KR20230098176A - 안구 적응증을 위한 벡터화된 tnf-알파 길항제 - Google Patents

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Abstract

완전 인간 번역 후 변형된 치료용 TNF 수용체 Fc 융합체의 전달을 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 완전 인간 번역 후 변형된 치료용 TNF 수용체 Fc 융합체는 유전자 요법 방법에 의해, 예를 들어, 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 벡터로서 적절한 조직에 전달될 수 있다. 또한, 완전 인간 번역 후 변형된 치료용 TNF 수용체 Fc 융합체로 비-감염성 포도막염과 같은 안구 적응증을 치료하는 방법이 제공된다.

Description

안구 적응증을 위한 벡터화된 TNF-알파 길항제
비-감염성 포도막염으로 진단된 인간 대상체에게, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)에 결합하는 완전 인간 번역 후 변형된(HuPTM) 치료용 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 융합 단백질을 전달하기 위한 조성물 및 방법이 기술된다.
치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질은 다수의 질환 및 병태를 치료하는 데 효과적인 것으로 나타났다. 그러나, 이러한 제제는 단지 짧은 기간 동안만 효과적이기 때문에, 장기간에 걸친 반복 주사가 종종 요구되어, 환자에게 상당한 치료 부담을 초래한다.
포도막염(uveitis)은 포도막관의 염증을 특징으로 하는 이질성 질환의 그룹을 포함한다. 포도막염은 일반적으로 염증의 병인에 의해 전신 질환과 관련되거나 관련이 없을 수 있는 감염성 또는 비-감염성(자가면역 장애)으로 분류될 수 있다. 또한, 포도막염은 해부학적으로 전방, 중간, 후방 또는 전체포도막염으로 분류될 수 있으며, 이들은 급성, 만성 또는 재발성 과정을 가질 수 있다. 임상 표현(clinical presentation)은 다양하며, 증상은 흐린 시력, 눈부심, 안구 통증 및 상당한 시각 장애를 포함할 수 있다(Valenzuela et al., Front Pharmacol. 2020; 11: 655).
비-감염성 포도막염은 포도막(홍채, 모양체 및 맥락막)의 염증을 특징으로 하는 심각한 시력-위협적인 안내 염증 병태이다. 비-감염성 포도막염은 안구 항원에 대한 면역-매개 반응의 결과인 것으로 생각되고, 선진국에서 생산 연령 집단에서 비가역적 실명의 주요 원인이다. 포도막염 치료의 목표는 염증을 조절하고, 재발을 예방하고, 시력을 보존할 뿐만 아니라 약물의 부작용을 최소화하는 것이다. 현재, 비-감염성 포도막염에 대한 치료 표준은 1차 약제로서 코르티코스테로이드의 투여를 포함하지만, 일부 경우에는 보다 적극적인 요법이 필요하다. 이는 합성 면역억제제, 예컨대, 항대사물(메토트렉세이트, 미코페놀레이트 모페틸, 및 아자티오프린), 칼시뉴린성 저해제(사이클로스포린, 타크롤리무스), 및 알킬화제(사이클로포스파마이드, 클로람부실)를 포함한다. 코르티코스테로이드 및 통상적인 면역억제 치료에 대해 불내성 또는 불응성이 되는 환자에서, 생물학적 제제는 질병 발병에 관여하는 관련 면역학적 경로를 표적화하는 것에 기초하여 소아 및 성인 포도막염에서 효과적인 요법으로 대두되었다. 현재의 면역조절 요법은 mAb, 예컨대, 인플릭시맙, 아달리무맙, 골리무맙, 및 세르톨리주맙-페골, 또는 TNF 수용체 융합 단백질, 에타너셉트(etanercept)로 달성된, TNFα의 억제를 포함한다. 이와 관련하여, 항-TNF 제제(인플릭시맙 및 아달리무맙)는 유리한 결과의 관점에서 가장 강력한 결과를 나타내었다. 아달리무맙은 격주로 피하 투여에 의한 비-감염성 포도막염의 치료에 대해 승인되었다. 통상적인 면역억제 치료 및/또는 항-TNF-α 요법이 실패하면, 다른 생물학적 제제가 권장된다.
EYS606은 TNFα p55 수용체 1(TNFR1)을 IgG1 면역글로불린 분자의 Fc 부분에 연결하는 재조합 융합 단백질을 인코딩한다. EYS606은 현재 비-감염성 후부, 중간 또는 전체 포도막염의 치료를 위한 비-바이러스 유전자 요법으로서 연구 중이다. EYS606은 환자의 모양체근에서 전기이동에 의해 투여된다.
에타너셉트는 IgG1 면역글로불린 분자(TNFR:Fc)의 Fc 부분에 융합된 인간 p75 TNFα 수용체(TNFR2)의 2개의 세포외 도메인으로 구성된 이량체 융합 단백질이고, 류마티스 관절염, 크론병, 및 건선성 관절염을 포함하는 여러 자가면역 염증 질환의 치료에 사용될 수 있다. 에타너셉트는 주당 1회 50 mg 또는 주당 2회 25 mg의 용량으로 피하 투여된다(Valenzuela et al., Front Pharmacol. 2020; 11: 655.).
비-감염성 포도막염으로 고통받는 환자에 대한 치료 부담을 감소시키는 보다 효과적인 치료가 필요하다. 유리체내 약제는 표적 조직에 다량의 약물을 제공하여 전신 독성의 위험을 제거하기 때문에 포도막염 환자에서 유망한 약물 투여 방식이 되었다. 주기적인 안구 투여의 필요성을 감소 또는 제거하는 것은 환자 부담을 감소시키고 요법을 개선시킬 것이다.
유전자 요법에 의해 전달되는 생물학적 저해제는 시간이 지남에 따라 소멸되어 최고 및 최저 수준을 초래하는 주사 또는 주입된 치료용 생물학적 저해제에 비해 여러 이점을 갖는다. 생물학적 저해제를 반복적으로 주사하는 것과 대조적으로, 전이유전자(transgene) 산물 생물학적 저해제의 지속적인 발현은 보다 일관된 수준의 생물학적 저해제가 작용 부위에 존재하게 하고, 더 적은 주사가 이루어져야 하기 때문에, 환자에게 덜 위험하고 더 편리하다. 또한, 전이유전자로부터 발현된 생물학적 저해제는 번역 동안 및 번역 후에 존재하는 상이한 미세환경으로 인해 직접 주사되는 것과 상이한 방식으로 번역 후 변형된다. 임의의 특정 이론에 의해 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이는 상이한 확산, 생물활성, 분포, 친화성, 약동학적, 및 면역원성 특성을 갖는 생물학적 저해제를 초래하여, 작용 부위에 전달된 항체가 직접 주사된 생물학적 제제와 비교하여 "바이오베터(biobetter)"가 되도록 한다. 간에서 데포(depot)로부터 발현되는 것과 같은 전신 투여, 또는 또한, 안구 조직으로의 치료제의 국소 전달은 치료제에 대한 대상체의 노출을 감소시키고 잠재적인 부작용의 위험을 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 명세서는 안구를 표적화하고, rAAV 조성물 투여의 20일, 30일, 40일, 50일, 60일, 또는 90일 내에 안구에서 생물학적 저해제의 치료학적 유효한 또는 예방적인 수준을 초래하는 항-TNFα Fc 융합 단백질(TNFR:Fc), 특히, 에타너셉트(TNFR2:Fc) 및 EYS606(TNFR1:Fc)의 발현을 위한 전이유전자의 데포를 생성하도록 설계된, 항-TNFα 유전자 요법, 특히 재조합 AAV 유전자 요법을 위한 조성물 및 방법이 제공된다.
비-감염성 포도막염 또는 치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질로의 치료를 위해 지시된 다른 병태로 진단된 환자(인간 대상체)에게 항-TNFα Fc 융합 단백질의 전신 전달을 위한 조성물 및 방법이 기술되어 있다. 전달은 유리하게는 유전자 요법을 통해 - 예를 들어, HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질, 예를 들어, 인간-글리코실화된 전이유전자 제품을, 항-TNFα Fc 융합 단백질이 이의 치료적 또는 예방적 효과를 달성하는 대상체의 적절한 안구 조직(순환계를 통하는 것을 포함함)에 연속적으로 공급하는 환자의 안구, 또는 대안적인 실시형태에서 간 및/또는 근육에 영구적인 데포를 생성하기 위해, 치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질로의 치료에 대해 지시된 병태로 진단된 대상체에게, 치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 작제물을 투여함으로써 달성될 수 있다.
전이유전자를 전달하는 데 사용되는 재조합 벡터는 비-복제 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터("rAAV")를 포함한다. 실시형태에서, AAV 타입, 예를 들어, AAV의 AAV8 서브타입, AAV3B 서브타입, AAV2.7m8, 또는 AAVrh73 서브타입은 안구에 대한 친화성을 갖는다. 그러나, 렌티바이러스 벡터; 백시니아 바이러스 벡터, 또는 "네이키드 DNA" 작제물로 지칭되는 비-바이러스 발현 벡터를 포함하지만 이로 제한되지 않는, 다른 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 전이유전자의 발현은 구성적 또는 조직-특이적 발현 조절 요소, 특히 안구 조직-특이적 조절 요소인 요소, 예를 들어, 표 1 또는 대안적으로 표 1a의 하나 이상의 요소에 의해 조절될 수 있다. 작제물은 또한 발현된 항-TNFα Fc 융합 단백질의 분비를 유도하는 신호 또는 리더 펩타이드, 예를 들어, 표 2, 또는 표 3 또는 표 4로부터의 펩타이드를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 전이유전자에 의해 인코딩된 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질은 TNFα, 특히 에타너셉트(또는 이의 임의의 바이오시밀러 버전) 또는 EYS606에 결합하는 TNFR:Fc 융합 단백질을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다(예를 들어, 도 2A 및 도 2B 참조).
치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질에 대한 유전자 요법 작제물은 Fc 부분에 융합된 가용성 TNFR(TNFR1 또는 TNFR2)이 이량체 융합 단백질(서열번호 10 및 12)로서 발현되도록 설계된다.
또한, 생체내 전이유전자로부터 발현된 항-TNFα Fc 융합 단백질은 단백질 응집 및 단백질 산화와 같은 재조합 기술에 의해 생산된 생물학적 제제와 관련된 분해 생성물을 함유할 가능성이 없다. 응집은 높은 단백질 농도, 제조 장비 및 용기와의 표면 상호작용, 및 특정 완충 시스템에 의한 정제로 인한 단백질 생산 및 저장과 관련된 문제이다. 응집을 촉진하는 이러한 상태는 유전자 요법에서 전이유전자 발현에 존재하지 않는다. 메티오닌, 트립토판, 및 히스티딘 산화와 같은 산화는 또한 단백질 생산 및 저장과 관련이 있고, 스트레스 받는 세포 배양 조건, 금속 및 공기 접촉, 및 완충제 및 부형제 중의 불순물에 의해 야기된다. 생체내에서 전이유전자로부터 발현된 단백질은 또한 스트레스 받는 조건에서 산화될 수 있다. 그러나, 인간 및 많은 다른 유기체는 산화 스트레스를 감소시킬 뿐만 아니라 때때로 산화를 복구 및/또는 역전시키는, 항산화 방어 시스템을 갖추고 있다. 따라서, 생체내에서 생산된 단백질은 산화된 형태일 가능성이 없다. 응집 및 산화 둘 다는 역가, 약동학(청소율), 및 면역원성에 영향을 미칠 수 있다.
인간 대상체의 안구에서 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질의 생산은 유전자 요법을 통해 - 예를 들어, 대상체의 형질도입된 세포에 의해 생산된 인간-글리코실화된, 설페이트화된 전이유전자 생성물을 연속적으로 공급하는 대상체에서 영구 데포를 생성하기 위해 그러한 Fc 융합 단백질에 대한 질환 적응증으로 진단된 환자(인간 대상체)에 HuPTM 항-TNFα 융합 단백질을 인코딩하는 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 작제물을 투여함으로써 달성되는 질환의 치료를 위한 "바이오베터" 분자를 초래해야 한다. HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질에 대한 cDNA 작제물은 형질도입된 인간 세포에 의한 적절한 공동- 및 번역-후 프로세싱(글리코실화 및 단백질 설페이트)을 보장하는 신호 펩타이드를 포함해야 한다.
유전자 요법에 대한 대안 또는 추가 치료로서, HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 인간 세포주에서 생산될 수 있으며, 당단백질은 환자에게 투여될 수 있다.
다른 이용 가능한 치료의 투여와 함께 환자에게 HuPTM 항-TNFα 융합 단백질의 전신 전달을 포함하는 조합 요법은 본 명세서에서 제공되는 방법에 포함된다. 추가 치료는 유전자 요법 치료 전, 동시에 또는 후에 투여될 수 있다. 이러한 추가 치료는 치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질 또는 항-TNFα mAb와의 공동-요법을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
또한, 바이러스 벡터, 특히 AAV 기반 바이러스 벡터를 제조하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 숙주 세포는, AAV ITR이 측접된(flanked) 시스 발현 카세트를 포함하는 인공 게놈으로서, 여기서 시스 발현 카세트는 인간 세포에서 전이유전자의 발현을 조절하는 발현 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 치료용 항체를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는, 상기 인공 게놈; AAV ITR이 결여되어 있는 트랜스 발현 카세트로서, 배양물에서 숙주 세포에서 AAV rep 및 캡시드 단백질의 발현을 구동하고 트랜스에서 상기 rep 및 cap 단백질을 공급하는 발현 제어 요소에 작동 가능하게 연결된 AAV rep 및 캡시드 단백질을 인코딩하는, 상기 트랜스 발현 카세트; AAV 캡시드 단백질에 의한 인공 게놈의 복제 및 패키징을 허용하는 기능을 하는 충분한 아데노바이러스 헬퍼를 함유하는, 상기 배양하는 단계; 및 세포 배양물로부터 인공 게놈을 캡시드화하는 재조합 AAV를 회수하는 단계를 포함하는 재조합 AAV를 생산하는 방법이 제공된다.
CAG 프로모터, Best1/GRK 프로모터(또는 표 1 또는 표 1a에 제공된 바와 같은 다른 프로모터(및 전이유전자를 발현시키는 코돈 최적화된 및 CpG 고갈 전이유전자, 예를 들어, 에타너셉트 및 EYS606을 포함하는, 항-TNFα 치료용 Fc 융합 단백질의 가용성 TNFR(TNFR1 또는 TNFR2) 및 Fc 도메인(힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함함))을 포함하는, 광수용체-특이적 프로모터 또는 다른 적합한 프로모터를 함유하는 최적화된 발현 카세트를 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 조성물이 제공된다. 투여 및 제조 방법이 또한 제공된다. 특히, 작제물 CAG.에타너셉트 또는 U1a.Vh4i.에타너셉트.scAAV를 포함하는 rAAV를 포함하는 조성물 및 방법이 제공된다(표 7 참조).
인간 대상체에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물은 생리학적으로 혼화 가능한 수성 완충제, 계면활성제 및 선택적인 부형제를 포함하는 제형 완충제 중에 재조합 벡터의 현탁액을 포함한다.
3.1 예시적인 실시형태
1. 비-감염성 포도막염의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 비-감염성 포도막염을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서,
(a) 안구 조직 세포에 대해 친화성을 갖는 바이러스 캡시드; 및
(b) AAV 내부 탠덤 반복부(ITR)가 측접된 발현 카세트를 포함하는 인공 게놈으로서, 상기 발현 카세트는 인간 안구 세포에서 전이유전자의 발현을 제어하는 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된, 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 포함하는, 인공 게놈
을 갖는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함하되,
상기 AAV 벡터는 상기 인간 대상체에 대한 망막하, 유리체내, 비강내, 전방내, 맥락막위 또는 전신 투여를 위해 제형화되는, 약제학적 조성물.
2. 조항 1에 있어서, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질은 면역글로불린 중쇄의 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 펩타이드 결합을 통해 공유 연결된 인간 TNFα 수용체 타입 I(TNFR1) 또는 타입 II(TNFR2)의 가용성, 세포외 부분을 포함하는, 약제학적 조성물.
3. 조항 1 또는 2에 있어서, 상기 바이러스 캡시드는 AAV 혈청형 1(AAV1), 혈청형 2(AAV2), 혈청형 AAV2.7m8(AAV2.7m8), 혈청형 3(AAV3), 혈청형 3B(AAV3B), 혈청형 4(AAV4), 혈청형 5(AAV5), 혈청형 6(AAV6), 혈청형 7(AAV7), 혈청형 8(AAV8), 혈청형 rh8(AAVrh8), 혈청형 9(AAV9), 혈청형 9e(AAV9e), 혈청형 rh10(AAVrh10), 혈청형 rh20(AAVrh20), 혈청형 rh39(AAVrh39), 혈청형 hu.37(AAVhu.37), 혈청형 rh73(AAVrh73), 혈청형 rh74(AAVrh74), 혈청형 hu51(AAV.hu51), 혈청형 hu21(AAV.hu21), 혈청형 hu12(AAV.hu12) 또는 혈청형 hu26(AAV.hu26)의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한, 약제학적 조성물.
4. 조항 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 AAV 캡시드는 AAV8, AAV3B, AAV2.7m8, 또는 AAVrh73인, 약제학적 조성물.
5. 조항 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 안구 조직 세포는 각막 세포, 홍채 세포, 모양체 세포, 쉴렘관 세포, 섬유주대 세포, 망막 세포, RPE-맥락막 조직 세포 또는 시신경 세포인, 약제학적 조성물.
6. 조항 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 조절 서열은 표 1 또는 표 1b로부터의 조절 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
7. 조항 5에 있어서, 상기 조절 서열은 인간 로돕신 키나제(GRK1) 프로모터(서열번호 54 또는 117), 마우스 원추체 어레스틴(CAR) 프로모터(서열번호 114 내지 116), 인간 레드 옵신(RedO) 프로모터(서열번호 112), CB 프로모터(서열번호 159), CBLong 프로모터(서열번호 160) 또는 Best1/GRK 프로모터(서열번호 161)인, 약제학적 조성물.
8. 조항 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이유전자는 상기 인간 안구 세포에서 분비 및 번역 후 변형을 유도하는 항-TNFα Fc 융합 단백질의 N-말단에서 신호 서열을 인코딩하는, 약제학적 조성물.
9. 조항 8에 있어서, 상기 신호 서열은 MYRMQLLLLIALSLALVTNS(서열번호 62) 또는 표 2, 3 또는 4로부터의 신호 서열인, 약제학적 조성물.
10. 조항 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 전이유전자는 N-말단에서 C-말단으로, 신호 서열 - 가용성 TNFR 세포외 도메인 - 힌지 영역 - Fc 도메인 - PolyA의 구조를 갖는, 약제학적 조성물.
11. 조항 10에 있어서, 상기 전이유전자는 가용성 TNFR 세포외 도메인의 C-말단에 서열번호 8의 트롬빈 절단 부위를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
12. 조항 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 항-TNFα Fc 융합 단백질은 이량체 융합 단백질로서 발현되는, 약제학적 조성물.
13. 조항 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질은 에타너셉트 또는 EYS606인, 약제학적 조성물.
14. 조항 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이유전자는 서열번호 15 내지 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
15. 조항 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질은 서열번호 10 또는 12의 아미노산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
16. 조항 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질은 과글리코실화된 돌연변이체이거나, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질의 Fc 폴리펩타이드가 글리코실화 또는 비글리코실화된(aglycosylated), 약제학적 조성물.
17. 조항 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgG1-Fc 도메인인, 약제학적 조성물.
18. 조항 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 인공 게놈은 자가 상보적인, 약제학적 조성물.
19. 조항 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 인공 게놈은 작제물 CAG.에타너셉트(서열번호 15 또는 16) 또는 mU1a.Vh4i.에타너셉트.scAAV(서열번호 17 또는 18)인, 약제학적 조성물.
20. 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함하는 조성물로서,
a. AAV 혈청형 1(AAV1), 혈청형 2(AAV2), 혈청형 AAV2.7m8(AAV2.7m8), 혈청형 3(AAV3), 혈청형 3B(AAV3B), 혈청형 4(AAV4), 혈청형 5(AAV5), 혈청형 6(AAV6), 혈청형 7(AAV7), 혈청형 8(AAV8), 혈청형 rh8(AAVrh8), 혈청형 9(AAV9), 혈청형 9e(AAV9e), 혈청형 rh10(AAVrh10), 혈청형 rh20(AAVrh20), 혈청형 rh39(AAVrh39), 혈청형 hu.37(AAVhu.37), 혈청형 rh73(AAVrh73), 또는 혈청형 rh74(AAVrh74), 혈청형 hu51(AAV.hu51), 혈청형 hu21(AAV.hu21), 혈청형 hu12(AAV.hu12) 또는 혈청형 hu26(AAV.hu26)의 아미노산 서열과 선택적으로 적어도 95% 동일한 바이러스 AAV 캡시드,
b. AAV 역 말단 반복부(ITR)가 측접된 발현 카세트를 포함하는 인공 게놈으로서, 상기 발현 카세트는 인간 안구 조직 세포에서 전이유전자의 발현을 촉진하는 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 면역글로불린 중쇄의 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 펩타이드 결합을 통해 공유 연결된 인간 가용성 TNFα 수용체 타입 I(TNFR1) 또는 타입 II(TNFR2) 세포외 도메인을 포함하는 항-TNF-α Fc 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 포함하는, 인공 게놈을 가지며,
상기 전이유전자는 안구 조직 세포에서 상기 항-TNFα Fc 융합의 분비 및 번역 후 변형을 유도하는 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질의 N-말단에서 신호 서열을 인코딩하는, 조성물.
21. 조항 20에 있어서, 상기 전이유전자는 가용성 인간 TNFR 세포외 도메인의 C-말단에 서열번호 8의 트롬빈 절단 부위를 추가로 포함하는, 조성물.
22. 조항 20 또는 21에 있어서, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질은 서열번호 10 또는 12의 아미노산 서열을 갖는, 조성물.
23. 조항 20 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질은 에타너셉트 또는 EYS606인, 조성물.
24. 조항 20항 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 안구 조직 세포는 각막 세포, 홍채 세포, 모양체 세포, 쉴렘관 세포, 섬유주대 세포, 망막 세포, RPE-맥락막 조직 세포 또는 시신경 세포인, 조성물.
25. 조항 20 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이유전자는 서열번호 13 또는 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조성물.
26. 조항 20 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 신호 서열은 MYRMQLLLLIALSLALVTNS(서열번호 62) 또는 표 2, 표 3 또는 표 4로부터의 신호 서열인, 조성물.
27. 조항 20 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 인공 게놈은 자가 상보적인, 조성물.
28. 조항 20 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 인공 게놈은 작제물 CAG.에타너셉트(서열번호 15) 또는 mU1a.Vh4i.에타너셉트.scAAV(서열번호 17)인, 조성물.
치료 방법
29. 비-감염성 포도막염의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 비-감염성 포도막염을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게, 치료학적 유효량의, 안구 조직 세포에서 전이유전자의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 재조합 AAV를 포함하는 조성물을 망막하, 유리체내, 비강내, 전안방내, 맥락막위, 또는 전신으로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
30. 비-감염성 포도막염의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 비-감염성 포도막염을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게, 치료적 유효량의, 인간 안구 조직 세포에서 전이유전자의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 항-TNFα Fc 융합 단백질의 인간 번역-후 변형된(HuPTM) 형태를 방출하는 데포(depot)가 형성되는, 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 재조합 뉴클레오타이드 발현 벡터를 망막하, 유리체내, 비강내, 전안방내, 맥락막위, 또는 전신으로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
31. 조항 29 및 제30에 있어서, 상기 안구 조직 세포는 각막 세포, 홍채 세포, 모양체 세포, 쉴렘관 세포, 섬유주대 세포, 망막 세포, RPE-맥락막 조직 세포 또는 시신경 세포인, 방법.
32. 조항 29 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-TNF-α Fc 융합 단백질은 IgG Fc 도메인에 공유 연결된 인간 가용성 TNFα 수용체 타입 I(TNFR1) 또는 타입 II(TNFR2) 세포외 도메인을 포함하는, 방법.
33. 조항 29 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이유전자는 에타너셉트 또는 EYS606인, 방법.
34. 조항 29 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이유전자는 서열번호 15 내지 17의 뉴클레오타이드 서열을 갖는, 방법.
35. 조항 29 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 뉴클레오타이드 발현 벡터는 바이러스 캡시드를 갖는 rAAV에 패키징되고, 상기 바이러스 캡시드는 AAV 혈청형 1(AAV1), 혈청형 2(AAV2), 혈청형 AAV2.7m8, 혈청형 3(AAV3), 혈청형 3B(AAV3B), 혈청형 4(AAV4), 혈청형 5(AAV5), 혈청형 6(AAV6), 혈청형 7(AAV7), 혈청형 8(AAV8), 혈청형 rh8(AAVrh8), 혈청형 9(AAV9), 혈청형 9e(AAV9e), 혈청형 rh10(AAVrh10), 혈청형 rh20(AAVrh20), 혈청형 rh39(AAVrh39), 혈청형 hu.37(AAVhu.37), 혈청형 rh73(AAVrh73), 또는 혈청형 rh74(AAVrh74), 혈청형 hu51(AAV.hu51), 혈청형 hu21(AAV.hu21), 혈청형 hu12(AAV.hu12) 또는 혈청형 hu26(AAV.hu26)의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한, 방법.
36. 조항 29, 31 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 AAV 캡시드는 AAV8, AAV2.7m8, AAV3B, 또는 AAVrh73인, 방법.
37. 조항 29 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 조절 서열은 표 1 또는 표 1a로부터의 조절 서열을 포함하는, 방법.
38. 조항 37에 있어서, 상기 조절 서열은 인간 로돕신 키나제(GRK1) 프로모터(서열번호 54 또는 117), 마우스 원추체 어레스틴(CAR) 프로모터(서열번호 114 내지 116), 인간 레드 옵신(RedO) 프로모터(서열번호 112), CB 프로모터(서열번호 159), CBLong 프로모터(서열번호 160) 또는 Best1/GRK 프로모터(서열번호 161)인, 방법.
39. 조항 29 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이유전자는 상기 인간 안구 조직 세포에서 분비 및 번역 후 변형을 유도하는 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질의 N-말단에서 신호 서열을 인코딩하는, 방법.
40. 조항 39에 있어서, 상기 신호 서열은 MYRMQLLLLIALSLALVTNS(서열번호 62) 또는 표 2, 표 3 또는 표 4로부터의 신호 서열인, 방법.
41. 조항 25 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 전이유전자는 신호 서열 - 9인간 가용성 TNFR 세포외 도메인(타입 1 또는 타입 2) - 힌지 영역 - Fc 도메인 - PolyA의 구조를 갖는, 방법.
42. 조항 41에 있어서, 상기 전이유전자는 상기 인간 가용성 TNFR 세포외 도메인의 C-말단에 서열번호 8을 갖는 트롬빈 절단 부위를 추가로 포함하는, 방법.
43. 조항 29 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질은 과글리코실화된 돌연변이체이거나, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질의 상기 Fc 도메인은 글리코실화 또는 비글리코실화된, 방법.
44. 조항 29 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 항-TNFα Fc 융합 단백질은 알파 2,6-시알화된 글리칸을 함유하는, 방법.
45. 조항 29 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 항-TNFα Fc 융합 단백질은 글리코실화되지만 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal을 함유하지 않는, 방법.
46. 조항 29 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 항-TNFα Fc 융합 단백질이 티로신 설페이트화를 함유하는, 방법.
47. 조항 29 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질의 상기 HuPTM 형태의 생산이 상기 재조합 뉴클레오타이드 발현 벡터로 배양물에서의 인간 안구 세포를 형질도입하고 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질을 발현시킴으로써 확인되는, 방법.
48. 조항 29 또는 47에 있어서, 치료적 유효량은 2 ETDRS 라인 이상만큼 최상의 교정 시력(BCVA)을 개선시키거나 logMAR을 증가시키고/시키거나, SUN 분류에 따른 전방 또는 후방의 염증 활성을 감소시키고/시키거나, 유리체 헤이즈(vitreous haze) 등급을 감소시키기에 충분하도록 결정되는, 방법.
49. 조항 29 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 rAAV는 자가-상보성인, 방법.
50. 조항 29 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 상기 전이유전자는 상기 작제물 CAG.에타너셉트(서열번호 15 또는 16) 또는 mU1a.Vh4i.에타너셉트.scAAV(서열번호 17 또는 18) 내에 있는, 방법.
제조 방법
51. 재조합 AAV를 생산하는 방법으로서,
(a) 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 숙주 세포는
(i) AAV ITR이 측접된 시스 발현 카세트를 포함하는 인공 게놈으로서, 상기 시스 발현 카세트는 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 포함하며, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질은 인간 안구 조직 세포에서 전이유전자의 발현을 촉진하는 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된, 면역글로불린 중쇄의 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 펩타이드 결합을 통해 공유 연결된 인간 TNFα 수용체 타입 I(TNFR1) 또는 타입 II(TNFR2)의 가용성, 세포외 부분을 포함하는, 상기 인공 게놈;
(ii) AAV ITR이 결여된 트랜스 발현 카세트로서, 상기 트랜스 발현 카세트는 배양물에서 숙주 세포에서 AAV rep 및 AAV 캡시드 단백질의 발현을 구동하고 상기 AAV rep 및 상기 AAV 캡시드 단백질을 트랜스로 공급하는 발현 제어 요소에 작동 가능하게 연결된 AAV rep 및 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하며, 상기 캡시드는 안구 조직 친화성을 갖는, 상기 트랜스 발현 카세트;
(iii) AAV 캡시드 단백질에 의한 인공 게놈의 복제 및 패키징을 허용하기에 충분한 아데노바이러스 헬퍼 기능을 함유하는, 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 세포 배양물로부터 상기 인공 게놈을 캡시드화하는 재조합 AAV를 회수하는 단계
를 포함하는, 방법.
52. 조항 51에 있어서, 상기 안구 조직 세포는 각막 세포, 홍채 세포, 모양체 세포, 쉴렘관 세포, 섬유주대 세포, 망막 세포, RPE-맥락막 조직 세포 또는 시신경 세포인, 방법.
53. 조항 51 또는 52에 있어서, 상기 전이유전자는 에타너셉트 또는 EYS606을 인코딩하며, 상기 AAV 캡시드 단백질은 실시형태 1의 상기 rAAV 캡시드 단백질이며, 상기 캡시드 단백질은 AAV 혈청형 1(AAV1), AAV 혈청형 2(AAV2), 혈청형 2.7m8, 혈청형 3(AAV3), 혈청형 3B(AAV3B), 혈청형 4(AAV4), 혈청형 5(AAV5), 혈청형 6(AAV6), 혈청형 7(AAV7), 혈청형 8(AAV8), 혈청형 rh8(AAVrh8), 혈청형 9(AAV9), 혈청형 9e(AAV9e), 혈청형 rh10(AAVrh10), 혈청형 rh20(AAVrh20), 혈청형 rh39(AAVrh39), 혈청형 hu.37(AAVhu.37), 혈청형 rh73(AAVrh73), 또는 혈청형 rh74(AAVrh74), 혈청형 hu51(AAV.hu51), 혈청형 hu21(AAV.hu21), 혈청형 hu12(AAV.hu12) 또는 혈청형 hu26(AAV.hu26)의 적어도 하나의 AAV 혈청형으로부터 유래된 것인, 방법.
54. 숙주 세포로서,
a. AAV ITR이 측접된 시스 발현 카세트를 포함하는 인공 게놈으로서, 상기 시스 발현 카세트는 항-TNFα 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 포함하며, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질은 인간 안구 조직 세포에서 상기 전이유전자의 발현을 촉진하는 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된, 면역글로불린 중쇄의 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 펩타이드 결합을 통해 공유 연결된 인간 TNFα 수용체 타입 I(TNFR1) 또는 타입 II(TNFR2)의 가용성, 세포외 부분을 포함하는, 상기 인공 게놈;
b. AAV ITR이 결여된 트랜스 발현 카세트로서, 상기 트랜스 발현 카세트는 배양물에서 상기 숙주 세포에서 상기 AAV rep 및 상기 AAV 캡시드 단백질의 발현을 구동하고 상기 AAV rep 및 상기 AAV 캡시드 단백질을 트랜스로 공급하는 발현 제어 요소에 작동 가능하게 연결된 AAV rep 및 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하며, 상기 캡시드는 안구 조직 친화성을 갖는, 상기 트랜스 발현 카세트;
c. 상기 AAV 캡시드 단백질에 의한 상기 인공 게놈의 복제 및 패키징을 허용하기에 충분한 아데노바이러스 헬퍼 기능
을 포함하는, 숙주 세포.
55. 조항 54에 있어서, 상기 전이유전자는 에타너셉트 또는 EYS606을 인코딩하는, 숙주 세포.
56. 조항 53 또는 54에 있어서, 상기 AAV 캡시드 단백질은 AAV 혈청형 1(AAV1), 혈청형 2(AAV2), 혈청형 2.7m8(AAV2.7m8), 혈청형 3(AAV3), 혈청형 3B(AAV3B), 혈청형 4(AAV4), 혈청형 5(AAV5), 혈청형 6(AAV6), 혈청형 7(AAV7), 혈청형 8(AAV8), 혈청형 rh8(AAVrh8), 혈청형 9(AAV9), 혈청형 9e(AAV9e), 혈청형 rh10(AAVrh10), 혈청형 rh20(AAVrh20), 혈청형 rh39(AAVrh39), 혈청형 hu.37(AAVhu.37), 혈청형 rh73(AAVrh73), 혈청형 rh74(AAVrh74), 혈청형 hu51(AAV.hu51), 혈청형 hu21(AAV.hu21), 혈청형 hu12(AAV.hu12) 또는 혈청형 hu26 (AAV.hu26)인, 숙주 세포.
도 1. AAV ITR이 측접된, 발현 요소에 의해 조절되는 에타너셉트를 인코딩하는 발현 카세트를 함유하는 rAAV 벡터 게놈 작제물의 개략도.
도 2A 및 도 2B. 항-TNFα Fc 융합 단백질 에타너셉트(A) 및 EYS606(B)의 아미노산 서열. 글리코실화 부위는 굵은 글씨체 또는 밑줄 표시이다. 글루타민 글리코실화 부위; 아스파라긴(N) 글리코실화 부위, 표준 및 비-컨센서스(non-consensus) 아스파라긴(N) 글리코실화 부위; 및 티로신-O-설페이트화 부위(이탤릭체)는 범례에 표시된 바와 같다. Fc 도메인(CH2 및 CH3 도메인)은 회색으로 강조 표시되어 있다. 힌지 영역은 이탤릭체로 표시된다. 트롬빈 절단 부위는 밑줄 표시되어 있다.
도 3. 안구 조직 친화성을 갖는 다양한 캡시드의 클러스터 다중 서열 정렬. 아미노산 치환(하단 행에 굵은 글씨로 표시됨)은 다른 정렬된 AAV 캡시드의 상응하는 위치로부터 아미노산 잔기를 "동원"함으로써 AAV8 캡시드로 이루어질 수 있다. 회색으로 표시된 서열 = 초가변 영역. AAV 캡시드의 아미노산 서열에는 도 3에 나타낸 바와 같이 서열 ID 번호가 할당된다.
도 4. IgG1(서열번호 47), IgG2(서열번호 48) 및 IgG4(서열번호 49)의 불변 중쇄 영역(CH2 및 CH3)의 클러스터 다중 서열 정렬. 중쇄의 잔기 219에서 잔기 230까지의 힌지 영역은 이탤릭체로 제시된다. 아미노산의 넘버링(numbering)은 EU-포맷이다.
도 5A 및 도 5B. A. 벡터화된 아달리무맙 IgG 및 Fab에 의한 모델 종(마우스, 래트, 및 인간)에 걸친 TNFα의 결합. 음성 대조군은 트랜스펙션되지 않은 세포로부터 유래된 상청액을 포함하였다. 벡터화된 라나델루맙(pAAV.CAG.라나델루맙.IgG)은 비특이적 항체 대조군으로서 기능하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. B. 벡터화된 아달리무맙 IgG 및 에타너셉트에 의한 모델 종(마우스, 래트, 및 인간)에 걸친 TNFα의 결합. 음성 대조군은 트랜스펙션되지 않은 세포로부터 유래된 상청액을 포함하였다. 벡터화된 라나델루맙(pAAV.CAG.라나델루맙.IgG)은 비특이적 항체 대조군으로서 기능하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다.
비-감염성 포도막염으로 진단된 인간 대상체에게 TNFα에 결합하는 완전 인간 번역-후 변형된(HuPTM) 치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질의 전신 전달을 위한 조성물 및 방법이 기술되어 있다. 전달은 유리하게는, 항-TNFα Fc 융합 단백질이 이의 치료 효과를 발휘하는, HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질, 예를 들어, 인간-코실화된 전이유전자 생성물을 연속적으로 공급하는, 환자의 조직 또는 기관, 특히, 망막과 같은 안구 조직에 영구 데포를 생성하기 위해, 유전자 요법을 통해 - 예를 들어, 비-감염성 포도막염으로 진단된 환자(인간 대상체)에게 치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질(또는 이들 중 어느 하나의 과글리코실화된 유도체)을 인코딩하는 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 작제물을 투여함으로써 달성될 수 있다.
특정 실시형태에서, 전이유전자에 의해 인코딩되는 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질은 TNFα, 특히 에타너셉트 또는 EYS606에 결합하는 TNFR:Fc 융합 단백질이지만, 이로 제한되지 않는다(TNFR-Fc 융합 단백질 에타너셉트 및 EYS606의 아미노산 서열에 대해 각각 도 2A 및 도 2B 참조). 실시형태에서, 발현된 경우, TNFR Fc 융합 단백질은 이량체이다.
전이유전자에 의해 인코딩되는 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질은 EYS606을 포함하지만 이로 제한되지 않는 TNFα에 결합하는 치료적 항-TNFα TNFR1:Fc 융합을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 전술한 것의 아미노산 서열은 하기 표 6에 제공된다. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 TNFR1 도메인 및 서열번호 6(또는 힌지 없이 7)의 아미노산 서열을 갖는 Fc 도메인, 및 서열번호 12의 아미노산을 갖는 EYS606 단백질. 전이유전자에 의해 인코딩된 HuPTM 항-TNFα TNFR1:Fc 융합은 Fc 도메인 상에 추가적인 글리코실화 부위를 함유하도록 조작된 이량체 융합 단백질을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
전이유전자에 의해 인코딩된 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질은 에타너셉트를 포함하지만 이로 제한되지 않는 TNFα에 결합하는 치료적 항-TNFα TNFR2:Fc 융합을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다. 전술한 것의 아미노산 서열은 하기 표 6에 제공된다. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 TNFR2 도메인 및 서열번호 3(힌지 영역이 없는 서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 Fc 도메인 및 서열번호 13 내지 18 중 하나의 전이유전자 뉴클레오타이드 서열을 갖는 서열번호 10(리더 서열을 포함하는 서열번호 11)의 아미노산 서열을 갖는 에타너셉트. 전이유전자에 의해 인코딩된 HuPTM 항-TNFα TNFR2:Fc 융합 단백질은 Fc 도메인 상에 추가적인 글리코실화 부위를 함유하도록 조작된 이량체 융합 단백질을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 제공되는 조성물 및 방법은, 바이러스 게놈의 데포로부터, 예를 들어, 대상체의 눈 또는 간/근육에서, 안구 조직에(예를 들어, 유리체 또는 수양액에) 소정의 수준으로, 또는 항-TNFα Fc 융합 단백질로 치료될 수 있는 비-감염성 포도막염 또는 다른 적응증의 증상을 치료 또는 완화시키는 데 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 혈청에 항-TNFα Fc 융합 단백질, 특히, 에타너셉트 및 EYS606을 전신 전달한다. 본 명세서에는 실시형태에서, 하나 이상의 안구 조직 세포, 및 세포에서, 실시형태에서 안구 조직 세포에서 항체의 발현을 촉진시키는 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는, 인간 대상체의 세포에 치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 전달하기 위한 바이러스 벡터가 확인된다. 안구 조직-특이적 조절 요소를 포함하는 이러한 조절 요소는 본 명세서의 표 1 및 표 1a에 제공된다. 따라서, 이러한 바이러스 벡터는 적절한 투여량으로 인간 대상체에게 전달되어, 투여 후 적어도 20, 30, 40, 50 또는 60일 후에 항-TNFα Fc 융합 단백질이 혈청 또는 상기 인간 대상체의 안구 조직에서 치료학적으로 유효한 수준으로 존재한다. 실시형태에서, 항-항-TNFα Fc 융합 단백질의 치료적 유효 수준은 2 ETDRS 라인 이상만큼 최상의 교정 시력(BCVA), 또는 logMAR의 증가, SUN 분류에 따른 전방 및 후방 챔버의 염증 활성 감소, 및/또는 유리체 혼탁 등급의 감소를 개선시키기 위해 결정된다(인간 시험, 동물 모델, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 것들 등에서).
전이유전자를 전달하는 데 사용되는 재조합 벡터는 비-복제 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터("rAAV")를 포함한다. rAAV는 다수의 이유로 특히 매력적인 벡터이다 - 이들은 비-복제 세포를 형질도입할 수 있고, 따라서 망막과 같이 낮은 수준에서 세포 분열이 일어나는 조직에 전이유전자를 전달하는 데 사용될 수 있다; 이들은 선택된 특정 기관을 우선적으로 표적화하도록 변형될 수 있고; 원하는 조직 특이성을 수득하고/하거나 일부 AAV에 대한 기존의 환자 항체에 의한 중화를 피하기 위해 선택할 수 있는 수백 개의 캡시드 혈청형이 있다. 이러한 rAAV는 AAV1, AAV2, AAV2.7m8 AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV9e, AAVrh10, AAVrh20, AAVrh39, AAVhu.37, AAVrh73, AAVrh74, AAV.hu51, AAV.hu21, AAV.hu12, 또는 AAV.hu26 중 하나 이상으로부터의 캡시드 성분을 포함하는 AAV 기반 벡터를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 AAV 기반 벡터는 AAV2.7m8, AAV8, AAV9, AAV10, 또는 AAVrh10 혈청형 중 하나 이상으로부터의 캡시드를 포함한다.
그러나, 렌티바이러스 벡터; 백시니아 바이러스 벡터, 또는 "네이키드 DNA" 작제물로 지칭되는 비-바이러스 발현 벡터를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 다른 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 전이유전자의 발현은 구성적 또는 조직-특이적 발현 조절 요소에 의해 조절될 수 있다.
치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질에 대한 유전자 요법 작제물은 공유 연결된 TNFR 및 Fc 부분이 이량체 융합 단백질로서 발현되도록 설계된다. 예를 들어, TNFR:Fc 융합은 중쇄 사이의 디설파이드 결합 형성에 연결된 힌지 영역(예를 들어, 서열번호 5 또는 9)의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 바람직하게는, TNFR1:Fc는 EYS606의 바이오베터 또는 바이오시밀러이거나, 보다 바람직하게는, TNFR:Fc는 EYS606이다. 바람직하게는, TNFR2:Fc는 에타너셉트의 바이오베터 또는 바이오시밀러이거나, 또는 보다 바람직하게는 TNFR:Fc는 에타너셉트이다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 핵산(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드) 및 핵산 서열은, 예를 들어, 당업자에게 공지된 임의의 코돈-최적화 기술을 통해 코돈-최적화될 수 있고(예를 들어, 문헌[Quax et al., 2015, Mol Cell 59:149-161]에서 검토), 또한 CpG 이량체를 감소시키기 위해 최적화될 수 있다. 코돈 최적화될 수 있는 치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질의 뉴클레오타이드 서열은 표 7에 개시되어 있다. 항-TNFα Fc 융합 단백질은 적절한 번역-후 프로세싱 및 분비를 보장하기 위해 N-말단 리더를 필요로 한다. 인간 세포에서 치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질의 발현을 위한 유용한 리더 서열이 본 명세서에 개시된다. 예시적인 재조합 발현 작제물은 도 1에 도시되어 있다.
HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질의 생산은 대상체의 형질도입된 세포에 의해 생산된 인간-글리코실화된, 설페이트화된 전이유전자 생성물을 연속적으로 공급하는 대상체에서의 영구 데포를 생성하기 위해, 유전자 요법을 통해 - 예를 들어, 에타너셉트 또는 EYS606과 같은, 항-TNFα Fc를 인코딩하는 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 작제물을 그러한 항-TNFα Fc 융합 단백질에 대한 질환 적응적으로 진단된 환자(인간 대상체)에게 투여함으로써 달성되는 질환의 치료를 위한 "바이오베터" 분자를 생성해야 한다. HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질에 대한 cDNA 작제물은 형질도입된 인간 세포에 의한 적절한 공동- 및 번역-후 프로세싱(글리코실화 및 단백질 설페이션)을 보장하는 신호 펩타이드를 포함해야 한다.
인간 대상체에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물은 생리학적으로 혼화 가능한 수성 완충제, 계면활성제 및 선택적인 부형제를 포함하는 제형 완충제 중 재조합 벡터의 현탁액을 포함한다. 이러한 제형 완충제는 다당류, 계면활성제, 폴리머, 또는 오일 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
유전자 요법에 대한 대안적 또는 추가 치료로서, 전장 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질은 재조합 DNA 기술에 의해 인간 세포주에서 생산될 수 있고, 당단백질은 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 재조합 당단백질 생산에 사용될 수 있는 인간 세포주는 몇 가지 예를 들면, 인간 배아 신장 293 세포(HEK293), 섬유육종 HT-1080, HKB-11, CAP, HuH-7, 및 망막 세포주, PER.C6, 또는 RPE를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다(예를 들어, 문헌[Dumont et al., 2015, Crit. Rev. Biotechnol. 36(6):1110-1122] 참조, 이러한 문헌은 HuPTM 생물학적 제제의 재조합 생산에 사용될 수 있는 인간 세포주의 검토를 위해 그 전체가 참조에 의해 원용됨). 완전한 글리코실화, 특히 시알릴화, 및 티로신-황화를 보장하기 위해, 생산에 사용되는 세포주는 α-2,6-시알릴트랜스퍼라제(또는 α-2,3- 및 α-2,6- 시알릴트랜스퍼라제 둘 다) 및/또는 인간 세포에서 티로신-O-황화를 담당하는 TPST-1 및 TPST-2 효소로 숙주 세포를 조작함으로써 향상될 수 있다.
유전자 요법 또는 단백질 요법 접근법에서 생산된 모든 분자가 완전히 글리코실화되고 설페이트화되는 것이 필수적이지는 않다. 오히려, 생산된 당단백질의 집단은 효능을 입증하기 위해 충분한 글리코실화(2,6-시알화 포함) 및 황산화를 가져야 한다. 본 발명의 유전자 요법 치료의 목표는 질환의 진행을 늦추거나 저지하는 것이다.
다른 이용 가능한 치료의 투여와 함께 환자에게 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질의 전달을 포함하는 조합 요법이 본 발명의 방법에 포함된다. 추가 치료는 유전자 요법 치료 전, 동시에 또는 후에 투여될 수 있다. 이러한 추가 치료는 치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질과의 공동-요법을 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
또한, 바이러스 벡터, 특히 AAV 기반 바이러스 벡터를 제조하는 방법이 제공된다. 특정 실시형태에서, AAV ITR이 측접된 시스 발현 카세트로서, 시스 발현 카세트는 인간 세포에서 전이유전자의 발현을 조절하는 발현 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 시스 발현 카세트; AAV ITR이 결여된 트랜스 발현 카세트로서, 트랜스 발현 카세트는 배양물 중에서 숙주 세포에서 AAV rep 및 캡시드 단백질의 발현을 구동시키고 트랜스에서 rep 및 cap 단백질을 공급하는 발현 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 AAV rep 및 캡시드 단백질을 인코딩하는 트랜스 발현 카세트; AAV 캡시드 단백질에 의한 인공 게놈의 복제 및 패키징을 허용하기 위한 충분한 아데노바이러스 헬퍼 기능을 포함하는 인공 게놈을 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 세포 배양물로부터 인공 게놈을 캡시드화하는 재조합 AAV를 회수하는 단계를 포함하는 재조합 AAV를 생산하는 방법이 제공된다.
5.1 정의
어구 "항-TNFα Fc 융합 단백질"은, 예를 들어, 펩타이드 결합을 통해 Fc 면역글로불린, 특히 IgG의 도메인에 공유 연결된, TNF-α 수용체 p55 또는 p75를 포함하는, TNFα에 대한 수용체의 가용성, 세포외 도메인 또는 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다.
용어 "조절 요소" 또는 "핵산 조절 요소"는 이웃 유전자의 전사를 조절하는 비코딩 핵산 서열이다. 시스 조절 요소는 통상적으로 전사 인자에 결합함으로써 유전자 전사를 조절한다. 이는 본 명세서에 기술된 바와 같은 하나 초과의 인핸서 또는 프로모터 요소를 포함하는 "복합 핵산 조절 요소"를 포함한다.
용어 "발현 카세트" 또는 "핵산 발현 카세트"는 프로모터, 인핸서 및/또는 조절 요소, 인트론 및 폴리아데닐화 서열을 비제한적으로 포함하는 하나 이상의 전사 조절 요소를 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 인핸서 및 프로모터는 통상적으로 하나 이상의 원하는 세포 타입, 조직 또는 기관에서 (트랜스)유전자 발현을 유도하는 기능을 한다.
용어 "작동 가능하게 연결된" 및 "...에 작동 가능하게 연결된"은 연결되고 통상적으로 인접하거나, 또는 실질적으로 인접하고, 필요한 경우 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하기 위해 인접하고 판독 프레임 내에 있는 핵산 서열을 지칭한다. 그러나, 인핸서는 일반적으로 수 킬로염기에 의해 프로모터로부터 분리될 때 기능하고 인트론 서열은 가변 길이일 수 있기 때문에, 일부 폴리뉴클레오타이드 요소는 작동 가능하게 연결될 수 있고 다운스트림 프로모터 및 전이유전자와 직접 인접하지 않으면서도 여전히 기능적일 수 있다.
용어 "AAV" 또는 "아데노-관련 바이러스"는 바이러스의 파르보바이러스과(Parvoviridae) 속 내의 디펜도파르보바이러스를 지칭한다. AAV는 자연 발생 "야생형" 바이러스로부터 유래된 AAV, 자연 발생 cap 유전자에 의해 인코딩된 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드에 패키징된 rAAV 게놈 및/또는 비-천연 발생 캡시드 캡 유전자에 의해 인코딩된 캡시드 단백질을 포함하는 캡시드에 패키징된 rAAV 게놈으로부터 유래된 AAV일 수 있다. 후자의 예는 천연-발생 캡시드의 아미노산 서열로의 펩타이드 삽입 또는 이의 변형을 포함하는 캡시드 단백질을 갖는 rAAV를 포함한다.
용어 "rAAV"는 "재조합 AAV"를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 재조합 AAV는 rep 및 cap 유전자의 일부 또는 전부가 이종성 서열로 대체된 AAV 게놈을 갖는다.
용어 "rep-cap 헬퍼 플라스미드"는 바이러스 rep 및 cap 유전자 기능을 제공하고 기능성 rep 및/또는 cap 유전자 서열이 결여된 rAAV 게놈으로부터 AAV의 생산을 돕는 플라스미드를 지칭한다.
용어 "캡 유전자"는 바이러스의 캡시드 코트를 형성하거나 형성하는 것을 돕는 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. AAV의 경우, 캡시드 단백질은 VP1, VP2, 또는 VP3일 수 있다.
용어 "rep 유전자"는 바이러스의 복제 및 생산에 필요한 비-구조 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 지칭한다.
용어 "핵산" 및 "뉴클레오타이드 서열"은 DNA 분자(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자(예를 들어, mRNA), DNA와 RNA 분자의 조합 또는 하이브리드 DNA/RNA 분자, 및 DNA 또는 RNA 분자의 유사체를 포함한다. 이러한 유사체는, 예를 들어, 이노신 또는 트리틸화된 염기를 포함하지만 이로 제한되지 않는 뉴클레오타이드 유사체를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 유사체는 또한, 예를 들어, 뉴클레아제 내성 또는 세포막을 가로지르는 증가된 능력과 같은 분자에 유익한 특성을 부여하는 변형된 백본을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 포함할 수 있다. 핵산 또는 뉴클레오타이드 서열은 단일-가닥, 이중-가닥일 수 있고, 단일-가닥 및 이중-가닥 부분 둘 다를 함유할 수 있고, 삼중-가닥 부분을 함유할 수 있지만, 바람직하게는 이중-가닥 DNA이다.
용어 "대상체", "숙주" 및 "환자"는 상호교환적으로 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 대상체는 바람직하게는 포유동물, 예컨대, 비-영장류(예를 들어, 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트 등) 또는 영장류(예를 들어, 원숭이 및 인간), 가장 바람직하게는 인간이다.
용어 "치료제" 또는 "생물요법제"는 질환 또는 장애가 전이유전자에 의해 제공되는 기능과 관련된 경우, 질환 또는 장애와 관련된 증상을 치료, 관리 또는 개선하는 데 사용될 수 있는 임의의 제제를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 "치료적 유효량"은 이로부터 고통받는 대상체에게 투여될 때 표적 질환 또는 장애의 치료 또는 관리에서 적어도 하나의 치료적 이점을 제공하는 제제의 양(예를 들어, 전이유전자에 의해 발현되는 생성물의 양)을 지칭한다. 또한, 본 발명의 작용제에 대한 치료적 유효량은 질환 또는 장애의 치료 또는 관리에서 적어도 하나의 치료적 이점을 제공하는 작용제 단독의, 또는 다른 요법과 조합된 경우의 양을 의미한다.
어구 "간-특이적" 또는 "간-유도된"은 간 세포의 세포내 환경과 이러한 요소의 상호작용으로 인해 간(간) 세포 또는 조직에서 이들의 활성을 적응시킨 핵산 요소를 지칭한다. 간은 간 조직으로 전달되는 유전자 요법의 맥락에서 신체에 대한 생물반응기 또는 "저장소"로서 작용하고, 간에서 발현을 위해 강화된 유전자 카세트는 순환계로 분비되는 생물치료제(번역된 단백질)를 생산할 것이다. 이와 같이, 생물치료제는 간 발현을 통해 대상체에게 전신 전달된다. 임의의 하나의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 생물치료제(예컨대, 전달된 전이유전자에 의해 생산됨)의 간 생산은 단백질을 생산하는 대상체의 내인성 T 세포가 단백질을 자가-단백질로서 인식하고 선천성 면역 반응을 유도하지 않도록 작용제에 면역내성을 제공할 수 있다.
5.2 작제물
HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 작제물이 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터 및 다른 DNA 발현 작제물은 전이유전자를 표적 세포로 전달하기 위한 임의의 적합한 방법을 포함한다. 전이유전자의 전달 수단은 바이러스 벡터, 리포솜, 다른 지질-함유 복합체, 다른 거대분자 복합체, 합성 변형된 mRNA, 비변형된 mRNA, 소분자, 비생물학적 활성 분자(예를 들어, 금 입자), 중합된 분자(예를 들어, 덴드리머), 네이키드 DNA, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 또는 에피솜을 포함한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 표적화된 벡터, 예를 들어, 안구 조직 세포를 표적으로 하는 벡터 또는 안구 조직 세포에 대한 친화성을 갖는 벡터이다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 사용하기 위한 핵산을 제공하며, 여기서 핵산은 본 명세서에 기재된 전이유전자로서, 전이유전자의 발현을 위해 표적화된 조직에서 발현을 위해 선택된 프로모터, 예를 들어, 유비쿼터스 프로모터, 예컨대, CB7/CAG 프로모터(서열번호 50) 및 관련 업스트림 조절 서열, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, EF-1 알파 프로모터(서열번호 53), mU1a(서열번호 52), UB6 프로모터, 닭 베타-액틴(CBA) 프로모터, 및 안구-조직 특이적 프로모터, 예컨대, 인간 로돕신 키나제(GRK1) 프로모터(서열번호 54 또는 117), 마우스 콘 저지(CAR) 프로모터(서열번호 114 내지 116), 인간 레드 옵신(RedO) 프로모터(서열번호 112), CB 프로모터(서열번호 159), CBLong 프로모터(서열번호 160), 또는 Best1/GRK 프로모터(서열번호 161)에 작동 가능하게 연결된, HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 유용한 프로모터의 목록은 표 1 및 표 1a를 참조한다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 핵산(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드)을 포함하는 재조합 벡터가 본 명세서에 제공된다. 핵산은 DNA, RNA, 또는 DNA와 RNA의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, DNA는 프로모터 서열, 관심 유전자의 서열(전이유전자, 예를 들어, HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열), 비번역 영역, 및 종결 서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 관심 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 핵산(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드) 및 핵산 서열은, 예를 들어, 당업자에게 공지된 임의의 코돈-최적화 기술을 통해 코돈-최적화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Quax et al., 2015, Mol Cell 59:149-161]의 리뷰 참조). 인간 세포에서 항-TNFα 융합 단백질의 발현을 위한 뉴클레오타이드 서열은 본 명세서의 표 7에 제공된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 작제물은 하기 성분을 포함한다: (1) 발현 카세트가 측접된 AAV2 역전된 말단 반복부; (2) 하나 이상의 조절 요소, b) 선택적으로, 닭 β-액틴 또는 다른 인트론 및 c) 토끼 β-글로빈 폴리 A 신호; 및 (3) 인간 IgG1 Fc 도메인의 N-말단에 연결된 TNFR2의 가용성 세포외 도메인을 코딩하는 핵산 서열, 여기서, Fc 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로, 힌지 영역-CH2 도메인-CH3 도메인(에타너셉트)을 포함함. 예시적인 작제물은 도 1 및 도 2A에 도시되어 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 작제물은 하기 성분을 포함한다: (1) 발현 카세트가 측접되는 AAV2 역전된 말단 반복부; (2) 하나 이상의 제어 요소, b) 임의로, 닭 β-액틴 또는 다른 인트론 및 c) 토끼 β-글로빈 폴리 A 신호; 및 (3) 트롬빈 절단 부위를 통해 인간 IgG1 Fc 도메인의 N-말단에 연결된 TNFR1의 가용성 세포외 도메인을 코딩하는 핵산 서열, 여기서 Fc 도메인은 N-말단으로부터 C-말단으로, 힌지 영역-CH2 도메인-CH3 도메인(EYS060)을 포함함. 예시적인 작제물은 도 2B에 도시되어 있다.
5.2.1 mRNA 벡터
특정 실시형태에서, DNA 벡터에 대한 대안으로서, 본 명세서에서 제공되는 벡터는 관심 유전자(예를 들어, 전이유전자, 예를 들어, HuPTM 비-단클론성 항체 생물학적 제제)를 인코딩하는 변형된 mRNA이다. 망막 색소 상피 세포로의 전이유전자의 전달을 위한 변형 및 비변형 mRNA의 합성은, 예를 들어, 문헌[Hansson et al., J. Biol. Chem., 2015, 290(9):5661-5672]에 교시되어 있으며, 이는 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 특정 실시형태에서, HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 변형된 mRNA가 본 명세서에 제공된다.
5.2.2 바이러스 벡터
바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV, 예를 들어, AAV2.7m8, AAV3, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV2.7m8, 및 다른 혈청형), 렌티바이러스, 헬퍼-의존성 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스, 폭스바이러스, 일본의 헤마글루티닌 바이러스(HVJ), 알파바이러스, 백시니아 바이러스, 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV) 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV)-기반 벡터를 포함한다. 알파바이러스 벡터는 셈리키 포레스트 바이러스(SFV) 및 신드비스 바이러스(SIN)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 재조합 바이러스 벡터이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 인간에서 복제-결핍되도록 변경된다. 특정 실시형태에서, 바이러스 벡터는 하이브리드 벡터, 예를 들어, "무력(helpless)" 아데노바이러스 벡터에 배치된 AAV 벡터이다. 특정 실시형태에서, 제1 바이러스로부터의 바이러스 캡시드 및 제2 바이러스로부터의 바이러스 외피 단백질을 포함하는 바이러스 벡터가 본 명세서에 제공된다. 특정 실시형태에서, 제2 바이러스는 수포성 구내염 바이러스(VSV)이다. 보다 구체적인 실시형태에서, 외피 단백질은 VSV-G 단백질이다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 HIV 기반 바이러스 벡터이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 HIV-기반 벡터는 적어도 2개의 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 여기서 gag 및 pol 유전자는 HIV 게놈으로부터의 것이고 env 유전자는 또 다른 바이러스로부터의 것이다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 단순 포진 바이러스-기반 바이러스 벡터이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 단순 포진 바이러스-기반 벡터는 이들이 하나 이상의 즉시 초기(IE) 유전자를 포함하지 않도록 변형되어, 이들을 비-세포독성이 되게 한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 MLV 기반 바이러스 벡터이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 MLV-기반 벡터는 바이러스 유전자 대신에 최대 8 kb의 이종성 DNA를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 렌티바이러스-기반 바이러스 벡터이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 렌티바이러스 벡터는 인간 렌티바이러스로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 렌티바이러스 벡터는 비-인간 렌티바이러스로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 캡시드에 패키징된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 렌티바이러스 벡터는 하기 요소 중 하나 이상을 포함한다: 긴 말단 반복부, 프라이머 결합 부위, 폴리퓨린 트랙, att 부위, 및 캡시드화 부위.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 알파바이러스-기반 바이러스 벡터이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 알파바이러스 벡터는 재조합 복제-결함 알파바이러스이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 알파바이러스 벡터에서 알파바이러스 레플리콘은 이들의 비리온 표면에 기능성 이종성 리간드를 표시함으로써 특정 세포 타입을 표적화한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 AAV 기반 바이러스 벡터이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 AAV-기반 벡터는 AAV rep 유전자(복제에 필요함) 및/또는 AAV cap 유전자(캡시드 단백질의 합성에 필요함)를 인코딩하지 않는다(rep 및 cap 단백질은 트랜스로 세포를 패키징함). 다수의 AAV 혈청형이 확인되었다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 AAV-기반 벡터는 AAV의 하나 이상의 혈청형으로부터의 성분을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 AAV-기반 벡터는 안구 조직, 간 및/또는 근육에 대한 친화성을 갖는 AAV의 하나 이상의 혈청형으로부터의 성분을 포함한다. 명세서 전체에 걸쳐, AAV "혈청형"은 면역학적으로 구별되는 캡시드, 자연 발생 캡시드, 또는 조작된 캡시드를 갖는 AAV를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 AAV 기반 벡터는 AAV1, AAV2, AAV2.7m8, AAV3, AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAV9, AAV9e, AAVrh10, AAVrh20, AAVrh39, AAVhu.37, AAVrh73, AAVrh74, AAV.hu51, AAV.hu21, AAV.hu12 또는 AAV.hu26 중 하나 이상으로부터의 캡시드 성분을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 AAV 기반 벡터는 AAV2.7m8, AAV8, AAV3B, AAV9, AAV10, AAVrh73, 또는 AAVrh10 혈청형 중 하나 이상으로부터의 성분이거나 이를 포함한다. 캡시드 단백질이 AAV8 캡시드 단백질(서열번호 32), AAV3B 캡시드 단백질(서열번호 26), 또는 AAVrh73 캡시드 단백질(서열번호 38)의 변이체인 바이러스 벡터가 제공되며, 캡시드 단백질은, 예를 들어, AAV8 캡시드 단백질(서열번호 32), AAV3B 캡시드 단백질(서열번호 26), 또는 AAVrh73 캡시드 단백질(서열번호 38)의 아미노산 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일하지만, 천연 캡시드의 생물학적 기능은 유지된다. 특정 실시형태에서, 인코딩된 AAV 캡시드는 AAV8, AAV3B, 또는 AAVrh73, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산 치환을 가지고, AAV8, AAV3B, 또는 AAVrh73 캡시드의 생물학적 기능을 유지하는 서열번호 32의 서열을 갖는다. 도 3은 SUBS로 라벨링된 행에서의 비교에 기반하여 정렬된 서열의 특정 위치에서 치환될 수 있는 잠재적인 아미노산과 상이한 AAV 혈청형의 캡시드 단백질의 아미노산 서열의 비교 정렬을 제공한다. 따라서, 특정 실시형태에서, AAV 벡터는 도 3의 SUBS 행에서 확인된 바와 같은 천연 AAV 캡시드 서열의 그러한 위치에 존재하지 않는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 아미노산 치환을 갖는 AAV8, AAV3B 또는 AAVrh73, 캡시드 변이체를 포함한다. AAV8, AAV3B 또는 AAVrh73 캡시드에 대한 아미노산 서열은 도 3에 제공된다.
일부 실시형태에서, AAV-기반 벡터는 AAV의 하나 이상의 혈청형으로부터의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 AAV 기반 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16 또는 다른 rAAV 입자, 또는 이들의 둘 이상의 조합 중 하나 이상으로부터의 캡시드 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 AAV 기반 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16 또는 다른 rAAV 입자, 또는 이들의 2개 이상의 혈청형의 조합 중 하나 이상으로부터의 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15, AAV16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, rAAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV.PHP.eB, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, 또는 AAV.HSC16, 또는 이의 유도체, 변형, 또는 슈도타입으로부터 선택된 AAV 캡시드 혈청형의 VP1, VP2, 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉, 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 재조합 AAV는 Anc80 또는 Anc80L65이다(예를 들어, 문헌[Zinn et al., 2015, Cell Rep. 12(6): 1056-1068] 참조, 이는 그 전체가 참조에 의해 원용된다). 특정 실시형태에서, 본 명세서의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 재조합 AAV는 AAV.7m8(이의 변이체 포함)이다(예를 들어, US 9,193,956; US 9,458,517; US 9,587,282; US 2016/0376323, 및 WO 2018/075798 참조, 이는 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다). 특정 실시형태에서, 본 명세서의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 AAV는 US 9,585,971호에 개시된 임의의 AAV, 예컨대, AAV-PHP.B이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 AAV는 AAV8 및 혈청형 cy5, rh20 또는 rh39로부터 유래된 하이브리드 캡시드 서열을 갖는 AAV2/Rec2 또는 AAV2/Rec3 벡터이다(예를 들어, 문헌[Issa et al., 2013, PLoS One 8(4): e60361] 참조, 이들 벡터에 대해 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 특정 실시형태에서, 본 명세서의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 AAV는 하기 중 임의의 것에 개시된 AAV이며, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다: US 7,282,199; US 7,906,111; US 8,524,446; US 8,999,678; US 8,628,966; US 8,927,514; US 8,734,809; US9,284,357; US 9,409,953; US 9,169,299; US 9,193,956; US 9,458,517; US 9,587,282; US 2015/0374803; US 2015/0126588; US 2017/0067908; US 2013/0224836; US 2016/0215024호; US 2017/0051257; PCT/US2015/034799; 및 PCT/EP2015/053335. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 하기 특허 및 특허 출원(이러한 문헌 각각은 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨) 중 어느 하나에 개시된 AAV 캡시드의 VP1, VP2 및/또는 VP3과 적어도 80% 이상 동일한, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉, 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 갖는다: 미국 특허 번호 7,282,199; 7,906,111; 8,524,446; 8,999,678; 8,628,966; 8,927,514; 8,734,809; US 9,284,357; 9,409,953; 9,169,299; 9,193,956; 9,458,517; 및 9,587,282; 미국 특허 출원 공개 번호 2015/0374803; 2015/0126588; 2017/0067908; 2013/0224836; 2016/0215024; 2017/0051257; 및 국제 특허 출원 번호 PCT/US2015/034799; PCT/EP2015/053335.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 미국 특허 번호 9,840,719 및 WO 2015/013313에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예컨대, AAV.Rh74 및 RHM4-1을 포함하며, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 WO 2014/172669에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예컨대, AAV rh.74를 포함하며, 이는 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 문헌[Georgiadis et al., 2016, Gene Therapy 23: 857-862 and Georgiadis et al., 2018, Gene Therapy 25: 450]에 기술된 바와 같은 AAV2/5의 캡시드를 포함하며, 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 원용된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 WO 2017/070491에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예를 들어, AAV2tYF를 포함하며, 이는 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는, 문헌[Puzzo et al., 2017, Sci. Transl. Med. 29(9): 418]에 기재된 바와 같은, AAVLK03 또는 AAV3B의 캡시드를 포함하며, 이는 그 전체가 참조에 의해 원용된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 미국 특허 번호 8,628,966; US 8,927,514; US 9,923,120 및 WO 2016/049230에 개시된 임의의 AAV 캡시드, 예를 들어, HSC1, HSC2, HSC3, HSC4, HSC5, HSC6, HSC7, HSC8, HSC9, HSC10, HSC11, HSC12, HSC13, HSC14, HSC15 또는 HSC16을 포함하며, 이러한 문헌 각각은 전문이 참조에 의해 원용된다.
일부 실시형태에서, rAAV 입자는 국제 출원 공개 번호 WO 2003/052051(예를 들어, '051 공보의 서열번호 2 참조), WO 2005/033321(예를 들어, '321 공보의 서열번호 123 및 88 참조), WO 03/042397(예를 들어, '397 공보의 서열번호 2, 81, 85, 및 97), WO 2006/068888(예를 들어, '888 공보의 서열번호 1 및 3-6 참조), WO 2006/110689(예를 들어, '689 간행물의 서열번호 5-38 참조) WO2009/104964(예를 들어, '964 간행물의 서열번호 1-5, 7, 9, 20, 22, 24 및 31 참조), WO 2010/127097(예를 들어, '097 공보의 서열번호 5-38 참조), 및 WO 2015/191508(예를 들어, '508 공보의 서열번호 80-294 참조), 및 미국 출원 공개 번호 20150023924(예를 들어, '924 공보의 서열번호 1, 5-10 참조)에 기재되어 있으며, 이들 각각의 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 일부 실시형태에서, rAAV 입자는 국제 특허공개 WO 2003/052051(예를 들어, '051 공보의 서열번호 2 참조), WO 2005/033321(예를 들어, '321 공보의 서열번호 123 및 88 참조), WO 03/042397(예를 들어, '397 공보의 서열번호 2, 81, 85, 및 97), WO 2006/068888(예를 들어, '888 공보의 서열번호 1 및 3-6 참조), WO 2006/110689(예를 들어, '689 공보의 서열번호 5-38 참조) WO2009/104964(예를 들어, 서열번호 964 공보의 서열번호 1-5, 7, 9, 20, 22, 24 및 31 참조), W0 2010/127097(예를 들어, '097 공보의 서열번호 5-38 참조), 및 WO 2015/191508(예를 들어, '508 공보의 서열번호 80-294 참조), 미국 출원 공개 20150023924(예를 들어, '924 공보의 서열번호 1, 5-10 참조)에 개시된 AAV 캡시드의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열과 적어도 80% 이상, 예를 들어, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 등, 즉, 최대 100% 동일한 캡시드 단백질을 갖는다.
추가 실시형태에서, rAAV 입자는 슈도타입화된 AAV 캡시드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 슈도타입화된 AAV 캡시드는 rAAV2/8 또는 rAAV2/9 슈도타입화된 AAV 캡시드이다. 슈도타입화된 rAAV 입자를 생산하고 사용하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671 (2001); Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532 (2000); Zolotukhin et al., Methods 28:158-167 (2002); 및 Auricchio et al., Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, (2001)] 참조).
AAV2.7m8-기반, AAV8-기반, AAV9-기반 및 AAVrh10-기반 바이러스 벡터는 본 명세서에 기술된 특정 방법에 사용된다. AAV 기반 바이러스 벡터의 뉴클레오타이드 서열 및 재조합 AAV 및 AAV 캡시드를 제조하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 9,193,956 B2, 미국 특허 번호 7,282,199 B2, 미국 특허 번호 7,790,449 B2, 미국 특허 번호 8,318,480 B2, 미국 특허 번호 8,962,332 B2 및 국제 특허 출원 번호 PCT/EP2014/076466에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 일 양태에서, 전이유전자(예를 들어, HuPTM 이량체 융합 단백질)을 인코딩하는 AAV(예를 들어, AAV2.7m8, AAV8, AAV9 또는 AAVrh10)-기반 바이러스 벡터가 본 명세서에 제공된다. AAV2.7m8, AAV8, AAV9 및 AAVrh10을 포함하는 AAV 캡시드의 아미노산 서열은 도 3에 제공된다.
특정 실시형태에서, 상기와 같이 단일-가닥 AAV(ssAAV)가 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 자가-상보적 벡터, 예를 들어, scAAV가 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2):171-82, McCarty et al, 2001, Gene Therapy, Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254]; 및 미국 특허 번호 6,596,535; 7,125,717; 및 7,456,683 참조, 이들 각각은 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용됨).
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법에 사용되는 바이러스 벡터는 아데노바이러스 기반 바이러스 벡터이다. 재조합 아데노바이러스 벡터는 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자에서 전달하는 데 사용될 수 있다. 재조합 아데노바이러스는 E1 결실을 갖고, E3 결실을 갖거나 갖지 않고, 발현 카세트가 어느 하나의 결실 영역에 삽입된 1세대 벡터일 수 있다. 재조합 아데노바이러스는 E2 및 E4 영역의 전체 또는 부분 결실을 함유하는 2세대 벡터일 수 있다. 헬퍼-의존성 아데노바이러스는 아데노바이러스 역전된 말단 반복부 및 패키징 신호(phi)만을 보유한다. 전이유전자는 게놈을 대략 36 kb의 야생형 크기에 가깝게 유지하기 위해 스터퍼 서열의 존재 또는 부재 하에 패키징 신호와 3'ITR 사이에 삽입된다. 아데노바이러스 벡터의 생산을 위한 예시적인 프로토콜은 문헌[Alba et al., 2005, "Gutless adenovirus: last generation adenovirus for gene therapy," Gene Therapy 12:S18-S27]에서 확인될 수 있으며, 이는 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법에 사용되는 바이러스 벡터는 렌티바이러스 기반 바이러스 벡터이다. 재조합 렌티바이러스 벡터는 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자로 전달하는 데 사용될 수 있다. 4개의 플라스미드가 작제물을 제조하는 데 사용된다: 플라스미드를 함유하는 Gag/pol 서열, 플라스미드를 함유하는 Rev 서열, 플라스미드를 함유하는 외피 단백질(예를 들어, VSV-G), 및 패키징 요소 및 항-TNFα Fc 융합 단백질을 갖는 Cis 플라스미드.
렌티바이러스 벡터 생산을 위해, 4개의 플라스미드가 세포(예를 들어, HEK293 기반 세포)로 공동-트랜스펙션되고, 이에 의해 폴리에틸렌이민 또는 칼슘 포스페이트가 특히 트랜스펙션 제제로서 사용될 수 있다. 이후, 렌티바이러스는 상청액에서 수확된다(렌티바이러스는 활성화되기 위해 세포로부터 발아될 필요가 있으므로, 세포 수확이 수행될 필요가 없다/수행되어서는 안 된다). 상청액을 여과하고(0.45 ㎛), 이어서 마그네슘 클로라이드 및 벤조나제가 첨가된다. 추가 다운스트림 공정은 TFF 및 컬럼 크로마토그래피를 사용하는 것이 가장 GMP 호환되는 것들로 매우 다양할 수 있다. 다른 것들은 컬럼 크로마토그래피와 함께/없이 초원심분리를 사용한다. 렌티바이러스 벡터의 생산을 위한 예시적인 프로토콜은 문헌[Lesch et al., 2011, "Production andpurification of lentiviral vector generated in 293T suspension cells with baculoviral vectors," Gene Therapy 18:531-538, and Ausubel et al., 2012, "Production of CGMP-Grade Lentiviral Vectors," Bioprocess Int. 10(2):32-43]에서 확인될 수 있으며, 이들 둘 다는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 사용하기 위한 벡터는, 관련 세포 내로 벡터의 도입시, HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질이 세포에 의해 발현되도록 하는 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 것이다.
5.2.3 유전자 발현의 프로모터 및 변형자
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 벡터는 유전자 전달 또는 유전자 발현을 조절하는 성분(예를 들어, "발현 조절 요소")을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 벡터는 유전자 발현을 조절하는 성분을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 벡터는 세포에 대한 결합 또는 표적화에 영향을 미치는 성분을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 벡터는 흡수 후 세포 내의 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 전이유전자)의 국소화에 영향을 미치는 성분을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 벡터는, 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드를 흡수한 세포를 검출하거나 선택하기 위해 검출 가능하거나 선택 가능한 마커로서 사용될 수 있는 성분을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 전이유전자의 발현을 제어하는 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터(및 인핸서와 같은 전사를 제어하는 다른 조절 요소)는 구성적일 수 있거나(유비쿼터스 발현 촉진) 안구 조직에서 특이적으로 또는 선택적으로 발현될 수 있다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다.
특정 실시형태에서, 프로모터는 CB7(CAG 프로모터로도 지칭됨)이다(문헌[Dinculescu et al., 2005, Hum Gene Ther 16: 649-663] 참조, 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 일부 실시형태에서, CAG(서열번호 51) 또는 CB7 프로모터(서열번호 50)는 벡터에 의해 구동되는 전이유전자의 발현을 향상시키는 다른 발현 조절 요소를 포함한다. 특정 실시형태에서, 다른 발현 조절 요소는 닭 β-액틴 인트론 및/또는 토끼 β-글로빈 polyA 신호(서열번호 55)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 TATA 박스를 포함한다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 하나 이상의 요소를 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 프로모터 요소는 서로에 대해 역전되거나 이동될 수 있다. 특정 실시형태에서, 프로모터의 요소는 협력하여 기능하도록 위치된다. 특정 실시형태에서, 프로모터의 요소는 독립적으로 기능하도록 위치된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 인간 CMV 즉시 초기 유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스(RS) 긴 말단 반복부, 및 래트 인슐린 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로모터를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 벡터는 AAV, MLV, MMTV, SV40, RSV, HIV-1 및 HIV-2 LTR로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 벡터는 하나 이상의 조직 특이적 프로모터(예를 들어, 망막-특이적 프로모터)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 안구 조직 세포 특이적 프로모터, 예를 들어, 인간 로돕신 키나제(GRK1) 프로모터(서열번호 54 또는 117), 마우스 원추체 어레스틴(CAR) 프로모터(서열번호 114 내지 116), 인간 레드 옵신(RedO) 프로모터(서열번호 112) 또는 Best1/GRK 프로모터(서열번호 161)를 포함한다.
발현 카세트에서 일렬로 요소의 배열과 관련하여 키메라인 핵산 조절 요소가 제공된다. 조절 요소는 일반적으로 전사 개시 또는 조절, 신호전달 시 발현을 유도하고 다운스트림 유전자의 발현을 향상시키기 위한 세포-특이적 기계와의 조정을 위한 인식 부위로서 다중 기능을 갖는다.
특정 실시형태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 저산소증-유도성 프로모터이다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 저산소증-유도성 인자(HIF) 결합 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 HIF-1α 결합 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 HIF-2α 결합 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, HIF 결합 부위는 RCGTG 모티프를 포함한다. HIF 결합 부위의 위치 및 서열에 관한 세부사항은, 예를 들어, 문헌[Schoedel, et al., Blood, 2011, 117(23):e207-e217]을 참조하고, 이는 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 특정 실시형태에서, 프로모터는 HIF 전사 인자 이외의 저산소증 유도된 전사 인자에 대한 결합 부위를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 저산소증에서 우선적으로 번역되는 하나 이상의 IRES 부위를 포함한다. 저산소증-유도성 유전자 발현 및 이에 관련된 인자에 관한 교시를 위해, 예를 들어, 문헌[Kenneth and Rocha, Biochem J., 2008, 414:19-29]을 참조하고, 이는 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 특정 실시형태에서, 저산소증-유도성 프로모터는 인간 N-WASP 프로모터(예를 들어, 문헌[Salvi, 2017, Biochemistry and Biophysics Reports 9:13-21](N-WASP 프로모터의 교시를 위해 참조에 의해 원용됨) 참조)이거나, 인간 Epo의 저산소증-유도 프로모터(예를 들어, 문헌[Tsuchiya et al., 1993, J. Biochem. 113:395-400](Epo 저산소증-유도성 프로모터의 개시를 위해 참조에 의해 원용됨) 참조]이다. 다른 실시형태에서, 프로모터는 약물 유도성 프로모터, 예를 들어, 라파마이신 또는 이의 유사체의 투여에 의해 유도되는 프로모터이다(예를 들어, PCT 공보 WO94/18317, WO 96/20951, WO 96/41865, WO 99/10508, WO 99/10510, WO 99/36553 및 WO 99/41258, 및 US 7,067,526에서 라파마이신 유도성 프로모터의 개시를 참조함, 이러한 문헌은 약물 유도성 프로모터의 개시를 위해 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨].
특정 유비쿼터스 및 조직-특이적 프로모터를 함유하는 작제물이 본 명세서에 제공된다. 이러한 프로모터는 합성 및 탠덤 프로모터를 포함한다. 프로모터의 예 및 뉴클레오타이드 서열은 하기 표 1 및 표 1a에 제공된다. 표 1은 또한 본 명세서에서 제공되는 발현 카세트에 유용한 다른 조절 요소의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
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Figure pct00004
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[표 1a]
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Figure pct00011
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Figure pct00016
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특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 프로모터 이외의 하나 이상의 조절 요소를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 인핸서를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 리프레서를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 인트론(예를 들어, VH4 인트론(서열번호 57) 또는 키메라 인트론(서열번호 56))을 포함한다. 바이러스 벡터는 또한 전이유전자 생성물, 예를 들어, GCCACC의 번역을 촉진하기 위해 Kozak 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 전이유전자의 코딩 영역의 다운스트림에 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 전사의 종결을 시그널링하고 polyA 꼬리의 합성을 지시하는 임의의 polyA 부위는 본 개시내용의 AAV 벡터에서 사용하기에 적합하다. 예시적인 polyA 신호는 SV40 후기 유전자, 토끼 β-글로빈 유전자(서열번호 55), 소 성장 호르몬(BPH) 유전자, 인간 성장 호르몬(hGH) 유전자, 합성 polyA(SPA) 부위, 및 소 성장 호르몬(bGH) 유전자로부터 유래되지만, 이로 제한되지 않는다(예를 들어, 문헌[Powell and Rivera-Soto, 2015, Discov. Med., 19(102):49-57] 참조).
전이유전자의 발현이 하나 초과의 조절 요소(프로모터 또는 인핸서)를 갖는 조작된 핵산 조절 요소에 의해 제어되는 유전자 발현 카세트 및 유전자 발현 카세트를 포함하는 rAAV가 제공된다.
5.2.4 신호 펩타이드
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 벡터는 단백질 전달을 조절하는 성분을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 분비를 지시하기 위해 전이유전자로부터 발현된 단백질이 N-말단에서 신호 서열을 갖도록 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 융합된 뉴클레오타이드 서열을 인코딩하는 하나 이상의 신호 펩타이드를 포함한다. 신호 펩타이드는 또한 본 명세서에서 "리더 서열" 또는 "리더 펩타이드"로 지칭될 수 있다. 특정 실시형태에서, 신호 펩타이드는 전이유전자 생성물이 세포에서 적절한 패키징(예를 들어, 글리코실화)을 달성하도록 한다. 특정 실시형태에서, 신호 펩타이드는 전이유전자 생성물이 세포에서 적절한 국소화를 달성하도록 한다. 특정 실시형태에서, 신호 펩타이드는 전이유전자 생성물이 세포로부터 분비를 달성하도록 한다.
유전자 요법 맥락에서 또는 세포 배양에서 단백질 생산을 위한 신호 서열을 선택하기 위한 2개의 일반적인 접근법이 있다. 한 가지 접근법은 발현되는 단백질과 상동성인 단백질로부터의 신호 펩타이드를 사용하는 것이다. 예를 들어, 인간 항체 신호 펩타이드는 CHO 또는 다른 세포에서 IgG를 발현하는 데 사용될 수 있다. 또 다른 접근법은 발현에 사용되는 특정 숙주 세포에 최적화된 신호 펩타이드를 확인하는 것이다. 신호 펩타이드는 상이한 단백질 사이에서 또는 심지어 상이한 유기체의 단백질 사이에서 교환될 수 있지만, 일반적으로 그 세포 타입의 가장 풍부한 분비 단백질의 신호 서열이 단백질 발현에 사용된다. 예를 들어, 혈장에서 가장 풍부한 단백질인 인간 알부민의 신호 펩타이드는 CHO 세포에서 단백질 생산 수율을 실질적으로 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 특정 신호 펩타이드는 발현된 단백질로부터 "표적화-후 기능"으로서 절단된 후 기능을 유지하고 활성을 발휘할 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 신호 펩타이드는 표적화-후 기능을 피하기 위해 발현에 사용된 세포에 의해 분비되는 가장 풍부한 단백질의 신호 펩타이드로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 신호 서열은 중쇄 및 경쇄 서열 둘 다에 융합된다. 예시적인 서열은 서열번호 63의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩될 수 있는 MYRMQLLLLIALSLALVTNS(서열번호 62)이다(표 2, 도 2A 및 도 2B 참조). 대안적으로, 발현에 적합하고 눈(안구 조직)에서 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질의 선택적 발현 또는 지시된 발현을 유발할 수 있는 신호 서열이 하기 표 2에 제공된다. 또한 간(표 3) 및 근육(표 4) 세포에서 활성인 신호 서열이 제공된다.
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
5.2.5 비번역 영역
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 하나 이상의 비번역 영역(UTR), 예를 들어, 3' 및/또는 5' UTR을 포함한다. 특정 실시형태에서, UTR은 원하는 수준의 단백질 발현에 대해 최적화된다. 특정 실시형태에서, UTR은 전이유전자의 mRNA 반감기에 대해 최적화된다. 특정 실시형태에서, UTR은 전이유전자의 mRNA의 안정성에 대해 최적화된다. 특정 실시형태에서, UTR은 전이유전자의 mRNA의 이차 구조에 대해 최적화된다.
5.2.6 역 말단 반복부
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 하나 이상의 역 말단 반복부(ITR) 서열을 포함한다. ITR 서열은 재조합 유전자 발현 카세트를 바이러스 벡터의 비리온으로 패키징하는 데 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, ITR은 AAV, 예를 들어, AAV8 또는 AAV2로부터의 것이다(예를 들어, 문헌[Yan et al., 2005, J. Virol., 79(1):364-379]; 미국 특허 제7,282,199 B2호, 미국 특허 제7,790,449 B2호, 미국 특허 제8,318,480 B2호, 미국 특허 제8,962,332 B2호 및 국제 특허 출원 PCT/EP2014/076466호 참조, 이러한 문헌 각각은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 바람직한 실시형태에서, ITR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, 서열번호 58(5'-ITR) 또는 60(3'-ITR)의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 자가-상보적 벡터, 예를 들어, scAAV를 생산하는 데 사용되는 변형된 ITR이 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2):171-82, McCarty et al, 2001, Gene Therapy, Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254; 6,596,535; 7,125,717; 및 7,456,683] 참조, 이들 각각은 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다). 바람직한 실시형태에서, 변형된 ITR을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, 서열번호 58(5'-ITR) 또는 60(3'-ITR), scAAV에 대해 변형된, 서열번호 59( m 5'ITR) 또는 서열번호 61(m 3' ITR)의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
5.2.7 전이유전자
전이유전자는 본 명세서에 개시된 치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질에 기반하여 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질, 예를 들어, TNFR1:Fc 융합 단백질 또는 TNFR2:Fc 융합 단백질을 인코딩한다. 특정 실시형태에서, HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질은 TNFR 및/또는 Fc 도메인 상에 추가적인 글리코실화 부위를 함유하도록 조작된다. 또한, 항-TNFα Fc 융합 단백질의 Fc 도메인은 N297에서 글리코실화 부위를 변경하여 해당 부위에서 글리코실화를 방지하도록 조작될 수 있다(예를 들어, 글리코실화 부위를 녹아웃시키기 위한 T 또는 S가 아닌 잔기의 경우 N297에서 또 다른 아미노산에 대한 치환 및/또는 T297에서의 치환). 이러한 Fc 도메인은 "비글리코실화"된다.
5.2.7.1 HuPTM TNFR:Fc 융합 단백질의 발현을 위한 작제물
특정 실시형태에서, 전이유전자는 항-TNFα 융합 단백질을 인코딩하며, 여기서 항-TNFα Fc 융합 단백질은, 예를 들어, 펩타이드 결합을 통해, 면역글로불린 중쇄의 Fc 도메인을 함유하는 폴리펩타이드에 공유 연결된 인간 TNFα 수용체 타입 I(TNFR1) 또는 타입 II(TNFR2)의 가용성, 세포외 부분을 포함한다.
특정 실시형태에서, 전이유전자는 면역글로불린 중쇄(서열번호 3 또는 4)의 Fc 도메인(예를 들어, 힌지, CH2 및 CH3 포함)의 전부 또는 일부에 융합된 TNFR2(서열번호 2)의 세포외 도메인의 전부 또는 TNFα-결합 부분을 인코딩한다. 바람직한 실시형태에서, 전이유전자는 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하며, 여기서 항-TNFα Fc 융합 단백질은 예컨대, 펩타이드 결합을 통해, 발현시 회합하여 이량체성 TNFR2:Fc 융합 단백질을 형성하는 인간 IgG1의 Fc 도메인(중쇄 CH2, 및 중쇄 CH3, 및 힌지 영역 포함)에 공유 연결된 TNFR2의 인간 가용성 세포외 도메인을 포함한다. 특히, 항-TNFα Fc 융합 단백질은 에타너셉트(리더 서열을 갖는 서열번호 10 또는 11의 아미노산 서열을 가짐) 또는 에타너셉트-szzs(ERELZI®) 및 에탄터셉트-ykro(ETICOVO®)를 포함하는 에타너셉트의 임의의 바이오시밀러 형태이다.
다른 실시형태에서, 전이유전자는 면역글로불린 중쇄 Fc 도메인(서열번호 6 또는 7)의 전부 또는 일부에 융합된 TNFR1(서열번호 1)의 가용성 세포외 도메인의 전부 또는 일부를 인코딩한다. 바람직한 실시형태에서, 전이유전자는 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하며, 여기서 항-TNFα Fc 융합 단백질은, 예컨대, 펩타이드 결합을 통해, 발현시 회합하여 이량체 TNFR1:Fc 융합 단백질(서열번호 12)을 형성하는, 인간 IgG1(중쇄 CH2, 및 중쇄 CH3, 및 힌지 영역 포함)의 Fc 부분에 공유 연결된 TNFR1의 인간 가용성, 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, TNFR1은 트롬빈 절단 부위 LVPRGS(서열번호 8)를 통해 Fc 도메인에 융합된다. 특정 실시형태에서, 항-TNFα Fc 융합 단백질은 EYS060(서열번호 12의 아미노산 서열을 가짐)이다.
재조합 AAV 작제물은 세포, 세포 배양물, 또는 대상체에서 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질을 발현한다. TNFR 및 Fc 도메인의 가용성 세포외 도메인을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있고, 인간 세포에서의 발현을 촉진시키기 위해 서열에서 CpG 이량체의 발생률이 감소될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 전이유전자는 본 명세서에 개시된 임의의 치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질, 예를 들어, 본 명세서의 도 1 또는 2에 도시된 TNFR:Fc 융합(도 2A 및 도 2B에 제공된 서열)을 인코딩한다.
특정 실시형태에서, Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이지만, 다른 실시형태에서, Fc 영역은 IgA, IgD, IgE, 또는 IgM일 수 있다. 전이유전자로부터 발현된 Fc 융합 단백질은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 Fc 도메인을 가질 수 있지만, 바람직하게는 인간 IgG1로부터 유래된다. Fc 도메인은 본 명세서에 기재된 중쇄 CH1, 힌지, CH2, 및 CH3 도메인의 일부 또는 전부(도 4 및 표 5 참조) 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다.
Fc 융합 단백질의 Fc 도메인은 항체 이소타입에 따라 상이한 하나 이상의 이펙터 기능을 갖는다. 이펙터 기능은 야생형 또는 치료용 Fc 융합 단백질의 기능과 동일할 수 있거나, 섹션 5.2.8에 개시된 Fc 변형을 사용하여 하나 이상의 이펙터 기능을 추가, 향상, 변형 또는 억제하기 위해 이로부터 변형될 수 있다. 특정 실시형태에서, HuPTM 비-단클론성 항체 전이유전자는 표 5에 제시된 바와 같은 IgG1, IgG2 또는 IgG4 이소타입의 예시적인 Fc 도메인 또는 에타너셉트에 대해 표 6에 제시된 본 명세서에 기술된 치료용 융합 단백질의 Fc 도메인 폴리펩타이드에 제시된 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 아미노산 서열을 포함하는 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 일부 실시형태에서, HuPTM 융합 단백질은 Fc 폴리펩타이드의 이펙터 기능을 변경시키기 위해, 서열이 하기 섹션 5.2.8에 기재된 기술 중 하나 이상으로 서열이 변형된 표 5의 Fc 폴리펩타이드 서열의 변이체인 서열 또는 Fc 폴리펩타이드를 포함한다.
재조합 AAV 작제물은 세포, 세포 배양물, 또는 대상체에서 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질을 발현한다. 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있고, 인간 세포에서의 발현을 촉진하기 위해 서열에서 CpG 이량체의 발생률이 감소될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 전이유전자는 본 명세서에 개시된 임의의 치료적 항-TNFα Fc 융합 단백질, 예를 들어, 본 명세서의 도 2A 및 2b에 도시되고 특정 실시형태에서, 표 6 또는 대안적으로 표 5에 제공된 관련된 Fc 도메인을 포함하는, 치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질 엔타너셉트 또는 EYS606을 인코딩한다. Fc 도메인은 섹션 5.2.8에서 추가로 논의된다. 예시적인 Fc 도메인 서열은 표 6뿐만 아니라 도 3 및 표 5에 제공된다. 도 2A는 TNFR2:Fc 융합 에타너셉트의 아미노산 서열을 제공하고, 도 2B는 TNFR1:Fc 융합 EYS606의 아미노산 서열을 제공한다(또한 표 6 참조).
일부 실시형태에서, 항-TNFα Fc 융합 단백질의 발현을 위한 전이유전자는, 예컨대, 펩타이드 결합을 통해, 본 명세서에 추가로 기술된 바와 같은 면역글로불린 중쇄의 Fc 도메인을 함유하는 폴리펩타이드에 공유 연결된 인간 TNFα 수용체 타입 I(TNFR1) 또는 타입 II(TNFR2)의 가용성, 세포외 부분을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, TNFR1은 트롬빈 절단 부위(서열번호 8)를 통해 Fc 도메인에 융합된다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 TNFR1 또는 TNFR2의 가용성 세포외 도메인, 선택적으로 치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질의 트롬빈 절단 부위, 힌지 영역, 및 IgG1 Fc 사슬(CH2 + CH3)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 표 7에 제공된다. 특정 실시형태에서, 이러한 뉴클레오타이드 서열은 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 예를 들어, 표 7의 에타너셉트의 코돈 최적화된 서열(서열번호 15-18)을 참조한다.
전이유전자는 사슬간 디-설파이드 결합을 형성하는 힌지 영역의 부분(예를 들어, 서열 CPPCPA(서열번호 153)을 함유하는 부분)을 포함할 수 있다. 서열 CCPCPA(서열번호 153)를 포함하는 힌지 영역의 일부를 함유하지 않는 Fc 도메인 서열은 사슬내 디설파이드 결합을 형성하지 않을 것이나, 서열 CPPCPA(서열번호 153)는 사슬내 디설파이드 결합을 형성할 것이고, 따라서 이량체 융합 단백질 단편을 형성할 것이다. 일부 실시형태에서, 힌지는 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(서열번호 145), 및 구체적으로, EPKSCDKTHL(서열번호 146), EPKSCDKTHT(서열번호 147), EPKSCDKTHTCPPCPA(서열번호 148), EPKSCDKTHLCPPCPA(서열번호 149), DKTHTCPPCPAPELLGG(서열번호 21), DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(서열번호 152), EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(서열번호 150) 또는 EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(서열번호 151)의 전부 또는 일부를 함유한다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 하기 요소를 하기 순서로 포함한다: a) 구성적 또는 유도성(예를 들어, 저산소증-유도성 또는 리파마이신-유도성) 프로모터 서열 또는 조직 특이적 프로모터/조절 영역, 예를 들어, 표 1 또는 표 1a에 제공된 조절 영역, 특히 안구 조직 특이적 발현을 촉진하는 프로모터 및 b) 전이유전자를 인코딩하는 서열(예를 들어, 항-TNFα Fc 융합 단백질). 특정 실시형태에서, 전이유전자를 포함하는 서열은, 예컨대, 펩타이드 결합을 통해, 면역글로불린 중쇄의 Fc 도메인을 함유하는 폴리펩타이드에 공유 연결된 인간 TNFα 타입 I(TNFR1) 또는 타입 II(TNFR2)의 가용성, 세포외 부분을 포함하는 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 전이유전자를 포함하는 서열은 상기 인간 안구 세포에서 분비 및 번역 후 변형을 지시하는 항-TNFα Fc 융합 단백질의 N-말단에서 신호 서열을 인코딩한다. 다른 실시형태에서, 서열은 서열번호 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 갖는 전이유전자 생성물을 인코딩한다. 바람직한 실시형태에서, 항-TNFα 융합 단백질은 에타너셉트 또는 EYS606이다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 하기 요소를 하기 순서로 포함한다: a) 구성적 또는 유도성 프로모터 서열 또는 조직 특이적 프로모터, 예를 들어, 표 1 및 1a의 프로모터 또는 조절 영역 중 하나, 및 b) 전이유전자(예를 들어, 항-TNFα Fc 융합 단백질)을 인코딩하는 서열, 여기서 전이유전자는 항-TNFα Fc 융합 단백질을 형성하기 위해 예컨대 펩타이드 결합을 통해, 면역글로불린 중쇄의 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 공유 연결된 인간 TNFα 수용체 타입 I(TNFR1) 또는 타입 II(TNFR2)의 단일 펩타이드, 가용성, 세포외 부분을 포함함. 다른 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 하기 요소를 하기 순서로 갖는다: a) 표 1 및 1a에 열거된 안구 조직-특이적 프로모터, 및 b) 신호 펩타이드를 포함하는 전이유전자를 인코딩하는 서열, 여기서 전이유전자는 항-TNFα Fc 융합 단백질을 형성하기 위해 예컨대 펩타이드 결합을 통해, 면역글로불린 중쇄의 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 공유 연결된 인간 TNFα 수용체 타입 I(TNFR1) 또는 타입 II(TNFR2)의 단일 펩타이드, 가용성, 세포외 부분을 포함함. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 LSPRGS(서열번호 158)의 아미노산 서열을 갖는 TNFR 도메인의 C-말단에 연결된 트롬빈 절단 부위를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, AAV2.7m8 캡시드, AAV8 캡시드, AAV3B 캡시드, 또는 AAVrh73 캡시드의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 바이러스 캡시드(도 3 참조); 및 AAV 역 말단 반복부(ITR)가 측접된 발현 카세트를 포함하는 인공 게놈을 포함하는 AAV 벡터가 제공되며; 여기서 발현 카세트는 하나 이상의 안구 조직에서 전이유전자의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된, 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 포함한다.
치료용 융합 단백질을 인코딩하고 발현하는 rAAV 벡터는 치료용 융합 단백질로 증상을 치료, 예방 또는 개선할 수 있는 질병 또는 병태의 증상을 치료 또는 예방 또는 개선하기 위해 투여될 수 있다. 또한, rAAV 벡터 및 이를 인코딩하는 작제물을 사용하여 인간 세포에서 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질을 발현시키는 방법이 제공된다.
5.2.8 Fc 영역 변형
특정 실시형태에서, 전이유전자는 회합하여 이량체 Fc 융합 단백질을 형성하는 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩한다. 따라서, 전이유전자는, 예컨대 펩타이드 결합을 통해, Fc 도메인 펩타이드의 N-말단 및 중쇄의 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함하는, 면역글로불린 중쇄의 Fc 도메인(도 2A 및 도 2B)을 함유하는 폴리펩타이드에 공유 연결된 인간 TNFα Fc 수용체 타입 I(TNFR1) 또는 타입 II(TNFR2)의 가용성, 세포외 부분을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 표 6은 본 명세서에 기술된 특정 치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질에 대한 Fc 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 제공한다. 대안적으로, 서열이 도 4에 제공되고 표 5에 제공되는 IgG2, 또는 IgG4 Fc 도메인이 이용될 수 있다. 상술된 바와 같이, 전이유전자는 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 힌지 영역의 N-말단에서 인간 TNFR의 가용성, 세포외 부분을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결된 치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질에 대한 Fc 도메인 폴리펩타이드를 인큐딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다(도 2A 및 도 2B 및 표 6에 제공된 아미노산 서열을 가짐).
용어 "Fc 영역"은 2개의 "Fc 폴리펩타이드"(또는 "Fc 도메인")의 이량체를 지칭하며, 각각의 "Fc 폴리펩타이드"는 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외한 항체의 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, "Fc 영역"은 하나 이상의 디설파이드 결합, 화학적 링커, 또는 펩타이드 링커에 의해 연결된 2개의 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. "Fc 폴리펩타이드"는 IgA, IgD, 및 IgG의 적어도 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 또는 IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인을 지칭하고, 또한 이러한 도메인에 대한 가요성 힌지 N-말단의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. IgG의 경우, 예를 들어, "Fc 폴리펩타이드"는 면역글로불린 도메인 Cγ2(Cγ2, 종종 CH2 도메인으로 지칭됨) 및 C감마3(Cγ3, CH3 도메인으로도 지칭됨)을 포함하고, C감마1(Cγ1, CH1 도메인으로도 지칭됨) 및 CH2 도메인을 포함한다. Fc 폴리펩타이드의 경계는 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 폴리펩타이드는 일반적으로 T223 또는 C226 또는 P230에서 시작하여 이의 카르복실-말단까지의 잔기를 포함하는 것으로 정의되며, 여기서 넘버링은 문헌[Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Services, Springfield, Va.)]에 따른 EU 인덱스에 따른 것이다. IgA의 경우, 예를 들어, Fc 폴리펩타이드는 면역글로불린 도메인 C알파2(Cα2) 및 C알파3(Cα3)을 포함하고, C알파1(Cα1)과 Cα2 사이의 힌지의 하부를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, Fc 폴리펩타이드는 에타너셉트 또는 EYS606의 것이다(표 6 참조). 다른 실시형태에서, Fc 폴리펩타이드는 IgG Fc 폴리펩타이드이다. Fc 폴리펩타이드는 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 아이소형으로부터 유래될 수 있거나(EU 넘버링에 따라 넘버링된 IgG1, IgG2 및 IgG4 Fc 도메인 서열의 정렬에 대해 도 4 참조), 예를 들어, 치료 항체의 요망되는 이펙터 활성에 따fms IgG3 Fc 도메인일 수 있다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인을 포함하는, 조작된 중쇄 불변 영역(CH)은 키메라이다. 이와 같이, 키메라 CH 영역은 하나 초과의 면역글로불린 이소타입 및/또는 서브타입으로부터 유래된 CH 도메인을 결합한다. 예를 들어, 키메라(또는 하이브리드) CH 영역은 IgG, IgA 및/또는 IgM으로부터의 Fc 영역의 일부 또는 전부를 포함한다. 다른 예에서, 키메라 CH 영역은 인간 IgG1, 인간 IgG2, 또는 인간 IgG4 분자로부터 유래된 CH3 도메인의 일부 또는 전부와 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2, 또는 인간 IgG4 분자로부터 유래된 CH2 도메인의 일부 또는 전부를 포함한다. 다른 실시형태에서, 키메라 CH 영역은 키메라 힌지 영역을 함유한다.
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일부 실시형태에서, 재조합 벡터는 조작된 (돌연변이) Fc 영역, 예를 들어, IgG 불변 영역의 조작된 Fc 영역을 포함하는 치료용 Fc 융합체를 인코딩한다. IgG 항체의 항체 불변 영역, Fc 영역 또는 Fc 단편에 대한 변형은 야생형 IgG 불변 영역 또는 인용된 변형(들)이 없는 IgG 중쇄 불변 영역을 갖는 상응하는 항체에 비해, Fe 수용체 결합 또는 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 및 이에 따른 반감기, CDC 활성, ADCC 활성 및/또는 ADPC 활성과 같은 하나 이상의 이펙터 기능을 변형시킨다. 따라서, 일부 실시형태에서, 항체는 하나 이상의 Fc 수용체(예를 들어, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA, FcγRIIIB, FcγRIV, 또는 FcRn 수용체)에 대한 (인용된 변형(들)이 없는 참조 또는 야생형 불변 영역과 비교하여) 변경된 결합을 나타내는 IgG 항체의 항체 불변 영역, Fc 영역 또는 Fc 단편을 제공하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 야생형 IgG 불변 영역, 또는 인용된 변형(들)이 없는 IgG 불변 영역을 갖는 상응하는 항체와 비교하여, CDC, ADCC, 또는 ADCP 활성과 같은 하나 이상의 변경된 이펙터 기능을 나타내는 IgG 항체의 항체 불변 영역, Fc 영역 또는 Fc 단편이다.
"이펙터 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용으로부터 발생하는 생화학적 사건을 지칭한다. 이펙터 기능은 ADCC 및 ADCP와 같은 FcγR-매개 이펙터 기능 및 CDC와 같은 보체-매개 이펙터 기능을 포함한다.
"이펙터 세포"는 하나 이상의 Fc 수용체를 발현하고 하나 이상의 이펙터 기능을 매개하는 면역 시스템의 세포를 지칭한다. 이펙터 세포는 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포, 혈소판, B 세포, 거대 과립 림프구, 랑게르한스 세포, 자연 살해(NK) 세포, 및 T 세포를 포함하지만 이로 제한되지 않으고, 인간, 마우스, 래트, 토끼, 및 원숭이를 포함하지만 이로 제한되지 않는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다.
"ADCC" 또는 "항체 의존적 세포-매개 세포독성"은 FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 이펙터(면역) 세포가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 후속하여 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응을 지칭한다.
"ADCP" 또는 "항체 의존적 세포-매개 식세포작용"은 FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 이펙터(면역) 세포가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 후속하여 표적 세포의 식균작용을 유발하는 세포-매개 반응을 지칭한다.
"CDC" 또는 "보체-의존적 세포독성"은 하나 이상의 보체 단백질 성분이 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 후속하여 표적 세포의 용해를 야기하는 반응을 지칭한다.
일부 실시형태에서, Fc 도메인의 변형은 IgG 불변 영역의 EU 넘버링(도 4 참조)과 관련하여 하기 변형 및 이들의 조합을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438 및 439.
특정 실시형태에서, Fc 영역은 IgG의 아미노산 잔기 251 내지 256, 285 내지 290, 308 내지 314, 385 내지 389 및 428 내지 436 중 하나 이상의 아미노산 부가, 결실, 또는 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 251 내지 256, 285 내지 290, 308 내지 314, 385-389 및 428 내지 436(Kabat의 EU 넘버링; 도 4 참조)은 히스티딘, 아르기닌, 라이신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 또는 글루타민으로 치환된다. 일부 실시형태에서, 비-히스티딘 잔기는 히스티딘 잔기로 치환된다. 일부 실시형태에서, 히스티딘 잔기는 비-히스티딘 잔기로 치환된다.
조작된 Fc를 갖는 항체에 의한 FcRn 결합의 향상은 야생형 Fc를 갖는 항체와 비교하여 FcRn에 대한 친화성-증진된 항체의 우선적인 결합을 유도하고, 따라서 FcRn-친화성-향상된 항체의 순 증진된 재순환을 유도하고, 이는 항체 반감기를 추가로 증가시킨다. 향상된 재순환 접근법은, 예를 들어, C5, 사이토카인, 또는 박테리아 또는 바이러스 항원과 같은 "고역가" 순환 항원을 포함하는 항원의 매우 효과적인 표적화 및 제거를 가능하게 한다.
특정 실시형태에서 야생형 Fc 영역(조작된 변형 없음)과 비교하여 혈청에서 FcRn에 대한 결합이 증진된 IgG 항체의 변형된 불변 영역, Fc 영역 또는 Fc 단편이 제공된다. 일부 예에서, 항체, 예를 들어, IgG 항체는 중성 pH, 예를 들어, pH 7.4 이상에서 FcRn에 결합하도록 조작되어 야생형 Fc 영역(조작된 변형이 없음)과 비교하여 FcRn에 대한 결합의 pH-의존성을 향상시킨다. 일부 예에서, 항체, 예를 들어, IgG 항체는 야생형 IgG 및/또는 산성 pH에서 FcRn에 대한 참조 항체 결합에 비해서뿐만 아니라 혈청에서 FcRn에 대한 결합(예를 들어, 중성 pH에서, 예를 들어, pH 7.4 이상)과 비교하여 엔도솜에서(예를 들어, 산성 pH에서, 예를 들어, pH 6.0 또는 그 미만에서) FcRn에 대한 향상된 결합(예를 들어, 증가된 친화성 또는 KD)을 나타내도록 조작된다. 야생형 IgG 불변 영역, 또는 인용된 변형(들)이 없는 IgG 불변 영역을 갖는 상응하는 항체와 비교하여, 개선된 혈청 또는 거주 조직 반감기를 나타내는 IgG 항체의 조작된 항체 불변 영역, Fc 영역 또는 Fc 단편을 갖는 항체가 제공된다.
이러한 Fc 변형의 비제한적인 예는, 예를 들어, 위치 250에서의 변형(예를 들어, E 또는 Q); 250 및 428(예를 들어, L 또는 F); 252(예를 들어, LN/Y/W 또는 T), 254(예를 들어, S 또는 T), 및 256(예를 들어, S/R/Q/E/D 또는 T); 또는 위치 428 및/또는 433(예를 들어, H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434(예를 들어, H/F 또는 Y)에서의 변형; 또는 위치 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 위치 307 또는 308(예를 들어, 308F, V308F), 및 434에서의 변형을 포함한다. 일 실시형태에서, 변형은 428L(예를 들어, M428L) 및 434S(예를 들어, N434S) 변형; 428L, 2591(예를 들어, V2591), 및 308F(예를 들어, V308F) 변형; 433K(예를 들어, H433K) 및 434(예를 들어, 434Y) 변형; 252, 254, 및 256(예를 들어, 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형(예를 들어, T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형(예를 들어, 308F 또는 308P)을 포함한다(EU 넘버링; 도 4 참조).
일부 실시형태에서, Fc 영역은 돌연변이 형태, 예컨대, M252 돌연변이를 포함하는 hIgG1 Fc일 수 있고, 예를 들어, M252Y 및 S254T 및 T256E("YTE 돌연변이")는 인간 FcRn에 대해 향상된 친화성(Dall'Acqua, et al., 2002, J Immunol 169:5171-5180) 및 2개의 염 브릿지를 생성하는 hFcRn에 결합된 이러한 돌연변이 항체의 후속 결정 구조(Oganesyan, et al. 2014, JBC 289(11): 7812-7824)를 나타낸다. YTE 돌연변이를 갖는 항체는 원숭이 및 인간에게 투여되었고, 유의하게 개선된 약동학적 특성을 갖는다(Haraya, et al., 2019, Drug Metabolism and Pharmacokinetics, 34(1):25-41).
일부 실시형태에서, Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 잔기에 대한 변형은 전신 순환(혈청)에서 반감기를 감소시킬 수 있지만, FcRn 결합을 불능화함으로써 조직에서 개선된 유지를 야기시킬 수 있다(예를 들어, H435A, EU numbering of Kabat)(Ding et al., 2017, MAbs 9:269-284; 및 Kim, 1999, Eur J Immunol 29:2819).
일부 실시형태에서, Fc 도메인은 Fc 폴리펩타이드(예를 들어, 항체)의 요망되는 약동학적 특성에 영향을 주지 않으면서, 정상 Fc 이펙터 기능의 전부, 일부를 활성화시키거나, 활성화시키지 않도록 조작될 수 있다. 변경된 이펙터 기능을 갖는 Fc 폴리펩타이드는 치료 단백질에 의한 이펙터 세포의 활성화와 같은 원치 않는 부작용을 감소시킬 수 있기 때문에 바람직할 수 있다.
이펙터 기능을 변경하거나 심지어 제거하는 방법은 항체의 힌지 영역 아미노산 잔기에 대한 돌연변이(들) 또는 변형(들)을 포함할 수 있다. 예를 들어, EU 넘버링 시스템에 따르면, 234A, 237A, 및 238S 치환을 포함하는 IgG Fc 도메인 돌연변이체는 감소된 보체 의존성 용해 및/또는 세포 매개 파괴를 나타낸다. 하부 힌지에서의 결실 및/또는 치환, 예를 들어, 힌지 도메인 내의 위치 233-236(EU 넘버링)이 결실되거나 글리신으로 변형되는 것은 ADCC 및 CDC 활성을 유의하게 감소시키는 것으로 당업계에 입증되었다.
특정 실시형태에서, Fc 도메인은 Fc 도메인이 글리코실화되지 않도록 297에서 글리코실화 부위를 변경하기 위해 잔기 297 또는 299에서 치환을 갖는 비글리코실화된 Fc 도메인이다. 이러한 글리코실화된 Fc 도메인은 감소된 ADCC 또는 다른 이펙터 활성을 가질 수 있다.
변경된 이펙터 기능을 갖는 돌연변이체 및/또는 키메라 CH 영역을 포함하는 단백질, 및 돌연변이체 항체를 조작하고 시험하는 방법의 비제한적인 예는 당업계, 예를 들어, 문헌[K.L. Amour, et al., Eur. J. Immunol. 1999, 29:2613-2624; Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103:4005]; 2007년 6월 14일에 공개된 미국 특허 출원 공개 20070135620A1호; 2008년 6월 26일에 공개된 미국 특허 출원 공개 20080154025 A1호; 2010년 9월 16일에 공개된 미국 특허 출원 공개 20100234572 A1호; 2012년 9월 6일에 공개된 미국 특허 출원 공개 20120225058 A1호; 2015년 11월 26일에 공개된 미국 특허 출원 공개 20150337053 A1호; 2016년 10월 6일에 공개된 국제 공개 WO20/16161010A2호; 2016년 6월 7일자로 허여된 US 9,359,437호; 및 2018년 8월 21일자로 허여된 미국 특허 10,053,517호에 기술되어 있으며, 이들 모두는 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
모든 인간 IgG 서브클래스의 중쇄 유전자에 보존된 C-말단 라이신(-K)은 일반적으로 혈청에서 순환하는 항체에 존재하지 않으며, 즉, C-말단 라이신은 순환 중에 절단되어, 순환하는 IgG의 이종 집단을 생성시킨다(van den Bremer et al., 2015, mAbs 7:672-680). 전장 mAb에 대한 벡터화된 작제물에서, Fc 말단의 C-말단 라이신(-K) 또는 글리신-리신(-GK)을 인코딩하는 DNA는 인시튜로 보다 균질한 항체 생성물을 생산하기 위해 결실될 수 있다(문헌[Hu et al., 2017 Biotechnol. Prog. 33: 786-794] 참조).
5.2.9 벡터의 제조 및 시험
본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 숙주 세포를 사용하여 제조될 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 포유동물 숙주 세포, 예를 들어, A549, WEHI, 10T1/2, BHK, MDCK, COS1, COS7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, VERO, W138, HeLa, 293, Saos, C2C12, L, HT1080, HepG2, 일차 섬유모세포, 간세포, 및 근육모세포를 사용하여 제조될 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 바이러스 벡터는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 또는 햄스터로부터의 숙주 세포를 사용하여 제조될 수 있다.
숙주 세포는 전이유전자 및 관련 요소(예를 들어, 벡터 게놈)를 인코딩하는 서열, 및 숙주 세포에서 바이러스를 생산하는 수단, 예를 들어, 복제 및 캡시드 유전자(예를 들어, rep 및 cap 유전자 AAV)로 안정하게 변형된다. AAV8 캡시드를 갖는 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법에 대해서는, 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 미국 특허 번호 7,282,199 B2의 상세한 설명의 섹션 IV를 참조한다. 상기 벡터의 게놈 복사 역가는, 예를 들어, TAQMAN® 분석에 의해 결정될 수 있다. 비리온은, 예를 들어, CsCl2 침강에 의해 회수될 수 있다.
대안적으로, 곤충 세포에서 배큘로바이러스 발현 시스템은 AAV 벡터를 생산하는 데 사용될 수 있다. 검토를 위해 문헌[Aponte-Ubillus et al., 2018, Appl. Microbiol. Biotechnol. 102:1045-1054]을 참조하며, 이는 제조 기술에 대해 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
시험관내 검정, 예를 들어, 세포 배양 검정은 본 명세서에 기재된 벡터로부터 전이유전자 발현을 측정하기 위해 사용될 수 있고, 따라서, 예를 들어, 벡터의 역가를 나타낸다. 예를 들어, 인간 배아 망막 세포로부터 유래된 세포주인 PER.C6® 세포주(Lonza), 또는 망막 색소 상피 세포, 예를 들어, 망막 색소 상피 세포주 hTERT RPE-1(ATCC®로부터 이용 가능)은 전이유전자 발현을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 일단 발현되면, 인간 글리코실화된 항-TNFα Fc 융합 단백질과 관련된 글리코실화 및 티로신 설페이트화 패턴의 결정을 포함하여, 발현된 생성물의 특성이 결정될 수 있다. 글리코실화 패턴 및 이를 결정하는 방법은 섹션 5.4에서 논의된다. 또한, 세포-발현된 인간 글리코실화된 항-TNFα Fc 융합 단백질의 글리코실화/황화로부터 초래되는 이점은 당업계에 공지된 검정, 예를 들어, 섹션 5.4에 기재된 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
벡터 게놈 농도(GC) 또는 벡터 게놈 복사체는 디지털 PCR(dPCR) 또는 ddPCR™(BioRad Technologies, 미국 캘리포니아주 헤라클레스 소재)을 사용하여 평가될 수 있다. 한 가지 예에서, 안구 조직 샘플, 예컨대, 방수 및/또는 유리체액 샘플은 여러 시점에서 수득된다. 또 다른 예에서, 주사 후 다양한 시점에 여러 마우스가 희생된다. 안구 조직 샘플은 벡터 복사체 수에 대해 총 DNA 추출 및 dPCR 검정을 거친다. 조직의 그램 당 벡터 게놈(전이유전자)의 복사체는 단일 생검 샘플에서 측정될 수 있거나, 순차적인 시점에 다양한 조직 섹션에서 측정될 수 있으며, 이는 눈 전체에 걸쳐 AAV의 확산을 나타낼 것이다. 수집된 안액 또는 조직으로부터 총 DNA를 DNeasy 혈액 & 조직 키트로 추출하고, DNA 농도를 Nanodrop 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 각 조직 샘플에서 벡터 복사체 수를 결정하기 위해, 디지털 PCR을 Naica Crystal Digital PCR 시스템(Stilla Technologies)으로 수행하였다. 전이유전자 AAV 및 내인성 대조군 유전자를 동시에 측정하기 위해 2색 다중화 시스템이 적용된다. 요약하면, 전이유전자 프로브는 FAM(6-카르복시플루오레세인) 염료로 표지될 수 있는 반면, 내인성 대조군 프로브는 VIC 형광 염료로 표지될 수 있다. 이배체 세포 당 특정 조직 섹션에서 전달된 벡터의 복사체 수는 (벡터 복사체 수)/(내인성 대조군)×2로 계산된다. 특정 세포 타입 또는 조직, 예를 들어, 각막, 홍채, 섬모체, 슐렘관 세포, 섬유주(trabecular meshwork), 망막 세포, RPE 세포, RPE-맥락막 조직, 또는 시신경 세포에서의 벡터 복사체는 시간 경과에 따라 조직에 의해 전이유전자의 지속적인 발현을 나타낼 수 있다.
5.2.9 조성물
인간 대상체에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물은 생리학적으로 혼화 가능한 수성 완충제, 계면활성제 및 선택적인 부형제를 포함하는 제형 완충제 중에 재조합 벡터의 현탁액을 포함한다. 이러한 제형 완충제는 다당류, 계면활성제, 폴리머, 또는 오일 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 대상체에 투여하기 위해 약제학적으로 허용되는 담체와 조합된 rAAV를 포함한다. 일 실시형태에서, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 동물, 및 보다 특히 인간에서의 사용에 대해 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 제제가 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트(예를 들어, 프로인트 완전 및 불완전 애쥬번트), 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 멸균 액체, 예를 들어, 물 및 석유, 동물, 식물성, 또는 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 광물유, 참기름 등을 포함하는 합성 기원의 것들을 포함하는 오일 및 오일일 수 있다. 약제학적 조성물이 정맥내 투여될 때 물은 일반적인 담체이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 특히 주사용 용액에 대해 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 소듐 클로라이드, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 및 안정화제의 추가 예는 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산을 포함하는 산화방지제; 저분자량 폴리펩타이드; 혈청 알부민 및 젤라틴과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 및/또는 당업계에 공지된 바와 같은 TWEENTM, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 PLURONICS™와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 및 보존제를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 서방형 제형 등의 형태를 취할 수 있다.
5.3 비-감염성 포도막염을 치료하는 방법
또 다른 양태에서, 항-TNFα Fc 융합 단백질 및 이의 변이체를 인코딩하는 발현 카세트를 포함하는 재조합 AAV 입자의 투여를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 항-TNFα Fc 융합 단백질로 치료될 수 있는 비-감염성 포도막염 또는 다른 적응증을 치료하는 방법이 제공된다. 이를 필요로 하는 대상체는 비-감염성 포도막염을 앓고 있는 대상체, 또는 이에 걸리기 쉬운 대상체, 예를 들어, 항-TNFα Fc 융합 단백질로 치료될 수 있는 비-감염성 포도막염 또는 다른 적응증의 발병 또는 이의 재발의 위험이 있는 대상체이다. 이러한 유전자 요법이 투여되는 대상체는 항-TNFα, 예를 들어, 에타너셉트, 아달리무맙, 인플릭시맙 또는 골리무맙에 반응성인 대상체일 수 있다. 특정 실시형태에서, 방법은 비-감염성 포도막염으로 진단된 환자를 치료하는 것을 포함하고, 특정 실시형태에서, 항-TNFα Fc 융합 단백질을 사용한 치료에 반응성인 것으로 확인되거나 항-TNFα Fc 융합 단백질을 사용한 요법에 대한 우수한 후보로 간주된다. 특정 실시형태에서, 환자는 이전에 항-TNFα Fc 융합 단백질로 치료되었다. 반응성을 결정하기 위해, 항-TNFα Fc 융합 단백질(예를 들어, 인간 세포 배양물, 생물반응기 등에서 생산됨)이 대상체에게 직접 투여될 수 있다.
특정 실시형태에서, 이를 필요로 하는 인간 대상체에서 항-TNFα Fc 융합 단백질로 치료할 수 있는 비-감염성 포도막염 또는 다른 적응증을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체의 눈(또는 간 및/또는 근육)에 치료적 유효량의, 인간 안구 조직 세포에서 전이유전자의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 Fc 영역의 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 재조합 뉴클레오타이드 발현 벡트럴 투여하여, mAb의 HuPTM 형태 또는 이의 항원-결합 단편을 방출하는 데포가 형성되는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 망막하, 유리체내, 전방내, 또는 맥락막상 투여는 하기 망막 세포 타입 중 하나 이상에서 가용성 전이유전자 생성물의 발현을 초래해야 한다: 인간 광수용기 세포(원추 세포, 간상 세포); 수평 세포; 양극성 세포; 아마크린 세포; 망막 신경절 세포(작은 세포, 파라솔 세포, 이중층화 세포, 거대 망막 신경절 세포, 감광성 신경절 세포, 및 뮬러 아교세포); 및 망막 색소 상피 세포 또는 다른 안구 조직 세포: 각막 세포, 홍채 세포, 모양체 세포, 쉴렘관 세포(schlemm's canal cell), 섬유주대 세포, RPE-맥락막 조직 세포 또는 시신경 세포.
이를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 재조합 벡터 및 약제학적 조성물은 섹션 5.2에 기술되어 있다. 이러한 벡터는 인간 안구 조직, 또는 간 및/또는 근육 세포에 대한 친화성을 가져야 하고, 비-복제 rAAV, 특히 AAV2.7m8, AAV3B, AAV8, AAAV9, AAV10, AAVrh10, 또는 AAVrh73 캡시드를 갖는 것들을 포함할 수 있다. 재조합 벡터는, 예를 들어, 재조합 벡터를 눈에 도입함으로써 재조합 벡터가 안구 조직 세포에 들어가도록 하는 임의의 방식으로 투여될 수 있다. 이러한 벡터는 인간 안구 조직 세포 및/또는 인간 간 및 근육 세포에서 전이유전자의 발현을 제어하는 하나 이상의 조절 서열을 추가로 포함해야 하며, 이는 비제한적으로 인간 로돕신 키나제(GRK1) 프로모터(서열번호 54 또는 117), 마우스 콘 저지(CAR) 프로모터(서열번호 114 내지 116), 인간 레드 옵신(RedO) 프로모터(서열번호 112) 또는 Best1/GRK 프로모터(서열번호 161)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다(또한 표 1 및 1a 참조).
5.4 N-글리코실화, 티로신 설페이트화, 및 O-글리코실화
본 명세서에 개시된 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질의 아미노산 서열(1차 서열)은 각각 Fc 융합 단백질의 아미노산 서열 내의 글리코실화 위치에 대해 N-글리코실화 또는 O-글리코실화가 일어나는 적어도 하나의 부위를 포함한다(도 2A 및 2b 참조). 번역-후 변형은 또한 전장 항체의 Fc 도메인, 특히 잔기 N297에서 발생한다(EU 넘버링에 의해, 도 4 참조).
대안적으로, 돌연변이는 잔기 N297에서 글리코실화 부위를 변경하기 위해 Fc 도메인에 도입될 수 있고(EU 넘버링, 도 4 참조), 특히 297에서 아스파라긴 또는 299에서 트레오닌을 또 다른 아미노산으로 치환하여 비글리코실화된 Fc 도메인을 생성하는 글리코실화 부위를 제거할 수 있다.
5.4.1 N-글리코실화
역 글리코실화 부위
표준 N-글리코실화 서열은 당업계에 Asn-X-Ser(또는 Thr)인 것으로 알려져 있으며, 여기서 X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다. 그러나, 최근에 인간 항체의 아스파라긴(Asn) 잔기가 역 컨센서스 모티프, Ser(또는 Thr)-X-Asn의 맥락에서 글리코실화될 수 있음이 입증되었으며, 여기서 X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있다(문헌[Valliere-Douglass et al., 2009, J. Biol. Chem. 284:32493-32506; and Valliere-Douglass et al., 2010, J. Biol. Chem. 285:16012-16022] 참조). 본 명세서에 개시된 바와 같이, 본 명세서에 개시된 특정 항-TNFα Fc 융합 단백질은 표준 및/또는 역 컨센서스 서열을 포함한다.
비-컨센서스 글리코실화 부위
역 N-글리코실화 부위 이외에, 인간 항체의 글루타민(Gln) 잔기는 비-컨센서스 모티프, Gln-Gly-Thr의 맥락에서 글리코실화될 수 있음이 최근에 입증되었다(문헌[Valliere-Douglass et al., 2010, J. Biol. Chem. 285:16012-16022] 참조). 놀랍게도, 본 명세서에 개시된 특정의 HuGlyFab 단편은 이러한 비-컨센서스 서열을 포함한다. 또한, O-글리코실화는 효소에 의해 세린 또는 트레오닌 잔기에 N-아세틸-갈락토사민의 첨가를 포함한다. 항체의 힌지 영역에 존재하는 아미노산 잔기는 O-글리코실화될 수 있는 것으로 입증되었다. O-글리코실화의 가능성은, 또한 이. 콜라이(E. coli)가 자연적으로 인간 O-글리코실화에서 사용되는 것과 동등한 기구를 함유하지 않기 때문에, 예를 들어, 이. 콜라이에서 생산된 항원-결합 단편과 비교하여, 본 명세서에서 제공되는 치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질에 다른 장점을 부여한다. (대신, 이. 콜라이에서 O-글리코실화는 박테리아가 특정 O-글리코실화 기구를 함유하도록 변형된 경우에만 입증되었다(예를 들어, 문헌[Farid-Moayer et al., 2007, J. Bacteriol. 189:8088-8098] 참조)).
조작된 N-글리코실화 부위
특정 실시형태에서, 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 핵산은 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질과 일반적으로 연관되는 것보다(예를 들어, 비변형된 상태의 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질과 연관된 N-글리코실화 부위의 수에 비해) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 N-글리코실화 부위(표준 N-글리코실화 컨센서스 서열, 역 N-글리코실화 부위, 및 비-컨센서스 N-글리코실화 부위)를 포함하도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 글리코실화 부위의 도입은 상기 도입이 이의 항원에 항원 또는 항원-결합 단편의 결합에 영향을 미치지 않는 한, 항원-결합 단편의 일차 구조의 임의의 위치에 N-글리코실화 부위(표준 N-글리코실화 컨센서스 서열, 역 N-글리코실화 부위, 및 비-컨센서스 N-글리코실화 부위 포함)의 삽입에 의해 달성된다. 글리코실화 부위의 도입은, 예를 들어, N-글리코실화 부위(예를 들어, 아미노산은 첨가되지 않지만, 항-TNFα Fc 융합 단백질의 선택된 아미노산은 N-글리코실화 부위를 형성하기 위해 돌연변이됨)를 생성하기 위해, 새로운 아미노산을 가용성 세포외 TNFR-도메인 또는 Fc 도메인에 첨가하거나(예를 들어, 글리코실화 부위는 완전히 또는 부분적으로 첨가됨), 가용성 세포외 TNFR 도메인 또는 Fc 도메인에서 기존 아미노산을 돌연변이시킴으로써, 달성될 수 있다. 당업자는 단백질의 아미노산 서열이 당업계에 공지된 접근법, 예를 들어, 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 변형을 포함하는 재조합 접근법을 사용하여 용이하게 변형될 수 있음을 인지할 것이다.
특정 실시형태에서, 항-TNFα Fc 융합 단백질은 포유동물 세포, 예컨대, 망막, CNS, 간 또는 근육 세포에서 발현되는 경우, 과글리코실화될 수 있도록 변형된다.
HuPTM 항 TNFαFc 융합 단백질의 N-글리코실화
소분자 약물과 달리, 생물학적 제제는 일반적으로 상이한 역가, 약동학, 및/또는 안전성 프로파일을 가질 수 있는 상이한 변형 또는 형태를 갖는 많은 변이체의 혼합물을 포함한다. 유전자 요법 또는 단백질 요법 접근법에서 생산된 모든 분자가 완전히 글리코실화되고 설페이트화되는 것이 필수적이지는 않다. 오히려, 생산된 당단백질의 집단은 효능을 입증하기 위해 충분한 글리코실화(2,6-시알화 포함) 및 황산화를 가져야 한다. 본 명세서에서 제공되는 유전자 요법 치료의 목표는, 예를 들어, 질병 또는 비정상 상태의 진행을 늦추거나 저지하거나, 질병 또는 비정상 상태와 관련된 하나 이상의 증상의 중증도를 감소시키는 것일 수 있다.
HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질이 인간 세포에서 발현되는 경우, Fc 융합 단백질의 N-글리코실화 부위는 다양한 상이한 글리칸으로 글리코실화될 수 있다. Fc 도메인의 글리코실화는 특성화되었고 아스파라긴 297에서 단일 N-연결 글리칸이다(EU 넘버링; 도 4 참조). 글리칸은 Fc 수용체에 대한 결합과 같은 항체 이펙터 기능에 영향을 미치는 필수적인 구조적 및 기능적 역할을 한다(예를 들어, 항체 기능에서 Fc 글리코실화의 역할의 논의에 대해 문헌[Jennewein and Alter, 2017, Trends In Immunology 38:358] 참조). Fc 영역 글리칸의 제거는 이펙터 기능을 거의 완전히 제거한다(Jennewien and Alter at 362). Fc 글리칸의 조성물은 이펙터 기능에 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 예를 들어, 과갈락토실화 및 푸코실화의 감소는 ADCC 활성을 증가시키는 것으로 나타난 반면, 시알화는 항-염증 효과와 상관관계가 있다(동일한 문헌, 364에서). 질환 상태, 유전학 및 심지어 식이는 생체내에서 Fc 글리칸의 조성에 영향을 미칠 수 있다. 재조합적으로 발현된 항체 및 Fc 융합 단백질의 경우, 글리칸 조성은 재조합 발현에 사용되는 숙주 세포의 타입에 따라 유의하게 상이할 수 있고, 이펙터 기능을 변경하기 위해 CHO와 같은 세포 배양물에서 재조합적으로 발현된 치료용 항체에서 글리칸의 조성을 제어 및 변형시키기 위한 전략이 이용 가능하다(예를 들어, Hansen et al.의 US 2014/0193404 참조). 따라서, 본 명세서에서 제공되는 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질은 유리하게는 비-인간 숙주 세포에서 발현된 항체보다 천연의 인간 글리칸 조성물과 더 유사한 N297에서 글리칸을 가질 수 있다.
중요하게는, HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질이 인간 세포에서 발현되는 경우, 원핵 숙주 세포(예를 들어, 이. 콜라이) 또는 진핵 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포 또는 NS0 세포)에서의 시험관내 생산을 위한 필요성이 회피된다. 대신, 본 명세서에 기재된 방법의 결과로서, HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질의 N-글리코실화 부위는 유리하게는 인간의 치료와 관련되고 이에 유익한 글리칸으로 데코레이션된다. 이러한 이점은 CHO 세포, NS0 세포, 또는 이. 콜라이는 항체/항원-결합 단편 생산에 이용되는데, 이는 예를 들어, CHO 세포가 (1) 2,6 시알릴트랜스퍼라제를 발현하지 않아 N-글리코실화 동안 2,6 시알산을 첨가할 수 없고; (2) Neu5Ac 대신 시알산으로서 Neu5Gc를 첨가할 수 있고; (3) 또한 대부분의 개체에 존재하는 항-α-Gal 항체와 반응하는, α-Gal 항원인 면역원성 글리칸을 생산할 수 있고, 이는 고농도에서 아나필락시스를 유발할 수 있기 때문이며; (4) 이. 콜라이는 N-글리코실화에 필요한 성분을 자연적으로 함유하지 않기 때문이다.
항-TNFα Fc 융합 단백질의 글리코실화 패턴을 결정하기 위한 검정은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 하이드라진분해는 글리칸을 분석하는 데 사용될 수 있다. 먼저, 다당류는 하이드라진과의 인큐베이션에 의해 이들의 관련 단백질로부터 방출된다(Ludger Liberate Hydrazinolysis Glycan Release Kit(영국 옥스퍼드셔 소재)가 사용될 수 있음). 친핵체 하이드라진은 다당류와 담체 단백질 사이의 글리코시드 결합을 공격하고 부착된 글리칸의 방출을 허용한다. N-아세틸 기는 이러한 처리 동안 손실되고 재-N-아세틸화에 의해 재구성되어야 한다. 글리칸은 또한 하이드라진보다 부반응이 적고 깨끗하게 절단하는 PNGase F 및 Endo H와 같은 글리코시다제 또는 엔도글리코시다제와 같은 효소를 사용하여 방출될 수 있다. 유리 글리칸은 탄소 컬럼에서 정제된 후, 환원 말단에서 형광단 2-아미노 벤즈아미드로 표지될 수 있다. 표지된 다당류는 문헌[Royle et al, Anal Biochem 2002, 304(1):70-90]의 HPLC 프로토콜에 따라 GlycoSep-N 컬럼(GL Sciences)에서 분리될 수 있다. 생성된 형광 크로마토그램은 다당류 길이 및 반복 단위의 수를 나타낸다. 구조적 정보는 개별 피크를 수집하고 후속하여 MS/MS 분석을 수행함으로써 수집될 수 있다. 이에 의해, 단당류 조성 및 반복 단위의 서열이 확인될 수 있고, 추가로 다당류 조성물의 균질성이 확인될 수 있다. 저분자량 또는 고분자량의 특정 피크는 MALDI-MS/MS에 의해 분석될 수 있고, 결과는 글리칸 서열을 확인하는 데 사용될 수 있다. 크로마토그램에서 각각의 피크는 특정 수의 반복 단위 및 이의 단편, 예를 들어, 당 잔기로 구성된 폴리머, 예를 들어, 글리칸에 상응한다. 따라서, 크로마토그램은 폴리머, 예를 들어, 글리칸의 길이 분포를 측정할 수 있게 한다. 용리 시간은 폴리머 길이에 대한 표시인 반면, 형광 강도는 각각의 폴리머, 예를 들어, 글리칸에 대한 몰 존재비와 상관관계가 있다. 항-TNFα Fc 융합 단백질과 관련된 글리칸을 평가하기 위한 다른 방법은 문헌[Montacir et al., 2018, The Protein Journal, 37(2), 164-179]에 기술된 것들을 포함한다.
항-TNFα Fc 융합 단백질과 관련된 글리칸 패턴의 균질성 또는 불균질성은 글리코실화 부위에 걸쳐 존재하는 글리칸 길이 또는 크기 및 수 둘 다와 관련이 있으므로, 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 글리칸, 길이 또는 크기 및 유체역학적 반경을 측정하는 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 크기 배제, 순상, 역상, 및 음이온 교환 HPLC와 같은 HPLC, 뿐만 아니라 모세관 전기영동은 유체역학적 반경의 측정을 가능하게 한다. 단백질에서 더 많은 수의 글리코실화 부위는 더 적은 글리코실화 부위를 갖는 담체와 비교하여 유체역학적 반경에서 더 높은 변동을 초래한다. 그러나, 단일 글리칸 사슬이 분석될 때, 이들은 더 제어된 길이로 인해 더 균질할 수 있다. 글리칸 길이는 하이드라진분해, SDS PAGE, 및 모세관 겔 전기영동에 의해 측정될 수 있다. 또한, 균질성은 또한 특정 글리코실화 부위 사용 패턴이 더 넓은/더 좁은 범위로 변하는 것을 의미할 수 있다. 이러한 인자는 글리코펩타이드 LC-MS/MS에 의해 측정될 수 있다.
특정 실시형태에서, HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질은 또한 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal을 함유하지 않는다. "검출 가능한 NeuGc" 또는 "검출 가능한 α-Gal" 또는 "NeuGc 또는 α-Gal을 함유하지 않거나 갖지 않는"은 본 명세서에서 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질이 당업계에 공지된 표준 검정 방법에 의해 검출 가능한 NeuGc 또는 α-Gal 모이어티를 함유하지 않음을 의미한다. 예를 들어, NeuGc는 문헌[Hara et al., 1989, "Highly Sensitive Determination of N-Acetyl-and N-Glycolylneuraminic Acids in Human Serum and Urine and Rat Serum by Reversed-Phase Liquid Chromatography with Fluorescence Detection" J. Chromatogr., B: Biomed. 377, 111-119]에 따라 HPLC에 의해 검출될 수 있으며, 이는 NeuGc를 검출하는 방법에 대해 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 대안적으로, NeuGc는 질량 분광법에 의해 검출될 수 있다. α-Gal은 ELISA를 사용하여(예를 들어, 문헌[Galili et al., 1998, "A sensitive assay for Measuring α-Gal epitope expression on cells by a monoclonal anti-Gal antibody)." Transplantation. 65(8):1129-32] 참조), 또는 질량 분광법에 의해(예를 들어, 문헌[Ayoub et al., 2013, "Correct primary structure assessment and extensive glyco-profiling of cetuximab by a combination of intact, middle-up, middle-down and bottom-up ESI and MALDI mass spectrometry techniques" Landes Bioscience. 5(5):699-710] 참조)에 의해 검출될 수 있다(또한 문헌[Platts-Mills et al., 2015, "Anaphylaxis to the Carbohydrate Side-Chain Alpha-gal" Immunol Allergy Clin North Am. 35(2): 247-260]에 인용된 참고문헌 참조).
N-글리코실화의 이점
N-글리코실화는 본 명세서에 기술된 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질에 수많은 이점을 부여한다. 이러한 이점은 이. 콜라이에서 항-TNFα Fc 융합 단백질의 생산에 의해 달성될 수 없는데, 그 이유는 이. 콜라이가 N-글리코실화에 필요한 성분을 자연적으로 보유하지 않기 때문이다. 또한, 일부 이점은, 예를 들어, CHO 세포(또는 뮤린 세포, 예컨대, NS0 세포)에서 항체 생산을 통해 달성할 수 없는데, 그 이유는 CHO 세포가 특정 글리칸(예를 들어, 2,6 시알산 및 이등분 GlcNAc)의 첨가에 필요한 성분이 부족하기 때문이고, CHO 또는 뮤린 세포주가 우세한 인간 시알산인 N-아세틸뉴라민산("Neu5Ac") 대신에 인간에게 자연적이지 않은(및 잠재적으로 면역원성인) N-N-글리콜릴뉴라민산("Neu5Gc" 또는 "NeuGc")을 첨가하기 때문이다(예를 들어, 문헌[Dumont et al., 2015, Crit. Rev. Biotechnol. 36(6):1110-1122; Huang et al., 2006, Anal. Biochem. 349:197-207 (NeuGc is the predominant sialic acid in murine cell lines such as SP2/0 and NS0); 및 Song et al., 2014, Anal. Chem. 86:5661-5666] 참조, 이들 각각은 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용됨). 또한, CHO 세포는 또한 대부분의 개체에 존재하는 항-α-Gal 항체와 반응하는 α-Gal 항원인 면역원성 글리칸을 생산할 수 있으며, 이는 고농도에서 아나필락시스를 유발할 수 있다(예를 들어, 문헌[Bosques, 2010, Nat. Biotech. 28:1153-1156] 참조). 본 명세서에 기술된 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질의 인간 글리코실화 패턴은 전이유전자 생성물의 면역원성을 감소시키고 효능을 개선시켜야 한다.
비-표준 글리코실화 부위는 일반적으로 항-TNFα Fc 융합 단백질 집단의 낮은 수준의 글리코실화(예를 들어, 1 내지 5%)를 초래하지만, 기능적 이점은 유의할 수 있다(예를 들어, 문헌[van de Bovenkamp et al., 2016, J. Immunol. 196:1435-1441] 참조). 예를 들어, 글리코실화는 항체의 안정성, 반감기, 및 결합 특성에 영향을 미칠 수 있다. 이의 표적에 대한 융합 단백질의 친화성에 대한 항-TNFα Fc 융합 단백질 글리코실화의 효과를 결정하기 위해, 당업자에게 공지된 임의의 기술, 예를 들어, 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA) 또는 표면 플라즈몬 공명(SPR)이 사용될 수 있다. 항-TNFα Fc 융합 단백질의 반감기에 대한 글리코실화의 효과를 결정하기 위해, 당업자에게 공지된 임의의 기술은, 예를 들어, 방사성표지된 항체가 투여된 대상체의 혈액 또는 장기에서 방사능 수준의 측정에 의해 사용될 수 있다. 항-TNFα Fc 융합 단백질의 안정성, 예를 들어, 응집 또는 단백질 언폴딩의 수준에 대한 글리코실화의 효과를 결정하기 위해, 당업자에게 공지된 임의의 기술, 예를 들어, 시차 주사 열량측정법(DSC), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 예를 들어, 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC), 모세관 전기영동, 질량 분광분석, 또는 탁도 측정이 사용될 수 있다.
본 명세서에 기술된 방법에서 사용되는 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질 상의 시알산의 존재는 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질의 청소율에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질의 시알산 패턴은 최적화된 청소율을 갖는 치료제를 생성하는 데 사용될 수 있다. 항-TNFα Fc 융합 단백질 청소율을 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
또 다른 특정 실시형태에서, N-글리코실화에 의해 부여되는 이점은 감소된 응집이다. 점유된 N-글리코실화 부위는 응집 경향이 있는 아미노산 잔기를 차폐하여 응집을 감소시킬 수 있다. 이러한 N-글리코실화 부위는 본 명세서에서 사용되는 항-TNFα Fc 융합 단백질에 고유하거나 본 명세서에서 사용되는 항원-결합 단편으로 조작되어, 예를 들어, 발현되는 경우, 예를 들어, 인간 세포에서 발현되는 경우, 응집이 덜 일어나는 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질을 생성할 수 있다. 항체의 응집을 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Courtois et al., 2016, mAbs 8:99-112] 참조, 이는 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용됨).
또 다른 특정 실시형태에서, N-글리코실화에 의해 부여되는 이점은 감소된 면역원성이다. 이러한 N-글리코실화 부위는 본 명세서에서 사용되는 항원-결합 단편에 고유하거나 본 명세서에서 사용되는 항원-결합 단편으로 조작되어, 발현되는 경우, 예를 들어, 인간 안구 조직 세포에서 발현되는 경우, 면역원성이 덜한 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질을 생성한다.
또 다른 특정 실시형태에서, N-글리코실화에 의해 부여되는 이점은 단백질 안정성이다. 단백질의 N-글리코실화는 이들에 안정성을 부여하는 것으로 잘 알려져 있고, N-글리코실화로부터 생성된 단백질 안정성을 평가하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Sola and Griebenow, 2009, J Pharm Sci., 98(4): 1223-1245] 참조).
또 다른 특정 실시형태에서, N-글리코실화에 의해 부여되는 이점은 변경된 결합 친화성이다. 결합 친화성을 측정하기 위한 검정은 당업계에 공지되어 있다.
5.4.2 O-글리코실화
O-글리코실화는 효소에 의해 세린 또는 트레오닌 잔기에 N-아세틸-갈락토사민의 첨가를 포함한다. 항-TNFα Fc 융합 단백질의 힌지 영역에 존재하는 아미노산 잔기는 O-글리코실화될 수 있는 것으로 입증되었다. 특정 실시형태에서, 항-TNFα Fc 융합 단백질은 이들의 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함하고, 따라서 인간 세포에서 발현될 때 O-글리코실화될 수 있다. O-글리코실화의 가능성은, 예를 들어, 이. 콜라이에서 생산된 항-TNFα Fc 융합 단백질과 비교하여, 본 명세서에서 제공되는 항-TNFα Fc 융합 단백질에 대한 다른 이점을 부여하는데, 그 이유는 이. 콜라이가 인간 O-글리코실화에서 사용되는 것과 동등한 기구를 함유하지 않기 때문이다(대신, 이. 콜라이에서 O-글리코실화는 박테리아가 특정 O-글리코실화 기구를 함유하도록 변형된 경우에만 입증됨. 예를 들어, 문헌[Farid-Moayer et al., 2007, J. Bacteriol. 189:8088-8098] 참조). O-글리코실화된 항-TNFα Fc 융합 단백질은 글리칸을 보유함으로써, N-글리코실화된 항-TNFα Fc 융합 단백질과 유리한 특징을 공유한다(상기 논의된 바와 같음).
5.5 비-감염성 포도막염에 대한 벡터화된 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질 작제물 및 제형
종양 괴사 인자-알파(TNFα), 예컨대, 에타너셉트 또는 EYS606)에 결합하고, 비-감염성 포도막염 치료용으로 명시된, HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질, 예컨대, TNFR1:Fc 융합 단백질 또는 TNFR2:Fc 융합 단백질의 전달을 위한 조성물 및 방법이 기술된다(도 2A 및 도 2B). 특정 실시형태에서, HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질은 에타너셉트 또는 EYS606, 또는 이의 바이오시밀러 또는 바이오베터의 아미노산 서열을 갖는다. 인간 TNFα 수용체 타입 I(TNFR1) 또는 타입 II(TNFR2)의 가용성, 세포외 부분의 아미노산 서열 및 융합 단백질의 Fc 도메인은 도 2A 및 2b 및 표 6에 제공된다. 전달은 안구 조직에 HuPTM, 예를 들어, 인간-글리코실화된, 전이유전자 생성물을 연속적으로 공급하는 영구 데포를 생성하기 위해, 유전자 요법을 통해, 예를 들어, 치료용 항-TNFα Fc 융합 단백질(및/또는 이의 과글리코실화된 유도체 또는 다른 유도체)을 인코딩하는 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 작제물을 비-감염성 포도막염의 하나 이상의 증상으로 진단된 환자(인간 대상체)에 투여함으로써 달성될 수 있다.
전이유전자
환자에 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질을 전달하기 위해 투여될 수 있는, TNFα에 결합하는 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 함유하는 재조합 벡터가 제공된다. 전이유전자는 인간 TNFα 수용체 타입 I(TNFR1) 또는 타입 II(TNFR2)의 가용성, 세포외 부분 및 에타너셉트 또는 EYS606과 같은 Fc 도메인, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 이의 변이체를 포함하는 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이다. 전이유전자는 또한 추가의 글리코실화 부위를 함유하는 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩할 수 있다(예를 들어, Courtois et al. 참조).
특정 실시형태에서, 항-TNFα 전이유전자는 (서열번호 10 또는 11의 아미노산 서열을 갖는, 표 6 및 도 2A 참조) TNFR2:Fc 융합 단백질 에타너셉트를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 뉴클레오타이드 서열은 인간 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈일 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, (표 7에 제시된 바와 같은 에타너셉트 전이유전자 서열을 인코딩하는) 서열번호 13 내지 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. TNFR2:Fc 융합 서열은 인간 세포, 특히, 하나 이상의 세포 안구 조직 세포에서 발현 및 분비에 적절한 N-말단에 신호 또는 리더 서열을 갖는다. 신호 서열은 MYRMQLLLLIALSLALVTNS(서열번호 62)의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, 신호 서열은 하나 이상의 안구 조직 세포에 의해 분비되는 단백질에 상응하는 표 2에 제시된 신호 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, 신호 서열은 하기 표 3 및 4에 열거된 것들과 같은 근육 또는 간 세포에서의 발현에 적합할 수 있다.
TNFR 타입 2 도메인의 가용성, 세포외 단백질 및 CH2 및 CH3 도메인 서열을 포함하는 Fc 불변 영역 이외에, 전이유전자는 중쇄 CH2 도메인 서열의 N-말단에 힌지 영역 모두 또는 일부를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 N-말단에 추가적인 힌지 영역 서열(예를 들어, 힌지를 갖는 서열번호 3)을 갖거나 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(서열번호 145), 및 구체적으로, EPKSCDKTHL(서열번호 146), EPKSCDKTHT(서열번호 147), EPKSCDKTHTCPPCPA(서열번호 148), EPKSCDKTHLCPPCPA(서열번호 149), EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(서열번호 150) 또는 EPKSCDKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(서열번호 151) 전부 또는 일부를 함유하는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는다. 항-TNFα Fc 융합 단백질의 Fc 도메인은 서열번호 3 또는 4(표 6)의 아미노산 서열 또는 도 4에 도시된 바와 같은 IgG1 Fc 도메인, 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체를 가질 수 있다. Fc 도메인은 하기 섹션 5.2.8에 개시된 바와 같이 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 변경된 결합 및/또는 이펙터 기능을 위해 조작될 수 있다.
에타너셉트의 발현은 구성적 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 특정 실시형태에서, 전이유전자는 CAG 프로모터(서열번호 51), CB 프로모터(서열번호 159), CBLong 프로모터(서열번호 161), GRK1(서열번호 54) 프로모터 또는 Best1/GRK 프로모터(서열번호 161)를 함유한다. 대안적으로, 프로모터는 조직 특이적 프로모터(또는 프로모터 및 인핸서 요소를 포함하는 조절 서열), 예를 들어, GRK1 프로모터(서열번호 54 또는 117), (마우스 원추체 어레스틴(CAR) 프로모터(서열번호 114-116), 인간 레드 옵신(RedO) 프로모터(서열번호 112) 또는 Best1/GRK 프로모터(서열번호 161))일 수 있다(게놈 구성을 보여주는 개략도는 도 1을 참조함). 전이유전자는 표 1에 제공된 요소를 함유할 수 있다. 에타너셉트를 인코딩하는 예시적인 전이유전자는 표 7에 제공되고, CAG.에타너셉트(서열번호 16) 또는 mU1a.Vh4i.에타너셉트.scAAV(서열번호 18)를 포함한다. ITR 서열은 5' 및 3에 첨가되고; 게놈을 생성하기 위해 작제물의 말단을 절단하여 CAG.에타너셉트(서열번호 15) 및 U1a.Vh4i.에타너셉트.scAAV(서열번호 17)를 생성한다. 특정 실시형태에서, 작제물은 자가-상보적 작제물이다. 전이유전자는 AAV, 특히 AAV2.7m8, AAV8, AAV3B, 또는 AAVrh73으로 패키징될 수 있다.
특정 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 2에 제시된 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TNFR 타입 2 도메인의 가용성, 세포외 부분을 포함하는 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 3에 제시된 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 10 또는 11에 제시된 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실, 및 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 서열번호 10 또는 11의 아미노산 서열을 포함하는 TNFR2:Fc 융합 단백질이 이루어진다.
특정 실시형태에서, 항-TNFα 전이유전자는 (서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는, 표 6 및 도 2B 참조) TNFR1:Fc 융합 단백질 EYS606을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 뉴클레오타이드 서열은 인간 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈일 수 있다. TNFR1:Fc 융합 단백질은 인간 세포, 특히, 망막을 형성하는 하나 이상의 세포에서 발현 및 분비에 적절한 N-말단에 신호 또는 리더 서열을 갖는다. 신호 서열은 MYRMQLLLLIALSLALVTNS(서열번호 62)의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, 신호 서열은 하나 이상의 안구 조직 세포에 의해 분비되는 단백질에 상응하는 표 2에 제시된 신호 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, 신호 서열은 하기 표 3 및 4에 열거된 것들과 같은 근육 또는 간 세포에서의 발현에 적절할 수 있다.
TNFR 타입 1 도메인의 가용성, 세포외 단백질 및 CH2 및 CH3 도메인 서열을 포함하는 Fc 불변 영역 이외에, 전이유전자는 중쇄 CH2 도메인 서열의 N-말단에 트롬빈 절단 부위 LVPRGS(서열번호 8) 및 힌지 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. 특정 실시형태에서, Fc 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖거나, N-말단에 아미노산 서열 DKTHTCPPCPAPELLGG(서열번호 21), 및 구체적으로, DKTHTCPPCPA(서열번호 154), DKTHLCPPCPA(서열번호 155), DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL(서열번호 152) 또는 DKTHLCPPCPAPELLGGPSVFL(서열번호 156)의 전부 또는 일부를 함유하는 힌지 영역 서열을 갖는다. 항-TNFα Fc 융합 단백질의 Fc 도메인은 서열번호 10의 아미노산 서열을 가질 수 있다(표 6). Fc 도메인은 하기 섹션 5.2.8에 개시된 바와 같이 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 변경된 결합 및/또는 이펙터 기능을 위해 조작될 수 있다.
EYS606의 발현은 구성적 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 특정 실시형태에서, 전이유전자는 CAG 프로모터(서열번호 51) 또는 GRK1(서열번호 54) 프로모터를 함유한다. 대안적으로, 프로모터는 조직 특이적 프로모터(또는 프로모터 및 인핸서 요소를 포함하는 조절 서열), 예를 들어, GRK1 프로모터(서열번호 54 또는 117), (마우스 원추체 어레스틴(CAR) 프로모터(서열번호 114 내지 116), 인간 레드 옵신(RedO) 프로모터(서열번호 112) 또는 Best1/GRK 프로모터(서열번호 161)일 수 있다. 전이유전자는 표 1에 제공된 요소를 함유할 수 있다. EYS606을 인코딩하는 예시적인 전이유전자는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. ITR 서열은 5' 및 3에, 게놈을 생성하기 위한 작제물의 말단을 첨가한다. 전이유전자는 AAV, 특히 AAV8, AAV3B, 또는 AAVrh73으로 패키징될 수 있다.
특정 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 1에 제시된 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TNFR 타입 1 도메인의 가용성, 세포외 부분을 포함하는 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 6에 제시된 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩한다. 특정 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 12에 제시된 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩한다. 특정 실시형태에서, TNFR1:Fc 융합 단백질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 TNFR 타입 1 도메인의 가용성 세포외 부분을 포함하며, 치환, 삽입 또는 결실이 이루어진다. 특정 실시형태에서, TNFR1:Fc 융합 단백질은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하며, 치환, 삽입 또는 결실은, 예를 들어, 프레임워크 영역에서 이루어진다.
유전자 치료 방법
항-TNFα 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 함유하는 바이러스 벡터의 투여에 의해 비-감염성 포도막염에 대한 인간 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 융합 단백질은 에타너셉트 또는 EYS606, 또는 이의 바이오베터 또는 바이오시밀러일 수 있다. 실시형태에서, 환자는 비-감염성 포도막염으로 진단되고/되거나 이와 관련된 증상(들)을 갖는다. 전이유전자를 전달하는 데 사용되는 재조합 벡터는 섹션 5.2에 기술되어 있다. 이러한 벡터는 인간 안구 조직 세포에 대한 친화성을 가져야 하고, 비-복제 rAAV, 특히 AAV8 캡시드, AAV3B 캡시드, 또는 AAVr73 캡시드를 보유하는 것들을 포함할 수 있다. 대안적으로, AAV2.7m8 또는 AAV9 캡시드를 보유하는 벡터는 안구 적응증에 사용될 수 있다. 도 1에 도시된 것과 같은 재조합 벡터는, 예를 들어, 재조합 벡터를 눈에 도입함으로써, 재조합 벡터가 하나 이상의 안구 조직 세포 타입에 들어가도록 하는 임의의 방식으로 투여될 수 있다. 치료 방법에 관한 세부사항은 섹션 5.3을 참조한다.
항-TNFα 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 함유하는 바이러스 벡터의 투여에 의해 비-감염성 포도막염에 대해 인간 대상체를 치료하는 방법이 제공된다. 융합 단백질은 에타너셉트 또는 EYS606일 수 있다. 실시형태에서, 환자는 비-감염성 포도막염으로 진단되고/되거나 이와 관련된 증상을 갖는다. 전이유전자를 전달하기 위해 사용되는 재조합 벡터는 섹션 5.2에 기술되어 있고 예시적인 전이유전자는 상기 제공된다. 이러한 벡터는 인간 안구 조직 세포에 대한 친화성을 가져야 하며, 비-복제 rAAV, 특히 AAV3B, AAV8, 또는 AAVrh73 캡시드를 보유하는 것들을 포함할 수 있다. 도 2A 및 2b에 도시된 바와 같은 재조합 벡터는 재조합 벡터가 안구 조직에 들어가도록 하는 임의의 방식으로 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 전이유전자는 AAV8 벡터에서 서열번호 13 내지 18이다(표 7 참조).
이러한 유전자 요법이 투여되는 대상체는 항-TNFα 요법에 반응성인 대상체일 수 있다. 특정 실시형태에서, 방법은 비-감염성 포도막염으로 진단되었거나, 이와 관련된 하나 이상의 증상을 갖고, 항-TNFα 항체, 항-TNFα Fc 융합 단백질, 또는 항-TNFα 항체 또는 항-TNFα Fc 융합 단백질을 이용한 요법에 대한 우수한 후보로 간주되는 환자를 치료하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 환자는 이전에 에타너셉트, 아달리무맙, 인플릭시맙, 또는 골리무맙으로 치료되었고, 에타너셉트, 아달리무맙, 인플릭시맙, 또는 골리무맙에 반응성인 것으로 밝혀졌다. 다른 실시형태에서, 환자는 이전에 항-TNF-알파 항체 또는 융합 단백질, 예컨대, 에타너셉트, 세르톨리주맙, 또는 다른 항-TNF-알파 제제로 치료되었다. 반응성을 결정하기 위해, 항-TNFα 전이유전자 생성물(예를 들어, 세포 배양물, 생물반응기 등에서 생산됨)은 대상체에게 직접 투여될 수 있다.
인간 번역 후 변형된 항-TNFα 융합 단백질
HuPTM 항-TNFα 융합 단백질의 생산은 예를 들어, 형질도입된 안구 조직 세포에 의해 생산된 완전-인간 번역후 변형된, 예를 들어, 인간-글리코실화된, 설페이트화된 전이유전자 생성물을 연속적으로 공급하는 하나 이상의 안구 조직(또는 세포 타입)에서 영구 데포를 생성하기 위해, 유전자 요법을 통해, 예를 들어, 비-감염성 포도막염으로 진단되거나 이의 하나 이상의 증상을 갖는 인간 대상체(환자)에게 항-TNFα HuPTM을 인코딩하는 바이러스 벡터 또는 다른 DNA 발현 작제물을 망막하, 유리체강내, 비강내, 전방내, 맥락막위, 또는 전신으로 투여함으로써 달성되는 비-감염성 포도막염의 치료를 위한 "바이오베터" 분자를 생성해야 한다.
특정 실시형태에서, HuPTM 항-TNFα 융합 단백질은 도 2A에 제시된 바와 같은 에타너셉트의 아미노산 서열을 갖는 Fc 도메인에 융합된 TNFR2 도메인의 가용성 세포외 부분(아스파라긴(N) 글리코실화 부위, 비-컨센서스 아스파라긴(N) 글리코실화 부위; 범례에 표시된 바와 같음)을 가지고, TNFR2 도메인(서열번호 2)의 N149 또는 N171 및/또는 Fc 도메인(서열번호 3)의 N317을 포함하는 도 2A에 명시된 아미노산 위치 중 하나 이상에 글리코실화, 특히 2,6-시알릴화, 및/또는 TNFR2 도메인(서열번호 2)의 아미노산 위치 T8, T184, S199 및/또는 T200 및/또는 힌지 영역(서열번호 11)의 T245 중 하나 이상에 O-연결된 글리 부위를 갖는다. 다른 실시형태에서, HuPTM 항-TNFα 융합 단백질은 임의의 검출 가능한 NeuGc 모이어티를 함유하지 않고/않거나 임의의 검출 가능한 알파-Gal 모이어티를 함유하지 않는다.
특정 실시형태에서, HuPTM 항-TNFα 융합 단백질은 도 2B에 제시된 바와 같은 ESY606의 아미노산 서열을 갖는 Fc 도메인에 융합된 TNFR1 도메인의 가용성, 세포외 부분(아스파라긴(N) 글리코실화 부위, 비-컨센서스 아스파라긴(N) 글리코실화 부위; 범례에 표시된 바와 같음)을 가지고, TNFR1 도메인(서열번호 1)의 N54, N94 또는 N145 및/또는 Fc 도메인(서열번호 12)의 N294 또는 N358, 및/또는 아미노산 위치 T8, T184, S199 중 하나 이상에서 O-연결된 글리코실화 부위, 및 /또는 TNFR2 도메인(서열번호 1)의 T200 및/또는 힌지 영역(서열번호 12)의 T245를 포함하는 도 2B에 나타낸 바와 같은 아미노산 위치 중 하나 이상에서 글리코실화, 특히 2,6-시알화를 갖는다. 다른 실시형태에서, HuPTM 항-TNFα 융합 단백질은 임의의 검출 가능한 NeuGc 모이어티를 함유하지 않고/않거나 임의의 검출 가능한 알파-Gal 모이어티를 함유하지 않는다.
특정 실시형태에서, HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질은 치료적으로 유효하고, 적어도 0.5%, 1% 또는 2% 글리코실화되고/되거나 설페이트화되고, 적어도 5%, 10% 또는 심지어 50% 또는 100% 글리코실화 및/또는 설페이트화될 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 유전자 요법 치료의 목표는 비-감염성 포도막염의 하나 이상의 증상, 예를 들어, 통증, 눈의 충혈, 빛에 대한 감수성, 및/또는 다른 환자의 불편함을 감소시키기 위한 것이다. 효능은 통증, 눈의 충혈, 및/또는 눈부심의 감소 및/또는 시력의 개선을 측정함으로써 모니터링될 수 있다.
다른 이용 가능한 치료의 전달을 수반하는 눈으로의 HuPTM 항-TNFα Fc 융합 단백질의 전달의 조합은 본 명세서에서 제공되는 방법에 포함된다. 추가 치료는 유전자 요법 치료 전, 동시에, 또는 후에 투여될 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 유전자 요법과 조합될 수 있는 비-감염성 포도막염을 갖는 대상체에 대해 이용 가능한 치료는 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트 모페틸, 사이클로스포린, 사이클로포스파마이드, 코르티코스테로이드(국소 및/또는 전신), 등, 및 에타너셉트, EYS606, 아달리무맙, 인플릭시맙, 또는 골리무맙을 포함하지만 이로 제한되지 않는 항-TNFα 제제와의 투여를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
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5.6 항-TNFα Fc 융합 단백질의 용량 투여
임의의 이러한 재조합 벡터의 치료적 유효량은, 예를 들어, 재조합 벡터를 혈류에 도입함으로써, 재조합 벡터가 안구 조직 세포(예를 들어, 망막 세포)에 들어가도록 하는 임의의 방식으로 투여되어야 한다. 대안적으로, 벡터는, 예를 들어, 망막하, 유리체내, 전방내, 맥락막상 주사를 통해 눈에 직접 투여될 수 있다. 구체적으로, 실시형태에서, 벡터는 망막하, 유리체내, 전방내, 맥락막상, 피하, 근육내 또는 정맥내 투여된다. 망막하, 유리체내, 전방내, 또는 맥락막상 투여는 하기 망막 세포 타입 중 하나 이상에서 가용성 전이유전자 생성물의 발현을 초래해야 한다: 인간 광수용기 세포(원추 세포, 간상 세포); 수평 셀; 양극성 세포; 아마크린 세포; 망막 신경절 세포(작은 세포, 파라솔 세포, 이중층화 세포, 거대 망막 신경절 세포, 감광성 신경절 세포, 및 뮬러 아교세포); 및 망막 색소 상피 세포 또는 다른 안구 조직 세포: 각막 세포, 홍채 세포, 모양체 세포, 쉴렘관 세포, 섬유주대 세포, RPE-맥락막 조직 세포 또는 시신경 세포.
전이유전자 생성물의 발현은 하나 이상의 눈 문제 또는 안구 조직 세포 타입, 예를 들어, 망막 세포에서 전이유전자 생성물의 전달 및 유지를 초래한다. 투여에 적합한 약제학적 조성물은 생리학적으로 적합한 수성 완충제를 포함하는 제형 완충제 중에 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 재조합 벡터의 현탁액을 포함한다. 제형 완충제는 다당류, 계면활성제, 폴리머, 또는 오일 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
대안적으로, 항-TNFα Fc 융합체를 인코딩하는 재조합 벡터를 인코딩하는 벡터는 간에 전달되고, 항-TNFα Fc 융합체는 발현되어 순환계로 분비된다. 특정 실시형태에서, 에타너셉트 Fc 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 벡터의 투여량 및 투여 경로는 유리체내와 동등한 수준으로 에타너셉트 융합 단백질의 유리체내 농도를 40 mg의 용량으로 에타너셉트(Amgen)의 매월 주사에 의해 달성된 유리체내 농도와 동등한 수준으로 달성하고 유지하는 에타너셉트 Fc 융합 단백질의 발현을 초래해야 한다.
5.7 효능 모니터링
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 NIU를 치료, 예방 또는 개선하는 데 있어서 효능을 평가하기 위한 임의의 방법을 사용하여 효능에 대해 평가될 수 있다. 평가는 동물 모델 또는 인간 대상체에서 결정될 수 있다. 시각 결함에 대한 효능은, 예를 들어, 문자 또는 선의 수의 증가를 평가하는 최상의 교정 시력(BCVA)에 의해 측정될 수 있고, 여기서 효능은 2개 이상의 ETDRS 선의 증가 또는 logMAR의 증가, SUN 분류에 따른 전방 및 후방 챔버의 염증 활성 감소 및/또는 유리체 헤이즈 등급의 감소로 평가될 수 있다. 눈에 대한 물리적 변화는 후미에 공지된 방법을 사용하여 광학 간섭 단층촬영에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 NIU를 치료, 예방 또는 개선하는 데 있어서 효능을 평가하기 위한 임의의 방법을 사용하여 효능에 대해 평가될 수 있다. 평가는 동물 모델 또는 인간 대상체에서 결정될 수 있다. 시각 결함에 대한 효능은, 예를 들어, 문자 또는 선의 수의 증가를 평가하는 최상의 교정 시력(BCVA)에 의해 측정될 수 있고, 여기서 효능은 2개 이상의 ETDRS 선의 증가 또는 logMAR의 증가, SUN 분류에 따른 전방 및 후방 챔버의 염증 활성 감소, 및/또는 유리체 헤이즈 등급의 감소로 평가될 수 있다. 눈에 대한 물리적 변화는 후미에 공지된 방법을 사용하여 광학 간섭 단층촬영에 의해 측정될 수 있다. 효능은 발적 및/또는 재발률, 전방 세포, 유리체 세포, 및 유리체 탁도 등급(예를 들어, 0.5+ 이하의 등급), 및/또는 활성 망막 또는 맥락막(염증) 병변의 수를 결정함으로써 추가로 모니터링될 수 있다(예를 들어, 문헌[Kim J.S. et al, Int Ophthalmol Clin. 2015 Summer; 55(3): 79-110 또는 Rosenbaum J.T. et al Volume 49, Issue 3, December 2019, Pages 438-445] 참조; 이는 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용됨).
종점은 기준선에서 12, 16, 20, 24, 또는 28주까지 또는 구조 시점에 연구 눈에서 유리체 탁도 등급의 평균 변화를 포함할 수 있지만, 더 이른 경우, 12, 16, 20, 24 또는 28주에 연구 눈에서 활성 중간, 후부, 또는 범포도막염, 기준선으로부터 12, 16, 20, 24 또는 28주까지의 최고 교정 시력의 평균 변화, 삶의 질/환자 보고된 결과 평가, 기준선에서 12, 16, 20, 24 또는 28주까지 유리체 혼탁 등급 및 전방 세포 등급의 평균 변화, 또는 기준선에서 12, 16, 20, 24 또는 28주로의 면역억제 약물 점수의 변화를 포함할 수 있지만, 이로 제한되지 않는다.
6. 실시예
6.1 실시예 1: 에타너셉트 cDNA-기반 벡터
TNFR:Fc 융합 에타너셉트를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 전이유전자를 포함하는 에타너셉트 cDNA-기반 벡터를 작제하였다(아미노산 서열은 서열번호 10 또는 11임). 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 13 또는 14의 뉴클레오타이드 서열이다. 전이유전자는 또한 신호 펩타이드, 예를 들어, MYRMQLLLLIALSLALVTNS(서열번호 62)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하였다(전이유전자 생성물의 아미노산 서열에 대해서는 도 2A 참조). 벡터는 추가로 CAG 및 mU1a와 같은 구성적 프로모터를 포함하고, EF1a 또는 CB7 또는 CB(서열번호 159) 또는 CB long(서열번호 160) 프로모터와 같은 대안적인 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터, 예컨대, 안구 조직-특이적 프로모터, 특히 GRK1 프로모터(서열번호 54), 또는 Best1/GRK 프로모터(서열번호 161) 또는 유도성 프로모터, 예컨대, 저산소증-유도성 프로모터를 포함할 수 있다.
6.2 실시예 2: EYS060 cDNA-기반 벡터
TNFR:Fc 융합 EYS060을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 전이유전자를 포함하는 EYS060 cDNA-기반 벡터가 작제된다(아미노산 서열은 서열번호 12임). 전이유전자는 또한 신호 펩타이드, 예를 들어, MYRMQLLLLIALSLALVTNS(서열번호 62)를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다(전이유전자 생성물의 아미노산 서열에 대해서는 도 2B 참조). 벡터는 구성적 프로모터, 예를 들어, CAG, mU1a를 추가로 포함하고, 대안적인 프로모터, 예를 들어, EF1a 또는 CB7 또는 CB(서열번호 159) 또는 CB long(서열번호 160) 프로모터, 또는 조직-특이적 프로모터, 예컨대, 안구 조직-특이적 프로모터, 특히 GRK1 프로모터(서열번호 54), 또는 Best1/GRK 프로모터(서열번호 161), 또는 유도성 프로모터, 예컨대, 저산소증-유도성 프로모터를 포함할 수 있다.
6.3 실시예 3: 벡터화된 아달리무맙 IgG 및 Fab 및 벡터화된 에타너셉트를 갖는 모델 종에 걸친 TNFα 결합
A. 인간, 마우스, 및 래트를 포함하는 모델 종으로부터 분리된 벡터화된 아달리무맙 후보를 TNFα에 대한 이들의 결합 능력에 대해 시험하였다. 벡터화된 항체를 293T 세포로의 시스 플라스미드 형질감염 후 세포 상청액으로 발현시키고 분비시켰다. 세포 상청액을 플레이트가 상기 언급된 종으로부터 유래된 재조합 TNFα로 코팅된 ELISA에서 시험하였다(도 5A). 아달리무맙 IgG는 인간 및 마우스 유래된 TNFα에 효과적으로 결합하였다. Fab는 IgG와 인간 TNFα에 대한 유사한 결합 프로파일을 입증한다. 그러나, Fab는 아달리무맙 IgG와 비교하여 마우스 TNFα에 대한 불량한 결합을 나타낸다. IgG 및 Fab 둘 다는 래트 TNFα에 대해 훨씬 감소된 결합을 나타낸다.
B. 벡터화된 에타너셉트를 인간, 마우스 및 래트 TNFα에 대한 결합에 대해 동일한 방식으로 검정하였다. 에타너셉트는 모든 인간, 마우스 및 래트 유래된 TNFα에 결합하였고, 아달리무맙보다 래트 TNFα에 더 잘 결합하였다. 도 5B 참조.
6.4 실시예 4: 비-감염성 후포도막염에 대한 AAV-매개 안구 유전자 요법
비-감염성 후포도막염은 눈의 망막 및 맥락막에 영향을 미치고 실명을 초래하는 안구 염증의 한 형태이다. 매년 약 38,000명의 미국인이 앓고 있다. 환자는 일반적으로 전신 스테로이드 또는 코르티코스테로이드 요법으로 치료되며, 이는 전신 합병증의 위험이 높다. 2016년에, 종양 괴사 인자-알파(TNFα)를 표적으로 하는 인간 단클론성 항체인 휴미라(아달리무맙)는 FDA에 의해 승인되었고 비-감염성 포도막염(NIU)의 치료를 위한 유일한 전신 비코르티코스테로이드 제제가 되었고 그 이후로 널리 사용되었다. 이 연구에서, AAV8.CAG.GFP뿐만 아니라 CAG.에타너셉트 또는 mU1a.Vh4i.에타너셉트.scAAV, 또는 벡터화된 EYS606을 포함하는 벡터화된 항-TNFα Fc 융합 단백질이 국소 투여를 통한 마우스 안구 조직에서의 생체내 AAV-매개된 항-TNFα Fc 융합 단백질 발현에 대해 평가될 것이다. AAV8.NUL은 대조군 벡터로서 작용할 것이다. 설치류 EAU 모델에서의 효능 연구는 또한 NIU에 대한 AAV-매개 항-TNFα 치료의 치료 가능성을 조사하기 위해 수행될 것이다.
벡터화된 에타너셉트 및 EYS606 서열을 작제하고 시험관내에서 시험할 것이다. 야생형 마우스에서 형질도입 효율 및 세포 타입 특이성을 추가로 평가할 것이다. 젊은 성인 C57BL/6 및 B10.RIII 마우스(8 내지 10주령)를 이 연구에 사용할 것이다. CAG.에타너셉트(서열번호 15 또는 16(측접 ITR의 유무)) 또는 mU1a.Vh4i.에타너셉트.scAAV(서열번호 17 또는 18(측접 ITR 서열의 유무))를 포함하는 벡터, 또는 벡터화된 EYS606 뿐만 아니라 AAV8.CAG.GFP 및 AAV8.NUL은 1 ㎕의 제형 완충제에서 상이한 용량(1×107, 1×108 및 1×109 vg/눈)으로 망막하(SR) 주사를 통해 마우스 눈에 전달될 것이다. 안저 및 OCT 영상화는 SR 주사 1, 2 및 4주 후에 수행될 것이다. 안구 샘플은 투여 5주 후에 수집될 것이다. 안구 조직에서 항체 또는 융합 단백질 발현의 수준은 ELISA에 의해 정량화될 것이다. 세포 타입 특이성은 다양한 망막 세포 마커를 사용한 면역형광 염색에 의해 결정될 것이다. 시험 벡터(들)는 효능 연구를 위해 선택될 것이다. 맥락막상, 전방내 및 유리체내 주사를 포함하는 상이한 투여 경로(ROA)가 또한 탐구될 것이다. 바람직한 ROA는 효능 연구에 사용될 것이다.
효능 연구는 인간 IRBP 펩타이드로의 면역화에 의해 B10.RIII 마우스에서 실험적 자가면역 포도막염(EAU)을 유도함으로써 수행될 것이다. T-세포 매개 안구 자가면역 반응은 유도 후 대략 11일 내지 18일에 피크로 이 모델에서 일어날 것이다. 시험 벡터는 EAU 유도 2주 전 또는 1주 후에 바람직한 ROA를 통해 마우스 눈에 투여될 것이다. 반대쪽 눈은 AAV.NUL 벡터와 함께 전달되고 대조군으로 제공될 것이다. 안저 및 OCT 영상화, 망막전위도검사(electroretinography: ERG) 및 시운동성 안진(Optokinetic nystagmus: OKN)을 EAU 유도 후 10, 17 및 30일에 시험하여 질병의 진행을 모니터링할 것이다. 안구 조직 또는 전체 안구는 EAU 유도 5주 후에 수집될 것이다. 안구 조직에서의 융합 단백질 발현의 수준은 ELISA에 의해 검출되고 정량화될 것이다. 망막 구조 변화 및 뉴런 생존은 조직학 및 면역형광 염색에 의해 평가될 것이다.
6.5 실시예 5: 생체내 연구
이 연구에서, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터(AAV8.CAG.아달리무맙.IgG(NIU001) 및 AAV8.CAG.아달리무맙.Fab(NIU002))에서 전장 및 Fab 아달리무맙 항체, 뿐만 아니라 에타너셉트 Fc 융합 단백질(AAV8.CAG. 에타너셉트)은 국소 투여를 통해 마우스 안구 조직에서 생체내 AAV-매개 항체 발현에 대해 평가될 것이다(망막하(SR), 표 8).
Figure pct00031
벡터화된 아달리무맙 및 에타너셉트 서열이 작제되고 시험관내 시험되었다. 젊은 성인 B10.RIII 마우스(6 내지 8주령)를 이 연구에 사용하였다. AAV8.CAG.아달리무맙.IgG, AAV8.CAG.아달리무맙.Fab, AAV8.CAG.에타너셉트, 및 비히클을 포함하는 벡터는 1 ㎕의 제형 완충제 중 2개의 상이한 용량(1×108 및 1×109 vg/눈)으로 망막하(SR) 주사를 통해 마우스 눈에 전달된다(표 8).
안저 및 OCT 영상화는 SR 주사 2주 및 4주 후에 수행되었다. 투여 4주 후에 안구 샘플을 수집하였다. 안구 조직에서 항체 또는 융합 단백질 발현의 수준은 ELISA에 의해 정량화된다. 다양한 망막 세포 마커를 이용한 면역형광 염색에 의해 세포 타입 특이성을 결정하였다. 망막 구조 변화 및 뉴런 생존은 투여 2주 및 4주 후에 조직학 및 면역형광 염색에 의해 평가된다.
6.6 실시예 6: 벡터-발현된 에타너셉트 결합 동역학의 평가
시스 플라스미드로부터 생산된 AAV로부터의 벡터화된 에타너셉트의 발현 및 정제가 평가될 것이다. 다양한 종의 TNFα 단백질에 대한 정제된 벡터화된 에타너셉트 동역학은 다양한 리간드 결합 검정에서 상업적으로 생산된 에타너셉트와 비교될 것이다.
Biacore™(표면 플라즈몬 공명(SPR)) 검정을 이용한 결합 친화성: BiacoreT200을 사용하여 정제된 TNFR-융합 단백질에 대한 상이한 TNF-알파(TNFα) 분자의 결합 친화성을 측정하기 위한 연구가 수행된다. 먼저, pAAV.CAG. 에타너셉트-생산된 융합 단백질에 대한 TNFα의 결합 친화성을 상업적 에타너셉트에 대한 TNFα의 결합과 비교한다. 둘째, 이후의 동물 모델 연구에 대한 다양한 종의 TNFα 단백질의 적합성을 결정하기 위해 상이한 종으로부터의 TNFα의 결합 친화성을 시험한다. Biacore 검정은 실행 완충제로서 HBS-EP+를 사용하여 25℃에서 수행된다. 희석된 융합 단백질은 Fc 포획 방법을 통해 센서 칩 상에 포획된다(포획 시간 15 내지 20분). 상이한 종 TNFα 단백질(인간, 마카크, 돼지, 마우스, 개, 토끼 및 래트)을 분석물로서 개별적으로 시험한 후, 해리 단계에서 러닝 완충제를 주입할 수 있다. 해리 속도를 계산하였다[Koff= Kd= 단백질 해리 속도; Kon = Ka = 단백질 회합률; KD = Koff/Kon]이고, 더 작은(더 낮은) KD 값은 이의 표적에 대한 TNFR-융합 단백질의 친화성이 더 크다는 것을 나타내었다.
Figure pct00032
벡터화된 에타너셉트 대 상업적인 에타너셉트에 대한 상이한 종 TNFα의 결합 친화성(KD)은 이들의 KD 값에 따라 순위화될 것이다.
6.7 실시예 7: TNF-융합 단백질 이펙터 기능의 측정
벡터-생산된 에타너셉트의 이펙터 기능, 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC) 및 보체-의존적 세포독성(CDC)은 시험관내 검정에 의해 평가되고 상업적으로 생산된 에타너셉트(ENBREL)와 비교할 것이다. 이펙터 기능은 항체의 Fc 도메인, 및 이에 따라 에타너셉트와 같은 Fc 도메인을 함유하는 융합 단백질을 통해 유도된다.
재료 및 방법
표적 세포(CHO/DG44-tm TNFα; GenScript Cat. #RD00746)는 5% CO2와 함께 37℃에서 상응하는 완전한 배양 배지로 유지된다. 이펙터 세포(말초 혈액 단핵 세포, PBMC; Saily Bio Cat. # XFB-HP100B)를 37℃에서 해동시키고 5% CO2와 함께 37℃에서 1640 완전한 배양 배지로 유지시킨다.
ADCC 용량-반응 검정의 경우, CHO/DG44-tm TNFα 및 PBMC를 각각 표적 및 이펙터 세포로서 사용할 수 있다. 25:1로 설정된 E/T(이펙터 세포 대 표적 세포) 비율로, CHO/DG44-tm TNFα에 대한 에타너셉트(상업용) 및 인간 IgG1을 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하였다. 간략하게, 방법 단계는 다음과 같다:
CHO/DG44-tm TNFα(표적 세포)
+
샘플
+
PBMC(이펙터 세포)
↓
표적 세포 용해 %
이펙터 세포(PBMC)를 해동하고 검정 완충제(CellTiter-Glo®Detection Kit(Promega, Cat.#G7573))로 재현탁시켰다. 표적 세포를 또한 해동시키고 ADCC 검정 완충제로 재현탁시킨 다음, 플레이트 맵에 따라 검정 플레이트로 현탁액으로 옮겼다. 용액 중의 대조군 및 시험 샘플을 또한 검정 플레이트로 옮기고, 검정 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이펙터 세포 밀도를 E/T 비율에 따라 조정한 다음, 이펙터 세포 현탁액을 검정 플레이트로 옮겼다. 이어서, 검정 플레이트를 세포 인큐베이터(37℃/5% CO2)에서 6시간 동안 인큐베이션하고, 제거한 다음, 검정 플레이트의 상응하는 웰의 상청액을 또 다른 96-웰 검정 플레이트로 옮긴다. LDH 혼합물(LDH 세포독성 검출 키트, Roche Cat# 11644793001)을 제2 96-웰 검정 플레이트의 상응하는 웰로 옮기고, 발광성/흡광도를 PHERAStar®(BMG LABTECH) 플레이트 판독기로 판독한다.
CDC 용량-반응 연구의 경우, CHO/DG44-tm TNFα가 표적 세포로서 사용될 수 있다. 5% NHSC(정상 인간 혈청 보체)로, CHO/DG44-tm TNFα에 대한 에타너셉트 및 인간 IgG1을 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용할 수 있다. 간략하게, CDC 검정 방법 단계는 다음과 같다:
CHO/DG44-tm TNFα(표적 세포)
+
샘플
+
NHSC
↓
표적 세포 용해 %
표적 세포를 원심분리에 의해 수확하고 검정 완충제(CellTiter-Glo®Detection Kit(Promega, Cat.#G7573))로 재현탁시킨다. 샘플 및 대조군은 CDC 검정 완충제를 갖는 용액으로 제조된다. 표적 세포 밀도를 조정한 다음, 세포 현탁액을 검정 플레이트로 옮겼다. 작업 용액 중의 대조군 및 시험 샘플을 또한 검정 플레이트로 옮기고, 이어서 검정 플레이트를 RT에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 정상 인간 혈청 보체(NHSC) 작업 용액(Quidel, Cat. # A113)을 검정 플레이트에 첨가한다. 검정 플레이트를 세포 인큐베이터(37℃/5% CO2)에서 4시간 동안 인큐베이션하고, 제거하고, Cell Titer-Glo® 작업 용액을 상응하는 웰에 첨가하고, 플레이트를 RT에서 약 10 내지 30분 동안 인큐베이션한다. PHERAStar® FSX(BMG LABTECH) 플레이트 리더에서 발광 데이터를 판독하여 생존 세포의 수를 결정하였다. ADCC 및 CDC 연구의 미가공 데이터를 PHERAStar® FSX 시스템으로부터 내보내고 Microsoft Office Excel 2016 및 GraphPad Prism 6 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. ADCC 표적 세포 용해 % = 100*(OD샘플 - ODT종양 세포 + 이펙터 세포)/(OD최대 방출 - OD최소 방출)의 공식. CDC 표적 세포 용해 %의 공식 = 100*(1-(RLUS샘플 - RLUNHSC)/(RLU세포+NHSC - RLUNHSC)). 상대 EC50 값은 다음과 같이 4-파라미터 함수를 사용하여 수득되며, 여기서 표적 세포 용해 %는 시험 샘플의 농도에 대한 S자 곡선을 특징화한다: Y = 바닥 + (상하)/(1+10^((LogEC50-X))*HillSlope)) = 표적 세포 용해의 백분율; 및 X = 농도.
25:1의 E/T 비율로, CHO/DG44-tm TNFα 세포는 ADCC 용량-반응 연구에서 표적 세포로서 사용될 수 있다. 양성 대조군(상업용 에타너셉트), 샘플 및 음성 대조군(인간 IgG1)의 용량-반응 및 최적-적합 값을 계산한다(예를 들어, EC50).
5% NHSC의 경우, CHO/DG44-tm TNFα 세포를 CDC 용량-반응 연구에서 표적 세포로서 사용하였다. 양성 대조군(에타너셉트), 샘플 및 음성 대조군(인간 IgG1)의 용량-반응 및 최적-적합 값을 계산한다(예를 들어, EC50).
AAV-에타너셉트 ADCC 및 CDC 활성은 상업적 에타너셉트와 비교될 것이다. 임의의 하나의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 글리코실화와 같은 번역-후 변형으로 인해 차이가 관찰될 수 있으며, 이는 상업적 에타너셉트의 제조 세포 배양으로 인해 다를 것으로 예상된다.
등가물
본 발명은 이의 특정 실시형태를 참조하여 상세히 설명되지만, 기능적으로 동등한 변형예는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 이해될 것이다. 실제로, 본 명세서에 도시되고 기재된 것들 이외에 본 발명의 다양한 변형예는 전술한 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위에 속하는 것으로 의도된다. 당업자는 단지 일상적인 실험을 이용하여 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 실시형태에 대한 많은 등가물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
SEQUENCE LISTING <110> REGENXBIO INC <120> VECTORIZED TNF-ALPHA ANTAGONISTS FOR OCULAR INDICATIONS <130> 38013.0016P1 <140> PCT/US2021/057380 <141> 2021-10-29 <150> US 63/107,415 <151> 2020-10-29 <160> 161 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 211 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; Anti-TNFalpha Fc Fusion <400> 1 Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro 20 25 30 His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys 35 40 45 Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys 50 55 60 Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp 65 70 75 80 Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu 85 90 95 Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val 100 105 110 Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg 115 120 125 Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe 130 135 140 Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu 145 150 155 160 Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu 165 170 175 Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr 180 185 190 Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser 195 200 205 Gly Thr Thr 210 <210> 2 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; 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Etanercept plus leader sequence <400> 11 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Leu Leu Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala 35 40 45 Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe 50 55 60 Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser 85 90 95 Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln 100 105 110 Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys 115 120 125 Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly 130 135 140 Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys 145 150 155 160 Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile 165 170 175 Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala 180 185 190 Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala 195 200 205 Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His 210 215 220 Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu 225 230 235 240 Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Glu 245 250 255 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 260 265 270 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 275 280 285 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 290 295 300 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 305 310 315 320 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 325 330 335 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 340 345 350 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 355 360 365 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 370 375 380 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 385 390 395 400 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 405 410 415 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 420 425 430 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 435 440 445 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 450 455 460 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 465 470 475 480 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 <210> 12 <211> 400 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; EYS606 <400> 12 Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro 20 25 30 His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys 35 40 45 Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys 50 55 60 Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp 65 70 75 80 Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu 85 90 95 Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val 100 105 110 Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg 115 120 125 Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe 130 135 140 Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu 145 150 155 160 Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu 165 170 175 Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr 180 185 190 Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser 195 200 205 Gly Thr Thr Leu Val Pro Arg Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 <210> 13 <211> 1404 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; Etanercept <400> 13 ctgcctgcac aggtggcttt taccccatat gctcctgagc ctggatccac ttgtaggctg 60 agggagtatt atgatcagac agcccagatg tgctgttcaa aatgttcccc tggacagcat 120 gctaaggtgt tttgtaccaa gacaagtgac actgtctgtg acagctgtga ggattctact 180 tacacccagc tgtggaattg ggtgccagaa tgtctgtcat gtgggagcag gtgttctagt 240 gaccaggtgg aaactcaggc ctgtacaaga gagcagaaca ggatttgtac atgtagacca 300 gggtggtact gtgccctgag caaacaggaa gggtgtaggc tctgtgctcc cctgaggaaa 360 tgtagacctg ggtttggggt ggccagacca ggaacagaaa cttctgatgt ggtctgtaag 420 ccctgtgcac caggaacctt ttcaaacact accagcagta cagacatctg cagaccccat 480 cagatctgta atgtggtggc cattcctggg aatgcaagta tggatgctgt ctgtacttcc 540 accagcccaa ctagatccat ggccccaggg gcagtccacc tgccccagcc tgtcagcact 600 agaagccagc atactcagcc cacacctgag ccttctacag caccctccac ctctttcctg 660 ctgcctatgg ggccatcacc tccagctgag ggcagtacag gggatgaacc taagtcatgt 720 gacaaaaccc atacctgtcc accctgccct gctcctgagc tgctgggggg acccagtgtc 780 ttcctgtttc ctcccaaacc taaagatact ctgatgatca gcagaacccc agaggtcaca 840 tgcgtggtag tggatgtctc ccatgaagac cctgaagtga agtttaattg gtatgtagat 900 ggggtggagg tccataatgc aaagaccaag cccagggaag aacagtataa cagtacttac 960 agggtggtgt ctgtgctgac agtactgcac caggactggc tgaatgggaa ggagtataag 1020 tgcaaagtca gcaataaggc actgcctgcc cctattgaaa agacaattag taaagctaag 1080 gggcagccca gggaaccaca ggtctacact ctgcccccta gtagagagga aatgacaaag 1140 aatcaggtca gtctgacatg tctggtcaag ggattctatc caagtgatat tgcagtggag 1200 tgggaaagta atggccagcc agagaataac tacaagacta cccccccagt gctggacagt 1260 gatggatctt tctttctgta ctccaaactg actgtggata aatcaagatg gcagcagggc 1320 aatgtctttt cctgttcagt catgcatgaa gccctgcata atcactacac tcagaagagc 1380 ctgtccctgt cccctggcaa atga 1404 <210> 14 <211> 1464 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; Etanercept plus leader sequence <400> 14 atgtatagga tgcagctgct gctgctgatt gctctgagtc tggctctggt cacaaatagt 60 ctgcctgcac aggtggcttt taccccatat gctcctgagc ctggatccac ttgtaggctg 120 agggagtatt atgatcagac agcccagatg tgctgttcaa aatgttcccc tggacagcat 180 gctaaggtgt tttgtaccaa gacaagtgac actgtctgtg acagctgtga ggattctact 240 tacacccagc tgtggaattg ggtgccagaa tgtctgtcat gtgggagcag gtgttctagt 300 gaccaggtgg aaactcaggc ctgtacaaga gagcagaaca ggatttgtac atgtagacca 360 gggtggtact gtgccctgag caaacaggaa gggtgtaggc tctgtgctcc cctgaggaaa 420 tgtagacctg ggtttggggt ggccagacca ggaacagaaa cttctgatgt ggtctgtaag 480 ccctgtgcac caggaacctt ttcaaacact accagcagta cagacatctg cagaccccat 540 cagatctgta atgtggtggc cattcctggg aatgcaagta tggatgctgt ctgtacttcc 600 accagcccaa ctagatccat ggccccaggg gcagtccacc tgccccagcc tgtcagcact 660 agaagccagc atactcagcc cacacctgag ccttctacag caccctccac ctctttcctg 720 ctgcctatgg ggccatcacc tccagctgag ggcagtacag gggatgaacc taagtcatgt 780 gacaaaaccc atacctgtcc accctgccct gctcctgagc tgctgggggg acccagtgtc 840 ttcctgtttc ctcccaaacc taaagatact ctgatgatca gcagaacccc agaggtcaca 900 tgcgtggtag tggatgtctc ccatgaagac cctgaagtga agtttaattg gtatgtagat 960 ggggtggagg tccataatgc aaagaccaag cccagggaag aacagtataa cagtacttac 1020 agggtggtgt ctgtgctgac agtactgcac caggactggc tgaatgggaa ggagtataag 1080 tgcaaagtca gcaataaggc actgcctgcc cctattgaaa agacaattag taaagctaag 1140 gggcagccca gggaaccaca ggtctacact ctgcccccta gtagagagga aatgacaaag 1200 aatcaggtca gtctgacatg tctggtcaag ggattctatc caagtgatat tgcagtggag 1260 tgggaaagta atggccagcc agagaataac tacaagacta cccccccagt gctggacagt 1320 gatggatctt tctttctgta ctccaaactg actgtggata aatcaagatg gcagcagggc 1380 aatgtctttt cctgttcagt catgcatgaa gccctgcata atcactacac tcagaagagc 1440 ctgtccctgt cccctggcaa atga 1464 <210> 15 <211> 3784 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; pAAV.CAG.Etanercept (from 5'-ITR to 3-ITR) <400> 15 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag ggtaatgggg 180 atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 240 tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 300 tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 360 tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 420 aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 480 caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 540 tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac 600 gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat 660 tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 720 ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 780 gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa 840 aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc 900 cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag 960 cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt 1020 ttcttttctg tggctgcgtg aaagccttga ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg 1080 gagcggctcg gggggtgcgt gcgtgtgtgt gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc 1140 gctgcccggc ggctgtgagc gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt 1200 gcgcgagggg agcgcggccg ggggcggtgc cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa 1260 caaaggctgc gtgcggggtg tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt 1320 cgggctgcaa ccccccctgc acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg 1380 tgcggggctc cgtacggggc gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca 1440 ggtgggggtg ccgggcgggg cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg 1500 cggcggcccc cggagcgccg gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt 1560 atggtaatcg tgcgagaggg cgcagggact tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa 1620 atctgggagg cgccgccgca ccccctctag cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg 1680 caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc 1740 tctccagcct cggggctgtc cgcgggggga cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc 1800 ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc 1860 cttcttcttt ttcctacagc tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt 1920 tggcaaagaa ttcgccacca tgtataggat gcagctgctg ctgctgattg ctctgagtct 1980 ggctctggtc acaaatagtc tgcctgcaca ggtggctttt accccatatg ctcctgagcc 2040 tggatccact tgtaggctga gggagtatta tgatcagaca gcccagatgt gctgttcaaa 2100 atgttcccct ggacagcatg ctaaggtgtt ttgtaccaag acaagtgaca ctgtctgtga 2160 cagctgtgag gattctactt acacccagct gtggaattgg gtgccagaat gtctgtcatg 2220 tgggagcagg tgttctagtg accaggtgga aactcaggcc tgtacaagag agcagaacag 2280 gatttgtaca tgtagaccag ggtggtactg tgccctgagc aaacaggaag ggtgtaggct 2340 ctgtgctccc ctgaggaaat gtagacctgg gtttggggtg gccagaccag gaacagaaac 2400 ttctgatgtg gtctgtaagc cctgtgcacc aggaaccttt tcaaacacta ccagcagtac 2460 agacatctgc agaccccatc agatctgtaa tgtggtggcc attcctggga atgcaagtat 2520 ggatgctgtc tgtacttcca ccagcccaac tagatccatg gccccagggg cagtccacct 2580 gccccagcct gtcagcacta gaagccagca tactcagccc acacctgagc cttctacagc 2640 accctccacc tctttcctgc tgcctatggg gccatcacct ccagctgagg gcagtacagg 2700 ggatgaacct aagtcatgtg acaaaaccca tacctgtcca ccctgccctg ctcctgagct 2760 gctgggggga cccagtgtct tcctgtttcc tcccaaacct aaagatactc tgatgatcag 2820 cagaacccca gaggtcacat gcgtggtagt ggatgtctcc catgaagacc ctgaagtgaa 2880 gtttaattgg tatgtagatg gggtggaggt ccataatgca aagaccaagc ccagggaaga 2940 acagtataac agtacttaca gggtggtgtc tgtgctgaca gtactgcacc aggactggct 3000 gaatgggaag gagtataagt gcaaagtcag caataaggca ctgcctgccc ctattgaaaa 3060 gacaattagt aaagctaagg ggcagcccag ggaaccacag gtctacactc tgccccctag 3120 tagagaggaa atgacaaaga atcaggtcag tctgacatgt ctggtcaagg gattctatcc 3180 aagtgatatt gcagtggagt gggaaagtaa tggccagcca gagaataact acaagactac 3240 ccccccagtg ctggacagtg atggatcttt ctttctgtac tccaaactga ctgtggataa 3300 atcaagatgg cagcagggca atgtcttttc ctgttcagtc atgcatgaag ccctgcataa 3360 tcactacact cagaagagcc tgtccctgtc ccctggcaaa tgataactcg aggacggggt 3420 gaactacgcc tgaggatccg atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg acatcatgaa 3480 gccccttgag catctgactt ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg 3540 ttggaatttt ttgtgtctct cactcggaag caattcgttg atctgaattt cgaccaccca 3600 taatacccat taccctggta gataagtagc atggcgggtt aatcattaac tacaaggaac 3660 ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc 3720 gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 3780 gcag 3784 <210> 16 <211> 3362 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; pAAV.CAG.Etanercept <400> 16 acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 60 atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 120 cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 180 tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 240 agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 300 gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 360 agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 420 ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 480 gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 540 cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 600 ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 660 agtcgctgcg cgctgccttc gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc 720 ccggctctga ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc 780 gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag 840 ccttgagggg ctccgggagg gccctttgtg cggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt 900 gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg ctccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg 960 cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cagtgtgcgc gaggggagcg cggccggggg 1020 cggtgccccg cggtgcgggg ggggctgcga ggggaacaaa ggctgcgtgc ggggtgtgtg 1080 cgtggggggg tgagcagggg gtgtgggcgc gtcggtcggg ctgcaacccc ccctgcaccc 1140 ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg gggctccgta cggggcgtgg 1200 cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg ggggtgccgg gcggggcggg 1260 gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc ggcccccgga gcgccggcgg 1320 ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg taatcgtgcg agagggcgca 1380 gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct gggaggcgcc gccgcacccc 1440 ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg aaggaaatgg gcggggaggg 1500 ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc cagcctcggg gctgtccgcg 1560 gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac 1620 cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct 1680 gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcattttggc aaagaattcg ccaccatgta 1740 taggatgcag ctgctgctgc tgattgctct gagtctggct ctggtcacaa atagtctgcc 1800 tgcacaggtg gcttttaccc catatgctcc tgagcctgga tccacttgta ggctgaggga 1860 gtattatgat cagacagccc agatgtgctg ttcaaaatgt tcccctggac agcatgctaa 1920 ggtgttttgt accaagacaa gtgacactgt ctgtgacagc tgtgaggatt ctacttacac 1980 ccagctgtgg aattgggtgc cagaatgtct gtcatgtggg agcaggtgtt ctagtgacca 2040 ggtggaaact caggcctgta caagagagca gaacaggatt tgtacatgta gaccagggtg 2100 gtactgtgcc ctgagcaaac aggaagggtg taggctctgt gctcccctga ggaaatgtag 2160 acctgggttt ggggtggcca gaccaggaac agaaacttct gatgtggtct gtaagccctg 2220 tgcaccagga accttttcaa acactaccag cagtacagac atctgcagac cccatcagat 2280 ctgtaatgtg gtggccattc ctgggaatgc aagtatggat gctgtctgta cttccaccag 2340 cccaactaga tccatggccc caggggcagt ccacctgccc cagcctgtca gcactagaag 2400 ccagcatact cagcccacac ctgagccttc tacagcaccc tccacctctt tcctgctgcc 2460 tatggggcca tcacctccag ctgagggcag tacaggggat gaacctaagt catgtgacaa 2520 aacccatacc tgtccaccct gccctgctcc tgagctgctg gggggaccca gtgtcttcct 2580 gtttcctccc aaacctaaag atactctgat gatcagcaga accccagagg tcacatgcgt 2640 ggtagtggat gtctcccatg aagaccctga agtgaagttt aattggtatg tagatggggt 2700 ggaggtccat aatgcaaaga ccaagcccag ggaagaacag tataacagta cttacagggt 2760 ggtgtctgtg ctgacagtac tgcaccagga ctggctgaat gggaaggagt ataagtgcaa 2820 agtcagcaat aaggcactgc ctgcccctat tgaaaagaca attagtaaag ctaaggggca 2880 gcccagggaa ccacaggtct acactctgcc ccctagtaga gaggaaatga caaagaatca 2940 ggtcagtctg acatgtctgg tcaagggatt ctatccaagt gatattgcag tggagtggga 3000 aagtaatggc cagccagaga ataactacaa gactaccccc ccagtgctgg acagtgatgg 3060 atctttcttt ctgtactcca aactgactgt ggataaatca agatggcagc agggcaatgt 3120 cttttcctgt tcagtcatgc atgaagccct gcataatcac tacactcaga agagcctgtc 3180 cctgtcccct ggcaaatgat aactcgagga cggggtgaac tacgcctgag gatccgatct 3240 ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc cttgagcatc tgacttctgg 3300 ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg aattttttgt gtctctcact 3360 cg 3362 <210> 17 <211> 2259 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; pAAV.sc.mU1a.Vh4i. Etanercept (5'-ITR to 3'-ITR) <400> 17 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggaatt cacgcgtatg 120 gaggcggtac tatgtagatg agaattcagg agcaaactgg gaaaagcaac tgcttccaaa 180 tatttgtgat ttttacagtg tagttttgga aaaactctta gcctaccaat tcttctaagt 240 gttttaaaat gtgggagcca gtacacatga agttatagag tgttttaatg aggcttaaat 300 atttaccgta actatgaaat gctacgcata tcatgctgtt caggctccgt ggccacgcaa 360 ctcatactca ggtgagtatc tcagggatcc agacatgggg atatgggagg tgcctctgat 420 cccagggctc actgtgggtc tctctgttca caggttaccg gtgccaccat gtataggatg 480 cagctgctgc tgctgattgc tctgagtctg gctctggtca caaatagtct gcctgcacag 540 gtggctttta ccccatatgc tcctgagcct ggatccactt gtaggctgag ggagtattat 600 gatcagacag cccagatgtg ctgttcaaaa tgttcccctg gacagcatgc taaggtgttt 660 tgtaccaaga caagtgacac tgtctgtgac agctgtgagg attctactta cacccagctg 720 tggaattggg tgccagaatg tctgtcatgt gggagcaggt gttctagtga ccaggtggaa 780 actcaggcct gtacaagaga gcagaacagg atttgtacat gtagaccagg gtggtactgt 840 gccctgagca aacaggaagg gtgtaggctc tgtgctcccc tgaggaaatg tagacctggg 900 tttggggtgg ccagaccagg aacagaaact tctgatgtgg tctgtaagcc ctgtgcacca 960 ggaacctttt caaacactac cagcagtaca gacatctgca gaccccatca gatctgtaat 1020 gtggtggcca ttcctgggaa tgcaagtatg gatgctgtct gtacttccac cagcccaact 1080 agatccatgg ccccaggggc agtccacctg ccccagcctg tcagcactag aagccagcat 1140 actcagccca cacctgagcc ttctacagca ccctccacct ctttcctgct gcctatgggg 1200 ccatcacctc cagctgaggg cagtacaggg gatgaaccta agtcatgtga caaaacccat 1260 acctgtccac cctgccctgc tcctgagctg ctggggggac ccagtgtctt cctgtttcct 1320 cccaaaccta aagatactct gatgatcagc agaaccccag aggtcacatg cgtggtagtg 1380 gatgtctccc atgaagaccc tgaagtgaag tttaattggt atgtagatgg ggtggaggtc 1440 cataatgcaa agaccaagcc cagggaagaa cagtataaca gtacttacag ggtggtgtct 1500 gtgctgacag tactgcacca ggactggctg aatgggaagg agtataagtg caaagtcagc 1560 aataaggcac tgcctgcccc tattgaaaag acaattagta aagctaaggg gcagcccagg 1620 gaaccacagg tctacactct gccccctagt agagaggaaa tgacaaagaa tcaggtcagt 1680 ctgacatgtc tggtcaaggg attctatcca agtgatattg cagtggagtg ggaaagtaat 1740 ggccagccag agaataacta caagactacc cccccagtgc tggacagtga tggatctttc 1800 tttctgtact ccaaactgac tgtggataaa tcaagatggc agcagggcaa tgtcttttcc 1860 tgttcagtca tgcatgaagc cctgcataat cactacactc agaagagcct gtccctgtcc 1920 cctggcaaat gataaaagct tgatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg 1980 aagccccttg agcatctgac ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg 2040 tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcggc tagcgaagca attctagcag gcatgctggg 2100 gagagatcga tctgaggaac ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg 2160 ctcgctcact gaggccgccc gggcaaagcc cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc 2220 ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaa 2259 <210> 18 <211> 1951 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; pAAV.sc.mU1a.Vh4i. Etanercept (promoter to polyA) <400> 18 atggaggcgg tactatgtag atgagaattc aggagcaaac tgggaaaagc aactgcttcc 60 aaatatttgt gatttttaca gtgtagtttt ggaaaaactc ttagcctacc aattcttcta 120 agtgttttaa aatgtgggag ccagtacaca tgaagttata gagtgtttta atgaggctta 180 aatatttacc gtaactatga aatgctacgc atatcatgct gttcaggctc cgtggccacg 240 caactcatac tcaggtgagt atctcaggga tccagacatg gggatatggg aggtgcctct 300 gatcccaggg ctcactgtgg gtctctctgt tcacaggtta ccggtgccac catgtatagg 360 atgcagctgc tgctgctgat tgctctgagt ctggctctgg tcacaaatag tctgcctgca 420 caggtggctt ttaccccata tgctcctgag cctggatcca cttgtaggct gagggagtat 480 tatgatcaga cagcccagat gtgctgttca aaatgttccc ctggacagca tgctaaggtg 540 ttttgtacca agacaagtga cactgtctgt gacagctgtg aggattctac ttacacccag 600 ctgtggaatt gggtgccaga atgtctgtca tgtgggagca ggtgttctag tgaccaggtg 660 gaaactcagg cctgtacaag agagcagaac aggatttgta catgtagacc agggtggtac 720 tgtgccctga gcaaacagga agggtgtagg ctctgtgctc ccctgaggaa atgtagacct 780 gggtttgggg tggccagacc aggaacagaa acttctgatg tggtctgtaa gccctgtgca 840 ccaggaacct tttcaaacac taccagcagt acagacatct gcagacccca tcagatctgt 900 aatgtggtgg ccattcctgg gaatgcaagt atggatgctg tctgtacttc caccagccca 960 actagatcca tggccccagg ggcagtccac ctgccccagc ctgtcagcac tagaagccag 1020 catactcagc ccacacctga gccttctaca gcaccctcca cctctttcct gctgcctatg 1080 gggccatcac ctccagctga gggcagtaca ggggatgaac ctaagtcatg tgacaaaacc 1140 catacctgtc caccctgccc tgctcctgag ctgctggggg gacccagtgt cttcctgttt 1200 cctcccaaac ctaaagatac tctgatgatc agcagaaccc cagaggtcac atgcgtggta 1260 gtggatgtct cccatgaaga ccctgaagtg aagtttaatt ggtatgtaga tggggtggag 1320 gtccataatg caaagaccaa gcccagggaa gaacagtata acagtactta cagggtggtg 1380 tctgtgctga cagtactgca ccaggactgg ctgaatggga aggagtataa gtgcaaagtc 1440 agcaataagg cactgcctgc ccctattgaa aagacaatta gtaaagctaa ggggcagccc 1500 agggaaccac aggtctacac tctgccccct agtagagagg aaatgacaaa gaatcaggtc 1560 agtctgacat gtctggtcaa gggattctat ccaagtgata ttgcagtgga gtgggaaagt 1620 aatggccagc cagagaataa ctacaagact acccccccag tgctggacag tgatggatct 1680 ttctttctgt actccaaact gactgtggat aaatcaagat ggcagcaggg caatgtcttt 1740 tcctgttcag tcatgcatga agccctgcat aatcactaca ctcagaagag cctgtccctg 1800 tcccctggca aatgataaaa gcttgatctt tttccctctg ccaaaaatta tggggacatc 1860 atgaagcccc ttgagcatct gacttctggc taataaagga aatttatttt cattgcaata 1920 gtgtgttgga attttttgtg tctctcactc g 1951 <210> 19 <211> 467 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; antibody construct <400> 19 Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser 1 5 10 15 Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys 20 25 30 Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr 35 40 45 Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu 50 55 60 Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser 65 70 75 80 Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys 85 90 95 Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys 100 105 110 Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala 115 120 125 Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro 130 135 140 Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His 145 150 155 160 Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala 165 170 175 Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val 180 185 190 His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr 195 200 205 Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly 210 215 220 Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Pro Gly Lys 465 <210> 20 <211> 400 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; 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regulatory sequence <400> 134 aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60 ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120 tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180 cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240 tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300 ggtttaggta gtgtgagagg ggtacccggg gatcttgcta ccagtggaac agccactaag 360 gattctgcag tgagagcaga gggccagcta agtggtactc tcccagagac tgtctgactc 420 acgccacccc ctccaccttg gacacaggac gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact 480 cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag 540 gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg 600 gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc ccctctggat ccactgctta 660 aatacggacg aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg caccaccact gacctgggac 720 agt 723 <210> 135 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; regulatory sequence <400> 135 aggttaattt ttaaaaagca gtcaaaagtc caagtggccc ttggcagcat ttactctctc 60 tgtttgctct ggttaataat ctcaggagca caaacattcc 100 <210> 136 <211> 200 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; regulatory sequence <400> 136 aggttaattt ttaaaaagca gtcaaaagtc caagtggccc ttggcagcat ttactctctc 60 tgtttgctct ggttaataat ctcaggagca caaacattcc aggttaattt ttaaaaagca 120 gtcaaaagtc caagtggccc ttggcagcat ttactctctc tgtttgctct ggttaataat 180 ctcaggagca caaacattcc 200 <210> 137 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; regulatory sequence <400> 137 aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60 ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120 tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180 cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240 tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300 ggtttaggta gtgtgagagg g 321 <210> 138 <211> 554 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; regulatory sequence <400> 138 aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60 ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120 tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180 cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240 tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300 ggtttaggta gtgtgagagg gtctagaagg ctcagaggca cacaggagtt tctgggctca 360 ccctgccccc ttccaacccc tcagttccca tcctccagca gctgtttgtg tgctgcctct 420 gaagtccaca ctgaacaaac ttcagcctac tcatgtccct aaaatgggca aacattgcaa 480 gcagcaaaca gcaaacacac agccctccct gcctgctgac cttggagctg gggcagaggt 540 cagagacctc tctg 554 <210> 139 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; regulatory sequence <400> 139 gatcttgcta ccagtggaac agccactaag gattctgcag tgagagcaga gggccagcta 60 agtggtactc tcccagagac tgtctgactc acgccacccc ctccaccttg gacacaggac 120 gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca 180 ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact 240 tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct 300 cccccgttgc ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc cctgtctcct 360 cagcttcagg caccaccact gacctgggac agt 393 <210> 140 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; regulatory sequence <400> 140 gatcttgcta ccagtggaac agccactaag gattctgcag tgagagcaga gggccagcta 60 agtggtactc tcccagagac tgtctgactc acgccacccc ctccaccttg gacacaggac 120 gctgtggttt ctgagccagg tacagtgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca 180 ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact 240 tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct 300 cccccgttgc ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc cctgtctcct 360 cagcttcagg caccaccact gacctgggac agt 393 <210> 141 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; regulatory sequence <400> 141 ccactacggg tttaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct 60 ggttataatt aacccagaca tgtggctgcc cccccccccc ccaacacctg ctgcctctaa 120 aaataaccct gtccctggtg gatc 144 <210> 142 <211> 288 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; regulatory sequence <400> 142 ccactacggg tttaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct 60 ggttataatt aacccagaca tgtggctgcc cccccccccc ccaacacctg ctgcctctaa 120 aaataaccct gtccctggtg gatcccacta cgggtttagg ctgcccatgt aaggaggcaa 180 ggcctgggga cacccgagat gcctggttat aattaaccca gacatgtggc tgcccccccc 240 ccccccaaca cctgctgcct ctaaaaataa ccctgtccct ggtggatc 288 <210> 143 <211> 432 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; regulatory sequence <400> 143 ccactacggg tttaggctgc ccatgtaagg aggcaaggcc tggggacacc cgagatgcct 60 ggttataatt aacccagaca tgtggctgcc cccccccccc ccaacacctg ctgcctctaa 120 aaataaccct gtccctggtg gatcccacta cgggtttagg ctgcccatgt aaggaggcaa 180 ggcctgggga cacccgagat gcctggttat aattaaccca gacatgtggc tgcccccccc 240 ccccccaaca cctgctgcct ctaaaaataa ccctgtccct ggtggatccc actacgggtt 300 taggctgccc atgtaaggag gcaaggcctg gggacacccg agatgcctgg ttataattaa 360 cccagacatg tggctgcccc cccccccccc aacacctgct gcctctaaaa ataaccctgt 420 ccctggtgga tc 432 <210> 144 <211> 199 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; regulatory sequence <400> 144 cccttcagat taaaaataac tgaggtaagg gcctgggtag gggaggtggt gtgagacgct 60 cctgtctctc ctctatctgc ccatcggccc tttggggagg aggaatgtgc ccaaggacta 120 aaaaaaggcc atggagccag aggggcgagg gcaacagacc tttcatgggc aaaccttggg 180 gccctgctga agctttggc 199 <210> 145 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; hinge <400> 145 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly 20 <210> 146 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; hinge <400> 146 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Leu 1 5 10 <210> 147 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; hinge <400> 147 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 148 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; hinge <400> 148 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 <210> 149 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; hinge <400> 149 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Leu Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 <210> 150 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; hinge <400> 150 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 20 25 <210> 151 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; hinge <400> 151 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Leu Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 20 25 <210> 152 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; hinge <400> 152 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu 20 <210> 153 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; hinge <400> 153 Cys Cys Pro Cys Pro Ala 1 5 <210> 154 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; hinge <400> 154 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 <210> 155 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; hinge <400> 155 Asp Lys Thr His Leu Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 <210> 156 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; hinge <400> 156 Asp Lys Thr His Leu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu 20 <210> 157 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; regulatory element <400> 157 gtaagtttag tctttttgtc ttttatttca ggtcccggat ccggtggtgg tgcaaatcaa 60 agaactgctc ctcagtggat gttgccttta cttctag 97 <210> 158 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; cleavage <400> 158 Leu Ser Pro Arg Gly Ser 1 5 <210> 159 <211> 663 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; promoter <400> 159 gacgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240 atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300 cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360 tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca 420 tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag 480 cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc 540 ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt 600 ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg 660 cgg 663 <210> 160 <211> 762 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; promoter <400> 160 gacgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240 atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300 cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360 tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac gttctgcttc actctcccca 420 tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat tttttaatta ttttgtgcag 480 cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc 540 ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt 600 ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg 660 cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc 720 cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag cg 762 <210> 161 <211> 935 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic construct; promoter <400> 161 gtcgacaaat tctgtcattt tactagggtg atgaaattcc caagcaacac catccttttc 60 agataagggc actgaggctg agagaggagc tgaaacctac ccggggtcac cacacacagg 120 tggcaaggct gggaccagaa accaggactg ttgactgcag cccggtattc attctttcca 180 tagcccacag ggctgtcaaa gaccccaggg cctagtcaga ggctcctcct tcctggagag 240 ttcctggcac agaagttgaa gctcagcaca gccccctaac ccccaactct ctctgcaagg 300 cctcaggggt cagaacactg gtggagcaga tcctttagcc tctggatttt agggccatgg 360 tagagggggt gttgccctaa attccagccc tggtctcagc ccaacaccct ccaagaagaa 420 attagagggg ccatggccag gctgtgctag ccgttgcttc tgagcagatt acaagaaggg 480 actaagacaa ggactccttt gtggaggtcc tggcttaggg agtcaagtga cggcggctca 540 gcactcacgt gggcagtgcc agcctctaag agtgggcagg ggcactggcc acagagtccc 600 agggagtccc accagcctag tcgccagatc tagagggccc cagaagcctg gtggttgttt 660 gtccttctca ggggaaaagt gaggcggccc cttggaggaa ggggccgggc agaagatcta 720 atcggattcc aagcagctca ggggattgtc tttttctagc accttcttgc cactcctaag 780 cgtcctccgt gaccccggct gggatttagc ctggtgctgt gtcagccccg ggctcccagg 840 ggcttcccag tggtccccag gaaccctcga cagggccagg gcgtctctct cgtccagcaa 900 gggcagggac gggccacagg ccaagggcct taagc 935

Claims (56)

  1. 비-감염성 포도막염(non-infectious uveitis)의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 비-감염성 포도막염을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서,
    (a) 안구 조직 세포에 대해 친화성(tropism)을 갖는 바이러스 캡시드; 및
    (b) AAV 내부 탠덤 반복부(ITR)가 측접된 발현 카세트를 포함하는 인공 게놈으로서, 상기 발현 카세트는 인간 안구 세포에서 전이유전자(transgene)의 발현을 제어하는 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된, 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 포함하는, 인공 게놈
    을 갖는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함하되,
    상기 AAV 벡터는 상기 인간 대상체에 대한 망막하, 유리체내, 비강내, 전방내, 맥락막위 또는 전신 투여를 위해 제형화되는, 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질은 면역글로불린 중쇄의 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 펩타이드 결합을 통해 공유 연결된 인간 TNFα 수용체 타입 I(TNFR1) 또는 타입 II(TNFR2)의 가용성, 세포외 부분을 포함하는, 약제학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 바이러스 캡시드는 AAV 혈청형 1(AAV1), 혈청형 2(AAV2), 혈청형 AAV2.7m8(AAV2.7m8), 혈청형 3(AAV3), 혈청형 3B(AAV3B), 혈청형 4(AAV4), 혈청형 5(AAV5), 혈청형 6(AAV6), 혈청형 7(AAV7), 혈청형 8(AAV8), 혈청형 rh8(AAVrh8), 혈청형 9(AAV9), 혈청형 9e(AAV9e), 혈청형 rh10(AAVrh10), 혈청형 rh20(AAVrh20), 혈청형 rh39(AAVrh39), 혈청형 hu.37(AAVhu.37), 혈청형 rh73(AAVrh73), 또는 혈청형 rh74(AAVrh74), 혈청형 hu51(AAV.hu51), 혈청형 hu21(AAV.hu21), 혈청형 hu12(AAV.hu12) 또는 혈청형 hu26(AAV.hu26)의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한, 약제학적 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 캡시드는 AAV8, AAV3B, AAV2.7m8, 또는 AAVrh73인, 약제학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안구 조직 세포는 각막 세포, 홍채 세포, 모양체 세포, 쉴렘관 세포(schlemm's canal cell), 섬유주대 세포, 망막 세포, RPE-맥락막 조직 세포 또는 시신경 세포인, 약제학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절 서열은 표 1 또는 표 1a로부터의 조절 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 조절 서열은 인간 로돕신 키나제(GRK1) 프로모터(서열번호 54 또는 117), 마우스 원추체 어레스틴(cone arresting)(CAR) 프로모터(서열번호 114 내지 116), 인간 레드 옵신(RedO) 프로모터(서열번호 112), CB 프로모터(서열번호 159), CBLong 프로모터(서열번호 160) 또는 Best1/GRK 프로모터(서열번호 161)인, 약제학적 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자는 상기 인간 안구 세포에서 분비 및 번역 후 변형을 유도하는 항-TNFα Fc 융합 단백질의 N-말단에서 신호 서열을 인코딩하는, 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 신호 서열은 MYRMQLLLLIALSLALVTNS(서열번호 62) 또는 표 2로부터의 신호 서열인, 약제학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 전이유전자는 N-말단에서 C-말단으로, 신호 서열 - 가용성 TNFR 세포외 도메인 - 힌지 영역 - Fc 도메인 - PolyA의 구조를 갖는, 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 전이유전자는 가용성 TNFR 세포외 도메인의 C-말단에 서열번호 8의 트롬빈 절단 부위를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TNFα Fc 융합 단백질은 이량체 융합 단백질로서 발현되는, 약제학적 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질은 에타너셉트(etanercept) 또는 EYS606인, 약제학적 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자는 서열번호 13 내지 18의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질은 서열번호 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 갖는, 약제학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질은 과글리코실화된 돌연변이체이거나, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질의 Fc 폴리펩타이드가 글리코실화 또는 비글리코실화된(aglycosylated), 약제학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 도메인은 IgG1-Fc 도메인인, 약제학적 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인공 게놈은 자가 상보적인, 약제학적 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인공 게놈은 작제물 CAG.에타너셉트(서열번호 15) 또는 mU1a.Vh4i.에타너셉트.scAAV(서열번호 17)인, 약제학적 조성물.
  20. 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함하는 조성물로서,
    a. AAV 혈청형 1(AAV1), 혈청형 2(AAV2), 혈청형 AAV2.7m8(AAV2.7m8), 혈청형 3(AAV3), 혈청형 3B(AAV3B), 혈청형 4(AAV4), 혈청형 5(AAV5), 혈청형 6(AAV6), 혈청형 7(AAV7), 혈청형 8(AAV8), 혈청형 rh8(AAVrh8), 혈청형 9(AAV9), 혈청형 9e(AAV9e), 혈청형 rh10(AAVrh10), 혈청형 rh20(AAVrh20), 혈청형 rh39(AAVrh39), 혈청형 hu.37(AAVhu.37), 혈청형 rh73(AAVrh73), 또는 혈청형 rh74(AAVrh74), 혈청형 hu51(AAV.hu51), 혈청형 hu21(AAV.hu21), 혈청형 hu12(AAV.hu12) 또는 혈청형 hu26(AAV.hu26)의 아미노산 서열과 선택적으로 적어도 95% 동일한 바이러스 AAV 캡시드,
    b. AAV 역 말단 반복부(ITR)가 측접된 발현 카세트를 포함하는 인공 게놈으로서, 상기 발현 카세트는 인간 안구 조직 세포에서 전이유전자의 발현을 촉진하는 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 면역글로불린 중쇄의 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 펩타이드 결합을 통해 공유 연결된 인간 가용성 TNFα 수용체 타입 I(TNFR1) 또는 타입 II(TNFR2) 세포외 도메인을 포함하는 항-TNF-α Fc 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 포함하는, 인공 게놈을 가지며,
    상기 전이유전자는 안구 조직 세포에서 상기 항-TNFα Fc 융합의 분비 및 번역 후 변형을 유도하는 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질의 N-말단에서 신호 서열을 인코딩하는, 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 전이유전자는 가용성 인간 TNFR 세포외 도메인의 C-말단에 서열번호 8의 트롬빈 절단 부위를 추가로 포함하는, 조성물.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질은 서열번호 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 갖는, 조성물.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질은 에타너셉트 또는 EYS606인, 조성물.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안구 조직 세포는 각막 세포, 홍채 세포, 모양체 세포, 쉴렘관 세포, 섬유주대 세포, 망막 세포, RPE-맥락막 조직 세포 또는 시신경 세포인, 조성물.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자는 서열번호 13 또는 14의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 조성물.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신호 서열은 MYRMQLLLLIALSLALVTNS(서열번호 62) 또는 표 2 또는 표 3으로부터의 신호 서열인, 조성물.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인공 게놈은 자가 상보적인, 조성물.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인공 게놈은 작제물 CAG.에타너셉트(서열번호 15 또는 16) 또는 mU1a.Vh4i.에타너셉트.scAAV(서열번호 17 또는 18)인, 조성물.
  29. 비-감염성 포도막염의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 비-감염성 포도막염을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게, 치료학적 유효량의, 안구 조직 세포에서 전이유전자의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 재조합 AAV를 포함하는 조성물을 망막하, 유리체내, 비강내, 전안방내, 맥락막위, 또는 전신으로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 비-감염성 포도막염의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에서 비-감염성 포도막염을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게, 치료적 유효량의, 인간 안구 조직 세포에서 전이유전자의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 항-TNFα Fc 융합 단백질의 인간 번역-후 변형된(HuPTM) 형태를 방출하는 데포(depot)가 형성되는, 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 재조합 뉴클레오타이드 발현 벡터를 망막하, 유리체내, 비강내, 전안방내, 맥락막위, 또는 전신으로 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제29항 및 제30항에 있어서, 상기 안구 조직 세포는 각막 세포, 홍채 세포, 모양체 세포, 쉴렘관 세포, 섬유주대 세포, 망막 세포, RPE-맥락막 조직 세포 또는 시신경 세포인, 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-TNF-α Fc 융합 단백질은 IgG Fc 도메인에 공유 연결된 인간 가용성 TNFα 수용체 타입 I(TNFR1) 또는 타입 II(TNFR2) 세포외 도메인을 포함하는, 방법.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자는 에타너셉트 또는 EYS606인, 방법.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자는 서열번호 13 내지 18의 뉴클레오타이드 서열을 갖는, 방법.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 캡시드는 AAV 혈청형 1(AAV1), 혈청형 2(AAV2), 혈청형 AAV2.7m8, 혈청형 3(AAV3), 혈청형 3B(AAV3B), 혈청형 4(AAV4), 혈청형 5(AAV5), 혈청형 6(AAV6), 혈청형 7(AAV7), 혈청형 8(AAV8), 혈청형 rh8(AAVrh8), 혈청형 9(AAV9), 혈청형 9e(AAV9e), 혈청형 rh10(AAVrh10), 혈청형 rh20(AAVrh20), 혈청형 rh39(AAVrh39), 혈청형 hu.37(AAVhu.37), 혈청형 rh73(AAVrh73), 또는 혈청형 rh74(AAVrh74), 혈청형 hu51(AAV.hu51), 혈청형 hu21(AAV.hu21), 혈청형 hu12(AAV.hu12) 또는 혈청형 hu26(AAV.hu26)의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한, 방법.
  36. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 캡시드는 AAV8, AAV2.7m8, AAV3B, 또는 AAVrh73인, 방법.
  37. 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절 서열은 표 1 또는 표 1a로부터의 조절 서열을 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 조절 서열은 인간 로돕신 키나제(GRK1) 프로모터(서열번호 54 또는 117), 마우스 원추체 어레스틴(CAR) 프로모터(서열번호 114 내지 116), 또는 인간 레드 옵신(RedO) 프로모터(서열번호 112)인, 방법.
  39. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자는 상기 인간 안구 조직 세포에서 분비 및 번역 후 변형을 유도하는 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질의 N-말단에서 신호 서열을 인코딩하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 신호 서열은 MYRMQLLLLIALSLALVTNS(서열번호 62) 또는 표 2 또는 표 3으로부터의 신호 서열인, 방법.
  41. 제25항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 전이유전자는 신호 서열 - 9인간 가용성 TNFR 세포외 도메인(타입 1 또는 타입 2) - 힌지 영역 - Fc 도메인 - PolyA의 구조를 갖는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 전이유전자는 상기 인간 가용성 TNFR 세포외 도메인의 C-말단에 서열번호 8을 갖는 트롬빈 절단 부위를 추가로 포함하는, 방법.
  43. 제29항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질은 과글리코실화된 돌연변이체이거나, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질의 상기 Fc 도메인은 글리코실화 또는 비글리코실화된, 방법.
  44. 제29항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TNFα Fc 융합 단백질은 알파 2,6-시알화된 글리칸을 함유하는, 방법.
  45. 제29항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TNFα Fc 융합 단백질은 글리코실화되지만 검출 가능한 NeuGc 및/또는 α-Gal을 함유하지 않는, 방법.
  46. 제29항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TNFα Fc 융합 단백질이 티로신 설페이트화를 함유하는, 방법.
  47. 제29항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질의 상기 HuPTM 형태의 생산이 상기 재조합 뉴클레오타이드 발현 벡터로 배양물에서의 인간 안구 세포를 형질도입하고 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질을 발현시킴으로써 확인되는, 방법.
  48. 제29항 또는 제47항에 있어서, 치료적 유효량은 2 ETDRS 라인 이상만큼 최상의 교정 시력(BCVA)을 개선시키거나 logMAR을 증가시키고/시키거나, SUN 분류에 따른 전방 또는 후방의 염증 활성을 감소시키고/시키거나, 유리체 헤이즈(vitreous haze) 등급을 감소시키기에 충분하도록 결정되는, 방법.
  49. 제29항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 rAAV는 자가-상보성인, 방법.
  50. 제29항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자는 상기 작제물 CAG.에타너셉트 또는 mU1a.Vh4i.에타너셉트.scAAV 내에 있는, 방법.
  51. 재조합 AAV를 생산하는 방법으로서,
    (c) 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 숙주 세포는
    (i) AAV ITR이 측접된 시스 발현 카세트를 포함하는 인공 게놈으로서, 상기 시스 발현 카세트는 항-TNFα Fc 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 포함하며, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질은 인간 안구 조직 세포에서 전이유전자의 발현을 촉진하는 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된, 면역글로불린 중쇄의 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 펩타이드 결합을 통해 공유 연결된 인간 TNFα 수용체 타입 I(TNFR1) 또는 타입 II(TNFR2)의 가용성, 세포외 부분을 포함하는, 상기 인공 게놈;
    (ii) AAV ITR이 결여된 트랜스 발현 카세트로서, 상기 트랜스 발현 카세트는 배양물에서 숙주 세포에서 AAV rep 및 AAV 캡시드 단백질의 발현을 구동하고 상기 AAV rep 및 상기 AAV 캡시드 단백질을 트랜스로 공급하는 발현 제어 요소에 작동 가능하게 연결된 AAV rep 및 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하며, 상기 캡시드는 안구 조직 친화성을 갖는, 상기 트랜스 발현 카세트;
    (iii) AAV 캡시드 단백질에 의한 인공 게놈의 복제 및 패키징을 허용하기에 충분한 아데노바이러스 헬퍼 기능을 함유하는, 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (d) 상기 세포 배양물로부터 상기 인공 게놈을 캡시드화하는 재조합 AAV를 회수하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 안구 조직 세포는 각막 세포, 홍채 세포, 모양체 세포, 쉴렘관 세포, 섬유주대 세포, 망막 세포, RPE-맥락막 조직 세포 또는 시신경 세포인, 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 전이유전자는 에타너셉트 또는 EYS606을 인코딩하며, 상기 AAV 캡시드 단백질은 실시형태 1의 상기 rAAV 캡시드 단백질이며, 상기 캡시드 단백질은 AAV 혈청형 1(AAV1), AAV 혈청형 2(AAV2), 혈청형 2.7m8, 혈청형 3(AAV3), 혈청형 3B(AAV3B), 혈청형 4(AAV4), 혈청형 5(AAV5), 혈청형 6(AAV6), 혈청형 7(AAV7), 혈청형 8(AAV8), 혈청형 rh8(AAVrh8), 혈청형 9(AAV9), 혈청형 9e(AAV9e), 혈청형 rh10(AAVrh10), 혈청형 rh20(AAVrh20), 혈청형 rh39(AAVrh39), 혈청형 hu.37(AAVhu.37), 혈청형 rh73(AAVrh73), 또는 혈청형 rh74(AAVrh74), 혈청형 hu51(AAV.hu51), 혈청형 hu21(AAV.hu21), 혈청형 hu12(AAV.hu12) 또는 혈청형 hu26(AAV.hu26)의 적어도 하나의 AAV 혈청형으로부터 유래된 것인, 방법.
  54. 숙주 세포로서,
    d. AAV ITR이 측접된 시스 발현 카세트를 포함하는 인공 게놈으로서, 상기 시스 발현 카세트는 항-TNFα 융합 단백질을 인코딩하는 전이유전자를 포함하며, 상기 항-TNFα Fc 융합 단백질은 인간 안구 조직 세포에서 상기 전이유전자의 발현을 촉진하는 하나 이상의 조절 서열에 작동 가능하게 연결된, 면역글로불린 중쇄의 Fc 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 펩타이드 결합을 통해 공유 연결된 인간 TNFα 수용체 타입 I(TNFR1) 또는 타입 II(TNFR2)의 가용성, 세포외 부분을 포함하는, 상기 인공 게놈;
    e. AAV ITR이 결여된 트랜스 발현 카세트로서, 상기 트랜스 발현 카세트는 배양물에서 상기 숙주 세포에서 상기 AAV rep 및 상기 AAV 캡시드 단백질의 발현을 구동하고 상기 AAV rep 및 상기 AAV 캡시드 단백질을 트랜스로 공급하는 발현 제어 요소에 작동 가능하게 연결된 AAV rep 및 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하며, 상기 캡시드는 안구 조직 친화성을 갖는, 상기 트랜스 발현 카세트;
    f. 상기 AAV 캡시드 단백질에 의한 상기 인공 게놈의 복제 및 패키징을 허용하기에 충분한 아데노바이러스 헬퍼 기능
    을 포함하는, 숙주 세포.
  55. 제54항에 있어서, 상기 전이유전자는 에타너셉트 또는 EYS606을 인코딩하는, 숙주 세포.
  56. 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 AAV 캡시드 단백질은 AAV 혈청형 1(AAV1), 혈청형 2(AAV2), 혈청형 2.7m8(AAV2.7m8), 혈청형 3(AAV3), 혈청형 3B(AAV3B), 혈청형 4(AAV4), 혈청형 5(AAV5), 혈청형 6(AAV6), 혈청형 7(AAV7), 혈청형 8(AAV8), 혈청형 rh8(AAVrh8), 혈청형 9(AAV9), 혈청형 9e(AAV9e), 혈청형 rh10(AAVrh10), 혈청형 rh20(AAVrh20), 혈청형 rh39(AAVrh39), 혈청형 hu.37(AAVhu.37), 혈청형 rh73(AAVrh73) 또는 혈청형 rh74(AAVrh74), 혈청형 hu51 (AAV.hu51), 혈청형 hu21 (AAV.hu21), 혈청형 hu12 (AAV.hu12) 또는 혈청형 hu26 (AAV.hu26)인, 숙주 세포.
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