KR20230088630A - 항-vegf 엔티티 및 음성 보체 조절인자를 코딩하는 핵산 및 연령-관련 황반 변성의 치료를 위한 그의 용도 - Google Patents

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로렌스 탐
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Abstract

본 발명은 요법에서 동시, 별개 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서, (i) 항-VEGF 엔티티; 및 (ii) 음성 보체 조절인자, 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 생성물에 관한 것이다. 특히, 항-VEGF 엔티티는 항-VEGF 항체, 바람직하게는 아플리베르셉트이고, 음성 보체 조절인자는 보체 인자 I (CFI) 또는 보체 인자 H 유사 단백질 1 (FHL1)이다. 주요 용도는 눈 질환, 특히 연령-관련 황반 변성 (AMD)의 치료를 위한 것이다.

Description

항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자를 코딩하는 핵산 및 연령-관련 황반 변성의 치료를 위한 그의 용도
본 발명은 유전자 요법에 사용하기 위한 작용제에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자, 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 조합물, 및 보체-매개 눈 질환, 예컨대 연령-관련 황반 변성 (AMD)을 포함하는 보체-매개 및 보체-연관 장애의 치료 또는 에방에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다.
황반은 시신경에 인접한 대략 3 내지 5 밀리미터의 크기의 눈의 망막에 있는 작은 영역이다. 이는 망막의 가장 민감한 영역이며, 높은 시력을 허용하는 함몰된 영역인 중심와를 함유하고, 색각을 담당하는 광수용체인 농밀한 농도의 추체를 함유한다.
연령-관련 황반 변성 (AMD)은 50세 초과의 사람에 대해 선진국에서 기능적 실명의 가장 통상적인 원인이다 (Seddon, J.M., Epidemiology of age-related macular degeneration. In: Ogden, T.E., et al., eds. Ryan S.J., ed-in-chief. Retina Vol II. 3rd ed. St. Louis, Mo.: Mosby; 2001: 1039-1050). AMD의 습성 형태는 맥락막 혈관구조로부터 기원하고 망막하 공간 내로 연장하는 혈관신생과 연관된다. 또한, AMD는 망막, 망막 색소 상피 (RPE), 및 기저를 이루는 맥락막 (RPE 밑에, 망막 및 공막 사이에 놓인 고도로 혈관성 조직)의 진행성 변성을 특징으로 한다.
산화적 스트레스, 가능한 자가면역 성분으로의 염증, 유전적 배경 (예를 들어 돌연변이), 및 환경적 또는 행동적 인자, 예컨대 흡연 및 식이를 포함하는 다양한 인자는 AMD의 병인론에 기여할 수 있다.
AMD의 임상적 진행은 황반의 변화에 따른 단계에서 특징화된다. 초기 AMD의 특징은 망막 밑의 세포외 데브리스의 축적이며 임상 검사 동안 및 안저 사진 상에서 망막에서의 황색 점으로서 나타나는 드루센의 출현이다. 드루센은 크기에 의해 작은 (<63 μm), 중간 (63 내지 124 μm) 및 큰 (>124 μm) 것으로서 카테고리화된다. 이들은 또한 안과학적 검사시 그들의 가장자리의 외관에 따라 경성 또는 연성으로 간주된다. 경성 드루센은 명백하게 정의된 가장자리를 갖는 반면, 연성 드루센은 덜 정의된 유체성 가장자리를 갖는다. 연령-관련 눈 질환 연구 (AREDS) 안저 사진 중증도 스케일은 이 상태에 대해 사용되는 주요 분류 시스템 중 하나이다.
AMD는 "건성" 및 "습성" (삼출성 또는 혈관신생성) 형태로 분류되었다. 건성 AMD는 전형적으로 RPE 층에서의 세포의 진행성 아폽토시스, 위에 가로놓인 광수용체 세포, 및 빈번하게 또한 맥락막 모세혈관 층 중의 기저를 이루는 세포를 특징으로 한다. 위에 가로놓인 광수용체 위축을 동반하는 RPE 세포 사멸의 합류 영역은 지도형 위축으로 지칭되며, 이는 건성 AMD의 후기 진행성 단계를 나타낸다. AMD의 이 형태를 갖는 환자는 중심 시각에서 느리고 진행성인 악화를 경험한다.
습성 AMD는 갑작스럽고 장애를 초래하는 시각의 상실의 원인이 될 수 있는, RPE 밑의 및 황반에서의 망막하 공간 내로 맥락막 혈관 (맥락막모세혈관)으로부터 성장된 비정상적 혈관으로부터의 출혈 및/또는 유체의 누출을 특징으로 한다. 환자가 경험하는 많은 시각 상실은 이러한 맥락막 혈관신생 (CNV) 및 그의 2차 합병증에 기인한다고 추정되었다. 혈관신생성 AMD의 하위유형은 망막 혈관종 증식 (RAP)으로 용어화된다. 여기서, 혈관종 증식은 망막으로부터 기원하고, 망막하 공간 내로 후방으로 연장되어, 결국 일부 경우에 맥락막의 새로운 혈관과 통신한다. 폴립모양 맥락막 혈관병증 (PCV)은 또한 발생하는 것으로 공지되어 있다.
습성 AMD에 대한 현재의 치료 선택안은 원칙적으로 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 경로를 표적화하는 다수의 요법이다. 이러한 VEGF-표적화된 요법의 예는 압타머 페갑타닙 (N Engl J Med (2004) 351: 2805-2816) 및 항체, 예컨대 라니비주맙 (N Engl J Med (2006) 355: 1432-1444), 아플리베르셉트 (BMJ (2014) 98: i17-i21) 및 베바시주맙 (BMJ (2010) 340: c2459)을 포함한다. 그러나, 모든 환자가 항-VEGF 항체로의 치료에 반응하는 것은 아니며, 시각을 회복하지 않거나 등록된 실명으로 진행된다. 매월 치료로 달성된 시력 (VA) 획득의 증분적 감소는 또한 보고되었다 (Singer et al.; Ophthalmology; 2012; 119(6); 1175-83).
또한, 항-VEGF 요법 및 지도형 위축의 진행 사이의 연관을 지지하는 증거가 있다 (Gemenetza et al.; Eye; 2017; 31; 1-9, Enslow et al.; Ophthalmology and Eye Diseases; 2016; 8; 21-32 & Sadda et al.; Ophthalmology; 2020; 127(5); 648-659).
또한, 환자에 대한 약물 부담을 감소시키고 순응성 및/또는 부적당한 투여로의 문제를 다루기 위한 치료 전략에 대한 필요가 있다.
따라서, 눈 질환, 예컨대 AMD를 치료하기 위한 새로운 접근법에 대한 상당한 필요가 관련 기술분야에 있다.
발명의 요약
이론에 구애되기를 원하지는 않지만, 본 발명은 - 적어도 부분적으로 - 전형적으로 "습성" AMD와 연관된 표적화 메커니즘과 동시에 전형적으로 "건성" AMD와 연관된 기저를 이루는 메커니즘을 표적화하는 것이 유리할 수 있다는 통찰에 기반한다. 또한, 본 발명은 부분적으로 AMD의 한 형태의 치료 표적화가 어떻게 다른 것에 영향을 미칠 수 있는지의 고려에 기반한다.
제1 측면에서, 본 발명은 요법에서 동시, 별개 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서, (i) 항-VEGF 엔티티; 및 (ii) 음성 보체 조절인자, 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 생성물을 제공한다.
한 실시양태에서, 생성물은 이들 사이에서 (i) 항-VEGF 엔티티; 및 (ii) 음성 보체 조절인자를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
따라서 바람직한 실시양태에서, 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자를 코딩하는 비시스트론성 폴리뉴클레오티드이다.
특히, 본 출원인은 환자에의 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자 둘 다의 전달에 사용될 수 있는 벡터를 제공하였다. 특히, 본 출원인은 양호한 역가로 생산될 수 있고, 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자 둘 다를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 기능적 AAV 벡터를 성공적으로 디자인하였다.
항-VEGF 엔티티는 Ig 융합 단백질, 항체, 압타머, 폴리펩티드, 펩티드, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어 VEGF 유전자 서열 또는 그의 mRNA의 그것을 표적화하는 서열의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, CRISPRi 가이드가닥) 및 비-항체 스캐폴드로부터 선택될 수 있다. 적합하게는, 항-VEGF 엔티티는 아플리베르셉트, 라니비주맙, 베바시주맙, 브롤루시주맙 및 페갑타닙 또는 그의 단편 또는 변이체로부터 선택된다.
음성 보체 조절인자는 보체 인자 I (CFI), 보체 인자 H 유사 단백질 1 (FHL1), 보체 인자 H (CFH), 보체 수용체 유형 1 (CR1), 막 보조인자 단백질 (MCP), 보체 붕괴-가속화 인자 (DAF) 및 MAC-억제성 단백질 (MAC-IP), C1-억제제, 아나필라톡신 억제제, C4b 결합 단백질 (C4BP), 클루스테린, 비트로넥틴 또는 그의 단편 또는 변이체로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 CMV 프로모터 또는 닭 β-액틴 프로모터를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 바람직하게는, CMV 또는 CAG 프로모터는 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류이다. 닭 β-액틴 프로모터는 CMV 초기 인핸서와 조합으로 (즉, CAG 프로모터로서) 제공될 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 WPRE 조절 요소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 바람직하게는, WPRE 조절 요소는 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 하류이다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 폴리-A 신호를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 여기서 폴리-A 신호는 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 하류이다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 소 성장 호르몬 폴리-A 신호를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 여기서 소 성장 호르몬 폴리-A 신호는 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 하류이다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는
(a) CMV 프로모터 또는 CAG 프로모터 (여기서 CMV 프로모터 또는 CAG 프로모터는 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류임); 및
(b) 소 성장 호르몬 폴리-A 신호 (여기서 소 성장 호르몬 폴리-A 신호는 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 하류임)
를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는
(a) CMV 프로모터 또는 CAG 프로모터 (여기서 CMV 프로모터 또는 CAG 프로모터는 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류임);
(b) WPRE 조절 요소 (여기서 WPRE 조절 요소는 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 하류임); 및
(c) 소 성장 호르몬 폴리-A 신호 (여기서 소 성장 호르몬 폴리-A 신호는 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 하류임)
를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
WPRE 조절 요소는 WPRE3 조절 요소일 수 있다.
항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류이고, 여기서 항-VEGF 엔티티는 아플리베르셉트, 라니비주맙, 베바시주맙, 브롤루시주맙 및 페갑타닙 또는 그의 단편 또는 변이체로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류이고, 여기서 항-VEGF 엔티티는 아플리베르셉트 또는 그의 단편 또는 변이체이다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류이고, 여기서 음성 보체 조절인자는 CFI 또는 그의 변이체 또는 단편이다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류이고, 여기서 음성 보체 조절인자는 FHL1 또는 그의 변이체 또는 단편이다.
일부 실시양태에서, 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류이고, 여기서 항-VEGF 엔티티는 아플리베르셉트 또는 그의 단편 또는 변이체이고, 음성 보체 조절인자는 CFI 또는 그의 변이체 또는 단편이다.
일부 실시양태에서, 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류이고, 여기서 항-VEGF 엔티티는 아플리베르셉트 또는 그의 단편 또는 변이체이고, 음성 보체 조절인자는 FHL1 또는 그의 변이체 또는 단편이다.
음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류일 수 있다.
일부 실시양태에서, 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류이고, 여기서 항-VEGF 엔티티는 아플리베르셉트, 라니비주맙, 베바시주맙, 브롤루시주맙 및 페갑타닙 또는 그의 단편 또는 변이체로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류이고, 여기서 항-VEGF 엔티티는 아플리베르셉트 또는 그의 단편 또는 변이체이다. 일부 실시양태에서, 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류이고, 여기서 음성 보체 조절인자는 CFI 또는 그의 변이체 또는 단편이다. 일부 실시양태에서, 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류이고, 여기서 음성 보체 조절인자는 FHL1 또는 그의 변이체 또는 단편이다.
일부 실시양태에서, 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류이고, 여기서 항-VEGF 엔티티는 아플리베르셉트 또는 그의 단편 또는 변이체이고, 음성 보체 조절인자는 CFI 또는 그의 변이체 또는 단편이다.
일부 실시양태에서, 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류이고, 여기서 항-VEGF 엔티티는 아플리베르셉트 또는 그의 단편 또는 변이체이고, 음성 보체 조절인자는 FHL1 또는 그의 변이체 또는 단편이다.
일부 실시양태에서, 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 링커에 의해 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 푸린(Furin), GSG, 11aa1D 및 F2A 링커이다. 바람직한 실시양태에서, 링커는 자기-절단 2A 펩티드 서열, 예를 들어 P2A 또는 푸린 절단 부위, GSG, 11a1D 및 F2A 서열을 포함하거나 그에 의해 정의되는 서열을 함유한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역위 말단 반복부 (ITR)를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 2개의 AAV ITR을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 그의 5' 단부에 AAV ITR 및 그의 3' 단부에 AAV ITR을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는
(a) 5' AAV ITR;
(b) CMV 프로모터 또는 CAG 프로모터;
(c) 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(d) 링커 (임의로 여기서 링커는 푸린 절단 부위, GSG, 11a1D 및 F2A 서열을 포함함);
(e) 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(f) 폴리-A 신호, 바람직하게는 소 성장 호르몬 폴리-A 신호; 및
(g) 3' AAV ITR
을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는
(a) 5' AAV ITR;
(b) CMV 프로모터 또는 CAG 프로모터;
(c) 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(d) 링커 (임의로 여기서 링커는 푸린 절단 부위, GSG, 11a1D 및 F2A 서열을 포함함);
(e) 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(f) WPRE 조절 요소 (임의로 여기서 WPRE 조절 요소는 WPRE3 조절 요소임);
(g) 폴리-A 신호, 바람직하게는 소 성장 호르몬 폴리-A 신호; 및
(h) 3' AAV ITR
을 포함한다.
적합하게는 (c) 및 (e)에 의해 정의되는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드에서 상호간 위치에 있을 수 있다.
특히, 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는
(a) 5' AAV ITR;
(b) CMV 프로모터 또는 CAG 프로모터;
(c) 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(d) 링커 (임의로 여기서 링커는 푸린 절단 부위, GSG, 11a1D 및 F2A 서열을 포함함);
(e) 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(f) 폴리-A 신호, 바람직하게는 소 성장 호르몬 폴리-A 신호; 및
(g) 3' AAV ITR
을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는
(a) 5' AAV ITR;
(b) CMV 프로모터 또는 CAG 프로모터;
(c) 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(d) 링커 (임의로 여기서 링커는 푸린 절단 부위, GSG, 11a1D 및 F2A 서열을 포함함);
(e) 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(f) WPRE 조절 요소 (임의로 여기서 WPRE 조절 요소는 WPRE3 조절 요소임);
(g) 폴리-A 신호, 바람직하게는 소 성장 호르몬 폴리-A 신호; 및
(h) 3' AAV ITR
을 포함한다.
적합하게는, (b)가 CAG 프로모터를 포함하는 실시양태에서; (f)는 WPRE3 조절 요소일 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'의 순서로 (a) 내지 (g) 또는 (a) 내지 (h)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, AAV ITR은 AAV2 또는 AAV8 ITR이다. 바람직한 실시양태에서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다.
일부 실시양태에서, 항-VEGF 엔티티 및/또는 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된다. 일부 실시양태에서, 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된다. 바람직한 실시양태에서, 아플리베르셉트 및 CFI, FHL1 또는 CFH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된다.
일부 실시양태에서, 아플리베르셉트를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호(SEQ ID NO): 11과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.
바람직한 실시양태에서, 아플리베르셉트를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 11이다.
일부 실시양태에서, CFI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 35 또는 36과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.
바람직한 실시양태에서, CFI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 35 또는 36이다.
일부 실시양태에서, 아플리베르셉트를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 11이고, CFI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 35 또는 36이다.
일부 실시양태에서, FHL1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 41과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.
바람직한 실시양태에서, FHL1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 41이다.
일부 실시양태에서, 아플리베르셉트를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 11이고, FHL1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 41이다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 45의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 46의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 47의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 48의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 49의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 50의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 51의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 52의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 53의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 54의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5.2, 5.1, 5.0, 4.9, 4.8 또는 4.7 kb 이하이다. 바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 4.7 kb 이하이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 따라서 한 측면에 따르면, 본 발명은 (i) 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 (ii) 음성 보체 조절인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 바람직하게는 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자는 바람직하게는 비시스트론성 폴리뉴클레오티드인 동일한 폴리뉴클레오티드 상에 제공된다.
적합하게는, 본원에 사용된 비시스트론성 폴리뉴클레오티드는 각각 동일한 프로모터 영역에 작동가능하게 연결된 적어도 2개의 단백질 코딩 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있다. 적합하게는, 비시스트론성 폴리펩티드는 각각 동일한 프로모터 영역에 작동가능하게 연결된 2개의 단백질 코딩 영역을 포함할 수 있다.
적합하게는, 본 발명은 또한 그들 사이에 (i) 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 (ii) 음성 보체 조절인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 초과의 (예를 들어 2개의) 벡터를 제공한다.
일부 실시양태에서, 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스 또는 아데노바이러스 벡터이다.
바람직한 실시양태에서, 벡터는 AAV 벡터이다.
일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터 입자의 형태이다.
일부 실시양태에서, AAV 벡터 입자는 AAV2 또는 AAV8 게놈, 바람직하게는 AAV2 게놈을 포함한다.
일부 실시양태에서, AAV 벡터 입자는 AAV2 또는 AAV8 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 실시양태에서, AAV 벡터 입자는 AAV2 게놈 및 AAV2 캡시드 단백질을 포함한다 (AAV2/2). 바람직한 실시양태에서, AAV 벡터 입자는 AAV2 게놈 및 AAV8 캡시드 단백질을 포함한다 (AAV2/8).
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 벡터로 형질도입된 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포를 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 안구내 투여를 위한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 요법에 사용하기 위한 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 안구 장애를 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 눈의 보체-매개 장애를 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 눈의 보체-매개 장애를 치료하거나 예방하는 방법이며, 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물을 눈의 보체-매개 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자를 대상체에게 제공하는 방법이며, 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포를 대상체의 눈에 전달하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물은 보체-매개 장애, 특히 만성 염증성 상태 및 보다 더 특히, 보체 C3b 피드백 사이클의 과다활성과 연관된 것들의 치료에 사용된다.
일부 실시양태에서, 장애는 보체 C3b 피드백 사이클의 과다-활성 및/또는 C3b 분해 사이클의 과소-활성과 연관된다 (도 5 참조).
일부 실시양태에서, 장애는 연령-관련 황반 변성 (AMD) 또는 당뇨병성 망막병증이다. 다른 실시양태에서, 장애는 녹내장, 스타가르트병, 중심성 장액성 맥락망막병증, 색소성 망막염, 폴립모양 맥락막 혈관병증, 당뇨병성 황반 부종, 분지성 망막 정맥 폐색 또는 포도막염이다.
바람직한 실시양태에서, 장애는 AMD이다.
일부 실시양태에서, 장애는 습성 AMD 및/또는 건성 AMD이다. 일부 실시양태에서, 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물은 습성 AMD 및 건성 AMD를 동시에 치료하고/거나 예방하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, AMD는 습성 AMD이고, 본 발명에 따른 용도는 상기 대상체에서 건성 AMD의 발병을 추가로 예방하고/거나 치료한다. 일부 실시양태에서, AMD는 건성 AMD이고, 본 발명에 따른 용도는 상기 대상체에서 습성 AMD의 발병을 추가로 예방하고/거나 치료한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 AMD로 진단되었거나 또는 AMD에 걸릴 위험이 있다.
일부 실시양태에서, 용도는 대상체에서
(a) 눈 및/또는 혈청에서 정상 보체 인자 I 활성 또는 농도 미만을 갖는, 바람직하게는 혈청에서 0 내지 30, 0 내지 20 또는 0 내지 10 μg/mL의 농도, 또는 그와 등가의 활성을 갖는; 및/또는
(b) 연령-관련 황반 변성 (AMD)-연관 SNP, 바람직하게는 희귀한 보체 인자 I 및/또는 보체 인자 H 변이체에 대해 이형접합성 또는 동형접합성인
장애를 치료하거나 예방하기 위한 것이다.
일부 실시양태에서, 용도는 대상체에서
(a) 눈 및/또는 혈청에서 보체 인자 I 활성 또는 농도의 정상 수준, 바람직하게는 혈청에서 적어도 30 μg/mL, 예컨대 30 내지 40 μg/mL를 갖는; 및/또는
(b) 희귀한 보체 인자 I 변이체 대립유전자를 보유하지 않는
장애를 치료하거나 예방하기 위한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 당뇨병성 망막병증을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 지도형 위축의 형성이 예방되거나 감소되고/거나, 지도형 위축의 양이 감소된다.
일부 실시양태에서, 지도형 위축의 진행이 감속된다.
일부 실시양태에서, 대상체의 치료된 눈에의 투여 후 12개월에 걸쳐 동일한 기간에 걸쳐 비치료된 눈에 비해 지도형 위축 면적의 증가의 적어도 10% 감소가 있다. 다른 실시양태에서, 대상체의 치료된 눈에의 투여 후 12개월에 걸쳐 동일한 기간에 걸쳐 비치료된 눈에 비해 지도형 위축 면적의 증가의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소가 있다.
일부 실시양태에서, 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물의 투여는 대상체에서, 또는 대상체의 눈에서, 예컨대 망막 색소 상피 (RPE) 수양액 및/또는 유리액에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 임의로 대상체, 또는 그의 눈 또는 RPE에서의 정상 수준을 초과하는 수준으로 증가시킨다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 예를 들어 눈 장애, 예컨대 본원에 개시된 눈 장애를 앓고 있는 대상체에서 시각 또는 시력을 개선시키거나 복원하는 데 사용하기 위한 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 시각 또는 시력의 상실, 예를 들어 눈 장애, 예컨대 본원에 개시된 눈 장애와 연관된 시각 또는 시력의 상실을 완화시키는 데 사용하기 위한 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서, 예를 들어 눈 장애, 예컨대 본원에 개시된 눈 장애를 앓고 있는 대상체에서 읽기 속도를 개선시키거나 복원하는 데 사용하기 위한 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 읽기 속도의 감소, 예를 들어 눈 장애, 예컨대 본원에 개시된 눈 장애와 연관된 읽기 속도의 감소를 완화시키는 데 사용하기 위한 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 광수용체 및/또는 망막 색소 상피 (RPE)의 상실, 예를 들어 눈 장애, 예컨대 본원에 개시된 눈 장애와 연관된 광수용체 및/또는 RPE의 상실을 감소시키거나 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 눈 장애, 예컨대 본원에 개시된 눈 장애를 갖는 혈관신생, 혈관 누출 또는 망막 부종을 감소시키거나 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물은 안구내로 투여된다.
일부 실시양태에서, 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물은 망막하에, 망막에 직접, 맥락막상에 또는 유리체내 주사에 의해 대상체의 눈에 투여된다.
일부 실시양태에서, 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물은 망막하 주사에 의해 대상체의 눈에 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물은 전신적으로 투여되지 않는다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물은 정맥내로 투여되지 않는다.
도 1 - 예시적인 모노시스트론성 아플리베르셉트 벡터의 디자인 및 AAV 게놈 크기 (ITR-ITR)를 도시하는 개략도
도 2 - 상이한 코돈 최적화된 AAV2-벡터 사이의 아플리베르셉트 발현의 비교. 데이터는 2회의 독립적 실험을 나타낸다.
도 3 - 형질도입 후 72시간에 배양된 상청액에서의 아플리베르셉트 단백질 발현을 예시하는 (A) 비-환원 및 (B) 환원 조건 하에서 수행된 웨스턴 블롯의 대표적인 화상. (C) 2회의 독립적 실험으로부터의 비-환원 및 환원 조건 하에서의 아플리베르셉트 발현의 농도계측 분석
도 4 - 음성 보체 조절인자 및 아플리베르셉트를 발현하는 예시적인 비시스트론성 벡터의 디자인을 예시하는 개략도
도 5 - 척추동물 보체의 대안적인 경로의 C3b 피드백 (증폭) 및 분해 (하향-조절) 사이클 ("I" = 보체 인자 I; "H" = 보체 인자 H; "B" = 보체 인자 B; 및 "D" = 보체 인자 D).
도 6 - CNV의 마우스 모델에서의 CFI (GT005) 또는 FHL1 (RC001)을 발현하는 모노시스트론성 벡터의 투여
도 7 - HEK293 세포에서의 비시스트론성 벡터 발현의 비교. (A) 아플리베르셉트 및 CFI의 AAV8 비시스트론성 발현; (B) 5e3의 MOI에서의 아플리베르셉트 (좌측 막대) 및 CFI (우측 막대)의 AAV2 비시스트론성 발현; (C) 아플리베르셉트 및 FHL-1의 AAV8 비시스트론성 발현 및 (D) 5e3의 MOI에서의 아플리베르셉트 (좌측 막대) 및 FHL-1 (우측 막대)의 AAV2 비시스트론성 발현; (E) 아플리베르셉트 및 CFI의 AAV8 비시스트론성 발현; (F) 아플리베르셉트 및 FHL-1의 AAV8 비시스트론성 발현의 대표적인 발현 수준.
도 8 - 비-환원 조건 하에서의 비시스트론성 벡터로부터의 단백질 발현을 제시하는 웨스턴 블롯 분석.
도 9 - 아플리베르셉트의 결합 친화도. 고정된 농도의 인간 VEGFA와 다양한 농도의 벡터 유래 아플리베르셉트의 인큐베이션 후 비결합된 VEGFA를 측정하는 결합 검정을 사용함으로써 결정된 바와 같은, VEGFA에 대한 모노시스트론성 및 비시스트론성 벡터에 의해 발현된 아플리베르셉트의 친화도. Kd 곡선으로부터 유래된 아일리아(Eylea)®의 IC50 값 = 2.3 nM
도 10 - 아플리베르셉트의 억제 특성. 고정된 농도의 VEGFA의 존재 하에서의 다양한 농도의 벡터 유래 아플리베르셉트를 사용한 HUVEC 세포의 VEGFA-유도 증식의 억제.
도 11 - CFI 및 FHL1에 대한 C3b 절단 검정은 비시스트론성 벡터로부터 발현된 CFI 및 FHL1이 기능적이고, C3b의 iC3b로의 분해를 용이하게 할 수 있음을 입증하였다.
도 12 - 아플리베르셉트 mRNA 발현 - 모노시스트론성 아플리베르셉트 (마우스). 항-VEGF (아플리베르셉트)를 발현하는 AAV8 (모노시스트론성) 벡터를 9-주령 수컷 마우스의 우측 눈 내로 망막하로 투여하였다. 트랜스진-유래 mRNA를 역전사 및 qRT-PCR에 의해 정량화하였다.
도 13 - 아플리베르셉트 단백질 발현 - 모노시스트론성 아플리베르셉트 (마우스). 항-VEGF (아플리베르셉트)를 발현하는 AAV8 (모노시스트론성) 벡터를 9-주령 수컷 마우스의 우측 눈 내로 망막하로 투여하였다. 안구 유체에서의 비결합된 아플리베르셉트를 정량적 샌드위치 유형 ELISA를 사용하여 측정하였다.
도 14 - 아플리베르셉트 mRNA 발현 - 비시스트론성 후보 (마우스). 항VEGF (아플리베르셉트) 및 보체 조절인자 (hCFI 또는 FHL-1)를 공동-발현하는 비시스트론성 AAV 벡터를 10-주령 수컷 마우스의 우측 눈 (OD) 내로 망막하로 투여하였다. 트랜스진-유래 mRNA를 역전사 및 qRT-PCR에 의해 정량화하였다.
도 15 - 아플리베르셉트, CFI 및 FHL-1 단백질 발현 (비시스트론성 벡터). 항VEGF (아플리베르셉트) 및 보체 조절인자 (hCFI 또는 FHL-1)를 공동-발현하는 비시스트론성 AAV 벡터를 10-주령 수컷 마우스의 우측 눈 (OD) 내로 망막하로 투여하였다. 안구 유체에서의 비결합된 아플리베르셉트를 정량적 샌드위치 유형 ELISA를 사용하여 측정하였다. 안구 유체에서의 인간 CFI 및 FHL-1을 MSD의 전자화학발광 검출 기술을 사용하여 정량화하였다.
도 16 - 뮤린 레이저-유도 맥락막 혈관신생 모델에서의 생체내 효능. 마우스의 5개의 그룹은 상이한 AAV 벡터의 일방 (우측 눈) 망막하 주사를 받았다. 벡터의 투여 후 4주에, CNV가 레이저 광응고에 의해 유도되었다. 마우스를 레이저화 후 제4일 및 제7일에 화상화하고, 이어서 희생시켰다. (A) CNV 누출 면적 및 (B) CNV 병변 크기의 정량을 수행하였다.
본원에 사용된 용어 "포함하는(comprising)", "포함하다(comprises)" 및 "구성된(comprised of)"은 "포함하는(including)" 또는 "포함하다(includes)"; 또는 "함유하는" 또는 "함유하다"와 동의어이고, 포함적 또는 개방-단부이며, 추가의 비-나열된 구성원, 요소 또는 단계를 배제하지 않는다. 용어 "포함하는(comprising)", "포함하다(comprises)" 및 "구성된(comprised of)"은 또한 용어 "이루어진"을 포함한다.
VEGF
혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 혈관의 형성을 자극하는 세포에 의해 생산되는 강력한 혈관형성 단백질이다. VEGF는 성장 인자의 서브-패밀리, 시스틴-매듭 성장 인자의 혈소판-유래 성장 인자 패밀리이다. 이들은 맥관형성 (배아 순환계의 신생 형성) 및 혈관형성 (기존의 혈관구조로부터의 혈관의 성장) 둘 다에 관여한다.
포유동물에서, VEGF 패밀리는 5개의 구성원을 포함한다: VEGF-A, 태반 성장 인자 (PGF), VEGF-B, VEGF-C 및 VEGF-D.
적합하게는, 본원에서 지칭된 VEGF는 VEGF-A일 수 있다.
단일, 8-엑손 VEGFA 유전자로부터의 mRNA의 대체 스플라이싱으로부터 초래되는 VEGF-A의 다수의 이소형이 있다. 이들은 그들의 말단 엑손 (엑손 8) 스플라이스 부위에 따라 지칭되는 2개의 그룹으로 분류된다: 근위 스플라이스 부위 (VEGFxxx로 나타내어짐) 또는 원위 스플라이스 부위 (VEGFxxxb). 또한, 엑손 6 및 7의 대체 스플라이싱은 그들의 헤파린-결합 친화도 및 아미노산 수를 변경시킨다 (인간에서: VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF189, VEGF206; 이들 단백질의 설치류 이종상동체는 하나 더 적은 아미노산을 함유함). 이들 도메인은 VEGF 스플라이스 변이체에 대한 중요한 기능적 결과를 갖는데, 이는 말단 (엑손 8) 스플라이스 부위가 단백질이 혈관형성 촉진성 (혈관형성 동안 발현되는 근위 스플라이스 부위, VEGFxxx)인지 또는 항-혈관형성성 (정상 조직에서 발현되는 원위 스플라이스 부위, VEGFxxxb)인지 여부를 결정하기 때문이다. 또한, 엑손 6 및 7의 포함 또는 배제는 세포 표면 상의 헤파린 술페이트 프로테오글리칸 (HSPG) 및 뉴로필린 공-수용체와의 상호작용을 매개하여, VEGF 수용체 (VEGFR)에 결합하고 이를 활성화시키는 그들의 능력을 증진시킨다.
VEGF는 3가지 수용체 티로신 키나제의 패밀리와 상호작용한다: VEGFR1 (VEGF 수용체 1), VEGFR2, 및 VEGFR3. VEGFA 및 VEGFB는 VEGFR1에 결합하고, VEGFA는 VEGFR2에 결합하고, VEGFC 및 VEGFD는 VEGFR2 및 VEGFR3 둘 다에 결합한다. 태반 성장 인자 (PGF)는 주로 VEGFR1과 상호작용한다. VEGFR은 폭넓게 다양한 세포 유형 상에서 발견된다. Flt-1 (fms-유사 티로신 키나제 1)로도 지칭되는 VEGFR1은 혈관 내피 세포, 조혈 줄기 세포, 단핵구, 및 대식세포 상에서 발견된다. KDR (키나제 삽입 도메인) 또는 Flk-1 (태아 간 키나제 1)로도 지칭되는 VEGFR2는 혈관 및 림프 내피 세포 상에서 발현되고; VEGFR3 (Flt-4로도 지칭됨)은 림프 내피 세포에 제한된다. 리간드 결합시, VEGFR은 다양한 매개인자를 통해 세포내 신호를 전달한다. 가장 잘 특징화된 VEGFR2의 경우, 이들은 포스포티딜이노시톨-3 키나제 (PI3K)/Akt, 미토겐-활성화된 키나제, 비수용체 티로신 키나제 Src, 뿐만 아니라 PLCγ (포스포리파제 C 감마)/PKC (단백질 키나제 C)를 포함하며, 이는 혈관형성, 림프형성, 혈관 침투성, 및 혈관 항상성을 촉진시킨다.
VEGF-A는 당뇨병성 망막병증 (DR)의 병인학에 있어서 중요하다. 당뇨병을 갖는 사람의 망막에서의 미세순환 문제는 망막 허혈을 유발할 수 있으며, 이는 VEGF-A의 방출, 및 정상적으로 발현된 항-혈관형성성 VEGF 이소형에 비해 혈관형성 촉진성 VEGF 이소형의 균형의 전환을 발생시킨다. 혈관형성 촉진성 VEGF는 이어서 망막에서 및 눈 중의 다른 곳에서 새로운 혈관의 생성을 유발하여, 시각에 영향을 미칠 수 있는 변화를 예고할 수 있다.
VEGF-A는 또한 산업화된 세계의 노인에 대한 실명의 선도적 원인인 습성 형태 연령-관련 황반 변성 (AMD)의 질환 병리학에 있어서 중요하다. AMD의 혈관 병리학은 당뇨병성 망막병증과 특정 유사성을 공유하지만, 질환의 원인 및 혈관신생의 전형적인 근원은 2가지 질환 사이에 상이하다.
본원에 사용된 항-VEGF 엔티티는 VEGF의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있는 임의의 엔티티를 지칭할 수 있다.
명백할 것인 바와 같이, 항-VEGF 엔티티는 VEGF의 하나 이상의 혈관형성 촉진성 이소형, 특히 VEGF-A의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있을 것이다.
적합하게는, VEGF는 VEGFA, VEGFB 및/또는 PGF일 수 있다.
적합하게는, VEGF는 VEGFA, VEGFB 및 PGF일 수 있다.
항-VEGF 엔티티는 하기 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다: 항체, Ig 융합 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA), 소분자, 비-항체 스캐폴드, 압타머, 또는 이들의 조합.
본원에 사용된 항체는 전체 항체 및 그의 항체 단편 둘 다를 포괄하는 것으로 의도된다. 적합하게는 항체는 모노클로날 및 폴리클로날 항체, 키메라, CDR-그라프팅된 및 인간화 항체를 포함하는 조작된 항체, 단일-쇄 항체, 항체 단편 및 파지 제시 또는 대안적인 기술을 사용하여 생산된 인공적으로 선택된 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
선택된 표적에 결합할 수 있는 적합한 항체 단편은 Fv, ScFv, F(ab') 및 F(ab')2를 포함한다. 또한, 고전적인 항체에 대한 대안, 예를 들어 "아비바디", "아비머", "안티칼린", "나노바디" 및 "DARPin"은 또한 본 발명에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "scFv" 또는 "단일-쇄 가변 단편"에 대한 언급은 항체의 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL)가 유연성 올리고펩티드를 통해 연결된 분자를 포함한다. 따라서 scFv는 적어도 하나의 가변 중쇄 및 적어도 하나의 가변 경쇄 사이의 융합물이다.
명백할 것인 바와 같이, 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자가 단리된 폴리뉴클레오티드로서 제공되는 실시양태에서, 항-VEGF 엔티티는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있는 엔티티일 것이다. 예를 들어, 항-VEGF 엔티티는 Ig 융합 단백질, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 폴리펩티드, 펩티드, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어 VEGF 유전자 서열 또는 그의 mRNA의 그것을 표적화하는 서열의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, CRISPRi 가이드가닥), 비-항체 스캐폴드, 또는 압타머일 수 있다.
항-VEGF 엔티티는 하나 이상의 VEGF 및/또는 하나 이상의 VEGF 수용체에 결합함으로써 작용할 수 있다.
항-VEGF 엔티티는 VEGF의 증식 촉진성 및/또는 혈관형성 촉진성 활성을 감소시킬 수 있다.
예로서, 항-VEGF 엔티티는 VEGF 의존성 세포주의 증식을 감소시킬 수 있다. 적합한 세포주는 내피 세포, 예컨대 문헌 [Wentink et al. (Br J Cancer; 2016; 115(8); 940-948)]에 의해 기재된 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) 및 Ba/F3-VEGFR2 세포주를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
항-VEGF 엔티티는 VEGF 의존성 세포주의 증식을 항-VEGF 엔티티의 부재 하에서의 증식에 비해 적어도 1배 (적합하게는, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 4배 또는 적어도 5배) 감소시킬 수 있다. 항-VEGF 엔티티는 VEGF 의존성 세포주의 증식을 항-VEGF 엔티티의 부재 하에서의 증식에 비해 적어도 10% (적합하게는, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 150% 또는 적어도 200%) 감소시킬 수 있다.
항-VEGF 엔티티는 아플리베르셉트, 라니비주맙, 베바시주맙 및 페갑타닙 또는 그의 단편 또는 변이체로부터 선택될 수 있다.
항-VEGF 엔티티는 아플리베르셉트, 라니비주맙 및 페갑타닙 또는 그의 단편 또는 변이체로부터 선택될 수 있다.
항-VEGF 엔티티는 아플리베르셉트 및 라니비주맙 또는 그의 단편 또는 변이체로부터 선택될 수 있다.
항-VEGF 엔티티는 아플리베르셉트 또는 그의 단편 또는 변이체일 수 있다.
항-VEGF 엔티티는 라니비주맙 또는 그의 단편 또는 변이체일 수 있다.
항-VEGF 엔티티는 베바시주맙 또는 그의 단편 또는 변이체일 수 있다.
항-VEGF 엔티티는 페갑타닙 또는 그의 단편 또는 변이체일 수 있다.
항-VEGF 엔티티는 아플리베르셉트일 수 있다. 아플리베르셉트는 순환 VEGF에 결합하고, "VEGF 트랩"으로서 작용한다. 이는 그에 의해 VEGF 하위유형 VEGF-A 및 VEGF-B, 뿐만 아니라 PGF의 활성을 억제한다. 아플리베르셉트는 인간 이뮤노글로불린 감마 1 (IgG1)의 Fc 영역과 융합된 VEGFR1 및 VEGFR2의 결합 도메인으로 구성된 재조합 단백질이다. 구조적으로, 아플리베르셉트는 96.9 kDa의 단백질 분자량을 갖는 이량체성 당단백질이다.
예시적인 아플리베르셉트 아미노산 서열은 서열식별번호: 1로서 제시된다.
Figure pct00001
아플리베르셉트 아미노산 서열은 서열식별번호: 1로서 제시된 서열을 포함할 수 있다. 변이체는 서열식별번호: 1과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 단편 또는 변이체는 서열식별번호: 1로서 제시된 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
아플리베르셉트 아미노산 서열은 서열식별번호: 2 내지 11로서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
Figure pct00002
일부 실시양태에서, 본 발명에 사용되는 아플리베르셉트 (또는 임의의 다른 항-VEGF 엔티티)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화된다. 상이한 세포는 특정 코돈의 그들의 사용빈도에 있어서 상이하다. 이 코돈 편향은 세포 유형에서의 특정 tRNA의 상대 풍부도의 편향에 상응한다. 서열에서 코돈을 이들이 상응하는 tRNA의 상대 풍부도와 매칭하게 맞추어지도록 변경시킴으로써, 발현을 증가시키는 것이 가능하다. 동일한 이유로, 상응하는 tRNA가 특정 세포 유형에서 희귀한 것으로 공지되어 있는 코돈을 의도적으로 선택함으로써 발현을 감소시키는 것이 가능하다. 따라서, 추가의 정도의 번역 제어가 이용가능하다.
아플리베르셉트를 코딩하는 예시적인 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 3 내지 11로서 제시된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
바람직하게는, 아플리베르셉트 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 11 또는 그의 변이체이다.
일부 실시양태에서, 아플리베르셉트를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 2 내지 11 중 임의의 것, 바람직하게는 서열식별번호: 11과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질은 서열식별번호: 1에 의해 나타내어진 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
라니비주맙은 VEGFA에 대한 모노클로날 항체 단편 (Fab)이다. 적합하게는, 라니비주맙 폴리펩티드는 각각 서열식별번호: 12 및 13로서 제시된 중쇄 및 경쇄 가변 서열을 포함할 수 있다. 상보성 결정 영역 (CDR)은 각각의 서열에서 밑줄로 제시된다.
Figure pct00007
라니비주맙 중쇄 및 경쇄 가변 서열은 서열식별번호: 12 또는 13로서 제시된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 변이체는 서열식별번호: 12 또는 13과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 단편 또는 변이체는 서열식별번호: 12 및 13로서 제시된 중쇄 및 경쇄 가변 서열의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
라니비주맙 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 단리된 폴리뉴클레오티드에서 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 또는 자기-절단 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 서로로부터 분리될 수 있다.
라니비주맙 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 예는 각각 서열식별번호: 14 및 15로서 제시된다.
Figure pct00008
라니비주맙을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 AAV 벡터의 예는 예를 들어 WO2019/164854에 의해 제공된다.
베바시주맙은 VEGFA에 대한 모노클로날 항체이다. 적합하게는, 베바시주맙 폴리펩티드 서열은 각각 서열식별번호: 16 및 17로서 제시된 중쇄 및 경쇄 서열을 포함할 수 있다. 상보성 결정 영역 (CDR)은 각각의 서열에서 밑줄로 제시된다.
Figure pct00009
베바시주맙 중쇄 및 경쇄 서열은 서열식별번호: 16 또는 17로서 제시된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 변이체는 서열식별번호: 16 또는 17과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 단편 또는 변이체는 서열식별번호: 16 및 17로서 제시된 중쇄 및 경쇄 서열의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
베바시주맙 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 예는 각각 서열식별번호: 18 및 19로서 제시된다.
Figure pct00010
베바시주맙 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 단리된 폴리뉴클레오티드에서 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 동일한 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 또는 자기-절단 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 서로로부터 분리될 수 있다.
페갑타닙은 VEGF(165) 이소형에 대해 특이적인 RNA 압타머이다. 페가타닙에 대한 RNA 서열은 서열식별번호: 20으로서 제시된다.
Figure pct00011
페갑타닙 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 20으로서 제시된 서열을 포함할 수 있다. 변이체는 서열식별번호: 20과 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게는, 단편 또는 변이체는 서열식별번호: 20으로서 제시된 폴리뉴클레오티드의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
페갑타닙을 코딩하는 예시 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 21로서 제시된다.
Figure pct00012
신호 펩티드
항-VEGF 엔티티를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 세포로부터의 항-VEGF 엔티티의 분비를 허용하는 신호 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다.
신호 펩티드는 짧은 펩티드이고, 통상적으로 5 내지 30개의 아미노산의 길이이고, 전형적으로 분비 경로를 향해 예정된 대다수의 새롭게 합성된 단백질의 N-말단에 존재한다. 이들 단백질은 특정 세포기관 (예를 들어, 세포질 세망, 골지체 또는 엔도솜) 내부에 거주하는 것들, 세포로부터 분비되는 것들, 및 막횡단 단백질을 포함한다.
신호 펩티드는 통상적으로 단일 알파-나선을 형성하는 경향성을 갖는 소수성 아미노산의 긴 스트레치인 코어 서열을 함유한다. 신호 펩티드는 전위 동안 폴리펩티드의 적절한 위상을 시행하는 것을 돕는 아미노산의 짧은 양으로 하전된 스트레치로 시작할 수 있다. 신호 펩티드의 단부에는 전형적으로 신호 펩티다제에 의해 인식되고 절단되는 아미노산의 스트레치가 있다. 신호 펩티다제는 전위의 완결 동안 또는 후에 절단되어 유리 신호 펩티드 및 성숙 단백질을 생성할 수 있다. 유리 신호 펩티드는 이어서 특이적 프로테아제에 의해 소화된다.
신호 펩티드는 통상적으로 분자의 아미노 말단에 위치되지만, 일부 카르복시-말단 신호 펩티드가 공지되어 있다.
신호 서열은 전형적으로 n- 및 c-영역에 의해 플랭킹된 소수성 코어 영역 (h-영역)으로 이루어진 3부분 구조를 갖는다. 후자는 신호 펩티다제 (SP아제) 컨센서스 절단 부위를 함유한다. 통상적으로, 신호 서열은 공동-번역적으로 절단되며, 생성된 절단된 신호 서열은 신호 펩티드로 용어화된다.
신호 서열은 소프트웨어 기술을 사용하여 검출되거나 예측될 수 있다 (예를 들어, http://www.predisi.de/ 참조). 다수의 신호 서열이 공지되어 있으며, 데이터베이스에서 이용가능하다. 예를 들어, http://www.signalpeptide.de는 그의 데이터베이스에 2109개의 확인된 포유동물 신호 펩티드를 열거한다.
적합하게는, 신호 펩티드는 CFH 신호 펩티드일 수 있다.
CFH 신호 펩티드를 코딩하는 예시적인 폴리뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 22 내지 31로서 제시된다.
Figure pct00013
보체계
보체계는 체액성 면역계의 필수적인 부분이며, 조직 염증, 세포 옵소닌화, 및 세포용해에 관여한다. 이는 미생물에 대한 보호를 제공하고, 숙주 조직으로부터의 외인성 및 내인성 세포 데브리스의 청소를 매개한다.
보체계 캐스케이드는 3개의 활성화 경로로 구성된다. 모든 경로는 궁극적으로 C3 인자의 중심 절단에서 및 그의 활성 단편 C3a 및 C3b의 생성에서 끝난다. C3a는 다양한 화학주성 및 염증촉진성 반응, 예컨대 염증 세포의 동원 및 증가된 미세혈관구조 침투성을 촉발시키는 아나필라톡신인 반면, C3b는 C3b에 공유 부착된 외래 표면의 옵소닌화를 담당한다. 활성화된 C3 단편 (C3b 및 iC3b)으로의 옵소닌화는 3가지 주요 기능을 수행한다: (i) 포식성 세포 (예를 들어 대식세포 또는 소교세포)에 의한 세포 데브리스 제거 및 적응성 면역계 (B 및 T 세포)의 자극; (ii) 표면-결합된 C3 컨버타제의 형성을 통한 보체 활성화의 증폭; 및 (iii) C5 컨버타제의 어셈블리.
C5 컨버타제의 어셈블리는 C5 절단을 담당하며, 이는 세포막에서 천공을 생성할 수 있는 세포용해성 막 공격 복합체 (MAC)의 형성을 발생시키고, 그에 의해 세포 용해 및 불필요한 세포의 제거를 촉진시킨다. 모든 이들 활성을 통해, 선천 보체 캐스케이드는 숙주 조직의 완전성을 보호하는 면역계의 하류 메커니즘의 기능을 지지하고 촉진시킨다. 전체적으로, 보체계 경로 활성화는 세포 용해를 매개하는 MAC 생성, 염증 세포를 손상의 부위로 유인하는 케모카인의 방출, 및 침윤 백혈구의 혈관외유출을 촉진시키는 모세혈관 침투성의 증진을 포함하는 염증촉진성 반응을 발생시킨다. 생리학적 조건 하에서, 보체 활성화는 가용성 및 막-연관 보체 조절 분자 (CRM)의 조화된 작용에 의해 효과적으로 제어된다. 가용성 보체 조절인자, 예컨대 C1-억제제, 아나필라톡신 억제제, C4b 결합 단백질 (C4BP), 보체 인자 H (CFH), 보체 인자 I (CFI), 클루스테린 및 비트로넥틴은 캐스케이드 반응의 다수의 부위에서 인간 조직에서 보체의 작용을 제한한다. 또한, 각각의 개별적 세포는 표면 단백질, 예컨대 보체 수용체 1 (CR1, CD35), 막 보조인자 단백질 (MCP, CD46), 및 글리코실포스파티딜이노시톨-고착된 단백질, 예컨대 붕괴-가속화 인자 (CD55) 또는 CD59 분자에 의해 상동성 보체의 공격에 대해 보호된다. 특히, 보체 공격으로부터 부적당하게 보호된 숙주 세포 및 조직은 구경꾼 세포 용해로 처리될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 눈의 보체-매개 장애의 치료 또는 예방에 관한 것이다. 예를 들어, 보체-매개 장애는 대안적인 경로 조절에서의 결함과, 및 특히 보체 C3b 피드백 사이클의 과다-활성 및/또는 C3b 분해 사이클의 과소-활성과 연관된 장애일 수 있다.
본 발명은 음성 보체 조절인자의 용도를 포함한다. 음성 보체 조절인자는 캐스케이드 반응의 하나 이상의 부위에서 보체의 작용을 제한하는 엔티티를 지칭할 수 있다. 예로서, 음성 보체 조절인자는 C1-억제제, 아나필라톡신 억제제, C4b 결합 단백질 (C4BP), 보체 인자 H (CFH), 인자 H 유사 단백질 1 (FHL1), 보체 인자 I (CFI), 클루스테린 또는 비트로넥틴일 수 있다. 음성 보체 조절인자는 또한 상동성 보체의 공격에 대해 세포를 보호할 수 있는 표면 단백질; 예를 들어 보체 수용체 1 (CR1, CD35), 막 보조인자 단백질 (CD46), 및 글리코실포스파티딜이노시톨-고착된 단백질, 예컨대 붕괴-가속화 인자 (CD55) 또는 CD59 분자일 수 있다.
적합하게는, 음성 보체 조절인자는 보체 활성화 캐스케이드의 성분의 억제제, 예를 들어 보체 C3b 피드백 사이클의 억제제일 수 있다.
음성 보체 조절인자는 CFI, FHL1, CFH, CR1 및 MCP 또는 그의 변이체 또는 단편으로부터 선택될 수 있다.
음성 보체 조절인자는 CFI, FHL1 및 CFH 또는 그의 변이체 또는 단편으로부터 선택될 수 있다.
음성 보체 조절인자는 CFI 또는 그의 변이체 또는 단편일 수 있다.
음성 보체 조절인자는 FHL1 또는 그의 변이체 또는 단편일 수 있다.
음성 보체 조절인자는 CFH 또는 그의 변이체 또는 단편일 수 있다.
음성 보체 조절인자는 CR1 또는 그의 변이체 또는 단편일 수 있다.
음성 보체 조절인자는 MCP 또는 그의 변이체 또는 단편일 수 있다.
적합하게는, 생성물은 하나 이상의 음성 보체 조절인자를 포함할 수 있다.
적합하게는, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 음성 보체 조절인자를 코딩할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물의 투여 전에, 대상체는 보체 인자 I 활성의 낮은 수준 (예를 들어 정상 수준 미만), 예를 들어 눈에서 보체 인자 I 활성의 낮은 수준 및/또는 보체 인자 I 활성의 낮은 혈청 수준을 갖는다. 보체 인자 I 활성의 정상-이하 수준은 정상적으로-기능하는 보체 인자 I의 정상-이하 발현, 또는 보체 인자 I의 비- 또는 하위-기능적 변이체의 적어도 부분적 (예를 들어 이형접합성) 발현 (정상 또는 정상-이하 수준에서)에 기인할 수 있다. (이러한 대상체는 AMD-연관 SNP의 하나 이상의 카피를 보유할 수 있으며, 예를 들어 대상체는 하기에 추가로 논의되는 희귀한 보체 인자 I 변이체 중 하나에 대해 동형- 또는 이형접합성일 수 있음). 따라서, 대상체는 눈 및/또는 혈청에서 보체 인자 I의 낮은 농도 (예를 들어 정상 농도 미만)를 가질 수 있다. 인간 대상체에 대해, 보체 인자 I 활성 (C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성)의 정상 수준은 대상체의 혈청에서 30 내지 40 μg/mL 보체 인자 I에 의해 제공된 것과 등가일 수 있다. 따라서, 낮은 보체 인자 I 활성을 갖는 대상체에서, 혈청에서의 보체 인자 I 활성은 30 μg/mL 미만 및 0 μg/mL 초과의 보체 인자 I, 예컨대 0 내지 20 또는 0 내지 10 μg/mL에 상응할 수 있다 (이들은 낮은 보체 인자 I 농도를 갖는 대상체를 포괄할 수 있는 보체 인자 I 혈청 농도의 범위임).
따라서, 본 발명에 의해 치료되는 대상체는 눈의 보체-매개 장애, 예컨대 AMD를 앓고 있을 수 있거나, 이러한 장애를 발달시킬 위험이 있을 수 있다. AMD는 습성 AMD 및/또는 건성 AMD일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 보체-매개 장애와 연관된 하나 이상의 SNP에 대해 감수성인 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 AMD를 발달시킬 위험이 있다. 예를 들어, 대상체는 AMD와 연관된 하나 이상의 SNP, 예를 들어 통상적으로 감소된 혈청 보체 인자 I 수준을 발생시키는 진행성 AMD와 연관된 보체 인자 I에서의 희귀한 돌연변이에 대해 감수성인 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다 (Kavanagh et al. (2015) Hum Mol Genet 24: 3861-3870). 특히 대상체는 하기 희귀한 보체 인자 I 변이체 중 하나 이상의 하나 또는 2개의 카피를 보유할 수 있다: rs144082872 (P50A를 코딩함); 4:110687847 (P64L을 코딩함); rs141853578 (G119R을 코딩함); 4:110685721 (V152M을 코딩함); 4:110682846 (G162D를 코딩함); 4:110682801 (N177I를 코딩함); rs146444258 (A240G를 코딩함); rs182078921 (G287R을 코딩함); rs41278047 (K441R을 코딩함); 및 rs121964913 (R474를 코딩함).
본 발명은 예를 들어 대상체가 보체-매개 장애와 연관된 하나 이상의 SNP에 대해 감수성인 동형접합성 또는 이형접합성인지 여부를 결정함으로써 (예를 들어, 대상체가 상기 열거된 AMD와 연관된 희귀한 보체 인자 I 변이체 중 하나 이상에 대해 동형접합성 또는 이형접합성인지 여부를 결정함으로써), 대상체가 보체-매개 장애 (예를 들어, AMD)를 발달시킬 위험이 있는지 여부를 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
대안적으로, 대상체는 예를 들어 눈 및/또는 혈청에서 내인성 보체 인자 I 활성 또는 농도의 정상 수준을 가질 수 있고/거나, 희귀한 변이체 보체 인자 I 대립유전자를 보유하지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물의 투여는 그에 의해 대상체의 눈에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 증가시킨다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물의 투여는 그에 의해 대상체의 눈에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 눈에서의 정상 수준을 초과하는 수준으로 증가시킨다. 보다 특히, C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 눈의 RPE에서 증가된다.
본 발명의 생성물의 제공 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로부터의 보체 인자 I 및 보체 인자 H-유사 단백질 1의 발현 후, 대상체에서의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성은, 대상체에서의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 총 수준이 정상 수준을 초과하도록, 대상체의 내인성 보체 인자 I (즉, 생성물에 의해 제공되거나 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로부터의 발현에 의해 생성되지 않는 대상체의 보체 인자 I)로부터의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성, 및 본 발명의 생성물에 의해 제공되거나 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로부터의 발현에 의해 생성된 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성을 포함할 수 있음이 인정될 것이다.
일부 실시양태에서, 대상체에서의, 예를 들어 눈에서의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 정상 수준의 적어도 5%, 10%, 15%, 20% 또는 25% 초과인 수준으로 증가된다.
다른 실시양태에서, 대상체에서의, 예를 들어 눈에서의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 정상 수준의 최대 2배, 또는 정상 수준의 최대 80%, 60%, 40% 또는 20% 초과인 수준으로 증가된다.
예를 들어, 대상체에서의, 예를 들어 눈에서의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준은 정상 수준의 5 내지 100%, 5 내지 80%, 5 내지 60%, 5 내지 40%, 5 내지 20%, 10 내지 100%, 10 내지 80%, 10 내지 60%, 10 내지 40%, 10 내지 20%, 15 내지 100%, 15 내지 80%, 15 내지 60%, 15 내지 40%, 15 내지 20%, 20 내지 100%, 20 내지 80%, 20 내지 60%, 20 내지 40%, 25 내지 100%, 25 내지 80%, 25 내지 60% 또는 25 내지 40% 초과인 수준으로 증가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물의 투여는 대상체의 혈장/혈청에서의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 검출가능하게 증가시키지 않는다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물의 투여는 대상체의 혈장/혈청에서의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 정상 수준 초과의 수준으로 검출가능하게 증가시키지 않는다.
상기 섹션에서, 자명하게 비적용가능한 경우를 제외하고, 보체 인자 I 및 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성에 대한 언급은 보체 인자 H 또는 보체 인자 H-유사 단백질 1, 및 C3b의 보체 인자 I 매개 절단에 대한 보조인자로서 작용하는 및 C3 컨버타제 및 C5 컨버타제의 해리의 속도를 증가시키는 능력으로 각각 대체될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물의 투여 전에, 대상체는 보체 인자 H의 낮은 수준 (예를 들어 정상 수준 미만), 예를 들어 눈에서 보체 인자 H의 낮은 수준 및/또는 보체 인자 H의 낮은 혈청 수준을 갖는다. 인간 대상체에 대해, 보체 인자 H의 정상 수준은 대상체의 혈청에서 약 200 내지 500 μg/mL일 수 있다. 따라서, 보체 인자 H의 낮은 수준을 갖는 대상체에서, 혈청에서의 수준은 200 μg/mL 미만 및 0 μg/mL 초과, 예컨대 0 내지 100 μg/mL일 수 있다. 대안적으로, 대상체는 예를 들어 눈 및/또는 혈청에서 내인성 보체 인자 H의 정상 수준을 가질 수 있다.
보체 인자 I (CFI)
보체 인자 I (인자 I, CFI), 일명 C3b/C4b 불활성화제는 인간에서 CFI 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다.
보체 인자 I는 ~35 μg/mL의 농도에서 (Nilsson et al. (2011) Mol Immunol 48: 1611-1620) 지모겐-유사 상태에서 (Roversi et al. (2011) PNAS 108: 12839-12844) 순환하는 세린 프로테아제이다. 보체 인자 I 단백질은 단일 디술피드 결합에 의해 연결된 2개의 폴리펩티드 쇄로 이루어진 심하게 N-글리코실화된 이종이량체이다. 중쇄 (50 kDa)는 N-말단 영역; FI 막 공격 복합체 (FIMAC) 도메인; CD5 유사-도메인 또는 스캐빈저 수용체 시스테인-풍부 (SRCR) 도메인; 2개의 저-밀도 지질단백질 수용체 (LDLr) 도메인; 및 종에 걸쳐 서열 가변성의 부위인 미공지된 기능의 C-말단 영역을 포함한다 (Roversi et al. (2011) PNAS 108: 12839-12844). 경쇄 (38 kDa)는 보존된 촉매 잔기를 갖는 세린 프로테아제 (SP) 도메인을 함유한다 (Goldberger et al. (1987) J Biol Chem 262: 10065-10071).
보체 인자 I는 C3b를 iC3b, C3d 및 C3dg로 절단함으로써, 및 유사한 방식으로, C4b를 C4c 및 C4d로 절단함으로써 이를 불활성화시킨다. 그의 기능을 적절하게 수행하기 위해, 보체 인자 I는 보조인자 단백질, 예컨대 C4b-결합 단백질 (C4BP), 보체 인자 H (CFH), 보체 수용체 1 (CR1/CD35) 및 막 보조인자 단백질 (MCP/CD46)의 존재를 요구한다 (Degn et al. (2011) Am J Hum Genet 88: 689-705).
iC3b는 인자 B와 회합할 수 없으며, 따라서 대안적인 경로를 통해 보체 캐스케이드의 증폭 또는 활성화를 영속시킬 수 없다. 따라서, C3b가 iC3b로 절단되었으면, 대안적인 경로 개시도, 말단 보체 캐스케이드 활성화도 일어나지 않는다.
iC3b는 다형핵 백혈구 (대부분 호중구), NK 세포 및 단핵 포식세포, 예컨대 대식세포 상의 보체 수용체 3 (CR3)(CD11b/CD18)에 결합하고, 이를 활성화시킴으로써 염증촉진성 작용을 제공할 수 있다.
보체 인자 I는 보조인자, CR1을 요구하는 프로테아제 활성을 통해 iC3b를 C3dg로 프로세싱할 수 있다. C3d,g는 CR3에 결합할 수 없다. 보체 수용체 CR3과 반응하는 iC3b는 보체 활성화가 염증을 유발하는 주요 메커니즘이기 때문에, iC3b의 C3dg로의 분해는 보체-유도 염증을 감소시키는 데 필수적이다 (Lachmann (2009) Adv. Immunol. 104: 115-149).
C3b의 iC3b로의 절단을 촉진시킬 뿐만 아니라 iC3b의 분해를 가속화시키는 보체 인자 I의 고유한 능력 - 치료 효능을 위해 전달되도록 요구되는 양에 대한 관련을 갖는, 인간 혈청에서의 그의 상대적으로 낮은 농도와 조합됨 - 은 이를 특히 유리한 표적으로 만든다.
일부 실시양태에서, 보체 인자 I 폴리펩티드는 C3b를 불활성 분해 생성물로 절단할 수 있다. 예를 들어, 보체 인자 I 폴리펩티드는 C3b를 iC3b로 절단할 수 있다.
일부 실시양태에서, 보체 인자 I 폴리펩티드는 iC3b를 불활성 분해 생성물로 프로세싱할 수 있다. 예를 들어, 보체 인자 I 폴리펩티드는 iC3b를 C3dg로 프로세싱할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 보체 인자 I 폴리펩티드는 C3b를 iC3b로 절단하고, iC3b를 C3dg로 프로세싱할 수 있다.
적합하게는, 보체 인자 I의 단편 또는 변이체는 천연 보체 인자 I의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%를 보유할 수 있다.
보체 인자 I, 또는 그의 단편 또는 유도체의 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성은 통상의 기술자에게 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 보체 인자 I 단백질분해 활성의 측정은 문헌 [Hsiung et al. (Biochem. J. (1982) 203: 293-298)]에 기재되어 있다. CFI 활성에 대한 용혈 및 유착 검정 둘 다는 문헌 [Lachmann PJ & Hobart MJ (1978) "Complement Technology" in Handbook of Experimental Immunology 3rd edition Ed DM Weir Blackwells Scientific Publications Chapter 5A p17]에 기재되어 있다. 또한 단백질분해 검정을 포함하는 보다 상세한 설명은 문헌 [Harrison RA (1996) in "Weir's Handbook of Experimental Immunology" 5th Edition Eds; Herzenberg Leonore A'Weir DM, Herzenberg Leonard A & Blackwell C Blackwells Scientific Publications Chapter 75 36-37]에 의해 주어진다. 유착 검정은 고도로 민감성이며, 고정된 C3b를 iC3b로 전환시키고 콘글루티닌과의 반응성을 획득하는 제1 (이중) 클립 둘 다를 검출하기 위해; 및 고정된 iC3b로 출발하여 콘글루티닌과의 반응성의 소실을 찾음으로써 C3dg에 대한 최종 클립을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 용혈 검정은 C3b의 iC3b로의 전환에 사용되며, 단백질분해 검정은 모든 클립을 검출한다.
일부 실시양태에서, 보체 인자 I는 인간 보체 인자 I이다.
예시 인간 보체 인자 I 단백질은 유니프롯(UniProt)KB 수탁 번호 P05156을 갖는 인간 보체 인자 I 단백질이다. 이 예시된 서열은 그의 아미노산 1 내지 18이 신호 서열을 형성하는 583개의 아미노산의 길이이다 (서열식별번호: 32로서 개시됨).
일부 실시양태에서, 보체 인자 I의 아미노산 서열은 서열식별번호: 32이다. 다른 실시양태에서, 보체 인자 I의 아미노산 서열은 서열식별번호: 32의 위치 19 내지 583으로서 개시된 서열이다. 바람직하게는, 변이체 또는 단편은 서열식별번호: 32에 의해 나타내어진 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
Figure pct00014
일부 실시양태에서, 보체 인자 I의 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_000195에 상응하는 서열식별번호: 33이다. 다른 실시양태에서, 보체 인자 I의 아미노산 서열은 서열식별번호: 33의 위치 19 내지 583으로서 개시된 서열이다.
Figure pct00015
보체 인자 I를 코딩하는 예시 야생형 뉴클레오티드 서열은 본원에서 서열식별번호: 34로서 개시된 NCBI 수탁 번호 NM_000204를 갖는 뉴클레오티드 서열이다.
Figure pct00016
일부 실시양태에서, 본 발명에서 사용되는 보체 인자 I의 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화된다.
보체 인자 I를 코딩하는 바람직한 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 35로서 제시된 뉴클레오티드 서열이다.
Figure pct00017
보체 인자 I를 코딩하는 추가의 예시 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 36이다.
Figure pct00018
일부 실시양태에서, 보체 인자 I를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 34, 35 또는 36, 바람직하게는 서열식별번호: 35와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질은 서열식별번호: 34, 35 또는 36에 의해 나타내어진 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시양태에서, 보체 인자 I를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 34, 35 또는 36, 바람직하게는 서열식별번호: 35이다.
다른 실시양태에서, 보체 인자 I를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 34, 35 또는 36, 바람직하게는 서열식별번호: 35의 위치 55 내지 1752와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질은 서열식별번호: 32 또는 33에 의해 나타내어진 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시양태에서, 보체 인자 I를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 34, 35 또는 36, 바람직하게는 서열식별번호: 35의 위치 55 내지 1752이다.
다른 실시양태에서, 보체 인자 I를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 32 또는 33과 적어도 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩한다. 바람직하게는, 여기서 아미노산 서열은 서열식별번호: 32 또는 33에 의해 나타내어진 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시양태에서, 보체 인자 I를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 아미노산 서열 서열식별번호: 32 또는 33을 코딩한다.
다른 실시양태에서, 보체 인자 I를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 32 또는 33의 위치 19 내지 583과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩한다. 바람직하게는, 여기서 아미노산 서열은 서열식별번호: 32 또는 33에 의해 나타내어진 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시양태에서, 보체 인자 I를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 32 또는 33의 위치 19 내지 583의 아미노산 서열을 코딩한다.
본 발명의 이점은 보체 인자 I가 정제된 단백질의 형태로 제조되는 것이 특히 곤란하다는 것이다. 따라서, 본 발명자들은 보체 인자 I-코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 벡터의 형태로 보체 인자 I를 투여함으로써, 예를 들어 연령-관련 황반 변성 (AMD)의 치료를 가능하게 하는 보체계를 조절하는 방식을 고안하였다. AAV 벡터는 보체 인자 I 폴리펩티드의 계내 번역을 가능하게 하기 위해 관심의 부위, 예를 들어 눈에 투여될 수 있다.
보체 인자 H (CFH)
보체 인자 H (인자 H, CFH)는 보체 제어 단백질이다.
보체 인자 H는 200 내지 300 μg/mL의 전형적인 농도로 인간 혈장에 존재하는 대형 (155 kDa), 가용성 당단백질이다 (Hakobyan et al. (2008) 49(5): 1983-90). 보체 인자 H의 주요한 기능은 보체계의 대안적인 경로를 조절하는 것이다.
보체 인자 H는 C3b의 보체 인자 I-매개 절단을 위한 보조인자 활성을 제공한다. 보체 인자 H는 또한 C3bBb 복합체 (C3 컨버타제) 및 (C3b)NBB 복합체 (C5 컨버타제)의 해리의 속도를 증가시키고, 그에 의해 대안적인 보체 경로의 활성을 감소시킨다.
보체 인자 H는 짧은 링커 (3 내지 8개의 아미노산 잔기의)에 의해 서로에 연결되고 연장된 머리 대 꼬리 방식으로 배열된 20가지 보체 제어 단백질 (CCP) 모듈 (또한 짧은 컨센서스 반복부 또는 스시 도메인으로 지칭됨)로 구성된다. 각각의 CCP 모듈은 1-3 2-4 배열로 디술피드 결합된 4개의 시스테인 잔기, 및 거의 불변하는 트립토판 잔기 주위에 만들어진 소수성 코어를 갖는 대략 60개의 아미노산으로 구성된다. CCP 모듈은 1 내지 20으로 넘버링된다 (단백질의 N-말단으로부터). CCP 1 내지 4 및 CCP 19 내지 20은 C3b와 결속하는 반면, CCP 7 및 CCP 19 내지 20은 GAG 및 시알산에 결합한다 (Schmidt et al. (2008) Journal of Immunology 181: 2610-2619).
보체 인자 H를 사용한 유전자 요법은 마우스에서 유도된 AMD-유사 병리학을 개선시킬 수 있음이 제시되었다 (Cashman et al. (2015) J. Gene Med. 17: 229-243). 마우스를 (i) 인간 AMD의 많은 병리학적 특색을 개괄하는 것으로 이전에 제시된 보체 성분 C3을 발현하는 아데노바이러스 벡터; 및 (ii) 보체 인자 H를 발현하는 아데노바이러스 벡터로 망막하로 공동-주사하였다. 보체 인자 H 대신 GFP를 받은 대조군 동물에 비해, 보체 인자 H-형질도입된 마우스는 내피 세포 증식의 91% 감소 및 RPE 위축의 69% 감쇠를 나타내었다. 망막전위도검사는 보체 인자 H를 받은 마우스에서 개선된 망막 기능을 나타내었으며, 로돕신 및 RPE65의 면역세포화학은 이러한 동물에서의 광수용체 및 RPE의 구제와 일치하였다.
일부 실시양태에서, 보체 인자 H 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 변이체는 C3b의 보체 인자 I-매개 절단을 위한 보조인자로서 작용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 보체 인자 H 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 변이체는 C3 컨버타제 및 C5 컨버타제의 해리의 속도를 증가시킬 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 보체 인자 H 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 변이체는 C3b의 보체 인자 I-매개 절단을 위한 보조인자로서 작용하고, C3 컨버타제 및 C5 컨버타제의 해리의 속도를 증가시킬 수 있다.
보체 인자 H, 또는 그의 단편 또는 유도체의 보조인자 활성 및 해리 가속화 활성은 통상의 기술자에게 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 보체 인자 H의 보조인자 활성의 측정은 문헌 [Sanchez-Corral, P., et al., 2002. The American Journal of Human Genetics, 71(6), pp.1285-1295]에 기재되어 있고, 보체 인자 H의 해리 가속화 활성의 측정은 문헌 [Wong, E.K., et al., 2014. Journal of the American Society of Nephrology, 25(11), pp.2425-2433]에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 보체 인자 H는 인간 보체 인자 H이다.
예시 인간 보체 인자 H 단백질은 유니프롯KB 수탁 번호 P08603을 갖는 인간 보체 인자 H 단백질이다. 이 예시된 서열은 그의 아미노산 1 내지 18이 신호 서열을 형성하는 1231개의 아미노산의 길이이다 (서열식별번호: 37로서 개시됨).
일부 실시양태에서, 보체 인자 H의 아미노산 서열은 서열식별번호: 37이다. 다른 실시양태에서, 보체 인자 H의 아미노산 서열은 서열식별번호: 37의 위치 19 내지 1231이다. 바람직하게는, 변이체 또는 단편은 서열식별번호: 37에 의해 나타내어진 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
Figure pct00019
보체 인자 H를 코딩하는 예시 뉴클레오티드 서열은 NCBI 수탁 번호 NM_000186을 갖는 뉴클레오티드 서열이다.
일부 실시양태에서, 보체 인자 H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 38이다.
Figure pct00020
일부 실시양태에서, 보체 인자 H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 38과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 여기서 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질은 서열식별번호: 37에 의해 나타내어진 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시양태에서, 보체 인자 H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 38이다.
다른 실시양태에서, 보체 인자 H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 38의 위치 55 내지 3696과 적어도 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 여기서 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질은 서열식별번호: 37에 의해 나타내어진 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시양태에서, 보체 인자 H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 38의 위치 55 내지 3696이다.
다른 실시양태에서, 보체 인자 H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 37과 적어도 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩한다. 바람직하게는, 여기서 아미노산 서열은 서열식별번호: 37에 의해 나타내어진 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시양태에서, 보체 인자 H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 아미노산 서열 서열식별번호: 37을 코딩한다.
다른 실시양태에서, 보체 인자 H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 37의 위치 19 내지 1231과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩한다. 바람직하게는, 여기서 아미노산 서열은 서열식별번호: 37에 의해 나타내어진 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시양태에서, 보체 인자 H를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 37의 위치 19 내지 1231의 아미노산 서열을 코딩한다.
보체 인자 H-유사 단백질 1 (FHL1)
보체 인자 H-유사 단백질 1 (FHL1)은 보체 인자 H의 최초 7개의 CCP, 이어서 4개의 아미노산 카르복시-말단 꼬리를 함유하는 보체 인자 H의 스플라이스 변이체이다 (Clark, S.J. et al. (2015) J Clin Med 4: 18-31). FHL1의 조절 활성은 보체 인자 H에 필적하는 것으로 제시되었다 (Mannes, M., et al., 2020. Frontiers in Immunology, 11; 596415).
일부 실시양태에서, FHL1 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 변이체는 C3b의 보체 인자 I-매개 절단을 위한 보조인자로서 작용할 수 있다. 일부 실시양태에서, FHL1 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 변이체는 C3 컨버타제 및 C5 컨버타제의 해리의 속도를 증가시킬 수 있다.
바람직한 실시양태에서, FHL1 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 변이체는 C3b의 보체 인자 I-매개 절단을 위한 보조인자로서 작용하고, C3 컨버타제 및 C5 컨버타제의 해리의 속도를 증가시킬 수 있다.
FHL1 폴리펩티드, 또는 그의 단편 또는 유도체의 보조인자 활성 및 해리 가속화 활성은 통상의 기술자에게 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 보체 인자 H에 대해 상기 기재된 검정 또는 문헌 [Mannes, M., et al., 2020. Frontiers in Immunology, 11; 596415]에 기재된 임의의 검정.
일부 실시양태에서, FHL1은 인간 FHL1이다.
일부 실시양태에서, FHL1의 아미노산 서열은 서열식별번호: 39이다. 바람직하게는, 변이체 또는 단편은 서열식별번호: 39에 의해 나타내어진 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다. 적합하게는, FHL1의 단편 또는 변이체는 서열식별번호: 39에 의해 나타내어진 단백질의 보조인자 활성 및/또는 해리 가속화 활성의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100%를 보유할 수 있다.
Figure pct00021
FHL1을 코딩하는 예시 뉴클레오티드 서열은
Figure pct00022
본 발명에 사용되는 FHL1의 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 코돈 최적화된다.
FHL1을 코딩하는 바람직한 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 41이다.
Figure pct00023
일부 실시양태에서, FHL1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 40 또는 41, 바람직하게는 서열식별번호: 41과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질은 서열식별번호: 39에 의해 나타내어진 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시양태에서, FHL1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 40 또는 41, 바람직하게는 서열식별번호: 41이다.
보체 수용체 1 (CR1)
보체 수용체 1 (CR1)은 보체를 활성화한 입자 및 면역 복합체에의 세포 결합을 매개한다.
일부 실시양태에서, CR1은 인간 CR1이다.
일부 실시양태에서, CR1의 아미노산 서열은 서열식별번호: 42이다. 바람직하게는, 변이체 또는 단편은 서열식별번호: 42에 의해 나타내어진 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
Figure pct00024
막 보조인자 단백질 (MCP)
MCP는 CFI에 대한 보조인자로서 작용한다.
일부 실시양태에서, MCP는 인간 MCP이다.
일부 실시양태에서, MCP의 아미노산 서열은 서열식별번호: 43 또는 그의 변이체 또는 단편이다. 바람직하게는, 변이체 또는 단편은 서열식별번호: 43에 의해 나타내어진 단백질의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
Figure pct00025
링커
바람직한 실시양태에서, 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류이다. 다른 실시양태에서, 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류이다.
본원에 사용된 "상류" 및 "하류"는 둘 다 DNA 또는 RNA에서의 상대적 위치를 지칭한다. DNA 또는 RNA의 각각의 가닥은 5' 단부 및 3' 단부를 가지며, 관례상, "상류" 및 "하류"는 각각 RNA 전사가 일어나는 5'에서 3'로의 방향에 관한 것이다. 예를 들어, 이중-가닥 DNA를 고려하는 경우, "상류"는 코딩 가닥의 5' 단부를 향하고, 하류는 코딩 가닥의 3' 단부를 향한다.
일부 실시양태에서, 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 링커에 의해 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 자기-절단 2A 펩티드 서열, 예컨대 푸린 절단 부위, GSG, 11a1D 및 F2A 서열을 포함하거나 그에 의해 정의되는 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 링커는 서열식별번호: 44이다.
Figure pct00026
다른 실시양태에서, 링커는 서열식별번호: 44와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 링커는 서열식별번호: 44의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
"작동가능하게 연결된"이란, 개별적 성분이 이들이 실질적으로 비방해되어 그들의 기능을 수행하는 것을 가능하게 하는 방식으로 함께 연결되는 것으로 이해되어야 한다.
생성물
본 발명의 생성물은 예를 들어, (i) 항-VEGF 엔티티; 및 (ii) 음성 보체 조절인자, 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 혼합물 중에 포함하는 조성물 (예를 들어 제약 조성물)일 수 있다. 대안적으로, 생성물은 예를 들어, (i) 항-VEGF 엔티티; 및 (ii) 음성 보체 조절인자, 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 제제, 및, 임의로, 이를 필요로 하는 대상체에의 제제의 동시, 순차적 또는 별개 투여를 위한 지시서를 포함하는 키트일 수 있다.
단백질 형질도입
세포에의 폴리뉴클레오티드의 전달에 대한 대안으로서, 본 발명의 생성물 및 작용제는 단백질 형질도입에 의해 세포에 전달될 수 있다.
단백질 형질도입은 벡터 전달을 통해서일 수 있다 (Cai, Y. et al. (2014) Elife 3: e01911; Maetzig, T. et al. (2012) Curr. Gene Ther. 12: 389-409). 벡터 전달은 세포에 전달되는 단백질을 포함하도록 바이러스 입자 (예를 들어 렌티바이러스 입자)의 조작을 수반한다. 따라서, 조작된 바이러스 입자가 그들의 자연 생활 주기의 일부로서 세포에 진입하는 경우, 입자에 포함된 단백질은 세포 내로 운반된다.
단백질 형질도입은 단백질 전달을 통해서일 수 있다 (Gaj, T. et al. (2012) Nat. Methods 9: 805-7). 단백질 전달은 예를 들어, 비히클 (예를 들어 리포솜)을 이용함으로써 또는 심지어 단백질 자체를 세포에 직접적으로 투여함으로써 달성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA, 바람직하게는 DNA를 포함할 수 있다. 이들은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 다수의 상이한 폴리뉴클레오티드는 유전 암호의 축중성의 결과로서 동일한 폴리펩티드를 코딩할 수 있음이 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 또한, 통상의 기술자는 통상적인 기술을 사용하여, 본 발명의 폴리펩티드가 발현되는 임의의 특정 숙주 유기체의 코돈 사용빈도를 반영하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열에 영향을 미치지 않는 뉴클레오티드 치환을 생성할 수 있음이 이해되어야 한다.
본원에 개시된 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 비시스트론성 벡터에서의 그들의 위치에 따라, 그들의 3' 단부에 정지 코돈을 포함하거나 결여할 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 정지 코돈이 존재하거나 부재하는 본원에 개시된 서열식별번호를 포괄한다.
폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야에서 이용가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 생체내 활성 또는 수명을 증진시키기 위해 수행될 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA 폴리뉴클레오티드는 재조합적으로, 합성적으로 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 이용가능한 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다. 이들은 또한 표준 기술에 의해 클로닝될 수 있다.
보다 긴 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 재조합 수단을 사용하여, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 클로닝 기술을 사용하여 생산될 것이다. 이는 클로닝하는 것이 바람직한 표적 서열을 플랭킹하는 프라이머 (예를 들어 약 15 내지 30개의 뉴클레오티드의)의 쌍을 제조하고, 프라이머를 동물 또는 인간 세포로부터 수득된 mRNA 또는 cDNA와 접촉시키고, 목적하는 영역의 증폭을 야기하는 조건 하에서 폴리머라제 연쇄 반응을 수행하고, 증폭된 단편을 단리하고 (예를 들어 아가로스 겔로 반응 혼합물을 정제함으로써), 증폭된 DNA를 회수하는 것을 수반할 것이다. 프라이머는 증폭된 DNA가 적합한 벡터 내로 클로닝될 수 있도록 적합한 제한 효소 인식 부위를 함유하도록 디자인될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 플라스미드 형질감염 또는 전기천공에 의해; 예를 들어 비-바이러스 벡터, 예컨대 네이키드 DNA 플라스미드, 박테리아 인공 염색체, 미니-서클 기술로서 세포에 전달될 수 있다. 이들 엔티티는 또한 AAV 벡터보다 더 큰 트랜스진을 패키징할 수 있지만, 덜 안정한, 생체이용률 및 표적 특이성인 약간의 단점이 있을 수 있다. 예를 들어, 아이벤시스(Eyevensys)는 치료 트랜스진을 근육/눈 등에 전달하기 위해 네이키드 DNA 전기천공 플랫폼을 사용한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 45의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
Figure pct00027
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 46의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
Figure pct00028
Figure pct00029
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 47의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
Figure pct00030
Figure pct00031
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 48의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
Figure pct00032
Figure pct00033
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 49의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
Figure pct00034
Figure pct00035
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 50의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
Figure pct00036
Figure pct00037
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 51의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
Figure pct00038
Figure pct00039
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 52의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
Figure pct00040
Figure pct00041
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 53의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
Figure pct00042
Figure pct00043
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 54의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
Figure pct00044
눈의 구조
본원에 개시된 의약은 눈 질환, 예컨대 연령-관련 황반 변성 (AMD)의 치료 또는 예방과 관련하여 포유동물, 바람직하게는 인간 눈에 전달될 수 있다.
눈의 질환의 치료에 있어서의 통상의 기술자는 눈의 구조의 상세하고 철저한 이해를 가질 것이다. 그러나, 본 발명에 대한 특정 관련의 하기 구조가 기재된다.
망막
망막은 눈의 내부 후안방을 라이닝하고, 시신경을 통해 뇌에 통신되는 시각적 세계의 이미지를 감각하는 다층 조직이다. 눈의 내부에서 외부의 순서로, 망막은 망막 색소 상피에 대해 원위에 놓인 맥락막을 갖는 감각신경 망막 및 망막 색소 상피의 층을 포함한다.
감각신경 망막 및 광수용체 세포
감각신경 망막은 빛을 직접적으로 감각하는 광수용체 세포를 갖는다. 이는 하기 층을 포함한다: 내부 제한 막 (ILM); 신경 섬유 층; 신경절 세포 층; 내부 총상 층; 내부 핵 층; 외부 총상 층; 외부 핵 층 (광수용체의 핵); 외부 제한 막 (ELM); 및 간상 및 원추의 내부 및 외부 절편.
통상의 기술자는 광수용체 세포의 상세한 이해를 가질 것이다. 간략하게, 광수용체 세포는 빛을 생물학적 신호로 전환시키는 망막에 위치한 특수화된 뉴런이다. 광수용체 세포는 망막에 걸쳐 상이하게 분포된 간상 및 원추 세포를 포함한다.
간상 세포는 주로 망막의 말초 부분에 걸쳐 분포된다. 이들은 고도로 민감성이며, 낮은 빛 수준에서 시각을 제공한다. 정상 인간 망막에는 평균 약 1억2천5백만개의 간상 세포가 있다.
원추 세포는 망막에 걸쳐 발견되지만, 중심 고해상도 시각을 담당하는 감각신경 망막에서의 구덩이인 중심와에 특히 고도로 집중된다. 원추 세포는 간상 세포보다 덜 민감하고, 색각을 담당한다. 정상 인간 망막에는 평균 약 6 내지 7백만개의 원추 세포가 있다.
망막 색소 상피
망막 색소 상피 (RPE)는 광수용체 외부 절편에 인접한 감각신경 망막의 외부에 바로 위치한 세포의 색소화된 층이다. RPE는 감각신경 망막을 맥락막 혈관구조로부터 분리하며, 광수용체 외부 절편으로부터의 시각적 색소를 재생하는 것과 같은 기능을 갖는다. RPE는 광수용체 세포로의 영양분 및 다른 물질의 수송, 및 시각을 개선시키기 위한 산란된 빛의 흡수를 포함하는 다수의 기능을 수행한다.
맥락막
맥락막은 RPE 및 눈의 외부 공막 사이에 위치된 혈관 층이다. 맥락막의 혈관구조는 망막에의 산소 및 영양분의 제공을 가능하게 한다.
연령-관련 황반 변성 (AMD)
연령-관련 황반 변성 (AMD)의 임상적 진행은 황반의 변화에 따른 단계에서 특징화된다. 초기 AMD의 특징은 망막 밑의 세포외 데브리스의 축적이며 임상 검사 동안 및 안저 사진 상에서 망막에서의 황색 점으로서 나타나는 드루센의 출현이다. 드루센은 크기에 의해 작은 (<63 μm), 중간 (63 내지 124 μm) 및 큰 (>124 μm) 것으로서 카테고리화된다. 이들은 또한 안과학적 검사시 그들의 가장자리의 외관에 따라 경성 또는 연성으로 간주된다. 경성 드루센은 명백하게 정의된 가장자리를 갖는 반면, 연성 드루센은 덜 정의된 유체성 가장자리를 갖는다. 연령-관련 눈 질환 연구 (AREDS) 안저 사진 중증도 스케일은 이 상태에 대해 사용되는 주요 분류 시스템 중 하나이다.
AMD는 "건성" 및 "습성" (삼출성 또는 혈관신생성) 형태로 분류된다. 건성 AMD는 전형적으로 RPE 층에서의 진행성 세포 소실, 위에 가로놓인 광수용체 세포, 및 빈번하게 또한 맥락막 모세혈관 층 중의 기저를 이루는 세포를 특징으로 한다. 위에 가로놓인 광수용체 위축을 동반하는 RPE 세포 사멸의 합류 영역은 지도형 위축 (GA)으로 지칭된다. AMD의 이 형태를 갖는 환자는 중심 시각에서 느리고 진행성인 악화를 경험한다.
습성 AMD는 갑작스럽고 장애를 초래하는 시각의 상실의 원인이 될 수 있는, RPE 및 황반 밑의 맥락막 혈관 (맥락막모세혈관)으로부터 성장된 비정상적 혈관으로부터의 출혈 및/또는 유체의 누출을 특징으로 한다. 환자가 경험하는 많은 시각 상실은 이러한 맥락막 혈관신생 (CNV) 및 그의 2차 합병증에 기인한다고 추정되었다.
본원에 기재된 AMD의 치료 또는 예방은 상기 기재된 AMD 표현형의 출현을 감소시키거나 예방할 수 있다. 바람직하게는, AMD의 치료는 시각 기능의 유지 또는 개선을 가능하게 한다.
일부 실시양태에서, AMD의 치료 또는 예방은 지도형 위축의 형성의 예방 또는 감소를 발생시킨다. 다른 실시양태에서, AMD의 치료 또는 예방은 지도형 위축의 진행의 감속을 발생시킨다. 예를 들어, 이는 대상체의 치료된 눈에의 투여 후 12개월에 걸쳐 동일한 기간에 걸쳐 비치료된 눈에 비해 GA 영역의 증가의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소를 발생시킨다. 다른 실시양태에서, AMD의 치료 또는 예방은 지도형 위축의 치료, 예를 들어 지도형 위축의 양의 감소를 발생시킨다.
일부 실시양태에서, AMD의 치료 또는 예방은 드루센의 형성의 예방 또는 감소를 발생시킨다. 다른 실시양태에서, AMD의 치료 또는 예방은 기존의 드루센의 감소, 예를 들어 기존의 드루센의 크기 및/또는 수의 감소를 발생시킨다.
일부 실시양태에서, AMD의 치료 또는 예방은 보체 침착의 예방 또는 감소를 발생시킨다. 다른 실시양태에서, AMD의 치료 또는 예방은 기존의 보체 침착의 감소를 발생시킨다.
일부 실시양태에서, AMD의 치료 또는 예방은 시각 또는 시력의 개선 또는 복원을 발생시킨다. 다른 실시양태에서, AMD의 치료 또는 예방은 시각 또는 시력의 상실을 완화시킨다.
일부 실시양태에서, AMD의 치료 또는 예방은 대상체에서 읽기 속도의 개선 또는 복원을 발생시킨다. 다른 실시양태에서, AMD의 치료 또는 예방은 대상체에서 읽기 속도의 감소를 완화시킨다.
일부 실시양태에서, AMD의 치료 또는 예방은 광수용체 및/또는 망막 색소 상피 (RPE)의 상실의 감소 또는 예방을 발생시킨다.
당뇨병성 망막병증
당뇨병성 망막병증은 당뇨병과 연관된 높은 혈당 수준에 의해 유발되는, 망막의 혈관에 대한 손상을 특징으로 하는 상태이다. 비치료되어 방치되는 경우, 당뇨병성 망막병증은 실명을 유발할 수 있다.
경도 당뇨병성 망막병증을 갖는 대상체는 양호한 시각을 가질 수 있지만, 특정 유형의 당뇨병성 망막병증, 즉, 당뇨병성 황반 부종 (DMO) 및 증식성 당뇨병성 망막병증 (PDR)은 대상체의 시력을 위협할 수 있다.
당뇨병성 황반 부종은 눈의 뒤에서의 손상된 혈관으로부터의 유체의 누출을 특징으로 한다. 누출된 유체는 황반에서 축적되고, 이는 부어오르고 흐릿한 시각을 초래한다. 이는 결국 불량한 중심 시각 및 읽거나 운전할 수 없음을 발생시킬 수 있다. 측면 시각은 통상적으로 정상으로 남아 있다.
증식성 당뇨병성 망막병증은 망막의 표면 상의 비정상적인 취약한 혈관의 성장을 초래하는 망막 혈관의 폐쇄를 특징으로 한다. 이는 눈 내로의 출혈, 흉터형성 및 망막 박리로 인해 시각의 영구적인 상실을 발생시킬 수 있다. 비-증식성 망막병증은 비치료되어 방치되는 경우 증식성 망막병증을 초래할 수 있는 당뇨병성 망막병증의 초기 단계이다. 따라서, 치료는 당뇨병성 망막병증의 모든 단계 및 유형에 대해 고려된다.
벡터
벡터는 하나의 환경으로부터 또 다른 환경으로의 엔티티의 전달을 허용하거나 용이하게 하는 도구이다.
아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 AAV 벡터를 제공한다.
바람직하게는, AAV 벡터는 AAV 벡터 입자의 형태이다.
바이러스 벡터 및 바이러스 벡터 입자, 예컨대 AAV로부터 유래된 것들을 제조하고 변형시키는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
AAV 벡터는 AAV 게놈 또는 그의 단편 또는 유도체를 포함할 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 바와 같은 (i) 항-VEGF 엔티티 및 (ii) 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 AAV에서의 패키징에 적합할 수 있다. AAV는 최대 5.2 kb의 크기의 게놈을 패키징할 수 있는 것으로 공지되어 있다 (Dong, J.-Y. et al. (1996) Human Gene Therapy 7: 2101-2112).
따라서, 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 조합이 AAV에서의 패키징에 적합하도록 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-VEGF 엔티티 및/또는 음성 보체 조절인자 (예컨대 본원에 기재된 것들)의 기능적 단편은 폴리뉴클레오티드가 AAV에서의 패키징에 적합함을 보장하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5.2, 5.1, 5.0, 4.9, 4.8 또는 4.7 kb 이하이다. 바람직한 실시양태에서, 본 폴리뉴클레오티드는 4.7 kb 이하이다.
AAV 게놈은 AAV 입자의 생산에 필요한 기능을 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 이들 기능은 AAV 입자 내로의 AAV 게놈의 캡시드화를 포함하는 숙주 세포에서의 AAV의 복제 및 패키징 사이클에서 작동하는 것들을 포함한다. 천연 발생 AAV는 복제-결함성이며, 복제 및 패키징 사이클의 완결을 위해 트랜스로 헬퍼 기능의 제공에 의존한다. 따라서, 본 발명의 AAV 벡터의 AAV 게놈은 전형적으로 복제-결함성이다.
AAV 게놈은 양성 또는 음성-센스 중 어느 하나의 단일 가닥 형태, 또는 대안적으로 이중-가닥 형태일 수 있다.
AAV 게놈은 AAV의 임의의 천연 유래 혈청형, 단리체 또는 분기군으로부터의 것일 수 있다. 따라서, AAV 게놈은 천연 발생 AAV의 전체 게놈일 수 있다. 통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 자연에서 발생하는 AAV는 다양한 생물학적 시스템에 따라 분류될 수 있다.
통상적으로, AAV는 그들의 혈청형의 관점에서 지칭된다. 혈청형은 캡시드 표면 항원의 발현의 그의 프로파일로 인해, 이를 다른 변이체 아종으로부터 구별하는 데 사용될 수 있는 독특한 반응성을 갖는 AAV의 변이체 아종에 상응한다. 전형적으로, 특정 AAV 혈청형을 갖는 바이러스는 임의의 다른 AAV 혈청형에 대해 특이적인 중화 항체와 효율적으로 교차-반응하지 않는다.
AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 및 AAV11, 및 또한 재조합 혈청형, 예컨대 영장류 뇌로부터 최근에 확인된 Rec2 및 Rec3을 포함한다. 이들 AAV 혈청형 중 임의의 것은 본 발명에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, AAV 벡터 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rec2, Rec3, Rh10, DJ 또는 Anc65 AAV 벡터 입자이다.
일부 실시양태에서, AAV 벡터 입자는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11 캡시드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV7 또는 AAV8 혈청형일 수 있다.
일부 실시양태에서, AAV는 AAV2 또는 AAV8 혈청형일 수 있다.
일부 실시양태에서, AAV는 AAV2 혈청형일 수 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, AAV는 AAV8 혈청형일 수 있다.
캡시드 단백질은 예컨대 본원에 참조로 포함되는 WO 2008/124724에 개시된 돌연변이체 캡시드 단백질일 수 있다.
일부 실시양태에서, AAV 벡터는 Y733F 돌연변이를 갖는 AAV8 캡시드를 포함한다.
AAV 혈청형의 검토는 문헌 [Choi et al. (2005) Curr. Gene Ther. 5: 299-310] 및 [Wu et al. (2006) Molecular Therapy 14: 316-27]에서 발견될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 AAV 게놈의 또는 ITR 서열, rep 또는 cap 유전자를 포함하는 AAV 게놈의 요소의 서열은 AAV 전체 게놈 서열에 대한 하기 수탁 번호로부터 유래될 수 있다: 아데노-연관 바이러스 1 NC_002077, AF063497; 아데노-연관 바이러스 2 NC_001401; 아데노-연관 바이러스 3 NC_001729; 아데노-연관 바이러스 3B NC_001863; 아데노-연관 바이러스 4 NC_001829; 아데노-연관 바이러스 5 Y18065, AF085716; 아데노-연관 바이러스 6 NC_001862; 조류 AAV ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828; 조류 AAV 균주 DA-1 NC_006263, AY629583; 소 AAV NC_005889, AY388617.
AAV는 또한 분기군 또는 클론의 관점에서 지칭될 수 있다. 이는 천연 유래 AAV의 계통발생적 관계, 및 전형적으로 공통 조상으로 거슬러 올라갈 수 있는 AAV의 계통발생적 군을 지칭하며, 그의 모든 자손을 포함한다. 추가로, AAV는 특이적 단리체, 즉, 자연에서 발견되는 특이적 AAV의 유전자 단리체의 관점에서 지칭될 수 있다. 용어 유전자 단리체는 다른 천연 발생 AAV와 제한된 유전자 혼합을 겪었고, 그에 의해 유전자 수준에서 인식가능하게 별개의 집단을 정의하는 AAV의 집단을 기재한다.
통상의 기술자는 그들의 통상적인 일반적 지식에 기반하여 본 발명에 사용하기 위한 AAV의 적절한 혈청형, 분기군, 클론 또는 단리체를 선택할 수 있다. 예를 들어, AAV5 캡시드는 유전된 색각 결함의 성공적인 교정에 의해 입증된 바와 같이 영장류 원추 광수용체를 효과적으로 형질도입하는 것으로 제시되었다 (Mancuso et al. (2009) Nature 461: 784-7).
AAV 혈청형은 AAV의 감염의 조직 특이성 (또는 향성)을 결정한다. 따라서, 본 발명에 따라 환자에게 투여되는 AAV에 사용하기 위한 바람직한 AAV 혈청형은 눈 내의 표적 세포의 감염에 대한 천연 향성 또는 그의 높은 효율을 갖는 것들이다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 AAV 혈청형은 감각신경 망막, 망막 색소 상피 및/또는 맥락막의 세포를 형질도입하는 것들이다.
전형적으로, AAV의 천연 유래 혈청형, 단리체 또는 분기군의 AAV 게놈은 적어도 하나의 역위 말단 반복부 서열 (ITR)을 포함한다. ITR 서열은 기능적 복제 원점을 제공하도록 시스로 작용하고, 세포의 게놈으로부터 벡터의 통합 및 삭제를 허용한다. 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 ITR 서열은 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 플랭킹한다. AAV 게놈은 전형적으로 또한 패키징 유전자, 예컨대 AAV 입자에 대한 패키징 기능을 코딩하는 rep 및/또는 cap 유전자를 포함한다. rep 유전자는 단백질 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40 또는 그의 변이체 중 하나 이상을 코딩한다. cap 유전자는 하나 이상의 캡시드 단백질, 예컨대 VP1, VP2 및 VP3 또는 그의 변이체를 코딩한다. 이들 단백질은 AAV 입자의 캡시드를 구성한다. 캡시드 변이체는 하기 논의된다.
프로모터는 각각의 패키징 유전자에 작동가능하게 연결될 것이다. 이러한 프로모터의 구체적인 예는 p5, p19 및 p40 프로모터를 포함한다 (Laughlin et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5567-5571). 예를 들어, p5 및 p19 프로모터는 일반적으로 rep 유전자를 발현시키는 데 사용되는 반면, p40 프로모터는 일반적으로 cap 유전자를 발현시키는 데 사용된다.
상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 AAV 벡터에 사용되는 AAV 게놈은 따라서 천연 발생 AAV의 전체 게놈일 수 있다. 예를 들어, 그들 사이에 전체 AAV 게놈을 포함하는 벡터는 시험관내에서 AAV 벡터 또는 벡터 입자를 제조하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 벡터는 원칙적으로 환자에게 투여될 수 있지만, 이는 실제로는 드물게 수행될 것이다. 바람직하게는, AAV 게놈은 환자에의 투여의 목적을 위해 유도체화될 것이다. 이러한 유도체화는 관련 기술분야에서 표준이며, 본 발명은 AAV 게놈의 임의의 공지된 유도체, 및 관련 기술분야에 공지된 기술을 적용함으로써 생성될 수 있는 유도체의 용도를 포괄한다. AAV 게놈의 및 AAV 캡시드의 유도체화는 문헌 [Coura and Nardi (2007) Virology Journal 4: 99], 및 상기 언급된 문헌 [Choi et al.] 및 [Wu et al.]에 검토되어 있다.
AAV 게놈의 유도체는 생체내에서 본 발명의 AAV 벡터로부터 트랜스진의 발현을 허용하는 AAV 게놈의 임의의 말단절단된 또는 변형된 형태를 포함한다. 전형적으로, 유의하게 최소 바이러스 서열을 포함하지만 상기 기능을 보유하도록 AAV 게놈을 말단절단하는 것이 가능하다. 이는 야생형 바이러스로의 벡터의 재조합의 위험을 감소시키기 위해, 및 또한 표적 세포에서의 바이러스 유전자 단백질의 존재에 의한 세포성 면역 반응을 촉발시키는 것을 회피하기 위해 안전성 이유로 바람직하다.
전형적으로, 유도체는 적어도 하나의 역위 말단 반복부 서열 (ITR), 바람직하게는 하나 초과의 ITR, 예컨대 2개의 ITR 또는 그 초과를 포함할 것이다. ITR 중 하나 이상은 상이한 혈청형을 갖는 AAV 게놈으로부터 유래될 수 있거나, 키메라 또는 돌연변이체 ITR일 수 있다. 바람직한 돌연변이체 ITR은 trs (말단 분해 부위)의 결실을 갖는 것이다. 이 결실은 코딩 및 상보적 서열 둘 다를 함유하는 단일-가닥 게놈, 즉, 자기-상보적 AAV 게놈을 생성하기 위한 게놈의 계속된 복제를 허용한다. 이는 표적 세포에서 DNA 복제의 우회를 허용하고, 따라서 가속화된 트랜스진 발현을 가능하게 한다.
하나 이상의 ITR은 바람직하게는 양쪽 단부에서 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 플랭킹할 것이다. 하나 이상의 ITR의 포함은 예를 들어 숙주 세포 DNA 폴리머라제의 작용에 의한 단일-가닥 벡터 DNA의 이중-가닥 DNA로의 전환 후, 숙주 세포의 핵에서 본 발명의 벡터의 연쇄체 형성을 보조하는 데 바람직하다. 이러한 에피솜 연쇄체의 형성은 숙주 세포의 일생 동안 벡터 구축물을 보호하고, 그에 의해 생체내에서 트랜스진의 연장된 발현을 허용한다.
바람직한 실시양태에서, ITR 요소는 유도체에서 천연 AAV 게놈으로부터 보유된 유일한 서열일 것이다. 따라서, 유도체는 바람직하게는 천연 게놈의 rep 및/또는 cap 유전자 및 천연 게놈의 임의의 다른 서열을 포함하지 않을 것이다. 이는 상기 기재된 이유로, 및 또한 숙주 세포 게놈 내로의 벡터의 통합의 가능성을 감소시키기 위해 바람직하다. 추가로, AAV 게놈의 크기를 감소시키는 것은 트랜스진 외에도 벡터 내의 다른 서열 요소 (예컨대 조절 요소)를 혼입시키는 데 있어서 증가된 유연성을 허용한다.
따라서 하기 부분은 본 발명의 유도체에서 제거될 수 있다: 복제 (rep) 및 캡시드 (cap) 유전자. 그러나, 일부 실시양태에서, 유도체는 추가로 하나 이상의 rep 및/또는 cap 유전자 또는 AAV 게놈의 다른 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 천연 발생 AAV는 인간 염색체 19 상의 특이적 부위에서 높은 빈도로 통합되고, 무시가능한 무작위 통합의 빈도를 나타내며, 그에 따라 벡터에서의 통합 능력의 보유는 치료 환경에서 용인될 수 있다.
유도체가 캡시드 단백질, 즉, VP1, VP2 및/또는 VP3을 포함하는 경우, 유도체는 하나 이상의 천연 발생 AAV의 키메라, 셔플드 또는 캡시드-변형된 유도체일 수 있다. 특히, 본 발명은 동일한 벡터 (즉, 위형화된 벡터) 내의 AAV의 상이한 혈청형, 분기군, 클론, 또는 단리체로부터의 캡시드 단백질 서열의 제공을 포괄한다.
키메라, 셔플드 또는 캡시드-변형된 유도체는 전형적으로 AAV 벡터에 대한 하나 이상의 목적하는 기능성을 제공하도록 선택될 것이다. 따라서, 이들 유도체는 천연 발생 AAV 게놈, 예컨대 AAV2 또는 AAV8의 그것을 포함하는 AAV 벡터에 비해 유전자 전달의 증가된 효율, 감소된 면역원성 (체액성 또는 세포성), 변경된 향성 범위 및/또는 특정 세포 유형의 개선된 표적화를 나타낼 수 있다. 유전자 전달의 증가된 효율은 세포 표면에서의 개선된 수용체 또는 공-수용체 결합, 개선된 내재화, 세포 내의 및 핵 내로의 개선된 트래피킹, 바이러스 입자의 개선된 탈각 및 단일-가닥 게놈의 이중-가닥 형태로의 개선된 전환에 의해 실행될 수 있다. 증가된 효율은 또한 변경된 향성 범위 또는 특이적 세포 집단의 표적화에 관련될 수 있으며, 그에 따라 벡터 용량은 그것이 필요하지 않은 조직에의 투여에 의해 희석되지 않는다.
키메라 캡시드 단백질은 천연 발생 AAV 혈청형의 2개 이상의 캡시드 코딩 서열 사이의 재조합에 의해 생성된 것들을 포함한다. 이는 예를 들어 하나의 혈청형의 비-감염성 캡시드 서열을 상이한 혈청형의 캡시드 서열로 공동-형질감염시키고, 지정된 선택을 사용하여 목적하는 특성을 갖는 캡시드 서열에 대해 선택하는 마커 구제 접근법에 의해 수행될 수 있다. 상이한 혈청형의 캡시드 서열은 세포 내의 상동성 재조합에 의해 변경되어 신규 키메라 캡시드 단백질을 생산할 수 있다.
키메라 캡시드 단백질은 또한 2개 이상의 캡시드 단백질 사이에, 예를 들어 상이한 혈청형의 2개 이상의 캡시드 단백질 사이에 특이적 캡시드 단백질 도메인, 표면 루프 또는 특이적 아미노산 잔기를 전달하도록 캡시드 단백질 서열을 조작함으로써 생성된 것들을 포함한다.
셔플드 또는 키메라 캡시드 단백질은 또한 DNA 셔플링에 의해 또는 오류-유발 PCR에 의해 생성될 수 있다. 하이브리드 AAV 캡시드 유전자는 관련된 AAV 유전자, 예를 들어 다수의 상이한 혈청형의 캡시드 단백질을 코딩하는 것들의 서열을 무작위로 단편화하고, 이어서 후속적으로 단편을 또한 서열 상동성의 영역에서 교차를 유발할 수 있는 자기-프라이밍 폴리머라제 반응에서 재어셈블리함으로써 생성될 수 있다. 이러한 방식으로 몇몇 혈청형의 캡시드 유전자를 셔플링함으로써 생성된 하이브리드 AAV 유전자의 라이브러리는 목적하는 기능성을 갖는 바이러스 클론을 확인하기 위해 스크리닝될 수 있다. 유사하게, 오류 유발 PCR은 변이체의 다양한 라이브러리를 생성하기 위해 AAV 캡시드 유전자를 무작위로 돌연변이시키는 데 사용될 수 있으며, 이는 이어서 목적하는 특성에 대해 선택될 수 있다.
캡시드 유전자의 서열은 또한 천연 야생형 서열에 관하여 특이적 결실, 치환 또는 삽입을 도입하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 특히, 캡시드 유전자는 캡시드 코딩 서열의 오픈 리딩 프레임 내에서, 또는 캡시드 코딩 서열의 N- 및/또는 C-말단에서 비관련된 단백질 또는 펩티드의 서열의 삽입에 의해 변형될 수 있다. 이는 예를 들어, 특이적 세포 수용체를 향한 향성을 부여하거나 변화시키기 위해 수행될 수 있다.
비관련된 단백질 또는 펩티드는 유리하게는 특정 세포 유형에 대한 리간드로서 작용하고, 그에 의해 표적 세포에의 개선된 결합을 부여하거나 특정 세포 집단에 대한 벡터의 표적화의 특이성을 개선시키는 것일 수 있다. 예는 망막 색소 상피에서 흡수를 차단하고, 그에 의해 주위의 망막 조직의 형질도입을 증진시키는 RGD 펩티드의 사용을 포함할 수 있다 (Cronin et al. (2008) ARVO Abstract: D1048). 비관련된 단백질은 또한 생산 프로세스의 일부로서 바이러스 입자의 정제를 보조하는 것, 즉, 에피토프 또는 친화성 태그일 수 있다. 삽입의 부위는 전형적으로 바이러스 입자의 다른 기능, 예를 들어 내재화, 바이러스 입자의 트래피킹을 방해하지 않도록 선택될 것이다. 통상의 기술자는 그들의 통상적인 일반적 지식에 기반하여 삽입을 위한 적합한 부위를 확인할 수 있다. 특정 부위는 상기 언급된 문헌 [Choi et al.] 및 [Dalkara et al. (Science, Translational Medicine, 2013; 5(189))]에 개시되어 있다.
본 발명은 추가로 상이한 순서로 AAV 게놈의 서열의 제공 및 천연 AAV 게놈의 그것에 대한 배치를 포괄한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 AAV 서열 또는 유전자의 또 다른 바이러스로부터의 서열로의 또는 하나 초과의 바이러스로부터의 서열로 구성된 키메라 유전자로의 대체를 포괄한다. 이러한 키메라 유전자는 상이한 바이러스 종의 2개 이상의 관련된 바이러스 단백질로부터의 서열로 구성될 수 있다.
본 발명의 AAV 벡터는 AAV 게놈 또는 그의 유도체를 포함하는 뉴클레오티드 서열 및 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자 트랜스진 또는 그의 유도체를 코딩하는 서열의 형태를 취할 수 있다.
본 발명의 AAV 입자는 하나의 혈청형의 ITR을 갖는 AAV 게놈 또는 유도체가 상이한 혈청형의 캡시드에서 패키징되는 캡시드전환된 형태를 포함한다. 본 발명의 AAV 입자는 또한 2개 이상의 상이한 혈청형으로부터의 비변형된 캡시드 단백질의 혼합물이 바이러스 캡시드를 구성하는 모자이크 형태를 포함한다. AAV 입자는 또한 캡시드 표면에 흡착된 리간드를 보유하는 화학적으로 변형된 형태를 포함한다. 예를 들어, 이러한 리간드는 특정 세포 표면 수용체를 표적화하기 위한 항체를 포함할 수 있다.
따라서, 예를 들어, 본 발명의 AAV 입자는 AAV2 게놈 및 AAV2 캡시드 단백질을 갖는 것들 (AAV2/2), AAV2 게놈 및 AAV5 캡시드 단백질을 갖는 것들 (AAV2/5) 및 AAV2 게놈 및 AAV8 캡시드 단백질을 갖는 것들 (AAV2/8), 뿐만 아니라 AAV2 게놈 및 하나 초과의 혈청형의 캡시드 단백질을 갖는 것들을 포함한다.
AAV 벡터는 본원에 언급된 뉴클레오티드 서열의 다수의 카피 (예를 들어, 2개, 3개 등)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 AAV ITR을 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 2개의 AAV ITR을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 그의 5' 단부에 AAV ITR 및 그의 3' 단부에 AAV ITR을 포함한다. 일부 실시양태에서, AAV ITR은 AAV2 또는 AAV8 ITR이다. 바람직한 실시양태에서, AAV ITR은 AAV2 ITR이다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 55의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 5' AAV ITR을 포함한다.
Figure pct00045
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5' ITR의 3' 단부에 바로 인접한 서열식별번호: 56의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
Figure pct00046
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 65의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 5' AAV ITR을 포함한다.
Figure pct00047
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 57의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 3' AAV ITR을 포함한다.
Figure pct00048
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 3' ITR의 5' 단부에 바로 인접한 서열식별번호: 58의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
Figure pct00049
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 66의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 3' AAV ITR을 포함한다.
Figure pct00050
프로모터 및 조절 서열
본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 또한 시험관내에서 또는 생체내에서 항-VEGF 엔티티 및/또는 음성 보체 조절인자 트랜스진의 발현을 허용하는 요소를 포함할 수 있다. 이들은 발현 제어 서열로 지칭될 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 전형적으로 트랜스진을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열 (예를 들어 프로모터 서열을 포함함)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 (a) CMV 프로모터 또는 CAG 프로모터 (임의로 여기서 CMV 또는 CAG 프로모터는 항-VEGF 엔티티 및/또는 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류임); (b) WPRE 조절 요소 (임의로 여기서 WPRE 조절 요소는 항-VEGF 엔티티 및/또는 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 하류임); 및/또는 (c) 폴리-A 신호, 예컨대 소 성장 호르몬 폴리-A 신호 (임의로 여기서 폴리-A 신호는 항-VEGF 엔티티 및/또는 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 하류임)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는
(a) 5' AAV ITR;
(b) 프로모터, 임의로 CMV 프로모터;
(c) 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(d) 링커 (임의로 여기서 링커는 푸린 절단 부위, GSG, 11a1D 및 F2A 서열을 포함하거나 그에 의해 정의됨);
(e) 항-VEGF 엔티티, 바람직하게는 아플리베르셉트를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(f) 임의로, WPRE 조절 요소, 임의로 WPRE3 조절 요소;
(g) 폴리-A 신호, 임의로 소 성장 호르몬 폴리-A 신호; 및
(h) 3' AAV ITR
을 포함한다.
음성 보체 조절인자는 CFI 및 FHL-1로부터 선택될 수 있다.
요소 (c) 및 (e)는 상호간 위치에 있을 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는
(a) 5' AAV ITR;
(b) 프로모터, 임의로 CMV 프로모터;
(c) 항-VEGF 엔티티, 바람직하게는 아플리베르셉트를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(d) 링커 (임의로 여기서 링커는 푸린 절단 부위, GSG, 11a1D 및 F2A 서열을 포함하거나 그에 의해 정의됨);
(e) 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(f) 임의로, WPRE 조절 요소, 임의로 WPRE3 조절 요소;
(g) 폴리-A 신호, 임의로 소 성장 호르몬 폴리-A 신호; 및
(h) 3' AAV ITR
을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는
(a) 5' AAV ITR;
(b) 프로모터, 임의로 CAG 프로모터;
(c) 음성 보체 조절인자, 바람직하게는 FHL-1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(d) 링커 (임의로 여기서 링커는 푸린 절단 부위, GSG, 11a1D 및 F2A 서열을 포함하거나 그에 의해 정의됨);
(e) 항-VEGF 엔티티, 바람직하게는 아플리베르셉트를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(f) 임의로, WPRE 조절 요소, 추가로 임의로 WPRE3 조절 요소;
(g) 폴리-A 신호, 임의로 소 성장 호르몬 폴리-A 신호; 및
(h) 3' AAV ITR
을 포함한다.
요소 (c) 및 (e)는 상호간 위치에 있을 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는
(a) 5' AAV ITR;
(b) 프로모터, 임의로 CAG 프로모터;
(c) 항-VEGF 엔티티, 바람직하게는 아플리베르셉트를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(d) 링커 (임의로 여기서 링커는 푸린 절단 부위, GSG, 11a1D 및 F2A 서열을 포함하거나 그에 의해 정의됨);
(e) 음성 보체 조절인자, 바람직하게는 FHL-1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(f) 임의로, WPRE 조절 요소, 추가로 임의로 WPRE3 조절 요소;
(g) 폴리-A 신호, 임의로 소 성장 호르몬 폴리-A 신호; 및
(h) 3' AAV ITR
을 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 5'에서 3'의 순서로 (a) 내지 (h)를 포함할 수 있다. 적합하게는, (a)는 폴리뉴클레오티드의 5' 단부에 있고, (h)는 폴리뉴클레오티드의 3' 단부에 있다. 적합하게는, (b)는 (c) 내지 (g)의 상류이다. 적합하게는, (f)는 (b) 내지 (e)의 하류이다. 적합하게는, (g)는 (b) 내지 (f)의 하류이다. 적합하게는, (c)는 (d)의 상류이고, (e)는 (d)의 하류이다.
임의의 적합한 프로모터가 사용될 수 있으며, 그의 선택은 통상의 기술자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다. 프로모터 서열은 구성적으로 활성 (즉, 임의의 숙주 세포 배경에서 작동적)일 수 있거나, 대안적으로 단지 특이적 숙주 세포 환경에서만 활성이며, 따라서 특정 세포 유형에서의 트랜스진의 표적화된 발현을 허용할 수 있다 (예를 들어 조직-특이적 프로모터). 프로모터는 또 다른 인자, 예를 들어 숙주 세포에 존재하는 인자의 존재에 반응하여 유도가능한 발현을 나타낼 수 있다. 좌우간, 벡터가 요법을 위해 투여되는 경우, 프로모터는 표적 세포 배경에서 기능적이어야 하는 것이 바람직하다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 트랜스진이 단지 망막 세포 집단에서만 발현되는 것을 허용하기 위해 망막-세포 특이적 발현을 나타내는 것이 바람직하다. 따라서, 프로모터로부터의 발현은 망막-세포 특이적, 예를 들어 단지 감각신경 망막 및 망막 색소 상피의 세포에만 국한될 수 있다. 프로모터는 또한 신경절 세포, 뮐러 세포, 광수용체 세포, 망막 색소 상피 세포, 및/또는 내피 세포에서 발현, 특히 조직- 또는 세포-특이적 발현을 가능하게 할 수 있다.
망막-세포 특이적이 아닌 바람직한 프로모터는 임의로 시토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서 요소와 조합으로 닭 베타-액틴 (CBA) 프로모터를 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 예시 프로모터는 CAG 프로모터, 예를 들어 rAVE 발현 카세트에 사용되는 프로모터이다 (GeneDetect.com).
바람직한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 CMV 프로모터를 포함한다.
예시 CMV 프로모터 서열은
Figure pct00051
이다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 서열식별번호: 59와 적어도 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, 여기서 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 59에 의해 나타내어진 프로모터의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 서열식별번호: 60의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터를 포함한다.
예시 CAG 프로모터 서열은
Figure pct00052
이다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 서열식별번호: 60과 적어도 75%, 80%, 85% 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, 여기서 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 60에 의해 나타내어진 프로모터의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 서열식별번호: 60의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로모터를 포함한다.
망막-특이적 유전자 발현을 유도할 인간 서열에 기반한 프로모터의 예는 간상 및 원추에 대한 로돕신 키나제 (Allocca et al. (2007) J. Virol. 81: 11372-80), 단지 원추에 대한 PR2.1 (Mancuso et al. (2009) Nature 461: 784-7) 및/또는 망막 색소 상피에 대한 RPE65 (Bainbridge et al. (2008) N. Engl. J. Med. 358: 2231-9) 또는 VMD2 (Esumi et al. (2004) J. Biol. Chem. 279: 19064-73)를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 또한 전사 전으로 또는 전사 후로 작용할 수 있는 하나 이상의 추가의 조절 서열을 포함할 수 있다. 조절 서열은 천연 트랜스진 유전자좌의 일부일 수 있거나, 이종 조절 서열일 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 천연 트랜스진 전사체로부터의 5'-UTR 또는 3'-UTR의 부분을 포함할 수 있다.
조절 서열은 트랜스진의 발현을 용이하게 하는, 즉, 전사체의 발현을 증가시키거나, mRNA의 핵 이출을 개선시키거나, 그의 안정성을 증진시키도록 작용하는 임의의 서열이다. 이러한 조절 서열은 예를 들어 인핸서 요소, 전사후 조절 요소 및 폴리아데닐화 부위를 포함한다.
바람직한 폴리아데닐화 부위는 소 성장 호르몬 폴리-A (bGH 폴리-A) 신호이다.
예시 소 성장 호르몬 폴리-A (bGH 폴리-A) 신호는
Figure pct00053
이다.
추가의 예시 소 성장 호르몬 폴리-A (bGH 폴리-A) 신호는
Figure pct00054
이다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 서열식별번호: 61 또는 62와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 바람직하게는, 여기서 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 61 또는 62에 의해 나타내어진 폴리아데닐화 신호의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 서열식별번호: 61 또는 62의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 맥락에서, 이러한 조절 서열은 시스-작용성일 것이다. 그러나, 본 발명은 또한 추가의 유전자 구축물 상에 위치한 트랜스-작용 조절 서열의 용도를 포괄한다.
본 발명의 AAV 벡터에 사용하기 위한 바람직한 전사후 조절 요소는 마멋 간염 전사후 조절 요소 (WPRE) 또는 그의 변이체이다.
예시 WPRE는
Figure pct00055
이다.
WPRE는 감마, 알파 및 베타 요소를 주어진 순서로 함유하는 3부분 요소이다. 단지 최소 감마 및 알파 요소만을 함유하는 WPRE의 단축된 버전 (WPRE3으로 지칭됨; Choi, J.-H. et al. (2014) Molecular Brain 7: 17)은 또한 본 발명에 사용될 수 있다.
예시 WPRE3 서열은
Figure pct00056
이다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 서열식별번호: 63 또는 64와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 전사후 조절 요소를 포함한다. 바람직하게는, 여기서 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 63 또는 64에 의해 나타내어진 전사후 조절 요소의 기능적 활성을 실질적으로 보유한다.
WPRE는 야생형 또는 변형된 마멋 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE) 서열로부터 유래될 수 있다.
다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 서열식별번호: 63 또는 64의 뉴클레오티드 서열을 갖는 전사후 조절 요소를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터에 사용될 수 있는 또 다른 조절 서열은 스캐폴드-부착 영역 (SAR)이다. 추가의 조절 서열은 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
투여의 방법
본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 전신적으로 (예를 들어 말초 정맥 주입에 의해) 투여될 수 있고, 국소적으로 또는 국지적으로 (예를 들어 경막내 주사에 의해 CNS 시스템에) 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 생성물, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 안구내로 투여된다.
용어 "안구내"는 눈의 내부를 지칭하며, 따라서 안구내 투여는 대상체의 눈의 내부에의 투여에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 생성물, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 망막하에, 망막에 직접, 맥락막상에 또는 유리체내 주사에 의해 대상체의 눈에 투여된다. 일부 실시양태에서, 상기 투여는 로봇에 의해 수행된다.
주사되는 의약 조성물의 부피는 예를 들어, 약 10 내지 500 μL, 예를 들어 약 50 내지 500, 100 내지 500, 200 내지 500, 300 내지 500, 400 내지 500, 50 내지 250, 100 내지 250, 200 내지 250 또는 50 내지 150 μL일 수 있다. 부피는 예를 들어, 약 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 μL일 수 있다. 바람직하게는, 주사되는 의약 조성물의 부피는 100 μL이다.
통상의 기술자는 개별적 망막하, 망막에 직접, 맥락막상 또는 유리체내 주사에 익숙하며 이를 잘 수행할 수 있을 것이다.
바람직하게는, 생성물, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 망막하 주사에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 생성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 이를 포함하는 제약 조성물은 대상체의 일생 동안 1회 이하, 또는 2회 이하 투여된다.
망막하 주사
망막하 주사는 망막하 공간 내로의, 즉, 감각신경 망막 밑의 주사이다. 망막하 주사 동안, 주사된 물질은 광수용체 세포 및 망막 색소 상피 (RPE) 층 내로 지향되고, 그 사이의 공간을 생성한다.
주사가 작은 망막절개술을 통해 수행되는 경우, 망막 박리가 생성될 수 있다. 주사된 물질에 의해 생성된 망막의 박리된, 상승된 층은 "수포"로 지칭된다.
망막하 주사에 의해 생성된 구멍은 주사된 용액이 투여 후에 유리체강 내로 유의하게 다시 역류하지 않도록 충분히 작아야 한다. 이러한 역류는 의약이 주사되는 경우 특히 문제가 될 것인데, 이는 의약의 효과가 표적 구역으로부터 멀어지게 될 것이기 때문이다. 바람직하게는, 주사는 감각신경 망막에서 자기-밀봉 진입점을 생성하며, 즉, 주사 바늘이 제거되면, 바늘에 의해 생성된 구멍은 매우 적은 주사된 물질이 구멍을 통해 방출되거나 실질적으로 방출되지 않도록 재밀봉된다.
이 프로세스를 용이하게 하기 위해, 전문 망막하 주사 바늘이 상업적으로 입수가능하다 (예를 들어 DORC 41G 테플론(Teflon) 망막하 주사 바늘, 더치 옵탈믹 리서치 센터 인터내셔날 비브이(Dutch Ophthalmic Research Center International BV), 네덜란드 주이들란트). 이들은 망막하 주사를 수행하도록 디자인된 바늘이다.
주사 동안 망막에 대한 손상이 일어나지 않는 한, 및 유의하게 작은 바늘이 사용되는 한, 실질적으로 모든 주사된 물질은 국재화된 망막 박리의 부위에서 박리된 감각신경 망막 및 RPE 사이에 국재화되어 잔류한다 (즉, 유리체강 내로 역류하지 않음). 사실, 짧은 기간에 걸친 수포의 전형적인 존속은 통상적으로 유리체 내로의 주사된 물질의 탈출이 거의 없음을 지시한다. 수포는 주사된 물질이 흡수됨에 따라 보다 긴 기간에 걸쳐 소멸될 수 있다.
예를 들어 광학 간섭 단층촬영술을 사용한 눈, 특히 망막의 시각화는 수술 전에 이루어질 수 있다.
주사되는 의약 조성물의 부피는 예를 들어, 약 10 내지 500 μL, 예를 들어 약 50 내지 500, 100 내지 500, 200 내지 500, 300 내지 500, 400 내지 500, 50 내지 250, 100 내지 250, 200 내지 250 또는 50 내지 150 μL일 수 있다. 부피는 예를 들어, 약 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 μL일 수 있다. 바람직하게는, 주사되는 의약 조성물의 부피는 100 μL이다. 보다 큰 부피는 망막을 늘어나게 할 위험을 증가시키는 반면, 보다 작은 부피는 보기 곤란할 수 있다.
2-단계 망막하 주사
본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 국재화된 망막 박리가 제1 용액의 망막하 주사에 의해 생성되는 2-단계 방법을 사용함으로써 증가된 정확성 및 안전성으로 전달될 수 있다. 제1 용액은 생성물, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하지 않는다. 이어서 제2 망막하 주사는 제1 망막하 주사에 의해 생성된 수포의 망막하 유체 내로 생성물, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 의약을 전달하는 데 사용된다. 의약을 전달하는 주사는 망막을 박리하는 데 사용되고 있지 않기 때문에, 용액의 특이적 부피는 이 제2 단계에서 주사될 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터의 망막하 주사는 하기 단계를 포함한다:
(a) 망막을 적어도 부분적으로 박리하여 망막하 수포를 형성하는 데 유효한 양으로 망막하 주사에 의해 대상체에게 용액을 투여하는 단계이며, 여기서 용액은 생성물, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하지 않는 것인 단계; 및
(b) 단계 (a)에 의해 형성된 수포 내로 망막하 주사에 의해 의약 조성물을 투여하는 단계이며, 여기서 의약은 생성물, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 것인 단계.
망막을 적어도 부분적으로 박리하기 위해 단계 (a)에서 주사되는 용액의 부피는 예를 들어, 약 10 내지 1000 μL, 예를 들어 약 50 내지 1000, 100 내지 1000, 250 내지 1000, 500 내지 1000, 10 내지 500, 50 내지 500, 100 내지 500, 250 내지 500 μL일 수 있다. 부피는 예를 들어, 약 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 μL일 수 있다.
단계 (b)에서 주사되는 의약 조성물의 부피는 예를 들어, 약 10 내지 500 μL, 예를 들어 약 50 내지 500, 100 내지 500, 200 내지 500, 300 내지 500, 400 내지 500, 50 내지 250, 100 내지 250, 200 내지 250 또는 50 내지 150 μL일 수 있다. 부피는 예를 들어, 약 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 또는 500 μL일 수 있다. 바람직하게는, 단계 (b)에서 주사되는 의약 조성물의 부피는 100 μL이다. 보다 큰 부피는 망막을 늘어나게 할 위험을 증가시키는 반면, 보다 작은 부피는 보기 곤란할 수 있다.
의약을 포함하지 않는 용액 (즉, 단계 (a)의 "용액")은 하기 기재된 바와 같이, 의약을 포함하는 용액과 유사하게 제제화될 수 있다. 의약을 포함하지 않는 바람직한 용액은 망막하 공간의 pH 및 삼투압에 매칭된 균형 염수 용액 (BSS) 또는 유사한 완충제 용액이다.
수술 동안 망막의 시각화
특정 상황 하에서, 예를 들어 말기-단계 망막 변성 동안, 망막을 확인하는 곤란한데, 이는 그것이 얇고, 투명하고, 그것이 놓인 파괴되고 심하게 색소화된 상피에 대해 보기 곤란하기 때문이다. 청색 생염료 (예를 들어 브릴리안트 필(Brilliant Peel)®, 고이더(Geuder); 멤브레인블루-듀얼(MembraneBlue-Dual)®, 도르크(Dorc))의 사용은 망막 박리 절차 (즉, 본 발명의 2-단계 망막하 주사에서 단계 (a))를 위해 만들어진 망막 구멍의 확인을 용이하게 할 수 있으며, 그에 따라 의약은 유리체강 내로의 재역류의 위험 없이 동일한 구멍을 통해 투여될 수 있다.
청색 생염료의 사용은 또한 비후된 내부 제한 막 또는 망막외 막이 있는 망막의 임의의 영역을 확인하는데, 이는 이들 구조 중 어느 하나를 통한 주사가 망막하 공간 내로의 깨끗한 접근을 방해할 것이기 때문이다. 더욱이, 수술 직후 기간에서 이들 구조 중 어느 하나의 수축은 유리체강 내로의 의약의 역류를 초래할 수 있는 망막 진입 구멍의 늘어남을 초래할 수 있다.
맥락막상 주사
본 발명의 생성물, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 마이크로카테터를 이용하는 외부 접근법을 사용하여 맥락막상 공간에 전달될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Peden et al. (2011) PLoS One 6(2): e17140] 참조). 이 방법에서 맨 공막을 노출시키기 위해 윤부 결막 결막절제술, 이어서 맨 맥락막을 노출시키기 위해 공막절개술이 수행된다. 마이크로카테터 (예컨대 임의로 조명 시스템, 예컨대 아이루민(iLumin) 레이저-다이오드 기반 미세-조명 시스템 (아이사이언스 인터벤셔날(iScience Interventional))에 연결된 아이사이언스 인터벤셔날로부터의 아이트랙(iTrack) 250A)은 맥락막상 공간 내로 도입되고, 시신경 원판을 향해 후방으로 진행된다. 목적하는 위치 내로의 마이크로카테터 팁의 조작 후, 생성물, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 주사는 망막 및 맥락막 내에 수포를 형성한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 생성물, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 (i) 맥락막상 공간 내로의 마이크로카테터의 도입; (ii) 팁이 망막의 고통을 받는 영역의 부근에 있을 때까지 상기 공간 내에서 마이크로카테터를 진행시키는 것; 및 (iii) 마이크로카테터 팁으로부터 생성물, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 주사하여 수포를 생성하는 것을 포함하는 방법에 의해 맥락막상으로 전달된다.
일부 실시양태에서, 상기 투여 절차는 로봇에 의해 직접적으로 수행된다.
제약 조성물 및 주사된 용액
본 발명의 의약, 예를 들어 생성물, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 제약 조성물로 제제화될 수 있다. 이들 조성물은 의약 외에도, 제약상 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 완충제, 안정화제 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 비-독성이어야 하고, 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여의 경로, 예를 들어 망막하에, 망막에 직접, 맥락막상에 또는 유리체내 주사에 따라 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.
제약 조성물은 전형적으로 액체 형태이다. 액체 제약 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예컨대 물, 석유, 동물 또는 식물성 오일, 미네랄 오일 또는 합성 오일을 포함한다. 생리학적 염수 용액, 염화마그네슘, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액, 또는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다. 일부 경우에, 계면활성제, 예컨대 플루론산 (PF68) 0.001%가 사용될 수 있다.
고통의 부위에서의 주사를 위해, 활성 성분은 피로겐-무함유이고, 적합한 pH 등장성 및 안정성을 갖는 수용액의 형태일 수 있다. 통상의 기술자는 예를 들어, 등장성 비히클, 예컨대 염화나트륨 주사, 링거 주사 또는 락테이트화 링거 주사를 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제는 필요에 따라 포함될 수 있다.
지연된 방출을 위해, 의약은 저속 방출을 위해 제제화된 제약 조성물에, 예컨대 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 생체적합성 중합체로부터 형성된 마이크로캡슐에 또는 리포솜 담체 시스템에 포함될 수 있다.
치료의 방법
치료에 대한 본원의 모든 언급은 치유적, 임시적 및 예방적 치료를 포함하는 것으로 인정되어야 하지만; 본 발명의 맥락에서 예방에 대한 언급은 보다 통상적으로 예방적 치료와 연관된다. 치료는 또한 질환의 중증도의 진행을 정지시키는 것을 포함할 수 있다.
포유동물, 특히 인간의 치료가 바람직하다. 그러나, 인간 및 수의학 치료 둘 다는 본 발명의 범주 내이다.
본원에 사용된 용어 "조합", 또는 용어 "조합으로", "조합으로 사용되는" 또는 "조합 제제"는 동시에, 순차적으로 또는 별개로 2개 이상의 작용제의 조합된 투여를 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "동시"는 작용제가 공동으로, 즉, 동시에 투여됨을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "순차적"은 작용제가 잇달아서 투여됨을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "별개"는 작용제가 서로에 독립적으로, 그러나 작용제가 조합된, 바람직하게는 상승적 효과를 나타내는 것을 허용하는 시간 간격 내에서 투여됨을 의미한다. 따라서, "별개로" 투여는 하나의 작용제가 다른 것 후 예를 들어 1분, 5분 또는 10분 내에 투여되는 것을 허용할 수 있다.
변이체, 유도체, 유사체, 동족체 및 단편
본원에 언급된 특이적 단백질 및 뉴클레오티드 외에도, 본 발명은 또한 그의 변이체, 유도체, 유사체, 동족체 및 단편의 용도를 포괄한다.
본 발명의 맥락에서, 임의의 주어진 서열의 변이체는 잔기 (아미노산 잔기든 또는 핵산 잔기든)의 특이적 서열이 해당 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 그의 기능을 실질적으로 보유하도록 하는 방식으로 변형된 서열이다. 변이체 서열은 천연-발생 단백질에 존재하는 적어도 하나의 잔기의 부가, 결실, 치환, 변형, 대체 및/또는 변이에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드에 관하여 본원에 사용된 용어 "유도체"는 생성된 단백질 또는 폴리펩티드가 그의 내인성 기능 중 적어도 하나를 실질적으로 보유하는 한, 서열로부터의 또는 서열에 대한 하나 (이상)의 아미노산 잔기의 임의의 치환, 그의 변이, 그의 변형, 그의 대체, 그의 결실 및/또는 그의 부가를 포함한다.
폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 관하여 본원에 사용된 용어 "유사체"는 임의의 모방체, 즉, 그것이 모방하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 내인성 기능 중 적어도 하나를 갖는 화학적 화합물을 포함한다.
전형적으로, 아미노산 치환, 예를 들어 1, 2 또는 3개 내지 10 또는 20개의 치환은, 변형된 서열이 요구되는 활성 또는 능력을 실질적으로 보유하는 한, 이루어질 수 있다. 아미노산 치환은 비-천연 발생 유사체의 사용을 포함할 수 있다.
본 발명에 사용되는 단백질은 또한 침묵 변화를 생성하고 기능적으로 등가의 단백질을 발생시키는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 의도적인 아미노산 치환은, 내인성 기능이 보유되는 한, 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 성질의 유사성에 기반하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양으로 하전된 아미노산은 리신 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 값을 갖는 비하전된 극성 헤드 기를 갖는 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌 및 티로신을 포함한다.
보존적 치환은 예를 들어 하기 표에 따라 이루어질 수 있다. 제2 칼럼에서 동일한 블록에 있는 및 바람직하게는 제3 칼럼에서 동일한 라인에 있는 아미노산은 서로에 대해 치환될 수 있다:
Figure pct00057
본원에 사용된 용어 "동족체"는 야생형 아미노산 서열 및 야생형 뉴클레오티드 서열과 특정 상동성을 갖는 엔티티를 의미한다. 용어 "상동성"은 "동일성"과 동등할 수 있다.
상동성 서열은 대상 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 동일할, 바람직하게는 적어도 95% 또는 97% 또는 99% 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 동족체는 대상 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 등을 포함할 것이다. 상동성은 또한 유사성 (즉, 유사한 화학적 특성/기능을 갖는 아미노산 잔기)의 관점에서 고려될 수 있지만, 본 발명의 맥락에서 서열 동일성의 관점에서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
상동성 서열은 대상 서열과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 동일할, 바람직하게는 적어도 95% 또는 97% 또는 99% 동일할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상동성은 또한 유사성의 관점에서 고려될 수 있지만, 본 발명의 맥락에서 서열 동일성의 관점에서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 본원에서 상세화된 서열식별번호 중 어느 하나와 퍼센트 동일성을 갖는 서열에 대한 언급은 지칭되는 서열식별번호의 전체 길이에 걸쳐 언급된 퍼센트 동일성을 갖는 서열을 지칭한다.
상동성 비교는 눈에 의해, 또는 보다 통상적으로, 용이하게 입수가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 수행될 수 있다. 이들 상업적으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 사이의 백분율 상동성 또는 동일성을 계산할 수 있다.
백분율 상동성은 인접한 서열에 걸쳐 계산될 수 있으며, 즉, 하나의 서열은 다른 서열과 정렬되고, 하나의 서열에서의 각각의 아미노산은 다른 서열에서의 상응하는 아미노산과 한 번에 하나의 잔기씩 직접적으로 비교된다. 이는 "비갭화된" 정렬로 지칭된다. 전형적으로, 이러한 비갭화된 정렬은 단지 상대적으로 짧은 수의 잔기에 걸쳐서만 수행된다.
이는 매우 간단하고 일관된 방법이지만, 이는 예를 들어, 그렇지 않다면 서열의 동일한 쌍에서, 뉴클레오티드 서열에서의 하나의 삽입 또는 결실은 하기 코돈이 정렬로부터 놓여지는 것을 유발할 수 있고, 따라서 전반적 정렬이 수행되는 경우 퍼센트 상동성의 큰 감소를 잠재적으로 발생시킬 수 있음을 고려하는 데 실패한다. 결과적으로, 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 점수를 과도하게 페널티화하지 않으면서 가능한 삽입 및 결실을 고려하는 최적 정렬을 생성하도록 디자인된다. 이는 국소 상동성을 최대화하는 것을 시도하기 위해 서열 정렬에서 "갭"을 삽입함으로써 달성된다.
그러나, 이들 보다 복잡한 방법은 "갭 페널티"를 정렬에서 발생하는 각각의 갭에 할당하며, 그에 따라 동일한 수의 동일한 아미노산에 대해, 2개의 비교되는 서열 사이에 보다 높은 관련성을 반영하는 가능한 한 적은 갭을 갖는 서열 정렬은 많은 갭을 갖는 것보다 더 높은 점수를 달성할 것이다. 갭의 존재에 대한 상대적으로 높은 코스트 및 갭에서의 각각의 후속 잔기에 대한 보다 작은 페널티를 부과하는 "아핀 갭 코스트"가 전형적으로 사용된다. 이는 가장 통상적으로 사용되는 갭 점수화 시스템이다. 높은 갭 페널티는 물론 보다 적은 갭을 갖는 최적화된 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 페널티가 변형되는 것을 허용한다. 그러나, 서열 비교를 위해 이러한 소프트웨어를 사용하는 경우 디폴트 값을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 GCG 위스콘신 베스트핏(Wisconsin Bestfit) 패키지를 사용하는 경우, 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 페널티는 갭에 대해 -12 및 각각의 연장에 대해 -4이다.
따라서, 최대 백분율 상동성의 계산은 먼저 갭 페널티를 고려하여 최적 정렬의 생성을 요구한다. 이러한 정렬을 수행하기 위한 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG 위스콘신 베스트핏 패키지이다 (유니버시티 오브 위스콘신(University of Wisconsin), 미국; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387). 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST 패키지 (문헌 [Ausubel et al. (1999) ibid - Ch. 18] 참조), FASTA (Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) 및 GENEWORKS 비교 툴의 묶음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. BLAST 및 FASTA 둘 다는 오프라인 및 온라인 검색을 위해 이용가능하다 (문헌 [Ausubel et al. (1999) ibid, pages 7-58 to 7-60] 참조). 그러나, 일부 적용에 대해, GCG 베스트핏 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 서열로 지칭되는 또 다른 툴은 또한 단백질 및 뉴클레오티드 서열을 비교하기 위해 이용가능하다 (문헌 [FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50]; [FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8] 참조).
최종 퍼센트 상동성은 동일성의 관점에서 측정될 수 있지만, 정렬 프로세스 자체는 전형적으로 실무율적 쌍 비교에 기반하지 않는다. 대신, 화학적 유사성 또는 진화적 거리에 기반하여 각각의 쌍별 비교에 대한 점수를 할당하는 스케일화된 유사성 점수 매트릭스가 일반적으로 사용된다. 통상적으로 사용되는 이러한 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스이다 - BLAST 프로그램의 묶음에 대한 디폴트 매트릭스. GCG 위스콘신 프로그램은 일반적으로 공개 디폴트 값 또는 공급되는 경우 커스텀 기호 비교 표 중 어느 하나를 사용한다 (추가의 상세사항에 대해서는 사용자 매뉴얼 참조). 일부 적용을 위해, GCG 패키지에 대해 공개 디폴트 값, 또는 다른 소프트웨어의 경우, 디폴트 매트릭스, 예컨대 BLOSUM62를 사용하는 것이 바람직하다.
소프트웨어가 최적 정렬을 생성하였으면, 퍼센트 상동성, 바람직하게는 퍼센트 서열 동일성을 계산하는 것이 가능하다. 소프트웨어는 전형적으로 이를 서열 비교의 일부로서 수행하고, 수치적 결과를 생성한다.
"단편"은 또한 변이체이며, 상기 용어는 전형적으로 기능적으로, 또는 예를 들어, 검정에서 관심의 대상인 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 선택된 영역을 지칭한다. 따라서, "단편"은 전장 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 부분인 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다.
이러한 변이체는 표준 재조합 DNA 기술, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여 제조될 수 있다. 삽입이 이루어져야 하는 경우, 삽입 부위의 양측의 천연-발생 서열에 상응하는 5' 및 3' 플랭킹 영역과 함께 삽입을 코딩하는 합성 DNA가 생성될 수 있다. 플랭킹 영역은 천연-발생 서열에서의 부위에 상응하는 편리한 제한 부위를 함유할 것이며, 그에 따라 서열은 적절한 효소(들)로 커팅되고, 합성 DNA는 커팅부 내로 라이게이션될 수 있다. 이어서 DNA는 본 발명에 따라 발현되어 코딩된 단백질을 생성한다. 이들 방법은 DNA 서열의 조작을 위한 관련 기술분야에 공지된 다수의 표준 기술의 단지 예시이며, 다른 공지된 기술은 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 측면
본 발명의 측면은 하기 넘버링된 단락 (단락)에서 정의된다:
1. (i) 항-VEGF 엔티티; 및 (ii) 음성 보체 조절인자, 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 요법에서의 동시, 별개 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서 포함하는 생성물.
2. 치료되거나 예방되는 질환이 안구 장애인 단락 1에 따른 사용하기 위한 생성물.
3. 안구 장애가 눈의 보체-매개 장애인 단락 2에 따른 사용하기 위한 생성물.
4. 보체-매개 장애가 연령-관련 황반 변성 (AMD), 당뇨병성 망막병증, 녹내장, 스타가르트병, 중심성 장액성 맥락망막병증, 색소성 망막염, 폴립모양 맥락막 혈관병증, 당뇨병성 황반 부종, 분지성 망막 정맥 폐색 또는 포도막염, 바람직하게는 AMD인 단락 3에 따른 사용하기 위한 생성물.
5. AMD가 습성 AMD 및/또는 건성 AMD인 단락 4에 따른 사용하기 위한 생성물.
6. AMD가 습성 AMD이고, 용도가 상기 대상체에서 건성 AMD의 발병을 추가로 예방하고/거나 치료하는 것인 단락 4에 따른 사용하기 위한 생성물.
7. 생성물이 (i) 항-VEGF 엔티티 및 (ii) 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 단락 1 내지 6에 따른 사용하기 위한 생성물.
8. (i) 항-VEGF 엔티티 및 (ii) 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
9. 항-VEGF 엔티티가 Ig 융합 단백질, 항체, 폴리펩티드, 펩티드, 비-항체 스캐폴드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, CRISPR-가이드 가닥 및 압타머로부터 선택되는 것인 단락 7에 따른 사용하기 위한 생성물 또는 단락 8에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드.
10. 항-VEGF 엔티티가 아플리베르셉트, 라니비주맙, 베바시주맙 및 페갑타닙으로부터 선택되는 것인 단락 9에 따른 사용하기 위한 생성물 또는 단리된 폴리뉴클레오티드.
11. 항-VEGF 엔티티가 아플리베르셉트이고, 예를 들어 아플리베르셉트가 서열식별번호: 3 내지 11 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것인 단락 10에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드.
12. 음성 보체 조절인자가 보체 인자 I (CFI), 보체 인자 H 유사 단백질 1 (FHL1), 보체 인자 H (CFH), 보체 수용체 유형 1 (CR1), 막 보조인자 단백질 (MCP), 보체 붕괴-가속화 인자 (DAF), MAC-억제성 단백질 (MAC-IP), C1-억제제, 아나필라톡신 억제제, C4b 결합 단백질 (C4BP), 클루스테린, 비트로넥틴 또는 그의 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 것인 임의의 선행하는 단락에 따른 사용하기 위한 생성물 또는 단리된 폴리뉴클레오티드.
13. 음성 보체 조절인자가 CFI 및 FHL1 또는 그의 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 것인 단락 12에 따른 사용하기 위한 생성물 또는 단리된 폴리뉴클레오티드.
14. 폴리뉴클레오티드가
(a) CMV 또는 CAG 프로모터 (임의로 여기서 CMV 또는 CAG 프로모터는 (i) 및 (ii)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류임);
(b) WPRE 조절 요소 (임의로 여기서 WPRE 조절 요소는 (i) 및 (ii)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 하류임); 및/또는
(c) 폴리-A 신호, 임의로 소 성장 호르몬 폴리-A 신호 (여기서 폴리A 신호는 임의로 (i) 및 (ii)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 하류임)
를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인 단락 7 내지 13 중 임의의 것에 따른 사용하기 위한 생성물 또는 단리된 폴리뉴클레오티드.
15. 폴리뉴클레오티드가 하나 이상의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 역위 말단 반복부 (ITR)를 추가로 포함하는 것인 단락 7 내지 14 중 임의의 것에 따른 사용하기 위한 생성물 또는 단리된 폴리뉴클레오티드.
16. 폴리뉴클레오티드가 그의 5' 단부에 AAV ITR 및 그의 3' 단부에 AAV ITR을 포함하는 것인 단락 7 내지 15 중 임의의 것에 따른 사용하기 위한 생성물 또는 단리된 폴리뉴클레오티드.
17. 폴리뉴클레오티드가
(a) 5' AAV ITR;
(b) CMV 또는 CAG 프로모터;
(c) 항-VEGF 엔티티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(d) 링커 (임의로 여기서 링커는 푸린 절단 부위, GSG, 11aa1D 서열 또는 F2A 서열을 포함하거나 그에 의해 정의됨);
(e) 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(f) 임의로, WPRE 조절 요소 (추가로 임의로 여기서 WPRE 조절 요소는 WPRE3 조절 요소임);
(g) 소 성장 호르몬 폴리-A 신호; 및
(h) 3' AAV ITR
을 포함하는 것인 단락 7 내지 16 중 임의의 것에 따른 사용하기 위한 생성물 또는 단리된 폴리뉴클레오티드.
18. AAV ITR이 AAV2 ITR인 단락 7 내지 17 중 임의의 것에 따른 사용하기 위한 생성물 또는 단리된 폴리뉴클레오티드.
19. 항-VEGF 엔티티 및 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 코돈 최적화된 것인 단락 7 내지 18 중 임의의 것에 따른 사용하기 위한 생성물 또는 단리된 폴리뉴클레오티드.
20. 아플리베르셉트를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 11과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 것인 단락 7 내지 19 중 임의의 것에 따른 사용하기 위한 생성물 또는 단리된 폴리뉴클레오티드.
21. CFI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 35 또는 36과 적어도 75% 서열 동일성을 갖거나, 또는 FHL-1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 41과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 것인 단락 7 내지 20 중 임의의 것에 따른 사용하기 위한 생성물 또는 단리된 폴리뉴클레오티드.
22. 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 45 내지 54의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 단락 7 내지 20 중 임의의 것에 따른 사용하기 위한 생성물 또는 단리된 폴리뉴클레오티드.
23. 폴리뉴클레오티드가 4.7 kb 이하인 단락 7 내지 22 중 임의의 것에 따른 사용하기 위한 생성물 또는 단리된 폴리뉴클레오티드.
24. 단락 8 내지 23 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
25. 벡터가 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터인 단락 24의 벡터.
26. 벡터가 바이러스 벡터 입자의 형태인 단락 24 또는 25의 벡터.
27. AAV 벡터 입자가 AAV2 또는 AAV8 게놈, 및 AAV2 또는 AAV8 캡시드 단백질을 포함하는 것인 단락 26의 벡터.
28. 단락 7 내지 22 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
29. 단락 24 내지 27 중 어느 하나의 벡터로 형질도입된 세포.
30. 단락 8 내지 29 중 어느 하나의 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포를 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함하는 제약 조성물.
31. 요법에 사용하기 위한 단락 8 내지 29 중 어느 하나의 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포.
32. 눈의 보체-매개 장애를 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 단락 8 내지 29 중 어느 하나의 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포.
33. 보체-매개 장애가 연령-관련 황반 변성 (AMD), 당뇨병성 망막병증, 녹내장, 스타가르트병, 중심성 장액성 맥락망막병증, 색소성 망막염, 폴립모양 맥락막 혈관병증, 당뇨병성 황반 부종, 분지성 망막 정맥 폐색 또는 포도막염, 바람직하게는 AMD인 단락 32에 따른 사용하기 위한 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포.
34. AMD가 습성 AMD 및/또는 건성 AMD인 단락 32에 따른 사용하기 위한 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포.
35. AMD가 습성 AMD이고, 용도가 상기 대상체에서 건성 AMD의 발병을 추가로 예방하고/거나 치료하는 것인 단락 33에 따른 사용하기 위한 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포.
36. 지도형 위축의 형성이 예방되거나 감소되고/거나, 지도형 위축의 양이 감소되는 것인 단락 32 내지 35 중 어느 하나에 따른 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포.
37. 지도형 위축의 진행이 감속되는 것인 단락 32 내지 36 중 어느 하나에 따른 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포.
38. 대상체의 치료된 눈에의 투여 후 12개월에 걸쳐 동일한 기간에 걸쳐 비치료된 눈에 비해 지도형 위축 면적의 증가의 적어도 10% 감소가 있는 것인 단락 32 내지 37 중 어느 하나에 따른 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포.
39. 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포의 투여가 대상체에서, 또는 대상체의 눈에서, 예컨대 망막 색소 상피 (RPE)에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 임의로 대상체, 또는 그의 눈 또는 RPE에서의 정상 수준을 초과하는 수준으로 증가시키는 것인 단락 32 내지 38 중 어느 하나에 따른 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포.
40. 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포가 안구내로 투여되는 것인 단락 32 내지 39 중 어느 하나에 따른 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포.
41. 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포가 망막하에, 망막에 직접, 맥락막상에 또는 유리체내 주사에 의해 대상체의 눈에 투여되는 것인 단락 32 내지 40 중 어느 하나에 따른 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포.
42. 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포가 망막하 주사에 의해 대상체의 눈에 투여되는 것인 단락 32 내지 41 중 어느 하나에 따른 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포.
43. 눈의 보체-매개 장애를 치료하거나 예방하는 방법이며, 단락 8 내지 29 중 어느 하나의 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포를 눈의 보체-매개 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
44. (i) 항-VEGF 엔티티; 및 (ii) 음성 보체 조절인자를 대상체에게 제공하는 방법이며, 단락 8 내지 29 중 어느 하나의 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포를 대상체의 눈에 전달하는 것을 포함하는 방법.
45. 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 항-VEGF 엔티티이며, 여기서 항-VEGF 엔티티는 음성 보체 조절인자와 조합으로 사용되는 것인 항-VEGF 엔티티.
46. 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 음성 보체 조절인자이며, 여기서 음성 보체 조절인자는 항-VEGF 엔티티와 조합으로 사용되는 것인 음성 보체 조절인자.
47. 질환이 단락 2 내지 6 중 임의의 것에 나열된 바와 같은 질환인 단락 45에 따른 사용하기 위한 항-VEGF 엔티티 또는 단락 46에 따른 사용하기 위한 음성 보체 조절인자.
48. 항-VEGF 엔티티가 단락 9 내지 11 중 임의의 것에서 정의된 바와 같은 엔티티인 단락 45 또는 47에 따른 사용하기 위한 항-VEGF 엔티티.
49. 음성 보체 조절인자가 단락 12 또는 13에서 정의된 바와 같은 엔티티인 단락 46 또는 47에 따른 사용하기 위한 음성 보체 조절인자.
통상의 기술자는 그들이 개시된 바와 같은 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않으면서 본원에 개시된 본 발명의 모든 특색을 조합할 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명의 바람직한 특색 및 실시양태는 이제 비-제한적 실시예에 의해 기재될 것이다.
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 관련 기술분야의 통상의 기술자의 능력 내인 화학, 생화학, 분자 생물학, 미생물학 및 면역학의 통상적인 기술을 채용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press]; [Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13 and 16, John Wiley & Sons]; [Roe, B., Crabtree, J. and Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons]; [Polak, J.M. and McGee, J.O'D. (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press]; [Gait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press]; 및 [Lilley, D.M. and Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Press]을 참조한다. 각각의 이들 일반 텍스트는 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1 - 아플리베르셉트 서열의 코돈 최적화
아플리베르셉트 단백질 서열을 먼저 www.drugbank.ca로부터 얻었다 (서열식별번호: 1 참조).
'드러그뱅크(Drugbank)'로부터의 단백질 서열을 DNA 서열로 역번역하고, 이를 이어서 인간 VEGF 수용체 및 인간 IgG 단백질 서열과 정렬하고, '야생형' 아플리베르셉트 서열로서 표시하였다. 야생형 아플리베르셉트 DNA 서열을 유도하고, RC288로서 표시된 GT005 백본 내로 서브클로닝하였다. 천연 FHL-1 신호 펩티드를 야생형 아플리베르셉트 서열의 상류에 첨가하여 세포로부터의 분비를 허용하였다. 5가지 온라인 툴을 사용하여 "기본" 서열을 생성하였다 (진아트(GeneArt), 젠스크립트(Genscript), 진와이즈(Genewiz), IDT 및 JCat). 이어서 각각의 기본 서열을 수동으로 최적화하여 암호성 스플라이스 부위, miRNA 결합 부위 및 탠덤 중복 코돈을 제거하였다. 이들 최적화된 서열은 "수동"으로 지정되었다. 각각의 코돈 최적화된 서열을 합성하고, 진와이즈에 의해 GT005 백본 내로 클로닝하였다 (표 1 및 도 1).
표 1: 코돈 최적화된 아플리베르셉트 구축물의 변이 및 온라인 코돈 최적화 툴에 대한 참조 링크를 열거하는 표
Figure pct00058
일반적으로, 모노시스트론성 아플리베르셉트 벡터는 하기로 구성된다:
· 역위 말단 반복부 (ITR)
· CMV 초기 인핸서/닭 β-액틴 (CAG) 프로모터
· 천연 또는 코돈 최적화된 FHL1 분비 신호 펩티드
· 아플리베르셉트는 인간 IgG의 FC 단편의 서열에 융합된 혈관 내피 성장 인자 수용체 VEGFR-1의 제2 결합 도메인 및 VEGFR-2의 제3 결합 도메인으로부터의 서열로 구성된다 (WT = 야생형; co아플리베르셉트 = 코돈 최적화된 아플리베르셉트 서열)
· 마멋 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE)
· 소 성장 호르몬 폴리-아데닐화 신호 (bGHpA)
실시예 2 - 시험관내에서의 벡터화된 아플리베르셉트 발현의 비교
모든 코돈 최적화된 아플리베르셉트 벡터를 삼중 형질감염 방법을 사용하여 AAV2 내로 패키징하였다. 이어서 모든 벡터를 qPCR에 의해 적정하고, MOI 1E4로 HEK293 내로 형질도입하였다. 아플리베르셉트 발현의 수준을 형질도입 후 72시간에 ELISA에 의해 배양 상청액에서 측정하였다. 실험을 2회 반복하였다. 도 2에 제시된 바와 같이, 모든 코돈 최적화된 아플리베르셉트 벡터는 다양한 수준의 발현을 나타내었다.
특히, RC298 (Jcat 기본) 및 RC299 (Jcat 수동)는 비-코돈 최적화된 야생형 서열을 함유하는 대조군 RC288 벡터와 비교하여 가장 높은 수준의 아플리베르셉트 발현을 나타내었다.
웨스턴 블롯 분석을 또한 수행하여 AAV2 벡터로부터의 발현된 아플리베르셉트 단백질의 완전성을 확인하였다. 모든 벡터는 115kDa의 예상된 분자량에서 (비-환원 조건 하에서) 아플리베르셉트 단백질 발현을 입증하였으며, 이는 재조합 아플리베르셉트 단백질과 필적하였다 (도 3A 및 B). 농도계측 분석은 RC298이 도 2에 따른 ELISA 데이터와 일치하게 가장 높은 수준의 아플리베르셉트를 발현하였음을 제시하였다 (도 3C). 특히, RC299는 비정상적 단백질 밴드 패턴을 나타내었으며, 따라서 선택으로부터 배제되었다.
결론적으로, RC298은 비시스트론성 벡터 내로 추진시키기 위한 가장 최적의 코돈 최적화된 아플리베르셉트 서열로서 선택되었다.
실시예 3 - 음성 보체 조절인자 및 아플리베르셉트를 공동-발현하는 비시스트론성 벡터의 구축
푸린 F2A 링커에 의해 연결된 코돈 최적화된 아플리베르셉트 (RC298로부터 유래됨)에 연결된 코돈 최적화된 CFI 또는 코돈 최적화된 FHL1 중 어느 하나의 발현을 유도하는 (CAG 또는 CMV) 프로모터로 구성된 비시스트론성 벡터를 생성하였다. 음성 보체 조절인자 및 알리프베르셉트의 위치는 도 4 및 표 2에 제시된 바와 같이 상이한 배치 사이에 상호교환되었다.
일반적으로, 비시스트론성 아플리베르셉트 벡터는 하기로 구성된다:
· 역위 말단 반복부 (ITR)
· 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 또는 CMV 초기 인핸서/닭 β-액틴 (CAG) 프로모터
· 코돈 최적화된 보체 인자 I (CFI) 또는 코돈 최적화된 FHL1
· 푸린 F2A 절단 펩티드
· 아플리베르셉트 - 인간 IgG의 FC 단편의 서열에 융합된 혈관 내피 성장 인자 수용체 VEGFR-1의 제2 결합 도메인 및 VEGFR-2의 제3 결합 도메인로부터의 서열로 구성됨 (WT = 야생형; co아플리베르셉트 = 코돈 최적화된 아플리베르셉트 서열)
· 마멋 간염 바이러스 전사후 조절 요소 (WPRE) 또는 단지 최소 감마 및 알파 요소만을 함유하는 WPRE의 단축된 버전 (WPRE3)
· 소 성장 호르몬 폴리-아데닐화 신호 (bGHpA)
표 2: 비시스트론성 벡터 및 상응하는 배치를 열거하는 표
Figure pct00059
Figure pct00060
코돈 최적화된 CFI 서열은 서열식별번호: 35이다.
코돈 최적화된 FHL1 서열은 서열식별번호: 41이다.
코돈 최적화된 아플리베르셉트 서열은 서열식별번호: 11이다.
5' ITR은 서열식별번호: 55이다.
CMV 프로모터는 서열식별번호: 59이다.
CAG 프로모터는 서열식별번호: 60이다.
WPRE 서열은 서열식별번호: 63이다.
WPRE3 서열은 서열식별번호: 64이다.
bGHpA 서열은 서열식별번호: 61이다.
3' ITR은 서열식별번호: 57이다.
실시예 4 - 음성 보체 조절인자 및 아플리베르셉트를 공동-발현하는 비시스트론성 벡터의 기능적 특징화
비시스트론성 벡터 발현의 비교를 시험관내 형질도입에 의해 수행하여 도 4에 열거된 비시스트론성 벡터로부터의 아플리베르셉트, CFI 및 FHL1의 발현을 모노시스트론성 대응물에 대해 비교하였다.
비시스트론성 벡터로부터의 아플리베르셉트의 기능적 분석을 수행하여 항-VEGF 결합 및 항-증식 능력을 결정하였다.
모든 비시스트론성 벡터를 삼중 형질감염 방법을 사용하여 AAV8 또는 AAV2 중 어느 하나 내로 패키징하였다. 시험관내 형질도입을 상이한 MOI로 HEK293 세포에서 수행하여 표 2에 열거된 바와 같은 비시스트론성 벡터로부터의 각각의 트랜스진의 발현을 비교하였다. ELISA를 사용하여 각각의 비시스트론성 벡터로부터의 아플리베르셉트, CFI 및 FHL1의 발현 수준을 정량화하였다. 병행하여, 발현을 모노시스트론성 대응물과 비교하였다. AAV8 및 AAV2 비시스트론성 벡터 (RC289 및 RC313)는 형질도입 후 측정가능한 수준의 CFI 및 아플리베르셉트 발현을 나타내었으며, AAV8 및 AAV2 벡터로서 패키징된 RC289로부터의 발현 수준은 모노시스트론성 대응물에 필적하였다 (도 7A 및 B). 대조적으로, RC313은 RC289 및 상응하는 모노시스트론성 벡터에 비해 더 낮은 수준의 발현을 나타내었다. 유사하게, AAV8 및 AAV2 비시스트론성 벡터 (RC304 및 RC312)는 정량화가능한 수준의 FHL-1 및 아플리베르셉트 발현을 나타내었으며, 발현의 수준은 상응하는 모노시스트론성 벡터 (RC146 - 모노시스트론성 FHL1, RC298 - 모노시스트론성 아플리베르셉트)의 그것에 필적하였다 (도 7C 및 D).
추가의 실험에서, 비시스트론성 벡터 RC313, RC289, RC304 및 RC312를 삼중 형질감염 방법을 사용하여 AAV8 내로 패키징하였다. 정제된 벡터를 3 MOI로 HEK293에서 삼중으로 형질도입하였다. 상청액을 취하고, 아플리베르셉트, CFI 및 FHL-1 ELISA에 의해 정량화하였다. CFI-아플리베르셉트 비시스트론성 벡터 (RC313 및 RC289)에 대해, 아플리베르셉트 발현은 2가지 벡터 사이에 유사하였으며, RC289는 RC313보다 더 높은 CFI 발현을 나타내었다 (도 7E). FHL-1-아플리베르셉트 비시스트론성 벡터에 대해, 아플리베르셉트 발현은 다시 벡터 사이에 유사하였으며, RC304는 RC312와 비교하여 MOI 1E4에서 더 높은 FHL-1 발현을 나타내었다 (도 7F). 발현 연구로부터의 동일한 세포 배양 상청액 샘플을 사용하여, 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 모든 비시스트론성 벡터로부터의 단백질 발현을 평가하였다. 비-환원 조건 하에서 모든 세포 배양 상청액은 CFI, FHL-1 및 아플리베르셉트 단백질 발현을 나타내었으며, 모든 비시스트론성 벡터는 재조합 단백질 대조군의 그것과 유사한 예상된 단백질 크기를 발현하였다 (도 8 참조).
이들 결과는 시험된 모든 비시스트론성 벡터가 이중 트랜스진 발현을 가능하게 하였으며, 일부 후보는 모노시스트론성 벡터의 그것과 유사한 발현 수준을 나타내었음을 지시한다. 모든 비시스트론성 벡터는 정확한 크기의 단백질을 발현하였다.
VEGF 결합 검정
VEGFA에 대한 비시스트론성 벡터로부터 발현된 아플리베르셉트의 결합 친화도를 결정하기 위해, 평형 결합 검정을 수행하였다. HEK293 세포를 아플리베르셉트를 발현하는 모노시스트론성 벡터 (RC298), 및 CFI 또는 FHL1 및 아플리베르셉트를 공동-발현하는 비시스트론성 벡터로 형질도입하였다. 형질도입 후 72시간에, 배양 상청액에서의 분비된 아플리베르셉트를 추출하고, ELISA에 의해 정량화하였다. 벡터 및 재조합 아플리베르셉트 (아일리아®)로부터 유래된 분비된 아플리베르셉트의 결합 친화도를 고정된 기간에 걸쳐 인큐베이션된 인간 VEGFA와 아플리베르셉트 (다양한 농도에 걸쳐)의 혼합물에서 유리 (비결합된) 인간 VEGFA를 검출하기 위한 특이적 및 민감성 ELISA를 사용함으로써 측정하였다. 도 9에 제시된 바와 같이, 모노시스트론성 및 비시스트론성 벡터 둘 다로부터 유래된 VEGFA에 대한 아플리베르셉트의 결합 평형 (kD) [IC50]은 아일리아®의 그것과 유사한 것으로 밝혀졌다.
이들 데이터는 디자인된 비시스트론성 벡터가 아일리아®의 그것과 유사한 용량에서 기능하는 아플리베르셉트을 발현할 수 있었음을 입증한다.
VEGF-유도 증식 검정
AAV 벡터 유래 아플리베르셉트가 VEGFA에 효과적으로 결합하고, 세포 증식을 유도하는 VEGF의 능력을 효과적으로 차단하는지 여부를 결정하기 위해, 인간 제대 혈관 내피 (HUVEC) 세포를 설정된 농도의 인간 VEGFA 및 다양한 농도의 아플리베르셉트 (상기와 같이 HEK293 세포의 AAV 형질도입 후 배양된 상청액으로부터 유래됨) 또는 아일리아® (양성 대조군)로 챌린지하였다. 처리 후 72시간에, HUVEC 세포의 VEGF-유도 증식의 억제를 [3-(4,5 디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸륨의 첨가, 및 450/570nm에서의 분광광도법적 분석에 의해 측정하였다. 도 10에 제시된 바와 같이, 모노시스트론성 및 비시스트론성 벡터로부터 유래된 아플리베르셉트는 이들 세포에서 5-일 성장 검정에서 VEGF-유도 증식을 차단하였으며, 관찰된 항-증식 특성은 아일리아®의 그것과 유사하였다.
이들 데이터는 디자인된 비시스트론성 벡터가 아일리아®의 그것과 유사한 용량에서 기능하는 아플리베르셉트를 발현할 수 있음을 입증한다.
C3b 절단 검정
형질도입된 세포로부터 분비된 CFI 또는 FHL1의 기능적 활성을 분석하기 위해, CFI를 발현하는 AAV2 (GT005); FHL1을 발현하는 AAV2 (RC146); CFI 및 아플리베르셉트를 공동-발현하는 AAV2 (RC289 또는 RC313), 또는 FHL1 및 아플리베르셉트를 공동-발현하는 AAV2 (RC312 또는 RC304)로 형질도입된 HEK293 세포로부터의 컨디셔닝된 상청액을 C3b 절단 검정에서 시험하였다 (도 11). 이 검정의 원리는 FHL1의 존재 하에서 C3b를 iC3b로 절단하는 CFI의 능력에 기반한다. iC3b ELISA는 C3b 분해 생성물, iC3b의 양을 정량화한다.
C3b 절단 검정을 1ug C3b를 재조합 FHL1 (GTP 테크) 및 CFI 발현 벡터 (GT005, RC289 및 RC313)로 형질도입된 세포로부터의 상청액과 함께 FHL1: CFI의 4:1 몰 비로 인큐베이션함으로써 수행하였다. 반응 부피를 옵티(Opti)-MEM™ 환원된 혈청 배지로 최대 20ul로 구성하고, 반응물을 37도에서 20분 동안 인큐베이션하였다. FHL1 벡터 (RC146, RC312 또는 RC304)로 형질도입된 세포로부터의 상청액을 재조합 CFI (컴플리먼트 테크놀로지, 인크(Complement Technology, Inc), A138), 1ug C3b (컴플리먼트 테크놀로지, 인크, A113) 및 옵티-MEM™ 혈청 무함유 배지와 함께 FHL1: CFI의 4:1 몰 비로 37℃에서 20분 동안 20ul의 총 부피에서 인큐베이션하였다.
생성된 샘플을 1:100 및 1:400 희석하고, 코팅 항체: 마우스 항-인간 활성화된 C3 (하이컬트(Hycult), HM2168), 검출 항체: 래트 항-C3dg (하이컬트, HM2199), 및 2차 항체: 마우스 항-래트 (서던 바이오테크(Southern Biotech), 3061-05)를 사용하여 iC3b ELISA 상으로 로딩하였다. iC3b 농도 (ng/mL)를 iC3b 정제된 인간 단백질 (컴플리먼트 테크놀로지, 인크)을 사용하여 생성된 표준 곡선에 따라 계산하였다.
재조합 CFI 및 FHL1과 함께 인큐베이션된 C3b는 양성 대조군으로서 역할을 하였다 (도 11, 좌측 막대). C3b 단독 음성 대조군은 C3b이 추가의 성분의 부재 하에서 안정하기 때문에 C3b 분해가 CFI 및 FHL1의 존재를 요구함을 입증하였다. 비형질도입된 세포 (UTD)로부터의 컨디셔닝된 상청액과 함께 인큐베이션된 C3b는 또한 음성 대조군으로서 역할을 하였다. 비시스트론성 벡터로부터의 iC3b 수준을 모노시스트론성 대응물과 비교하였다. iC3b ELISA의 결과는 모든 비시스트론성 벡터로부터 발현된 CFI 및 FHL1이 기능적이며 C3b의 iC3b로의 분해를 용이하게 할 수 있음을 입증하였다 (도 11 참조).
생체내 연구
설치류에서의 비시스트론성 벡터로부터의 음성 보체 조절인자 및 아플리베르셉트의 발현을 결정하기 위한 생체내 비시스트론성 발현 및 효능 연구를 수행한다. 레이저 CNV 마우스 모델에서의 비시스트론성 벡터의 효능을 입증하기 위한 연구를 또한 수행한다.
실시예 5 - CNV의 마우스 모델에서의 CFI 또는 FHL1을 발현하는 모노시스트론성 벡터의 투여
AAV 벡터를 먼저 마우스 눈 내로 망막하로 전달하고, 4주 동안 방치한다. 제0일에, 모든 사전-주사된 눈을 브루흐(Bruch) 막의 레이저 버닝에 의해 레이저 유도 CNV 병변으로 처리한다. 아플리베르셉트 (아일리아®)를 또한 양성 대조군 그룹에 대해 CNV 병변 눈 내로 유리체내 주사를 통해 전달한다. 광학 간섭 단층촬영술 및 플루오레세인 혈관촬영술을 사용하여 제0일 및 제4일에 각각 망막 구조 및 CNV 병변 영역을 화상화한다. 레이저 버닝 후 제7일에, 모든 마우스를 도태시키고, CNV 면적 (이소렉틴 염색에 의해 결정됨), CNV 누출 면적 및 CNV 점수 (등급화됨)를 1차 및 2차 종점으로서 측정한다 (도 6 참조).
실시예 6 - 생체내 발현 연구
모노시스트론성 발현 데이터
항-VEGF (아플리베르셉트)를 발현하는 AAV8 (모노시스트론성) 벡터를 하기 그룹에 따라 9-주령 C57BL/6JRj 수컷 마우스의 우측 눈 내로 망막하로 투여하였다. 성공적인 망막하 투여를 스펙트럼-도메인 광학 간섭 단층촬영술 (SD-OCT)을 사용하여 확인하였다.
그룹 1: AAV8 RC298, 용량 5e7 vg/눈 (n = 9);
그룹 2: AAV8 RC298, 용량 2e8 vg/눈 (n = 10);
그룹 3: AAV8 RC298, 용량 5e8 vg/눈 (n = 10);
그룹 4: AAV8 RC298, 용량 2e9 vg/눈 (n = 10);
그룹 5: AAV8 RC298, 용량 5e9 vg/눈 (n= 10);
그룹 6: AAV8 RC298, 용량 1e10 vg/눈 (n = 9).
각각의 동물의 대측성 눈은 비주사된 대조군으로서 역할을 하였다. 주사 후 5주에, 모든 동물을 희생시켰다. 주사된 및 대측성 비주사된 둘 다의 눈을 절개하고, 안구 유체를 스크류 캡핑된 튜브에서 40 μl의 PBS (프로테아제 억제제를 함유함)에서 수집하고, 단백질 분석까지 순간 동결시켰다. 후방 아이컵을 50 μl의 RNA레이터 용액을 함유하는 신선한 튜브 내로 정치하고, 절개 가위로 추가로 파괴하였다. 이어서 절개된 아이컵을 액체 질소에서 30초 동안 순간 동결시키고, β-메르캅토에탄올을 함유하는 50 uL RLT 완충제를 첨가한 후, 균질화기를 사용하여 2분 동안 추가의 균질화로 처리하였다. β-메르캅토에탄올을 갖는 200 uL RLT 완충제를 아이컵 균질화물에 첨가하고, 상하로 피펫팅함으로써 혼합하였다. 모든 아이컵 균질화물을 RNA 추출 전에 -80℃에서 적어도 24시간 동안 저장하였다.
RNA 추출 및 정량적 RT-PCR
RNA를 RN이지 미니 (RNeasy Mini) 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜 (퀴아젠(Qiagen))에 따라 래트 후방 아이컵 조직으로부터 단리하였다. 동결된 아이컵 균질화물을 퀴아쉬레더(QIAshredder)를 사용함으로써 기계적 파쇄로 처리된 얼음 상에서 해동시켰다. 파쇄 후, 70% EtOH를 균질화물에 첨가하고, 이어서 혼합물을 RN이지 칼럼에 옮겼다. 칼럼을 원심분리하고, RW1 완충제로 세척하였다. 이어서 칼럼 막을 실온에서 15분 동안 인큐베이션에 의해 DN아제I로 처리한 후, RW1 및 RPE 완충제로 추가로 세척하였다. 이어서 RNA를 50 μL의 최종 부피에서 RN아제-무함유수로 용리하였다. 이어서 각각의 샘플의 RNA 농도를 네오도트(NeoDot) 나노분광계 (제네론(Generon))를 사용하여 측정하였다.
역전사를 슈퍼스크립트(SuperScript) III 리버스 트랜스크립타제 키트 (인비트로젠(Invitrogen))를 사용하여 수행하였다. 트랜스진-유래 mRNA를 뮤린 샘플에 대한 bGHpA 서열을 표적화하는 하기 프라이머를 사용함으로써 정량화하였다: bGHpA FR 5'-CATCGCATTGTCTGAGTAGGT-3' 및 bGHpA Rv 5'-AGCATGCCTGCTATTGTCTT-3'. 모든 qRT-PCR을 SYBR 그린(Green) 화학을 갖는 CFX96 터치(Touch) 실시간 PCR 검출 시스템 (바이오래드(BioRad))을 사용하여 수행하였다. 표준물로서, 공지된 농도로 희석된 선형화된 트랜스진 플라스미드를 사용하였다. SYBR 그린 적용을 하기와 같이 수행하였다: 95℃에서 3분 동안 초기 변성, 이어서 95℃에서 10초 및 56℃에서 30초의 40 사이클.
도 12는 그룹 1 내지 6에 대한 아플리베르셉트 mRNA 발현을 제시한다.
아플리베르셉트 발현의 정량
안구 유체에서의 비결합된 아플리베르셉트를 정량적 샌드위치 유형 ELISA를 사용하여 제조업체의 프로토콜 (이뮤노가이드(ImmunoGuide))에 따라 측정하였다. 간략하게, 희석된 아플리베르셉트 표준물 및 안구 유체 샘플을 재조합 인간 혈관 내피 성장 인자-A (rhVEGF-A)로 코팅된 마이크로타이터 플레이트에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 웰을 세척하고, 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 접합된 항-인간 IgG 모노클로날 항체를 첨가하여 웰의 표면 상에 rhVEGF-A에 의해 사전-포획된 아플리베르셉트의 Fc 부분에 결합시켰다. 인큐베이션 후, 웰을 세척하고, 결합된 효소 활성을 크로모겐-기재의 첨가에 의해 검출하였다. 전개된 색상은 샘플 또는 표준물에서의 아플리베르셉트의 양에 비례하였으며, 광학 밀도 (OD)를 450 nm에서 광도계로 측정하였다 (OD620 nm에서의 참조물은 임의적이었음).
도 13은 그룹 1 내지 6에 대한 아플리베르셉트 단백질 발현을 제시한다.
비시스트론성 발현 데이터
항VEGF (아플리베르셉트) 및 보체 조절인자 (hCFI 또는 FHL-1)를 공동-발현하는 비시스트론성 AAV 벡터를 10-주령 C57BL/6 수컷 마우스의 우측 눈 (OD) 내로 망막하로 투여하였다. 성공적인 망막하 투여를 스펙트럼-도메인 광학 간섭 단층촬영술 (SD-OCT)을 사용하여 확인하였다. 각각의 동물의 대측성 눈은 비주사된 대조군으로서 역할을 하였다. 4주 후 마우스를 희생시키고, 안구 유체 및 후방 아이 컵을 수집하였다.
연구는 8개의 처리 그룹으로 이루어졌다:
그룹 1: AAV8-RC313, 5x107 vg/눈 (n= 10마리의 마우스);
그룹 2: AAV8-RC313, 5x108 vg/눈 (n= 10);
그룹 3: AAV8-RC289, 5x107 vg/눈 (n= 10);
그룹 4: AAV8-RC289, 5x108 vg/눈 (n= 10);
그룹 5: AAV8-RC304, 5x107 vg/눈 (n= 9);
그룹 6: AAV8-RC304, 5x108 vg/눈 (n= 10);
그룹 7: AAV8-RC312, 5x107 vg/눈 (n= 9);
그룹 8: AAV8-RC312, 5x108 vg/눈 (n= 10).
RNA 추출 및 정량적 RT-PCR
후방 아이컵을 50 μl의 RNA레이터 용액을 함유하는 신선한 튜브 내로 정치하고, 절개 가위로 추가로 파괴하였다. 이어서 절개된 아이컵을 액체 질소에서 30초 동안 순간 동결시키고, β-메르캅토에탄올을 함유하는 50 uL RLT 완충제를 첨가한 후, 균질화기를 사용하여 2분 동안 추가의 균질화로 처리하였다. β-메르캅토에탄올을 갖는 200 uL RLT 완충제를 아이컵 균질화물에 첨가하고, 상하로 피펫팅함으로써 혼합하였다. 모든 아이컵 균질화물을 RNA 추출 전에 -80℃에서 적어도 24시간 동안 저장하였다.
RNA를 RN이지 미니 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜 (퀴아젠)에 따라 래트 후방 아이컵 조직으로부터 단리하였다. 동결된 아이컵 균질화물을 퀴아쉬레더를 사용함으로써 기계적 파쇄로 처리된 얼음 상에서 해동시켰다. 파쇄 후, 70% EtOH를 균질화물에 첨가하고, 이어서 혼합물을 RN이지 칼럼에 옮겼다. 칼럼을 원심분리하고, RW1 완충제로 세척하였다. 이어서 칼럼 막을 실온에서 15분 동안 인큐베이션에 의해 DN아제I로 처리한 후, RW1 및 RPE 완충제로 추가로 세척하였다. 이어서 RNA를 50 μL의 최종 부피에서 RN아제-무함유수로 용리하였다. 이어서 각각의 샘플의 RNA 농도를 네오도트 나노분광계 (제네론)를 사용하여 측정하였다.
역전사를 슈퍼스크립트 III 리버스 트랜스크립타제 키트 (인비트로젠)를 사용하여 수행하였다. 트랜스진-유래 mRNA를 뮤린 샘플에 대해 bGHpA 서열을 표적화하는 하기 프라이머를 사용함으로써 정량화하였다: bGHpA FR 5'-CATCGCATTGTCTGAGTAGGT-3' 및 bGHpA Rv 5'-AGCATGCCTGCTATTGTCTT-3'. 모든 qRT-PCR을 SYBR 그린 화학을 갖는 CFX96 터치 실시간 PCR 검출 시스템 (바이오래드)을 사용하여 수행하였다. 표준물로서, 공지된 농도로 희석된 선형화된 트랜스진 플라스미드를 사용하였다. SYBR 그린 적용을 하기와 같이 수행하였다: 95℃에서 3분 동안 초기 변성, 이어서 95℃에서 10초 및 56℃에서 30초의 40 사이클.
도 14는 비시스트론성 벡터로부터의 아플리베르셉트 mRNA 발현을 제시한다.
아플리베르셉트 및 보체 발현의 정량
아플리베르셉트
안구 유체에서의 비결합된 아플리베르셉트를 정량적 샌드위치 유형 ELISA를 사용하여 제조업체의 프로토콜 (이뮤노가이드)에 따라 측정하였다. 간략하게, 희석된 아플리베르셉트 표준물 및 안구 유체 샘플을 재조합 인간 혈관 내피 성장 인자-A (rhVEGF-A)로 코팅된 마이크로타이터 플레이트에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 웰을 세척하고, 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 접합된 항-인간 IgG 모노클로날 항체를 첨가하여 웰의 표면 상에 rhVEGF-A에 의해 사전-포획된 아플리베르셉트의 Fc 부분에 결합시켰다. 인큐베이션 후, 웰을 세척하고, 결합된 효소 활성을 크로모겐-기재의 첨가에 의해 검출하였다. 전개된 색상은 샘플 또는 표준물에서의 아플리베르셉트의 양에 비례하였으며, 광학 밀도 (OD)를 450 nm에서 광도계로 측정하였다 (OD620 nm에서의 참조물은 임의적이었음).
안구 유체에서의 CFI 단백질 발현
안구 유체에서의 인간 CFI를 MSD의 전자화학발광 검출 기술을 사용하여 정량화하였다. MSD 골드(Gold) 96-웰 작은 스폿 스트렙타비딘 섹터(Sector) 플레이트를 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 (850RPM) 비오티닐화 항-CFI 항체로 코팅하였다. CFI 표준물 (컴플리먼트 테크놀로지) 및 샘플을 그에 따라 희석하였다. 플레이트를 PBS-트윈(Tween) 0.05%로 세척하고, 25 uL의 표준물, 대조군 및 샘플을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 (850RPM) 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 이전과 같이 세척하고, 25 uL의 항 FI (항-FI, A231) 검출 항체를 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 (850RPM) 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 이전과 같이 세척하고, 150ul의 2X 판독 완충제 T를 각각의 웰에 첨가한 후, MSD 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.
안구 유체에서의 FHL-1 단백질 발현
안구 유체에서의 FHL-1을 MSD의 전자화학발광 검출 기술을 사용하여 정량화하였다. MSD 골드 96-웰 스트렙타비딘 섹터 플레이트를 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 (850RPM) 비오티닐화 항-FHL-1 항체로 코팅하였다. FHL-1 표준물 및 샘플을 그에 따라 희석하였다. 플레이트를 PBS-트윈 0.05%로 세척하고, 25 uL의 표준물, 대조군 및 샘플을 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 (850RPM) 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 이전과 같이 세척하고, 25 uL의 항 FH 검출 항체 (항-FH, MA170057, 인비트로젠)를 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 (850RPM) 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 이전과 같이 세척하고, 150ul의 2X 판독 완충제 T를 각각의 웰에 첨가한 후, MSD 플레이트 판독기 상에서 판독하였다.
도 15는 비시스트론성 벡터로부터의 아플리베르셉트, CFI 및 FHL1 단백질 발현을 제시한다.
실시예 7 - 뮤린 레이저-유도 맥락막 혈관신생 모델에서의 생체내 효능
마우스의 5개의 그룹은 상이한 AAV 벡터의 일방 (우측 눈) 망막하 주사를 받았다. 성공적인 망막하 치료 투여를 AAV 투여 직후 스펙트럼-도메인 광학 간섭 단층촬영술 (SD-OCT)을 사용하여 확인하였다. 벡터의 투여 후 4주에, CNV를 레이저 광응고에 의해 유도하였다. 간략하게, 마취된 동물은 동공을 확장시키기 위해 한 방울의 0.5% 트로피카미드 (오프탄 트로피카미드(Oftan Tropicamid), 산텐 오와이(Santen Oy))를 받았다. 한 방울의 비스코티어스(Viscotears) (닥터 게하르트 만 켐. -팜.(Dr. Gerhard Mann Chem. -Pharm.), 독일)를 눈 상에 적용하고, 커버슬립을 사용하여 각막을 압평하였다. 3개의 레이저 병변을 532 nm 다이오드 레이저 (스폿 크기: 100 μm; 전력: 130 mW; 시간: 120 ms. 오큐라이트 TX(Oculight TX). 이리덱스 코포레이션(Iridex Corp.), 미국)를 사용하여 시신경 머리 주위의 우측 눈 상에 일방으로 실행하였다. CNV 병변의 성공적인 생성을 SD-OCT 및 플루오레세인 혈관촬영술 (FA)을 사용함으로써 확인하였다. CNV 유도 직후, 마우스의 추가의 그룹은 아플리베르셉트의 유리체내 투여를 받았다. 마우스를 SD-OCT 및 FA로의 레이저화 후 제4일 및 제7일에 다시 화상화하고, 이어서 희생시켰다.
레이저화된 눈을 적출하고, 절개하였다. 맥락막 플랫 마운트를 제조하고, 플루오레세인-표지된 그리포니아 심플리시폴리아 렉틴(Griffonia Simplicifolia Lectin) I (GSLI) 이소렉틴 B4 (FL-1201, 벡터 래버러토리스(Vector Laboratories), 미국)로 염색하여 혈관신생을 평가하였다. 간략하게, 플랫 마운트를 트리스(Tris)-완충 염수 (TBS)로 세척하고, 10 % 정상 염소 혈청 (NGS), TBS pH 7.4 (TBST) 중 0.5 % 트리톤(Triton) X-100으로 실온 (RT)에서 1시간 동안 차단하였다. 샘플을 TBS로 세척하고, 플루오레세인-표지된 이소렉틴 GS-IB4 (1:200, 벡터 래버러토리스)와 함께 0.1 % TBST에 희석된 1 % NGS에서 +4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후, 샘플을 0.1 % TBST에서 희석된 1 % NGS로 3 x 10분 세척하고, DAPI로 반대염색하고, 현미경 슬라이드 상에서 플루오로쉴드(Fluoroshield)™ 마운팅 배지 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))로 마운팅하였다. 맥락막 샘플을 DMi8 THUNDER 3D 현미경 (레이카 미크로시스템스(Leica Microsystems), 독일)을 사용하여 화상화하였다. 염색된 면적을 윤곽화하고, 염색된 면적을 화상 프로세싱 소프트웨어 FIJI를 사용하여 측정하였다 (Schindelin et al. 2012).
그룹 1: RC268, 널, 제-28일에 5E8 및 CNV 유도;
그룹 2: RC289, 제-28일에 5E7 및 CNV 유도;
그룹 3: RC289, 제-28일에 5E8 및 CNV 유도;
그룹 4: RC304, 제-28일에 5E7 및 CNV 유도;
그룹 5: RC304, 제-28일에 5E8 및 CNV 유도;
그룹 6: 제0일에 CNV 유도 및 아플리베르셉트 (80 μg/눈) 처리.
CNV 누출 면적 및 CNV 병변 크기의 정량
플루오레세인 혈관촬영술 (FA): 맥락막 수준에서의 혈관 누출을 하이델베르크 스펙트랄리스(Heidelberg Spectralis) HRA 시스템 (하이델베르크 엔지니어링(Heidelberg Engineering), 독일)을 사용하여 조사하였다. 간략하게, 한 방울의 0.5% 트로피카미드 (오프탄 트로피카미드. 산텐 오와이)를 동공을 확장시키기 위해 마취된 마우스의 각막 상에 투여하고, 마우스를 마우스 홀더 상에 정치하였다. 적외선 반사율 카메라를 사용하여 망막 수준에서 시신경 머리를 정렬한 후, 2.5 % 나트륨 플루오레세인의 용액 (시그마-알드리치, 핀란드)을 s.c. 주사 (30 μl/10 g)로서 투여하였다. 연속적 형광 화상 (민감도: 45; ART 평균: 5 프레임)을 플루오레세인 투여 후 5분의 기간 동안 망막 및 맥락막 초점 수준으로부터 60초마다 취하였다.
스펙트럼 도메인 광학 간섭 단층촬영술 (SD-OCT): SD-OCT를 수행하여 CNV 유도 전 및 후, 및 CNV 유도 후 제4일 및 제7일에서의 망막하 투여를 확인하였다. FA 화상화 직후, 마우스를 SD-OCT 시스템 엔비스(Envisu) R2200 (비옵티겐 인크.(Bioptigen Inc.)/레이카 미크로시스템스, 미국)을 사용하여 조사하였다. 스캐닝된 면적은 시신경 주위에 집중된 망막의 1.4 x 1.4 mm2를 커버한다. 각각의 스캔은 각각의 하나가 1000 A 스캔으로 구성된 100 B 스캔으로 구성된다.
CNV 누출 면적을 FA 안저 화상화 및 후속 AI 화상 분석에 의해 평가하였다. FA 스캔을 시멘틱 세그멘테이션 및 전통적인 컴퓨터 시각 알고리즘을 위해 디자인된 컨볼루션 신경 네트워크 (CNN)의 조합을 사용하는 등록상표 알고리즘에 의해 분석하였다. 신경 네트워크는 전이 학습 접근법을 사용하여 CNV 병변을 인식하고 정량화하도록 훈련되었다. 모델로부터의 결과를 검토하고, 필요에 따라 치료에 맹검인 과학자에 의해 조정하였다.
레이저화된 면적을 FA 스캔으로부터 누출성 또는 비-누출성으로서 정성적으로 등급화하고, SD-OCT 스캔으로부터 확인하였다.
데이터 분석
정량적 데이터를 그래프화하고, 분석하고, 평균 ± 표준 편차 (SD)로서 제시하였다. 통계적 분석을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어 (v8.0.1 그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software). 미국)를 사용하여 수행하였다. 차이는 p < 0.05 수준에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
결과는 도 16에 제시된다.
상기 명세서에 언급된 모든 간행물은 본원에 참조로 포함된다. 본 발명의 개시된 작용제, 조성물, 용도 및 방법의 다양한 변형 및 변이는 본 발명의 범주 및 정신으로부터 벗어나지 않으면서 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 본 발명은 구체적인 바람직한 실시양태에 관하여 개시되었지만, 청구된 바와 같은 본 발명은 이러한 구체적인 실시양태에 과도하게 제한되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 사실, 통상의 기술자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위한 개시된 방식의 다양한 변형은 하기 청구범위의 범주 내인 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Gyroscope Therapeutics Limited <120> Product <130> P121218PCT <150> GB 2016463.8 <151> 2020-10-16 <160> 68 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 431 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> illustrative aflibercept amino acid sequence <400> 1 Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu 1 5 10 15 Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val 20 25 30 Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr 35 40 45 Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe 50 55 60 Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu 65 70 75 80 Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg 85 90 95 Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile 100 105 110 Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr 115 120 125 Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys 130 135 140 His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly 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480 agtgagatga agaaattttt gagcacctta actatagatg gtgtaacccg gagtgaccaa 540 ggattgtaca cctgtgcagc atccagtggg ctgatgacca agaagaacag cacatttgtc 600 agggtccatg aaaaagacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 660 gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 720 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 780 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 840 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 900 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 960 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1020 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1080 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1140 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1200 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1260 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggttga 1296 <210> 3 <211> 1296 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Illustrative codon optimized nucleotide sequences encoding aflibercept <400> 3 tctgataccg gcagaccctt cgtggaaatg tacagcgaga tccccgagat catccacatg 60 accgagggca gagagctggt catcccctgc agagtgacaa gccccaacat caccgtgact 120 ctgaagaagt tccctctgga cacactgatc cccgacggca agagaatcat ctgggacagc 180 cggaagggct tcatcatcag caacgccacc tacaaagaga tcggcctgct gacctgtgaa 240 gccaccgtga atggccacct gtacaagacc aactacctga cacacagaca gaccaacacc 300 atcatcgacg tggtgctgag ccctagccac ggcattgaac tgtctgtggg cgagaagctg 360 gtgctgaact gtaccgccag aaccgagctg aacgtgggca tcgacttcaa ctgggagtac 420 cccagcagca agcaccagca caagaaactg gtcaaccggg acctgaaaac ccagagcggc 480 agcgagatga agaaattcct gagcaccctg accatcgacg gcgtgaccag atctgaccag 540 ggcctgtaca catgtgccgc cagctctggc ctgatgacca agaaaaacag caccttcgtg 600 cgggtgcacg agaaggacaa gacccacacc tgtcctccat gtcctgctcc agaactgctc 660 ggcggacctt ccgtgttcct gtttcctcca aagcctaagg acaccctgat gatcagcaga 720 acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggat gtgtcccacg aggatcccga 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cagagcagcg gcctgtacag cctgagcagc gtggtgaccg tgcccagcag cagcctgggc 600 acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaag 660 gtggagccca agagctgcga caagacccac ctg 693 <210> 15 <211> 642 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Examples polynucleotide sequence encoding Ranibizumab light chain variable polypeptide <400> 15 gacatccagc tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60 atcacctgca gcgccagcca ggacatcagc aactacctga actggtacca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaaggtgct gatctacttc accagcagcc tgcacagcgg cgtgcccagc 180 cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcaccg tgccctggac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggagatcaa gcgcaccgtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600 ctgagcagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cgcggcgagt gc 642 <210> 16 <211> 453 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Bevacizumab heavy chain <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60 Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 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Illustrative polynucleotide sequences encoding a CFH signal peptide <400> 25 atgcggctgc tggccaagat catctgcctg atgctgtggg ccatctgcgt ggca 54 <210> 26 <211> 54 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Illustrative polynucleotide sequences encoding a CFH signal peptide <400> 26 atgcggctgc tcgccaagat catttgcctg atgctgtggg ccatctgcgt ggca 54 <210> 27 <211> 54 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Illustrative polynucleotide sequences encoding a CFH signal peptide <400> 27 atgagactgc tcgccaagat catctgtctg atgctgtggg ctatctgtgt cgct 54 <210> 28 <211> 54 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Illustrative polynucleotide sequences encoding a CFH signal peptide <400> 28 atgagactgc tcgccaagat catttgtctg atgctgtggg ctatctgtgt cgct 54 <210> 29 <211> 54 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Illustrative polynucleotide sequences encoding a CFH signal peptide <400> 29 atgcgcttgc tggcgaagat aatctgcctg atgttgtggg ccatatgcgt agcc 54 <210> 30 <211> 54 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Illustrative polynucleotide sequences encoding a CFH signal peptide <400> 30 atgcgcttgc tggcgaagat aatctgcctg atgttgtggg ccatatgcgt agcc 54 <210> 31 <211> 54 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Illustrative polynucleotide sequences encoding a CFH signal peptide <400> 31 atgcgcctgc tggccaagat catctgcctg atgctgtggg ccatctgcgt ggcc 54 <210> 32 <211> 583 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Complement Factor I <400> 32 Met Lys Leu Leu His Val Phe Leu Leu Phe Leu Cys Phe His Leu Arg 1 5 10 15 Phe Cys Lys Val Thr Tyr Thr Ser Gln Glu Asp Leu Val Glu Lys Lys 20 25 30 Cys Leu Ala Lys Lys Tyr Thr His Leu Ser Cys Asp Lys Val Phe Cys 35 40 45 Gln Pro Trp Gln Arg Cys Ile Glu Gly Thr Cys Val Cys Lys Leu Pro 50 55 60 Tyr Gln Cys Pro Lys Asn Gly Thr Ala Val Cys Ala Thr Asn Arg Arg 65 70 75 80 Ser Phe Pro Thr Tyr Cys Gln Gln Lys Ser Leu Glu Cys Leu His Pro 85 90 95 Gly Thr Lys Phe Leu Asn Asn Gly Thr Cys Thr Ala Glu Gly Lys Phe 100 105 110 Ser Val Ser Leu Lys His Gly Asn Thr Asp Ser Glu Gly Ile Val Glu 115 120 125 Val Lys Leu Val 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tcacgagaac 1260 tacaatgccg gcacatatca gaacgacatc gccctgatcg agatgaagaa ggatggcaat 1320 aagaaggact gtgagctgcc cagatccatc cctgcatgcg tgccatggag cccctatctg 1380 ttccagccca acgatacctg catcgtgtcc ggatggggaa gggagaagga caatgagcgg 1440 gtgttttctc tgcagtgggg cgaggtgaag ctgatctcca actgttctaa gttctacggc 1500 aataggtttt atgagaagga gatggagtgc gccggcacct acgatggcag catcgacgcc 1560 tgtaagggcg attccggagg accactggtg tgcatggacg caaacaatgt gacatacgtg 1620 tggggagtgg tgtcctgggg agagaactgc ggcaagccag agttccccgg cgtatatacc 1680 aaggtggcca attattttga ttggatttcc taccacgtcg gcaggccctt tatttcccag 1740 tataatgtct aa 1752 <210> 37 <211> 1231 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Complement Factor H <400> 37 Met Arg Leu Leu Ala Lys Ile Ile Cys Leu Met Leu Trp Ala Ile Cys 1 5 10 15 Val Ala Glu Asp Cys Asn Glu Leu Pro Pro Arg Arg Asn Thr Glu Ile 20 25 30 Leu Thr Gly Ser Trp Ser Asp Gln Thr Tyr Pro Glu Gly Thr Gln Ala 35 40 45 Ile Tyr Lys Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Val Ile Met 50 55 60 Val Cys Arg Lys Gly 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ggagatctcc tgcaagtctc ccgacgtgat caacggcagc 1740 ccaatcagcc agaagattat ttacaaagag aacgagcgct tccagtacaa gtgtaacatg 1800 ggctatgagt attcagagag gggagatgcc gtctgcactg agagcggctg gagaccactg 1860 cctagctgcg aggaaaagag ttgtgacaac ccttacatcc caaatggcga ctactcccct 1920 ctgcggatca aacaccggac cggggatgaa atcacctatc agtgccgcaa tggattctac 1980 ccggccaccc gcggcaacac cgccaaatgc accagcacag gctggatccc cgccccccgc 2040 tgtacgctga agccttgcga ctatccagac atcaagcacg gaggcctgta ccacgaaaac 2100 atgcggcggc cttatttccc tgtggcagtg gggaagtact acagctacta ctgcgacgag 2160 cacttcgaga ccccctctgg ctcctactgg gaccacatcc actgcacaca ggacggctgg 2220 tctccagctg tgccctgcct gaggaaatgc tacttcccct acctggagaa cggatacaac 2280 cagaactatg gccgcaagtt cgtgcagggc aagagcatcg atgtggcctg ccaccctggc 2340 tacgccctgc ccaaggccca gacaactgtg acctgcatgg agaatggttg gagccccacc 2400 ccgcgctgca tccgggtgtc cttcacgctc cgaaggaaac gaggaagcgg agaagccaga 2460 cacaaacaga aaattgtggc accggtgaaa cagactttga attttgacct tctcaagttg 2520 gcgggagacg tcgagtccaa 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gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc 3420 aagaccaagc cccgcgagga gcagtacaac agcacctacc gcgtggtgag cgtgctgacc 3480 gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgag caacaaggcc 3540 ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatcagc aaggccaagg gccagccccg cgagccccag 3600 gtgtacaccc tgccccccag ccgcgacgag ctgaccaaga accaggtgag cctgacctgc 3660 ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc 3720 gagaacaact acaagaccac cccccccgtg ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac 3780 agcaagctga ccgtggacaa gagccgctgg cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg 3840 atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaagagcc tgagcctgag ccccggctaa 3900 ctcgaggtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg 3960 accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat 4020 tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag 4080 gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggg cggccgcagg 4140 aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg 4200 ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcg 4258 <210> 54 <211> 4258 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> polynucleotide <400> 54 cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg 60 gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc 120 tggcgcgccc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact 180 ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa 240 gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg 300 cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta 360 gtcatcgcta ttaccatggt cgaggtgagc cccacgttct gcttcactct ccccatctcc 420 cccccctccc cacccccaat tttgtattta tttatttttt aattattttg tgcagcgatg 480 ggggcggggg gggggggggg gcgcgcgcca ggcggggcgg ggcggggcga ggggcggggc 540 ggggcgaggc ggagaggtgc ggcggcagcc aatcagagcg gcgcgctccg aaagtttcct 600 tttatggcga ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc gaagcgcgcg gcgggcggga 660 gtcgctgcgc gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg ccgcctcgcg ccgcccgccc 720 cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc gggacggccc ttctcctccg 780 ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt ttctgtggct gcgtgaaagc 840 cttgaggggc tccgggaggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcggggct gtccgcgggg 900 ggacggctgc cttcgggggg gacggggcag ggcggggttc ggcttctggc gtgtgaccgg 960 cggctctaga gcctctgcta accatgttca tgccttcttc tttttcctac agctcctggg 1020 caacgtgctg gttattgtgc tgtctcatca ttttggcaaa gaattggatc cactagtgcc 1080 accatgcgcc tgctggccaa gatcatctgc ctgatgctgt gggccatctg cgtggccagc 1140 gacaccggcc gccccttcgt ggagatgtac agcgagatcc ccgagatcat ccacatgacc 1200 gagggccgcg agctggtgat cccctgccgc gtgaccagcc ccaacatcac cgtgaccctg 1260 aagaagttcc ccctggacac cctgatcccc gacggcaagc gcatcatctg ggacagccgc 1320 aagggcttca tcatcagcaa cgccacctac aaggagatcg gcctgctgac ctgcgaggcc 1380 accgtgaacg gccacctgta caagaccaac tacctgaccc accgccagac caacaccatc 1440 atcgacgtgg tgctgagccc cagccacggc atcgagctga gcgtgggcga gaagctggtg 1500 ctgaactgca ccgcccgcac cgagctgaac gtgggcatcg acttcaactg ggagtacccc 1560 agcagcaagc accagcacaa gaagctggtg aaccgcgacc tgaagaccca gagcggcagc 1620 gagatgaaga agttcctgag caccctgacc atcgacggcg tgacccgcag cgaccagggc 1680 ctgtacacct gcgccgccag cagcggcctg atgaccaaga agaacagcac cttcgtgcgc 1740 gtgcacgaga aggacaagac ccacacctgc cccccctgcc ccgcccccga gctgctgggc 1800 ggccccagcg tgttcctgtt cccccccaag cccaaggaca ccctgatgat cagccgcacc 1860 cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg agccacgagg accccgaggt gaagttcaac 1920 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agccccgcga ggagcagtac 1980 aacagcacct accgcgtggt gagcgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 2040 aaggagtaca agtgcaaggt gagcaacaag gccctgcccg cccccatcga gaagaccatc 2100 agcaaggcca agggccagcc ccgcgagccc caggtgtaca ccctgccccc cagccgcgac 2160 gagctgacca agaaccaggt gagcctgacc tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac 2220 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac cacccccccc 2280 gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagagccgc 2340 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 2400 acccagaaga gcctgagcct gagccccggc taacgaagga aacgaggaag cggagaagcc 2460 agacacaaac agaaaattgt ggcaccggtg aaacagactt tgaattttga ccttctcaag 2520 ttggcgggag acgtcgagtc caaccctggg cccatgcgcc tcctggccaa gatcatctgc 2580 ctcatgctgt gggccatctg cgtggctgag gactgcaatg agctgccgcc caggaggaac 2640 acagagatcc tgacagggag ctggtctgac cagacctacc ctgagggcac ccaggcgatc 2700 tacaagtgcc ggccgggcta caggagcctg gggaacatca tcatggtgtg tagaaagggc 2760 gaatgggtgg ccctcaaccc cctgaggaag tgccagaagc ggccctgtgg ccaccccggg 2820 gacacaccct tcgggacctt caccctgacc ggcggcaatg tgtttgagta cggcgtgaag 2880 gctgtctaca catgcaacga ggggtaccag ctgctgggcg agattaacta ccgggagtgt 2940 gacaccgatg ggtggaccaa cgacattccc atctgtgagg tggtcaagtg tctccccgtg 3000 acagccccag aaaatggcaa aatcgtgagc agcgccatgg agcctgaccg cgaatatcac 3060 tttgggcagg ccgtgaggtt tgtgtgcaac tcgggctaca aaattgaagg tgatgaggag 3120 atgcactgca gcgatgatgg cttctggtcc aaggagaagc ccaaatgtgt ggagatctcc 3180 tgcaagtctc ccgacgtgat caacggcagc ccaatcagcc agaagattat ttacaaagag 3240 aacgagcgct tccagtacaa gtgtaacatg ggctatgagt attcagagag gggagatgcc 3300 gtctgcactg agagcggctg gagaccactg cctagctgcg aggaaaagag ttgtgacaac 3360 ccttacatcc caaatggcga ctactcccct ctgcggatca aacaccggac cggggatgaa 3420 atcacctatc agtgccgcaa tggattctac ccggccaccc gcggcaacac cgccaaatgc 3480 accagcacag gctggatccc cgccccccgc tgtacgctga agccttgcga ctatccagac 3540 atcaagcacg gaggcctgta ccacgaaaac atgcggcggc cttatttccc tgtggcagtg 3600 gggaagtact acagctacta ctgcgacgag cacttcgaga ccccctctgg ctcctactgg 3660 gaccacatcc actgcacaca ggacggctgg tctccagctg tgccctgcct gaggaaatgc 3720 tacttcccct acctggagaa cggatacaac cagaactatg gccgcaagtt cgtgcagggc 3780 aagagcatcg atgtggcctg ccaccctggc tacgccctgc ccaaggccca gacaactgtg 3840 acctgcatgg agaatggttg gagccccacc ccgcgctgca tccgggtgtc cttcacgctc 3900 ctcgaggtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg 3960 accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat 4020 tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag 4080 gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggg cggccgcagg 4140 aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg 4200 ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcg 4258 <210> 55 <211> 121 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> 5' AAV ITR <400> 55 cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt tggtcgcccg 60 gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc 120 t 121 <210> 56 <211> 57 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> sequence immediately adjacent to the 3' end of the 5' ITR <400> 56 tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct aggtacc 57 <210> 57 <211> 121 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> 3' AAV ITR <400> 57 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 g 121 <210> 58 <211> 85 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> nucleotide sequence <400> 58 cttctgaggc ggaaagaacc agctggggct cgactagagc atggctacgt agataagtag 60 catggcgggt taatcattaa ctaca 85 <210> 59 <211> 585 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> CMV promoter <400> 59 ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc 60 ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca 120 ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta 180 tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta 240 tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat 300 cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga 360 ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca 420 aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg 480 taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc 540 ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccg 585 <210> 60 <211> 942 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> CAG promoter <400> 60 ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga 60 cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat 120 atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc 180 cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct 240 attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc 300 ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg 360 gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg cggggcgagg 420 cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg 480 aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg agtcgctgcg 540 cgctgccttc gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga 600 ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat 660 tagcgcttgg tttaatgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttgagggg 720 ctccgggagg gccctttgtg cggggggagc ggctcggggc tgtccgcggg gggacggctg 780 ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg gcggctctag 840 agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct 900 ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaattggat cc 942 <210> 61 <211> 223 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> example Bovine Growth Hormone poly-A (bGH poly-A) signal <400> 61 gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg 60 gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg 120 agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg 180 gaagacaata gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tgg 223 <210> 62 <211> 270 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> example Bovine Growth Hormone poly-A (bGH poly-A) signal <400> 62 tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc 60 cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga 120 aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga 180 cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat 240 ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg 270 <210> 63 <211> 588 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> woodchuck hepatitis post-transcriptional regulatory element (WPRE) <400> 63 atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc 60 cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta 120 tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt 180 ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg 240 gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta 300 ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt 360 tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg 420 cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca 480 atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc 540 gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgc 588 <210> 64 <211> 245 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> WPRE3 <400> 64 aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60 ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120 atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttag ttcttgccac ggcggaactc 180 atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc 240 gtggt 245 <210> 65 <211> 145 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> 5' AAV ITR <400> 65 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145 <210> 66 <211> 145 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> 3' AAV ITR <400> 66 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> bGHpA FR primer <400> 67 catcgcattg tctgagtagg t 21 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> bGHpA Rv primer <400> 68 agcatgcctg ctattgtctt 20

Claims (29)

  1. (i) 항-VEGF 엔티티 및 (ii) 음성 보체 조절인자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 항-VEGF 엔티티가 Ig 융합 단백질, 항체, 폴리펩티드, 펩티드, 비-항체 스캐폴드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, CRISPR-가이드 가닥 및 압타머로부터 선택되는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서, 항-VEGF 엔티티가 아플리베르셉트, 라니비주맙, 베바시주맙, 브롤루시주맙 및 페갑타닙으로부터 선택되는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항에 있어서, 항-VEGF 엔티티가 아플리베르셉트이고, 예를 들어 아플리베르셉트가 서열식별번호: 3 내지 11 중 어느 하나를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 음성 보체 조절인자가 보체 인자 I (CFI), 보체 인자 H 유사 단백질 1 (FHL1), 보체 인자 H (CFH), 보체 수용체 유형 1 (CR1), 막 보조인자 단백질 (MCP), 보체 붕괴-가속화 인자 (DAF), MAC-억제성 단백질 (MAC-IP), C1-억제제, 아나필라톡신 억제제, C4b 결합 단백질 (C4BP), 클루스테린, 비트로넥틴 또는 그의 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항에 있어서, 음성 보체 조절인자가 CFI 및 FHL1 또는 그의 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 아플리베르셉트를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 11과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, CFI를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 35 또는 36과 적어도 75% 서열 동일성을 갖거나, 또는 FHL-1을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 41과 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 45 내지 54의 뉴클레오티드 서열, 또는 그와 적어도 75% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 4.7 kb 이하인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 벡터가 임의로 바이러스 벡터 입자, 바람직하게는 AAV2 게놈 및 AAV2 또는 AAV8 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 벡터 입자의 형태의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터인 벡터.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함하는 제약 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 제약 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 눈의 보체-매개 장애, 예를 들어 연령-관련 황반 변성 (AMD), 당뇨병성 망막병증, 녹내장, 스타가르트병, 중심성 장액성 맥락망막병증, 색소성 망막염, 폴립모양 맥락막 혈관병증, 당뇨병성 황반 부종, 분지성 망막 정맥 폐색 또는 포도막염, 바람직하게는 AMD를 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 제약 조성물.
  16. 제15항에 있어서, AMD가 습성 AMD 및/또는 건성 AMD인 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 제약 조성물.
  17. 제15항에 있어서, i) AMD가 습성 AMD이고, 용도가 대상체에서 건성 AMD의 발병을 추가로 예방하고/거나 치료하는 것이거나, 또는 ii) AMD가 건성 AMD이고, 용도가 대상체에서 습성 AMD의 발병을 추가로 예방하고/거나 치료하는 것이거나, 또는 iii) 용도가 건성 AMD 및 습성 AMD를 동시에 예방하고/거나 치료하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 제약 조성물.
  18. 제17항에 있어서, AMD가 습성 AMD이고, 용도가 대상체에서 건성 AMD의 발병을 추가로 예방하고/거나 치료하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 제약 조성물.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 지도형 위축의 형성이 예방되거나 감소되고/거나, 지도형 위축의 양이 감소되거나, 또는 지도형 위축의 진행이 감속되거나;
    (ii) 대상체의 치료된 눈에의 투여 후 12개월에 걸쳐 동일한 기간에 걸쳐 비치료된 눈에 비해 지도형 위축 면적의 증가의 적어도 10% 감소가 있거나; 또는
    (iii) 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 제약 조성물의 투여가 대상체에서, 또는 대상체의 눈에서, 예컨대 망막 색소 상피 (RPE)에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 임의로 대상체, 또는 그의 눈 또는 RPE에서의 정상 수준을 초과하는 수준으로 증가시키는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 제약 조성물.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, i) 혈관신생이 예방되거나 감소되고/거나, ii) 혈관 누출이 예방되거나 감소되고/거나, iii) 망막 부종이 예방되거나 감소되는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 제약 조성물.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 제약 조성물이 안구내로, 예를 들어 망막하에, 망막에 직접, 맥락막상에 또는 유리체내 주사에 의해 투여되는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 제약 조성물.
  22. i) 대상체에서 건성 AMD의 발병을 추가로 예방하고/거나 치료하는, 습성 AMD를 치료하는 데 있어서의 동시, 별개 또는 순차적 사용; 또는 ii) 대상체에서 습성 AMD의 발병을 예방하고/거나 치료하는, 건성 AMD를 치료하는 데 있어서의 동시, 별개 또는 순차적 사용, 또는 iii) 건성 AMD 및 습성 AMD를 동시에 치료하고/거나 예방하기 위한 동시, 별개 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서, (i) 항-VEGF 엔티티; 및 (ii) 음성 보체 조절인자, 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 생성물.
  23. 제22항에 있어서, 대상체에서 건성 AMD를 추가로 예방하고/거나 치료하는, 습성 AMD를 치료하는 데 있어서의 동시, 별개 또는 순차적 사용을 위한 생성물.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 항-VEGF 엔티티가 Ig 융합 단백질, 항체, 폴리펩티드, 펩티드, 비-항체 스캐폴드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, shRNA, CRISPR-가이드 가닥 및 압타머로부터 선택되고, 바람직하게는 항-VEGF 엔티티가 아플리베르셉트, 라니비주맙, 베바시주맙, 브롤루시주맙 및 페갑타닙으로부터 선택되는 것인 생성물.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 음성 보체 조절인자가 보체 인자 I (CFI), 보체 인자 H 유사 단백질 1 (FHL1), 보체 인자 H (CFH), 보체 수용체 유형 1 (CR1), 막 보조인자 단백질 (MCP), 보체 붕괴-가속화 인자 (DAF), MAC-억제성 단백질 (MAC-IP), C1-억제제, 아나필라톡신 억제제, C4b 결합 단백질 (C4BP), 클루스테린, 비트로넥틴 또는 그의 변이체 또는 단편으로부터 선택되고, 바람직하게는 음성 보체 조절인자가 CFI 또는 FHL1 또는 그의 변이체 또는 단편으로부터 선택되는 것인 생성물.
  26. 의약으로서 동시, 별개 또는 순차적 사용을 위한 조합 제제로서, (i) 항-VEGF 엔티티; 및 (ii) 인자 I, 또는 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 생성물.
  27. 제26항에 있어서, 보체-매개 안구 장애, 예컨대 연령-관련 황반 변성 (AMD), 당뇨병성 망막병증, 녹내장, 스타가르트병, 중심성 장액성 맥락망막병증, 색소성 망막염, 폴립모양 맥락막 혈관병증, 당뇨병성 황반 부종, 분지성 망막 정맥 폐색 또는 포도막염, 바람직하게는 AMD를 치료하거나 예방하는 데 사용하기 위한 생성물.
  28. 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 지도형 위축의 형성이 예방되거나 감소되고/거나, 지도형 위축의 양이 감소되거나, 또는 지도형 위축의 진행이 감속되거나;
    (ii) 대상체의 치료된 눈에의 투여 후 12개월에 걸쳐 동일한 기간에 걸쳐 비치료된 눈에 비해 지도형 위축 면적의 증가의 적어도 10% 감소가 있거나; 또는
    (iii) 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 제약 조성물의 투여가 대상체에서, 또는 대상체의 눈에서, 예컨대 망막 색소 상피 (RPE)에서 C3b-불활성화 및 iC3b-분해 활성의 수준을 임의로 대상체, 또는 그의 눈 또는 RPE에서의 정상 수준을 초과하는 수준으로 증가시키는 것인 생성물.
  29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, i) 혈관신생이 예방되거나 감소되고/거나, ii) 혈관 누출이 예방되거나 감소되고/거나, iii) 망막 부종이 예방되거나 감소되는 것인 생성물.
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HUE030719T2 (en) 2007-04-09 2017-05-29 Univ Florida RAAV vector formulations and methods comprising tyrosine-modified capsid proteins for their use
CA3019426A1 (en) * 2016-04-15 2017-10-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for treatment of wet age-related macular degeneration
US20210188927A1 (en) * 2017-10-20 2021-06-24 Gemini Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating age-related macular degeneration
US20210093734A1 (en) 2018-02-20 2021-04-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for treatment of wet age-realted macular degeneration
GB201821082D0 (en) * 2018-12-21 2019-02-06 Gyroscope Therapeutics Ltd Combination of complement factors i and h, and vector encoding thereof
US20220395557A1 (en) * 2019-10-23 2022-12-15 Gemini Therapeutics Sub, Inc. Methods for treating patients having cfh mutations with recombinant cfh proteins

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