JP2023545229A - 抗ｖｅｇｆ実体および負の補体調節因子をコードする核酸、ならびに加齢黄斑変性の処置のためのその使用 - Google Patents

抗ｖｅｇｆ実体および負の補体調節因子をコードする核酸、ならびに加齢黄斑変性の処置のためのその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、同時的治療、別個の治療、または逐次的治療における使用のための組合せ調製物としての、（ｉ）抗ＶＥＧＦ実体；および（ｉｉ）負の補体調節因子、またはこれをコードするヌクレオチド配列を含む生成物に関する。特に、抗ＶＥＧＦ実体は抗ＶＥＧＦ抗体であり、好ましくはアフリベルセプトおよび負の補体調節因子は補体Ｉ因子（ＣＦＩ）または補体ＦＨＬ１（ｆａｃｔｏｒ Ｈ Ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）である。主要な使用は眼疾患の処置、特に加齢黄斑変性（ＡＭＤ）である。

Description

本発明は、遺伝子治療における使用のための薬剤に関する。特に、本発明は、抗ＶＥＧＦ実体と、負の補体調節因子との組合せ、またはこれをコードするヌクレオチド配列、ならびに加齢黄斑変性（ＡＭＤ）などの補体媒介性眼疾患を含む、補体媒介性障害および補体関連障害の処置または防止におけるその使用に関する。
黄斑とは、約３～５ミリメートルのサイズで、視神経と隣接する、眼の網膜内の小領域である。黄斑は、網膜のうちで、最も高感度の領域であり、高度の視力を可能とする陥没領域である、中心窩を含有し、色覚を担う光受容体である、高濃度の錐体を含有する。
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、先進国の５０歳を超える患者について、機能的失明の最も一般的な原因である（Seddon, J.M., Epidemiology of age-related macular degeneration. In: Ogden, T.E., et al., eds. Ryan S.J., ed-in-chief. Retina Vol II. 3rd ed. St. Louis, Mo.: Mosby; 2001: 1039-1050）。ＡＭＤの湿潤形態は、脈絡膜血管系に由来し、網膜下腔へと拡大する新血管形成と関連する。加えて、ＡＭＤは、網膜、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、およびこれらの基底をなす脈絡膜（ＲＰＥの下方、網膜と強膜との間に存在する、高度に血管性の組織）の進行性変性により特徴付けられる。
酸化ストレス、可能な自己免疫構成要素を伴う炎症、遺伝的背景（例えば、突然変異）、および環境因子、または喫煙および食物摂取などの行動因子を含む、様々な因子が、ＡＭＤの発症機序に寄与しうる。
ＡＭＤの臨床的進行は、黄斑の変化に従う病期において特徴付けられる。早期ＡＭＤの特徴は、網膜の下方における、細胞外破砕物の蓄積であり、臨床検査時および眼底写真において、網膜内の、黄色の斑点として現れる、ドルーゼンの出現である。ドルーゼンは、サイズにより、小型（＜６３μｍ）、中型（６３～１２４μｍ）、および大型（＞１２４μｍ）と類別される。ドルーゼンはまた、眼科検査時における、それらの縁辺部の外見に応じて、硬質または軟質とみなされる。硬質ドルーゼンが、明確な縁辺部を有するのに対し、軟質ドルーゼンは、それほど明確でない、流動的な縁辺部を有する。Ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｙｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｔｕｄｙ（ＡＲＥＤＳ）眼底写真重症度スケールは、この状態について使用される、主要な分類システムのうちの１つである。
ＡＭＤは、「乾燥型」および「湿潤型」（滲出型または新生血管型）と分類されている。乾燥型ＡＭＤは、典型的に、ＲＰＥ層内、上部の光受容体細胞、および脈絡膜毛細管層内の基底細胞においてもまた高頻度である、細胞の進行性アポトーシスにより特徴付けられる。上部の光受容体の萎縮を伴う、ＲＰＥ細胞死の融合領域は、地図状萎縮と称され、乾燥型ＡＭＤの進行後期を表す。この形態のＡＭＤを伴う患者は、緩徐かつ進行性の、中心視の劣化を経る。
湿潤型ＡＭＤは、突然かつ機能障害的な失明の一因をなす、出血および／またはＲＰＥの下方の脈絡膜血管（脈絡毛細管枝）から増殖した、異常な血管から、黄斑内の網膜下腔への、流体の漏出により特徴付けられる。患者が経る失明の大半は、このような脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）およびその続発性合併症に起因することが推定されている。新生血管型ＡＭＤの亜種は、網膜血管腫状増殖（ＲＡＰ）と称される。本実施例において、血管腫状増殖は、網膜を起点とし、その後、網膜下腔へと拡大し、ついには、場合によって、脈絡膜新血管と連絡する。ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）もまた、発生することが公知である。
湿潤型ＡＭＤのための、現行の処置選択肢は、主に、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）経路をターゲティングする、多数の治療である。このようなＶＥＧＦターゲティング療法の例は、アプタマーである、ペガプタニブ（N Engl J Med (2004) 351: 2805-2816）、ならびにラニビズマブ（N Engl J Med (2006) 355: 1432-1444）、アフリベルセプト（BMJ (2014) 98: i17-i21）、およびベバシズマブ（BMJ (2010) 340: c2459）などの抗体を含む。しかし、全ての患者が、抗ＶＥＧＦ抗体による処置に応答するわけではなく、視覚の回復に至らないか、または公認の失明へと進行する。毎月の処置により達成された視力（ＶＡ）の増進の、漸進的な減退もまた、報告されている（Singer et al.; Ophthalmology; 2012; 119(6); 1175-83）。
さらに、抗ＶＥＧＦ療法と、地図状萎縮の進行との関連を裏付ける証拠も存在する（Gemenetza et al.; Eye; 2017; 31; 1-9, Enslow et al.; Ophthalmology and Eye Diseases; 2016; 8; 21-32 & Sadda et al.; Ophthalmology; 2020; 127(5); 648-659）。
また、患者に対する薬物負荷を軽減し、服薬遵守および／または服薬不良の問題に取り組む、治療戦略も必要とされている。
したがって、当技術分野では、ＡＭＤなどの眼疾患を処置する、新たな手法が、強く必要とされている。
理論により束縛されることを望まずに述べると、本発明は、「湿潤型」ＡＭＤと典型的に関連する機構のターゲティングと同時に、「乾燥型」ＡＭＤと典型的に関連する基礎的機構をターゲティングすることが有利でありうるという洞察に基づく（少なくとも部分的に）。加えて、本発明は、部分的に、ＡＭＤの一方の形態の治療的ターゲティングが、他の形態に、どのように影響を及ぼしうるのかについての検討に基づく。
第１の態様では、本発明は、同時的治療、別個の治療、または逐次的治療における使用のための組合せ調製物としての、（ｉ）抗ＶＥＧＦ実体；および（ｉｉ）負の補体調節因子、またはこれをコードするヌクレオチド配列を含む生成物を提供する。
一実施形態では、生成物は、それらの間において、（ｉ）抗ＶＥＧＦ実体と；（ｉｉ）負の補体調節因子とをコードする、１つまたは複数のポリヌクレオチドでありうる。
したがって、好ましい実施形態では、抗ＶＥＧＦ実体と、負の補体調節因子とをコードするポリヌクレオチドが提示される。
好ましくは、ポリヌクレオチドは、抗ＶＥＧＦ実体と、負の補体調節因子とをコードする、バイシストロニックのポリヌクレオチドである。
特に、本出願者は、抗ＶＥＧＦ実体および負の補体調節因子の両方の、患者への送達のために使用されうるベクターを提供した。特に、本出願者は、良好な力価における作製が可能であり、抗ＶＥＧＦ実体および負の補体調節因子の両方をコードするヌクレオチド配列を含む機能的ＡＡＶベクターのデザインに成功した。
抗ＶＥＧＦ実体が、Ｉｇ融合タンパク質、抗体、アプタマー、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド（例えば、ＶＥＧＦの遺伝子配列またはそのｍＲＮＡ配列をターゲティングする、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、配列のＣＲＩＳＰＲｉガイド鎖）、および非抗体足場から選択されうる。適切には、抗ＶＥＧＦ実体は、アフリベルセプト、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、およびペガプタニブ、またはこれらの断片もしくは変異体から選択される。
負の補体調節因子が、補体Ｉ因子（ＣＦＩ）、補体ＦＨＬ１（ｆａｃｔｏｒ Ｈ Ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）、補体Ｈ因子（ＣＦＨ）、１型補体受容体（ＣＲ１）、ＭＣＰ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、補体ＤＡＦ（ｄｅｃａｙ－ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、およびＭＡＣ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｔｔａｃｋ ｃｏｍｐｌｅｘ）阻害性タンパク質（ＭＡＣ－ＩＰ）、Ｃ１阻害剤、アナフィラトキシン阻害剤、Ｃ４ｂ結合性タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、クラステリン、ビトロネクチン、またはこれらの断片もしくは変異体から選択されうる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＭＶプロモーターまたはニワトリβ－アクチンプロモーターをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。好ましくは、ＣＭＶプロモーターまたはＣＡＧプロモーターは、抗ＶＥＧＦ実体と、負の補体調節因子とをコードするヌクレオチド配列の上流にある。ニワトリβ－アクチンプロモーターは、ＣＭＶ早期エンハンサーと組み合わせて（すなわち、ＣＡＧプロモーターとして）提供されうる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＷＰＲＥ調節エレメントをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。好ましくは、ＷＰＲＥ調節エレメントは、抗ＶＥＧＦ実体と、負の補体調節因子とをコードするヌクレオチド配列の下流にある。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリＡシグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。好ましくは、ポリＡシグナルは、抗ＶＥＧＦ実体と、負の補体調節因子とをコードするヌクレオチド配列の下流にある。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウシ成長ホルモンポリＡシグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。好ましくは、ウシ成長ホルモンポリＡシグナルは、抗ＶＥＧＦ実体と、負の補体調節因子とをコードするヌクレオチド配列の下流にある。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、
（ａ）抗ＶＥＧＦ実体と、負の補体調節因子とをコードするヌクレオチド配列の上流にある、ＣＭＶプロモーターまたはＣＡＧプロモーター；および
（ｂ）抗ＶＥＧＦ実体と、負の補体調節因子とをコードするヌクレオチド配列の下流にある、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル
をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、
（ａ）抗ＶＥＧＦ実体と、負の補体調節因子とをコードするヌクレオチド配列の上流にある、ＣＭＶプロモーターまたはＣＡＧプロモーター；
（ｂ）抗ＶＥＧＦ実体と、負の補体調節因子とをコードするヌクレオチド配列の下流にある、ＷＰＲＥ調節エレメント；および
（ｃ）抗ＶＥＧＦ実体と、負の補体調節因子とをコードするヌクレオチド配列の下流にある、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル
をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
ＷＰＲＥ調節エレメントは、ＷＰＲＥ３調節エレメントでありうる。
抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列は、負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列の上流にありうる。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列は、負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列の上流にあり、抗ＶＥＧＦ実体は、アフリベルセプト、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、およびペガプタニブ、またはこれらの断片もしくは変異体から選択される。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列は、負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列の上流にあり、抗ＶＥＧＦ実体は、アフリベルセプトまたはその断片もしくは変異体である。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列は、負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列の上流にあり、負の補体調節因子は、ＣＦＩ、またはこれらの変異体もしくは断片である。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列は、負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列の上流にあり、負の補体調節因子は、ＦＨＬ１、またはこれらの変異体もしくは断片である。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列は、負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列の上流にあり、抗ＶＥＧＦ実体は、アフリベルセプトまたはその断片もしくは変異体であり、負の補体調節因子は、ＣＦＩ、またはこれらの変異体もしくは断片である。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列は、負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列の上流にあり、抗ＶＥＧＦ実体は、アフリベルセプトまたはその断片もしくは変異体であり、負の補体調節因子は、ＦＨＬ１、またはこれらの変異体もしくは断片である。
負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列は、抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列の上流にありうる。
一部の実施形態では、負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列は、抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列の上流にあり、抗ＶＥＧＦ実体は、アフリベルセプト、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、およびペガプタニブ、またはこれらの断片もしくは変異体から選択される。一部の実施形態では、負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列は、抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列の上流にあり、抗ＶＥＧＦ実体は、アフリベルセプトまたはその断片もしくは変異体である。一部の実施形態では、負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列は、抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列の上流にあり、負の補体調節因子は、ＣＦＩ、またはこれらの変異体もしくは断片である。一部の実施形態では、負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列は、抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列の上流にあり、負の補体調節因子は、ＦＨＬ１、またはこれらの変異体もしくは断片である。
一部の実施形態では、負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列は、抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列の上流にあり、抗ＶＥＧＦ実体は、アフリベルセプトまたはその断片もしくは変異体であり、負の補体調節因子は、ＣＦＩ、またはこれらの変異体もしくは断片である。
一部の実施形態では、負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列は、抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列の上流にあり、抗ＶＥＧＦ実体は、アフリベルセプトまたはその断片もしくは変異体であり、負の補体調節因子は、ＦＨＬ１、またはこれらの変異体もしくは断片である。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ実体と、負の補体調節因子とをコードするヌクレオチド配列は、リンカーにより、作動可能に連結される。一部の実施形態では、リンカーは、フーリンリンカー、ＧＳＧリンカー、１１ａ１Ｄリンカー、およびＦ２Ａリンカーである。好ましい実施形態では、リンカーは、自己切断２Ａペプチド配列、例えば、Ｐ２Ａ、またはフーリン切断部位配列、ＧＳＧ配列、１１ａ１Ｄ配列、およびＦ２Ａ配列を含むか、またはこれにより規定される配列を含有する。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）をさらに含む。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つのＡＡＶ ＩＴＲをさらに含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、その５’末端におけるＡＡＶ ＩＴＲと、その３’末端におけるＡＡＶ ＩＴＲとを含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、
（ａ）５’ＡＡＶ ＩＴＲ；
（ｂ）ＣＭＶプロモーターまたはＣＡＧプロモーター；
（ｃ）抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）任意選択で、フーリン切断部位配列、ＧＳＧ配列、１１ａ１Ｄ配列、およびＦ２Ａ配列を含むリンカー；
（ｅ）負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）ポリＡシグナル、好ましくは、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル；および
（ｇ）３’ＡＡＶ ＩＴＲ
を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、
（ａ）５’ＡＡＶ ＩＴＲ；
（ｂ）ＣＭＶプロモーターまたはＣＡＧプロモーター；
（ｃ）抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）任意選択で、フーリン切断部位配列、ＧＳＧ配列、１１ａ１Ｄ配列、およびＦ２Ａ配列を含むリンカー；
（ｅ）負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）任意選択で、ＷＰＲＥ３調節エレメントである、ＷＰＲＥ調節エレメント；
（ｇ）ポリＡシグナル、好ましくは、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル；および
（ｈ）３’ＡＡＶ ＩＴＲ
を含む。
適切には、（ｃ）および（ｅ）により規定されるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド内の互換的位置にありうる
特に、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、
（ａ）５’ＡＡＶ ＩＴＲ；
（ｂ）ＣＭＶプロモーターまたはＣＡＧプロモーター；
（ｃ）負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）任意選択で、フーリン切断部位配列、ＧＳＧ配列、１１ａ１Ｄ配列、およびＦ２Ａ配列を含むリンカー；
（ｅ）抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）ポリＡシグナル、好ましくは、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル；および
（ｇ）３’ＡＡＶ ＩＴＲ
を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、
（ａ）５’ＡＡＶ ＩＴＲ；
（ｂ）ＣＭＶプロモーターまたはＣＡＧプロモーター；
（ｃ）負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）任意選択で、フーリン切断部位配列、ＧＳＧ配列、１１ａ１Ｄ配列、およびＦ２Ａ配列を含むリンカー；
（ｅ）抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）任意選択で、ＷＰＲＥ３調節エレメントである、ＷＰＲＥ調節エレメント；
（ｇ）ポリＡシグナル、好ましくは、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル；および
（ｈ）３’ＡＡＶ ＩＴＲ
を含む。
適切には、（ｂ）が、ＣＡＧプロモーターを含む実施形態では、（ｆ）は、ＷＰＲＥ３調節エレメントでありうる。
ポリヌクレオチドは、５’～３’の順に、（ａ）～（ｇ）または（ａ）～（ｈ）を含みうる。
一部の実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲまたはＡＡＶ８ ＩＴＲである。好ましい実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ実体および／または負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。一部の実施形態では、負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。好ましい実施形態では、アフリベルセプトと、ＣＦＩ、ＦＨＬ１、またはＣＦＨとをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
一部の実施形態では、アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
好ましい実施形態では、アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１である。
一部の実施形態では、ＣＦＩをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３５または３６に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
好ましい実施形態では、ＣＦＩをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３５または３６である。
一部の実施形態では、アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１であり、ＣＦＩをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３５または３６である。
一部の実施形態では、ＦＨＬ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４１に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
好ましい実施形態では、ＦＨＬ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４１である。
一部の実施形態では、アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１であり、ＦＨＬ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４１である。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４５のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４６のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４７のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４８のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４９のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５０のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５１のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５２のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５３のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５４のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５．２、５．１、５．０、４．９、４．８、または４．７ｋｂ以下である。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、４．７ｋｂ以下である。
別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。したがって、一態様に従い、本発明は、（ｉ）抗ＶＥＧＦ実体をコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）負の補体調節因子をコードするポリヌクレオチドとを含むベクターを提供する。好ましくは、抗ＶＥＧＦ実体および負の補体調節因子は、好ましくは、バイシストロニックのポリヌクレオチドである、同じポリヌクレオチド上において提供される。
適切には、本明細書では使用されるバイシストロニックのポリヌクレオチドは、各々が、同じプロモーター領域に作動可能に連結された、少なくとも２つのタンパク質コード領域を含むポリヌクレオチドを指す場合がある。適切には、バイシストロニックのポリペプチドは、各々が、同じプロモーター領域に作動可能に連結された、２つのタンパク質コード領域を含みうる。
適切には、本発明はまた、それらの間において、（ｉ）抗ＶＥＧＦ実体をコードするポリヌクレオチドと、（ｉｉ）負の補体調節因子をコードするポリヌクレオチドとを含む、１つを超える（例えば、２つの）ベクターも提供する。
一部の実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターである。
好ましい実施形態では、ベクターは、ＡＡＶベクターである。
一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター粒子の形態にある。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクター粒子は、ＡＡＶ２ゲノムまたはＡＡＶ８ゲノム、好ましくは、ＡＡＶ２ゲノムを含む。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクター粒子は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質またはＡＡＶ８カプシドタンパク質を含む。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクター粒子は、ＡＡＶ２ゲノムと、ＡＡＶ２カプシドタンパク質とを含む（ＡＡＶ２／２）。好ましい実施形態では、ＡＡＶベクター粒子は、ＡＡＶ２ゲノムと、ＡＡＶ８カプシドタンパク質とを含む（ＡＡＶ２／８）。
別の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、本発明のベクターにより形質導入された細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、または細胞を含む医薬組成物を提供する。
好ましい実施形態では、医薬組成物は、眼内投与のための医薬組成物である。
別の態様では、本発明は、治療における使用のための、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、眼障害の処置または防止における使用のための、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、眼の補体媒介性障害の処置または防止における使用のための、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、眼の補体媒介性障害を処置または防止する方法であって、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物を、それを必要とする対象へと投与するステップを含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は、抗ＶＥＧＦ実体と、負の補体調節因子とを、対象へと施す方法であって、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞を、対象の眼へと送達するステップを含む方法を提供する。
特定の実施形態では、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物は、補体媒介性障害、特に、慢性炎症性状態の処置において使用され、なおより特定すると、補体Ｃ３ｂのフィードバックサイクルの過剰活性と関連する、慢性炎症性状態の処置において使用される。
一部の実施形態では、障害は、補体Ｃ３ｂのフィードバックサイクルの過剰活性、および／またはＣ３ｂの分解サイクルの過小活性と関連する（図５を参照されたい）。
一部の実施形態では、障害は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）または糖尿病網膜症である。他の実施形態では、障害は、緑内障、スターガルト病、中心性漿液性脈絡網膜症、色素性網膜炎、ポリープ状脈絡膜血管症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈分枝閉塞症、またはブドウ膜炎である。
好ましい実施形態では、障害は、ＡＭＤである。
一部の実施形態では、障害は、湿潤型ＡＭＤおよび／または乾燥型ＡＭＤである。一部の実施形態では、生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物は、湿潤型ＡＭＤと、乾燥型ＡＭＤとを、同時に処置および／または防止するのに使用される。
一部の実施形態では、ＡＭＤは、湿潤型ＡＭＤであり、本発明に従う使用は、さらに、前記対象における乾燥型ＡＭＤの発症を防止および／または処置する。一部の実施形態では、ＡＭＤは、乾燥型ＡＭＤであり、本発明に従う使用は、さらに、前記対象における湿潤型ＡＭＤの発症を防止および／または処置する。
一部の実施形態では、対象は、ＡＭＤを伴うと診断されているか、またはＡＭＤに罹患する危険性がある。
一部の実施形態では、使用は、
（ａ）眼および／もしくは血清における、補体Ｉ因子の活性もしくは濃度が正常未満であり、好ましくは、血清中の濃度が、０～３０、０～２０、もしくは０～１０μｇ／ｍＬであるか、もしくは血清中の活性が、これらと同等である対象；ならびに／または
（ｂ）加齢黄斑変性（ＡＭＤ）関連ＳＮＰ、好ましくは、希少な補体Ｉ因子変異体および／もしくは補体Ｈ因子変異体について、ヘテロ接合性またはホモ接合性である対象
における障害の処置または防止のための使用である。
一部の実施形態では、使用は、
（ａ）眼および／もしくは血清における、補体Ｉ因子の活性もしくは濃度が正常レベルであり、好ましくは、血清中レベルが、３０～４０μｇ／ｍＬなど、少なくとも３０μｇ／ｍＬである対象；ならびに／または
（ｂ）希少な補体Ｉ因子変異体対立遺伝子を保有しない対象
における障害の処置または防止のための使用である。
別の態様では、本発明は、糖尿病網膜症の処置または防止における使用のための、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物を提供する。
一部の実施形態では、地図状萎縮の形成が、防止もしくは軽減され、かつ／または地図状萎縮の量が、低減される。
一部の実施形態では、地図状萎縮の進行が、緩徐化される。
一部の実施形態では、対象の処置眼への投与後１２カ月間にわたり、同じ期間にわたる非処置眼と比べて、少なくとも１０％の、地図状萎縮面積の増大の低減がみられる。他の実施形態では、対象の処置眼への投与後１２カ月間にわたり、同じ期間にわたる非処置眼と比べて、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の、地図状萎縮面積の増大の低減がみられる。
一部の実施形態では、生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物の投与は、対象、または対象の網膜色素上皮（ＲＰＥ）、房水、および／もしくは硝子体液など、対象の眼におけるＣ３ｂ不活化／ｉＣ３ｂ分解活性のレベルを、任意選択で、対象またはその眼もしくはＲＰＥにおける正常レベルを超えるレベルへと上昇させる。
別の態様では、本発明は、例えば、本明細書では開示される眼障害などの眼障害を患う対象における視覚または視力の改善または回復における使用のための、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物を提供する。別の態様では、本発明は、視覚または視力の喪失、例えば、本明細書で開示される眼障害などの眼障害と関連する、視覚または視力の喪失の緩和における使用のための、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、対象、例えば、本明細書で開示される眼障害などの眼障害を患う対象における読書速度の改善または回復における使用のための、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物を提供する。別の態様では、本発明は、対象における読書速度の低減、例えば、本明細書では開示される眼障害などの眼障害と関連する、読書速度の低減の緩和における使用のための、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞を提供する。
別の態様では、本発明は、光受容体および／または網膜色素上皮（ＲＰＥ）の喪失、例えば、本明細書で開示される眼障害などの眼障害と関連する、光受容体および／またはＲＰＥの喪失の軽減または防止における使用のための、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物を提供する。
さらなる態様では、本発明は、本明細書で開示される眼障害などの眼障害に伴う、新血管形成、血管漏出、または網膜浮腫の軽減または防止における使用のための、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物を提供する。
一部の実施形態では、生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物は、眼内投与される。
一部の実施形態では、生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物は、網膜下注射、直接的な網膜内注射、脈絡膜上注射、または硝子体内注射により、対象の眼へと投与される。
一部の実施形態では、生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物は、網膜下注射により、対象の眼へと投与される。
一部の実施形態では、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物は、全身投与されない。他の実施形態では、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物は、静脈内投与されない。
例示的なモノシストロニックのアフリベルセプトベクターのデザイン、およびＡＡＶゲノムサイズ（ＩＴＲ～ＩＴＲ）を描示する概略図である。 異なるコドン最適化ＡＡＶ２ベクターの間における、アフリベルセプト発現の比較を示す図である。データは、２つの独立の実験を示す。 形質導入の７２時間後における、培養上清中のアフリベルセプトタンパク質の発現を例示する、（Ａ）非還元条件下および（Ｂ）還元条件下で実施されたウェスタンブロットについての代表的画像である。（Ｃ）２つの独立の実験による、非還元条件下および還元条件下における、アフリベルセプト発現についての、濃度測定解析である。 （上記の通り。） 負の補体調節因子およびアフリベルセプトを発現させる、例示的バイシストロニックベクターのデザインを例示する概略図を示す図である。 脊椎動物補体の補体第二経路（「Ｉ」＝補体Ｉ因子；「Ｈ」＝補体Ｈ因子；「Ｂ」＝補体因子Ｂ；および「Ｄ」＝補体因子Ｄ）の、Ｃ３ｂフィードバック（増幅）サイクルおよび分解（下方調節）サイクルを示す図である。 ＣＮＶのマウスモデルにおける、ＣＦＩ（ＧＴ００５）またはＦＨＬ１（ＲＣ００１）を発現させる、モノシストロニックベクターの投与を示す図である。 ＨＥＫ２９３細胞内の、バイシストロニックベクターによる発現の比較を示す図である。（Ａ）アフリベルセプトおよびＣＦＩの、ＡＡＶ８によるバイシストロニック発現；（Ｂ）感染多重度を、５×１０３とする、アフリベルセプト（左バー）およびＣＦＩ（右バー）の、ＡＡＶ２によるバイシストロニック発現；（Ｃ）アフリベルセプトおよびＦＨＬ－１のＡＡＶ８によるバイシストロニック発現；ならびに（Ｄ）感染多重度を、５×１０３とする、アフリベルセプト（左バー）およびＦＨＬ－１（右バー）の、ＡＡＶ２によるバイシストロニック発現；（Ｅ）アフリベルセプトおよびＣＦＩの、ＡＡＶ８によるバイシストロニック発現；（Ｆ）アフリベルセプトおよびＦＨＬ－１の、ＡＡＶ８によるバイシストロニック発現の、代表的発現レベルである。 （上記の通り。） （上記の通り。） 非還元条件下における、バイシストロニックベクターからのタンパク質発現を示す、ウェスタンブロット解析を示す図である。 アフリベルセプトの結合アフィニティーを示す図である。一定濃度のヒトＶＥＧＦＡの、変動濃度の、ベクター由来のアフリベルセプトを伴うインキュベーションの後における、非結合ＶＥＧＦＡを測定する結合アッセイを使用することにより決定される、モノシストロニックベクターおよびバイシストロニックベクターにより発現されたアフリベルセプトの、ＶＥＧＦＡに対するアフィニティーである。Ｋｄ曲線に由来する、Ｅｙｌｅａ（登録商標）のＩＣ５０値＝２．３ｎＭである。 アフリベルセプトの阻害特性を示す図である。一定濃度のＶＥＧＦＡの存在下で、変動濃度の、ベクター由来のアフリベルセプトを使用する、ＨＵＶＥＣ細胞の、ＶＥＧＦＡ誘導性増殖の阻害である。 ＣＦＩおよびＦＨＬ１についてのＣ３ｂ切断アッセイが、バイシストロニックベクターから発現されたＣＦＩおよびＦＨＬ１が、機能的であり、Ｃ３ｂの、ｉＣ３ｂへの分解を容易とすることを裏付けたことを示す図である。 アフリベルセプトｍＲＮＡの発現：モノシストロニックベクターによるアフリベルセプト（マウス）を示す図である。抗ＶＥＧＦ（アフリベルセプト）を発現させるＡＡＶ８（モノシストロニック）ベクターを、９週齢の雄マウスの右眼へと、網膜下投与した。トランス遺伝子由来ｍＲＮＡは、逆転写およびｑＲＴ－ＰＣＲにより定量した。 アフリベルセプトタンパク質の発現：モノシストロニックベクターによるアフリベルセプト（マウス）を示す図である。抗ＶＥＧＦ（アフリベルセプト）を発現させるＡＡＶ８（モノシストロニック）ベクターを、９週齢の雄マウスの右眼へと、網膜下投与した。眼液中の非結合アフリベルセプトは、定量的サンドイッチ型ＥＬＩＳＡを使用して測定した。 アフリベルセプトｍＲＮＡの発現：バイシストロニックの候補ベクター（マウス）を示す図である。抗ＶＥＧＦ（アフリベルセプト）と、補体調節因子（ｈＣＦＩまたはｈＦＨＬ－１）とを共発現させる、バイシストロニックのＡＡＶベクターを、１０週齢の雄マウスの右眼（ＯＤ）へと、網膜下投与した。トランス遺伝子由来ｍＲＮＡは、逆転写およびｑＲＴ－ＰＣＲにより定量した。 アフリベルセプト、ＣＦＩ、およびＦＨＬ－１のタンパク質発現（バイシストロニックベクター）を示す図である。抗ＶＥＧＦ（アフリベルセプト）と、補体調節因子（ｈＣＦＩまたはｈＦＨＬ－１）とを共発現させる、バイシストロニックのＡＡＶベクターを、１０週齢の雄マウスの右眼（ＯＤ）へと、網膜下投与した。眼液中の非結合アフリベルセプトは、定量的サンドイッチ型ＥＬＩＳＡを使用して測定した。眼液中のヒトＣＦＩおよびヒトＦＨＬ－１は、ＭＳＤ製の電気化学発光検出技術を使用して定量した。 ｉｎ ｖｉｖｏのレーザー誘導性マウス脈絡膜新血管形成モデルにおける有効性を示す図である。５群のマウスに、異なるＡＡＶベクターの、片側（右眼）網膜下注射を施した。ベクター投与の４週間後、レーザー光凝固により、ＣＮＶを誘導した。レーザー照射の４および７日後に、マウスをイメージングし、次いで、屠殺した。（Ａ）ＣＮＶ漏出面積、および（Ｂ）ＣＮＶ病変サイズの定量を実行した。 （上記の通り。）
本明細書で使用される、「～を含むこと」、「～を含む」、および「～から構成された」という用語は、「～を含むこと」もしくは「～を含む」；または「～を含有すること」もしくは「～を含有する」と同義であり、包含的またはオープンエンドであり、引用されていないさらなるメンバー、要素、またはステップを除外しない。「～を含むこと」、「～を含む」、および「～から構成された」という用語はまた、「～からなること」という用語も含む。
ＶＥＧＦ
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管の形成を刺激する細胞により産生される、強力な血管新生性タンパク質である。ＶＥＧＦは、増殖因子のサブファミリーである、システインノット増殖因子のうちの、血小板由来増殖因子ファミリーである。ＶＥＧＦは、血管形成（胎児循環系のデノボ形成）および血管新生（既存の血管系からの血管の増殖）の両方に関与する。
哺乳動物では、ＶＥＧＦファミリーは、５つのメンバー：ＶＥＧＦ－Ａ、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、およびＶＥＧＦ－Ｄを含む。
適切には、本明細書で言及されるＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ－Ａでありうる。
単一の、８エクソンのＶＥＧＦＡ遺伝子からの、ｍＲＮＡの代替的スプライシングの結果として、ＶＥＧＦ－Ａの複数のアイソフォームが得られる。これらは、それらの末端のエクソン（エクソン８）スプライス部位に従い言及される、２つの群：近位スプライス部位（ＶＥＧＦｘｘｘと表記される）または遠位スプライス部位（ＶＥＧＦｘｘｘｂ）に分類される。加えて、第６エクソンおよび第７エクソンの代替的スプライシングは、それらのヘパリン結合アフィニティーおよびアミノ酸数を変更する（ヒトにおいては：ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１２１ｂ、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６であり；これらのタンパク質の齧歯動物オーソログは、１つ少ないアミノ酸を含有する）。末端（第８エクソン）のスプライス部位は、タンパク質が、血管新生促進性（血管新生時に発現される、近位スプライス部位；ＶＥＧＦｘｘｘ）であるのか、抗血管新生性（正常組織内で発現される、遠位スプライス部位；ＶＥＧＦｘｘｘｂ）であるのかを決定するので、これらのドメインは、ＶＥＧＦスプライス変異体に対して、重要な機能的な帰結をもたらす。加えて、第６エクソンおよび第７エクソンの組入れまたは除外は、細胞表面上の、ヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧｓ）およびニューロフィリン共受容体との相互作用を媒介し、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）に結合し、これを活性化させる、それらの能力を増強する。
ＶＥＧＦは、３つの受容体チロシンキナーゼ：ＶＥＧＦＲ１（ＶＥＧＦ受容体１）、ＶＥＧＦＲ２、およびＶＥＧＦＲ３のファミリーと相互作用する。ＶＥＧＦＡおよびＶＥＧＦＢは、ＶＥＧＦＲ１に結合し、ＶＥＧＦＡは、ＶＥＧＦＲ２に結合し、ＶＥＧＦＣおよびＶＥＧＦＤは、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３の両方に結合する。胎盤増殖因子（ＰＧＦ）は、主に、ＶＥＧＦＲ１と相互作用する。ＶＥＧＦＲは、多種多様な細胞型において見出される。Ｆｌｔ－１（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１）ともまた呼ばれる、ＶＥＧＦＲ１は、血管内皮細胞、造血幹細胞、単球、およびマクロファージにおいて見出される。ＫＤＲ（ｋｉｎａｓｅ ｉｎｓｅｒｔ ｄｏｍａｉｎ）またはＦｌｋ－１（ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｋｉｎａｓｅ １）ともまた呼ばれる、ＶＥＧＦＲ２は、血管内皮細胞およびリンパ内皮細胞において発現され；ＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ－４ともまた呼ばれる）は、リンパ内皮細胞へと制約される。リガンドが結合すると、ＶＥＧＦＲは、様々なメディエーターを介して、細胞シグナルを伝達する。最もよく特徴付けられているＶＥＧＦＲ２の場合、細胞シグナルは、血管新生、リンパ管形成、血管透過性、および血管ホメオスタシスを促進する、ホスファチジルイノシトール－３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ、マイトジェン活性化キナーゼ、受容体チロシンキナーゼ以外のＳｒｃのほか、ＰＬＣγ（ホスホリパーゼＣガンマ）／ＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）を含む。
ＶＥＧＦ－Ａは、糖尿病網膜症（ＤＲ）の病因において、重要である。糖尿病者の網膜における微小循環問題は、ＶＥＧＦ－Ａの放出、および血管新生促進性ＶＥＧＦアイソフォームが正常発現型抗血管新生性ＶＥＧＦアイソフォームを上回る均衡の切り替えを結果としてもたらす網膜内虚血を引き起こしうる。次いで、血管新生促進性ＶＥＧＦは、網膜内および眼内の他の箇所における、新血管の創出を引き起こすことから、視覚に影響を及ぼす変化の前兆となる。
ＶＥＧＦ－Ａもまた、産業化世界の高齢者にとって、失明の第一の原因である湿潤型加齢黄斑変性（ＡＭＤ）において、重要な疾患病態である。ＡＭＤの血管病態は、糖尿病網膜症との、ある特定の類似性を共有するが、疾患の原因および新血管形成の典型的源泉は、２つの疾患の間で異なる。
本明細書で使用される、抗ＶＥＧＦ実体は、ＶＥＧＦの発現および／または活性を低減することが可能な、任意の実体を指す場合がある。
明らかな通り、抗ＶＥＧＦ実体は、ＶＥＧＦ、特に、ＶＥＧＦ－Ａの、１つまたは複数の血管新生促進性アイソフォームの発現および／または活性を低減することが可能であろう。
適切には、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、および／またはＰＧＦでありうる。
適切には、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、およびＰＧＦでありうる。
抗ＶＥＧＦ実体が、以下：抗体、Ｉｇ融合タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、低分子、非抗体足場、アプタマーまたはこれらの組合せのうちの１つまたは複数から選択されうる。
本明細書で使用される抗体は、全抗体、およびその抗体断片の両方を包含することが意図される。適切には、抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、およびヒト化抗体、単鎖抗体、抗体断片、およびファージディスプレイ法または代替法を使用して作製される、人工選択抗体を含む操作抗体を含むがこれらに限定されない。
選択された標的に結合することが可能な、適切な抗体断片は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）、およびＦ（ａｂ’）２を含む。加えて、本発明では、古典的抗体に対する代替物、例えば、「アビボディー」、「アビマー」、「アンチカリン」、「ナノボディー」、および「ＤＡＲＰｉｎ」もまた、使用されうる。
本明細書で使用される、「ｓｃＦｖ」または「単鎖可変断片」に対する言及は、抗体の可変重鎖（ＶＨ）と、可変軽鎖（ＶＬ）とが、可撓性のオリゴペプチドを介して連結された分子を含む。したがって、ｓｃＦｖは、少なくとも１つの可変重鎖と、少なくとも１つの可変軽鎖との融合体である。
明らかな通り、抗ＶＥＧＦ実体および負の補体調節因子が、単離ポリヌクレオチドとして提供される実施形態では、抗ＶＥＧＦ実体は、ポリヌクレオチドによりコードされうる実体であろう。例えば、抗ＶＥＧＦ実体は、Ｉｇ融合タンパク質、抗体またはその抗原結合性断片、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド（例えば、ＶＥＧＦの遺伝子配列またはそのｍＲＮＡ配列をターゲティングする、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、配列のＣＲＩＳＰＲｉガイド鎖）、非抗体足場、またはアプタマーでありうる。
抗ＶＥＧＦ実体は、１つもしくは複数のＶＥＧＦ、および／または１つもしくは複数のＶＥＧＦ受容体に結合することにより作用しうる。
抗ＶＥＧＦ実体は、ＶＥＧＦの増殖促進活性および／または血管新生促進活性を低減することが可能でありうる。
例を目的として述べると、抗ＶＥＧＦ実体は、ＶＥＧＦ依存性細胞系の増殖を低減することが可能でありうる。適切な細胞系は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、およびWentink et al. (Br J Cancer; 2016; 115(8); 940-948)により記載されている、Ｂａ／Ｆ３－ＶＥＧＦＲ２細胞系などの内皮細胞を含むがこれらに限定されない。
抗ＶＥＧＦ実体は、ＶＥＧＦ依存性細胞系の増殖を、抗ＶＥＧＦ実体の非存在下における増殖と比べて、少なくとも１分の１（適切には、少なくとも１．５分の１、少なくとも２分の１、少なくとも２．５分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、または少なくとも５分の１）に低減しうる。抗ＶＥＧＦ実体は、ＶＥＧＦ依存性細胞系の増殖を、抗ＶＥＧＦ実体の非存在下における増殖と比べて、少なくとも１０％（適切には、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、または少なくとも２００％）低減しうる。
抗ＶＥＧＦ実体が、アフリベルセプト、ラニビズマブ、ベバシズマブ、およびペガプタニブ、またはこれらの断片もしくは変異体から選択されうる。
抗ＶＥＧＦ実体が、アフリベルセプト、ラニビズマブ、およびペガプタニブ、またはこれらの断片もしくは変異体から選択されうる。
抗ＶＥＧＦ実体が、アフリベルセプトおよびラニビズマブ、またはこれらの断片もしくは変異体から選択されうる。
抗ＶＥＧＦ実体は、アフリベルセプトまたはその断片もしくは変異体でありうる。
抗ＶＥＧＦ実体は、ラニビズマブまたはその断片もしくは変異体でありうる。
抗ＶＥＧＦ実体は、ベバシズマブまたはその断片もしくは変異体でありうる。
抗ＶＥＧＦ実体は、ペガプタニブまたはその断片もしくは変異体でありうる。
抗ＶＥＧＦ実体は、アフリベルセプトでありうる。アフリベルセプトは、循環ＶＥＧＦに結合し、「ＶＥＧＦトラップ」として作用する。こうして、抗ＶＥＧＦ実体は、ＶＥＧＦ亜種である、ＶＥＧＦ－ＡおよびＶＥＧＦ－Ｂのほか、ＰＧＦの活性を阻害する。アフリベルセプトは、ヒト免疫グロブリンガンマ１（ＩｇＧ１）のＦｃ領域と融合された、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２の結合性ドメインから構成された組換えタンパク質である。構造的に、アフリベルセプトは、タンパク質分子量を９６．９ｋＤａとする、二量体の糖タンパク質である。
例示的なアフリベルセプトのアミノ酸配列は、配列番号１として示される。
配列番号１
アフリベルセプトのアミノ酸配列は、配列番号１として示される配列を含みうる。変異体は、配列番号１に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有しうる。好ましくは、断片または変異体は、配列番号１として示されるタンパク質の機能活性を実質的に保持する。
アフリベルセプトのアミノ酸配列は、配列番号２～１１として示されるポリヌクレオチド配列によりコードされうる。
配列番号２
一部の実施形態では、本発明で使用される、アフリベルセプト（または他の任意の抗ＶＥＧＦ実体）をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。異なる細胞は、それらによる特定のコドン使用が異なる。このコドンバイアスは、細胞型内の、特定のｔＲＮＡの相対存在度のバイアスに対応する。配列内のコドンを微調整して、対応するｔＲＮＡの相対存在度とマッチするように変更することにより、発現を増大させることが可能である。同様に、対応するｔＲＮＡが、特定の細胞型内で希少であることが公知であるコドンを意図的に選び出すことにより、発現を低下させることも可能である。したがって、さらなる程度の翻訳制御も利用可能である。
アフリベルセプトをコードする、例示的なコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号３～１１として示される。
配列番号３
配列番号４
配列番号５
配列番号６
配列番号７
配列番号８
配列番号９
配列番号１０
配列番号１１
好ましくは、アフリベルセプトのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１１またはその変異体である。
一部の実施形態では、アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２～１１のうちのいずれか、好ましくは、配列番号１１に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。好ましくは、ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質は、配列番号１により表されるタンパク質の機能活性を実質的に保持する。
ラニビズマブは、ＶＥＧＦＡに対するモノクローナル抗体断片（Ｆａｂ）である。適切には、ラニビズマブのポリペプチドは、それぞれ、配列番号１２および１３として示される、重鎖可変配列および軽鎖可変配列を含みうる。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の各々に下線を付されて示される。
配列番号１２
配列番号１３
ラニビズマブの重鎖可変配列および軽鎖可変配列は、配列番号１２または１３として示されるポリペプチドを含みうる。変異体は、配列番号１２または１３に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有しうる。好ましくは、断片または変異体は、配列番号１２および１３として示される重鎖可変配列および軽鎖可変配列の機能活性を実質的に保持する。
ラニビズマブの重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、任意の適切なポリヌクレオチド配列によりコードされうる。重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、単離ポリヌクレオチド内で作動可能に連結されうる。例えば、重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、同じプロモーターに作動可能に連結され、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）または自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列により、互いから分離されうる。
ラニビズマブの重鎖および軽鎖のポリペプチドのそれぞれをコードするポリヌクレオチド配列の例は、配列番号１４および１５として示される。
配列番号１４
配列番号１５
ラニビズマブをコードする、単離ポリヌクレオチドおよびＡＡＶベクターの例については、例えば、国際公開第２０１９／１６４８５４号パンフレットにより提示されている。
ベバシズマブは、ＶＥＧＦＡに対するモノクローナル抗体である。適切には、ベバシズマブのポリペプチド配列は、それぞれ、配列番号１６および１７として示される、重鎖配列および軽鎖配列を含みうる。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の各々に下線を付されて示される。
配列番号１６
配列番号１７
ベバシズマブの重鎖配列および軽鎖配列は、配列番号１６または１７として示されるポリペプチドを含みうる。変異体は、配列番号１６または１７に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有しうる。好ましくは、断片または変異体は、配列番号１６および１７として示される、重鎖配列および軽鎖配列の機能活性を実質的に保持する。
ベバシズマブの重鎖および軽鎖のポリペプチドのそれぞれをコードするポリヌクレオチド配列の例は、配列番号１８および１９として示される。
配列番号１８
配列番号１９
ベバシズマブの重鎖および軽鎖のポリペプチドは、任意の適切なポリヌクレオチド配列によりコードされうる。重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、単離ポリヌクレオチド内で作動可能に連結されうる。例えば、重鎖および軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、同じプロモーターに作動可能に連結され、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）または自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列により、互いから分離されうる。
ペガプタニブは、ＶＥＧＦ（１６５）アイソフォームに特異的なＲＮＡアプタマーである。ペガプタニブのためのＲＮＡ配列は、配列番号２０として示される。
配列番号２０
ＧＣＧＧＡＡＵＣＡＧＵＧＡＡＵＧＣＵＵＡＵＡＣＡＵＣＣＧＣ
ペガプタニブのポリヌクレオチド配列は、配列番号２０として示される配列を含みうる。変異体は、配列番号２０に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有しうる。好ましくは、断片または変異体は、配列番号２０として示されるポリヌクレオチドの機能活性を実質的に保持する。
ペガプタニブをコードする、例示的なポリヌクレオチド配列は、配列番号２１として示される。
配列番号２１
ＣＧＣＣＴＴＡＧＴＣＡＣＴＴＡＣＧＡＡＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧ
シグナルペプチド
抗ＶＥＧＦ実体をコードするポリヌクレオチド配列は、抗ＶＥＧＦ実体の、細胞からの分泌を可能とする、シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含みうる。
シグナルペプチドとは、典型的に、分泌経路へと決定されている新規合成タンパク質の大部分のＮ末端に存在する、一般に、５～３０アミノ酸長である、短鎖ペプチドである。これらのタンパク質は、ある特定の細胞内小器官（例えば、小胞体、ゴルジ体、またはエンドソーム）の内部に常在するか、または細胞から分泌されるタンパク質、および膜貫通タンパク質を含む。
シグナルペプチドは、一般に、単一のアルファ－ヘリックスを形成する傾向がある、疎水性アミノ酸の長い連なりである、コア配列を含有する。シグナルペプチドは、転位時において、ポリペプチドの適正なトポロジーを強制する一助となる、短く、正に帯電したアミノ酸の連なりで始まりうる。シグナルペプチドの末端には、典型的に、シグナルペプチダーゼにより認識および切断される、アミノ酸の連なりが存在する。シグナルペプチダーゼは、遊離シグナルペプチドと、成熟タンパク質とをもたらすように、転位時に切断する場合もあり、転位の完了後に切断する場合もある。次いで、遊離シグナルペプチドは、特異的プロテアーゼにより消化される。
シグナルペプチドは、一般に、分子のアミノ末端に配置されるが、一部のカルボキシ末端におけるシグナルペプチドも公知である。
シグナル配列は、典型的に、ｎ領域と、ｃ領域とにより挟まれた疎水性コア領域（ｈ領域）からなる、三部構造を有する。後者は、シグナルペプチダーゼ（ＳＰアーゼ）コンセンサス切断部位を含有する。通例、シグナル配列は、共翻訳的に切り離され、結果として得られる切断シグナル配列は、シグナルペプチドと称される。
シグナル配列は、ソフトウェア法を使用して、検出または予測されうる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｄｉｓｉ．ｄｅ／を参照されたい）。多数のシグナル配列が公知であり、データベースにおいて閲覧可能である。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅは、そのデータベース内で、２１０９の、確認された哺乳動物シグナルペプチドを一覧している。
適切には、シグナルペプチドは、ＣＦＨシグナルペプチドでありうる。
ＣＦＨシグナルペプチドをコードする、例示的なポリヌクレオチド配列は、配列番号２２～３１として示される。
配列番号２２：ＡＴＧＡＧＡＣＴＴＣＴＡＧＣＡＡＡＧＡＴＴＡＴＴＴＧＣＣＴＴＡＴＧＴＴＡＴＧＧＧＣＴＡＴＴＴＧＴＧＴＡＧＣＡ
配列番号２３：ＡＴＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＣ
配列番号２４：ＡＴＧＡＧＡＣＴＧＣＴＣＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＴＴＴＧＣＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＣ
配列番号２５：ＡＴＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＡ
配列番号２６：ＡＴＧＣＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＴＴＴＧＣＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＡ
配列番号２７：ＡＴＧＡＧＡＣＴＧＣＴＣＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＴＣＴＧＴＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＴＡＴＣＴＧＴＧＴＣＧＣＴ
配列番号２８：ＡＴＧＡＧＡＣＴＧＣＴＣＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＴＴＴＧＴＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＴＡＴＣＴＧＴＧＴＣＧＣＴ
配列番号２９：ＡＴＧＣＧＣＴＴＧＣＴＧＧＣＧＡＡＧＡＴＡＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＴＧＴＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＡＴＧＣＧＴＡＧＣＣ
配列番号３０：ＡＴＧＣＧＣＴＴＧＣＴＧＧＣＧＡＡＧＡＴＡＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＴＧＴＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＡＴＧＣＧＴＡＧＣＣ
配列番号３１：ＡＴＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＴＧＣＴＧＴＧＧＧＣＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＧＣＣ
補体系
補体系は、体液性免疫系に不可欠の部分であり、組織炎症、細胞のオプソニン化、および細胞溶解に関与する。補体系は、微生物に対する防御をもたらし、外因性細胞破砕物および内因性細胞破砕物の、宿主組織からの除去を媒介する。
補体系カスケードは、３つの活性化経路から構成される。経路の全ては、最終的に、Ｃ３因子の切断中心となり、その活性断片であるＣ３ａおよびＣ３ｂの発生をもたらすことで終わる。Ｃ３ａが、炎症性細胞の動員、および微小血管透過性の増大など、ある範囲にわたる走化性および炎症促進性反応を誘発する、アナフィラトキシンであるのに対し、Ｃ３ｂは、Ｃ３ｂに共有結合的に接合された異種表面のオプソニン化を担う。活性化Ｃ３断片（Ｃ３ｂおよびｉＣ３ｂ）を伴うオプソニン化は、３つの主要な機能：（ｉ）食細胞（例えば、マクロファージまたはミクログリア）による、細胞破砕物の消失、および獲得免疫系（Ｂ細胞およびＴ細胞）の刺激；（ｉｉ）表面結合Ｃ３転換酵素の形成を介する、補体活性化の増幅；ならびに（ｉｉｉ）Ｃ５転換酵素の組織化を果たす。
Ｃ５転換酵素の組織化は、Ｃ５の切断を担い、これは、細胞膜に穿孔をもたらし、これにより、細胞溶解の促進および不要な細胞の消失をもたらすことが可能な、細胞溶解性のＭＡＣ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｔｔａｃｋ ｃｏｍｐｌｅｘ）の形成を結果としてもたらす。これらの活性の全てを通して、生得的補体カスケードは、宿主組織の完全性を保護する、免疫系の下流機構の機能を支援し、これを促進する。全体として、補体系経路の活性化は、細胞の溶解、炎症性細胞を、損傷部位へと誘引するケモカインの放出、および浸潤性白血球の溢出を促進する、毛細管透過性の増強を媒介する、ＭＡＣの発生を含む炎症促進性応答を結果としてもたらす。生理学的条件下で、補体活性化は、可溶性補体調節分子（ＣＲＭ）と、膜会合性ＣＲＭとの協同的作用により、有効に制御される。Ｃ１阻害剤、アナフィラトキシン阻害剤、Ｃ４ｂ結合性タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、補体Ｈ因子（ＣＦＨ）、補体Ｉ因子（ＣＦＩ）、クラステリン、およびビトロネクチンなどの可溶性補体調節因子は、ヒト組織内の、カスケード反応の複数の部位における、補体の作用を制限する。加えて、各個別の細胞は、補体受容体１（ＣＲ１、ＣＤ３５）、ＭＣＰ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＤ４６）、およびＤＡＦ（ｄｅｃａｙ－ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）（ＣＤ５５）またはＣＤ５９分子などのグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型タンパク質などの表面タンパク質による、相同な補体の攻撃に対して保護される。補体の攻撃からの保護が不十分である宿主細胞および宿主組織は、バイスタンダー細胞溶解を受けうることは注目に値する。
一部の実施形態では、本発明は、眼の補体媒介性障害の処置または防止に関する。例えば、補体媒介性障害は、補体第二経路の調節不全と関連する障害、特に、補体Ｃ３ｂのフィードバックサイクルの過剰活性、および／またはＣ３ｂの分解サイクルの過小活性と関連する障害でありうる。
本発明は、負の補体調節因子の使用を含む。負の補体調節因子は、カスケード反応の、１つまたは複数の部位において、補体の作用を制限する実体を指す場合がある。例を目的として述べると、負の補体調節因子は、Ｃ１阻害剤、アナフィラトキシン阻害剤、Ｃ４ｂ結合性タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、補体Ｈ因子（ＣＦＨ）、ＦＨＬ１（ｆａｃｔｏｒ Ｈ Ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）、補体Ｉ因子（ＣＦＩ）、クラステリン、またはビトロネクチンでありうる。負の補体調節因子はまた、相同な補体の攻撃に対して、細胞を保護することが可能な表面タンパク質；例えば、補体受容体１（ＣＲ１、ＣＤ３５）、ＭＣＰ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＣＤ４６）、およびＤＡＦ（ｄｅｃａｙ－ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）（ＣＤ５５）またはＣＤ５９分子などのグリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型タンパク質でもありうる。
適切には、負の補体調節因子は、補体活性化カスケードの成分の阻害剤、例えば、補体Ｃ３ｂのフィードバックサイクルの阻害剤でありうる。
負の補体調節因子が、ＣＦＩ、ＦＨＬ１、ＣＦＨ、ＣＲ１、およびＭＣＰ、またはこれらの変異体もしくは断片から選択されうる。
負の補体調節因子が、ＣＦＩ、ＦＨＬ１、およびＣＦＨ、またはこれらの変異体もしくは断片から選択されうる。
負の補体調節因子は、ＣＦＩ、またはこれらの変異体もしくは断片でありうる。
負の補体調節因子は、ＦＨＬ１、またはこれらの変異体もしくは断片でありうる。
負の補体調節因子は、ＣＦＨ、またはこれらの変異体もしくは断片でありうる。
負の補体調節因子は、ＣＲ１、またはこれらの変異体もしくは断片でありうる。
負の補体調節因子は、ＭＣＰ、またはこれらの変異体もしくは断片でありうる。
適切には、生成物は、１つまたは複数の負の補体調節因子を含みうる。
適切には、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の負の補体調節因子をコードしうる。
一部の実施形態では、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物の投与の前に、対象は、補体Ｉ因子活性のレベルが低レベル（例えば、正常未満のレベル）である、例えば、眼内の補体Ｉ因子活性レベルが低レベルであり、かつ／または補体Ｉ因子活性の血清レベルが低レベルである。正常未満レベルの補体Ｉ因子活性は、機能が正常である補体Ｉ因子の、正常未満の発現に起因する場合もあり、補体Ｉ因子の、非機能的変異体または機能不全的変異体の、少なくとも部分的（例えば、ヘテロ接合性）発現（正常レベルまたは正常未満レベルにおける）に起因する場合もある（このような対象は、ＡＭＤ関連ＳＮＰの１つまたは複数のコピーを保有しうる、例えば、対象は、下記でさらに論じられる、希少な補体Ｉ因子変異体のうちの１つについて、ホモ接合性の対象の場合もあり、ヘテロ接合性の対象の場合もある）。したがって、対象の眼内および／または血清中の補体Ｉ因子が、低濃度（例えば、正常未満の濃度）でありうる。ヒト対象について、補体Ｉ因子活性（Ｃ３ｂ不活化／ｉＣ３ｂ分解活性）の正常レベルは、対象の血清中の補体Ｉ因子３０～４０μｇ／ｍＬによりもたらされるレベルと同等でありうる。したがって、補体Ｉ因子活性が低度である対象では、血清中の補体Ｉ因子活性は、０～２０、または０～１０μｇ／ｍＬなど、３０μｇ／ｍＬ未満であり、かつ、０μｇ／ｍＬを超える補体Ｉ因子に対応しうる（これらの濃度は、補体Ｉ因子濃度が低濃度である対象を包含しうる、補体Ｉ因子の血清濃度の範囲である）。
したがって、本発明により処置される対象は、ＡＭＤなど、眼の補体媒介性障害を患っている場合もあり、このような障害を発症する危険性がある場合もある。ＡＭＤは、湿潤型ＡＭＤの場合もあり、かつ／または乾燥型ＡＭＤの場合もある。例えば、対象は、補体媒介性障害と関連する、１つまたは複数のＳＮＰに感受性である、ホモ接合性の対象の場合もあり、ヘテロ接合性の対象の場合もある。
一部の実施形態では、対象は、ＡＭＤを発症する危険性がある。例えば、対象は、ＡＭＤと関連する、１つまたは複数のＳＮＰ、例えば、一般に、血清補体Ｉ因子レベルの低減を結果としてもたらす、進行ＡＭＤと関連する、補体Ｉ因子における、希少な突然変異に感受性である、ホモ接合性の対象の場合もあり、ヘテロ接合性の対象の場合もある（Kavanagh et al. (2015) Hum Mol Genet 24: 3861-3870）。特に、対象は、以下の希少な補体Ｉ因子変異体：ｒｓ１４４０８２８７２（Ｐ５０Ａをコードする）；４：１１０６８７８４７（Ｐ６４Ｌをコードする）；ｒｓ１４１８５３５７８（Ｇ１１９Ｒをコードする）；４：１１０６８５７２１（Ｖ１５２Ｍをコードする）；４：１１０６８２８４６（Ｇ１６２Ｄをコードする）；４：１１０６８２８０１（Ｎ１７７Ｉをコードする）；ｒｓ１４６４４４２５８（Ａ２４０Ｇをコードする）；ｒｓ１８２０７８９２１（Ｇ２８７Ｒをコードする）；ｒｓ４１２７８０４７（Ｋ４４１Ｒをコードする）；およびｒｓ１２１９６４９１３（Ｒ４７４をコードする）のうちの１つまたは複数の、１つまたは２つのコピーを保有しうる。
本発明は、例えば、対象が、補体媒介性障害と関連する、１つまたは複数のＳＮＰに感受性である、ホモ接合性の対象であるのか、ヘテロ接合性の対象であるのかを決定することにより（例えば、対象が、上記で列挙された、ＡＭＤと関連する、希少な補体Ｉ因子変異体のうちの１つまたは複数について、ホモ接合性であるのか、ヘテロ接合性であるのかを決定することにより）、対象が、補体媒介性障害（例えば、ＡＭＤ）を発症する危険性があるのかどうかを決定するステップをさらに含みうる。
代替的に、対象は、例えば、眼内および／もしくは血清中の内因性補体Ｉ因子の活性または濃度のレベルが正常であり、かつ／または希少な変異体補体Ｉ因子の対立遺伝子を保有しない場合がある。
一部の実施形態では、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物の投与は、これにより、対象の眼における、Ｃ３ｂ不活化／ｉＣ３ｂ分解活性のレベルを上昇させる。他の実施形態では、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物の投与は、これにより、対象の眼における、Ｃ３ｂ不活化／ｉＣ３ｂ分解活性のレベルを、眼における正常レベルを超えるレベルへと上昇させる。より特定すると、眼のＲＰＥでは、Ｃ３ｂ不活化／ｉＣ３ｂ分解活性のレベルが上昇する。
本発明の生成物の施与、ならびに／または本発明のポリヌクレオチドまたはベクターからの、補体Ｉ因子および補体ＦＨＬ１（ｆａｃｔｏｒ Ｈ Ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）の発現の後の対象における、Ｃ３ｂ不活化／ｉＣ３ｂ分解活性は、対象における、全Ｃ３ｂ不活化／ｉＣ３ｂ分解活性レベルが、正常レベルを超えるように、対象の内因性補体Ｉ因子（すなわち、生成物によりもたらされないか、またはポリヌクレオチドまたはベクターからの発現によりもたらされない、対象の補体Ｉ因子）によるＣ３ｂ不活化／ｉＣ３ｂ分解活性と、本発明の生成物によりもたらされるか、または本発明のポリヌクレオチドまたはベクターからの発現によりもたらされる、Ｃ３ｂ不活化／ｉＣ３ｂ分解活性とを含みうることが理解されるであろう。
一部の実施形態では、対象、例えば、眼におけるＣ３ｂ不活化／ｉＣ３ｂ分解活性のレベルは、正常レベルを、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、または２５％上回るレベルへと上昇する。
他の実施形態では、対象、例えば、眼におけるＣ３ｂ不活化／ｉＣ３ｂ分解活性のレベルは、正常レベルの２倍以下のレベル、または正常レベルを、８０％、６０％、４０％、または２０％以下上回るレベルへと上昇する。
例えば、対象、例えば、眼におけるＣ３ｂ不活化／ｉＣ３ｂ分解活性のレベルは、正常レベルを、５～１００％、５～８０％、５～６０％、５～４０％、５～２０％、１０～１００％、１０～８０％、１０～６０％、１０～４０％、１０～２０％、１５～１００％、１５～８０％、１５～６０％、１５～４０％、１５～２０％、２０～１００％、２０～８０％、２０～６０％、２０～４０％、２５～１００％、２５～８０％、２５～６０％、または２５～４０％上回るレベルへと上昇しうる。
一部の実施形態では、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物の投与は、対象の血漿／血清中の、Ｃ３ｂ不活化／ｉＣ３ｂ分解活性のレベルを検出可能な程度に上昇させない。他の実施形態では、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物の投与は、対象の血漿／血清中の、Ｃ３ｂ不活化／ｉＣ３ｂ分解活性のレベルを、正常レベルを超えるレベルへと、検出可能な程度に上昇させない。
明らかに適用不可能な場合を除き、前出の節における、補体Ｉ因子およびＣ３ｂ不活化／ｉＣ３ｂ分解活性に対する言及は、それぞれ、補体Ｈ因子または補体ＦＨＬ１（ｆａｃｔｏｒ Ｈ Ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）、およびＣ３ｂの補体Ｉ因子媒介切断のための補因子として作用し、Ｃ３転換酵素およびＣ５転換酵素の解離速度を増大させる能力で置きかえられうる。一部の実施形態では、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物の投与の前に、対象は、補体Ｈ因子のレベルが低レベル（例えば、正常未満のレベル）である、例えば、眼内の補体Ｈ因子レベルが低レベルであり、かつ／または補体Ｈ因子の血清レベルが低レベルである。ヒト対象について、補体Ｈ因子の正常レベルは、対象の血清中、約２００～５００μｇ／ｍＬでありうる。したがって、補体Ｈ因子が低レベルである対象では、血清中レベルは、０～１００μｇ／ｍＬなど、２００μｇ／ｍＬ未満であり、かつ、０μｇ／ｍＬを超えるレベルでありうる。代替的に、対象は、例えば、眼内および／または血清中において、正常レベルの内因性補体Ｈ因子を有しうる。
補体Ｉ因子（ＣＦＩ）
Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ不活性化因子としてもまた公知の補体Ｉ因子（ｆａｃｔｏｒ Ｉ、ＣＦＩ）は、ヒトにおいて、ＣＦＩ遺伝子によりコードされるタンパク質である。
補体Ｉ因子は、ザイモゲン様状態（Roversi et al. (2011) PNAS 108: 12839-12844）において、約３５μｇ／ｍＬの濃度（Nilsson et al. (2011) Mol Immunol 48: 1611-1620）で循環するセリンプロテアーゼである。補体Ｉ因子タンパク質は、単一のジスルフィド結合により連結された、２つのポリペプチド鎖からなる、高度にＮ－グリコシル化されたヘテロ二量体である。重鎖（５０ｋＤａ）は、Ｎ末端領域；ＦＩＭＡＣ（ＦＩ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｔｔａｃｋ ｃｏｍｐｌｅｘ）ドメイン；ＣＤ５様ドメイン、またはスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン；２つの低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬｒ）ドメイン；および種にわたる配列可変性を有する部位である、機能が未知のＣ末端領域部位（Roversi et al. (2011) PNAS 108: 12839-12844）を含む。軽鎖（３８ｋＤａ）は、保存的触媒性残基を伴う、セリンプロテアーゼ（ＳＰ）ドメインを含有する（Goldberger et al. (1987) J Biol Chem 262: 10065-10071）。
補体Ｉ因子は、Ｃ３ｂを、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄ、およびＣ３ｄｇへと切断することにより、これを不活化し、類似の方式で、Ｃ４ｂを、Ｃ４ｃおよびＣ４ｄへと不活化する。その機能を、適正に実施するために、補体Ｉ因子は、Ｃ４ｂ結合性タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、補体Ｈ因子（ＣＦＨ）、補体受容体１（ＣＲ１／ＣＤ３５）、およびＭＣＰ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＣＰ／ＣＤ４６）など、補因子タンパク質の存在を要求する（Degn et al. (2011) Am J Hum Genet 88: 689-705）。
ｉＣ３ｂは、Ｂ因子と会合することが不可能であり、このため、補体カスケードの増幅または補体第二経路を通した活性化を永続化させることができない。よって、Ｃ３ｂが、ｉＣ３ｂへと切断されると、補体第二経路の開始も、末端における、補体カスケードの活性化も、生じない。
ｉＣ３ｂは、多型核白血球（大半が好中球である）上、ＮＫ細胞上、およびマクロファージなどの単核食細胞上における、補体受容体３（ＣＲ３）（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）に結合し、これらを活性化させることにより、炎症促進性作用をもたらすことが可能である。
補体Ｉ因子は、補因子である、ＣＲ１を要求する、プロテアーゼ活性を介して、ｉＣ３ｂを、Ｃ３ｄｇへとプロセシングすることが可能である。Ｃ３ｄｇは、ＣＲ３に結合することができない。補体受容体であるＣＲ３と反応するｉＣ３ｂは、補体の活性化が、炎症をもたらす、主要な機構であるので、ｉＣ３ｂの、Ｃ３ｄｇへの分解は、補体誘導性炎症を低減するために不可欠である（Lachmann (2009) Adv. Immunol. 104: 115-149）。
Ｃ３ｂの、ｉＣ３ｂへの切断を促進し、かつ、ｉＣ３ｂの分解を加速化させる、補体Ｉ因子の固有の能力（ヒト血清中の濃度が、比較的低度であることと組み合わされるが、これは、治療有効性のために、送達が要求される量に関与する）は、補体Ｉ因子を、特に、有利な標的とする。
一部の実施形態では、補体Ｉ因子ポリペプチドは、Ｃ３ｂを、不活性の分解生成物へと切断することが可能である。例えば、補体Ｉ因子ポリペプチドは、Ｃ３ｂを、ｉＣ３ｂへと切断することが可能でありうる。
一部の実施形態では、補体Ｉ因子ポリペプチドは、ｉＣ３ｂを、不活性の分解生成物へとプロセシングすることが可能である。例えば、補体Ｉ因子ポリペプチドは、ｉＣ３ｂを、Ｃ３ｄｇへとプロセシングすることが可能でありうる。
好ましい実施形態では、補体Ｉ因子ポリペプチドは、Ｃ３ｂを、ｉＣ３ｂへと切断し、ｉＣ３ｂを、Ｃ３ｄｇへとプロセシングすることが可能である。
適切には、補体Ｉ因子の断片または変異体は、天然補体Ｉ因子の、Ｃ３ｂ不活化／ｉＣ３ｂ分解活性のうちの、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を保持しうる。
補体Ｉ因子、またはその断片もしくは誘導体によるＣ３ｂ不活化／ｉＣ３ｂ分解活性は、当業者に公知である、任意の適切な方法を使用して決定されうる。例えば、補体Ｉ因子のタンパク質分解活性の測定については、Hsiung et al. (Biochem. J. (1982) 203: 293-298)において記載されている。ＣＦＩ活性についての、溶血アッセイおよび膠着アッセイのいずれについても、Lachmann PJ & Hobart MJ (1978) “Complement Technology” in Handbook of Experimental Immunology 3rd edition Ed DM Weir Blackwells Scientific Publications Chapter 5A p17において記載されている。タンパク質分解アッセイもまた含む、より詳細な記載は、Harrison RA (1996) in “Weir’s Handbook of Experimental Immunology” 5th Edition Eds; Herzenberg Leonore A’Weir DM, Herzenberg Leonard A & Blackwell C Blackwells Scientific Publications Chapter 75 36-37により与えられている。膠着アッセイは、高感度であり、一定のＣ３ｂを、ｉＣ３ｂへと転換する、第１の（二重の）切断、およびコングルチニンとの反応性の獲得の両方の検出；一定のｉＣ３ｂで始め、コングルチニンとの反応性の喪失を探索することによる、Ｃ３ｄｇへの最終的な切断の検出のために使用されうる。溶血アッセイは、Ｃ３ｂの、ｉＣ３ｂへの転換について使用されるが、タンパク質分解アッセイは、全ての切断を検出する。
一部の実施形態では、補体Ｉ因子は、ヒト補体Ｉ因子である。
例示的なヒト補体Ｉ因子タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号：Ｐ０５１５６を有する、ヒト補体Ｉ因子タンパク質である。この例示的配列は、５８３アミノ酸の長さ（配列番号３２として開示される）であり、このうちのアミノ酸１～１８が、シグナル配列を形成する。
一部の実施形態では、補体Ｉ因子のアミノ酸配列は、配列番号３２である。他の実施形態では、補体Ｉ因子のアミノ酸配列は、配列番号３２の１９～５８３位として開示される配列である。好ましくは、変異体または断片は、配列番号３２により表されるタンパク質の機能活性を実質的に保持する。
一部の実施形態では、補体Ｉ因子のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号：ＮＰ＿０００１９５に対応する、配列番号３３である。他の実施形態では、補体Ｉ因子のアミノ酸配列は、配列番号３３の１９～５８３位として開示される配列である。
補体Ｉ因子をコードする、例示的な野生型ヌクレオチド配列は、本明細書で、配列番号３４として開示される、ＮＣＢＩ受託番号：ＮＭ＿０００２０４を有するヌクレオチド配列である。
一部の実施形態では、本発明において使用される補体Ｉ因子のヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
補体Ｉ因子をコードする、好ましいヌクレオチド配列は、配列番号３５として示されるヌクレオチド配列である。
補体Ｉ因子をコードする、さらなる例示的なコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号３６である。
一部の実施形態では、補体Ｉ因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３４、３５、または３６、好ましくは、配列番号３５に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。好ましくは、ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質は、配列番号３４、３５、または３６により表されるタンパク質の機能活性を実質的に保持する。
他の実施形態では、補体Ｉ因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３４、３５、または３６、好ましくは、配列番号３５である。
他の実施形態では、補体Ｉ因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３４、３５、または３６、好ましくは、配列番号３５の５５～１７５２位に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。好ましくは、ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質は、配列番号３２または３３により表されるタンパク質の機能活性を実質的に保持する。
他の実施形態では、補体Ｉ因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３４、３５、または３６、好ましくは、配列番号３５の５５～１７５２位である。
他の実施形態では、補体Ｉ因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３２または３３に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする。好ましくは、アミノ酸配列は、配列番号３２または３３により表されるタンパク質の機能活性を実質的に保持する。
他の実施形態では、補体Ｉ因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３２または３３のアミノ酸配列をコードする。
他の実施形態では、補体Ｉ因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３２または３３の１９～５８３位に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする。好ましくは、アミノ酸配列は、配列番号３２または３３により表されるタンパク質の機能活性を実質的に保持する。
他の実施形態では、補体Ｉ因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３２または３３の１９～５８３位のアミノ酸配列をコードする。
本発明の利点は、補体Ｉ因子が、特に、精製タンパク質の形態で調製することが困難であることである。したがって、本発明者らは、例えば、補体Ｉ因子をコードするヌクレオチド配列を含むＡＡＶベクターの形態で、補体Ｉ因子を投与することにより、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の処置を可能とするように、補体系をモジュレートする方式を考案した。ＡＡＶベクターは、ｉｎ ｓｉｔｕにおいて補体Ｉ因子ポリペプチドの翻訳を可能とするように、目的の部位、例えば、眼へと投与されうる。
補体Ｈ因子（ＣＦＨ）
補体Ｈ因子（ｆａｃｔｏｒ Ｈ；ＣＦＨ）は、補体制御タンパク質である。
補体Ｈ因子は、ヒト血漿中に、２００～３００μｇ／ｍＬの典型的濃度で存在する、大型（１５５ｋＤａ）の可溶性糖タンパク質である（Hakobyan et al. (2008) 49(5): 1983-90）。補体Ｈ因子の主要な機能は、補体系の補体第二経路を調節することである。
補体Ｈ因子は、Ｃ３ｂの補体Ｉ因子媒介切断のための補因子活性をもたらす。補体Ｈ因子はまた、Ｃ３ｂＢｂ複合体（Ｃ３転換酵素）および（Ｃ３ｂ）ＮＢＢ複合体（Ｃ５転換酵素）の解離速度も増大させ、これにより、補体第二経路の活性を低減する。
補体Ｈ因子は、短鎖リンカー（３～８アミノ酸残基の間の）により、互いへと接続された、２０の補体制御タンパク質（ＣＣＰ）モジュール（また、ショートコンセンサスリピートまたはｓｕｓｈｉドメインとも称される）から構成され、拡大型頭尾結合の形で配置されている。ＣＣＰモジュールの各々は、１－３／２－４配置でジスルフィド結合された、４つのシステイン残基と、ほぼ不変のトリプトファン残基の周囲に構築された、疎水性コアとを伴う、約６０のアミノ酸からなる。ＣＣＰモジュールは、１～２０と番号付けされる（タンパク質のＮ末端から）。ＣＣＰ １～４およびＣＣＰ １９～２０が、Ｃ３ｂとエンゲージするのに対し、ＣＣＰ７およびＣＣＰ １９～２０は、ＧＡＧおよびシアル酸に結合する（Schmidt et al. (2008) Journal of Immunology 181: 2610-2619）。
補体Ｈ因子を使用する遺伝子治療は、マウスにおける誘導性ＡＭＤ様病態を改善しうることが、示されている（Cashman et al. (2015) J. Gene Med. 17: 229-243）。マウスの網膜下に、（ｉ）ヒトＡＭＤの、多くの病理学的特徴を再現することが、既に示されている、補体成分であるＣ３を発現させるアデノウイルスベクター；および（ｉｉ）補体Ｈ因子を発現させるアデノウイルスベクターを共注射した。補体Ｈ因子ではなく、ＧＦＰを施される、対照動物と比べて、補体Ｈ因子形質導入マウスは、内皮細胞増殖の９１％の低減、およびＲＰＥ萎縮の６９％の緩和を示した。網膜電図は、補体Ｈ因子を施されるマウスにおける網膜内機能の改善を示し、ロドプシンおよびＲＰＥ６５についての免疫細胞化学は、このような動物における、光受容体およびＲＰＥのレスキューと符合した。
一部の実施形態では、補体Ｈ因子ポリペプチド、またはこれらの断片もしくは変異体は、Ｃ３ｂの、補体Ｉ因子媒介切断のための補因子として作用することが可能である。一部の実施形態では、補体Ｈ因子ポリペプチド、またはこれらの断片もしくは変異体は、Ｃ３転換酵素およびＣ５転換酵素の解離速度を増大させることが可能である。
好ましい実施形態では、補体Ｈ因子ポリペプチド、またはこれらの断片もしくは変異体は、Ｃ３ｂの、補体Ｉ因子媒介切断のための補因子として作用し、Ｃ３転換酵素およびＣ５転換酵素の解離速度を増大させることが可能である。
補体Ｈ因子、またはその断片もしくは誘導体の補因子活性および解離加速化活性は、当業者に公知である、任意の適切な方法を使用して決定されうる。例えば、補体Ｈ因子の補因子活性の測定については、Sanchez-Corral, P., et al., 2002. The American Journal of Human Genetics, 71(6), pp.1285-1295において記載されており、補体Ｈ因子の解離加速化活性の測定については、Wong, E.K., et al., 2014. Journal of the American Society of Nephrology, 25(11), pp.2425-2433において記載されている。
一部の実施形態では、補体Ｈ因子は、ヒト補体Ｈ因子である。
例示的なヒト補体Ｈ因子タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号：Ｐ０８６０３を有するヒト補体Ｈ因子タンパク質である。この例示的配列は、１２３１アミノ酸の長さ（配列番号３７として開示される）であり、このうちのアミノ酸１～１８が、シグナル配列を形成する。
一部の実施形態では、補体Ｈ因子のアミノ酸配列は、配列番号３７である。他の実施形態では、補体Ｈ因子のアミノ酸配列は、配列番号３７の１９～１２３１位である。好ましくは、変異体または断片は、配列番号３７により表されるタンパク質の機能活性を実質的に保持する。
補体Ｈ因子をコードする、例示的なヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ受託番号：ＮＭ＿０００１８６を有するヌクレオチド配列である。
一部の実施形態では、補体Ｈ因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３８である。
一部の実施形態では、補体Ｈ因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３８に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。好ましくは、ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質は、配列番号３７により表されるタンパク質の機能活性を実質的に保持する。
他の実施形態では、補体Ｈ因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３８である。
他の実施形態では、補体Ｈ因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３８の５５～３６９６位に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。好ましくは、ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質は、配列番号３７により表されるタンパク質の機能活性を実質的に保持する。
他の実施形態では、補体Ｈ因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３８の５５～３６９６位である。
他の実施形態では、補体Ｈ因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３７に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする。好ましくは、アミノ酸配列は、配列番号３７により表されるタンパク質の機能活性を実質的に保持する。
他の実施形態では、補体Ｈ因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３７のアミノ酸配列をコードする。
他の実施形態では、補体Ｈ因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３７の１９～１２３１位に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする。好ましくは、アミノ酸配列は、配列番号３７により表されるタンパク質の機能活性を実質的に保持する。
他の実施形態では、補体Ｈ因子をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３７の１９～１２３１位のアミノ酸配列をコードする。
補体ＦＨＬ１（ｆａｃｔｏｒ Ｈ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）
補体ＦＨＬ１（ｆａｃｔｏｒ Ｈ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）は、補体Ｈ因子の、最初の７つのＣＣＰに続き、４アミノ酸のカルボキシ末端テールを含有する、補体Ｈ因子のスプライス変異体である（Clark, S.J. et al. (2015) J Clin Med 4: 18-31）。ＦＨＬ１の調節活性は、補体Ｈ因子と同等であることが示されている（Mannes, M., et al., 2020. Frontiers in Immunology, 11; 596415）。
一部の実施形態では、ＦＨＬ１ポリペプチド、またはこれらの断片もしくは変異体は、Ｃ３ｂの、補体Ｉ因子媒介切断のための補因子として作用することが可能である。一部の実施形態では、ＦＨＬ１ポリペプチド、またはこれらの断片もしくは変異体は、Ｃ３転換酵素およびＣ５転換酵素の解離速度を増大させることが可能である。
好ましい実施形態では、ＦＨＬ１ポリペプチド、またはこれらの断片もしくは変異体は、Ｃ３ｂの、補体Ｉ因子媒介切断のための補因子として作用し、Ｃ３転換酵素およびＣ５転換酵素の解離速度を増大させることが可能である。
ＦＨＬ１ポリペプチド、またはその断片もしくは誘導体の補因子活性および解離加速化活性は、当業者に公知である、任意の適切な方法を使用して決定されうる。例えば、補体Ｈ因子について上記で記載されたアッセイ、またはMannes, M., et al., 2020. Frontiers in Immunology, 11; 596415において記載されている任意のアッセイである。
一部の実施形態では、ＦＨＬ１は、ヒトＦＨＬ１である。
一部の実施形態では、ＦＨＬ１のアミノ酸配列は、配列番号３９である。好ましくは、変異体または断片は、配列番号３９により表されるタンパク質の機能活性を実質的に保持する。適切には、ＦＨＬ１の断片または変異体は、配列番号３９により表されるタンパク質の、補因子活性および／または解離加速化活性のうちの、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を保持しうる。
ＦＨＬ１をコードする、例示的なヌクレオチド配列は、
である。
本発明において使用されるＦＨＬ１のヌクレオチド配列は、好ましくは、コドン最適化されている。
ＦＨＬ１をコードする、好ましいヌクレオチド配列は、配列番号４１である。
一部の実施形態では、ＦＨＬ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４０または４１、好ましくは、配列番号４１に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。好ましくは、ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質は、配列番号３９により表されるタンパク質の機能活性を実質的に保持する。
他の実施形態では、ＦＨＬ１をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４０または４１、好ましくは、配列番号４１である。
補体受容体１（ＣＲ１）
補体受容体１（ＣＲ１）は、補体を活性化させた粒子および免疫複合体への、細胞の結合を媒介する。
一部の実施形態では、ＣＲ１は、ヒトＣＲ１である。
一部の実施形態では、ＣＲ１のアミノ酸配列は、配列番号４２である。好ましくは、変異体または断片は、配列番号４２により表されるタンパク質の機能活性を実質的に保持する。
ＭＣＰ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）
ＭＣＰは、ＣＦＩに対する補因子として作用する。
一部の実施形態では、ＭＣＰは、ヒトＭＣＰである。
一部の実施形態では、ＭＣＰのアミノ酸配列は、配列番号４３、またはこれらの変異体もしくは断片である。好ましくは、変異体または断片は、配列番号４３により表されるタンパク質の機能活性を実質的に保持する。
リンカー
好ましい実施形態では、抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列は、負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列の上流にある。他の実施形態では、負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列は、抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列の上流にある。
本明細書で使用される、「上流」および「下流」は、いずれも、ＤＮＡ内またはＲＮＡ内の相対位置を指す。ＤＮＡまたはＲＮＡの各鎖は、５’末端および３’末端を有し、慣例により、「上流」および「下流」は、それぞれ、ＲＮＡの転写が生じる、５’－３’方向に関する。例えば、二本鎖ＤＮＡについて検討する場合、「上流」とは、コード鎖の５’末端方向であり、「下流」とは、コード鎖の３’末端方向である。
一部の実施形態では、抗ＶＥＧＦ実体と、負の補体調節因子とをコードするヌクレオチド配列は、リンカーにより、作動可能に連結される。一部の実施形態では、リンカーは、フーリン切断部位配列、ＧＳＧ配列、１１ａ１Ｄ配列、およびＦ２Ａ配列を含むか、またはこれらにより規定される配列などの自己切断２Ａペプチド配列を含む。
一部の実施形態では、リンカーは、配列番号４４である。
ＣＧＡＡＧＧＡＡＡＣＧＡＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＡＧＣＣＡＧＡＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＧＣＡＣＣＧＧＴＧＡＡＡＣＡＧＡＣＴＴＴＧＡＡＴＴＴＴＧＡＣＣＴＴＣＴＣＡＡＧＴＴＧＧＣＧＧＧＡＧＡＣＧＴＣＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＴＧＧＧＣＣＣ
（配列番号４４）
他の実施形態では、リンカーは、配列番号４４に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。好ましくは、リンカーは、配列番号４４の機能活性を実質的に保持する。
「作動可能に連結された」とは、個々の成分が、それらが、それらの機能を、実質的に妨げられずに果たすことを可能とする方式で、一体に連結されていると理解されるものとする。
生成物
本発明の生成物は、例えば、（ｉ）抗ＶＥＧＦ実体と；（ｉｉ）負の補体調節因子、またはこれをコードするヌクレオチド配列とを、混合物中に含む、組成物（例えば、医薬組成物）でありうる。代替的に、生成物は、例えば、（ｉ）抗ＶＥＧＦ実体；および（ｉｉ）負の補体調節因子、またはこれをコードするヌクレオチド配列の調製物と、任意選択で、それを必要とする対象への、調製物の、同時的投与、逐次的投与、または個別投与のための指示書とを含むキットでありうる。
タンパク質導入
ポリヌクレオチドの、細胞への送達に対する代替法として、本発明の生成物および薬剤は、タンパク質導入により、細胞へと送達されうる。
タンパク質導入は、ベクターの送達を介する導入でありうる（Cai, Y. et al. (2014) Elife 3: e01911; Maetzig, T. et al. (2012) Curr. Gene Ther. 12: 389-409）。ベクターの送達は、細胞へと送達されるタンパク質を組み入れるような、ウイルス粒子（例えば、レンチウイルス粒子）の操作を伴う。したがって、操作ウイルス粒子が、細胞に、それらの天然生活環の一部として侵入する場合、粒子内に組み入れられたタンパク質は、細胞へと運ばれる。
タンパク質導入は、タンパク質の送達を介する導入でありうる（Gaj, T. et al. (2012) Nat. Methods 9: 805-7）。タンパク質送達は、例えば、媒体（例えば、リポソーム）を活用することにより達成される場合もあり、なおまたはタンパク質自体を、細胞へと、直接投与することにより達成される場合もある。
ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくは、ＤＮＡを含みうる。本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もある。当業者により、多数の異なるポリヌクレオチドは、遺伝子コードの縮重の結果として、同じポリペプチドをコードしうることが理解されるであろう。加えて、当業者は、常套的技法を使用して、本発明のポリペプチドが発現される、任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映する、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる、ポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を施しうることが理解されるものとする。
本明細書で開示される、本発明のヌクレオチド配列は、例えば、バイシストロニックベクター内の、それらの位置に応じて、それらの３’末端において、終止コドンを含む場合もあり、これを欠く場合もある。したがって、本開示は、本明細書で開示される配列番号に、終止コドンが存在する配列番号、または終止コドンが存在しない配列番号を包含する。
ポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能な、任意の方法により修飾されうる。このような修飾は、本発明のポリヌクレオチドの、ｉｎ ｖｉｖｏ活性または寿命を増強するために実行されうる。
ＤＮＡポリヌクレオチドなど、ポリヌクレオチドは、組換えにより作出される場合もあり、合成により作出される場合もあり、当業者に利用可能な、任意の手段により作出される場合もある。ポリヌクレオチドはまた、標準法によりクローニングされる場合もある。
長鎖のポリヌクレオチドは、一般に、組換え手段を使用して、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるクローニング法を使用して作製されるであろう。これは、クローニングすることが所望される標的配列を挟むプライマー（例えば、約１５～３０ヌクレオチドである）対を作製するステップと、プライマーを、動物細胞またはヒト細胞から得られた、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させるステップと、所望の領域の増幅をもたらす条件下で、ポリメラーゼ連鎖反応を実施するステップと、増幅された断片を単離するステップ（例えば、アガロースゲルにより、反応混合物を精製することにより）と、増幅されたＤＮＡを回収するステップとを伴うであろう。プライマーは、増幅されたＤＮＡが、適切なベクターへとクローニングされうるように、適切な制限酵素認識部位を含有するようデザインされうる。
ポリヌクレオチドは、プラスミドトランスフェクションまたは電気穿孔により、例えば、ネイキッドＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体、ミニサークル技術など、非ウイルスベクターとして、細胞へと送達されうる。これらの実体はまた、ＡＡＶベクターより大型のトランス遺伝子もパッケージングしうるが、安定性、バイオアベイラビリティー、および標的特異性が低下する点で、わずかに劣る場合がある。例えば、Ｅｙｅｖｅｎｓｙｓは、治療用トランス遺伝子を、筋肉／眼などへと送達するために、ネイキッドＤＮＡによる電気穿孔プラットフォームを使用する。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４５のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはこれらからなる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４６のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはこれらからなる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４７のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはこれらからなる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４８のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはこれらからなる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４９のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはこれらからなる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５０のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはこれらからなる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５１のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはこれらからなる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５２のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはこれらからなる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５３のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはこれらからなる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５４のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、またはこれらからなる。
眼の構造
本明細書で開示される医薬は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）などの眼疾患の処置または防止との関係で、哺乳動物の眼、好ましくは、ヒトの眼へと送達されうる。
眼疾患の処置の技術分野における当業者は、眼の構造について、詳細かつ完全な理解を有するであろう。しかし、本発明に、特に関連する以下の構造について記載される。
網膜
網膜とは、後眼房の内面を裏打ちし、視神経を介して、脳へと伝達される、視覚世界の映像を感知する、多層組織である。眼の内部から、外部への順に、網膜は、網膜神経感覚上皮および網膜色素上皮による層を含み、脈絡膜は、網膜色素上皮に対して、遠位にある。
網膜神経感覚上皮および光受容体細胞
網膜神経感覚上皮は、光を、直接的に感知する、光受容体細胞を有する。網膜神経感覚上皮は、以下の層：内境界膜（ＩＬＭ）；神経線維層；神経節細胞層；内網状層；内核層；外網状層；外核層（光受容体核）；外境界膜（ＥＬＭ）；ならびに桿状体および錐体の内節および外節を含む。
当業者は、光受容体細胞についての、詳細な理解を有するであろう。略述すると、光受容体細胞は、光を、生物学的シグナルへと変換する、網膜内に配置された、特化ニューロンである。光受容体細胞は、網膜にわたり、異なる形で分配された、桿状体細胞および錐体細胞を含む。
桿状体細胞は、主に、網膜の周縁部分にわたり分布する。桿状体細胞は、高感度であり、光レベルが低レベルである場合の視覚をもたらす。正常ヒト網膜には、平均約１億２，５００万個の桿状体細胞が存在する。
錐体細胞は、網膜にわたり見出されるが、特に、高分解能の中心視を担う、網膜神経感覚上皮内の凹部である中心窩に高度に濃縮されて見出される。錐体細胞は、桿状体細胞より低感度であり、色覚を担う。正常ヒト網膜には、平均約６～７００万個の錐体細胞が存在する。
網膜色素上皮
網膜色素上皮（ＲＰＥ）とは、網膜神経感覚上皮のすぐ外部に、光受容体外節に隣接して配置された細胞による色素性層である。ＲＰＥは、網膜神経感覚上皮を、脈絡膜血管系から隔て、光受容体外節からの、視覚色素のリサイクリングなどの機能を有する。ＲＰＥは、栄養物および他の物質の、光受容体細胞への輸送、および視覚を改善する、散乱光の吸収を含む、多数の機能を果たす。
脈絡膜
脈絡膜とは、眼の、ＲＰＥと、外側の強膜との間に位置する血管層である。脈絡膜の血管系は、酸素および栄養物の、網膜への供給を可能とする。
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の臨床的進行は、黄斑の変化に従う病期において特徴付けられる。早期ＡＭＤの特徴は、網膜の下方における、細胞外破砕物の蓄積であり、臨床検査時および眼底写真において、網膜内の、黄色の斑点として現れる、ドルーゼンの出現である。ドルーゼンは、サイズにより、小型（＜６３μｍ）、中型（６３～１２４μｍ）、および大型（＞１２４μｍ）と類別される。ドルーゼンはまた、眼科検査時における、それらの縁辺部の外見に応じて、硬質または軟質とみなされる。硬質ドルーゼンが、明確な縁辺部を有するのに対し、軟質ドルーゼンは、それほど明確でない、流動的な縁辺部を有する。Ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ Ｅｙｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｔｕｄｙ（ＡＲＥＤＳ）眼底写真重症度スケールは、この状態について使用される、主要な分類システムのうちの１つである。
ＡＭＤは、「乾燥型」および「湿潤型」（滲出型または新生血管型）と分類されている。乾燥型ＡＭＤは、典型的に、ＲＰＥ層内、上部の光受容体細胞、および脈絡膜毛細管層内の基底細胞においてもまた高頻度である、進行性の細胞喪失により特徴付けられる。上部の光受容体の萎縮を伴う、ＲＰＥ細胞死の融合領域は、地図状萎縮（ＧＡ）と称される。この形態のＡＭＤを伴う患者は、緩徐かつ進行性の、中心視の劣化を経る。
湿潤型ＡＭＤは、突然かつ機能障害的な失明の一因をなす、出血および／またはＲＰＥおよび黄斑の下方の脈絡膜血管（脈絡毛細管枝）から増殖した、異常な血管からの流体の漏出により特徴付けられる。患者が経る失明の大半は、このような脈絡膜新血管形成（ＣＮＶ）およびその続発性合併症に起因することが推定されている。
本明細書では記載されるＡＭＤの処置または防止は、上記で記載されたＡＭＤ表現型の外見を軽減または防止しうる。好ましくは、ＡＭＤの処置は、視覚機能の維持または改善を可能とする。
一部の実施形態では、ＡＭＤの処置または防止は、地図状萎縮の形成の防止または低減を結果としてもたらす。他の実施形態では、ＡＭＤの処置または防止は、地図状萎縮の進行の緩徐化を結果としてもたらす。例えば、ＡＭＤの処置または防止は、対象の処置眼への投与後１２カ月間にわたり、同じ期間にわたる非処置眼と比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の、ＧＡ面積の増大の低減を結果としてもたらす。他の実施形態では、ＡＭＤの処置または防止は、地図状萎縮の処置、例えば、地図状萎縮の量の低減を結果としてもたらす。
一部の実施形態では、ＡＭＤの処置または防止は、ドルーゼン形成の防止または低減を結果としてもたらす。他の実施形態では、ＡＭＤの処置または防止は、既存のドルーゼンの低減、例えば、既存のドルーゼンのサイズおよび／または数の低減を結果としてもたらす。
一部の実施形態では、ＡＭＤの処置または防止は、補体沈着の防止または低減を結果としてもたらす。他の実施形態では、ＡＭＤの処置または防止は、既存の補体沈着の低減を結果としてもたらす。
一部の実施形態では、ＡＭＤの処置または防止は、視覚または視力の改善または回復を結果としてもたらす。他の実施形態では、ＡＭＤの処置または防止は、視覚または視力の喪失を軽減する。
一部の実施形態では、ＡＭＤの処置または防止は、対象における読書速度の改善または回復を結果としてもたらす。他の実施形態では、ＡＭＤの処置または防止は、対象における読書速度の低減を軽減する。
一部の実施形態では、ＡＭＤの処置または防止は、光受容体および／または網膜色素上皮（ＲＰＥ）の喪失の低減または防止を結果としてもたらす。
糖尿病網膜症
糖尿病網膜症とは、糖尿病と関連する高血糖レベルにより引き起こされる、網膜の血管への損傷により特徴付けられる状態である。非処置のまま放置されると、糖尿病網膜症は、失明を引き起こしうる。
穏和な糖尿病網膜症を伴う対象は、視覚が良好でありうるが、ある特定の種類の糖尿病網膜症、すなわち、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＯ）および増殖性糖尿病網膜症（ＰＤＲ）は、対象の視覚を脅かしうる。
糖尿病性黄斑浮腫は、眼の後方の損傷血管からの流体の漏出により特徴付けられる。漏出した流体は、黄斑内に蓄積され、これは、腫脹およびかすみ目をもたらす。これは、最終的に、中心視不良および読書または運転の不能をもたらす。周辺視は、通例、正常を維持する。
増殖性糖尿病網膜症は、網膜表面における、異常で脆弱な血管の増殖をもたらす、網膜血管の閉止により特徴付けられる。これは、眼への出血、瘢痕化、および網膜剥離に起因する、恒久的失明を結果としてもたらしうる。非増殖性網膜症は、糖尿病網膜症の初期段階であり、非処置のまま放置されると、増殖性網膜症をもたらしうる。したがって、全ての病期および型の糖尿病網膜症に対する処置が想定される。
ベクター
ベクターは、実体の、１つの環境から、別の環境への導入を可能とするか、またはこれを容易とするツールである。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター
一態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターを提供する。
好ましくは、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクター粒子の形態にある。
当技術分野では、ＡＡＶに由来するウイルスベクターおよびウイルスベクター粒子などの、ウイルスベクターおよびウイルスベクター粒子を調製および改変する方法が周知である。
ＡＡＶベクターは、ＡＡＶゲノム、またはその断片もしくは誘導体を含みうる。
本発明により提供される、（ｉ）抗ＶＥＧＦ実体と、（ｉｉ）負の補体調節因子とをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、ＡＡＶ内のパッケージングに適しうる。ＡＡＶは、５．２ｋｂ以下のサイズのゲノムのパッケージングが可能であることが公知である（Dong, J.-Y. et al. (1996) Human Gene Therapy 7: 2101-2112）。
このように、抗ＶＥＧＦ実体と、負の補体調節因子とをコードするヌクレオチド配列は、組合せが、ＡＡＶ内のパッケージングに適するように選択されうる。ある特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ実体および／または負の補体調節因子の機能的断片（本明細書で記載される機能的断片など）は、ポリヌクレオチドが、ＡＡＶ内のパッケージングに適することを確保するのに使用されうる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５．２、５．１、５．０、４．９、４．８、または４．７ｋｂ以下である。好ましい実施形態では、本ポリヌクレオチドは、４．７ｋｂ以下である。
ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ粒子の作出に必要とされる機能をコードしうる、ポリヌクレオチド配列である。これらの機能は、宿主細胞内におけるＡＡＶの複製／パッケージング周期において作動する機能であって、ＡＡＶゲノムの、ＡＡＶ粒子への封入を含む機能を含む。天然に存在するＡＡＶは、複製欠損性であり、複製／パッケージング周期の完了のための、トランスにおける、ヘルパー機能の供給に依拠する。したがって、本発明のＡＡＶベクターのＡＡＶゲノムは、典型的に、複製欠損である。
ＡＡＶゲノムは、プラスセンスまたはマイナスセンスの一本鎖形態の場合もあり、代替的に、二本鎖形態の場合もある。
ＡＡＶゲノムは、任意の天然由来の血清型に由来する場合もあり、ＡＡＶの分離株またはクレードに由来する場合もある。したがって、ＡＡＶゲノムは、天然に存在するＡＡＶの全ゲノムでありうる。当業者に公知である通り、天然に存在するＡＡＶは、多様な生体系に従い分類されうる。
一般に、ＡＡＶは、それらの血清型との関連において言及される。血清型は、そのカプシド表面抗原の発現プロファイルに起因して、顕著に異なる反応性を有し、他の亜種変異体から識別するのに使用されうる、ＡＡＶの変異体亜種に対応する。典型的に、特定のＡＡＶ血清型を有するウイルスは、他の任意のＡＡＶ血清型に特異的な中和抗体とは、効率的に交差反応しない。
ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、およびＡＡＶ１１を含み、また、近年、霊長動物脳から同定された、Ｒｅｃ２およびＲｅｃ３などの組換え血清型も含む。本発明では、これらのＡＡＶ血清型のうちのいずれもが使用されうる。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクター粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｅｃ２、Ｒｅｃ３、Ｒｈ１０、ＤＪ、またはＡｎｃ６５ＡＡＶのベクター粒子である。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクター粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶ１１のカプシドを含みうる。
一部の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、またはＡＡＶ８の血清型でありうる。
一部の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ２またはＡＡＶ８の血清型でありうる。
一部の実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ２血清型でありうる。他の好ましい実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ８血清型でありうる。
カプシドタンパク質は、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２００８／１２４７２４号パンフレットにおいて開示されている突然変異体カプシドタンパク質などの、突然変異体カプシドタンパク質でありうる。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、Ｙ７３３Ｆ突然変異を伴う、ＡＡＶ８カプシドを含む。
ＡＡＶ血清型についての総説は、Choi et al. (2005) Curr. Gene Ther. 5: 299-310およびWu et al. (2006) Molecular Therapy 14: 316-27において見出されうる。本発明における使用のための、ＩＴＲ配列、ｒｅｐ遺伝子、またはｃａｐ遺伝子を含む、ＡＡＶゲノムの配列、またはＡＡＶゲノムのエレメントは、ＡＡＶの全ゲノム配列についての、以下の受託番号：１型アデノ随伴ウイルスである、ＮＣ＿００２０７７、ＡＦ０６３４９７；２型アデノ随伴ウイルスである、ＮＣ＿００１４０１；３型アデノ随伴ウイルスである、ＮＣ＿００１７２９；３Ｂ型アデノ随伴ウイルスである、ＮＣ＿００１８６３；４型アデノ随伴ウイルスである、ＮＣ＿００１８２９；５型アデノ随伴ウイルスである、Ｙ１８０６５、ＡＦ０８５７１６；６型アデノ随伴ウイルスである、ＮＣ＿００１８６２；トリＡＡＶ ＡＴＣＣ ＶＲ－８６５である、ＡＹ１８６１９８、ＡＹ６２９５８３、ＮＣ＿００４８２８；トリＡＡＶ株ＤＡ－１である、ＮＣ＿００６２６３、ＡＹ６２９５８３；ウシＡＡＶである、ＮＣ＿００５８８９、ＡＹ３８８６１７に由来しうる。
ＡＡＶはまた、クレードまたはクローンとの関連においても言及されうる。これは、天然由来ＡＡＶの系統発生関係を指し、典型的に、共通の祖先への遡及が可能であり、それらの全ての子孫を含む、ＡＡＶの系統発生群を指す。加えて、ＡＡＶは、特異的分離株、すなわち、天然で見出される、特異的ＡＡＶの遺伝的分離株との関連においても言及されうる。遺伝的分離株という用語は、他の天然に存在するＡＡＶとの、限定的な遺伝的混合を経ており、このため、遺伝子レベルで、顕著に異なる集団を、認識可能な形で規定する、ＡＡＶ集団について記載する。
当業者は、共通の一般的知見に基づき、本発明における使用のための、ＡＡＶの、適切な血清型、クレード、クローン、または分離株を選択しうる。例えば、ＡＡＶ５カプシドは、遺伝性色覚欠損の矯正の成功により証拠立てられている通り、霊長動物錐体の光受容体へと、効率的に形質導入されることが示されている（Mancuso et al. (2009) Nature 461: 784-7）。
ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ感染（または指向性）の組織特異性を決定する。したがって、本発明に従う患者へと投与されるＡＡＶにおける使用のために好ましいＡＡＶ血清型は、眼内の標的細胞に対する、天然の指向性、または感染効率の高さを有するＡＡＶ血清型である。一部の実施形態では、本発明における使用のためのＡＡＶ血清型は、網膜神経感覚上皮、網膜色素上皮、および／または脈絡膜の細胞へと形質導入されるＡＡＶ血清型である。
典型的に、天然由来のＡＡＶの血清型、分離株、またはクレードのＡＡＶゲノムは、少なくとも１つのＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）を含む。ＩＴＲ配列は、シスにおいて作用して、機能的な複製起点をもたらし、細胞のゲノムへのベクターの組込み、および細胞のゲノムからのベクターの切出しを可能とする。好ましい実施形態では、１つまたは複数のＩＴＲ配列は、抗ＶＥＧＦ実体と、負の補体調節因子とをコードするヌクレオチド配列を挟む。ＡＡＶゲノムはまた、典型的に、ＡＡＶ粒子のためのパッケージング機能をコードする、ｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子などのパッケージング遺伝子も含む。ｒｅｐ遺伝子は、タンパク質である、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０、またはこれらの変異体のうちの１つまたは複数をコードする。ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、またはこれらの変異体など、１つまたは複数のカプシドタンパク質をコードする。これらのタンパク質は、ＡＡＶ粒子のカプシドを構成する。カプシド変異体については、下記で論じられる。
プロモーターは、パッケージング遺伝子の各々に作動可能に連結されるであろう。このようなプロモーターの具体例は、プロモーターである、ｐ５、ｐ１９、およびｐ４０を含む（Laughlin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5567-5571）。例えば、プロモーターである、ｐ５およびｐ１９が、一般に、ｒｅｐ遺伝子を発現させるのに使用されるのに対し、ｐ４０プロモーターは、一般に、ｃａｐ遺伝子を発現させるのに使用される。
上記において論じられた通り、したがって、本発明のＡＡＶベクターで使用されるＡＡＶゲノムは、天然に存在するＡＡＶの全ゲノムでありうる。例えば、それらの間において、全ＡＡＶゲノムを含むベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＡＡＶベクターまたはベクター粒子を調製するのに使用されうる。しかし、このようなベクターが、原理的には、患者へと投与されうるのに対し、これが実際になされることは稀である。ＡＡＶゲノムは、患者への投与を目的として、誘導体化されることが好ましいであろう。当技術分野では、このような誘導体化が標準的であり、本発明は、ＡＡＶゲノムの、任意の公知の誘導体、および当技術分野で公知の技法を適用することにより作出されうる誘導体の使用を包含する。ＡＡＶゲノムおよびＡＡＶカプシドの誘導体化については、Coura and Nardi (2007) Virology Journal 4: 99、ならびに上記で参照されたChoi et al.およびWu et al.において総説されている。
ＡＡＶゲノムの誘導体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、本発明のＡＡＶベクターからの、トランス遺伝子の発現を可能とする、ＡＡＶゲノムの、任意の切断形態または改変形態を含む。典型的に、最小限のウイルス配列を含む一方で、上記機能を保持するように、ＡＡＶゲノムを、有意味に切断することが可能である。これは、野生型ウイルスによるベクター組換えの危険性を低減し、また、標的細胞内の、ウイルス遺伝子タンパク質の存在により、細胞性免疫応答の誘発も回避する、安全性の理由で好ましい。
典型的に、誘導体は、少なくとも１つのＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）、好ましくは、２つまたはこれを超えるＩＴＲなど、１つを超えるＩＴＲを含むであろう。ＩＴＲのうちの１つまたは複数は、異なる血清型を有するＡＡＶゲノムに由来する場合もあり、キメラＩＴＲまたは突然変異体ＩＴＲの場合もある。好ましい突然変異体ＩＴＲは、ｔｒｓ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）の欠失を有する、突然変異体ＩＴＲである。この欠失は、コード配列および相補性配列の両方、すなわち、自己相補性ＡＡＶゲノムを含有する一本鎖ゲノムを作出する、ゲノムの持続的複製を可能とする。これは、標的細胞内のＤＮＡ複製の迂回を可能とし、このため、トランス遺伝子発現の加速化を可能とする。
１つまたは複数のＩＴＲは、両端において、抗ＶＥＧＦ実体と、負の補体調節因子とをコードするヌクレオチド配列を挟むことが好ましいであろう。１つまたは複数のＩＴＲの組入れは、例えば、宿主細胞のＤＮＡポリメラーゼの作用による、一本鎖ベクターＤＮＡの、二本鎖ＤＮＡへの転換の後に、宿主細胞の核内における、本発明のベクターのコンカタマー形成を支援することが好ましい。このようなエピソームコンカタマーの形成は、宿主細胞の寿命中に、ベクター構築物を保護し、これにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、トランス遺伝子の発現の長期化を可能とする。
好ましい実施形態では、ＩＴＲエレメントは、誘導体内で、天然のＡＡＶゲノムから保持された、唯一の配列であろう。したがって、誘導体は、天然ゲノムのｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子、ならびに天然ゲノムの他の任意の配列を含まないことが好ましいであろう。これは、上記で記載された理由で好ましいが、また、ベクターの、宿主細胞ゲノムへの組込みの可能性を低減するためにも好ましい。加えて、ＡＡＶゲノムのサイズの低減は、ベクター内に、トランス遺伝子に加えて、他の配列エレメント（調節エレメントなど）も組み込む、柔軟性の増大を可能とする。
したがって、本発明の誘導体では、以下の部分：複製（ｒｅｐ）遺伝子およびカプシド（ｃａｐ）遺伝子は、除去されうるであろう。しかし、一部の実施形態では、誘導体は、加えて、ＡＡＶゲノムのうちの、１つもしくは複数のｒｅｐ遺伝子および／もしくはｃａｐ遺伝子、または他のウイルス配列を含みうる。天然に存在するＡＡＶは、高頻度で、ヒト第１９染色体上の特異的部位に組み込まれ、ベクターにおける組込み能の保持が、治療状況下において、忍容可能でありうるように、無視できる頻度のランダム組込みを示す。
誘導体が、カプシドタンパク質、すなわち、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３を含む場合、誘導体は、１つまたは複数の天然に存在するＡＡＶの、キメラ誘導体、シャッフル誘導体、またはカプシド修飾誘導体でありうる。特に、本発明は、同じベクター内における、ＡＡＶの、異なる血清型、クレード、クローン、または分離株に由来するカプシドタンパク質配列の施与（すなわち、偽型ベクター）を包含する。
キメラ誘導体、シャッフル誘導体、またはカプシド修飾誘導体は、典型的に、ＡＡＶベクターのために、１つまたは複数の所望の機能性をもたらすように選択されるであろう。したがって、これらの誘導体は、ＡＡＶ２またはＡＡＶ８のＡＡＶゲノムなど、天然に存在するＡＡＶゲノムを含むＡＡＶベクターと比較した、遺伝子送達効率の増大、免疫原性（体液性または細胞性）の低下、指向性範囲の変更、および／または特定の細胞型のターゲティングの改善を提示しうる。遺伝子送達効率の増大は、細胞表面における、受容体または共受容体への結合の改善、内部化の改善、細胞内および核へのトラフィッキングの改善、ウイルス粒子の脱穀の改善、ならびに一本鎖ゲノムの、二本鎖形態への転換の改善によりもたらされうる。効率の増大はまた、ベクター用量が、それが必要とされない組織への投与により希釈されないように、特異的細胞集団の指向性範囲またはターゲティングの変更にも関しうる。
キメラカプシドタンパク質は、天然に存在するＡＡＶ血清型の、２つまたはこれを超えるカプシドコード配列の間の組換えにより作出される、キメラカプシドタンパク質を含む。これは、例えば、１つの血清型の非感染性カプシド配列が、異なる血清型のカプシド配列と共に共トランスフェクトされ、指向性選択が、所望の特性を有するカプシド配列を選択するのに使用される、マーカーレスキュー法により実施されうる。異なる血清型のカプシド配列は、新規のキメラカプシドタンパク質を作製するように、細胞内の相同組換えにより変更されうる。
キメラカプシドタンパク質はまた、特異的カプシドタンパク質ドメイン、表面ループ、または特異的アミノ酸残基を、２つまたはこれを超えるカプシドタンパク質の間に、例えば、異なる血清型の、２つまたはこれを超えるカプシドタンパク質の間に導入する、カプシドタンパク質配列の操作により作出される、キメラカプシドタンパク質も含む。
シャッフルカプシドタンパク質またはキメラカプシドタンパク質はまた、ＤＮＡシャッフリングまたはエラープローンＰＣＲによっても作出されうる。ハイブリッドＡＡＶカプシド遺伝子は、類縁ＡＡＶ遺伝子の配列、例えば、複数の異なる血清型のカプシドタンパク質をコードする配列を、ランダムに断片化させ、次いで、その後、また、配列相同性領域内の交差も引き起こしうる、自己プライミングポリメラーゼ反応において、断片をリアセンブルすることにより創出されうる。この方式で、いくつかの血清型のカプシド遺伝子をシャッフリングすることにより創出される、ハイブリッドＡＡＶ遺伝子のライブラリーは、所望の機能性を有するウイルスクローンを同定するようにスクリーニングされうる。同様に、ＡＡＶカプシド遺伝子を、ランダムに突然変異させて、変異体の、多様なライブラリーを創出するのに、エラープローンＰＣＲが使用され、次いで、所望の特性について選択される場合もある。
また、天然の野生型配列に照らして、特異的欠失、置換、または挿入を導入するように、カプシド遺伝子の配列が遺伝子改変される場合もある。特に、カプシド遺伝子は、カプシドコード配列のオープンリーディングフレーム内、またはカプシドコード配列のＮ末端および／もしくはＣ末端における、非類縁タンパク質または非類縁ペプチドの配列の挿入により改変されうる。これは、例えば、特異的細胞受容体への指向性を付与するか、またはこれを変化させるようになされうる。
非類縁タンパク質または非類縁ペプチドは、特定の細胞型に対するリガンドとして作用し、これにより、標的細胞への結合の改善を付与するか、またはベクターの、特定の細胞集団へのターゲティングの特異性を改善するタンパク質またはペプチドであると有利でありうる。例は、網膜色素上皮への取込みを遮断し、これにより、周囲の網膜内組織への形質導入を増強する、ＲＧＤペプチドの使用を含みうる（Cronin et al. (2008) ARVO Abstract: D1048）。非類縁タンパク質はまた、作出ステップの一部として、ウイルス粒子の精製を支援するタンパク質、すなわち、エピトープタグまたはアフィニティータグでもありうる。挿入部位は、典型的に、ウイルス粒子の他の機能、例えば、ウイルス粒子の内部化、トラフィッキングに干渉しないように選択されるであろう。当業者は、共通の一般的知見に基づき、挿入に適する部位を同定しうる。特定の部位については、上記で参照された、Choi et al.、Dalkara et al. (Science, Translational Medicine, 2013; 5(189))において開示されている。
本発明は、加えて、天然ＡＡＶゲノムの順序および構成と異なる順序および構成における、ＡＡＶゲノムの配列の施与を包含する。本発明はまた、１つまたは複数のＡＡＶ配列またはＡＡＶ遺伝子の、別のウイルスに由来する配列、または１つを超えるウイルスに由来する配列から構成されたキメラ遺伝子による置きかえも包含する。このようなキメラ遺伝子は、異なるウイルス種の、２つまたはこれを超える類縁ウイルスタンパク質に由来する配列から構成されうる。
本発明のＡＡＶベクターは、ＡＡＶゲノムまたはその誘導体を含むヌクレオチド配列、ならびに抗ＶＥＧＦ実体および、負の補体調節因子のトランス遺伝子、またはこれらの誘導体をコードする配列の形態を取りうる。
本発明のＡＡＶ粒子は、１つの血清型のＩＴＲを有する、ＡＡＶゲノムまたは誘導体が、異なる血清型のカプシド内にパッケージングされる、トランスカプシド化形態を含む。本発明のＡＡＶ粒子はまた、２つまたはこれを超える異なる血清型に由来する、非修飾カプシドタンパク質の混合物が、ウイルスカプシドを構成する、モザイク形態も含む。ＡＡＶ粒子はまた、カプシド表面へと吸着されたリガンドを有する化学改変形態も含む。例えば、このようなリガンドは、特定の細胞表面受容体をターゲティングするための抗体を含みうる。
したがって、例えば、本発明のＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ２ゲノムと、ＡＡＶ２カプシドタンパク質とを伴うＡＡＶ粒子（ＡＡＶ２／２）、ＡＡＶ２ゲノムと、ＡＡＶ５カプシドタンパク質とを伴うＡＡＶ粒子（ＡＡＶ２／５）、およびＡＡＶ２ゲノムと、ＡＡＶ８カプシドタンパク質とを伴うＡＡＶ粒子（ＡＡＶ２／８）のほか、ＡＡＶ２ゲノムと、１つを超える血清型のカプシドタンパク質とを伴うＡＡＶ粒子を含む。
ＡＡＶベクターは、本明細書で言及されるヌクレオチド配列の、複数（例えば、２つ、３つなど）のコピーを含みうる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のＡＡＶ ＩＴＲをさらに含む。好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つのＡＡＶ ＩＴＲをさらに含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、その５’末端におけるＡＡＶ ＩＴＲと、その３’末端におけるＡＡＶ ＩＴＲとを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲまたはＡＡＶ８ ＩＴＲである。好ましい実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲである。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５５のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を伴う、５’ＡＡＶ ＩＴＲを含む。
ＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ
配列番号５５
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’ＩＴＲの３’末端と、直に隣接する、配列番号５６のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列をさらに含む。
ＴＧＴＡＧＴＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＴＡＣＴＴＡＴＣＴＡＣＧＴＡＧＣＣＡＴＧＣＴＣＴＡＧＧＴＡＣＣ
配列番号５６
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６５のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を伴う、５’ＡＡＶ ＩＴＲを含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号５７のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を伴う、３’ＡＡＶ ＩＴＲを含む。
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧ
配列番号５７
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、３’ＩＴＲの５’末端と、直に隣接する、配列番号５８のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列をさらに含む。
ＣＴＴＣＴＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＴＣＧＡＣＴＡＧＡＧＣＡＴＧＧＣＴＡＣＧＴＡＧＡＴＡＡＧＴＡＧＣＡＴＧＧＣＧＧＧＴＴＡＡＴＣＡＴＴＡＡＣＴＡＣＡ
配列番号５８
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号６６のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を伴う、３’ＡＡＶ ＩＴＲを含む。
プロモーター配列および調節配列
本発明のポリヌクレオチドまたはベクターはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおける、抗ＶＥＧＦ実体および／または負の補体調節因子のトランス遺伝子の発現を可能とするエレメントも含みうる。これらは、発現制御配列と称されうる。したがって、ポリヌクレオチドまたはベクターは、典型的に、トランス遺伝子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、発現制御配列（例えば、プロモーター配列を含む）を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、（ａ）任意選択で、抗ＶＥＧＦ実体および／または負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列の上流にある、ＣＭＶプロモーターまたはＣＡＧプロモーター；（ｂ）任意選択で、抗ＶＥＧＦ実体および／または負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列の下流にある、ＷＰＲＥ調節エレメント；および／または（ｃ）任意選択で、抗ＶＥＧＦ実体および／または負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列の下流にある、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル、など、ポリＡシグナルをコードするヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、
（ａ）５’ＡＡＶ ＩＴＲ；
（ｂ）任意選択で、ＣＭＶプロモーターである、プロモーター；
（ｃ）負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）フーリン切断部位配列、ＧＳＧ配列、１１ａ１Ｄ配列、およびＦ２Ａ配列を含むか、またはこれにより規定されるリンカー；
（ｅ）抗ＶＥＧＦ実体、好ましくは、アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）任意選択で、ＷＰＲＥ３調節エレメントである、任意選択のＷＰＲＥ調節エレメント；
（ｇ）任意選択で、ウシ成長ホルモンポリＡシグナルである、ポリＡシグナル；および
（ｈ）３’ＡＡＶ ＩＴＲ
を含む。
負の補体調節因子が、ＣＦＩおよびＦＨＬ－１から選択されうる。
エレメント（ｃ）および（ｅ）は、互換的位置にありうる。
このように、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、
（ａ）５’ＡＡＶ ＩＴＲ；
（ｂ）任意選択で、ＣＭＶプロモーターである、プロモーター；
（ｃ）抗ＶＥＧＦ実体、好ましくは、アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）フーリン切断部位配列、ＧＳＧ配列、１１ａ１Ｄ配列、およびＦ２Ａ配列を含むか、またはこれにより規定されるリンカー；
（ｅ）負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）任意選択で、ＷＰＲＥ３調節エレメントである、任意選択のＷＰＲＥ調節エレメント；
（ｇ）任意選択で、ウシ成長ホルモンポリＡシグナルである、ポリＡシグナル；および
（ｈ）３’ＡＡＶ ＩＴＲ
を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、
（ａ）５’ＡＡＶ ＩＴＲ；
（ｂ）任意選択で、ＣＡＧプロモーターである、プロモーター；
（ｃ）負の補体調節因子、好ましくは、ＦＨＬ－１をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）フーリン切断部位配列、ＧＳＧ配列、１１ａ１Ｄ配列、およびＦ２Ａ配列を含むか、またはこれにより規定されるリンカー；
（ｅ）抗ＶＥＧＦ実体、好ましくは、アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）任意選択で、ＷＰＲＥ３調節エレメントである、任意選択の、さらなるＷＰＲＥ調節エレメント；
（ｇ）任意選択で、ウシ成長ホルモンポリＡシグナルである、ポリＡシグナル；および
（ｈ）３’ＡＡＶ ＩＴＲ
を含む。
エレメント（ｃ）および（ｅ）は、互換的位置にありうる。
このように、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、
（ａ）５’ＡＡＶ ＩＴＲ；
（ｂ）任意選択で、ＣＡＧプロモーターである、プロモーター；
（ｃ）抗ＶＥＧＦ実体、好ましくは、アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）フーリン切断部位配列、ＧＳＧ配列、１１ａ１Ｄ配列、およびＦ２Ａ配列を含むか、またはこれにより規定されるリンカー；
（ｅ）負の補体調節因子、好ましくは、ＦＨＬ－１をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）任意選択で、ＷＰＲＥ３調節エレメントである、任意選択の、さらなるＷＰＲＥ調節エレメント；
（ｇ）任意選択で、ウシ成長ホルモンポリＡシグナルである、ポリＡシグナル；および
（ｈ）３’ＡＡＶ ＩＴＲ
を含む。
ポリヌクレオチドは、５’～３’の順に、（ａ）～（ｈ）を含みうる。適切には、（ａ）は、ポリヌクレオチドの５’末端にあり、（ｈ）は、ポリヌクレオチドの３’末端にある。適切には、（ｂ）は、（ｃ）～（ｇ）の上流にある。適切には、（ｆ）は、（ｂ）～（ｅ）の下流にある。適切には、（ｇ）は、（ｂ）～（ｆ）の下流にある。適切には、（ｃ）は、（ｄ）の上流にあり、（ｅ）は、（ｄ）の下流にある。
その選択が、当業者により、たやすくなされうる、任意の適切なプロモーターが使用されうる。プロモーター配列は、構成的に活性（すなわち、任意の宿主細胞バックグラウンドにおいて、作動的）の場合もあり、代替的に、特異的宿主細胞環境だけにおいて活性であり、これにより、特定の細胞型における、ターゲティングされたトランス遺伝子の発現を可能とする場合もある（例えば、組織特異的プロモーター）。プロモーターは、別の因子、例えば、宿主細胞内に存在する因子の存在に応答する、誘導型発現を示しうる。いずれにせよ、ベクターが、治療のために投与される場合、プロモーターは、標的細胞バックグラウンドにおいて、機能的であることが好ましい。
一部の実施形態では、プロモーターは、トランス遺伝子が、網膜細胞集団内だけで発現されることを可能とするために、網膜細胞特異的発現を示すことが好ましい。したがって、プロモーターからの発現は、網膜細胞特異的でありうる、例えば、網膜神経感覚上皮および網膜色素上皮の細胞だけに制約されうる。プロモーターはまた、神経節細胞、ミュラー細胞、光受容体細胞、網膜色素上皮細胞、および／または内皮細胞における発現、特に、組織特異的発現または細胞特異的発現も可能としうる。
網膜細胞特異的でない、好ましいプロモーターは、任意選択で、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーエレメントと組み合わせた、ニワトリベータ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーターを含む。本発明における使用のための、例示的プロモーターは、ＣＡＧプロモーター、例えば、ｒＡＶＥ発現カセット（ＧｅｎｅＤｅｔｅｃｔ．ｃｏｍ）において使用されているプロモーターである。
好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、ＣＭＶプロモーターを含む。
例示的なＣＭＶプロモーター配列は、
である。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、配列番号５９に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を伴うプロモーターを含む。好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号５９により表される、プロモーターの機能活性を実質的に保持する。
他の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、配列番号６０のヌクレオチド配列を伴うプロモーターを含む。
例示的なＣＡＧプロモーター配列は、
である。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、配列番号６０に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を伴うプロモーターを含む。好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号６０により表される、プロモーターの機能活性を実質的に保持する。
他の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、配列番号６０のヌクレオチド配列を伴うプロモーターを含む。
網膜特異的遺伝子発現を誘導するヒト配列に基づくプロモーターの例は、桿状体および錐体のためのロドプシンキナーゼ（Allocca et al. (2007) J. Virol. 81: 11372-80）、錐体だけのためのＰＲ２．１（Mancuso et al. (2009) Nature 461: 784-7）、ならびに／または網膜色素上皮のための、ＲＰＥ６５（Bainbridge et al. (2008) N. Engl. J. Med. 358: 2231-9）もしくはＶＭＤ２（Esumi et al. (2004) J. Biol. Chem. 279: 19064-73）を含む。
本発明のポリヌクレオチドまたはベクターはまた、転写前に作用する場合もあり、転写後に作用する場合もある、１つまたは複数のさらなる調節配列も含みうる。調節配列は、天然のトランス遺伝子の遺伝子座の一部の場合もあり、異種調節配列の場合もある。本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、天然のトランス遺伝子転写物に由来する、５’－ＵＴＲまたは３’－ＵＴＲの部分を含みうる。
調節配列とは、トランス遺伝子の発現を容易とする、すなわち、転写物の発現を増大させるか、ｍＲＮＡの核からの移出を改善するか、またはこれらの安定性を増強するように作用する、任意の配列である。このような調節配列は、例えば、エンハンサーエレメント、転写後調節エレメント、およびポリアデニル化部位を含む。
好ましいポリアデニル化部位は、ウシ成長ホルモンポリＡ（ｂＧＨポリＡ）シグナルである。
例示的なウシ成長ホルモンポリＡ（ｂＧＨポリＡ）シグナルは、
である。
さらなる例示的なウシ成長ホルモンポリＡ（ｂＧＨポリＡ）シグナルは、
である。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、配列番号６１または６２に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を伴う、ポリアデニル化シグナルを含む。好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号６１または６２により表される、ポリアデニル化シグナルの機能活性を実質的に保持する。
他の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、配列番号６１または６２のヌクレオチド配列を伴う、ポリアデニル化シグナルを含む。
本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの文脈では、このような調節配列は、シス作用型であろう。しかし、本発明はまた、さらなる遺伝子構築物上に配置された、トランス作用型調節配列の使用も包含する。
本発明のＡＡＶベクターにおける使用のための、好ましい転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）またはその変異体である。
例示的なＷＰＲＥは、
である。
ＷＰＲＥは、所与の順序で、ガンマエレメント、アルファエレメント、およびベータエレメントを含有する、三部エレメントである。最小限のガンマエレメントおよびアルファエレメントだけを含有する、ＷＰＲＥの短縮形（ＷＰＲＥ３と称される；Choi, J.-H. et al. (2014) Molecular Brain 7: 17）もまた、本発明において使用されうる。
例示的なＷＰＲＥ３配列は、
である。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、配列番号６３または６４に対する、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を伴う、転写後調節エレメントを含む。好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号６３または６４により表される、転写後調節エレメントの機能活性を実質的に保持する。
ＷＰＲＥは、野生型ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列に由来する場合もあり、修飾ＷＰＲＥ配列に由来する場合もある。
他の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、配列番号６３または６４のヌクレオチド配列を伴う、転写後調節エレメントを含む。
本発明のポリヌクレオチドまたはベクターにおいて使用されうる、別の調節配列は、足場接合領域（ＳＡＲ）である。さらなる調節配列も、当業者によりたやすく選択されうる。
投与法
本発明の生成物、ポリヌクレオチドまたはベクターは、全身（例えば、末梢静脈内注入により）投与されうるが、局所投与または領域内投与（例えば、髄腔内注射により、ＣＮＳ系へと）されうる。好ましい実施形態では、生成物、ポリヌクレオチドまたはベクターは、眼内投与される。
「眼内」という用語は、眼の内部を指すので、眼内投与は、対象の眼の内部への投与に関する。
一部の実施形態では、生成物、ポリヌクレオチドまたはベクターは、網膜下注射、直接的な網膜内注射、脈絡膜上注射、または硝子体内注射により、対象の眼へと投与される。一部の実施形態では、前記投与は、ロボットにより実行される。
注射される医薬組成物の容量は、例えば、約１０～５００μＬ、例えば、約５０～５００、１００～５００、２００～５００、３００～５００、４００～５００、５０～２５０、１００～２５０、２００～２５０、または５０～１５０μＬでありうる。容量は、例えば、約１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００μＬでありうる。好ましくは、注射される医薬組成物の容量は、１００μＬである。
当業者は、個別の網膜下注射、直接的な網膜内注射、脈絡膜上注射、または硝子体内注射に精通しており、これらを実行することが十分に可能であろう。
好ましくは、生成物、ポリヌクレオチドまたはベクターは、網膜下注射により投与される。
一部の実施形態では、生成物、ポリヌクレオチド、ベクターまたはこれらを含む医薬組成物は、対象の生涯において、１回以下、または２回以下投与される。
網膜下注射
網膜下注射とは、網膜下腔への、すなわち、網膜神経感覚上皮の下方への注射である。網膜下注射時において、注射素材は、光受容体細胞および網膜色素上皮（ＲＰＥ）層へと方向付けられ、これらの間に、空間を創出する。
注射が、小網膜切開術を介して実行される場合、網膜剥離が創出されうる。注射素材により作出される、網膜の剥離／隆起層は、「ブレブ」と称される。
網膜下注射により創出される孔は、投与後に、注射された溶液が、大きく逆流して、硝子体腔へと戻らない程度に十分に小さくなければならない。このような逆流は、医薬が、注射される場合、医薬の効果が、標的帯域から離れるように方向付けられるため、特に問題となるであろう。好ましくは、注射は、網膜神経感覚上皮において、セルフシーリング型刺入点を創出する、すなわち、注射針が取り外されたら、孔を通して放出される注射素材が、極めて微量であるか、または実質的に存在しないように、注射針により創出された孔は、リシーリングされる。
このステップを容易とするために、専門家用の網膜下注射針が市販されている（例えば、ＤＯＲＣ ４１Ｇ Ｔｅｆｌｏｎ ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｎｅｅｄｌｅ、Ｄｕｔｃｈ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＢＶ、Ｚｕｉｄｌａｎｄ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。これらは、網膜下注射を実行するためにデザインされた注射針である。
注射時に、網膜への損傷が生じず、十分に小注射針が使用される限りにおいて、実質的に全ての注射素材は、局所的網膜剥離部位の、剥離した網膜神経感覚上皮と、ＲＰＥとの間に、局所的に滞留する（すなわち、硝子体腔へと逆流しない）。実際、ブレブの典型的存続が、短い時間枠における存続であることは、通例、注射素材の、硝子体腔への逸出が微量であることを指し示す。長時間枠では、注射素材が吸収されるにつれて、ブレブは、散逸しうる。
例えば、光干渉断層法を使用する、眼、特に、網膜の視覚化は、手術前になされうる。
注射される医薬組成物の容量は、例えば、約１０～５００μＬ、例えば、約５０～５００、１００～５００、２００～５００、３００～５００、４００～５００、５０～２５０、１００～２５０、２００～２５０、または５０～１５０μＬでありうる。容量は、例えば、約１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００μＬでありうる。好ましくは、注射される医薬組成物の容量は、１００μＬである。大容量は、網膜を引っ張る危険性を増大させる場合がある一方、小容量は、視認が困難になりうる。
２ステップ式の網膜下注射
本発明の生成物、ポリヌクレオチド、またはベクターは、第１の溶液の網膜下注射により、局所的網膜内剥離が創出される、２ステップ法を使用することにより、精度および安全性を増大させて送達されうる。第１の溶液は、生成物、ポリヌクレオチド、またはベクターを含まない。次いで、第２の網膜下注射が、生成物、ポリヌクレオチド、またはベクターを含む医薬を、第１の網膜下注射により創出されたブレブの網膜下液へと送達するのに使用される。医薬を送達する注射は、網膜を剥離させるのに使用されていないため、この第２のステップでは、特殊な容量の溶液が注射されうる。
一部の実施形態では、ベクターの網膜下注射は、
（ａ）網膜下注射により、溶液を、対象へと、網膜を少なくとも部分的に剥離させて、網膜下ブレブを形成するのに有効な量で投与するステップであって、溶液が、生成物、ポリヌクレオチド、またはベクターを含まないステップ；および
（ｂ）網膜下注射により、医薬組成物を、ステップ（ａ）により形成されたブレブへと投与するステップであって、医薬が、生成物、ポリヌクレオチド、またはベクターを含むステップ
を含む。
工程（ａ）において注射されて、網膜を少なくとも部分的に剥離させる溶液の容量は、例えば、約１０～１０００μＬ、例えば、約５０～１０００、１００～１０００、２５０～１０００、５００～１０００、１０～５００、５０～５００、１００～５００、２５０～５００μＬでありうる。容量は、例えば、約１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００μＬでありうる。
工程（ｂ）において注射される医薬組成物の容量は、例えば、約１０～５００μＬ、例えば、約５０～５００、１００～５００、２００～５００、３００～５００、４００～５００、５０～２５０、１００～２５０、２００～２５０、または５０～１５０μＬでありうる。容量は、例えば、約１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００μＬでありうる。好ましくは、工程（ｂ）において注射される医薬組成物の容量は、１００μＬである。大容量は、網膜を引っ張る危険性を増大させる場合がある一方、小容量は、視認が困難になりうる。
医薬を含まない溶液（すなわち、ステップ（ａ）の「溶液」）は、下記で記載される、医薬を含む溶液と同様に製剤化されうる。好ましい、医薬を含まない溶液は、網膜下腔のｐＨおよび浸透圧へとマッチさせた平衡化生理食塩液（ＢＳＳ）または同様緩衝液である。
手術時における、網膜の視覚化
ある特定の状況下において、例えば、末期網膜変性時において、網膜は、それが上に載る、破壊され、色素性である上皮に対して、薄く、透明であり、見ることが困難であるため、網膜を同定することは、困難である。青色生体染色色素（例えば、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｐｅｅｌ（登録商標）、Ｇｅｕｄｅｒ；ＭｅｍｂｒａｎｅＢｌｕｅ－Ｄｕａｌ（登録商標）、Ｄｏｒｃ）の使用は、医薬が、逆流して、硝子体腔へと戻る危険性を伴わず、網膜孔を通して投与されうるように、網膜剥離手順（すなわち、本発明の２ステップ式網膜下注射法における、ステップ（ａ））のために施された、網膜孔の同定を容易としうる。
内境界膜または網膜上膜の構造のうちのいずれかを通した注射は、網膜下腔への円滑なアクセスを妨げるので、青色生体染色色素の使用はまた、内境界膜または網膜上膜の肥厚がみられる、網膜の任意の領域も同定する。さらに、手術直後期における、これらの構造の収縮は、網膜刺入孔の伸長をもたらす場合があり、これは、医薬の、硝子体腔への逆流をもたらしうる。
脈絡膜上注射
本発明の生成物、ポリヌクレオチド、またはベクターは、マイクロカテーテルを活用する流出路再建術を使用して、脈絡膜上腔へと送達されうる（例えば、Peden et al. (2011) PLoS One 6(2): e17140を参照されたい）。この方法では、角結膜間角膜周囲切開術を実行して、強膜露出をもたらすのに続き、強膜切開術を実行して、脈絡膜露出をもたらす。マイクロカテーテル（任意選択で、ｉＬｕｍｉｎ ｌａｓｅｒ－ｄｉｏｄｅ ｂａｓｅｄ ｍｉｃｒｏ－ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ｉＳｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ）などの照射システムへと接続された、ｉＳｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎａｌ製のｉＴｒａｃｋ ２５０Ａなど）を、脈絡膜上腔へと導入し、その後、視神経円板へと進入させる。所望の位置への、マイクロカテーテルの先端部の操作の後、生成物、ポリヌクレオチド、またはベクターの注射は、網膜／脈絡膜内に、ブレブを形成する。
したがって、一部の実施形態では、生成物、ポリヌクレオチド、またはベクターは、（ｉ）マイクロカテーテルの、脈絡膜上腔への導入ステップ；（ｉｉ）前記脈絡膜上腔内のマイクロカテーテルを、先端部が、網膜の罹患領域の近傍に達するまで進入させるステップ；および（ｉｉｉ）生成物、ポリヌクレオチド、またはベクターを、マイクロカテーテルの先端部へと注入して、ブレブを創出するステップを含む方法により、脈絡膜上に送達される。
一部の実施形態では、上記の投与手順は、ロボットにより、直接実行される。
医薬組成物および注射溶液
医薬、例えば、本発明の生成物、ポリヌクレオチド、またはベクターは、医薬組成物へと製剤化されうる。これらの組成物は、医薬に加えて、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、緩衝液、安定化剤、または当技術分野では周知の他の材料を含みうる。このような材料は、非毒性であるものとし、有効成分の有効性に干渉しないものとする。担体または他の材料の、正確な性格は、投与経路、例えば、網膜下注射、直接的な網膜内注射、脈絡膜上注射、または硝子体内注射に従い、当業者により決定されうる。
医薬組成物は、典型的に、液体形態である。液体の医薬組成物は、一般に、水、石油、動物または植物油、鉱物油または合成油などの液体担体を含む。生理食塩液、塩化マグネシウム、デキストロースもしくは他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなどのグリコールが組み入れられうる。場合によって、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＰＦ６８）０．００１％などの界面活性剤も使用されうる。
罹患部位における注射のために、有効成分は、発熱物質非含有であり、適切なｐＨ、等張性、および安定性を有する水溶液の形態でありうる。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、または乳酸加リンゲル注射液などの等張性媒体を使用して、適切な溶液を調製することが、十分に可能である。要求に応じて、保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤、および／または他の添加剤も組み入れられうる。
遅延放出のために、医薬は、生体適合性ポリマーから形成されたマイクロカプセル、または当技術分野で公知の方法に従うリポソーム担体システムなど、徐放のために製剤化された医薬組成物中に組み入れられうる。
処置法
本発明の文脈では、防止に対する言及は、より一般に、予防的処置と関連するが、本明細書における、全ての処置に対する言及は、治癒的処置、緩和的処置、および予防的処置を含むことが理解されるものとする。処置はまた、疾患の重症度の進行を停止させることも含みうる。
哺乳動物、特に、ヒトの処置が好ましい。しかし、ヒト処置および獣医科処置のいずれもが、本発明の範囲内にある。
本明細書で使用される、「組合せ」という用語、または「組み合わせて」、「～と組み合わせて使用された」、もしくは「組合せ調製物」という用語は、２つまたはこれを超える薬剤の、同時、逐次的、または個別の組合せ投与を指す場合がある。
本明細書で使用される、「同時的」という用語は、薬剤が、共時的に、すなわち、同時に投与されることを意味する。
本明細書で使用される、「逐次的」という用語は、薬剤が、順次投与されることを意味する。
本明細書で使用される、「個別的」という用語は、薬剤が、互いから独立であるが、薬剤が、組合せ効果、好ましくは、相乗的効果を示すことを可能とする時間間隔内に投与されることを意味する。したがって、「個別」投与は、一方の薬剤が、例えば、他方の薬剤の投与後、１分間、５分間、または１０分間以内に投与されることを許容しうる。
変異体、誘導体、類似体、相同体、および断片
本明細書で言及される、特異的なタンパク質およびヌクレオチドに加えて、本発明はまた、それらの変異体、誘導体、類似体、相同体、および断片の使用も包含する。
本発明の文脈では、任意の所与の配列の変異体は、残基（アミノ酸残基であれ、核酸残基であれ）の特異的配列が、問題のポリペプチドまたはポリヌクレオチドが、その機能を実質的に保持するような形で修飾されている配列である。変異体配列は、天然に存在するタンパク質内に存在する、少なくとも１つの残基の、付加、欠失、置換、修飾、置きかえ、および／または変異により得られうる。
本明細書において、本発明のタンパク質またはポリペプチドとの関係で使用される、「誘導体」という用語は、結果として得られるタンパク質またはポリペプチドがその内因性機能のうちの少なくとも１つを実質的に保持することを条件として、配列からの、または配列への、１つ（以上）のアミノ酸残基の、任意の置換、変異、修飾、置きかえ、欠失、および／または付加を含む。
本明細書において、本発明のタンパク質またはポリペプチドとの関係で使用される、「類似体」という用語は、任意の模倣体、すなわち、それが模倣する、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの、内因性機能のうちの少なくとも１つを有する化合物を含む。
典型的に、修飾配列が、要求される活性または能力を実質的に保持することを条件として、アミノ酸置換、例えば、１つ、２つ、または３つ～１０、または２０の置換がなされうる。アミノ酸置換は、天然に存在しない類似体の使用を含みうる。
本発明で使用されるタンパク質はまた、サイレント変化をもたらし、機能的に同等のタンパク質を結果としてもたらす、アミノ酸残基の、欠失、挿入、または置換も有しうる。意図的アミノ酸置換は、内因性機能が、保持される限りにおいて、残基の、極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性における類似性に基づきなされうる。例えば、負帯電アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含み；正帯電アミノ酸は、リシンおよびアルギニンを含み；親水性値が同様である、非帯電極性ヘッド基を伴うアミノ酸は、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、およびチロシンを含む。
保存的置換は、例えば、下記の表に従いなされうる。第２のカラムの同じブロック内のアミノ酸、好ましくは、第３のカラム内の同じ行中のアミノ酸は、互いに置換されうる。
本明細書で使用される、「相同体」という用語は、野生型アミノ酸配列および野生型ヌクレオチド配列との、ある特定の相同性を有する実体を意味する。「相同性」という用語は、「同一性」と同義でありうる。
相同配列は、対象配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一、好ましくは、少なくとも９５％、または９７％、または９９％同一でありうるアミノ酸配列を含みうる。典型的に、相同体は、対象のアミノ酸配列と同じ活性部位などを含むであろう。相同性はまた、類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）との関連においても考えられうるが、本発明の文脈では、相同性を、配列同一性との関連において表すことが好ましい。
相同配列は、対象配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一、好ましくは、少なくとも９５％、または９７％、または９９％同一でありうるヌクレオチド配列を含みうる。相同性はまた、類似性との関連においても考えられうるが、本発明の文脈では、相同性を、配列同一性との関連において表すことが好ましい。
好ましくは、本明細書で詳述された配列番号のうちのいずれか１つに対して、ある同一性パーセントを有する配列への言及は、言及された配列番号の長さの全体にわたり、言明された同一性パーセントを有する配列を指す。
相同性の比較は、目視により行われる場合もあり、より通例では、たやすく利用可能な配列比較プログラムを一助として行われる場合もある。これらの市販のコンピュータプログラムは、２つまたはこれを超える配列間における、相同性または同一性の百分率を計算しうる。
相同性百分率は、連続配列にわたり計算されうる、すなわち、１つの配列を、他の配列とアライメントし、１つの配列内の各アミノ酸を、一度に１残基ずつ、他の配列内の、対応するアミノ酸と、直接比較する。これは、「ギャップなし」アライメントと呼ばれる。典型的に、このようなギャップなしアライメントは、比較的小さな残基数だけにわたり実行される。
これは、極めて単純かつ一貫した方法であるが、例えば、それ以外は同一な配列対において、ヌクレオチド配列内の、１つの挿入または欠失が、後続のコドンを、アライメントの対象外とし、この結果として、グローバルアライメントが実施される場合に、パーセント相同性の大幅な低減を、潜在的にもたらすことを考慮に入れることができない。結果として、大半の配列比較法は、相同性スコアの全体を、不当に減点することなく、可能な挿入および欠失を考慮に入れる、最適アライメントをもたらすようにデザインされる。これは、配列アライメント内に「ギャップ」を挿入して、局所的相同性を最大化しようと試みることにより達成される。
しかし、これらのより複雑な方法は、同数の同一なアミノ酸について、比較される２つの配列間において高度の類縁性を反映する、可能な限り少数のギャップを伴う配列アライメントが、多くのギャップを伴う配列アライメントより、高値のスコアを達成するように、アライメントにおいて生じる各ギャップへと、「ギャップペナルティー」を割り当てる。典型的に、ギャップの存在に対して、比較的高額のコストを課し、ギャップ内の各後続の残基に対して、小さなペナルティーを課する、「アファインギャップコスト」が使用される。これは、最も一般に使用される、ギャップ評定システムである。高値のギャップペナルティーは、当然ながら、少数のギャップを伴う、最適化アライメントをもたらすであろう。大半のアライメントプログラムは、ギャップペナルティーの改変を可能とする。しかし、このようなソフトウェアを、配列比較のために使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のための、デフォルトのギャップペナルティーは、ギャップに対する－１２、および各伸長に対する－４である。
したがって、相同性百分率の最大値の計算は、まず、ギャップペナルティーを考慮に入れる、最適アライメントの生成を要求する。このようなアライメントを実行するために適するコンピュータプログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｕ．Ｓ．Ａ．；Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387）である。配列比較を実施しうる、他のソフトウェアの例は、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ausubel et al. (1999) ibid - Ch. 18を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410）、および比較ツールのパッケージソフトであるＧＥＮＥＷＯＲＫＳを含むがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡのいずれも、オフラインおよびオンラインの検索について利用可能である（Ausubel et al. (1999) ibid, pages 7-58 to 7-60を参照されたい）。しかし、一部の適用のためには、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる、別のツールもまた、タンパク質配列およびヌクレオチド配列を比較するために利用可能である（FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8を参照されたい）。
最終的なパーセント相同性は、同一性との関連において、測定されうるが、アライメントステップ自体は、典型的に、全部またはゼロの対比較には基づかない。実際、一般に、化学的類似性または進化の距離に基づく、対応のある各比較に、スコアを割り当てる、類似性計量スコア行列が使用される。一般に使用される、このような行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（ＢＬＡＳＴプログラムパッケージソフトのデフォルト行列）である。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般に、公開のデフォルト値、または支給される場合、カスタムの記号比較表を使用する（さらなる詳細については、使用説明書を参照されたい）。一部の適用のために、ＧＣＧパッケージのために、公開のデフォルト値を使用するか、または他のソフトウェアの場合に、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト行列を使用することが好ましい。
ソフトウェアが、最適アライメントをもたらしたら、相同性パーセント、好ましくは、配列同一性パーセントを計算することが可能である。ソフトウェアは、典型的に、これを、配列比較の一部として行い、数値結果を生成する。
「断片」はまた、変異体でもあり、用語は、典型的に、機能的に目的となる、または、例えば、アッセイにおいて目的となる、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの選択領域を指す。したがって、「断片」とは、全長ポリペプチドまたは全長ポリヌクレオチドの一部である、アミノ酸配列または核酸配列を指す。
このような変異体は、部位指向突然変異誘発など、標準的組換えＤＮＡ法を使用して調製されうる。挿入がなされる場合、挿入部位の両側の天然に存在する配列に対応する、５’側フランキング領域および３’側フランキング領域と併せて、インサートをコードする合成ＤＮＡが作製されうる。フランキング領域は、配列が、適切な酵素（複数可）により切断され、合成ＤＮＡが、切断部へとライゲーションされうるように、天然に存在する配列内の部位に対応する、好都合な制限部位を含有するであろう。次いで、コードされるタンパク質を作製するように、本発明に従うＤＮＡが発現される。これらの方法は、ＤＮＡ配列を操作するための、当技術分野で公知の、多数の標準法を例示するに過ぎず、他の公知の技法もまた使用されうる。
本発明の態様
本発明の態様は、以下の番号付き項目において規定される。
１．同時的治療、別個の治療、または逐次的治療における使用のための組合せ調製物としての、（ｉ）抗ＶＥＧＦ実体；および（ｉｉ）負の補体調節因子、またはこれをコードするヌクレオチド配列を含む生成物。
２．処置または防止される疾患が、眼障害である、項目１に記載の使用のための生成物。
３．眼障害が、眼の補体媒介性障害である、項目２に記載の使用のための生成物。
４．補体媒介性障害が、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病網膜症、緑内障、スターガルト病、中心性漿液性脈絡網膜症、色素性網膜炎、ポリープ状脈絡膜血管症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈分枝閉塞症、またはブドウ膜炎、好ましくは、ＡＭＤである、項目３に記載の使用のための生成物。
５．ＡＭＤが、湿潤型ＡＭＤおよび／または乾燥型ＡＭＤである、項目４に記載の使用のための生成物。
６．ＡＭＤが、湿潤型ＡＭＤであり、さらに、前記対象における乾燥型ＡＭＤの発症を防止および／または処置する、項目４に記載の使用のための生成物。
７．（ｉ）抗ＶＥＧＦ実体と、（ｉｉ）負の補体調節因子とをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、項目１から６のいずれかに記載の使用のための生成物。
８．（ｉ）抗ＶＥＧＦ実体と、（ｉｉ）負の補体調節因子とをコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
９．抗ＶＥＧＦ実体が、Ｉｇ融合タンパク質、抗体、ポリペプチド、ペプチド、非抗体足場、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイド鎖、およびアプタマーから選択される、項目７に記載の使用のための生成物、または項目８に記載の単離ポリヌクレオチド。
１０．抗ＶＥＧＦ実体が、アフリベルセプト、ラニビズマブ、ベバシズマブ、およびペガプタニブから選択される、項目９に記載の使用のための生成物または単離ポリヌクレオチド。
１１．抗ＶＥＧＦ実体が、アフリベルセプトであり、例えば、アフリベルセプトが、配列番号３～１１のうちのいずれか１つを含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、項目１０に記載の単離ポリヌクレオチド。
１２．負の補体調節因子が、補体Ｉ因子（ＣＦＩ）、補体ＦＨＬ１（ｆａｃｔｏｒ Ｈ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、補体Ｈ因子（ＣＦＨ）、１型補体受容体（ＣＲ１），ＭＣＰ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、補体ＤＡＦ（ｄｅｃａｙ－ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、ＭＡＣ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｔｔａｃｋ ｃｏｍｐｌｅｘ）阻害性タンパク質（ＭＡＣ－ＩＰ）、Ｃ１阻害剤、アナフィラトキシン阻害剤、Ｃ４ｂ結合性タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、クラステリン、ビトロネクチン、またはこれらの変異体もしくは断片から選択される、項目１から１１のいずれかに記載の使用のための生成物または単離ポリヌクレオチド。
１３．負の補体調節因子が、ＣＦＩおよびＦＨＬ１、またはこれらの変異体もしくは断片から選択される、項目１２に記載の使用のための生成物または単離ポリヌクレオチド。
１４．ポリヌクレオチドが、
（ａ）任意選択で、（ｉ）および（ｉｉ）をコードするヌクレオチド配列の上流にある、ＣＭＶプロモーターまたはＣＡＧプロモーター；
（ｂ）任意選択で、（ｉ）および（ｉｉ）をコードするヌクレオチド配列の下流にある、ＷＰＲＥ調節エレメント；および／または
（ｃ）任意選択で、（ｉ）および（ｉｉ）をコードするヌクレオチド配列の下流にある、任意選択で、ウシ成長ホルモンポリＡシグナルである、ポリＡシグナル
をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目７から１３のいずれかに記載の使用のための生成物または単離ポリヌクレオチド。
１５．ポリヌクレオチドが、１つまたは複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）をさらに含む、項目７から１４のいずれかに記載の使用のための生成物または単離ポリヌクレオチド。
１６．ポリヌクレオチドが、その５’末端におけるＡＡＶ ＩＴＲと、その３’末端におけるＡＡＶ ＩＴＲとを含む、項目７から１５のいずれかに記載の使用のための生成物または単離ポリヌクレオチド。
１７．ポリヌクレオチドが、
（ａ）５’ＡＡＶ ＩＴＲ；
（ｂ）ＣＭＶプロモーターまたはＣＡＧプロモーター；
（ｃ）抗ＶＥＧＦ実体をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）任意選択で、フーリン切断部位配列、ＧＳＧ配列、１１ａ１Ｄ配列、またはＦ２Ａ配列を含むか、またはこれにより規定されるリンカー；
（ｅ）負の補体調節因子をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）任意選択で、ＷＰＲＥ３調節エレメントである、任意選択の、さらなるＷＰＲＥ調節エレメント；
（ｇ）ウシ成長ホルモンポリＡシグナル；および
（ｈ）３’ＡＡＶ ＩＴＲ
を含む、項目７から１６のいずれかに記載の使用のための生成物または単離ポリヌクレオチド。
１８．ＡＡＶ ＩＴＲが、ＡＡＶ２ ＩＴＲである、項目７から１７のいずれかに記載の使用のための生成物または単離ポリヌクレオチド。
１９．抗ＶＥＧＦ実体と、負の補体調節因子とをコードするヌクレオチド配列が、コドン最適化されている、項目７から１８のいずれかに記載の使用のための生成物または単離ポリヌクレオチド。
２０．アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１１に対する、少なくとも７５％の配列同一性を有する、項目７から１９のいずれかに記載の使用のための生成物または単離ポリヌクレオチド。
２１．ＣＦＩをコードするヌクレオチド配列が、配列番号３５もしくは３６に対する、少なくとも７５％の配列同一性を有するか、またはＦＨＬ－１をコードするヌクレオチド配列が、配列番号４１に対する、少なくとも７５％の配列同一性を有する、項目７から２０のいずれかに記載の使用のための生成物または単離ポリヌクレオチド。
２２．ポリヌクレオチドが、配列番号４５～５４のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、項目７から２０のいずれかに記載の使用のための生成物または単離ポリヌクレオチド。
２３．ポリヌクレオチドが、４．７ｋｂ以下である、項目７から２２のいずれかに記載の使用のための生成物または単離ポリヌクレオチド。
２４．項目８から２３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
２５．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、項目２４に記載のベクター。
２６．ウイルスベクター粒子の形態にある、項目２４または２５に記載のベクター。
２７．ＡＡＶベクター粒子が、ＡＡＶ２ゲノムまたはＡＡＶ８ゲノムと、ＡＡＶ２カプシドタンパク質またはＡＡＶ８カプシドタンパク質とを含む、項目２６に記載のベクター。
２８．項目７から２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
２９．項目２４から２７のいずれか一項に記載のベクターにより形質導入された細胞。
３０．薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、項目８から２９のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞を含む医薬組成物。
３１．治療における使用のための、項目８から２９のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞。
３２．眼の補体媒介性障害の処置または防止における使用のための、項目８から２９のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞。
３３．補体媒介性障害が、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病網膜症、緑内障、スターガルト病、中心性漿液性脈絡網膜症、色素性網膜炎、ポリープ状脈絡膜血管症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈分枝閉塞症、またはブドウ膜炎、好ましくは、ＡＭＤである、項目３２に記載の使用のための、単離ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞。
３４．ＡＭＤが、湿潤型ＡＭＤおよび／または乾燥型ＡＭＤである、項目３２に記載の使用のための、単離ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞。
３５．ＡＭＤが、湿潤型ＡＭＤであり、使用が、さらに、前記対象における乾燥型ＡＭＤの発症を防止および／または処置する、項目３３に記載の使用のための、単離ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞。
３６．地図状萎縮の形成が、防止もしくは軽減され、かつ／または地図状萎縮の量が、低減される、項目３２から３５のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド、ベクター、または細胞。
３７．地図状萎縮の進行が、緩徐化される、項目３２から３６のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド、ベクター、または細胞。
３８．対象の処置眼への投与後１２カ月間にわたり、同じ期間にわたる非処置眼と比べて、少なくとも１０％の、地図状萎縮面積の増大の低減がみられる、項目３２から３７のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド、ベクター、または細胞。
３９．ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞の投与が、対象、または対象の網膜色素上皮（ＲＰＥ）など、対象の眼における、Ｃ３ｂ不活化／ｉＣ３ｂ分解活性のレベルを、対象またはその眼もしくはＲＰＥにおける正常レベルを超えるレベルへと上昇させる、項目３２から３８のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド、ベクター、または細胞。
４０．眼内投与される、項目３２から３９のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド、ベクター、または細胞。
４１．網膜下注射、直接的な網膜内注射、脈絡膜上注射、または硝子体内注射により、対象の眼へと投与される、項目３２から４０のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド、ベクター、または細胞。
４２．網膜下注射により、対象の眼へと投与される、項目３２から４１のいずれか一項に記載の使用のためのポリヌクレオチド、ベクター、または細胞。
４３．眼の補体媒介性障害を処置または防止する方法であって、項目８から２９のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞を、それを必要とする対象へと投与するステップを含む方法。
４４．（ｉ）抗ＶＥＧＦ実体；および（ｉｉ）負の補体調節因子を、対象へと施す方法であって、項目８から２９のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞を、対象の眼へと送達するステップを含む方法。
４５．負の補体調節因子と組み合わせて使用される、疾患の処置または防止における使用のための抗ＶＥＧＦ実体。
４６．抗ＶＥＧＦ実体と組み合わせて使用される、疾患の処置または防止における使用のための負の補体調節因子。
４７．疾患が、項目２から６のいずれかに記載の疾患である、項目４５に記載の使用のための抗ＶＥＧＦ実体、または項目４６に記載の使用のための負の補体調節因子。
４８．項目９から１１のいずれかに記載の実体である、項目４５または４７に記載の使用のための抗ＶＥＧＦ実体。
４９．項目１２または１３に記載の実体である、項目４６または４７に記載の使用のための負の補体調節因子。
当業者は、開示される本発明の範囲から逸脱せずに、本明細書で開示される本発明の、全ての特色を組み合わせうることを理解するであろう。
ここで、非限定例を目的として、本発明の、好ましい特色および実施形態が記載される。
本発明の実施は、そうでないことが指し示されない限りにおいて、当業者の能力の範囲内にある、化学、生化学、分子生物学、微生物学、および免疫学の常套的技法を利用するであろう。このような技法は、文献において、説明されている。例えば、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13 and 16, John Wiley & Sons; Roe, B., Crabtree, J. and Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; Polak, J.M. and McGee, J.O’D. (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; and Lilley, D.M. and Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Pressを参照されたい。これらの一般的教科書のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
[実施例１]
アフリベルセプト配列のコドン最適化
まず、アフリベルセプトのタンパク質配列を、ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａから得た（配列番号１を参照されたい）。
「Ｄｒｕｇｂａｎｋ」によるタンパク質配列を、ＤＮＡ配列へと翻訳し戻し、次いで、これを、ヒトＶＥＧＦ受容体およびヒトＩｇＧのタンパク質配列とアライメントし、「野生型」アフリベルセプト配列として表示した。野生型アフリベルセプトのＤＮＡ配列を導出し、ＧＴ００５骨格へとサブクローニングし、ＲＣ２８８と表示した。細胞からの分泌を可能とするように、天然ＦＨＬ－１シグナルペプチドを、野生型アフリベルセプト配列の上流に付加した。５つのオンラインツール（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｇｅｎｅｗｉｚ、ＩＤＴ ＆ ＪＣａｔ）を使用して、「基本」配列を生成した。次いで、潜伏スプライス部位、ｍｉＲＮＡ結合性部位、およびタンデム重複コドンを除去するように、基本配列の各々を、手作業で最適化した。これらの最適化配列を、「手作業による最適化配列」と称した。Ｇｅｎｅｗｉｚにより、各コドン最適化配列を合成し、ＧＴ００５骨格へとクローニングした（表１および図１）。
一般に、モノシストロニックのアフリベルセプトベクターは、
・ＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）
・ＣＭＶ早期エンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター
・天然ＦＨＬ１分泌シグナルペプチドまたはコドン最適化ＦＨＬ１分泌シグナルペプチド
・血管内皮増殖因子受容体である、ＶＥＧＦＲ－１の、第２の結合性ドメインに由来する配列と、ヒトＩｇＧのＦＣ断片の配列へと融合された、ＶＥＧＦＲ－２の、第３の結合性ドメインとから構成されるアフリベルセプト（ＷＴ＝野生型アフリベルセプト配列；ｃｏＡｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ＝コドン最適化アフリベルセプト配列）
・ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）
・ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）
から構成される。
[実施例２]
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、ベクター化アフリベルセプトの発現についての比較
三重トランスフェクション法を使用して、全てのコドン最適化アフリベルセプトベクターを、ＡＡＶ２へとパッケージングした。次いで、全てのベクターを、ｑＰＣＲにより滴定し、感染多重度を１×１０４として、ＨＥＫ２９３へと形質導入した。アフリベルセプトの発現レベルは、形質導入の７２時間後の培養物上清中で、ＥＬＩＳＡにより測定した。実験は、２回にわたり反復した。図２に示される通り、全てのコドン最適化アフリベルセプトベクターは、発現レベルの変動を示した。
特に、ＲＣ２９８（Ｊｃａｔ Ｂａｓｉｃ）およびＲＣ２９９（Ｊｃａｔ Ｍａｎｕａｌ）は、コドン最適化されていない野生型配列を含有する対照ＲＣ２８８ベクターと比較して、最高レベルのアフリベルセプト発現を示した。
ＡＡＶ２ベクターから発現されたアフリベルセプトタンパク質の完全性を確認するように、ウェスタンブロット解析もまた実行した。全てのベクターは、組換えアフリベルセプトタンパク質と同等な、１１５ｋＤａの予測分子量における、アフリベルセプトタンパク質の発現（非還元条件下における）を裏付けた（図３Ａおよび３Ｂ）。濃度測定解析は、ＲＣ２９８が、最高レベルのアフリベルセプトを発現させることを示した（図３Ｃ）が、これは、図２に従うＥＬＩＳＡデータと符合した。特に、ＲＣ２９９は、タンパク質バンドパターンの異常を示したので、選択から除外した。
結論として述べると、ＲＣ２９８を、最適のコドン最適化アフリベルセプト配列として選択して、バイシストロニックベクターへと進んだ。
[実施例３]
負の補体調節因子と、アフリベルセプトとを共発現させるバイシストロニックベクターの構築
フーリンＦ２Ａリンカーにより連結された、コドン最適化アフリベルセプト（ＲＣ２９８に由来する）へと連結された、コドン最適化ＣＦＩまたはコドン最適化ＦＨＬ１の発現を駆動する（ＣＡＧまたはＣＭＶ）プロモーターから構成された、バイシストロニックベクターを作出した。図４および表２に示される通り、負の補体調節因子の位置と、アフリベルセプトの位置とを、異なる構成の間で交換した。
一般に、バイシストロニックのアフリベルセプトベクターは、
・ＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）
・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターまたはＣＭＶ早期エンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター
・コドン最適化補体Ｉ因子（ＣＦＩ）またはコドン最適化ＦＨＬ１
・フーリンＦ２Ａ切断ペプチド
・血管内皮増殖因子受容体である、ＶＥＧＦＲ－１の、第２の結合性ドメインに由来する配列と、ヒトＩｇＧのＦＣ断片の配列へと融合された、ＶＥＧＦＲ－２の、第３の結合性ドメインとから構成されるアフリベルセプト（ＷＴ＝野生型アフリベルセプト配列；ｃｏＡｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ＝コドン最適化アフリベルセプト配列）
・ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）または最小ガンマエレメントおよびアルファエレメント（ＷＰＲＥ３）だけを含有する、ＷＰＲＥの短縮形
・ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）
から構成される。
コドン最適化ＣＦＩ配列は、配列番号３５である。
コドン最適化ＦＨＬ１配列は、配列番号４１である。
コドン最適化アフリベルセプト配列は、配列番号１１である。
５’ＩＴＲは、配列番号５５である。
ＣＭＶプロモーターは、配列番号５９である。
ＣＡＧプロモーターは、配列番号６０である。
ＷＰＲＥ配列は、配列番号６３である。
ＷＰＲＥ３配列は、配列番号６４である。
ｂＧＨｐＡ配列は、配列番号６１である。
３’ＩＴＲは、配列番号５７である。
[実施例４]
負の補体調節因子と、アフリベルセプトとを共発現させるバイシストロニックベクターの機能的特徴付け
バイシストロニックベクターによる発現の比較をｉｎ ｖｉｔｒｏにおける形質導入により実施して、アフリベルセプト、ＣＦＩ、およびＦＨＬ１の、図４に列挙されたバイシストロニックベクターからの発現を、モノシストロニックの対応物に対して比較した。
バイシストロニックベクターからのアフリベルセプトについての機能解析を実施して、抗ＶＥＧＦ結合能および抗ＶＥＧＦ増殖能を決定した。
三重トランスフェクション法を使用して、全てのバイシストロニックベクターを、ＡＡＶ８またはＡＡＶ２へとパッケージングした。ＨＥＫ２９３細胞において、異なる感染多重度で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質導入を実行して、それぞれのトランス遺伝子の、表２に列挙されるバイシストロニックベクターからの発現を比較した。ＥＬＩＳＡを使用して、アフリベルセプト、ＣＦＩ、およびＦＨＬ１の、それぞれのバイシストロニックベクターからの発現レベルを定量した。これと並行して、発現を、モノシストロニックの対応物と比較した。ＡＡＶ８バイシストロニックベクターおよびＡＡＶ２バイシストロニックベクター（ＲＣ２８９およびＲＣ３１３）は、形質導入後に、ＣＦＩおよびアフリベルセプトの、測定可能な発現レベルを示し、ＡＡＶ８ベクターおよびＡＡＶ２ベクターとしてパッケージングされた、ＲＣ２８９からの発現レベルは、モノシストロニックの対応物と同等であった（図７Ａおよび７Ｂ）。これに対し、ＲＣ３１３は、ＲＣ２８９および対応するモノシストロニックベクターと比較して、低度の発現レベルを示した。同様に、ＡＡＶ８バイシストロニックベクターおよびＡＡＶ２バイシストロニックベクター（ＲＣ３０４およびＲＣ３１２）は、ＦＨＬ－１およびアフリベルセプトの、定量可能な発現レベルを示し、発現レベルは、対応するモノシストロニックベクターによる発現レベル（ＲＣ１４６：モノシストロニックベクターによるＦＨＬ１、ＲＣ２９８：モノシストロニックなアフリベルセプト）と同等であった（図７Ｃおよび７Ｄ）。
さらなる実験では、三重トランスフェクション法を使用して、バイシストロニックベクターである、ＲＣ３１３、ＲＣ２８９、ＲＣ３０４、およびＲＣ３１２を、ＡＡＶ８へとパッケージングした。精製ベクターを、３つの感染多重度、三連で、ＨＥＫ２９３に形質導入した。上清を採取し、アフリベルセプト、ＣＦＩ、およびＦＨＬ－１についてのＥＬＩＳＡにより定量した。ＣＦＩ－アフリベルセプトバイシストロニックベクター（ＲＣ３１３およびＲＣ２８９）について、アフリベルセプト発現は、２つのベクター間で同様であり、ＲＣ２８９は、ＲＣ３１３より高度のＣＦＩ発現を示した（図７Ｅ）。ＦＨＬ－１－アフリベルセプトバイシストロニックベクターについて、アフリベルセプト発現は、ここでも、ベクター間で同様であり、ＲＣ３０４は、感染多重度を１×１０４として、ＲＣ３１２と比較して、高度のＦＨＬ－１発現を示した（図７Ｆ）。発現研究と同じ細胞培養物上清試料を使用して、ウェスタンブロット解析を実行して、全てのバイシストロニックベクターからのタンパク質発現について評価した。非還元条件下で、全ての細胞培養物上清は、ＣＦＩ、ＦＨＬ－１、およびアフリベルセプトのタンパク質発現を示し、全てのバイシストロニックベクターは、組換えタンパク質対照のサイズと同様の、予測サイズのタンパク質を発現させた（図８を参照されたい）。
これらの結果は、全ての被験バイシストロニックベクターが、二重のトランス遺伝子発現を可能とし、一部の候補ベクターは、モノシストロニックベクターの発現レベルと同様の発現レベルを示したことを指し示す。全てのバイシストロニックベクターは、適正サイズのタンパク質を発現させた。
ＶＥＧＦ結合アッセイ
バイシストロニックベクターから発現されたアフリベルセプトの、ＶＥＧＦＡに対する結合アフィニティーを決定するために、平衡結合アッセイを実施した。アフリベルセプトを発現させるモノシストロニックベクター（ＲＣ２９８）、およびＣＦＩまたはＦＨＬ１と、アフリベルセプトとを共発現させるバイシストロニックベクターを、ＨＥＫ２９３細胞へと形質導入した。形質導入の７２時間後、培養物上清中に分泌されたアフリベルセプトを抽出し、ＥＬＩＳＡにより定量した。一定時間にわたりインキュベートされた、アフリベルセプト（ある濃度範囲にわたる）のヒトＶＥＧＦＡとの混合物中の、遊離（非結合）ヒトＶＥＧＦＡを検出するために、高特異度／高感度のＥＬＩＳＡを使用して、ベクターに由来する、分泌アフリベルセプト、および組換えアフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））の結合アフィニティーを測定した。図９に示される通り、モノシストロニックベクターおよびバイシストロニックベクターの両方に由来するアフリベルセプトの、ＶＥＧＦＡに対する平衡結合定数（ｋＤ）［ＩＣ５０］は、Ｅｙｌｅａ（登録商標）のＩＣ５０と同様であることを見出した。
これらのデータは、デザインされたバイシストロニックベクターが、Ｅｙｌｅａ（登録商標）のバイシストロニックベクターと同様の能力で機能するアフリベルセプトを発現させることが可能であったことを裏付ける。
ＶＥＧＦ誘導性増殖アッセイ
ＡＡＶベクター由来のアフリベルセプトが、ＶＥＧＦＡに有効に結合し、ＶＥＧＦが細胞の増殖を誘導する能力を、有効に遮断するのかどうかを決定するために、ヒト臍帯血管内皮（ＨＵＶＥＣ）細胞に、一定濃度のヒトＶＥＧＦＡ、および変動濃度のアフリベルセプト（上記の通り、ＨＥＫ２９３細胞への、ＡＡＶによる形質導入後における培養上清に由来する）、またはＥｙｌｅａ（登録商標）（陽性対照）を接種した。処置の７２時間後、［３－（４，５ジメチルチアゾール－２－イル）－５－（３－カルボキシメトキシフェニル）－２－（４－スルホフェニル）－２Ｈ－テトラゾリウムの添加、および４５０／５７０ｎｍにおける分光光度解析により、ＨＵＶＥＣ細胞の、ＶＥＧＦ誘導性増殖に対する阻害を測定した。図１０に示される通り、モノシストロニックベクターおよびバイシストロニックベクターに由来するアフリベルセプトは、これらの細胞内で、５日間にわたる、増殖アッセイにおいて、ＶＥＧＦ誘導性増殖を遮断し、観察される抗増殖性特性は、Ｅｙｌｅａ（登録商標）の抗増殖性特性と同様であった。
これらのデータは、デザインされたバイシストロニックベクターが、Ｅｙｌｅａ（登録商標）のバイシストロニックベクターと同様の能力で機能する、アフリベルセプトを発現させることが可能であることを裏付ける。
Ｃ３ｂ切断アッセイ
形質導入細胞から分泌されたＣＦＩまたはＦＨＬ１の機能活性を解析するために、ＣＦＩを発現させるＡＡＶ２（ＧＴ００５）；ＦＨＬ１を発現させるＡＡＶ２（ＲＣ１４６）；ＣＦＩと、アフリベルセプトとを共発現させるＡＡＶ２（ＲＣ２８９またはＲＣ３１３）、またはＦＨＬ１と、アフリベルセプトとを共発現させるＡＡＶ２（ＲＣ３１２またはＲＣ３０４）により形質導入されたＨＥＫ２９３細胞からの馴化上清を、Ｃ３ｂ切断アッセイにおいて調べた（図１１）。このアッセイの原理は、ＦＨＬ１の存在下において、ＣＦＩが、Ｃ３ｂを、ｉＣ３ｂへと切断する能力に基づく。ｉＣ３ｂ ＥＬＩＳＡは、Ｃ３ｂの分解生成物である、ｉＣ３ｂの量を定量する。
Ｃ３ｂ切断アッセイは、１ｕｇのＣ３ｂを、ＦＨＬ１：ＣＦＩのモル比を４：１とする、組換えＦＨＬ１（ＧＴＰ Ｔｅｃｈ）、およびＣＦＩ発現ベクター（ＧＴ００５、ＲＣ２８９、およびＲＣ３１３）により形質導入された細胞に由来する上清と共にインキュベートすることにより行った。Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）血清低減培地により、反応容量を、２０ｕｌ以下とし、反応物を、３７度で、２０分間にわたりインキュベートした。ＦＨＬ１ベクター（ＲＣ１４６、ＲＣ３１２、またはＲＣ３０４）により形質導入された細胞に由来する上清を、２０ｕｌの総容量中、ＦＨＬ１：ＣＦＩのモル比を４：１として、３７℃で、２０分間にわたり、組換えＣＦＩ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ、Ａ１３８）、１ｕｇのＣ３ｂ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ、Ａ１１３）、およびＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）無血清培地と共にインキュベートした。
結果として得られる試料を、１：１００および１：４００に希釈し、コーティング抗体：マウス抗ヒト活性化Ｃ３（Ｈｙｃｕｌｔ、ＨＭ２１６８）、検出抗体：ラット抗Ｃ３ｄｇ（Ｈｙｃｕｌｔ、ＨＭ２１９９）、および二次抗体：マウス抗ラット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、３０６１－０５）を使用するｉＣ３ｂ ＥＬＩＳＡへとロードした。ｉＣ３ｂ濃度（ｎｇ／ｍＬ）は、精製ヒトｉＣ３ｂタンパク質（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）を使用して作成された検量線に従い計算した。
組換えＣＦＩおよび組換えＦＨＬ１と共にインキュベートされたＣ３ｂは、陽性対照として用いられた（図１１、左バー）。Ｃ３ｂだけの陰性対照は、さらなる成分の非存在下では、Ｃ３ｂが安定であるので、Ｃ３ｂ分解が、ＣＦＩおよびＦＨＬ１の存在を要求することを裏付けた。非形質導入細胞（ＵＴＤ）に由来する馴化上清と共にインキュベートされたＣ３ｂもまた、陰性対照として用いられた。バイシストロニックベクターによるｉＣ３ｂレベルを、モノシストロニックの対応物と比較した。ｉＣ３ｂ ＥＬＩＳＡの結果は、全てのバイシストロニックベクターから発現されたＣＦＩおよびＦＨＬ１が、機能的であり、Ｃ３ｂの、ｉＣ３ｂへの分解を容易とすることを裏付けた（図１１を参照されたい）。
ｉｎ ｖｉｖｏ研究
ｉｎ ｖｉｖｏバイシストロニック発現／有効性研究を実行して、齧歯動物における、負の補体調節因子およびアフリベルセプトの、バイシストロニックベクターからの発現を決定した。レーザーＣＮＶマウスモデルにおける、バイシストロニックベクターの有効性を裏付ける研究もまた実施する。
[実施例５]
マウスＣＮＶモデルにおける、ＣＦＩまたはＦＨＬ１を発現させるモノシストロニックベクターの投与
まず、ＡＡＶベクターを、マウス眼へと網膜下送達し、４週間にわたり放置した。０日目に、レーザーによるブルッフ膜の焼切りを介して、あらかじめ注射された全ての眼を、レーザー誘導性ＣＮＶ病変下に置く。陽性対照群のために、アフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ（登録商標））もまた、硝子体内注射を介して、ＣＮＶ病変眼へと送達する。光干渉断層法およびフルオレセイン血管造影を使用して、それぞれ、０日目および４日目に、網膜内構造およびＣＮＶ病変領域をイメージングする。レーザーによる焼切り後７日目に、全てのマウスを殺処分し、ＣＮＶ面積（イソレクチン染色により決定された）、ＣＮＶ漏出面積、およびＣＮＶスコア（評定された）を、主要評価項目および副次的評価項目として測定する（図６を参照されたい）。
[実施例６]
ｉｎ ｖｉｖｏ発現研究
モノシストロニック発現データ
抗ＶＥＧＦ（アフリベルセプト）を発現させるＡＡＶ８（モノシストロニック）ベクターを、下記の群に従い、９週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪＲｊ雄マウスの右眼へと、網膜下投与した。スペクトラルドメイン光干渉断層法（ＳＤ－ＯＣＴ）を使用して、網膜下投与の成功を検証した。
群１：ＡＡＶ８ ＲＣ２９８、用量：眼１つ当たり５×１０７個のベクターゲノム（ｎ＝９）；
群２：ＡＡＶ８ ＲＣ２９８、用量：眼１つ当たり２×１０８個のベクターゲノム（ｎ＝１０）；
群３：ＡＡＶ８ ＲＣ２９８、用量：眼１つ当たり５×１０８個のベクターゲノム（ｎ＝１０）；
群４：ＡＡＶ８ ＲＣ２９８、用量：眼１つ当たり２×１０９個のベクターゲノム（ｎ＝１０）；
群５：ＡＡＶ８ ＲＣ２９８、用量：眼１つ当たり５×１０９個のベクターゲノム（ｎ＝１０）；
群６：ＡＡＶ８ ＲＣ２９８、用量：眼１つ当たり１×１０１０個のベクターゲノム（ｎ＝９）
各動物の反対側の眼は、非注射対照として用いられた。注射の５週間後、全ての動物を屠殺した。注射された眼および反対側の注入されていない眼の両眼を切り出し、眼液を、ネジ蓋付き試験管内、４０μｌのＰＢＳ（プロテアーゼ阻害剤を含有する）中に回収し、タンパク質解析まで、瞬時凍結させた。後眼杯を、５０μｌのＲＮＡｌａｔｅｒ液を含有する未使用の試験管に入れ、解剖用鋏でさらに分解した。次いで、解剖された眼杯を、液体窒素中で、３０秒間にわたり瞬時凍結させ、β－メルカプトエタノールを含有する、５０ｕＬのＲＬＴ緩衝液を添加してから、２分間にわたり、ホモジナイザーを使用する、さらなるホモジネーションにかけた。β－メルカプトエタノールを伴う、２００ｕＬのＲＬＴ緩衝液を、眼杯ホモジネートへと添加し、上下にピペッティングすることにより混合した。全ての眼杯ホモジネートを、－８０℃で、少なくとも２４時間にわたり保管してから、ＲＮＡの抽出を行った。
ＲＮＡの抽出および定量的ＲＴ－ＰＣＲ
製造元のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ）に従い、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットを使用して、ＲＮＡを、ラット後眼杯組織から単離した。凍結させた眼杯ホモジネートを、氷上で溶解させ、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒを使用することにより、機械的破砕にかけた。破砕の後、７０％のＥｔＯＨを、ホモジネートへと添加し、次いで、混合物を、ＲＮｅａｓｙカラムへと移した。カラムを遠心分離し、ＲＷ１緩衝液で洗浄した。次いで、室温で、１５分間にわたるインキュベーションにより、カラム膜を、ＤＮアーゼＩで処理してから、ＲＷ１緩衝液およびＲＰＥ緩衝液でさらに洗浄した。次いで、ＲＮＡを、５０μＬの最終容量中の、ＲＮａｓｅ非含有水により溶出させた。次いで、ＮｅｏＤｏｔ ｎａｎｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｇｅｎｅｒｏｎ）を使用して、各試料のＲＮＡ濃度を測定した。
逆転写は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施した。マウス試料のために、ｂＧＨｐＡ配列をターゲティングする、以下のプライマー：ｂＧＨｐＡフォワード：５’－ＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴ－３’、およびｂＧＨｐＡリバース：５’－ＡＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴＧＴＣＴＴ－３’を使用することにより、トランス遺伝子由来ｍＲＮＡを定量した。全てのｑＲＴ－ＰＣＲは、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ化学反応と共に使用して行った。標準物質として、既知の濃度へと希釈された、直鎖化トランス遺伝子プラスミドを使用した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの適用は、以下：９５℃で３分間にわたる初期変性に続く、９５℃で、１０秒間、および５６℃で、３０秒間ずつにわたる、４０サイクルの通りに実施した。
図１２は、群１～６について、アフリベルセプトｍＲＮＡの発現を示す。
アフリベルセプト発現の定量
眼液中の非結合アフリベルセプトは、製造元のプロトコール（ＩｍｍｕｎｏＧｕｉｄｅ）に従い、定量的サンドイッチ型ＥＬＩＳＡを使用して測定した。略述すると、希釈されたアフリベルセプト標準物質および眼液試料を、組換えヒト血管内皮増殖因子Ａ（ｒｈＶＥＧＦ－Ａ）によりコーティングされた、マイクロ滴定プレート内でインキュベートした。インキュベーションの後、ウェルを洗浄し、ウェル表面上のｒｈＶＥＧＦ－Ａによりあらかじめ捕捉されたアフリベルセプトのＦｃ部分に結合するように、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を添加した。インキュベーションの後、ウェルを洗浄し、色原体－基質の添加により、結合酵素活性を検出した。発色は、試料中のアフリベルセプトまたは標準物質の量に比例し、光学濃度（ＯＤ）は、光度計により、４５０ｎｍ（ＯＤ６２０ｎｍにおける参照は、任意選択とした）で測定した。
図１３は、群１～６について、アフリベルセプトタンパク質の発現を示す。
バイシストロニック発現のデータ
抗ＶＥＧＦ（アフリベルセプト）と、補体調節因子（ｈＣＦＩまたはｈＦＨＬ－１）とを共発現させる、バイシストロニックのＡＡＶベクターを、１０週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスの右眼（ＯＤ）へと、網膜下投与した。スペクトラルドメイン光干渉断層法（ＳＤ－ＯＣＴ）を使用して、網膜下投与の成功を検証した。各動物の反対側の眼は、非注射対照として用いられ、４週間後、マウスを屠殺し、眼液および後眼杯を回収した。
研究は、８つの処置群：
群１：ＡＡＶ８－ＲＣ３１３、眼１つ当たり５×１０７個のベクターゲノム（マウスのｎ＝１０）；
群２：ＡＡＶ８－ＲＣ３１３、眼１つ当たり５×１０８個のベクターゲノム（ｎ＝１０）；
群３：ＡＡＶ８－ＲＣ２８９、眼１つ当たり５×１０７個のベクターゲノム（ｎ＝１０）；
群４：ＡＡＶ８－ＲＣ２８９、眼１つ当たり５×１０８個のベクターゲノム（ｎ＝１０）；
群５：ＡＡＶ８－ＲＣ３０４、眼１つ当たり５×１０７個のベクターゲノム（ｎ＝９）；
群６：ＡＡＶ８－ＲＣ３０４、眼１つ当たり５×１０８個のベクターゲノム（ｎ＝１０）；
群７：ＡＡＶ８－ＲＣ３１２、眼１つ当たり５×１０７個のベクターゲノム（ｎ＝９）；
群８：ＡＡＶ８－ＲＣ３１２、眼１つ当たり５×１０８個のベクターゲノム（ｎ＝１０）
からなった。
ＲＮＡの抽出および定量的ＲＴ－ＰＣＲ
後眼杯を、５０μｌのＲＮＡｌａｔｅｒ液を含有する未使用の試験管に入れ、解剖用鋏でさらに分解した。次いで、解剖された眼杯を、液体窒素中で、３０秒間にわたり瞬時凍結させ、β－メルカプトエタノールを含有する、５０ｕＬのＲＬＴ緩衝液を添加してから、２分間にわたり、ホモジナイザーを使用する、さらなるホモジネーションにかけた。β－メルカプトエタノールを伴う、２００ｕＬのＲＬＴ緩衝液を、眼杯ホモジネートへと添加し、上下にピペッティングすることにより混合した。全ての眼杯ホモジネートを、－８０℃で、少なくとも２４時間にわたり保管してから、ＲＮＡの抽出を行った。
製造元のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ）に従い、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキットを使用して、ＲＮＡを、ラット後眼杯組織から単離した。凍結させた眼杯ホモジネートを、氷上で溶解させ、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒを使用することにより、機械的破砕にかけた。破砕の後、７０％のＥｔＯＨを、ホモジネートへと添加し、次いで、混合物を、ＲＮｅａｓｙカラムへと移した。カラムを遠心分離し、ＲＷ１緩衝液で洗浄した。次いで、室温で、１５分間にわたるインキュベーションにより、カラム膜を、ＤＮアーゼＩで処理してから、ＲＷ１緩衝液およびＲＰＥ緩衝液でさらに洗浄した。次いで、ＲＮＡを、５０μＬの最終容量中の、ＲＮａｓｅ非含有水により溶出させた。次いで、ＮｅｏＤｏｔ ｎａｎｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｇｅｎｅｒｏｎ）を使用して、各試料のＲＮＡ濃度を測定した。
逆転写は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して実施した。マウス試料のために、ｂＧＨｐＡ配列をターゲティングする、以下のプライマー：ｂＧＨｐＡフォワード：５’－ＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴ－３’、およびｂＧＨｐＡリバース：５’－ＡＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＴＧＴＣＴＴ－３’を使用することにより、トランス遺伝子由来ｍＲＮＡを定量した。全てのｑＲＴ－ＰＣＲは、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ）を、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ化学反応と共に使用して行った。標準物質として、既知の濃度へと希釈された、直鎖化トランス遺伝子プラスミドを使用した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの適用は、以下：９５℃で３分間にわたる初期変性に続く、９５℃で、１０秒間、および５６℃で、３０秒間ずつにわたる、４０サイクルの通りに実施した。
図１４は、バイシストロニックベクターからの、アフリベルセプトｍＲＮＡの発現を示す。
アフリベルセプトおよび補体の発現の定量
アフリベルセプト
眼液中の非結合アフリベルセプトは、製造元のプロトコール（ＩｍｍｕｎｏＧｕｉｄｅ）に従い、定量的サンドイッチ型ＥＬＩＳＡを使用して測定した。略述すると、希釈されたアフリベルセプト標準物質および眼液試料を、組換えヒト血管内皮増殖因子Ａ（ｒｈＶＥＧＦ－Ａ）によりコーティングされた、マイクロ滴定プレート内でインキュベートした。インキュベーションの後、ウェルを洗浄し、ウェル表面上のｒｈＶＥＧＦ－Ａによりあらかじめ捕捉されたアフリベルセプトのＦｃ部分に結合するように、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体を添加した。インキュベーションの後、ウェルを洗浄し、色原体－基質の添加により、結合酵素活性を検出した。発色は、試料中のアフリベルセプトまたは標準物質の量に比例し、光学濃度（ＯＤ）は、光度計により、４５０ｎｍ（ＯＤ６２０ｎｍにおける参照は、任意選択とした）で測定した。
眼液中のＣＦＩタンパク質の発現
眼液中のヒトＣＦＩは、ＭＳＤ製の電気化学発光検出技術を使用して定量した。ＭＳＤ Ｇｏｌｄ ９６－ｗｅｌｌ ｓｍａｌｌ ｓｐｏｔ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｓｅｃｔｏｒ ｐｌａｔｅを、振盪（８５０ＲＰＭ）しながら、室温で、１時間にわたり、ビオチニル化抗ＣＦＩ抗体でコーティングした。ＣＦＩ標準物質（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）および試料を、相応に希釈した。プレートを、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ０．０５％で洗浄し、２５ｕＬの標準物質、対照、および試料を、プレートへと添加した。プレートをシーリングし、振盪（８５０ＲＰＭ）しながら、室温で、１時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを、既出の通りに洗浄し、２５ｕＬの抗ＦＩ（抗ＦＩ、Ａ２３１）検出抗体を、ウェルへと添加し、振盪（８５０ＲＰＭ）しながら、室温で、１時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後、プレートを、既出の通りに洗浄し、１５０ｕｌの２倍濃度リード緩衝液Ｔを、各ウェルへと添加してから、ＭＳＤプレートリーダー上の読取りを行った。
眼液中のＦＨＬ－１タンパク質の発現
眼液中のＦＨＬ－１は、ＭＳＤ製の電気化学発光検出技術を使用して定量した。ＭＳＤ Ｇｏｌｄ ９６－ｗｅｌｌ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｓｅｃｔｏｒ ｐｌａｔｅを、振盪（８５０ＲＰＭ）しながら、室温で、１時間にわたり、ビオチニル化抗ＦＨＬ－１抗体でコーティングした。ＦＨＬ－１標準物質および試料を、相応に希釈した。プレートを、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ０．０５％で洗浄し、２５ｕＬの標準物質、対照、および試料を、プレートへと添加した。プレートをシーリングし、振盪（８５０ＲＰＭ）しながら、室温で、１時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを、既出の通りに洗浄し、２５ｕＬの抗ＦＨ検出抗体（抗ＦＨ、ＭＡ１７００５７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ウェルへと添加し、振盪（８５０ＲＰＭ）しながら、室温で、１時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの後、プレートを、既出の通りに洗浄し、１５０ｕｌの２倍濃度リード緩衝液Ｔを、各ウェルへと添加してから、ＭＳＤプレートリーダー上の読取りを行った。
図１５は、バイシストロニックベクターからの、アフリベルセプト、ＣＦＩ、およびＦＨＬ１のタンパク質の発現を示す。
[実施例７]
ｉｎ ｖｉｖｏのレーザー誘導性マウス脈絡膜新血管形成モデルにおける有効性
５群のマウスに、異なるＡＡＶベクターの、片側（右眼）網膜下注射を施した。ＡＡＶ投与の直後に、スペクトラルドメイン光干渉断層法（ＳＤ－ＯＣＴ）を使用して、網膜下投与の成功を検証した。ベクター投与の４週間後、レーザー光凝固により、ＣＮＶを誘導した。略述すると、麻酔下の動物に、瞳孔を散大させるように、０．５％トロピカミド（Ｏｆｔａｎ Ｔｒｏｐｉｃａｍｉｄ、参天製薬）１滴を施した。Ｖｉｓｃｏｔｅａｒｓ（Ｄｒ．Ｇｅｒｈａｒｄ Ｍａｎｎ Ｃｈｅｍ．－Ｐｈａｒｍ．、Ｇｅｒｍａｎｙ）１滴を、眼に適用し、カバースリップを使用して、角膜を、圧平させた。５３２ｎｍのダイオードレーザー（斑点サイズ：１００μｍ；出力：１３０ｍＷ；時間：２００ミリ秒間；Ｏｃｕｌｉｇｈｔ ＴＸ．Ｉｒｉｄｅｘ Ｃｏｒｐ．、ＵＳＡ）を使用して、３つのレーザー片側病変を、右眼の近傍視神経頭に施した。ＣＮＶ病変作出の成功は、ＳＤ－ＯＣＴおよびフルオレセイン血管造影（ＦＡ）を使用することにより確認した。ＣＮＶ誘導の直後に、さらなるマウス群に、アフリベルセプトの硝子体内投与を施した。レーザー照射の４および７日後に、ＳＤ－ＯＣＴおよびＦＡにより、マウスを、再度イメージングし、次いで、屠殺した。
レーザー照射された眼を摘出し、解剖した。脈絡膜プレパラートを調製し、新血管形成について査定するように、フルオレセイン標識化バンディラマメ（Griffonia simplicifolia）レクチンＩ（ＧＳＬＩ）イソレクチンＢ４（ＦＬ－１２０１；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）で染色した。略述すると、プレパラートを、トリス緩衝生理食塩液（ＴＢＳ）で洗浄し、室温（ＲＴ）において、１０％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、ＴＢＳ ｐＨ７．４中に０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＴＢＳＴ）で、１時間にわたりブロッキングした。試料を、ＴＢＳで洗浄し、０．１％ ＴＢＳＴに希釈した１％ ＮＧＳ中で、フルオレセイン標識化イソレクチンＧＳ－ＩＢ４（１：２００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と、＋４℃で、一晩にわたりインキュベートした。その後、試料を、０．１％のＴＢＳＴ中で希釈された、１％のＮＧＳにより、１０分間ずつ、３回にわたり洗浄し、ＤＡＰＩで対比染色し、Ｆｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄ（商標）封入剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）により、顕微鏡用スライド上にマウントした。ＤＭｉ８ ＴＨＵＮＤＥＲ ３Ｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、脈絡膜試料をイメージングした。画像処理ソフトウェアであるＦＩＪＩを使用して、染色領域に輪郭線を引き、染色領域を測定した。（Schindelin et al. 2012）.
群１：ＲＣ２６８、ヌル、－２８日目における５×１０８、ＣＮＶの誘導；
群２：ＲＣ２８９、－２８日目における５×１０７、ＣＮＶの誘導；
群３：ＲＣ２８９、－２８日目における５×１０８、ＣＮＶの誘導；
群４：ＲＣ３０４、－２８日目における５×１０７、ＣＮＶの誘導；
群５：ＲＣ３０４、－２８日目における５×１０８、ＣＮＶの誘導；
群６：０日目における、ＣＮＶの誘導およびアフリベルセプト（眼１つ当たり８０μｇ）処置
ＣＮＶ漏出面積およびＣＮＶ病変サイズの定量
フルオレセイン血管造影（ＦＡ）：Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ ＨＲＡ ｓｙｓｔｅｍ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、脈絡膜レベルにおける血管漏出を精査した。略述すると、０．５％トロピカミド（Ｏｆｔａｎ Ｔｒｏｐｉｃａｍｉｄ、参天製薬）１滴を、瞳孔を散大させるために、麻酔下マウスの角膜に投与し、マウスを、マウス保持器に入れた。赤外線反射率カメラを使用して、視神経頭を、網膜レベルにアライメントした後で、２．５％のフルオレセインナトリウム溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を、ｓ．ｃ．注射（３０μｌ／１０ｇ）として投与した。フルオレセイン投与後、網膜レベルおよび脈絡膜焦点レベルにおいて、６０秒ごと、５分間にわたり、連続蛍光画像（感度：４５；ＡＲＴ（ａｌｇｅｂｒａｉｃ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）画像の平均値フレーム数：５フレーム）を撮影した。
スペクトラルドメイン光干渉断層法（ＳＤ－ＯＣＴ）：ＣＮＶ誘導の前後、ならびにＣＮＶの誘導後４および７日目に、ＳＤ－ＯＣＴを実施して、網膜下投与について検証した。ＦＡイメージングの直後に、ＳＤ－ＯＣＴシステムであるＥｎｖｉｓｕ Ｒ２２００ （Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ Ｉｎｃ．／Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を使用して、マウスを精査した。スキャン領域は、視神経近傍を中心とする、１．４×１．４ｍｍ２の網膜をカバーする。各スキャンは、各々が、１０００のＡスキャンから構成される、１００のＢスキャンから構成される。
ＣＮＶ漏出面積を、ＦＡ眼底イメージング、および後続の人工知能による画像解析により評価した。セマンティックセグメンテーションのためにデザインされた畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）と、従来のコンピュータ用視覚アルゴリズムとの組合せを使用する、独自開発アルゴリズムにより、ＦＡスキャンを解析した。転移学習法を使用して、ＣＮＶ病変を認識および定量するように、ニューラルネットワークをトレーニングした。モデルからの結果は、必要な場合、処置に対して盲検化された専門医により、再検討および調整された。
レーザー照射領域を、ＦＡスキャンにより、漏出ありまたは漏出なしとして、定性的に評定し、ＳＤ－ＯＣＴスキャンにより検証した。
データ解析
定量データをグラフ化し、解析し、平均値±標準偏差（ＳＤ）として提示した。統計学的解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖ８．０．１；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＵＳＡ）を使用して実施した。ｐ＜０．０５のレベルの差違を、統計学的に有意であると考えた。
結果を、図１６に示す。
上記明細書で言及された、全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の範囲および精神から逸脱しない限りにおいて、当業者には、開示される、本発明の薬剤、組成物、使用、および方法に対する、多様な改変および変動が明らかであろう。本発明は、特異的な好ましい実施形態との関連で開示されたが、特許請求される本発明は、このような特異的実施形態に、不当に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、当業者に明らかである、本発明を実行するための、開示された方式に対する、多様な改変は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。

Claims (29)

  1. （ｉ）抗ＶＥＧＦ実体と、（ｉｉ）負の補体調節因子とをコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチド。
  2. 前記抗ＶＥＧＦ実体が、Ｉｇ融合タンパク質、抗体、ポリペプチド、ペプチド、非抗体足場、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイド鎖、およびアプタマーから選択される、請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
  3. 前記抗ＶＥＧＦ実体が、アフリベルセプト、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、およびペガプタニブから選択される、請求項２に記載の単離ポリヌクレオチド。
  4. 前記抗ＶＥＧＦ実体が、アフリベルセプトであり、例えば、前記アフリベルセプトが、配列番号３～１１のうちのいずれか１つを含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項３に記載の単離ポリヌクレオチド。
  5. 前記負の補体調節因子が、補体Ｉ因子（ＣＦＩ）、補体ＦＨＬ１（ｆａｃｔｏｒ Ｈ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、補体Ｈ因子（ＣＦＨ）、１型補体受容体（ＣＲ１）、ＭＣＰ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、補体ＤＡＦ（ｄｅｃａｙ－ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、ＭＡＣ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｔｔａｃｋ ｃｏｍｐｌｅｘ）阻害性タンパク質（ＭＡＣ－ＩＰ）、Ｃ１阻害剤、アナフィラトキシン阻害剤、Ｃ４ｂ結合性タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、クラステリン、ビトロネクチン、またはこれらの変異体もしくは断片から選択される、請求項１から４のいずれかに記載の単離ポリヌクレオチド。
  6. 前記負の補体調節因子が、ＣＦＩおよびＦＨＬ１、またはこれらの変異体もしくは断片から選択される、請求項５に記載の単離ポリヌクレオチド。
  7. アフリベルセプトをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１１に対する、少なくとも７５％の配列同一性を有する、請求項３から６のいずれかに記載の単離ポリヌクレオチド。
  8. ＣＦＩをコードするヌクレオチド配列が、配列番号３５もしくは３６に対する、少なくとも７５％の配列同一性を有するか、またはＦＨＬ－１をコードするヌクレオチド配列が、配列番号４１に対する、少なくとも７５％の配列同一性を有する、請求項６または７に記載の単離ポリヌクレオチド。
  9. 配列番号４５～５４のヌクレオチド配列、またはこれに対する、少なくとも７５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項３から８のいずれかに記載の単離ポリヌクレオチド。
  10. ４．７ｋｂ以下である、請求項１から９のいずれかに記載の単離ポリヌクレオチド。
  11. 請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドを含むベクター。
  12. 任意選択で、ウイルスベクター粒子、好ましくは、ＡＡＶ２ゲノムと、ＡＡＶ２カプシドタンパク質またはＡＡＶ８カプシドタンパク質とを含むＡＡＶベクター粒子の形態にあるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１１に記載のベクター。
  13. 薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、請求項１から１２のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチドまたはベクターを含む医薬組成物。
  14. 治療における使用のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物。
  15. 眼の補体媒介性障害、例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病網膜症、緑内障、スターガルト病、中心性漿液性脈絡網膜症、色素性網膜炎、ポリープ状脈絡膜血管症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈分枝閉塞症、またはブドウ膜炎、好ましくは、ＡＭＤの処置または防止における使用のための、請求項１から１４のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物。
  16. ＡＭＤが、湿潤型ＡＭＤおよび／または乾燥型ＡＭＤである、請求項１５に記載の使用のための、単離ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物。
  17. ｉ）ＡＭＤが、湿潤型ＡＭＤであり、前記使用が、さらに、対象における乾燥型ＡＭＤの発症を防止および／もしくは処置するか、またはｉｉ）ＡＭＤが、乾燥型ＡＭＤであり、前記使用が、さらに、対象における湿潤型ＡＭＤの発症を防止および／もしくは処置するか、またはｉｉｉ）前記使用が、乾燥型ＡＭＤと、湿潤型ＡＭＤとを、同時に、防止および／もしくは処置する、請求項１５に記載の使用のための、単離ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物。
  18. ＡＭＤが、湿潤型ＡＭＤであり、前記使用が、さらに、対象における乾燥型ＡＭＤの発症を防止および／または処置する、請求項１７に記載の使用のための、単離ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物。
  19. （ｉ）地図状萎縮の形成が、防止もしくは軽減され、かつ／または地図状萎縮の量が、低減されるか、あるいは地図状萎縮の進行が、緩徐化されるか；
    （ｉｉ）対象の処置眼への投与後１２カ月間にわたり、同じ期間にわたる非処置眼と比べて、少なくとも１０％の、地図状萎縮面積の増大の低減がみられるか；あるいは
    （ｉｉｉ）前記単離ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物の投与が、対象、または対象の網膜色素上皮（ＲＰＥ）など、対象の眼における、Ｃ３ｂ不活化／ｉＣ３ｂ分解活性のレベルを、任意選択で対象またはその眼もしくはＲＰＥにおける正常レベルを超えるレベルへと、上昇させる、
    請求項１５から１８のいずれかに記載の使用のための、単離ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物。
  20. ｉ）新血管形成が、防止もしくは軽減され、ｉｉ）血管漏出が、防止もしくは軽減され、かつ／またはｉｉｉ）網膜浮腫が、防止もしくは軽減される、請求項１５から１９のいずれかに記載の使用のための、単離ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物。
  21. 例えば、網膜下注射、直接的な網膜内注射、脈絡膜上注射、または硝子体内注射により、眼内投与される、請求項１５から２０のいずれか一項に記載の使用のための単離ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物。
  22. ｉ）湿潤型ＡＭＤの処置における、同時的使用、別個の使用、もしくは逐次的使用であって、さらに、対象における乾燥型ＡＭＤの発症を、防止および／もしくは処置する使用；またはｉｉ）乾燥型ＡＭＤの処置における、同時的使用、別個の使用、もしくは逐次的使用であって、さらに、対象における湿潤型ＡＭＤの発症を防止および／もしくは処置する使用、またはｉｉｉ）乾燥型ＡＭＤと、湿潤型ＡＭＤとを、同時に、処置および／もしくは防止するための、同時的使用、別個の使用、もしくは逐次的使用のための組合せ調製物としての、（ｉ）抗ＶＥＧＦ実体；および（ｉｉ）負の補体調節因子、またはこれをコードするヌクレオチド配列を含む生成物。
  23. 湿潤型ＡＭＤの処置における、同時的使用、別個の使用、もしくは逐次的使用であって、さらに、対象における乾燥型ＡＭＤの発症を防止および／もしくは処置する使用のための、請求項２２に記載の使用のための生成物。
  24. 前記抗ＶＥＧＦ実体が、Ｉｇ融合タンパク質、抗体、ポリペプチド、ペプチド、非抗体足場、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイド鎖、およびアプタマーから選択され、好ましくは、前記抗ＶＥＧＦ実体が、アフリベルセプト、ラニビズマブ、ベバシズマブ、ブロルシズマブ、およびペガプタニブから選択される、請求項２２または２３に記載の使用のための生成物。
  25. 前記負の補体調節因子が、補体Ｉ因子（ＣＦＩ）、補体ＦＨＬ１（ｆａｃｔｏｒ Ｈ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、補体Ｈ因子（ＣＦＨ）、１型補体受容体（ＣＲ１）、ＭＣＰ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）、補体ＤＡＦ（ｄｅｃａｙ－ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、ＭＡＣ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｔｔａｃｋ ｃｏｍｐｌｅｘ）阻害性タンパク質（ＭＡＣ－ＩＰ）、Ｃ１阻害剤、アナフィラトキシン阻害剤、Ｃ４ｂ結合性タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、クラステリン、ビトロネクチン、またはこれらの変異体もしくは断片から選択され、好ましくは、前記負の補体調節因子が、ＣＦＩもしくはＦＨＬ１、またはこれらの変異体もしくは断片から選択される、請求項２２から２４のいずれかに記載の使用のための生成物。
  26. 医薬としての同時的使用、別個の使用、または逐次的使用のための組合せ調製物としての、（ｉ）抗ＶＥＧＦ実体；および（ｉｉ）Ｉ因子、またはこれをコードするヌクレオチド配列を含む生成物。
  27. 加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病網膜症、緑内障、スターガルト病、中心性漿液性脈絡網膜症、色素性網膜炎、ポリープ状脈絡膜血管症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈分枝閉塞症、またはブドウ膜炎などの補体媒介性眼障害、好ましくは、ＡＭＤの処置または防止における使用のための、請求項２６に記載の使用のための生成物。
  28. （ｉ）地図状萎縮の形成が、防止もしくは軽減され、かつ／または地図状萎縮の量が、低減されるか、あるいは地図状萎縮の進行が、緩徐化されるか；
    （ｉｉ）対象の処置眼への投与後１２カ月間にわたり、同じ期間にわたる非処置眼と比べて、少なくとも１０％の、地図状萎縮面積の増大の低減がみられるか；あるいは
    （ｉｉｉ）前記単離ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物の投与が、対象、または対象の網膜色素上皮（ＲＰＥ）など、対象の眼における、Ｃ３ｂ不活化／ｉＣ３ｂ分解活性のレベルを、任意選択で対象またはその眼もしくはＲＰＥにおける正常レベルを超えるレベルへと、上昇させる、
    請求項２２から２７のいずれかに記載の使用のための生成物。
  29. ｉ）新血管形成が、防止もしくは軽減され、ｉｉ）血管漏出が、防止もしくは軽減され、かつ／またはｉｉｉ）網膜浮腫が、防止もしくは軽減される、請求項２２から２８のいずれかに記載の使用のための生成物。
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