JP2023548145A - 眼の適応症に対するベクター化ｔｎｆ－アルファアンタゴニスト - Google Patents

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Abstract

完全にヒト翻訳後修飾された治療用ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合物の送達のための方法及び組成物を提供する。完全にヒトの翻訳後修飾された治療用ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合物は、遺伝子療法によって、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターとして、適切な組織に送達され得る。また、完全にヒト翻訳後修飾された治療用ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合物で、非感染性ブドウ膜炎などの眼の適応症を治療する方法も提供される。【選択図】なし

Description

１，序文
非感染性ブドウ膜炎と診断されたヒト対象への、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）に結合する完全にヒト翻訳後修飾された（ＨｕＰＴＭ）治療用腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）融合タンパク質の送達のための組成物及び方法を記載する。
２．背景技術
治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質は、いくつかの疾患及び状態の治療に有効であることが示されている。しかしながら、これらの薬剤は短期間のみ有効であるため、長期間にわたる反復注射が必要であることが多く、それによって患者にかなりの治療負担が生じる。
ブドウ膜炎は、ブドウ膜の炎症を特徴とする不均一な疾患の群を含む。ブドウ膜炎は、一般に、炎症の病因によって、全身性疾患に関連している可能性がある、または関連していない、感染性または非感染性（自己免疫障害）として分類され得る。加えて、ブドウ膜炎は、解剖学的に前部、中間、後部または全ブドウ膜炎に分類され得、急性、慢性または再発性の経過を有する可能性がある。臨床症状は可変的であり、症状には、かすみ目、光恐怖症、眼の痛み及び著しい視覚障害が含まれ得る（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０２０；１１：６５５）。
非感染性ブドウ膜炎は、ブドウ膜（虹彩、毛様体、及び脈絡膜）の炎症を特徴とする、重篤で視力を脅かす眼内炎症性状態である。非感染性ブドウ膜炎は、眼の抗原に対する免疫媒介性応答から生じると考えられており、先進国の労働年齢人口における不可逆的失明の主な原因である。ブドウ膜炎治療の目的は、炎症を制御し、再発を防ぎ、視力を維持し、薬物の有害作用を最小限に抑えることである。現在、非感染性ブドウ膜炎の標準治療には、第１選択薬としてのコルチコステロイドの投与が含まれるが、場合によってはより積極的な療法が必要である。これには、代謝拮抗剤（メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、及びアザチオプリン）、カルシニューリン阻害剤（シクロスポリン、タクロリムス）、及びアルキル化剤（シクロホスファミド、クロラムブシル）などの合成免疫抑制剤が含まれる。コルチコステロイド及び従来の免疫抑制治療に不耐性または不応性になる患者において、生物学的薬剤は、疾患発症に関与する関連免疫学的経路を標的とすることに基づいて、小児及び成人のブドウ膜炎における有効な療法として生じている。現在の免疫調節療法には、インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、及びセルトリズマブ－ペゴールなどのｍＡｂ、またはＴＮＦ受容体融合タンパク質、エタネルセプトで達成されるＴＮＦαの阻害が含まれる。この点に関して、抗ＴＮＦ薬（インフリキシマブ及びアダリムマブ）は、良好な転帰の点で最も強い結果を示している。アダリムマブは、隔週の皮下投与による非感染性ブドウ膜炎の治療のために承認されている。従来の免疫抑制治療及び／または抗ＴＮＦ－α療法が失敗する場合、他の生物学的薬剤が推奨される。
ＥＹＳ６０６は、ＴＮＦα ｐ５５受容体１（ＴＮＦＲ１）をＩｇＧ１免疫グロブリン分子のＦｃ部分に連結する組換え融合タンパク質をコードする。ＥＹＳ６０６は現在、非感染性の後部、中間または全ブドウ膜炎の治療のための非ウイルス性遺伝子療法として調査中である。ＥＹＳ６０６は、患者の毛様体筋内で電気移動によって投与される。
エタネルセプトは、ＩｇＧ１免疫グロブリン分子（ＴＮＦＲ：Ｆｃ）のＦｃ部分に融合したヒトｐ７５ ＴＮＦα受容体（ＴＮＦＲ２）の２つの細胞外ドメインからなる二量体融合タンパク質であり、関節リウマチ、クローン病、及び乾癬性関節炎を含むいくつかの自己免疫性炎症性疾患の治療に使用することができる。エタネルセプトは、週１回５０ｍｇまたは週２回２５ｍｇの用量で皮下投与される（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０２０；１１：６５５。）。
非感染性ブドウ膜炎に罹患している患者の治療負担を低減する、より効果的な治療が必要とされている。硝子体内投薬は、標的組織に大量の薬物を提供し、全身毒性のリスクを排除するため、ブドウ膜炎患者における有望な薬物投与モードとなっている。定期的な眼投与の必要性を低減または排除することは、患者の負担を低減し、療法を改善するであろう。
３．発明の概要
遺伝子療法によって送達される生物学的阻害剤は、経時的に消散し、ピーク及びトラフレベルをもたらす注射または注入された治療用生物学的阻害剤に比べていくつかの利点を有する。導入遺伝子産物の生物学的阻害剤の持続的な発現は、生物学的阻害剤を繰り返し注射するのとは対照的に、より一貫したレベルの生物学的阻害剤が作用部位に存在することを可能にし、より少ない注射を行う必要があるため、患者にとってリスクがより低く、より便利である。さらに、導入遺伝子から発現される生物学的阻害剤は、翻訳中及び翻訳後に存在する異なる微小環境のために直接注射されるものとは異なる様式で翻訳後修飾される。いずれの特定の理論によっても拘束されないが、これは、作用部位に送達される抗体が、直接注射された生物学的製剤と比較して「バイオベター」であるように、異なる拡散、生物活性、分布、親和性、薬物動態、及び免疫原性特性を有する生物学的阻害剤をもたらす。肝臓のデポーから発現するような全身投与、または加えて、眼組織への治療薬の局所送達は、治療薬への対象の曝露を低減し、潜在的な有害作用のリスクを低減し得る。したがって、眼を標的とし、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質（ＴＮＦＲ：Ｆｃ）、特にエタネルセプト（ＴＮＦＲ２：Ｆｃ）及びＥＹＳ６０６（ＴＮＦＲ１：Ｆｃ）の発現のための導入遺伝子のデポーを生成するように設計された、ｒＡＡＶ組成物の投与の２０日、３０日、４０日、５０日、６０日、または９０日以内に眼における生物学的阻害剤の治療有効レベルまたは予防レベルをもたらす、抗ＴＮＦα遺伝子療法、特に組換ＡＡＶ遺伝子療法のための組成物及び方法を本明細書に提供する。
非感染性ブドウ膜炎または治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質による治療のために示される他の状態と診断された患者（ヒト対象）への抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の全身送達のための組成物及び方法を記載する。送達は、有利には、遺伝子療法を介して、例えば、治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードするウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現コンストラクトを、治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質での治療のために指示された状態と診断された対象に投与して、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質、例えば、ヒトグリコシル化導入遺伝子産物を、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質がその治療または予防効果を発揮する対象の適切な眼組織に（循環循環によるものを含めて）継続的に供給する患者の眼内、または代替実施形態では、肝臓及び／または筋肉に、恒久的デポーを作製することによって達成することができる。
導入遺伝子を送達するために使用される組換えベクターは、非複製組換えアデノ随伴ウイルスベクター（「ｒＡＡＶ」）を含む。実施形態では、ＡＡＶ型は、眼に対する向性、例えば、ＡＡＶのＡＡＶ８亜型、ＡＡＶ３Ｂ亜型、ＡＡＶ２．７ｍ８、またはＡＡＶのＡＡＶｒｈ７３亜型を有する。しかしながら、レンチウイルスベクター；ワクシニアウイルスベクター、または「ネイキッドＤＮＡ」コンストラクトと称される非ウイルス発現ベクターを含むがこれらに限定されない他のウイルスベクターを使用してもよい。導入遺伝子の発現は、構成的または組織特異的発現制御エレメント、特に眼組織特異的制御エレメントであるエレメント、例えば、表１または代替的に表１ａの１つ以上のエレメントによって制御され得る。コンストラクトはまた、発現した抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の分泌を指向するシグナルまたはリーダーペプチド、例えば、表２、または表３もしくは４のペプチドを含み得る。
ある特定の実施形態では、導入遺伝子によってコードされるＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＮＦα、特にエタネルセプト（もしくはその任意の後発生物製剤）またはＥＹＳ６０６に結合するＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質を含むことができるが、これらに限定されず、例えば、図２Ａ及び２Ｂを参照されたい。
治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の遺伝子療法コンストラクトは、Ｆｃ部分に融合した可溶性ＴＮＦＲ（ＴＮＦＲ１またはＴＮＦＲ２）が二量体融合タンパク質（配列番号１０及び１２）として発現されるように設計される。
加えて、インビボで導入遺伝子から発現される抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質は、タンパク質凝集及びタンパク質酸化などの組換え技術によって産生される生物学的製剤と関連する分解産物を含有する可能性は低い。凝集は、高タンパク質濃度、製造装置及び容器との表面相互作用、ならびにある特定の緩衝系での精製に起因するタンパク質の産生及び貯蔵と関連する問題である。凝集を促進するこれらの状態は、遺伝子療法における導入遺伝子発現において存在しない。メチオニン、トリプトファン、及びヒスチジン酸化などの酸化は、タンパク質の産生及び貯蔵とも関連しており、ストレス性細胞培養条件、金属及び空気接触、ならびに緩衝液及び賦形剤中の不純物によって引き起こされる。インビボで導入遺伝子から発現したタンパク質は、ストレス状態で酸化することもある。しかしながら、ヒト及び他の多くの生物には、抗酸化防御システムが備わっており、酸化ストレスを低減するだけでなく、酸化を修復及び／または逆転させることもある。したがって、インビボで産生されたタンパク質は、酸化形態である可能性が低い。凝集及び酸化の両方が、効力、薬物動態（クリアランス）、及び免疫原性に影響を与える可能性がある。
ヒト対象の眼におけるＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の産生は、例えば、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα融合タンパク質をコードするウイルスベクター、または他のＤＮＡ発現コンストラクトを、そのＦｃ融合タンパク質の疾患適応症と診断された患者（ヒト対象）に投与して、対象の形質導入細胞によって産生されるヒトグリコシル化された硫酸化導入遺伝子産物を継続的に供給する恒久的なデポーを対象において作製することによって、遺伝子療法を介して達成される疾患の治療のための「バイオベター」分子をもたらすべきである。ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のｃＤＮＡコンストラクトは、形質導入されたヒト細胞による適切な共翻訳及び翻訳後の処理（グリコシル化及びタンパク質硫酸化）を確実にするシグナルペプチドを含むべきである。
遺伝子療法の代替または追加の治療として、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質は、組換えＤＮＡ技術によってヒト細胞株で産生され得、糖タンパク質は、患者に投与され得る。
他の利用可能な治療の投与を伴う患者へのＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα融合タンパク質の全身送達を伴う併用療法は、本明細書に提供する方法に包含される。追加の治療は、遺伝子療法治療の前、同時、または後に施されてもよい。かかる追加の治療には、治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質または抗ＴＮＦα ｍＡｂとの併用療法が含まれ得るが、これらに限定されない。
ウイルスベクター、特にＡＡＶベースのウイルスベクターを製造する方法もまた提供される。特定の実施形態では、組換えＡＡＶを産生する方法であって、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接するシス発現カセット（シス発現カセットは、ヒト細胞における導入遺伝子の発現を制御する発現制御エレメントに作動可能に連結した治療用抗体をコードする導入遺伝子を含む）、ＡＡＶ ＩＴＲを欠くトランス発現カセット（トランス発現カセットは、培養物中の宿主細胞におけるＡＡＶ ｒｅｐ及びキャプシドタンパク質の発現を駆動し、ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質をトランスで供給する発現制御エレメントに作動可能に連結したＡＡＶ ｒｅｐ及びキャプシドタンパク質をコードする）、ＡＡＶキャプシドタンパク質による人工ゲノムの複製及びパッケージングを可能にするために十分なアデノウイルスヘルパー機能を含む人工ゲノムを含有する宿主細胞を培養することと、人工ゲノムをキャプシド形成する組換えＡＡＶを細胞培養物から回収することと、を含む、上記方法を提供する。
光受容体特異的プロモーターまたは他の好適なプロモーター（ＣＡＧプロモーター、Ｂｅｓｔ１／ＧＲＫプロモーター（または表１もしくは表１ａに提供される他のプロモーター）を含む）ならびに導入遺伝子、例えば、抗ＴＮＦα治療用Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト及びＥＹＳ６０６を含む）の可溶性ＴＮＦＲ（ＴＮＦＲ１またはＴＮＦＲ２）及びＦｃドメイン（ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む）を発現するコドン最適化及びＣｐＧ枯渇導入遺伝子を含有する最適化発現カセットを含むｒＡＡＶベクターを含む、組成物が提供される。投与及び製造方法もまた提供される。特に、コンストラクトＣＡＧ．エタネルセプトまたはＵ１ａ．Ｖｈ４ｉ．エタネルセプト．ｓｃＡＡＶを含むｒＡＡＶを含む組成物及び方法が提供される（表７を参照されたい）。
ヒト対象への投与に好適な薬学的組成物には、生理学的に適合性の水性緩衝液、界面活性剤及び任意選択の賦形剤を含む、製剤緩衝液中の組換えベクターの懸濁液が含まれる。
３．１ 例示的な実施形態
１．非感染性ブドウ膜炎の治療を必要とするヒト対象においてそれを行うための薬学的組成物であって、
（ａ）眼組織細胞に対して向性を有するウイルスキャプシドと、
（ｂ）ＡＡＶ内部タンデムリピート（ＩＴＲ）に隣接する発現カセットを含む人工ゲノムであって、前記発現カセットが、ヒト眼細胞における導入遺伝子の発現を制御する１つ以上の調節配列に作動可能に連結した抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含む、前記人工ゲノムと、を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含み、
前記ＡＡＶベクターが、前記ヒト対象への網膜下、硝子体内、鼻腔内、前房内、脈絡膜上、または全身投与のために製剤化される、前記薬学的組成物。
２．前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインを含むポリペプチドにペプチド結合を通じて共有結合した、ヒトＴＮＦα受容体Ｉ型（ＴＮＦＲ１）またはＩＩ型（ＴＮＦＲ２）の可溶性細胞外部分を含む、パラグラフ１に記載の薬学的組成物。
３．前記ウイルスキャプシドが、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、血清型２（ＡＡＶ２）、血清型ＡＡＶ２．７ｍ８（ＡＡＶ２．７ｍ８）、血清型３（ＡＡＶ３）、血清型３Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ）、血清型４（ＡＡＶ４）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）、血清型７（ＡＡＶ７）、血清型８（ＡＡＶ８）、血清型ｒｈ８（ＡＡＶｒｈ８）、血清型９（ＡＡＶ９）、血清型９ｅ（ＡＡＶ９ｅ）、血清型ｒｈ１０（ＡＡＶｒｈ１０）、血清型ｒｈ２０（ＡＡＶｒｈ２０）、血清型ｒｈ３９（ＡＡＶｒｈ３９）、血清型ｈｕ．３７（ＡＡＶｈｕ．３７）、血清型ｒｈ７３（ＡＡＶｒｈ７３）、血清型ｒｈ７４（ＡＡＶｒｈ７４）、血清型ｈｕ５１（ＡＡＶ．ｈｕ５１）、血清型ｈｕ２１（ＡＡＶ．ｈｕ２１）、血清型ｈｕ１２（ＡＡＶ．ｈｕ１２）、または血清型ｈｕ２６（ＡＡＶ．ｈｕ２６）のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、パラグラフ１または２に記載の薬学的組成物。
４．前記ＡＡＶキャプシドが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ２．７ｍ８、またはＡＡＶｒｈ７３である、パラグラフ１～３のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
５．前記眼組織細胞が、角膜細胞、虹彩細胞、毛様体細胞、シュレム管細胞、線維柱帯細胞、網膜細胞、ＲＰＥ脈絡膜組織細胞、または視神経細胞である、パラグラフ１～４のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
６．前記調節配列が、表１または１ｂからの調節配列を含む、パラグラフ１～５のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
７．前記調節配列が、ヒトロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）プロモーター（配列番号５４もしくは１１７）、マウス錐体アレスチン（ＣＡＲ）プロモーター（配列番号１１４～１１６）、ヒト赤オプシン（ＲｅｄＯ）プロモーター（配列番号１１２）、ＣＢプロモーター（配列番号１５９）、ＣＢロングプロモーター（配列番号１６０）、またはＢｅｓｔ１／ＧＲＫプロモーター（配列番号１６１）である、パラグラフ５に記載の薬学的組成物。
８．前記導入遺伝子が、前記ヒト眼細胞における分泌及び翻訳後修飾を指向する、前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のＮ末端におけるシグナル配列をコードする、パラグラフ１～７のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
９．前記シグナル配列が、ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号６２）または表２、３または４からのシグナル配列である、パラグラフ８に記載の薬学的組成物。
１０．前記導入遺伝子が、前記Ｎ末端からＣ末端までの構造：シグナル配列－可溶性ＴＮＦＲ細胞外ドメイン－ヒンジ領域－Ｆｃドメイン－ポリＡを有する、パラグラフ１～８のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
１１．前記導入遺伝子が、前記可溶性ＴＮＦＲ細胞外ドメインの前記Ｃ末端に、配列番号８のトロンビン切断部位をさらに含む、パラグラフ１０に記載の組成物。
１２．抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、二量体融合タンパク質として発現される、パラグラフ１～１１のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
１３．前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、エタネルセプトまたはＥＹＳ６０６である、パラグラフ１～１２のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
１４．前記導入遺伝子が、配列番号１５～１８のヌクレオチド配列を含む、パラグラフ１～１３のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
１５．前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１０または１２のアミノ酸配列を有する、パラグラフ１～１４のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
１６．前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、高グリコシル化変異体であるか、または前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のＦｃポリペプチドが、グリコシル化または非グリコシル化される、パラグラフ１～１５のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
１７．前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１－Ｆｃドメインである、パラグラフ１～１６のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
１８．前記人工ゲノムが、自己相補的である、パラグラフ１～１７のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
１９．前記人工ゲノムが、コンストラクトＣＡＧ．エタネルセプト（配列番号１５もしくは１６）またはｍＵ１ａ．Ｖｈ４ｉ．エタネルセプト．ｓｃＡＡＶ（配列番号１７もしくは１８）である、パラグラフ１～１８のいずれか１つに記載の薬学的組成物。
２０．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む組成物であって、
ａ．任意選択で、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、血清型２（ＡＡＶ２）、血清型ＡＡＶ２．７ｍ８（ＡＡＶ２．７ｍ８）、血清型３（ＡＡＶ３）、血清型３Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ）、血清型４（ＡＡＶ４）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）、血清型７（ＡＡＶ７）、血清型８（ＡＡＶ８）、血清型ｒｈ８（ＡＡＶｒｈ８）、血清型９（ＡＡＶ９）、血清型９ｅ（ＡＡＶ９ｅ）、血清型ｒｈ１０（ＡＡＶｒｈ１０）、血清型ｒｈ２０（ＡＡＶｒｈ２０）、血清型ｒｈ３９（ＡＡＶｒｈ３９）、血清型ｈｕ．３７（ＡＡＶｈｕ．３７）、血清型ｒｈ７３（ＡＡＶｒｈ７３）、血清型ｒｈ７４（ＡＡＶｒｈ７４）、血清型ｈｕ５１（ＡＡＶ．ｈｕ５１）、血清型ｈｕ２１（ＡＡＶ．ｈｕ２１）、血清型ｈｕ１２（ＡＡＶ．ｈｕ１２）、または血清型ｈｕ２６（ＡＡＶ．ｈｕ２６）のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、ウイルスＡＡＶキャプシドと、
ｂ．ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する発現カセットを含む人工ゲノムであって、前記発現カセットが、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインを含むポリペプチドにペプチド結合を通じて共有結合されるヒト可溶性ＴＮＦα受容体Ｉ型（ＴＮＦＲ１）またはＩＩ型（ＴＮＦＲ２）細胞外ドメインを含み、ヒト眼組織細胞における導入遺伝子の発現を促進する１つ以上の調節配列に作動可能に連結した抗ＴＮＦ－α Ｆｃ融合タンパク質をコードする前記導入遺伝子を含む、前記人工ゲノムと、を有し、
前記導入遺伝子が、眼組織細胞における前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合の分泌及び翻訳後修飾を指向する前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のＮ末端におけるシグナル配列をコードする、前記組成物。
２１．前記導入遺伝子が、可溶性ヒトＴＮＦＲ細胞外ドメインのＣ末端に、配列番号８のトロンビン切断部位をさらに含む、パラグラフ２０に記載の組成物。
２２．前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１０または１２のアミノ酸配列を有する、パラグラフ２０または２１に記載の組成物。
２３．前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、エタネルセプトまたはＥＹＳ６０６である、パラグラフ２０～２２のいずれか１つに記載の組成物。
２４．前記眼組織細胞が、角膜細胞、虹彩細胞、毛様体細胞、シュレム管細胞、線維柱帯細胞、網膜細胞、ＲＰＥ脈絡膜組織細胞、または視神経細胞である、パラグラフ２０～２３のいずれか１つに記載の組成物。
２５．前記導入遺伝子が、配列番号１３または１４のヌクレオチド配列を含む、パラグラフ２０～２４のいずれか１つに記載の組成物。
２６．前記シグナル配列が、ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号６２）または表２、３もしくは４からのシグナル配列である、パラグラフ２０～２５のいずれか１つに記載の組成物。
２７．前記人工ゲノムが、自己相補的である、パラグラフ２０～２６のいずれか１つに記載の組成物。
２８．前記人工ゲノムが、コンストラクトＣＡＧ．エタネルセプト（配列番号１５）またはｍＵ１ａ．Ｖｈ４ｉ．エタネルセプト．ｓｃＡＡＶ（配列番号１７）である、パラグラフ２０～２７のいずれか１つに記載の組成物。
治療方法
２９．非感染性ブドウ膜炎の治療を必要とするヒト対象においてそれを行う方法であって、眼組織細胞における導入遺伝子の発現を制御する１つ以上の調節配列に作動可能に連結した抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする前記導入遺伝子を含む組換えＡＡＶを含む、治療有効量の組成物を、前記対象に網膜下、硝子体内、鼻腔内、前房内、脈絡膜上、または全身的に投与することを含む、前記方法。
３０．非感染性ブドウ膜炎の治療を必要するヒト対象においてそれを行う方法であって、ヒト眼組織細胞における導入遺伝子の発現を制御する１つ以上の調節配列に作動可能に連結した抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含む、治療有効量の組換えヌクレオチド発現ベクターを、前記対象に網膜下、硝子体内、鼻腔内、前房内、脈絡膜上、または全身的に投与することを含み、それにより、ヒト翻訳後修飾（ＨｕＰＴＭ）形態の抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質を放出するデポーが形成される、前記方法。
３１．前記眼組織細胞が、角膜細胞、虹彩細胞、毛様体細胞、シュレム管細胞、線維柱帯細胞、網膜細胞、ＲＰＥ脈絡膜組織細胞、または視神経細胞である、パラグラフ２９及び３０に記載の方法。
３２．前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、ＩｇＧ Ｆｃドメインに共有結合した、ヒト可溶性ＴＮＦα受容体Ｉ型（ＴＮＦＲ１）またはＩＩ型（ＴＮＦＲ２）細胞外ドメインを含む、パラグラフ２９～３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．前記導入遺伝子が、エタネルセプトまたはＥＹＳ６０６である、パラグラフ２９～３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．前記導入遺伝子が、配列番号１５～１７のヌクレオチド配列を有する、パラグラフ２９～３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．前記組換えヌクレオチド発現ベクターが、ウイルスキャプシドを有するｒＡＡＶ中にパッケージングされ、前記ウイルスキャプシドが、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、血清型２（ＡＡＶ２）、血清型ＡＡＶ２．７ｍ８、血清型３（ＡＡＶ３）、血清型３Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ）、血清型４（ＡＡＶ４）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）、血清型７（ＡＡＶ７）、血清型８（ＡＡＶ８）、血清型ｒｈ８（ＡＡＶｒｈ８）、血清型９（ＡＡＶ９）、血清型９ｅ（ＡＡＶ９ｅ）、血清型ｒｈ１０（ＡＡＶｒｈ１０）、血清型ｒｈ２０（ＡＡＶｒｈ２０）、血清型ｒｈ３９（ＡＡＶｒｈ３９）、血清型ｈｕ．３７（ＡＡＶｈｕ．３７）、血清型ｒｈ７３（ＡＡＶｒｈ７３）、または血清型ｒｈ７４（ＡＡＶｒｈ７４）、血清型ｈｕ５１（ＡＡＶ．ｈｕ５１）、血清型ｈｕ２１（ＡＡＶ．ｈｕ２１）、血清型ｈｕ１２（ＡＡＶ．ｈｕ１２）、または血清型ｈｕ２６（ＡＡＶ．ｈｕ２６）のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、パラグラフ２９～３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．前記ＡＡＶキャプシドが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ３Ｂ、またはＡＡＶｒｈ７３である、パラグラフ２９、３１～３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．前記調節配列が、表１または１ａからの調節配列を含む、パラグラフ２９～３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．前記調節配列が、ヒトロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）プロモーター（配列番号５４もしくは１１７）、マウス錐体アレスチン（ＣＡＲ）プロモーター（配列番号１１４～１１６）、ヒト赤オプシン（ＲｅｄＯ）プロモーター（配列番号１１２）、ＣＢプロモーター（配列番号１５９）、ＣＢロングプロモーター（配列番号１６０）、またはＢｅｓｔ１／ＧＲＫプロモーター（配列番号１６１）である、パラグラフ３７に記載の方法。
３９．前記導入遺伝子が、前記ヒト眼組織細胞における分泌及び翻訳後修飾を指向する、前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の前記Ｎ末端におけるシグナル配列をコードする、パラグラフ２９～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．前記シグナル配列が、ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号６２）または表２、３もしくは４からのシグナル配列である、パラグラフ３９に記載の方法。
４１．導入遺伝子が、以下の構造：シグナル配列－９ヒト可溶性ＴＮＦＲ細胞外ドメイン（１型または２型）－ヒンジ領域－Ｆｃドメイン－ポリＡを有する、パラグラフ２５～４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．前記導入遺伝子が、前記ヒト可溶性ＴＮＦＲ細胞外ドメインの前記Ｃ末端に、配列番号８を有するトロンビン切断部位をさらに含む、パラグラフ４１に記載の方法。
４３．前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、高グリコシル化変異体であるか、または前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の前記Ｆｃドメインが、グリコシル化または非グリコシル化される、パラグラフ２９～４２のいずれか１つに記載の方法。
４４．前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、アルファ２，６－シアリル化グリカンを含有する、パラグラフ２９～４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、グリコシル化されるが、検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα－Ｇａｌを含有しない、パラグラフ２９～４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、チロシン硫酸化を含有する、パラグラフ２９～４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の前記ＨｕＰＴＭ形態の産生が、前記組換えヌクレオチド発現ベクターを培養物中のヒト眼細胞へ形質導入し、前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質を発現することによって確認される、パラグラフ２９～４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．前記治療有効量が、２つ以上のＥＴＤＲＳ株によって最良の矯正視力（ＢＣＶＡ）を改善するか、またはｌｏｇＭＡＲの増加、ＳＵＮ分類による前房及び後房の炎症活性の低減、及び／または硝子体混濁のグレードの低減に十分であると決定される、パラグラフ２９または４７に記載の方法。
４９．前記ｒＡＡＶが、自己相補的である、パラグラフ２９～４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．前記導入遺伝子が、コンストラクトＣＡＧ．エタネルセプト（配列番号１５または１６）またはｍＵ１ａ．Ｖｈ４ｉ．エタネルセプト．ｓｃＡＡＶ（配列番号１７または１８）である、パラグラフ２９～４９のいずれか１つに記載の方法。
製造方法
５１．組換えＡＡＶを産生する方法であって、
（ａ）
（ｉ）ＡＡＶ ＩＴＲに隣接するシス発現カセットを含む人工ゲノムであって、前記シス発現カセットが、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含み、前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインを含むポリペプチドにペプチド結合を通じて共有結合した、ヒトＴＮＦα受容体Ｉ型（ＴＮＦＲ１）またはＩＩ型（ＴＮＦＲ２）の可溶性細胞外部分を含み、ヒト眼組織細胞における前記導入遺伝子の発現を促進する１つ以上の調節配列に作動可能に連結している、前記人工ゲノム、
（ｉｉ）ＡＡＶ ＩＴＲを欠くトランス発現カセットであって、前記トランス発現カセットが、培養物中の宿主細胞中の前記ＡＡＶ ｒｅｐ及び前記ＡＡＶキャプシドタンパク質の発現を駆動し、トランスでの前記ＡＡＶ ｒｅｐ及び前記ＡＡＶキャプシドタンパク質を供給する発現制御エレメントに作動可能に連結したＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードし、前記キャプシドが、眼組織向性を有する、前記トランス発現カセット、
（ｉｉｉ）前記ＡＡＶキャプシドタンパク質による前記人工ゲノムの複製及びパッケージングを可能にするのに十分なアデノウイルスヘルパー機能、を含有する前記宿主細胞を培養することと、
（ｂ）前記人工ゲノムをキャプシド形成する組換えＡＡＶを前記細胞培養物から回収することと、を含む、前記方法。
５２．前記眼組織細胞が、角膜細胞、虹彩細胞、毛様体細胞、シュレム管細胞、線維柱帯細胞、網膜細胞、ＲＰＥ脈絡膜組織細胞、または視神経細胞である、パラグラフ５１に記載の方法。
５３．前記導入遺伝子が、エタネルセプトまたはＥＹＳ６０６をコードし、前記ＡＡＶキャプシドタンパク質が、実施形態１のｒＡＡＶキャプシドタンパク質であり、前記キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、血清型２（ＡＡＶ２）、血清型２．７ｍ８、血清型３（ＡＡＶ３）、血清型３Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ）、血清型４（ＡＡＶ４）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）、血清型７（ＡＡＶ７）、血清型８（ＡＡＶ８）、血清型ｒｈ８（ＡＡＶｒｈ８）、血清型９（ＡＡＶ９）、血清型９ｅ（ＡＡＶ９ｅ）、血清型ｒｈ１０（ＡＡＶｒｈ１０）、血清型ｒｈ２０（ＡＡＶｒｈ２０）、血清型ｒｈ３９（ＡＡＶｒｈ３９）、血清型ｈｕ．３７（ＡＡＶｈｕ．３７）、血清型ｒｈ７３（ＡＡＶｒｈ７３）、血清型ｒｈ７４（ＡＡＶｒｈ７４）、血清型ｈｕ５１（ＡＡＶ．ｈｕ５１）、血清型ｈｕ２１（ＡＡＶ．ｈｕ２１）、血清型ｈｕ１２（ＡＡＶ．ｈｕ１２）、または血清型ｈｕ２６（ＡＡＶ．ｈｕ２６）のうちの少なくとも１つのＡＡＶ血清型由来である、パラグラフ５１または５２に記載の方法。
５４．宿主細胞であって、
ａ．ＡＡＶ ＩＴＲに隣接するシス発現カセットを含む人工ゲノムであって、前記シス発現カセットが、抗ＴＮＦα融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含み、前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインを含むポリペプチドにペプチド結合を通じて共有結合した、ヒトＴＮＦα受容体Ｉ型（ＴＮＦＲ１）またはＩＩ型（ＴＮＦＲ２）の可溶性細胞外部分を含み、ヒト眼組織細胞における前記導入遺伝子の発現を促進する１つ以上の調節配列に作動可能に連結している、前記人工ゲノムと、
ｂ．ＡＡＶ ＩＴＲを欠くトランス発現カセットであって、前記トランス発現カセットが、培養物中の前記宿主細胞中の前記ＡＡＶ ｒｅｐ及び前記ＡＡＶキャプシドタンパク質の発現を駆動し、トランスでの前記ＡＡＶ ｒｅｐ及び前記ＡＡＶキャプシドタンパク質を供給する発現制御エレメントに作動可能に連結したＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶキャプシドタンパク質をコードし、前記キャプシドが、眼組織向性を有する、前記トランス発現カセットと、
ｃ．前記ＡＡＶキャプシドタンパク質による前記人工ゲノムの複製及びパッケージングを可能にするのに十分なアデノウイルスヘルパー機能と、を含有する、前記宿主細胞。
５５．前記導入遺伝子が、エタネルセプトまたはＥＹＳ６０６をコードする、パラグラフ５４に記載の宿主細胞。
５６．前記ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、血清型２（ＡＡＶ２）、血清型２．７ｍ８（ＡＡＶ２．７ｍ８）、血清型３（ＡＡＶ３）、血清型３Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ）、血清型４（ＡＡＶ４）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）、血清型７（ＡＡＶ７）、血清型８（ＡＡＶ８）、血清型ｒｈ８（ＡＡＶｒｈ８）、血清型９（ＡＡＶ９）、血清型９ｅ（ＡＡＶ９ｅ）、血清型ｒｈ１０（ＡＡＶｒｈ１０）、血清型ｒｈ２０（ＡＡＶｒｈ２０）、血清型ｒｈ３９（ＡＡＶｒｈ３９）、血清型ｈｕ．３７（ＡＡＶｈｕ．３７）、血清型ｒｈ７３（ＡＡＶｒｈ７３）、血清型ｒｈ７４（ＡＡＶｒｈ７４）、血清型ｈｕ５１（ＡＡＶ．ｈｕ５１）、血清型ｈｕ２１（ＡＡＶ．ｈｕ２１）、血清型ｈｕ１２（ＡＡＶ．ｈｕ１２）、または血清型ｈｕ２６（ＡＡＶ．ｈｕ２６）である、パラグラフ５３または５４に記載の宿主細胞。
４．図面の簡単な説明
ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する、発現要素によって制御されるエタネルセプトをコードする発現カセットを含有するｒＡＡＶベクターゲノムコンストラクトの概略図。 抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質エタネルセプトのアミノ酸配列。グリコシル化部位は、太字または下線付きである。グルタミングリコシル化部位；アスパラギン酸（Ｎ）グリコシル化部位、正準及び非コンセンサスのアスパラギン酸（Ｎ）グリコシル化部位；ならびにチロシン－Ｏ－硫酸化部位（斜体）は、凡例に示される通りである。Ｆｃドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）は、灰色で強調表示される。ヒンジ領域は、斜体で示される。トロンビン切断部位は、下線付きである。 抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質ＥＹＳ６０６のアミノ酸配列。グリコシル化部位は、太字または下線付きである。グルタミングリコシル化部位；アスパラギン酸（Ｎ）グリコシル化部位、正準及び非コンセンサスのアスパラギン酸（Ｎ）グリコシル化部位；ならびにチロシン－Ｏ－硫酸化部位（斜体）は、凡例に示される通りである。Ｆｃドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）は、灰色で強調表示される。ヒンジ領域は、斜体で示される。トロンビン切断部位は、下線付きである。 眼組織向性を有する様々なキャプシドのクラスタル多重配列アラインメント。アミノ酸置換（下の行に太字で示されている）は、他のアラインメントされたＡＡＶキャプシドの対応する位置からアミノ酸残基を「動員」することによって、ＡＡＶ８キャプシドに対して行うことができる。灰色で示される配列＝超可変領域。ＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列には、図３に示されるような配列ＩＤ番号が割り当てられる。 図３－１の続きである。 図３－１の続きである。 図３－１の続きである。 図３－１の続きである。 図３－１の続きである。 図３－１の続きである。 ＩｇＧ１（配列番号４７）、ＩｇＧ２（配列番号４８）、及びＩｇＧ４（配列番号４９）の定常重鎖領域（ＣＨ２及びＣＨ３）のクラスタル多重配列アラインメント。重鎖の残基２１９から残基２３０までのヒンジ領域は、斜体で示されている。アミノ酸の番号付けは、ＥＵ形式である。 Ａ．ベクター化アダリムマブＩｇＧ及びＦａｂによるモデル種（マウス、ラット、及びヒト）にわたるＴＮＦαの結合。陰性対照には、トランスフェクトされていない細胞に由来する上清が含まれた。ベクター化ラナデルマブ（ｐＡＡＶ．ＣＡＧ．ラナデルマブ．ＩｇＧ）は、非特異的抗体対照として機能した。データは、平均値±ＳＥＭとして表される。Ｂ．ベクター化アダリムマブＩｇＧ及びエタネルセプトによるモデル種（マウス、ラット、及びヒト）にわたるＴＮＦαの結合。陰性対照には、トランスフェクトされていない細胞に由来する上清が含まれた。ベクター化ラナデルマブ（ｐＡＡＶ．ＣＡＧ．ラナデルマブ．ＩｇＧ）は、非特異的抗体対照として機能した。データは、平均値±ＳＥＭとして表される。
５．発明を実施するための形態
非感染性ブドウ膜炎と診断されたヒト対象への、ＴＮＦαに結合する完全にヒト翻訳後修飾された（ＨｕＰＴＭ）治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の送達のための全身用の組成物及び方法を記載する。送達は、有利には、遺伝子療法、例えば、治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質（またはいずれかの高グリコシル化誘導体）をコードするウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現コンストラクトを、非感染性ブドウ膜炎と診断された患者（ヒト対象）に投与して、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質、例えば、ヒトグリコシル化導入遺伝子産物を、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質がその治療効果を発揮する場所に継続的に供給する恒久的デポーを作製することによって達成され得る。
ある特定の実施形態では、導入遺伝子によってコードされたＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質は、限定されないが、ＴＮＦαに結合するＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質、特にエタネルセプトまたはＥＹＳ６０６である（それぞれ、ＴＮＦＲ－Ｆｃ融合タンパク質エタネルセプト及びＥＹＳ６０６のアミノ酸配列については、図２Ａ及び２Ｂを参照されたい）。実施形態では、発現する場合、ＴＮＦＲ Ｆｃ融合タンパク質は、二量体である。
導入遺伝子によってコードされるＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質には、ＥＹＳ６０６を含むが、これに限定されないＴＮＦαに結合する治療用抗ＴＮＦα ＴＮＦＲ１：Ｆｃ融合が含まれ得るが、これに限定されない。上記のアミノ酸配列を以下の表６に提供する。配列番号１のアミノ酸配列を有するＴＮＦＲ１ドメイン、及び配列番号６（またはヒンジを含まない７）のアミノ酸配列を有するＦｃドメイン、及び配列番号１２のアミノ酸配列を有するＥＹＳ６０６タンパク質。導入遺伝子によってコードされるＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα ＴＮＦＲ１：Ｆｃ融合物には、Ｆｃドメイン上の追加のグリコシル化部位を含有するように操作された二量体融合タンパク質が含まれるが、これに限定されない。
導入遺伝子によってコードされるＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質には、エタネルセプトを含むが、これに限定されないＴＮＦαに結合する治療用抗ＴＮＦα ＴＮＦＲ２：Ｆｃ融合が含まれ得るが、これに限定されない。上記のアミノ酸配列を以下の表６に提供する。配列番号２のアミノ酸配列を有するＴＮＦＲ２ドメイン、及び配列番号３（ヒンジ領域を含まない配列番号４）のアミノ酸配列を有するＦｃドメイン、及び配列番号１０（リーダー配列を含む配列番号１１）のアミノ酸配列を有するエタネルセプトと、配列番号１３～１８のうちの１つの導入遺伝子ヌクレオチド配列。導入遺伝子によってコードされるＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα ＴＮＦＲ２：Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃドメイン上のさらなるグリコシル化部位を含有するように操作された二量体融合タンパク質を含むことができるが、これに限定されない。
本明細書に提供する組成物及び方法は、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質、特に、エタネルセプト及びＥＹＳ６０６を、ウイルスゲノムのデポーから、例えば、対象の眼、または肝臓／筋肉内で、眼組織内（例えば、硝子体液もしくは房水中）、または抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質で治療され得る非感染性ブドウ膜炎または他の適応症の症状を治療または緩和するために治療的または予防的に有効である血清中のいずれかのレベルで全身的に送達する。実施形態では、１つ以上の眼組織細胞を含む、ヒト対象における細胞への治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする導入遺伝子の送達のためのウイルスベクター、及び細胞、実施形態では、眼組織細胞における抗体の発現を促進する抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した調節エレメントが、本明細書で特定される。眼組織特異的調節エレメントを含むかかる調節エレメントを、本明細書の表１及び表１ａに提供する。したがって、かかるウイルスベクターは、投与後少なくとも２０、３０、４０、５０または６０日後に、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が治療有効レベルで当該ヒト対象の血清または眼組織に存在するように、適切な投与量でヒト対象に送達されてもよい。実施形態では、抗抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の治療有効レベルは、（ヒト治験では、動物モデル、例えば、本明細書に記載のもの等）、２つ以上のＥＴＤＲＳ株によって最良の矯正視力（ＢＣＶＡ）を改善するか、またはｌｏｇＭＡＲの増加、ＳＵＮ分類による前房及び後房の炎症活性の低減、及び／または硝子体混濁のグレードの低減のために決定される。
導入遺伝子を送達するために使用される組換えベクターは、非複製組換えアデノ随伴ウイルスベクター（「ｒＡＡＶ」）を含む。ｒＡＡＶは、いくつかの理由で特に魅力的なベクターであり、それらは非複製細胞を形質導入することができ、したがって、網膜などの低レベルで細胞分裂が生じる組織に導入遺伝子を送達するために使用することができ、それらは、選択した特定の器官を優先的に標的とするように修飾することができ、所望の組織特異性を得るために、及び／またはいくつかのＡＡＶに対する既存の患者抗体による中和を回避するために選択するために何百ものキャプシド血清型が存在する。かかるｒＡＡＶには、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．７ｍ８ ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９ｅ、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ７３、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ．ｈｕ５１、ＡＡＶ．ｈｕ２１、ＡＡＶ．ｈｕ１２、またはＡＡＶ．ｈｕ２６のうちの１つ以上からのキャプシド成分を含む、ＡＡＶベースのベクターが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０血清型のうちの１つ以上からのキャプシドを含む。
しかしながら、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、または「ネイキッドＤＮＡ」コンストラクトと称される非ウイルス発現ベクターを含むがこれらに限定されない他のウイルスベクターを使用してもよい。導入遺伝子の発現は、構成的または組織特異的発現制御エレメントによって制御することができる。
治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の遺伝子療法コンストラクトは、共有結合したＴＮＦＲ及びＦｃ部分が二量体融合タンパク質として発現されるように設計される。例えば、ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合物は、重鎖間のジスルフィド結合形成に連結されているヒンジ領域（例えば、配列番号５または９）の全てまたは一部分を含み得る。好ましくは、ＴＮＦＲ１：Ｆｃは、ＥＹＳ６０６のバイオベターもしくはバイオシミラーであるか、またはより好ましくは、ＴＮＦＲ：Ｆｃは、ＥＹＳ６０６である。好ましくは、ＴＮＦＲ２：Ｆｃは、エタネルセプトのバイオベターもしくはバイオシミラーであるか、またはより好ましくは、ＴＮＦＲ：Ｆｃは、エタネルセプトである。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示する核酸（例えば、ポリヌクレオチド）及び核酸配列は、例えば、当業者に既知である任意のコドン最適化技術（例えば、Ｑｕａｘ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ５９：１４９－１６１による概説を参照されたい）を介して、コドン最適化され得、またＣｐＧ二量体を低減するためにも最適化され得る。コドン最適化され得る治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のヌクレオチド配列を表７に開示する。抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質は、適切な翻訳後処理及び分泌を確実にするためにＮ末端リーダーを必要とする。ヒト細胞における治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の発現のための有用なリーダー配列を本明細書に開示する。例示的な組換え発現コンストラクトを図１に示す。
ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の産生は、例えば、エタネルセプトもしくはＥＹＳ６０６などの抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードするウイルスベクター、または他のＤＮＡ発現コンストラクトを、その抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の疾患適応症と診断された患者（ヒト対象）に投与して、対象の形質導入細胞によって産生されるヒトグリコシル化された硫酸化導入遺伝子産物を継続的に供給する恒久的なデポーを対象において作製することによって、遺伝子療法を介して達成される疾患の治療のための「バイオベター」分子をもたらすべきである。ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のｃＤＮＡコンストラクトは、形質導入されたヒト細胞による適切な共翻訳及び翻訳後の処理（グリコシル化及びタンパク質硫酸化）を確実にするシグナルペプチドを含むべきである。
ヒト対象への投与に好適な薬学的組成物には、生理学的に適合性の水性緩衝液、界面活性剤及び任意選択の賦形剤を含む、製剤緩衝液中の組換えベクターの懸濁液が含まれる。かかる製剤緩衝液は、多糖類、界面活性剤、ポリマー、または油のうちの１つ以上を含むことができる。
遺伝子療法の代替または追加の治療として、全長ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質は、組換えＤＮＡ技術によってヒト細胞株で産生され得、糖タンパク質は、患者に投与され得る。かかる組換え糖タンパク質産生に使用され得るヒト細胞株としては、限定されないが、ほんの一例として、ヒト胚性腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）、線維肉腫ＨＴ－１０８０、ＨＫＢ－１１、ＣＡＰ、ＨｕＨ－７、及び網膜細胞株、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＲＰＥが挙げられる（例えば、Ｄｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６（６）：１１１０－１１２２（ＨｕＰＴＭ生物学的製剤の組換え産生に使用され得るヒト細胞株の概説について、参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい）。完全なグリコシル化、特にシアリル化、及びチロシン－硫酸化を確実にするために、産生に使用される細胞株は、宿主細胞を操作して、ヒト細胞におけるチロシン－Ｏ－硫酸化に関与するα－２，６－シアリルトランスフェラーゼ（もしくはα－２，３－及びα－２，６－シアリルトランスフェラーゼの両方）、及び／またはＴＰＳＴ－１及びＴＰＳＴ－２酵素を共発現させることによって強化され得る。
遺伝子療法またはタンパク質療法アプローチのいずれかで産生される全ての分子が完全にグリコシル化及び硫酸化されることは必須ではない。むしろ、産生された糖タンパク質の集団は、有効性を実証するのに十分なグリコシル化（２，６－シアリル化を含む）及び硫酸化を有するべきである。本発明の遺伝子療法治療の目標は、疾患の進行を遅らせるか、または阻止することである。
他の利用可能な治療の投与を伴う患者へのＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の送達を伴う併用療法は、本発明の方法に包含される。追加の治療は、遺伝子療法治療の前、同時、または後に施されてもよい。かかる追加の治療には、治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質との併用療法が含まれ得るが、これに限定されない。
ウイルスベクター、特にＡＡＶベースのウイルスベクターを製造する方法もまた提供する。特定の実施形態では、組換えＡＡＶを産生する方法であって、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接するシス発現カセット（シス発現カセットは、ヒト細胞における導入遺伝子の発現を制御する発現制御エレメントに作動可能に連結した治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含む）、ＡＡＶ ＩＴＲを欠くトランス発現カセット（トランス発現カセットは、培養物中の宿主細胞におけるＡＡＶ ｒｅｐ及びキャプシドタンパク質の発現を駆動し、ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質をトランスで供給する発現制御エレメントに作動可能に連結したＡＡＶ ｒｅｐ及びキャプシドタンパク質をコードする）、ＡＡＶキャプシドタンパク質による人工ゲノムの複製及びパッケージングを可能にするために十分なアデノウイルスヘルパー機能を含む人工ゲノムを含有する宿主細胞を培養することと、人工ゲノムをキャプシド形成する組換えＡＡＶを細胞培養物から回収することと、を含む、方法を提供する。
５．１． 定義
「抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質」という語句は、例えば、ペプチド結合を介して免疫グロブリン、特にＩｇＧのＦｃドメインに共有結合した、ＴＮＦ－α受容体ｐ５５またはｐ７５を含む、ＴＮＦαの受容体の可溶性細胞外ドメインまたは部分を含むポリペプチドを意味する。
「調節エレメント」または「核酸調節エレメント」という用語は、隣接する遺伝子の転写を制御する非コード核酸配列である。シス調節エレメントは、典型的には、転写因子に結合することによって遺伝子転写を調節する。これには、本明細書に記載の２つ以上のエンハンサーまたはプロモーターエレメントを含む、「複合核酸調節エレメント」が含まれる。
「発現カセット」または「核酸発現カセット」という用語は、プロモーター、エンハンサー及び／または調節エレメント、イントロン及びポリアデニル化配列を含むが、これらに限定されない、１つ以上の転写制御エレメントを含む核酸分子を指す。エンハンサー及びプロモーターは、典型的には、１つ以上の所望の細胞型、組織または器官における（トランス）遺伝子発現を指向するように機能する。
「作動可能に連結した」及び「に作動可能に連結した」という用語は、連結されており、典型的には隣接しているか、または実質的に隣接しており、２つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合は、隣接してリーディングフレーム内にある核酸配列を指す。しかしながら、エンハンサーは、一般に、数キロベースだけプロモーターから分離されたときに機能し、イントロン配列は可変長であり得るため、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは、下流プロモーター及び導入遺伝子に直接連続していないが、作動可能に連結され、依然として機能的であり得る。
「ＡＡＶ」または「アデノ随伴ウイルス」という用語は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ属のウイルス内のディペンドパルボウイルスを指す。ＡＡＶは、天然に存在する「野生型」ウイルスに由来するＡＡＶ、天然に存在するｃａｐ遺伝子によってコードされるキャプシドタンパク質を含むキャプシドにパッケージングされたｒＡＡＶゲノムに由来するＡＡＶ、及び／または非天然に存在するキャプシドｃａｐ遺伝子によってコードされるキャプシドタンパク質を含むキャプシドにパッケージングされたｒＡＡＶゲノムに由来するＡＡＶであり得る。後者の例は、天然に存在するキャプシドのアミノ酸配列へのペプチド挿入または修飾を含むキャプシドタンパク質を有するｒＡＡＶを含む。
「ｒＡＡＶ」という用語は、「組換えＡＡＶ」を指す。一部の実施形態では、組換えＡＡＶは、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子の一部または全てが異種配列で置き換えられているＡＡＶゲノムを有する。
「ｒｅｐ－ｃａｐヘルパープラスミド」という用語は、ウイルスｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子機能を提供し、機能ｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子配列を欠くｒＡＡＶゲノムからのＡＡＶの産生を補助するプラスミドを指す。
「ｃａｐ遺伝子」という用語は、ウイルスのキャプシドコートを形成するか、または形成するのを助けるキャプシドタンパク質をコードする核酸配列を指す。ＡＡＶの場合、キャプシドタンパク質は、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３であり得る。
「ｒｅｐ遺伝子」という用語は、ウイルスの複製及び産生に必要な非構造タンパク質をコードする核酸配列を指す。
「核酸」及び「ヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の組み合わせまたはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡ分子の類似体を含む。かかる類似体は、例えば、イノシンまたはトリチル化塩基を含むが、これらに限定されないヌクレオチド類似体を使用して生成することができる。かかる類似体はまた、例えば、ヌクレアーゼ耐性または細胞膜を横断する能力の増加などの分子に有益な属性を与える修飾された骨格を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含むことができる。核酸またはヌクレオチド配列は、一本鎖、二本鎖であり得、一本鎖部分及び二本鎖部分の両方を含み得、三本鎖部分を含み得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、互換的に使用される。本明細書で使用される場合、対象は、好ましくは非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット等）または霊長類（例えば、サル及びヒト）などの哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
「治療薬」または「バイオ治療薬」という用語は、疾患または障害と関連する症状を治療、管理、または緩和する際に使用され得る任意の薬剤を指し、疾患または障害は、導入遺伝子によって提供される機能と関連する。本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、標的疾患または障害に苦しむ対象に投与されたときに、その治療または管理において少なくとも１つの治療上の利益を提供する薬剤の量（例えば、導入遺伝子によって発現される産物の量）を指す。さらに、本発明の薬剤に関する治療有効量は、疾患または障害の治療または管理において少なくとも１つの治療上の利益をもたらす、薬剤単独または他の治療法と組み合わせたときの量を意味する。
「肝臓特異的」または「肝臓指向性」という語句は、かかるエレメントと肝細胞の細胞内環境との相互作用に起因して、肝臓（肝）細胞または組織におけるそれらの活性を適応させた核酸エレメントを指す。肝臓は、肝臓組織に送達される遺伝子療法の文脈で、身体のバイオリアクターまたは「デポー」として機能し、肝臓での発現のために強化された遺伝子カセットは、循環に分泌されるバイオ治療薬（翻訳されたタンパク質）を産生する。このように、バイオ治療薬は、肝臓発現によって全身的に対象に送達される。いずれの理論にも縛られることなく、（送達された導入遺伝子によって産生されるような）バイオ治療薬の肝臓産生は、タンパク質を産生する対象の内因性Ｔ細胞がタンパク質を自己タンパク質として認識し、自然免疫応答を誘導しないように、薬剤に免疫寛容を提供し得る。
５．２． コンストラクト
ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードするウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現コンストラクトを本明細書に提供する。本明細書に提供するウイルスベクター及び他のＤＮＡ発現コンストラクトは、導入遺伝子を標的細胞に送達するための任意の好適な方法を含む。導入遺伝子の送達手段には、ウイルスベクター、リポソーム、他の脂質含有複合体、他の高分子複合体、合成修飾ｍＲＮＡ、非修飾ｍＲＮＡ、小分子、非生物学的に活性な分子（例えば、金粒子）、重合分子（例えば、デンドリマー）、ネイキッドＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、またはエピソームが含まれる。一部の実施形態では、ベクターは、標的化ベクター、例えば、眼組織細胞を標的とするベクター、または眼組織細胞に対する向性を有するベクターである。
いくつかの態様では、本開示は、使用のための核酸を提供し、核酸は、導入遺伝子の発現のために標的とされた組織における発現のために選択されたプロモーター、例えば、限定されないが、ユビキタスプロモーター、例えば、ＣＢ７／ＣＡＧプロモーター（配列番号５０）及び関連上流調節配列、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター（配列番号５３）、ｍＵ１ａ（配列番号５２）、ＵＢ６プロモーター、ニワトリベータ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、及び眼組織特異的プロモーター、例えば、ヒトロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）プロモーター（配列番号５４もしくは１１７）、マウス錐体アレスチン（ＣＡＲ）プロモーター（配列番号１１４～１１６）、ヒト赤オプシン（ＲｅｄＯ）プロモーター（配列番号１１２）、ＣＢプロモーター（配列番号１５９）、ＣＢロングプロモーター（配列番号１６０）、またはＢｅｓｔ１／ＧＲＫプロモーター（配列番号１６１）に作動可能に連結した本明細書に記載の導入遺伝子として、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。有用なプロモーターのリストについては、表１及び１ａを参照されたい。
ある特定の実施形態では、１つ以上の核酸（例えば、ポリヌクレオチド）を含む組換えベクターを本明細書に提供する。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ及びＲＮＡの組み合わせを含み得る。ある特定の実施形態では、ＤＮＡは、プロモーター配列、目的の遺伝子の配列（導入遺伝子、例えば、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列）、非翻訳領域、及び終止配列からなる群から選択される配列のうちの１つ以上を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、目的の遺伝子に作動可能に連結したプロモーターを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示する核酸（例えば、ポリヌクレオチド）及び核酸配列は、例えば、当業者に既知である任意のコドン最適化技術（例えば、Ｑｕａｘ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ５９：１４９－１６１による概説を参照されたい）を介して、コドン最適化され得る。ヒト細胞における抗ＴＮＦα融合タンパク質の発現のためのヌクレオチド配列を、表７において本明細書に提供する。
特定の実施形態では、本明細書に記載のコンストラクトは、以下の構成要素：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ２逆方向末端反復、（２）１つ以上の制御エレメント、ｂ）任意選択で、ニワトリβ－アクチンまたは他のイントロン、及びｃ）ウサギβ－グロビンポリＡシグナル、及び（３）ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＮ末端に連結されたＴＮＦＲ２の可溶性細胞外ドメインをコードする核酸配列を含み、Ｆｃドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、ヒンジ領域－ＣＨ２ドメイン－ＣＨ３ドメイン（エタネルセプト）を含む。例示的なコンストラクトを図１及び図２Ａに示す。
特定の実施形態では、本明細書に記載のコンストラクトは、以下の構成要素：（１）発現カセットに隣接するＡＡＶ２逆方向末端反復、（２）１つ以上の制御エレメント、ｂ）任意選択で、ニワトリβ－アクチンまたは他のイントロン、及びｃ）ウサギβ－グロビンポリＡシグナル、及び（３）ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＮ末端にトロンビン切断部位を介して連結されたＴＮＦＲ１の可溶性細胞外ドメインをコードする核酸配列を含み、Ｆｃドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、ヒンジ領域－ＣＨ２ドメイン－ＣＨ３ドメイン（ＥＹＳ０６０）を含む。例示的なコンストラクトを図２Ｂに示す。
５．２．１ ｍＲＮＡベクター
ある特定の実施形態では、ＤＮＡベクターの代替として、本明細書に提供するベクターは、目的の遺伝子（例えば、導入遺伝子、例えば、ＨｕＰＴＭ非モノクローナル抗体生物学的製剤）をコードする修飾ｍＲＮＡである。網膜色素上皮細胞への導入遺伝子の送達のための修飾及び非修飾ｍＲＮＡの合成は、例えば、Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１５，２９０（９）：５６６１－５６７２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に説かれている。ある特定の実施形態では、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡを本明細書に提供する。
５．２．２ ウイルスベクター
ウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ２．７ｍ８、及び他の血清型）、レンチウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＨＶＪ））、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、及びレトロウイルスベクターが含まれる。レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベースのベクターが含まれる。アルファウイルスベクターには、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）及びシンドビスウイルス（ＳＩＮ）が含まれる。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、組換えウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、それらがヒトにおいて複製欠損であるように改変される。ある特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ハイブリッドベクター、例えば、「無力な」アデノウイルスベクターに配置されたＡＡＶベクターである。ある特定の実施形態では、第１のウイルスからのウイルスキャプシド及び第２のウイルスからのウイルスエンベロープタンパク質を含むウイルスベクターを本明細書に提供する。特定の実施形態では、第２のウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）である。より特定の実施形態では、エンベロープタンパク質は、ＶＳＶ－Ｇタンパク質である。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、ＨＩＶベースのウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するＨＩＶベースのベクターは、少なくとも２つのポリヌクレオチドを含み、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子は、ＨＩＶゲノム由来であり、ｅｎｖ遺伝子は、別のウイルス由来である。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルスベースのウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、本明細書に提供する単純ヘルペスウイルスベースのベクターは、それらが１つ以上の最初期（ＩＥ）遺伝子を含まないように修飾され、それらを非細胞傷害性にする。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、ＭＬＶベースのウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するＭＬＶベースのベクターは、ウイルス遺伝子の代わりに最大で８ｋｂの異種ＤＮＡを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、レンチウイルスベースのウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するレンチウイルスベクターは、ヒトレンチウイルスに由来する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するレンチウイルスベクターは、非ヒトレンチウイルスに由来する。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するレンチウイルスベクターは、レンチウイルスキャプシドにパッケージングされる。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するレンチウイルスベクターは、以下のエレメント：長い末端反復、プライマー結合部位、ポリプリン管、ａｔｔ部位、及びカプシド形成部位のうちの１つ以上を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、アルファウイルスベースのウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するアルファウイルスベクターは、組換え複製欠損アルファウイルスである。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するアルファウイルスベクター内のアルファウイルスレプリコンは、そのビリオン表面に機能的異種リガンドを表示することによって、特定の細胞型を標的とする。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、ＡＡＶベースのウイルスベクターである。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子（複製に必要とされる）及び／またはＡＡＶ ｃａｐ遺伝子（キャプシドタンパク質の合成に必要とされる）をコードしない（ｒｅｐ及びｃａｐタンパク質は、トランスでのパッケージング細胞によって提供され得る）。複数のＡＡＶ血清型が同定されている。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶの１つ以上の血清型からの成分を含む。好ましい実施形態では、本明細書に提供するＡＡＶベースのベクターは、眼組織、肝臓、及び／または筋肉に対する向性を有するＡＡＶの１つ以上の血清型からの成分を含む。本明細書を通して、ＡＡＶ「血清型」は、免疫学的に異なるキャプシド、天然に存在するキャプシド、または操作されたキャプシドを有するＡＡＶを指す。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９ｅ、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ７３、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ．ｈｕ５１、ＡＡＶ．ｈｕ２１、ＡＡＶ．ｈｕ１２、またはＡＡＶ．ｈｕ２６のうちの１つ以上からのキャプシド成分を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ８、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ７３、またはＡＡＶｒｈ１０血清型のうちの１つ以上からの成分であるか、またはそれらを含む。キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質（配列番号３２）、ＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質（配列番号２６）、またはＡＡＶｒｈ７３キャプシドタンパク質（配列番号３８）のバリアントであり、キャプシドタンパク質が、例えば、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質（配列番号３２）、ＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質（配列番号２６）、またはＡＡＶｒｈ７３キャプシドタンパク質（配列番号３８）のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％同一である一方で、天然キャプシドの生物学的機能を保持する、ウイルスベクターを提供する。ある特定の実施形態では、コードされたＡＡＶキャプシドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を伴う配列番号３２の配列を有し、ＡＡＶ８、ＡＡＶ３Ｂ、またはＡＡＶｒｈ７３キャプシドの生物学的機能を保持している。図３は、異なるＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列と、アラインメントされた配列のある特定の位置で置換され得る潜在的なアミノ酸との比較アラインメントを、行ラベルが付いたＳＵＢＳの比較に基づいて提供する。したがって、特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、図３のＳＵＢＳ行において特定された天然ＡＡＶキャプシド配列のその位置には存在しない１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有するＡＡＶ８、ＡＡＶ３Ｂ、またはＡＡＶｒｈ７３、キャプシドバリアントを含む。ＡＡＶ８、ＡＡＶ３Ｂ、またはＡＡＶｒｈ７３キャプシドのアミノ酸配列を図３に提供する。
一部の実施形態では、ＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶの１つ以上の血清型からの成分を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供するＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、または他のｒＡＡＶ粒子のうちの１つ以上、あるいはそれらの２つ以上の組み合わせからのキャプシド成分を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供するＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、または他のｒＡＡＶ粒子のうちの１つ以上、あるいはそれらの２つ以上の血清型の組み合わせからの成分を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ｒＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、もしくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６、またはそれらの誘導体、修飾、もしくはシュードタイプから選択されるＡＡＶキャプシド血清型のＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列と少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％等、すなわち、最大で１００％同一のキャプシドタンパク質を含む。
特定の実施形態では、本明細書の組成物及び方法において使用するための組換えＡＡＶは、Ａｎｃ８０またはＡｎｃ８０Ｌ６５である（例えば、Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．１２（６）：１０５６－１０６８（参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書の組成物及び方法において使用するための組換えＡＡＶは、ＡＡＶ．７ｍ８（そのバリアントを含む）である（例えば、ＵＳ９，１９３，９５６、ＵＳ９，４５８，５１７、ＵＳ９，５８７，２８２、ＵＳ２０１６／０３７６３２３、及びＷＯ２０１８／０７５７９８（その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書の組成物及び方法において使用するためのＡＡＶは、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ＢなどのＵＳ９，５８５，９７１に開示される任意のＡＡＶである。特定の実施形態では、本明細書の組成物及び方法において使用するためのＡＡＶは、ＡＡＶ２／Ｒｅｃ２またはＡＡＶ２／Ｒｅｃ３ベクターであり、これは、ＡＡＶ８及び血清型ｃｙ５、ｒｈ２０またはｒｈ３９に由来するハイブリッドキャプシド配列を有する（例えば、Ｉｓｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ８（４）：ｅ６０３６１（これらのベクターについて、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書の組成物及び方法において使用するためのＡＡＶは、以下のうちのいずれかに開示されるＡＡＶであり、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：ＵＳ７，２８２，１９９、ＵＳ７，９０６，１１１、ＵＳ８，５２４，４４６、ＵＳ８，９９９，６７８、ＵＳ８，６２８，９６６、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ８，７３４，８０９、ＵＳ９，２８４，３５７、ＵＳ９，４０９，９５３、ＵＳ９，１６９，２９９、ＵＳ９，１９３，９５６、ＵＳ９，４５８，５１７、ＵＳ９，５８７，２８２、ＵＳ２０１５／０３７４８０３、ＵＳ２０１５／０１２６５８８、ＵＳ２０１７／００６７９０８、ＵＳ２０１３／０２２４８３６、ＵＳ２０１６／０２１５０２４、ＵＳ２０１７／００５１２５７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９、及びＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、以下の特許及び特許出願のうちのいずれかに開示されるＡＡＶキャプシドのＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３配列と少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％等、すなわち、最大で１００％同一のキャプシドタンパク質を有し、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：米国特許第７，２８２，１９９号、同第７，９０６，１１１号、同第８，５２４，４４６号、同第８，９９９，６７８号、同第８，６２８，９６６号、同第８，９２７，５１４号、同第８，７３４，８０９号、同第ＵＳ９，２８４，３５７号、同第９，４０９，９５３号、同第９，１６９，２９９号、同第９，１９３，９５６号、同第９，４５８，５１７号、及び同第９，５８７，２８２号；米国特許出願第２０１５／０３７４８０３号、同第２０１５／０１２６５８８号、同第２０１７／００６７９０８号、同第２０１３／０２２４８３６号、同第２０１６／０２１５０２４号、同第２０１７／００５１２５７号；ならびに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、同第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第９，８４０，７１９号及びＷＯ２０１５／０１３３１３（その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている任意のＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ．Ｒｈ７４及びＲＨＭ４－１）を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０１４／１７２６６９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている任意のＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶｒｈ．７４）を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３：８５７－８６２及びＧｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５：４５０（その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、ＡＡＶ２／５のキャプシドを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＷＯ２０１７／０７０４９１（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている任意のＡＡＶキャプシド（例えば、ＡＡＶ２ｔＹＦ）を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、Ｐｕｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２９（９）：４１８（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、ＡＡＶＬＫ０３またはＡＡＶ３Ｂのキャプシドを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、米国特許第８，６２８，９６６号、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ９，９２３，１２０及びＷＯ２０１６／０４９２３０（その各々は、参照によりその全体が組み込まれる）に開示されている任意のＡＡＶキャプシド（例えば、ＨＳＣ１、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４、ＨＳＣ５、ＨＳＣ６、ＨＳＣ７、ＨＳＣ８、ＨＳＣ９、ＨＳＣ１０、ＨＳＣ１１、ＨＳＣ１２、ＨＳＣ１３、ＨＳＣ１４、ＨＳＣ１５、またはＨＳＣ１６）を含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、国際出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、′０５１公開の配列番号２を参照されたい）、ＷＯ２００５／０３３３２１（例えば、′３２１公開の配列番号１２３及び８８を参照されたい）、ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、′３９７公開の配列番号２、８１、８５、及び９７を参照されたい）、ＷＯ２００６／０６８８８８（例えば、′８８８公開の配列番号１及び３～６を参照されたい）、ＷＯ２００６／１１０６８９（例えば、′６８９公開の配列番号５～３８を参照されたい）、ＷＯ２００９／１０４９６４（例えば、′９６４公開の配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４及び３１を参照されたい）、ＷＯ２０１０／１２７０９７（例えば、′０９７公開の配列番号５～３８を参照されたい）、及びＷＯ２０１５／１９１５０８（例えば、′５０８公開の配列番号８０～２９４を参照されたい）、ならびに米国出願公開第２０１５／００２３９２４号（例えば、′９２４公開の配列番号１、５～１０を参照されたい）（その各々の内容が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されているキャプシドタンパク質を有する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、国際出願公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、′０５１公開の配列番号２を参照されたい）、ＷＯ２００５／０３３３２１（例えば、′３２１公開の配列番号１２３及び８８を参照されたい）、ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、′３９７公開の配列番号２、８１、８５、及び９７を参照されたい）、ＷＯ２００６／０６８８８８（例えば、′８８８公開の配列番号１及び３～６を参照されたい）、ＷＯ２００６／１１０６８９（例えば、′６８９公開の配列番号５～３８を参照されたい）、ＷＯ２００９／１０４９６４（例えば、９６４公開の配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４及び３１を参照されたい）、ＷＯ２０１０／１２７０９７（例えば、′０９７公開の配列番号５～３８を参照されたい）、及びＷＯ２０１５／１９１５０８（例えば、′５０８公開の配列番号８０～２９４を参照されたい）、ならびに米国出願公開第２０１５／００２３９２４号（例えば、′９２４公開の配列番号１、５～１０を参照されたい）に開示されているＡＡＶキャプシドのＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３と少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％等、すなわち、最大で１００％同一のキャプシドタンパク質を有する。
追加の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、シュードタイプＡＡＶキャプシドを含む。一部の実施形態では、シュードタイプＡＡＶキャプシドは、ｒＡＡＶ２／８またはｒＡＡＶ２／９シュードタイプＡＡＶキャプシドである。シュードタイプｒＡＡＶ粒子を産生し、使用するための方法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７（２００２）、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）を参照されたい）。
ＡＡＶ２．７ｍ８ベース、ＡＡＶ８ベース、ＡＡＶ９ベース、及びＡＡＶｒｈ１０ベースのウイルスベクターは、本明細書に記載のある特定の方法において使用される。ＡＡＶベースのウイルスベクターのヌクレオチド配列、ならびに組換えＡＡＶ及びＡＡＶキャプシドを作製する方法は、例えば、米国特許第９，１９３，９５６Ｂ２号、米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号、米国特許第７，７９０，４４９Ｂ２号、米国特許第８，３１８，４８０Ｂ２号、米国特許第８，９６２，３３２Ｂ２号、及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６号（その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に説かれている。一態様では、導入遺伝子（例えば、ＨｕＰＴＭ二量体融合タンパク質）をコードするＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ１０）ベースのウイルスベクターを本明細書に提供する。ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びＡＡＶｒｈ１０を含む、ＡＡＶキャプシドのアミノ酸配列を図３に提供する。
ある特定の実施形態では、上記で一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）が使用され得る。ある特定の実施形態では、自己相補性ベクター、例えば、ｓｃＡＡＶが使用され得る（例えば、Ｗｕ，２００７，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（２）：１７１－８２、ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４；ならびに米国特許第６，５９６，５３５号；同第７，１２５，７１７号；及び同第７，４５６，６８３号（その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法において使用されるウイルスベクターは、アデノウイルスベースのウイルスベクターである。組換えアデノウイルスベクターを使用して、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする導入遺伝子内で転送することができる。組換えアデノウイルスは、Ｅ１欠失を伴う、Ｅ３欠失を伴うまたは伴わない、及びいずれかの欠失領域に発現カセットが挿入された、第１世代ベクターであることができる。組換えアデノウイルスは、Ｅ２及びＥ４領域の完全または部分的な欠失を含有する、第２世代ベクターであることができる。ヘルパー依存性アデノウイルスは、アデノウイルス逆方向末端反復及びパッケージングシグナル（ｐｈｉ）のみを保持する。導入遺伝子は、パッケージングシグナルと３’ＩＴＲとの間に挿入され、ゲノムをおよそ３６ｋｂの野生型サイズ付近に維持するためのスタッファー配列を伴うまたは伴わない。アデノウイルスベクターを産生するための例示的なプロトコルは、Ａｌｂａ ｅｔ ａｌ．，２００５，“Ｇｕｔｌｅｓｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：ｌａｓｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２：Ｓ１８－Ｓ２７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に見出され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法において使用されるウイルスベクターは、レンチウイルスベースのウイルスベクターである。組換えレンチウイルスベクターを使用して、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする導入遺伝子内で転送することができる。４つのプラスミドを使用して、コンストラクトを作製する：プラスミドを含有するＧａｇ／ｐｏｌ配列、プラスミドを含有するＲｅｖ配列、プラスミドを含有するエンベロープタンパク質（例えば、ＶＳＶ－Ｇ）、及びパッケージングエレメント及び抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質を有するシスプラスミド。
レンチウイルスベクター産生のために、４つのプラスミドを細胞（例えば、ＨＥＫ２９３ベースの細胞）に共トランスフェクトし、それによって、とりわけ、ポリエチレンイミンまたはリン酸カルシウムをトランスフェクション剤として使用することができる。次いで、レンチウイルスは、上清中で採取される（レンチウイルスは、活性であるために細胞から出芽する必要があるため、細胞採取を行う必要がない／行われるべきではない）。上清を濾過し（０．４５μｍ）、次いで、塩化マグネシウム及びベンゾナーゼを添加する。さらなる下流プロセスは、ＴＦＦ及びカラムクロマトグラフィーを使用することによって、最もＧＭＰ互換性のあるものであることから大きく異なり得る。他は、カラムクロマトグラフィーの有無にかかわらず超遠心分離を使用する。レンチウイルスベクターの産生のための例示的なプロトコルは、Ｌｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｉｎ ２９３Ｔ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １８：５３１－５３８、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１２，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＧＭＰ－Ｇｒａｄｅ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔ．１０（２）：３２－４３（両方とも、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法において使用するためのベクターは、ベクターを関連する細胞に導入すると、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のグリコシル化及び／またはチロシン硫酸化バリアントが細胞によって発現されるように、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードするベクターである。
５．２．３ 遺伝子発現のプロモーター及び修飾因子
ある特定の実施形態では、本明細書に提供するベクターは、遺伝子送達または遺伝子発現を調節する構成要素（例えば、「発現制御エレメント」）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するベクターは、遺伝子発現を調節する構成要素を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するベクターは、細胞への結合または標的化に影響を及ぼす構成要素を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するベクターは、取り込み後に細胞内のポリヌクレオチド（例えば、導入遺伝子）の局在化に影響を及ぼす構成要素を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するベクターは、例えば、ポリヌクレオチドを取り込んだ細胞を検出または選択するための検出可能または選択可能なマーカーとして使用することができる構成要素を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、導入遺伝子の発現を制御する１つ以上のプロモーターを含む。これらのプロモーター（及びエンハンサーなどの転写を制御する他の調節エレメント）は、構成的（ユビキタス発現を促進する）であり得るか、または眼組織において特異的または選択的に発現し得る。ある特定の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。
ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＣＢ７である（ＣＡＧプロモーターとも称される）（Ｄｉｎｃｕｌｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６：６４９－６６３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。一部の実施形態では、ＣＡＧ（配列番号５１）またはＣＢ７プロモーター（配列番号５０）は、ベクターによって駆動される導入遺伝子の発現を強化する他の発現制御エレメントを含む。ある特定の実施形態では、他の発現制御エレメントには、ニワトリβ－アクチンイントロン及び／またはウサギβ－グロビンポリＡシグナル（配列番号５５）が含まれる。ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＴＡＴＡボックスを含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは、１つ以上のエレメントを含む。ある特定の実施形態では、１つ以上のプロモーターエレメントは、互いに対して逆方向または移動させ得る。ある特定の実施形態では、プロモーターのエレメントは、協調的に機能するように配置されている。ある特定の実施形態では、プロモーターのエレメントは、独立して機能するように配置されている。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、ヒトＣＭＶ最初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳ）の長い末端反復、及びラットインスリンプロモーターからなる群から選択される１つ以上のプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するベクターは、ＡＡＶ、ＭＬＶ、ＭＭＴＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ－１、及びＨＩＶ－２ ＬＴＲからなる群から選択される１つ以上の長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーターを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供するベクターは、１つ以上の組織特異的プロモーター（例えば、網膜特異的プロモーター）を含む。特定の実施形態では、本明細書で提供するウイルスベクターは、ヒトロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）プロモーター（配列番号５４もしくは１１７）、マウス錐体アレスチン（ＣＡＲ）プロモーター（配列番号１１４～１１６）、ヒト赤オプシン（ＲｅｄＯ）プロモーター（配列番号１１２）、またはＢｅｓｔ１／ＧＲＫプロモーター（配列番号１６１）などの眼組織細胞特異的プロモーターを含む。
発現カセット内のタンデムでのエレメントの配列に関してキメラである核酸調節エレメントを提供する。一般に、調節エレメントは、転写開始または調節、シグナル伝達時の発現を駆動するための細胞特異的機構との調整のため、及び下流遺伝子の発現を強化するための認識部位として複数の機能を有する。
ある特定の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。ある特定の実施形態では、プロモーターは、低酸素誘導性プロモーターである。ある特定の実施形態では、プロモーターは、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）結合部位を含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＨＩＦ－１α結合部位を含む。ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＨＩＦ－２α結合部位を含む。ある特定の実施形態では、ＨＩＦ結合部位は、ＲＣＧＴＧモチーフを含む。ＨＩＦ結合部位の位置及び配列に関する詳細については、例えば、Ｓｃｈｏｄｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１１，１１７（２３）：ｅ２０７－ｅ２１７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ある特定の実施形態では、プロモーターは、ＨＩＦ転写因子以外の低酸素誘導性転写因子のための結合部位を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、低酸素状態で優先的に翻訳される１つ以上のＩＲＥＳ部位を含む。低酸素誘導性遺伝子発現及びそれに関与する因子に関する教示については、例えば、Ｋｅｎｎｅｔｈ ａｎｄ Ｒｏｃｈａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，２００８，４１４：１９－２９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。特定の実施形態では、低酸素誘導性プロモーターは、ヒトＮ－ＷＡＳＰプロモーターであるか（例えば、Ｓａｌｖｉ，２０１７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９：１３－２１（Ｎ－ＷＡＳＰプロモーターの教示のために参照により組み込まれる）を参照されたい）、またはヒトＥｐｏの低酸素誘導性プロモーターである（例えば、Ｔｓｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：３９５－４００（Ｅｐｏ低酸素誘導性プロモーターの開示のために参照により組み込まれる）を参照されたい）。他の実施形態では、プロモーターは、薬物誘導性プロモーター、例えば、ラパマイシンまたはその類似体の投与によって誘導されるプロモーターである。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１８３１７、ＷＯ９６／２０９５１、ＷＯ９６／４１８６５、ＷＯ９９／１０５０８、ＷＯ９９／１０５１０、ＷＯ９９／３６５５３、及びＷＯ９９／４１２５８、ならびにＵＳ７，０６７，５２６（薬物誘導性プロモーターの開示のために参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）におけるラパマイシン誘導性プロモーターの開示を参照されたい。
ある特定のユビキタス及び組織特異的プロモーターを含有するコンストラクトを本明細書に提供する。かかるプロモーターには、合成プロモーター及びタンデムプロモーターが含まれる。プロモーターの例及びヌクレオチド配列を以下の表１及び１ａに提供する。表１はまた、本明細書に提供する発現カセットに有用な他の調節エレメントのヌクレオチド配列も含む。
















ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、プロモーター以外の１つ以上の制御エレメントを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、エンハンサーを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、リプレッサーを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、イントロン（例えば、ＶＨ４イントロン（配列番号５７）またはキメライントロン（配列番号５６）を含む。ウイルスベクターはまた、導入遺伝子産物、例えば、ＧＣＣＡＣＣの翻訳を促進するためのＫｏｚａｋ配列を含んでもよい。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、導入遺伝子のコード領域の下流にポリアデニル化配列を含む。転写の終結をシグナル伝達し、ポリＡ尾部の合成を指向する任意のポリＡ部位は、本開示のＡＡＶベクターでの使用に好適である。例示的なポリＡシグナルは、以下に由来するが、これらに限定されない：ＳＶ４０後期遺伝子、ウサギβ－グロビン遺伝子（配列番号５５）、ウシ成長ホルモン（ＢＰＨ）遺伝子、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子、合成ポリＡ（ＳＰＡ）部位、及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）遺伝子。例えば、Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｒｉｖｅｒａ－Ｓｏｔｏ，２０１５，Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｅｄ．，１９（１０２）：４９－５７を参照されたい。
遺伝子発現カセット、及び導入遺伝子の発現が、２つ以上の調節エレメント（プロモーターまたはエンハンサー）を有する操作された核酸調節エレメントによって制御される遺伝子発現カセットを含むｒＡＡＶを提供する。
５．２．４ シグナルペプチド
ある特定の実施形態では、本明細書に提供するベクターは、タンパク質送達を調節する構成要素を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、導入遺伝子から発現するタンパク質が分泌を指向するためにＮ末端でシグナル配列を有するように、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に融合される、ヌクレオチド配列をコードする１つ以上のシグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは、本明細書では「リーダー配列」または「リーダーペプチド」も称され得る。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、導入遺伝子産物が細胞内で適切なパッケージング（例えば、グリコシル化）を達成することを可能にする。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、導入遺伝子産物が細胞内で適切な局在化を達成することを可能にする。ある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、導入遺伝子産物が細胞からの分泌を達成することを可能にする。
遺伝子療法コンテキストまたは細胞培養におけるタンパク質産生のためのシグナル配列を選択するための２つの一般的なアプローチがある。１つのアプローチは、発現されるタンパク質と相同のタンパク質からのシグナルペプチドを使用することである。例えば、ヒト抗体シグナルペプチドは、ＣＨＯまたは他の細胞においてＩｇＧを発現するために使用され得る。別のアプローチは、発現に使用される特定の宿主細胞に最適化されたシグナルペプチドを同定することである。シグナルペプチドは、異なるタンパク質間、またはさらには異なる生物のタンパク質間で交換され得るが、通常、その細胞型の最も豊富な分泌タンパク質のシグナル配列は、タンパク質発現のために使用される。例えば、血漿中で最も豊富なタンパク質であるヒトアルブミンのシグナルペプチドは、ＣＨＯ細胞におけるタンパク質産生率を実質的に増加させることが見出された。しかしながら、ある特定のシグナルペプチドは、「標的化後の機能」として発現したタンパク質から切断された後に機能を保持し、活性を発揮し得る。したがって、特定の実施形態では、シグナルペプチドは、標的化後の機能を回避するために発現に使用される細胞によって分泌される最も豊富なタンパク質のシグナルペプチドから選択される。ある特定の実施形態では、シグナル配列は、重鎖配列及び軽鎖配列の両方に融合される。例示的な配列は、配列番号６３のヌクレオチド配列によってコードされ得るＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号６２）である（表２、図２Ａ及びＢを参照されたい）。代替的に、発現に適切であり、眼（眼組織）におけるＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の選択的発現または指向性発現を引き起こし得るシグナル配列を以下の表２に提供する。肝臓（表３）及び筋肉（表４）細胞において活性なシグナル配列も提供される。




５．２．５ 非翻訳領域
ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、１つ以上の非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えば、３’及び／または５’ＵＴＲを含む。ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、所望のタンパク質発現レベルに関して最適化されている。ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、導入遺伝子のｍＲＮＡ半減期に関して最適化されている。ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、導入遺伝子のｍＲＮＡの安定性に関して最適化されている。ある特定の実施形態では、ＵＴＲは、導入遺伝子のｍＲＮＡの二次構造に関して最適化されている。
５．２．６ 逆方向末端反復
ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、１つ以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。ＩＴＲ配列は、組換え遺伝子発現カセットを、ウイルスベクターのビリオンにパッケージングするために使用され得る。ある特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ２に由来する（例えば、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７９（１）：３６４－３７９；米国特許第７，２８２，１９９Ｂ２号、米国特許第７，７９０，４４９Ｂ２号、米国特許第８，３１８，４８０Ｂ２号、米国特許第８，９６２，３３２ Ｂ２号及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６号（その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。好ましい実施形態では、ＩＴＲをコードするヌクレオチド配列は、例えば、配列番号５８（５′－ＩＴＲ）または６０（３′－ＩＴＲ）のヌクレオチド配列を含み得る。ある特定の実施形態では、自己相補性ベクター、例えば、ｓｃＡＡＶを産生するために使用される修飾ＩＴＲが使用され得る（例えば、Ｗｕ，２００７，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（２）：１７１－８２、ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４；ならびに米国特許第６，５９６，５３５号；同第７，１２５，７１７号；及び同第７，４５６，６８３号（その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。好ましい実施形態では、修飾ＩＴＲをコードするヌクレオチド配列は、例えば、配列番号５８（５′－ＩＴＲ）または６０（３′－ＩＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでもよく、またはｓｃＡＡＶ、配列番号５９（ｍ ５’ＩＴＲ）もしくは配列番号６１（ｍ ３’ＩＴＲ）に対して修飾されてもよい。
５．２．７ 導入遺伝子
導入遺伝子は、本明細書に開示する治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質に基づく、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質、例えば、ＴＮＦＲ１：Ｆｃ融合タンパク質またはＴＮＦＲ２：Ｆｃ融合タンパク質をコードする。特定の実施形態では、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質は、ＴＮＦＲ及び／またはＦｃドメイン上の追加のグリコシル化部位を含有するように操作される。加えて、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、Ｎ２９７でのグリコシル化部位を改変して、その部位でのグリコシル化を防止するように操作され得る（例えば、Ｎ２９７での別のアミノ酸による置換、及び／またはＴ２９７でのＴまたはＳではない残基による置換によって、グリコシル化部位をノックアウトする）。かかるＦｃドメインは、「非グリコシル化」されている。
５．２．７．１ ＨｕＰＴＭ ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質の発現のためのコンストラクト
ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、抗ＴＮＦα融合タンパク質をコードし、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインを含むポリペプチドにペプチド結合を通じて共有結合した、ヒトＴＮＦα受容体Ｉ型（ＴＮＦＲ１）またはＩＩ型（ＴＮＦＲ２）の可溶性細胞外部分を含む。
ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、免疫グロブリン重鎖（配列番号３または４）のＦｃドメイン（例えば、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む）の全てまたは一部分に融合したＴＮＦＲ２（配列番号２）の細胞外ドメインの全てまたはＴＮＦα結合部分をコードする。好ましい実施形態では、導入遺伝子は、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードし、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、ペプチド結合を通じて、発現時に会合して二量体ＴＮＦＲ２：Ｆｃ融合タンパク質を形成する、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン（重鎖ＣＨ２、及び重鎖ＣＨ３、及びヒンジ領域を含む）に共有結合した、ＴＮＦＲ２のヒト可溶性細胞外ドメインを含む。特に、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質は、エタネルセプト（リーダー配列と共に配列番号１０もしくは１１のアミノ酸配列を有する）、またはエタネルセプト－ｓｚｚｓ（ＥＲＥＬＺＩ（登録商標））及びエタネルセプト－ｙｋｒｏ（ＥＴＩＣＯＶＯ（登録商標））を含む、任意のバイオシミラー形態のエタネルセプトである。
他の実施形態では、導入遺伝子は、免疫グロブリン重鎖Ｆｃドメイン（配列番号６または７）の全てまたは一部に融合されたＴＮＦＲ１（配列番号１）の可溶性細胞外ドメインの全てまたは一部をコードする。好ましい実施形態では、導入遺伝子は、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードし、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、ペプチド結合を通じて、発現時に会合して二量体ＴＮＦＲ１：Ｆｃ融合タンパク質（配列番号１２）を形成する、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（重鎖ＣＨ２、及び重鎖ＣＨ３、及びヒンジ領域を含む）に共有結合した、ＴＮＦＲ１のヒト可溶性細胞外ドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＮＦＲ１は、トロンビン切断部位ＬＶＰＲＧＳ（配列番号８）を介してＦｃドメインに融合される。ある特定の実施形態では、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質は、ＥＹＳ０６０（配列番号１２のアミノ酸配列を有する）である。
組換えＡＡＶコンストラクトは、細胞、細胞培養物において、または対象において、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質を発現する。ＴＮＦＲドメイン及びＦｃドメインの可溶性細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列は、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化されてもよく、ヒト細胞での発現を促進するために、配列でのＣｐＧ二量体の発生率を低減していてもよい。好ましい実施形態では、導入遺伝子は、本明細書に開示する治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質、例えば、図１または２に示されるＴＮＦＲ：Ｆｃ融合タンパク質（図２Ａ及び２Ｂに提供される配列）のうちのいずれかをコードする。
ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインであるが、他の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭであり得る。導入遺伝子から発現されるＦｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ Ｆｃドメインを有し得るが、好ましくは、ヒトＩｇＧ１に由来する。Ｆｃドメインは、本明細書に記載の重鎖ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメイン（図４及び表５を参照されたい）、またはそれらの断片もしくはバリアントの一部または全てを含むことができる。
Ｆｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、抗体アイソタイプと共に変化する１つ以上のエフェクター機能を有する。エフェクター機能は、野生型または治療用Ｆｃ融合タンパク質のエフェクター機能と同じであるか、または以下のセクション５．２．８に開示されるＦｃ修飾を使用して、１つ以上のエフェクター機能を付加、強化、修飾、または阻害するようにそこから修飾することができる。ある特定の実施形態では、ＨｕＰＴＭ非モノクローナル抗体導入遺伝子は、エタネルセプトについて表６に示される本明細書に記載の治療用融合タンパク質のＦｃドメインポリペプチド、または表５に示されるＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４アイソタイプの例示的なＦｃドメインに示される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むＦｃポリペプチドを含む、融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ＨｕＰＴＭ融合タンパク質は、Ｆｃポリペプチドまたは表５のＦｃポリペプチド配列のバリアントである配列を含み、その配列を、以下のセクション５．２．８に記載されている技術のうちの１つ以上で修飾して、Ｆｃポリペプチドのエフェクター機能を改変した。
組換えＡＡＶコンストラクトは、細胞、細胞培養物において、または対象において、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質を発現する。抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ヒト細胞での発現に最適化されたコドンであってもよく、ヒト細胞での発現を促進するために、配列中のＣｐＧ二量体の発生率を低減していてもよい。好ましい実施形態では、導入遺伝子は、本明細書に開示する治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のうちのいずれか、例えば、本明細書の図２Ａ及び２Ｂに示される治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質エタネルセプトまたはＥＹＳ６０６をコードし、ある特定の実施形態では、表６または代替として表５に提供される関連するＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインについては、セクション５．２．８でさらに考察する。例示的なＦｃドメイン配列を表６、ならびに図３及び表５に提供する。図２Ａは、ＴＮＦＲ２：Ｆｃ融合エタネルセプトのアミノ酸配列を提供し、図２Ｂは、ＴＮＦＲ１：Ｆｃ融合ＥＹＳ６０６のアミノ酸配列を提供する（表６も参照されたい）。
一部の実施形態では、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の発現のための導入遺伝子は、本明細書にさらに記載される免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインを含有するポリペプチドに、例えばペプチド結合を通じて共有結合した、ヒトＴＮＦα受容体Ｉ型（ＴＮＦＲ１）またはＩＩ型（ＴＮＦＲ２）の可溶性細胞外部分をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。一部の実施形態では、ＴＮＦＲ１は、トロンビン切断部位（配列番号８）を介してＦｃドメインに融合される。
ＴＮＦＲ１またはＴＮＦＲ２の可溶性細胞外ドメイン、任意選択で、本明細書に開示する治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のトロンビン切断部位、ヒンジ領域、及びＩｇＧ１ Ｆｃ鎖（ＣＨ２＋ＣＨ３）をコードするヌクレオチド配列を表７に提供する。ある特定の実施形態では、これらのヌクレオチド配列は、ヒト細胞での発現に最適化されたコドンである。例えば、表７のエタネルセプトのコドン最適化配列（配列番号１５～１８）を参照されたい。
導入遺伝子は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域の部分（例えば、配列ＣＰＰＣＰＡ（配列番号１５３）を含有する部分）を含んでもよい。配列ＣＣＰＣＰＡ（配列番号１５３）を含むヒンジ領域の部分を含有しないＦｃドメイン配列は、鎖内ジスルフィド結合を形成せず、一方、配列ＣＰＰＣＰＡ（配列番号１５３）を含有するＣ末端にヒンジ領域の一部分を有するＦｃ融合ドメイン配列は、鎖内ジスルフィド結合を形成し、したがって、二量体融合タンパク質断片を形成する。一部の実施形態では、ヒンジは、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ（配列番号１４５）、及び特に、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＬ（配列番号１４６）、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号１４７）、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡ（配列番号１４８）、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＬＣＰＰＣＰＡ（配列番号１４９）、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ（配列番号２１）、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬ（配列番号１５２）、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬ（配列番号１５０）またはＥＰＫＳＣＤＫＴＨＬＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬ（配列番号１５１）の全てまたは一部分を含有する。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、以下のエレメントを以下の順序で含む：ａ）構成的もしくは誘導性（例えば、低酸素誘導性もしくはリファマイシン誘導性）プロモーター配列、または組織特異的プロモーター／調節領域、例えば、表１または表１ａに提供する調節領域のうちの１つ、特に眼組織特異的発現を促進するプロモーター、及びｂ）導入遺伝子（例えば、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質）をコードする配列。ある特定の実施形態では、導入遺伝子を含む配列は、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインを含有するポリペプチドに、例えば、ペプチド結合を通じて共有結合した、ヒトＴＮＦα受容体Ｉ型（ＴＮＦＲ１）またはＩＩ型（ＴＮＦＲ２）の可溶性細胞外部分を含む、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、導入遺伝子を含む配列は、当該ヒト眼細胞における分泌及び翻訳後修飾を指向する、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のＮ末端におけるシグナル配列をコードする。他の実施形態では、配列は、配列番号１０、１１または１２のアミノ酸配列を有する導入遺伝子産物をコードする。好ましい実施形態では、抗ＴＮＦα融合タンパク質は、エタネルセプトまたはＥＹＳ６０６である。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、以下のエレメントを以下の順序で含む：ａ）例えば、表１及び１ａのプロモーターまたは調節領域のうちの１つの構成的もしくは誘導性プロモーター配列または組織特異的プロモーター、及びｂ）導入遺伝子（例えば、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質）をコードする配列（導入遺伝子は、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質を形成するために、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインを含むポリペプチドに、例えば、ペプチド結合を通じて共有結合した、シグナルペプチド、ＴＮＦα受容体Ｉ型（ＴＮＦＲ１）またはＩＩ型（ＴＮＦＲ２）の可溶性細胞外部分を含む）。他の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、以下のエレメントを以下の順序で有する：ａ）表１及び１ａに列挙される眼組織特異的プロモーター、及びｂ）シグナルペプチドを含む導入遺伝子をコードする配列（導入遺伝子は、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質を形成するために、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインを含有するポリペプチドに、例えば、ペプチド結合を通じて共有結合した、シグナルペプチド、ヒトＴＮＦα受容体Ｉ型（ＴＮＦＲ１）またはＩＩ型（ＴＮＦＲ２）の可溶性細胞外部分を含む）。特定の実施形態では、本明細書に提供するウイルスベクターは、ＬＳＰＲＧＳのアミノ酸配列（配列番号１５８）を有するＴＮＦＲドメインのＣ末端に連結したトロンビン切断部位をさらに含む。
特定の実施形態では、ＡＡＶ２．７ｍ８キャプシド、ＡＡＶ８キャプシド、ＡＡＶ３Ｂキャプシド、またはＡＡＶｒｈ７３キャプシドのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるウイルスキャプシド（図３を参照されたい）、及びＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接した発現カセット（発現カセットは、１つ以上の眼組織における導入遺伝子の発現を制御する１つ以上の調節配列に作動可能に連結した、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含む）を含む人工ゲノムを含む、ＡＡＶベクターを提供する。
治療用融合タンパク質をコードし、発現するｒＡＡＶベクターは、治療用融合タンパク質による症状の治療、予防、または改善に適した疾患または状態の症状を治療または予防または改善するために投与され得る。また、ｒＡＡＶベクター及びそれらをコードするコンストラクトを使用して、ヒト細胞においてＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質を発現させる方法も提供する。
５．２．８ Ｆｃ領域修飾
ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、会合して二量体Ｆｃ融合タンパク質を形成する抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする。したがって、導入遺伝子は、例えば、重鎖のヒンジ領域の全てまたは一部分及びＦｃドメインペプチドのＮ末端を含む、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメイン（図２Ａ及び２Ｂ）を含有するポリペプチドに、例えば、ペプチド結合を通じて共有結合した、ヒトＴＮＦα受容体Ｉ型（ＴＮＦＲ１）またはＩＩ型（ＴＮＦＲ２）の可溶性細胞外部分をコードするヌクレオチド配列を含む。表６は、本明細書に記載のある特定の治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質に対するＦｃポリペプチドのアミノ酸配列を提供する。代替的に、その配列が図４に提供され、表５に提供されるＩｇＧ２またはＩｇＧ４ Ｆｃドメインを利用してもよい。詳述されるように、導入遺伝子は、本明細書に提供するヒンジ領域のＮ末端においてヒトＴＮＦＲの可溶性細胞外部分をコードするヌクレオチド配列に連結された、治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のＦｃドメインポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み得る（図２Ａ及び２Ｂ及び表６に提供されるアミノ酸配列と共に）。
「Ｆｃ領域」という用語は、２つの「Ｆｃポリペプチド」（または「Ｆｃドメイン」）の二量体を指し、各「Ｆｃポリペプチド」は、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の重鎖定常領域を含む。一部の実施形態では、「Ｆｃ領域」は、１つ以上のジスルフィド結合、化学リンカー、またはペプチドリンカーによって連結された２つのＦｃポリペプチドを含む。「Ｆｃポリペプチド」は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの少なくとも最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、またはＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインを指し、また、これらのドメインに対する可撓性ヒンジＮ末端の一部または全てを含み得る。ＩｇＧについては、例えば、「Ｆｃポリペプチド」は、免疫グロブリンドメインＣｇａｍｍａ２（Ｃγ２、しばしばＣＨ２ドメインと称される）及びＣｇａｍｍａ３（Ｃγ３、ＣＨ３ドメインとも称される）を含み、Ｃｇａｍｍａ１（Ｃγ１、ＣＨ１ドメインとも称される）とＣＨ２ドメインとの間のヒンジドメインの下部を含み得る。Ｆｃポリペプチドの境界は異なる場合があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃポリペプチドは、通常、Ｔ２２３またはＣ２２６またはＰ２３０で始まり、そのカルボキシル末端までの残基を含むように定義され、番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｖａ．）にあるようなＥＵインデックスに従う。ＩｇＡの場合、例えば、Ｆｃポリペプチドは、免疫グロブリンドメインＣアルファ２（Ｃα２）及びＣアルファ３（Ｃα３）を含み、Ｃアルファ１（Ｃα１）とＣα２との間のヒンジの下部を含み得る。
ある特定の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、エタネルセプトまたはＥＹＳ６０６のＦｃポリペプチドである（表６を参照されたい）。他の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧ Ｆｃポリペプチドである。Ｆｃポリペプチドは、例えば、治療用抗体の所望のエフェクター活性に応じて、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４アイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４ Ｆｃドメイン配列のアラインメントについては、図４を参照されたい）に由来し得るか、またはＩｇＧ３ Ｆｃドメインであり得る。一部の実施形態では、Ｆｃドメインを含む操作された重鎖定常領域（ＣＨ）は、キメラである。したがって、キメラＣＨ領域は、２つ以上の免疫グロブリンアイソタイプ及び／またはサブタイプに由来するＣＨドメインを組み合わせる。例えば、キメラ（またはハイブリッド）ＣＨ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／またはＩｇＭからのＦｃ領域の一部または全てを含む。他の例では、キメラＣＨ領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ３ドメインの一部または全てと組み合わされた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ２ドメインの一部または全てを含む。他の実施形態では、キメラＣＨ領域は、キメラヒンジ領域を含有する。
一部の実施形態では、組換えベクターは、操作された（変異体）Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ定常領域の操作されたＦｃ領域を含む治療用Ｆｃ融合物をコードする。ＩｇＧ抗体の抗体定常領域、Ｆｃ領域またはＦｃ断片への修飾は、列挙された修飾（複数可）なしの野生型ＩｇＧ定常領域、またはＩｇＧ重鎖定常領域を有する対応する抗体と比較して、Ｆｃ受容体結合または新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合、したがって半減期、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性、及び／またはＡＤＰＣ活性などの１つ以上のエフェクター機能を改変し得る。したがって、一部の実施形態では、抗体は、１つ以上のＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、ＦｃγＲＩＶ、またはＦｃＲｎ受容体）への（列挙された修飾（複数可）なしの参照または野生型定常領域と比較して）改変した結合を示すＩｇＧ抗体の抗体定常領域、Ｆｃ領域またはＦｃ断片を提供するように操作され得る。一部の実施形態では、野生型ＩｇＧ定常領域を有する対応する抗体、または列挙された修飾（複数可）なしのＩｇＧ定常と比較して、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、もしくはＡＤＣＰ活性などの１つ以上の改変したエフェクター機能を示すＩｇＧ抗体の抗体、抗体定常領域、Ｆｃ領域またはＦｃ断片。
「エフェクター機能」は、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用から生じる生化学的事象を指す。エフェクター機能としては、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰなどのＦｃγＲ媒介性エフェクター機能、ならびにＣＤＣなどの補体媒介性エフェクター機能が挙げられる。
「エフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃ受容体を発現し、１つ以上のエフェクター機能を媒介する免疫系の細胞を指す。エフェクター細胞には、限定されないが、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、Ｂ細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びＴ細胞が含まれ、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルを含む任意の生物に由来し得る。
「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」は、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性エフェクター（免疫）細胞が、標的細胞に結合した抗体を認識し、続いて、標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。
「ＡＤＣＰ」または「抗体依存性細胞媒介性食作用」は、ＦｃＲを発現する非特異的細胞傷害性エフェクター（免疫）細胞が、標的細胞に結合した抗体を認識し、続いて、標的細胞の食作用を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。
「ＣＤＣ」または「補体依存性細胞傷害」は、１つ以上の補体タンパク質成分が、標的細胞に結合した抗体を認識し、続いて、標的細胞の溶解を引き起こす、反応を指す。
一部の実施形態では、Ｆｃドメインの修飾には、ＩｇＧ定常領域のＥＵ番号付けを参照して、以下の修飾及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない（図４を参照されたい）：２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４８、２４９、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１５、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３４２、３４４、３５６、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３７３、３７５、３７６、３７８、３８０、３８２、３８３、３８４、３８６、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４２８、４３０、４３３、４３４、４３５、４３７、４３８、及び４３９。
ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧのアミノ酸残基２５１～２５６、２８５～２９０、３０８～３１４、３８５～３８９、及び４２８～４３６のうちの１つ以上のアミノ酸付加、欠失、または置換を含む。一部の実施形態では、２５１～２５６、２８５～２９０、３０８～３１４、３８５～３８９、及び４２８～４３６（ＫａｂａｔのＥＵ番号付け、図４を参照されたい）は、ヒスチジン、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、またはグルタミンで置換される。一部の実施形態では、非ヒスチジン残基は、ヒスチジン残基で置換される。一部の実施形態では、ヒスチジン残基は、非ヒスチジン残基で置換される。
操作されたＦｃを有する抗体によるＦｃＲｎ結合の強化は、野生型Ｆｃを有する抗体と比較して、ＦｃＲｎに対する親和性強化抗体の優先的な結合をもたらし、したがって、ＦｃＲｎ親和性強化抗体の正味の強化されたリサイクルをもたらし、これにより、抗体半減期がさらに増加する。強化されたリサイクルアプローチは、例えば、Ｃ５、サイトカイン、または細菌もしくはウイルス抗原などの「高力価」循環抗原を含む、抗原の非常に効果的な標的化及びクリアランスを可能にする。
ある特定の実施形態では、（操作された修飾のない）野生型Ｆｃ領域と比較して、血清中のＦｃＲｎへの強化された結合を有するＩｇＧ抗体の修飾された定常領域、Ｆｃ領域またはＦｃ断片が提供される。場合によっては、抗体、例えば、ＩｇＧ抗体は、中性ｐＨ、例えば、ｐＨ７．４以上でＦｃＲｎに結合するように操作され、（操作された修飾のない）野生型Ｆｃ領域と比較して、ＦｃＲｎへの結合のｐＨ依存性を強化する。場合によっては、抗体、例えば、ＩｇＧ抗体は、酸性ｐＨでのＦｃＲｎに対する野生型ＩｇＧ及び／または参照抗体の結合に対して、ならびに（例えば、中性ｐＨ、例えば、ｐＨ７．４以上での）血清中のＦｃＲｎとの結合と比較して、エンドソーム内のＦｃＲｎへの強化された結合（例えば、増加した親和性またはＫＤ）を示すように操作される。野生型ＩｇＧ定常領域を有する対応する抗体または列挙された修飾（複数可）のないＩｇＧ定常を有する抗体と比較して、改善された血清もしくは常駐組織半減期を示すＩｇＧ抗体の操作された抗体定常領域、Ｆｃ領域もしくはＦｃ断片を有する抗体が提供される。
かかるＦｃ修飾の非限定的な例には、例えば、２５０位（例えば、ＥまたはＱ）、２５０位及び４２８位（例えば、ＬまたはＦ）、２５２位（例えば、ＬＮ／Ｙ／ＷまたはＴ）、２５４位（例えば、ＳまたはＴ）、及び２５６位（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）での修飾、あるいは４２８位及び／または４３３位（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱもしくはＫ）及び／または４３４位（例えば、Ｈ／ＦもしくはＹ）での修飾、あるいは２５０位及び／または４２８位での修飾、あるいは３０７位または３０８位（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）、及び４３４位での修飾が含まれる。一実施形態では、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）及び４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）の修飾；４２８Ｌ、２５９ｌ（例えば、Ｖ２５９ｌ）、及び３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）の修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）及び４３４（例えば、４３４Ｙ）の修飾；２５２、２５４、及び２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔ、及び２５６Ｅ）の修飾；２５０Ｑ及び４２８Ｌの修飾（例えば、Ｔ２５０Ｑ及びＭ４２８Ｌ）；３０７及び／または３０８の修飾（例えば、３０８Ｆもしくは３０８Ｐ）（ＥＵ番号付け、図４を参照されたい）を含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｍ２５２変異を含むｈＩｇＧ１ Ｆｃなどの変異体型であってもよく、例えば、Ｍ２５２Ｙ及びＳ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ（「ＹＴＥ変異」）は、ヒトＦｃＲｎに対する親和性の強化（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９：５１７１－５１８０）及びｈＦｃＲｎに結合したこの変異体型抗体の後続の結晶構造を示し、２つの塩架橋の作製をもたらす（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ，ｅｔ ａｌ．２０１４，ＪＢＣ ２８９（１１）：７８１２－７８２４）。ＹＴＥ変異を有する抗体は、サル及びヒトに投与されており、薬物動態特性が著しく改善されている（Ｈａｒａｙａ，ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，３４（１）：２５－４１）。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域における１つ以上のアミノ酸残基への修飾は、全身循環（血清）における半減期を低減し得るが、ＦｃＲｎ結合（例えば、Ｈ４３５Ａ、ＫａｂａｔのＥＵ番号付け）を無効にすることによって、組織（例えば、眼）における保持の改善をもたらす（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７，ＭＡｂｓ ９：２６９－２８４、及びＫｉｍ，１９９９，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９：２８１９）。
一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃポリペプチド（例えば、抗体）の所望の薬物動態特性に影響を及ぼすことなく、正常なＦｃエフェクター機能の全て、一部を活性化するか、または全く活性化しないように操作されてもよい。改変されたエフェクター機能を有するＦｃポリペプチドは、治療用タンパク質によるエフェクター細胞の活性化などの望ましくない副作用を低減し得るため、望ましい場合がある。
エフェクター機能を改変またはさらにはアブレーションする方法は、抗体のヒンジ領域アミノ酸残基に対する変異（複数可）または修飾（複数可）を含み得る。例えば、ＥＵ番号付けシステムによれば、２３４Ａ、２３７Ａ、及び２３８Ｓ置換を含むＩｇＧ Ｆｃドメイン変異体は、減少した補体依存性溶解及び／または細胞媒介性破壊を示す。下部ヒンジにおける欠失及び／または置換は、例えば、ヒンジドメイン（ＥＵ番号付け）内の位置２３３～２３６が欠失しているか、またはグリシンに修飾される場合、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を著しく低減することが、当該技術分野で示されている。
特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインがグリコシル化されないように、２９７でグリコシル化部位を改変するために、残基２９７または２９９に置換を有する、アグリコシル化Ｆｃドメインである。かかるアグリコシル化Ｆｃドメインは、低減したＡＤＣＣまたは他のエフェクター活性を有し得る。
改変したエフェクター機能を有する変異体及び／またはキメラＣＨ領域を含むタンパク質の非限定的な例、ならびに変異体抗体を操作及び試験する方法は、当該技術分野、例えば、Ｋ．Ｌ．Ａｍｏｕｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９，２９：２６１３－２６２４、Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２００６，１０３：４００５、２００７年６月１４日に公開された米国特許出願公開第２００７／０１３５６２０Ａ１号、２００８年６月２６日に公開された米国特許出願公開第２００８／０１５４０２５Ａ１号、２０１０年９月１６日に公開された米国特許出願公開第２０１０／０２３４５７２Ａ１号、２０１２年９月６日に公開された米国特許出願公開第２０１２／０２２５０５８Ａ１号、２０１５年１１月２６日に公開された米国特許出願公開第２０１５／０３３７０５３Ａ１号、２０１６年１０月６日に公開された国際公開第ＷＯ２０／１６１６１０１０Ａ２号、２０１６年６月７日に発行された米国特許第９，３５９，４３７号、及び２０１８年８月２１日発行された米国特許第１０，０５３，５１７号（それらの全てが、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
全てのヒトＩｇＧサブクラスの重鎖遺伝子において保存されるＣ末端リジン（－Ｋ）は、一般に、血清中を循環する抗体からは存在せず、Ｃ末端リジンは循環中で切断され、循環ＩｇＧの異種集団をもたらす（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５，ｍＡｂｓ ７：６７２－６８０）。全長ｍＡｂのベクター化コンストラクトにおいて、Ｆｃ末端のＣ末端リジン（－Ｋ）またはグリシン－リジン（－ＧＫ）をコードするＤＮＡを欠失させて、より均質な抗体産物を原位置で産生することができる。（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１７ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．３３：７８６－７９４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
５．２．９ ベクターの製造及び試験
本明細書に提供するウイルスベクターは、宿主細胞を使用して製造され得る。本明細書に提供するウイルスベクターは、哺乳動物宿主細胞、例えば、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、Ｗ１３８、ＨｅＬａ、２９３、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、初代線維芽細胞、肝細胞、及び筋芽細胞を使用して製造され得る。本明細書に提供するウイルスベクターは、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、またはハムスターからの宿主細胞を使用して製造され得る。
宿主細胞は、導入遺伝子及び関連するエレメント（例えば、ベクターゲノム）、ならびに宿主細胞においてウイルスを産生する手段、例えば、複製及びキャプシド遺伝子（例えば、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）をコードする配列を用いて安定に形質転換される。ＡＡＶ８キャプシドを伴う組換えＡＡＶベクターの産生方法については、米国特許第７，２８２，１９９ Ｂ２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の発明を実施するための形態のセクションＩＶを参照されたい。当該ベクターのゲノムコピー力価は、例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分析によって決定し得る。ビリオンは、例えば、ＣｓＣｌ２沈降法によって回収し得る。
代替的には、昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現システムは、ＡＡＶベクターを産生するために使用され得る。レビューについては、Ａｐｏｎｔｅ－Ｕｂｉｌｌｕｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０２：１０４５－１０５４（製造技術について、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
インビトロアッセイ、例えば、細胞培養アッセイを使用して、本明細書に記載のベクターからの導入遺伝子発現を測定することができ、ゆえに、例えば、ベクターの効力を示すことができる。例えば、ヒト胚性網膜細胞に由来する細胞株であるＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞株（Ｌｏｎｚａ）、または網膜色素上皮細胞、例えば、網膜色素上皮細胞株ｈＴＥＲＴ ＲＰＥ－１（ＡＴＣＣ（登録商標）から入手可能）を使用して、導入遺伝子発現を評価することができる。一度発現すると、発現された産物の特徴を決定することができ、これには、ヒトグリコシル化抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質と関連するグリコシル化及びチロシン硫酸化パターンの決定が含まれる。グリコシル化パターン及びそれらを決定する方法については、セクション５．４において考察されている。加えて、細胞発現ヒトグリコシル化抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のグリコシル化／硫酸化から生じる利益は、当該技術分野で既知のアッセイ、例えば、セクション５．４に記載の方法を使用して決定することができる。
ベクターゲノム濃度（ＧＣ）またはベクターゲノムコピーは、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）またはｄｄＰＣＲ（商標）（ＢｉｏＲａｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して評価され得る。一実施例では、房水及び／または硝子体液試料などの眼組織試料は、いくつかの時点で得られる。別の実施例では、数匹のマウスは、注射後の様々な時点で屠殺される。眼組織試料を、ベクターコピー数について、全ＤＮＡ抽出及びｄＰＣＲアッセイに供する。組織１グラム当たりのベクターゲノム（導入遺伝子）のコピーは、単一の生検試料中で測定されてもよく、または連続した時点で様々な組織切片で測定されてもよく、眼全体にわたるＡＡＶの広がりを明らかにする。収集した眼液または組織からの総ＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット、及びＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計を使用して測定されたＤＮＡ濃度を用いて抽出する。各組織試料のベクターコピー数を決定するために、Ｎａｉｃａ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲシステム（Ｓｔｉｌｌａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてデジタルＰＣＲを行う。２色多重化システムを適用して、導入遺伝子ＡＡＶ及び内因性対照遺伝子を同時に測定する。簡潔には、導入遺伝子プローブは、ＦＡＭ（６－カルボキシフルオレセイン）染料で標識することができ、一方、内因性制御プローブは、ＶＩＣ蛍光染料で標識することができる。二倍体細胞当たりの特定の組織切片における送達されたベクターのコピー数は、次のように計算される：（ベクターコピー数）／（内因性対照）×２。経時的に、角膜、虹彩、毛様体、シュレム管細胞、線維柱帯、網膜細胞、ＲＰＥ細胞、ＲＰＥ脈絡膜組織、または視神経細胞などの特定の細胞型または組織におけるベクターコピーは、組織による導入遺伝子の持続的な発現を示し得る。
２．９ 組成物
ヒト対象への投与に好適な薬学的組成物には、生理学的に適合性の水性緩衝液、界面活性剤及び任意選択の賦形剤を含む、製剤緩衝液中の組換えベクターの懸濁液が含まれる。かかる製剤緩衝液は、多糖類、界面活性剤、ポリマー、または油のうちの１つ以上を含むことができる。一部の実施形態では、薬学的組成物は、対象への投与のための薬学的に許容される担体と組み合わされたｒＡＡＶを含む。一実施形態では、「薬学的に許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒトでの使用のために、連邦もしくは州政府の規制当局によって承認された、または米国薬局方もしくは一般に認識されている他の薬局方に列挙されていることを意味する。「担体」という用語は、薬剤と共に投与される希釈剤、補助剤（例えば、フロイント完全及び不完全補助剤）、賦形剤、またはビヒクルを指す。かかる薬学的担体は、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む、石油、動物、植物、または合成起源のものを含む、水及び油などの滅菌液体であり得る。水は、薬学的組成物が静脈内に投与されるときの共通の担体である。生理食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール溶液もまた、特に注射可能溶液用の液体担体として用いられ得る。好適な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が含まれる。薬学的に許容される担体、賦形剤、及び安定剤のさらなる例には、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン及びゼラチンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／または当該技術分野で既知の、ＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物はまた、上記の成分に加えて、潤滑剤、湿潤剤、甘味料、香味剤、乳化剤、懸濁化剤、及び防腐剤を含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性製剤等の形態をとることができる。
３． 非感染性ブドウ膜炎を治療する方法
別の態様では、非感染性ブドウ膜炎または抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質で治療することができる他の適応症の治療を必要とする対象においてそれを行うための方法であって、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質及びそのバリアントをコードする発現カセットを含む組換えＡＡＶ粒子の投与を含む、方法を提供する。治療を必要とする対象は、非感染性ブドウ膜炎に罹患している対象、またはその素因がある対象、例えば、非感染性ブドウ膜炎、または抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質で治療され得る他の適応症を発症するリスクがあるか、または再発するリスクがある対象を含む。かかる遺伝子療法が投与される対象は、抗ＴＮＦα、例えば、エタネルセプト、アダリムマブ、インフリキシマブ、またはゴリムマブに応答するものであり得る。特定の実施形態では、方法は、非感染性ブドウ膜炎と診断され、ある特定の実施形態では、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質での治療に応答すると特定されるか、または抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質での療法のための良好な候補と考えられる患者を治療することを包含する。特定の実施形態では、患者は、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質で以前に治療されている。応答性を決定するために、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質（例えば、ヒト細胞培養物、バイオリアクター等において産生される）を対象に直接投与することができる。
特定の実施形態では、非感染性ブドウ膜炎または抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質での治療に適している他の適応症の治療を必要とするヒト対象においてそれを行う方法であって、当該対象の眼（または肝臓及び／または筋肉）に、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含む治療有効量の組換えヌクレオチド発現ベクター、ヒト眼組織細胞における導入遺伝子の発現を制御する１つ以上の調節配列に作動可能に連結したＦｃ領域を投与することにより、ｍＡｂまたはその抗原結合断片のＨｕＰＴＭ形態を放出するデポーが形成されることを含む、方法を提供する。網膜下、硝子体内、前房内、または脈絡膜上投与は、可溶性導入遺伝子産物の発現を、以下の網膜細胞タイプのうちの１つ以上においてもたらすべきである：ヒト光受容体細胞（錐体細胞、桿体細胞）；水平細胞；双極細胞；アマルクリン細胞；網膜神経節細胞（ミゼット細胞、パラソル細胞、二層化細胞、巨大網膜神経節細胞、感光性神経節細胞、及びミュラーグリア）；ならびに網膜色素上皮細胞または他の眼組織細胞：角膜細胞、虹彩細胞、毛様体細胞、シュレム管細胞、線維柱帯細胞、ＲＰＥ－コロイド組織細胞、または視神経細胞。
疾患または障害の治療を必要とする対象においてそれを行うための組換えベクター及び薬学的組成物は、セクション５．２．に記載されている。かかるベクターは、ヒト眼組織、または肝臓及び／または筋肉細胞に対して向性を有するべきであり、非複製ｒＡＡＶ、特にＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ８、ＡＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶｒｈ７３キャプシドを担持するものを含むことができる。組換えベクターは、例えば、組換えベクターを眼に導入することによって、組換えベクターが眼組織細胞に入るように、任意の様式で投与され得る。かかるベクターは、ヒト眼組織細胞及び／またはヒト肝臓及び筋肉細胞における導入遺伝子の発現を制御する１つ以上の調節配列をさらに含むべきであり、これらには、ヒトロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）プロモーター（配列番号５４もしくは１１７）、マウス錐体アレスチン（ＣＡＲ）プロモーター（配列番号１１４～１１６）、ヒト赤オプシン（ＲｅｄＯ）プロモーター（配列番号１１２）、またはＢｅｓｔ１／ＧＲＫプロモーター（配列番号１６１）が含まれるが、これらに限定されない（表１及び１ａも参照されたい）。
５．４ Ｎ－グリコシル化、チロシン硫酸化、及びＯ－グリコシル化
本明細書に開示するＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（一次配列）は各々、Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列内のグリコシル化位置について、Ｎ－グリコシル化またはＯ－グリコシル化が行われる少なくとも１つの部位（図２Ａ及び２Ｂを参照されたい）を含む。翻訳後修飾はまた、全長抗体のＦｃドメイン、特に残基Ｎ２９７においても生じる（ＥＵ番号付けによる、図４を参照されたい）。
代替的に、変異をＦｃドメインに導入して、残基Ｎ２９７（ＥＵ番号付け、図４を参照されたい）のグリコシル化部位を改変し、特に、２９７のアスパラギンまたは２９９のトレオニンを別のアミノ酸で置換して、グリコシル化部位を除去し、非グリコシル化Ｆｃドメインをもたらし得る。
５．４．１ Ｎ－グリコシル化
逆グリコシル化部位
正準Ｎ－グリコシル化配列は、当該技術分野において、Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ（またはＴｈｒ）であることが知られており、Ｘは、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸であり得る。しかしながら、ヒト抗体のアスパラギン（Ａｓｎ）残基が、逆コンセンサスモチーフであるＳｅｒ（またはＴｈｒ）－Ｘ－Ａｓｎの文脈でグリコシル化され得ることが最近実証されており、Ｘは、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸であり得る。Ｖａｌｌｉｅｒｅ－Ｄｏｕｇｌａｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４：３２４９３－３２５０６、及びＶａｌｌｉｅｒｅ－Ｄｏｕｇｌａｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：１６０１２－１６０２２を参照されたい。本明細書に開示されるように、本明細書に開示されるある特定の抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質は、正準及び／または逆コンセンサス配列を含む。
非コンセンサスグリコシル化部位
逆Ｎ－グリコシル化部位に加えて、ヒト抗体のグルタミン（Ｇｌｎ）残基が、非コンセンサスモチーフであるＧｌｎ－Ｇｌｙ－Ｔｈｒの文脈でグリコシル化され得ることが最近実証されている。Ｖａｌｌｉｅｒｅ－Ｄｏｕｇｌａｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：１６０１２－１６０２２を参照されたい。驚くべきことに、本明細書に開示されるある特定のＨｕＧｌｙＦａｂ断片は、かかる非コンセンサス配列を含む。加えて、Ｏ－グリコシル化は、酵素によるセリンまたはトレオニン残基へのＮ－アセチル－ガラクトサミンの付加を含む。抗体のヒンジ領域に存在するアミノ酸残基は、Ｏ－グリコシル化され得ることが実証されている。Ｏ－グリコシル化の可能性は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉで産生される抗原結合断片と比較して、本明細書に提供する治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質に別の利点を付与し、これもまた、Ｅ．ｃｏｌｉが、ヒトＯ－グリコシル化で使用されるものと同等の機構を天然に含まないためである。（代わりに、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＯ－グリコシル化は、細菌が、特定のＯ－グリコシル化機構を含有するように修飾されるときにのみ実証されている。例えば、Ｆａｒｉｄ－Ｍｏａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９：８０８８－８０９８を参照されたい。）
操作されたＮ－グリコシル化部位
ある特定の実施形態では、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸は、通常、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質と会合するよりも（例えば、非修飾状態でＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質と会合するＮ－グリコシル化部位の数と比較して）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超のＮ－グリコシル化部位（正準Ｎ－グリコシル化コンセンサス配列、逆Ｎ－グリコシル化部位、及び非コンセンサスＮ－グリコシル化部位を含む）を含むように修飾される。特定の実施形態では、グリコシル化部位の導入は、抗原結合断片の一次構造内の随所に、Ｎ－グリコシル化部位（正準Ｎ－グリコシル化コンセンサス配列、逆Ｎ－グリコシル化部位、及び非コンセンサスＮ－グリコシル化部位を含む）の挿入によって達成されるが、当該導入は、抗体または抗原結合断片のその抗原への結合に影響を及ぼさない。グリコシル化部位の導入は、Ｎ－グリコシル化部位を生成するために、例えば、可溶性細胞外ＴＮＦＲ－ドメインまたはＦｃドメインの一次構造に新しいアミノ酸を付加することによって（例えば、グリコシル化部位を完全にもしくは部分的に付加する）、または可溶性細胞外ＴＮＦＲドメインもしくはＦｃドメイン内の既存のアミノ酸を変異させることによって達成することができる（例えば、アミノ酸は付加されないが、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の選択されたアミノ酸は、Ｎ－グリコシル化部位を形成するように変異される）。当業者であれば、タンパク質のアミノ酸配列は、当該技術分野で既知のアプローチ、例えば、タンパク質をコードする核酸配列の修飾を含む組換えアプローチを使用して容易に修飾され得ることを認識するであろう。
特定の実施形態では、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質は、網膜、ＣＮＳ、肝臓または筋肉細胞などの哺乳類細胞で発現されたときに、それが高グリコシル化され得るように修飾される。
ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のＮ－グリコシル化
小分子薬物とは異なり、生物学的製剤は通常、異なる効力、薬物動態、及び／または安全性プロファイルを有し得る異なる修飾または形態を有する多くのバリアントの混合物を含む。遺伝子療法またはタンパク質療法アプローチのいずれかで産生される全ての分子が完全にグリコシル化及び硫酸化されることは必須ではない。むしろ、産生された糖タンパク質の集団は、有効性を実証するのに十分なグリコシル化（２，６－シアリル化を含む）及び硫酸化を有するべきである。本明細書に提供する遺伝子療法治療の目標は、例えば、疾患もしくは異常状態の進行を遅らせるかもしくは阻止すること、または疾患もしくは異常状態と関連する１つ以上の症状の重症度を低減することであり得る。
ヒト細胞においてＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が発現されるとき、Ｆｃ融合タンパク質のＮ－グリコシル化部位は、様々な異なるグリカンでグリコシル化され得る。Ｆｃドメインのグリコシル化が特徴付けられており、アスパラギン２９７（ＥＵ番号付け、図４を参照されたい）での単一のＮ結合グリカンである。グリカンは、Ｆｃ受容体への結合などの抗体エフェクター機能に影響を及ぼす、不可欠な構造的及び機能的役割を果たす（例えば、抗体機能におけるＦｃグリコシル化の役割に関する考察については、Ｊｅｎｎｅｗｅｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｅｒ，２０１７，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３８：３５８を参照されたい）。Ｆｃ領域グリカンの除去は、エフェクター機能をほぼ完全に除去する（Ｊｅｎｎｅｗｉｅｎ ａｎｄ Ａｌｔｅｒ、３６２）。Ｆｃグリカンの組成物は、エフェクター機能に影響を与えることが示されており、例えば、高ガラクトシル化及びフコシル化の低減は、ＡＤＣＣ活性を増加させることが示されているが、シアリル化は、抗炎症効果と相関する（３６４において同上）。疾患状態、遺伝学、さらには食事は、インビボでＦｃグリカンの組成に影響を与える可能性がある。組換え発現抗体及びＦｃ融合タンパク質について、グリカン組成物は、組換え発現に使用される宿主細胞の種類によって著しく異なり得、エフェクター機能を改変するために、ＣＨＯなどの細胞培養物中で組換え発現される治療用抗体中のグリカンの組成を制御及び修飾するための戦略が利用可能である（例えば、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．によるＵＳ２０１４／０１９３４０４を参照されたい）。したがって、本明細書に提供するＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質は、有利には、非ヒト宿主細胞で発現される抗体よりも、天然のヒトグリカン組成物に近いＮ２９７でのグリカンを有し得る。
重要なことに、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質がヒト細胞において発現されるとき、原核宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞）におけるインビトロ産生の必要性は回避される。代わりに、本明細書に記載の方法の結果として、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のＮ－グリコシル化部位は、有利には、ヒトの治療に関連し、かつ有益なグリカンで装飾される。かかる利点は、例えば、ＣＨＯ細胞が（１）２，６シアリルトランスフェラーゼを発現せず、したがってＮ－グリコシル化中に２，６シアル酸を添加することができず、（２）Ｎｅｕ５Ａｃの代わりにＮｅｕ５Ｇｃをシアル酸として添加することができ、（３）また、ほとんどの個体に存在する抗α－Ｇａｌ抗体と反応し、高濃度でアナフィラキシーを引き起こす可能性がある免疫原性グリカン、α－Ｇａｌ抗原を産生することができるため、また（４）Ｅ．ｃｏｌｉがＮ－グリコシル化に必要な成分を天然に含有しないため、抗体／抗原結合断片産生に利用される場合には達成不可能である。
抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のグリコシル化パターンを決定するためのアッセイは、当該技術分野で既知である。例えば、ヒドラジン分解を使用して、グリカンを分析することができる。まず、多糖類は、ヒドラジンとのインキュベーションによってそれらの関連するタンパク質から放出される（Ｌｕｄｇｅｒ Ｌｉｂｅｒａｔｅヒドラジン分解グリカン放出キット（Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用することができる）。求核ヒドラジンは、多糖類と担体タンパク質との間のグリコシド結合を攻撃し、付着したグリカンの放出を可能にする。Ｎ－アセチル基は、この処置中に失われ、再Ｎ－アセチル化によって再構成される必要がある。グリカンはまた、ＰＮＧａｓｅ Ｆ及びＥｎｄｏ Ｈなどのグリコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼなどの酵素を使用して放出されてもよく、ヒドラジンよりも清潔に切断され、副作用が少ない。遊離グリカンは、炭素カラム上で精製され、続いて、フルオロフォア２－アミノベンズアミドで還元末端に標識され得る。標識された多糖類は、Ｒｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００２，３０４（１）：７０－９０のＨＰＬＣプロトコルに従って、ＧｌｙｃｏＳｅｐ－Ｎカラム（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分離することができる。得られた蛍光クロマトグラムは、多糖類の長さ及び反復単位の数を示す。構造情報は、個々のピークを収集し、続いて、ＭＳ／ＭＳ分析を行うことによって集めることができる。これにより、反復単位の単糖組成物及び配列を確認することができ、追加として、多糖組成物の均質性を特定することができる。低分子量または高分子量の特定のピークは、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ／ＭＳによって分析することができ、その結果は、グリカン配列を確認するために使用される。クロマトグラム中の各ピークは、一定数の反復単位及びそれらの断片、例えば、糖残基からなるポリマー、例えば、グリカンに対応する。したがって、クロマトグラムは、ポリマー、例えば、グリカン、長さ分布の測定を可能にする。溶出時間は、ポリマー長さの指標であるが、蛍光強度は、それぞれのポリマー、例えば、グリカンのモル存在量と相関する。抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質と関連するグリカンを評価するための他の方法としては、Ｍｏｎｔａｃｉｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｊｏｕｒｎａｌ，３７（２），１６４－１７９に記載されているものが挙げられる。
抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質に関連するグリカンパターンの均一性または不均一性は、グリカンの長さまたはサイズ及びグリコシル化部位に存在するグリカンの数の両方と関連するため、当該技術分野で既知の方法、例えば、グリカンの長さまたはサイズ及び流体力学的半径を測定する方法を使用して評価することができる。サイズ排除、正常相、逆相、及びアニオン交換ＨＰＬＣなどのＨＰＬＣ、ならびにキャピラリー電気泳動は、流体力学半径の測定を可能にする。タンパク質中のグリコシル化部位の数が多いほど、グリコシル化部位が少ない担体と比較して、流体力学的半径の変動が大きい。しかしながら、単一のグリカン鎖が分析されるとき、それらは、より制御された長さのためにより均質であり得る。グリカン長は、ヒドラジン分解、ＳＤＳ ＰＡＧＥ、及びキャピラリーゲル電気泳動によって測定することができる。加えて、均質性はまた、ある特定のグリコシル化部位の使用パターンがより広い／より狭い範囲に変化することを意味する可能性がある。これらの要因は、グリコペプチドＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定することができる。
ある特定の実施形態において、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質はまた、検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα－Ｇａｌを含有しない。「検出可能なＮｅｕＧｃ」または「検出可能なα－Ｇａｌ」または「ＮｅｕＧｃもしくはα－Ｇａｌを含有しない、もしくは有しない」とは、本明細書において、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、当該技術分野で既知である標準的なアッセイ方法によって検出可能なＮｅｕＧｃまたはα－Ｇａｌ部分を含有しないことを意味する。例えば、ＮｅｕＧｃは、Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，“Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ－Ａｃｅｔｙｌ－ａｎｄ Ｎ－Ｇｌｙｃｏｌｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ ａｎｄ Ｕｒｉｎｅ ａｎｄ Ｒａｔ Ｓｅｒｕｍ ｂｙ Ｒｅｖｅｒｓｅｄ－Ｐｈａｓｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．”Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｂ：Ｂｉｏｍｅｄ．３７７，１１１－１１９（ＮｅｕＧｃを検出する方法について、参照により本明細書に組み込まれる）に従い、ＨＰＬＣによって検出され得る。代替的に、ＮｅｕＧｃは、質量分析によって検出され得る。α－Ｇａｌは、ＥＬＩＳＡを使用して（例えば、Ｇａｌｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，“Ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ α－Ｇａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉ－Ｇａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ．”Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．６５（８）：１１２９－３２を参照されたい）、または質量分析法によって（例えば、Ａｙｏｕｂ ｅｔ ａｌ．，２０１３，“Ｃｏｒｒｅｃｔ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｇｌｙｃｏ－ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｃｅｔｕｘｉｍａｂ ｂｙ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ，ｍｉｄｄｌｅ－ｕｐ，ｍｉｄｄｌｅ－ｄｏｗｎ ａｎｄ ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ ＥＳＩ ａｎｄ ＭＡＬＤＩ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．”Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．５（５）：６９９－７１０を参照されたい）検出されてもよい。また、Ｐｌａｔｔｓ－Ｍｉｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５，“Ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｓｉｄｅ－Ｃｈａｉｎ Ａｌｐｈａ－ｇａｌ”Ｉｍｍｕｎｏｌ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．３５（２）：２４７－２６０において引用される参考文献を参照されたい。
Ｎ－グリコシル化の利点
Ｎ－グリコシル化は、本明細書に記載のＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質に多数の利益を付与する。Ｅ．ｃｏｌｉはＮ－グリコシル化に必要な成分を天然には所有していないため、かかる利点は、Ｅ．ｃｏｌｉでの抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の産生によって達成することができない。さらに、ＣＨＯ細胞がある特定のグリカンの付加に必要な成分を欠いているため（例えば、２，６シアル酸及び二等分ＧｌｃＮＡｃ）、及びＣＨＯまたはマウス細胞株のいずれかが、優性ヒトシアル酸であるＮ－アセチルノイラミン酸（「Ｎｅｕ５Ａｃ」）の代わりに、ヒトに天然ではない（及び潜在的に免疫原性である）Ｎ－Ｎ－グリコリルノイラミン酸（「Ｎｅｕ５Ｇｃ」もしくは「ＮｅｕＧｃ」）を付加するため、いくつかの利益は、例えば、ＣＨＯ細胞（またはＮＳ０細胞などのマウス細胞）における抗体産生を通じて達成不可能である。例えば、Ｄｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６（６）：１１１０－１１２２、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４９：１９７－２０７（ＮｅｕＧｃは、ＳＰ２／０及びＮＳ０などのマウス細胞株における優性シアル酸である）、ならびにＳｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８６：５６６１－５６６６（その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。さらに、ＣＨＯ細胞は、ほとんどの個体に存在する抗α－Ｇａｌ抗体と反応する免疫原性グリカン、α－Ｇａｌ抗原を産生することもでき、これは高濃度でアナフィラキシーを引き起こす可能性がある。例えば、Ｂｏｓｑｕｅｓ，２０１０，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１１５３－１１５６を参照されたい。本明細書に記載のＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のヒトグリコシル化パターンは、導入遺伝子産物の免疫原性を低減し、有効性を向上させるべきである。
非正準グリコシル化部位は、通常、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質集団の低レベルのグリコシル化（例えば、１～５％）をもたらすが、機能的利益は顕著であり得る（例えば、ｖａｎ ｄｅ Ｂｏｖｅｎｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９６：１４３５－１４４１を参照されたい）。例えば、グリコシル化は、抗体の安定性、半減期、及び結合特性に影響を及ぼし得る。標的に対する融合タンパク質の親和性に対する抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質グリコシル化の効果を決定するために、当業者に既知の任意の技術、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用することができる。抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の半減期に対するグリコシル化の効果を決定するために、当業者に既知の任意の技術は、例えば、放射性標識抗体が投与された対象の血液または臓器における放射能レベルの測定によって使用され得る。抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の安定性、例えば、凝集レベルまたはタンパク質展開レベルに対するグリコシル化の効果を決定するために、当業者に既知知の任意の技術、例えば、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、例えば、サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動、質量分析、または濁度測定を使用してもよい。
本明細書に記載の方法において使用されるＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質上のシアル酸の存在は、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のクリアランス率に影響を及ぼし得る。したがって、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のシアル酸パターンを使用して、最適化されたクリアランス率を有する治療薬を生成することができる。抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のクリアランス率を評価する方法は、当該技術分野で既知である。
別の特定の実施形態では、Ｎ－グリコシル化によって付与される利益は、凝集の低減である。占有されたＮ－グリコシル化部位は、凝集傾向のあるアミノ酸残基をマスクすることができ、凝集の減少をもたらす。かかるＮ－グリコシル化部位は、本明細書で使用される抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質に天然であるか、または本明細書で使用される抗原結合断片に操作され、発現されるとき、例えば、ヒト細胞で発現されるときに凝集しにくいＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をもたらし得る。抗体の凝集を評価する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｃｏｕｒｔｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，ｍＡｂｓ ８：９９－１１２（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
別の特定の実施形態では、Ｎ－グリコシル化によって付与される利益は、免疫原性の低減である。かかるＮ－グリコシル化部位は、本明細書で使用される抗原結合断片に天然であり得るか、または本明細書で使用される抗原結合断片に操作され得、発現されるとき、例えば、ヒト眼組織細胞で発現されるときに免疫原性が低いＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をもたらす。
別の特定の実施形態では、Ｎ－グリコシル化によって付与される利益は、タンパク質の安定性である。タンパク質のＮ－グリコシル化は、それらに安定性を付与することがよく知られており、Ｎ－グリコシル化から生じるタンパク質安定性を評価する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｓｏｌａ ａｎｄ Ｇｒｉｅｂｅｎｏｗ，２００９，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．，９８（４）：１２２３－１２４５を参照されたい。
別の特定の実施形態では、Ｎ－グリコシル化によって付与される利益は、改変した結合親和性である。結合親和性を測定するためのアッセイは、当該技術分野で既知である。
５．４．２ Ｏ－グリコシル化
Ｏ－グリコシル化は、酵素によるセリンまたはトレオニン残基へのＮ－アセチル－ガラクトサミンの付加を含む。抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のヒンジ領域に存在するアミノ酸残基は、Ｏ－グリコシル化され得ることが実証されている。ある特定の実施形態では、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質は、ヒンジ領域の全てまたは一部分を含み、したがって、ヒト細胞内で発現されたときにＯ－グリコシル化されることができる。Ｏ－グリコシル化の可能性は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉで産生される抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質と比較して、本明細書に提供する抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質に別の利点を付与し、これもまた、Ｅ．ｃｏｌｉが、ヒトＯ－グリコシル化で使用されるものと同等の機構を天然に含まないためである。（代わりに、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＯ－グリコシル化は、細菌が、特定のＯ－グリコシル化機構を含有するように修飾されるときにのみ実証されている。例えば、Ｆａｒｉｄ－Ｍｏａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８９：８０８８－８０９８を参照されたい。）Ｏ－グリコシル化抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質は、グリカンを有することにより、Ｎ－グリコシル化抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質と有利な特徴を共有する（上で考察された通り）。
５．５非感染性ブドウ膜炎のためのベクターＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質コンストラクト及び製剤
エタネルセプトまたはＥＹＳ６０６（図２Ａ及び２Ｂ）などの腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）に結合する、ＴＮＦＲ１：Ｆｃ融合タンパク質またはＴＮＦＲ２：Ｆｃ融合タンパク質などのＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の送達のための組成物及び方法を記載し、非感染性ブドウ膜炎を治療するために示される。ある特定の実施形態では、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質は、エタネルセプトまたはＥＹＳ６０６のアミノ酸配列、またはそのバイオシミラーもしくはバイオベターを有する。融合タンパク質のヒトＴＮＦα受容体Ｉ型（ＴＮＦＲ１）またはＩＩ型（ＴＮＦＲ２）及びＦｃドメインの可溶性細胞外部分のアミノ酸配列を図２Ａ及び２Ｂならびに表６に提供する。送達は、遺伝子療法を介して、例えば、治療用抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質（及び／またはその高グリコシル化誘導体もしくは他の誘導体）をコードするウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現コンストラクトを、非感染性ブドウ膜炎の１つ以上の症状と診断された患者（ヒト対象）に投与して、ＨｕＰＴＭ、例えば、ヒトグリコシル化導入遺伝子産物を眼組織に継続的に供給する恒久的デポーを作製することによって達成され得る。
導入遺伝子
ＴＮＦαに結合するＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含有し、それを投与して、患者にＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質を送達することができる、組換えベクターが提供される。導入遺伝子は、エタネルセプトもしくはＥＹＳ６０６などのヒトＴＮＦα受容体Ｉ型（ＴＮＦＲ１）またはＩＩ型（ＴＮＦＲ２）の可溶性細胞外部分、ならびにＦｃドメイン、または本明細書に詳述されるそのバリアントを含む抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸である。導入遺伝子はまた、追加のグリコシル化部位を含有する抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードし得る（例えば、Ｃｏｕｒｔｏｉｓ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。
ある特定の実施形態では、抗ＴＮＦα導入遺伝子は、ＴＮＦＲ２：Ｆｃ融合タンパク質エタネルセプトをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０または１１のアミノ酸配列を有する、表６及び図２Ａを参照されたい）を含む。ヌクレオチド配列は、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化することができる。ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号１３～１８のヌクレオチド配列（表７に示されるエタネルセプト導入遺伝子配列をコードする）を含み得る。ＴＮＦＲ２：Ｆｃ融合配列は、ヒト細胞、特に１つ以上の細胞眼組織細胞における発現及び分泌に適切なＮ末端にシグナルまたはリーダー配列を有する。シグナル配列は、ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号６２）のアミノ酸配列を有してもよい。代替的に、シグナル配列は、１つ以上の眼組織細胞によって分泌されるタンパク質に対応する、表２に示されるシグナル配列のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有してもよい。代替的に、シグナル配列は、以下の表３及び４に列挙されているものなどの筋肉または肝細胞における発現に適切であり得る。
ＴＮＦＲ２型ドメインの可溶性細胞外タンパク質、ならびにＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列を含むＦｃ定常領域に加えて、導入遺伝子は、重鎖ＣＨ２ドメイン配列のＮ末端に、ヒンジ領域の全てまたは一部分を含んでもよい。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｎ末端に追加のヒンジ領域配列を有する（例えば、ヒンジを有する配列番号３）、またはアミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ（配列番号１４５）、及び特に、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＬ（配列番号１４６）、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ（配列番号１４７）、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡ（配列番号１４８）、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＬＣＰＰＣＰＡ（配列番号１４９）、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬ（配列番号１５０）、もしくはＥＰＫＳＣＤＫＴＨＬＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬ（配列番号１５１）の全てもしくは一部分を含有する配列番号４のアミノ酸配列を有する。抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、配列番号３もしくは４のアミノ酸配列（表６）、または図４に示すようなＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、またはその変異体もしくはバリアントを有してよい。Ｆｃドメインは、以下のセクション５．２．８に開示されるように、１つ以上のＦｃ受容体及び／またはエフェクター機能への改変された結合のために操作され得る。
エタネルセプトの発現は、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーターによって指向され得る。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＣＡＧプロモーター（配列番号５１）、ＣＢプロモーター（配列番号１５９）、ＣＢロングプロモーター（配列番号１６１）、ＧＲＫ１（配列番号５４）プロモーターまたはＢｅｓｔ１／ＧＲＫプロモーター（配列番号１６１）を含有する。代替的に、プロモーターは、ＧＲＫ１プロモーター（配列番号５４もしくは１１７）、（マウス錐体アレスチン（ＣＡＲ）プロモーター（配列番号１１４～１１６）、ヒト赤オプシン（ＲｅｄＯ）プロモーター（配列番号１１２）、またはＢｅｓｔ１／ＧＲＫプロモーター（配列番号１６１）などの組織特異的プロモーター（もしくはプロモーター及びエンハンサーエレメントを含む調節配列）であり得る。ゲノム構成を示す概略図については、図１を参照されたい。導入遺伝子は、表１に提供されるエレメントを含有してもよい。エタネルセプトをコードする例示的な導入遺伝子を表７に提供し、ＣＡＧ．エタネルセプト（配列番号１６）またはｍＵ１ａ．Ｖｈ４ｉ．エタネルセプト．ｓｃＡＡＶ（配列番号１８）を含む。ＩＴＲ配列を、コンストラクトの５’及び３；末端に付加して、ＣＡＧ．エタネルセプト（配列番号１５）及びＵ１ａ．Ｖｈ４ｉ．エタネルセプト．ｓｃＡＡＶ（配列番号１７）をもたらすゲノムを生成する。ある特定の実施形態では、コンストラクトは、自己相補的コンストラクトである。導入遺伝子は、ＡＡＶ、特にＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ８、ＡＡＶ３Ｂ、またはＡＡＶｒｈ７３にパッケージングされてもよい。
ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号２に示される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、ＴＮＦＲ２型ドメインの可溶性細胞外部分を含む抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号３に示される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｆｃドメインを含む抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１０または１１に示される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする。特定の実施形態では、ＴＮＦＲ２：Ｆｃ融合タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のアミノ酸置換、挿入または欠失を有する、配列番号１０または１１のアミノ酸配列を含み、当該置換、挿入または欠失が作製される。
ある特定の実施形態では、抗ＴＮＦα導入遺伝子は、ＴＮＦＲ１：Ｆｃ融合タンパク質ＥＹＳ６０６をコードするヌクレオチド配列（配列番号１２のアミノ酸配列を有する、表６及び図２Ｂを参照されたい）を含む。ヌクレオチド配列は、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化することができる。ＴＮＦＲ１：Ｆｃ融合配列は、ヒト細胞、特に網膜を形成する１つ以上の細胞における発現及び分泌に適切なＮ末端にシグナルまたはリーダー配列を有する。シグナル配列は、ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号６２）のアミノ酸配列を有してもよい。代替的に、シグナル配列は、１つ以上の眼組織細胞によって分泌されるタンパク質に対応する、表２に示されるシグナル配列のうちのいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有してもよい。代替的に、シグナル配列は、以下の表３及び４に列挙されているものなどの筋肉または肝細胞における発現に適切であり得る。
ＴＮＦＲ１型ドメインの可溶性細胞外タンパク質、ならびにＣＨ２及びＣＨ３ドメイン配列を含むＦｃ定常領域に加えて、導入遺伝子は、重鎖ＣＨ２ドメイン配列のＮ末端に、トロンビン切断部位ＬＶＰＲＧＳ（配列番号８）及びヒンジ領域の全てまたは一部分を含んでもよい。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を有するか、またはアミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ（配列番号２１）、及び特にＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡ（配列番号１５４）、ＤＫＴＨＬＣＰＰＣＰＡ（配列番号１５５）、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬ（配列番号１５２）もしくはＤＫＴＨＬＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬ（配列番号１５６）の全てもしくは一部分を含有するＮ末端にヒンジ領域配列を有する。抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のＦｃドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を有し得る（表６）。Ｆｃドメインは、以下のセクション５．２．８に開示されるように、１つ以上のＦｃ受容体及び／またはエフェクター機能への改変された結合のために操作され得る。
ＥＹＳ６０６の発現は、構成的プロモーターまたは組織特異的プロモーターによって指向され得る。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、ＣＡＧプロモーター（配列番号５１）またはＧＲＫ１（配列番号５４）プロモーターを含有する。代替的に、プロモーターは、ＧＲＫ１プロモーター（配列番号５４もしくは１１７）、（マウス錐体アレスチン（ＣＡＲ）プロモーター（配列番号１１４～１１６）、ヒト赤オプシン（ＲｅｄＯ）プロモーター（配列番号１１２）、またはＢｅｓｔ１／ＧＲＫプロモーター（配列番号１６１）などの組織特異的プロモーター（もしくはプロモーター及びエンハンサーエレメントを含む調節配列）であり得る。導入遺伝子は、表１に提供されるエレメントを含有してもよい。ＥＹＳ６０６をコードする例示的な導入遺伝子は、当該技術分野で既知の方法を使用して生成され得る。ＩＴＲ配列を、コンストラクトの５’及び３；末端に付加して、ゲノムを生成する。導入遺伝子は、ＡＡＶ、特にＡＡＶ８、ＡＡＶ３Ｂ、またはＡＡＶｒｈ７３にパッケージングされてもよい。
ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１に示される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、ＴＮＦＲ１型ドメインの可溶性細胞外部分を含む抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号６に示される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、Ｆｃドメインを含む抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、配列番号１２に示される配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする。特定の実施形態では、ＴＮＦＲ１：Ｆｃ融合タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のアミノ酸置換、挿入または欠失を有する、配列番号１のアミノ酸配列を含むＴＮＦＲ１型ドメインの可溶性細胞外部分を含み、当該置換、挿入または欠失が作製される。特定の実施形態では、ＴＮＦＲ１：Ｆｃ融合タンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のアミノ酸置換、挿入または欠失を有する、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、当該置換、挿入または欠失が、例えば、フレームワーク領域において作製される。
遺伝子療法の方法
抗ＴＮＦα融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含有するウイルスベクターを投与することによって、非感染性ブドウ膜炎のヒト対象を治療する方法を提供する。融合タンパク質は、エタネルセプトもしくはＥＹＳ６０６、またはそのバイオベターもしくはバイオシミラーであってもよい。実施形態では、患者は、非感染性ブドウ膜炎と診断されている、及び／または非感染性ブドウ膜炎と関連する症状（複数可）を有する。導入遺伝子を送達するために使用される組換えベクターは、セクション５．２．に記載されている。かかるベクターは、ヒト眼組織細胞に対して向性を有するべきであり、非複製ｒＡＡＶ、特にＡＡＶ８キャプシド、ＡＡＶ３Ｂキャプシド、またはＡＡＶｒ７３キャプシドを有するものを含むことができる。代替的に、ＡＡＶ２．７ｍ８またはＡＡＶ９キャプシドを担持するベクターを、眼の適応症のために使用することができる。図１に示されるものなどの組換えベクターは、組換えベクターが１つ以上の眼組織細胞型に入るような任意の様式で、例えば、組換えベクターを眼に導入することによって投与することができる。治療方法に関する詳細については、セクション３．を参照されたい。
抗ＴＮＦα融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含有するウイルスベクターを投与することによって、非感染性ブドウ膜炎のヒト対象を治療する方法を提供する。融合タンパク質は、エタネルセプトまたはＥＹＳ６０６であり得る。実施形態では、患者は、非感染性ブドウ膜炎と診断されている、及び／または非感染性ブドウ膜炎と関連する症状を有する。導入遺伝子を送達するために使用される組換えベクターは、セクション５．２に記載され、例示的な導入遺伝子は、上記で提供される。かかるベクターは、ヒト眼組織細胞に対して向性を有するべきであり、非複製ｒＡＡＶ、特にＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ８、またはＡＡＶｒｈ７３キャプシドを担持するものを含むことができる。図２Ａ及び２Ｂに示されるような組換えベクターは、組換えベクターが眼組織に入るように任意の様式で投与することができる。特定の実施形態において、導入遺伝子は、ＡＡＶ８ベクターにおける配列番号１３～１８である（表７を参照されたい）。
かかる遺伝子療法が施される対象は、抗ＴＮＦα療法に応答するものであり得る。ある特定の実施形態では、本方法は、非感染性ブドウ膜炎と診断されたか、またはそれと関連する１つ以上の症状を有し、抗ＴＮＦα抗体、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質での治療に応答性であると特定されたか、または抗ＴＮＦα抗体もしくは抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質での療法のための良好な候補と考えられた患者を治療することを包含する。特定の実施形態では、患者は以前にエタネルセプト、アダリムマブ、インフリキシマブ、またはゴリムマブで治療されており、エタネルセプト、アダリムマブ、インフリキシマブ、またはゴリムマブに応答することが見出されている。他の実施形態では、患者は、エタネルセプト、セルトリズマブ、または他の抗ＴＮＦ－α剤などの抗ＴＮＦ－α抗体または融合タンパク質で以前に治療されている。応答性を決定するために、抗ＴＮＦα導入遺伝子産物（例えば、細胞培養物、バイオリアクター等において産生される）を対象に直接投与することができる。
ヒト翻訳後修飾抗ＴＮＦα融合タンパク質
ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα融合タンパク質の産生は、例えば、抗ＴＮＦα ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα融合タンパク質をコードするウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現コンストラクトを、非感染性ブドウ膜炎と診断されるか、または非感染性ブドウ膜炎の１つ以上の症状を有するヒト対象（患者）に、網膜下、硝子体内、鼻腔内、前房内、脈絡膜上、または全身に投与して、完全にヒト翻訳後修飾された、例えば、形質導入された眼組織細胞によって産生されるヒトグリコシル化された、硫酸化導入遺伝子産物を継続的に供給する１つ以上の眼組織（または細胞型）に恒久的デポーを作製することによって、遺伝子療法を介して達成される非感染性ブドウ膜炎の治療のための「バイオベター」分子をもたらすべきである。
特定の実施形態では、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα融合タンパク質は、図２Ａに示されるエタネルセプトのアミノ酸配列を有するＦｃドメインに融合されたＴＮＦＲ２ドメインの可溶性細胞外部分を有し（アスパラギン酸（Ｎ）グリコシル化部位、非コンセンサスアスパラギン酸（Ｎ）グリコシル化部位；凡例に示される通り）、図２Ａに示されるアミノ酸位置のうちの１つ以上にグリコシル化、特に２，６－シアリル化を有し、ＴＮＦＲ２ドメイン（配列番号２）のＮ１４９もしくはＮ１７１及び／またはＦｃドメイン（配列番号３）のＮ３１７、及び／またはアミノ酸位置Ｔ８、Ｔ１８４、Ｓ１９９のうちの１つ以上におけるＯ連結グリコシル化部位、及び／またはＴＮＦＲ２ドメイン（配列番号２）のＴ２００、及び／またはヒンジ領域のＴ２４５（配列番号１１）を含む。他の実施形態では、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα融合タンパク質は、任意の検出可能なＮｅｕＧｃ部分を含有しない、及び／またはあらゆる検出可能なアルファ－Ｇａｌ部分を含有しない。
特定の実施形態では、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα融合タンパク質は、図２Ｂに示されるＥＳＹ６０６のアミノ酸配列を有するＦｃドメインに融合されたＴＮＦＲ１ドメインの可溶性細胞外部分を有し（アスパラギン酸（Ｎ）グリコシル化部位、非コンセンサスアスパラギン酸（Ｎ）グリコシル化部位；凡例に示される通り）、図２Ｂに示されるアミノ酸位置のうちの１つ以上にグリコシル化、特に２，６－シアリル化を有し、ＴＮＦＲ１ドメイン（配列番号１）のＮ５４、Ｎ９４もしくはＮ１４５、及び／またはＦｃドメイン（配列番号１２）のＮ２９４もしくはＮ３５８、及び／またはアミノ酸位置Ｔ８、Ｔ１８４、Ｓ１９９のうちの１つ以上におけるＯ連結グリコシル化部位、ＴＮＦＲ２ドメイン（配列番号１）のＴ２００、及び／またはヒンジ領域のＴ２４５（配列番号１２）を含む。他の実施形態では、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα融合タンパク質は、任意の検出可能なＮｅｕＧｃ部分を含有しない、及び／またはあらゆる検出可能なアルファ－Ｇａｌ部分を含有しない。
ある特定の実施形態では、ＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質は、治療上有効であり、少なくとも０．５％、１％または２％のグリコシル化及び／または硫酸化であり、少なくとも５％、１０％またはさらには５０％または１００％のグリコシル化及び／または硫酸化であり得る。本明細書に提供する遺伝子療法治療の目標は、患者の疼痛、眼の発赤、光に対する感受性、及び／または他の患者の不快感のレベルを低減するなど、非感染性ブドウ膜炎の１つ以上の症状の進行を遅らせる、またはそれを阻止する、またはそれを緩和することである。有効性は、疼痛の低減、眼の発赤、及び／または光恐怖症、及び／または視覚の改善を測定することによってモニターされ得る。
他の利用可能な治療の送達を伴う眼へのＨｕＰＴＭ抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の送達の組み合わせは、本明細書に提供する方法によって包含される。追加の治療は、遺伝子療法治療の前、同時、または後に施されてもよい。本明細書に提供する遺伝子療法と組み合わせることができる非感染性ブドウ膜炎を有する対象の利用可能な治療には、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、シクロスポリン、シクロホスファミド、コルチコステロイド（局所及び／または全身）、ならびに他のものが含まれるが、これらに限定されず、エタネルセプト、ＥＹＳ６０６、アダリムマブ、インフリキシマブ、またはゴリムマブを含むが、これらに限定されない抗ＴＮＦα剤との投与が含まれる。











５．６ 抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の用量投与
任意のかかる組換えベクターの治療有効用量は、組換えベクターが眼組織細胞（例えば、網膜細胞）に入るような任意の様式で、例えば、組換えベクターを血流に導入することによって投与されるべきである。代替的に、ベクターは、例えば、網膜下、硝子体内、前房内、脈絡膜上注射を介して、眼に直接投与されてもよい。特定の実施形態では、ベクターは、網膜下、硝子体内、前房内、脈絡膜上、皮下、筋肉内または静脈内に投与される。網膜下、硝子体内、前房内、または脈絡膜上投与は、可溶性導入遺伝子産物の発現を、以下の網膜細胞タイプのうちの１つ以上においてもたらすべきである：ヒト光受容体細胞（錐体細胞、桿体細胞）；水平細胞；双極細胞；アマルクリン細胞；網膜神経節細胞（ミゼット細胞、パラソル細胞、二層化細胞、巨大網膜神経節細胞、感光性神経節細胞、及びミュラーグリア）；ならびに網膜色素上皮細胞または他の眼組織細胞：角膜細胞、虹彩細胞、毛様体細胞、シュレム管細胞、線維柱帯細胞、ＲＰＥ－コロイド組織細胞、または視神経細胞。
導入遺伝子産物の発現は、１つ以上の眼組織または眼組織細胞型、例えば、網膜細胞における導入遺伝子産物の送達及び維持をもたらす。投与に好適な薬学的組成物は、生理学的に適合する水性緩衝液を含む製剤緩衝液中の抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含む組換えベクターの懸濁液を含む。製剤緩衝液は、多糖類、界面活性剤、ポリマー、または油のうちの１つ以上を含むことができる。
代替的に、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合物をコードする組換えベクターをコードするベクターを肝臓に送達し、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合物を発現し、循環系に分泌する。特定の実施形態では、エタネルセプトＦｃ融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含むベクターの投与の用量及び経路は、４０ｍｇの用量でエタネルセプト（Ａｍｇｅｎ）の月次注射によって達成される硝子体内濃度と同等のレベルでエタネルセプト融合タンパク質の硝子体内濃度を達成し、維持するエタネルセプトＦｃ融合タンパク質の発現をもたらすべきである。
５．７ 有効性のモニタリング
本明細書に記載の組成物及び方法は、ＮＩＵの治療、予防、または寛解における有効性を評価するための任意の方法を使用して、有効性について評価され得る。評価は、動物モデルまたはヒト対象において決定され得る。視覚障害に対する有効性は、最良矯正視力（ＢＣＶＡ）、例えば、文字または線の数の増加を評価することによって測定され得、有効性は、２つ以上のＥＴＤＲＳラインの増加またはｌｏｇＭＡＲの増加、ＳＵＮ分類による前房及び後房の炎症活性の低減、及び／または硝子体混濁のグレードの低減として評価され得る。眼への物理的変化は、当該技術分野で既知の方法を使用して、光コヒーレンストモグラフィーによって測定され得る。
本明細書に記載の組成物及び方法は、ＮＩＵの治療、予防、または寛解における有効性を評価するための任意の方法を使用して、有効性について評価され得る。評価は、動物モデルまたはヒト対象において決定され得る。視覚障害に対する有効性は、最良矯正視力（ＢＣＶＡ）、例えば、文字または線の数の増加を評価することによって測定され得、有効性は、２つ以上のＥＴＤＲＳラインの増加またはｌｏｇＭＡＲの増加、ＳＵＮ分類による前房及び後房の炎症活性の低減、及び／または硝子体混濁のグレードの低減として評価され得る。眼への物理的変化は、当該技術分野で既知の方法を使用して、光コヒーレンストモグラフィーによって測定され得る。有効性は、フレア及び／または再発率、前房細胞、硝子体細胞、及び硝子体混濁グレード（例えば、≦０．５＋のグレード）、及び／または活性網膜または脈絡膜（炎症性）病変を決定することによってモニターされ得る（例えば、Ｋｉｍ Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｃｌｉｎ．２０１５ Ｓｕｍｍｅｒ；５５（３）：７９－１１０またはＲｏｓｅｎｂａｕｍ Ｊ．Ｔ．ｅｔ ａｌ Ｖｏｌｕｍｅ ４９，Ｉｓｓｕｅ ３，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１９，Ｐａｇｅｓ ４３８－４４５（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
エンドポイントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ベースラインから１２、１６、２０、２４、または２８週まで、またはレスキュー時での研究眼の硝子体混濁グレードにおける平均変化（より早い場合）、１２、１６、２０、２４、または２８週時点での研究眼における活性中間、後部、または全ブドウ膜炎の再発のないレスポンダーの割合、ベースラインから１２、１６、２０、２４、または２８週までの最良矯正視力における平均変化、生活の質／患者が報告した転帰評価におけるベースラインからの変化、ベースラインから１２、１６、２０、２４、または２８週までの硝子体混濁グレード及び前室細胞グレードにおける平均変化、またはベースラインから１２、１６、２０、２４、または２８週までの免疫抑制薬物スコアにおける変化。
６.実施例
６．１ 実施例１：エタネルセプトｃＤＮＡベースのベクター
ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合エタネルセプト（配列番号１０または１１であるアミノ酸配列）をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、エタネルセプトｃＤＮＡベースのベクターを構築した。ヌクレオチド配列は、配列番号１３または１４のヌクレオチド配列である。導入遺伝子はまた、シグナルペプチド、例えば、ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号６２）をコードするヌクレオチド配列を含む。導入遺伝子産物のアミノ酸配列については、図２Ａを参照されたい。ベクターはさらに、ＣＡＧ及びｍＵ１ａなどの構成的プロモーターを含み、ＥＦ１ａもしくはＣＢ７もしくはＣＢ（配列番号１５９）もしくはＣＢロング（配列番号１６０）プロモーターなどの代替プロモーター、または眼組織特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーター、特にＧＲＫ１プロモーター（配列番号５４）、もしくはＢｅｓｔ１／ＧＲＫプロモーター（配列番号１６１）、または低酸素誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーターを含み得る。
６．２ 実施例２：ＥＹＳ０６０ ｃＤＮＡベースのベクター
ＴＮＦＲ：Ｆｃ融合ＥＹＳ０６０（配列番号１２であるアミノ酸配列）をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、ＥＹＳ０６０ ｃＤＮＡベースのベクターを構築する。導入遺伝子はまた、シグナルペプチド、例えば、ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号６２）をコードするヌクレオチド配列を含む。導入遺伝子産物のアミノ酸配列については、図２Ｂを参照されたい。ベクターは、ＣＡＧ、ｍＵ１ａなどの構成的プロモーターをさらに含み、ＥＦ１ａもしくはＣＢ７もしくはＣＢ（配列番号１５９）もしくはＣＢロング（配列番号１６０）プロモーターなどの代替プロモーター、または眼組織特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーター、特にＧＲＫ１プロモーター（配列番号５４）、もしくはＢｅｓｔ１／ＧＲＫプロモーター（配列番号１６１）、または低酸素誘導性プロモーターなどの誘導性プロモーターを含み得る。
６．３ 実施例３：ＴＮＦαと、ベクター化アダリムマブＩｇＧ及びＦａｂ及びベクター化エタネルセプトとの、モデル種にわたる結合
Ａ．ヒト、マウス、及びラットを含むモデル種から単離したベクター化アダリムマブ候補を、ＴＮＦαに対するそれらの結合能力について試験した。２９３Ｔ細胞へのシスプラスミドトランスフェクションに続いて、ベクター化抗体を発現させ、細胞上清に分泌させた。細胞上清をＥＬＩＳＡにおいて試験し、プレートを前述の種に由来する組換えＴＮＦαでコーティングした（図５Ａ）。アダリムマブＩｇＧは、ヒト及びマウス由来のＴＮＦαに効果的に結合した。Ｆａｂは、ＩｇＧと同様のヒトＴＮＦαへの結合プロファイルを示す。しかしながら、Ｆａｂは、アダリムマブＩｇＧと比較して、マウスＴＮＦαへの不十分な結合を示す。ＩｇＧ及びＦａｂの両方が、ラットＴＮＦαへのはるかに低減した結合を示す。
Ｂ．ベクター化エタネルセプトを、ヒト、マウス及びラットＴＮＦαへの結合について同じ様式でアッセイした。エタネルセプトは、ヒト、マウス及びラット由来のＴＮＦαの全てに結合し、アダリムマブよりも良好にラットＴＮＦαに結合する。図５Ｂを参照されたい。
６．４ 実施例４：非感染性後部ブドウ膜炎に対するＡＡＶ媒介性眼遺伝子療法
非感染性後部ブドウ膜炎は、眼の網膜及び脈絡膜に影響を及ぼし、失明につながる眼の炎症の一形態である。毎年およそ３８，０００人のアメリカ人を苦しめている。患者は通常、全身性ステロイドまたはコルチコステロイド療法で治療され、これは全身性合併症の高いリスクをもたらす。２０１６年、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）を標的とするヒトモノクローナル抗体であるヒュミラ（アダリムマブ）がＦＤＡによって承認され、非感染性ブドウ膜炎（ＮＩＵ）の治療のための唯一の全身性非コルチコステロイド剤となり、それ以来広く使用されている。この研究では、ＣＡＧ．エタネルセプトまたはｍＵ１ａ．Ｖｈ４ｉ．エタネルセプト．ｓｃＡＡＶを含むベクター化抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質、またはベクター化ＥＹＳ６０６、ならびにＡＡＶ８．ＣＡＧ．ＧＦＰが、局所投与を介して、マウスの眼組織におけるＡＡＶ媒介性抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の発現について評価される。ＡＡＶ８ ＮＵＬは、対照ベクターとして機能する。げっ歯類ＥＡＵモデルにおける有効性試験もまた、ＮＩＵに対するＡＡＶ媒介性抗ＴＮＦα治療の治療可能性を調査するために行う。
ベクター化エタネルセプト及びＥＹＳ６０６配列は、インビトロで構築及び試験される。野生型マウスにおける形質導入効率及び細胞型特異性をさらに評価する。この研究には、若年成体Ｃ５７ＢＬ／６及びＢ１０．ＲＩＩＩマウス（８～１０週齢）を使用する。ＣＡＧ．エタネルセプト（配列番号１５もしくは１６（隣接ＩＴＲを伴う、もしくは伴わない））、またはｍＵ１ａ．Ｖｈ４ｉ．エタネルセプト．ｓｃＡＡＶ（配列番号１７もしくは１８（隣接ＩＴＲ配列を伴う、もしくは伴わない））、またはベクター化ＥＹＳ６０６、ならびにＡＡＶ８．ＣＡＧ．ＧＦＰ及びＡＡＶ８．ＮＵＬを含むベクターを、異なる用量（１×１０７、１×１０８、及び１×１０９ｖｇ／眼）で１μｌの製剤緩衝液中の網膜下注射（ＳＲ）を介してマウス眼に送達する。ＳＲ注射の１、２及び４週間後に眼底及びＯＣＴイメージングを行う。投与後５週間で眼試料を収集する。眼組織における抗体または融合タンパク質の発現のレベルは、ＥＬＩＳＡによって定量化する。細胞型特異性は、様々な網膜細胞マーカーを用いた免疫蛍光染色によって決定される。有効性研究のために試験ベクター（複数可）を選択する。脈絡膜上、前房内及び硝子体内注射を含む、異なる投与経路（ＲＯＡ）もまた探索される。好ましいＲＯＡは、有効性研究に使用される。
有効性研究は、ヒトＩＲＢＰペプチドによる免疫化によってＢ１０．ＲＩＩＩマウスにおける実験的自己免疫ブドウ膜炎（ＥＡＵ）を誘導することによって実施される。Ｔ細胞媒介性眼自己免疫応答は、このモデルで発生し、ピークは誘導後およそ１１～１８日である。試験ベクターは、ＥＡＵの誘導の２週間前または１週間後に、好ましいＲＯＡを介してマウス眼に投与される。反対側の眼は、ＡＡＶ．ＮＵＬベクターを送達され、対照となる。眼底及びＯＣＴイメージング、網膜電図（ＥＲＧ）及び視運動性眼振（ＯＫＮ）は、ＥＡＵの誘導後１０、１７及び３０日で検査し、疾患の進行をモニターする。ＥＡＵ導入後５週間で眼組織または眼球全体を収集する。眼組織における融合タンパク質の発現のレベルは、ＥＬＩＳＡによって検出し、定量化する。網膜構造の変化及びニューロンの生存は、組織学及び免疫蛍光染色によって評価される。
６．５ 実施例５：インビボ研究
この研究では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（ＡＡＶ８．ＣＡＧ．アダリムマブ．ＩｇＧ（ＮＩＵ００１）及びＡＡＶ８．ＣＡＧ．アダリムマブ．Ｆａｂ（ＮＩＵ００２））中の全長及びＦａｂアダリムマブ抗体、ならびにエタネルセプトＦｃ融合タンパク質（ＡＡＶ８．ＣＡＧ．エタネルセプト）を、局所投与（網膜下（ＳＲ）、表８）を介して、マウス眼組織におけるインビボでのＡＡＶ媒介性抗体発現について評価する。
ベクター化アダリムマブ及びエタネルセプト配列は、インビトロで構築及び試験されている。この研究には、若年成体Ｂ１０．ＲＩＩＩマウス（６～８週齢）を使用する。ＡＡＶ８．ＣＡＧ．アダリムマブ．ＩｇＧ、ＡＡＶ８．ＣＡＧ．アダリムマブ．Ｆａｂ、ＡＡＶ８．ＣＡＧ．エタネルセプト、及びビヒクルを含むベクターを、１μｌの製剤緩衝液（表８）中の２つの異なる用量（１×１０８及び１×１０９ｖｇ／眼）で網膜下（ＳＲ）注射を介してマウスの眼に送達する。
眼底及びＯＣＴイメージングは、ＳＲ注射の２週間及び４週間後に行った。眼試料を投与後４週間で収集した。眼組織における抗体または融合タンパク質の発現のレベルは、ＥＬＩＳＡによって定量化する。細胞型特異性は、様々な網膜細胞マーカーを用いた免疫蛍光染色によって決定した。網膜構造の変化及びニューロン生存は、投与後２週間及び４週間の組織学及び免疫蛍光染色によって評価する。
６．６ 実施例６：ベクター発現エタネルセプト結合動態の評価
シスプラスミドから産生されたＡＡＶからのベクター化エタネルセプトの発現及び精製を評価する。様々な種のＴＮＦαタンパク質への結合の精製されたベクター化エタネルセプト動態を、様々なリガンド結合アッセイにおいて市販のエタネルセプトと比較する。
Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ））アッセイを使用した結合親和性：ＢｉａｃｏｒｅＴ２００を使用して、精製されたＴＮＦＲ融合タンパク質に対する異なるＴＮＦ－アルファ（ＴＮＦα）分子の結合親和性を測定するために研究を行う。まず、ＴＮＦαのｐＡＡＶ．ＣＡＧ．エタネルセプト産生融合タンパク質への結合親和性を、ＴＮＦαの市販のエタネルセプトへの結合と比較する。第２に、後の動物モデル研究のための様々な種のＴＮＦαタンパク質の好適性を決定するために、異なる種からのＴＮＦαの結合親和性を試験する。Ｂｉａｃｏｒｅアッセイは、ＨＢＳ－ＥＰ＋を泳動用緩衝液として使用して、２５℃で行われる。希釈した融合タンパク質は、Ｆｃ捕捉法（１５～２０分の捕捉時間）によってセンサーチップ上で捕捉される。異なる種のＴＮＦαタンパク質（ヒト、マカク、ブタ、マウス、イヌ、ウサギ及びラット）を分析物として個々に試験し、続いて解離段階で泳動用緩衝液を注入することができる。解離率を計算し、［Ｋｏｆｆ＝Ｋｄ＝タンパク質解離率、Ｋｏｎ＝Ｋａ＝タンパク質会合率、Ｋ￢Ｄ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ］、及びより小さい（より低い）ＫＤ値は、その標的に対するＴＮＦＲ融合タンパク質の親和性が高いことを示した。
異なる種のＴＮＦαのベクター化エタネルセプト対市販のエタネルセプトへの結合親和性（ＫＤ）を、それらのＫＤ値に従ってランク付けする。
６．７ 実施例７：ＴＮＦ融合タンパク質エフェクター機能の測定
ベクター産生エタネルセプトのエフェクター機能、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を、インビトロアッセイによって評価し、市販のエタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ）と比較する。エフェクター機能は、抗体のＦｃドメイン、ひいては、エタネルセプトなどのＦｃドメインを含有する融合タンパク質を介して誘発される。
材料及び方法
標的細胞（ＣＨＯ／ＤＧ４４－ｔｍ ＴＮＦα；ＧｅｎＳｃｒｉｐｔカタログ番号ＲＤ００７４６）を、対応する完全培養培地で３７℃、５％ ＣＯ２で維持する。エフェクター細胞（末梢血単核細胞、ＰＢＭＣ；Ｓａｉｌｙ Ｂｉｏカタログ番号ＸＦＢ－ＨＰ１００Ｂ））を３７℃で解凍し、１６４０完全培養培地で３７℃、５％ ＣＯ２で維持する。
ＡＤＣＣ用量－応答アッセイの場合、ＣＨＯ／ＤＧ４４－ｔｍ ＴＮＦα及びＰＢＭＣは、それぞれ、標的細胞及びエフェクター細胞として使用することができる。２５：１に設定されたＥ／Ｔ（エフェクター細胞対標的細胞）比で、ＣＨＯ／ＤＧ４４－ｔｍ ＴＮＦαに対するエタネルセプト（市販）及びヒトＩｇＧ１は、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用される。簡潔に、方法のステップは以下の通りである。
ＣＨＯ／ＤＧ４４－ｔｍ ＴＮＦα（標的細胞）
＋
試料
＋
ＰＢＭＣ（エフェクター細胞）
↓
標的細胞溶解％
エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）を解凍し、アッセイ緩衝液（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７３）で再懸濁させる。標的細胞もまた解凍し、ＡＤＣＣアッセイ緩衝液で再懸濁し、次いで、プレートマップに従って懸濁液中でアッセイプレートに移した。溶液中の対照及び試験試料も同様にアッセイプレートに移し、アッセイプレートを室温で３０分間インキュベートする。エフェクター細胞密度をＥ／Ｔ比に従って調節し、次いでエフェクター細胞懸濁液をアッセイプレートに移す。次いで、アッセイプレートを細胞インキュベーター（３７℃／５％ ＣＯ２）内で６時間インキュベートし、除去し、次いで、アッセイプレートの対応するウェルの上清を別の９６ウェルアッセイプレートに移す。ＬＤＨ混合物（ＬＤＨ細胞傷害性検出キット、Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１６４４７９３００１）を、第２の９６ウェルアッセイプレートの対応するウェルに移し、発光／吸光度を、ＰＨＥＲＡＳｔａｒ（登録商標）（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）プレートリーダーで読み取る。
ＣＤＣの用量応答研究では、ＣＨＯ／ＤＧ４４－ｔｍ ＴＮＦαを標的細胞として使用することができる。５％ ＮＨＳＣ（正常ヒト血清補体）で、ＣＨＯ／ＤＧ４４－ｔｍ ＴＮＦαに対するエタネルセプト及びヒトＩｇＧ１は、それぞれ、陽性対照及び陰性対照として使用することができる。簡潔に、ＣＤＣアッセイ方法のステップは以下の通りである。
ＣＨＯ／ＤＧ４４－ｔｍ ＴＮＦα（標的細胞）
＋
試料
＋
ＮＨＳＣ
↓
標的細胞溶解％
標的細胞を遠心分離によって採取し、アッセイ緩衝液（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）検出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７３）で再懸濁させる。試料及び対照を、ＣＤＣアッセイ緩衝液と共に溶液中で調製する。標的細胞密度を調節し、次いで細胞懸濁液をアッセイプレートに移した。作業溶液中の対照及び試験試料もまた、アッセイプレートに移し、次いで、アッセイプレートを室温で３０分間インキュベートし、正常ヒト血清補体（ＮＨＳＣ）作業溶液（Ｑｕｉｄｅｌ、カタログ番号Ａ１１３）をアッセイプレートに添加する。アッセイプレートを細胞インキュベーター（３７℃／５％ＣＯ２）内で４時間インキュベートし、除去し、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）作動溶液を対応するウェルに添加し、プレートを室温で約１０～３０分間インキュベートする。発光データは、ＰＨＥＲＡＳｔａｒ（登録商標）ＦＳＸ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）プレートリーダー上で読み取り、生細胞の数を決定する。ＡＤＣＣ及びＣＤＣ研究の生データを、ＰＨＥＲＡＳｔａｒ（登録商標）ＦＳＸシステムからエクスポートし、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ ２０１６及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアを使用して分析する。ＡＤＣＣ標的細胞溶解％の式＝１００＊（ＯＤ試料－ＯＤ腫瘍細胞＋エフェクター細胞）／（ＯＤ最大放出－ＯＤ最小放出）。ＣＤＣ標的細胞溶解％の式＝１００＊（１－（ＲＬＵ試料－ＲＬＵＮＨＳＣ）／（ＲＬＵ細胞＋ＮＨＳＣ－ＲＬＵＮＨＳＣ））。相対ＥＣ５０値は、以下の４つのパラメータ関数を使用して得られ、標的細胞溶解％が試験試料の濃度に対してであるシグモイド曲線を特徴付ける。Ｙ＝底部＋（上部－底部）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ５０－Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））＝標的細胞溶解のパーセンテージ、及びＸ＝濃度。
２５：１のＥ／Ｔ比で、ＣＨＯ／ＤＧ４４－ｔｍ ＴＮＦα細胞を、ＡＤＣＣ用量応答研究における標的細胞として使用することができる。陽性対照（市販のエタネルセプト）、試料及び陰性対照（ヒトＩｇＧ１）の用量応答及び最良適合値を計算する（例えば、ＥＣ５０）。
５％ ＮＨＳＣでは、ＣＨＯ／ＤＧ４４－ｔｍ ＴＮＦα細胞を、ＣＤＣ用量応答研究における標的細胞として使用する。陽性対照（エタネルセプト）、試料及び陰性対照（ヒトＩｇＧ１）の用量応答及び最良適合値を計算する（例えば、ＥＣ５０）。
ＡＡＶ－エタネルセプトＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を、市販のエタネルセプトと比較する。いずれの理論にも拘束されることなく、市販のエタネルセプトの製造細胞培養により異なると予想される、グリコシル化などの翻訳後修飾に起因して差異が観察され得る。
均等物
本発明を、その特定の実施形態を参照しながら詳細に説明しているが、機能的に均等である変更が、本発明の範囲内であることは理解されるであろう。実際、本明細書に示す及び記載するものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明及び添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。当業者は、単に慣習的な実験を使用して、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識する、または確認することができるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
本明細書で言及されている刊行物、特許及び特許出願は全て、個々の刊行物、特許または特許出願が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (56)

  1. 非感染性ブドウ膜炎の治療を必要とするヒト対象においてそれを行うための薬学的組成物であって、
    （ａ）眼組織細胞に対して向性を有するウイルスキャプシドと、
    （ｂ）ＡＡＶ内部タンデムリピート（ＩＴＲ）に隣接する発現カセットを含む人工ゲノムであって、前記発現カセットが、ヒト眼細胞における導入遺伝子の発現を制御する１つ以上の調節配列に作動可能に連結した抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする前記導入遺伝子を含む、前記人工ゲノムと、を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含み、
    前記ＡＡＶベクターが、前記ヒト対象への網膜下、硝子体内、鼻腔内、前房内、脈絡膜上、または全身投与のために製剤化される、前記薬学的組成物。
  2. 前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインを含むポリペプチドにペプチド結合を通じて共有結合した、ヒトＴＮＦα受容体Ｉ型（ＴＮＦＲ１）またはＩＩ型（ＴＮＦＲ２）の可溶性細胞外部分を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
  3. 前記ウイルスキャプシドが、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、血清型２（ＡＡＶ２）、血清型ＡＡＶ２．７ｍ８（ＡＡＶ２．７ｍ８）、血清型３（ＡＡＶ３）、血清型３Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ）、血清型４（ＡＡＶ４）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）、血清型７（ＡＡＶ７）、血清型８（ＡＡＶ８）、血清型ｒｈ８（ＡＡＶｒｈ８）、血清型９（ＡＡＶ９）、血清型９ｅ（ＡＡＶ９ｅ）、血清型ｒｈ１０（ＡＡＶｒｈ１０）、血清型ｒｈ２０（ＡＡＶｒｈ２０）、血清型ｒｈ３９（ＡＡＶｒｈ３９）、血清型ｈｕ．３７（ＡＡＶｈｕ．３７）、血清型ｒｈ７３（ＡＡＶｒｈ７３）、または血清型ｒｈ７４（ＡＡＶｒｈ７４）、血清型ｈｕ５１（ＡＡＶ．ｈｕ５１）、血清型ｈｕ２１（ＡＡＶ．ｈｕ２１）、血清型ｈｕ１２（ＡＡＶ．ｈｕ１２）、または血清型ｈｕ２６（ＡＡＶ．ｈｕ２６）のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
  4. 前記ＡＡＶキャプシドが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ２．７ｍ８、またはＡＡＶｒｈ７３である、請求項１～３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  5. 前記眼組織細胞が、角膜細胞、虹彩細胞、毛様体細胞、シュレム管細胞、線維柱帯細胞、網膜細胞、ＲＰＥ脈絡膜組織細胞、または視神経細胞である、請求項１～４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  6. 前記調節配列が、表１または１ａからの調節配列を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  7. 前記調節配列が、ヒトロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）プロモーター（配列番号５４もしくは１１７）、マウス錐体アレスチン（ＣＡＲ）プロモーター（配列番号１１４～１１６）、ヒト赤オプシン（ＲｅｄＯ）プロモーター（配列番号１１２）、ＣＢプロモーター（配列番号１５９）、ＣＢロングプロモーター（配列番号１６０）、またはＢｅｓｔ１／ＧＲＫプロモーター（配列番号１６１）である、請求項５に記載の薬学的組成物。
  8. 前記導入遺伝子が、前記ヒト眼細胞における分泌及び翻訳後修飾を指向する、前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のＮ末端におけるシグナル配列をコードする、請求項１～７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  9. 前記シグナル配列が、ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号６２）または表２からのシグナル配列である、請求項８に記載の薬学的組成物。
  10. 前記導入遺伝子が、Ｎ末端からＣ末端までの構造：シグナル配列－可溶性ＴＮＦＲ細胞外ドメイン－ヒンジ領域－Ｆｃドメイン－ポリＡを有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  11. 前記導入遺伝子が、前記可溶性ＴＮＦＲ細胞外ドメインのＣ末端に、配列番号８のトロンビン切断部位をさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、二量体融合タンパク質として発現される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  13. 前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、エタネルセプトまたはＥＹＳ６０６である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  14. 前記導入遺伝子が、配列番号１３～１８のヌクレオチド配列を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  15. 前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１０、１１または１２のアミノ酸配列を有する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  16. 前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、高グリコシル化変異体であるか、または前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のＦｃポリペプチドが、グリコシル化または非グリコシル化される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  17. 前記Ｆｃドメインが、ＩｇＧ１－Ｆｃドメインである、請求項１～１６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  18. 前記人工ゲノムが、自己相補的である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  19. 前記人工ゲノムが、コンストラクトＣＡＧ．エタネルセプト（配列番号１５）またはｍＵ１ａ．Ｖｈ４ｉ．エタネルセプト．ｓｃＡＡＶ（配列番号１７）である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
  20. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む組成物であって、
    ａ．任意選択で、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、血清型２（ＡＡＶ２）、血清型ＡＡＶ２．７ｍ８（ＡＡＶ２．７ｍ８）、血清型３（ＡＡＶ３）、血清型３Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ）、血清型４（ＡＡＶ４）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）、血清型７（ＡＡＶ７）、血清型８（ＡＡＶ８）、血清型ｒｈ８（ＡＡＶｒｈ８）、血清型９（ＡＡＶ９）、血清型９ｅ（ＡＡＶ９ｅ）、血清型ｒｈ１０（ＡＡＶｒｈ１０）、血清型ｒｈ２０（ＡＡＶｒｈ２０）、血清型ｒｈ３９（ＡＡＶｒｈ３９）、血清型ｈｕ．３７（ＡＡＶｈｕ．３７）、血清型ｒｈ７３（ＡＡＶｒｈ７３）、または血清型ｒｈ７４（ＡＡＶｒｈ７４）、血清型ｈｕ５１（ＡＡＶ．ｈｕ５１）、血清型ｈｕ２１（ＡＡＶ．ｈｕ２１）、血清型ｈｕ１２（ＡＡＶ．ｈｕ１２）、または血清型ｈｕ２６（ＡＡＶ．ｈｕ２６）のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、ウイルスＡＡＶキャプシドと、
    ｂ．ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接する発現カセットを含む人工ゲノムであって、前記発現カセットが、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインを含むポリペプチドにペプチド結合を通じて共有結合されるヒト可溶性ＴＮＦα受容体Ｉ型（ＴＮＦＲ１）またはＩＩ型（ＴＮＦＲ２）細胞外ドメインを含み、ヒト眼組織細胞における導入遺伝子の発現を促進する１つ以上の調節配列に作動可能に連結した抗ＴＮＦ－α Ｆｃ融合タンパク質をコードする前記導入遺伝子を含む、前記人工ゲノムと、を有し、
    前記導入遺伝子が、眼組織細胞における前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合の分泌及び翻訳後修飾を指向する前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のＮ末端におけるシグナル配列をコードする、前記組成物。
  21. 前記導入遺伝子が、前記可溶性ヒトＴＮＦＲ細胞外ドメインのＣ末端に、配列番号８のトロンビン切断部位をさらに含む、請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号１０、１１または１２のアミノ酸配列を有する、請求項２０または２１に記載の組成物。
  23. 前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、エタネルセプトまたはＥＹＳ６０６である、請求項２０～２２のいずれか１項に記載の組成物。
  24. 前記眼組織細胞が、角膜細胞、虹彩細胞、毛様体細胞、シュレム管細胞、線維柱帯細胞、網膜細胞、ＲＰＥ脈絡膜組織細胞、または視神経細胞である、請求項２０～２３のいずれか１項に記載の組成物。
  25. 前記導入遺伝子が、配列番号１３または１４のヌクレオチド配列を含む、請求項２０～２４のいずれか１項に記載の組成物。
  26. 前記シグナル配列が、ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号６２）または表２もしくは３からのシグナル配列である、請求項２０～２５のいずれか１項に記載の組成物。
  27. 前記人工ゲノムが、自己相補的である、請求項２０～２６のいずれか１項に記載の組成物。
  28. 前記人工ゲノムが、コンストラクトＣＡＧ．エタネルセプト（配列番号１５もしくは１６）またはｍＵ１ａ．Ｖｈ４ｉ．エタネルセプト．ｓｃＡＡＶ（配列番号１７もしくは１８）である、請求項２０～２７のいずれか１項に記載の組成物。
  29. 非感染性ブドウ膜炎の治療を必要とするヒト対象においてそれを行う方法であって、眼組織細胞における導入遺伝子の発現を制御する１つ以上の調節配列に作動可能に連結した抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする前記導入遺伝子を含む組換えＡＡＶを含む、治療有効量の組成物を、前記対象に網膜下、硝子体内、鼻腔内、前房内、脈絡膜上、または全身的に投与することを含む、前記方法。
  30. 非感染性ブドウ膜炎の治療を必要するヒト対象においてそれを行う方法であって、ヒト眼組織細胞における導入遺伝子の発現を制御する１つ以上の調節配列に作動可能に連結した抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含む、治療有効量の組換えヌクレオチド発現ベクターを、前記対象に網膜下、硝子体内、鼻腔内、前房内、脈絡膜上、または全身的に投与することを含み、それにより、ヒト翻訳後修飾（ＨｕＰＴＭ）形態の抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質を放出するデポーが形成される、前記方法。
  31. 前記眼組織細胞が、角膜細胞、虹彩細胞、毛様体細胞、シュレム管細胞、線維柱帯細胞、網膜細胞、ＲＰＥ脈絡膜組織細胞、または視神経細胞である、請求項２９及び３０に記載の方法。
  32. 前記抗ＴＮＦ－α Ｆｃ融合タンパク質が、ＩｇＧ Ｆｃドメインに共有結合した、ヒト可溶性ＴＮＦα受容体Ｉ型（ＴＮＦＲ１）またはＩＩ型（ＴＮＦＲ２）細胞外ドメインを含む、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記導入遺伝子が、エタネルセプトまたはＥＹＳ６０６である、請求項２９～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記導入遺伝子が、配列番号１３～１８のヌクレオチド配列を有する、請求項２９～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記ウイルスキャプシドが、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、血清型２（ＡＡＶ２）、血清型ＡＡＶ２．７ｍ８、血清型３（ＡＡＶ３）、血清型３Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ）、血清型４（ＡＡＶ４）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）、血清型７（ＡＡＶ７）、血清型８（ＡＡＶ８）、血清型ｒｈ８（ＡＡＶｒｈ８）、血清型９（ＡＡＶ９）、血清型９ｅ（ＡＡＶ９ｅ）、血清型ｒｈ１０（ＡＡＶｒｈ１０）、血清型ｒｈ２０（ＡＡＶｒｈ２０）、血清型ｒｈ３９（ＡＡＶｒｈ３９）、血清型ｈｕ．３７（ＡＡＶｈｕ．３７）、血清型ｒｈ７３（ＡＡＶｒｈ７３）、または血清型ｒｈ７４（ＡＡＶｒｈ７４）、血清型ｈｕ５１（ＡＡＶ．ｈｕ５１）、血清型ｈｕ２１（ＡＡＶ．ｈｕ２１）、血清型ｈｕ１２（ＡＡＶ．ｈｕ１２）、または血清型ｈｕ２６（ＡＡＶ．ｈｕ２６）のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項２９～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記ＡＡＶキャプシドが、ＡＡＶ８、ＡＡＶ２．７ｍ８、ＡＡＶ３Ｂ、またはＡＡＶｒｈ７３である、請求項２９～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記調節配列が、表１または１ａからの調節配列を含む、請求項２９～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記調節配列が、ヒトロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）プロモーター（配列番号５４もしくは１１７）、マウス錐体アレスチン（ＣＡＲ）プロモーター（配列番号１１４～１１６）、またはヒト赤オプシン（ＲｅｄＯ）プロモーター（配列番号１１２）である、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記導入遺伝子が、前記ヒト眼組織細胞における分泌及び翻訳後修飾を指向する、前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のＮ末端におけるシグナル配列をコードする、請求項２９～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記シグナル配列が、ＭＹＲＭＱＬＬＬＬＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号６２）または表２もしくは３からのシグナル配列である、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記導入遺伝子が、以下の構造：シグナル配列－９ヒト可溶性ＴＮＦＲ細胞外ドメイン（１型または２型）－ヒンジ領域－Ｆｃドメイン－ポリＡを有する、請求項２５～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記導入遺伝子が、前記ヒト可溶性ＴＮＦＲ細胞外ドメインのＣ末端に、配列番号８を有するトロンビン切断部位をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、高グリコシル化変異体であるか、または前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質のＦｃドメインが、グリコシル化またはアグリコシル化される、請求項２９～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、アルファ２，６－シアリル化グリカンを含有する、請求項２９～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、グリコシル化されるが、検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα－Ｇａｌを含有しない、請求項２９～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、チロシン硫酸化を含有する、請求項２９～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質の前記ＨｕＰＴＭ形態の産生が、前記組換えヌクレオチド発現ベクターを培養物中のヒト眼細胞に形質導入し、前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質を発現することによって確認される、請求項２９～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記治療有効量が、２以上のＥＴＤＲＳラインによって最良の矯正視力（ＢＣＶＡ）を改善するか、またはｌｏｇＭＡＲの増加、ＳＵＮ分類による前房及び後房の炎症活性の低減、及び／または硝子体混濁のグレードの低減に十分であると決定される、請求項２９または４７に記載の方法。
  49. 前記ｒＡＡＶが、自己相補的である、請求項２９～４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記コンストラクトＣＡＧ．エタネルセプトまたはｍＵ１ａ．Ｖｈ４ｉ．エタネルセプト．ｓｃＡＡＶ内の前記導入遺伝子、請求項２９～４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 組換えＡＡＶを生産する方法であって、
    （ｃ）
    （ｉ）ＡＡＶ ＩＴＲに隣接するシス発現カセットを含む人工ゲノムであって、前記シス発現カセットが、抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含み、前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインを含むポリペプチドにペプチド結合を通じて共有結合した、ヒトＴＮＦα受容体Ｉ型（ＴＮＦＲ１）またはＩＩ型（ＴＮＦＲ２）の可溶性細胞外部分を含み、ヒト眼組織細胞における前記導入遺伝子の発現を促進する１つ以上の調節配列に作動可能に連結している、前記人工ゲノム、
    （ｉｉ）ＡＡＶ ＩＴＲを欠くトランス発現カセットであって、前記トランス発現カセットが、培養物中の宿主細胞中のＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶキャプシドタンパク質の発現を駆動し、トランスでの前記ＡＡＶ ｒｅｐ及び前記ＡＡＶキャプシドタンパク質を供給する発現制御エレメントに作動可能に連結した前記ＡＡＶ ｒｅｐ及び前記ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードし、前記キャプシドが、眼組織向性を有する、前記トランス発現カセット、
    （ｉｉｉ）前記ＡＡＶキャプシドタンパク質による前記人工ゲノムの複製及びパッケージングを可能にするのに十分なアデノウイルスヘルパー機能、を含有する前記宿主細胞を培養することと、
    （ｄ）前記人工ゲノムをキャプシド形成する組換えＡＡＶを前記細胞培養物から回収することと、を含む、前記方法。
  52. 前記眼組織細胞が、角膜細胞、虹彩細胞、毛様体細胞、シュレム管細胞、線維柱帯細胞、網膜細胞、ＲＰＥ脈絡膜組織細胞、または視神経細胞である、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記導入遺伝子が、エタネルセプトまたはＥＹＳ６０６をコードし、前記ＡＡＶキャプシドタンパク質が、実施形態１のｒＡＡＶキャプシドタンパク質であり、前記キャプシドタンパク質が、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、血清型２（ＡＡＶ２）、血清型２．７ｍ８、血清型３（ＡＡＶ３）、血清型３Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ）、血清型４（ＡＡＶ４）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）、血清型７（ＡＡＶ７）、血清型８（ＡＡＶ８）、血清型ｒｈ８（ＡＡＶｒｈ８）、血清型９（ＡＡＶ９）、血清型９ｅ（ＡＡＶ９ｅ）、血清型ｒｈ１０（ＡＡＶｒｈ１０）、血清型ｒｈ２０（ＡＡＶｒｈ２０）、血清型ｒｈ３９（ＡＡＶｒｈ３９）、血清型ｈｕ．３７（ＡＡＶｈｕ．３７）、血清型ｒｈ７３（ＡＡＶｒｈ７３）、または血清型ｒｈ７４（ＡＡＶｒｈ７４）、血清型ｈｕ５１（ＡＡＶ．ｈｕ５１）、血清型ｈｕ２１（ＡＡＶ．ｈｕ２１）、血清型ｈｕ１２（ＡＡＶ．ｈｕ１２）、または血清型ｈｕ２６（ＡＡＶ．ｈｕ２６）のうちの少なくとも１つのＡＡＶ血清型由来である、請求項５１または５２に記載の方法。
  54. 宿主細胞であって、
    ｄ．ＡＡＶ ＩＴＲに隣接するシス発現カセットを含む人工ゲノムであって、前記シス発現カセットが、抗ＴＮＦα融合タンパク質をコードする導入遺伝子を含み、前記抗ＴＮＦα Ｆｃ融合タンパク質が、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインを含むポリペプチドにペプチド結合を通じて共有結合した、ヒトＴＮＦα受容体Ｉ型（ＴＮＦＲ１）またはＩＩ型（ＴＮＦＲ２）の可溶性細胞外部分を含み、ヒト眼組織細胞における前記導入遺伝子の発現を促進する１つ以上の調節配列に作動可能に連結している、前記人工ゲノムと、
    ｅ．ＡＡＶ ＩＴＲを欠くトランス発現カセットであって、前記トランス発現カセットが、培養物中の前記宿主細胞中のＡＡＶ ｒｅｐ及びＡＡＶキャプシドタンパク質の発現を駆動し、トランスでの前記ＡＡＶ ｒｅｐ及び前記ＡＡＶキャプシドタンパク質を供給する発現制御エレメントに作動可能に連結した前記ＡＡＶ ｒｅｐ及び前記ＡＡＶキャプシドタンパク質をコードし、前記キャプシドが、眼組織向性を有する、前記トランス発現カセットと、
    ｆ．前記ＡＡＶキャプシドタンパク質による前記人工ゲノムの複製及びパッケージングを可能にするのに十分なアデノウイルスヘルパー機能と、を含有する、前記宿主細胞。
  55. 前記導入遺伝子が、エタネルセプトまたはＥＹＳ６０６をコードする、請求項５４に記載の宿主細胞。
  56. 前記ＡＡＶキャプシドタンパク質が、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、血清型２（ＡＡＶ２）、血清型２．７ｍ８（ＡＡＶ２．７ｍ８）、血清型３（ＡＡＶ３）、血清型３Ｂ（ＡＡＶ３Ｂ）、血清型４（ＡＡＶ４）、血清型５（ＡＡＶ５）、血清型６（ＡＡＶ６）、血清型７（ＡＡＶ７）、血清型８（ＡＡＶ８）、血清型ｒｈ８（ＡＡＶｒｈ８）、血清型９（ＡＡＶ９）、血清型９ｅ（ＡＡＶ９ｅ）、血清型ｒｈ１０（ＡＡＶｒｈ１０）、血清型ｒｈ２０（ＡＡＶｒｈ２０）、血清型ｒｈ３９（ＡＡＶｒｈ３９）、血清型ｈｕ．３７（ＡＡＶｈｕ．３７）、血清型ｒｈ７３（ＡＡＶｒｈ７３）、または血清型ｒｈ７４（ＡＡＶｒｈ７４）、血清型ｈｕ５１（ＡＡＶ．ｈｕ５１）、血清型ｈｕ２１（ＡＡＶ．ｈｕ２１）、血清型ｈｕ１２（ＡＡＶ．ｈｕ１２）、または血清型ｈｕ２６（ＡＡＶ．ｈｕ２６）である、請求項５３または５４に記載の宿主細胞。
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