KR20220095183A - 바이러스 감염을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

바이러스 감염을 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 명세서는 케모카인, 사이토카인, 또는 세포자멸사 유도 단백질(예: 카스파제 9(Casp9)), 또는 바이러스 중합 효소의 존재하에서만 전사될 수 있는 형태의 기타 독소를 암호화하는 재조합 핵산 구조물 또는 복제 불능 바이러스-유사 입자를 이용하는 방법 및 조성물을 제공한다. 이러한 방법은 많은 바이러스 감염을 표적으로 하고 바이러스 부하를 줄이거나 제거하고 바이러스 감염에 대해 근본적으로 다른 치료법을 제공하도록 조정할 수 있다.

Description

바이러스 감염을 치료하기 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호-참조
[0001] 본 출원은 2019년 8월 29일에 출원된 미국 가출원 제62/893,460호; 2020년 1월 31일에 출원된 미국 가출원 제62/968,387호; 2020년 2월 14일에 출원된 미국 가출원 제62/976,491호; 및 2020년 3월 5일에 출원된 미국 가출원 제62/985,597호에 대한 우선권을 주장하고, 이들 각각은 그 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다.
기술분야
[0002] 본 명세서는, 바이러스 중합 효소의 존재하에서만 전사될 형태로, 케모카인, 사이토카인, 또는 세포자멸사 유도 단백질(apoptosis inducing protein)(예: 카스파제 9(Casp9))을 암호화하는 재조합 핵산 구조물 또는 복제 불능 바이러스-유사 입자를 이용하는 방법 및 조성물을 제공한다. 이러한 방법은 많은 바이러스 감염을 표적으로 하고 바이러스 부하(viral load)를 줄이거나 제거하고, 바이러스 감염에 대해 근본적으로 다른 치료법을 제공하도록 조정할 수 있다.
[0003] 바이러스 감염은 세계 공중 보건의 어려운 문제이다. 특정 바이러스 감염을 치료하는 데 약간의 진전이 있었지만, 이러한 치료 중 많은 부분이 전 세계적으로 비효율적이거나 비용이 많이 든다. 예를 들어, 치료하기 어려운 만성 바이러스 감염의 모델로 간주되는 B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 여전히 중대한 공중 보건 문제로 남아 있다. HBV 예방접종이 도입된 이후, 수직적 모자간 전파(vertical mother-to-child transmission), 수평적 전파를 포함한 전파 위험이 크게 감소하였다. 그러나, 전 세계적으로 2억 4,800만 명이 여전히 HBV에 만성적으로 감염된 것으로 추정된다. 이는 풍토성 영역과 지역에서 높은 사회 경제적 부담을 지운다. 만성 B형 간염(CHB)의 임상 결과는 B형 간염의 자발적인 해결에서 간부전, 간경변, 및 간세포 암종(HCC)의 발병을 포함한 심각한 해로운 결과에 이르기까지 매우 다양하다. 숙주의 항바이러스 면역에 의해 매개되는 지속적 또는 반복적인 간 괴사염증은 질병 진행의 주요 원인이고, 결국에는 진행된 간 섬유화 및 간의 발암을 유발한다. CHB의 심각한 부작용의 전생애 위험도는 15%-40%만큼 높다. 위험한 상태의 사람들에 대한 조기 진단과 시기 적절한 항바이러스 치료는 불리한 임상 결과의 발생을 예방하는 데 필요하다.
[0004] 따라서, HBV와 같은, 바이러스 감염을 치료하기 위해 새롭고, 보다 효과적이고, 보다 널리 이용 가능한 치료법이 필요하다. 효과적인 바이러스 치료법을 개발하는 데 있어 어려운 측면 중 하나는, 숙주 세포의 수명 주기와 밀접하게 관련이 있는, 복잡한 수명 주기이다. 예를 들어, 감염된 간세포에서 HBV 지속성은, 바이러스 RNA의 전사를 위한 주형인, cccDNA(covalently closed circular DNA)의 존재로 인한 것이다. 뉴클레오시드 유사체를 사용한 항바이러스 요법은 감염된 세포의 세포질에 존재하는 캡시드에서 HBV DNA의 복제를 억제하지만, 핵 cccDNA를 감소시키거나 파괴하지는 않는다. 약간의 진척에도 불구하고, 항바이러스제는 현재 몇 가지 바이러스성 질병에만 효과가 있다.
[0005] 따라서, 바이러스 감염 치료의 판도를 바꾸기 위해서는 근본적으로 다른 치료 접근법이 필요하다.
요약
[0006] 제1 및 제2 바이러스 전사 인식 신호가 플랭크된(flanked), 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 또는 이들의 조합을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자를 포함하고, 제1 바이러스 전사 인식 신호의 상류(5')에 있는 제1 프로모터 및 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 또는 이들의 조합을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자의 5'에 인접한 제2 프로모터를 추가로 포함하는 재조합 핵산 서열이 본 명세서에 제공된다.
[0007] 본 발명의 특정 실시예에서, 음성 가닥 핵산 분자는 음성 센스 RNA, 음성 센스 DNA, 비-코딩, 음성 센스 RNA, 또는 pgRNA를 발현하는 단일 또는 이중 가닥 DNA, 또는 이들의 임의의 조합이다.
[0008] 본 발명의 추가 실시예에서, 바이러스 전사 인식 신호는 음성 가닥 바이러스, RNA 역전사 바이러스, 또는 DNA 역전사 바이러스로부터 선택된 바이러스로부터 선택된다.
[0009] 본 발명의 추가 실시예에서, 재조합 핵산은 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 또는 이들의 조합을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자의 폴리 A 꼬리 하류(3')를 추가로 포함한다.
[0010] 본 발명의 추가 실시예에서, 세포자멸사 유도 단백질은 BAX, BID, BAK, BAD, 카스파제 2, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 10, 카스파제 11, 카스파제 12, 시토크롬 C, SMAC, 및 세포자멸사-유도 인자, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0011] 본 발명의 또 다른 추가 실시예에서, 제1 프로모터는 TBG(티록신 결합 글로불린), 알부민 프로모터 및/또는 강화 요소, AFP(알파-태아단백질) 프로모터, AAT(알파-1-항트립신) 프로모터, ApoE(아포지단백질 E) 프로모터, 또는 PEPCK(포스포에놀피루베이트 카복시키나제) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 강력한 유비쿼터스 프로모터 또는 간-조직-특이적 프로모터를 포함한다.
[0012] 본 발명의 또 다른 추가 실시예에서, 제2 프로모터는 신장 인자 1알파 결합 서열(EFS)을 포함한다.
[0013] 본 발명의 추가 실시예에서, 케모카인은 CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, XCL1, XCL2, 및 CX3CL1로부터 선택된다.
[0014] 본 발명의 추가 실시예에서, 사이토카인은 IL-15, IL-2, IL-8, IL-10, IL-12, IL-6, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF- α, CD40L, Mig, 및 Crg-2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0015] 본 발명의 추가 실시예에서, 바이러스 전사 인식 신호는 입실론 인식 신호(SEQ ID NO:1)를 포함한다.
[0016] 본 발명의 추가 실시예에서, 바이러스는 B형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 수포성 구내염 인디애나 바이러스, 광견병 바이러스, 소 유행 열 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 부냠웨라 바이러스, 한탄 바이러스, 나이로비 양 병 바이러스, 모래파리 열 시칠리아 바이러스, 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 C, 토고토 바이러스, 쥐 유선 종양 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 메이슨-화이자 원숭이 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 1, 인간 스푸마바이러스, 오리 B형 간염 바이러스, 및 이들의 조합이다.
[0017] 본 발명의 추가 실시예에서, 핵산 분자는 바이러스 폴리머라제, 역전사효소, 캡시드, 외피, 패키징 신호, 또는 전위 모티프에 대한 서열(코딩 또는 비코딩)을 포함하지 않는다.
[0018] 본 명세서에 기재된 임의의 재조합 핵산 서열을 포함하는 벡터가 본 명세서에 제공된다.
[0019] 본 발명의 추가 실시예에서, 벡터는 포유동물 세포로의 전달을 위한 전달 벡터 또는 비히클을 포함한다.
[0020] 본 발명의 추가 실시예에서, 벡터 또는 비히클은 VLP, 아데노-연관 바이러스(AAV), 리포솜, 나노입자, 미셀, 중합체 소포, 또는 중합체를 포함한다.
[0021] 본 명세서에 기재된 임의의 재조합 핵산 서열 또는 본 명세서에 기재된 임의의 벡터를 포함하는 약학 조성물이 본 명세서에 제공된다.
[0022] B형 간염 바이러스 캡시드 또는 D형 간염 바이러스 캡시드로부터의 캡시드 단백질에 융합된 선택적 전위 모티프(TLM); 및
제1 및 제2 바이러스 전사 인식 신호가 플랭크된(flanked), 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 또는 이들의 조합을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자를 포함하고, 제1 바이러스 전사 인식 신호의 상류(5')에 있는 제1 프로모터 및 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 또는 이들의 조합을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자의 5'에 인접한 제2 프로모터를 추가로 포함하는 복제 불능 바이러스-유사 입자(VLP)가 제공된다.
[0023] 제1 및 제2 표적 바이러스 전사 인식 신호가 플랭크된(flanked), 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 또는 이들의 조합을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자를 포함하고, 제1 바이러스 전사 인식 신호의 상류(5')에 있는 제1 프로모터 및 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 또는 이들의 조합을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자의 5'에 인접한 제2 프로모터를 추가로 포함하는 복제 불능 바이러스-유사 입자(VLP)가 제공되고, 상기 VLP는 표적 바이러스에 감염된 세포에 대한 친화성을 나타낸다.
[0024] 본 발명의 추가 실시예에서, 음성 가닥 핵산 분자는 음성 센스 RNA, 음성 센스 DNA, 비-코딩, 음성 센스 RNA, 또는 pgRNA를 발현하는 단일 또는 이중 가닥 DNA, 또는 이들의 임의의 조합이다.
[0025] 본 발명의 추가 실시예에서, 복제 불능 바이러스-유사 입자(VLP)는 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 또는 이들의 조합을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자의 폴리 A 꼬리 하류(3')를 추가로 포함한다.
[0026] 본 발명의 추가 실시예에서, 제1 프로모터는 TBG(티록신 결합 글로불린), 알부민 프로모터 및/또는 강화 요소, AFP(알파-태아단백질) 프로모터, AAT(알파-1-항트립신) 프로모터, ApoE(아포지단백질 E) 프로모터, 또는 PEPCK(포스포에놀피루베이트 카복시키나제) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 강력한 유비쿼터스 프로모터 또는 간-조직-특이적 프로모터를 포함한다.
[0027] 본 발명의 추가 실시예에서, 제2 프로모터는 신장 인자 1알파 결합 서열(EFS)을 포함한다.
[0028] 본 발명의 추가 실시예에서, 바이러스 전사 인식 신호는 음성 가닥 바이러스, RNA 역전사 바이러스, 또는 DNA 역전사 바이러스로부터 선택된 바이러스로부터 선택된다.
[0029] 본 발명의 추가 실시예에서, 바이러스 전사 인식 신호는 입실론 인식 신호(SEQ ID NO:1)를 포함한다.
[0030] 본 발명의 추가 실시예에서, 세포자멸사 유도 단백질은 BAX, BID, BAK, BAD, 카스파제 2, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 10, 카스파제 11, 카스파제 12, 시토크롬 C, SMAC, 및 세포자멸사-유도 인자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0031] 본 발명의 추가 실시예에서, 케모카인은 CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, XCL1, XCL2, 및 CX3CL1로부터 선택된다.
[0032] 본 발명의 추가 실시예에서, 사이토카인은 IL-15, IL-2, IL-8, IL-10, IL-12, IL-6, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF- α, CD40L, Mig, 및 Crg-2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[0033] 본 발명의 추가의 실시예에서, 바이러스는 B형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 수포성 구내염 인디애나 바이러스, 광견병 바이러스, 소 유행 열 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 부냠웨라 바이러스, 한탄 바이러스, 나이로비 양 병 바이러스, 모래파리 열 시칠리아 바이러스, 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 C, 토고토 바이러스, 쥐 유선 종양 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 메이슨-화이자 원숭이 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 1, 인간 스푸마바이러스, 오리 B형 간염 바이러스, 및 이들의 조합이다.
[0034] 본 발명의 추가 실시예에서, 핵산 분자는 바이러스 캡시드, 폴리머라제, 역전사효소, 외피, 패키징 신호, 또는 전위 모티프에 대한 서열(코딩 또는 비코딩)을 포함하지 않는다.
[0035] 본 명세서에 기재된 임의의 불능 바이러스-유사 입자를 포함하는 약학 조성물이 추가로 제공된다.
[0036] 또한, 이를 필요로 하는 대상체에서 바이러스 감염을 치료하는 방법이 제공되고, 이 방법은 대상체에게 본 명세서에 기재된 재조합 핵산 분자, 또는 본 명세서에 기재된 벡터, 또는 본 명세서에 기재된 약학 조성물, 또는 본 명세서에 기재된 복제 불능 바이러스-유사 입자를 투여하는 것을 포함한다.
[0037] 본 발명의 추가 실시예에서, 바이러스 감염은 볼티모어 분류 IV, V, VI, 또는 VII하에 분류된 바이러스로부터의 감염을 포함한다.
[0038] 본 발명의 추가 실시예에서, 바이러스 감염은 B형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 수포성 구내염 인디애나 바이러스, 광견병 바이러스, 소 유행 열 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 부냠웨라 바이러스, 한탄 바이러스, 나이로비 양 병 바이러스, 모래파리 열 시칠리아 바이러스, 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 C, 토고토 바이러스, 쥐 유선 종양 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 메이슨-화이자 원숭이 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 1, 인간 스푸마바이러스, 오리 B형 간염 바이러스, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터의 감염을 포함한다.
[0039] 본 발명의 추가 실시예에서, 바이러스 감염은 인플루엔자 A, B, C, 및/또는 임의의 코로나바이러스, 및/또는 볼티모어 분류 그룹 IV로부터의 임의의 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터의 감염을 포함한다.
[0040] 본 발명의 추가 실시예에서, 바이러스 감염은 필로바이러스, 파라믹소바이러스, 모빌리바이러스, 루불라바이러스(rubulavirus), 뉴모바이러스, 수포성바이러스, 리사바이러스, 에페메로바이러스(ephemerovirus), 아레나바이러스, 분야바이러스, 한타바이러스, 나이로바이러스, 플레보바이러스, 오르토헤파드나바이러스(Orthohepadnavirus), 아비헤파드나바이러스(Avihepadnavirus), 포유동물 B형 레트로바이러스, 포유동물 C형 레트로바이러스, 조류 C형 레트로바이러스, D형 레트로바이러스, BLV-HTLV 레트로바이러스, 렌티바이러스, 스푸마바이러스, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터의 감염을 포함한다.
[0041] 본 발명의 일부 실시예에서, 바이러스 감염은 COVID-19, SARS, 또는 MERS로 지칭되는 바이러스와 같은 코로나바이러스로부터의 감염을 포함한다.
[0042] 본 발명의 추가 실시예에서, 투여 시 핵산 분자, 벡터, 약학 조성물, 또는 복제 불능 바이러스-유사 입자는 간 세포로 들어간다.
[0043] 본 발명의 추가 실시예에서, 투여시 핵산 분자, 벡터, 약학 조성물, 또는 복제 불능 바이러스-유사 입자는 핵산 분자를 간 세포에 전달하고 핵산 분자는 간 세포에서 발현된다.
[0044] 본 발명의 추가 실시예에서, 대상체는 급성, 만성, 또는 잠복성 바이러스 감염을 갖는다.
[0045] 본 발명의 추가 실시예에서, 투여는 바이러스 감염을 유발하는 바이러스에 감염된 세포에 대한 면역 반응을 유도한다.
[0046] 본 발명의 추가 실시예에서, 투여는 바이러스 감염을 유발하는 바이러스에 감염된 세포에서 세포자멸사를 유도한다.
[0047] 또한, 이를 필요로 하는 대상체에서, 바이러스에 감염된 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 제공되고, 이 방법은 대상체에게 임의의 본 명세서에 기재된 재조합 핵산 분자, 또는 본 명세서에 기재된 벡터, 또는 본 명세서에 기재된 약학 조성물, 또는 본 명세서에 기재된 복제 불능 바이러스-유사 입자를 투여하는 것을 포함한다.
[0048] 또한, 이를 필요로 하는 대상체에서, 바이러스에 감염된 세포에 대한 세포자멸사 반응을 유도하는 방법이 제공되고, 이 방법은 대상체를 임의의 본 명세서에 기재된 재조합 핵산 분자, 또는 본 명세서에 기재된 벡터, 또는 본 명세서에 기재된 약학 조성물, 또는 본 명세서에 기재된 복제 불능 바이러스-유사 입자와 접촉시키는 것을 포함한다.
[0049] 본 발명의 추가 실시예에서, 바이러스는 HBV, HDV, A형 간염 바이러스(HAV), C형 간염 바이러스(HCV), 또는 이들의 임의의 조합이다.
[0050] 또한 대상체에서 B형 간염을 치료하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 대상체에게 본 명세서에 기재된 재조합 핵산 분자, 또는 본 명세서에 기재된 벡터, 또는 본 명세서에 기재된 약학 조성물, 또는 본 명세서에 기재된 복제 불능 바이러스-유사 입자를 투여하는 것을 포함한다.
[0051] 본 발명의 추가 실시예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 항바이러스제, HBV 폴리머라제 억제제, 인터페론, TLR 조절제, 예컨대 TLR-7 효능제 또는 TLR-9 효능제, 치료 백신, 특정 세포 바이러스 RNA 센서의 면역 활성화제, 바이러스 침입 억제제, 바이러스 성숙 억제제, 별개의 캡시드 어셈블리 조절제, 별개의 또는 알려지지 않은 기전의 항바이러스 화합물, 및 이들의 임의의 조합을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
[0052] 본 발명의 추가 실시예에서, 방법은 하나 이상의 항바이러스제 3TC, FTC, L-FMAU, 인터페론, 아데포비르 디피복실, 엔테카비르, 텔비부딘(L-dT), 발토르시타빈(3'-발리닐 L-dC), .베타.-D-디옥솔라닐-구아닌(DXG), .베타.-D-디옥솔라닐-2,6-디아미노퓨린(DAPD), .베타.-D-디옥솔라닐-6-클로로퓨린(ACP), 팜시클로비르, 펜시클로비르, 로부카비르, 간시클로비르, 리바비린, 및 이들의 임의의 조합을 투여하는 것을 추가로 포함한다.
[0053] 본 발명의 추가 실시예에서, 치료는 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 매월 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 4개월마다 1회, 5개월마다 1회, 6개월마다 1회, 또는 7개월마다 1회, 또는 8개월마다 1회, 또는 9개월마다 1회, 또는 10개월마다 1회, 또는 11개월마다, 또는 유지 치료로서 1년에 1회, 또는 환자가 안정하거나 검출할 수 없는 질병을 달성하는 데 필요한 기간을 포함하여 주기적으로 투여된다.
[0054] 도 1a 및 도 1b는 AAV8-HBV-DRS2 구조물(6005bp)의 특징을 도시하는 플라스미드 지도 및 재조합 구조물 개략도를 포함한다.
[0055] 도 2a, 도 2b, 및 도 2c는 실험 1에 대한 수치 데이터와 함께 HepG2(야생형) 및 HepAD38 세포에서 시험 및 대조군 구조물의 생존 세포 데이터를 도시하는 그래프인 비제한적인 플라스미드 지도를 예시한다.
[0056] 도 3a 및 도 3b는 비제한적인 플라스미드 지도 및 카스파제-9 억제제의 화학 구조 및 실험 2에 대한 HepG2(야생형) 세포에서 시험 및 대조군 구조물의 생존 세포 데이터를 도시하는 그래프를 예시한다.
[0057] 도 4a, 도 4b, 및 도 4c는 비제한적인 플라스미드 지도 및 카스파제-9 억제제의 화학 구조(도 4a), HepAD38 세포(HBV 모델 세포)에서 시험 및 대조군 구조물의 생존 세포 데이터를 도시하는 그래프(도 4b)를 실험 2에 대한 수치 데이터(도 4c)와 함께 예시한다.
[0058] 도 5a 및 도 5b는 플라스미드 지도(도 5a) 및 실험 2에 대한 HepG2 대 HepAD38 세포의 시험 및 대조군 구조물에 대한 결과를 도시하는 비교 그래프(도 5b)를 도시한다.
[0059] 도 6a, 도 6b, 및 도 6c는 시험 구조물 AAV-HBV-DRS2(TBG>HBV-rcCasp9)에 대한 플라스미드 지도 및 카스파제-9 억제제의 화학 구조(도 6a), 및 HepG2 대 HepAD38 세포에서 시험 및 대조군 구조물의 생존 세포 데이터를 보여주는 비교 그래프(도 6b)를 실험 3에 대한 수치 데이터(도 4c)와 함께 도시한다.
[0060] 도 7은 AAV8-HBV-DRS1 구조물 및 서열의 특징을 도시하는 플라스미드 지도 및 구조물 개략도이다.
[0061] 도 8은 AAV8-HBV-DRS2 구조물 및 서열의 특징을 도시하는 플라스미드 지도 및 구조물 개략도이다.
[0062] 도 9는 표적화된 재조합 구조물의 분포, 효능, 특이성/기능성, 및 안전성을 평가하기 위해 모델 쥐를 이용하는 생체 내 시험을 예시하는 개략도이다.
[0063] 도 10a 및 도 10b는 "인플루엔자 하이잭/자살 벡터"가 감염된 세포에서 세포자멸사를 유도하기 위해 바이러스 기계를 하이재킹하는 방법을 보여주는 개략도 및 그래프이고(도 10a), 인플루엔자 폴리머라제와 결합하기 위해 트랜스로 전달된 시험 구조물이 바이러스 기계를 하이재킹하여 인플루엔자 감염 세포에서 미치료 감염된 세포보다 40% 더 빠르게 세포 사멸을 유도한다는 것을 보여주는 시험관 내 결과이다(도 10b).
[0064] 도 11a, 도 11b, 및 도 11c는 쥐 모델에서 HBV 하이잭 구조물을 사용한 결과를 보여주는 이미지, 그래프, 및 개략도이다.
[0065] 도 12a 및 도 12b는 코로나바이러스 "하이잭-RNA" 구조물에 대한 설계의 개요를 보여주는 개략도이다.
[0066] 도 13은 SARS-CoV-2 감염 세포에서 SARS-CoV-2 하이잭 RNA의 작용 기전을 보여주는 개략도를 도시한다.
[0067] 도 14는 비제한적인 플라스미드 지도 및 Cov-2 하이잭 DTA 시험관 내 전사 벡터의 특징 및 서열을 보여주는 구조물 개략도를 도시한다.
[0068] 도 15는 비제한적인 플라스미드 지도 및 SARS-CoV-2 하이잭 RNA 구조물의 특징 및 서열을 보여주는 및 구축물 개략도를 예시한다.
[0069] 도 16a 및 도 16b는 시험 또는 대조군 구조물로 치료한 후 SARS-CoV-2-감염 또는 감염되지 않은 세포의 생존력을 보여주는 비교 그래프이다.
발명의 상세한 설명
[0070] 본 발명의 특정 실시예에서, 바이러스 폴리머라제의 존재하에서만 전사될, 케모카인, 사이토카인, 또는 세포자멸사 유도 단백질(예: Caspase 9(Casp9) 및 본 명세서에 제공된 바와 같은 다른 것들)을 암호화하는 재조합 핵산 구조물 또는 복제 불능 바이러스-유사 입자를 이용하는 방법 및 조성물이 제공된다. 특정 실시예에서, 구조물은 Casp9를 암호화하는 서열을 보유하고, 이는 바이러스 감염된 세포의 사멸을 초래할 것이다. 이러한 방법은 많은 바이러스 감염을 표적으로 하고 바이러스 부하를 줄이거나 제거하고, 바이러스 감염에 대해 근본적으로 다른 치료법을 제공하도록 조정할 수 있다.
바이러스 기계를 사용하여 바이러스에 감염된 세포 파괴
[0071] 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 방법 및 조성물은 적어도 부분적으로 감염된 세포의 세포질에 전형적으로 존재하는 바이러스 기계를 이용하는 것에 기초한다. 특정 실시예에서, 재조합 핵산 구조물 또는 복제 불능 바이러스-유사 입자(VLP)를 바이러스 감염된 세포 내로 지시하거나 주사하는 단계로서, 여기서 구조물 또는 VLP는, B형 간염 역전사효소에 의해 인식될 때만 전사되고 엡실론 서열을 사용하여 세그먼트를 전사하고 Casp 9에 대한 코딩 서열을 번역할 구조물을 형성하기 위해, B형 간염 입실론 신호 결합 서열이 플랭킹된, 케모카인, 사이토카인, 또는 세포자멸사 유도 단백질, 예를 들어, Casp 9(및 이의 프로모터)를 코딩하는 서열을 함유하는 단일 가닥 RNA 핵산 구조물을 포함하고, 이는 B형 간염에 감염된 세포의 세포자멸사를 촉발한다. 이러한 구조물은 "바이러스 특이적 자살 구조물"로서 효과적으로 기능할 것이고, 그렇지 않으면 바이러스에 감염되지 않은 세포에서 분해될 것이다.
[0072] 따라서, 특정 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 B형 간염 감염된 세포를 표적으로 하도록 설계된 재조합 핵산 구조물 및 복제 불능 바이러스-유사 입자를 포함한다. HBV는 단일-가닥 RNA 중간체를 통해 복제되는 이중-가닥 DNA 바이러스를 포함하는 볼티모어 그룹 VII에서 유래하였다. B형 간염 바이러스로 대표되는 이 작은 바이러스 그룹에는, 바이러스 mRNA 및 하위 게놈 RNA 생성을 위한 주형 역할을 하는 공유 폐쇄 원(cccDNA)을 형성하기 위해 채워진, 이중-가닥의 틈이 있는 게놈이 있다. 프리게놈(pregenome) RNA는 DNA 게놈 생산을 위한 바이러스 역전사효소의 주형 역할을 한다. 이 바이러스 폴리머라제는 본 명세서에 기술된 재조합 핵산 구조물 및 복제 불능 바이러스-유사 입자에서 플랭킹 입실론 서열을 인식하고 독성 물질을 생성한다. 따라서, 바이러스에 감염된 세포만 케모카인, 사이토카인, 또는 세포자멸사 유도 단백질(예: Caspase 9(Casp9))의 생산에 의해 사멸된다.
[0073] 본 발명의 일부 실시예에서, 케모카인, 사이토카인, 또는 세포자멸사 유도 단백질은 바이러스 5' UTR 및 바이러스 3' UTR에 의해 플랭킹되어, 핵산이 화학식 X-Y-Z로 표시될 수 있고, 여기서 X는 바이러스 5' UTR이고, Y는 관심 단백질, 예를 들어 케모카인, 사이토카인, 또는 세포자멸사 유도 단백질(예: Caspase 9 또는 본 명세서에 제공된 바와 같은 다른 것, 또는 디프테리아 독소 A 단편)이고, Z는 바이러스 3' UTR이다. 5' UTR과 관심 단백질 또는 3' UTR과 관심 단백질 사이에 중간 서열이 있을 수 있다. 전사체가 세포에 의해 인식되면 관심 단백질을 암호화하는 5'-3' 역보체를 생성한다. 이는 AAV 발현 벡터 또는 다른 적절한 바이러스 벡터에서도 전달될 수 있다.
[0074] 본 발명의 일부 실시예에서, 5'-UTR은 COVID-19(또는 COVD-19), SARS, 또는 MERS로 지칭되는 바이러스와 같은 코로나바이러스의 5' 선행 서열이다. 일부 실시예에서, 5’-UTR은:
ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAACAAACCAACCAACTTTCGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGAACTTTAAAATCTGTGTGGCTGTCACTCGGCTGCATGCTTAGTGCACTCACGCAGTATAATTAATAACTAATTACTGTCGTTGACAGGACACGAGTAACTCGTCTATCTTCTGCAGGCTGCTTACGGTTTCGTCCGTGTTGCAGCCGATCATCAGCACATCTAGGTTTCGTCCGGGTGTGACCGAAAGGTAAG(SEQ ID NO: 25)
의 서열 또는 그의 상보체를 포함한다.
본 발명의 일부 실시예에서, 3’UTR은:
CAATCTTTAATCAGTGTGTAACATTAGGGAGGACTTGAAAGAGCCACCACATTTTCACCGAGGCCACGCGGAGTACGATCGAGTGTACAGTGAACAATGCTAGGGAGAGCTGCCTATATGGAAGAGCCCTAATGTGTAAAATTAATTTTAGTAGTGCTATCCCCATGTGATTTTAATAGCTTCTTAGGAGAATGACAAAAAAACAATCTTGCTAAACACTGTCTTCATG (SEQ ID NO: 26)
의 서열 또는 그의 상보체를 포함한다.
[0075] 본 발명의 일부 실시예에서, 디프테리아 독소 A 단편을 암호화하는 핵산 서열은:
ATGGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAATCTTTTGTGATGGAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAACCTGGTTATGTAGATTCCATTCAAAAAGGTATACAAAAGCCAAAATCTGGTACACAAGGAAATTATGACGATGATTGGAAAGGGTTTTATAGTACCGACAATAAATACGACGCTGCGGGATACTCTGTAGATAATGAAAACCCGCTCTCTGGAAAAGCTGGAGGCGTGGTCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAAGTGGATAATGCCGAAACTATTAAGAAAGAGTTAGGTTTAAGTCTCACTGAACCGTTGATGGAGCAAGTCGGAACGGAAGAGTTTATCAAAAGGTTCGGTGATGGTGCTTCGCGTGTAGTGCTCAGCCTTCCCTTCGCTGAGGGGAGTTCTAGCGTTGAATATATTAATAACTGGGAACAGGCGAAAGCGTTAAGCGTAGAACTTGAGATTAATTTTGAAACCCGTGGAAAACGTGGCCAAGATGCGATGTATGAGTATATGGCTCAAGCCTGTGCAGGAAATCGTGTCAGGCGATCAGTAGGTAGCTCATTGTAA (SEQ ID NO: 27)
(또는 그의 상보체)를 포함한다.
[0076] 본 발명의 일부 실시예에서,
ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAACAAACCAACCAACTTTCGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGAACTTTAAAATCTGTGTGGCTGTCACTCGGCTGCATGCTTAGTGCACTCACGCAGTATAATTAATAACTAATTACTGTCGTTGACAGGACACGAGTAACTCGTCTATCTTCTGCAGGCTGCTTACGGTTTCGTCCGTGTTGCAGCCGATCATCAGCACATCTAGGTTTCGTCCGGGTGTGACCGAAAGGTAAGATGGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAATCTTTTGTGATGGAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAACCTGGTTATGTAGATTCCATTCAAAAAGGTATACAAAAGCCAAAATCTGGTACACAAGGAAATTATGACGATGATTGGAAAGGGTTTTATAGTACCGACAATAAATACGACGCTGCGGGATACTCTGTAGATAATGAAAACCCGCTCTCTGGAAAAGCTGGAGGCGTGGTCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAAGTGGATAATGCCGAAACTATTAAGAAAGAGTTAGGTTTAAGTCTCACTGAACCGTTGATGGAGCAAGTCGGAACGGAAGAGTTTATCAAAAGGTTCGGTGATGGTGCTTCGCGTGTAGTGCTCAGCCTTCCCTTCGCTGAGGGGAGTTCTAGCGTTGAATATATTAATAACTGGGAACAGGCGAAAGCGTTAAGCGTAGAACTTGAGATTAATTTTGAAACCCGTGGAAAACGTGGCCAAGATGCGATGTATGAGTATATGGCTCAAGCCTGTGCAGGAAATCGTGTCAGGCGATCAGTAGGTAGCTCATTGTAACAATCTTTAATCAGTGTGTAACATTAGGGAGGACTTGAAAGAGCCACCACATTTTCACCGAGGCCACGCGGAGTACGATCGAGTGTACAGTGAACAATGCTAGGGAGAGCTGCCTATATGGAAGAGCCCTAATGTGTAAAATTAATTTTAGTAGTGCTATCCCCATGTGATTTTAATAGCTTCTTAGGAGAATGACAAAAAAACAATCTTGCTAAACACTGTCTTCATG (SEQ ID NO: 28)
의 서열을 포함하는 조성물이 제공되고, 이는 5'UTR, 3' UTR, 및 관심 단백질을 암호화하고, 이는 본 명세서에 제공된 바와 같은 임의의 서열일 수 있다. 위의 실시예에서, 서열은 디프테리아 독소 A 단편을 암호화한다.
[0077] 본 발명의 일부 실시예에서, 디프테리아 독소 A 단편을 암호화하는 핵산 서열은 역 상보체로서 제공되고, 이는:
TTACAATGAGCTACCTACTGATCGCCTGACACGATTTCCTGCACAGGCTTGAGCCATATACTCATACATCGCATCTTGGCCACGTTTTCCACGGGTTTCAAAATTAATCTCAAGTTCTACGCTTAACGCTTTCGCCTGTTCCCAGTTATTAATATATTCAACGCTAGAACTCCCCTCAGCGAAGGGAAGGCTGAGCACTACACGCGAAGCACCATCACCGAACCTTTTGATAAACTCTTCCGTTCCGACTTGCTCCATCAACGGTTCAGTGAGACTTAAACCTAACTCTTTCTTAATAGTTTCGGCATTATCCACTTTTAGTGCGAGAACCTTCGTCAGTCCTGGATACGTCACTTTGACCACGCCTCCAGCTTTTCCAGAGAGCGGGTTTTCATTATCTACAGAGTATCCCGCAGCGTCGTATTTATTGTCGGTACTATAAAACCCTTTCCAATCATCGTCATAATTTCCTTGTGTACCAGATTTTGGCTTTTGTATACCTTTTTGAATGGAATCTACATAACCAGGTTTAGTCCCGTGGTACGAAGAAAAGTTTTCCATCACAAAAGATTTAGAAGAATCAACAACATCATCAGCGCCCAT (SEQ ID NO: 29)
의 서열을 포함할 수 있다.
[0078] 본 발명의 일부 실시예에서, 서열은 역 상보체로서 제공되고, 이는:
CATGAAGACAGTGTTTAGCAAGATTGTTTTTTTGTCATTCTCCTAAGAAGCTATTAAAATCACATGGGGATAGCACTACTAAAATTAATTTTACACATTAGGGCTCTTCCATATAGGCAGCTCTCCCTAGCATTGTTCACTGTACACTCGATCGTACTCCGCGTGGCCTCGGTGAAAATGTGGTGGCTCTTTCAAGTCCTCCCTAATGTTACACACTGATTAAAGATTGTTACAATGAGCTACCTACTGATCGCCTGACACGATTTCCTGCACAGGCTTGAGCCATATACTCATACATCGCATCTTGGCCACGTTTTCCACGGGTTTCAAAATTAATCTCAAGTTCTACGCTTAACGCTTTCGCCTGTTCCCAGTTATTAATATATTCAACGCTAGAACTCCCCTCAGCGAAGGGAAGGCTGAGCACTACACGCGAAGCACCATCACCGAACCTTTTGATAAACTCTTCCGTTCCGACTTGCTCCATCAACGGTTCAGTGAGACTTAAACCTAACTCTTTCTTAATAGTTTCGGCATTATCCACTTTTAGTGCGAGAACCTTCGTCAGTCCTGGATACGTCACTTTGACCACGCCTCCAGCTTTTCCAGAGAGCGGGTTTTCATTATCTACAGAGTATCCCGCAGCGTCGTATTTATTGTCGGTACTATAAAACCCTTTCCAATCATCGTCATAATTTCCTTGTGTACCAGATTTTGGCTTTTGTATACCTTTTTGAATGGAATCTACATAACCAGGTTTAGTCCCGTGGTACGAAGAAAAGTTTTCCATCACAAAAGATTTAGAAGAATCAACAACATCATCAGCGCCCATCTTACCTTTCGGTCACACCCGGACGAAACCTAGATGTGCTGATGATCGGCTGCAACACGGACGAAACCGTAAGCAGCCTGCAGAAGATAGACGAGTTACTCGTGTCCTGTCAACGACAGTAATTAGTTATTAATTATACTGCGTGAGTGCACTAAGCATGCAGCCGAGTGACAGCCACACAGATTTTAAAGTTCGTTTAGAGAACAGATCTACAAGAGATCGAAAGTTGGTTGGTTTGTTACCTGGGAAGGTATAAACCTTTAAT (SEQ ID NO: 30)
의 서열을 포함할 수 있다.
[0079] 본 명세서에 제공된 서열(위 및 아래)은 DNA 서열로 표시되지만, 상응하는 RNA 서열도 제공된다.
[0080] 본 명세서에 사용된 용어 "핵산 서열" 및 "핵산 분자"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
[0081] 본 발명의 일부 실시예에서, 제1 및 제2 바이러스 전사 인식 신호가 플랭크된(flanked), 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 또는 이들의 조합을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자를 포함하고, 제1 바이러스 전사 인식 신호의 상류(5')에 있는 제1 프로모터 및 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 디프테리아 독소 A(또는 이의 단편), 또는 이들의 조합을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자의 5'에 인접한 제2 프로모터를 추가로 포함하는 재조합 핵산 서열이 본 명세서에 제공된다. 케모카인, 사이토카인, 및 세포자멸사 유도 단백질의 비제한적인 예가 본원에 제공된다. 제1 및 제2 바이러스 전사 인식 신호가 플랭킹되는 실제 단백질은 임의의 적합한 단백질일 수 있다. 이 암호화된 단백질은 또한 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 또는 디프테리아 독소 A(또는 이의 단편)를 암호화하는 것뿐만 아니라 임의의 관심 단백질로 대체될 수 있다.
[0082] 본 명세서에 제공된 바와 같이 음성 가닥 핵산 분자는 음성 센스 RNA, 음성 센스 DNA, 비코딩, 음성 센스 RNA, 또는 pgRNA를 발현하는 단일 또는 이중 가닥 DNA, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시예에서, 음성 가닥 핵산 분자는 음성 센스 RNA이다. 일부 실시예에서, 음성 가닥 핵산 분자는 음성 센스 DNA이다. 일부 실시예에서, 음성 가닥 핵산 분자는 비-코딩, 음성 센스 RNA를 발현하는 단일 또는 이중 가닥 DNA이다. 일부 실시예에서, 음성 가닥 핵산 분자는 pgRNA이다.
[0083] 본 명세서에 제공된 바와 같이, 일부 실시예에서, 바이러스 전사 인식 신호는, 예를 들어 음성 가닥 바이러스, RNA 역전사 바이러스, 또는 DNA 역전사 바이러스인, 바이러스로부터 유래되거나 이에 기초한다. 일부 실시예에서, 바이러스 전사 인식 신호는 음성 가닥 바이러스 바이러스 전사 인식 신호이다. 일부 실시예에서, 바이러스 전사 인식 신호는 RNA 역전사 바이러스 바이러스 전사 인식 신호이다. 일부 실시예에서, 바이러스 전사 인식 신호는 DNA 역전사 바이러스 바이러스 전사 인식 신호이다.
[0084] 본 발명의 일부 실시예에서, 재조합 핵산 서열은, 독소, 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 또는 이들의 조합과 같은 관심 단백질을 또한 암호화하는, 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자의 폴리 A 꼬리 하류(3')를 포함한다.
[0085] 세포자멸사 유도 단백질은 세포에서의 발현에 기초하여 세포자멸사를 유도할 수 있는 임의의 단백질일 수 있다. 예에는 BAX, BID, BAK, BAD, 카스파제 2, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 10, 카스파제 11, 카스파제 12, 시토크롬 C, SMAC, 및 세포자멸사-유도 인자, 또는 이들의 조합이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 따라서, 이들 단백질은 감염된 개체에게 투여되거나 감염된 세포와 접촉하여 이들 관심 단백질의 발현을 통해 세포 사멸을 유도하는 구조물에서 관심 단백질로서 발현될 수 있다.
[0086] 본 발명의 일부 실시예에서, 관심 단백질은 바이러스 단백질이 아니다.
[0087] 본 발명의 실시예에 의해 사용되거나 암호화될 수 있는 케모카인의 예는 CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, XCL1, XCL2, 및/또는 CX3CL1을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[0088] 본 명세서에 제공된 바와 같이, 일부 실시예에서, 재조합 핵산 서열은 세포에서 핵산 서열의 발현을 지시하는 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 실시예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 일부 실시예에서, 프로모터는 간-조직-특이적 프로모터이다. 간-조직-특이적 프로모터의 예에는 TBG(티록신 결합 글로불린), 알부민 프로모터 및/또는 강화 요소, AFP(알파-태아단백질) 프로모터, AAT(알파-1-항트립신) 프로모터, ApoE(아포지단백질 E) 프로모터 또는 PEPCK(포스포에놀피루베이트 카복시키나제) 프로모터가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 프로모터는 본 명세서에 언급된 제1 프로모터로서 사용될 수 있다.
[0089] 본 발명의 일부 실시예에서, 재조합 핵산 서열은 제2 프로모터를 포함한다. 이러한 제2 프로모터의 비제한적인 예는 신장 인자 1알파 결합 서열(EFS)이다.
[0090] 본 발명의 일부 실시예에서, 바이러스 전사 인식 신호(서열)는 엡실론 인식 신호(SEQ ID NO:1) 또는 코로나 바이러스 인식 서열(예: SEQ ID: 25, SEQ ID: 26, SEQ ID: 28, 또는 SEQ ID: 30에서 발견되는 것들)을 포함한다. 다른 바이러스 전사 인식 신호 서열이 또한 사용될 수 있고 치료될 바이러스 또는 바이러스 감염에 대해 특이적인 서열로 대체될 수 있다.
[0091] 본 명세서에 제공된 바와 같이, 본 실시예는 바이러스 감염을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 그리고 일부 실시예에서, 조성물 및 방법을 사용하여 바이러스 감염된 세포를 특이적으로 사멸시킬 수 있다. 바이러스에 감염된 세포를 특이적으로 사멸시키는 이점은 바이러스를 보유하고 있는 세포만 파괴할 수 있다는 것이다. 바이러스 전사 인식 신호에 사용할 수 있는 바이러스의 예에는 코로나 바이러스(예: COVID-19, SARS, MERS), B형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 수포성 구내염 인디애나 바이러스, 광견병 바이러스, 소 유행 열 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 부냠웨라 바이러스, 한탄 바이러스, 나이로비 양 병 바이러스, 모래파리 열 시칠리아 바이러스, 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 C, 토고토 바이러스, 쥐 유선 종양 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 메이슨-화이자 원숭이 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 1, 인간 스푸마바이러스, 오리 B형 간염 바이러스, 코로나바이러스, 및 이들의 조합이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 임의의 특정 이론에 구속되지 않고, 바이러스 전사 인식 신호 서열의 선택을 사용하여 치료되는 바이러스 감염 유형을 결정할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 전사 인식 신호 서열이 COVID-19 바이러스 전사 인식 신호 서열이라면, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 COVID-19에 감염된 세포에서만 발현될 것이다. COVID-19는 단지 비제한적인 예로서 사용되고 본 명세서에 제공된 실시예를 제한하는 데 사용되어서는 안 된다.
[0092] 본 발명의 일부 실시예에서, 핵산 분자는 바이러스 폴리머라제, 역전사효소, 캡시드, 외피, 패키징 신호, 또는 전위 모티프에 대한 서열(코딩 또는 비코딩)을 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 재조합 핵산 분자는 바이러스 폴리머라제에 대한 서열(코딩 또는 비코딩)을 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 재조합 핵산 분자는 역전사효소에 대한 서열(코딩 또는 비코딩)을 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 재조합 핵산 분자는 캡시드 단백질에 대한 서열(코딩 또는 비코딩)을 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 재조합 핵산 분자는 외피 단백질에 대한 서열(코딩 또는 비코딩)을 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 재조합 핵산 분자는 패키징 신호에 대한 서열(코딩 또는 비코딩)을 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 재조합 핵산 분자는 전위 모티프에 대한 서열(코딩 또는 비코딩)을 포함하지 않는다.
[0093] 본 명세서에서 제공되는 재조합 핵산 분자는 벡터로 제공될 수 있다. 벡터는 예를 들어 인간 세포와 같은 포유동물 세포로의 전달을 위한 전달 벡터 또는 비히클일 수 있다. 일부 실시예에서, 세포는 시노(예를 들어, 원숭이) 세포이다. 일부 실시예에서, 벡터는 재조합 핵산 분자를 인간 및 시노 세포에 전달할 수 있는 벡터이다. 일부 실시예에서, 벡터는 재조합 핵산 분자를 인간 세포에 전달할 수 있지만 시노 세포에는 전달할 수 없는 벡터이다. 일부 실시예에서, 벡터는 재조합 핵산 분자를 시노 세포에 전달할 수 있지만 인간 세포에는 전달할 수 없는 벡터이다.
[0094] 본 발명의 일부 실시예에서, 전달 벡터 또는 비히클은 VLP, 아데노-연관 바이러스(AAV), 리포솜, 나노입자, 미셀, 중합체 소포, 또는 폴리머솜이다. 일부 실시예에서, 전달 벡터 또는 비히클은 AAV 벡터이다. 일부 실시예에서, 전달 벡터 또는 비히클은 리포솜이다. 일부 실시예에서, 전달 벡터 또는 비히클은 나노입자이다. 일부 실시예에서, 전달 벡터 또는 비히클은 미셀이다. 일부 실시예에서, 전달 벡터 또는 비히클은 중합체 소포이다. 일부 실시예에서, 전달 벡터 또는 비히클은 폴리머솜이다. 전달 벡터 또는 비히클의 비제한적인 예는 미국 특허 출원 공개 제20200206362호, 미국 특허 출원 공개 제20200246267호, 미국 특허 출원 공개 제20170273907호, 및 미국 특허 제10,556,018호에 기재된 것들을 포함하고, 이들 각각은 전체 내용이 참조로 본 명세서에 포함된다.
17. 또한 본 명세서에 제공된 재조합 핵산 분자를 포함할 수 있는 복제 불능 바이러스-유사 입자(VLP)가 제공된다. 일부 실시예에서, VLP는 관심 바이러스로부터의 캡시드 단백질에 융합된 선택적 전위 모티프(TLM)를 포함한다. 예를 들어, 캡시드 단백질은 B형 간염 바이러스 캡시드 또는 D형 간염 바이러스 캡시드 또는 코로나바이러스 융합 단백질일 수 있다.
본 발명의 일부 실시예에서, VLP에 의해 제공되는 재조합 핵산 분자는 관심 단백질을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자이다. 본 명세서에 제공된 바와 같이, 관심 단백질은 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 디프테리아 독소 A(또는 이의 단편) 또는 이들의 조합이다. 본 명세서에 제공된 바와 같이, 관심 단백질을 암호화하는 서열은 제1 및 제2 바이러스 전사 인식 신호에 의해 플랭킹될 수 있고, 제1 바이러스 전사 인식 신호의 상류(5')에 제1 프로모터 및 관심 단백질(예: 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 또는 이들의 조합)을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자의 5'에 인접한 제2 프로모터를 추가로 포함한다. 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 또는 이들의 조합의 비제한적 예가 본 명세서에 제공된다.
본 발명의 일부 실시예에서, 제1 및 제2 표적 바이러스 전사 인식 신호가 플랭크된(flanked), 관심 단백질(예: 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 또는 이들의 조합)을 암호화하는, 본 명세서에 제공된 것(예: 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자)과 같은 재조합 핵산 분자를 포함하고, 제1 바이러스 전사 인식 신호의 상류(5')에 있는 제1 프로모터 및 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 또는 이들의 조합을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자의 5'에 인접한 제2 프로모터를 추가로 포함하는 복제 불능 바이러스-유사 입자(VLP)가 제공되고, 상기 VLP는 표적 바이러스에 감염된 세포에 대한 친화성을 나타낸다. 친화성은, VLP의 표면에서 발현되는 바이러스 단백질의 발현에 의해 제어될 뿐만 아니라, 재조합 핵산 분자에 의해 암호화되는 바이러스 전사 인식 신호 서열의 공급원에 의한 핵산 분자의 발현을 제어할 수 있다.
본 명세서에 제공된 바와 같이, 일부 실시예에서, 음성 가닥 핵산 분자는 음성 센스 RNA, 음성 센스 DNA, 비-코딩, 음성 센스 RNA, 또는 pgRNA를 발현하는 단일 또는 이중 가닥 DNA, 또는 이들의 임의의 조합이다.
본 발명의 일부 실시예에서, 복제 불능 바이러스-유사 입자는 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 또는 이들의 조합을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자의 하류(3')에 폴리 A 꼬리 서열을 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 실시예에서, 복제 불능 바이러스-유사 입자는 프로모터(예를 들어, 제1 프로모터 및 제2 프로모터)를 포함한다. 이러한 프로모터의 비제한적인 예가 본 명세서에 제공된다.
[0095] 본 명세서에 기재된 바와 같은 전체 설계 및 재조합 핵산 구조물 및 복제 불능 바이러스-유사 입자는 볼티모어 그룹 IV, V, VI, 및 VII로부터의 바이러스를 포함하도록 적응될 수 있다. 그룹 IV-VII 바이러스 중 하나를 표적화하기 위해, HBV 예에 대해 설명된 바와 같이, 예를 들어 입실론 인식 신호 서열(SEQ ID NO:1)을 대체하는, 특정 바이러스 폴리머라제 인식 신호가 사용된다. 볼티모어 그룹은 다음과 같이 설명된다:
[0096] 볼티모어 그룹 IV 바이러스: 피코르나바이러스(A형 간염 바이러스, 엔테로바이러스, 라이노바이러스, 폴리오바이러스, 및 구제역바이러스와 같은 잘-알려진 바이러스를 포함하는 바이러스 패밀리임), SARS 바이러스, C형 간염 바이러스, 황열 바이러스, 및 풍진 바이러스를 포함하는 양성-센스 단일 가닥 RNA 게놈을 보유한다. 이 그룹에는 뎅기열 바이러스, C형 간염 바이러스, 황열 바이러스, 및 지카 바이러스와 같은 플라비바이러스뿐만 아니라 코로나바이러스, 헤페바이러스(E형 간염)도 포함된다.
[0097] 볼티모어 그룹 V 바이러스: 단일 가닥 RNA 바이러스; 음성 센스(예: 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviruses), 라브도바이러스(Rhabdoviruses)).
[0098] 볼티모어 그룹 VI 바이러스: DNA 중간체를 통해 복제되는 양성-센스 단일 가닥 RNA 바이러스(예: 레트로바이러스).
[0099] 볼티모어 그룹 VII 바이러스: 단일-가닥 RNA 중간체를 통해 복제하는 이중-가닥 DNA 바이러스.
[0100] NSV 수명 주기 및 복제
[0101] 음성-가닥 RNA 바이러스(NSV, 또는 볼티모어 그룹 V 바이러스)는 21개의 별개의 패밀리로 분류될 수 있다. 비분절 게놈(nonsegmented genome)으로 구성된 패밀리에는 Rhabdo-, Paramyxo-, Filo-, 및 Borna-가 포함된다. Orthomyxo-, Bunya-, Arenaviridae-는 각각 6~8개, 3개, 또는 2개의 음성-센스 RNA 세그먼트의 게놈을 함유한다(Palese, P., et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11354-11358, 1996; and Boritz, Eli et al. Journal of Virology. 73 (8): 6937-6945, 1999 참조).
[0102] 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 파라인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르크 바이러스와 같은 많은 매우 일반적인 인간 병원체가 NSV 내에 포함된다. NSV의 수명 주기에는 여러 단계가 있다. 바이러스는 먼저 바이러스 표면 당단백질을 통해 숙주 세포 수용체에 결합함으로써 숙주 세포를 감염시킨다. 산성 환경에서 당단백질 바이러스 막과 숙주 세포의 원형질막이 융합되면 바이러스 리보핵단백질(RNP) 복합체가 세포질 내로 방출된다. 대부분의 NSV는 감염된 세포의 세포질에서 복제한다. 새로 합성된 RNP 복합체는 원형질막 또는 골지체의 막에서 바이러스 구조 단백질과 조립된다. 이는 모두 새로 합성된 바이러스의 방출로 이어진다.
[0103] 비분절 NSV의 복제 및 전사와 관련하여, 이들 NSV의 유전자는 3개의 조절 영역, 즉 유전자 말단 신호, 유전자 간 영역, 및 유전자 시작 신호로 구성된다. 유전자 말단 신호의 한 예는 수포성 구내염 바이러스(VSV)라고 하는 특정 바이러스에 매우 보존적인 유전자 말단 신호가 함유되어 있다. 유전자 간 영역은 매우 가변적이고 보존된 디뉴클레오티드, 트리뉴클레오티드, 또는 최대 143개의 뉴클레오티드 영역으로 구성된다. 유전자 간 영역의 다양한 길이는 전사 감쇠와 상관관계가 있지만, 다양한 유전자 간 영역은 유전자 발현을 변경하지 않는다. 유전자 시작 신호는 처음 세 개의 뉴클레오티드가 유전자 발현에 중요하기 때문에 매우 특이적이다.
[0104] 헤파드나비리대 과의 구성원인 B형 간염 바이러스(HBV)는 레트로바이러스와 유사한 특이한 특징을 가진 작은 DNA 바이러스이다. HBV는 RNA 중간체를 통해 복제되고 숙주 게놈 내에 통합될 수 있다. HBV 복제 주기의 독특한 특징은 감염된 세포에서 바이러스가 지속되는 독특한 능력을 부여한다. 다양한 형태의 HBV-관련 질병 진단 및 만성 B형 간염 감염 치료를 위한 바이러스 및 혈청학적 분석이 개발되었다. HBV 감염은 급성(전격성 간 부전 포함)에서 만성 간염, 간경변, 및 간세포 암종에 이르는 광범위한 간 질환을 유발한다. 급성 HBV 감염은 무증상이거나 증상이 있는 급성 간염과 함께 존재할 수 있다. 바이러스에 감염된 대부분의 성인은 회복되지만, 5~10%는 바이러스를 제거하지 못하고 만성적으로 감염된다. 많은 만성 감염자는 장기간의 질병률이나 사망률이 거의 또는 전혀 없는 경증의 간 질환을 갖고 있다. 만성 HBV 감염이 있는 다른 개체는, 간경변 및 간암으로 진행될 수 있는, 활동성 질환을 발병한다. 또한, 일부 개체는 HBV 외에 A형 간염(HAV), C형 간염(HCV), D형 간염(HDV), 또는 E형 간염(HEV)과 같은 다른 간염 바이러스에 감염된다. 따라서, HBV를 치료하면 이러한 동시-감염, 특히 복제를 위해 HBV가 필요한, HDV를 약화시키는 데 도움이 된다. HBV를 치료하면 발암성 이상과 간경변의 가능성도 줄어든다.
[0105] 본 발명이 보다 쉽게 이해될 수 있도록, 특정 기술 및 과학 용어는 아래에서 구체적으로 정의된다. 본 명세서의 다른 곳에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 다른 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다.
[0106] 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 그리고 달리 명시하지 않는 한, 용어 "약(about)"은 그것이 수식하는 값의 ± 5%를 의미하도록 의도된다. 따라서, 약 100은 95에서 105를 의미한다. 또한, 용어 "약(about)"은 "약 1, 2, 3, 4, 또는 5"와 같은 일련의 용어에서 용어를 수식하고, 용어 "약"은 "약 1, 2, 3, 4, 또는 5"가 "약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 또는 약 5"를 의미하는 것으로 이해될 수 있도록 목록의 각 구성원을 수식함을 이해해야 한다. "적어도(at least)" 또는 "보다 작은(less than)", "보다 큰(greater than)" 등과 같은(이에 국한되지 않음) 다른 수량화 수식어에 의해 수식된 목록에 대해서도 마찬가지이다.
[0107] 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나의(a)", "하나의(an)", 및 "상기(the)"는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다.
[0108] 본 명세서에 사용된 용어 "포함하다(comprise)", "갖다(have)", "갖다(has)", 및 "포함하다(include)" 및 본 명세서에 사용된 이들의 활용형은 "포함하지만 이에 제한되지 않는(including but not limited to)"을 의미한다. 다양한 조성물 및 방법이 다양한 구성요소 또는 단계를 "포함하는(comprising)"이라는 용어로 설명되지만("포함하지만 이에 제한되지 않는(including, but not limited to)" 의미로 해석됨), 조성물, 방법, 및 장치는 또한 다양한 구성 요소 및 단계로 "본질적으로 구성(consist essentially of)"되거나 "구성(consist of)"될 수 있고 이러한 용어는 본질적으로 폐쇄된-구성원 그룹을 정의하는 것으로 해석되어야 한다.
[0109] 본 명세서에 기재된 재조합 변이체를 시험하는데 사용된 예시적인 구조물의 벡터 지도는 도 1a, 도 1b, 도 2a, 도 3a, 도 4a, 도 5a, 도 6a, 도 7, 및 도 8에 도시되어 있다. 이러한 구조물을 시험한 결과는 도 2b, 도 3b, 도 4b, 도 4c, 도 5b, 도 6b, 및 도 6c에 도시되어 있다. 이들 구조물에 유용한 예시적인 서열은 SEQ ID NOs:1-9에 제공된다. 이들은 비제한적인 예이고 치료할 관심 바이러스에 따라 수정되거나 조정될 수 있다.
[0110] 용어 “공동-투여" 등은 단일 환자에 대한 선택된 치료제의 투여를 포함하는 것을 의미하고, 제제가 동일하거나 상이한 투여 경로에 의해 또는 동일하거나 상이한 투여 시점에 투여되는 치료 요법을 포함하도록 의도된다.
[0111] 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “작용제(agonist)”는, 그 존재가 단백질에 대한 자연 발생 리간드의 존재로부터 야기되는 생물학적 활성과 동일한 단백질의 생물학적 활성을 초래하는 화합물을 지칭한다.
[0112] 본 명세서에 사용된 용어 "부분 작용제(partial agonist)“는, 그 존재가 단백질에 대한 자연 발생 리간드의 존재로 인한 것과 동일한 유형이지만, 더 낮은 규모인 단백질의 생물학적 활성을 초래하는 화합물을 지칭한다.
[0113] 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 “길항제(antagonist)”는, 그 존재가 단백질의 생물학적 활성의 크기를 감소시키는 화합물을 지칭한다. 특정 실시예에서, 길항제의 존재는 단백질의 생물학적 활성의 완전한 억제를 초래한다. 특정 실시예에서, 길항제는 억제제이다.
[0114] 치료 조성물(예: 재조합 핵산 구조물 및 복제 불능 바이러스-유사 입자 및 이러한 생성물을 포함하는 조성물)과 함께 사용되는 경우 “투여하는(Administering)”은 치료제를 표적 조직 내로 또는 표적 조직 상에 직접 투여하거나 치료제를 환자에게 투여함으로써 치료제가 표적 조직에 긍정적으로 영향을 미치는 것을 의미한다.
[0115] 본 명세서에 사용된 용어 “대상체(subject)” 또는 “환자(patient)”는 인간 및 야생, 가축, 및 농장 동물과 같은 인간이 아닌 척추동물을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시예에서, 본 명세서에 기재된 대상체 또는 환자는 동물이다. 특정 실시예에서, 대상체 또는 환자는 포유동물이다. 특정 실시예에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시예에서, 대상체 또는 환자는 비인간 동물이다. 특정 실시예에서, 대상체 또는 환자는 비인간 포유동물이다. 특정 실시예에서, 대상체 또는 환자는 개, 고양이, 소, 돼지, 말, 양, 또는 염소와 같은 가축이다. 특정 실시예에서, 대상체 또는 환자는 개 또는 고양이와 같은 반려 동물이다. 특정 실시예에서, 대상체 또는 환자는 소, 돼지, 말, 양, 또는 염소와 같은 가축 동물이다. 특정 실시예에서, 대상체 또는 환자는 동물원 동물이다. 또 다른 실시예에서, 대상체 또는 환자는 설치류, 개, 또는 인간이 아닌 영장류와 같은 연구 동물이다. 특정 실시예에서, 대상체 또는 환자는 형질전환 쥐 또는 형질전환 돼지와 같은 비인간 형질전환 동물이다.
[0116] 용어 “억제하다(inhibit)”는 증상의 발병을 예방하거나, 증상을 경감시키거나, 질병, 질환, 또는 장애를 제거하기 위해 본 명세서의 실시예의 치료제를 투여하는 것을 포함한다.
[0117] “약학적으로 허용되는(pharmaceutically acceptable)“은 담체, 희석제, 또는 부형제가 치료제의 다른 성분과 상용성이고 이의 수용체에게 유해하지 않아야 함을 의미한다.
[0118] 본 명세서에 사용된 용어 “치료하다(treat)”, “치료된(treated)“, 또는 “치료하는(treating)”은 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭하고, 여기서 목적은 바람직하지 않은 생리학적 질환, 장애, 또는 질병을 억제, 예방, 또는 지연(경감)시키거나, 유익하거나 원하는 임상 결과를 개선, 억제, 또는 획득하기 위한 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상 결과에는, 증상의 개선 또는 완화; 질환, 장애, 또는 질병의 정도 감소; 질환, 장애, 또는 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음); 질환, 장애, 또는 질병의 발병 지연 또는 진행 지연; 질환, 장애, 또는 질병 상태의 개선; 및 차도(부분적이든 전체적이든)(검출 가능 여부 불문), 또는 질환, 장애, 또는 질병의 향상 또는 개선이 포함된다. 치료에는 과도한 수준의 부작용 없이 임상적으로 유의한 반응을 유도하는 것이 포함된다. 치료에는 치료를 받지 않는 경우의 예상 생존 기간과 비교하여 생존 기간이 연장되는 것도 포함된다.
[0119] 본 명세서에 사용된 용어 “항체(antibody)”는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 무손상 면역글로불린일 수 있고 무손상 면역글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. 항체는 예를 들어 다클론 항체, 단일클론 항체, Fv, Fab, 및 F(ab)2, 뿐만 아니라 단일 사슬 항체 및 인간화 항체를 비롯한 다양한 형태로 존재할 수 있다.
[0120] 용어 "항체 단편(antibody fragment)“은 무손상 항체의 일부를 의미하고 무손상 항체의 항원 결정 가변 영역을 의미한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[0121] 본 명세서에 사용된 용어 “항원(antigen)”은 면역 반응을 유발하는 분자로 정의된다. 이 면역 반응은 항체 생산 또는 특정 면역학적으로-적합한 세포의 활성화 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 숙련된 기술자는 사실상 모든 단백질 또는 펩티드를 포함하는 모든 거대분자가 항원으로 작용할 수 있음을 이해할 것이다. 더욱이, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 당업자는 면역 반응을 유발하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 그 용어가 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "항원"을 암호화하는 것으로 이해할 것이다. 또한, 당업자는 항원이 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 암호화될 필요는 없다는 것을 이해할 것이다. 실시예가 하나 이상의 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열의 사용을 포함하지만 이에 제한되지 않는 것과 이러한 뉴클레오티드 서열이 원하는 면역 반응을 유도하기 위해 다양한 조합으로 배열된다는 것이 명백하다. 더욱이, 숙련된 기술자는 항원이 "유전자"에 의해 암호화될 필요가 전혀 없다는 것을 이해할 것이다. 항원이 합성될 수 있거나 생물학적 시료로부터 유래될 수 있다는 것은 명백하다. 이러한 생물학적 시료는 조직 시료, 바이러스, 세포, 또는 생물학적 유체를 함유하는 것으로 의심되는 조직 시료를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
[0122] 본 명세서에 사용된 용어 “항원(antigen)”은 면역 반응을 유발하는 분자로 정의된다. 이 면역 반응은 항체 생산 또는 특정 면역학적으로-적합한 세포의 활성화 또는 둘 다를 포함할 수 있다.
[0123] 본 명세서에 사용된 용어 “생체 외(ex vivo)“는 신체 “외부(outside)”를 의미한다.
[0124] “질병(disease)”은 개체의 항상성을 유지할 수 없는 개체의 건강 상태이고, 질병이 개선되지 않으면 동물의 건강이 계속 악화된다. 대조적으로, 대상체의 “장애(disorder)”는 대상체가 항상성을 유지할 수 있지만, 대상의 건강 상태가 장애가 없을 때보다 덜 양호한 건강 상태이다. 치료하지 않고 방치하는 경우, 장애가 반드시 대상체의 건강 상태를 추가로 감소시키는 것은 아니다.
[0125] 본 명세서에 사용된 “유효량(effective amount)”은 치료적 또는 예방적 이점을 제공하는 양을 의미한다.
[0126] “암호화(Encoding)”는 정의된 뉴클레오티드 서열(즉, rRNA, tRNA, 및 mRNA) 또는 정의된 아미노산 서열 및 그로부터 생성되는 생물학적 특성을 갖는 생물학적 공정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 역할을 하는 유전자, cDNA, 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드의 특정 뉴클레오티드 서열의 고유한 특성을 의미한다. 따라서, 해당 유전자에 해당하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우, 유전자는 단백질을 암호화한다. 두 코딩 가닥 모두, 그 서열이 mRNA 서열과 동일하고 서열 목록에 일반적으로 제공되고, 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-코딩 가닥은 해당 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 기타 생성물을 암호화하는 것으로 언급될 수 있다.
[0127] 본 명세서에서 사용된 “내인성(endogenous)”은 유기체, 세포, 조직, 또는 계로부터 유래하거나 내부에서 생성된 임의의 물질을 의미한다.
[0128] 본 명세서에 사용된 용어 “외인성(exogenous)”은 유기체, 세포, 조직, 또는 계로부터 도입되거나 외부에서 생성된 임의의 물질을 의미한다.
[0129] 본 명세서에 사용된 용어 “발현(expression)”은 그의 프로모터에 의해 구동되는 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로 정의된다.
[0130] “발현 벡터(Expression vector)“는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 의미한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스(cis)-작용 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 시험관 내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 코스미드, 플라스미드(예: 리포솜에 노출되거나 함유됨) 및 바이러스(예: 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-연관 바이러스)와 같은 당업계에 알려진 모든 것을 포함한다.
[0131] “상동성(Homologous)”은 2개의 폴리펩티드 사이 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성 또는 서열 동일성을 의미한다. 2개의 비교된 서열 모두의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유될 때, 예를 들어 2개의 DNA 분자 각각의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 상동성이다. 두 서열 사이의 상동성 백분율은 두 서열이 공유하는 일치 또는 상동 위치의 수를 비교한 위치 수로 나눈 함수 X 100이다. 두 서열의 10개 위치 중 6개가 일치하거나 상동이면 두 서열은 60% 상동이다. 예를 들어, DNA 서열 ATTGCC 및 TATGGC는 50% 상동성을 공유한다. 일반적으로, 두 서열이 최대 상동성을 제공하도록 정렬될 때 비교가 이루어진다.
[0132] 본 발명의 일부 실시예에서, 단백질은 본 명세서에 제공된 서열과 적어도 또는 약 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% 상동성이다. "보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)“은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이러한 패밀리에는 염기성 측쇄(예: 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예: 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄(예: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예: 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄(예: 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)가 있는 아미노산이 포함된다.
[0133] 본 명세서에 사용된 용어 “면역글로불린(immunoglobulin)” 또는 "Ig"는 항체로서 기능하는 단백질 부류로 정의된다. B 세포에 의해 발현되는 항체는 때때로 BCR(B 세포 수용체) 또는 항원 수용체로 지칭된다. 이 부류의 단백질에 포함된 5가지 구성원은 IgA, IgG, IgM, IgD, 및 IgE이다.
[0134] “단리된(Isolated)”은 자연 상태에서 변경되거나 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리"되지 않지만, 자연 상태의 공존 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드는 "단리"된다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들어 숙주 세포와 같은 비-천연 환경에 존재할 수 있다. "단리된" 생물학적 구성요소(예: 핵산, 단백질, 또는 세포)는 다른 생물학적 구성요소(예: 세포 파편, 기타 단백질, 핵산, 또는 세포 유형)로부터 실질적으로 분리되거나 정제되었다. "단리된" 생물학적 성분에는 표준 정제 방법으로 정제된 성분이 포함된다.
[0135] 질병 예방, 치료, 또는 개선: 질병 “예방(Preventing)”은 질병의 완전한 발달을 억제하는 것을 의미한다. “치료(Treating)”는 발병하기 시작한 질병 또는 병리학적 질환의 징후 또는 증상을 개선하는 치료적 개입을 의미한다. “개선(Ameliorating)”은 질병의 징후 또는 증상의 수 또는 중증도의 감소를 의미한다.
[0136] 본 명세서에 사용된 바와 같이, 재조합체는 일반적으로 다음을 의미한다: 재조합 핵산 또는 단백질은 자연적으로 발생하지 않는 서열을 갖거나 그렇지 않으면 분리된 2개의 서열 세그먼트의 인공 조합에 의해 만들어진 서열을 갖는 것이다. 이 인공적인 조합은 종종 화학적 합성 또는 유전 공학 기술과 같은 단리된 핵산 세그먼트의 인공 조작에 의해 수행된다.
[0137] 본 명세서에 사용된 바와 같이, 일반적으로 발생하는 핵산 염기에 대해 하기 약어가 사용된다. "A"는 아데노신, "C"는 시토신, "G"는 구아노신, "T"는 티미딘, 그리고 "U"는 우리딘을 나타낸다.
[0138] 본 명세서에 사용된 용어 “백혈구(leukocytes)” 또는 “백혈구(white blood cell)”는 단핵구, 호중구, 호산구, 호염기구, 및 림프구를 포함하는 임의의 면역 세포를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “림프구(lymphocytes)”는 림프에서 흔히 발견되는 세포를 의미하고, 자연살해세포(NK 세포), T-세포, 및 B-세포를 포함한다. 상기 열거된 면역 세포 유형이 추가 서브세트로 분할될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
[0139] 본 명세서에 사용된 용어 "종양 침윤성 백혈구(tumor infiltrating leukocytes)“는 고형 종양에 존재하는 백혈구를 의미한다.
[0140] 본 명세서에 사용된 용어 "혈액 시료(blood sample)“는 혈장, 혈액으로부터 단리된 혈구 등과 같이 혈액으로부터 제조된 임의의 시료를 의미한다.
[0141] 본 명세서에 사용된 용어 "정제된 시료(purified sample)“는 하나 이상의 세포 서브세트가 농축된 임의의 시료를 의미한다. 시료는 크기, 단백질 발현 등과 같은 특성을 기반으로 하는 세포의 제거 또는 단리에 의해 정제될 수 있다.
[0142] 약학적으로 허용되는 비히클: 본 명세서에서 유용한 약학적으로 허용되는 담체(비히클)는 통상적이다. E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 15th Edition (1975)의 Remington's Pharmaceutical Sciences는 하나 이상의 치료 조성물 및 추가 약제의 약제 전달에 적합한 조성물 및 제형을 설명한다.
[0143] 일반적으로, 전달에 적합한 담체 또는 비히클의 성질은 사용되는 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 비경구 제형은 일반적으로 비히클로서 물, 생리 식염수, 균형 염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 등과 같은 약학적으로 및 생리학적으로 허용되는 유체를 포함하는 주사 가능한 유체를 포함한다. 고체 조성물(예를 들어, 분말, 알약, 정제, 또는 캡슐 형태)의 경우, 통상적인 무독성 고체 담체는 예를 들어 약학 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 또는 마그네슘 스테아레이트를 포함할 수 있다. 생물학적으로 중성인 담체에 더하여, 투여될 약학 조성물은 습윤제 또는 유화제, 방부제, 및 pH 완충제 등과 같은 무독성 보조 물질, 예를 들어 아세트산나트륨 또는 소르비탄 모노라우레이트를 소량 함유할 수 있다.
[0144] 본 발명의 일부 실시예에서, 조성물은, 용액, 현탁액, 또는 기타 유사한 형태이든지 간에: DMSO, 멸균 희석제, 예를 들어 주사용수, 식염수, 바람직하게는 생리 식염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 용매 또는 현탁 매질로 작용할 수 있는 합성 모노 또는 디글리세리드와 같은 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 기타 용매; 벤질알코올 또는 메틸파라벤 등의 항균제; 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트, 또는 포스페이트와 같은 완충제 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 긴장성 조절제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
[0145] 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법이 치료할 수 있는 질병은 바이러스 감염과 같은 미생물 감염을 포함한다.
[0146] “바이러스 감염(viral infection)“은 신체에 바이러스가 존재하여 발생하는 감염을 의미한다. 바이러스 감염은 만성 또는 지속성 바이러스 감염을 포함하고, 이는 치명적인 것으로 판명되기 전에 숙주를 감염시키고 장기간(보통 몇 주, 몇 달, 또는 몇 년)에 걸쳐 숙주의 세포 내에서 번식할 수 있는 바이러스 감염이다.
[0147] 만성 감염을 일으키는 바이러스에는 예를 들어 인유두종 바이러스(HPV), 단순 헤르페스, 및 기타 헤르페스 바이러스, B형 및 C형 간염 바이러스, 및 기타 간염 바이러스, 인간 면역결핍증 바이러스, 및 홍역 바이러스가 포함되고, 이들 모두 중요한 임상 질환을 일으킬 수 있다. 장기간의 감염은 궁극적으로, 예를 들어 C형 간염 바이러스 간암의 경우, 환자에게 치명적일 수 있는 질병의 유도로 이어질 수 있다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 다른 만성 바이러스 감염은 본 명세서에 기재된 바와 같은 불활성 재조합 뉴클레오티드 벡터/VLP를 전사하기 위한 활성화 효소로서 사용될 수 있는 바이러스-특이적 폴리머라제를 이용하는 임의의 그룹 V-VII 바이러스를 포함한다.
[0148] 본 발명의 특정 실시예에서, 재조합 핵산 구조물 및 복제 불능 바이러스-유사 입자, 또는 이러한 구조물/입자를 포함하는 조성물은 항미생물제, 항바이러스제, 및/또는 기타 치료제와 동시에 투여될 수 있다. 대안적으로, 구조물/입자 또는 이러한 구조물/입자를 포함하는 조성물은 항미생물제, 항바이러스제, 및 기타 치료제가 투여되는 시간보다 앞서 선택된 시간에 투여될 수 있다.
[0149] 항바이러스제에는 리토나비르, 아시클로비르, 시도포비르, 간시클로비르, 포스카르넷, 지도부딘, 리바비린, 및 히드록시클로로퀸이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
[0150] 항바이러스제에는 다음과 같은 HIV 치료가 포함되고 이에 제한되지 않는다:
[0151] 소분자 HIV 융합 또는 진입 억제제는: bevirimat(DSB;PA-457); Vicriviroc, Maraviroc(케모카인 수용체 길항제" 또는 "CCR5 억제제"), T-20(enfuvirtide, Fuzeon, Roche 및 Trimeris에 의해 개발됨), TRI-1144, 및 TRI-999(Qian, K et al, Med Res Rev. 2009 Mar; 29(2):369?393, and Haggani and Tilton, Antiviral Res. 2013 May; 98(2):158-70 참조)를 포함한다. 유사하게, 항-HIV mAb의 예에는 CCR5 및 CD4에 대한 것들이 포함되고, 구체적으로: Ibalizumab(상표명 Trogarzo)는 CD4에 결합하는 비면역억제성 인간화 단일클론 항체이고; PRO 140은 CCR5를 표적으로 하는 인간화 단일클론항체이다.
[0152] 조합 치료를 위한 항바이러스제는: HBV 폴리머라제 억제제, 인터페론, TLR-7 작용제 또는 TLR-9 작용제와 같은 TLR 조절제, 치료 백신, 특정 세포 바이러스 RNA 센서의 면역 활성화제, 바이러스 진입 억제제, 바이러스 성숙 억제제, 별개의 캡시드 어셈블리 조절제, 별개의 또는 알려지지 않은 메커니즘의 항바이러스 화합물 중 어느 하나 또는 조합을 포함할 수 있다.
[0153] 항바이러스제는: 3TC, FTC, L-FMAU, 인터페론, 아데포비르 디피복실, 엔테카비르, 텔비부딘(L-dT), 발토르시타빈(3'-발리닐 L-dC), .베타.-D- 디옥솔라닐-구아닌(DXG), .베타.-D-디옥솔라닐-2,6-디아미노퓨린(DAPD), .베타.-D-디옥솔라닐-6-클로로퓨린(ACP), 팜시클로비르, 펜시클로비르, 로부카비르, 간시클로비르, 리바비린, 테노포비르, 빅테그라비르, 엠트리시타빈, 빅타비, 및 이들의 조합 중 어느 하나 또는 조합일 수도 있다.
[0154] 본 발명의 일부 실시예에서, "치료학적 유효량(therapeutically effective amount)“은, 본 발명의 재조합 핵산 구조물 및 복제 불능 바이러스-유사 입자, 또는 이러한 구조물/입자를 포함하는 조성물이 투여되지 않은 동물 또는 동물 그룹(예: 2, 3, 5, 10, 또는 그 이상의 동물)의 바이러스 역가 또는 미생물 역가에 비해, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 재조합 핵산 구조물 및 복제 불능 바이러스-유사 입자, 또는 이러한 구조물/입자를 포함하고 본 명세서에 기재된 관련 방법으로 치료되는 조성물을 투여받은 대상체/환자/동물에서 바이러스 역가를 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 25%, 적어도 35%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99% 감소시키는, 재조합 핵산 구조물 및 복제 불능 바이러스-유사 입자, 또는 이러한 구조물/입자를 포함하는 조성물의 양이다.
바이러스 벡터-매개 전달 방법의 예
[0155] 본 발명의 특정 실시예에서, 재조합 핵산 구조물은 세포로의 유전자 전달을 매개하기 위해 바이러스 유사 입자(자기-복제 능력에 결함이 있음)에 통합된다. 일반적으로, 바이러스는 생리학적 조건에서 적절한 숙주 세포에 단순히 노출되어, 바이러스를 흡수할 수 있다(미국 특허 제9,089,520호 참조). 본 발명의 방법은 하기 논의되는 바와 같이 원하는 세포 표적에 재조합 구조물을 전달하기 위해 다양한 바이러스 벡터 또는 바이러스-유사 입자를 활용하도록 조정될 수 있고, 불능하거나 비-복제 VLP가 되도록 최적화된 아데노바이러스 벡터 시스템을 포함한다.
1. 아데노바이러스(Adenovirus)
[0156] 아데노바이러스는 중간-크기의 DNA 게놈, 조작 용이성, 높은 역가, 넓은 표적-세포 범위, 및 높은 감염성으로 인해 유전자 전달 벡터로 사용하기에 특히 적합하다. 대략 36kb 바이러스 게놈은 100-200개의 염기 쌍(bp) 역 말단 반복부(ITR)로 둘러싸여 있고, 여기에는 바이러스 DNA 복제 및 패키징에 필요한 시스-작용 요소가 함유되어 있다. 다른 전사 단위를 함유하는 게놈의 초기(E) 및 후기(L) 영역은 바이러스 DNA 복제의 시작에 따라 구분된다.
[0157] E1 영역(E1A 및 E1B)은 바이러스 게놈 및 몇몇 세포 유전자의 전사 조절을 담당하는 단백질을 암호화한다. E2 영역(E2A 및 E2B)의 발현은 바이러스 DNA 복제를 위한 단백질 합성을 초래한다. 이들 단백질은 DNA 복제, 늦은 유전자 발현, 및 숙주 세포 차단에 관여한다(Renan, M. J. (1990) Radiother Oncol., 19, 197-218). 대부분의 바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 후기 유전자(L1, L2, L3, L4, 및 L5)의 산물은 주요 후기 프로모터(MLP)에 의해 유래된 단일 1차 전사체의 상당한 치료 후에만 발현된다. MLP(16.8 지도 단위에 위치)는 감염 후기 단계에서 특히 효율적이고, 이 프로모터에서 유래된 모든 mRNA는 5' TL(tripartite leader) 서열을 갖고 있어, 번역에 유용하다.
[0158] 특정 경우에, DNA의 큰 부분이 포함될 수 있도록 AAV의 운반 능력을 최대화하는 것이 도움이 된다. 또한 특정 아데노바이러스 제품과 관련된 독성 및 면역 반응을 줄이는 것이 매우 바람직하다. 두 가지 목표는 어느 정도는 아데노바이러스 유전자의 제거가 양쪽 목적에 기여한다는 점에서 동일하다.
[0159] 바이러스 DNA 복제에 필요한 시스 요소가 모두 선형 바이러스 게놈의 양쪽 끝에 있는 역 말단 반복부(ITR)(100-200bp)에 국한되어 있기 때문에 DNA의 큰 변위가 가능하다. ITR을 함유하는 플라스미드는 결함이 없는 아데노바이러스의 존재하에 복제할 수 있다(Hay, R. T., et al., J Mol. Biol. 1984 Jun. 5; 175(4):493-510). 따라서, 아데노바이러스 벡터에서 이러한 요소를 삭제하면 독립적인 복제가 방지된다.
[0160] 또한, 바이러스 캡슐화를 위한 패키징 신호는 바이러스 게놈의 왼쪽 끝에 194-385bp(0.5-1.1 지도 단위) 사이에 위치한다(Hearing et al., J. (1987) Virol., 67, 2555-2558). 이 신호는, 왼쪽 말단에 가깝지만 응집성 말단 서열 외부에 있는 특정 서열이 머리 구조 내에 DNA를 삽입하는 데 필요한 단백질에 대한 결합을 매개하는, 박테리오파지 람다 DNA의 단백질 인식 부위를 모방한다. Ad의 E1 치환 벡터는 바이러스 게놈의 왼쪽 말단에 있는 450bp(0-1.25 지도 단위) 단편이 293개 세포에서 패키징을 지시할 수 있음을 입증하였다(Levrero et al., Gene, 101:195-202, 1991).
[0161] 이전에는, 아데노바이러스 게놈의 특정 영역이 포유동물 세포의 게놈 내에 통합될 수 있고 이에 의해 암호화되는 유전자가 발현될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이들 세포주는 세포주에 의해 암호화된 아데노바이러스 기능이 결핍된 아데노바이러스 벡터의 복제를 지속시킬 수 있다. 또한 “돕는(helping)” 벡터, 예를 들어 야생형 바이러스 또는 조건부 결함 돌연변이에 의한 복제 결핍 아데노바이러스 벡터의 보충에 대한 보고가 있었다.
[0162] 시험관 내에서 VLP/복제-결핍 아데노바이러스 벡터를 생성하기 위해, 이러한 결핍 벡터는, 트랜스로, 헬퍼 바이러스에 의해 보완될 수 있다. 그러나, 복제 기능을 제공하는 데 필요한, 헬퍼 바이러스의 존재는 모든 준비에 악영향을 줄 수 있기 때문에, 복제-결함 벡터의 단리를 허용하지 않는다. 따라서, 복제 및/또는 복제-결함 벡터의 패키징에 특이성을 추가하는 추가 요소가 필요하다. 그 요소는 아데노바이러스의 패키징 기능에서 파생된다.
[0163] 아데노바이러스에 대한 패키징 신호는 기존의 아데노바이러스 맵의 왼쪽 끝에 존재하는 것으로 나타났다(Tibbetts et. al. (1977) Cell, 12, 243-249). 나중 연구에 따르면 게놈의 E1A(194-358bp) 영역이 결실된 돌연변이는 초기(E1A) 기능을 보완하는 세포주에서도 제대로 성장하지 못하였다(Hearing and Shenk, (1983) J. Mol. Biol. 167, 809-822). 보상 아데노바이러스 DNA(0-353bp)가 돌연변이체의 우측 말단 내에 재조합되었을 때, 바이러스는 정상적으로 패키징되었다. 추가 돌연변이 분석은 Ad5 게놈의 왼쪽 끝에 있는 짧고, 반복적인, 위치-의존적 요소를 확인하였다. 반복의 한 모사는, 게놈의 양쪽 끝에 존재하는 경우 효율적인 패키징에 충분한 것으로 밝혀졌지만, Ad5 DNA 분자의 내부로 이동할 때는 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다(Hearing et al., J. (1987) Virol., 67, 2555-2558).
[0164] 패키징 신호의 돌연변이 버전을 사용하여, 다양한 효율성으로 패키징된 헬퍼 바이러스를 생성할 수 있다. 일반적으로, 돌연변이는 점 돌연변이 또는 결실이다. 저효율 패키징을 하는 헬퍼 바이러스가 헬퍼 세포에서 성장할 때, 바이러스는 비록 야생형 바이러스에 비해 감소된 비율이지만 패키징되어 헬퍼의 번식을 허용한다. 그러나 이러한 헬퍼 바이러스가 야생형 패키징 신호를 함유하는 바이러스와 함께 세포에서 성장하면, 돌연변이 버전보다 야생형 패키징 신호가 우선적으로 인식된다. 제한된 양의 패키징 인자를 감안할 때, 야생형 신호를 함유하는 바이러스는 헬퍼와 비교할 때 선택적으로 패키징된다. 선호도가 충분히 크면, 동질성에 가까운 저장(stock)이 달성될 수 있다.
[0165] 특정 조직 또는 종에 대한 ADV 구조물의 친화성을 개선하기 위해, 수용체-결합 섬유 서열은 종종 아데노바이러스 단리물 사이에서 대체될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 5에서 발견되는 콕사키-아데노바이러스 수용체(CAR) 리간드는 아데노바이러스 35의 CD46-결합 섬유 서열을 대체하여 인간 조혈 세포에 대한 결합 친화도가 크게 개선된 바이러스를 만들 수 있다. 그 결과 “위형(pseudotyped)” 바이러스인 Ad5f35가 임상적으로 개발된 여러 바이러스 단리주의 기초가 되었다. 더욱이, 표적 세포에 대한 바이러스의 재표적화를 허용하도록 섬유를 변형시키는 다양한 생화학적 방법이 존재한다. 방법에는 이작용성 항체(한 쪽 끝은 CAR 리간드에 결합하고 한 쪽 끝은 표적 서열에 결합)의 사용과 맞춤형 아비딘-기반 키메라 리간드와의 결합을 허용하는 섬유의 대사 비오틴화(biotinylation)가 포함된다. 대안적으로, 이종이작용성 링커(예: PEG-함유)에 의한 리간드(예: 항-CD205)를 아데노바이러스 입자에 부착할 수 있다.
2. 레트로바이러스(Retrovirus)
[0166] 레트로바이러스는 역전사 과정에 의해 감염된 세포에서 그들의 RNA를 이중-가닥 DNA로 전환시키는 능력을 특징으로 하는 단일-가닥 RNA 바이러스의 그룹이다(Coffin, (1990) In: Virology, ed., New York: 레이븐 프레스, pp. 1437-1500). 생성된 DNA는 프로바이러스로서 세포 염색체에 안정적으로 통합되고 바이러스 단백질의 합성을 지시한다. 통합은 수용체 세포와 그 후손에서 바이러스 유전자 서열을 유지하게 한다. 레트로바이러스 게놈에는 각각 캡시드 단백질, 폴리머라제 효소, 및 외피 성분을 코딩하는 3개의 유전자(gag, pol, 및 env)가 함유되어 있다. psi라고 하는 gag 유전자의 상류에서 발견되는 서열은 게놈을 비리온 내로 패키징하기 위한 신호 역할을 한다. 2개의 긴 말단 반복(LTR) 서열은 바이러스 게놈의 5' 및 3' 말단에 존재한다. 이들은 강력한 프로모터 및 인핸서 서열을 포함하고 숙주 세포 게놈에 통합하는 데에도 필요하다(Coffin, 1990).
[0167] 레트로바이러스 벡터를 구성하기 위해, 특정 바이러스 서열 대신에 프로모터를 암호화하는 핵산을 바이러스 게놈 내에 삽입하여 복제-결함 바이러스를 생성한다. 비리온을 생산하기 위해, gag, pol, 및 env 유전자를 함유하지만 LTR 및 psi 성분이 없는 패키징 세포주가 구성된다(Mann et al., (1983) Cell, 33, 153-159). 인간 cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드가 레트로바이러스 LTR 및 psi 서열과 함께 이 세포주에 도입될 때(예를 들어 인산칼슘 침전에 의해), psi 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자 내로 패키징되도록 하고, 이후 배양 배지 내로 분비된다(Nicolas, J. F., and Rubenstein, J. L. R., (1988) In: Vectors: a Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Rodriquez and Denhardt, Eds.). Nicolas and Rubenstein; Temin et al., (1986) In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188; Mann et al., 1983). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고, 선택적으로 농축하고, 유전자 전달에 사용한다. 레트로바이러스 벡터는 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 그러나, 많은 유형의 레트로바이러스의 통합 및 안정적인 발현은 숙주 세포의 분열을 필요로 한다(Paskind et al., (1975) Virology, 67, 242-248). 레트로바이러스 벡터의 특정 표적화를 허용하도록 설계된 접근법은 최근 바이러스 외피에 갈락토스 잔기의 화학적 첨가에 의한 레트로바이러스의 화학적 변형을 기반으로 개발되었다. 이 변형은 아시알로당단백질 수용체를 통한 간세포와 같은 세포의 특정 감염을 허용할 수 있고, 이는 바람직할 수 있다.
[0168] 레트로바이러스 외피 단백질 및 특정 세포 수용체에 대한 비오틴화된 항체가 사용되는 재조합 레트로바이러스의 표적화에 대한 다른 접근 방식이 설계되었다. 항체는 스트렙타비딘을 사용하여 비오틴 성분을 통해 결합되었다(Roux et al., (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86, 9079-9083). 주요 조직적합성 복합체 클래스 I 및 클래스 II 항원에 대한 항체를 사용하여, 그러한 표면 항원을 보유하는 다양한 인간 세포의 감염이 시험관 내 에코트로픽 바이러스로 입증되었다(Roux et al., 1989).
3. 아데노-연관 바이러스(Adeno-Associated Virus)
AAV는 약 4700개 염기 쌍의 선형 단일-가닥 DNA를 사용한다. 역 말단 반복은 게놈의 측면에 있다. 2개의 유전자가 게놈 내에 존재하여, 다수의 별개의 유전자 산물을 생성한다. 첫 번째, cap 유전자는, VP-1, VP-2, 및 VP-3으로 명명된 세 가지 다른 비리온 단백질(VP)을 생성한다. 두 번째, rep 유전자는, 4개의 비구조 단백질(NS)을 암호화한다. 이러한 rep 유전자 산물 중 하나 이상이 AAV 전사의 전사 활성화를 담당한다.
[0169] AAV에 있는 3개의 프로모터는 게놈에서 지도 단위의 위치에 따라 지정된다. 왼쪽에서 오른쪽으로, p5, p19, 및 p40이다. 전사는 6개의 전사체를 생성하고, 2개는 3개의 프로모터 각각에서 시작되고, 각 쌍 중 1개는 스플라이싱된다. 지도 단위 42-46에서 파생된 스플라이스 부위는 각 전사체에 대해 동일하다. 4개의 비구조 단백질은 명백하게 더 긴 전사체에서 유래하고, 3개의 비리온 단백질은 모두 가장 작은 전사체에서 유래한다.
[0170] AAV는 인간의 병리학적 상태와 관련이 없다. 흥미롭게도, AAV는 효율적인 복제를 위해 단순 헤르페스 바이러스 I 및 II, 거대 세포 바이러스, 유사 광견병 바이러스, 및 물론 아데노 바이러스와 같은 바이러스의 “도움(helping)” 기능이 필요하다. 헬퍼의 가장 특징적인 것은 아데노바이러스이고, 이 바이러스에 대한 많은 "초기(early)" 기능이 AAV 복제를 돕는 것으로 나타났다. AAV rep 단백질의 낮은-수준 발현은 AAV 구조적 발현을 억제하는 것으로 여겨지고, 헬퍼 바이러스 감염은 이 차단을 제거하는 것으로 간주된다.
[0171] AAV 벡터의 말단 반복부는 AAV 또는 변형된 AAV 게놈을 함유하는 플라스미드, 예컨대 p201의 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의해, 또는 AAV의 공개된 서열을 기반으로 하는 말단 반복부의 화학적 또는 효소적 합성을 포함하나 이에 제한되지 않는 다른 방법에 의해 수득될 수 있다(Samulski et al., J. Virol., 61:3096-3101 (1987))). 예를 들어, 기능, 즉 안정적이고 부위-특이적 통합을 허용하는 데 필요한 AAV ITR의 최소 서열 또는 일부를, 결실 분석에 의해, 결정할 수 있다. 또한 안정적이고 부위-특이적 통합을 지시하는 말단 반복의 능력을 유지하면서, 서열의 어떤 사소한 변형이 허용될 수 있는지 결정할 수 있다.
[0172] AAV-기반 벡터는 시험관 내 유전자 전달을 위한 안전하고 효과적인 비히클임이 입증되었고, 이러한 벡터는 생체 외 및 생체 내에서, 잠재적 유전자 요법의 광범위한 적용을 위해 전임상 및 임상 단계에서 개발 및 시험되고 있다(Carter and Flotte, (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci., 770; 79-90; Chatteijee, et al., (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci., 770, 79-90; Ferrari et al., (1996) J. Virol., 70, 3227-3234; Fisher et al., (1996) J. Virol., 70, 520-532; Flotte et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90, 10613-10617, (1993); Goodman et al. (1994), Blood, 84, 1492-1500; Kaplitt et al., (1994) Nat'l Genet., 8, 148-153; Kaplitt, M. G., et al., Ann Thorac Surg. 1996 December; 62(6):1669-76; Kessler et al., (1996) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 93, 14082-14087; Koeberl et al., (1997) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 94, 1426-1431; Mizukami et al., (1996) Virology, 217, 124-130).
[0173] 폐에서의 AAV-매개된 효율적인 유전자 전달 및 발현은 낭포성 섬유증의 치료를 위한 임상 시험으로 이어졌다(Carter and Flotte, 1995; Flotte et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 90, 10613-10617, (1993)). 유사하게, 골격근으로의 디스트로핀 유전자의 AAV-매개 유전자 전달에 의한 근이영양증의 치료, 뇌로의 티로신 히드록실라제 유전자 전달에 의한 파킨슨병의 치료, 간으로의 인자 IX 유전자 전달에 의한 혈우병 B, 그리고 잠재적으로 심장에 대한 혈관 내피 성장 인자 유전자에 의한 심근 경색의 치료에 대한 전망은, 이들 기관에서 AAV-매개 이식유전자 발현이 최근에 매우 효율적인 것으로 나타났기 때문에, 유망한 것으로 보인다(Fisher et al., (1996) J. Virol., 70, 520-532; Flotte et al., 1993; Kaplitt et al., 1994; 1996; Koeberl et al., 1997; McCown et al., (1996) Brain Res., 713, 99-107; Ping et al., (1996) Microcirculation, 3, 225-228; Xiao et al., (1996) J. Virol., 70, 8098-8108).
[0174] 간-유도 유전자 요법과 관련된 문제는 간세포의 효율적인 표적화, 벡터 게놈의 안정성, 및 지속적인 고수준 발현이다. 이러한 장애 중 많은 부분은 AAV(아데노-연관 바이러스) 유전자 전달 벡터로 극복할 수 있다. 생체 내 사용을 위해 개발된 최초의 AAV 유전자 전달 벡터는 AAV2 혈청형을 기반으로 하였다. AAV2는 광범위한 친화성을 갖고 생체 내에서 간세포를 비롯한 많은 세포 유형을 비교적 효율적으로 형질도입한다. 캡시드 단백질은 혈청학적 프로파일을 부여하고 적어도 12개의 영장류 AAV 혈청형이 이미 특성화되었다. 중요하게는, 다른 캡시드 단백질을 사용하여 재조합 AAV 벡터를 유사형으로 지정하면(pseudotyping) 친화성을 극적으로 변경할 수 있다. AAV8 및 AAV9는 모두 AAV2와 비교할 때 간세포에 대해 더 높은 친화성을 갖는다. 특히, AAV8은 AAV2와 비교할 때 3-4배 더 많은 간세포를 형질도입하고 형질도입된 세포당 3-4배 더 많은 게놈을 전달할 수 있다(Mark S. Sands, Methods Mol. Biol. 2011; 807: 141-157 참조). 투여량에 따라, AAV8은 내문(intraportal) 정맥 주사 후 쥐 간에서 간세포의 최대 90-95%를 형질도입할 수 있다. 흥미롭게도, 정맥 주사 후 유사한 수준의 형질도입이 달성될 수 있다. AAV 벡터의 직접적인 실질 내 주사는 또한 비교적 높은 수준의 장기간 발현을 매개한다. AAV8 캡시드 단백질과 함께 간-특이적 프로모터를 사용하여 추가 특이성을 부여할 수 있다. 1차 간세포 결함을 치료하는 것 외에도, 간의 고정 조직 대식세포인 쿠퍼 세포를 우회하고 간세포로의 발현을 제한함으로써 이식유전자 산물에 대한 면역 반응을 최소화할 수 있다. AAV 혈청형과 간-특이적 프로모터의 사용으로 간세포를 표적으로 삼는 능력은 새로운 치료 접근법을 시험할 수 있게 한다.
4. 렌티바이러스 벡터
[0175] 본 발명의 특정 실시예에서, 재조합 핵산 또는 복제 불능 VLP는, 전기천공에 의해, 또는 핵산, 단백질, 부위-특이적 뉴클레아제, 자가-복제 RNA 바이러스, 또는 통합-결핍 렌티바이러스 벡터(이러한 벡터에 대해서는 미국 특허 제10,131,876호 참조)의 형질감염에 의해, 표적 세포 내로 형질도입된다.
[0176] 본 발명의 특정 실시예에서, 형질도입은 렌티바이러스, 감마-, 알파-레트로바이러스 또는 아데노바이러스로 또는 핵산(DNA, mRNA, miRNA, 안타고미르, ODN), 단백질, 부위-특이적 뉴클레아제(징크 핑거 뉴클레아제, TALEN, CRISP/R), 자가-복제 RNA 바이러스(예: 말 뇌병증 바이러스) 또는 통합-결핍 렌티바이러스 벡터에 의한 전기천공 또는 형질감염으로 수행된다.
[0177] 본 발명의 추가 실시예에서, 재조합 핵산 또는 복제 불능 VLP의 전달은 상기 세포를 렌티바이러스 벡터로 형질도입함으로써 수행될 수 있다(Cockrell Adam S et al., "Gene delivery by lentivirus vectors", Molecular Biotechnology, vol. 36, No. 3, Jul. 2007 참조).
[0178] VSVG 슈도타입(VSVG pseudo type)을 갖는 렌티바이러스 벡터는 자동화된 제조 방법하에서 효율적인 형질도입을 가능하게 한다. 그러나, 본 방법은 모든 유형의 렌티바이러스 벡터(예: 홍역 바이러스(ML-LV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GALV), 고양이 내인성 레트로바이러스(RD114), 개코원숭이 내인성 레트로바이러스(BaEV) 유래 슈도타입화된 외피)의 사용에 전적으로 적합하다. 감마 또는 알파 레트로바이러스 벡터와 같은 다른 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 본 발명에 기재된 자동화 제조를 사용하여 필요할 때 형질도입 증강 시약을 첨가할 수 있다.
5. 기타 바이러스 벡터
[0179] 다른 바이러스 벡터가 본 발명의 방법 및 조성물에서 발현 구조물로서 사용될 수 있다. 백시니아 바이러스와 같은 바이러스 유래 벡터(Ridgeway, (1988) In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, pp. 467-492; Baichwal and Sugden, (1986) In, Gene Transfer, pp. 117-148; Coupar et al., Gene, 68:1-10, 1988) 카나리아두바이러스 및 헤르페스 바이러스가 사용된다. 이 바이러스는 다양한 포유동물 세포 내로의 유전자 전달에 사용하기 위한 몇 가지 기능을 제공한다.
질병 치료 방법
[0180] 본 발명의 방법은 또한 재조합 핵산, VLP 제품, 또는 약학 조성물의 투여가 다양한 유효량으로 전달될 수 있는 바이러스 질환 또는 상태의 치료 또는 예방 방법을 포함한다.
[0181] 접종물에 관한 "단위 용량(unit dose)"이라는 용어는 포유동물에 대한 단일 용량으로 적합한 물리적으로 별개의 단위를 의미하고, 각 단위는 필요한 희석제와 관련하여 원하는 면역원성 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 약학 조성물을 함유한다. 접종물의 단위 용량에 대한 사양은 약학 조성물의 고유한 특성 및 달성할 특정 면역학적 효과에 의해 지시되고 의존적이다.
[0182] 재조합 핵산, VLP 제품, 또는 이의 약학 조성물의 유효량은 바이러스에 감염된, 예를 들어 HBV, 코비드-19 등으로 감염된 세포의 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 97% 이상이 사멸되는 양일 것이다. 이 용어는 또한 "충분한 양(sufficient amount)"과 동의어이다.
[0183] 임의의 특정 적용을 위한 유효량은 치료되는 질병 또는 질환, 투여되는 특정 조성물, 대상체의 크기, 및/또는 질병 또는 질환의 중증도와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 과도한 실험을 필요로 하지 않고 본 명세서에 제시된 특정 조성물의 유효량을 경험적으로 결정할 수 있다.
[0184] 세포, 조직, 또는 유기체에 적용될 때 "접촉된(contacted)" 및 "노출된(exposed)"이라는 용어는 본 명세서에서 약학 조성물 및/또는 다른 약제, 예를 들어 항바이러스제가 표적 세포, 조직, 또는 유기체로 전달되거나 표적 세포, 조직, 또는 유기체와 직접 병치되는 과정을 설명하는 데 사용된다. 세포 사멸 또는 정체를 달성하기 위해, 재조합 핵산, VLP 제품, 또는 이의 약학 조성물, 및/또는 추가 제제(들)는 바이러스에 감염된 세포(들)를 사멸시키거나 분열을 예방하는 데 효과적인 조합된 양으로 하나 이상의 세포에 전달된다. 재조합 핵산, VLP 제품, 또는 약학 조성물의 투여는 수분에서 수주 범위의 간격으로 다른 제제(들)보다 선행하거나, 동시 진행되고/되거나, 뒤따를 수 있다. 약학 조성물 및 기타 작용제(들)가 세포, 조직, 또는 유기체에 별도로 적용되는 실시예에서, 일반적으로 상당한 기간이 각 전달 시간 사이에 만료되지 않도록 하여, 약학 조성물 및 제제(들)가 여전히 세포, 조직, 또는 유기체에 유리하게 결합된 효과를 발휘할 수 있다. 예를 들어, 그러한 경우에, 세포, 조직, 또는 유기체를 약학 조성물과 실질적으로 동시에(즉, 약 1분 이내) 2, 3, 4, 또는 그 이상의 양상으로 접촉시킬 수 있는 것으로 고려된다. 다른 측면에서, 하나 이상의 제제는 재조합 핵산, VLP, 또는 의약품의 투여 전 및/또는 후에, 약 1분 내지 약 24시간 내지 약 7일 내지 약 1 내지 약 8주 또는 그 이상, 및 그 안에서 유도가능한 임의의 범위로, 실질적으로 동시에, 투여될 수 있다. 또한, 본 명세서에 제시된 약학 조성물 및 하나 이상의 제제의 다양한 조합 요법이 사용될 수 있다.
환자에게 투여하기 위한 제형 및 경로
[0185] 임상 적용이 고려되는 경우, 의도된 적용에 적절한 형태로, 약학 조성물, 즉 발현 구조물, 발현 벡터, 융합 단백질, 형질감염 또는 형질도입된 세포를 제조하는 것이 필요할 것이다. 일반적으로, 이는 본질적으로 발열원뿐만 아니라 인간이나 동물에 해로울 수 있는 기타 불순물이 없는 조성물의 제조를 수반할 것이다.
[0186] 재조합 핵산, VLP 제품, 또는 이의 약학 조성물은, 예를 들어 용량당 약 1-5백만 입자의 용량으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 약 0.25ml 내지 약 10ml, 예를 들어 약 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 또는 10 ml, 예를 들어 약 2ml의 바이알당 부피와 같은 제품을 함유하는 바이알 또는 기타 용기가 제공될 수 있다.
[0187] 재조합 핵산 또는 VLP 제품이 환자 내에 도입될 때 일반적으로 적절한 염 및 완충액을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "약학적으로 또는 약리학적으로 허용되는(pharmaceutically or pharmacologically acceptable)"이라는 문구는, 동물 또는 인간에게 투여될 때, 유해, 알레르기, 또는 기타 이상 반응을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 의미한다. 약학적으로 허용되는 담체는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 용도는 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 벡터 또는 세포와 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 치료 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 보조 활성 성분이 또한 조성물 내에 포함될 수 있다.
[0188] 제형화 시, 용액은 투여 제형과 양립가능한 방식으로 치료적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 제형은 주사용 용액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 제형으로 용이하게 투여된다. 수용액에서 비경구 투여를 위해, 예를 들어, 용액은 필요하다면 적절하게 완충될 수 있고 액체 희석제는 먼저 충분한 염수 또는 포도당과 등장성이 된다. 이러한 특정 수용액은 정맥 내, 근육 내, 피하, 및 복강 내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 멸균 수성 매질을 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 투여량을 등장성 NaCl 용액 1ml에 용해시키고 피하주사액 1000ml에 첨가하거나 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다(예: "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 및 1570-1580 참조). 투여량의 약간의 변화는 치료 대상의 상태에 따라 필연적으로 발생할 것이다. 투여 책임자는 어떤 경우에도 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다. 더욱이, 인간 투여의 경우, 제제는 FDA 생물학청 표준에서 요구하는 무균, 발열성, 및 일반 안전 및 순도 표준을 충족할 수 있다.
[0189] 조성물은 대상체에게 에어로졸화된 전달을 위해 제형화될 수 있다. 에어로졸 전달의 경우, 기재된 조성물은 물과 같은 수용액 또는 Hanks 용액, Ringer 용액, 또는 생리 식염수 완충액과 같은 생리학적으로 적합한 완충액으로 제형화될 수 있다. 용액은 현탁제, 안정화제, 또는 분산제와 같은 하나 이상의 제제화 제제를 함유할 수 있다.
[0190] 본 명세서의 폴리뉴클레오티드를 대상체의 원하는 세포에 전달하는 본 명세서의 전달 시스템은 본 명세서의 VLP에 제한되지 않는다. 일부 실시예에서, 전달 벡터는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 리포솜, 나노입자, 미셀, 중합체 소포, 또는 폴리머솜을 포함한다.
[0191] 본 발명의 일부 실시예에서, 전달 벡터는 AAV로부터 유래된 벡터를 포함한다. AAV 벡터는 유전자 치료에 가장 자주 사용되는 벡터 중 하나이다. AAV는 하나의 긴 단일 가닥 DNA 분자에 게놈이 암호화되어 있는 작고, 외피가 없는 클래스 II 바이러스이다. AAV 유래 벡터는 표적 세포에 부착 및 진입하고, 유전 물질을 핵으로 전달하고, 일반적으로 독성이 없는 상태에서 지속 기간 동안 정보를 표현하는 능력을 갖는다. AAV 유래 벡터는 일반적으로 숙주 게놈 내로의 부위 특이적 통합에 필요한 AAV 구성요소를 암호화하지 않고 일반적으로 염색체 외 요소로 지속된다. AAV 벡터는 또한 어느 정도 선택적인 조직 및 기관 표적화 능력이 있다. 따라서, AAV 벡터는 대상체의 원하는 세포로의 본 명세서의 단일 가닥 DNA 폴리뉴클레오티드에 대한 가능한 전달 메커니즘이다.
[0192] 본 발명의 일부 실시예에서, 본 명세서의 재조합 폴리뉴클레오티드는 대상체의 원하는 표적 세포에 전달되도록 비-바이러스 전달 시스템 내로 패키징될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 명세서의 폴리뉴클레오티드는 대상체의 원하는 표적 세포에 전달될 나노입자, 미셀, 중합체 소포, 또는 폴리머솜 내로 패키징된다. 일부 실시예에서, 이들 제품은 흡입기에 의한 또는 나노입자에 의한 전달을 위해 에어로졸 내로 제형화될 수 있다. 추가 전달 경로에는: 국소, 경피, 정맥 내, 피하, 및 척추 강내 전달이 포함된다. 일부 실시예에서, 나노입자는 치료제를 암호화하는 ssRNA를 캡슐화하고, 그 후 이는 에어로졸 전달과 같이 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 에어로졸 전달은 코로나바이러스와 같은 본 명세서에 제공된 바와 같은 바이러스에 감염된 환자의 폐에 치료제를 전달하는 데 사용될 수 있다.
[0193] 추가로, 특정 환자에서, 이 치료는 임의의 남아 있는 바이러스/비리온을 감소 또는 제거하기 위해 주기적으로 반복될 것으로 예상된다. 이러한 주기적 치료는 환자가 안정하거나 검출할 수 없는 질병을 달성하기 위해 요구하는 동안 유지 치료로서 매주 한 번, 2주에 한 번, 3주에 한 번, 한 달에 한 번, 두 달에 한 번, 3개월에 한 번, 4개월에 한 번, 5개월에 한 번, 6개월에 한 번, 또는 7개월마다, 8개월마다, 9개월마다, 10개월마다, 11개월마다, 또는 매년 1회까지 다양할 수 있다.
병용 및 대체 요법
[0194] HIV, HBV, 및 HCV를 비롯한 많은 바이러스 감염의 약물-내성 변이체가 항바이러스제로 장기간 치료 후에 나타날 수 있다는 것이 인식되어 왔다. 약물 내성은 가장 일반적으로 바이러스 복제, 가장 일반적으로 HIV, 역전사 효소, 프로테아제, 또는 DNA 폴리머라제의 경우, HBV, DNA 폴리머라제의 경우, 또는 HCV, RNA 폴리머라제, 프로테아제, 또는 헬리카제의 경우에 사용되는 효소와 같은 단백질을 암호화하는 유전자의 돌연변이에 의해 발생한다. 최근에, HIV 감염에 대한 약물의 효능은 주요 약물에 의해 유발된 것과 다른 돌연변이를 유도하는 두 번째 및 아마도 세 번째 항바이러스 화합물과 병용 또는 대체의 화합물을 투여함으로써 연장, 증대, 또는 회복될 수 있음이 입증되었다. 화합물은 HBV 폴리머라제 억제제, 인터페론, TLR-7 효능제 또는 TLR-9 효능제와 같은 TLR 조절제, 치료 백신, 특정 세포 바이러스 RNA 센서의 면역 활성화제, 바이러스 침입 억제제, 바이러스 성숙 억제제, 별개의 캡시드 조립 조절제, 별개의 또는 알려지지 않은 기전의 항바이러스 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조합을 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 약물의 약동학, 생체분포, 또는 기타 매개변수는 이러한 병용 또는 대체 요법에 의해 변경될 수 있다. 일반적으로, 병용 요법은 바이러스에 여러 동시 스트레스를 유발하기 때문에 대체 요법보다 일반적으로 선호된다.
[0195] 본 발명의 특정 실시예에서, 이 방법은 환자를 구조물의 전달 동안 테노포비르 등과 같은 항바이러스 치료 중으로 유지한 다음; 2주에서 1개월 범위의 기간 또는 시간 동안 환자에게 항바이러스 치료를 중단하고, 바이러스 복제를 허용하고 바이러스 세포 사멸을 제한하여, 압도적인 바이러스 간 세포 사멸 상황이나 유사한 세포 사멸이 없도록 세포 사멸을 통제하는 요법을 포함한다.
[0196] 이러한 주기 후에, 환자는 항바이러스 치료로 돌아가, 조직의 복구를 허용하고; 환자에게 도움이 되는 한 8주마다, 12주마다, 16주마다, 20주마다 등의 주기를 반복한다.
[0197] HBV 치료를 위한 병용 또는 대체 요법을 위한 추가 화합물은 3TC, FTC, L-FMAU, 인터페론, 아데포비르 디피복실, 엔테카비르, 텔비부딘(L-dT), 발토르시타빈(3'-발리닐 L-dC), .베타.-D-디옥솔라닐-구아닌(DXG), .베타.-D-디옥솔라닐-2,6-디아미노퓨린(DAPD), 및 .베타.-D-디옥솔라닐-6-클로로퓨린(ACP), 팜시클로비르, 펜시클로비르, 로부카비르, 간시클로비르, 및 리바비린을 포함한다.
키트
[0198] 추가로, 이들 재조합 핵산, VLP 제품, 또는 이의 약학 조성물의 특정 성분 또는 실시예는 키트로 제공될 수 있다. 예를 들어, 임의의 재조합 핵산 또는 VLP 제품은 단독으로 또는 사전-컨디셔닝 또는 사후-컨디셔닝 단계의 다른 제제의 별도 용기 및 선택적인 사용 지침과 함께 키트로 냉동 및 포장되어 제공될 수 있다.
[0199] 본 발명의 일부 실시예는 또한 키트의 상기 언급된 조성물 중 임의의 것에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 키트는 앰플, 일회용 주사기, 캡슐, 바이알, 튜브 등을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 키트는 본 명세서의 실시예의 국소 제형을 포함하는 단일 용량 용기 또는 다중 용량 용기를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 각각의 용량 용기는 하나 이상의 단위 용량을 함유할 수 있다. 일부 실시예에서, 키트는 어플리케이터를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 키트는 컨디셔닝/치료 단계에 필요한 모든 구성요소를 포함한다. 일부 실시예에서, 세포 조성물은 방부제를 갖거나 방부제가 없을 수 있다(예를 들어, 1회용 용기에서). 일부 실시예에서, 재조합 핵산 또는 VLP 제품은 병원 또는 치료 센터로 운송하기에 적합한 원하는 단계에서 제조 및 동결될 수 있다.
[0200] 추가로, 특정 환자에서, 임의의 방법 또는 치료 요법이 바이러스 제제(들)에 대한 면역계 반응을 증가시키기 위해 주기적으로 반복될 것으로 예상된다. 이러한 주기적 치료는 환자가 필요로 하는 동안 유지 치료로서 매주 1회, 매월 1회, 2개월에 1회, 3개월에 1회, 4개월에 1회, 5개월에 1회, 6개월에 1회, 또는 7개월에 1회, 또는 8개월에 1회, 또는 9개월에 1회, 10개월에 1회, 11개월에 1회, 또는 매년 1회까지 다양할 수 있다.
[0201] 본 발명이 다양한 바람직한 실시예와 관련하여 설명되었지만, 이에 제한되는 것으로 의도되지 않고, 오히려 당업자는 본 발명의 사상 및 첨부된 청구범위의 범위 내에서 변형 및 수정이 이루어질 수 있음을 인식할 것이다.
[0202] 본 발명의 특정 실시예에서, 본 명세서에 기재된 시험 구조물은 AAV8이 간 세포를 표적화하기 때문에 전달 벡터로서 AAV8을 이용하고; 비특이적 표적화는 표시된 대로 다양한 컨트롤에서 시험된다. TBG(Thyroxine Binding Globulin)는 간-특이적 프로모터로 활용되고, 간 세포에서만 만들어지는 특이적 전사 인자에 의해 활성화된다. 이는 역상보적 구조에 있는 재조합 전사체의 발현을 유도할 것이고, 따라서 비-기능적인 것으로 간주되고, 바이러스 전사 인식 신호(이 경우 엡실론 서열(SEQ ID NO:1))의 존재 없이 더 분해를 겪을 것이다.
[0203] 이들 실험은 시험 구조물이, HBV DNA 폴리머라제가 존재하는 HBV-감염 간 세포에서만 발현되고, 내장된 HBV 엡실론 전사 인식 서열과 상호작용하고 HBV "바이러스 자살(viral suicide)" 전사체를 전사한다는 것을 나타내기 위해 고안되었다. 이 과정 후에, 센스 HBV 전사체(Casp9를 암호화하는 엡실론 서열에 의해 인식되는 센스 전사체)는, 바이러스에 감염된 숙주 세포의 프로그램화된 세포 사멸 - 세포자멸사를 개시하는, 강력한 구성적으로 활성인 EFS 프로모터 아래에 있는, 이제 Casp 9를 암호화하는 숙주 세포 기계에 의해 전사 및 번역될 수 있고, 임의의 감염되지 않은 다른 세포를 세포자멸사로부터 보호한다.
[0204] 이러한 결과는 도 1-12의 개략도, 지도, 그래프, 및 표에 예시되어 있고, 하기의 실시예 1-6에서 보다 완전하게 설명된다.
[0205] 실시예 1
[0206] HepAD38은 테트라사이클린으로 조절될 수 있는 조건하에 인간 B형 간염 바이러스(HBV)를 복제하는 세포주이다. 항생제가 있는 경우, 이 세포주는 pg(pregenomic) RNA 합성의 억제로 인해 바이러스가 없다. 배양 배지에서 테트라사이클린을 제거하면, 세포는 바이러스 pg RNA를 발현하고, 바이러스 복제의 특징인 DNA 중간체를 함유하는 서브바이러스 입자를 세포질에 축적하고, 바이러스-유사 입자를 상등액 내로 분비한다. HepAD38 세포주는 높은 수준의 HBV DNA를 생산할 수 있기 때문에, 동기화된 방식으로 바이러스 DNA 합성에 의존하는 바이러스 복제 주기를 분석하는 데 유용해야 한다. 또한, 이 세포주는 새로운 종류의 HBV 복제 억제제에 대한 다양한 화합물 라이브러리의 대규모 스크리닝을 허용하는 고속-처리량의 세포-기반 분석 내로 포맷되었다. Ladner S.K. et al. Antimicrob Agents Chemother. 1997 Aug;41(8):1715-20 참조. 따라서, HepAD38 세포주는 인간 B형 간염 바이러스(HBV) 연구에 적합한 시험관 내 모델 시스템이다.
[0207] G2형 간염은 고분화 간세포 암종을 앓고 있는 유럽 가계의 15세 미국 청소년 소년의 간 조직으로부터 유래된 불멸 세포주이다. 이들 세포는 형태가 상피이고, 모달 염색체 번호가 55이며, 실험용 쥐(nude mice)에서 종양을 유발하지 않는다. 세포는 다양한 주요 혈장 단백질, 예를 들어 알부민 및 급성기 단백질 피브리노겐, 알파 2-마크로글로불린, 알파 1-항트립신, 트랜스페린 및 플라스미노겐을 분비한다. 그들은 대규모 배양 시스템에서 성공적으로 성장하였다. B형 간염 바이러스 표면 항원은 이들 세포에서 검출되지 않았다. G2형 간염은 인간 성장 호르몬으로 자극에 반응할 것이다. 따라서, Hep G2 세포는 분극화된 인간 간세포 연구에 적합한 시험관 내 모델 시스템이다.
[0208] 본 명세서에 기재된 "바이러스 특이적 세포독성(viral specific cytotoxic)" 구조물을 시험하기 위해, HepG2 세포를 이용하는 것은 정상의 건강한 간 세포에 대한 대조군으로 작용하였다. HepG2 세포는 HBV에 감염되지 않은 간 세포이기 때문에, 실험 1에서 사용된 AAV8-HBV-DRS1(EF1a > HBV-rcCasp9) 시험 복제 불능에 영향을 받지 않아야 하고, 결과는 도 2a 및 도 2c에 나와 있다.
[0209] 대조적으로, HepAD38 세포주는 본 명세서에 기재된 "바이러스 특이적 세포독성(viral specific cytotoxic)" 구조물: 복제 불능 구조물: AAV8-HBV-DRS1(EF1a > HBV-rcCasp9)(도 2a에 도시된 벡터) 중 하나를 시험하기 위한 HBV+ 모델로서 이용되었다. 실험 1, 그룹 1-3에 대해 나타낸 결과는, 도 2b의 그래픽 데이터에 도시된 바와 같이 HepAD38 세포에서 그룹 2 시험 구조물 AAV8-HBV-DRS1(EF1a > HBV-rcCasp9)이 바이러스 특이적 세포 사멸을 나타내고, 도 2c에 기재된 상응하는 세포 수 및 생존력을 나타낸다는 것을 예시한다.
[0210] 실시예 2
[0211] 추가로, 도 3a 및 도 3b, 및 도 4a, 도 4b, 및 도 4c에 도시된 실험 2에서, AAV8-HBV-DRS1(EF1a > HBV-rcCasp9) 구조물을 HepG2 세포 및 HepAD38 세포에서 추가로 시험하였고 특정 테스트 그룹에서 Caspase-9 억제제 Z-LEHD-FMK를 사용하여 사멸이 Casp9 발현의 결과임을 설명하였다(그룹 3 및 그룹 5 참조). 이러한 실험의 결과는 그룹 2 HepAD38 세포에서 바이러스 특이적 세포 사멸을 설명하고, 이는 거의 80%의 세포 사멸 비율을 나타낸다. 도 5a는 벡터 지도이고 도 5b는 AAV8-HBV-DRS1(EF1a > HBV-rcCasp9) 구조물로 감염된 HepAD38 세포에서의 급격한 세포 사멸을 강조하기 위해 HepG2 세포 및 HepAD38 세포에서의 시험 구조물 및 다양한 대조군의 효과를 보여주는 조합된 그래프이다.
[0212] 실시예 3
[0213] 마지막으로, 실험 3에서, AAV8-HBV-DRS2(TBG > HBV-rcCasp9) 구조물을 시험하였다. 이 구조물은 간-특이적 프로모터인 티록신 결합 글로불린(TBG)을 함유한다. 이러한 실험의 결과는 그룹 2 HepAD38 세포에서 바이러스 특이적 세포 사멸을 설명하고, 이는 거의 80%의 세포 사멸 비율을 나타낸다(도 6a 및 도 6b). 이 그룹에서, 그룹 1 세포는 형질도입되지 않았고, 그룹 2 세포는 AAV8-HBV-DRS2(TBG > HBV-rcCasp9)로 형질도입된 시험 세포이고; 그룹 3 세포는 Casp9 억제제 z-LEHD.fmk의 첨가와 동일하였고; 그룹 4 세포는 대조군으로서 Casp9 억제제 z-LEHD.fmk와만 접촉되었고; 그룹 5 세포는 GFP를 함유하는 구조물로 형질도입되어 구조물 발현을 추가로 추적하고; 그룹 6 세포는 동일한 GFP 구조물로 형질도입되었고 또한 Casp9 억제제 z-LEHD.fmk와 함께 배양되었다.
[0214] 실험 2-3에서 벡터 + Casp9 억제제 대조군은 세포 사멸이 벡터/DNA 독성이 아니라 카스파제-9에 의해 개시됨을 예시하였다.
[0215] 실험 2-3에서 GFP-AAV 대조군은 세포 사멸이 AAV 독성으로 인한 것이 아님을 예시하였다.
실시예 4
[0216] 실험 4에서, HBV-감염 또는 HBV 생산 세포를 본 명세서에 제공된 바와 같이 HBV RNA로 치료하고, 세포 생존율을 기준으로 평균 세포 사멸 퍼센트를 계산하였다. 4일까지, 다양한 HBV-생성 세포에서 평균 세포 사멸은 92%(88.6%에서 95.8% 범위)였다. 감염되지 않은 세포에서는 유의미한 세포 사멸이 관찰되지 않았다. RT 및 판-카스파제(pan-caspase) 억제제는 AAV-치료된 감염된 세포에서 개별적으로 세포 사멸을 예방하였다. 이러한 결과는 HBV RNA 구조물이 HBV-감염 또는 생성 세포를 선택적으로 사멸시킨다는 것을 보여준다.
실시예 5
[0217] 생체 내 쥐 간염 모델 실험
[0218] 이들 구조물은 생체 내 쥐 모델에서 추가로 시험되었고, 결과는 시험 구조물 AAV8-HBV-DRS1(EF1a > HBV-rcCasp9) 및 AAV8-HBV-DRS2(TBG > HBV-rcCasp9)에 대한 바이러스 특이적 세포 사멸을 설명한다(도 9).
[0219] 상기 섹션에서, 감염된 간세포의 세포자멸사를 유도하기 위해 B형 간염 바이러스(HBV) 폴리머라제(pol)를 선취(co-opt)하는 신규한 시험관 내 개념-증명의 결과가 제시되었다. HBV 형질전환 쥐 모델을 사용하여 생체 내에서 이들 구조물 및 접근 메커니즘의 효능 및 특이성을 평가하였다.
방법
[0220] AAV 입자는 HBV pol(HBV pol/RT)의 역전사 효소(RT) 도메인에 특이적인 서열 사이에 플랭킹된 비-기능성 비-코딩(nc)RNA를 발현하는 독점 벡터 구조물로 패키징되었다. ncRNA는 HBV pol/RT에 의해 인식되고 카스파제-9(casp-9)를 과발현하도록 암호화된 이중-가닥(ds)DNA 내로 역전사된다(도 1a 및 도 1b). 그룹당 5마리의 HBV 형질전환 쥐에 EF1a 또는 간-특이적 티록신 결합 글로불린(TBG) 프로모터, GFP 벡터, 또는 위약 하에 벡터를 발현하는 AAV 입자를 주사하였다. 말초 혈액에서 간 효소 및 HBeAg에 대해 매주 모니터링되었다. 심장, 폐, 신장, 및 간을 14일 또는 28일에 채취하고 IHC 및 웨스턴 블롯에 의해 AAV VP의 조직 분포에 대해 평가하였다. Casp-9, 카스파제 절단 산물 및 casp-9를 사용한 HBV 코어 단백질의 이중 염색도 IHC로 평가하였다. 또한, HBV pol-발현 또는 비발현 HepG2-Red-Fluc 세포를 매트리젤과 함께 실험용 쥐의 간 내에 이식하여 국소 종양 성장을 촉진하였다. 그 다음, 쥐를 시험 벡터를 발현하는 AAV로 치료하였다. 다양한 시점에서, IVIS Lumina S5 Imaging System을 사용하여 종양 크기의 변화를 정량화하기 위해 쥐에 D-루시페린 기질을 주입하였다.
결과
[0221] 치료-후 14일째에 형질전환 쥐로부터 채취된 기관은 HBV를 발현하는 간 및 신장 세포에서 상당한 casp-9 발현을 나타내었지만 HBV를 발현하지 않는 세포에서는 그렇지 않았다. TBG 프로모터를 운반하는 벡터로 치료된 쥐의 신장 조직은 치료되지 않은 대조군 및 GFP 대조군에 비해 casp-9 발현이 증가하지 않았다. 더욱이, 치료 AAV 입자에 대해 양성으로 염색된 다른 기관의 세포는 casp-9 과발현을 나타내지 않았다. 치료-후 28일째에 채취한 간은 치료 군에서는 확산성 세포자멸사 호중구-침윤 부위를 나타내었지만 대조군에서는 그렇지 않았다(도 11a). 치료 군에서 4주차에, GFP-AAV 및 위약 대조군과 비교하여 ALT 수준은 1.8-2.2배 증가하고 AST 수준은 1.4배 증가하였다(도 11b). 말초 HBeAg에는 유의한 변화가 없었다. 실험용 쥐 이종이식 치료 연구의 결과가 평가될 것이다.
결론
[0222] HBV pol을 하이재킹하는 신규 AAV 벡터는 시험관 내 및 생체 내에서 HBV-발현 세포에서 Casp-9의 과발현 및 세포자멸사를 특이적으로 유도하였다. 이 과정의 개요를 보여주는 개략도가 도 11c에 도시되어 있다. 말초 HBeAg 감소의 결여는 형질전환 쥐에서 재생 간 조직이 항원을 구성적으로 발현하기 때문에 예상되었다. 이러한 데이터는 HBV 감염을 치료하거나 치유하는 잠재적인 새로운 경로를 제시한다.
서열
[0223] SEQ ID NO:1: HBV RNA 폴리머라제 엡실론 신호
UGUUCAUGUCCUACUGUUCAAGCCUCCAAGCUGUGCCUUGGGUGGCUUUGGGGCAUGGACA
[0224] SEQ ID NO:2: EFS 프로모터
GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGATCCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGG
[0225] SEQ ID NO:3: 카스파제 9 (Casp9) 인간 ORF
ATGGACGAAGCGGATCGGCGGCTCCTGCGGCGGTGCCGGCTGCGGCTGGTGGAAGAGCTGCAGGTGGACCAGCTCTGGGACGCCCTGCTGAGCCGCGAGCTGTTCAGGCCCCATATGATCGAGGACATCCAGCGGGCAGGCTCTGGATCTCGGCGGGATCAGGCCAGGCAGCTGATCATAGATCTGGAGACTCGAGGGAGTCAGGCTCTTCCTTTGTTCATCTCCTGCTTAGAGGACACAGGCCAGGACATGCTGGCTTCGTTTCTGCGAACTAACAGGCAAGCAGCAAAGTTGTCGAAGCCAACCCTAGAAAACCTTACCCCAGTGGTGCTCAGACCAGAGATTCGCAAACCAGAGGTTCTCAGACCGGAAACACCCAGACCAGTGGACATTGGTTCTGGAGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCATAA
[0226] SEQ ID NO:4: Casp9의 역보체
TTATGATGTTTTAAAGAAAAGTTTTTTCCGGAGGAAATTAAAGCAACCAGGCATCTGTTTATAAATCCCTTTCACCGAAACAGCATTAGCGACCCTAAGCAGGAGGGACTGCAGGTCTTCAGAGTGAGCCCACTGCTCAAAGATGTCGTCCAGGGTCTCAACGTACCAGGAGCCACTCTTGGGGTCCCTCCAGGAAACAAAACCTGGGAAAGTAGAGTAGGACACAAAGATGTCACTGGGTGTGGGCAAACTAGATATGGCGTCCAGCTGGTCGAAGGTCCTCAAACCTTCCTGGAACGGGGTGGCATCTGGCTCGGGGTTACTGCCAGGGGACTCGTCTTCAGGGGAAGTGGAGGCCACCTCAAACCCATGGTCTTTCTGCTCCCCACCACAGGCCTGGATGAAAAAGAGCTTGGGCTTCCCTCCCAGGCTGGGGCAGCTGGTCCCATTGAAGATGTTCACAATCTTCTCGACCGACACAGGGCATCCATCTGTGCCGTAGACAGCCCCTGGGAACTGCAGGTGGCTGGCCTGACAGCCGTGAGAGAGAATGACCACCACGCAGCAGTCCAGAGCACCGTGGTCCTGCTGCGCCAGCTCCAGCAAAGCCAGCACCATTTTCTTGGCAGTCAGGTCGCCCTTCACCTCCACCATGAAATGCAGCGAGGAGAAGCGACGCCGCAACTTCTCACAGTCGATGTTGGAGCCAGTGCGGGTGCGGAGCCCGGACTCACGGCAGAAGTTCACATTGTTGATAATGAGGCAGTGGCCACAGGGCTCCATGCTCAGGATGTAAGCCAAATCTGCATTTCCCCTCAAACTCTCAAGAGCACCGACATCACCAAATCCTCCAGAACCAATGTCCACTGGTCTGGGTGTTTCCGGTCTGAGAACCTCTGGTTTGCGAATCTCTGGTCTGAGCACCACTGGGGTAAGGTTTTCTAGGGTTGGCTTCGACAACTTTGCTGCTTGCCTGTTAGTTCGCAGAAACGAAGCCAGCATGTCCTGGCCTGTGTCCTCTAAGCAGGAGATGAACAAAGGAAGAGCCTGACTCCCTCGAGTCTCCAGATCTATGATCAGCTGCCTGGCCTGATCCCGCCGAGATCCAGAGCCTGCCCGCTGGATGTCCTCGATCATATGGGGCCTGAACAGCTCGCGGCTCAGCAGGGCGTCCCAGAGCTGGTCCACCTGCAGCTCTTCCACCAGCCGCAGCCGGCACCGCCGCAGGAGCCGCCGATCCGCTTCGTCCAT
[0227] SEQ ID NO:5: EFS 프로모터의 역보체
CCTGTGTTCTGGCGGCAAACCCGTTGCGAAAAAGAACGTTCACGGCGACTACTGCACTTATATACGGTTCTCCCCCACCCTCGGGAAAAAGGCGGAGCCAGTACACGACATCACTTTCCCAGTTTACCCCGCGCCACCTTCTCTAGGCACCGGATCAATTGCCGACCCCTCCCCCCAACTTCTCGGGGACTGTGGGCGATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCACCGGAGCC
[0228] SEQ ID NO:6: SV40 폴리A
ACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTCT
[0229] SEQ ID NO:7: SV40 폴리A의 역보체
AGAGCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGT
[0230] SEQ ID NO:8: 구조물(전사): (1746 bp)
ATGTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACAAGAGCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTTATGATGTTTTAAAGAAAAGTTTTTTCCGGAGGAAATTAAAGCAACCAGGCATCTGTTTATAAATCCCTTTCACCGAAACAGCATTAGCGACCCTAAGCAGGAGGGACTGCAGGTCTTCAGAGTGAGCCCACTGCTCAAAGATGTCGTCCAGGGTCTCAACGTACCAGGAGCCACTCTTGGGGTCCCTCCAGGAAACAAAACCTGGGAAAGTAGAGTAGGACACAAAGATGTCACTGGGTGTGGGCAAACTAGATATGGCGTCCAGCTGGTCGAAGGTCCTCAAACCTTCCTGGAACGGGGTGGCATCTGGCTCGGGGTTACTGCCAGGGGACTCGTCTTCAGGGGAAGTGGAGGCCACCTCAAACCCATGGTCTTTCTGCTCCCCACCACAGGCCTGGATGAAAAAGAGCTTGGGCTTCCCTCCCAGGCTGGGGCAGCTGGTCCCATTGAAGATGTTCACAATCTTCTCGACCGACACAGGGCATCCATCTGTGCCGTAGACAGCCCCTGGGAACTGCAGGTGGCTGGCCTGACAGCCGTGAGAGAGAATGACCACCACGCAGCAGTCCAGAGCACCGTGGTCCTGCTGCGCCAGCTCCAGCAAAGCCAGCACCATTTTCTTGGCAGTCAGGTCGCCCTTCACCTCCACCATGAAATGCAGCGAGGAGAAGCGACGCCGCAACTTCTCACAGTCGATGTTGGAGCCAGTGCGGGTGCGGAGCCCGGACTCACGGCAGAAGTTCACATTGTTGATAATGAGGCAGTGGCCACAGGGCTCCATGCTCAGGATGTAAGCCAAATCTGCATTTCCCCTCAAACTCTCAAGAGCACCGACATCACCAAATCCTCCAGAACCAATGTCCACTGGTCTGGGTGTTTCCGGTCTGAGAACCTCTGGTTTGCGAATCTCTGGTCTGAGCACCACTGGGGTAAGGTTTTCTAGGGTTGGCTTCGACAACTTTGCTGCTTGCCTGTTAGTTCGCAGAAACGAAGCCAGCATGTCCTGGCCTGTGTCCTCTAAGCAGGAGATGAACAAAGGAAGAGCCTGACTCCCTCGAGTCTCCAGATCTATGATCAGCTGCCTGGCCTGATCCCGCCGAGATCCAGAGCCTGCCCGCTGGATGTCCTCGATCATATGGGGCCTGAACAGCTCGCGGCTCAGCAGGGCGTCCCAGAGCTGGTCCACCTGCAGCTCTTCCACCAGCCGCAGCCGGCACCGCCGCAGGAGCCGCCGATCCGCTTCGTCCATCCTGTGTTCTGGCGGCAAACCCGTTGCGAAAAAGAACGTTCACGGCGACTACTGCACTTATATACGGTTCTCCCCCACCCTCGGGAAAAAGGCGGAGCCAGTACACGACATCACTTTCCCAGTTTACCCCGCGCCACCTTCTCTAGGCACCGGATCAATTGCCGACCCCTCCCCCCAACTTCTCGGGGACTGTGGGCGATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCACCGGAGCCTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATAA
[0231] SEQ ID NO:9
[0232] HBV 입실론 신호 사이에 플랭킹된 "zsGreen 유전자를 구동하는 EFS 프로모터"의 역상보 서열:
ATGTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACAAGAGCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTTAGGGCAAGGCGGAGCCGGAGGCGATGGCGTGCTCGGTCAGGTGCCACTTCTGGTTCTTGGCGTCGCTGCGGTCCTCGCGGGTCAGCTTGTGCTGGATGAAGTGCCAGTCGGGCATCTTGCGGGGCACGGACTTGGCCTTGTACACGGTGTCGAACTGGCAGCGCAAGCGGCCACCGTCCTTCAGCAGCAGGTACATGCTCACGTCGCCCTTCAAGATGCCCTGCTTGGGCACGGGGATGATCTTCTCGCAGGAGGGCTCCCAGTTGTCGGTCATCTTCTTCATCACGGGGCCGTCGGCGGGGAAGTTCACGCCGTAGAACTTGGACTCGTGGTACATGCAGTTCTCCTCCACGCTCACGGTGATGTCGGCGTTGCAGATGCACACGGCGCCGTCCTCGAACAGGAAGGAGCGGTCCCAGGTGTAGCCGGCGGGGCAGGAGTTCTTGAAGTAGTCGACGATGTCCTGGGGGTACTCGGTGAACACGCGGTTGCCGTACATGAAGGCGGCGGACAAGATGTCCTCGGCGAAGGGCAAGGGGCCGCCCTCCACCACGCACAGGTTGATGGCCTGCTTGCCCTTGAAGGGGTAGCCGATGCCCTCGCCGGTGATCACGAACTTGTGGCCGTCCACGCAGCCCTCCATGCGGTACTTCATGGTCATCTCCTTGGTCAGGCCGTGCTTGGACTGGGCCATCCTGTGTTCTGGCGGCAAACCCGTTGCGAAAAAGAACGTTCACGGCGACTACTGCACTTATATACGGTTCTCCCCCACCCTCGGGAAAAAGGCGGAGCCAGTACACGACATCACTTTCCCAGTTTACCCCGCGCCACCTTCTCTAGGCACCGGATCAATTGCCGACCCCTCCCCCCAACTTCTCGGGGACTGTGGGCGATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCACCGGAGCCTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATAA
실시예 6
[0233] 인플루엔자-특이적 Casp9 구조물 및 실험
[0234] 하기 서열 및 구조물은 인플루엔자 바이러스를 치료하도록 설계된 구조물을 시험하는데 이용될 것이다. 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 폴리머라제 복합체를 이용하여 바이러스 단백질을 발현하거나 바이러스 게놈을 복제하는 단일-가닥 음성-센스 RNA 바이러스이기 때문에, 음성-센스 nc(non-coding)RNA를 발현하는 벡터 구조물은 인플루엔자 폴리머라제에 관여하도록 설계되었다(실시예 1-4에 기재된 바와 같이 HBV에 대해 특별히 설계된 것과 유사한 방식으로). ncRNA는 바이러스 기계를 "하이재킹(hijack)"하여 감염된 세포에서 특이적으로 세포자멸사를 유도하고, 이는 잠재적인 항바이러스 치료이다(도 10a 및 도 10b).
방법
[0235] 아데노-연관 바이러스(AAV)는 ncRNA를 발현하는 신규 벡터(인플루엔자 "하이잭 RNA(hijack RNA)" 또는 인플루엔자 감염 세포에 대한 RNA 자살 벡터로 생각할 수 있음)와 함께 패키징되었고, 이는 여러 인플루엔자 바이러스 균주에 걸쳐 고도로 보존된 인플루엔자 게놈 RNA 비코딩 서열(NCS) 영역 사이의 zsGreen 마커(AAV.infv.rcZsGreen) 또는 카스파제-9(casp9) 유전자(AAV.infv.rcCasp9)의 역상보 가닥을 전사한다. 이들 서열의 실시예는 SEQ ID NOs 10- 24로서 하기에 제시되어 있다. Madin-Darby Canine Kidney(MDCK) 세포는, 이러한 인플루엔자(nc)RNA 구조물을 시험하기 위한 시험관 내 시스템으로, 0.1 MOI에서 인플루엔자 A H1N1 또는 H3N2 또는 인플루엔자 B 바이러스에 감염되었다. 인플루엔자 감염된 및 감염되지 않은 MDCK 세포를, casp9 억제제 Z-LEHD-FMK의 존재 및 부재하에 AAV.infv.rcZsGreen 벡터 및 AAV.infv.rcCasp9로 형질도입하여 인플루엔자에 감염 세포에 대한 하이잭 벡터 또는 RNA 자살 벡터의 기능을 결정하였다. 유세포 분석을 사용하여 zsGreen 발현을 결정하였다. 세포 생존 및 증식은 FACS, Annexin 분석, 및 자동 세포 계수에 의해 매일 평가되었다.
결과
[0236] 모든 AAV.infv.rcZsGreen 벡터 형질도입된 인플루엔자-감염 세포는 zsGreen 단백질을 성공적으로 생산하여, 하이잭/자살 RNA 구조물이 각 인플루엔자 균주에서 폴리머라제 복합체에 의해 인식되고 전사됨을 확인시켜주었다. 인플루엔자 감염은 6일까지 치료되지 않은 세포의 60%-68%를 사멸시켰다. 인플루엔자 감염-후 24시간에 casp9 하이잭/자살 벡터로 치료된 감염된 세포의 91%-95%가 치료-후 3일에 사멸하였다. 회수된 벡터 배양물에서 Casp-9 억제는 세포 사멸을 유도하고 감염된 세포의 수명을 5-6일로 연장시켰다(도 10b). 감염되지 않은 대조군에서는 유의미한 세포 사멸이 없었다.
결론
[0237] 인플루엔자 폴리머라제와 결합하기 위해 트랜스로 전달된 벡터는 치료되지 않은 감염된 세포보다 40% 더 빠르게 인플루엔자 감염된 세포에서 사멸을 유도하기 위해 바이러스 기계를 하이재킹한다. 이 효과는 인플루엔자 폴리머라제의 보존된 특성으로 인해 바이러스 균주에서 나타났다. 이 새로운 접근법은 인플루엔자에 대한 효과적인 치료법을 개발하는 데 사용될 수 있다.
서열
[0238] SEO ID NO:10
[0239] 벡터의 3' 비코딩 영역
5' CCTGCTTTTGCT 3'
[0240] SEO ID NO:11
[0241] 벡터의 5' 비코딩 영역
5' AGTAGAAACAAGG 3'
[0242] SEO ID NO:12
[0243] 인플루엔자-특이적 Casp9 벡터
AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTATCATTATGATGTTTTAAAGAAAAGTTTTTTCCGGAGGAAATTAAAGCAACCAGGCATCTGTTTATAAATCCCTTTCACCGAAACAGCATTAGCGACCCTAAGCAGGAGGGACTGCAGGTCTTCAGAGTGAGCCCACTGCTCAAAGATGTCGTCCAGGGTCTCAACGTACCAGGAGCCACTCTTGGGGTCCCTCCAGGAAACAAAACCTGGGAAAGTAGAGTAGGACACAAAGATGTCACTGGGTGTGGGCAAACTAGATATGGCGTCCAGCTGGTCGAAGGTCCTCAAACCTTCCTGGAACGGGGTGGCATCTGGCTCGGGGTTACTGCCAGGGGACTCGTCTTCAGGGGAAGTGGAGGCCACCTCAAACCCATGGTCTTTCTGCTCCCCACCACAGGCCTGGATGAAAAAGAGCTTGGGCTTCCCTCCCAGGCTGGGGCAGCTGGTCCCATTGAAGATGTTCACAATCTTCTCGACCGACACAGGGCATCCATCTGTGCCGTAGACAGCCCCTGGGAACTGCAGGTGGCTGGCCTGACAGCCGTGAGAGAGAATGACCACCACGCAGCAGTCCAGAGCACCGTGGTCCTGCTGCGCCAGCTCCAGCAAAGCCAGCACCATTTTCTTGGCAGTCAGGTCGCCCTTCACCTCCACCATGAAATGCAGCGAGGAGAAGCGACGCCGCAACTTCTCACAGTCGATGTTGGAGCCAGTGCGGGTGCGGAGCCCGGACTCACGGCAGAAGTTCACATTGTTGATAATGAGGCAGTGGCCACAGGGCTCCATGCTCAGGATGTAAGCCAAATCTGCATTTCCCCTCAAACTCTCAAGAGCACCGACATCACCAAATCCTCCAGAACCAATGTCCACTGGTCTGGGTGTTTCCGGTCTGAGAACCTCTGGTTTGCGAATCTCTGGTCTGAGCACCACTGGGGTAAGGTTTTCTAGGGTTGGCTTCGACAACTTTGCTGCTTGCCTGTTAGTTCGCAGAAACGAAGCCAGCATGTCCTGGCCTGTGTCCTCTAAGCAGGAGATGAACAAAGGAAGAGCCTGACTCCCTCGAGTCTCCAGATCTATGATCAGCTGCCTGGCCTGATCCCGCCGAGATCCAGAGCCTGCCCGCTGGATGTCCTCGATCATATGGGGCCTGAACAGCTCGCGGCTCAGCAGGGCGTCCCAGAGCTGGTCCACCTGCAGCTCTTCCACCAGCCGCAGCCGGCACCGCCGCAGGAGCCGCCGATCCGCTTCGTCCATTCCCCTGCTTTTGCT
[0244] 주요 특징 5':
[0245] SEQ ID N0:13: 벡터의 5' 비코딩 영역: AGTAGAAACAAGG
[0246] SEQ ID NO:14: 비특이적 버퍼 서열 GTG
[0247] SEQ ID NO:15: 역전사 동안 폴리A 신호 내로 "스터터될(stuttered)" U5-7 반복부: TTTTTT
[0248] SEQ ID NO:16: 인플루엔자 종에 걸쳐 가장 흔한 비특이적 버퍼 서열: ATCA
[0249] SEQ ID NO:17: "최종 +센스 Casp9 전사체"의 정지 코돈: TTA
[0250] 주요 특징 3':
[0251] SEQ ID NO:18: "최종 + 센스 Casp9 전사체"의 개시 코돈: CAT
[0252] SEQ ID NO:19: 비특이적 버퍼 서열: TCC
[0253] SEQ ID NO:20: 벡터의 3' 비코딩 영역: CCTGCTTTTGCT
[0254] SEO ID NO:21
[0255] 인플루엔자 폴리머라제 복합체 인식 및 역전사를 위한 (-)ssRNA 전사
[0256] (시험 벡터에 의해 발현된 전사체)
AGUAGAAACAAGGGUGUUUUUUAUCAUUAUGAUGUUUUAAAGAAAAGUUUUUUCCGGAGGAAAUUAAAGCAACCAGGCAUCUGUUUAUAAAUCCCUUUCACCGAAACAGCAUUAGCGACCCUAAGCAGGAGGGACUGCAGGUCUUCAGAGUGAGCCCACUGCUCAAAGAUGUCGUCCAGGGUCUCAACGUACCAGGAGCCACUCUUGGGGUCCCUCCAGGAAACAAAACCUGGGAAAGUAGAGUAGGACACAAAGAUGUCACUGGGUGUGGGCAAACUAGAUAUGGCGUCCAGCUGGUCGAAGGUCCUCAAACCUUCCUGGAACGGGGUGGCAUCUGGCUCGGGGUUACUGCCAGGGGACUCGUCUUCAGGGGAAGUGGAGGCCACCUCAAACCCAUGGUCUUUCUGCUCCCCACCACAGGCCUGGAUGAAAAAGAGCUUGGGCUUCCCUCCCAGGCUGGGGCAGCUGGUCCCAUUGAAGAUGUUCACAAUCUUCUCGACCGACACAGGGCAUCCAUCUGUGCCGUAGACAGCCCCUGGGAACUGCAGGUGGCUGGCCUGACAGCCGUGAGAGAGAAUGACCACCACGCAGCAGUCCAGAGCACCGUGGUCCUGCUGCGCCAGCUCCAGCAAAGCCAGCACCAUUUUCUUGGCAGUCAGGUCGCCCUUCACCUCCACCAUGAAAUGCAGCGAGGAGAAGCGACGCCGCAACUUCUCACAGUCGAUGUUGGAGCCAGUGCGGGUGCGGAGCCCGGACUCACGGCAGAAGUUCACAUUGUUGAUAAUGAGGCAGUGGCCACAGGGCUCCAUGCUCAGGAUGUAAGCCAAAUCUGCAUUUCCCCUCAAACUCUCAAGAGCACCGACAUCACCAAAUCCUCCAGAACCAAUGUCCACUGGUCUGGGUGUUUCCGGUCUGAGAACCUCUGGUUUGCGAAUCUCUGGUCUGAGCACCACUGGGGUAAGGUUUUCUAGGGUUGGCUUCGACAACUUUGCUGCUUGCCUGUUAGUUCGCAGAAACGAAGCCAGCAUGUCCUGGCCUGUGUCCUCUAAGCAGGAGAUGAACAAAGGAAGAGCCUGACUCCCUCGAGUCUCCAGAUCUAUGAUCAGCUGCCUGGCCUGAUCCCGCCGAGAUCCAGAGCCUGCCCGCUGGAUGUCCUCGAUCAUAUGGGGCCUGAACAGCUCGCGGCUCAGCAGGGCGUCCCAGAGCUGGUCCACCUGCAGCUCUUCCACCAGCCGCAGCCGGCACCGCCGCAGGAGCCGCCGAUCCGCUUCGUCCAUUCCCCUGCUUUUGCU
[0257] 일반적인 벡터 구조
일부 실시예에서, 일반 벡터 구조는 하기 화학식을 갖는다:
SEQ ID NO:22-ORF-SEQ ID NO:23, 여기서
SEQ ID NO:22는 AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTATCATTA이고;
ORF는 임의의 단백질 코딩 서열이고; 그리고
SEQ ID NO:23은 CATTCCCCTGCTTTTGCT이다.
[0258] SEQ ID NO:24
[0259] 실험적 검출을 위한 GFP 마커 구조물(Casp9 대신)
AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTATCATTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAGGGCGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTAGCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATTCCCCTGCTTTTGCT
실시예 7
[0260] 이 실험에서, Madin-Darby Canine Kidney(MDCK) 세포는 감염되지 않았고, 인플루엔자 A(H1N1 또는 H3N2) 또는 인플루엔자 B 바이러스에 감염되었다. 다음으로, 인간 casp9를 코딩하는 하이잭 RNA를 포함하는 AAV 입자 또는 GFP를 포함하는 AAV 입자로 감염되지 않은 및 감염된 세포를 치료하였다. 각각 3회씩 3개의 독립적인 실험을 실행하였다.
[0261] Casp9 발현 및 그의 분해 산물(카스파제 3 및 7)을 유세포 분석을 통해 측정하였다. Casp9 발현은 감염되지 않은 세포에 비해 H1N1 인플루엔자 감염으로 4배 증가하였다. 하이잭 RNA AAV는 감염되지 않은 세포에 영향을 미치지 않았지만, 감염된 세포에 사용했을 때 "하이잭(hijack)" RNA AAV는 감염되지 않은 세포에 비해 casp9를 10배, 치료하지 않은 감염된 세포에 비해 3배 증가시켰다.
[0262] 하이잭 RNA AAV의 효과는 자동 세포 계수 및 FACS 분석으로 세포 생존 및 증식을 모니터링함으로써 매일 측정하였다. 감염되지 않은 세포를 "하이잭(hijack)" RNA AAV로 치료하면 세포 생존력에 영향을 미치지 않는다. 그러나, 인플루엔자 B, H1N1, 또는 H3N2 감염 세포를 하이잭 RNA AAV로 치료하면 치료되지 않은 감염된 세포 또는 GFP AAV 치료된 감염된 세포와 비교하여 세포 생존력이 120시간 증가하였다.
[0263] FACS 분석을 사용하여 인플루엔자 핵단백질 세포 내 염색을 통해 배양물 중 감염된 세포 백분율을 모니터링하였다. 하이잭 RNA AAV를 사용한 치료는 H1N1, H3N2, 또는 인플루엔자 B 감염 세포의 백분율을 72시간까지 감소시켰고 인플루엔자 감염을 96시간까지 완전히 근절하였다.
[0264] 이러한 결과는 카스파제-9를 발현하는 하이잭 RNA AAV가 세포 배양에서 인플루엔자 감염을 효과적으로 사멸시킨다는 것을 보여준다.
실시예 8
코로나바이러스 구조 설계
[0265] CoV 폴리머라제(RNA-의존성 RNA-폴리머라제 또는 RdRp)를 통한 (+)ssRNA로부터의 서브게놈 (-)ssRNA 합성. 코로나바이러스 RdRp는 유전자 간 주형-스위칭 공여체 신호에서 일시 중지하고 복제-선택 메커니즘에 의해 게놈의 5' 말단 근처에 있는 매우 유사한 수용체 부위로 전달되어 5' 말단 선도를 복제한다. 전사 조절 서열(TRS)은 주형-스위칭 신호로 기능한다. TRS는 양성 가닥에서 5'ACGAAC3'(SEQ ID NO: 31)이고 음성 가닥에서 3'UGCUUG5'(SEQ ID NO: 32)이다. 서브게놈 mRNA(sgmRNA)에 여전히 여러 TRS가 있는 경우, RdRp는 새로운 smRNA를 작은 게놈으로 보고, 이에 대한 음성 가닥 합성을 시작하고, 내부 공여체 신호에서 주형을 스위칭하여 음성 가닥 주형을 만들어 더 짧은 내부 중첩 sgmRNA를 합성한다. 선도 RNA(60-80nt) 서열은 항상 서브게놈 음성 가닥의 3' 말단과 서브게놈 mRNA의 5' 말단에 유지된다.
[0266] 서브게놈 (-)ssRNA는 바이러스 단백질 합성을 위한 새로운 mRNA를 생성하기 위한 중간체이다. 따라서, 선도 RNA 및 TRS 서열을 모방하지만 관심 유전자(예: 카스파제-9)의 음성 가닥을 운반하는 (-)ssRNA인 코로나바이러스 "하이잭 RNA(hijack RNA)"를 설계할 수 있다. 이 전략의 개요는 도 12a 및 도 12b에 도시되어 있다.
표준 방법
[0267] 분자 생물학의 표준 방법은 Sambrook, Fritsch and Maniatis (1982 & 1989 2nd Edition, 2001 3rd Edition) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA)에 기재되어 있다. 표준 방법은 Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY, which describes cloning in bacterial cells and DNA mutagenesis (Vol. 1), cloning in mammalian cells and yeast (Vol. 2), glycoconjugates and protein expression (Vol. 3), and bioinformatics (Vol. 4)에도 나타난다.
[0268] 면역침전, 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리, 및 결정화를 포함하는 단백질 정제 방법이 기재되어 있다(Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). 화학적 분석, 화학적 변형, 번역-후 변형, 융합 단백질의 생산, 단백질의 글리코실화가 기재되어 있다(예를 들어, Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391 참조). 다클론 및 단일클론 항체의 생산, 정제, 및 단편화가 기재되어 있다(Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane, supra). 리간드/수용체 상호작용을 특성화하기 위한 표준 기술이 이용 가능하다(예를 들어, Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York 참조).
[0269] 본 명세서에 인용된 모든 참조문헌은, 각각의 개별 간행물, 데이터베이스 항목(예: Genbank 서열 또는 GeneID 항목), 특허 출원, 또는 특허가 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼, 동일한 정도로 참조로 포함된다. 참조에 의한 이 통합 설명은, 37 C.F.R.§1.57(b)(1)에 따라, 출원인이 각각의 모든 개별 간행물, 데이터베이스 항목(예: Genbank 서열 또는 GenelD 항목), 특허 출원, 또는 특허와 관련하여 의도한 것이고, 그러한 인용이 참조에 의한 통합 설명에 바로 인접하지 않더라도, 각각은 37 C.F.R.§1.57(b)(2)에 따라 명확하게 식별된다. 명세서 내에서 참조에 의한 통합에 대한 전용 설명을 포함하는 것은 참조에 의한 통합에 대한 일반적인 설명을 어떤 식으로든 약화시키지 않는다. 본 명세서에 인용된 참조의 인용은, 참조가 적절한 선행 기술임을 인정하기 위한 것이 아니고, 이러한 간행물이나 문서의 내용이나 날짜에 대한 인정을 구성하지도 않는다.
실시예 9
[0270] 이 실험에서, SARS-CoV-2 RNA-의존성-RNA-폴리머라제(RdRp)에 의해 인식되도록 설계된 합성 RNA("하이잭 RNA(hijack RNA)")가 세포 배양에서 SARS-CoV-2 감염을 근절하는 능력에 대해 시험되었다. 인식 시, 하이잭 RNA는 디프테리아 독소 단편 A(DT-A) 내로 전사되어, 감염된 세포에서 특이적으로 세포자멸사를 유도하고, 이는 잠재적인 치료가 될 수 있다(도 13).
방법
[0271] 아데노-연관 바이러스(AAV)는 SARS-CoV-2 하이잭 RNA를 발현하는 신규 벡터와 함께 패키징되었고(도 15), 이는 DT-A cDNA의 역상보 가닥 및 SARS-CoV-2 sgRNA의 2차 구조를 함유한다. Vero 세포는 0.1 MOI에서 SARS-CoV-2 USA-WA1/2020 균주로 감염되었다. SARS-CoV-2에 감염된 베로 세포와 감염되지 않은 베로 세포를 시험(도 15) 또는 대조군(GFP) AAV로 형질도입하였다. 감염되지 않은 jurkat, HEK 및 BHK-21 세포도 시험 AAV로 형질도입되어 감염되지 않은 세포에서 하이잭 RNA의 잠재적인 표적외 효과를 추가로 조사하였다. 세포 사멸 및 생존력은 FACS 및 자동 세포 계수에 의해 매일 평가되었다. 세포 배양에서 감염의 근절은 세포 영상화를 통한 세포변성 효과(CPE)의 관찰과 바이러스 단백질의 세포 내 염색을 통한 FACS에 의해 확립되었다. 감염된 세포 및 감염되지 않은 세포에서의 DT-A 생산은 배양 상청액 및 세포 용해물의 웨스턴 블롯(WB) 분석에 의해 측정되었다. 다양한(0-100ng) 농도에서 시험관 내 전사된 하이잭 RNA(도 14)로 세포를 형질감염시켜 동일한 실험을 반복하였다. SARS-CoV-2 RdRp를 발현하는 안정한 vero 및 jurkat 세포주를 또한 생성하여 하이잭 RNA의 RdRp-특이적 발현을 평가하였다.
결과
[0272] SARS-CoV-2 감염은 시험 AAV 형질도입 48시간 이내에 배양물에서 성공적으로 근절되었고, 이는 세포 영상에서 세포 증식 분석 및 CPE의 부재 및 FACS 분석에 의해 확인되었다(도 16a). 하이잭 RNA 형질감염 24시간 이내에 동일한 결과가 관찰되었다. 테스트 AAV 또는 하이잭 RNA는 감염되지 않은 세포에 영향을 미치지 않았다(도 16b). 유사한 결과가 RdRp 발현 세포주에서 관찰되었고, 이는 가정된 작용 기전을 확인시켜 준다.
결론
[0273] SARS-CoV-2 RdRp와 결합하기 위해 트랜스로 전달되거나 발현된 RNA는 바이러스 기계를 하이재킹하고 감염된 세포에서 급속한 사멸을 유도했지만 감염되지 않은 세포에서는 그렇지 않았다. 하이잭 RNA의 사멸 분자 DT-A로의 번역은 여러 다른 세포주에서 입증된 바와 같이 바이러스 RdRp에 의존하여, 치료의 특이성과 민감성을 확인하였다. 이 새로운 접근 방식은 COVID-19 감염을 근절하기 위한 효과적인 치료법을 개발하는 데 사용될 수 있다.
[0274] 본 발명은 본 명세서에 기술된 특정 실시예에 의해 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본 명세서에 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위에 속하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Gumrukcu, Serhat <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING VIRAL INFECTIONS <130> 147144.00402 <150> 62/893,460 <151> 2019-08-29 <150> 62/968,387 <151> 2020-01-31 <150> 62/976,491 <151> 2020-02-14 <150> 62/985,597 <151> 2020-03-05 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 61 <212> RNA <213> Hepatitis B virus <400> 1 uguucauguc cuacuguuca agccuccaag cugugccuug gguggcuuug gggcauggac 60 a 61 <210> 2 <211> 232 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60 ggaggggtcg gcaattgatc cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120 gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180 gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca gg 232 <210> 3 <211> 1251 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggacgaag cggatcggcg gctcctgcgg cggtgccggc tgcggctggt ggaagagctg 60 caggtggacc agctctggga cgccctgctg agccgcgagc tgttcaggcc ccatatgatc 120 gaggacatcc agcgggcagg ctctggatct cggcgggatc aggccaggca gctgatcata 180 gatctggaga ctcgagggag tcaggctctt cctttgttca tctcctgctt agaggacaca 240 ggccaggaca tgctggcttc gtttctgcga actaacaggc aagcagcaaa gttgtcgaag 300 ccaaccctag aaaaccttac cccagtggtg ctcagaccag agattcgcaa accagaggtt 360 ctcagaccgg aaacacccag accagtggac attggttctg gaggatttgg tgatgtcggt 420 gctcttgaga gtttgagggg aaatgcagat ttggcttaca tcctgagcat ggagccctgt 480 ggccactgcc tcattatcaa caatgtgaac ttctgccgtg agtccgggct ccgcacccgc 540 actggctcca acatcgactg tgagaagttg cggcgtcgct tctcctcgct gcatttcatg 600 gtggaggtga agggcgacct gactgccaag aaaatggtgc tggctttgct ggagctggcg 660 cagcaggacc acggtgctct ggactgctgc gtggtggtca ttctctctca cggctgtcag 720 gccagccacc tgcagttccc aggggctgtc tacggcacag atggatgccc tgtgtcggtc 780 gagaagattg tgaacatctt caatgggacc agctgcccca gcctgggagg gaagcccaag 840 ctctttttca tccaggcctg tggtggggag cagaaagacc atgggtttga ggtggcctcc 900 acttcccctg aagacgagtc ccctggcagt aaccccgagc cagatgccac cccgttccag 960 gaaggtttga ggaccttcga ccagctggac gccatatcta gtttgcccac acccagtgac 1020 atctttgtgt cctactctac tttcccaggt tttgtttcct ggagggaccc caagagtggc 1080 tcctggtacg ttgagaccct ggacgacatc tttgagcagt gggctcactc tgaagacctg 1140 cagtccctcc tgcttagggt cgctaatgct gtttcggtga aagggattta taaacagatg 1200 cctggttgct ttaatttcct ccggaaaaaa cttttcttta aaacatcata a 1251 <210> 4 <211> 1251 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ttatgatgtt ttaaagaaaa gttttttccg gaggaaatta aagcaaccag gcatctgttt 60 ataaatccct ttcaccgaaa cagcattagc gaccctaagc aggagggact gcaggtcttc 120 agagtgagcc cactgctcaa agatgtcgtc cagggtctca acgtaccagg agccactctt 180 ggggtccctc caggaaacaa aacctgggaa agtagagtag gacacaaaga tgtcactggg 240 tgtgggcaaa ctagatatgg cgtccagctg gtcgaaggtc ctcaaacctt cctggaacgg 300 ggtggcatct ggctcggggt tactgccagg ggactcgtct tcaggggaag tggaggccac 360 ctcaaaccca tggtctttct gctccccacc acaggcctgg atgaaaaaga gcttgggctt 420 ccctcccagg ctggggcagc tggtcccatt gaagatgttc acaatcttct cgaccgacac 480 agggcatcca tctgtgccgt agacagcccc tgggaactgc aggtggctgg cctgacagcc 540 gtgagagaga atgaccacca cgcagcagtc cagagcaccg tggtcctgct gcgccagctc 600 cagcaaagcc agcaccattt tcttggcagt caggtcgccc ttcacctcca ccatgaaatg 660 cagcgaggag aagcgacgcc gcaacttctc acagtcgatg ttggagccag tgcgggtgcg 720 gagcccggac tcacggcaga agttcacatt gttgataatg aggcagtggc cacagggctc 780 catgctcagg atgtaagcca aatctgcatt tcccctcaaa ctctcaagag caccgacatc 840 accaaatcct ccagaaccaa tgtccactgg tctgggtgtt tccggtctga gaacctctgg 900 tttgcgaatc tctggtctga gcaccactgg ggtaaggttt tctagggttg gcttcgacaa 960 ctttgctgct tgcctgttag ttcgcagaaa cgaagccagc atgtcctggc ctgtgtcctc 1020 taagcaggag atgaacaaag gaagagcctg actccctcga gtctccagat ctatgatcag 1080 ctgcctggcc tgatcccgcc gagatccaga gcctgcccgc tggatgtcct cgatcatatg 1140 gggcctgaac agctcgcggc tcagcagggc gtcccagagc tggtccacct gcagctcttc 1200 caccagccgc agccggcacc gccgcaggag ccgccgatcc gcttcgtcca t 1251 <210> 5 <211> 232 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 cctgtgttct ggcggcaaac ccgttgcgaa aaagaacgtt cacggcgact actgcactta 60 tatacggttc tcccccaccc tcgggaaaaa ggcggagcca gtacacgaca tcactttccc 120 agtttacccc gcgccacctt ctctaggcac cggatcaatt gccgacccct ccccccaact 180 tctcggggac tgtgggcgat gtgcgctctg cccactgacg ggcaccggag cc 232 <210> 6 <211> 135 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 6 acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa 60 ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt 120 atcatgtctg gctct 135 <210> 7 <211> 135 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 7 agagccagac atgataagat acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg 60 aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag 120 ctgcaataaa caagt 135 <210> 8 <211> 1746 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 8 atgtgttcat gtcctactgt tcaagcctcc aagctgtgcc ttgggtggct ttggggcatg 60 gacaagagcc agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc 120 agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta 180 taagctgcaa taaacaagtt tatgatgttt taaagaaaag ttttttccgg aggaaattaa 240 agcaaccagg catctgttta taaatccctt tcaccgaaac agcattagcg accctaagca 300 ggagggactg caggtcttca gagtgagccc actgctcaaa gatgtcgtcc agggtctcaa 360 cgtaccagga gccactcttg gggtccctcc aggaaacaaa acctgggaaa gtagagtagg 420 acacaaagat gtcactgggt gtgggcaaac tagatatggc gtccagctgg tcgaaggtcc 480 tcaaaccttc ctggaacggg gtggcatctg gctcggggtt actgccaggg gactcgtctt 540 caggggaagt ggaggccacc tcaaacccat ggtctttctg ctccccacca caggcctgga 600 tgaaaaagag cttgggcttc cctcccaggc tggggcagct ggtcccattg aagatgttca 660 caatcttctc gaccgacaca gggcatccat ctgtgccgta gacagcccct gggaactgca 720 ggtggctggc ctgacagccg tgagagagaa tgaccaccac gcagcagtcc agagcaccgt 780 ggtcctgctg cgccagctcc agcaaagcca gcaccatttt cttggcagtc aggtcgccct 840 tcacctccac catgaaatgc agcgaggaga agcgacgccg caacttctca cagtcgatgt 900 tggagccagt gcgggtgcgg agcccggact cacggcagaa gttcacattg ttgataatga 960 ggcagtggcc acagggctcc atgctcagga tgtaagccaa atctgcattt cccctcaaac 1020 tctcaagagc accgacatca ccaaatcctc cagaaccaat gtccactggt ctgggtgttt 1080 ccggtctgag aacctctggt ttgcgaatct ctggtctgag caccactggg gtaaggtttt 1140 ctagggttgg cttcgacaac tttgctgctt gcctgttagt tcgcagaaac gaagccagca 1200 tgtcctggcc tgtgtcctct aagcaggaga tgaacaaagg aagagcctga ctccctcgag 1260 tctccagatc tatgatcagc tgcctggcct gatcccgccg agatccagag cctgcccgct 1320 ggatgtcctc gatcatatgg ggcctgaaca gctcgcggct cagcagggcg tcccagagct 1380 ggtccacctg cagctcttcc accagccgca gccggcaccg ccgcaggagc cgccgatccg 1440 cttcgtccat cctgtgttct ggcggcaaac ccgttgcgaa aaagaacgtt cacggcgact 1500 actgcactta tatacggttc tcccccaccc tcgggaaaaa ggcggagcca gtacacgaca 1560 tcactttccc agtttacccc gcgccacctt ctctaggcac cggatcaatt gccgacccct 1620 ccccccaact tctcggggac tgtgggcgat gtgcgctctg cccactgacg ggcaccggag 1680 cctgttcatg tcctactgtt caagcctcca agctgtgcct tgggtggctt tggggcatgg 1740 acataa 1746 <210> 9 <211> 1191 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 9 atgtgttcat gtcctactgt tcaagcctcc aagctgtgcc ttgggtggct ttggggcatg 60 gacaagagcc agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc 120 agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta 180 taagctgcaa taaacaagtt tagggcaagg cggagccgga ggcgatggcg tgctcggtca 240 ggtgccactt ctggttcttg gcgtcgctgc ggtcctcgcg ggtcagcttg tgctggatga 300 agtgccagtc gggcatcttg cggggcacgg acttggcctt gtacacggtg tcgaactggc 360 agcgcaagcg gccaccgtcc ttcagcagca ggtacatgct cacgtcgccc ttcaagatgc 420 cctgcttggg cacggggatg atcttctcgc aggagggctc ccagttgtcg gtcatcttct 480 tcatcacggg gccgtcggcg gggaagttca cgccgtagaa cttggactcg tggtacatgc 540 agttctcctc cacgctcacg gtgatgtcgg cgttgcagat gcacacggcg ccgtcctcga 600 acaggaagga gcggtcccag gtgtagccgg cggggcagga gttcttgaag tagtcgacga 660 tgtcctgggg gtactcggtg aacacgcggt tgccgtacat gaaggcggcg gacaagatgt 720 cctcggcgaa gggcaagggg ccgccctcca ccacgcacag gttgatggcc tgcttgccct 780 tgaaggggta gccgatgccc tcgccggtga tcacgaactt gtggccgtcc acgcagccct 840 ccatgcggta cttcatggtc atctccttgg tcaggccgtg cttggactgg gccatcctgt 900 gttctggcgg caaacccgtt gcgaaaaaga acgttcacgg cgactactgc acttatatac 960 ggttctcccc caccctcggg aaaaaggcgg agccagtaca cgacatcact ttcccagttt 1020 accccgcgcc accttctcta ggcaccggat caattgccga cccctccccc caacttctcg 1080 gggactgtgg gcgatgtgcg ctctgcccac tgacgggcac cggagcctgt tcatgtccta 1140 ctgttcaagc ctccaagctg tgccttgggt ggctttgggg catggacata a 1191 <210> 10 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 10 cctgcttttg ct 12 <210> 11 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 11 agtagaaaca agg 13 <210> 12 <211> 1292 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 12 agtagaaaca agggtgtttt ttatcattat gatgttttaa agaaaagttt tttccggagg 60 aaattaaagc aaccaggcat ctgtttataa atccctttca ccgaaacagc attagcgacc 120 ctaagcagga gggactgcag gtcttcagag tgagcccact gctcaaagat gtcgtccagg 180 gtctcaacgt accaggagcc actcttgggg tccctccagg aaacaaaacc tgggaaagta 240 gagtaggaca caaagatgtc actgggtgtg ggcaaactag atatggcgtc cagctggtcg 300 aaggtcctca aaccttcctg gaacggggtg gcatctggct cggggttact gccaggggac 360 tcgtcttcag gggaagtgga ggccacctca aacccatggt ctttctgctc cccaccacag 420 gcctggatga aaaagagctt gggcttccct cccaggctgg ggcagctggt cccattgaag 480 atgttcacaa tcttctcgac cgacacaggg catccatctg tgccgtagac agcccctggg 540 aactgcaggt ggctggcctg acagccgtga gagagaatga ccaccacgca gcagtccaga 600 gcaccgtggt cctgctgcgc cagctccagc aaagccagca ccattttctt ggcagtcagg 660 tcgcccttca cctccaccat gaaatgcagc gaggagaagc gacgccgcaa cttctcacag 720 tcgatgttgg agccagtgcg ggtgcggagc ccggactcac ggcagaagtt cacattgttg 780 ataatgaggc agtggccaca gggctccatg ctcaggatgt aagccaaatc tgcatttccc 840 ctcaaactct caagagcacc gacatcacca aatcctccag aaccaatgtc cactggtctg 900 ggtgtttccg gtctgagaac ctctggtttg cgaatctctg gtctgagcac cactggggta 960 aggttttcta gggttggctt cgacaacttt gctgcttgcc tgttagttcg cagaaacgaa 1020 gccagcatgt cctggcctgt gtcctctaag caggagatga acaaaggaag agcctgactc 1080 cctcgagtct ccagatctat gatcagctgc ctggcctgat cccgccgaga tccagagcct 1140 gcccgctgga tgtcctcgat catatggggc ctgaacagct cgcggctcag cagggcgtcc 1200 cagagctggt ccacctgcag ctcttccacc agccgcagcc ggcaccgccg caggagccgc 1260 cgatccgctt cgtccattcc cctgcttttg ct 1292 <210> 13 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 13 agtagaaaca agg 13 <210> 14 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 14 cctgcttttg ct 12 <210> 15 <211> 1292 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 15 aguagaaaca aggguguuuu uuaucauuau gauguuuuaa agaaaaguuu uuuccggagg 60 aaauuaaagc aaccaggcau cuguuuauaa aucccuuuca ccgaaacagc auuagcgacc 120 cuaagcagga gggacugcag gucuucagag ugagcccacu gcucaaagau gucguccagg 180 gucucaacgu accaggagcc acucuugggg ucccuccagg aaacaaaacc ugggaaagua 240 gaguaggaca caaagauguc acugggugug ggcaaacuag auauggcguc cagcuggucg 300 aagguccuca aaccuuccug gaacggggug gcaucuggcu cgggguuacu gccaggggac 360 ucgucuucag gggaagugga ggccaccuca aacccauggu cuuucugcuc cccaccacag 420 gccuggauga aaaagagcuu gggcuucccu cccaggcugg ggcagcuggu cccauugaag 480 auguucacaa ucuucucgac cgacacaggg cauccaucug ugccguagac agccccuggg 540 aacugcaggu ggcuggccug acagccguga gagagaauga ccaccacgca gcaguccaga 600 gcaccguggu ccugcugcgc cagcuccagc aaagccagca ccauuuucuu ggcagucagg 660 ucgcccuuca ccuccaccau gaaaugcagc gaggagaagc gacgccgcaa cuucucacag 720 ucgauguugg agccagugcg ggugcggagc ccggacucac ggcagaaguu cacauuguug 780 auaaugaggc aguggccaca gggcuccaug cucaggaugu aagccaaauc ugcauuuccc 840 cucaaacucu caagagcacc gacaucacca aauccuccag aaccaauguc cacuggucug 900 gguguuuccg gucugagaac cucugguuug cgaaucucug gucugagcac cacuggggua 960 agguuuucua ggguuggcuu cgacaacuuu gcugcuugcc uguuaguucg cagaaacgaa 1020 gccagcaugu ccuggccugu guccucuaag caggagauga acaaaggaag agccugacuc 1080 ccucgagucu ccagaucuau gaucagcugc cuggccugau cccgccgaga uccagagccu 1140 gcccgcugga uguccucgau cauauggggc cugaacagcu cgcggcucag cagggcgucc 1200 cagagcuggu ccaccugcag cucuuccacc agccgcagcc ggcaccgccg caggagccgc 1260 cgauccgcuu cguccauucc ccugcuuuug cu 1292 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 16 agtagaaaca agggtgtttt ttatcatta 29 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 17 cattcccctg cttttgct 18 <210> 18 <211> 761 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 18 agtagaaaca agggtgtttt ttatcattac ttgtacagct cgtccatgcc gagagtgatc 60 ccggcggcgg tcacgaactc cagcaggacc atgtgatcgc gcttctcgtt ggggtctttg 120 ctcagggcgg actgggtgct caggtagtgg ttgtcgggca gcagcacggg gccgtcgccg 180 atgggggtgt tctgctggta gtggtcggcg agctgcacgc tgccgtcctc gatgttgtgg 240 cggatcttga agttcacctt gatgccgttc ttctgcttgt cggccatgat atagacgttg 300 tggctgttgt agttgtactc cagcttgtgc cccaggatgt tgccgtcctc cttgaagtcg 360 atgcccttca gctcgatgcg gttcaccagg gtgtcgccct cgaacttcac ctcggcgcgg 420 gtcttgtagt tgccgtcgtc cttgaagaag atggtgcgct cctggacgta gccttcgggc 480 atggcggact tgaagaagtc gtgctgcttc atgtggtcgg ggtagcggct gaagcactgc 540 acgccgtagg tcagggtggt cacgagggtg ggccagggca cgggcagctt gccggtggtg 600 cagatgaact tcagggtcag cttgccgtag gtggcatcgc cctcgccctc gccggacacg 660 ctgaacttgt ggccgtttac gtcgccgtcc agctcgacca ggatgggcac caccccggtg 720 aacagctcct cgcccttgct caccattccc ctgcttttgc t 761 <210> 19 <211> 265 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 19 attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60 gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact 120 cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc 180 ttctgcaggc tgcttacggt ttcgtccgtg ttgcagccga tcatcagcac atctaggttt 240 cgtccgggtg tgaccgaaag gtaag 265 <210> 20 <211> 229 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 20 caatctttaa tcagtgtgta acattaggga ggacttgaaa gagccaccac attttcaccg 60 aggccacgcg gagtacgatc gagtgtacag tgaacaatgc tagggagagc tgcctatatg 120 gaagagccct aatgtgtaaa attaatttta gtagtgctat ccccatgtga ttttaatagc 180 ttcttaggag aatgacaaaa aaacaatctt gctaaacact gtcttcatg 229 <210> 21 <211> 603 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 21 atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 60 taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 120 tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagggt tttatagtac cgacaataaa 180 tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 240 gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 300 gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 360 acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 420 ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta 480 agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 540 gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg tagctcattg 600 taa 603 <210> 22 <211> 1097 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 22 attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60 gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact 120 cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc 180 ttctgcaggc tgcttacggt ttcgtccgtg ttgcagccga tcatcagcac atctaggttt 240 cgtccgggtg tgaccgaaag gtaagatggg cgctgatgat gttgttgatt cttctaaatc 300 ttttgtgatg gaaaactttt cttcgtacca cgggactaaa cctggttatg tagattccat 360 tcaaaaaggt atacaaaagc caaaatctgg tacacaagga aattatgacg atgattggaa 420 agggttttat agtaccgaca ataaatacga cgctgcggga tactctgtag ataatgaaaa 480 cccgctctct ggaaaagctg gaggcgtggt caaagtgacg tatccaggac tgacgaaggt 540 tctcgcacta aaagtggata atgccgaaac tattaagaaa gagttaggtt taagtctcac 600 tgaaccgttg atggagcaag tcggaacgga agagtttatc aaaaggttcg gtgatggtgc 660 ttcgcgtgta gtgctcagcc ttcccttcgc tgaggggagt tctagcgttg aatatattaa 720 taactgggaa caggcgaaag cgttaagcgt agaacttgag attaattttg aaacccgtgg 780 aaaacgtggc caagatgcga tgtatgagta tatggctcaa gcctgtgcag gaaatcgtgt 840 caggcgatca gtaggtagct cattgtaaca atctttaatc agtgtgtaac attagggagg 900 acttgaaaga gccaccacat tttcaccgag gccacgcgga gtacgatcga gtgtacagtg 960 aacaatgcta gggagagctg cctatatgga agagccctaa tgtgtaaaat taattttagt 1020 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cctagatgtg ctgatgatcg gctgcaacac ggacgaaacc 900 gtaagcagcc tgcagaagat agacgagtta ctcgtgtcct gtcaacgaca gtaattagtt 960 attaattata ctgcgtgagt gcactaagca tgcagccgag tgacagccac acagatttta 1020 aagttcgttt agagaacaga tctacaagag atcgaaagtt ggttggtttg ttacctggga 1080 aggtataaac ctttaat 1097

Claims (52)

  1. 제1 및 제2 바이러스 전사 인식 신호가 플랭크된(flanked), 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 디프테리아 독소 A(또는 이들의 단편), 또는 이들의 임의의 조합을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자;
    제1 바이러스 전사 인식 신호의 제1 프로모터 상류(5'); 및
    케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 디프테리아 독소 A(또는 이들의 단편), 또는 이들의 임의의 조합을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자의 5'에 인접한 제2 프로모터;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 음성 가닥 핵산 분자는 음성 센스 RNA, 음성 센스 DNA, 비-코딩, 음성 센스 RNA를 발현하는 단일 또는 이중 가닥 DNA, 또는 이들의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 및 제2 바이러스 전사 인식 신호는 음성 가닥 바이러스, RNA 역전사 바이러스, 또는 DNA 역전사 바이러스로부터 선택된 바이러스로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 핵산 분자는 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 또는 이들의 조합을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자의 폴리 A 꼬리 하류(3')를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포자멸사 유도 단백질은 BAX, BID, BAK, BAD, 카스파제 2, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 10, 카스파제 11, 카스파제 12, 시토크롬 C, SMAC, 및 세포자멸사-유도 인자, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 프로모터는 TBG(티록신 결합 글로불린), 알부민 프로모터 및/또는 강화 요소, AFP(알파-태아단백질) 프로모터, AAT(알파-1-항트립신) 프로모터, ApoE(아포지단백질 E) 프로모터, 또는 PEPCK(포스포에놀피루베이트 카복시키나제) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 강력한 유비쿼터스 프로모터 또는 간-조직-특이적 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 프로모터는 신장 인자 1알파 결합 서열(EFS)을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 케모카인은 CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, XCL1, XCL2, 및 CX3CL1로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-15, IL-2, IL-8, IL-10, IL-12, IL-6, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, CD40L, Mig, 및 Crg-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  10. 제3항에 있어서, 상기 바이러스 전사 인식 신호는 SEQ ID NO:1에 기재된 입실론 인식 신호 또는 SEQ ID: 25, SEQ ID: 26, SEQ ID: 28, 및 SEQ ID: 30으로 이루어진 군에서 선택되는 코로나 바이러스 인식 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  11. 제3항에 있어서, 상기 바이러스는 코로나 바이러스, B형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 수포성 구내염 인디애나 바이러스, 광견병 바이러스, 소 유행 열 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 부냠웨라 바이러스, 한탄 바이러스, 나이로비 양 병 바이러스, 모래파리 열 시칠리아 바이러스, 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 C, 토고토 바이러스, 쥐 유선 종양 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 메이슨-화이자 원숭이 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 1, 인간 스푸마바이러스, 오리 B형 간염 바이러스, 및 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 바이러스 폴리머라제, 역전사효소, 캡시드, 외피, 패키징 신호, 또는 전위 모티프에 대한 서열(코딩 또는 비코딩)을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 상기 벡터는 포유동물 세포로의 전달을 위한 전달 벡터 또는 비히클을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 상기 벡터 또는 비히클은 VLP, 아데노-연관 바이러스(AAV), 리포솜, 나노입자, 미셀, 중합체 소포, 또는 폴리머좀을 포함하는 것을 특징으로 하는 전달 벡터 또는 비히클.
  16. 제1항 내지 제12항의 재조합 핵산 서열 중 임의의 하나 또는 제13항 내지 제15항의 벡터 중 임의의 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  17. B형 간염 바이러스 캡시드 또는 D형 간염 바이러스 캡시드로부터의 캡시드 단백질 또는 코로나바이러스 융합 단백질에 융합된 선택적 전위 모티프(TLM);
    제1 및 제2 바이러스 전사 인식 신호가 플랭크된(flanked), 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 디프테리아 독소 A(또는 이들의 단편), 또는 이들의 조합을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자;
    제1 바이러스 전사 인식 신호의 제1 프로모터 상류(5'); 및
    케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 디프테리아 독소 A(또는 이들의 단편), 또는 이들의 조합을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자의 5'에 인접한 제2 프로모터;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 복제 불능 바이러스-유사 입자(VLP).
  18. 제1 및 제2 표적 바이러스 전사 인식 신호가 플랭크된(flanked), 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 디프테리아 독소 A(또는 이들의 단편), 또는 이들의 임의의 조합을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자;
    제1 바이러스 전사 인식 신호의 제1 프로모터 상류(5'); 및
    케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 디프테리아 독소 A(또는 이들의 단편), 또는 이들의 임의의 조합을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자의 5'에 인접한 제2 프로모터;
    를 포함하는 복제 불능 바이러스-유사 입자(VLP)로서,
    상기 VLP는 표적 바이러스에 감염된 세포에 대한 친화성을 나타내는 것을 특징으로 하는 복제 불능 바이러스-유사 입자(VLP).
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 음성 가닥 핵산 분자는 음성 센스 RNA, 음성 센스 DNA, 비-코딩, 음성 센스 RNA를 발현하는 단일 또는 이중 가닥 DNA, 또는 이들의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 복제 불능 바이러스-유사 입자.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 불능 바이러스-유사 입자(VLP)는 케모카인, 사이토카인, 세포자멸사 유도 단백질, 또는 이들의 조합을 암호화하는 음성 가닥 핵산 분자 또는 pgRNA 핵산 분자의 폴리 A 꼬리 하류(3')를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 복제 불능 바이러스-유사 입자.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 프로모터는 TBG(티록신 결합 글로불린), 알부민 프로모터 및/또는 강화 요소, AFP(알파-태아단백질) 프로모터, AAT(알파-1-항트립신) 프로모터, ApoE(아포지단백질 E) 프로모터, 또는 PEPCK(포스포에놀피루베이트 카복시키나제) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 강력한 유비쿼터스 프로모터 또는 간-조직-특이적 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 복제 불능 바이러스-유사 입자.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 프로모터는 신장 인자 1알파 결합 서열(EFS)을 포함하는 것을 특징으로 하는 복제 불능 바이러스-유사 입자.
  23. 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 전사 인식 신호는 음성 가닥 바이러스, RNA 역전사 바이러스, 또는 DNA 역전사 바이러스로부터 선택된 바이러스로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복제 불능 바이러스-유사 입자.
  24. 제23항에 있어서, 상기 바이러스 전사 인식 신호는 입실론 인식 신호(SEQ ID NO:1) 또는 코로나바이러스의 바이러스 인식 서열, 예를 들어 SEQ ID: 25 또는 SEQ ID: 26을 포함하는 것을 특징으로 하는 복제 불능 바이러스-유사 입자.
  25. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포자멸사 유도 단백질은 BAX, BID, BAK, BAD, 카스파제 2, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 10, 카스파제 11, 카스파제 12, 시토크롬 C, SMAC, 및 세포자멸사-유도 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복제 불능 바이러스-유사 입자.
  26. 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 케모카인은 CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CXCL1, CXCL2, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, XCL1, XCL2, 및 CX3CL1로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복제 불능 바이러스-유사 입자.
  27. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-15, IL-2, IL-8, IL-10, IL-12, IL-6, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, CD40L, Mig, 및 Crg-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 복제 불능 바이러스-유사 입자.
  28. 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 B형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 수포성 구내염 인디애나 바이러스, 광견병 바이러스, 소 유행 열 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 부냠웨라 바이러스, 한탄 바이러스, 나이로비 양 병 바이러스, 모래파리 열 시칠리아 바이러스, 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 C, 토고토 바이러스, 쥐 유선 종양 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 메이슨-화이자 원숭이 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 1, 인간 스푸마바이러스, 오리 B형 간염 바이러스, 및 이들의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 복제 불능 바이러스-유사 입자.
  29. 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 바이러스 캡시드, 폴리머라제, 역전사효소, 외피, 패키징 신호, 또는 전위 모티프에 대한 서열(코딩 또는 비코딩)을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 복제 불능 바이러스-유사 입자.
  30. 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항의 복제 불능 바이러스-유사 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  31. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자, 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 벡터, 제16항 또는 제30항의 약학 조성물, 또는 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항의 복제 불능 바이러스-유사 입자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 이를 필요로 하는 대상체에서 바이러스 감염을 치료하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 바이러스 감염은 볼티모어 분류 IV, V, VI, 또는 VII하에 분류된 바이러스로부터의 감염을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 바이러스 감염은 코로나바이러스, B형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스, 수포성 구내염 인디애나 바이러스, 광견병 바이러스, 소 유행 열 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 부냠웨라 바이러스, 한탄 바이러스, 나이로비 양 병 바이러스, 모래파리 열 시칠리아 바이러스, 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 C, 토고토 바이러스, 쥐 유선 종양 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 메이슨-화이자 원숭이 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 1, 인간 스푸마바이러스, 오리 B형 간염 바이러스, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터의 감염을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 바이러스 감염은 필로바이러스, 파라믹소바이러스, 모빌리바이러스, 루불라바이러스(rubulavirus), 뉴모바이러스, 수포성바이러스, 리사바이러스, 에페메로바이러스(ephemerovirus), 아레나바이러스, 분야바이러스, 한타바이러스, 나이로바이러스, 플레보바이러스, 오르토헤파드나바이러스(Orthohepadnavirus), 아비헤파드나바이러스(Avihepadnavirus), 포유동물 B형 레트로바이러스, 포유동물 C형 레트로바이러스, 조류 C형 레트로바이러스, D형 레트로바이러스, BLV-HTLV 레트로바이러스, 렌티바이러스, 스푸마바이러스, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스로부터의 감염을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제31항에 있어서, 상기 투여 시 핵산 분자, 벡터, 약학 조성물, 또는 복제 불능 바이러스-유사 입자는 간 세포로 진입하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 핵산 분자, 벡터, 약학 조성물, 또는 복제 불능 바이러스-유사 입자는 투여 시 핵산 분자를 간 세포에 전달하고 핵산 분자는 간 세포에서 발현되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 급성, 만성, 또는 잠복성 바이러스 감염을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 바이러스 감염을 유발하는 바이러스에 감염된 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 바이러스 감염을 유발하는 바이러스에 감염된 세포에서 세포자멸사를 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자, 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제16항 또는 제30항의 약학 조성물, 또는 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항의 복제 불능 바이러스-유사 입자와 대상체를 접촉시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 이를 필요로 하는 대상체에서 바이러스에 감염된 세포에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  41. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자, 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제16항 또는 제30항의 약학 조성물, 또는 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항의 복제 불능 바이러스-유사 입자와 대상체를 접촉시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 이를 필요로 하는 대상체에서 바이러스에 감염된 세포에 대한 세포자멸사 반응을 유도하는 방법.
  42. 제31항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 코로나바이러스, 인플루엔자, HBV, HDV, A형 간염 바이러스(HAV), C형 간염 바이러스(HCV), 또는 이들의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자, 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 벡터, 제16항 또는 제30항의 약학 조성물, 또는 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항의 복제 불능 바이러스-유사 입자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 대상체에서 B형 간염, 인플루엔자, 또는 코로나바이러스 감염을 치료하는 방법.
  44. 제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 적어도 하나의 항바이러스제, HBV 폴리머라제 억제제, 인터페론, TLR 조절제, 예컨대 TLR-7 효능제 또는 TLR-9 효능제, 치료 백신, 특정 세포 바이러스 RNA 센서의 면역 활성화제, 바이러스 침입 억제제, 바이러스 성숙 억제제, 별개의 캡시드 어셈블리 조절제, 별개의 또는 알려지지 않은 기전의 항바이러스 화합물, 및 이들의 임의의 조합을 투여하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 방법은 적어도 하나의 항바이러스제 3TC, FTC, L-FMAU, 인터페론, 아데포비르 디피복실, 엔테카비르, 텔비부딘(L-dT), 발토르시타빈(3'-발리닐 L-dC), .베타.-D-디옥솔라닐-구아닌(DXG), .베타.-D-디옥솔라닐-2,6-디아미노퓨린(DAPD), .베타.-D-디옥솔라닐-6-클로로퓨린(ACP), 팜시클로비르, 펜시클로비르, 로부카비르, 간시클로비르, 리바비린, 테노포비르, 빅테그라비르, 엠트리시타빈, 빅타비, 및 이들의 임의의 조합을 투여하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자, 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제16항 또는 제30항의 약학 조성물, 또는 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항의 복제 불능 바이러스-유사 입자와 대상체를 접촉시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 이를 필요로 하는 대상체에서 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포에 대한 세포자멸사 반응을 유도하는 방법.
  47. 제31항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 인플루엔자 C, 또는 이들의 임의의 조합인 인플루엔자 바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자, 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제16항 또는 제30항의 약학 조성물, 또는 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항의 복제 불능 바이러스-유사 입자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 대상체에서 인플루엔자를 치료하는 방법.
  49. 제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 적어도 하나의 항바이러스제 3TC, FTC, L-FMAU, 인터페론, 아데포비르 디피복실, 엔테카비르, 텔비부딘(L-dT), 발토르시타빈(3'-발리닐 L-dC), .베타.-D-디옥솔라닐-구아닌(DXG), .베타.-D-디옥솔라닐-2,6-디아미노퓨린(DAPD), .베타.-D-디옥솔라닐-6-클로로퓨린(ACP), 팜시클로비르, 펜시클로비르, 로부카비르, 간시클로비르, 리바비린, 테노포비르, 빅테그라비르, 엠트리시타빈, 빅타비, 및 이들의 임의의 조합을 투여하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자, 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제16항 또는 제30항의 약학 조성물, 또는 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항의 복제 불능 바이러스-유사 입자와 대상체를 접촉시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 이를 필요로 하는 대상체에서 코로나바이러스에 감염된 세포에 대한 세포자멸사 반응을 유도하는 방법.
  51. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 재조합 핵산 분자, 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 벡터, 또는 제16항 또는 제30항의 약학 조성물, 또는 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항의 복제 불능 바이러스-유사 입자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 대상체에서 코로나바이러스 감염을 치료하는 방법.
  52. 제31항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 매주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 매월 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 4개월마다 1회, 5개월마다 1회, 6개월마다 1회, 또는 7개월마다 1회, 또는 8개월마다 1회, 또는 9개월마다 1회, 또는 10개월마다 1회, 또는 11개월마다, 또는 유지 치료로서 1년에 1회, 또는 환자가 안정하거나 검출할 수 없는 질병을 달성하는 데 필요한 기간을 포함하여 주기적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
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