’)的序列与对应的3’人序列在它们最优地比对时可以有多达7个核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6或7个核苷酸不同。

术语“pri-mir-29”用于指代由任何全长哺乳动物pri-mir-29序列组成的RNA寡核苷酸，或其片段或变体，它们包含pre-mir-29序列并且能够通过双链RNA特异性核糖核酸酶(III型RNA酶)Drosha处理为pre-mir-29序列。

单一转录物可能能够被处理为两种或更多种mir-29分子、其模拟物或前体。

hsa-mir29a和mir29b1编码在具有GenBank登录号EU154353(EU154353.1GI:161824377)的转录物的最后外显子中。下文示出了编码mir29a和mir29b1的区域加上旁侧序列。(Hsa-mir29a以粗体大写字体示出，其中成熟的miR-29a序列以下划线标注。Hsa-mir29b以大写字体示出，其中miR-29b以下划线标注。)

hsa-pri-miR29b2和hsa-pri-mir29c编码在下文示出的单一转录物中。hsa-mir29b2以大写字体示出，其中成熟的hsa-miR-29b2以下划线标注。hsa-mir29c以粗体大写字体示出，其中成熟的hsa-miR-29c以下划线标注。

因此，pri-mir-29可以包含多于一个成熟的miR-29或模拟物序列。例如，它可以包含miR-29a和miR-29b1或其模拟物、或者miR-29b2和miR-29c或其模拟物。

可替代地，pri-mir-29可以仅包含其模拟物的一个成熟的miR-29序列。

pri-mir-29与上文所示的pri-mir-29序列、或包含成熟的miR-29序列之一的那些序列中的一个的片段中任一个可以具有至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。

与所示的序列相比较，pri-mir-29可以具有成熟序列之外或天然pre-mir-29序列之外的一个或多个修饰。

例如，成熟序列上游(5’)的序列与对应的人序列可以具有例如至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。

pre-mir-29序列上游(5’)的序列与对应的人序列可以具有例如至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。

天然pre-mir-29下游(3’)的序列与对应的人序列可以具有例如至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。

miR-29前体可以是任何合适的长度，只要它可以被处理为成熟的miR-29(不管是单链的还是双链的)即可。因此，miR-29a前体的长度是至少23个核苷酸，miR29b前体的长度是至少24个核苷酸，并且miR-29c前体的长度是至少25个核苷酸。

miR29前体的长度可以是至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少1000、至少1500或至少2000个核苷酸。

可替代地，前体的长度最大可以是25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450、500、1000、1500、2000或2500个核苷酸，但是更长的前体转录物是可能的。

应注意到，术语“寡核苷酸”并不意图暗示任何特定长度，并且仅用于指代连接核苷酸的任何单一连续链。

miR-29模拟物及其前体

miR-29模拟物是一种寡核苷酸，其与天然存在的miR-29相比较具有结构或序列的一个或多个修饰，但是保持与通过miR-29调节的mRNA中的miR-29结合位点杂交，并且抑制这种mRNA的翻译或促进其降解，例如抑制由该mRNA编码的蛋白质的产生的能力。通过miR-29调节的mRNA包括3型胶原(Col3a1)。

miR-29结合位点的实例包括：

CCAUUUUAUACCAAAGGUGCUAC(来自Col1a1mRNA)；

UGUUCAUAAUACAAAGGUGCUAA(来自Col1a2mRNA)；以及

UUCAAAAUGUCUCAAUGGUGCUA(来自col3a1mRNA)。

miR-29模拟物寡核苷酸的长度典型地是15-35个核苷酸，例如15至30、15至25、18至25、20至25，例如20至23，例如20、21、22或23个核苷酸。

miR-29模拟物与天然miR-29成熟序列中的一个相比较可能在碱基序列、核苷酸结构和/或主链连接方面有所不同。

miR-29模拟物包含种子序列，所述种子序列可以与天然种子序列相同：

AGCACCA

或者可能在不超过三个位置处，例如，不超过两个位置处，例如，不超过一个位置处与天然种子序列不同。优选地，种子序列与所示的种子序列相同。

miR-29模拟物可以包含具有成熟的天然miR-29引导序列的寡核苷酸或由其组成，所述成熟的天然miR-29引导序列诸如：

UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA(hsa-miR-29a)；

UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU(hsa-miR-29b1和hsa-mi R-29b2)；或

UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA(hsa-miR-29c)；

(其中种子序列在各个情况下都以下划线标注)；

或所述模拟物在以下位置不同于成熟的天然序列：

(i)在所述种子序列内不超过三个位置处；以及

(ii)在所述种子序列之外不超过五个位置处。

因此，模拟物种子序列在不超过三个位置处，例如，不超过两个位置处，例如，不超过一个位置处与天然种子序列不同。优选地，所述种子序列与天然种子序列相同。

另外或可替代地，所述模拟物在种子序列之外不超过五个位置处，例如不超过四个位置处、不超过三个位置处、不超过两个位置处，例如不超过一个位置处与天然序列不同。

miR-29模拟物可以与第二寡核苷酸杂交。如同天然miR-29一样，活性寡核苷酸可以被称为“引导链”，并且缔合的寡核苷酸被称为“过客链”。杂交复合体可以被称为双链miR-29模拟物。

模拟过客链的序列可以与天然过客链的序列相同，或可以在一个或多个位置处与天然过客链不同。例如，模拟过客链的序列可以在不超过10个位置处、不超过9个位置处、不超过8个位置处、不超过7个位置处、不超过6个位置处、不超过5个位置处、不超过4个位置处、不超过3个位置处、不超过2个位置处或不超过1个位置处与天然过客链的序列不同。

双链miR-29模拟物中的一个或两个链可以包含具有1或2个核苷酸的3’突出部分。例如，两个链可以包含具有2个核苷酸的3’突出部分。可替代地，复合体在一端或两端处可以是平端的。在一些实施方案中，过客链与引导链长度相同，或在长度上相差一个或两个核苷酸。

miR-29模拟物的前体是任何分子，所述分子可以典型通过Dicer酶的作用或通过Drosha和Dicer酶的顺序作用在靶细胞内处理为如上所定义的miR-29模拟物。

因此，前体可以具有模拟物序列的上游(5’)和/或下游(3’)的附加的寡核苷酸序列。

前体可以包含通过环序列连接至对应的过客序列的miR-29模拟物引导序列，过客序列与引导序列完全或部分互补，并且其中所述寡核苷酸能够形成茎-环结构(或“发夹”)，其中引导序列和过客序列彼此杂交。这种寡核苷酸可以被视作是pre-mir-29模拟物并且能够充当双链RNA特异性核糖核酸酶(III型RNA酶)Dicer的底物，借此所述寡核苷酸被处理为包含单独的引导链和过客链的双链miR-29模拟物。

可替代地，所述前体可以是pri-mir-29模拟物(即，其具有pre-mir-29模拟物序列的上游(5’)和/或下游的(3’)附加的寡核苷酸序列)，并且能够通过双链RNA特异性核糖核酸酶(III型RNA酶)Drosha处理为pre-mir-29模拟物序列。

例如，成熟的miR-29模拟物序列上游(5’)的序列与对应的人序列可以具有例如至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。

pre-mir-29模拟物序列上游(5’)的序列与对应的人序列可以具有例如至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。

成熟的miR-29模拟物序列下游(3’)的序列与对应的人序列可以具有例如至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。

pre-mir-29模拟物序列下游(3’)的序列与对应的人序列可以具有例如至少50％同一性、至少55％同一性、至少60％同一性、至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性。

miR-29模拟物前体可以是任何合适的长度，只要它可以被处理为成熟的miR-29模拟物(不管是单链的还是双链的)即可。因此，所述前体的长度是至少23个核苷酸，并且长度可以是至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少1000、至少1500或至少2000个核苷酸。

可替代地，所述前体的长度最大可以是25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450、500、1000、1500、2000或2500个核苷酸。

结构修饰

除了上文论述的序列修饰之外或作为其替代方案，miR-29模拟物或其前体与RNA寡核苷酸相比较可以包含一个或多个结构修饰。

miR-29模拟物或前体可以包含一个或多个核苷酸，所述一个或多个核苷酸包含修饰的糖残基，即，不同于核糖残基的糖残基。这类修饰的糖残基的实例包括2’-O-甲基核糖、2’-O-甲氧基乙基核糖、2’-氟-核糖和4-硫代-核糖、以及二环糖。二环糖典型地包含具有2’,4’桥(例如，亚甲桥)的呋喃糖基环，2’,4’桥将该环限制于C3’内向构型。包含二环糖的核苷酸经常被称为锁核酸(“LNA”)残基。

miR-29模拟物或前体可以独立地包含任何或所有这些类型修饰的糖残基中的一个或多个。例如，所述模拟物可以包含一个、两个、三个、四个、五个、多达10个、多达15个、多达20个或甚至更多个修饰的糖残基。在某些实施方案中，所有核苷酸包含修饰的糖残基。

另外或可替代地，miR-29模拟物或前体可以包含一个或多个主链修饰，例如，修饰的核苷间连键。

因此，一个或多个邻近的核苷酸可以经由替代的连接部分而不是磷酸酯部分来连接。

可能特别希望miR-29模拟物的一端或两端，即介于5’端核苷酸与邻近核苷酸之间和/或介于3’端核苷酸与邻近核苷酸之间存在修饰的核苷间连键。

适合于用作核苷间连键的部分包括硫代磷酸酯、吗啉代和膦酰羧酸酯部分、以及硅氧烷、硫化物、亚砜、砜、乙酰基、甲酰乙酰基、硫代甲酰乙酰基、亚甲基甲酰乙酰基、硫代甲酰乙酰基、烯基、氨基磺酸酯、亚甲基亚胺基、亚甲基肼基、磺酸酯以及磺酰胺部分。

在硫代磷酸酯部分中，非桥氧原子被硫原子置换。硫代磷酸酯基团可以促进血清蛋白结合并且因此可以改进模拟物的体内分布和生物利用度。这在系统地向接受者施用模拟物的情况下可能是希望的。

另外或可替代地，miR-29模拟物或前体可以包含作为天然存在的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤以及尿嘧啶的替代物的一个或多个修饰的碱基。这类修饰的碱基包括5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇基、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(包括5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶以及胞嘧啶)，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基-腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。

已经表明过客链修饰痕迹越严重，越不太可能结合到RISC复合体中，并且由此引导链将越有效。因此，甚至是在引导链是天然miR-29的情况下，可能希望过客链包含一个或多个修饰，例如，一个或多个修饰的糖残基、一个或多个修饰的核苷间连键和/或一个或多个修饰的碱基。

另外或可替代地，miR-29模拟物或前体可以包含用于促进靶细胞的质膜之上的转运的膜转运部分。这个部分可以是合适的脂质或其它脂肪部分，包括但不限于胆固醇和硬脂酰部分。

其它膜转运部分包括细胞穿透肽(“CPP”，诸如来自HIV-1的TAT和MPG、穿膜肽、聚精氨酸)以及融合肽(例如，HIV-1包膜(HGP)或流感病毒融合肽(diINF-7)的内功能域衍生物)。膜转运部分可以缀合至载体分子，所述载体分子非共价地与miR-29模拟物或前体本身缔合。可替代地，膜转运部分可以缀合至miR-29模拟物或前体本身。

膜转运部分可以缀合至引导链或过客链，但是过客链是优选的，这是为了不损害引导链功能。在5’端或3’端缀合可能是优选的，但是缀合至内部残基也是可能的。

为了避免疑义，miR-29分子(即，在其它情况下并不处理与天然分子的任何结构或序列差异)在连接至膜转运部分时可以被视作是miR-29模拟物或前体。

miR-29模拟物的实例是引导链：

5′-rUrArGrCrArCrCrArUrCrUrGrArArArUrCrGrGmUmUmA -3′

其中“r”指示核糖，并且“m”指示2’-O-甲基核糖。

引导链可以是结合过客链的双链miR-29模拟物的部分。合适的过客链的实例是：

5′mAmCrCmGrAmUrUmUrCmArGmArUmGrGmUrGmCrUA-3′

以及

5′-mAmCrCmGrAmUrUmUrCmArGmArUmGrGmUrGmCrUmAdG-3′

miR-29、模拟物和前体的递送

可以提供组合物，其中miR-29、模拟物和前体与合适的载体缔合(例如，与之复合或由其胶囊化)。

合适的载体包括药学上可接受的脂质和聚合物以及其组合。例如，组合物可以具有脂质体、脂囊泡、脂质复合体或聚合物复合体的形式。

例如，脂囊泡和脂质体是具有含水核心的脂质双层颗粒，所述含水核心包含寡核苷酸运载物。

脂质复合体(或“脂复合物”)和聚合物复合体(“聚复合物”)典型地包含带正电荷的脂质或聚合物，所述脂质或聚合物与带负电荷的寡核苷酸相互作用以形成复合体。

阳离子型聚合物或脂质还可以与靶细胞的表面处的带负电荷的分子相互作用。通过脂质和首基的合适的选择，复合体可以被定制来促进与靶细胞的质膜的融合或与选定的内膜(诸如，胞内膜或核膜)的融合，从而促进寡核苷酸运载物向适当的亚细胞区室的递送。通过脂复合物和聚复合物进行基因递送可参见例如Tros de Ilarduya等人的Eur.J.Pharm.Sci.40(2010)159–170。

中性脂质乳剂也可以用于与具有纳米数量级的直径的miRNA形成粒状复合体。

适当的脂质可以由技术人员根据施用、运载物和靶细胞来选择。可以使用单一脂质，或更常见地是脂质的组合。

合适的脂质描述于例如WO2011/088309和其中引用的参考文献中并且包括：

-中性脂质和磷脂质，诸如鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱(PC)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺(PE)、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂(sphinogomyelin)(SM)、心磷脂、磷脂酸(phosphosphatidic acid)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二月桂酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、二棕榈油酰-PE、二植烷酰-PE、DSPE、二反式油酰-PE、二亚油酰基-SM以及二亚油酰基-PE；

-固醇类，例如，胆固醇

-聚合物修饰的脂质，例如，聚乙二醇(PEG)修饰的脂质，包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG-神经酰胺缀合物、PEG修饰的二烷基胺以及PEG修饰的1,2-二酰氧基丙烷-3-胺。特别适合的是PEG修饰的二酰基甘油和二烷基甘油，例如，PEG-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)、PEG-二苯乙烯基甘油(PEG-DSG)以及PEG-氨甲酰基-1,2-二肉豆蔻氧基丙胺(PEG-cDMA)；

-阳离子脂质，诸如N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(“DODAC”)；N-(2,3-二油基氧基)丙基-N,N-N-三乙基氯化铵(“DOTMA”)；N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(“DDAB”)；N-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(“DOTAP”)；1,2-二油基氧基-3-三甲基氨基丙烷盐酸盐(“DOTAP.Cl”)；3β-(N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(“DC-Chol”)、N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N-2-(精胺羧酰胺)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(“DOSPA”)、八烷基酰氨基甘氨酰羧基精胺(“DOGS”)、1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(“DOPE”)、1,2-二油酰基-3-二甲基丙铵(“DODAP”)、N,N-二甲基-2,3-二油基氧基)丙胺(“DODMA”)、N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(“DMRIE”)、1,2-二亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1-亚油酰基-2-亚油醇氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氨基甲酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)以及2,2-二亚油基-4-10二甲基氨甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)。阳离子脂质的商业制剂包括Lipofectin^TM(包含DOTMA和DOPE，可获自Gibco/BRL)，以及Lipofectamine^TM(包含DOSPA和DOPE，可获自Gibco/BRL)。

-阴离子脂质，包括磷脂酰基甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷基磷脂酰基乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺以及赖氨酰磷脂酰基甘油。

WO/0071096描述了不同的制剂，诸如可以有效用于寡核苷酸递送的DOTAP:胆固醇或胆固醇衍生物制剂。

可商购的能够实现miRNA到肺部的良好递送的组合物是中性脂质乳剂MaxSuppressor体内型RNALancerII(BIOO Scientific,Austin,TX)，其由1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱、角鲨烯油、聚山梨醇20以及抗氧化剂组成。与合成miRNA复合时，它们形成纳米直径范围的纳米颗粒。

合适的聚合物包括组蛋白和鱼精蛋白(以及其它DNA结合蛋白)、聚(乙烯亚胺)(PEI)、阳离子树状聚合物诸如聚酰胺-胺(PAMAM)树状聚合物、甲基丙烯酸2-二甲基(氨基乙基)酯(pDMAEM)、聚(L-赖氨酸)(PLL)、基于碳水化合物的聚合物诸如壳聚糖等。有关综述参见Tros de Ilarduya等人，Eur.J.Pharm.Sci.40(2010)159–17。

还可以使用蛋白质和肽诸如去端肽胶原。去端肽胶原是通过蛋白酶处理产生的水溶性胶原形式，特别是来自小牛真皮的经胃蛋白酶处理的I型胶原。

环糊精也可以用于递送。

靶向剂

载体分子还可以携带能够结合至靶细胞的表面的靶向剂。例如，靶向剂可以是特异性结合配偶体，能够特异性地结合至靶肌腱细胞的表面上表达的分子。合适的结合配偶体包括针对细胞表面分子或这类细胞表面分子的配体或受体的抗体等等。可以帮助靶向肌腱细胞的表面标记物包括腱生蛋白C、CD55以及腱调蛋白。

术语“特异性结合对”用于描述包含特异性结合成员(sbm)及其结合配偶体(bp)的一对分子，所述特异性结合成员及其结合配偶体针对彼此具有特定特异性并且在正常条件下优先于与其它分子结合而彼此结合。特异性结合对的实例是抗体及其同源表位/抗原、配体(诸如激素等)和受体、抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白和生物素、凝集素和碳水化合物以及互补核苷酸序列。

众所周知的是，整个抗体的片段可以执行结合抗原的功能。功能结合片段的实例是(i)Fab片段，所述Fab片段由VL、VH、CL以及CH1结构域组成；(ii)Fd片段，所述Fd片段由VH和CH1结构域组成；(iii)Fv片段，所述Fv片段由单一抗体的VL和VH结构域组成；(iv)dAb片段(Ward,E.S.等人，Nature 341,544-546(1989))，所述dAb片段由VH结构域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，所述F(ab')2片段是包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，所述肽接头允许两个结构域缔合以形成抗原结合位点(Bird等人，Science,242,423-426,1988；Huston等人，PNAS USA,85,5879-5883,1988)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)以及(ix)“二价抗体”，所述二价抗体是通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；P.Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 6444-6448,1993)。

由于抗体可以多种方式修饰，术语“抗体”因此应被视为涵盖具有带所需特异性的结合结构域的任何特异性结合物质。因此，这个术语涵盖上文描述的抗体片段，以及抗体的衍生物、功能等效物和同源物，包括包含免疫球蛋白结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成的。包含免疫球蛋白结合结构域或等效物且其与另一种多肽融合的嵌合分子因此都被包括在内。EP-A-0120694和EP-A-0125023中描述了嵌合抗体的克隆和表达。

抗体的替代物正日益变得可获得。所谓的“亲和蛋白”或“工程化蛋白支架”常规可以针对特定靶标定制亲和力。它们典型地是基于具有构象稳定的或刚性的核心的非免疫球蛋白支架蛋白，所述支架蛋白经修饰对靶标具有亲和力。修饰可以包括一个或多个表面残基的置换、和/或支架蛋白的表面处的一个或多个残基的插入。例如，对靶标具有亲和力的肽可以插入到支架蛋白的表面环中，或可以置换支架蛋白的表面环的部分或全部。合适的支架及其工程化等效物包括：

-BPTI、LAC-DI、ITI-D2(Kunitz结构域支架)；

-ETI-II、AGRP(Knottin)；

-硫氧还蛋白(肽适体)；

-Fn3(AdNectin)；

-脂质运载蛋白(BBP)(Anticalin)；

-锚蛋白重复(DARPin)；

-蛋白A的Z结构域(Affibody)；

-γ-B-晶体蛋白/泛素(Affilin)；

-LDLR-A-结构域(Avimer)。

参见例如，Gebauer,M和Skerra,A,Current Op.Chem.Biol.2009,13:245-255；以及Friedman,M和Stahl,S,Biotechnol.Appl.Bio chem.(2009)53:1-29；以及其中引用的参考文献。

编码miR-29、模拟物和前体的核酸

作为向靶细胞直接递送miR-29寡核苷酸、模拟物和前体的替代方案，有可能向靶细胞递送编码miR-29寡核苷酸、其模拟物、或它们任一者的前体的核酸，以使得miR-29寡核苷酸、模拟物或前体被表达在靶细胞内。这种方法可以被视作是“基因治疗”。

对于技术人员而言将容易显而易见的是，核酸仅可以用于编码miR-29、其模拟物和前体，它们由RNA构成，即，由RNA的四种天然存在的核苷酸组分构成，而不具有修饰的碱基、糖或核苷间连键。

核酸典型地包含表达构建体，所述表达构建体包含编码miR-29寡核苷酸、模拟物或前体的核酸序列，所述核酸序列与适当的调节序列可操作地连接以促进表达。调节序列可以根据靶细胞来选择，但将典型地包括适当的启动子和任选地增强子，所述启动子和增强子通过RNA聚合酶II引导转录；以及转录终止子(正常包括多聚腺苷酸化信号)。

启动子可以是组织特异性启动子，所述组织特异性启动子优先或仅仅在靶细胞或组织中而不是在其它细胞或组织中驱动转录。

因此，启动子可以是优先或仅仅在肌腱细胞中驱动转录的启动子。1a1型胶原(col1a1)启动子可以是合适的启动子。

向靶细胞递送核酸

编码miR-29、模拟物和前体的核酸可以通过任何常规的途径来递送。

用于向细胞体内递送核酸的方法包括磷酸钙沉淀、DEAE-葡萄糖法、电穿孔、微量注射、负载DNA脂质体、超声处理以及使用涂布有核酸的微粒(例如，金或钨微珠)来轰击。各种这些技术已经成功地适于体内或离体使用。

因此，核酸可以裸露形式联合(例如，与之复合或由其胶囊化)合适的载体诸如聚合物或脂质(如在本说明书中其它地方所描述)一起施用；或者涂布在微粒表面上。在这类实施方案中，核酸典型地是DNA。核酸或载体还可以包含如本说明书中其它地方所描述的靶向部分或膜转运部分。任何这些方法也可以在适当时适于递送miR96、前体和模拟物本身。

核酸典型地呈现表达载体的形式。技术人员将能够针对治疗用途(以及针对本说明书中描述的其它用途)设计合适的核酸表达载体。载体将典型地包含表达构建体，所述表达构建体包含编码miR-29、模拟物或前体的核酸序列，所述核酸序列与适当的调节序列可操作地连接，所述调节序列包括启动子序列和转录终止序列，根据特定应用任选地与增强子序列、标记基因和其它序列组合。载体可能意图结合到宿主细胞染色体中，或者可能独立于宿主染色体作为游离体例如质粒而存在和复制。

可替代地，病毒载体可以用于递送核酸。

可以将任何合适的类型的病毒载体采用作为基因递送媒介物。这些病毒载体包括腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒(尤其是慢病毒)以及疱疹病毒载体。腺病毒和慢病毒可能是特别优选的，因为它们有能力实现未活跃地分裂的细胞中递送的基因的表达。

病毒载体典型地包含病毒结构蛋白和核酸有效负载，所述核酸有效负载包含所需的呈起到在靶细胞或组织中表达基因的作用的形式的表达构建体。因此，基因典型地可操作地连接至启动子和其它适当的转录调节信号。

在腺病毒载体中，核酸有效负载典型地是双链DNA(dsDNA)分子。在逆转录病毒载体中，所述核酸有效负载典型地是单链RNA。

核酸有效负载典型地包含将所述核酸有效负载包装到基因递送媒介物中所需的并且在靶细胞或组织中得到适当地处理的其它元件。

对于腺病毒载体，这些可以包括腺病毒反向末端重复(ITR)序列和适当的包装信号。

对于逆转录病毒载体，这些包括特征性末端序列(所谓的“R-U5”和“U3-R”序列)和包装信号。末端序列使得前病毒的任一端处能够产生同向重复序列(“长末端重复”或“LTR”)，这是逆转录的结果，所述同向重复序列之后促进前病毒结合到宿主细胞基因组中并且引导随后的表达。

核酸有效负载还可以包含可选择标记物，即，编码产物的基因，所述产物允许容易地检测转导的细胞。实例包括荧光蛋白(例如，GFP)、产生可视反应产物的酶(例如，β-半乳糖苷酶、荧光素酶)以及抗生素抗性基因的基因。

病毒载体典型地不具有复制能力。也就是说，核酸有效负载并不包含病毒复制所需的所有病毒基因(以及其它基因元件)。然而，病毒载体将包含所有结构蛋白以及以下所需的酶活性：将有效负载引入到宿主细胞中并且适当处理所述有效负载以使得编码的miR-29、模拟物或前体可以被表达。在这些未被核酸有效负载编码的情况下，所述病毒载体典型地将由包装细胞系来供应。技术人员将很好地了解到可以用于产生适当的病毒递送媒介物的合适的细胞系。

因此，对腺病毒载体，核酸有效负载典型地缺乏来自E1、E2、E3或E4区的一个或多个功能性腺病毒基因。这些基因可能是缺失的，或以其它方式例如通过插入包含异源基因或选择性标记物的转录单位来灭活。

在一些实施方案中，核酸不包含功能性病毒基因。因此，对于腺病毒载体，仅存在的病毒组分可能是ITR和包装信号。

不具有功能性病毒基因的核酸可能是优选的，因为所述核酸降低了因病毒蛋白合成而对转导的靶细胞或组织产生宿主免疫应答的风险。

病毒载体可以被工程化，以使得它们具有能够结合至靶细胞上的标记物的修饰的表面蛋白，从而增加所需靶细胞将被转导的机会并且减少其它细胞或组织类型的非特异性转导的机会。这种方法有时被称为假型化。因此，病毒载体可以包含能够结合至肌腱细胞上的表面标记物的表面蛋白。可以帮助靶向肌腱细胞的表面标记物包括腱生蛋白C和CD55。

肌腱和肌腱损伤

肌腱是将肌肉附接至骨头的结缔组织。所述肌腱允许来自收缩肌肉的力转而施加到与肌肉自身¹相距一定距离处的附接的骨骼结构上。

肌腱是复杂的、系统性组织的组织并且包含若干相异的层。

肌腱自身是大致上呈单轴的复合物，所述复合物包含约30％胶原和2％弹性蛋白(湿重)，它们嵌入在包含各种类型的细胞(最显著的是肌腱细胞³)的胞外基质中。

主要胶原是I型胶原，所述I型胶原具有大的直径(40-60nm)并且连接在一起形成紧密的纤维束。还存在3型胶原并且3型胶原直径较小(10-20nm)，从而形成较为松散的网束。

胶原被组织(以不断提高的复杂性)为原纤维、纤维、纤维束以及神经纤维束，它们由一层松散的、成胶质的且富含脂质的称为肌腱的结缔组织基质包围⁴。一层称为腱鞘的相同物质覆盖在整个肌腱的表面上。包围腱鞘的是称为腱旁组织的结缔组织，所述结缔组织包含1型和3型胶原原纤维、一些弹性原纤维和一层滑膜细胞。一些肌腱另外由腱鞘包围。

肌腱内的主要细胞类型是肌腱细胞和肌腱母细胞(tenoblast)，它们两者都是成纤维细胞样的细胞¹⁴。这两种类型的细胞对于维持健康的肌腱而言都是很重要的，因为两者都产生胶原并且维持胞外基质¹⁵。因此，如本说明书中所使用的术语“肌腱细胞”涵盖肌腱细胞和肌腱母细胞两者。

肌腱细胞是扁平的成锥形的细胞，所述细胞在纵向方向上呈纺锤形，且在截面上呈星形，并且在胶原纤维之间很难检测到成排的肌腱细胞。所述肌腱细胞具有形成延伸穿过胞外基质的三维网状物的复杂的细胞突(经由细胞突交流信息)并且可以是活动性的。

肌腱母细胞是肌腱细胞的前体。所述肌腱母细胞是呈纺锤形形状或星形的细胞，所述细胞具有长的成锥形的嗜酸性的扁平的核。它们是活动性的并且是高度增殖性的。

在胚胎发育过程中，如同骨骼成肌细胞、软骨细胞和成骨细胞一样，肌腱母细胞以及因此肌腱细胞起源于中胚层区室¹⁶。产生自这些区室的多潜能间充质祖细胞中的一些表达碱性的螺旋-环-螺旋转录因子scleraxis。然而，一旦它们定型为构成特异性组织的细胞，仅肌腱母细胞和肌腱细胞保持表达scleraxis的能力。scleraxis基因因此是发现对于在发育期间建立肌腱谱系而言必需的首要主基因。腱调蛋白是后期(胚胎期[E]第17.5天)发育阶段中小鼠肌腱内诱导的II型跨膜糖蛋白，并且也可在成人肌腱中观察到。因此，scleraxis表示肌腱母细胞和肌腱细胞两者的标记物，而腱调蛋白是成熟肌腱细胞的表面标记物¹⁹。

肌腱损伤可能是由众多因素引起的或者与众多因素相关联，包括(但不限于)外部创伤、机械应力(包括过度使用)、变性、炎症以及这些因素的组合，它们经常被称为“肌腱病”。

术语“肌腱损伤”通常用于指代因包括外部创伤和肌腱断裂(即，肌腱完全断裂)的单次创伤事件所致的急性损伤。

肌腱病是多因素的，具有从急性到慢性的疾病范围，并且往往与肌腱的过度使用相关联，所述过度使用可能是瞬时的或延续的一段时间内的过度使用。肌腱病可能涉及胶原的变性或在微观或宏观层面上其它种类对胶原的机械损伤(有时称为“肌腱变性”)、炎症或两者的组合(有时称为“肌腱炎”)。

肌腱的生物力学特性尤其是其抗张强度与截面面积(即，厚度)、胶原含量和不同类型胶原之间的比率相关。在急性损伤之后、在肌腱病期间以及在肌腱损伤的愈合期间，胶原合成发生变化，偏离1型胶原而朝向3型胶原合成。1型胶原合成可以在初始下降之后返回到正常水平，但是3型合成的持续增加会导致胶原比的长期失衡。这会对肌腱的生物力学特性产生显著有害的影响。具体而言，胶原比的长期失衡会降低肌腱的抗张强度，从而降低其最终的断裂强度并且因此使得肌腱随后更容易断裂。

本发明的方法可以应用于任何损伤的肌腱。人体中受肌腱病影响的主要肌腱是跟腱、冈上肌腱、屈肌总腱以及伸肌总腱。马受试者体内受肌腱病影响的主要肌腱是浅屈肌腱。这些可以代表治疗的特别重要的靶标。

miR-29、模拟物和前体的治疗应用

诸位发明人已发现，通过增加肌腱细胞中的miR-29活性，有可能将胶原平衡改变成有利于1型胶原合成而偏离3型胶原合成。

因此，本发明提供用于通过miR-29的治疗应用来调整肌腱愈合的方法。本说明书中描述的方法可以被视作是用于调整肌腱中的相对胶原组成和/或合成，尤其是肌腱中的1型和3型胶原的相对含量和合成的方法。认为可将平衡调整成有利于1型胶原，即，在肌腱内相对于3型胶原增加1型胶原的合成或含量。将了解到，这不一定涉及1型胶原合成或含量的净增加，因为miR-29可能会抑制1型胶原合成。然而，将在比1型胶原更大的程度上抑制3型胶原的合成。

在生理学层面上，本说明书中描述的方法可以被视作是用于调整肌腱的生物力学特性，优选地改进肌腱的生物力学特性，例如提高或增加肌腱的抗张强度的方法。

可以在肌腱病的任何阶段、或在损伤的肌腱的愈合过程的任何阶段应用本发明的方法。例如，所述方法可以用于在肌腱病的愈合期间或在急性肌腱损伤(诸如断裂的肌腱)的愈合期间调整肌腱的胶原比，以及因此生物力学特性。

因此，本发明的方法可以同样被视作是用于治疗肌腱损伤，包括因肌腱损伤和肌腱病所致的损伤的方法。

在损伤之后的短时间内以及在肌腱病早期，可以在肌腱中观察到IL-33。不希望受到任何特定理论的限制，IL-33可以参与从1型胶原合成转换为3型胶原合成。然而，认为胶原合成的失衡在IL-33的初始参与之后还会持续存在。本发明的方法并不限于早期肌腱损伤的治疗，而是同样适用于后期损伤或疾病，例如慢性肌腱病。

因此，可以在症状发作的任何阶段或在创伤事件对肌腱造成损伤之后施用治疗。例如，可以在症状发作或创伤事件之后1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更多天施用治疗。可以在症状发作或创伤事件之后1周、2周、3周、4周或更多周施用治疗。可以在症状发作或创伤事件之后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更多个月施用治疗。

治疗的受试者

虽然治疗的最常见的受试者会是人，但是本发明的方法可以扩展到任何其它哺乳动物，包括其它灵长类动物(尤其是大型猿类，诸如大猩猩、黑猩猩和猩猩，而且还有旧世界猴和新世界猴)以及啮齿类动物(包括小鼠和大鼠)，以及其它常见实验室动物、家养动物和农业动物(包括但不限于兔、狗、猫、马、奶牛、绵羊、山羊等)。

所述方法可能特别适用于马受试者，即马。马以及尤其是纯血马诸如赛马特别容易出现肌腱损伤。考虑到所关注的许多动物的价值，对有效治疗存在长期持续的需求。

治疗的药用组合物和方法

本文描述的分子可以药用组合物的形式配制。除了以上物质中的一种之外，这些组合物还可以包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其它物质。这类物质应是无毒的，并且应该不干扰活性成分的功效。载体或其它材料的精确性质可以取决于施用途径，例如，口服、静脉内、经皮或皮下、经鼻、肌内以及腹膜内途径。Esseku和Adeyeye(2011)以及Van den Mooter G.(2006)中提供了合适的组合物和施用方法的实例。

用于口服施用的药用组合物可以是呈片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可以包含固体载体，诸如明胶或佐剂。液体药用组合物通常包含液体载体，诸如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。生理盐水溶液、右旋糖或者其它糖溶液或二元醇，诸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇可以被包含在内。

对于静脉内注射、经皮注射或皮下注射，或者患病部位处的注射，活性成分将是肠胃外可接受的水溶液的形式，所述水溶液是无热原的并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域的相关技术人员完全能够使用例如，等渗媒介物，诸如氯化钠注射液、林格氏注射液、加入乳酸盐的林格氏注射液来制备合适的溶液。根据需要，可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。

鉴于有待治疗的病状的局部性质，局部注射施用可能是特别合适的。可以将注射液递送到患病肌腱中或递送在患病肌腱的紧邻区域中。

无论即将给予个体的活化剂(例如，细胞、多肽、核酸分子、根据本发明其它药学上有用的试剂)的性质如何，优选地以“预防有效量”或“治疗有效量”(视情况而定，尽管预防也可以被视作是治疗)施用，所述剂量足以使个体受益。实际施用量以及施用速率和时程将取决于正治疗的疾病的性质和严重程度。治疗处方例如剂量等的决定属于普通医疗工作者和其它医生以及兽医学领域的兽医的责任范围内，并且典型地考虑有待治疗的病症、个体患者的状况、递送部位、施用方法以及医疗工作者已知的其它因素。上文提及的技术和方案的实例可以参见2000年由Lippincott,Williams & Wilkins出版的Remington’sPharmaceutical Sciences，第20版。

现将参考附图和实施例以举例而非限制的方式更详细地描述本发明。

附图说明

图1：肌腱中的IL-33/ST2表达。

肌腱样品中的(A)IL-33、(B)可溶性ST2(sST2)以及(C)膜结合型ST2(mST2)基因表达。IL-33、可溶性/膜结合型ST2在对照(n＝10)、撕裂的冈上肌和匹配的肩胛下肌人肌腱样品(n＝17)中的基因表达的倍数变化。所示的数据点是相较于管家基因18S的相对表达(两次重复分析的平均值)。平均值±SD反映了t检验的患者群体比较。(D)以所示的平均值和SEM对肌腱样品进行改良型Bonar评分。对于对照肌腱(Ctl)，n＝10；对于撕裂的肌腱和早期肌腱病，n＝17。改良型Bonar评分系统描绘了基于10个高倍视野的平均评分/样品。0＝未染色，1＝<10％，2＝10％-20％，3＝>20％阳性细胞染色/高倍视野。(E)IL-33和ST2在用相应剂量的TNFα单独、IL-1β单独以及组合地孵育后24小时的基因表达的倍数变化。所示数据是三个重复样品的平均值±SD，并且进而表示对三个单独患者样品执行的实验。与对照样品相比较，*p<0.05，**p<0.01。(F)col1和col3用50和100ηg/ml的rhIL-33孵育后24小时的基因表达的倍数变化。(G)col1和col3用100ηg/ml IL-33孵育后的基因表达的时程。(H)在rhIL-33的浓度不断增加的情况下孵育后24小时的1型和3型胶原蛋白的表达。对于F、G和H，所示数据是三个重复样品的平均值±SD，并且进而表示对三个单独患者样品执行的实验。与对照样品相比较，*p<0.05，**p<0.01。

图2：体内肌腱愈合的IL-33/ST2轴。

(A，B)有关损伤后第1天、第3天、第7天以及第21天的IL-33基因表达和可溶性ST2基因表达。所示数据是平均倍数变化±SD(根据四种顺序情况对4只小鼠/组执行获得的合并数据，因此n＝16/情况)；对照对比损伤的小鼠，*p<0.05，**p<0.01。(C，D)损伤后WT和ST2-/-在损伤后第1天和第3天的col1mRNA和1型胶原蛋白的水平。(E，F)WT和ST2-/-在损伤后第1天和第3天的col3mRNA和3型胶原蛋白的水平。所示的数据是两个重复样品的平均值±SD，并且表示使用四只小鼠在每种情况下进行的实验(n＝16)。对照对比损伤的小鼠，*p<0.05，**p<0.01。WT损伤的小鼠对比ST2-/-损伤的小鼠，+p<0.05，++p<0.01。(G)WT和ST2-/-损伤和未损伤的肌腱在损伤后第1天和第3天的肌腱强度的百分比变化。所示的数据是平均值±SD，并且表示使用四只小鼠在每种情况下进行的实验(n＝16)。对照对比损伤的小鼠，*p<0.05，**p<0.01。ST2-/-损伤的小鼠对比WT损伤的小鼠，#p<0.05。

图3：IL-33促进3型胶原产生并且降低肌腱强度，而抗IL-33在体内减弱了这些肌腱损伤的变化。

用rhIL-33治疗的WT和ST2-/-小鼠在损伤后第1天的(A)col1mRNA，(B)1型胶原蛋白，(C)col3mRNA以及(D)3型胶原蛋白。所示的数据是两个重复样品的平均值±SD，并且表示使用四只小鼠在每种情况下进行的实验(n＝16)。损伤的小鼠对比未损伤的小鼠，*p<0.05，**p<0.01。WT对比ST2-/-小鼠，+p<0.05。(E)WT未损伤的小鼠在用rhIL-33治疗后第1天和第3天的肌腱强度的百分比变化。所示的数据是平均值±SD，并且表示每组使用四只小鼠进行的实验(n＝16)。损伤的小鼠对比未损伤的小鼠，**p<0.01。WT小鼠在用抗-IL-33治疗之后，在肌腱损伤后第1天和第3天的(F)col1mRNA，(G)1型胶原蛋白，(H)col3mRNA以及(I)3型胶原蛋白的水平。(J)用抗IL-33治疗的WT小鼠在损伤后第1天和第3天的肌腱强度的百分比变化。所示的数据是平均值±SD，并且表示使用四只小鼠在每种情况下进行的实验(n＝16)。损伤的小鼠对比未损伤的小鼠，*p<0.05，**p<0.01。A-J，所示的数据是两个重复样品的平均值±SD，并且表示使用四只小鼠在每种情况下进行的实验(n＝16)。

图4：微小RNA 29直接靶向可溶性ST2–参与肌腱疾病的胶原基质变化。

(A)miR-29家族的所有成员(miR-29a、miR-29b和miR-29c)被表达在肌腱病的肌腱细胞(n＝6个患者样品)中。较低的ΔCt值指示较高的表达水平。miR-29家族在对照、撕裂的冈上肌(撕裂的肌腱)和匹配的肩胛下肌肌腱(早期肌腱病)中的基因表达。所示的数据是两个重复样品的平均值±SD，并且表示对十个患者样品进行的实验。*p<0.05，**p<0.01。(B)在添加100ng/ml的rhIL-33之后的miR-29a表达的时程。(C和D)在用零乱的模拟物、miR-29a模拟物或miR29a反义寡核苷酸转染之后的col1和col3mRNA以及1型和3型胶原蛋白的表达。(E)在添加miR-29a模拟物/反义寡核苷酸和100ng rhIL-33之后的3型胶原蛋白的水平。对于B-E，所示的数据是两个重复样品的平均值±SD，并且表示对五个肌腱外植体样品进行的实验。(n＝5)p<0.05，**p<0.01(F)用包含Col 1a1、Col 1a2或Col 3a1的3’UTR的前体miR-29a转染的原代人肌腱细胞中的荧光素酶活性。相对于用零乱的RNA转染的对照来确定活性，所述对照的活性被定义为100％。在3个独立的实验中重复这一操作。与零乱的对照对比，*p<0.05，**p<0.01。(G)col3a1和col1a1/col1a2的长/短形式上的miR-29a结合位点和MRE’突出了可选择性多聚腺苷酸化位点。(H)在用miR-29a转染之后的肌腱细胞(T)中的长/短胶原转录物的百分比。(I)在用零乱的模拟物和miR-29a反义寡核苷酸转染之后的col1a1、col1a2和col3a1mRNA。所示的数据是两个重复样品的平均值±SD，并且表示对三个肌腱外植体样品进行的实验。(n＝3)p<0.05，**p<0.01

图5：IL-33/ST2体内调节肌腱愈合所用的miR-29

(A)用包含可溶性ST2的3’UTR的pre-miR-29a，连同用可溶性ST2的3’UTR的miRNA调节元件(MRE’)对HEK 293细胞进行的共转染以及所得的荧光素酶活性测定。与零乱的对照对比，***p<0.001(n＝3)(B)在添加零乱的模拟物、miR-29a模拟物或miR-29a反义寡核苷酸之后的sST2和膜结合型ST2mRNA的水平(C)在用miR29a模拟物/反义寡核苷酸孵育之后的人sST2蛋白生产量(ng/ml)。(n＝5)p<0.05，**p<0.01。

(D)定量PCR示出WT损伤的动物对比未损伤的动物在损伤后第1天和第3天的miR-29a的平均倍数变化±SD。(E)定量PCR示出针对WT和ST2-/-小鼠，损伤的动物对比未损伤的动物在用rhIL-33或PBS治疗之后在损伤后第1天的miR-29a的平均倍数变化±SD。(F)在添加抗IL-33之后损伤的WT动物在损伤后第1天和第3天的miR-29a表达。所示的数据是两个重复样品的平均倍数变化±SD，并且表示每组使用四只小鼠进行的实验(n＝16)。p<0.05，**p<0.01。

图6：肌腱病变的IL-33/miR-29轴。

示意图说明了IL-33/miR-29a在肌腱病变中的作用。使肌腱细胞经受应激的肌腱损伤或重复的微裂痕会导致释放IL-33以及NFkB下游的磷酸化作用，所述磷酸化作用反过来阻遏miR-29a，从而引起3型胶原和可溶性ST2产生的增加。3型胶原的增加降低了肌腱最终的抗张强度，从而导致了肌腱的早期断裂，而可溶性ST2以自分泌形式起作用，这最终可以形成保护机制，借此过量的IL-33被从系统去除。

图7

(A)图示出了两个由Targetscan预测的miR-29a MRE位点的种子区域：29-1和29-2(B)用包含Col 1或Col 3的3’UTR的前体miR-29a/b/c(pre-miR-29)转染的HEK 293细胞的荧光素酶活性。相对于用零乱的RNA转染的对照来确定活性，所述对照的活性被定义为100％。在3个独立的实验中重复这一操作。与零乱的对照对比，*p<0.05，**p<0.01。(C)用包含可溶性ST2的3’UTR的pre-miR-29a、b、c对HEK 293细胞进行的共转染显示出与用零乱的RNA转染的对照相比较，miR-29a显著降低了相对荧光素酶活性(n＝3)

(D)在萤光素酶测定法中测试存在于短的col3a1 3’UTR变体中的其余miR-29结合位点对miR-29a的敏感性并且发现完全具有活性。

(E)来自人和马的肌腱细胞胶原转录物的3’RACE产物的序列。以下划线标注了多聚腺苷酸化信号。以斜体字示出了人Col3a1(短的3’UTR)转录物和马Col3a1转录物中的miR29a MRE。

图8

WT小鼠在肌腱损伤之后用miR-29a模拟物治疗后的(A)Col3mRNA，(B)3型胶原蛋白，(C)Col1mRNA以及(D)1型胶原蛋白的水平。mRNA的数据是两个重复样品中的基因总拷贝数对比18S管家基因。数据是两个重复样品的平均值±SD，表示每组6只小鼠，与对照对比，*p<0.05，**p<0.01。(ANOVA)

发明详述

材料和方法

肌腱病的人模型

所有程序和方案都得到了伦理委员会(Ethics Committee)根据ACEC第99/101号作出的批准。从因回旋肌腱群撕裂而经历肩部手术的患者收集十五个冈上肌肌腱样品(表1)。回旋肌腱群断裂的患者的平均年龄是54岁(范围为35-70岁)-平均裂痕大小是2.5cm。同时从相同的患者收集肩胛下肌肌腱的样品。患者只有在以下情况下才被包括在内：在外科手术前MRI扫描上不存在肩胛下肌肌腱病的临床可检测的证据或者在关节内窥镜术时不存在对肩胛下肌肌腱的肉眼可见的损伤–通过这些标准，所述患者代表真实的临床前组群。获得独立的对照组，所述对照组包括从出于肩部稳定而非回旋肌腱群撕裂目的经历关节内窥镜手术的患者收集的10个肩胛下肌肌腱的样品。通过关节内窥镜的检查证实不存在回旋肌腱群撕裂。对照组的平均年龄是35岁(范围为20-41岁)。

组织收集和制备

使用如前文所述的标准的三通道技术来执行对回旋肌腱群的关节内窥镜修复。如前文所述估测和记录回旋肌腱群裂痕的截面大小³⁹。以关节内窥镜方式从盂唇外侧1cm处的肌腱的上缘收获肩胛下肌肌腱。在手术修补之前从裂痕边缘的1.5cm范围内收获冈上肌肌腱。在免疫组织化学染色中，将组织样品立即固定在10％(v/v)的福尔马林中，持续4至6小时，并且之后将所述组织样品嵌入在石蜡中。使用Leica-LM显微切片机(LeicaMicrosystems,Germany)将所述石蜡切割成5μm厚的切片，并且将所述切片置于SuperfrostUltra Plus载玻片(Gerhard Menzel,Germany)上。用二甲苯将石蜡从组织切片上去除，在分级醇中重新水合并且根据先前确立的方法将所述切片用于组织学和免疫组织化学染色⁴⁰。

将人肌腱来源的细胞从经历腘绳肌腱ACL重建术的5名患者(年龄为18-30岁)的腘绳肌腱组织植出。将培养物在37℃下在5％CO₂的湿润环境中维持28天。在亚融合状态下，对细胞进行继代培养并且在胰蛋白酶下解离所述细胞。将来自第3代和第4代的细胞用于含氧量正常的情况中。

组织学和免疫组织化学技术

用苏木精和曙红以及甲苯胺蓝对人切片进行染色，以用于确定通过改良版本的Bonar评分评定的肌腱病的程度⁴¹(4级＝明显肌腱病，3级＝晚期肌腱病，2级＝中度变性，1级＝轻度变性，0级＝正常肌腱)。这包括存在或不存在水肿和变性以及成纤维细胞细胞结构和软骨样化生的程度。此后，用针对以下标记物的抗体对切片进行染色：-IL-33(Alexis，小鼠单克隆)、ST2(Sigma Aldrich，兔多克隆)、IL-1RaCP(ProSci，兔多克隆)、CD68(潘巨噬细胞)、CD3(T细胞)、CD4(T辅助细胞)、CD206(M₂巨噬细胞)以及肥大细胞类胰蛋白酶(肥大细胞)(Vector Labs)。

用3％(v/v)H₂O₂淬灭内源性过氧化物酶活性，并且用2.5％马血清的TBST缓冲液将非特异性抗体结合阻断30分钟。在0.01M柠檬酸盐缓冲液中利用微波执行抗原修复，持续20分钟。在4℃下，在2.5％(w/v)马血清/人血清/TBST中用一级抗体将切片孵育过夜。在两次洗涤之后，利用Vector ImmPRESS Reagent试剂盒按照制造商说明书将载玻片孵育30分钟。对载玻片进行洗涤并且利用Vector ImmPACT DAB显色原溶液将所述载玻片孵育2分钟，之后进行充分洗涤。最终，用苏木精对切片进行复染。除了用于每种单独的抗体染色技术的外科手术试样之外，还包括阳性(人扁桃体组织)和阴性对照试样。一级抗体的省略和阴性对照同种型的使用证实了染色的特异性。

我们基于先前的方法来应用评分系统⁴²以使免疫组织化学染色量化。通过三个独立的评定方(NLM、JHR、ALC)来评估十个随机高倍视野(x400)。在每个视野中，计数阳性和阴性染色的细胞的数目并且计算阳性细胞的百分比，从而给出以下半定量的分级；0级＝未染色，1级＝<10％细胞呈阳性染色，2级＝10％-20％细胞呈阳性染色，3级＝>20％细胞呈阳性染色。

使用以上方案利用针对以下标记物的抗体来处理小鼠切片：-IL-33(R&D系统，小鼠单克隆)、ST2(Sigma Aldrich，兔多克隆)、F4/80(Serotec，小鼠单克隆)以及Anti-Histamine(Sigma Aldrich，兔多克隆)。

基质调节

评估肌腱细胞的1型胶原和3型胶原的免疫组织化学染色以评定肌腱细胞基质产生(Abcam)。使用Sircol测定试剂盒(Biocolor Ltd,Carrickfergus,Northern Ireland)根据制造商的方案来从细胞培养上清液测量总可溶胶原。将1ml Sircol染料试剂添加至100μl测试样品，并且在室温下混合30分钟。通过以10,000×g离心10分钟来使胶原-染料复合体沉淀；并且之后用500μl乙醇洗涤两次。将粒料溶解在500μl碱性试剂中。通过酶标仪测量540nm处的吸光度。基于由制造商提供的胶原标准物来产生校准曲线。另外，使用ELISA根据通过酶标仪在450nm处测量的颜色变化连同制造商供应的标准物(USCNK Life ScienceInc)来评定人和小鼠1型和3型胶原的浓度。

信号传导实验

使用人磷酸化-MAPK测定(R&D系统，Europe,UK)按照制造商说明书来评估丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、胞外信号调节的激酶(ERK1/2)、c-Jun N-末端激酶(JNK)以及p38同工型的磷酸化状态。ERK抑制剂(FR180204)购自CalbioChem(Merck KGaA,Germany)，并且在IC₅₀＝10μM(先前确定来相对于脱靶效应提供最优特异性抑制的浓度)下使用，我们的实验室先前使用过该浓度⁴³。

使用InstantOne ELISA在来自处理过的和未处理的肌腱细胞的细胞裂解物中评定NFΚβp65的磷酸化作用。通过酶标仪测量450nm处的吸光度，其中阳性和阴性对照由制造商供应。使用受刺激的对比未受刺激的细胞的相对吸光度来评定每个样品中的总NFΚβp65或磷酸化的NFΚβp65。

RNA提取和定量PCR

在mRNA提取之前利用Trizol将细胞从正常氧和低氧实验中分离出来。QIAgen微柱(Qiagen Ltd,Crawley UK)用于根据制造商的说明书利用结合的柱上DNA酶步骤进行的RNA纯化。根据AffinityScript^TM(Agilent Technologies,CA,USA)多温度cDNA合成试剂盒依据制造商的说明书来从RNA样品制备cDNA。使用SYBR green或Taqman FastMix(AppliedBiosystems,CA,USA)根据探针是否与引物一起使用来执行实时PCR。使用不含RNa酶的水以1:5稀释cDNA。分析每个样品，重复三次。引物(Integrated DNA Technologies,Belgium)如下：GAPDH，5'-TCG ACA GTC AGC CGC ATC TTC TTT-3'(f)和5'-ACC AAA TCC GTT GAC TCCGAC CTT-3'(r)；IL-33人GGA AGA ACA CAG CAA GCA AAG CCT(f)TAA GGC CAG AGC GGAGCT TCA TAA(r)；IL-33鼠GGA AGA ACA CAG CAA GCA AAG CCT(f)TAA GGC CAG AGC GGAGCT TCA TAA(r)；总ST2人ACA ACT GGA CAG CAC CTC TTG AGT(f)ACC TGC GTC CTC AGTCAT CAC ATT(r)；sST2鼠CCA ATG TCC CTT GTA GTC GG(f)CTT GTT CTC CCC GCA GTC(r)；TCC CCA TCT CCT CAC CTC CCT TAA T(探针)；ST2L鼠TCT GCT ATT CTG GAT ACT GCTTTC，TCT GTG GAG TAC TTT GTT CAC C(r)AGA GAC CTG TTA CCT GGG CAA GAT G(探针)；人ST2L ACA AAG TGC TCT ACA CGA CTG(f)TGT TCT GGA TTG AGG CCA C(r)；CCC CAT CTGTAC TGG ATT TGT AGT TCC G(探针)；人sST2GAG ACC TGC CAC GAT TAC AC(f)TGTTAAACCCTGAGTTCCCAC(r)；CCC CAC ACC CCT ATC CTT TCT CCT(探针)；Col 3A人TTGGCA GCA ACG ACA CAG AAA CTG(f)TTG AGT GCA GGG TCA GCA CTA CTT(r)Col 3A小鼠GCTTTG TGC AAA GTG GAA CCT GG(f)CAA GGT GGC TGC ATC CCA ATT CAT(r)；COL 1A1人CCATGC TGC CCT TTC TGC TCC TTT(f)CAC TTG GGT GTT TGA GCA TTG CCT(r)；COL 1A1小鼠TTC TCC TGG CAA AGA CGG ACT CAA(f)GGA AGC TGAAGT CATAAC CGC CA(r)

RNA分离和miRNA的实时定量PCR分析

通过miRNeasy试剂盒(Qiagen)来分离总RNA。miScript逆转录试剂盒(Qiagen)用于cDNA制备。TaqMan mRNA测定(AppliedBiosystems)或miScript引物测定(Qiagen)用于人miR-29a(MS(MS00001701)29b(MS00006566)和29c(MS00009303)以及小鼠29a(MS00003262)、29b(MS00005936)和29c(MS00001379)的表达的半定量测定。U6B核内小RNA或β-肌动蛋白的表达用作内源对照。

可选择性多聚腺苷酸化胶原转录物的量化

1型和3型转录物的长的和短的3’UTR形式的绝对水平通过相对于标准物进行q-PCR来测定。使用具有随机六聚体和寡-dT引物的AffinityScript(Agilent)来产生cDNA。使用以下引物来执行SYBR green定量-PCR：相对于GAPDH内源对照来将样品归一化。

Col1a2_S FW 5′ GCCTGCCCTTCCTTGATATT 3′

Col1a2_S REV 5′ TGAAACAGACTGCGCCAATG 3′

col1a2_L FW 5′ TCAGATACTTGAAGAATGTTGATGG 3′

col1a2_L REV 5′ CACCACACGATACAACTCAATAC 3′

Col1a1_S FW 5′ CTTCACCTACAGCGTCACT 3′

Ccl1a1_S REV 5′ TTGTATTCAATCACTGTCTTGCC 3′

col1a1_L FW 5′ CCACACAAAGCAGAAACATC 3′

col1a1_L REV 5′GCAACACAGTTACACAAGGAAC 3′

CoL3A1_S FW 5′ CTATGACATTGGTGGTCCTGAT 3′

COL3A1_S REV 5′ TGGGATTTCAGATAGAGTTTGGT 3′

CoL3A1_L FW 5′ CCACCAAATACAATTCAATTCAAATGC 3′

CoL3A1_L REV 5′ GATGGGCTAGGATTGATTCAAAGA 3′

3’cDNA末端快速扩展术(RACE)

为了表征人序列，使用MiRscript II逆转录酶试剂盒(Qiagen)对cDNA执行3’RACE，cDNA产生自从人肌腱细胞分离的总RNA。通过PCR使用下文所列的以下基因特异性正向引物连同来自试剂盒的通用反向引物来使cDNA末端扩增。

人3’RACE基因特异性正向引物：

RACE-Col1a1-L FW 5′ GACAACTTCCCAAAGCACAAAG 3′

RACE-Col1a1-S FW 5′ CTTCCTGTAAACTCCCTCCATC 3′

RACE-Col1a2-L FW 5′ TCTTCTTCCATGGTTCCACAG 3′

RACE-Col1a2-S FW 5′ CCTTCCTTGATATTGCACCTTTG 3′

RACE-Col3a1-L FW 5′CTATACATTGGTGGTCCTGAT 3′

RACE-Col3a1-S FW 5′ GTGTGACAAAAGCAGCAGCCCATAA 3′

为了表征马序列，使用3’cDNA末端快速扩展术(3’RACE)来使马肌腱细胞中表达的Col1a1、Col1a2和Col3a1转录物的3’UTR扩增。对扩增的cDNA片段进行测序，并且根据AATAAA的位置来鉴别polyA信号，经典的polyA信号位于polyA尾部5’处的10到30个核苷酸处。

马3’RACE引物：

马 col1a1 GSP1 CCCTGGAAACAGACAAACAAC

马 col1a1 GSP2 CAGACAAACAACCCAAACTGAA

马 col1a2 GSP1 GCTGACCAAGAATTCGGTTTG

马 co1a2 GSP2 ACATTGGCCCAGTCTGTTT

马 col3a1 GSPl AGGCCGTGAGACTACCTATT

马 col3a1 GSp2 CTATGATGTTGGTGGTCCTGAT

马 col1a1 q-PCR fw CAGACTGGCAACCTCAAGAA

马 col1a1 q-PCR rev TAGGTGACGCTGTAGGTGAA

马 col1a2 q-PCR fw GGCAACAGCAGGTTCACTTAT

马 col1a2 q-PCR Rev GCAGGCGAGATGGCTTATTT

马 col3a1 q-PCR fw CTGGAGGATGGTTGCACTAAA

马 col3a1 q-PCR rev CACCAACATCATAGGGAGCAATA

将所得PCR产物克隆到pCR2.1TOPO(Invitrogen)中并且进行测序。

miRNA转染

在20nM的最终浓度下，通过使用3siRNA转染试剂(Thermo Scientific Inc)，利用miR 29a和29b的合成的成熟的miRNA或利用阴性对照(标记有Dy547的秀丽隐杆线虫(C.elegans)miR-67模拟物，Thermo Scientific Inc)对细胞进行转染。在转染后48小时，收集细胞裂解物以分析所关注的基因的表达。

通过流式血细胞计数术使用Dy547标记的模拟物来评定转染率，并且通过零乱对照的模拟物和相应的miR29家族模拟物的定量PCR来证实转染率。

用于靶向1型和3型胶原以及可溶性ST2的萤光素酶报告基因测定

通过使寡核苷酸退火来产生人2miRNA靶位点：对于COL 1和3以及可溶性ST2，它们的3’UTR按照pMIR-REPORT荧光素酶载体(Ambion)中的荧光素酶基因下游的正义取向和反义取向来克隆。对这些构建体测序以证实插入物，并且命名为pMIR-COL I/COL III/sST2-miR29a/b/c以及pMIR(A/S)-COL I/COL III/sST2-miR29a/b/c，并且将所述构建体用于HEK293细胞的转染。在96孔板中培养HEK293细胞，并且用0.1μg pMIR-COL I/COL III/sST2-miR29a/b/c、pMIR(A/S)-COL I/COL III/sST2-miR29a/b/c或pMIR-REPORT，连同用包含海肾荧光素酶的0.01μg pRL-TK载体(Promega)和40nM miR-155或零乱的miRNA(ThermoScientific)来对所述HEK293细胞进行转染。使用Effectene(Qiagen)根据制造商的说明书来进行转染。在转染后二十四小时，使用双萤光素酶报导基因测定(Promega)来测量荧光素酶活性。人sST2的3’UTR是使用以下引物sST2fw 5’AGTTTAAACTGGCTTGAGAAGGCACACCGT3’和sST2rev 5’AGTCGACGGGCCAAGAAAGGCTCCCTGG3’从基因组DNA扩增而来的，所述引物分别产生PmeI和SalI位点。这些位点用于将PCR扩增的产物克隆到pmiRGLO(Promega)的相同位点中。使用QuickChange定点诱变试剂盒(Agilent)来使两个由Targetscan预测的miR29a MRE位点的种子区域：29-1和29-2突变。使用Attactene(Qiagen)根据制造商的说明书来将每个载体连同miR29a或零乱的对照模拟物转染到HEK293细胞中。在24小时之后，使用Dual-Glo萤光素酶测定法(Promega)来测量荧光素酶活性，其中将荧光素酶活性相对于海肾荧光素酶归一化。归一化的荧光素酶活性表达为相同构建体的零乱的对照的百分比。

细胞因子产生

25-Plex人细胞因子测定评估使用Luminex技术对25个单独的人细胞因子进行的体外定量测定。上清液(n＝3)

髌肌腱损伤模型

在外科手术的准备过程中，用异氟烷(3％)和氧(1％)的混合物对小鼠进行麻醉，并且将两个后肢剃光。在外科手术过程中，利用水平下降至1％的异氟烷和氧经由鼻锥来递送麻醉。在切开皮肤之后，在支持带的每一侧上切出与肌腱平行的两个切口，之后将一组平面型剪刀置于髌肌腱下方。在剪刀刀片充当支撑件的情况下，0.75mm直径的活检打孔器(World Precision Instruments)用于在右侧髌肌腱中产生全厚的部分横切片。对左侧髌肌腱进行假手术，其由以下内容构成：仅将塑料背衬置于肌腱下方而不造成损伤。用皮肤用U形钉闭合皮肤伤口，并且在外科手术后第1天、第3天和第7天以及第21天将小鼠处死。通过吸入CO₂处死小鼠并且立即称重。使用两组小鼠BALB/c对照(CTL)和ST2-/-BALB/c。每组在每个时间点含有16只小鼠(n＝8只ST2-/-BALB/c和8只BALB/c)。在4种单独的情况下重复这些实验。

为了测试IL-33是否诱导肌腱基质调节异常，建立细胞因子注入模型。初始在针对IL-23或IL-22的应用描述的先前报道的模型中测试IL-33^44-45。在损伤第3天、第2天、第1天和损伤当天每天向ST2-/-小鼠(n＝4/组/治疗/实验)腹膜内注射IL-33(每只小鼠0.2μg，稀释于100μL PBS中)。在最后一次注射之后24小时，根据方案剔除小鼠。对照小鼠类似地接收相等体积的PBS。我们还通过再次在4/组/治疗/实验中在损伤后立即向WT和ST2-/-小鼠腹膜内注射IgG对照来测试IL-33的中和抗体(0.5μg/ml R&D系统)。

生物力学分析

在生物力学分析中，每组小鼠的髌肌腱受到损伤，并且按照先前由Lin等人所述在力学测试的三个时间点中的一个时间点处死八只小鼠¹⁰。简而言之，对髌肌腱进行解剖和清除，从而只留下髌骨、髌肌腱和胫骨作为一个整体。之后将肌腱宽度和厚度量化并且将截面面积计算为两者的乘积。将胫骨嵌入在定制设计的固定结构中的Isopon p38(High BuildCellulose Filler)中，并且用金属夹具固定在合适的位置上。通过将虎钳夹口与BOSE3200测试仪器一起使用来将髌骨保持在合适的位置上。每个肌腱试样经历以下方案：浸没在370C盐水浴中–重新装载至0.02N，以0.1％/s(0.003mm/s)的速率在10个循环内从0.02预调节至0.04，并且保持10s。紧接下来的是，通过以25％(0.75mm/s)的速率拉伸肌腱使其产生5％(.015mm)的应变，之后松弛600s来执行应力松弛实验。最终，以0.1％/s(0.003mm/s)的速率应用断裂斜线变化。根据这些测试，确定最大应力，并且使用线性回归从应力应变曲线的接近线性区域计算模数。

miR29a模拟物的体内施用

制备包含150ng/ml miR-29a模拟物、9μg/ml聚乙烯亚胺(PEI)和5％葡萄糖的转染复合体。在外科手术之后不久将50μl这种复合体注入到小鼠髌肌腱中。在1天和3天后处死动物，并且测量col1a1和col3a1mRNA以及蛋白质的水平。荧光标记的miR-29a模拟物用于通过免疫荧光，使用鬼笔环肽(以显示细胞骨架结构)和核(DAPI)的复染来评定miR-29a模拟物在肌腱中的体内分布。

miR29a模拟物如下：

过客链：

mAmCrCmGrAmUrUmUrCmArGmArUmGrGmUrGmCrUmAdG

引导链：

/5Phos/rUrArGrCrArCrCrArUrCrUrGrArArArUrCrGrGmUmUmA

/5Phos/＝5’磷酸酯

mA＝2’O-甲基腺苷核糖核苷酸；

mC＝2’O-甲基胞嘧啶核糖核苷酸；

mG＝2’O-甲基鸟嘌呤核糖核苷酸；

mU＝2’O-甲基尿嘧啶核糖核苷酸；

rA＝腺苷核糖核苷酸；

rC＝胞嘧啶核糖核苷酸；

rG＝鸟嘌呤核糖核苷酸；

rU＝尿嘧啶核糖核苷酸；

统计学分析

所有结果显示为平均值+/-标准误差平均值(SEM)，并且使用Graph Pad Prism 5软件通过斯氏T检验、ANOVA检验或Mann Whitney检验(如附图图注中所指示)来进行所有统计学分析。p值<0.05被认为是统计学上显著的。

结果

人肌腱病的IL-33和ST2表达

我们首先使用我们先前开发的模型研究了人肌腱病中的IL-33表达²²。与对照或撕裂肌腱活检相比较，IL-33、可溶性和膜结合型ST2转录物在早期肌腱病中显著上调(图1A-1C)。与撕裂肌腱或对照活检相比较，早期肌腱病组织展现出对IL-33和ST2更为显著的染色(图1D)。染色在内皮细胞以及尤其是成纤维细胞样细胞中是明显的(未示出数据)，成纤维细胞样细胞即为被认为对早期肌腱病的调节至关重要的肌腱细胞。同时，体外培养的肌腱细胞表达核IL-33，该核IL-33的mRNA和蛋白质水平均被上调，之后用TNF和IL-1β进行刺激(图1E且未示出数据)。相比之下，ST2组成性地表达在休眠和未受刺激的肌腱细胞中(未示出数据)。

IL-33调节肌腱细胞胶原基质和促炎细胞因子合成

基质朝向3型胶原表达的调节异常是肌腱病重要的早期表型改变，由此加快修复；然而，3型胶原在生物力学方面较为逊色。IL-33诱导剂量和时间依赖性的总胶原蛋白的上调(未示出数据)，这通过增加的1型但尤其是3型胶原mRNA和蛋白的表达来说明(图1F、图1G)。在阵列分析(未示出数据)之后并发现与报道的IL-33下游信号传导相一致^12,16，这通过ERK抑制来消除(未示出数据)。rhIL-33还显著提高IL-6、IL-8和MCP-1的产生(未示出数据)，rhIL-33通过NF-kB抑制来调节，从而表明IL-33在肌腱细胞中经由其经典的IL-1R信号传导路径来起作用(未示出数据)。相比之下，我们发现不对其它细胞因子的产生具有影响，这与先前报道的IL-33在成纤维细胞中诱导细胞因子产生的特征保持一致^20-23。

在肌腱损伤之后对IL-33/ST2路径进行体内建模

我们将这些观察结果扩展到广为接受的肌腱损伤体内模型。WT小鼠体内的IL-33mRNA在肌腱损伤后第1天和第3天升高(图2A)。这在损伤的ST2-/-小鼠中显著降低，从而表明存在自分泌调节。与未损伤的对照相比较，WT小鼠中的可溶性ST2在损伤后的所有时间点都显著上调(图2B)，而膜结合型ST2mRNA仅到损伤后第3天才升高(未示出数据)。在损伤后第7天或第21天，在WT小鼠中未发现IL-33或ST2转录物或蛋白质表达的显著变化，或在ST2-/-小鼠中未发现IL-33表达的显著变化，从而表明IL-33表达的影响在早期就已显现出来，这与肌腱损伤/修复中的‘警戒素’型活性保持一致。

胶原合成分析揭示与未损伤的对照或损伤的ST2-/-小鼠相比较，WT小鼠中的3型胶原在损伤后的所有时间点的表达显著更高(图2E、图2F且未示出数据)。WT损伤的小鼠中的1型胶原的mRNA水平初始(第1天、第3天)出现下调(图2C)，但到第7天和第21天向损伤前水平回复(未示出数据)，其中在1型胶原蛋白的表达中出现了类似的趋势(图2D)。相比之下，ST2-/-损伤的小鼠显示出1型胶原合成减少延长(第1天、第3天和第7天)，只有到第21天才返回到基线(未示出数据)。重要的是，到第7天和第21天才恢复的ST2-/-(图2G)相比较，WT小鼠肌腱的损伤在损伤后第1天就导致生物力学强度的显著降低(未示出数据)。这些数据表明ST2-/-小鼠中的改变的胶原基质合成暗示IL-33/ST2是具有生物力学意义的肌腱损伤胶原变化的早期调节物。

操纵IL-33来体内修饰3型胶原

为了证实这种可能性，我们设法直接体内修改IL-33效应子生物学。rhIL-33的施用并不影响1型胶原合成(图3A、图3B)，但尤其是在损伤的肌腱中确实会显著增加3型胶原合成(图3D、图3E且未示出数据)。此外，rhIL-33施用在WT小鼠内注射后的所有时间点都会显著降低最终的肌腱强度(图3E且未示出数据)，从而表明这类变化具有功能影响。IL-33施用并不影响ST2-/-小鼠内的胶原基质合成或愈合肌腱的最终肌腱强度，从而证实IL-33经由ST2依赖性路径起作用(未示出数据)。

我们接着直接在体内靶向IL-33。IL-33的中和抗体在损伤后的第1天和第3天使WT损伤的小鼠内由1型胶原到3型胶原的转换减弱(图3F-3I)，从而使WT小鼠肌腱的生物力学强度在损伤后第1天显著增加(图3J)。在稍后的时间点并未观察到这种作用(未示出数据)。在对照实验中，我们未观察到对ST2-/-小鼠的作用(未示出数据)，从而进一步证实内源性IL-33对损伤诱导的肌腱病的贡献。

IL-33经由miR-29促进肌腱细胞中的1/3型胶原的差异调节

虽然已经确认IL-33会驱动肌腱细胞中的1型和3型胶原的差异调节，但是我们也推测了miRNA网络在这个过程中的机械作用。先前的研究已经显示miR-29家族直接靶向众多胞外基质基因，包括1型和3型胶原^24-25，并且参与先天和适应性免疫的调节²⁶。计算算法预测miR-29还可以靶向sST2。我们发现miR-29家族的所有成员都被表达在人肌腱活检和植出的肌腱细胞中(图4A)，其中miR-29a显示出改变最大的表达。在肌腱细胞培养物中，IL-33在第6小时、第12小时和第24小时显著降低miR-29a的表达(图4B)，这是经由NFκB依赖性的信号传导起作用，而我们观察到了对miR-29b和29c不一致的作用(未示出数据)。由于IL-33介导的3型胶原基质变化可以通过miR-29a来调节，我们分析了miR-29a操纵对胶原基质体外合成的功能作用。首先，使用萤光素酶测定法，我们确认miR-29a如先前所证明直接靶向col 1a1和3a1²⁷(图7B)。我们还观察到了先前未识别的与col 1a2亚单元转录物的相互作用(图7)。为了测试miR-29a是否确实调节疾病相关细胞中的候选靶mRNA的水平，我们用miR-29a模拟物和反义寡核苷酸转染肌腱细胞。miR-29a操纵选择性地调节3型胶原，但是不调节原代肌腱细胞中的1型胶原mRNA和蛋白的表达(图4C、图4D)。此外，miR-29a过表达会显著消除IL-33诱导的3型胶原的mRNA和蛋白的合成(图4E)。另外，miR-29a抑制带来col 3a1表达的显著增加，从而表明miR-29a不仅积极地调节人肌腱细胞中的这些转录物，而且它的损耗是肌腱病中观察到的3型胶原产生的增加的重要因素。相比之下，col 1a1转录物水平未发生改变(图4I)。

鉴于miR-29a在荧光素酶报告基因测定中能够以等于或大于3型胶原的效率阻遏col 1a1和1a2，这不可能是miR-29a对3型转录物中的它的MRE具有更大亲和力的结果(图4F)。对于转录物调整其对miRNA调节的敏感性的一个充分研究的机制解释是通过利用可选择性多聚腺苷酸化信号(图4G)。为了测试这一点，我们将全长(包含miR-29a的)转录物的水平与通过q-PCR得到的总水平进行比较(图4H)，从而显示在肌腱细胞中，少于5％的col 1a1和1a2转录物利用远端多聚腺苷酸化信号，而大多数col 3a1转录物却是如此行为。

这通过3’cDNA末端快速扩增术(RACE)来证实(图7E)，从而证实col 1a1和1a2两者但不是col 3a1利用先前未识别的多聚腺苷酸化信号(图4G)。所得截短的3’UTR缺乏miR29aMRE。(将了解到，图7E中所示的序列是cDNA序列；对应的mRNA序列理所应当地将包含U而非T。)这些数据表明在肌腱细胞中，miR-29a特异地调节col3a1，而col 1a1和col 1a2两者都对miR-29a抑制不敏感，这是因为利用了可选择性多聚腺苷酸化信号。这种可选择性多聚腺苷酸化信号的利用并不受IL-33的存在的影响(未示出数据)。miR-29a在IL-33信号传导时发生的损耗会导致3型胶原的减少，从而有可能对损伤肌腱中观察到的这种胶原的增加作出贡献。

人肌腱细胞的3’RACE结果揭示了两个col 3a1 UTR，其中较短的一个[在图7E中标注为Col3a1(短3’UTR)]包含一个miR-29a MRE，而较长的一个包含两个miR-29a MRE。两者如图7D中所示都通过miR-29a来调节。

马肌腱细胞中表达的Col1a1、Cola2和Col3a1转录物的3’UTR的表征显示它们利用与人肌腱细胞中表达的直系同源胶原转录物所使用相同的保守的polyA信号。在col1a1和cola2中，使用这些近端polyA信号产生具有3’UTR的转录物，3’UTR的长度介于100与350个核苷酸之间并且它们不包含miR-29结合位点，且因此对通过这种miRNA进行的调节不敏感。相比之下，col3a1的两个3’UTR包含miR-29结合位点，从而使3’UTR对通过miR-29进行的调节敏感。

可溶性ST2是miR-29的直接靶标

计算分析揭示miR-29a可以靶向可溶性ST2，从而表明其在IL-33效应子功能中的适宜的调节作用。产生了包含人sST2的3’UTR的荧光素酶报告基因，因此预测具有两个潜在的miR-29abc结合位点。用miR-29模拟物对sST2-荧光素酶报告质粒进行共转染导致荧光素酶活性相对于零乱的对照的显著降低(图7B)。另外，荧光素酶活性在sST2中的两个miR-29MRE的种子区域突变时完全恢复，从而结论性地证明sST2是miR-29a的直接靶标(图5A)。为了研究miR-29a是否确实调节肌腱细胞中的候选靶mRNA的水平，我们再次将miR-29a模拟物和反义寡核苷酸转染到人肌腱细胞中。可溶性ST2信息通过用miR-29a模拟物/反义寡核苷酸转染明显改变接近5倍(p<0.01)(图5B)，其中对应的可溶性ST2蛋白的显著改变证实miR29a是可溶性ST2的靶标(图5C)。

IL-33/sST2在肌腱愈合的体内模型中调节miR-29表达

最终，我们在我们的体内肌腱病模型中研究miR-29a表达。WT小鼠中的肌腱损伤在第1天导致miR29a下降22倍，到第3天回复到6倍下降(对比基线)(图5D且未示出数据)，而到第7天就不存在显著差异。这个作用在ST2-/-小鼠中明显消失(未示出数据)。此外，施用外源性rh-IL-33与PBS注射对照相比较会在所有时间点降低未损伤的肌腱中的miR-29a表达(未示出数据)。这个作用在损伤的WT小鼠中最为显著，其中添加rhIL-33介导miR-29a的进一步的10倍降低(图5E)。在ST2-/-小鼠中添加rhIL-33未对损伤或未损伤的肌腱中的miR-29a表达产生显著影响，从而再次表明miR-29a下调部分是通过IL-33/ST2依赖性信号传导直接介导的。添加IL-33的中和抗体在损伤后第1天和第3天明显减轻了损伤对miR-29a基因表达的影响(图5F)。

在髌肌腱损伤模型中体内施用miR29a模拟物

经由直接注射miR-29a/PEI复合体向WT小鼠髌肌腱中的肌腱细胞递送miR-29a模拟物。用鬼笔环肽(绿色，针对细胞骨架结构)和DAPI(以示出核)复染的模拟物的免疫荧光染色(红色)用于使肌腱细胞周围的模拟物的定位在注射miR-29a模拟物后24小时可视化(未示出)。如图8中所示，与对照相比较，3型胶原mRNA和蛋白的水平在注射了miR-29a模拟物的肌腱中出现显著降低。相比之下，1型胶原水平未发生变化。

讨论

微小RNA因其在疾病和组织重塑中的重要作用而出现作为各种细胞过程的有力调节物。这些利用肌腱病作为模型系统的研究首次揭示了单一微小RNA(miR-29)在复杂的带来组织修复的早期生物学过程中交叉调节炎性细胞因子效应子功能和胞外基质调节的能力。

我们在本文中提供了IL-33在引起肌腱病的重要临床实体的初始阶段中的作用的新证据。IL-33近来变得越来越与肌骨骼病理学相关联¹⁶。我们的数据显示IL-33在疾病早期存在于人肌腱活检中，而末期活检在信息和蛋白质水平上具有显著更低的IL-33表达，从而促成了IL-33是肌腱损伤和后续组织重塑的早期组织介导物的概念。在细胞损伤内生危险信号时，坏死细胞会释放所谓的损伤相关分子模式，坏死细胞包括热休克蛋白²⁸、HMGB1²⁹、尿酸³⁰以及包括IL-33^33-34的IL-1家族成员^31-32。这些危险信号随后由各种免疫细胞识别，所述免疫细胞引发炎性和修复反应。我们的数据暗示IL-33是早期肌腱病的警戒素，并且重要的是，我们的生物力学数据表明这种表达具有致病性相关作用。添加rhIL-33会使WT小鼠断裂的负载在早期时间点显著降低约30％，其可能的结果是伴生的3型胶原基质变化，这会导致力学上较逊色的肌腱³⁵。因此，介导早期肌腱修复(生物力学上较逊色)的事件的一个可能的机制可以是在重复的微损伤之后，IL-33被上调，其随后通过机械应力/坏死来释放，进而驱使基质变性和促炎细胞因子产生，从而推动肌腱朝向病理状态，诸如早期肌腱病活检中观察到的病理状态发展。有趣的是，向损伤的小鼠添加中和抗体确实逆转了3型胶原表型，但是这仅能够在损伤后第1天短暂地提高肌腱强度。虽然这可以否定会阻断长期运动损伤中的IL-33，但是与病态肌腱变化相关联的重复微创伤相反地可以允许中和IL-33充当对进一步不想要的基质调节异常的查控手段。

新出现的研究强调miRNA是白细胞功能和细胞因子网络的重要调节物，同时协调决定胞外基质组成的间质谱系的增殖和分化³⁶。miR-29a在调节IL-33‘警戒素’介导的作用中的作用的新发现提供了对组织修复中涉及炎症和基质调节的miRNA交叉调节网络的了解。我们的数据提供了miR-29作为鼠和人肌腱损伤中的胶原的转录后调节物的功能作用的令人信服的证据。若干项现有研究³⁷ ^27.38中强调了miR-29家族对胶原的调节。现在我们的结果表明miR-29能充当肌腱愈合中调节胶原表达的关键阻遏剂。此外，miR-29在人活检中的降低的表达表明其功能衰减会自由地允许发展肌腱病。尽管肌腱病变通过会导致生物力学劣势和变性的增加的3型胶原沉积来表征，但是这种胶原‘转换’的分子前提迄今为止仍是未知的。我们首次描述了IL-33诱导的miR-29a的缺乏会导致3型胶原的过度产生，同时经由IL-33对sST2的抑制来动态地设定这个早期修复过程的最终解决方案。与人肌腱细胞中的期望相反，miR-29仅能够影响col 3a1而不是1型胶原的表达。1型和3型胶原的3’UTR的随后表征揭示先前报道的两个1型亚单元中的可选择性多聚腺苷酸化的模式导致转录物缺乏miR29a结合位点，从而使所述亚单元对通过这种miRNA进行的阻遏不敏感。对于3型胶原转录物，情况并非如此，所述转录物保留两个miR-29a结合位点。在人肌腱细胞中，miR-29a积极地阻遏3型胶原，如由miR-29a的以下能力所证实：miR-29a抑制剂会显著增加3型胶原的水平，而在存在IL-33的情况下向肌腱细胞补充miR-29a足以抑制3型胶原产生的增加。重要的是，在我们的模型系统中，miR-29a另外靶向IL-33诱杀型受体sST2。因此，由miR-29a表达驱动的对IL-33的损耗导致同时阻遏3型胶原和sST2，其中随后的IL-33的自动调节性抑制有助于解决即时警戒素反应。

基于这项工作，我们提出IL-33作为早期肌腱损伤和肌腱病的未被满足的临床领域中的有影响力的警戒素，IL-33对于修复与变性之间的平衡而言可能是很重要的。已经揭露了miR-29作为肌腱愈合和肌腱病中基质/炎性基因的转录后调节物的新作用。出于治疗目的探索miRNA的重大前景之一是单一微小RNA有可能调节功能上趋同的靶基因。我们对早期组织愈合中的单一微小RNA依赖性调节路径的发现强调将miR-29替补疗法作为肌腱病的有前景的治疗选项，其中牵连到其中涉及基质调节异常的许多其它人体病理学。

虽然已经结合上文描述的示例性实施方案对本发明进行了描述，但是在给出本公开时，许多等效修改和变化对于本领域的技术人员而言将是显而易见的。因此，所阐述的本发明的示例性实施方案应视为是说明性的而非限制性的。可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对所描述的实施方案作出各种改变。本文引用的所有文件以引用的方式明确并入。

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Claims

1.一种用于调整受试者的肌腱愈合的方法，所述方法包括增加肌腱细胞中的miR-29的表达或活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其包括向肌腱细胞递送miR-29、其模拟物、或它们任一者的前体的步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述miR-29模拟物或前体包含一个或多个修饰的糖残基。

4.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述miR-29模拟物或前体包含一个或多个修饰的核苷间连键。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中所述miR-29模拟物或前体包含一个或多个修饰的碱基。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述miR-29模拟物或前体包含膜转运部分。

7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述miR-29、模拟物或前体与载体缔合(例如，与之复合或由其胶囊化)。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述载体包括药学上可接受的脂质或聚合物。

9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述载体分子包含能够结合至靶细胞的表面的靶向剂。

10.根据权利要求1所述的方法，其包括以下步骤：向肌腱细胞递送编码miR-29、其模拟物或它们任一者的前体的核酸，以使得所述miR-29、模拟物或前体被表达在所述肌腱细胞中。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述核酸与载体缔合(例如，与之复合或由其胶囊化)。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述载体包括药学上可接受的脂质或聚合物。

13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述载体分子包含能够结合至靶细胞的表面的靶向剂。

14.根据权利要求10所述的方法，其中所述核酸经由病毒载体来递送。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述病毒载体是腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒或疱疹病毒载体。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述逆转录病毒载体是慢病毒载体。

17.根据权利要求2至16中任一项所述的方法，其中所述miR-29是miR-29a、miR-29b1、miR29b2或miR-29c或者其组合。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述组合包含miR-29a。

19.根据权利要求2至18中任一项所述的方法，其中所述miR-29或其模拟物包含引导链，所述引导链包含种子序列AGCACCA。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述引导链包含以下序列：

UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA(hsa-miR-29a)；

UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU(hsa-miR-29b1；hsa-miR-29b2)；或

UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA(hsa-miR-29c)。

21.根据权利要求2至20中任一项所述的方法，其中所述前体是pre-mir-29。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述pre-mir-29包含以下序列：

CUUCUGGAAGCUGGUUUCACAUGGUGGCUUAGAUUUUUCCAUCUUUGUAUCUAGCACCAUUUGAAAUCAGUGU UUUAGGAG(hsa-pre-mir-29b2)；或

AUCUCUUACACAGGCUGACCGAUUUCUCCUGGUGUUCAGAGUCUGUUUUUGUCUAGCACCAUUUGAAAUCGGU UAUGAUGUAGGGGGA(hsa-pre-mir-29c)

(其中成熟的引导链序列以下划线标注)。

23.根据权利要求2至16中任一项所述的方法，其中所述miR-29模拟物包含引导链，所述引导链包含以下序列：

UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA(hsa-miR-29a)；

UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU(hsa-miR-29b1和hsa-miR-29b2)；或

UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA(hsa-miR-29c)

(其中种子序列在各个情况下都以下划线标注)；

或所述模拟物在以下位置不同于所述序列：

(i)在所述种子序列内不超过三个位置处；以及

(ii)在所述种子序列之外不超过五个位置处。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肌腱细胞是肌腱细胞或肌腱母细胞。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肌腱受到肌腱损伤或肌腱病的影响。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者是人或马。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受影响的肌腱是跟腱、冈上肌肌腱、屈肌总腱、伸肌总腱或浅屈肌腱。

28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中调整肌腱愈合包括增加所述肌腱的抗张强度。

29.用于调整肌腱愈合的方法的miR-29、其模拟物或它们任一者的前体。

30.miR-29、其模拟物或它们任一者的前体在制造用于调整肌腱愈合的药剂中的用途。

31.一种用于调整肌腱愈合的方法的核酸，所述核酸编码miR-29、其模拟物或它们任一者的前体。

32.编码miR-29、其模拟物或它们任一者的前体的核酸在制造用于调整肌腱愈合的药剂中的用途。