JP2023548758A - Ｅｎｐｐ１またはｅｎｐｐ３の肝臓特異的生成 - Google Patents

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Abstract

本開示は、特に、インビボでのＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の発現のためのベクターおよび対象における石灰化および骨化の疾患を治療する方法を提供する。

Description

相互参照
本出願は、以下の仮出願、２０２０年１０月８日に出願された米国特許出願第６３／０８９，５１５号、２０２１年３月２４日に出願された米国特許出願第６３／１６５，６５０号、および２０２１年９月２４日に出願された米国特許出願第６３／２４８，３３９号に対する優先権を主張するものであり、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は概して、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードする核酸を哺乳動物に提供することによる、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の欠損に関与する疾患の治療に関する。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２１年１０月８日に作成された前述のＡＳＣＩＩコピーは、４４２７－１１３０４＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、４６６．５３９バイトのサイズである。
ＥＮＰＰ１（ＰＣ－１としても知られる）は、骨芽細胞および軟骨細胞の鉱質沈着基質小胞上に位置する２型細胞外膜結合糖タンパク質であり、細胞外ヌクレオチド（主にＡＴＰ）をアデノシンモノホスフェート（ＡＭＰ）およびピロホスフェート（ＰＰｉ）に加水分解する。ＰＰｉは、発生期のヒドロキシアパタイト（ＨＡ）結晶に結合することによって異所性組織石灰化の強力な阻害剤として機能し、それによって、これらの結晶の将来の成長を防止する。ＥＮＰＰ１が、ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）の加水分解を介してＰＰｉを生成し、進行性強直タンパク質（ＡＮＫ）が、細胞内ＰＰｉを細胞外空間に輸送し、組織非特異性アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＰ）が、ＰＰｉのＰｉへの直接加水分解を介してＰＰｉを除去する。ＷＯ ２０１１／１１３０２７－Ｑｕｉｎｎ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ２０１２／１２５１８２ －Ｑｕｉｎｎ ｅｔ ａｌ， ＷＯ ２０１６／１００８０３ －Ｑｕｉｎｎ ｅｔ ａｌ および ＷＯ ２０１７／２１８７８６ －Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．がＮＰＰ１について記載している。
ＥＮＰＰ１のようなＥＮＰＰ３はまた、ホスホジエステラーゼＩ／ヌクレオチドピロホスファターゼ酵素ファミリーに属する。これらの酵素はＩＩ型膜貫通タンパク質であり、デオキシヌクレオチド、ＮＡＤ、およびヌクレオチド糖を含む様々な分子のホスホジエステルおよびホスホスルフェートの結合の切断を触媒する。ＥＮＰＰ１は、幼児に発生し、かつ広範な動脈石灰化を伴う重篤な疾患であるＧＡＣＩ（幼児の全身性動脈石灰化）に対するマウスモデルにおいて、全身性動脈石灰化を低減するなど、異所性の組織石灰化の特定の疾患の治療に効果的であることが示されている（Ａｌｂｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．１０００６）。
発明の概要
一態様では、本開示は、（ａ）肝臓特異的プロモーターと、（ｂ）エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチドの触媒ドメインまたはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）ポリペプチドの触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列と、を含む組み換え核酸を提供する。
組み換え核酸の一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列が、可溶性ＥＮＰＰ１または可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする。
組み換え核酸の一部の実施形態では、前述の該核酸は、前述のコードされたポリペプチドを発現することができるベクターまたはプラスミドを含む。
組み換え核酸の一部の実施形態では、前述のベクターはウイルスベクターである。
組み換え核酸がベクターにより哺乳類細胞中に伝達される一部の実施形態では、前述のベクターはウイルスベクターである。
組み換え核酸がベクターにより哺乳類細胞中に伝達される一部の実施形態では、前述のベクターは非ウイルスベクターである。
組み換え核酸の一部の実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
前述の組み換え核酸の一部の実施形態では、前述の核酸はアズロシジンシグナルペプチドをコードし、前述のシグナルペプチドは前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドと動作可能に関連付けられている、
任意の前述の組み換え核酸の一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドおよび異種タンパク質を含むＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードする。
組み換え核酸の一部の実施形態では、前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述のＥＮＰＰ１融合タンパク質またはＥＮＰＰ３融合タンパク質は、異種タンパク質を含まないＥＮＰＰ１ポリペプチドの循環半減期と比較して、哺乳動物において循環半減期が増加する。
組み換え核酸の一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述の異種タンパク質は、イムノグロブリン結晶化可能断片（Ｆｃ）ポリペプチドまたはアルブミンポリペプチドである。
組み換え核酸の一部の実施形態では、前述のヌクレオチド配列によりコードされる前述のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質は、前述の融合タンパク質のアミノ末端からカルボキシ末端の順序で、前述のＥＮＰＰ１または前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドおよび前述のＦｃポリペプチドまたは前述のアルブミンポリペプチドを含む。
任意の組み換え核酸の一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドである。
組み換え核酸の一部の実施形態では、前述のコードされたＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸を含む。
組み換え核酸の一部の実施形態では、前述のコードされたＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドは、バリアントＩｇＧ Ｆｃである。
組み換え核の一部の実施形態では、前述のバリアントＦｃポリペプチドは、アミノ酸置換、ＥＵ番号によるＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ、を含む。
組み換え核酸の一部の実施形態では、前述のコードされたバリアントＦｃポリペプチドは、配列番号９５のアミノ酸８５３－１０７９を含む。
前述の組み換え核酸の一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸９９～９２５をコードする。
組み換え核酸の一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、バリアントの前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする。
組み換え核酸の一部の実施形態では、前述のコードされたバリアントＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１に対する３３２位のアミノ酸置換をコードする配列を含む。
組み換え核酸の一部の実施形態では、前述の配列番号１に対する３３２位のアミノ酸置換をコードする前述の配列は、Ｉ３３２Ｔを含む。
組み換え核酸の一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号９５のアミノ酸２１～８４７をコードする配列を含む。
組み換え核酸の一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号９５のアミノ酸２０～８４７をコードする。
組み換え核酸の一部の実施形態では、前述のコードされたＥＮＰＰ１融合タンパク質は、前述のコードされたＥＮＰＰ１ポリペプチドおよび前述のコードされた異種ポリペプチドとを連結するタンパク質リンカーをコードする配列を含む。
組み換え核酸の一部の実施形態では、前述のコードされたタンパク質リンカーは、配列番号９４（ＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を含む。
組み換え核酸の一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号９５のアミノ酸２１～１０７９を含む。
組み換え核酸の一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号９５のアミノ酸２０～１０７９を含む。
別の態様では、本開示は、（ａ）肝臓特異的プロモーターと、（ａ）エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチドのまたはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、を含むウイルスベクターを提供する。
一部の実施形態では、前述の肝臓特異的プロモーターが、肝臓プロモーター１（ＬＰ１）およびハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）からなる群から選択される、任意の前述の組み換え核酸、または任意の前述のウイルスベクター。
ウイルスベクターの一部の実施形態では、ベクターは、ポリアデニル化信号をコードする配列を含む。
ウイルスベクターの一部の実施形態では、ベクターは、アズロシジンシグナルペプチドであるシグナルペプチドをコードする。
ウイルスベクターの一部の実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
ウイルスベクターの一部の実施形態では、前述の血清型を有するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ－ｒｈ７４からなる群から選択される血清型を有する。
一部の実施形態では、任意の前述のウイルスベクターは、ウイルスベクターは任意の前述の核酸を含む。
一部の実施形態では、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の触媒ドメインをコードする前述の組み換え核酸の細胞への送達は、ウイルスベクターを使用して行われる。
一部の実施形態では、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の触媒ドメインをコードする前述の組み換え核酸の細胞への送達は、非ウイルスベクターを使用して行われる。
一部の実施形態では、前述の組み換え核酸の細胞への送達は、弾道ＤＮＡ、エレクトロポレーション、ソノポレーション、フォトポレーション、マグネトフェクション、ハイドロポレーションのうちの一つ以上の使用を伴う。
一部の実施形態では、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の触媒ドメインをコードする前述の組み換え核酸を含む非ウイルスベクターの細胞内への送達は、ＤＮＡ／カチオン性脂質（リポプレックス）、ＤＮＡ／カチオン性ポリマー（ポリプレックス）、ＤＮＡ／カチオン性ポリマー／カチオン性脂質（リポポリプレックス）、脂質ナノ粒子（ＬＰＮ）、イオン化可能な脂質、リピドイド、ペプチド系ベクター、およびポリマー経ベクターのうちの一つ以上の使用を伴う。
一部の実施形態では、前述の組み換え核酸の送達に使用される非ウイルスベクターは、リポプレックス、ポリプレックス、リポポリプレックス、イオン化可能な脂質、リピドイド、脂質ナノ粒子（ＬＰＮ）、ペプチド系ベクター、およびポリマー系ベクターからなる群から選択される。
一部の実施形態では、前述の組み換え核酸の送達に使用される非ウイルスベクターは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。
一部の実施形態では、前述の組み換え核酸の送達に使用されるＬＮＰは、安定性強化部分で被覆および／またはコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、ＬＮＰの安定性強化部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
一部の実施形態では、前述の組み換え核酸の送達に使用されるＬＮＰは、標的部分で被覆および／またはコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、前述の組み換え核酸の送達に使用されるＬＮＰは、一つ以上の標的部分とコンジュゲートされ、標的部分は、鉄飽和トランスフェリン（Ｔｆ）、葉酸、アルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）、およびアニサミドからなる群から選択される。
一部の実施形態では、前述の組み換え核酸の送達に使用されるＬＮＰは、ｐＨ感受性リンカーとコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、前述の組み換え核酸の送達に使用されるＬＮＰは、ｐＨ感受性リンカーとコンジュゲートされ、ｐＨ感受性リンカーは、ジオルトエステル、オルトエステル、ビニルエーテル、ホスホルアミデート、ヒドラジン、およびベータチオプロピオネートからなる群から選択される。
一部の実施形態では、前述の組み換え核酸の送達に使用されるＬＮＰは、肝臓に組み換え核酸を特異的に送達するために、標的部分で改変される。
一部の実施形態では、前述の組み換え核酸の肝臓への送達に使用されるＬＮＰは、ビタミンＡ結合リポソームである。
一部の実施形態では、前述の組み換え核酸の送達に使用されるＬＮＰは、コラーゲンＶＩ型受容体、マンノース－６－ホスフェート受容体、およびガラクトース受容体からなる群から選択される特異的受容体を標的とするリガンドとコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、前述の組み換え核酸の送達に使用される非ウイルスベクターは、ペプチド系ベクターである。
一部の実施形態では、前述の組み換え核酸の送達に使用される非ウイルスベクターは、ポリマー系ベクターである。
一部の実施形態では、ポリマー系ベクターは、天然および合成ポリマーからなる群から選択される。
一部の実施形態では、ポリマー系ベクターは天然であり、タンパク質、ペプチド、または多糖類から選択される。
一部の実施形態では、ポリマー系ベクターは、キトサンである。
一部の実施形態では、ポリマー系ベクターは合成であり、タンパク質、ペプチド、または多糖類から選択される。
一部の実施形態では、ポリマー系ベクターは合成であり、ポリエチレン鉱物（ＰＥＩ）、デンドリマー、およびポリホスホエステルから選択される。
さらに別の態様では、本開示は、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチドのまたはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え核酸を含む非ウイルスベクターを特徴とする。ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、本明細書に記載される任意のＥＮＰＰ１ポリペプチドであってもよい。ＥＮＰＰ３ポリペプチドは、本明細書に記載される任意のＥＮＰＰ３ポリペプチドであってもよい。一部の実施形態では、核酸は肝臓特異的プロモーター配列をさらに含む。
別の態様では、本開示はまた、前述の任意の組み換えウイルスベクターを取得する方法を提供し、本方法は、
ｉ．核酸を含む細胞を提供するステップと、
ｉｉ．ウイルスの組立に適切な条件下に細胞を維持するステップと、
ｉｉｉ．細胞によって産生されるウイルスベクターを精製するステップと、を含む。
一部の実施形態では、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質を哺乳動物に提供する方法は、任意の前述のウイルスベクターを前述の哺乳動物に投与することを含む。
別の態様では、本開示は、ウイルスベクターの任意の一つおよび生理学的に適合する担体を含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、疾患の進行の予防または減少を必要とする哺乳動物における疾患の進行を予防または減少させる方法を提供し、方法は、前述の哺乳動物に、治療有効量の医薬組成物を投与することを含み、疾患は、Ｘ連鎖性低リン血症（ＸＬＨ）、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、ミネラル骨障害（ＭＢＤ）、血管石灰化、軟部組織の病理学的石灰化、軟部組織の病理学的骨化、乳児の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、および後縦靱帯の骨化（ＯＰＬＬ）からなる群から選択され、前述の哺乳動物における前述の疾患が予防されるまたはその進行が低減される。
別の態様では、本開示は、任意の前述の核酸を含む細胞を提供する。
関連の態様では、本開示は、病理学的石灰化または病理学的骨化の疾患または障害の治療または予防を必要とする対象において病理学的石灰化または病理学的骨化の疾患または障害の治療または予防する方法を提供し、方法は、対象に、治療有効量の任意の前述のウイルスベクター、前述の方法によって産生されるウイルスベクター、または医薬組成物を投与し、それによって前述の疾患または障害を治療または予防することを含む。
別の態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１タンパク質欠損を有する対象を治療する方法を提供し、本方法は、対象に、治療有効量の任意の前述のウイルスベクター、前述の任意の方法によって産生されるウイルスベクター、または医薬組成物を投与し、それによって前述の対象を治療することを含む。
方法の一部の実施形態では、前述の疾患または障害または前述のＥＮＰＰ１タンパク質欠損は、前述の対象におけるＮＰＰ１遺伝子の機能喪失変異またはＡＢＣＣ６遺伝子の機能喪失変異と関連する。
方法の一部の実施形態では、前述のウイルスベクターは、組み換えＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする。
方法の一部の実施形態では、前述のウイルスベクターは、組み換えＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする。
ＥＮＰＰ１タンパク質欠損を有する対象を治療する方法の一部の実施形態では、方法は、治療有効量の前述のウイルスベクター、前述の任意の方法によって産生されるウイルスベクター、または医薬組成物を対象に投与することを含み、それによって前述の対象を治療する。
方法の一部の実施形態では、前述の疾患または障害、または前述のＥＮＰＰ１タンパク質欠損は、前述の対象におけるＮＰＰ１遺伝子の機能喪失変異、またはＡＢＣＣ６遺伝子の機能喪失変異と関連する。
方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターまたは医薬組成物は、対象の１×１０１２～１×１０１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。
方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターまたは医薬組成物は、対象の１×１０１３～１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。
方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターまたは医薬組成物は、対象の５×１０１１～５×１０１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。
方法の一部の実施形態では、前述のウイルスベクターまたは医薬組成物の対象への投与は、前述の対象において、血漿ピロホスフェート（ＰＰｉ）および／または血漿ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３濃度を増加させる。
方法の一部の実施形態では、対象または哺乳動物から得られた生物学的試料において、（ｉ）ピロホスフェートの濃度、（ｉｉ）ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の発現レベル、および（ｉｉｉ）ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の酵素活性の一つ以上のパラメータを検出または測定することをさらに含む。
方法の一部の実施形態では、検出または測定は、ウイルスベクターまたは医薬組成物を投与する前に起こる。別の態様では、本開示は、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）またはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）を含む組み換えポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の任意の組み換えポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを提供する。
一部の実施形態では、組み換えポリヌクレオチドは、ヒトＥＮＰＰ１またはヒトＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする。このため、本開示はまた、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）またはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）を含む組み換えポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを提供する。
本明細書に記載される任意のポリヌクレオチドまたはウイルスベクターの一部の実施形態では、組み換えポリペプチドは、ＥＮＰＰ１融合ポリペプチドである。
本明細書に記載される任意のポリヌクレオチドまたはウイルスベクターの一部の実施形態では、組み換えポリペプチドは、ＥＮＰＰ３融合ポリペプチドである。
本明細書に記載される任意のポリヌクレオチドまたはウイルスベクターの一部の実施形態では、ＥＮＰＰ１融合ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドまたはＥＮＰＰ１－アルブミン融合ポリペプチドである。
本明細書に記載される任意のポリヌクレオチドまたはウイルスベクターの一部の実施形態では、ＥＮＰＰ３融合ポリペプチドは、ＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合ポリペプチドまたはＥＮＰＰ３－アルブミン融合ポリペプチドである。
本明細書に記載される任意のポリヌクレオチドまたはウイルスベクターの一部の実施形態では、組み換えポリペプチドは、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３と融合されたシグナルペプチドである。
本明細書に記載される任意のポリヌクレオチドまたはウイルスベクターの一部の実施形態では、シグナルペプチドは、アズロシジンシグナルペプチドまたはＮＰＰ２シグナルペプチドまたはＮＰＰ７シグナルペプチドである。
本明細書に記載される任意のポリヌクレオチドまたはウイルスベクターの一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、または単純ヘルペスベクター、またはアルファウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。本発明の一態様では、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）の血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、もしくはＡＡＶ３、もしくはＡＡＶ４、もしくはＡＡＶ５、もしくはＡＡＶ６、もしくはＡＡＶ７、もしくはＡＡＶ８、もしくはＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ－ｒｈ７４である。
さらに別の態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする組み換えポリペプチドを含むアデノ随伴ウイルスベクターを提供する。
さらに別の態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドに融合されたアズロシジンシグナルペプチドを含む組み換えポリペプチドをコードする組み換えポリペプチドを含むアデノ随伴ウイルスベクターを提供する。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、バキュロウイルスベクターなどの昆虫ウイルスベクターではない。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ヒト細胞（例えば、ヒト肝細胞またはＨＥＫ細胞、ＨｅＬａまたはＡ５４９または肝細胞）などの哺乳類細胞を感染させることができる。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ヒト細胞などの哺乳類細胞に感染、侵入、および／または融合することができる。一部の実施形態では、ウイルスベクターのポリヌクレオチドのすべてまたは機能的部分（例えば、本明細書に記載のポリペプチドを発現することができる部分）は、本明細書に記載されるウイルスベクターによって接触される細胞のゲノムを統合する、またはそれに統合される。一部の実施形態では、ウイルスベクターのポリヌクレオチドのすべてまたは機能的部分は、本明細書に記載されるウイルスベクターと接触した哺乳類細胞のゲノム内に統合されることなく、染色体外状態で持続することができる。
一部の実施形態では、組み換えポリヌクレオチドは、ウイルスタンパク質および／またはヒトＥＮＰＰ１をコードするベクターまたはプラスミドを含む。一部の実施形態では、組み換えポリヌクレオチドは、ウイルスタンパク質および／またはヒトＥＮＰＰ３をコードするベクターまたはプラスミドを含む。一部の実施形態では、ベクターまたは前述のプラスミドは、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）またはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）に融合されたアズロシジンシグナルペプチドを含むコードされたポリペプチドを発現することができる。
一部の実施形態では、コードされたポリペプチドは、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）に融合されたアズロシジンシグナルペプチドを含み、膜貫通ドメイン、ソマトメジンドメイン、触媒ドメイン、およびヌクレアーゼドメインを含む。
一部の実施形態では、コードされたポリペプチドは、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）に融合されたアズロシジンシグナルペプチドを含み、シトソル内に分泌される。
一部の実施形態では、ポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドは、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）に融合された膜貫通ドメインを含み、分泌されず、膜結合している。
一部の実施形態では、本開示は、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）を含むポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）を含むポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基を含む。
一部の実施形態では、コードされたポリペプチドは、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）に融合されたアズロシジンシグナルペプチドを含む。
一部の実施形態では、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）に融合されたアズロシジンシグナルペプチドを含むポリペプチドは、ポリアスパラギンドメインまたは負に帯電した骨標的ドメインを欠く。
一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態では、本明細書に記載される任意のポリヌクレオチドは、ＥＮＰＰ１に融合されたアズロシジンシグナルペプチドまたはＥＮＰＰ３に融合されたアズロシジンシグナルペプチド、およびアミノ末端からカルボキシ末端の順序で、アズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ１－Ｆｃまたはアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ３－Ｆｃを形成するためにＦｃポリペプチドに融合されるＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を、それぞれコードする。
一部の実施形態では、組み換えポリヌクレオチドは、ＥＮＰＰ１に融合されたアズロシジンシグナルペプチドまたはＥＮＰＰ３に融合されたアズロシジンシグナルペプチド、およびアミノ末端からカルボキシ末端の順序で、アズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ１－アルブミンまたはアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ３－アルブミンを形成するためにヒト血清アルブミンに融合されるＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を、それぞれコードする。
一部の実施形態では、Ｆｃまたはアルブミン配列は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質のＣ末端に直接融合される。一部の実施形態では、Ｆｃまたはアルブミン配列は、例えば、可撓性リンカーなどのリンカーを通じて、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質のＣ末端に融合される。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号５７～８８から選択される。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３のＮ末端に融合されたシグナルペプチドをコードする核酸配列を含み、かつそれを発現することができる。ウイルスベクターの一部の実施形態では、ベクターはプロモーターを含む。ウイルスベクターの一部の実施形態では、プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。
ウイルスベクターの一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、アルブミンプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、およびアルファ－１－抗トリプシンプロモーターからなる群から選択される。ウイルスベクターの一部の実施形態では、ベクターは、ポリアデニル化信号をコードする配列を含む。
ウイルスベクターの一部の実施形態では、シグナルペプチドは、アズロシジンシグナルペプチドである。ウイルスベクターの一部の実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ウイルスベクターの一部の実施形態では、血清型を有するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ－ｒｈ７４からなる群から選択される。
ウイルスベクターの一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＥＮＰＰ１に融合されたアズロシジンシグナルペプチド、またはＥＮＰＰ３に融合されたアズロシジンシグナルペプチド、およびアミノ末端からカルボキシ末端の順序で、アズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ１－Ｆｃまたはアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ３－Ｆｃを形成するためにＦｃポリペプチドに融合されるＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を、それぞれコードする。
ウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＥＮＰＰ１に融合されたアズロシジンシグナルペプチド、またはＥＮＰＰ３に融合されたアズロシジンシグナルペプチド、およびアミノ末端からカルボキシ末端の順序で、アズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ１－アルブミンまたはアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ３－アルブミンを形成するためにヒト血清アルブミンに融合されるＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を、それぞれコードする。
さらに別の態様では、本開示は、本明細書に記載される任意のポリヌクレオチドを含む細胞（例えば、齧歯類細胞、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞などの哺乳類細胞）を提供する。
一部の実施形態では、本発明はまた、
ｉ．本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を提供するステップと、
ｉｉ．ウイルスの組立に適切な条件下に細胞を維持するステップと、
ｉｉｉ．細胞によって産生されるウイルスベクターを精製するステップと、を含む、組み換えウイルスベクターを得る方法を提供する。
別の態様では、本開示は、組み換えウイルスベクターを産生する方法を提供する。本方法は、
ｉ．本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または細胞集団を提供することであって、細胞が、組み換えウイルスベクターへのポリヌクレオチドのパッケージングまたは組立に必須なウイルスタンパク質を発現する提供することと、
ｉｉ．前述の組み換えウイルスベクターのパッケージングの組立に適切な条件下に、細胞または細胞集団を維持することと、を含む。
一部の実施形態では、方法は、細胞もしくは細胞集団から、または細胞もしくは細胞集団が維持される培地から、ウイルスベクターを精製することを含む。
一部の実施形態では、細胞は、齧歯類細胞（例えば、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞）、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａまたはＡ５４９）などの哺乳類細胞である。
一部の実施形態では、方法は、細胞または細胞集団に、一つ以上のウイルスタンパク質（ウイルスベクターのパッケージングまたは組立に必須であるものなど）をコードする組み換え核酸を導入すること、例えば、細胞または細胞集団をかかる組み換え核酸を含むヘルパーウイルスに感染させること、細胞または細胞集団とかかる組み換え核酸などを含むヘルパープラスミドとのトランスフェクションなど、をさらに含む。
一部の実施形態では、ウイルスベクターは、標的細胞に感染すると、本明細書に記載される一つ以上のポリペプチドを発現することができる。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の精製ウイルスベクターを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の滅菌／エンドトキシン遊離精製ウイルスベクターを含む滅菌医薬組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の任意の方法によって取得および精製されるウイルスベクターを提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の任意の方法によって取得および精製される任意のウイルスベクターを含む医薬組成物を提供する。
特定の実施形態では、本発明は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を哺乳動物に提供する方法を提供し、方法は、本発明のウイルスベクターを哺乳動物に投与することを含む。
特定の実施形態では、本開示は、哺乳動物（例えば、かかる発現を必要とするヒトなどのヒト）においてＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現する方法を提供し、方法は、本明細書に記載される任意のウイルスベクターを哺乳動物に投与することを含む。哺乳動物へのウイルスベクターの投与の前に、と同時に、および／またはその後に、方法は、哺乳動物から得られた生物学的試料において、ＥＮＰＰ１および／またはＥＮＰＰ３の発現、ＥＮＰＰ１および／またはＥＮＰＰ３の活性レベル、および／またはピロホスフェートレベルまたは濃度のパラメータのうちの一つ以上を検出および／または測定することをさらに含むことができる。一部の実施形態では、一つ以上のパラメータは、ウイルスベクターの哺乳動物への投与後、１週間、１～２週間、および／または１か月以内に検出または測定される。一部の実施形態では、哺乳動物（例えば、ヒト）は、ＥＮＰＰ１またはＡＢＣＣ６欠損を有する哺乳動物である。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の任意のウイルスベクターおよび生理学的に適合する担体を含む医薬組成物を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、病態または疾患の進行を防止または低減を必要とする哺乳動物において病態または疾患の進行を防止または低減する方法を提供し、方法は、前述の哺乳動物に、治療有効量の本発明による組成物を投与することを含み、病態または疾患は、限定されるものではないが、以下、ＮＰＰ１の欠損、低レベルのＰＰｉ、動脈および／または結合組織におけるカルシウムおよび他のミネラルの沈着の蓄積を特徴とする進行性障害、軟部組織の異所性石灰化、動脈または静脈の石灰化、大動脈組織や冠動脈組織などの心臓組織の石灰化、弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）、Ｘ連鎖性低リン血症（ＸＬＨ）、慢性腎臓疾患（ＣＲＯ）、ミネラル骨障害（ＭＢＤ）、血管石灰化、軟部組織の病理学的石灰化、軟部組織の病理学的骨化、乳児の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、および後縦靱帯の骨化（ＯＰＬＬ）のうちの一つ以上を含み、これにより、前述の哺乳動物における前述の疾患は防止されるまたはその進行が低減される。
別の態様では、本開示は、病理学的石灰化または病理学的骨化の疾患または障害の治療または予防を、それを必要とする対象において治療または予防および／または改善する方法を提供し、方法は、治療有効量の任意の本明細書に記載のウイルスベクターを投与し、それによって前述の疾患または障害を治療、予防、または改善することを含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ヒトＥＮＰＰ１またはヒトＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
別の態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１タンパク質欠損を有する対象を治療する方法を提供し、方法は、組み換えＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする治療有効量のウイルスベクターを対象に投与し、それによって対象を治療することを含む。本発明の一態様では、ウイルスベクターは、ヒトＥＮＰＰ１またはヒトＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする。
別の態様では、対象は、対象のＮＰＰ１遺伝子の機能喪失変異、または対象のＡＢＣＣ６遺伝子の機能喪失変異と関連する疾患または障害またはＥＮＰＰ１タンパク質欠損を有する。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするＡＡＶベクターであり、ベクターは、１×１０１２～１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、好ましくは１×１０１３～１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするＡＡＶベクターであり、ベクターは、５×１０１１～５×１０１５ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするＡＡＶベクターであり、対象当たり約１×１０１２～１×１０１５ｖｇ／ｋｇが、ＥＮＰＰ１－Ｆｃポリペプチドの送達および発現のために投与される。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするＡＡＶベクターであり、ベクターは、１×１０１２～１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、好ましくは１×１０１３～１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするＡＡＶベクターであり、ベクターは、５×１０１１～５×１０１５ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするＡＡＶベクターであり、対象当たり約１×１０１２～１×１０１５ｖｇ／ｋｇが、ＥＮＰＰ３－Ｆｃポリペプチドの送達および発現のために投与される。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、ＥＮＰＰ１－ＦｃポリペプチドをコードするＡＡＶベクターを対象への投与により、前述の対象において、血漿ピロホスフェート（ＰＰｉ）の用量依存的増加、および血漿ＥＮＰＰ１濃度の用量依存的増加が生じる。
哺乳動物へのウイルスベクターの投与の前に、と同時に、および／またはその後に、本明細書に記載される任意の方法は、哺乳動物から得られた生物学的試料において、ＥＮＰＰ１および／またはＥＮＰＰ３の発現、ＥＮＰＰ１および／またはＥＮＰＰ３の活性レベル、および／またはピロホスフェートレベルまたは濃度のパラメータのうちの一つ以上を検出および／または測定することをさらに含むことができる。一部の実施形態では、一つ以上のパラメータは、ウイルスベクターの哺乳動物への投与後、１週間、１～２週間、および／または１か月以内に検出または測定される。
さらに別の態様では、本開示は、病理学的石灰化または病理学的骨化の疾患または障害の治療または予防を、それを必要とする対象において治療または予防する方法を提供し、前述の対象に組み換えＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする治療有効量のウイルスベクターを投与し、それによって前述の疾患または障害を治療または予防することを含む。
別の態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１タンパク質欠損を有する対象を治療する方法を提供し、組み換えＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする治療有効量のウイルスベクターを前述の対象に投与し、それによって前述の対象を治療することを含む。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、前述の疾患または障害、または前述のＥＮＰＰ１タンパク質欠損は、前述の対象におけるＮＰＰ１遺伝子の機能喪失変異、またはＡＢＣＣ６遺伝子の機能喪失変異と関連する。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、前述のウイルスベクターは、組み換えＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、前述のウイルスベクターは、組み換えＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、前述のウイルスベクターは、組み換えＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドまたは組み換えＥＮＰＰ１－アルブミン融合ポリペプチドをコードする。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、前述のウイルスベクターは、組み換えＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合ポリペプチドまたは組み換えＥＮＰＰ３－アルブミン融合ポリペプチドをコードする。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、前述のウイルスベクターは、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３に融合されたシグナルペプチドを含む組み換えポリペプチドをコードする。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、前述のベクターは、ＥＮＰＰ１－ＦｃまたはＥＮＰＰ１－アルブミンをコードする。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、前述のシグナルペプチドは、アズロシジンシグナルペプチド、ＮＰＰ２シグナルペプチド、またはＮＰＰ７シグナルペプチドである。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、または単純ヘルペスベクター、またはアルファウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）の血清型は、ＡＡＶ１、またはＡＡＶ２、またはＡＡＶ３、またはＡＡＶ４、またはＡＡＶ５、またはＡＡＶ６、またはＡＡＶ７、またはＡＡＶ８、またはＡＡＶ９、またはＡＡＶ－ｒｈ７４である。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドに融合されたアズロシジンシグナルペプチドを含む組み換えポリペプチドをコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする前述のＡＡＶベクターは、１×１０１２～１×１０１５ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、前述の用量は、１×１０１３～１×１０１４ｖｇ／ｋｇである。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、前述のＡＡＶベクターは、５×１０１１～５×１０１５ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、前述のＡＡＶベクターは、ＥＮＰＰ１－ＦｃをコードするＡＡＶベクターであり、１×１０１２～１×１０１５ｖｇ／ｋｇの用量で対象に投与される。
任意の前述の方法の一部の実施形態では、ＥＮＰＰ１－ＦｃポリペプチドをコードするＡＡＶベクターの対象への投与により、前述の対象において、血漿ピロホスフェート（ＰＰｉ）の用量依存的増加、および血漿ＥＮＰＰ１濃度の用量依存的増加が生じる。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、対象は哺乳動物であるが、哺乳動物に限定されない。本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ネコ、およびイヌを含むが、これらに限定されない。
別の態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質の触媒ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを特徴とする。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３タンパク質の細胞外ドメインを含む。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３タンパク質の膜貫通ドメインを含む。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３タンパク質のヌクレアーゼドメインを含む。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１の残留物９９～９２５（Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）を含む。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７の残留物３１～８７５（Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ～Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｉｌｅ）を含む。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１の残留物１９１～５９１（Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ～Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ）を含む。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７の残留物１４０～５１０（Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ～Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ）を含む。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号９２の残留物１～８２７（Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）を含む。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号８９の残留物１～８３３（Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）または配列番号９１の残留物１～８３０（Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）を含む。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、ウイルスベクターは、昆虫ウイルスベクターではない。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、ウイルスベクターは、哺乳類細胞を感染させる、または感染させることができる。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはプロモーター配列をコードする。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、前述のプロモーターは肝臓特異的プロモーターである。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、アルブミンプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、およびアルファ－１－抗トリプシンプロモーターからなる群から選択される。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリアデニル化信号をコードするヌクレオチド配列を含む。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列に対してシグナルペプチドアミノ末端をコードする。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、シグナルペプチドは、アズロシジンシグナルペプチドである。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、前述のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ－ｒｈ７４からなる群から選択される血清型を有する。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、前述のポリヌクレオチドは、前述のＥＮＰＰ１に融合された前述のアズロシジンシグナルペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３に融合された前述のアズロシジンシグナルペプチドと、およびアミノからカルボキシ末端の順序で、アズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ１－Ｆｃまたはアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ３－Ｆｃを形成するためにＦｃポリペプチドに融合される前述のＥＮＰＰ１または前述のＥＮＰＰ３と、をそれぞれコードする。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、前記ポリヌクレオチドは、前述のＥＮＰＰ１に融合された前述のアズロシジンシグナルペプチド、または前述のＥＮＰＰ３に融合された前述のアズロシジンシグナルペプチド、およびアミノからカルボキシ末端の順序で、アズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ１－アルブミンまたはアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ３－アルブミンを形成するためにヒト血清アルブミンに融合される前述のＥＮＰＰ１または前述のＥＮＰＰ３とを、それぞれコードする。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、（ｉ）ＥＮＰＰ１タンパク質またはＥＮＰＰ３タンパク質と、（ｉｉ）半減期延長ドメインと、を含む融合タンパク質である。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、半減期延長ドメインは、ＩｇＧ ＦｃドメインまたはＩｇＧ Ｆｃドメインまたはその機能的断片の非存在下でのポリペプチドの半減期と比較して、哺乳動物におけるポリペプチドの半減期を延長することができるＩｇＧ Ｆｃドメインの機能的断片である。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、半減期延長ドメインは、アルブミンドメインまたはその機能的断片の非存在下でのポリペプチドの半減期と比較して、哺乳動物におけるポリペプチドの半減期を延長することができるアルブミンドメインまたはアルブミンドメインの機能的断片である。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、半減期延長ドメインは、融合タンパク質中のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質に対するカルボキシ末端である。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、ＩｇＧ Ｆｃドメインは、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、アルブミンドメインは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはリンカー配列をコードする。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、リンカー配列は、ＳＩＮの５７～８８からなる群から選択される。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、リンカー配列は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質と融合タンパク質の半減期延長ドメインを結合する。
本明細書に記載される任意のウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号８９、９１、９２、および９３に示されるアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本開示は、組み換えウイルスベクターを生成する方法を提供し、方法は、
ｉ．ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質の触媒ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞または細胞集団を提供することであって、細胞が、ポリヌクレオチドの組み換えウイルスベクターへのパッケージングおよび／または組立に必須なウイルスタンパク質を発現する提供することと、
ｉｉ．ポリヌクレオチドを含む前述の組み換えウイルスベクターのパッケージングの組立に適切な条件下で、細胞または細胞集団を維持することと、を含む。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、哺乳類細胞は、齧歯類細胞またはヒト細胞である。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターは、本明細書に記載されるウイルスベクターの任意の一つである。
一部の実施形態では、本明細書に記載される任意の方法は、細胞もしくは細胞集団から、または細胞もしくは細胞集団が維持される培地から、組み換えウイルスベクターを精製することをさらに含むことができる。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の組み換えウイルスベクターを産生および／または精製する方法から精製された組み換えウイルスベクターを特徴とする。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のウイルスベクターまたは組み換えウイルスベクターの任意の一つ、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
さらに別の態様では、本開示は、疾患の進行を予防または低減を必要とする哺乳動物における疾患の進行を予防または低減する方法を提供し、方法は、前述の哺乳動物に、本明細書に記載される任意の一つの医薬組成物の治療有効量を投与して、疾患または障害の進行を防止または低減することを含む。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、疾患は、Ｘ連鎖性低リン血症（ＸＬＨ）、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、ミネラル骨障害（ＭＢＤ）、血管石灰化、軟部組織の病理学的石灰化、軟部組織の病理学的骨化、ＰＸＥ、乳児の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、および後縦靱帯の骨化（ＯＰＬＬ）からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象において病理学的石灰化または病理学的骨化の疾患または障害を治療または予防する方法を提供し、方法は、本明細書に記載されるウイルスベクターまたは医薬組成物の任意の一つの治療有効量を対象に投与し、それによって、前述の疾患または障害を治療または予防することを含む。
別の態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１タンパク質欠損を有する対象を治療する方法を特徴とし、方法は、本明細書に記載されるウイルスベクターまたは医薬組成物の任意の一つの治療有効量を対象に投与し、それによって前述の対象を治療することを含む。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、前述の疾患または障害、または前述のＥＮＰＰ１タンパク質欠損は、前述の対象におけるＮＰＰ１遺伝子の機能喪失変異、またはＡＢＣＣ６遺伝子の機能喪失変異と関連する。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターまたは医薬組成物は、対象または哺乳動物の１×１０１２～１×１０１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターまたは医薬組成物は、対象または哺乳動物の１×１０１３～１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターまたは医薬組成物は、対象または哺乳動物の５×１０１１～５×１０１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターまたは医薬組成物は、対象または哺乳動物の１ｘ１０１２～１ｘ１０１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与される。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、前述のウイルスベクターまたは医薬組成物の対象または哺乳動物への投与により、前述の対象または哺乳動物において、血漿ピロホスフェート（ＰＰｉ）および／または血漿ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３濃度が増加する。
一部の実施形態では、前述の任意の方法は、対象または哺乳動物から得られた生物学的試料において、（ｉ）ピロホスフェートの濃度、（ｉｉ）ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の発現レベル、および（ｉｉｉ）ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の酵素活性のパラメータの一つ以上を検出または測定することをさらに含む。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、検出または測定は、ウイルスベクターまたは医薬組成物を投与する前に発生する。
別の態様では、本開示は、Ｅｎｐｐ１欠損の対象、またはＥｎｐｐ３欠損の対象もしくはそれを必要とする対象における骨欠損を補正するための方法を提供し、治療有効量の本明細書に記載のウイルスベクターまたは医薬組成物の任意の一つを、前述の骨欠損を補正するのに有効な量で前述の対象に投与し、それによって前述の骨欠損を補正することを含む。
別の態様では、本開示は、Ｅｎｐｐ１欠損の対象またはＥｎｐｐ３欠損の対象またはそれを必要とする対象において成長板構造を修復する方法を提供し、前述の対象に本明細書に記載されるウイルスベクターまたは医薬組成物の任意の一つの治療有効量を、成長板構造を修復するのに有効な量で投与し、それによって前述の対象の成長板構造を修復することを含む。
別の態様では、本開示は、Ｅｎｐｐ１欠損対象またはＥｎｐｐ３欠損対象またはそれを必要とする対象において、異常な骨芽細胞機能の発達を阻害する方法を提供し、前述の対象に本明細書に記載されるウイルスベクターまたは医薬組成物の任意の一つの治療有効量を、前述の対象における異常な骨芽細胞の発達を阻害するのに有効な量で投与し、それによって前述の対象における異常な骨芽細胞の発達を阻害することを含む。
別の態様では、本開示は、Ｅｎｐｐ１欠損の対象またはＥｎｐｐ３欠損の対象またはそれを必要とする対象において、骨形成速度を増加させる方法を提供し、前述の対象に本明細書に記載されるウイルスベクターまたは医薬組成物の任意の一つの治療有効量を、骨形成を増加させるのに有効な量で投与し、それによって前述の対象における骨形成を増加させることを含む。
別の態様では、本開示は、Ｅｎｐｐ１欠損の対象またはＥｎｐｐ３欠損の対象またはそれを必要とする対象において、骨芽細胞面を増加させる方法を提供し、前述の対象に本明細書に記載されるウイルスベクターまたは医薬組成物の任意の一つの治療有効量を、骨芽細胞面を増加させるのに有効な量で投与し、それによって前述の対象の骨芽細胞面を増加させることを含む。
本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターは、単回用量で投与される。本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターは、二回以上の用量で投与される。
Ｅｎｐｐ１欠損対象またはＥｎｐｐ３欠損対象またはそれを必要とする対象の骨欠損を補正するための本明細書に記載される方法の一部の実施形態では、前述の対象に、本明細書に記載されるウイルスベクターまたは医薬組成物の任意の一つの治療有効量を投与することを含み、前述の骨欠損を補正するのに有効な量で、それによって前述の骨欠損を補正し、補正が、前述の対象において、骨長、イントラベキュラー（ｉｎｔｒａｂｅｃｕｌａｒ）数、皮質厚、骨梁厚、骨梁骨体積、骨形成速度および骨芽細胞面からなる群の一つ以上の増加として示されることを含む。
Ｅｎｐｐ１欠損対象またはＥｎｐｐ３欠損対象またはそれを必要とする対象の骨欠損を補正するための本明細書に記載される方法の一部の実施形態では、成長板構造の修復、およびくる病の表現型の発現の阻害を含み、前述の対象において、骨長、イントラベキュラー（ｉｎｔｒａｂｅｃｕｌａｒ）数、皮質厚、骨梁厚、骨梁骨体積、骨形成速度および骨芽細胞面からなる群の一つ以上の増加として示される。
Ｅｎｐｐ１欠損対象またはＥｎｐｐ３欠損対象またはそれを必要とする対象の骨欠損を補正するための本明細書に記載される方法の一部の実施形態では、前述の補正は、非侵襲的撮像を介して検出される。本明細書に開示される方法の一部の態様では、非侵襲的撮像は、動的組織形態計測分析を含む。本明細書に記載される任意の方法の一部の実施形態では、Ｅｎｐｐ１欠損対象またはＥｎｐｐ３欠損対象またはそれを必要とする対象の骨欠損を補正するための本明細書に記載される方法を含み、補正の検出は、本明細書に記載されるウイルスベクターまたは医薬組成物の任意の一つの治療有効量の投与の前に前述の対象に表示される表現型または測定値に関連する。補正の指標は、好ましくは少なくとも０．１ｍｍであり、０．１ｍｍ～５ｍｍの範囲である骨長の増加と、好ましくは、少なくとも一つのイントラベキュラー（ｉｎｔｒａｂｅｃｕｌａｒ）ユニットから最大６ユニットまでの増加を含むイントラベキュラー（ｉｎｔｒａｂｅｃｕｌａｒ）数の増加と、好ましくは少なくとも０．００５ｍｍ～最大０．０４ｍｍの増加を含む骨梁厚の増加と、好ましくは少なくとも０．０１ｍｍ～０．３ｍｍの増加を含む皮質厚の増加と、好ましくは少なくとも０．０１ＢＶ／ＴＶ（骨梁骨体積／総骨量）の増加を含む骨梁骨体積の増加と、好ましくは少なくとも１ｍｍ３／ｍｍ２／年～３００ｍｍ３／ｍｍ２／年の増加を含む骨形成速度の増加と、好ましくは統計的に有意な増加を含む骨芽細胞面の増加と、を含む。
別の態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質の触媒ドメインを含むポリペプチドをコードする組み換え核酸を含む非ウイルスベクターを特徴とする。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３タンパク質の細胞外ドメインを含む。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３タンパク質の膜貫通ドメインを含む。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３タンパク質のヌクレアーゼドメインを含む。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１の残留物９９～９２５（Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）を含む。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７の残留物３１～８７５（Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ～Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｉｌｅ）を含む。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１の残留物１９１～５９１（Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ～Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ）を含む。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号７の残留物１４０～５１０（Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ～Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ）を含む。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号９２の残留物１～８２７（Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）を含む。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号８９の残留物１～８３３（Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｌａ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）および配列番号９１の残留物１～８３０（Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）を含む。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、組み換え核酸は、プロモーター配列をコードする。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、前述のプロモーターは肝臓特異的プロモーターである。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、アルブミンプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、およびアルファ－１－抗トリプシンプロモーターからなる群から選択される。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、組み換え核酸は、ポリアデニル化信号をコードするヌクレオチド配列を含む。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、組み換え核酸は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列に対してシグナルペプチドアミノ末端をコードする。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、シグナルペプチドは、アズロシジンシグナルペプチドである。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、脂質ナノ粒子（ＬＰＮ）である。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、ペプチド系ベクターである。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、非ウイルスベクターはポリマー系ベクターである。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、前述の組み換え核酸は、前述のＥＮＰＰ１に融合された前述のアズロシジンシグナルペプチド、または前述のＥＮＰＰ３に融合された前述のアズロシジンシグナルペプチド、およびアミノ末端からカルボキシ末端の順序でアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ１－Ｆｃまたはアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ３－Ｆｃを形成するためにＦｃポリペプチドに融合された前述のＥＮＰＰ１または前述のＥＮＰＰ３を、それぞれコードする。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、前述の組み換え核酸は、前述のＥＮＰＰ１に融合された前述のアズロシジンシグナルペプチド、または前述のＥＮＰＰ３に融合された前述のアズロシジンシグナルペプチド、アミノ末端からカルボキシ末端の順序でアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ１－アルブミンまたはアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ３－アルブミンを形成するためにヒト血清アルブミンに融合された前述のＥＮＰＰ１または前述のＥＮＰＰ３を、それぞれコードする。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリペプチドは、（ｉ）ＥＮＰＰ１タンパク質またはＥＮＰＰ３タンパク質と、（ｉｉ）半減期延長ドメインと、を含む融合タンパク質である。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、半減期延長ドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインまたはその機能的断片の非存在下でのポリペプチドの半減期と比較して、哺乳動物におけるポリペプチドの半減期を延長することができるＩｇＧ ＦｃドメインまたはＩｇＧ Ｆｃドメインの機能的断片である。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、半減期延長ドメインは、アルブミンドメインまたはその機能的断片の非存在下でのポリペプチドの半減期と比較して、哺乳動物におけるポリペプチドの半減期を延長することができるアルブミンドメインまたはアルブミンドメインの機能的断片である。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、半減期伸長ドメインは、融合タンパク質中のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質に対するカルボキシ末端である。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、ＩｇＧ Ｆｃドメインは、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、アルブミンドメインは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはリンカー配列をコードする。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、リンカー配列は、ＳＩＮ：５７～８８からなる群から選択される。
本明細書に記載される任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、リンカー配列は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質と融合タンパク質の半減期延長ドメインとを結合する。
別の態様では、本開示は、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチドの触媒ドメイン、またはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）ポリペプチドの触媒ドメインをコードする組み換え核酸を含む非ウイルスベクターを提供する。
非ウイルスベクターの一部の実施形態では、前述の組み換え核酸は、肝臓特異的プロモーターをさらに含む。
非ウイルスベクターの一部の実施形態では、肝臓プロモーターは、肝臓プロモーター１（ＬＰ１）およびハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）からなる群から選択される。
非ウイルスベクターの一部の実施形態では、前述の核酸は、アズロシジンシグナルペプチドであるシグナルペプチドをさらにコードする。
前述の任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、ＤＮＡ／カチオン性脂質（リポプレックス）、ＤＮＡ／カチオン性ポリマー（ポリプレックス）、ＤＮＡ／カチオン性ポリマー／カチオン性脂質（リポポリプレックス）、脂質ナノ粒子（ＬＰＮ）、イオン化可能な脂質、リピドイド、ペプチド系ベクター、およびポリマー系ベクターからなる群から選択される。
前述の任意の非ウイルスベクターの一部の実施形態では、前述の非ウイルスベクターは、リポプレックス、ポリプレックス、リポポリプレックス、イオン化可能な脂質、リポイド、リピドイド、脂質ナノ粒子（ＬＰＮ）、ペプチド系ベクター、およびポリマー系ベクターからなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質を対象に提供する方法を提供し、方法は、前述の任意の非ウイルスベクターを前述の哺乳動物に投与することを含む。
別の態様では、本開示は、非ウイルスベクターの任意の一つおよび生理学的に適合する担体を含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、疾患の進行の予防または減少を必要とする対象における疾患の進行を予防または減少させる方法を提供し、方法は、前述の哺乳動物に、治療有効量の前述のウイルスベクターの医薬組成物を投与することを含み、疾患は、Ｘ連鎖性低リン血症（ＸＬＨ）、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、ミネラル骨障害（ＭＢＤ）、血管石灰化、軟部組織の病理学的石灰化、軟部組織の病理学的骨化、乳児の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、および後縦靱帯の骨化（ＯＰＬＬ）からなる群から選択され、前述の哺乳動物における前述の疾患が予防されるまたはその進行が低減される。
本開示の別の態様では、病理学的石灰化または病理学的骨化の疾患または障害の治療または予防する方法を、それを必要とする対象において提供し、方法は、治療有効量の任意の前述の非ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターの医薬組成物を対象に投与し、それによって前述の疾患または障害を治療または予防することを含む。
別の態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１タンパク質欠損を有する対象を治療する方法を提供し、治療有効量の任意の前述のウイルスベクターまたは非ウイルスベクターの医薬組成物を対象に投与し、それによって前述の対象を治療することを含む。
方法の一部の実施形態では、前述の疾患または障害、または前述のＥＮＰＰ１タンパク質欠損は、前述の対象におけるＮＰＰ１遺伝子の機能喪失変異、またはＡＢＣＣ６遺伝子の機能喪失変異と関連する。
方法の一部の実施形態では、前述の非ウイルスベクターは、組み換えＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする核酸を含む。
方法の一部の実施形態では、前述の非ウイルスベクターは、組み換えＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする核酸を含む。
別の態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１タンパク質欠損を有する対象を治療する方法を提供し、方法は、治療有効量の任意の前述のウイルスベクターまたは先述の非ウイルスベクターの医薬組成物を対象に投与することを含む。
方法の一部の実施形態では、前述の疾患または障害、または前述のＥＮＰＰ１タンパク質欠損は、前述の対象におけるＮＰＰ１遺伝子の機能喪失変異、またはＡＢＣＣ６遺伝子の機能喪失変異と関連する。
方法の一部の実施形態では、前述の非ウイルスベクターまたは医薬組成物の対象への投与は、前述の対象において、血漿ピロホスフェート（ＰＰｉ）および／または血漿ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３濃度を増加させる。
方法の一部の実施形態では、対象から得られた生物学的試料において、（ｉ）ピロホスフェートの濃度、（ｉｉ）ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の発現レベル、および（ｉｉｉ）ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の酵素活性の一つ以上のパラメータを検出または測定することをさらに含む。
方法の一部の実施形態では、検出または測定は、非ウイルスベクターまたは医薬組成物を投与する前に起こる。
別の態様では、本開示は、Ｅｎｐｐ１欠損対象において骨欠損を補正する方法を提供し、前述の任意の非ウイルスベクターを、前述の骨欠損を補正するのに有効な量で前述の対象に投与し、それによって前述の骨欠損を補正することを含む。
別の態様では、本開示は、Ｅｎｐｐ１欠損対象において成長板構造を修復する方法を提供し、前述の任意の非ウイルスベクターを、成長板構造を修復するのに有効な量で前述の対象に投与し、それによって前述の対象において成長板構造を修復することを含む。
別の態様では、本開示は、Ｅｎｐｐ１欠損対象において異常な骨芽細胞機能の発達を阻害する方法を提供し、前述の対象に前述の任意の非ウイルスベクターを、前述の対象において異常な骨芽細胞機能の発達を阻害するのに有効な量で投与することを含み、それによって前述の対象における異常な骨芽細胞機能の発達を阻害する。
別の態様では、本開示は、Ｅｎｐｐ１欠損対象において骨形成速度を増加させる方法を提供し、前述の任意の非ウイルスベクターを、骨形成を増加させるのに有効な量で前述の対象に投与し、それによって前記対象の骨形成を増加させることを含む。
別の態様では、本開示は、Ｅｎｐｐ１欠損対象において骨芽細胞面を増加させる方法を提供し、前述の任意の非ウイルスベクターを、骨芽細胞面を増加させるのに有効な量で前述の対象に投与し、それによって前記対象の骨芽細胞面を増加させることを含む。
方法の一部の実施形態では、補正が、骨長、イントラベキュラー（ｉｎｔｒａｂｅｃｕｌａｒ）数、皮質厚、骨梁厚、骨梁骨体積、骨形成速度、および骨芽細胞面からなる群から選択される一つ以上の増加として前述の対象において示される。
方法の一部の実施形態では、前述の補正、復元、阻害、および減少はそれぞれ、骨長、イントラベキュラー（ｉｎｔｒａｂｅｃｕｌａｒ）数、皮質厚、骨梁厚、骨梁骨体積、骨形成速度、および骨芽細胞面からなる群の一つ以上の増加として、前述の対象に提示される。
方法の一部の実施形態では、前述の補正、修復、阻害、および減少は、それぞれ非侵襲的撮像を介して検出される。
方法の一部の実施形態では、前述の非侵襲的撮像は、動的組織形態計測分析を含む。
方法の一部の実施形態では、前述の検出は、前述の対象への前述の投与前の検出に関する。
特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも一つの図面を含む。色付きの図面を含む本特許または特許出願公報の写しは、要請があれば、必要な手数料の支払いがあった時点で、オフィスから提供されるであろう。
図１は、ＡＡＶ構築物を示す概略図である。 図２は、ＮＰＰ２およびＮＰＰ７シグナル配列と比較して、アズロシジンシグナル配列を使用した際のＥＮＰＰ１の発現量の増加を示す。 図３は、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合を発現するベクターのプラスミドマップである。 図４は、モデルマウスへのＥＮＰＰ１構築物を含むウイルス粒子の投与を示す概略図である。 図５は、ウイルスベクター投与の７日後、２８日後、および５６日後に収集された対照、低用量、および高用量のマウスコホートから得られた血漿試料におけるＥＮＰＰ１活性の用量依存性の増加を示す図である。 図６は、ウイルスベクター投与の７日後、２８日後、および５６日後に収集された対照、低用量、および高用量のマウスコホートから得られた血漿試料におけるＥＮＰＰ１濃度の用量依存性の増加を示す図である。 図７は、ウイルスベクター投与の７日後、２８日後、および５６日後に収集された対照、低用量、および高用量のマウスコホートから得られた血漿試料における血漿ＰＰｉ濃度の用量依存性の増加を示す図である。 図８は、ウイルスベクター投与後最大１１２日間のＥｎｐｐ１の持続的発現を示す図である。 図９は、ウイルスベクター投与の７日後、２８日後、５６日後、および１１２日後に収集された対照、低用量、および高用量のマウスコホートから得られた血漿試料におけるＥＮＰＰ１活性の用量依存性の増加を示す図である。 図１０は、ＥＮＰＰ１をコードおよび発現する様々なウイルス構築物を投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスの血漿で測定された可溶性ＥＮＰＰ１の活性を示す折れ線グラフである。Ｙ軸は、ｍＯＤ／分単位であり、Ｘ軸は、日単位である。 図１１は、ＡＡＶウイルスベクターを使用して送達されたバリアントＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質の、治療マウスの血液中の異なる時点での酵素活性を示す図である。 図１２は、異なる用量濃度のＥＮＰＰ１欠損マウスと比較した、野生型マウスにおけるバリアントＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質に関する血漿ピロホスフェートレベルの濃度を示す図である。 図１３は、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質を用いた処置後の、異なる時点でのマウスコホートの体重チャートを示す図である。 図１４は、処置されたマウスからの異なる組織の石灰化のレベルを示す図である。パネルＡは、処置された変異型マウスの大動脈における石灰化レベルを示す。パネルＢは、処置されたマウスの腎臓における石灰化レベルを示す。パネルＣは、処置されたマウスの脾臓における石灰化レベルを示す。パネルＤは、処置されたマウスの感覚毛における石灰化レベルを示す。 図１５Ａ～１５Ｅは、骨長（ｍｍ）図１５Ａ、骨梁数（１／ｍｍ）図１５Ｂ、皮質厚（ｍｍ）図１５Ｃ、骨梁厚（ｍｍ）図１５Ｄ、および骨梁骨体積ＢＶ／ＴＶ図１５Ｅを含む、処置されたマウスの骨構造のいくつかのパラメータを示す。 図１６Ａ～１６Ｂは、メスの大腿骨の組織形態分析に基づく、処置されたマウスにおける骨形成速度および骨芽細胞面を、それぞれ示す。ＡＡＶ用量は２．５×１０１３ｖｇ／ｋｇであった。 図１７は、野生型マウス、ビヒクルで処置されたＡＳｊ－２ｊマウス、およびＡＡＶ－ＥＮＰＰ１－Ｆｃで処置されたＡＳｊ－２ｊマウス、すなわちＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊマウスにおける異常肥大した軟骨細胞の構造を比較する。
本発明は、哺乳動物ＥＮＰＰ１または哺乳動物ＥＮＰＰ３をコードする核酸の、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の欠損を有する哺乳動物への送達に関する。
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等である任意の方法および材料を、本発明の実践または試験に使用することができるが、例証的な方法および材料が記載される。本明細書で使用される場合、以下の用語の各々は、本節においてそれに関連する意味を有する。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の一つまたは複数（すなわち、少なくとも一つ）を指すために使用される。一例として、「要素」は、一つの要素または複数の要素を意味する。
本明細書で使用される場合、組成物または方法または生成物を指す場合の「含む」という用語は、組成物、方法または生成物が特定の特徴を含むが、他の特徴の存在が、その意図される使用または目的に対してそれぞれの組成物または方法または生成物を機能しない状態にしない限り、他の特徴の存在を排除しないことを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「～からなる」は、組成物または方法または生成物を指す場合、列挙されたものとは別に、組成物、方法または生成物にさらなる特徴が存在しないことを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「実質的に～からなる」または「実質的に含む」は、組成物または方法または生成物に向けられたとき、列挙された特徴が存在し、特定の追加の特徴または要素も存在しうるが、追加の特徴または要素の存在は、組成物、方法、または生成物の本質的な特徴または機能に実質的に影響を与えないことを意味する。
以下の表記法は、明確さのために本開示に適用される。いずれにせよ、本明細書における本規則に従わない任意の教示は、依然として本開示の一部であり、教示が開示される文脈に照らして完全に理解され得る。タンパク質記号は、非斜字の大文字で開示されている。非限定的な例として、「ＥＮＰＰ１」はタンパク質を指す。特定の実施形態では、タンパク質がヒトタンパク質である場合、タンパク質記号の前に「ｈ」が使用される。他の実施形態では、タンパク質がマウスタンパク質である場合、タンパク質記号の前に「ｍ」が使用される。ヒトＥＮＰＰ１は「ｈＥＮＰＰ１」と呼ばれ、マウスＥＮＰＰ１は「ｍＥＮＰＰ１」と呼ばれる。ヒト遺伝子記号は、斜体の大文字で開示される。非限定的な例として、タンパク質ｈＥＮＰＰ１に対応するヒト遺伝子は、ＥＮＰＰ１である。マウス遺伝子記号は、最初の文字が大文字および残りの文字が小文字で開示され、さらにマウス遺伝子記号は斜体で示される。非限定的な例として、タンパク質ｍＥｎｐｐ１を作製するマウス遺伝子は、Ｅｎｐｐ１である。遺伝子変異に関する記載は、大文字で示される。
「ヒトＥｎｐｐ１」： ヒトＮＰＰ１（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＰ＿００６１９９／Ｕｎｉｐｒｏｔ－Ｓｕｓｓｐｒｏｔ Ｐ２２４１３）
「可溶性ヒトＥＮＰＰ１」は、ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００６１９９の残基９６～９２５を含むポリペプチドである。
配列番号１に示されるＥＮＰＰ１アミノ酸配列は、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、ＳＭＢ１ドメイン、ＳＭＢ２ドメイン、ホスホジエステラーゼ／触媒ドメイン、リンカードメイン、およびヌクレアーゼドメインを含む。
ＳＭＢ１ドメイン、ＳＭＢ２ドメイン、触媒ドメイン、リンカードメイン、およびヌクレアーゼドメインは、合わせて細胞外ドメインと呼ばれる。残基１～７６（Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ａｒｇ～Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ）は、細胞質ドメインに対応する。残基７７～９７（Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ～Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ）は、膜貫通ドメインに対応する。残基９９～９２５（Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）は、細胞外ドメインに対応する。残基１０４～１４４（Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ～Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ）はＳＭＢ１ドメインに対応し、残基１４５－１８９（Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｔｒｐ～Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ）はＳＭＢ２ドメインに対応する。残基５９７～６４７は、触媒ドメインとヌクレアーゼドメインを接続するリンカードメインに対応する。残基１９１～５９１（Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ～Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ）は、触媒／ホスホジエステラーゼドメインに対応する。残基６５４～９２５（Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）は、ヌクレアーゼドメインに対応する。残基番号およびドメイン分類は、ヒトＮＰＰ１配列に基づく（ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００６１９９／Ｕｎｉｐｒｏｔ－Ｓｕｓｓｐｒｏｔ Ｐ２２４１３）
「ヒトＥｎｐｐ３」： ヒトＮＰＰ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｏ１４６３８．２）
「可溶性ヒトＥＮＰＰ３」は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｏ１４６３８．２の残基４９～８９５を含むポリペプチドである。
配列番号７に示されるＥＮＰＰ３アミノ酸配列は、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、ホスホジエステラーゼ／触媒ドメイン、およびヌクレアーゼドメインを含む。触媒ドメインおよびヌクレアーゼドメインは、合わせて細胞外ドメインと呼ばれる。残基１～１１（Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｓｅｒ～Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｕ）は、細胞質ドメインに対応する。
残基１２～３０（Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ～Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ）は、膜貫通ドメインに対応する。残基３１～８７５（Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ～Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｉｌｅ）は、細胞外ドメインに相当する。残基１４０～５１０（Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ～Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ）は、触媒／ホスホジエステラーゼドメインに対応する。残基６０５～８７５（Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ～Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｉｌｅ）は、ヌクレアーゼドメインに対応する。残基番号およびドメイン分類は、ヒトＮＰＰ３配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｏ１４６３８．２）に基づく。
「石灰化の低減」：本明細書で使用される場合、「石灰化の低減」は、Ｘ線、マイクロＣＴ、およびＭＲＩのような非侵襲的方法を使用することにより観察される。９９ｍＴｃ－ピロホスフェート（９９ｍＰＹＰ）取り込みを用いる無線撮像を使用することによって、石灰化の低減も推測される。マウスにおける石灰化の存在は、マイクロコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、ならびにヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ及びＥ）およびアリザリンレッドなどの染料を使用する心臓、大動脈、および腎臓から採取された組織学的切片により、Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ． （Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｖｏｌｕｍｅ ６， Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ： １０００６ （２０１５））によって確立されたプロトコルに従って、検死を介して評価される。
ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３に関する「酵素活性」は、ＡＭＰおよびＰＰｉへのＡＴＰ加水分解活性および／またはＡＴＰへのＡＰ３ａ加水分解を有し、かつ基質を結合する活性を有するものとして定義される。
ＡＴＰ加水分解活性は、以下のように決定され得る。
ＮＰＰ１のＡＴＰ加水分解活性
ＮＰＰ１は、ＡＴＰをＡＭＰおよびＰＰｉに容易に加水分解する。ＮＰＰ１の定常状態のミカエリス－メンテン酵素定数は、ＡＴＰを基質として使用して決定される。ＮＰＰ１は、酵素反応のＨＰＬＣ分析によってＡＴＰを切断することが示され得、反応の基質および生成物の同一性は、ＡＴＰ、ＡＭＰ、およびＡＤＰ標準を使用して確認される。ＡＴＰ基質は、ＮＰＰ１の存在下で経時的に分解し、酵素産物ＡＭＰの蓄積を伴う。ＡＴＰ基質の様々な濃度を使用して、ＮＰＰ１の初期速度の速度は、ＡＴＰの存在下で導出され、データは、酵素速度定数を導出するために曲線に適合される。生理学的ｐＨでは、ＮＰＰ１の運動速度定数は、Ｋｍ＝１４４μＭおよびｋｃａｔｔ＝７．８ｓ－１である。
ＮＰＰ３のＡＴＰ加水分解活性
ＮＰＰ３の酵素活性を、ｐＮＰ－ＴＭＰまたはＡＴＰを基質として測定した。ＮＰＰ３タンパク質を、３７℃で、ｐＨ８．９の１００ｍＭのトリス－ＨＣｌおよび５ｍＭのｐＮＰ－ＴＭＰまたは５０μＭの［γ－３２Ｐ］ＡＴＰのいずれかの存在下において培養した。ｐＮＰ－ＴＭＰの加水分解は、３％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸中の１０倍希釈によって停止された。続いて、反応混合物を、６０μｌの５Ｎ ＮａＯＨで中和し、形成されたｐ－ニトロフェノール（ｐＮＰ）を４０５ｎｍで比色定量した。ＡＴＰの加水分解は、１００ｍＭのＥＤＴＡの添加によって停止された。反応混合物の１μｌを、ポリエチレンイミンセルロースプレート（Ｍｅｒｃｋ）上の薄層クロマトグラフィーにより分析した。ヌクレオチドおよび分解生成物を、ｐＨ３．０で７５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４中での上昇クロマトグラフィーによって分離した。オートラジオグラフィーによって放射性スポットを可視化した。５０μＭ ［ａ－３２Ｐ］ ＡＴＰの加水分解中に形成されたヌクレオチジル化中間体は、Ｂｌｙｔｔ ｅｔ ａｌ． （Ｈ．Ｊ． Ｂｌｙｔｔ， Ｊ．Ｅ． Ｂｒｏｔｈｅｒｔｏｎ， Ｌ． Ｂｕｔｌｅｒ Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４７ （１９８５）， ｐｐ． ５１７－５２０）， ｗｉｔｈ ｓｌｉｇｈｔ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｒ． Ｇｉｊｓｂｅｒｓ， Ｈ． Ｃｅｕｌｅｍａｎｓ， Ｗ． Ｓｔａｌｍａｎｓ， Ｍ． Ｂｏｌｌｅｎ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６ （２００１）， ｐｐ． １３６１－１３６８）に従って、捕捉された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥに続いて、捕捉された中間体をオートラジオグラフィーによって可視化した。Ｂｉｓ－ｐＮＰＰおよびｐＮＰＰも、ＮＰＰ３の基質として試験した。ＮＰＰ３アイソフォームを、ｐＨ８．９で１００ｍＭのトリス－ＨＣｌ中および５ｍＭのｂｉｓ－ｐＮＰＰまたはｐＮＰＰのいずれかで、３７℃で２．５時間培養した。その後、形成されたｐＮＰを、４０５ｎｍで比色定量した。（Ｇｉｊｓｂｅｒｓ Ｒ１， Ａｏｋｉ Ｊ， Ａｒａｉ Ｈ， Ｂｏｌｌｅｎ Ｍ， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２００３ Ｍａｒ １３；５３８（１－３）：６０－４．）生理学的ｐＨでは、ＮＰＰ３は、ＥＮＰＰ１と類似した約２．５９（±０．０４）ｓ－１およびＫｍ（＜８μＭ）値のｋｃａｔ値を有する。（ＷＯ ２０１７／０８７９３６）
ＨＰＬＣプロトコル
ＮＰＰ１によるＡＴＰ切断の測定、および生成物の識別使用されるＨＰＬＣプロトコルは、文献（Ｓｔｏｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １４６：１１８－１２４）から変更されている。５０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣ１、１ｍＭのＭｇＣｌ２、および１ｍＭのＣａＣｌ２緩衝液中のＡＴＰの様々な濃度を含む反応は、０．２～１μＭのＮＰＰ１の添加によって開始され、等体積の３Ｍのギ酸、または０．５ＮのＫＯＨによって様々な時点でクエンチされ、ｐＨ６に氷酢酸によって再酸性化される。クエンチした反応溶液を体系的に希釈し、ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ， Ｍｉｌｆｏｒｄ Ｍａｓｓ．）に装填し、基質および産生物を２５４または２５９ｎｍのＵＶ吸光度により監視する。基質および生成物を、Ｃ１８、５ｕｍ ２５０×４．６ｍｍ ＨＰＬＣカラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆ．）で、１５ｍＭのアンモニウムアセテートｐＨ ６．０溶液を使用して、０％から１０％（または２０％）のメタノール勾配で分離する。生成物および基質は、対応するピークおよび式の統合に従って定量される：
Figure 2023548758000002
 式中、［基質］は、初期基質濃度である。式で使用されたＡＭＰ、ＡＤＰおよびＡＴＰの減退係数は、１５．４ｍＭ－１ｃｍ’であった。２５４ｎｍでモニタリングする場合、反応と同じ日に行われた基質および生成物標準が、統合された生成物／基質のピーク面積を濃度に変換するのに使用された。
「病理学的石灰化」：本明細書で使用される場合、本用語は、軟部組織、分泌物、および体の排泄経路におけるカルシウム塩の異常な沈着が硬化することを指す。二つの種類があり、それは、細胞および組織の恒常性能力を超える、死滅するおよび死滅した組織で生じる異栄養性石灰化と、カルシウムの細胞外レベルを上昇させる転移性石灰化（高カルシウム血症）である。石灰化には、細胞、ならびに基底膜のコラーゲンおよび動脈壁の弾性繊維などの細胞外マトリックス成分も関与し得る。石灰化しやすい組織のいくつかの例としては、以下が挙げられる：胃粘膜－胃の内部上皮内層、腎臓および肺、角膜、全身動脈、ならびに肺静脈。
「病理学的骨化」：本明細書で使用される場合、用語は、骨系にない組織および通常は骨形成特性を示さない結合組織において骨が発生する、病理学的状態を指す。骨化は、罹患している組織または器官の性質に応じて三つの種類に分類され、軟骨内骨化は、軟骨内で生じ、かつ軟骨に置き換わる骨化である。膜内骨化は、結合組織で生じ、かつ結合組織に置き換わる骨化である。変形骨化は、通常軟らかい身体構造における骨質物質の発達であり、異所性骨化とも呼ばれる。
ＮＰＰ１の「欠損」とは、対象が、血漿中に正常なレベルのＮＰＰ１の５％～１０％以下を有する状態を指す。健康なヒト対象におけるＮＰＰ１の正常レベルは、およそ１０～３０ｎｇ／ｍｌである。（Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ． ２００１年２月、１５８（２）：５４３－５５４）
「低」レベルのＰＰｉは、対象が、正常なレベルの血漿ピロホスフェート（ＰＰｉ）の２％～５％以下を有する状態を指す。健康なヒト対象における正常なレベルの血漿ＰＰｉは、約１．８～２．６μＭである。（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．８（Ａｕｇｕｓｔ １９７９））
「異所性石灰化」は、組織におけるカルシウム塩の病理学的沈着または軟部組織における骨成長によって特徴付けられる状態を指す。
「軟部組織の異所性石灰化」は、典型的には、軟部組織の硬化の喪失につながる、軟部組織で生じるカルシウムホスフェート、ヒドロキシアパタイト、カルシウムオキサレート、およびオカタカルシウムホスフェートからなる不適切なバイオミネラル化を指す。「動脈石灰化」は、動脈の硬化および／または狭小化につながる、動脈および心臓弁に生じる異所性石灰化を指す。動脈の石灰化は、アテローム性プラークの負荷、ならびに心筋梗塞のリスクの増加、末梢血管疾患における虚血性エピソードの増加、および血管形成術後の解離のリスクの増加と相関する。
「静脈石灰化」という用語は、静脈の弾性を低減し、かつ血流を制限し、次いで、血圧および冠動脈欠損の増加につながり得る、静脈に生じる異所性石灰化を指す。
「血管石灰化」という用語は、血管系におけるミネラルの病理学的沈着を指す。これは、内膜石灰化および内側石灰化を含む様々な形態を有するが、心臓の弁にも見出され得る。血管石灰化は、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、ある特定の遺伝状態、および腎臓疾患、特にＣＫＤと関連している。血管石灰化を有する患者は、有害な心血管事象のリスクがより高い。血管石灰化は、多種多様な患者に影響を与える。特発性乳児動脈石灰化は、新生児の動脈が石灰化する、まれな形態の血管石灰化である。
「脳石灰化」（ＢＣ）という用語は、血管壁および実質組織におけるカルシウムおよび他のミネラルの沈着が生じ、神経細胞死および神経膠症につながる、非特異的神経病理学を指す。脳石灰化は」、ダウン症候群、レビー小体病、アルツハイマー病、パーキンソン病、血管性認知症、脳腫瘍、および様々な内分泌状態を含む様々な慢性および急性脳障害としばしば関連している。
心臓組織の石灰化は、大動脈組織および冠動脈組織などの心臓の組織におけるカルシウムの沈着物（他のミネラルを含む可能性がある）の蓄積を指す。
本明細書で使用される場合、用語「慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）」は、健康に影響を伴う、三か月超持続する腎臓の構造または機能の異常を指す。概して、ほとんどの慢性腎臓疾患では、排泄、内分泌、および代謝機能が共に低下する。心血管疾患は、慢性腎臓疾患（ＣＲＤ）を有する患者において最もよく見られる死因であり、血管石灰化は、心血管リスクの最も強力な予測因子の一つである。腎機能の低下に伴い、血管石灰化の有病率が増加し、石灰化は、一般集団よりも数年早く、ＣＫＤ患者で発生する。血管石灰化の防止、低減、および／または反転は、ＣＫＤを有する患者の生存率の増加をもたらし得る。
慢性腎臓疾患の臨床症状には、痒み、筋肉の痙攣、悪心、食欲の欠如、足および足首の腫れ、不眠および呼吸困難が含まれる。慢性腎臓疾患は、未治療のまま放置すると末期腎臓疾患（ＥＳＲＤ）に進行する傾向がある。ＥＳＲＤの一般的な症状には、排尿不能、疲労、倦怠感、体重減少、骨の痛み、皮膚の色の変化、頻繁なあざの形成、および指、つま先、手、および脚などの四肢の浮腫が含まれる。カルシフィラキシスまたは石灰性尿毒症性細動脈症（ＣＵＡ）は、脂肪および皮膚の血管内にカルシウムを蓄積させる状態である。ＥＳＲＤに罹患している患者の亜集団も、カルシフィラキシスを発症し得る。カルシフィラキシスの一般的な症状には、皮膚上の大きな紫色の網様パターン、潰瘍化し治癒しない黒褐色の痂皮を伴う開いた傷を形成する深く痛みのある塊、下肢または大腿、乳房、殿部、および腹部などの脂肪含量が高い領域の皮膚病変が含まれる。カルシフィラキシスを有する人は、血液中のカルシウム（高カルシウム血）およびホスフェート（高リン酸血）が正常レベルよりも高いことがあり得る。また、副甲状腺機能亢進症の症状も認められる。副甲状腺機能亢進症は、副甲状腺が過剰な副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を産生するときに生じる。血漿ピロホスフェート（ＰＰｉ）レベルの低下は、末期腎臓疾患（ＥＳＤ）に関連する血管石灰化にも存在する。
ＥＳＲＤに関連する血管石灰化は、脈圧を上昇させ、高血圧を引き起こし、または悪化させ、心筋梗塞および脳卒中を誘発または激化することによって、不良な転帰に寄与する。ＥＳＲＤ患者の大半は、腎不全で死亡するわけではなく、ＥＳＲＤの心血管系合併症から死亡し、また、透析中の非常に若い患者の多くは、冠動脈の石灰化を有することに注意することが重要である。ＣＫＤに関連する血管石灰化の組織学的サブタイプは、メンケベルグ（Ｍｏｎｃｋｅｂｕｒｇ）硬化症として知られており、これは血管硬化の一種であり、カルシウム沈着物が内側血管壁の筋層に見られる。この形態の石灰化は、が、ヒトＣＫＤ患者、および本明細書に記載される疾患の齧歯類モデルで観察される血管石灰化と同一であるが、アテローム性動脈硬化症で一般的に観察される内膜または新内膜の血管壁の石灰化と組織学的に異なっている。
本明細書で使用される場合、「幼児の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）」（ＩＡＣＩとしても知られる）は、出生前または生後数か月以内に明らかになる循環器系に影響を及ぼす障害を指す。それは、心臓から体のその他の部分（動脈）に血液を運ぶ血管の壁にミネラルカルシウムが異常に蓄積すること（石灰化）を特徴とする。石灰化は、しばしば動脈壁（内膜）の内層の肥厚と共に起こる。これらの変化は、動脈の狭窄（狭窄）および硬化をもたらし、血液をポンプで送るために心臓がより激しく働くことになる。その結果、心不全は、呼吸困難、四肢の液体の蓄積（浮腫）、皮膚または唇の青みがかった外観（チアノーゼ）、重度の高血圧（高血圧）、および肥大した心臓（心臓肥大）を含む兆候および症状を有する、罹患した個人で発症しうる。ＧＡＣＩの患者は、他の器官や組織にも、特に関節の周りに石灰化を有する。さらに、それらは、くる病と呼ばれる難聴または骨の軟化および弱化を有し得る。
全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）または突発性乳児動脈石灰化（ＩＩＡＣ）は、心臓から体のその他の部分（動脈）に血液を運ぶ血管の壁にミネラルカルシウムが異常に蓄積すること（石灰化）を特徴とする。石灰化は、動脈壁（内膜）の内層の肥厚と共にしばしば起こる。これらの変化は、動脈の狭窄（狭窄）および硬化をもたらし、血液をポンプで送るために心臓がより激しく働くことになる。その結果、心不全は、呼吸困難、四肢の液体の蓄積（浮腫）、皮膚または唇の青みがかった外観（チアノーゼ）、重度の高血圧（高血圧）、および肥大した心臓（心臓肥大）を含む兆候および症状を有する、罹患した個人で発症しうる。
本明細書で使用される場合、用語「動脈石灰化」、または「血管石灰化」、または「動脈硬化」は、筋動脈壁の肥厚および弾性の喪失によって特徴付けられるプロセスを指す。肥厚および弾性の喪失は、血管系の内膜および内側層（内側血管石灰化）の二つの異なる部位で発生する。内膜石灰化はアテローム性動脈硬化と関連し、内側石灰化は血管硬化および動脈硬化を特徴とする。これにより、心血管系の血行動態が損なわれ、動脈の弾性が低下し、罹患率と死亡率の傾向が増加する。
「骨形成速度」は、骨表面の単位当たりの単位時間内で形成される新しい骨の量である。これは、骨表面の単位当たりの単位時間内で形成される新しい骨の量であり、石灰化表面をミネラル付着率で乗じることによって計算される。
「皮質厚」は、０．５～２．２５ｍｍの範囲であり、平均の厚さは１．２８ｍｍをわずかに超える。皮質骨は、内部空洞の周りに保護層を形成する、骨の高密度の外表面である。緻密骨としても知られるこのタイプの骨は、骨格質量の８０％近くを占め、曲げやねじれに対して高い耐性があるため、体構造および体重負荷に不可欠である。
骨梁骨は、骨髄で満たされた細孔を囲む骨梁と呼ばれる相互接続されたロッドおよびプレートのネットワークに組織化された、高度に多孔質（典型的には７５～９５％）の骨組織である。「骨梁骨の厚さ」は２００および４００μｍの範囲であり、構造は、骨機能と体内の位置に応じて変化する。「骨梁数」は、長さの単位当たりの骨梁の数である。計測単位はｍｍ－１である。
「骨体積（ＢＶ／ＴＶ）」は、単位体積当たりの石灰化骨の体積を包含し、試料ＢＶは表面により含まれる体積であり、ＴＶは総試験体積の周りに巻かれた表面によって囲まれた体積である。
「骨欠損の補正」には、以下、一つの形成速度、皮質厚、骨梁厚、骨梁数、骨体積、および成長板構造などのパラメータによって決定されるが、これらに限定されない、正常な表現型により近く見えるように骨を修復することを含む。
「成長板構造」は、骨の長軸方向成長が起こる長骨の軟骨性の部分である。その構造には、最終的に死に至るまで成熟のいくつかの段階を経て、骨芽細胞、破骨細胞、および層板骨によって置換される、コラーゲン基質中に懸濁された軟骨細胞が含まれる。
「成長板構造の復元」には、限定されるものではないが、成長板構造における異常肥大した軟骨細胞の配列の復元、限定されるものではないが、特にくる病表現型の復元が含まれる。本開示はまた、成長する骨の不適切な石灰化によって特徴付けられる代謝性骨疾患または障害から生じるくる病表現型の防止を包含する。
本明細書で使用される場合、「ミネラル骨障害（ＭＢＤ）」という用語は、異常なホルモンレベルによって特徴付けられる障害を指し、人の血液中のカルシウムおよびリンレベルがバランスを欠くことを引き起こす。ミネラルと骨の障害は、一般的に、ＣＫＤを有する人に起こり、透析を受ける腎不全のほとんどの人に起こる。
骨減少症は、骨の衰弱と骨折のリスクの増加をもたらす、骨密度の減少を特徴とする骨の状態である。骨軟化症は、新たに形成された骨の石灰化の減少を特徴とする骨障害である。骨軟化症は、重度のビタミンＤ欠乏症（栄養性、または遺伝性症候群によって引き起こされ得る）および非常に低い血中ホスフェートレベルを引き起こす状態によって引き起こされる。骨軟化症と骨減少症の両方が、骨折のリスクを高める。骨軟化症の症状には、骨痛および筋力低下、骨の圧痛、歩行困難、ならびに筋痙攣が含まれる。
本明細書で使用される場合、「加齢関連骨減少症」は、骨ミネラル濃度が正常より低い状態を指す。一般的に、骨減少症を有する患者は、－１．０～－２．５の骨ミネラル濃度Ｔスコアを有する。骨減少症は、治療されずに放置されると、進行し、骨粗しょう症となり、骨がもろくなり、非常に骨折しやすくなる。
本明細書で使用される場合、用語「後縦靱帯の骨化（ＯＰＬＬ）」は、後縦靱帯の異所性石灰化をもたらす、過形成（過剰な骨成長）状態を指す。後縦靱帯は、脊柱の骨を接続し、安定化させる。靱帯の肥厚または石灰化は、脊髄を圧迫し、脊髄症を生じ得る。脊髄症の症状には、歩行困難、腸および膀胱の制御困難が含まれる。ＯＰＬＬはまた、神経根障害、または神経根の圧迫を引き起こし得る。頸部神経根障害の症状には、首、肩、腕、または手の疼痛、チクチク感、または麻痺が含まれる。
ＯＰＬＬによって引き起こされる臨床症状および徴候は、（１）脊髄症、または上肢および下肢の運動障害および感覚障害、痙縮、および膀胱機能障害を伴う脊髄病変、（２）上肢の痛みおよび感覚障害を伴う頸部神経根障害、ならびに（３）頸部周辺の痛みおよび硬直を伴う軸性不快感、に分類される。ＯＰＬＬの初期の最も一般的な症状には、手の感覚異常およびチクチクする感覚、ならびにぎこちなさが含まれる。神経学的欠損の進行に伴い、歩行困難などの下肢症状が現れ得る。ＯＰＬＬは、側面単純Ｘ線写真で検出され、頸部ＯＰＬＬの診断および形態学的詳細は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）およびコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）によって明確に示される。
本明細書で使用される場合、用語「弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）」は、弾性繊維中におけるカルシウムおよび他のミネラルの沈着の蓄積（石灰化）によって特徴付けられる進行性障害を指す。弾性繊維は結合組織の成分であり、体全体の構造に強度と柔軟性を提供する。ＰＸＥでは、石灰化は皮膚、眼、および血管の弾性繊維に影響を与え、消化管などの他の領域では与える頻度は低い。ＰＸＥの患者は、首、脇下、および関節が曲がったときに触れる皮膚の他の領域に丘疹と呼ばれる黄色っぽい隆起を有し得る。心臓から身体の残りの部分に血液を運ぶ血管（動脈）の石灰化は、ＰＸＥの他の徴候および症状を引き起こす可能性がある。例えば、この状態を有する人は、動脈の狭窄（動脈硬化）または腕および脚への血流の減少による運動中の筋痙攣および痛みを特徴とする跛行と呼ばれる状態を発症し得る。
グレンブラッド－ストランドベリー症候群としても知られる弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）は、一部の組織において弾性繊維の断裂と石灰化を引き起こす遺伝性疾患である。最も一般的な問題は、皮膚と眼、および後に血管で早期アテローム性動脈硬化の形態で発生する。ＰＸＥは、１６番染色体の短腕のＡＢＣＣ６遺伝子（１６ｐ１３．１）における常染色体劣性変異によって引き起こされる。一部の場合では、一部の乳児は、ＧＡＣＩを生き延び、成人に成長した際に弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）を発症する。ＰＸＥは、結合組織の成分である弾性繊維におけるカルシウムおよび他のミネラルの蓄積（石灰化）を特徴とする。結合組織は、体全体の構造に強度と柔軟性を提供する。ＧＡＣＩでも発生するＰＸＥの特徴には、脇下および関節の屈曲時に接触する皮膚の他の領域の丘疹と呼ばれる黄色っぽい隆起（屈曲領域）、動脈狭窄、および眼検査中に検出される眼の裏の組織に影響を与える網膜色素線条（網膜出血）と呼ばれる異常が含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「末期腎臓疾患（ＥＳＲＤ）」は、患者の腎臓がもはや機能しなくなった慢性腎臓疾患の進行期を指す。一般的な症状には、貧血（低血中鉄）を伴う疲労、食欲減退、悪心、嘔吐、カリウム上昇を含む臨床検査値異常、骨の健康に関連するホルモン異常、リン上昇および／またはカルシウム低下、高血圧（高血圧）、手／脚／目／腰（仙骨）の腫れ、および息切れが含まれる。
本明細書で使用される場合、「石灰性尿毒症性細動脈症（ＣＵＡ）」または「カルシフィラキシス」は、腎臓疾患、特に末期腎臓疾患（ＥＳＲＤ）を有する患者に見られる、高い罹患率および死亡率を有する状態を指す。それは、血栓を生じさせる、脂肪組織内および皮膚の深層内に位置した小さな血管の石灰化、および過剰な石灰化による血流の減少による皮膚細胞の死滅を特徴とする。
本明細書で使用される場合、「低リン血症性くる病」は、血液中のホスフェートレベルが低いために、骨が軟化し、容易に屈曲する障害を指す。症状は通常、幼児期に始まり、脚の弓状変形、骨の変形、骨痛、関節痛、骨の成長不良、低身長など、重症度はさまざまである。
本明細書で使用される場合、「遺伝性低リン血症性くる病」は、血液中の低レベルのホスフェートに関連する障害（低リン血症）を指す。ホスフェートは、骨および歯の正常な形成に必須のミネラルである。最も一般的には、ＰＨＥＸ遺伝子の突然変異により引き起こされる。この状態の原因となり得る他の遺伝子としては、ＣＬＣＮ５、ＤＭＰ１、ＥＮＰＰ１、ＦＧＦ２３、およびＳＬＣ３４Ａ３遺伝子が挙げられる。遺伝性低リン血症性くる病の他の徴候および症状には、頭蓋骨の早期融合（頭蓋骨癒合症）および歯の異常が含まれ得る。この障害はまた、靱帯および腱が関節に付着する異常な骨成長（筋腱付着部症）も引き起こし得る。成人では、低リン血症は、骨軟化症として知られる骨の軟化を特徴とする。別の稀なタイプの障害は、高カルシウム尿症を伴う遺伝性低リン血症性くる病（ＨＨＲＨ）として知られており、低リン血症に加えて、この状態は、尿中の高レベルのカルシウムの排出（高カルシウム尿症）によって特徴付けられる。
「Ｘ連鎖性低リン血症（ＸＬＨ）」、本明細書で使用される場合、用語Ｘ連鎖性低リン血症（ＸＬＨ）は、Ｘ連鎖性優性低リン血症性（ＸＬＨ）、またはＸ連鎖性ビタミンＤ抵抗性くる病とも呼ばれ、ビタミンＤの補足がそれを治癒しないという点で、くる病のほとんどの症例とは異なる、くる病（または骨軟化症）のＸ連鎖性優性形態である。それは、低身長および内反膝（Ｏ脚）を含む、骨の変形を引き起こし得る。これは、ＰＨＥＸ遺伝子配列（Ｘｐ．２２）の変異、およびそれに続くＰＨＥＸタンパク質の非活性と関連している。
本明細書で使用される場合、用語「常染色体劣性低リン血症性くる病２型（ＡＲＨＲ２）」は、低リン血症、くる病、および／または骨軟化症および成長の遅れを特徴とする遺伝性腎臓ホスフェート消耗性障害を指す。常染色体劣性低リン血症性くる病２型（ＡＲＨＲ２）は、ＥＮＰＰ１遺伝子のホモ接合性機能喪失型変異によって引き起こされる。
本明細書で使用される場合、「常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）」は、尿中のホスフェートの過剰喪失が、形成不良な骨（くる病）、骨痛、および歯の膿瘍につながる、希少な遺伝性疾患を指す。ＡＤＨＲは、線維芽細胞成長因子２３（ＦＧＦ２３）の突然変異によって引き起こされる。ＡＤＨＲは、骨の石灰化障害、くる病、および／または骨軟化症、カルシトリオール（１、２５－ジヒドロキシビタミンＤ３）の抑制レベル、腎臓ホスフェートの消耗、および低血清ホスフェートにより特徴付けられる。ＦＧＦ２３の突然変異は、プロテアーゼによってタンパク質をより安定的および分裂不可能にし、その結果、ＦＧＦ２３の生物活性が増強される。ＦＧＦ２３変異体の増強された活性は、近位尿細管細胞の頂点表面上のリン酸ナトリウム共輸送体であるＮＰＴ２ａおよびＮＰＴ２ｃの発現を減少させ、腎臓ホスフェートの消耗をもたらす。
低リン血症性くる病（以前はビタミンＤ抵抗性くる病と呼ばれていた）は、血液中のホスフェートレベルが低いため、骨が痛みを伴うほど軟化し、曲がりやすくなる障害である。症状には、脚および他の骨の弓状変形、骨痛、関節痛、骨の成長不良、および低身長が含まれ得る。罹患した一部の乳児では、頭蓋骨間の空間が早く閉じすぎるため、頭蓋骨癒合症に至る。ほとんどの患者は、カルシウム－ホスフェート代謝の異常、歯のエナメル質の異常、歯の萌出遅延、および長くて狭い頭部（長頭）を呈する。
本明細書において互換的に使用される、用語「ウイルスベクター」または「ウイルス粒子」は、少なくとも一つのウイルスキャプシドタンパク質と、封入された組み換えウイルスゲノム（またはウイルスタンパク質および／またはウイルス複製を指示するウイルス配列をコードするウイルスゲノムの一部）とからなるウイルス粒子を指す。ウイルス粒子は、ヒトＥＮＰＰ１の触媒ドメインまたはヒトＥＮＰＰ３またはその機能的に等価なバリアント）、および任意選択的に転写調節領域および／またはプロモーター領域を最後にコードする配列を含む異種ポリヌクレオチドを有する組み換えウイルスゲノムを含む。粒子は、典型的には、「ベクター粒子」と称される。
「アデノ随伴ウイルスベクター」、「ＡＡＶベクター」、「アデノ随伴ウイルス」、「ＡＡＶウイルス」、「ＡＡＶビリオン」「ＡＡＶウイルス粒子」および「ＡＡＶ粒子」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、少なくとも一つのＡＡＶカプシドタンパク質（好ましくは、特定のＡＡＶ血清型の全カプシドタンパク質による）およびカプシド形成された組み換えウイルスゲノムとからなるウイルス粒子を指す。粒子は、ヒトＥＮＰＰ１もしくはヒトＥＮＰＰ３またはその機能的等価バリアント）をコードする配列、およびＡＡＶ逆位末端反復に隣接したプロモーターを少なくとも含む転写調節領域を含む異種ポリヌクレオチドを有する組み換えウイルスゲノムを含む。粒子は、典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」または「ＡＡＶベクター」と称される。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミド、すなわち、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る円形二重鎖ＤＮＡループである。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターであり、追加のヌクレオチド配列は、ウイルスゲノム内にライゲーションされ得る。一部の実施形態では、ベクターは、導入される宿主細胞（例えば、複製の細菌起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）において、自律複製することができる。他の実施形態では、ベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノム内に統合されることによって、宿主ゲノムとともに複製される。更に、ある特定のベクター（発現ベクター）は、それらが動作可能に連結された遺伝子の発現を指示することができる。
本明細書で使用される場合、「非ウイルスベクター」は、少なくともＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の触媒ドメインをコードする核酸の送達を指し、ここで、送達は、遺伝物質を細胞に送達する物理的または化学的方法に依存し、ウイルスベクター（本明細書に定義）に依存しない。これは、物理的技術（細胞に入る針など）または化学的技術（実験室で創出される）のいずれかであり得る。非ウイルスベクターには、例えば、化学的破損、エレクトロポレーション、およびポリマー系試薬を使用した核酸の送達が含まれる。非ウイルスベクターの例には、コード核酸を包含する脂質ナノ粒子が含まれる。
本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」（ＬＮＰ）は、組み換え核酸成分および脂質成分を含む。脂質成分は、カチオン性および／またはイオン化可能な脂質、例えば、リン脂質、ペグ化脂質、および／または構造脂質（コレステロールまたはコルチコステロイドなど）を含有してもよい。典型的には、ＬＮＰは、インビボまたはインビトロで哺乳類細胞をトランスフェクトして、そこに含まれる核酸コード配列を発現するために使用される
本明細書で使用される場合、用語「組み換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、本明細書で使用される場合、外因性核酸および／または組み換えベクターが導入されている細胞を意味する。「組み換え宿主細胞」および「宿主細胞」は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も意味することが理解されるべきである。変異または環境の影響のいずれかに起因して、ある特定の変異が後続する世代で生じ得るため、かかる子孫は、実際には親細胞と同一ではない場合があるが、本明細書で使用されるように、依然として「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
用語「組み換えウイルスゲノム」は、ウイルスゲノム、または少なくとも一つの発現カセットが挿入されるその一部を指す。
本明細書で使用される場合、用語「ＡＡＶ組み換えウイルスゲノム」は、少なくとも一つの発現カセットポリヌクレオチドが挿入されるＡＡＶゲノムを指す。本発明による有用なＡＡＶのゲノムの最低限の「ゲノム」は、典型的には、シス作用５’および３’逆位末端反復配列（ＩＴＲ）および発現カセットを含む。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」という用語は、標的細胞における特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有する、組換えまたは合成で生成された核酸構築物を指す。本開示によるＡＡＶベクターのＡＡＶ組み換えウイルスゲノムの発現カセットは、ＥＮＰＰ１もしくはＥＮＰＰ３またはその機能的等価バリアントをコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された転写調節領域を含み得る。
本明細書で使用される場合、「転写調節領域」という用語は、一つ以上の遺伝子の発現を調節することができる核酸断片を指す。本発明による転写調節領域は、プロモーター、および任意選択的にエンハンサーを含む。
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の上流に位置する、一つ以上のポリヌクレオチドの転写を制御する働きをする核酸断片を指し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、ならびにこれらに限定されないが、転写因子結合部位、リプレッサー、および活性化因子タンパク質結合部位を含む任意の他のＤＮＡ配列、ならびに当該技術分野で既知のヌクレオチドの任意の他の配列の存在によって構造的に識別され、プロモーターからの転写量を調節するために直接的または間接的に作用する。誘導性プロモーター、構成的プロモーター、および組織特異的プロモーターを含む任意の種類のプロモーターが、本発明で使用され得る。
本明細書で使用される場合、「エンハンサー」という用語は、転写因子が結合して遺伝子転写を増加させるＤＮＡ配列エレメントを指す。エンハンサーの例としては、制限されるものではないが、ＲＳＶエンハンサー、ＣＭＶエンハンサー、ＨＣＲエンハンサーなどが挙げられる。別の実施形態では、エンハンサーは、肝臓特異的エンハンサー、より好ましくは肝臓制御領域エンハンサー（ＨＣＲ）である。
本明細書で使用される場合、「動作可能に連結された」という用語は、目的のポリヌクレオチドに関するプロモーター配列の機能的関係および位置を指す（例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に動作可能に連結される）。概して、動作可能に連結されたプロモーターは、目的の配列に連続している。しかしながら、エンハンサーは、その発現を制御するために、目的の配列に連続する必要はない。別の実施形態では、プロモーターおよびＥＮＰＰ１もしくはＥＮＰＰ３またはその機能的等価バリアントをコードするヌクレオチド配列。
「治療有効量」という用語は、所望の生物学的結果を提供するために、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードするウイルスベクターの非毒性であるが、十分な量を指す。その結果は、疾患の兆候、症状、もしくは原因の低減および／または軽減、または生物学的系の任意の他の所望の改変であり得る。例えば、本発明によるＡＡＶベクターの治療有効量は、生成に十分な量である。
本明細書で使用される場合、用語「Ｃａｐタンパク質」は、天然ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）の少なくとも一つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。Ｃａｐタンパク質の機能的活性の例としては、カプシドの形成を誘導する、一本鎖ＤＮＡの蓄積を促進する、カプシドへのＡＡＶ ＤＮＡパッケージングを促進する（すなわち、カプシド形成）、細胞受容体と結合する、およびビリオンの宿主細胞への侵入を促進する能力が挙げられる。原則的に、任意のＣａｐタンパク質を本発明の状況で使用することができる。
本明細書で使用される場合、用語「カプシド」は、ウイルスゲノムがパッケージングされる構造を指す。カプシドは、タンパク質から作製されたいくつかのオリゴマー構造サブユニットからなる。例えば、ＡＡＶは、三つのカプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の相互作用によって形成される正二十面体型カプシドを有する。
本明細書で使用される場合、「Ｒｅｐタンパク質」という用語は、天然ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ ４０、５２、６８、７８）の少なくとも一つの機能的活性を有するポリペプチドを指す。Ｒｅｐタンパク質の「機能的活性」は、認識、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起源の結合およびニッキング、ならびにＤＮＡヘリカーゼ活性を介してＤＮＡの複製を促進することを含む、タンパク質の生理学的機能に関連する任意の活性である。追加の機能には、ＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節、およびＡＡＶ ＤＮＡの宿主染色体への部位特異的統合が含まれる。特定の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、またはＡＡＶｒｈ１０に由来する。より好ましくは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、およびＡＡＶｒｈ１０からなる群から選択されるＡＡＶ血清型に由来する。
本明細書で使用される場合、表現「ＡＡＶが複製に依存するウイルスタンパク質」は、ＡＡＶが複製に依存する機能（すなわち、「ヘルパー機能」）を行うポリペプチドを指す。ヘルパー機能には、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化に関与する部分、段階特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、キャップ発現産物の合成、およびＡＡＶカプシド組立を含むが、これらに限定されない、ＡＡＶ複製に必要な機能が含まれる。ウイルス系アクセサリ機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、およびワクシニアウイルスなどの任意の既知のヘルパーウイルスに由来する。ヘルパー機能には、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、およびＥ４、またはヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬＢ、ＵＬ５２、およびＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、ＡＡＶが複製に依存するタンパク質は、アデノウイルスに由来する。
本明細書で使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルスＩＴＲ」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、アデノ随伴ウイルスのゲノムのＤＮＡ鎖の両端に存在する逆位末端反復を指す。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶゲノムの効率的な増殖に必要とされる。これらの配列の別の特性は、ヘアピンを形成するそれらの能力である。この特性は、第二のＤＮＡ鎖のプリマーゼ非依存性合成を可能にするその自己プライミングに寄与する。これらのＩＴＲ配列を修飾するための手順は、当該技術分野で既知である（Ｂｒｏｗｎ Ｔ， “Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ”， Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ， Ｌｏｎｄｏｎ， ＧＢ， １９９５、Ｗａｔｓｏｎ Ｒ， ｅｔ ａｌ．， “Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”， ２ｎｄ Ｅｄ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ＵＳ， １９９２、Ａｌｂｅｒｔｓ Ｂ， ｅｔ ａｌ．， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ”， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ＵＳ， ２００８、Ｉｎｎｉｓ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｄｓ．， “ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ．， ＵＳ， １９９０、およびＳｃｈｌｅｅｆ Ｍ， Ｅｄ．， “Ｐｌａｓｍｉｄ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ”， Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ， Ｗｅｉｎｈｅｉｍ， Ｄｅｌ．， ２００１）。
「組織特異的」プロモーターという用語は、特定の種類の分化細胞または組織でのみ活性である。典型的には、組織特異的プロモーター中の下流遺伝子は、他のどのプロモーターよりも特異的である組織においてはるかに高い程度に活性であるものである。この場合、特異的である組織以外の任意の組織において、プロモーターの活性がほとんどまたは実質的にない場合がある。
本明細書で使用される場合、用語「骨格筋特異的プロモーター」は、プロモーターとして機能する（すなわち、プロモーターに動作可能に連結された選択された核酸配列の発現を調節する）核酸配列を指し、骨格筋の特定の組織細胞における選択された核酸配列の発現を促進する。骨格筋特異的プロモーターの例としては、限定されないが、ミオシン軽鎖プロモーター（ＭＬＣ）および筋クレアチンキナーゼプロモーター（ＭＣＫ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「肝臓特異的プロモーター」は、プロモーターとして機能する（すなわち、プロモーターに動作可能に連結された選択された核酸配列の発現を調節する）核酸配列を指し、肝細胞における選択された核酸配列の発現を促進する。典型的には、肝臓特異的プロモーターは、体内の任意の他の組織におけるその活性と比較して、肝臓においてより活性である。肝臓特異的プロモーターは、構成的または誘導的であり得る。適切な肝臓特異的プロモーターとしては、例えば、Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ ２００６； １０７（７）：２６５３－２６６１ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｙｂｒｉｄ ｌｉｖｅｒ ｐｒｏｍｏｔｅｒ （ＨＬＰ） ａｓ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ ２０１３； １２１（１７）：３３３５－４４．に記載の肝臓プロモーター１（ＬＰ１）が挙げられる。かかるプロモーターには、［アルファ］１－抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルファフェトタンパク質プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）プロモーター、ＨＢＶ塩基性コアプロモーター（ＢＣＰ）およびＰｒｅＳ２プロモーター、アルブミンプロモーター、－４６０～７３ｂｐのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、肝臓制御領域（ＨＣＲ）－ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ－ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、マウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）要素と組み合わせたＡＡＴプロモーター、アポリポタンパク質Ｅプロモーター、低密度リポタンパク質プロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター、レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）プロモーター、アポリポタンパク質Ｈ（ＡｐｏＨ）プロモーター、トランスフェリンプロモーター、トランスチレチンプロモーター、アルファ－フィブリノーゲンおよびベータ－フィブリノーゲンプロモーター、アルファ１－抗キモトリプシンプロモーター、アルファ２－ＨＳ糖タンパク質プロモーター、ハプトグロビンプロモーター、セルロプラスミンプロモーター、プラスミノーゲンプロモーター、補体タンパク質のプロモーター（ＣＩｑ、ＣＩｒ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ９、補体因子Ｉおよび因子Ｈ）、Ｃ３補体活性化因子および ［アルファ］－酸糖タンパク質プロモーター、が含まれる。追加的な組織特異的プロモーターは、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ， ＴｉＰｒｏＤ （Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｊ４：Ｄ１０４－Ｄ１０７ （２００６））に見出し得る。別の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、アルブミンプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、およびアルファ１－抗トリプシンプロモーター、より好ましくはアルファ１－抗トリプシンプロモーター、さらにより好ましくはヒトアルファ１－抗トリプシンプロモーターからなる群から選択される。
本明細書で使用される場合、用語「誘導性プロモーター」は、例えば、化学誘導剤の適用によって、生理学的または発生学的に制御されるプロモーターを指す。例えば、それは、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ミフェプリストン（ＲＵ－４８６）誘導性プロモーターなどであり得る。
本明細書で使用される場合、「構成的プロモーター」という用語は、その活性が、生物の全ての細胞において、またはほとんどの発達段階の間に、細胞環境条件をほとんどまたは全く考慮せずに、比較的一定のレベルで維持されるプロモーターを指す。別の実施形態では、転写調節領域は、ＥＮＰＰ１の構成的発現を可能にする。構成的プロモーターの例としては、限定されるものでないが、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択的にＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択的にＣＭＶエンハンサーを含む）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１ａプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９８５；４１：５２１－５３０）が含まれる。好ましくは、構成的プロモーターは、肝臓におけるＥＮＰＰ１の発現に好適であり、限定されないが、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）のプロモーター、アデノシンデアミナーゼのプロモーター、ピルビン酸キナーゼのプロモーター、β－アクチンのプロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモーター、アルブミンプロモーター、および他の構造的プロモーターを含む。細胞内で構成的に機能する例示的なウイルスプロモーターには、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ， １９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４－３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９８０， Ｃｅｌｌ ２２：７８７－７９７）、またはヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ７８：１４４１－１４４５）が含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「ポリアデニル化信号」は、ｍＲＮＡの３’末端へのポリアデニンストレッチの結合を媒介する核酸配列に関する。好適なポリアデニル化信号には、限定されるものではないが、ＳＶ４０早期ポリアデニル化信号、ＳＶ４０後期ポリアデニル化信号、ＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化信号、プロタミン遺伝子ポリアデニル化信号、アデノウイルス５ ＥＩｂポリアデニル化信号、ウシ成長ホルモンポリアデニル化信号、ヒトバリアント成長ホルモンポリアデニル化信号などが含まれる。
用語「ヌクレオチドまたは核酸配列」は、本明細書において「ポリヌクレオチド」と互換的に使用され、任意の長さの任意のポリマー型のヌクレオチドに関する。前述のヌクレオチド配列は、シグナルペプチドおよびＥＮＰＰ１タンパク質またはその機能的に均等なバリアントをコードする。
本明細書で使用される場合、「シグナルペプチド」という用語は、タンパク質翻訳中に新生の目的のタンパク質のアミノ末端で結合されたアミノ酸残基（１０～３０残基の長さの範囲）の配列を指す。シグナルペプチドは、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）によって認識され、小胞体での輸送後にシグナルペプチダーゼによって切断される。（Ｌｏｄｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）。
本明細書で使用される場合、用語「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーおよび他の類人類およびサル種）、家畜（例えば、鳥類、魚、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ）、家畜哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）、または実験動物（例えば、マウス、マウス、モルモットなど齧歯類、）などの個々の哺乳動物を指す。用語は、任意の年齢または性別の対象を含む。別の実施形態では、対象は哺乳動物、好ましくはヒトである。
疾患または障害の症状の重症度、かかる症状が患者によって経験される頻度、またはその両方が低減された場合、疾患または障害は「軽減」される。
本明細書で使用される場合、「改変」、「欠陥」、「変動」、または「変異」という用語は、ミスセンスおよびナンセンス変異、挿入、欠失、フレームシフト、ならびに未成熟終止を含む、それがコードするポリペプチドの機能、活性、発現（転写もしくは翻訳）または立体配座に影響を及ぼす、細胞内の遺伝子の変異を指す。
「疾患」は、動物がホメオスタシスを維持できない動物の健康状態であり、疾患が改善されない場合、動物の健康状態は悪化し続ける。
動物の中の「障害」は、動物がホメオスタシスを維持することができるが、その動物の健康状態が、障害が無い場合よりも好ましくない健康状態である。治療を受けないまま放置した場合、障害が必ずしも動物の健康状態のさらなる低下を引き起こすとは限らない。
本明細書で使用される場合、用語「免疫応答」または「免疫反応」は、侵入（感染）病原性生物における抗原、または外来性タンパク質の導入もしくは発現に対する宿主の免疫系を指す。免疫応答は、概して、液性かつ局所的であり、Ｂ細胞によって産生される抗体は、抗原－抗体複合体中の抗原と組み合わさって、抗原を不活化または中和する。ヒトタンパク質をマウスモデル系に注射すると、免疫応答が観察されることが多い。一般的に、マウスモデル系は、外来抗原の導入前に免疫抑制薬を注射して、より良好な生存率を確実にすることにより、免疫寛容になる。
本明細書で使用される場合、「免疫抑制」という用語は、外来タンパク質、臓器移植、骨髄および組織移植などの外来抗原に対する免疫寛容を促進するために免疫抑制薬を使用する、宿主免疫系の活性化または有効性の意図的な低減である。免疫抑制薬の非限定的な例としては、抗ＣＤ４（ＧＫ１．５）抗体、シクロホスファミド、アザチオプリン（イムラン）、ミコフェノール酸モフェチル（セルセプト）、シクロスポリン（ネオーラル、サンディミュン、ゲングラフ）、メトトレキサート（リウマトレックス）、レフルノミド（アラバ）、シクロホスファミド（シトキサン）、およびクロラムブシル（ロイケラン）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「ＥＮＰＰ」または「ＮＰＰ」は、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼを指す。
本明細書で使用される場合、用語「ＥＮＰＰ１タンパク質」または「ＥＮＰＰ１ポリペプチド」は、ＥＮＰＰ１遺伝子によってコードされるエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１タンパク質を指す。コードされるタンパク質は、ＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、ヌクレオチドおよびヌクレオチド糖のホスホジエステル結合、ならびにヌクレオチドおよびヌクレオチド糖のピロホスフェート結合を含む、様々な基質を切断する。ＥＮＰＰ１タンパク質は、膜貫通ドメインおよび可溶性細胞外ドメインを有する。細胞外ドメインは、ソマトメジンＢドメイン、触媒ドメイン、およびヌクレアーゼドメインに更に細分される。野生型ＥＮＰＰ１の配列および構造は、Ｂｒａｄｄｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．のＰＣＴ出願公開第２０１４／１２６９６５号で詳細に説明され、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
哺乳動物ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３ポリペプチド、変異体、またはその変異体断片は、国際ＰＣＴ出願公開第２０１４／１２６９６５－Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．、同第２０１６／１８７４０８－Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．、同第２０１７／０８７９３６－Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．、および同第２０１８／０２７０２４－Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．で以前に開示されており、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、用語「ＥＮＰＰ３タンパク質」または「ＥＮＰＰ３ポリペプチド」は、ＥＮＰＰ３遺伝子によってコードされるエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３タンパク質を指す。コードされるタンパク質は、ＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、ヌクレオチドおよびヌクレオチド糖のホスホジエステル結合、ならびにヌクレオチドおよびヌクレオチド糖のピロホスフェート結合を含む、様々な基質を切断する。ＥＮＰＰ３タンパク質は、膜貫通ドメインおよび可溶性細胞外ドメインを有する。野生型ＥＮＰＰ３の配列および構造は、Ｂｒａｄｄｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．のＰＣＴ出願公開第２０１７／０８７９３６号で詳細に説明され、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ＥＮＰＰ１前駆体タンパク質」という用語は、ＥＮＰＰ１ Ｎ末端にそのシグナルペプチド配列を有するＥＮＰＰ１を指す。タンパク質分解時に、シグナル配列は、ＥＮＰＰ１から切断され、ＥＮＰＰ１タンパク質を提供する。本発明内で有用なシグナルペプチド配列としては、これらに限定されないが、アルブミンシグナル配列、アズロシジンシグナル配列、ＥＮＰＰ１シグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ２シグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ７シグナルペプチド配列、および／またはＥＮＰＰ５シグナルペプチド配列が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「ＥＮＰＰ３前駆体タンパク質」は、ＥＮＰＰ３ Ｎ末端にそのシグナルペプチド配列を有するＥＮＰＰ３を指す。タンパク質分解時に、シグナル配列は、ＥＮＰＰ３から切断され、ＥＮＰＰ３タンパク質を提供する。本発明内で有用なシグナルペプチド配列としては、これらに限定されないが、アルブミンシグナルペプチド配列、アズロシジンシグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ１シグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ２シグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ７シグナルペプチド配列、および／またはＥＮＰＰ５シグナルペプチド配列が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「アズロシジンシグナルペプチド配列」という用語は、ヒトアズロシジンに由来するシグナルペプチドを指す。カチオン性抗微生物タンパク質ＣＡＰ３７またはヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）としても知られるアズロシジンは、ヒトにおいてＡＺＵ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。アズロシンシグナルペプチド（ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ）をコードするヌクレオチド配列は、コードされると、ＥＮＰＰ１前駆体タンパク質またはＥＮＰＰ３前駆体タンパク質を生成する、ＮＰＰ１またはＮＰＰ３遺伝子のヌクレオチド配列と融合される。（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＣＨＯ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ， Ｋｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ． ２０１３ Ａｐｒ；１１０（４）：１１６４－７３）
本明細書で使用される場合、用語「ＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物」は、ＩｇＧ分子（好ましくは、ヒトＩｇＧ）のＦｃＲ結合ドメインに（共有結合および非共有結合の両方を含む）組換え融合および／または化学的にコンジュゲートされたＥＮＰＰ１を指す。特定の実施形態では、ＥＮＰＰ１のＣ末端は、ＦｃＲ結合ドメインのＮ末端に融合またはコンジュゲートされる。
本明細書で使用される場合、「ＥＮＰＰ３－Ｆｃ構築物」という用語は、ＩｇＧ分子（好ましくは、ヒトＩｇＧ）のＦｃＲ結合ドメインに（共有結合および非共有結合の両方を含む）組換え融合および／または化学的にコンジュゲートされたＥＮＰＰ３を指す。特定の実施形態では、ＥＮＰＰ１のＣ末端は、ＦｃＲ結合ドメインのＮ末端に融合またはコンジュゲートされる。
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ」という用語は、ヒトＩｇＧ（イムノグロブリン）Ｆｃドメインを指す。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４などのＩｇＧのサブタイプは、Ｆｃドメインとして使用するために企図される。
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域またはＦｃポリペプチド」は、ＩｇＧ分子のパパイン消化により得られた結晶化可能断片と相関するＩｇＧ分子の部分である。Ｆｃ領域は、ジスルフィド結合によって連結されるＩｇＧ分子の二つの重鎖のＣ末端の半分を含む。抗原結合活性はないが、ＦｃＲｎ受容体を含む相補体およびＦｃ受容体の炭水化物部分および結合部位を含む。Ｆｃ断片は、第二の定常ドメインＣＨ２全体（Ｋａｂａｔ番号システムによるヒトＩｇＧ１の残基２３１～３４０）および第三の定常ドメインＣＨ３（残基３４１～４４７）を含む。「ＩｇＧヒンジ－Ｆｃ領域」または「ヒンジ－Ｆｃ断片」という用語は、Ｆｃ領域（残基２３１～４４７）およびＦｃ領域のＮ末端から延びるヒンジ領域（残基２１６～２３０）からなるＩｇＧ分子の領域を指す。「定常ドメイン」という用語は、イムノグロブリンの他の部分、抗原結合部位を含む可変ドメインに対して、より保存されたアミノ酸配列を有するイムノグロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン、ならびに軽鎖のＣＨＬドメインを含む。Ｆｃ変異体の実施例は、Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｈａｌｆ－Ｌｉｆｅ， Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ０７ Ｊｕｎｅ ２０１９．に記載されているので参照。
本明細書で使用される場合、用語「動作可能に連結」または「動作可能に関連付けられる」は、融合タンパク質の形成をもたらし、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３などの標的タンパク質およびＦｃまたはアルブミンなどの異種タンパク質の機能のいずれかに有害に影響を与えないような方法で実施される、標的タンパク質と異種タンパク質との間の接続を指す。
本明細書で使用される場合、用語「循環半減期」は、哺乳動物、好ましくはヒトの全血中を循環する際に、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３などの組成物の血清濃度が、その定常状態を半減（血清半減期）するのにかかる時間を指す。例えば、ＥＮＰＰ１－ＦｃまたはＥＮＰＰ１－アルブミン異種タンパク質融合物は、野生型ＥＮＰＰ１タンパク質にわたって半減期の増加を示す。Ｂｒａｄｏｃｋらは、ＥＮＰＰ１変異およびＦｃ変異（ＥＮＰＰ１－Ｆｃバリアント）を含むＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質が、約３５時間の半減期の増加を示したと報告した。（Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｇｌｙｃａｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｐｈａｒｍｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ １０‐ｆｏｌｄ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｐｒｉｌ ２０１９， ＦＡＳＥＢを参照）。
本明細書で使用される場合、用語「ＥＮＰＰ１－Ｆｃバリアント」は、ＥＮＰＰ１タンパク質と例えばＦｃなどの異種タンパク質の動作可能な連結によって形成される融合タンパク質を指し、それらは、ＥＮＰＰ１タンパク質で置換された一つ、二つ、三つ、四つ、または五つの残基、および／またはＦｃタンパク質領域で置換された一つ、二つ、三つ、四つ、または五つの残基を含む。例えば、配列番号９５に示されるＥＮＰＰ１－Ｆｃバリアントは、ＥＮＰＰ１タンパク質領域中に単一変異（Ｉ３３２Ｔ変異、配列番号１に示されるＥＮＰＰ１ ＷＴタンパク質に対する位置番号）を、およびＦｃ領域中に三重変異を有する。（ＥＵ番号によるＭ２５２Ｙ， Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ変異）。いくつかのＥＮＰＰ１－Ｆｃバリアントは、一つ以上の置換を含むＥＮＰＰ１タンパク質を、既知の変異を含むＦｃタンパク質と動作可能に連結することによって容易に生成され得る。（ＩｇＧ Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏ ｍｏｄｕｌａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ． ２０１８ Ｊａｎ； ９（１）： ６３－７３の表Ｉを参照）
本明細書で使用される場合、用語「ＥＮＰＰ３－Ｆｃバリアント」は、ＥＮＰＰ１タンパク質と例えばＦｃなどの異種タンパク質の動作可能な連結によって形成される融合タンパク質を指し、それらは、ＥＮＰＰ３タンパク質で置換された一つ、二つ、三つ、四つ、または五つの残基、および／またはＦｃタンパク質領域で置換された一つ、二つ、三つ、四つ、または五つの残基を含む。例えば、配列番号９６に示されるＥＮＰＰ３－Ｆｃバリアントは、Ｆｃ領域（ＥＵ番号によるＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ変異）に三重変異を有する。いくつかのＥＮＰＰ３－Ｆｃバリアントは、一つ以上の置換を含むＥＮＰＰ３タンパク質を、既知の変異を含むＦｃタンパク質と動作可能に連結することによって容易に生成され得る。（ＩｇＧ Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｏ ｍｏｄｕｌａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ． ２０１８ Ｊａｎ； ９（１）： ６３－７３を参照）
本明細書で使用される場合、用語「アルブミン」は、球状タンパク質のファミリーを指し、概して、様々なリガンドに結合し、それらを運ぶ輸送タンパク質である。一般的な例としては、ヒト血清アルブミン、アルファ－フェトタンパク質、オバルブミン、およびラクトアルブミンが挙げられる。ヒト血清アルブミンは、ヒト血漿の主要タンパク質である。それは、ヒト血漿タンパク質の約５０％を占める。アルブミンバリアントのいくつかの例は、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ ａｎｄ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｉｎｆｅｒｒｅｄ ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ＰＮＡＳ， Ｖｏｌ． ８４， Ｎｏ． １３ （Ｊｕｌ． １， １９８７）， ｐｐ． ４４１３－４４１７； ＆ Ａｌｂｕｍｉｎ ａｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １８３０（１２）， Ａｐｒｉｌ ２０１３．に記載されている。
本明細書で使用される場合、核酸に適用される場合、用語「断片」は、より大きな核酸のサブ配列を指す。核酸の「断片」は、少なくとも約１５個、５０～１００個、１００～５００個、５００－１０００個、１０００－１５００個のヌクレオチド、１５００－２５００個、または２５００個のヌクレオチド（およびその間の任意の整数値）であり得る。本明細書で使用される場合、タンパク質またはペプチドに適用される用語「断片」は、より大きなタンパク質またはペプチドのサブ配列を指し、少なくとも約２０、５０、１００、２００、３００または４００アミノ酸長（およびその間の任意の整数値）であり得る。
「単離された」は、天然状態から改変または除去されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはポリペプチドは、「単離されて」いないが、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはポリペプチドは、「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができるか、または例えば、宿主細胞などの非天然環境中に存在することができる。
「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも２個、ある特定の実施形態では、少なくとも８、１５、または２５個のヌクレオチドの長さの範囲の核酸であるが、最大５０、１００、１０００、もしくは５０００個のヌクレオチドの長さ、またはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする化合物であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「患者」、「個体」、または「対象」は、ヒトを指す。
本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」または「組成物」は、薬学的に許容可能な担体を含む本開示内の有用な少なくとも一つの化合物の混合物を指す。医薬組成物は、患者への化合物の投与を容易にする。これらに限定されないが、皮下、静脈内、経口、エアロゾル、吸入、直腸、膣、経皮、鼻腔内、頬側、舌下、非経口、髄腔内、胃内、眼、肺、および局所投与を含む、化合物を投与する複数の技術が、当該技術分野に存在する。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な」という用語は、化合物の生物学的活性または特性を破壊せず、比較的非毒性である、担体または希釈剤などの材料を指し、すなわち、材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、または例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などのそれが含まれる組成物の任意の構成成分と有害な様式で相互作用することなく、個体に投与され得る。
本明細書で使用される場合、用語「血漿ピロホスフェート（ＰＰｉ）レベル」は、動物の血漿中に存在するピロホスフェートの量を指す。ある特定の実施形態では、動物には、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ヒト、ウシ、およびウマが含まれる。血小板からの放出のため、血清ではなく血漿中のＰＰｉを測定する必要がある。ＰＰｉを測定するにはいくつかの方法があり、そのうちの一つは、修飾を伴うウリジン－ジホスホグルコース（ＵＤＰＧ）ピロホスホリラーゼ（Ｌｕｓｔ ＆ Ｓｅｅｇｍｉｌｌｅｒ， １９７６， Ｃｌｉｎ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ ６６：２４１－２４９； Ｃｈｅｕｎｇ ＆ Ｓｕｈａｄｏｌｎｉｋ， １９７７， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ８３：６１－６３）を使用した酵素アッセイによるものである。典型的には、健康な対象における正常なＰＰｉレベルは、約１μｍ～約３μｍの範囲であり、一部の場合では、１～２μｍである。ＥＮＰＰ１発現欠損を有する対象は、正常なレベルより少なくとも１０％下回る、正常なレベルより少なくとも２０％下回る、正常なレベルより少なくとも３０％下回る、正常なレベルより少なくとも４０％下回る、正常なレベルより少なくとも５０％下回る、正常なレベルより少なくとも６０％下回る、正常なレベルより少なくとも７０％下回る、正常なレベルより少なくとも８０％下回る、およびそれらの組み合わせの範囲である、低ｐｐｉレベルを呈する傾向がある。ＧＡＣＩに悩まされた患者において、ｐｐｉレベルは、１μｍ未満であることが見出され、いくつかの場合では検出可能なレベルを下回る。ＰＸＥに悩まされた患者において、ｐｐｉレベルは、０．５μｍを下回る。（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ． ２０１４ Ｓｅｐ；３４（９）：１９８５－９； Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１５； ６： １０００６．）
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、自然発生構造バリアントに関連するアミノ酸残基、およびペプチド結合を介して連結されたその合成非自然発生類似体から構成されるポリマーを指す。
本明細書で使用される場合、「ＰＰｉ」という用語は、ピロホスフェートを指す。
本明細書で使用される場合、用語「予防する」または「予防」は、何も生じなかった場合に障害もしくは疾患の発症がないこと、または障害もしくは疾患の発症が既にあった場合に更なる障害もしくは疾患の発達がないことを意味する。また、障害または疾患に関連する症状のうちのいくつかまたは全てを予防する能力も考慮される。
本明細書で使用される場合、「試料」または「生物学的試料」は、対象から単離された生物学的材料を意味する。生物学的試料は、対象における生理学的または病理学的プロセスのｍＲＮＡ、ポリペプチド、または他のマーカーの検出に好適な任意の生物学的物質を含有してもよく、個体から得られた液体、組織、細胞および／または非細胞物質を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「実質的に精製された」は、他の構成成分を本質的に含まないことを指す。例えば、実質的に精製されたポリペプチドは、通常その自然発生状態で会合している他の構成成分から分離されているポリペプチドである。非限定的な実施形態には、９５％の純度、９９％の純度、９９．５％の純度、９９．９％の純度、および１００％の純度が含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「治療」または「治療すること」は、患者への治療剤、すなわち本発明で有用な化合物（単独または別の医薬品と組み合わせた）の適用もしくは投与、または疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害を発症する可能性を有する患者からの（例えば、診断またはエクスビボ適用のための）単離された組織もしくは細胞株への治療剤の適用もしくは投与として定義され、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害を発症する可能性を治す、治癒する、軽減する、緩和する、改変する、是正する、改善する、改良する）、またはそれに影響を及ぼす目的を伴う。そのような治療は、薬理ゲノミクスの分野から得られた知識に基づいて、特異的に調整または修正され得る。
本明細書で使用される場合、用語「予防する」、「予防している」、および「予防」は、対象における疾患の発症の阻害または発生の減少を指す。予防は、完全であってもよく（例えば、対象における病理学的細胞の完全な不存在）、または部分的であってもよい。予防はまた、臨床状態に対する感受性の低下を指す。
本明細書で使用される場合、用語「野生型」は、自然発生起源から単離された遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団で最も頻繁に観察され、したがって、ヒトＮＰＰ１遺伝子またはＮＰＰ３遺伝子の「正常」または「野生型」形態を任意に設計される。対照的に、「機能的等価」という用語は、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、配列および／または機能的特性（すなわち、改変された特性）の修飾を示す、ＮＰＰ１もしくはＮＰＰ３遺伝子または遺伝子産物を指す。自然発生変異体は単離することができる。これらは、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合、改変された特徴（改変された核酸配列を含む）を有するという事実によって識別される。
本明細書で使用される場合、用語「機能的等価バリアント」は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の配列（上記で定義される）に対して実質的に相同であり、かつそれぞれＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の酵素および生物学的活性を保持するポリペプチドに関する。バリアントが天然のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の生物学的活性を保持するかどうかを決定する方法は、当業者に広く知られており、前述の出願の実験部分で使用される任意のアッセイを含む。特に、ウイルスベクターによって送達されるＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の機能的等価バリアントは、本発明によって包含される。
ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の機能的等価バリアントは、それぞれ天然のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３に対して実質的に相同であるポリペプチドである。「実質的に相同」という表現は、前述のタンパク質配列が、それぞれ先に記載のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３配列に関して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性の程度を有する場合のタンパク質配列に関する。
二つのポリペプチド間の同一性の程度は、当業者に広く知られているコンピュータアルゴリズムおよび方法を使用して決定される。二つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくは、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ， Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． ２０８９４， Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３－４１０ （１９９０））を使用することによって決定されるが、他の類似のアルゴリズムも使用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０は、本明細書に記載されるパラメータを用いて、配列同一性パーセントを決定するために使用される。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センターを通じて公開されている。
ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の「機能的等価バリアント」は、それぞれ、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を産生するために使用される宿主細胞中のコドン選好を説明するポリヌクレオチド内のヌクレオチドを置き換えることによって得ることができる。かかる「コドン最適化」は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．によって提供されるコドン選好の「Ｈｕｍａｎ ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」などのコドン出現頻度表を組み込むコンピュータアルゴリズムを介して決定され得る。
量、持続時間などの測定可能値を指す場合、本明細書で使用される場合、「約」は、指定された値から±２０％または±１０％の変動、特定の実施形態では±５％の変動、特定の実施形態では±１％の変動、特定の実施形態では±０．１％の変動を包含することを意味する。これは、かかる変動は、開示された方法を実施するのに適切であるためである。
本開示は、本発明のタンパク質配列および核酸配列の代表的な例を提供する。記載したタンパク質配列は、リビア（ｒｅｖｅｒｅ）翻訳およびコドン最適化を行うことによって核酸配列に変換することができる。かかる変換を可能にするＥｘｐａｓｙ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）やバイオインフォマティクスサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ）など、いくつかのツールが、技術分野で利用可能である。
範囲：本開示の全体を通して、本発明による様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式の記載は、単に利便性および簡潔性のためであり、本発明による非柔軟な制限として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の説明は、その範囲内の全ての可能な部分範囲ならびに個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記述は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの具体的に開示された部分範囲、ならびに例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６などのその範囲内の個々の数を、有するとみなされるべきである。これは、範囲の広さに関係なく適用される。
可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド
特定の態様では、本開示は、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドに関する。本明細書に開示されるＥＮＰＰ１ポリペプチドが、ＥＮＰＰ１ファミリーの自然発生ポリペプチド、および生物学的活性を保持するその任意のバリアント（変異体、断片、融合体、および／またはペプチド模倣形態を含む）を含む。「ＥＮＰＰ１」または「ＥＮＰＰ１ポリペプチド」という用語は、任意の種に由来する、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ１タンパク質（ＮＰＰ１／ＥＮＰＰ１／ＰＣ－１）およびＥＮＰＰ１関連タンパク質を指す。ＥＮＰＰ１タンパク質は、ホモ二量体を形成するＩＩ型膜貫通糖タンパク質を含む。ＥＮＰＰ１タンパク質の各単量体は、原形質膜への標的化に関与する短い細胞内Ｎ末端ドメイン、膜貫通ドメイン、および数個のドメインを含む大きい細胞外領域を含む。大きい細胞外領域は、ＳＭＢ１およびＳＭＢ２ドメインを含み、これらは、ＥＮＰＰ１二量体化に関与することが報告されている（Ｒ． Ｇｉｊｓｂｅｒｓ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３７１； ２００３： ３２１－３３０）。具体的には、ＳＭＢドメインは、八つのシステイン残基を含有し、各々が四つのジスルフィド結合に配置され、共有結合シスチン間結合および分子内結合を通じて、ＥＮＰＰ１ホモ二量体化を媒介することが示されている。ＥＮＰＰ１タンパク質は、ヌクレオチドおよびヌクレオチド糖のホスホジエステル結合、ならびにヌクレオチドおよびヌクレオチド糖のピロホスフェート結合を含む、様々な基質を切断する。ＥＮＰＰ１タンパク質は、ヌクレオシド５’トリホスファターゼを、対応するモノホスフェートに加水分解し、またジアデノシンポリリン酸も加水分解するように機能する。ＥＮＰＰ１タンパク質は、心血管、神経学的、免疫学的、筋骨格、ホルモン、および血液学的機能の調節に関与する、プリン作動性シグナル伝達における役割を果たす。ヒトＥＮＰＰ１前駆体タンパク質（ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００６１９９）の例示的なアミノ酸配列が図１に示される（配列番号１）。ヒトＥＮＰＰ１前駆体タンパク質は、ＥＮＰＰ１ Ｎ末端に内在性ＥＮＰＰ１シグナルペプチド配列を含む。本明細書に説明される全てのＥＮＰＰ１関連ポリペプチドに対するアミノ酸の番号は、別段の指定がない限り、図１に提供されるヒトＥＮＰＰ１前駆体タンパク質配列の番号に基づく。
特定の実施形態では、ＥＮＰＰ１前駆体タンパク質は、内在性または異種のシグナルペプチド配列を更に含む。タンパク質分解時に、シグナルペプチド配列は、ＥＮＰＰ１前駆体タンパク質から切断され、成熟ＥＮＰＰ１タンパク質を提供する。Ｊａｎｓｅｎ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． ２００５；１１８（Ｐｔ １４）：３０８１－９を参照。本明細書で開示されるポリペプチドとともに使用され得る例示的なシグナルペプチド配列としては、限定されるものではないが、ＥＮＰＰ１シグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ２シグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ７シグナルペプチド配列、および／またはＥＮＰＰ５シグナルペプチド配列が挙げられる。処理された（成熟、可溶性）細胞外ＥＮＰＰ１ポリペプチド配列が配列番号２に示される。
様々なヌクレオチドトリホスフェート（例えば、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、およびＣＴＰ）、ｐＮＰ－ＴＭＰ、３’，５’－ｃＡＭＰ、および２’－３’－ｃＧＡＭＰに結合するＥＮＰＰ１もまた、高度に保存されている（例えば、Ｋａｔｏ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１２；１０９（４２）：１６８７６－８１ ａｎｄ Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ ＮＣ， ｅｔ ａｌ． Ｂｏｎｅ． ２０１２；５１（５）：９６１－８参照）。したがって、これらの整列から、正常なＥＮＰＰ１活性に重要である細胞外ドメインとの重要なアミノ酸位置を予測すること、および正常なＥＮＰＰ１活性を顕著に改変することなく、置換に耐性がある可能性が高いアミノ酸位置を予測することが可能である。それゆえに、本開示の方法による、活性のある有用なヒトＥＮＰＰ１ポリペプチドは、別の脊椎動物ＥＮＰＰ１の配列からの対応する位置に一つ以上のアミノ酸を含み得るか、またはヒトもしくは他の脊椎動物配列のものと同様の残基を含み得る。対応する位置における一つ以上のアミノ酸の置換は、ポリペプチド鎖の形状を改変するか、または正常なＥＮＰＰ１活性を改変する可能性が低い保存的変形または置換を含み得る。保存的変形、または置換の例としては、別のものに対するイソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニンなどの一つの疎水性残基の置換、またはリジンに対するアルギニン、アスパラギン酸に対するグルタミン、もしくはアスパラギンに対するグルタミンの置換などの、別のものに対する一つの極性残基の置換などが挙げられる。例えば、ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１ポリペプチドの配列と少なくとも約８０％、好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えるの同一性の配列を有する任意の既知のＥＮＰＰ１ポリペプチドの配列に由来するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１ポリペプチドドメイン（例えば、ＳＭＢ１、ＳＭＢ２、触媒ドメイン、ヌクレアーゼ様ドメイン、リンカー配列）、または別の種（例えば、ヒトとカニクイザル）からの対応するドメインもしくは部分配列で置換された部分配列を含み得る。
ＥＮＰＰ１タンパク質は、構造的および生物学的特徴の点で当技術分野で特徴付けられてきた。特定の実施形態では、本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１タンパク質は、ピロホスファターゼおよび／またはホスホジエステラーゼ活性を含む。例えば、一部の実施形態では、ＥＮＰＰ１タンパク質は、ヌクレオチドトリホスフェート（例えば、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、およびＣＴＰ）、ｐＮＰ－ＴＭＰ、３’，５’－ｃＡＭＰ、および２’－３’－ｃＧＡＭＰに結合し、ヌクレオチドトリホスフェートを無機ピロホスフェートに変換する〔例えば、Ｋａｔｏ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１２；１０９（４２）：１６８７６－８１； Ｌｉ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ２０１４；１０（１２）：１０４３－８； Ｊａｎｓｅｎ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ． ２０１２；２０（１１）：１９４８－５９； ａｎｄ Ｏｎｙｅｄｉｂｅ ＫＩ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． ２０１９；２４（２２）参照］。本明細書で使用される場合、用語「酵素的に活性」または「生物学的に活性」は、ピロホスファターゼおよび／またはホスホジエステラーゼ活性を呈する（例えば、ＡＴＰをＡＭＰおよびＰＰｉに、ならびに／またはＡＰ３ａをＡＴＰに結合および／または加水分解することができる）ＥＮＰＰ１ポリペプチドを指す。
例えば、ＥＮＰＰ１タンパク質のピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼドメインは、細胞外ヌクレオチドトリホスフェートを加水分解して、無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）を生成し、概して、可溶性である。この活性は、上記に説明されたようにｐＮＰ－ＴＭＰアッセイを使用して測定され得る（Ｓａｕｎｄｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｍｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． ７（１０）：３３５２－６２； Ａｌｂｒｉｇｈｔ， ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔ Ｃｏｍｍ． ６：１０００６）。特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、約３．４（±０．４）ｓ’１酵素’１以上の基質ＡＴＰに対するｋｃａｔ値を有し、ｋｃａｔは、ポリペプチドに対するＡＴＰの加水分解速度を測定することによって決定される。特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、約２ｐＭ以下の基質ＡＴＰに対するＫＭ値を有し、ＫＭは、ポリペプチドに対するＡＴＰの加水分解速度を測定することによって決定される。本明細書の教示に加えて、これらの参考文献は、一つ以上の生物学的活性を保持する可溶性ＥＮＰＰ１タンパク質を生成するやり方（例えば、無機ピロホスフェートへのヌクレオチドの変換）のための十分なガイダンスを提供する。
一実施形態では、本開示は、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドに関する。本明細書に説明されるように、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドという用語は、生物学的活性（例えば、酵素的活性）を保持する、ＥＮＰＰ１タンパク質の任意の自然発生細胞外ドメイン、およびその任意のバリアント（変異体、断片、およびペプチド模倣形態を含む）を含む。例示的な可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１タンパク質の細胞外ドメイン（例えば、ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００６１９９の残基９６～９２５）を含み、本明細書に説明される。
例示的な可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１ポリペプチドの細胞外ドメインの全てまたは一部に加えてシグナル配列を更に含み得る。例示的なシグナル配列は、ＥＮＰＰ１ポリペプチドの天然シグナル配列、または限定されるものではないが、本面最初に記載されるｈＥＮＰＰ７シグナル配列またはアズロシジンなどの別のタンパク質からのシグナル配列を含む。バリアント可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの例は、本開示全体を通して、ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／１２５１８２号、同第ＷＯ２０１４／１２６９６５号、同第ＷＯ２０１６／１８７４０８号、同第ＷＯ ２０１８／０２７０２４号、および同第ＷＯ ２０２０／０４７５２０号に提供され、それらの全てが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、本明細書に記載のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、バリアントポリペプチドであり、一つ以上のアミノ酸置換、欠失、または挿入によってポリペプチドの野生型形態とは異なる。
特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、組み換えポリペプチドである。一部の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１膜貫通ドメインを欠くＥＮＰＰ１ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１ポリペプチドを含み、ＥＮＰＰ１膜貫通ドメインは、除去され（および／または切断され）、例えば、非限定的な例として、ＥＮＰＰ２、ＥＮＰＰ５、またはＥＮＰＰ７などの、別のポリペプチドの膜貫通ドメインで置き換えられている。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるバリアントＥＮＰＰ１ポリペプチドまたはバリアント可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、一つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、バリアントＥＮＰＰ１ポリペプチドまたはバリアント可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、国際特許出願公開ＷＯ２０２０／００４７５２０に記載されるアミノ酸置換のうちの一つ以上を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるバリアントＥＮＰＰ１ポリペプチドまたはバリアント可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１に関する、３３２位での少なくとも一つのアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１に対する３３２位のイソロイシン（Ｉ）とトレオニン（Ｔ）との置換である。特定の実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１に対する３３２位のイソロイシン（Ｉ）とセリン（Ｓ）との置換である。
一部の実施形態では、ＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号９５に示されるアミノ酸配列を含む、またはからなる。
一部の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドまたはＥＮＰＰ３ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１ポリペプチドドメインおよび一つ以上の異種タンパク質部分（すなわち、ＥＮＰＰ１に対して異種のポリペプチドドメイン）を含む融合タンパク質である。アミノ酸配列が、配列番号１によって表されるＥＮＰＰ１の形態で一意に見出されない場合、ＥＮＰＰ１に対して異種であると理解される。一部の実施形態では、異種タンパク質部分は、イムノグロブリンのＦｃドメインを含む。一部の実施形態では、イムノグロブリンのＦｃドメインは、ＩｇＧ１イムノグロブリンのＦｃドメインである。特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ヒトイムノグロブリン１（ＩｇＧ１）、ヒトイムノグロブリン２（ＩｇＧ２）、ヒトイムノグロブリン３（ＩｇＧ３）、および／またはヒトイムノグロブリン４（ＩｇＧ４）のＦｃドメインにＣ末端融合される。他の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、ヒトイムノグロブリン１（ＩｇＧ１）、ヒトイムノグロブリン２（ＩｇＧ２）、ヒトイムノグロブリン３（ＩｇＧ３）、および／またはヒトイムノグロブリン４（ＩｇＧ４）のＦｃドメインにＮ末端融合される。一部の実施形態では、Ｆｃドメインの存在は、循環半減期、可溶性を改善し、免疫原性を低減し、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドの活性を増加させる。特定の実施形態では、天然ヒトＩｇＧタンパク質（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４）の部分が、Ｆｃ部分（例えば、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ）の代わりに使用され得る。例えば、本開示は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４に由来するＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３ドメインなどの、イムノグロブリンの定常ドメインを含むポリペプチドに融合されたＥＮＰＰ１を含む融合タンパク質を提供する。Ｆｃ断片は、ヒンジ領域（Ｋａｂａｔ番号システムによる、ヒトＩｇＧ１の残基２１６～２３０）などの天然ＩｇＧの領域、第二の定常ドメインＣＨ２（残基２３１～３４０）全体、および第三の定常ドメインＣＨ３（残基３４１～４４７）を含み得る。
一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、バリアントＦｃ定常領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ定常領域は、それが由来した天然定常領域に対して、３０個以下（例えば、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２個以下）のアミノ酸置換、挿入、または、欠失を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ定常領域は、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅ、Ｎ４３４Ｓ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ２５９Ｉ、Ｔ２５０Ｉ、およびＶ３０８Ｆからなる群から選択される一つ以上のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ定常領域は、アミノ酸置換Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅを含む。一部の実施形態では、バリアントヒトＦｃ定常領域は、各々ＥＵ番号において、位置４２８にメチオニン、および位置４３４にアスパラギンを含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ定常領域が、例えば、米国特許第８，０８８，３７６号に説明される４２８Ｌ／４３４Ｓ二重置換を含む。一部の実施形態では、機能的均等物または機能的誘導体が、本明細書に開示されるＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物と同一のもしくは類似の、またはそれよりも高い生物学的活性を有するか否かを決定する方法は、ＷＯ２０１６／１８７４０８に説明されるＡＴＰ切断を伴う酵素学的アッセイを使用することによって決定され得る。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、配列番号９５のアミノ酸８５３～１０７９を含む。
一部の実施形態では、ＥＮＰＰ１融合タンパク質が、ＥＮＰＰ１ポリペプチドドメインと一つ以上の異種タンパク質部分（例えば、Ｆｃイムノグロブリンドメイン）との間に位置付けられたリンカーを更に含む。特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、Ｆｃドメインに直接的または間接的に融合される。一部の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１融合タンパク質は、ＦｃドメインとＥＮＰＰ１ポリペプチドとの間のリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、１～２００個のアミノ酸を含むアミノ酸スペーサーであってもよい。好適なペプチドスペーサーは、当技術分野で公知であり、例えば、グリシン、アラニン、およびセリンなどの柔軟なアミノ酸残基を含有するペプチドリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ポリグリシンリンカーまたはＧｌｙ－Ｓｅｒリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーアミノ酸配列は、配列番号９４に示されたアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
特定の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、負に帯電した骨標的化ドメインを欠く。一部の実施形態では、ポリアスパラギン酸ドメイン（約２～約２０個以上の連続アスパラギン酸残基）は、負に帯電した骨標的化ドメインの非限定的な例である。一部の実施形態では、負に帯電した骨標的化ドメインは、８個の連続アスパラギン酸残基を含むポリアスパラギン酸ドメインを含む。一部の実施形態では、負に帯電した骨標的化ドメインは、１０個の連続アスパラギン酸残基を含むポリアスパラギン酸ドメインを含む。一部の実施形態では、可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、負に帯電した骨標的化ドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に開示される可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチドは、上記に説明されたように、負に帯電した骨標的化ドメインを欠く（ＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１１／１１３０２７号および同第ＷＯ２０１２／１２５１８２号）。
ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３のインビボ発現のためのウイルスベクター
ＮＰＰ１またはＮＰＰ３配列を含むポリヌクレオチドなどの遺伝物質を哺乳動物に導入して、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３ポリペプチドの欠損を補償することができる。
特定の修飾ウイルスは、哺乳動物への投与後、ウイルスが細胞に感染し、コードされたタンパク質を発現するため、コード配列を担持するためのベクターとしてしばしば使用される。本発明による有用な修飾ウイルスは、例えば、以下：パルボウイルス、ピコルナウイルス、仮性狂犬病ウイルス、Ａ型、Ｂ型、またはＣ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（ポリオーマおよびＳＶ４０など）またはヘルペスウイルス（エプスタイン－バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、帯状疱疹および単純ヘルペスウイルス１型および２型）、ＲＮＡウイルス、またはモロニーマウス白血病ウイルスもしくはレンチウイルスなどのレトロウイルス（すなわち、ヒト免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルスなど）を含むウイルスに由来する。本発明による有用なＤＮＡウイルスには、以下がある：アデノ随伴ウイルスアデノウイルス、アルファウイルス、およびレンチウイルス。
ウイルスベクターは、一般的に注射により投与され、最も頻繁には、直接体内に静脈内（ＩＶにより）に、または特定の組織中に直接投与され、そこでは個々の細胞によって取り込まれる。代替的に、ウイルスベクターは、エクスビボでウイルスベクターを患者の細胞の試料と接触させることによって投与されてもよく、それによってウイルスベクターが細胞を感染させることを可能にし、次いでベクターを含む細胞が患者に戻される。ウイルスベクターが送達されると、コード配列が発現され、機能性タンパク質がもたらされる。概して、ウイルスベクターによる細胞の感染および形質導入は、ウイルスカプシドの標的細胞表面上の受容体との相互作用、エンドサイトーシスによる内在化、エンドサイトーシス／プロテアソーム区画を通した細胞内輸送、エンドソーム脱出、核輸入、ビリオン脱殻、ならびに組み換えコード配列対象の転写および発現につながるウイルスＤＮＡ二重鎖変換という一連の連続的な事象によって生じる。（Ｃｏｌｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ． ２０１７ Ｄｅｃ １；８：８７－１０４．）。
本発明によるアデノ随伴ウイルスベクター
ＡＡＶは、パルボウイルス科のディペンドウイルス属に属するウイルスを指す。ＡＡＶゲノムは、約４．７キロベースの長さであり、ポジティブまたはネガティブセンスのいずれかであり得る直鎖一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）からなる。ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端に逆位末端反復（ＩＴＲ）、ならびにニつのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐおよびｃａｐを含む。ｒｅｐフレームは、ＡＡＶライフサイクルに必要な非構造複製（Ｒｅｐ）タンパク質をコードする四つの重複遺伝子から作製されている。ｃａｐフレームは、構造ＶＰカプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の重複ヌクレオチド配列を含み、それらは一緒に相互作用して、正二十面体型カプシドを形成する。
末端１４５ヌクレオチドは、自己相補的であり、Ｔ字形状のヘアピンを形成する、エネルギー的に安定した分子内二本鎖が形成され得るように組織化される。これらのヘアピン構造は、ウイルスＤＮＡ複製の起源として機能し、細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとしての役目を果たす。哺乳類細胞における野生型ＡＡＶ感染に続いて、ｒｅｐ遺伝子（すなわち、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２）は、それぞれ、Ｐ５プロモーターおよびＰ１９プロモーターから発現され、両方のＲｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムの複製において機能を有する。ｒｅｐ ＯＲＦにおけるスプライシング事象は、実際には四つのＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０）の発現をもたらす。しかしながら、哺乳類細胞におけるＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質をコードする非スプライシングｍＲＮＡは、ＡＡＶベクター生産に十分であることが示されている。また、昆虫細胞では、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質はＡＡＶベクター産生に十分である。
ＡＡＶベクターは、典型的にはｒｅｐおよびｃａｐフレームを欠く。かかるＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）をコードおよび発現するベクターでトランスフェクトされている宿主細胞中に存在する場合、複製および感染性ウイルス粒子中にパッケージングされてもよく、宿主細胞は、アデノウイルスオープンリーディングフレームＥ４ｏｒｆ６からタンパク質をコードおよび発現するベクターでトランスフェクトされている。
一実施形態では、本発明は、哺乳動物ＥＮＰＰ１または哺乳動物ＥＮＰＰ３をコードする配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現ベクターに関し、哺乳動物に投与すると、ベクターは、細胞内のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３前駆体を発現し、前駆体は、そのカルボキシ末端でＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３のアミノ末端に融合されたアズロシジンシグナルペプチドを含む。ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３前駆体は、ＩｇＧ Ｆｃ領域またはヒトアルブミンなどの安定化ドメインを含み得る。細胞から前駆体が分泌されると、シグナルペプチドは、切断され、酵素的に活性な可溶性哺乳動物ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３は、細胞外に提供される。
ＡＡＶ発現ベクターは、アズロシジンシグナルペプチド配列およびエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ（ＥＮＰＰ１）ポリペプチド配列を含むポリペプチドをコードする組み換え核酸配列に動作可能に連結された転写調節領域を含むヌクレオチド配列に動作可能に連結された転写調節領域を含む発現カセットを含み得る。
一部の実施形態では、発現カセットは、プロモーターおよびエンハンサー、コザック配列ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ、哺乳動物ＮＰＰ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列または哺乳動物ＮＰＰ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列、他の好適な調節エレメント、ならびにポリアデニル化信号を含む。
一部の実施形態では、本発明によるＡＡＶベクターのＡＡＶ組み換えゲノムは、ｒｅｐオープンリーディングフレームおよび／またはｃａｐオープンリーディングフレームを欠く。
本開示によるＡＡＶベクターは、任意の血清型に由来するカプシドを含む。一般に、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸および核酸レベルで顕著な相同性のゲノム配列を有し、同一の遺伝的機能のセットを提供し、実質的に同一の機序を介して複製およびアセンブリする。特に、本発明のＡＡＶは、ＡＡＶ（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、またはヒツジＡＡＶの血清型１に属し得る。
異なるＡＡＶ血清型のゲノムの配列の例は、文献またはＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースで見出され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１４０１．２（ＡＡＶ２）、ＮＣ＿００１８２９．１（ＡＡＶ４）、ＮＣ＿００６１５２．１（ＡＡＶ５）、ＡＦ０２８７０４．１（ＡＡＶ６）、ＮＣ＿００６２６０．１（ＡＡＶ７）、ＮＣ＿００６２６１．１（ＡＡＶ８）、ＡＸ７５３２５０．１（ＡＡＶ９）、およびＡＸ７５３３６２．１（ＡＡＶ１０）などである。
一部の実施形態では、本発明によるアデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、およびＡＡＶｒｈ１０血清型からなる群から選択される血清型に由来するカプシドを含む。別の実施形態では、ＡＡＶの血清型は、ＡＡＶ８である。ウイルスベクターがカプシドタンパク質をコードする配列を含む場合、これらは、ＡＡＶを一つもしくは複数の特定の細胞型に配向するために、または標的ベクターの細胞への送達の効率を増加させるために、またはＡＡＶの精製もしくは検出を促進するために、または宿主応答を低減するために、外因性配列を含むように修飾され得る。
その内容が参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる、公開された出願ＵＳ２０１７／０２９０９２６－Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．は、ＡＡＶベクターが生成、送達、および投与されるプロセスを詳細に説明している。
本発明による有用なアデノウイルスベクター
アデノウイルスは、所望の遺伝子産物（例えば、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３）をコードおよび発現するように操作されてもよく、同時に、正常な溶解ウイルスライフサイクルで複製するその能力に関して不活性化される。加えて、アデノウイルスは、気道上皮に対して天然指向性を有する。ウイルスは、気道に見られるような静止細胞に感染することができ、レトロウイルスよりも大きい利点を提供する。アデノウイルス発現は、宿主細胞染色体へのウイルスＤＮＡの組み込みなしで達成され、それによって、挿入変異誘発に関する懸念を軽減する。更に、アデノウイルスは、長年にわたって、優れた安全性プロファイルを有する生腸ワクチンとして使用されてきた（Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ａ． Ｒ． ｅｔ ａｌ． （１９７４） Ａｍ． Ｒｅｖ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｄｉｓ． １０９：２３３－２３８）。最後に、アデノウイルス介在性遺伝子導入は、アルファ－１－抗トリプシンおよびＣＦＴＲのコットンラットの肺への導入を含むいくつかの事例で実証されている（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ， Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１－４３４； Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｃｅｌｌ ６８：１４３－１５５）。更に、アデノウイルスをヒトの癌の原因物質として確立しようとする広範な研究は、一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９７９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７６：６６０６）。
偽アデノウイルスベクター（ＰＡＶ）－ＰＡＶｓは、アデノウイルス逆位末端反復と、ヘルパーウイルス依存性のベクターの複製およびパッケージングに必要な最小のアデノウイルス５’配列と、を含有する。これらのベクターは、潜在的に有害なウイルス遺伝子を含有せず、３６ｋｂ近い異物に対する理論的容量を有し、合理的に高い力価で産生され、分裂および非分裂ヒト標的細胞型に対する親ウイルスの指向性を維持し得る。ＰＡＶベクターは、プラスミド媒介性構築物、または感染性ウイルス粒子のいずれかとして維持され得る。プラスミド構築物として、ＰＡＶは、野生型または欠損型ヘルパーウイルスのいずれかによる、これらの配列および任意の所望の追加の外因性遺伝物質の効率的な複製およびパッケージングに必要な野生型アデノウイルス２型からの最小限の配列から構成される。
その内容が参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるＧｒｅｇｏｒｙらの米国特許公開第７，３１８，９１９号は、アデノウイルスベクターが生成、送達されるプロセス、および疾患治療のためのそれらの対応する使用について詳細に説明している。本発明は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードするヌクレオチドをそれを必要とする対象に送達するためのアデノウイルスベクターの使用、ならびにそれを使用する治療方法を企図している。
本発明による有用な単純ヘルペスベクター
単純ヘルペスベクター（ＨＳＶ系ウイルスベクター）は、核酸配列を多数の細胞型に導入するためのベクターとしての使用に好適である。成熟ＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂである線形二本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを有する、エンベロープされた二面体カプシドからなる。別の実施形態では、ＨＳＶ系ウイルスベクターは、少なくとも一つの必須ＨＳＶ遺伝子を欠損している。一部の実施形態では、少なくとも一つの必須ＨＳＶ遺伝子が欠損しているＨＳＶ系ウイルスベクターは、複製欠損である。大部分の複製欠損ＨＳＶベクターは、複製を防止するために、一つ以上の最初期、初期、または後期ＨＳＶ遺伝子を除去するための欠失を含有する。例えば、ＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される最初期遺伝子を欠損し得る。ＨＳＶベクターの利点は、長期ＤＮＡ発現を結果的にもたらし得る潜伏段階に入るその能力、および最大２５ｋｂの外因性ＤＮＡ挿入を収容し得るその大きいウイルスＤＮＡゲノムである。
ＨＳＶ系ベクターは、例えば、Ｐｒｅｓｔｏｎらの米国特許第５，８３７，５３２号、Ｗｉｃｋｈａｍらの同第５，８４６，７８２号、およびＤｅｌｕｃａらの同第５，８０４，４１３号、ならびにＰｒｅｓｔｏｎらの国際特許出願第ＷＯ９１／０２７８８号、Ｐｒｅｓｔｏｎらの同第ＷＯ９６／０４３９４号、Ｄｅｌｕｃａらの同第ＷＯ９８／１５６３７号、およびＧｌｏｒｉｏｓｏらの同第ＷＯ９９／０６５８３号に説明され、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。ＨＳＶベクターは、ＨＳＶゲノムの早期領域のみ、ＨＳＶゲノムの最初期領域のみ、ＨＳＶゲノムの後期領域のみ、またはＨＳＶゲノムの早期および後期両方の領域の複製必須遺伝子機能を欠損し得る。ＨＳＶベクターの産生は、当該技術分野で周知の標準的な分子生物学的技術を使用することを伴う。
複製欠損ＨＳＶベクターは、典型的には、複製欠損ＨＳＶベクターには存在しないが、ウイルス増殖に必要とされる遺伝子機能を、ウイルスベクターストックの高い力価を生成するために適切なレベルで提供する相補細胞株で産生される。タンパク質をコードする核酸配列の発現は、核酸配列に動作可能に連結された好適な発現制御配列によって制御される。「発現制御配列」は、別の核酸配列の発現（典型的には、かつ好ましくは転写）を促進、増強、または制御する任意の核酸配列である。
好適な発現制御配列としては、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、およびエンハンサーが挙げられる。ベクター中のタンパク質をコードする核酸配列は、その内因性プロモーターによって、または好ましくは、非天然プロモーター配列によって調節され得る。好適な非天然プロモーターの例としては、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）最初期プロモーター（ＨＣＭＶ ＩＥｐ）などのＨＣＭＶプロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復プロモーターなどのＨＩＶ由来のプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復などのＲＳＶプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｌａｐ２プロモーター、またはヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ７８， １４４４－１４４５ （１９８１））、ＳＶ４０またはエプスタインバーウイルス由来のプロモーターなどが挙げられる。別の実施形態では、プロモーターは、ＨＣＭＶ ＩＥｐである。
プロモーターはまた、誘導性プロモーター、すなわち、適切なシグナルに応答して上方および／または下方調節されるプロモーターであってもよい。例えば、薬学的剤によって上方調節される発現制御配列は、疼痛管理用途において特に有用である。例えば、プロモーターは、薬学的誘導性プロモーター（例えば、テトラサイクリンに応答する）であり得る。プロモーターは、当技術分野で公知の方法によって、例えば、ゲノムの所与の領域における固有の制限部位の導入によって、ベクターのゲノム内に導入され得る。
Ｇｌｏｒｉｏｓｏらの米国特許公報ＵＳ ７，５３１，１６７では、単純ヘルペスベクターが生成、送達されるプロセス、および疾患の治療のためのそれらの対応する使用について詳細に説明されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードするヌクレオチドを必要としている対象にそれを送達するための単純ヘルペスベクターの使用、ならびにそれを使用する治療方法を企図している。
本発明による有用なアルファウイルスベクター
アルファウイルス発現ベクターは、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、およびベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスを含む、異なるタイプのアルファウイルスから開発されてきた。アルファウイルスレプリコンは、その５’末端に、ウイルスＲＮＡが細胞内にトランスフェクトされたときに翻訳されるウイルス複製体（Ｒｅｐ）をコードするオープンリーディングフレームを含有する。Ｒｅｐは、ポリタンパク質として発現され、その後、四つのサブユニット（ｎｓｐｓ１～４）に処理される。未処理Ｒｅｐは、ＲＮＡベクターをマイナス鎖ＲＮＡにコピーしてもよく、これは、トランスフェクションまたは感染後最初の３～４時間の間のみ行われるプロセスである。処理されると、Ｒｅｐは、より多くのレプリコン分子を合成するためのテンプレートとして、マイナス鎖ＲＮＡを使用することになる。処理されたＲｅｐは、マイナス鎖ＲＮＡ内の内部配列、またはサブゲノムプロモーターを認識することができ、そこから、レプリコンの３’末端に対応するサブゲノムプラス鎖ＲＮＡを合成することになる。このサブゲノムＲＮＡは、翻訳されて、異種タンパク質を大量に産生することになる。
ｎｓｐ２（ｎｓｐ２中のＳＩＮ Ｐ７２６Ｌベクター）中の位置７２６の単一アミノ酸変化（Ｌに対するＰ）を含有するＳＩＮから単離された非細胞変性変異体は、Ｒｅｐハイパープロセシングを示した（Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７３： ３８５４－６５）。この変異体は、ＢＨＫ細胞において連続複製を効率的に確立することができた。この非細胞変性ＳＩＮベクターは、元のＳＩＮベクターで取得されたそれらのうち約４％の良好な安定性レベルおよび発現レベルを有する長期間の導入遺伝子発現を提供することができるため、インビトロで広く使用されている（Ａｇａｐｏｖ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９５： １２９８９－９４）。同様に、Ｓｍｅｒｄｏｕらの特許出願第ＷＯ２００８０６５２２５号は、非細胞変性ＳＦＶベクターが、複製ｎｓｐ２サブユニット中に変異Ｒ６４９Ｈ／Ｐ７１８Ｔを有すると説明している。上述のベクターは、その抵抗性遺伝子がアルファウイルスベクターに組み込まれる抗生物質の存在下で培養することによって、関心対象の遺伝子を構成的かつ安定的に発現することができる細胞株を取得することを可能にする（Ｃａｓａｌｅｓ ｅｔ ａｌ． ２００８． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． ３７６：２４２－５１）。
本発明は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３などの関心対象の遺伝子の配列が、部位特異的組み換えの認識配列とともに組み込まれている、アルファウイルスレプリコンに相補的なＤＮＡ配列を含むベクターを設計することを企図する。前述のベクターによって、関心対象の遺伝子の配列を含むアルファウイルスレプリコンが細胞ゲノム内に組み込まれた細胞を取得および選択することができ、その結果、細胞は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３ポリペプチドを安定的に発現する。本発明はまた、アルファウイルスレプリコンが誘導性プロモーターの制御下にある発現ベクターを生成することも企図する。所与のリガンドの存在下で、アルファウイルスレプリコン転写を調節するプロモーターの活性を正に調節することができる転写アクチベーターをコードする発現カセットを組み込むことによって更に修飾されている細胞に組み込まれたときの前述のベクター。
その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡｒａｎｄａらの米国特許公報ＵＳ １０，０１１，８４７には、アルファウイルスベクターが生成、送達されるプロセス、および疾患治療のためのそれらの対応する使用が詳細に説明されている。本発明は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードするヌクレオチドを必要としている対象にそれを送達するためのアルファウイルスベクターの使用、ならびにそれを使用する治療方法を企図している。
本発明による有用なレンチウイルスベクター
レンチウイルスは、レトロウイルス科のウイルス属に属し、長い潜伏期間によって特徴付けられる。レンチウイルスは、宿主細胞のＤＮＡ内に相当量のウイルスＲＮＡを送達し、非分裂細胞に感染することができるレトロウイルスの中でも独自の能力を有し得る。レンチウイルスベクター、特にＨＩＶ－１由来のそれらは、広く研究されており、頻繁に使用されるベクターである。レンチウイルスベクターバックボーンの進化、および組み換えＤＮＡ分子（導入遺伝子）を標的細胞内に送達するウイルスの能力は、遺伝療法およびインビトロの組み換えタンパク質産生で機能的遺伝子の復元におけるそれらの使用につながっている。
本発明は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３などの目的のタンパク質を発現する好適なプロモーターおよび導入遺伝子を含むレンチウイルスベクターを企図する。典型的には、ベクターのバックボーンは、ＳＩＶ１またはアフリカミドリザルＳＩＶ（ＳＩＶ－ＡＧＭ）などの、類人猿免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）由来である。一実施形態では、プロモーターは、好ましくは、ハイブリッドヒトＣＭＶエンハンサー／ＥＦ１ａ（ｈＣＥＦ）プロモーターである。本発明は、レンチウイルスベクターの製造方法、関心対象の遺伝子を発現するレンチウイルスベクターを含む組成物、ならびに石灰化または骨化の疾患を治療するためにＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質を発現する遺伝子療法における使用を包含する。本発明によるレンチウイルスベクターは、治療用タンパク質の分泌を促進するための遺伝子療法の方法にも使用され得る。更なる例として、本発明は、気道または循環器系の内腔への治療用タンパク質の分泌を提供する。したがって、本発明によるベクターの投与、および気道細胞によるその取り込みは、「工場」としての肺（または鼻もしくは気道）の使用を可能にして、治療用タンパク質を生成してもよく、次いで、治療用タンパク質が分泌され、治療レベルで全身循環に入り、治療効果を引き出すために関心対象の細胞／組織に移動し得る。細胞内または膜タンパク質とは対照的に、そのような分泌されたタンパク質の産生は、形質導入される特定の疾患標的細胞に依存せず、これは、顕著な利点であり、高レベルのタンパク質発現を達成する。したがって、心血管疾患および血液障害などの、気道疾患ではない他の疾患もまた、レンチウイルスベクターによって治療され得る。本発明によるものなどのレンチウイルスベクターは、形質導入された細胞のゲノムに組み込まれ、それらを幹細胞／前駆細胞の形質導入に好適にする長期間の発現につながり得る。
その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡｌｔｏｎらの米国特許出願公開第２０１７／００９６６８４号には、レンチウイルスベクターが生成、送達されるプロセス、および疾患治療のためのそれらの対応する使用が詳細に説明されている。本発明は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードするヌクレオチドをそれを必要とする対象に送達するためのレンチウイルスベクターの使用、ならびにそれを使用する治療方法を企図している。
本発明による非ウイルスベクター
組み換え核酸の非ウイルスベクター系送達には、限定されるものではないが、バリスティックＤＮＡ、エレクトロポレーション、ソノポレーション、フォトポレーション（ｐｈｏｔｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、マグネトフェクション、ハイドドロポレーションなどの物理的方法、およびＤＮＡ／カチオン性脂質（リポプレックス）、ＤＮＡ／カチオン性ポリマー（ポリプレックス）、およびＤＮＡ／カチオン性ポリマー／カチオン性脂質（リポポリプレックス）、イオン化可能な脂質、リピドイド、ペプチド系ベクターおよびポリマー系ベクターの一つ以上の使用を伴う化学的方法が含まれる。（Ｓｅｅ Ｎｏｎｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ： ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ， ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ， ａｎｄ ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ， Ａｌ－Ｄｏｓａｒｉ ＭＳ ｅｔ ａｌ．， ＡＡＰＳ Ｊ． ２００９ Ｄｅｃ； １１（４）：６７１－８１； Ｇａｓｃｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｏｎ ｖｉｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｉｎ Ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ －ｔｏｏｌｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． ２０１３； “Ｎｏｎ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ－ ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．”， Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ： ＪＣＤＲ ｖｏｌ． ９，１ （２０１５）参照）
一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチドまたはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）ポリペプチドの触媒ドメインをコードする組み換え核酸を伝達するために使用される。
一部の実施形態では、非ウイルスベクターは、組み換え核酸を伝達するために使用され、前述の核酸は、（ａ）肝臓特異的プロモーターと、（ｂ）エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチドまたはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、を含む。
脂質系送達の一部の非限定的な例には、カチオン性脂質、脂質ナノエマルジョン、リピドイド脂質ナノ粒子（ＬＰＮ）、および固体脂質ナノ粒子が含まれる。（Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， Ｙｉ Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ Ｇｅｎｅｔ． ２０１４ ； ８８： １３－３６を参照）。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、細胞に、数個のヌクレオチド（ＲＮＡ）から数百万個のヌクレオチド（染色体）の範囲のサイズの様々な核核酸分子を濃縮し送達する力強い能力を示した。ＬＮＰはまた、標的化リガンドの組み込みによって容易に改変されて、肝臓、腎臓、脳、心臓および脾臓などの所望の関心領域への組み換え核酸の焦点送達を容易にすることができる。カチオン性脂質は、典型的には、両方を接続するリンカー構造を有する親水性頭部および疎水性尾部を正に電荷する。正電荷の頭部基は、核酸中で負電荷のホスフェート基と結合し、リポプレックスと呼ばれる固有の圧縮構造を形成する。トランスフェクション効率は、全体的な幾何学的形状、分子当たりの電荷基の数、脂質アンカーの性質、およびリンカーの結合に依存する。リポプレックスは、その正電荷により、負電荷糖タンパク質および細胞膜のプロテオグリカンと静電的に相互作用し、これは細胞の核酸の取込みを促進し得る。遺伝物質を取り囲む正電荷した脂質は、細胞内および細胞外ヌクレアーゼから保護するのに役立つ。
一部の実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの中性ポリマーを、リポプレックスの表面コーティングとして使用して、過剰な電荷を克服し、ＬＮＰの安定性／半減期を延長することができる。一部の実施形態では、ＬＮＰは、一つ以上の鉄飽和トランスフェリン（Ｔｆ）（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）、葉酸（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．， Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ－ｆｒｅｅ， ｌｉｐｏ－ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅｓ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｂｙ ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｐｏｌｙｍｅｒ ｉｎｔｅｒｌａｙｅｒ ｆｏｒ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｎｄ ｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ． ２０１４， ３（２）：２７３－２８２； Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ． ＰＳＡ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ａｎｄ ＰＳＭＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ． ２０１３； ３４（２８）：６９７６－６９９１．）、アルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＲＧＤ－ｌａｂｅｌｅｄ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２０１０； １６（１５）：３９１０－３９２２．； Ｍａｊｚｏｕｂ ｅｔ ａｌ．， Ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ＰＥＧｙｌａｔｅｄ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ＲＧＤ－ｔａｇｇｉｎｇ， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ． ２０１４； ３５（１８）：４９９６－５００５．）、およびアニサミド（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｖｉａ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ． ２００８； １６（５）：９４２－９４６）とのコンジュゲートを含む。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、より特異的な送達、例えば、ジオルトエステル、オルトエステル、ビニルエーテル、ホスホルアミデート、ヒドラジン、およびベータチオプロピオネート（Ｒｏｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｈｅｄｄａｂｌｅ ｃｏａｔｉｎｇｓ ｆｏｒ ｌｏｎｇ－ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ２００８； ２５（１）：５５－７１．）を達成するために、ナノ粒子に適用されるｐＨ感受性リンカーとコンジュゲートされる。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、遺伝子欠損を補正するために、コードされたポリペプチド（ＮＰＰ１またはＮＰＰ３）を発現することができるベクターまたはプラスミドを含む治療用核酸を付着させることによって官能化され得る、磁気ＬＮＰと呼ばれる脂質コーティングを有する磁気コアを有する。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、例えば、ビタミンＡ結合リポソームを使用して、組み換え核酸を肝臓に送達するために、標的部分で修飾される（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｖｉｔａｍｉｎ Ａ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｔｏ ｄｅｌｉｖｅｒ ｓｉＲＮＡ ａｇａｉｎｓｔ ａ ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ２００８； ２６（４）：４３１－４４２．）。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、それらが、限定されるものではないが、コラーゲンタイプＶＩ受容体（Ｄｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｙｃｌｉｃ Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｌａｂｅｌｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｒｕｇ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｒａｔｓ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． ２００７； ３２２（２）：５６０－５６８．）、マンノース－６－ホスフェート受容体（Ａｄｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｌｉｐｉｄ－ｂａｓｅｄ ｄｒｕｇ ｃａｒｒｉｅｒ ｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅｌｌａｔｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｉｎ ｂｉｌｅ ｄｕｃｔ－ｌｉｇａｔｅｄ ｒａｔｓ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． ２００７； ３２１（２）： ５３６－５４３）、およびガラクトース受容体（Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ ａｇａｉｎｓｔ ａｒｓｅｎｉｔｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． ２００７； ３２０（３）：９９４－１００１）などの特異的受容体に向けられるように、標的部分で修飾される。
イオン化可能な脂質は、ポリアニオン性核酸と混合された場合にナノ粒子に自己構築できる脂質のクラスである。ｐＫａ値が調節されたイオン化可能なカチオン性脂質は、核酸ペイロードを増加させ、遺伝子療法の治療有効性を強化する。低ｐＨ状態である製剤化のステップでは、イオン化可能な脂質は、正電荷となり、高い核酸負荷をもたらす。注射時に、ｐＨがイオン化可能な脂質のｐＫａを超える生理学的環境では、ＬＮＰの表面は、網膜内皮系（ＲＥＳ）取り込みを回避し、循環を改善し、毒性を低減できるほぼ中性電荷を有する。しかしながら、ナノ粒子が、ｐＨが脂質のｐＫａよりも低いエンドソーム内に取り込まれると、イオン化可能な脂質のアミノ基はプロトン化され、アニオン性エンドソーム脂質と会合し、エンドソームの脱出を促進する。イオン化可能なカチオン性脂質の一部の非限定的な例としては、６．７のｐＫａを有するＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（２，２－ジリン－オレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン）、および６．４のｐＫａを有するＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン）が挙げられる。（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｃ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ， Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ． ２０１２； ５１（３４）：８５２９－８５３３）。
リピドイドは、三級アミンを含有する脂質様物質の新しいクラスである。それらは、市販のアミンをコンジュゲートすることによって調製される。特に、リピドイドライブラリーを生成するための合成反応は、溶媒または触媒の非存在下で進行し、それによって精製または濃縮ステップを取り除く。リピドイドおよび脂質は、遺伝子送達のためのリポソームの形成を駆動する物理化学的特性の多くを共有する。しかしながら、リピドイドは合成および精製が容易であり、効率的なＤＮＡ送達のためのコリピド（ｃｏｌｉｐｉｄ）を必要としない。（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｌｉｐｉｄｏｉｄ ｓｉＲＮＡ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ． ２００９； １７（５）：８７２－８７９．； Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｌｉｐｉｄｏｉｄｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． ２０１２； ２３（１）：１３５－１４０参照）。
脂質エマルションは、乳化剤によって安定化された別の液体中の一つの非混和性液体の分散液である。それらは、約２００ｎｍの粒子であり、オイル、水、および界面活性剤を含む。組み換え核酸は、脂質エマルションの生成前に混合物に添加され、これにより、エマルションにて生成されたナノ粒子によって核酸を封入することができる。
固体脂質粒子は、室温および体温の両方で固体状態のままである脂質から生成される。それは、カチオン性脂質および脂質ナノエマルジョンの両方の利点を有する。カチオン性固体脂質ナノ粒子は、ヌクレアーゼ分解から核酸を効果的に保護することができる。
ペプチド系ベクターは、タイトでコンパクトで、ＤＮＡ、標的特異的細胞受容体を保護し、エンドソーム膜を破壊し、遺伝子カーゴを核内に送達するという点において、他の非ウイルスベクターよりも有利である。リジンおよび／またはアルギニンなどの塩基性残基が豊富なカチオン性ペプチドは、組み換え核酸の送達に一般的に使用される。ペプチドリガンドをポリプレックスまたはリポプレックスに付加することにより、ベクターを特定の標的に向けることができる。一部の実施形態では、ウイルスタンパク質から採取された短いペプチド配列は、ベクターが、遺伝物質の核内への輸送を支援する核局在化シグナルを提供することを可能にする。これらの利点のために、ペプチドはカチオン性リポプレックスまたはポリプレックスを機能化するために頻繁に使用される（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｃｔｏｒｓ， Ｊ Ｍａｔｅｒ Ｃｈｅｍ Ｂ ． ２０１９ Ｍａｒ ２１；７（１１）：１８２４－１８４１参照）。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、ペプチド系ベクターの一つかかるクラスであり、ＣＰＰは、インビトロおよびインビボの両方で細胞内に組み換え核酸を送達する能力を有する比較的短い、カチオン性、および／または両親媒性ペプチドである。（前述のＨａｓｓａｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂ Ｃｅｌｌ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ： ｏｖｅｒｖｉｅｗ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ２０１０ Ｍａｒ； ６７（５）：７１５－２６．参照）
カチオン性ポリマーなどのポリマー系ベクターは、ＤＮＡと混合して、ポリプレックスと呼ばれるナノサイズの複合体を形成する。ポリプレックスは、リポプレックスよりも安定している。ポリマーは、天然および合成ポリマーに分類される。天然ポリマーの一部の非限定的な例としては、キトサン、タンパク質、およびペプチドなどの多糖類が挙げられる。キトサンは、カチオン性多糖類に基づく天然ポリマーである。それは、高濃度であっても毒性はない。それは、グルコサミンから構成される直鎖状カチオン性多糖類である。キトサンの正電荷は、負電荷を帯びたＤＮＡと静電気的に結合する。その粘膜付着性の特性を考慮すると、キトサン／ＤＮＡポリプレックスは、経口および経鼻遺伝子療法に適している。一部の実施形態では、キトサンは、葉酸とコンジュゲートされて、細胞内バリアを効果的に通過する。
合成ポリマーの一部の非限定的な例としては、ポリエチレン鉱物（ＰＥＩ）、デンドリマー、およびポリホスホエステルが挙げられる。ＰＥＩなどのカチオン性ポリマーは、高密度アミン基を有し、これはタンパク質スポンジ効果を発揮し、最終的にエンドソームｐＨの酸性化を停止する。これにより、コンパートメント内に塩化物が流入し、浸透圧が上昇し、エンドソーム膜の膨張および破裂につながる。一部の実施形態では、組み換え核酸の送達に使用される合成ポリマーは、生分解性である。ポリ（ＤＬ－ラクチド）（ＰＬＡ）およびポリ（ＤＬ－ラクチド－コ－グリコシド）（ＰＬＧＡは、生分解性ポリエステルであり、バルク加水分解を受け、結果として組み換え核酸の持続的送達を提供する。デンドリマーは、サイズおよび形状が対称であり、端末基の機能を備える。デンドリマーは、正に電荷された周辺基が生理的ｐＨで核酸と相互作用する場合、組み換え核酸に結合する。ナノメートルサイズのため、細胞膜、細胞小器官、およびタンパク質と効果的に相互作用することができる。ポリメタクリレートは、ポリヌクレオチドをナノメートルサイズの粒子に凝縮することができるビニル系ポリマーである。
したがって本開示は、組み換え核酸を送達する非ウイルスベクターの使用を想定し、前述の核酸は、前述のコードされたポリペプチドを発現することができるベクターまたはプラスミドを含む。
配列
配列番号１ － ＥＮＰＰ１アミノ酸配列 － 野生型（位置３３２は太字で示されている）
Figure 2023548758000003
Figure 2023548758000004
Figure 2023548758000005
上述のＮＰＰ１アミノ酸配列は、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、ＳＭＢ１ドメイン、ＳＭＢ２ドメイン、ホスホジエステラーゼ／触媒ドメイン、リンカードメイン、およびヌクレアーゼドメインを含む。ＳＭＢ１ドメイン、ＳＭＢ２ドメイン、触媒ドメイン、リンカードメイン、およびヌクレアーゼドメインは、合わせて細胞外ドメインと呼ばれる。残基１～７６（Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ａｒｇ～Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ）は、細胞質ドメインに対応する。残基７７～９７（Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ～Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ）は、膜貫通ドメインに対応する。残基９９～９２５（Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）は、細胞外ドメインに対応する。残基１０４～１４４（Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ～Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ）はＳＭＢ１ドメインに対応し、残基１４５－１８９（Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｔｒｐ～Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ）はＳＭＢ２ドメインに対応する。残基５９７～６４７は、触媒ドメインとヌクレアーゼドメインを接続するリンカードメインに対応する。残基１９１～５９１（Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ～Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ）は、触媒／ホスホジエステラーゼドメインに対応する。残基６５４～９２５（Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）は、ヌクレアーゼドメインに対応する。残基番号およびドメイン分類は、ヒトＮＰＰ１配列に基づく（ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００６１９９／Ｕｎｉｐｒｏｔ－Ｓｕｓｓｐｒｏｔ Ｐ２２４１３）。
配列番号２ － アズロシジン－ＥＮＰＰ１－ＦＣ
Figure 2023548758000006
 単一下線－アズロシジンシグナル配列、二重下線－ＥＮＰＰ１配列の始まりおよび終わり、太字残基－Ｆｃ配列、＊＊は、シグナル配列の切断点を示す。
配列番号３ － アズロシジン－ＥＮＰＰ１－Ａｌｂ
Figure 2023548758000007
 単一下線－アズロシジンシグナル配列、二重下線－ＥＮＰＰ１配列の始まりおよび終わり、太字残基－アルブミン配列、＊＊は、シグナル配列の切断点を示す。
配列番号４ － アズロシジン－ＥＮＰＰ１
Figure 2023548758000008
 単一下線－アズロシジンシグナル配列、二重下線－ＥＮＰＰ１配列の始まりおよび終わり、＊＊は、シグナル配列の切断点を示す。
配列番号５ － ＥＮＰＰ２アミノ酸配列－野生型
Figure 2023548758000009
Figure 2023548758000010
Figure 2023548758000011
配列番号６ － ＥＮＰＰ３の細胞外ドメイン：
Figure 2023548758000012
Figure 2023548758000013
Figure 2023548758000014
配列番号７ － ＮＰＰ３アミノ酸配列：
Figure 2023548758000015
Figure 2023548758000016
Figure 2023548758000017
上述のＮＰＰ３アミノ酸配列は、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、ホスホジエステラーゼ／触媒ドメイン、およびヌクレアーゼドメインを含む。触媒ドメインおよびヌクレアーゼドメインは、合わせて細胞外ドメインと呼ばれる。残基１～１１（Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｓｅｒ～Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｕ）は、細胞質ドメインに対応する。残基１２～３０（Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ～Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ）は、膜貫通ドメインに対応する。残基３１～８７５（Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ～Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｉｌｅ）は、細胞外ドメインに相当する。残基１４０～５１０（Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ～Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ）は、触媒／ホスホジエステラーゼドメインに対応する。残基６０５～８７５（Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ～Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｉｌｅ）は、ヌクレアーゼドメインに対応する。残基番号およびドメイン分類は、ヒトＮＰＰ３配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｏ１４６３８．２）に基づく。
配列番号８ － アズロシジン－ＥＮＰＰ３－ＦＣ
Figure 2023548758000018
 単一下線－アズロシジンシグナル配列、二重下線－ＥＮＰＰ３配列の始まりおよび終わり、太字残基－Ｆｃ配列、＊＊は、シグナル配列の切断点を示す。
配列番号９ － アズロシジン－ＥＮＰＰ３－アルブミン
Figure 2023548758000019
 単一下線－アズロシジンシグナル配列、二重下線－ＥＮＰＰ３配列の始まりおよび終わり、太字残基－アルブミン配列、＊＊は、シグナル配列の切断点を示す。
配列番号１０ － アズロシジン－ＥＮＰＰ３
Figure 2023548758000020
 単一下線－アズロシジンシグナル配列、二重下線－ＥＮＰＰ３配列の始まりおよび終わり、＊＊は、シグナル配列の切断点を示す。
配列番号１１ － ＥＮＰＰ４アミノ酸配列－野生型
Figure 2023548758000021
Figure 2023548758000022
配列番号１２ － ＥＮＰＰ５１アミノ酸配列
Figure 2023548758000023
Figure 2023548758000024
Figure 2023548758000025
 単一下線：シグナルペプチド配列、二重下線：ＮＰＰ１の始まりおよび終わり、＊＊＝シグナルペプチド配列での切断位置
配列番号１３ － ＥＮＰＰ５１－ＡＬＢアミノ酸配列：
Figure 2023548758000026
Figure 2023548758000027
Figure 2023548758000028
Figure 2023548758000029
 単一下線：シグナルペプチド配列、二重下線：ＮＰＰ１の始まりおよび終わり、＊＊＝シグナルペプチド配列での切断位置、太字残基は、アルブミン配列を示す
配列番号１４ － ＥＮＰＰ５－ＮＰＰ３－Ｆｃ配列
Figure 2023548758000030
Figure 2023548758000031
Figure 2023548758000032
 単一下線：シグナルペプチド配列、二重下線：ＮＰＰ３３の始まりおよび終わり、＊＊＝シグナルペプチド配列での切断位置、太字残基は、アルブミン配列を示す
配列番号１５ － ＥＮＰＰ５－ＮＰＰ３－アルブミン配列
Figure 2023548758000033
Figure 2023548758000034
Figure 2023548758000035
Figure 2023548758000036
 単一下線：シグナルペプチド配列、二重下線：ＮＰＰ３の始まりおよび終わり、＊＊＝シグナルペプチド配列での切断位置、太字残基は、アルブミン配列を示す
配列番号１６ － ＥＮＰＰ５タンパク質輸出シグナル配列
Figure 2023548758000037
配列番号１７ － ＥＮＰＰ５－１－Ｆｃ
Figure 2023548758000038
Figure 2023548758000039
Figure 2023548758000040
 単一下線：シグナルペプチド配列、二重下線：ＮＰＰ３の始まりおよび終わり、＊＊＝シグナルペプチド配列での切断位置、太字残基は、Ｆｃ配列を示す
配列番号１８ － ＥＮＰＰ７－１－Ｆｃアミノ酸配列
Figure 2023548758000041
Figure 2023548758000042
Figure 2023548758000043
 単一下線：シグナルペプチド配列、二重下線：ＮＰＰ１の始まりおよび終わり、＊＊＝シグナルペプチド配列での切断位置、太字残基は、Ｆｃ配列を示す
配列番号１９ － ＥＮＰＰ７１（ＮＰＰ１ Ｎ末端ＧＬＫを欠く）アミノ酸配列：
Figure 2023548758000044
Figure 2023548758000045
Figure 2023548758000046
 単一下線：シグナルペプチド配列、二重下線：ＮＰＰ３の始まりおよび終わり、＊＊＝シグナルペプチド配列での切断位置
配列番号２０ － ＥＮＰＰ７１（ＮＰＰ１ Ｎ末端ＧＬＫを欠く）Ｆｃアミノ酸配列：
Figure 2023548758000047
Figure 2023548758000048
Figure 2023548758000049
 単一下線：シグナルペプチド配列、二重下線：ＮＰＰ１の始まりおよび終わり、＊＊＝シグナルペプチド配列での切断位置、太字残基は、Ｆｃ配列を示す
配列番号２１ － ＥＮＰＰ７－１（ＮＰＰ１ Ｎ末端ＧＬＫを欠く）－ＡＬＢアミノ酸配列
Figure 2023548758000050
Figure 2023548758000051
Figure 2023548758000052
Figure 2023548758000053
 単一下線：シグナルペプチド配列、二重下線：ＮＰＰ１の始まりおよび終わり、＊＊＝シグナルペプチド配列での切断位置、太字残基は、アルブミン配列を示す
配列番号２２ － ＥＮＰＰ７－ＮＰＰ３－Ｆｃ配列：
Figure 2023548758000054
Figure 2023548758000055
Figure 2023548758000056
 単一下線：シグナルペプチド配列、二重下線：ＮＰＰ３の始まりおよび終わり、＊＊＝シグナルペプチド配列での切断位置、太字残基は、Ｆｃ配列を示す
配列番号２３ － ＥＮＰＰ７－１－アルブミン
Figure 2023548758000057
Figure 2023548758000058
Figure 2023548758000059
Figure 2023548758000060
 単一下線：シグナルペプチド配列、二重下線：ＮＰＰ３の始まりおよび終わり、＊＊＝シグナルペプチド配列での切断位置、太字残基は、Ｆｃ配列を示す
配列番号２４ － ＥＮＰＰ７－ＮＰＰ３－アルブミン
Figure 2023548758000061
Figure 2023548758000062
Figure 2023548758000063
Figure 2023548758000064
 単一下線：シグナルペプチド配列、二重下線：ＮＰＰ３の始まりおよび終わり、＊＊＝シグナルペプチド配列での切断位置、太字残基は、アルブミン配列を示す
配列番号２５ － ＥＮＰＰ７－ＥＮＰＰ３－アルブミン
Figure 2023548758000065
Figure 2023548758000066
Figure 2023548758000067
Figure 2023548758000068
Figure 2023548758000069
 単一下線：シグナルペプチド配列、二重下線：ＮＰＰ３の始まりおよび終わり、＊＊＝シグナルペプチド配列での切断位置、太字残基は、アルブミン配列を示す
配列番号２６ － ＥＮＰＰ７１－ＧＬＫアミノ酸配列
Figure 2023548758000070
Figure 2023548758000071
Figure 2023548758000072
 単一下線：シグナルペプチド配列、二重下線：ＮＰＰ１の始まりおよび終わり、＊＊＝シグナルペプチド配列での切断位置
配列番号２７ － ＥＮＰＰ１２１アミノ酸配列
Figure 2023548758000073
Figure 2023548758000074
Figure 2023548758000075
 単一下線：シグナルペプチド配列、二重下線：ＮＰＰ１の始まりおよび終わり、＊＊＝シグナルペプチド配列での切断位置
配列番号番号：２８ － ＥＮＰＰ１２１－Ｆｃアミノ酸配列
Figure 2023548758000076
Figure 2023548758000077
Figure 2023548758000078
Figure 2023548758000079
 単一下線：シグナルペプチド配列、二重下線：ＮＰＰ１の始まりおよび終わり、＊＊＝シグナルペプチド配列での切断位置、太字残基は、Ｆｃ配列を示す
配列番号２９ － ＥＮＰＰ１２１－ＡＬＢアミノ酸配列：
Figure 2023548758000080
Figure 2023548758000081
Figure 2023548758000082
Figure 2023548758000083
Figure 2023548758000084
 単一下線：シグナルペプチド配列、二重下線：ＮＰＰ１の始まりおよび終わり、＊＊＝シグナルペプチド配列での切断位置、太字残基は、アルブミン配列を示す
配列番号３０ － ＥＮＰＰ１２１－ＮＰＰ３－Ｆｃ配列
Figure 2023548758000085
Figure 2023548758000086
Figure 2023548758000087
Figure 2023548758000088
 単一下線：シグナルペプチド配列、二重下線：ＮＰＰ１の始まりおよび終わり、＊＊＝シグナルペプチド配列での切断位置、太字残基は、Ｆｃ配列を示す
配列番号３１ － ＥＮＰＰ１２１－ＮＰＰ３－アルブミン配列
Figure 2023548758000089
Figure 2023548758000090
Figure 2023548758000091
Figure 2023548758000092
Figure 2023548758000093
 単一下線：シグナルペプチド配列、二重下線：ＮＰＰ３の始まりおよび終わり、＊＊＝シグナルペプチド配列での切断位置、太字残基は、アルブミン配列を示す
配列番号３２ － ＥＮＰＰ１２１ＧＬＫタンパク質輸出シグナル配列
Figure 2023548758000094
配列番号３３ － アルブミン配列
Figure 2023548758000095
Figure 2023548758000096
配列番号３４ － ヒトＩｇＧ Ｆｃドメイン、Ｆｃ
Figure 2023548758000097
配列番号３５ － アルブミン配列
Figure 2023548758000098
Figure 2023548758000099
配列番号３６ － ＥＮＰＰ２シグナルペプチド
Figure 2023548758000100
配列番号３７ － シグナル配列ＥＮＰＰ７
Figure 2023548758000101
配列番号３８ － シグナル配列ＥＮＰＰ７
Figure 2023548758000102
配列番号３９ － シグナル配列ＥＮＰＰ１－２－１
Figure 2023548758000103
配列番号４０ － ｅｘＥＮＰＰ３
Figure 2023548758000104
配列番号４１ － シグナル配列ＥＮＰＰ５：
Figure 2023548758000105
配列番号４２ － アズロシジン－ＥＮＰＰ１－ＦＣヌクレオチド配列
Figure 2023548758000106
 凡例：青＝制限部位、太字＝開始／終止コドン、緑＝コザック配列、下線＝シグナルペプチドのヌクレオチド配列。
配列番号４３ － アズロシジン－ＥＮＰＰ１－アルブミンヌクレオチド配列
Figure 2023548758000107
Figure 2023548758000108
配列番号４４ － アズロシジン－ＥＮＰＰ１ヌクレオチド配列
Figure 2023548758000109
配列番号４５ － アズロシジン－ＥＮＰＰ３－ＦＣヌクレオチド配列
Figure 2023548758000110
配列番号４６ － アズロシジン－ＥＮＰＰ３－アルブミンヌクレオチド配列
Figure 2023548758000111
Figure 2023548758000112
配列番号４７ － アズロシジン－ＥＮＰＰ３－ＦＣヌクレオチド配列
Figure 2023548758000113
配列番号４８ － ＥＮＰＰ７－１－Ｆｃヌクレオチド配列
Figure 2023548758000114
Figure 2023548758000115
配列番号４９ － ＥＮＰＰ７－ＮＰＰ１アルブミンヌクレオチド配列：
Figure 2023548758000116
Figure 2023548758000117
配列番号５０ － ＮＰＰ１２１－ＮＰＰ３－Ｆｃのヌクレオチド配列
Figure 2023548758000118
Figure 2023548758000119
配列番号５１ － ＮＰＰ１２１－ＮＰＰ３－Ｆｃのヌクレオチド配列
Figure 2023548758000120
Figure 2023548758000121
配列番号５２ － ｈＮＰＰ３－ｈＦｃ－ｐｃＤＮＡ３のヌクレオチド配列
Figure 2023548758000122
Figure 2023548758000123
Figure 2023548758000124
Figure 2023548758000125
配列番号５３ － ＥＮＰＰ１２１－Ｆｃヌクレオチド配列
Figure 2023548758000126
Figure 2023548758000127
配列番号５４ － ＥＮＰＰ１２１－ アルブミンヌクレオチド配列
Figure 2023548758000128
Figure 2023548758000129
配列番号５５ － ＥＮＰＰ３ヌクレオチド配列
Figure 2023548758000130
配列番号５６ － ＥＮＰＰ１ヌクレオチド配列：
Figure 2023548758000131
配列番号５７ － リンカー
Figure 2023548758000132
配列番号５８ － リンカー
Figure 2023548758000133
配列番号５９ － リンカー
Figure 2023548758000134
配列番号６０ － リンカー
Figure 2023548758000135
配列番号６１ － リンカー
Figure 2023548758000136
配列番号６２ － リンカー
Figure 2023548758000137
配列番号６３ － リンカー
Figure 2023548758000138
配列番号６４ － リンカー
Figure 2023548758000139
配列番号６５ － リンカー
Figure 2023548758000140
配列番号６６ － リンカー
Figure 2023548758000141
配列番号６７ － リンカー
Figure 2023548758000142
配列番号６８ － リンカー
Figure 2023548758000143
配列番号６９ － リンカー
Figure 2023548758000144
配列番号７０ － リンカー
Figure 2023548758000145
配列番号７１ － リンカー
Figure 2023548758000146
配列番号７２ － リンカー
Figure 2023548758000147
配列番号７３ － リンカー
Figure 2023548758000148
配列番号７４ － リンカー
Figure 2023548758000149
配列番号７５ － リンカー
Figure 2023548758000150
配列番号７６ － リンカー
Figure 2023548758000151
配列番号７７ － リンカー
Figure 2023548758000152
配列番号７８ － リンカー
Figure 2023548758000153
配列番号７９ － リンカー
Figure 2023548758000154
配列番号８０ － リンカー
Figure 2023548758000155
配列番号８１ － リンカー
Figure 2023548758000156
配列番号８２ － リンカー
Figure 2023548758000157
配列番号８３ － リンカー
Figure 2023548758000158
配列番号８４ － リンカー
Figure 2023548758000159
配列番号８５ － リンカー
Figure 2023548758000160
配列番号８６ － リンカー
Figure 2023548758000161
配列番号８７ － リンカー
Figure 2023548758000162
配列番号８８ － リンカー
Figure 2023548758000163
配列番号８９－可溶性ＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質配列
Figure 2023548758000164
Figure 2023548758000165
 二重下線：ＮＰＰ１の始まりと終わり；太字の残基はＦｃ配列を示す
配列番号９０ － 可溶性ＮＰＰ１－Ｆｃのヌクレオチド配列
Figure 2023548758000166
Figure 2023548758000167
配列番号９１－可溶性ＮＰＰ１－（ＧＬＫ）－Ｆｃ融合タンパク質配列
Figure 2023548758000168
Figure 2023548758000169
 二重下線：ＮＰＰ１の始まりと終わり；太字の残基はＦｃ配列を示す
配列番号９２－可溶性ＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質配列
Figure 2023548758000170
Figure 2023548758000171
 二重下線：ＮＰＰ１の始まりと終わり；太字の残基はＦｃ配列を示す
配列番号９３－可溶性ＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質配列
Figure 2023548758000172
Figure 2023548758000173
 二重下線：ＮＰＰ１の始まりと終わり；太字の残基はＦｃ配列を示す
配列番号９４－リンカー
Figure 2023548758000174
配列番号９５－ ＥＮＰＰ１－Ｆｃバリアントの例－（ＥＮＰＰ１部分はＩ３３２Ｔ変異（配列番号１に示されるＥＮＰＰ１ ＷＴタンパク質に基づく変異位置番号）を有し、ＩｇＧ１ Ｆｃ部分はＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ変異およびＴ２５６Ｅ変異（ＥＵ番号による変異位置）を有する
Figure 2023548758000175
アノテーションキー：
・下線のアミノ酸配列：アズロシジンシグナルペプチド；
・二重下線のアミノ酸配列：３３２位で単一アミノ酸置換を含むバリアントヒト可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド（Ｉ３３２Ｔ、太字）；
・イタリック体アミノ酸配列：リンカーアミノ酸配列、および
・非修飾アミノ酸配列部分：太字で識別された三つのアミノ酸置換を含むバリアントヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分。
配列番号９６－ＥＮＰＰ３－Ｆｃバリアントの例－（ＥＮＰＰ３部分は変異を有さず、ＩｇＧ１ Ｆｃ部分はＥＵ番号によるＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ変異を有する）
Figure 2023548758000176
アノテーションキー：
・下線のアミノ酸配列：アズロシジンシグナルペプチド；
・二重下線のアミノ酸配列：バリアントヒト可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド
・イタリック体アミノ酸配列：リンカーアミノ酸配列、および
・非修飾アミノ酸配列部分：太字で識別された三つのアミノ酸置換を含むバリアントヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分。
＊＊ － シグナル配列の切断点を示す。
配列番号９７－ ハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）
Figure 2023548758000177
本発明による医薬組成物
本発明によるＡＡＶベクターは、医薬組成物における前述のベクターの製剤化を必要とする従来的な方法によって、ヒトまたは動物の体に投与することができる。一実施形態では、本発明は、組み換えウイルスゲノムを含むＡＡＶベクターを含む医薬組成物（以下、本発明による医薬組成物という）に関し、前述の組み換えウイルスゲノムは、ＥＮＰＰ１もしくはＥＮＰＰ３またはその機能的に等価なバリアントをコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された転写調節領域を含む発現カセットを含む。
アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスベクター、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターに関連して開示されるすべての実施形態は、本発明による医薬組成物にも適用可能である。
一部の実施形態では、医薬組成物は、本発明によるＡＡＶベクターの治療有効量および薬学的に許容可能な担体を含み得る。一部の実施形態では、医薬組成物は、本発明によるアデノウイルスベクターの治療有効量および薬学的に許容可能な担体を含み得る。
一部の実施形態では、医薬組成物は、本発明によるレンチウイルスベクターの治療有効量および薬学的に許容可能な担体を含み得る。
一部の実施形態では、医薬組成物は、本発明によるアルファウイルスベクターの治療有効量および薬学的に許容可能な担体を含み得る。
一部の実施形態では、医薬組成物は、本発明による単純ヘルペスウイルスベクターの治療有効量および薬学的に許容可能な担体を含み得る。
用語「治療有効量」は、所望の効果を生成するために計算された本発明によるＡＡＶベクターの数量を指し、他にも理由はあるが、本発明によるウイルスベクターの自体の特徴および得られる治療効果によって一般的に決定される。疾患の治療に有効であろう本発明によるウイルスベクターの量は、本明細書に記載される、または当技術分野で公知の標準的な臨床技術によって決定することができる。さらに、インビトロ試験を任意選択的に使用して、最適な用量範囲の特定を助けることもできる。製剤で使用するための正確な用量は、投与経路、および状態の重症度に依存し、医師の判断で、および各患者の状況に応じて決定されるべきである。
プロモーター
遺伝子療法で使用されるベクターは、発現カセットを必要とする。発現カセットは、プロモーター、治療遺伝子、およびポリアデニル化信号の三つの重要な構成要素からなる。プロモーターは、治療遺伝子の発現を制御するために不可欠である。組織特異的プロモーターは、特定の細胞型においてのみ活性を有するプロモーターである。発現カセットにおける組織特異的プロモーターの使用は、望ましくない導入遺伝子発現を制限し、また持続的な導入遺伝子発現を促進することができる。遺伝子治療に一般的に使用されるプロモーターには、サイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ－ＩＥ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスロング末端反復（ＲＳＶ－ＬＴＲ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲ、および他のレトロウイルスＬＴＲプロモーターが含まれる。真核性プロモーターは、遺伝子療法に使用することができる。真核性プロモーターの一般的な例としては、ヒトａ１－抗トリプシン（ｈＡＡＴ）およびマウスＲＮＡポリメラーゼＩＩ（大型サブユニット）プロモーターが挙げられる。小核ＲＮＡ Ｕ１ｂプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、およびＰＧＫ１プロモーターなどの非組織特異的プロモーターも、遺伝子療法での使用に利用可能である。Ａｐｏ Ａ－Ｉ、ＡｐｏＥおよびａ１－抗トリプシン（ｈＡＡＴ）などの組織特異的プロモーターは、遺伝子療法における目的のタンパク質の組織特異的発現を可能にする。Ｐａｐａｄａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．の表Ｉ（Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ： Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２００４， ４， ８９－１１３）は、遺伝子療法における真核性プロモーターを使用した転写標的化の例を列挙しており、それらすべては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
用量および投与方法
ＡＡＶ力価は、１ｍｌ（ｖｇ／ｍｌ）または（ｖｇ／ｋｇ）のベクターまたはウイルスゲノム当たりの１キログラム用量当たりのベクターまたはウイルスゲノムにおける「物理的」力価として与えられる。精製されたベクター粒子のＱＰＣＲを使用して、力価を決定することができる。ＡＡＶ ＶＧ数滴定を実施する方法の一つは、以下のとおりである：精製されたＡＡＶベクター試料は、最初にＤＮａｓｅで処理され、生産プロセスからカプシド化されていないＡＡＶゲノムＤＮＡまたは汚染プラスミドＤＮＡを除去する。次に、ＤＮａｓｅ耐性粒子を熱処理して、カプシドからゲノムを放出する。放出されたゲノムは、ウイルスゲノムの特定の領域を標的とするプライマー／プローブセットを使用したリアルタイムＰＣＲによって定量化される。
ウイルス組成物は、ヒト患者に対して、約１．０×１０９ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、および好ましくは１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇの範囲内の量のウイルスベクターを含む用量単位で製剤化され得る。好ましくは、製剤中のウイルスの用量は、１．０×１０９ｖｇ／ｋｇ、５．０×１０９ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０１０ｖｇ／ｋｇ、５．０×１０１０ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０１１ｖｇ／ｋｇ、５．０×１０１１ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、５．０×１０１２ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、５．０×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、５．０×１０１４ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０１５ｖｇ／ｋｇ、または５．０×１０１５ｖｇ／ｋｇである。
一部の実施形態では、本発明による文脈において哺乳動物、特にヒトに投与される用量は、特定のウイルスベクター、ベクターおよびその担体を含有する組成物（上記で論じたように）、および投与様式によって変化する。用量は、望ましい応答、例えば、治療的または予防的応答を、望ましい時間枠内でもたらすのに十分な量である。ウイルスベクターに関しては、用量は、最大１×１０１５ｖｇ／ｋｇとすることができる。
本発明のベクターは、長期の遺伝子発現を可能にし、治療用タンパク質の長期効果をもたらす。「長期的発現」、「維持的発現」および「持続的発現」という語句は、互換的に使用される。本発明による長期的発現は、好ましくは治療レベルでの、少なくとも４５日間、少なくとも６０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１２０日間、少なくとも１８０日間、少なくとも２５０日間、少なくとも３６０日間、少なくとも４５０日間、少なくとも７３０日間以上の、治療遺伝子および／またはタンパク質の発現を意味する。好ましくは、長期的発現は、少なくとも９０日間、少なくとも１２０日間、少なくとも１８０日間、少なくとも２５０日間、少なくとも３６０日間、少なくとも４５０日間、少なくとも７２０日間以上、より好ましくは、少なくとも３６０日間、少なくとも４５０日間、少なくとも７２０日間以上の発現を意味する。この長期的発現は、反復投与（可能であれば）または単回投与によって達成され得る。
反復投与は、１日２回、１日１回、週２回、週１回、月１回、二か月毎、三か月毎、四か月毎、六か月毎、一年毎、二年毎以上の期間毎で投与されてもよい。投薬は、例えば、少なくとも六か月、少なくとも一年、二年、三年、四年、五年、十年、十五年、二十年以上の期間、治療される患者の生涯に至るまで、必要なだけ継続され得る。
本発明による医薬組成物は、局所的または全身的に、筋肉内、静脈内および非経口的に投与され得る。本発明による治療用組成物の送達は、中枢神経系、心臓系、および肺系に向けることができる。一般的な送達戦略は、直接的な筋肉注射である。非限定的な例として、骨格筋は、効率的に形質導入される標的組織型であることが示されている。形質導入されると、筋細胞は、多くのＡＡＶバリアントによって局所的または全身的に作用できるタンパク質産物の産生部位としての役目を果たす。
一実施形態では、医薬組成物は、その細胞が形質導入される組織または器官の近くに投与される。特定の実施形態では、本発明による医薬組成物は、肝実質内への注射により、肝内で局所的に投与される。別の実施形態では、本発明による医薬組成物は全身的に投与される。
非限定的な例として、全身投与は、例えば筋肉内（ｉｍ）、血管内（ｉｅ）、動脈内（ｉａ）、静脈内（ｉｖ）、腹腔内（ｉｐ）、または皮下注射などの本発明によるＡＡＶベクターの全身注射を含む。好ましくは、全身投与は、ｉｍ、ｉｐ、ｉｓ、またはｉｖ注射を介したものである。一部の実施形態では、本発明によるＡＡＶベクターは、静脈内注射を介して投与される。
別の実施形態では、本発明による医薬組成物は、対象の肝臓に送達される。肝臓への投与は、限定されないが、静脈内投与、門脈内投与、胆管内投与、動脈内投与、および肝実質への直接注射を含む、当技術分野に公知の方法を使用して達成される。別の実施形態では、医薬組成物は静脈内投与される。
本発明による医薬組成物は、単回投与で投与されてもよく、または本発明による特定の実施形態では、複数の用量（例えば、二回、三回、四回以上の投与）を使用して治療効果を達成してもよい。好ましくは、本発明による医薬組成物に含まれるＡＡＶベクターは、中和抗体の効果を取り除くために複数回用量が必要とされる場合、異なる血清型由来である。
製剤
調製物はまた、緩衝塩を含んでもよい。代替的に、組成物は、使用前に適切なビヒクル（例えば、滅菌された発熱物質を含まない水）を用いる構成のための粉末形態であってもよい。必要に応じて、組成物はまた、注射部位の痛みを軽減するためのリドカインなどの局所麻酔薬を含んでもよい。組成物が浸潤によって投与される場合、医薬品質の水または生理食塩水を含有する浸潤ボトルで分注することができる。組成物が注射によって投与される場合、注射液または滅菌生理食塩水のために水バイアルが提供されてもよく、それによって、成分が投与前に混合され得る。好ましくは、薬学的に許容可能な担体は、生理食塩水およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）などの洗浄剤である。
本発明による組成物は、獣医学用途で動物（例えば、家畜（ウシ、ブタ、その他））、および他の非ヒト哺乳類対象、ならびにヒト対象への送達のために製剤化されてもよい。ＡＡＶベクターは、遺伝子導入および遺伝子治療の適用において使用する生理学的に許容可能な担体を用いて製剤化することができる。非限定的な例として、本発明によるＡＡＶベクターと組み合わせた、または混合したアジュバントの使用も包含される。企図されるアジュバントには、鉱塩アジュバントまたは鉱塩ゲルアジュバント、粒子アジュバント、微粒子アジュバント、粘膜アジュバントが含まれるが、これらに限定されない。アジュバントは、本発明によるＡＡＶベクターとの混合物として対象に投与されてもよく、または前述のＡＡＶベクターと組み合わせて使用されてもよい。
本明細書で互換的に使用される用語「薬学的に許容可能な担体」、「薬学的に許容可能な希釈剤」、「薬学的に許容可能な賦形剤」、または「薬学的に許容可能なビヒクル」は、任意の従来的なタイプの非毒性の固体、半固体、または液体充填剤、希釈剤、封入材料、または製剤補助剤を指す。薬学的に許容可能な担体は、使用される用量および濃度で、レシピエントにとって本質的に非毒性であり、製剤の他の成分と適合性がある。薬学的に許容可能な担体の数および性質は、所望の投与形態に依存する。薬学的に許容可能な担体は既知であり、当技術分野で周知の方法によって調製されてもよい（Ｆａｕｌｉ ｉ Ｔｒｉｌｌｏ Ｃ， “Ｔｒａｔａｄｏ ｄｅ Ｆａｒｍａｃｉａ Ｇａｌｅｎｉｃａ”． Ｅｄ． Ｌｕｚａｎ ５， Ｓ． Ａ．， Ｍａｄｒｉｄ， ＥＳ， １９９３； Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ， Ｅｄ．， “Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ” ２０ｔｈ ｅｄ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， Ｐａ．， ＵＳ， ２００３）。
非限定的な例として、ＡＡＶベクターは、注射（例えば、ボーラス注射または連続注入）による非経口投与のために製剤化され得る。注射のための製剤は、添加された防腐剤とともに単位剤形（例えば、アンプルまたは複数回用量容器）で提示され得る。ウイルス組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルションなどの形態を取ってもよく、懸濁剤、安定化剤、または分散剤などの配合剤を含んでもよい。ＡＡＶ製剤の液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂肪）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油）、および防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル－ｐ－ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容可能な添加剤を用いて、従来的な手段によって調製され得る。
非経口投与に適した製剤には、水性および非水性の等張性滅菌注射液が含まれ、これは、製剤を意図したレシピエントの血液と等張にする抗酸化剤、緩衝剤、バクテリオスタット、および溶質、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位用量または複数回用量のアンプルおよびバイアルなどの密封容器に提示することができ、例えば、使用直前の、注射のための水などの滅菌液体賦形剤の添加のみを必要とする凍結乾燥（凍結乾燥）状態で保存することができる。即時の注射溶液および懸濁液は、前述の滅菌粉末、顆粒、および錠剤の類から調製することができる。
さらに、組成物は、追加の治療剤または生物活性剤を含み得る。例えば、特定の適応症の治療に有用な治療因子が存在し得る。イブプロフェンまたはステロイドなどの炎症を制御する因子は、ベクターのインビボ投与および生理学的苦痛に関連する腫れおよび炎症を減少させるための組成物の一部であり得る。免疫系抑制剤は、ベクター自体に対する、または障害と関連する免疫応答を低減する合成方法を用いて投与することができる。免疫抑制薬または免疫抑制剤の投与は、意図的に誘発された免疫抑制の主な方法であり、最適な状況では、免疫抑制剤は、免疫系の任意の超活性成分のみを標的とする。
免疫抑制剤、免疫抑制薬、または抗拒絶剤は、免疫系の活性を阻害または予防する薬剤である。かかる薬剤には、グルココルチコイド、細胞分裂阻害剤、抗体、イムノフィリンに作用する薬剤が含まれる。薬理学的（超生理学的）用量では、プレドニゾン、デキサメタゾン、およびヒドロコルチゾンなどのグルココルチコイドが、様々なアレルギー性および炎症性反応を抑制するために使用される。プリン類似体などの細胞分裂阻害剤、窒素マスタード（シクロホスファミド）などのアルキル化剤、ニトロソウレア、プラチナ化合物、およびその他。シクロホスファミド（Ｂａｘｔｅｒ’ｓ Ｃｙｔｏｘａｎ）は、おそらく最も強力な免疫抑制化合物である。代謝拮抗物質、例えば、メトトレキサートなどの葉酸類似体、アザチオプリンおよびメルカプトプリンなどのプリン類似体、フルオロウラシルなどのピリミジン類似体、およびタンパク質合成阻害剤。細胞傷害性抗生物質の中では、ダクチノマイシンが最も重要である。それは、腎臓移植に使用される。他の細胞傷害性抗生物質は、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシンである。抗体は、時に、急性拒絶反応（例えば抗－ＣＤ２０モノクローナル）を防止する、迅速で強力な免疫抑制療法として使用されることがある。
あるいは、免疫エンハンサーを組成物中に含めて、疾患に対する体の天然防御を上方制御することができる。
遺伝子導入手順および他の障害に関連する感染のリスクを減少させるために、抗生物質、すなわち、殺菌剤および殺菌剤が存在し得る。
医薬組成物は、ヒトへの静脈内、皮下、または筋肉内投与に適合された医薬組成物として、日常的な手順に従って製剤化することができる。
本発明による治療方法
非限定的な例として、ヒトＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードするウイルスベクターは哺乳動物に投与され、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードするＤＮＡの送達、および哺乳動物におけるタンパク質の発現をもたらし、それによって、軟部組織における石灰化または骨化を低減するために必要なＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３のレベルが復元される。
一態様では、本発明は、組み換えウイルスゲノムを含むアデノ随伴ウイルスベクターに関し、前述の組み換えウイルスゲノムは、病理学的石灰化または骨化の疾患の治療および／または予防に使用のための、ＥＮＰＰ１もしくはＥＮＰＰ３もしくはその機能的に均等なバリアントもしくは前述のウイルスベクターを含む医薬組成物をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された転写調節領域を含む発現カセットを含む。
別の態様では、本発明は、組み換えウイルスゲノムを含むアデノ随伴ウイルスベクターの使用に関し、前述の組み換えウイルスゲノムは、病理学的石灰化または骨化の疾患の治療および／または予防のための薬剤の製造のための、ＥＮＰＰ１もしくはＥＮＰＰ３もしくはその機能的に均等なバリアントもしくは前述のウイルスベクターを含む医薬組成物をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された転写調節領域を含む発現カセットを含む。
別の態様では、本発明は、病理学的石灰化または骨化の疾患の治療および／または予防のための方法を、それを必要とする対象において提供し、方法は、組み換えウイルスゲノムを含むアデノ随伴ウイルスベクターの前述の対象への投与を含み、前述の組み換えウイルスゲノムは、ＥＮＰＰ１もしくはＥＮＰＰ３、またはその機能的に均等なバリアント、または前述のウイルスベクターを含む医薬組成物をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された転写調節領域を含む発現カセットを含む。
別の態様では、本発明の組成物および方法によって治療される病理学的石灰化または骨化の疾患は、Ｘ連鎖性低リン血症（ＸＬＨ）、慢性腎臓疾患（ＣＲＯＮ）、ミネラル骨障害（ＭＢＤ）、血管石灰化、軟部組織の病理学的石灰化、軟部組織の病理学的骨化、乳児の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、後縦靱帯の骨化（ＯＰＬＬ）からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、Ｅｎｐｐ１欠損個体または対象、またはＥｎｐｐ３欠損個体または対象、または骨欠損の補正を必要とする哺乳動物または固体または対象の骨欠損を補正する方法であって、請求項２６～３２の任意の一項に記載のウイルスベクターを投与することを含み、ウイルスベクターは（ａ）肝臓特異的プロモーターおよび（ａ）エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチドまたはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み、一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、肝臓プロモーター１（ＬＰ１）およびハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）からなる群から選択され、一部の実施形態では、ベクターは、ポリアデニル化信号をコードする配列を含み、一部の実施形態では、ベクターは、アズロシジンシグナルペプチドであるシグナルペプチドをコードし、一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ－ｒｈ７４からなる群から選択される血清型を有し、一部の実施形態では、ウイルスベクターは、（ａ）肝臓特異的プロモーター、および（ａ）エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチドまたはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え核酸を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、可溶性ＥＮＰＰ１または可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードし、一部の実施形態では、前述の核酸は、前述のコードされたポリペプチドを発現することができるベクターまたはプラスミドを含み、一部の実施形態では、前述のベクターはウイルスベクターであり、一部の実施形態では、前述のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、一部の実施形態では、前述の核酸はアズロシジンシグナルペプチドをコードし、前述のシグナルペプチドは前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドと動作可能に関連付けられ、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドおよび異種タンパク質を含むＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードし、一部の実施形態では、前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述のＥＮＰＰ１融合タンパク質またはＥＮＰＰ３融合タンパク質は、異種タンパク質を含まないＥＮＰＰ１ポリペプチドの循環半減期と比較して、哺乳動物において循環半減期が増加し、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述の異種タンパク質は、イムノグロブリン結晶化可能断片（Ｆｃ）ポリペプチドまたはアルブミンポリペプチドであり、一部の実施形態では、前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端の順序で、前述の融合タンパク質前述のＥＮＰＰ１または前述のＥＮＰＰ３ポリペプチド、および前述のＦｃポリペプチドまたは前述のアルブミンポリペプチドを含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドであり、 一部の実施形態では、前述のＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、一部の実施形態では、前述のコードされたＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドは、バリアントＩｇＧ Ｆｃであり、一部の実施形態では、前述のコードされたバリアントＦｃポリペプチドは、ＥＵ番号に従うＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅのアミノ酸置換を含み、一部の実施形態では、前述のコードされたバリアントＦｃポリペプチドは、配列番号９５のアミノ酸配列８５３～１０７９を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸配列９９～９２５を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、バリアント前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードし、一部の実施形態では、前述のコードされたバリアントＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１に関する位置３３２のアミノ酸置換をコードする配列を含み、一部の実施形態では、配列番号１に関する位置３３２の前述のアミノ酸置換をコードする前述の配列は、Ｉ３３２Ｔを含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号９５のアミノ酸２１～８４７をコードする配列を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号９５のアミノ酸２０～８４７をコードする配列を含み、一部の実施形態では、前述のコードされたＥＮＰＰ１融合タンパク質は、前述のコードされたＥＮＰＰ１ポリペプチドと前述のコードされた異種ポリペプチドとを連結するタンパク質リンカーをコードする配列を含み、一部の実施形態では、前述のコードされたタンパク質リンカーは、配列番号９４（ＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号９５のアミノ酸２１～１０７９を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列は、単回投与以上で、配列番号９５のアミノ酸２０～１０７９を含み、補正は、前述の個体において、骨長、イントラベキュラー（ｉｎｔｒａｂｅｃｕｌａｒ）数、皮質厚、骨梁厚、骨梁骨体積、骨形成速度と骨芽細胞面からなる群から選択される一つ以上増加として示され、増加は、前述の未処理のＥｎｐｐ１欠損個体または対象、または前述のＥｎｐｐ３欠損個体または対象、または前述の哺乳動物、それを必要とする固体または対象に関し、前述の増加は、例えば検非侵襲的撮像技術によって、検出される。
別の態様では、Ｅｎｐｐ１欠損個体または対象、またはＥｎｐｐ３欠損個体または対象、または哺乳動物、それを必要とする個体または対象における成長板構造を修復する方法が開示されており、（ａ）肝臓特異的プロモーター、および（ａ）エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチドまたはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むウイルスベクターを投与することを含み、一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、肝臓プロモーター１（ＬＰ１）およびハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）からなる群から選択され、一部の実施形態では、ベクターは、ポリアデニル化信号をコードする配列を含み、一部の実施形態では、ベクターは、アズロシジンシグナルペプチドであるシグナルペプチドをコードし、一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ－ｒｈ７４からなる群から選択される血清型を有し、一部の実施形態では、ウイルスベクターは、（ａ）肝臓特異的プロモーター、および（ａ）エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチドまたはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え核酸を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、可溶性ＥＮＰＰ１または可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードし、一部の実施形態では、前述の核酸は、前述のコードされたポリペプチドを発現することができるベクターまたはプラスミドを含み、一部の実施形態では、前述のベクターはウイルスベクターであり、一部の実施形態では、前述のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、一部の実施形態では、前述の核酸はアズロシジンシグナルペプチドをコードし、前述のシグナルペプチドは前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドと動作可能に関連付けられ、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドおよび異種タンパク質を含むＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードし、一部の実施形態では、前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述のＥＮＰＰ１融合タンパク質またはＥＮＰＰ３融合タンパク質は、異種タンパク質を含まないＥＮＰＰ１ポリペプチドの循環半減期と比較して、哺乳動物において循環半減期が増加し、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述の異種タンパク質は、イムノグロブリン結晶化可能断片（Ｆｃ）ポリペプチドまたはアルブミンポリペプチドであり、一部の実施形態では、前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端の順序で、前述の融合タンパク質前述のＥＮＰＰ１または前述のＥＮＰＰ３ポリペプチド、および前述のＦｃポリペプチドまたは前述のアルブミンポリペプチドを含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドであり、 一部の実施形態では、前述のＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、一部の実施形態では、前述のコードされたＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドは、バリアントＩｇＧ Ｆｃであり、一部の実施形態では、前述のコードされたバリアントＦｃポリペプチドは、ＥＵ番号に従うＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅのアミノ酸置換を含み、一部の実施形態では、前述のコードされたバリアントＦｃポリペプチドは、配列番号９５のアミノ酸配列８５３～１０７９を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸配列９９～９２５を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、バリアント前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードし、一部の実施形態では、前述のコードされたバリアントＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１に関する位置３３２のアミノ酸置換をコードする配列を含み、一部の実施形態では、配列番号１に関する位置３３２の前述のアミノ酸置換をコードする前述の配列は、Ｉ３３２Ｔを含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号９５のアミノ酸２１～８４７をコードする配列を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号９５のアミノ酸２０～８４７をコードする配列を含み、一部の実施形態では、前述のコードされたＥＮＰＰ１融合タンパク質は、前述のコードされたＥＮＰＰ１ポリペプチドと前述のコードされた異種ポリペプチドとを連結するタンパク質リンカーをコードする配列を含み、一部の実施形態では、前述のコードされたタンパク質リンカーは、配列番号９４（ＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号９５のアミノ酸２１～１０７９を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列は、単回投与以上で、配列番号９５のアミノ酸２０～１０７９を含み、修復は、前述の未処理のＥｎｐｐ１欠損個体または対象、または前述のＥｎｐｐ３欠損個体または対象、または前述の哺乳動物、それを必要とする固体または対象に関し、前述の修復は、例えば検非侵襲的撮像技術または動的組織形態計測分析によって検出される。
別の態様では、Ｅｎｐｐ１欠損個体または対象、またはＥｎｐｐ３欠損個体または対象、または哺乳動物、それを必要とする個体または対象における異常な骨芽細胞機能の発達を阻害する方法が開示されており、（ａ）肝臓特異的プロモーター、および（ａ）エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチドまたはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むウイルスベクターを投与することを含み、一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、肝臓プロモーター１（ＬＰ１）およびハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）からなる群から選択され、一部の実施形態では、ベクターは、ポリアデニル化信号をコードする配列を含み、一部の実施形態では、ベクターは、アズロシジンシグナルペプチドであるシグナルペプチドをコードし、一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ－ｒｈ７４からなる群から選択される血清型を有し、一部の実施形態では、ウイルスベクターは、（ａ）肝臓特異的プロモーター、および（ａ）エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチドまたはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え核酸である請求項１～２５の任意の一項に記載の核酸を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、可溶性ＥＮＰＰ１または可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードし、一部の実施形態では、前述の核酸は、前述のコードされたポリペプチドを発現することができるベクターまたはプラスミドを含み、一部の実施形態では、前述のベクターはウイルスベクターであり、一部の実施形態では、前述のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、一部の実施形態では、前述の核酸はアズロシジンシグナルペプチドをコードし、前述のシグナルペプチドは前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドと動作可能に関連付けられ、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドおよび異種タンパク質を含むＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードし、一部の実施形態では、前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述のＥＮＰＰ１融合タンパク質またはＥＮＰＰ３融合タンパク質は、異種タンパク質を含まないＥＮＰＰ１ポリペプチドの循環半減期と比較して、哺乳動物において循環半減期が増加し、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述の異種タンパク質は、イムノグロブリン結晶化可能断片（Ｆｃ）ポリペプチドまたはアルブミンポリペプチドであり、一部の実施形態では、前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端の順序で、前述の融合タンパク質前述のＥＮＰＰ１または前述のＥＮＰＰ３ポリペプチド、および前述のＦｃポリペプチドまたは前述のアルブミンポリペプチドを含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドであり、 一部の実施形態では、前述のＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、一部の実施形態では、前述のコードされたＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドは、バリアントＩｇＧ Ｆｃであり、一部の実施形態では、前述のコードされたバリアントＦｃポリペプチドは、ＥＵ番号に従うＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅのアミノ酸置換を含み、一部の実施形態では、前述のコードされたバリアントＦｃポリペプチドは、配列番号９５のアミノ酸配列８５３～１０７９を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸配列９９～９２５を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、バリアント前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードし、一部の実施形態では、前述のコードされたバリアントＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１に関する位置３３２のアミノ酸置換をコードする配列を含み、一部の実施形態では、配列番号１に関する位置３３２の前述のアミノ酸置換をコードする前述の配列は、Ｉ３３２Ｔを含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号９５のアミノ酸２１～８４７をコードする配列を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号９５のアミノ酸２０～８４７をコードする配列を含み、一部の実施形態では、前述のコードされたＥＮＰＰ１融合タンパク質は、前述のコードされたＥＮＰＰ１ポリペプチドと前述のコードされた異種ポリペプチドとを連結するタンパク質リンカーをコードする配列を含み、一部の実施形態では、前述のコードされたタンパク質リンカーは、配列番号９４（ＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号９５のアミノ酸２１～１０７９を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列は、単回投与以上で、配列番号９５のアミノ酸２０～１０７９を含み、阻害は、前述の未処理のＥｎｐｐ１欠損個体または対象、または前述のＥｎｐｐ３欠損個体または対象、または前述の哺乳動物、それを必要とする固体または対象に関し、前述の阻害は、例えば検非侵襲的撮像技術または動的組織形態計測分析によって検出される。
別の態様では、本開示は、Ｅｎｐｐ１欠損個体または対象、またはＥｎｐｐ３欠損個体または対象、または哺乳動物またはそれを必要とする固体または対象の骨形成速度を増加する方法であって、請求項２６～３２の任意の一項に記載のウイルスベクターを投与することを含み、ウイルスベクターは（ａ）肝臓特異的プロモーターおよび（ａ）エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチドまたはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含み、一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、肝臓プロモーター１（ＬＰ１）およびハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）からなる群から選択され、一部の実施形態では、ベクターは、ポリアデニル化信号をコードする配列を含み、一部の実施形態では、ベクターは、アズロシジンシグナルペプチドであるシグナルペプチドをコードし、一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ－ｒｈ７４からなる群から選択される血清型を有し、一部の実施形態では、ウイルスベクターは、（ａ）肝臓特異的プロモーター、および（ａ）エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチドまたはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え核酸を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、可溶性ＥＮＰＰ１または可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードし、一部の実施形態では、前述の核酸は、前述のコードされたポリペプチドを発現することができるベクターまたはプラスミドを含み、一部の実施形態では、前述のベクターはウイルスベクターであり、一部の実施形態では、前述のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、一部の実施形態では、前述の核酸はアズロシジンシグナルペプチドをコードし、前述のシグナルペプチドは前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドと動作可能に関連付けられ、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドおよび異種タンパク質を含むＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードし、一部の実施形態では、前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述のＥＮＰＰ１融合タンパク質またはＥＮＰＰ３融合タンパク質は、異種タンパク質を含まないＥＮＰＰ１ポリペプチドの循環半減期と比較して、哺乳動物において循環半減期が増加し、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述の異種タンパク質は、イムノグロブリン結晶化可能断片（Ｆｃ）ポリペプチドまたはアルブミンポリペプチドであり、一部の実施形態では、前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端の順序で、前述の融合タンパク質前述のＥＮＰＰ１または前述のＥＮＰＰ３ポリペプチド、および前述のＦｃポリペプチドまたは前述のアルブミンポリペプチドを含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドであり、 一部の実施形態では、前述のＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、一部の実施形態では、前述のコードされたＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドは、バリアントＩｇＧ Ｆｃであり、一部の実施形態では、前述のコードされたバリアントＦｃポリペプチドは、ＥＵ番号に従うＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅのアミノ酸置換を含み、一部の実施形態では、前述のコードされたバリアントＦｃポリペプチドは、配列番号９５のアミノ酸配列８５３～１０７９を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸配列９９～９２５を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、バリアント前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードし、一部の実施形態では、前述のコードされたバリアントＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１に関する位置３３２のアミノ酸置換をコードする配列を含み、一部の実施形態では、配列番号１に関する位置３３２の前述のアミノ酸置換をコードする前述の配列は、Ｉ３３２Ｔを含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号９５のアミノ酸２１～８４７をコードする配列を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号９５のアミノ酸２０～８４７をコードする配列を含み、一部の実施形態では、前述のコードされたＥＮＰＰ１融合タンパク質は、前述のコードされたＥＮＰＰ１ポリペプチドと前述のコードされた異種ポリペプチドとを連結するタンパク質リンカーをコードする配列を含み、一部の実施形態では、前述のコードされたタンパク質リンカーは、配列番号９４（ＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号９５のアミノ酸２１～１０７９を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列は、単回投与以上で、配列番号９５のアミノ酸２０～１０７９を含み、増加は、前述の未処理のＥｎｐｐ１欠損個体または対象、または前述のＥｎｐｐ３欠損個体または対象、または前述の哺乳動物、それを必要とする固体または対象に関し、前述の増加は、例えば動的組織形態計測分析によって検出される。
別の態様では、Ｅｎｐｐ１欠損個体または対象、またはＥｎｐｐ３欠損個体または対象、または哺乳動物、それを必要とする個体または対象における骨芽細胞面を増加する方法が開示されており、（ａ）肝臓特異的プロモーター、および（ａ）エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチドまたはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むウイルスベクターを投与することを含み、一部の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、肝臓プロモーター１（ＬＰ１）およびハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）からなる群から選択され、一部の実施形態では、ベクターは、ポリアデニル化信号をコードする配列を含み、一部の実施形態では、ベクターは、アズロシジンシグナルペプチドであるシグナルペプチドをコードし、一部の実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ－ｒｈ７４からなる群から選択される血清型を有し、一部の実施形態では、ウイルスベクターは、（ａ）肝臓特異的プロモーター、および（ａ）エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチドまたはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え核酸を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、可溶性ＥＮＰＰ１または可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードし、一部の実施形態では、前述の核酸は、前述のコードされたポリペプチドを発現することができるベクターまたはプラスミドを含み、一部の実施形態では、前述のベクターはウイルスベクターであり、一部の実施形態では、前述のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり、一部の実施形態では、前述の核酸はアズロシジンシグナルペプチドをコードし、前述のシグナルペプチドは前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドと動作可能に関連付けられ、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前述のＥＮＰＰ３ポリペプチドおよび異種タンパク質を含むＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードし、一部の実施形態では、前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述のＥＮＰＰ１融合タンパク質またはＥＮＰＰ３融合タンパク質は、異種タンパク質を含まないＥＮＰＰ１ポリペプチドの循環半減期と比較して、哺乳動物において循環半減期が増加し、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述の異種タンパク質は、イムノグロブリン結晶化可能断片（Ｆｃ）ポリペプチドまたはアルブミンポリペプチドであり、一部の実施形態では、前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端の順序で、前述の融合タンパク質前述のＥＮＰＰ１または前述のＥＮＰＰ３ポリペプチド、および前述のＦｃポリペプチドまたは前述のアルブミンポリペプチドを含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列によってコードされる前述のＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドであり、 一部の実施形態では、前述のＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドは、配列番号３４のアミノ酸配列を含み、一部の実施形態では、前述のコードされたＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドは、バリアントＩｇＧ Ｆｃであり、一部の実施形態では、前述のコードされたバリアントＦｃポリペプチドは、ＥＵ番号に従うＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅのアミノ酸置換を含み、一部の実施形態では、前述のコードされたバリアントＦｃポリペプチドは、配列番号９５のアミノ酸配列８５３～１０７９を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸配列９９～９２５を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、バリアント前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードし、一部の実施形態では、前述のコードされたバリアントＥＮＰＰ１ポリペプチドは、配列番号１に関する位置３３２のアミノ酸置換をコードする配列を含み、一部の実施形態では、配列番号１に関する位置３３２の前述のアミノ酸置換をコードする前述の配列は、Ｉ３３２Ｔを含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号９５のアミノ酸２１～８４７をコードする配列を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号９５のアミノ酸２０～８４７をコードする配列を含み、一部の実施形態では、前述のコードされたＥＮＰＰ１融合タンパク質は、前述のコードされたＥＮＰＰ１ポリペプチドと前述のコードされた異種ポリペプチドとを連結するタンパク質リンカーをコードする配列を含み、一部の実施形態では、前述のコードされたタンパク質リンカーは、配列番号９４（ＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列は、配列番号９５のアミノ酸２１～１０７９を含み、一部の実施形態では、前述のＥＮＰＰ１融合タンパク質をコードする前述のヌクレオチド配列は、単回投与以上で、配列番号９５のアミノ酸２０～１０７９を含み、増加は、前述の未処理のＥｎｐｐ１欠損個体または対象、または前述のＥｎｐｐ３欠損個体または対象、または前述の哺乳動物、それを必要とする固体または対象に関し、前述の増加は、例えば動的組織形態計測分析によって検出される。
本発明によるポリヌクレオチド、ベクターおよびプラスミド
本発明はまた、ウイルスベクター、例えば本発明によるＡＡＶベクターを産生するのに有用なポリヌクレオチドに関する。一実施形態では、本発明は、アデノ随伴ウイルスＩＴＲに隣接した発現カセットを含むポリヌクレオチド（「本発明によるポリヌクレオチド」）に関し、前述の発現カセットは、ＥＮＰＰ１もしくはＥＮＰＰ３またはその機能的に等価なバリアントをコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された転写調節領域を含む。
一実施形態では、本発明によるポリヌクレオチドは、プロモーター、好ましくは構成的プロモーター、より好ましくは肝臓特異的プロモーター、より好ましくはアルブミンプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーターおよびアルファ１－抗トリプシンプロモーターからなる群から選択される肝臓特異的プロモーターを含む転写調節領域を含み、最も好ましいのはヒトアルファ１－抗トリプシンプロモーターである。別の実施形態では、本発明によるポリヌクレオチドの転写調節領域は、プロモーター、好ましくは肝臓特異的エンハンサー、より好ましくは肝臓制御領域エンハンサー（ＨＣＲ）に動作可能に連結されたエンハンサーをさらに含む。
別の実施形態では、本発明によるポリヌクレオチドの発現カセットはポリアデニル化信号、より好ましくはＳＶ４０ｐｏｌｙＡをさらに含む。別の実施形態では、本発明によるポリヌクレオチドによってコードされるＥＮＰＰ１は、ヒトＥＮＰＰ１およびヒトＥＮＰＰ３からなる群から選択される。
本発明によるポリヌクレオチドは、例えばプラスミドなどのベクターに組み込まれ得る。したがって、別の態様では、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターまたはプラスミドに関する。特定の実施形態では、本発明によるポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルスベクターまたはプラスミドに組み込まれる。
好ましくは、アデノ随伴ウイルスの産生に必要な他のすべての構造的および非構造的コード配列は、プラスミドなどの別のベクターによってトランスで提供され得るか、または配列をパッケージング細胞株に安定的に統合することによって提供され得るため、ウイルスベクター中に存在しない。
本発明によるＡＡＶの入手方法
本発明はまた、非限定的な例として、ＡＡＶベクターなどの、本発明によるウイルスベクターを取得する方法に関する。前述のＡＡＶベクターは、本発明によるポリヌクレオチドを、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を構造的に発現する細胞に導入することによって、取得することができ、ＲｅｐおよびＣａｐコード配列はプラスミドもしくはベクターで提供される。したがって、別の態様では、本発明は、
（ｉ）本発明によるポリヌクレオチド、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質、および任意選択的にＡＡＶが複製に依存するウイルスタンパク質を含む細胞を提供するステップと、
（ｉｉ）ＡＡＶの組立に適切な状態下に細胞を維持するステップと、
（ｉｉｉ）細胞によって産生されるアデノ随伴ウイルスベクターを精製するステップと、を含むアデノ随伴ウイルスベクターを取得する方法に関する。
導入遺伝子をベクター化するための組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の産生は、以前にも説明されている（Ａｙｕｓｏ Ｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１０， １０：４２３－４３６； Ｏｋａｄａ Ｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００９， ２０：１０１３－１０２１； Ｚｈａｎｇ Ｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００９， ２０：９２２－９２９； ａｎｄ Ｖｉｒａｇ Ｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００９， ２０：８０７－８１７）。これらのプロトコルは、本発明によるＡＡＶを生成するために使用または適合することができる。アデノ随伴ウイルスベクターを産生することができる任意の細胞を、哺乳類および昆虫細胞を含む本発明で使用することができる。
一実施形態では、産生細胞株は、本発明によるポリヌクレオチド（ＩＴＲに隣接した発現カセットを含む）およびＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードし、ヘルパー機能を提供する構築物で一過性にトランスフェクトされる。別の実施形態では、細胞株はヘルパー機能を安定的に供給し、本発明によるポリヌクレオチド（ＩＴＲに隣接した発現カセットを含む）およびＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードする構築物で一過性にトランスフェクトされる。
別の実施形態では、細胞株は、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質、ならびにヘルパー機能を安定的に供給し、本発明によるポリヌクレオチドで一過性にトランスフェクトされる。別の実施形態では、細胞株は、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を安定的に供給し、本発明によるポリヌクレオチドおよびヘルパー機能をコードするポリヌクレオチドで一過性にトランスフェクトされる。さらに別の実施形態では、細胞株は、本発明によるポリヌクレオチド、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質、ならびにヘルパー機能を安定的に供給する。これらおよび他のＡＡＶ生産系を作製および使用する方法は、当技術分野で説明されてきた。
別の実施形態では、産生細胞株は、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を提供するバキュロウイルス発現ベクターに感染する昆虫細胞株（典型的にはＳｆ９細胞）である。このシステムは、アデノウイルスヘルパー遺伝子を必要としない（Ａｙｕｓｏ Ｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１０， １０：４２３－４３６）。
別の実施形態では、ＡＡＶの導入遺伝子送達能力は、アニーリングして頭尾コンカテマーを形成することができる二つのゲノムのＡＡＶ ＩＴＲを提供することによって増加させることができる。一般的に、ＡＡＶが宿主細胞に侵入すると、導入遺伝子を含有する一本鎖ＤＮＡは、宿主細胞ＤＮＡポリメラーゼ複合体によって二本鎖ＤＮＡに変換され、その後、ＩＴＲは核におけるコンカタマー形成を助ける。代替として、ＡＡＶは、標的細胞への侵入時にウイルスベクターが二本鎖合成のステップをバイパスすることを可能にする自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶとなるように操作されてもよく、より速く、潜在的にはより高い（例えば、１００倍まで）導入遺伝子発現を有するｓｃＡＡＶウイルスベクターを提供する。
例えば、ＡＡＶは、導入遺伝子ユニットおよびその補体をそれぞれコードする二つの連結した一本鎖ＤＮＡを含むゲノムを有するように操作されてもよく、これは標的細胞への送達後に一緒に折ることができ、対象導入遺伝子ユニットをコードする二本鎖ＤＮＡをもたらす。自己相補的ＡＡＶは当技術分野で記載されている（Ｃａｒｔｅｒ Ｂ， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ６，５９６，５３５， Ｃａｒｔｅｒ Ｂ， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ７，１２５，７１７， ａｎｄ Ｔａｋａｎｏ Ｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ７，４５６，６８３）。
好ましくは、全ての構的造および非構造コード配列（Ｃａｐタンパク質およびＲｅｐタンパク質）は、プラスミドなどのベクターによってトランスで提供され得るため、ＡＡＶベクター中に存在しない。Ｃａｐタンパク質は、ＡＡＶウイルスの宿主向性、細胞、組織、または器官の特異性、受容体の使用、感染効率、および免疫原性に影響を与えることが報告されている。したがって、ｒＡＡＶで使用するためのＡＡＶキャップは、例えば、対象の種（例えば、ヒトまたは非ヒト）、対象の免疫状態、長期または短期の治療に対する対象の適合性、または特定の治療的適用（例えば、特定の疾患もしくは障害の治療、または特定の細胞、組織もしくは器官への送達）を考慮して選択されうる。
別の実施形態では、Ｃａｐタンパク質は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、およびＡＡＶｒｈ１０血清型からなる群のＡＡＶに由来する。別の実施形態では、Ｃａｐタンパク質はＡＡＶ８に由来する。
一部の実施形態では、本発明による方法で使用するＡＡＶ Ｃａｐは、前述のＡＡＶ Ｃａｐのうちの一つまたはそのコードする核酸の変異誘発（すなわち、挿入、欠失、または置換）によって生成され得る。一部の実施形態では、ＡＡＶキャップは、前述のＡＡＶＣａｐの一つ以上に、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％以上類似する。
一部の実施形態では、ＡＡＶ Ｃａｐは、前述のＡＡＶ Ｃａｐのうちの二、三、四個以上のドメインを含むキメラである。一部の実施形態では、ＡＡＶ Ｃａｐは、二つまたは三つの異なるＡＡＶまたは組み換えＡＡＶに由来するＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３モノマーのモザイクである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、前述のＣａｐのうちの一つ以上を含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物で使用するＡＡＶ Ｃａｐは、異種配列または他の修飾を含むように操作される。例えば、選択的標的化または免疫回避をもたらすペプチドまたはタンパク質配列を、Ｃａｐタンパク質に操作してもよい。代替的に、または追加的に、ｒＡＡＶの表面がポリエチレングリコール化（すなわちペグ化）されるように、Ｃａｐは化学的に改変することができ、それによって免疫回避が促進され得る。Ｃａｐタンパク質はまた、変異誘発されてもよい（例えば、その天然受容体結合を除去するために、または免疫原性エピトープをマスクするために）。
一部の実施形態では、本発明による方法で使用するＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質は、前述のＡＡＶ Ｒｅｐの一つまたはそのコードする核酸の変異誘発（すなわち、挿入、欠失、または置換）によって生成され得る。一部の実施形態では、ＡＡＶ Ｒｅｐは、前述のＡＡＶ Ｒｅｐのうちの一つ以上と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％以上類似している。
別の実施形態では、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質は、ＡＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、およびＡＡＶｒｈ１０からなる群から選択されるＡＡＶ血清型に由来する。
一部の実施形態では、ＡＡＶが本発明による方法における使用のための複製に依存するウイルスタンパク質は、前述のウイルスタンパク質のうちの一つまたはそのコードする核酸の変異誘発（すなわち、挿入、欠失、または置換）によって生成され得る。一部の実施形態では、ウイルスタンパク質は、前述のウイルスタンパク質のうちの一つ以上と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％以上類似している。
ＡＡＶが複製を依存するＣａｐタンパク質、Ｒｅｐタンパク質、およびウイルスタンパク質の機能をアッセイする方法は、当技術分野で周知である。ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子、およびヘルパー機能を提供する遺伝子は、前述の遺伝子を例えばプラスミドなどのベクターに組み込み、前述のベクターを細胞に導入することによって細胞内に導入することができる。遺伝子は、同じプラスミド内に、または異なるプラスミド内に組み込まれてもよい。別の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は、一つのプラスミドに組み込まれ、ヘルパー機能を提供する遺伝子は、別のプラスミドに組み込まれている。本発明による方法での使用に適したＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むプラスミドの例としては、ｐＨＬＰ１９ベクターおよびｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクターが挙げられる（Ｃｏｌｉｓｉ Ｐ， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ６，００１，６５０ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ６，１５６，３０３）。
本発明によるポリヌクレオチドならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むポリヌクレオチドまたはヘルパー機能を提供する遺伝子は、当技術分野で周知の任意の適切な方法を使用することにより細胞内に導入することができる。トランスフェクションの方法の例としては、以下に限定されないが、カルシウムホスフェート、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリブレンとの共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム介在性融合、リポフェクション、レトロウイルス感染、およびバイオリスティックトランスフェクションが挙げられる。特定の実施形態では、トランスフェクションは、カルシウムホスフェートとの共沈によって実施される。細胞が、任意のＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子およびアデノウイルスヘルパー機能を提供する遺伝子の発現を欠く場合、前述の遺伝子は、本発明によるポリヌクレオチドと同時に細胞内に導入され得る。
代替的に、前述の遺伝子は、本発明によるポリヌクレオチドの導入の前または後に細胞内に導入され得る。特定の実施形態では、細胞は、
１）本発明によるポリヌクレオチドを含むプラスミド、
２）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むプラスミド、
３）ヘルパー機能を提供する遺伝子を含むプラスミド、の三つのプラスミドと同時にトランスフェクトされる。
代替的に、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子およびヘルパー機能を提供する遺伝子は、エピソーム的におよび／またはパッケージング細胞のゲノム内に組み込まれることによって、パッケージング細胞によって運ばれてもよい。
本発明は、ＡＡＶの組立に適切な条件下での細胞の維持に関する方法を含む。パッケージング細胞を培養する方法、および細胞溶解物の生成などのＡＡＶベクター粒子の放出を促進する例示的な条件は、本明細書の実施例に記載されるように実施され得る。産生細胞は、ＡＡＶの組立およびウイルスベクターの培地への放出を促進するために、適切な期間にわたって増殖される。概して、細胞は、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、最大約１０日の間、増殖され得る。約１０日後（またはより早い時期、培養条件および使用される特定の産生細胞に応じて）、産生レベルは概して著しく減少する。一般的に、培養時間は、ウイルス産生の時点から測定される。例えば、ＡＡＶの場合、ウイルス産生は概して、本明細書に記載されるように適切な産生細胞にヘルパーウイルス機能を供給することにより始まる。一般的に、細胞は、ヘルパーウイルス感染後（またはウイルス産生開始後）、約４８～約１００、好ましくは約４８～約９６、好ましくは約７２～約９６、好ましくは約６８～約７２時間後に採取される。
本発明は、細胞によって産生されるアデノ随伴ウイルスベクターを精製する方法を包含する。本発明によるＡＡＶは、ｉ）本発明によるポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞、およびｉｉ）トランスフェクション後の期間、好ましくは７２時間後の前述の細胞の培地、の両方から取得することができる。本発明によるＡＡＶを取得するために、前述の細胞または前述の培地からのＡＡＶの精製のための任意の方法を使用できる。特定の実施形態では、本発明によるＡＡＶは、ポリエチレングリコール沈殿ステップおよび二つの連続的な塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配に基づいて最適化された方法に従って精製される。本発明による精製ＡＡＶは、ＰＢＳに対して透析され、－８０℃で濾過され、保存されることができる。ウイルスゲノムの力価は、線形化プラスミドＤＮＡを標準曲線として使用するＡＡＶ２参照標準物質について記載されるプロトコルに従って定量的ＰＣＲによって決定され得る（Ｌｏｃｋ Ｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２０１０； ２１：１２７３－１２８５）。
別の実施形態では、精製はポリエチレングリコール沈殿ステップまたは塩化セシウム勾配分画によってさらに実施される。一部の実施形態では、方法は、例えば、細胞溶解物のベンゾナーゼによる処理、ＣｓＣｌ勾配による細胞溶解物の精製、またはヘパリン硫酸クロマトグラフィーの使用による細胞溶解物の精製などの精製ステップをさらに含む（Ｈａｌｂｅｒｔ Ｃ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２００４； ２４６：２０１－２１２）。
様々な自然発生および組み換えＡＡＶ、それらのコードする核酸、ＡＡＶ ＣａｐおよびＲｅｐタンパク質ならびにそれらの配列、ならびにかかるＡＡＶを単離または生成、増殖、および精製する方法、とりわけ、ＡＡＶ生産における使用に適したそれらのキャプシドは、当技術分野で公知である。
動物モデル
以下は、病理学的骨化または石灰化の進行を防止または低減するために、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を投与する有効性を試験するために使用できる非限定的な動物モデルである。
１． 幼児の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）のＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊモデル； Ｌｉ， ｅｔ ａｌ． ， ２０１３， Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ＆ Ｍｅｃｈ． ６（５）： １２２７－３５．
２． 幼児の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）のＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊモデル； Ｌｉ， ｅｔ ａｌ， ２０１４， ＰｌｏＳ ｏｎｅ ９（１２）：ｅｌ １３５４２。
３． 弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）のＡＢＣＣ６－／－マウスモデル、Ｊｉａｎｇ， ｅｔ ａｌ． ， ２００７， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍ． １２７（６）： １３９２－４１０２．
４． Ｘ連鎖性低ホスファターゼ症（ＸＬＨ）のＨＹＰマウスモデル、Ｌｉａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， ２００９， Ｃａｌｃｉｆ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ． ８５（３）：２３５－４６。
５． ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群のＬｍｎａＧ６０９Ｇ／＋マウスモデル； Ｖｉｌｌａ－ Ｂｅｌｌｏｓｔａ， ｅｔａｌ， ２０１３， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １２７（２４）：２４４２－５１。
６． 後縦靱帯の骨化（ＯＰＬＬ）のつま先歩行（ｔｔｗ）マウス（Ｏｋａｗａ， ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９（３）：２７１－３； Ｎａｋａｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ， １９９９， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｌ０４（６）：４９２－７） ａｎｄ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ （Ｂｅｒｔｒａｎｄ， ｅｔ ａｌ， ２０１２， Ａｎｎａｌｓ Ｒｈｅｕｍ． Ｄｉｓｅａｓｅｓ ７１（７）： １２４９－５３）。
７． アデニン食に関する慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）のラットモデル、Ｓｃｈｉｂｌｅｒ， ｅｔ ａｌ． ， １９６８， Ｃｌｉｎ． Ｓｃｉ． ３５（２）：３６３－７２； Ｏ’Ｎｅｉｌｌ， ｅｔａｌ， ２０１１， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ７９（５）：５１２－７。
８． アデニン食に関する慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）のマウスモデル；Ｊｉａ， ｅｔ ａｌ．， ２０１３， ＢＭＣ Ｎｅｐｈｒｏｌ． １４：１１６．
９． ５／６腎臓摘出のＣＫＤラットモデル； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， １９６２， Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ． １１：３２１－３２、
Ｓｈｉｍａｍｕｒａ ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， １９７５， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． ７９（１）：９５－１０６．
１０． ＧＡＣＩおよび骨減少症のＥＮＰＰ１ノックアウトマウスモデル、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ， ｅｔ ａｌ， ２０１２， ＰｌｏＳ ｏｎｅ ７（２）：ｅ３２１７７．
上記などの動物モデルは、本発明による、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードするベクターの投与時に、軟部組織の石灰化および骨化の変化を試験するために使用される。例えば、以下のマウスモデル：（ａ）Ｎｐｔ２ａ－／－ （ｂ）二重変異体Ｎｐｔ２ａ－／－／Ｅｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊ、および（ｃ）腎結石の食事誘発性形成に供されているＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）、食事は高カルシウム、低マグネシウム食（Ｔｅｋｌａｄ Ｌａｂｓ ｄｉｅｔ ＴＤ．０００４２， Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｓ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩなど）。
Ｎｐｔ２ａ－／－マウスは、離乳齢から始まり通常の食物を与えられ、少なくとも１０週齢まで持続すると、腎結石形成を示す。逆に、二重変異Ｎｐｔ２ａ－／－／Ｅｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスは、通常の食物を与えられた場合、Ｎｐｔ２ａ－／－マウスと比較して、腎結石形成の二倍のレベルを提示する。Ｎｐｔ２ａ－／－マウス、およびＮｐｔ２ａ－／－／Ｅｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＭＥから市販されている。二重変異マウス（Ｎｐｔ２ａ－／－／Ｅｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊ）は、当技術分野で公知の標準プロトコルに従ってＮｐｔ２ａ－／－マウスおよびＥｎｐｐ １ａｓｊ／ａｓｊマウスを交配させることによって作製される（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ， （２００７， １－２９））。腎結石関連疾患に対するＮｐｔ２ａ－／－またはＮｐｔ２ａ－／－／Ｅｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊ二重変異マウスモデルを使用して、本発明による治療の有効性を試験することができる（Ｋｈａｎ ＆ Ｃａｎａｌｅｓ， ２０１１， Ｊ． Ｕｒｏｌ． １８６（３）：１１０７－１３； Ｗｕ， ２０１５， Ｕｒｏｌｉｔｈｉａｓｉｓ ４３（Ｓｕｐｐｌ １）：６５－７６）。オキサレート石形成齧歯類モデル、すなわち、エチレングリコール、ヒドロキシルプリン飼育マウスもしくはラット、またはマウスおよびラットのオキサレートナトリウムの腹腔内注射（Ｋｈａｎ ＆ Ｇｌｅｎｔｏｎ， Ｊ． Ｕｒｏｌｏｇｙ １８４：１１８９－１１９６）、尿酸石形成（Ｗｕ， ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ Ｓ Ａ ９１（２）：７４２－６）およびシスチン尿症マウスモデル（Ｚｅｅ， ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２３（３）：２８８－２９０； Ｓａｈｏｔａ， ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｕｒｏｌｏｇｙ ８４（５）：１２４９ ｅ９－１５）も試験することができる。
特定の実施形態では、文献において、常染色体劣性低リン酸血症性くる病２型（ＡＲＨＲ２）とも呼ばれる、ヒト疾患ＧＡＣＩの成体形態を再現する齧歯類モデルはない（Ｌｅｖｙ－Ｌｉｔａｎ， ｅｔ ａｌ， ２０１０， Ａｍ． Ｊ． Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ． ８６（２）：２７３－８．）。
ＥＮＰＰ１の酵素活性、ＥＮＰＰ３の酵素活性、血漿ＰＰｉの定量化、マイクロ－ＣＴスキャン、血漿ＰＰｉの取り込みの定量化に関する実験詳細は、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３３２３６－Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．、ＷＯ ２０１４／１２６９６５－ Ｂｒａｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．、ＷＯ ２０１７／０８７９３６－ Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．、およびＵＳ ２０１５／０３５９８５８－Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．の特許出願および刊行物に詳細に記載されている。
本発明は、以下の実施例によってさらに図示されており、これはさらなる限定であると決して解釈されるべきではない。本出願全体を通して引用されたすべての引用文献（文献参考、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
実施例１－ＡＡＶシステムへのＮＰＰ１配列のクローニング、ＡＡＶ感染、ＡＡＶ産生および精製のための構築物の生成
本実施例で使用されるＡＡＶプラスミドは、ＡＡＶ２からの二つのＩＴＲに隣接する発現カセットを含む。ＡＡＶ２のゲノムは、ＡＡＶ８で偽型とすることができる。発現カセットは、５’から３’の方向に、以下の要素、肝臓特異的エンハンサー肝臓制御領域（ＨＣＲ）、肝臓特異的プロモーターヒトアルファ抗トリプシン（ｈＡＡＴ）、イントロン、Ｎ末端アズロシジンシグナル配列を含むポリヌクレオチド、ＮＰＰ１ ｃＤＮＡ、Ｃ末端Ｆｃ配列、およびＳＶ４０ポリアデニル化信号、を有し得る。発現カセットは、ＡＡＶ２から５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲに隣接されている。生成された構築物は、図１の概略図に示される。
ＥＮＰＰ１タンパク質は、別個の膜内ドメインを有する細胞表面に局在化された膜貫通タンパク質である。ＥＮＰＰ１タンパク質は、膜貫通ドメインを省略することによって可溶性にされる。ヒトＮＰＰ１（ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００６１９９）は、その膜貫通領域（例えばＥＮＰＰ１の残基７７～９８、ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００６１９９）を、（ａ）ヒトＮＰＰ２の残基１２～３０（ＮＣＢＩアクセッションＮＰ＿００１ １２４３３５）、または（ｂ）ＮＰＰ７の残基１～２２、または（ｃ）ＮＰＰ５の残基１～２４、または（ｄ）ヒト血清アルブミン、（ｅ）ヒトアズロシジンからなる群から選択される適切なシグナルペプチド配列で置換することによって、可溶性の、組み換えタンパク質を発現するように修飾された。
配列番号（１～４、６～１５、１７～３１、および４２～５６）は、いくつかのＥＮＰＰ１－ＦｃおよびＥＮＰＰ３－Ｆｃ構築物を示し、それらはすべて、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３配列のＡＡＶ感染のための構築物を生成するＡＡＶシステムへのクローニングに使用することができる。
修飾されたＮＰＰ１配列を、標準的な分子生物学プロトコルを使用してプラスミド内にクローニングした。構築物の同じ成分を担持するが、ＮＰＰ１ ｃＤＮＡを含まず、マルチクローニング部位を有する非コードプラスミドを使用して、対照としてヌル粒子を生成した。
感染性ＡＡＶベクター粒子は、各ローラーボトルを１２５μｇのベクタープラスミド（ＩＴＲおよび発現カセットを含む）と共に、１２５μｇのｒｅｐ／ｃａｐプラスミド（ＡＡＶ粒子のキャプシドタンパク質およびウイルス複製に必要なタンパク質を発現する）、および１５０μｇのアデノウイルスヘルパー機能を発現するヘルパープラスミドをカルシウムホスフェート共沈により共トランスフェクトすることによって、ローラーボトルで培養されたＨＥＫ２９３細胞で生成される。各ベクター調製には、合計１０個のローラーボトルが使用される。トランスフェクションの約３日後、細胞を採取し、２５００ｇで１０分間遠心分離する。次いで、細胞ペレットおよび培地を別々に処理する。細胞ペレットは、ＴＢＳ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０）中で完全に再構成される。
３回の凍結／融解サイクル後、溶解物を２５００ｇで３０分間遠心分離する。この遠心分離からの上清を培地に加え、ベクター粒子を、ＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｎｍａ）の８％で１５時間培養し、２５００ｇで３０分間ペレット化することによって沈殿させる。細胞および培地由来のベクターを含有するペレットは、ＴＢＳ内で完全に再構成され、３７℃で３０分間ベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ）で処理され、１０，０００ｇで１０分間遠心分離される。上清を、１．３～１．５ｇ／ｍｌのＣｓＣｌ密度ステップ勾配を含有する３７．５ｍｌのウルトラクリアチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ）にロードし、ＳＷ２８ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）中で２８，０００ｒｐｍで１７時間遠心分離する。ウイルスバンドは、１０ｍｌのシリンジおよび１８ゲージの針を使用して収集され、新しい１２．５ｍｌのウルトラクリアチューブに移され、これは１．３７９ｇ／ｍｌのＣｓＣｌ溶液で満たされて、連続的な勾配を生成する。ＳＷＳＷ４０Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）中で、チューブを３８，０００ｒｐｍで４８時間遠心分離する。最後に、１０ＫＤａ膜（Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、完全な粒子のバンドを収集し、ＰＢＳ中で透析し、０．４５μｍミリポアフィルターで濾過する。このＰＥＧおよびＣｓＣｌ系精製プロトコルは、空のＡＡＶキャプシドと、ウイルスストックからのＤＮＡおよびタンパク質不純物を劇的に減少させ、従ってＡＡＶの純度を増加させ、最終的にインビボでの形質導入を高める。いずれのＥＮＰＰタンパク質もコードしない「ヌル」ベクターを担持する感染性ＡＡＶ粒子を生成するために、同じプロトコルが使用される。
実施例２－異なるシグナル配列を使用したＥＮＰＰ１の発現
ＥＮＰＰ１は、ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３哺乳類細胞のいずれかに安定したトランスフェクションを確立することによって産生される。安定細胞株を確立するために、ＥＮＰＰ１融合タンパク質（例えば、本明細書の他の場所に開示される配列）をコードする核酸配列を、大規模なタンパク質産生のための適切なベクター中に配置する。市販の供給源から入手可能な様々なかかるベクターがある。
例えば、図３は、ｐｃＤＮＡ３プラスミドにクローニングされたＮＰＰ２ｓｉｇｎａｌ－ＮＰＰ１－Ｆｃ、ｐｃＤＮＡ３プラスミドにクローニングされたＮＰＰ７ｓｉｇｎａｌ－ＮＰＰ１－Ｆｃ、および適切なエンドヌクレアーゼ制限部位を有するｐｃＤＮＡ３プラスミドにクローニングされたアズロシジンｓｉｇｎａｌ－ＮＰＰ１－Ｆｃのプラスミドマップを示す。所望のタンパク質構築物を含むｐｃＤＮＡ３プラスミドは、エレクトロポレーションまたはリポフェクタミンなどの確立された技術を使用して、発現プラスミドに安定的にトランスフェクトされ、細胞は、抗生物質選択下で増殖されて、安定的にトランスフェクトされた細胞に対して強化される。
次いで、単一の安定的にトランスフェクトされた細胞のクローンが確立され、所望の融合タンパク質の高発現クローンについてスクリーニングされる。ＥＮＰＰ１タンパク質発現のための単一細胞クローンのスクリーニングは、ＥＮＰＰ１用に先に記載された合成酵素基質ｐＮＰ－ＴＭＰを使用して、９６ウェルプレートでハイスループット様式で達成される（Ｓａｕｎｄｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， ２００８， Ｍｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． ７（１０）：３３５２－６２； Ａｌｂｒｉｇｈｔ， ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ６：１０００６）。
スクリーニングを通じた高発現クローンの識別時、タンパク質産生が、振盪フラスコ内で、または以前ＥＮＰＰ１に対して説明されたバイオリアクターを使用して達成される（Ａｌｂｒｉｇｈｔ， ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ６：１０００６）。ＥＮＰＰ１の精製は、当該技術分野で既知の標準的な精製技術の組み合わせを使用して達成することができる。
図２に示すように、アズロシジンシグナル配列を含む構築物は、最も高い量のＮＰＰ１タンパク質を生成する。アズロシジンシグナル配列（７３１ｍｇ／リットル）を使用して産生されたＥＮＰＰ１タンパク質の量は、ＮＰＰ２（１２７ｍｇ／リットル）またはＮＰＰ７（１３６ｍｇ／リットル）シグナル配列を使用して産生されたＥＮＰＰ１タンパク質と比較して、驚くべきことに五倍高い。このように生成されたＥＮＰＰ１タンパク質は、追加の技術および／または上述のクロマトグラフィーステップを使用してさらに精製され、純度約９９％などの大幅に高い純度に達する。
このように生成されたＥＮＰＰ１の酵素活性は、ＨＰＬＣを使用してヒトＮＰＰ１によるＡＴＰの定常状態加水分解を決定することによって測定される。簡潔に述べると、酵素反応は、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、４．５ｎＭのＫＣｌ、１４ｕＭのＺｎＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、および１ｍＭのＣａＣｌ２を含有する反応緩衝液中のＡＴＰの様々な濃度に１０ｎＭのＥＮＰＰ１を加えることによって開始される。様々な時点で、５０μｌの反応溶液を除去し、等体積の３Ｍギ酸でクエンチする。クエンチした反応溶液を、５ｍＭのアンモニウムアセテート（ｐＨ６．０）溶液中で平衡化したＣ－１８（５μｍ、２５０×４．６ｍｍ）カラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）にロードし、０％～２０％のメタノール勾配で溶出する。基質および生成物を、２５９ｎｍでのＵＶ吸光度によって監視し、対応するピークおよび標準曲線の統合に従って定量化した。したがって、ＥＮＰＰ１タンパク質は、本明細書ならびにＰＣＴ／２０１４／０１５９４５－ Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．； ＰＣＴ／２０１６／０３３２３６－Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ． および ＰＣＴ／２０１６／０６３０３４－Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．の他の箇所にて記載されるプロトコルに従って特徴づけられる。
実施例３－ＥＮＰＰ１－ＦｃをコードするＡＡＶウイルス粒子のマウスへの注射、および体重増加、骨密度、骨強度および骨体積の測定。
ＮＰＰ１またはＮＰＰ３をコードし、それらを発現できるベクターの送達の有効性は、Ｅｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスモデル、ＡＢＣＣ６－／－マウスモデル、ＨＹＰマウスモデル、ｔｔｗマウスモデル、慢性腎臓疾患のマウスモデル（ＣＫＤ）、またはＣＫＤの５／６腎臓摘出のラットモデルなどのマウスモデルを使用して試験される。非限定的な例として、以下の実験では、マウスモデルとしてＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスを使用し、マウスモデルに送達されるポリヌクレオチドとしてアズロシジン－ＮＰＰ１－Ｆｃ構築物を使用し、送達は、インビボでＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質をコードするＡＡＶ粒子（実施例１に示すように調製される）を使用することによって達成される。
当業者であれば、病理学的石灰化または骨化の疾患を治療する遺伝子療法の効果を試験するための本発明で開示される、代替のマウスモデル、異なるＥＮＰＰ１融合タンパク質（ＥＮＰＰ１－アルブミンまたはＥＮＰＰ１－ＦｃもしくはＥＮＰＰ１の機能的等価物、またはＦｃもしくはアルブミンドメインを欠くＥＮＰＰ１など）、または異なるＥＮＰＰ３融合タンパク質（ＥＮＰＰ３－ＦｃもしくはＥＮＰＰ３－アルブミンまたはＦｃもしくはアルブミンドメインを欠くＥＮＰＰ３もしくはＥＮＰＰ３の機能的等価物）をコードする代替のシグナル配列（ＮＰＰ２、ＮＰＰ５、ＮＰＰ７アルブミンまたはアズロシジンなど）を含む代替ポリヌクレオチド構築物を使用することにより、同じ実験を繰り返すことができることを認識するであろう。実験で利用されるアズロシジン－ＮＰＰ１－Ｆｃ構築物は、概念実証としてヒトＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質をコードし、ヒトＥＮＰＰ３－Ｆｃをコードするアズロシジン－ＮＰＰ３－Ｆｃ構築物で同じ実験を繰り返すことができる。
この実験では、四セットのマウスを使用し、各セットは、少なくとも五匹のマウス（６～８週齢）を有し、ＡＡＶ粒子を注射する前に、すべてのマウスセットは、１０００μｇ／ｍｌの濃度の力価ＧＫ１．５ＣＤ４抗体（２５～４０μｇ／動物の最終用量）の腹腔内注射によって寛容化され、ＡＡＶ構築物によって産生されるヒトタンパク質に対するマウスの免疫反応を減少させる。対照群として機能するＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第一のコホートに、ヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射し、対照群として機能するＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊマウスの第二のコホートに、ヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射し、試験群として機能するＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第三のコホートに、ＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ粒子を注射し、および試験群として機能するＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊの第四のコホートに、ＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ粒子を注射する。各コホートへのＡＡＶ注射の後、寛容化注射は毎週繰り返される（すなわち、ＡＡＶ注射後、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、８４、９１、９８、および１０５日目）。
実験のマウスは、加速食（リンに富み、マグネシウム含有量を減少させた（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ， Ｒｏｄｅｎｔ ｄｉｅｔ ＴＤ．００４４２， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ））、または通常の食事（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｃｌａｖａｂｌｅ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ ５０１０； ＰＭＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｂｒｅｎｔｗｏｏｄ， ＭＯ）のいずれかを与えられ、６～８週齢後、すべてのマウスは、ｐＨ ７．４のＰＢＳの約１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、好ましくは１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／ｋｇの後眼窩注射または尾静脈注射を受ける。注射されたベクターは、空の「ヌル」（対照群）であるか、またはＮＰＰ１遺伝子（試験群）を担持するのいずれかである。体重測定は、ＡＡＶ注射後のいかなる体重の増加または減少も記録するために毎日行われる。マウスからの血液、尿、骨、および組織試料を採取して、以下のとおり分析する。実験プロトコルは、Ａｌｂｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１５ Ｄｅｃ １；６：１０００６， およびＣａｂａｌｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１７； １２（７）： ｅ０１８００９８に詳細に列挙され、それらすべての内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。試験終了時（７、２８、および１１２日、マウスはすべて、イソフルランを用いた深層麻酔における眼窩放血により安楽死させ、重要な器官を、当技術分野で記載されるように除去する。（Ｉｍｐａｉｒｅｄ ｕｒｉｎａｒｙ ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｐｔ２ａ－／－ ｍｉｃｅ．， Ｃａｂａｌｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２０１７ Ｊａｎ １； ３１２（１）：Ｆ７７－Ｆ８３； Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｎｐｔ２ａ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ｔｏ ｄｉｅｔａｒｙ ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ，Ｌｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１７； １２（４）：ｅ０１７６２３２．）。
血漿ＰＰｉの定量化
動物は、ヘパリン化されたマイクロピペットを使用して後方眼窩に採血され、血液はヘパリン処理したエッペンドルフ管に分注され、湿った氷上に置かれる。試料を、４，０００ ｒ．ｐ．ｍ．で４℃の事前冷却した微小遠心機中で５分間回転させ、血漿を収集し、５０ｍＭの体積のトリス－アセテート ｐＨ＝８．０で希釈する。収集された血漿を、超遠心分離（ＮａｎｏＳｅｐ ３００Ｋ， Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．， Ａｎｎ Ａｒｂｏｕｒ， ＭＩ）を介して３００ＫＤａ膜を通して濾過し、－８０℃で凍結する。ピロホスフェートを、ウリジン５’ジホスホ［１４Ｃ］グルコースを使用した標準的な三つのステップの酵素アッセイを使用して定量化し、反応生成物、ウリジン５’ジホスホ［１４Ｃ］グルコン酸を記録する。（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｔ ｔｈｅ ｐｉｃｏｍｏｌｅ ｌｅｖｅｌ． Ｃｈｅｕｎｇ ＣＰ， Ｓｕｈａｄｏｌｎｉｋ ＲＪ， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９７７ Ｎｏｖ； ８３（１）：６１－３）。簡潔に述べると、５ｍＭのＭｇＣｌ２、９０ｍＭのＫＣＬ、６３ｍＭのトリス－ＨＣＬ（ｐＨ ７．６）、１ｎｍｏｌのＮＡＤＰ＋、２ｎｍｏｌのグルコース１，６－ジホスフェート、４００ｐｍｏｌのウリジン５’－ジホスホグルコース、０．０２μＣｉのウリジン５’ジホスホ［１４Ｃ］グルコース、ウリジン５’－ジホスホグルコースの０．２５単位、ホスホグルコースムターゼの０．２５単位、グルコースン６－ホスフェートデヒドロゲナーゼの０．５単位、および無機ピロホスフェート（５０～２００ｐｍｏｌ）を含む反応混合物を含む反応混合物（１００μｌ）を３７℃で３０分培養する。反応は、水中に十分に懸濁された２００μｌの２％の炭素の添加によって終了する。次いで、２００μｌの上清のアリコートを、シンチレーション溶液中で計数する。
インビボ９９ｍＰＹＰ撮像
必要に応じて、骨撮像を実施することができる。骨撮像剤９９ｍＴｃ－ピロホスフェート（Ｐｈａｒｍａｌｕｃｅｎｃｅ， Ｉｎｃ）は、二重の１ｍｍピンホールコリメータ（Ｘ－ＳＰＥＣＴ、Ｇａｍｍａ Ｍｅｄｉｃａ－Ｉｄｅａｓ）３８を有する前臨床ｍｉｃｒｏＳＰＥＣＴ／ＣＴハイブリッド撮像システムを使用して、動物のコホートで評価される。各動物に、２～５ｍＣｉの放射性標識トレーサーを腹腔内注射し、注射の１～１．５時間後に撮像する。ＳＰＥＣＴ画像との解剖学的共局在化のために、ＣＴスキャン（５０ｋＶｐ、８００ｕＡ、および倍率１．２５で５１２投影）が取得される。ＳＰＥＣＴ画像は、反時計回りの回転でコリメータヘッド当たり１８０°で取得され、射影は３２、射影当たり６０秒、ＲＯＲは７．０ｃｍ、ＦＯＶは８．９５ｃｍ、エネルギーウィンドウは１４０ｋｅＶ±２０である。ＣＴ画像は、フィルタリングされたバックプロジェクションアルゴリズムを使用して、ＦＬＥＸ Ｘ－Ｏ ＣＴソフトウェア（Ｇａｍｍａ Ｍｅｄｉｃａ－Ｉｄｅａｓ）を用いて再構成されるものとする。ＳＰＥＣＴ画像は、ＦＬＥＸ ＳＰＥＣＴソフトウェア（５つの反復、４つのサブセット）を使用して再構成され、その後、ＣＴ画像と融合され、ＡＭＩＲＡソフトウェアを使用して分析される。
９９ｍＰＹＰ取り込みの定量化
９９ｍＰＹＰマウススキャンでは、動物を注射から７日以内に撮像する。得られたＳＰＥＣＴスキャンは、ＮＩＨの画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪにインポートされ、関心領域が各動物の頭部（標的器官）および全身の周りに描かれる。しばしば「パーセント注射用量」と称される注入活性パーセント（ＰＩＡ）は、頭部の計数と全身の計数の比率を比較することによって計算され、パーセント注射用量として表され、放射性トレーサーが関心領域（頭部）によって取り込まれる親和性の尺度を与える。各スキャンでの合計計数は、注入用量の全身尺度として理解される。
血液および尿パラメータ
生化学的分析はまた、血液試料（眼窩の放血により採取される）および、午前１０時から午後２時の間の同じ時間に一晩絶食した後に採取されるスポット尿を使用して実施され得る。濾過によるヘパリン化血漿の脱タンパク質化（ＮａｎｏＳｅｐ ３００ Ｋ， Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ）後、血漿および尿の総ピロホスフェート（ＰＰｉ）濃度を、蛍光プローブ（ＡＢ１１２１５５， ＡＢＣＡＭ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を使用して決定する。尿ＰＰｉは、尿クレアチニンに対して補正され、これは、アッセイ間の変動性を調整するための適切な対照を使用して、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳまたはＥＬＩＳＡによって測定される。
腎臓の組織構造
左腎臓は、４％のホルマリン／ＰＢＳ中で４℃Ｃで１２時間固定され、その後、エタノールおよびキシレンの濃度を上げて脱水し、続いてパラフィンで包埋する。１％メチルグリーンで対比染色した１０ｕｍのフォンコッサ染色切片で、鉱床沈着物を決定する。ヘマトキシリン／エオシンは、形態学的評価のための対比染色として使用される。組織形態計測評価、皮質、髄質および骨盤を含む矢状腎臓切片の組織形態計測評価は、骨形態計測装置（Ｏｓｔｅｏｍｅｔｒｉｃｓ， Ａｔｌａｎｔａ， ＧＡ）を使用して、二人の独立した観察者によって盲検化される。石灰化面積の割合は、式を使用して決定され：％ 石灰化面積＝１００＊石灰化面積／総面積（皮質、髄質、および骨盤腔を含む）、セクション当たりの観察された面積の数に依存する。石灰化サイズは、式を使用して決定され、：石灰化サイズ＝石灰化面積／セクション当たりの観察された石灰化面積の数。
透過電子顕微鏡では、左腎臓の１ｍｍの３ブロックを、リン酸緩衝食塩水中の２．５％グルタルアルデヒドおよび２％パラホルムアルデヒド中で２時間固定し、続いて１％のオスミウム液体中で２時間後固定する。脱水は、一連のエタノール濃度（５０％～１００％）を使用して実施される。腎組織はエポキシ樹脂に包埋され、重合は６０℃で一晩実施される。薄い切片（５０ｎｍ）を調製した後、組織をウランおよび鉛で二重染色し、Ｔｅｃｎａｉ Ｂｉｏｔｗｉｎ（ＬａＢ６、８０ｋＶ）（ＦＥＩ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、ＯＲ）を使用して観察する。
組織型、組織形態計測、およびマイクロ－ＣＴ
マウスの脛骨および大腿骨は、軟部組織から剥がされ、７０％エタノールに固定され、脱水され、メチルメタクリレート中に埋め込まれて切片化され、トルイジンブルーで染色される（Ｃ． Ｂ． Ｗａｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｏｗ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｃａｕｓｅｓ ｐｌａｃｅｎｔａｌ， ｓｋｅｌｅｔａｌ， ｎｅｕｒａｌ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｅｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｐｅｒｉｎａｔａｌ ｄｅａｔｈ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１， １２８３－１２９９ （１９９５））。組織形態計測測定は、一次海綿質に対応する成長板のすぐ下の固定領域で実施される（Ａ． Ｍ． Ｐａｒｆｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｂｏｎｅ ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ： ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ， ｓｙｍｂｏｌｓ， ａｎｄ ｕｎｉｔｓ． Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＡＳＢＭＲ Ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ． Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２， ５９５－６１０ （１９８７）） ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ Ｏｓｔｅｏｍｅａｓｕｒｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ （Ｏｓｔｅｏｍｅｔｒｉｃｓ， Ａｔｌａｎｔａ， ＧＡ）。骨は、Ｓｃａｎｃｏ ｕＣＴ－３５（Ｓｃａｎｃｏ， Ｂｒｕｔｉｓｓｅｌｌｅｎ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してスキャンされ、成長板直下の脛骨近位部および大腿骨遠位部の両方（骨梁骨）で、および脛骨または大腿骨中軸部（皮質骨）で、多数の構造パラメータについて分析される。
骨の生体力学的検査
加速食のマウスからの大腿骨は、三点曲げで破損するまで負荷をかけられ、通常食のマウスからの大腿骨は四点曲げで破損するまで負荷がかけられる。すべての全骨試験は、大腿骨を後方から前方に負荷をかけることによって行われ、その結果、前方四分円は引張荷重を受ける。四点曲げ装置の下側および上側支持体の幅はそれぞれ７ｍｍおよび３ｍｍである。試験は、油圧サーボ試験機（Ｉｎｓｔｒｏｎ ｍｏｄｅｌ ８８７４； Ｉｎｓｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．， Ｎｏｒｗｏｏｄ， ＭＡ， ＵＳＡ）を使用して、０．０５ｍｍ／秒のたわみ率で実施される。負荷およびミッドスパンの偏向は、２００Ｈｚのサンプリング周波数で直接取得される。負荷－偏向曲線は、剛性、最大荷重、および骨折までの仕事について分析される。降伏は、初期接線剛性と比較して、割線剛性の１０％減少（偏向範囲に対して正規化された負荷範囲）として定義される。大腿骨を室温で試験し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で湿潤に保つ。破損時のたわみから降伏時のたわみを引いたものと定義される、降伏後のたわみも測定される。
実施例４－ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するウイルスベクターを使用した慢性腎臓疾患の治療。
以下の実施例は、血管石灰化およびＣＫＤに関連する症状の治療に有効であると予想される、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶを提供する。ＥＮＰＰ１－ＦｃおよびＥＮＰＰ３－Ｆｃは、例示の目的で実施例において使用され、本発明の他のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合物を使用することにより類似の結果を得ることができる。
ＥＮＰＰ１－ＦｃおよびＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するＡＡＶビリオンは、実施例１に従って作製され、ＣＫＤマウス（慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）のモデルである（ＢＭＣ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ， ２０１３， １４：１１６）に投与される。ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３を用いた処置には、マウスの六セットが使用される。
対照コホート：この実験では、対照群として機能するＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第一のコホートに、ヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射し、対照群として機能する第二のコホートに、ヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ１－処理マウスコホート：ＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第三のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、またＣＫＤマウスの第四のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ３－処理マウスコホート：ＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第五のコホートに、ＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、またＣＫＤマウスの第六のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。
アデニン食：ＣＫＤマウスは、アデニン食で維持され、野生型マウスは、通常食で維持される（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｃｌａｖａｂｌｅ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ ５０１０； ＰＭＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｂｒｅｎｔｗｏｏｄ， ＭＯ）。ＣＫＤマウスが消費するアデニンを含む食を提供するため、アデニンを臭気と味覚を鈍らせるカゼイン系食事と混合した。アデニンはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭＯ， ＵＳＡ）から購入され、カゼイン系食事はＳｐｅｃｉａｌ Ｄｉｅｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＳＤＳ、英国）から購入される（参照番号８２４５２２）。食事の他の成分は、トウモロコシデンプン（３９．３％）、カゼイン（２０．０％）、マルトデキストリン（１４．０％）、スクロース（９．２％）、トウモロコシ／コーンオイル（５％）、セルロース（５％）、ビタミンミックス（１．０％）、ＤＬ－メチオニン（０．３％）、およびコリンビタルトレート（０．２％）である。
ベクター注射：生後２週間後、すべてのマウスは、マウス当たりｐＨ ７．４のＰＢＳの、約１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇｋｇ、好ましくは１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／ｋｇの後眼窩注射または尾静脈注射を受ける。注射されたベクターは、空の「ヌル」（対照群）であるか、またはＮＰＰ１ｏｒＮＰＰ３遺伝子（試験群）を担持している。
アッセイ：腎臓組織型、ＰＰｉレベル、およびＦＧＦ－２３レベル、ビタミンＤ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）レベル、血清／血液尿素レベル、血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベル、血清／血液クレアチンレベル、および血漿ピロホスフェート（ＰＰｉ）などの血液尿パラメータを、実施例３に記載されるように各コホートについて分析する。尿は、自然排尿後にスポット尿試料として収集される。血清および尿カルシウム、リン、クレアチニンおよび尿素レベルは、Ｋｏｎｅｌａｂ ２０ＸＴｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定される。クレアチニン濃度は、比色アッセイ（ＢｉｏＣｈａｉｎ、ＣＡ ＵＳＡ）で検証される。ＰＴＨはマウスインタクトなＰＴＨ ＥＬＩＳＡキット（Ｉｍｍｕｔｏｐｉｃｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）により測定され、ＦＧＦ２３レベルはインタクトなＦＧＦ２３ ＥＬＩＳＡ（Ｋａｉｎｏｓ， Ｊａｐａｎ）により測定され、ビタミンＤはＥＩＡキット（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＵＫ）により測定される。実験の詳細は、ＢＭＣ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ， ２０１３， １４：１１６， ａｎｄ ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１７ Ｊｕｌ １３；１２（７）．に列挙される。
結果：未処置のＣＫＤマウスは概して、体重減少と、尿中尿素／血清尿素および尿クレアチニン／血清クレアチニンとの間の比の減少など、腎機能低下の兆候を示す。対照的に、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質を発現するＡＡＶで処置されたＣＫＤマウスは、正常なＷＴマウスの体重範囲に近づく体重の増加を示すと予想される。一般的に、８０～１００ｍｇ／ｄＬの範囲の血清尿素レベルが最適であるとみなされる。１００ｍｇ／ｄＬを超える尿素レベルは、体重減少および身体活動の減少と共に、罹患率の増加と関連している。処置された（ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を有するＡＡＶ）ＣＫＤマウスは、血清尿素レベルの低下および尿尿素レベルの増加によって明示される腎臓機能の改善を示し、尿尿素／血清尿素比の上昇をもたらすと予想される。
ＣＫＤマウスの肝組織の腎臓組織学分析は、例えば、管腔、微小膿瘍および拡張尿細管などの領域における結晶質構造の沈着、拡張したボウマン嚢腔を示す過ヨウ素酸－シッフ（ＰＡＳ）染色、タンパク質キャストを伴う萎縮性尿細管（「甲状腺化」）および管状基底膜の肥厚を伴う管状萎縮の存在、Ｌａｄｅｗｉｇ染色で見られる軽度の間質性線維症の存在およびフォンコッサ染色で見られる管状構造の広範な石灰化の発生を示すと予想される。対照的に、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３で本発明に従って処置されたＣＫＤマウスは、管腔における腎ミネラル沈着の減少または欠乏および健康な野生型マウスの組織型と類似した組織型を有するおよび軟部組織の血管系を示すと予想される。
未処置のＣＫＤマウスは、健常な野生型マウスと比較する時、血清無機リン（ｐｉ）の有意な増加、ＰＴＨおよびＦＧＦ２３レベルの増加が予想されるが、１，２５（ＯＨ）２－ビタミンＤレベルの減少およびＰＰｉレベルの低下（約０．５μＭ）が予想される（Ｐｐｉの正常レベルは約２～４μＭであり、ＰＴＨについては約１０～６５ｎｇ／Ｌであり、ＦＧＦ２３レベルの中央値は１３ＲＵ／ｍｌであり、正常なＦＧＦ２３レベルは５～２１０ＲＵ／ｍｌであり、正常なビタミンＤレベルは２０ｎｇ／Ｌ～５０ｎｇ／Ｌである）。対照的に、処置されたＣＫＤマウスは、ＰＰｉのレベルの上昇（約４～５μＭ）を示すことが予想され、これは未処置ＣＫＤマウスに見られるＰＰｉレベル（約０．５μＭ）よりも高いことが予想される。したがって、当業者は、組織学的分析によって可視化された腎臓および冠動脈の軟部組織の石灰化の減少（２５％、または５０％、または７０％、または９０％または１００％）、血清ＰＰｉ値の増加、ビタミンＤレベルの正常化、ＦＧＦ２３レベルの正常範囲までの低下、血液分析からのＰＴＨレベルの正常化、生存率の増加、体重増加を伴う尿中尿素およびクレアチンの増加によって観察される腎機能の改善などの一つ以上の要素を観察することにより、慢性腎臓疾患の治療におけるベクター系ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の治療効果の決定を行うことができる。
ヒト対象の治療：
ＣＫＤに罹患しているヒト患者は、ｐＨ７．４で１Ｘ ＰＢＳ中約５×１０１１～５×１０１５ ｖｇ／ｋｇを含有するイントラベナル（ｉｎｔｒａｖｅｎａｌ）注射を提供することによって治療され、一部の実施形態では、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を送達および発現することができる対象当たり、ｐＨ７．４で１Ｘ ＰＢＳ中約１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇである。マウスモデルで論じたように、定期的な血液および尿検査を通して前述のパラメータの一つ以上を監視することによって、ＣＫＤの治療の成功が観察される。生きている患者において行うことができない腎臓の切片または動脈組織の染色を必要とする組織学的分析の代わりに、ＣＴスキャン、超音波、または静脈性腎盂造影などの当業者において一般的に知られている非侵襲的可視化技術を使用して、ＣＫＤに罹患している患者におけるＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３のベクター系送達および発現に応答して、石灰化の存在および石灰化の減少を可視化する。静脈性腎盂造影は、染料として機能する造影剤を使用するＸ線検査で、尿路の可視化と腎石灰化の検出に役立つ。コンピュータ断層撮影法は、Ｘ線技術を使用して、尿路などの身体の内部構造を描写する非侵襲的撮像技術である。腎石灰化は、ＣＴスキャンで見ることができる。ＣＴスキャンは、身体の周りの異なる角度からＸ線画像を収集し、詳細な断面画像ならびに身体の内部構造および器官の三次元画像を生成する。ＣＴスキャンは、治療後の石灰化の存在およびその後の減少を検出するために、動脈でも使用することができる。コンピュータは、身体を通して伝送される放射線を分析して、内部構造および器官の画像を再構築する。
軟部組織の石灰化、心臓の石灰化、心筋梗塞を可視化する技術を有する医師は、ヒトＥＮＰＰ１またはヒトＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶビリオンを投与することによって、ＣＫＤに罹患した対象の治療を行う。医師は、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３の構築物を送達し、誘導性プロモーターの制御下で対応するタンパク質を発現するウイルス粒子を投与する。したがって、医師は、症状の改善率および程度に基づいて、用量（発現されたｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３の量）を制御する選択肢を有する。治療の成功は、腎機能の改善、尿クレアチン値の改善（正常な尿中のクレアチンレベルは男性ではクレアチン値は４０～２７８ｍｇ／ｄＬ、女性では２９～２２６ｍｇ／ｄＬ）、尿尿素レベルの改善（成人の尿中の尿素値は正常で２６－４３ｇ／２４時間）、正常な血清－クレアチン値（正常な血清クレアチニン範囲は女性では０．６～１．１ｍｇ／ｄＬ、男性では０．７－１．３ｍｇ／ｄＬ）、正常なビタミンＤレベル（健康な人には２０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍＬが、適切であると考えられる。１２ｎｇ／ｍＬ未満のレベルは、ビタミンＤ欠損を示す）、正常な血中尿素窒素レベル（健康な成人のＢＵＮレベルは７～２０ｍｇ／ｄＬ）、体重増加、血清ＰＰｉレベルの増加（少なくとも約４～５μｍ）、動脈組織の石灰化の減少（２５％、または５０％、または７０％、または９０％、または１００％減少）、およびまたはＣＴまたは超音波スキャンなどの非侵襲的技術によって可視化された腎臓尿細管における石灰化の減少などの一つ以上の陽性症状を観察することによって、当業者の医療専門家によって観察される。
実施例５－ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するウイルスベクターを使用したＧＡＣＩの治療。
以下の実施例は、血管石灰化およびＧＡＣＩに関連する症状の治療に有効であると予想される、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶを提供する。ＥＮＰＰ１－ＦｃおよびＥＮＰＰ３－Ｆｃは、例示の目的で実施例において使用され、本発明の他のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合物を使用することにより類似の結果を得ることができる。
ＥＮＰＰ１－ＦｃおよびＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するＡＡＶビリオンは、実施例１に従って作製され、Ｅｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウス（これは、全身性動脈石灰化のモデルである（Ｌｉ， ｅｔ ａｌ． ， ２０１３， Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ＆ Ｍｅｃｈ． ６（５）： １２２７－３５）に投与される。ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３を用いた処置には、マウスの六セットが使用される。
対照コホート：この実験では、対照群として機能するＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第一のコホートに、ヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射し、対照群として機能するｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスの第二のコホートに、ヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ１－処置マウスコホート：ＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第三のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、Ｅｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスの第四のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ３－処置マウスコホート：ＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第五のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、Ｅｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスの第六のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。野生型マウスは、通常食で維持され、Ｅｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスは、高ホスフェートＴｅｋｌａｄ食事を与えられた。
ベクター注射：２週齢後、すべてのマウスは、マウス当たり約１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、好ましくは１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／ｋｇの後眼窩注射または尾静脈注射をＰＢＳ ｐＨ ７．４で受ける。注射されたベクターは、空の「ヌル」（対照群）であるか、またはＮＰＰ１またはＮＰＰ３遺伝子（試験群）を担持したのいずれかである。
アッセイ：腎臓組織型、ＰＰｉレベル、および、ＦＧＦ－２３レベル、ビタミンＤ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）レベル、血清／血液尿素レベル、血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベル、血清／血液クレアチンレベル、および血漿ピロホスフェート（ＰＰｉ）などの血液尿パラメータを、実施例３および４に記載されるように各コホートについて分析する。
結果：未処置のＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスは、概して体重減少および死亡率の増加を呈する。対照的に、ＥＮＰＰ１タンパク質またはＥＮＰＰ３タンパク質を発現するＡＡＶで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスは、正常なＷＴマウスの体重範囲に近づく体重の増加を示すと予測される。
ヌルベクターで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスは、心臓、大動脈および冠動脈に石灰化、および右心室の自由壁の心筋梗塞の組織学的証拠、冠動脈、心臓、上行大動脈および下行大動脈の石灰化、心筋細胞壊死、ならびに冠動脈石灰化の領域に隣接する心筋組織における心筋線維症を示すことが予想される。対照的に、ＥＮＰＰ１－ＦｃまたはＥＮＰＰ３－Ｆｃを発現するＡＡＶで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊ動物は、組織型または死後のマイクロＣＴにおいて心臓、動脈、または大動脈の石灰化の不在を示すことが予想される。ヌルベクターで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスはまた、腎皮質への拡張を伴う、外側髄質を中心とする重度の広範な石灰化とともに、腎髄質を中心とする石灰化を示す。対照的に、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を用いて本発明により処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスは、管腔における腎ミネラル沈着の減少または欠乏および健康な野生型マウスの組織型と類似した組織型を有する軟部組織の血管系を示すと予想される。
生存、毎日の動物体重、および末期組織型に加えて、治療応答は、死後高解像度マイクロＣＴスキャンを介して評価され、血管石灰化、血漿ＰＰｉ濃度、および９９ｍＴｃ ＰＰｉ（９９ｍＰＹＰ）取り込みを撮像する。ＷＴまたは処置された（ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するベクター）Ｅｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊのいずれも、未処置（ヌルベクター）Ｅｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊコホートの大動脈、冠動脈、および心臓に予想される劇的な石灰化とは対照的に、マイクロＣＴを介していかなる血管石灰化を有さないと予想される。さらに、処置した（ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するベクター）Ｅｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊ動物（５．２μＭ）の血清ＰＰｉ濃度は、ＷＴレベル（４．４μＭ）まで上昇し、未処置のｅｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊレベル（０．５μＭ）を有意に上回ると予想される。
９９ｍＰＹＰは、心臓撮像および骨リモデリングに典型的に使用される撮像剤である。それは、ヒドロキシアパタイトの表面に局在し、その後破骨細胞により取り込まれる得るため、異常に骨の再構築活性が高い領域に敏感である。未処置のＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊ動物の毎週の連続撮像は、処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊ動物のそれと比較して、頭部における９９ｍＰＹＰのより大きな取り込みを示すと予想される。測定は、ＥＮＰＰ１を発現するヌルベクターまたはベクターを含有するウイルス粒子の投与後３０～３５日目および５０～６５日後に行われる。これらの実験群の比較は、ＥＮＰＰ１－ＦｃまたはＥＮＰＰ３－Ｆｃ処置が、ＧＡＣＩマウスにおける９９ｍＰＹＰの取込みをＷＴレベルに戻し、ＥＮＰＰ１－ＦｃまたはＥＮＰＰ３－Ｆｃ処置は、細胞外ＰＰｉ濃度を上昇させることによって、Ｅｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスにおける非制御組織、感覚毛、および頭蓋骨の石灰化を廃棄できることを示唆することを示すと予想される。これらの観察結果は、ＥＮＰＰ１－ＦｃまたはＥＮＰＰ３－Ｆｃを発現するベクターを含有するウイルス粒子を投与されたＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスは、血管石灰化がなく、正常な血漿ＰＰｉ濃度を有することを示すことが予想される。
未処置のＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスはまた、健常な野生型マウスと比較して、血清無機リン（ｐｉ）の有意な増加、ＰＴＨおよびＦＧＦ２３レベルの増加、しかしながら１，２５（ＯＨ）２－ビタミンＤレベルの減少およびＰＰｉレベルの低下（約０．５ Ｍ）を示すと予想される（ｐｐの正常レベルは約２～４μＭであり、ＰＴＨについては約１０－６５ｎｇ／Ｌであり、ＦＧＦ２３レベルの中央値は１３ ＲＵ／ｍｌであり、正常なＦＧＦ２３レベルは５～２１０ ＲＵ／ｍｌの範囲であり、正常ビタミンＤレベルは２０ ｎｇ／ｍＬ～５０ ｎｇ／ｍＬである）。対照的に、処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスは、ＰＰｉのレベルの上昇（約４～５μＭ）を示すことが予想され、これは未処置のＣＫＤマウスに見られるＰＰｉレベル（約０．５μＭ）よりも高いことが予想される。したがって、当業者は、ＧＡＣＩの治療におけるベクター系ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３ベースの治療の有効性を、組織学的分析を通じて可視化された肝臓および冠動脈の軟部組織の石灰化の減少（２５％、または５０％、または７０％、または９０％または１００％減少）、血清ＰＰｉレベルの増加、ビタミンＤレベルの正常化、ＦＧＦ２３レベルの正常範囲までの低下および血液分析からのＰＴＨレベルの正常化、生存率の増加、体重増加に伴う尿中尿素とクレアチンの増加によって観察される腎機能の改善などの、一つ以上の要素を観察することによって、決定することができる。
ヒト対象の治療
ＧＡＣＩに罹患しているヒト患者は、ｐＨ７．４で１Ｘ ＰＢＳ中、およそ５×１０１１～５×１０１５ ｖｇ／ｋｇを含む注射を提供することによって治療される。一部の実施形態では、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３を送達および発現することができる、対象当たり、ｐＨ７．４で１Ｘ ＰＢＳ中、およそ１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇである。ＧＡＣＩの治療の成功は、マウスモデルで論じた定期的な血液および尿検査を通して、前述の一つ以上のパラメータを監視することによって観察される。生きている患者において行うのが現実的ではない腎臓の切片または動脈組織の染色を必要とする組織学的分析の代わりに、実施例４で論じた非侵襲的可視化技術を使用する。
軟部組織の石灰化、心臓の石灰化、心筋梗塞を可視化する技術を有する医師は、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶビリオンを投与することによって、ＧＡＣＩに罹患した対象の治療を行う。医師は、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３をコードする構築物を送達するウイルス粒子を投与し、ベクターは、誘導性プロモーターの制御下でＥＮＰＰタンパク質を発現する。医師は、症状の改善率および程度に基づいて、用量（発現されたｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３の量）を制御できる。正常なビタミンＤレベル（２０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍＬが、健康な人には適切であるとみなされる。１２ｎｇ／ｍｌ未満のレベルはビタミンＤ欠損を示す）、正常な血中尿素窒素レベル（健康な成人のＢＵＮレベルは７～２０ｍｇ／ｄＬ）、体重増加、血清ＰＰｉレベルの増加（少なくとも約４～５μｍ）、動脈組織の石灰化の減少（２５％、または５０％、または７０％、または９０％または１００％減少）および／またはＣＴまたは超音波スキャンなどの非侵襲的な技術によって可視化された腎臓細管における石灰化の減少などの一つ以上の陽性症状を観察することによって、当業者である医療専門家によって治療の成功が観察される。
実施例６－ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するウイルスベクターを使用したＰＸＥの処理。
以下の実施例は、血管石灰化およびＰＸＥに関連する症状の治療に効果的であることが予想される、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶを提供する。ＥＮＰＰ１－ＦｃおよびＥＮＰＰ３－Ｆｃは、例示の目的で実施例において使用され、本発明の他のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合物を使用することにより類似の結果を得ることができる。
ＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質およびＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するＡＡＶビリオンは、実施例１に従って作製され、ＡＢＣＣ６－／－マウス（弾性線維性仮性黄色腫のモデルである；Ｊｉａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍ． １２７（６）： １３９２－４１０２）に投与される。ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３を用いた処置には、マウスの六セットが使用される。
対照コホート：この実験では、対照群として機能するＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第一のコホートに、ヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射し、対照群として機能するＡＢＣＣ６－／－マウスの第二のコホートに、ヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ１－処置マウスコホート：ＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第三のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、ＡＢＣＣ６－／－マウスの第四のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ３－処置マウスコホート：ＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第五のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、ＡＢＣＣ６－／－マウスの第六のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。野生型マウスは、通常食で維持され、ＡＢＣＣ６－／－マウスは、高ホスフェートＴｅｋｌａｄ食事を与えられた。
ベクター注射：２週齢後、すべてのマウスは、マウス当たり約１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、好ましくは１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／ｋｇの後眼窩注射または尾静脈注射をＰＢＳ ｐＨ ７．４で受ける。注射されたベクターは、空の「ヌル」（対照群）であるか、またはＮＰＰ１またはＮＰＰ３遺伝子（試験群）を担持したのいずれかである。
アッセイ：腎臓組織型、ＰＰｉレベル、および、ＦＧＦ－２３レベル、ビタミンＤ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）レベル、血清／血液尿素レベル、血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベル、血清／血液クレアチンレベル、および血漿ピロホスフェート（ＰＰｉ）などの血液尿パラメータを、実施例３および４に記載されるように各コホートについて分析する。
結果：未処置のＡＢＣＣ６－／－マウスは、概して体重減少および死亡率の増加を呈する。対照的に、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質を発現するＡＡＶで処置されたＡＢＣＣ６－／－マウスは、正常なＷＴマウスの体重範囲に近づく体重の増加を示すと予測される。ヌルベクターで処置されたＡＢＣＣ６－／－マウスは、心臓、大動脈および冠動脈に石灰化、および右心室の自由壁の心筋梗塞の組織学的証拠、冠動脈、心臓、上行大動脈および下行大動脈の石灰化、心筋細胞壊死、ならびに冠動脈石灰化の領域に隣接する心筋組織における心筋線維症を示すことが予想される。対照的に、ＥＮＰＰ１－ＦｃまたはＥＮＰＰ３－Ｆｃを発現するベクターで処置されたＡＢＣＣ６－／－動物は、組織型または死後のマイクロＣＴにおいて心臓、動脈、または大動脈の石灰化の不在を示すことが予想される。ヌルベクターで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスはまた、腎皮質への拡張を伴う、外側髄質を中心とする重度の広範な石灰化とともに、腎髄質を中心とする石灰化を示す。対照的に、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３のウイルスベクター系発現を用いて処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスは、健康な野生型マウスの組織型と類似した組織型を有する管腔および軟部組織の血管系における腎ミネラル沈着の減少または欠乏を示すと予想される。
生存、毎日の動物体重、および末期組織型に加えて、治療応答は、死後高解像度マイクロＣＴスキャンを介して評価され、血管石灰化、および血漿ＰＰｉ濃度を撮像する。ＷＴまたは処置された（ＥＮＰＰ１を発現するベクター）ＡＢＣＣ６－／－は、未処置（ヌルベクター）ＡＢＣＣ６－／－コホートの大動脈、冠動脈、および心臓に見られると予想される劇的な石灰化とは対照的に、マイクロＣＴを介していかなる血管石灰化を有さないと予測される。さらに、処置した（ＥＮＰＰ１を発現するベクター）ＡＢＣＣ６－／－動物（５．２μＭ）の血清ＰＰｉ濃度は、ＷＴレベル（４．４μＭ）まで上昇し、未処置のＡＢＣＣ６－／－レベル（０．５μＭ）を有意に上回ると予想される。
未処置のＡＢＣＣ６－／－マウスはまた、健常な野生型マウスと比較して、血清無機リン（ｐｉ）の有意な増加、ＰＴＨおよびＦＧＦ２３レベルの増加、しかしながら１，２５（ＯＨ）２－ビタミンＤレベルの減少およびＰＰｉレベルの低下（約０．５μＭ）を示すと予想される（ｐｐの正常レベルは約２～４μＭであり、ＰＴＨについては約１０～６５ｎｇ／Ｌであり、ＦＧＦ２３レベルの中央値は１３ ＲＵ／ｍｌであり、正常なＦＧＦ２３レベルは５～２１０ ＲＵ／ｍｌの範囲であり、正常ビタミンＤレベルは２０ ｎｇ／ｍＬ～５０ ｎｇ／ｍＬである）。対照的に、処置されたＡＢＣＣ６－／－マウスは、ＰＰｉのレベルの上昇（約４～５μＭ）を示すことが予想され、これは未処置のＡＢＣＣ６－／－マウスに見られるＰＰｉレベル（約０．５μＭ）よりも高いことが予想される。したがって、当業者は、ＰＸＥの治療におけるベクター系のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３ベースの治療の有効性を、組織学的分析を通じて可視化された肝臓および冠動脈の軟部組織の石灰化の減少（２５％、または５０％、または７０％、または９０％または１００％減少）、血清ＰＰｉレベルの増加、ビタミンＤレベルの正常化、ＦＧＦ２３レベルの正常範囲までの低下および血液分析からのＰＴＨレベルの正常化、生存率の増加、体重増加に伴う尿中尿素とクレアチンの増加によって観察される腎機能の改善などの、一つ以上の要素を観察することによって、決定することができる。
ヒト対象の治療：
ＰＸＥに罹患しているヒト患者は、ｐＨ７．４で１Ｘ ＰＢＳ中、およそ５×１０１１～５×１０１５ ｖｇ／ｋｇを含むイントラベナル（ｉｎｔｒａｖｅｎａｌ）注射を提供することによって治療される。一部の実施形態では、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を送達および発現することができる、対象当たり、ｐＨ７．４で１Ｘ ＰＢＳ中、およそ１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇである。ＰＸＥの治療の成功は、マウスモデルで論じた定期的な血液および尿検査を通して、前述の一つ以上のパラメータを監視することによって観察される。生きている患者において行うのが現実的ではない腎臓の切片または動脈組織の染色を必要とする組織学的分析の代わりに、実施例４で論じた非侵襲的可視化技術を使用する。
軟部組織の石灰化、心臓の石灰化、心筋梗塞を可視化する技術を有する医師は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶビリオンを投与することによって、ＰＸＥに罹患した対象の治療を行うことができる。医師は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の構築物を送達し、誘導性プロモーターの制御下で対応するタンパク質を発現するウイルス粒子を使用することもできる。したがって、医師は、症状の改善率および程度に基づいて、用量（ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の発現量）を制御する選択肢を有する。正常なビタミンＤレベル（２０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍＬが、健康な人には適切であるとみなされる。１２ｎｇ／ｍｌ未満のレベルはビタミンＤ欠損を示す）、網膜色素線条の消失およびそのサイズおよびまたは数の減少、腎出血の減少または欠乏、正常な血中尿素窒素レベル（健康な成人のＢＵＮレベルは７～２０ｍｇ／ｄＬ）、体重増加、血清ＰＰｉレベルの増加（少なくとも約４～５μｍ）、動脈組織、結合組織の石灰化の減少（２５％、または５０％、または７０％、または９０％または１００％減少）および／またはＣＴまたは超音波スキャンなどの非侵襲的な技術によって可視化された腎臓細管における石灰化の減少などの一つ以上の陽性症状を観察することによって、当業者である医療専門家によって治療の成功および適切な用量が容易に推察される。
実施例７－ヒトＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するウイルスベクターを使用したＯＰＬＬの治療。
以下の実施例は、血管石灰化およびＰＸＥに関連する症状の治療に効果的であることが予想される、ヒトＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶを提供する。ＥＮＰＰ１－ＦｃおよびＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合物は、例示の目的で実施例において使用され、本発明の他のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合物を使用することにより類似の結果を得ることができる。
ＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質またはＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するＡＡＶビリオンは、実施例１に従って作製され、つま先歩行（ｔｔｗ）マウス（後縦靱帯の骨化のためのモデルである；（Ｏｋａｗａ， ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９（３）：２７１－３； Ｎａｋａｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ， １９９９， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｌ０４（６）：４９２－７）に投与される。ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３を用いた処置には、マウスの六セットが使用される。
対照コホート：この実験では、対照群として機能するＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第一のコホートに、ヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射し、対照群として機能するｔｔｗマウスの第二のコホートに、ヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ１－処置マウスコホート：ＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第三のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、ｔｔｗマウスの第四のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ３－処置マウスコホート：ＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第五のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、ｔｔｗマウスの第六のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。野生型マウスは、通常食で維持され、ｔｔｗマウスは、高ホスフェートＴｅｋｌａｄ食事を与えられた。
ベクター注射：２週齢後、すべてのマウスは、マウス当たり約１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、好ましくは１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／ｋｇの後眼窩注射または尾静脈注射をＰＢＳ ｐＨ ７．４で受ける。注射されたベクターは、空の「ヌル」（対照群）であるか、またはＮＰＰ１またはＮＰＰ３遺伝子（試験群）を担持したのいずれかである。
アッセイ：腎臓組織型、ＰＰｉレベル、および、ＦＧＦ－２３レベル、ビタミンＤ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）レベル、血清／血液尿素レベル、血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベル、血清／血液クレアチンレベル、および血漿ピロホスフェート（ＰＰｉ）などの血液尿パラメータを、実施例３および４に記載されるように各コホートについて分析する。
結果：未処置のｔｔｗマウスは、概して体重減少、背柱の肥厚、昏睡、および死亡率の増加を呈する。対照的に、ＥＮＰＰ１タンパク質またはＥＮＰＰ３タンパク質を発現するＡＡＶで処置されたｔｔｗマウスは、正常なＷＴマウスの体重範囲に近づく体重の増加、正常な覚醒、および野生型マウスの厚さに近づく背柱の厚さの減少を示すと予想される。ヌルベクターで処置されたｔｔｗマウスは、その心臓、大動脈および冠動脈の石灰化、右心室の自由壁における心筋梗塞の組織学的証拠、冠動脈、心臓、上行大動脈および下行大動脈の石灰化、心筋細胞壊死、冠動脈石灰化領域に隣接した心筋組織における心筋線維症を呈する。対照的に、ＥＮＰＰ１－ＦｃまたはＥＮＰＰ３－Ｆｃを発現するベクターで処置されたｔｔｗ動物は、組織型または死後マイクロＣＴで心臓、動脈、または大動脈の石灰化の非存在を示すことが予想される。ヌルベクターで処置されたｔｔｗマウスはまた、腎皮質への拡張を伴う、外側髄質の中心とする重度の広範な石灰化とともに、腎髄質を中心とする石灰化を示す。対照的に、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３のウイルスベクター系発現を用いて処置されたｔｔｗマウスは、管腔における腎ミネラル沈着の減少または欠乏、背柱の石灰化の減少、および健康な野生型マウスの組織型と類似した組織型を有する軟部組織の血管系を示すと予想される。
生存、毎日の動物体重、および末期組織型に加えて、治療応答は、死後高解像度マイクロＣＴスキャンを介して評価され、血管石灰化、および血漿ＰＰｉ濃度を撮像する。ＷＴまたは処置された（ＥＮＰＰ１を発現するベクター）ｔｔｗのいずれも、未処置（ヌルベクター）ｔｔｗコホートの大動脈、冠動脈、および心臓に見られると予想される劇的な石灰化とは対照的に、マイクロＣＴを介していかなる血管石灰化を有さないと予測される。さらに、処置済み（ＥＮＰＰ１を発現するベクター）ｔｔｗ－動物（５．２μＭ）の血清ＰＰｉ濃度は、ＷＴレベル（４．４μＭ）まで上昇し、未処置ｔｔｗレベル（０．５μＭ）を有意に上回ると予想される。
未処置のｔｔｗマウスはまた、健康な野生型マウスと比較して、血清無機リン（ｐｉ）の有意な増加、ＰＴＨおよびＦＧＦ２３レベルの増加が予想されるが、１，２５（ＯＨ）２～ビタミンＤレベルの減少およびＰＰｉレベルの低下（約０．５μＭ）を示す（ＰＰの正常レベルは約２～４μＭであり、ＰＴＨについては約１０～６５ｎｇ／Ｌであり、ＦＧＦ２３レベルの中央値は１３ＲＵ／ｍｌであり、正常なＦＧＦ２３レベルは５～２１０ＲＵ／ｍｌであり、正常なビタミンＤレベルは２０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬである）。対照的に、処置されたｔｔｗマウスは、ＰＰｉのレベルの上昇（約４～５μＭ）を示すと予想され、これは未処置ｔｔｗマウス（約０．５μＭ）に見られるＰＰｉレベルよりも高いと予想される。したがって、当業者は、組織学的分析によって可視化された腎臓および冠動脈の軟部組織の石灰化の減少（２５％、または５０％、または７０％、または９０％または１００％の減少）、血清ＰＰｉ値の増加、ビタミンＤレベルの正常化、ＦＧＦ２３レベルの正常範囲までの低下および血液分析からのＰＴＨレベルの正常化、生存率の増加、体重増加の増加をともなう尿尿素およびクレアチンの増加によって観察されたおよび腎機能の改善などの一つ以上の要素を観察することによって、ＯＬＬの治療におけるベクター系ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の治療の有効性を決定することができる。
ヒト対象の治療：
ＯＰＬＬに罹患しているヒト患者は、ｐＨ７．４で１Ｘ ＰＢＳ中、およそ５×１０１１～５×１０１５ ｖｇ／ｋｇを含有するイントラベナル（ｉｎｔｒａｖｅｎａｌ）注射を提供することによって治療される。一部の実施形態では、対象当たりｐＨ７．４で、１Ｘ ＰＢＳ中、およそ１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、のｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３を送達および発現することができる。ＯＰＬＬの治療の成功は、マウスモデルで論じた定期的な血液および尿検査を通して、一つ以上の前述のパラメータを監視することによって観察される。生きている患者において行うのが現実的ではない腎臓の切片または動脈組織の染色を必要とする組織学的分析の代わりに、実施例４で論じた非侵襲的可視化技術を使用する。
軟部組織の石灰化、心臓の石灰化、心筋梗塞を可視化する技術を持つ医師は、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶビリオンの投与時にＯＰＬＬに罹患した対象の治療を行うことができる。一部の実施形態では、医師は、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３の構築物を送達し、誘導性プロモーターの制御下で対応するタンパク質を発現するウイルス粒子を使用する。したがって、医師は、症状の改善率および程度に基づいて、用量（発現されたｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３の量）を制御する選択肢を有する。治療の成功および適切な用量は、正常なビタミンＤレベル（２０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍＬは、健康な人には適切とみなされる。１２ｎｇ／ｍＬ未満のレベルは、ビタミンＤ欠損）、正常な血中尿素窒素レベル（健康な成人のＢＵＮレベルは７～２０ｍｇ／ｄＬ）、体重増加、血清ＰＰｉレベルの増加（少なくとも約４～５μｍ）、動脈組織の石灰化の減少（２５％、または５０％、または７０％、または９０％または１００％減少）、背柱の肥厚および痛覚の減少、ＣＴ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）または超音波などの非侵襲的手法によって可視化された脊柱狭窄の減少（ＭＲＩスキャン、またはＭＲＩスキャンなどの磁気共鳴検査、などの一つ以上の陽性症状を観察することによって、当業者である医療専門家によって容易に推察される。
実施例８－ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するウイルスベクターを使用した骨減少症および／または骨軟化症の治療。
以下の実施例は、骨減少症および／または骨軟化症に関連する症状の治療に効果的であると予想される、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶを提供する。ＥＮＰＰ１－ＦｃおよびＥＮＰＰ３－Ｆｃは、例示の目的で実施例において使用され、本発明の他のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合物を使用することにより類似の結果を得ることができる。
ＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質またはＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するＡＡＶビリオンは、実施例１に従って作製され、つま先歩行（ｔｔｗ）マウス（変形性関節症のマウスモデルである（Ｂｅｒｔｒａｎｄ， ｅｔ ａｌ， ２０１２， Ａｎｎａｌｓ Ｒｈｅｕｍ． Ｄｉｓｅａｓｅｓ ７１（７）： １２４９－５３））に投与される。ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３を用いた処置には、マウスの六セットが使用される。同様の実験は、骨減少症のモデルとしても機能するＥＮＰＰ１ノックアウトマウス（ＥＮＰＰ１ＫＯ）を使用して繰り返される。ＧＡＣＩに加えて、（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ， ｅｔ ａｌ， ２０１２， ＰｌｏＳ ｏｎｅ ７（２）：ｅ３２１７７）。
対照コホート：この実験では、対照群として機能するＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第一のコホートに、ヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射し、対照群として機能するｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）マウスの第二のコホートに、ヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ１－処置マウスコホート：ＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第三のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、ｔｔｗマウス（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）の第四のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ３－処置マウスコホート：ＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第五のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、ｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）マウスの第六のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。野生型マウスは、通常食で維持され、ｔｔｗマウス（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）は、高ホスフェートＴｅｋｌａｄ食事を与えられた。
ベクター注射：生後２週間後、すべてのマウスは、マウス当たりｐＨ ７．４のＰＢＳの、約１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、好ましくは１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／ｋｇの後眼窩注射または尾静脈注射を受ける。注射されたベクターは、空の「ヌル」（対照群）であるか、またはＮＰＰ１ｏｒＮＰＰ３遺伝子（試験群）を担持している。
アッセイ：腎臓組織型、ＰＰｉレベル、および、ＦＧＦ－２３レベル、ビタミンＤ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）レベル、血清／血液尿素レベル、血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベル、血清／血液クレアチンレベル、および血漿ピロホスフェート（ＰＰｉ）などの血液尿パラメータを、実施例３および４に記載されるように各コホートについて分析する。
組織型、組織形態計測、およびマイクロ－ＣＴ： 骨分析は、実施例３に記載されるプロトコルに従って実施される。
骨の生体力学的検査：骨分析は、実施例３に記載されるプロトコルに従って実施される。
結果：未処置のｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）マウスは概して、体重減少、昏睡、皮質骨の厚さおよび骨梁骨体積の減少、軟骨および靱帯の石灰化、大腿骨および脛骨などの長骨における骨密度の減少、ならびに野生型と比較して死亡率の増加を呈する。対照的に、ＥＮＰＰ１タンパク質またはＥＮＰＰ３タンパク質を発現するＡＡＶで処置されたｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）マウスは、正常なＷＴマウスの体重範囲に近づく体重の増加、正常な注意力、骨ミネラル濃度の増加、皮質骨厚および骨梁骨体積の改善、骨強度および骨延性の増加を示すことが予測される。ヌルベクターで処置されたｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）マウスは、心臓、大動脈および冠動脈に石灰化、および右心室の自由壁の心筋梗塞の組織学的証拠、冠動脈、心臓、上行大動脈および下行大動脈の石灰化、心筋細胞壊死、ならびに冠動脈石灰化の領域に隣接する心筋組織における心筋線維症を示すことが予想される。対照的に、ＥＮＰＰ１－ＦｃまたはＥＮＰＰ３－Ｆｃを発現するベクターで処置されたｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）動物は、組織学的または死後のマイクロＣＴにおいて心臓、動脈、または大動脈の石灰化の不在を示すことが予想される。ヌルベクターで処置されたｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）マウスはまた、腎皮質への拡張を伴う、外側髄質を中心とする重度の広範な石灰化とともに、腎髄質を中心とする石灰化を示す。対照的に、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３のウイルスベクター系発現を用いて処置されたｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）マウスは、管腔における腎ミネラル沈着の減少または欠乏、背柱の石灰化、健康な野生型マウスの組織型と類似した組織型を有する軟部組織の血管系を示すと予想される。
生存、毎日の動物体重、および末期組織型に加えて、治療応答は、死後高解像度マイクロＣＴスキャンを介して評価され、血管石灰化、および血漿ＰＰｉ濃度を撮像する。ＷＴまたは処置された（ＥＮＰＰ１を発現するベクター）ｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）のいずれも、未処置（ヌルベクター）ｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）コホートの大動脈、冠動脈、および心臓に見られると予想される劇的な石灰化とは対照的に、マイクロＣＴを介していかなる血管石灰化を有さないと予測される。さらに、処置した（ＥＮＰＰ１を発現するベクター）ｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）動物（５．２μＭ）の血清ＰＰｉ濃度は、ＷＴレベル（４．４μＭ）まで上昇し、未処置のｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）レベル（０．５μＭ）を有意に上回ると予想される。
未処置のｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）マウスはまた、健常な野生型マウスと比較して、血清無機リン（ｐｉ）の有意な増加、ＰＴＨおよびＦＧＦ２３レベルの増加、しかしながら１，２５（ＯＨ）２－ビタミンＤレベルの減少およびＰＰｉレベルの低下（約０．５ Ｍ）を示すと予想される（ｐｐの正常レベルは約２～４μＭであり、ＰＴＨについては約１０－６５ｎｇ／Ｌであり、ＦＧＦ２３レベルの中央値は１３ ＲＵ／ｍｌであり、正常なＦＧＦ２３レベルは５～２１０ ＲＵ／ｍｌの範囲であり、正常ビタミンＤレベルは２０ ｎｇ／ｍＬ～５０ ｎｇ／ｍＬである）。対照的に、処置されたｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）マウスは、ＰＰｉのレベルの上昇（約４～５μＭ）を示すことが予想され、これは未処置のｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）マウスに見られるＰＰｉレベル（約０．５μＭ）よりも高いと予想される。したがって、当業者は、骨減少症または骨軟化症または変形性関節症の治療におけるベクター系ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の治療の有効性を、組織学的分析を通じて可視化された肝臓および冠動脈の軟部組織の石灰化の減少（２５％、または５０％、または７０％、または９０％または１００％減少）、血清ＰＰｉレベルの増加、ビタミンＤレベルの正常化、ＦＧＦ２３レベルの正常範囲までの低下および血液分析からのＰＴＨレベルの正常化、長骨の強度の向上、骨密度の向上、皮質骨の厚さおよび骨梁骨体積の向上、生存率の増加、体重増加に伴う尿中尿素とクレアチンの増加によって観察される腎機能の改善などの、一つ以上の要素を観察することによって、決定することができる。
ヒト対象の治療：
骨減少症または骨軟化症または変形性関節症に罹患しているヒト患者は、ｐＨ７．４で１Ｘ ＰＢＳ中、およそ５×１０１１～５×１０１５ ｖｇ／ｋｇを含むイントラベナル（ｉｎｔｒａｖｅｎａｌ）注射を提供することによって治療され、一部の実施形態では、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３を送達および発現することができる対象当たり、ｐＨ７．４で１Ｘ ＰＢＳ中、およそ１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇである。骨減少症または骨軟化症または変形性関節症の治療の成功は、マウスモデルで論じた定期的な骨強度、骨密度、血液および尿検査を通して、前述の一つ以上のパラメータを監視することによって観察される。生きている患者において行うのが現実的ではない腎臓の切片または動脈組織の染色を必要とする組織学的分析の代わりに、実施例４で論じた非侵襲的可視化技術を使用する。
同様に、患者は、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）または周辺二重エネルギーＸ線吸収測定法（ｐＤＸＡ）または定量的超音波（ＱＵＳ）または周辺定量的コンピュータ断層撮影法（ｐＱＣＴ）を使用して、定期的な骨密度測定を受ける。これらの方法の一つから取得された骨密度スコアは、治療後に取得された状態および進行の指標を提供する。－１．０以上のＴスコアは、正常な骨密度とみなされ、－１．０～－２．５の間のＴスコアは、骨減少症の存在を示し、一方で－２．５以下のＴスコアは、骨粗しょう症の存在を示す。本発明のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３で治療された患者において、Ｔスコアの段階的な改善が予想される。
軟部組織の石灰化、心臓の石灰化、骨密度を可視化する技術を有する医師は、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶビリオンの投与によって、骨減少症または変形性関節症に罹患した対象の治療を行う。一部の実施形態では、医師は、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３の構築物を送達し、誘導性プロモーターの制御下で対応するタンパク質を発現するウイルス粒子を使用する。したがって、医師は、症状の改善率および程度に基づいて、用量（発現されたｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３の量）を制御する選択肢を有する。正常なビタミンＤレベル（２０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍＬが、健康な人には適切であるとみなされる。１２ｎｇ／ｍｌ未満のレベルはビタミンＤ欠損を示す）、正常な骨密度（－１以上のＴスコア）、正常な血中尿素窒素レベル（健康な成人のＢＵＮレベルは７～２０ｍｇ／ｄＬ）、体重増加、血清ＰＰｉレベルの増加（少なくとも約４～５μｍ）、動脈組織の石灰化の減少（２５％、または５０％、または７０％、または９０％または１００％減少）、ＣＴ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）または超音波スキャンなどの非侵襲的な技術によって可視化された向上した骨強度などの一つ以上の陽性症状を観察することによって、当業者である医療専門家によって治療の成功および適切な用量が容易に推察される。
実施例９－ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するウイルスベクターを使用したＡＤＨＲ－２またはＡＲＨＲ－２およびまたはＸＬＨの治療。
以下の実施例は、ＡＤＨＲ－２またはＡＲＨＲ－２またはＸＬＨに関連する症状の治療に有効であると予想される、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶを提供する。ＥＮＰＰ１－ＦｃおよびＥＮＰＰ３－Ｆｃは、例示の目的で実施例において使用され、本発明の他のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合物を使用することにより類似の結果を得ることができる。
ＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質またはＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するＡＡＶビリオンは、実施例１に従って作製され、Ｘ連鎖性低ホスファターゼ症（ＸＬＨ）のＨＹＰマウスモデルに投与される（Ｌｉａｎｇ， ｅｔ ａｌ． ， ２００９， Ｃａｌｃｉｆ ． Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ． ８５（３）：２３５－４６）。ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３を用いた処置には、マウスの六セットが使用される。同様の実験をＡＲＨＲ－２のモデルの役割も果たすＥＮＰＰ１年齢硬化関節マウス（ＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）を使用して繰り返す。ＧＡＣＩに加えて、（Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ． ２０１０ Ｆｅｂ １２； ８６（２）： ２７３－２７８．）。
対照コホート：この実験では、対照群として機能するＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第一のコホートに、ヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射し、対照群として機能するＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスの第二のコホートに、ヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ１－処置マウスコホート：ＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第三のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、ＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスの第四のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ３－処置マウスコホート：ＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第五のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、ＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスの第六のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。野生型マウスは、通常食で維持され、ＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスは、高ホスフェートＴｅｋｌａｄ食事を与えられた。
ベクター注射：２週齢後、すべてのマウスは、後眼窩注射または尾静脈注射を、ＰＢＳ中、ｐＨ ７．４でマウス当たり約１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、好ましくは１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／ｋｇで受ける。注射されたベクターは、空の「ヌル」（対照群）であるか、またはＮＰＰ１ｏｒＮＰＰ３遺伝子（試験群）を担持している。
アッセイ：腎臓組織型、ＰＰｉレベル、および、ＦＧＦ－２３レベル、ビタミンＤ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）レベル、血清／血液尿素レベル、血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベル、血清／血液クレアチンレベル、および血漿ピロホスフェート（ＰＰｉ）などの血液尿パラメータを、実施例３および４に記載されるように各コホートについて分析する。
組織型、組織形態計測、およびマイクロ－ＣＴ： 骨分析は、実施例３に記載されるプロトコルに従って実施される。
骨の生体力学的検査：骨分析は、実施例３に記載されるプロトコルに従って実施される。
結果：未処置のＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスは概して、体重減少、昏睡、皮質骨の厚さおよび骨梁骨体積の減少、軟骨および靱帯の石灰化、大腿骨および脛骨などの長骨における骨密度の減少、ならびに野生型と比較して死亡率の増加を呈する。対照的に、ＥＮＰＰ１タンパク質またはＥＮＰＰ３タンパク質を発現するＡＡＶで処置されたＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスは、正常なＷＴマウスの体重範囲に近づく体重の増加、正常な注意力、骨ミネラル濃度の増加、皮質骨厚および骨梁骨体積の改善、骨強度および骨延性の増加を示すことが予想される。ヌルベクターで処置されたＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスは、心臓、大動脈および冠動脈に石灰化、および右心室の自由壁の心筋梗塞の組織学的証拠、冠動脈、心臓、上行大動脈および下行大動脈の石灰化、心筋細胞壊死、ならびに冠動脈石灰化の領域に隣接する心筋組織における心筋線維症を示すことが予想される。対照的に、ＥＮＰＰ１－ＦｃまたはＥＮＰＰ３－Ｆｃを発現するベクターで処置されたＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスは、組織型または死後のマイクロＣＴにおいて心臓、動脈、または大動脈の石灰化の不在を示すことが予想される。ヌルベクターで処置されたＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスはまた、腎皮質への拡張を伴う、外側髄質を中心とする重度の広範な石灰化とともに、腎髄質を中心とする石灰化を示す。対照的に、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３のウイルスベクター系発現を用いて処置されたＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスは、管腔における腎ミネラル沈着の減少または欠乏、背柱の石灰化、健康な野生型マウスの組織型と類似した組織型を有する軟部組織の血管系を示すと予想される。
生存、毎日の動物体重、および末期組織型に加えて、治療応答は、死後高解像度マイクロＣＴスキャンを介して評価され、血管石灰化、および血漿ＰＰｉ濃度を撮像する。ＷＴマウスまたは処置された（ＥＮＰＰ１を発現するベクター）ＨＹＰ（ＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスのいずれも、未処置（ヌルベクター）ＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）コホートの大動脈、冠動脈、および心臓に見られると予想される劇的な石灰化とは対照的に、マイクロＣＴを介して血管石灰化を有さないと予想される。さらに、処置した（ＥＮＰＰ１を発現するベクター）ＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウス（５．２μＭ）の血清ＰＰｉ濃度は、ＷＴレベル（４．４μＭ）まで上昇し、未処置のＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）レベル（０．５μＭ）を有意に上回ると予想される。
未処置のＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスはまた、健常な野生型マウスと比較して、血清無機リン（ｐｉ）の有意な増加、ＰＴＨおよびＦＧＦ２３レベルの増加、しかしながら１，２５（ＯＨ）２－ビタミンＤレベルの減少およびＰＰｉレベルの低下（約０．５ Ｍ）を示すと予想される（ｐｐの正常レベルは約２～４μＭであり、ＰＴＨについては約１０－６５ｎｇ／Ｌであり、ＦＧＦ２３レベルの中央値は１３ ＲＵ／ｍｌであり、正常なＦＧＦ２３レベルは５～２１０ ＲＵ／ｍｌの範囲であり、正常ビタミンＤレベルは２０ ｎｇ／ｍＬ～５０ ｎｇ／ｍＬである）。対照的に、処置されたＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスは、ＰＰｉのレベルの上昇（約４～５μＭ）を示すことが予想され、これは未処置のＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスに見られるＰＰｉレベル（約０．５μＭ）よりも高いことが予想される。したがって、当業者は、ＡＤＨＲ－２またはＡＲＨＲ－２またはＸＬＨの治療におけるベクター系ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の治療の有効性を、組織学的分析を通じて可視化された肝臓および冠動脈の軟部組織の石灰化の減少（２５％、または５０％、または７０％、または９０％または１００％減少）、血清ＰＰｉレベルの増加、ビタミンＤレベルの正常化、ＦＧＦ２３レベルの正常範囲までの低下および血液分析からのＰＴＨレベルの正常化、長骨の強度の向上、骨密度の向上、皮質骨の厚さおよび骨梁骨体積の向上、生存率の増加、体重増加に伴う尿中尿素とクレアチンの増加によって観察される腎機能の改善などの、一つ以上の要素を観察することによって、決定することができる。
ヒト対象の治療：
ＡＤＨＲ－２またはＡＲＨＲ－２またはＸＬＨに罹患しているヒト患者は、ｐＨ７．４で１Ｘ ＰＢＳ中、およそ５×１０１１～５×１０１５ ｖｇ／ｋｇを含むイントラベナル（ｉｎｔｒａｖｅｎａｌ）注射を提供することによって治療される。一部の実施形態では、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３を送達および発現することができる、対象当たり、ｐＨ７．４で１Ｘ ＰＢＳ中、およそ１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇである。ＡＤＨＲ－２またはＡＲＨＲ－２またはＸＬＨの治療の成功は、マウスモデルで論じた定期的な骨強度、骨密度、血液および尿検査を通して、前述の一つ以上のパラメータを監視することによって観察される。生きている患者において行うのが現実的ではない腎臓の切片または動脈組織の染色を必要とする組織学的分析の代わりに、実施例４で論じた非侵襲的可視化技術を使用する。
同様に、患者は、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）または周辺二重エネルギーＸ線吸収測定法（ｐＤＸＡ）または定量的超音波（ＱＵＳ）または周辺定量的コンピュータ断層撮影法（ｐＱＣＴ）を使用して、定期的な骨密度測定を受ける。これらの方法の一つから取得された骨密度スコアは、治療後に取得された状態および進行の指標を提供する。－１．０以上のＴスコアは、正常な骨密度とみなされ、－１．０～－２．５の間のＴスコアは、骨減少症の存在を示し、一方で－２．５以下のＴスコアは、骨粗しょう症の存在を示す。本発明のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３で治療された患者において、Ｔスコアの段階的な改善が予想される。
軟部組織の石灰化、心臓の石灰化、骨密度を可視化する技術を有する医師は、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶビリオンの投与によって、ＡＤＨＲ－２またはＡＲＨＲ－２またはＸＬＨに罹患した対象の治療を行う。一部の実施形態では、医師は、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３の構築物を送達し、誘導性プロモーターの制御下で対応するタンパク質を発現するウイルス粒子を使用する。したがって、医師は、症状の改善率および程度に基づいて、用量（発現されたｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３の量）を制御する選択肢を有する。正常なビタミンＤレベル（２０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍＬが、健康な人には適切であるとみなされる。１２ｎｇ／ｍｌ未満のレベルはビタミンＤ欠損を示す）、正常な骨密度（－１以上のＴスコア）、正常な血中尿素窒素レベル（健康な成人のＢＵＮレベルは７～２０ｍｇ／ｄＬ）、体重増加、血清ＰＰｉレベルの増加（少なくとも約４～５μｍ）、動脈組織の石灰化の減少（２５％、または５０％、または７０％、または９０％または１００％減少）、ＣＴ、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）または超音波スキャンなどの非侵襲的な技術によって可視化された向上した骨強度などの一つ以上の陽性症状を観察することによって、当業者である医療専門家によって治療の成功および適切な用量が容易に推察される。
実施例１０－ウイルス投与後のモデルマウスにおける血漿ＰＰｉレベル、ＥＮＰＰ１濃度および活性レベルの分析。
この実験には、正常なマウスの三つのコホートを使用した。各コホートは、五匹の成体マウスを含む。第一のコホートを「対照群」として使用し、生理食塩水を対照群に注射した。第二のコホートを「低用量群」として使用し、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ濃度のＡＡＶベクターを低用量群に注射した。第三のコホートを「高用量群」として使用し、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ濃度のＡＡＶベクターを高用量群に注射した。ＡＡＶ構築物からウイルス粒子を生成し、ＥＮＰＰ１融合タンパク質を含む組み換えＡＡＶウイルス粒子を正常なマウスに注入するプロセスを、図４に概略的に示す。すべてのコホートからのマウスを、投与後７日目、２８日目、および５６日目に採血し、血漿および血清を採取した。
血液をヘパリン処置チューブに採取した。血漿を単離し、ナノセップ３０ｋＤａのオメガ遠心フィルター（Ｐａｌｌ、ＯＤ０３０Ｃ３５）を通して濾過することによって血小板を除去した。試料を、最高速度（約２０ｋｇ）で４℃で２０分間遠心分離した。フロースルーを収集し、ドライアイス上に置き、試料を急速凍結した。試料を後にアッセイで使用するため－８０℃で保存した。
採取した試料を最初にアッセイして、比色基質であるｐ－ニトロフェニルチミジン５’－モノホスフェート（Ｓｉｇｍａ）を使用してＥＮＰＰ１の活性レベルを決定した。血漿試料を、１％のトリトン、２００ｍＭのトリス、ｐＨ８．０の緩衝液中で、１ｍｇ／ｍｌのｐ－ニトロフェニルチミジン５’－モノホスフェートで１時間培養した。１時間後、反応を停止させるために１００ｍＭのＮａＯＨを添加し、吸光度を４０５ｎｍで測定した。組み換えヒトＥＮＰＰ－１；カタログ番号：６１３６－ＷＮについて、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓによって開示されるアッセイプロトコルに従って、特異的活性を決定した。
Figure 2023548758000178
 ＊基質ブランク用に調整
＊＊較正用標準物質４－ニトロフェノール（シグマアルドリッチ社製、カタログ番号２４１３２６）を用いて算出。
ＥＮＰＰ１活性アッセイの結果は図５にあり、それらは注射後のＥＮＰＰ１活性の用量依存性の増加があることを示す。正常なマウス血漿を、ＥＮＰＰ１活性レベルを正規化するための参照標準として使用し、一元配置分散分析を統計分析に使用した。図５は、ＥＮＰＰ１活性レベルが、対照群のそれと比較して低用量群の方が高かったことを示す。同様に、ＥＮＰＰ１活性レベルは、低用量群および対照群のそれと比較して、高用量群の方が高かった。低用量および高用量コホートにおいて、ＥＮＰＰ１活性は、高用量群の７日目から５６日目まで血漿試料で安定していたが、低用量群の２８日目から５６日目までにＥＮＰＰ１活性のわずかな減少があった。
次いで、試料をアッセイして、シグマ（ＳＡＢ１４００１９９）に由来するＥＮＰＰ１ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＥＮＰＰ１の濃度を決定した。９６ウェル透明平底ポリスチレン高結合マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃａｔ＃９０１８）、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ＃７９０６）、１０Ｘ ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ） （Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃａｔ＃１１９－０６８－１０１）、Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ＃Ｐ２２８７）、 抗－ＥＮＰＰ１、マウス（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｔ＃ ＳＡＢ１４００１９９）で産生される抗体、Ｓｕｒｅ Ｂｌｕｅ ＴＭＢ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌペルオキシダーゼ基質（１成分）（ＫＰＬ Ｐｒｏｄ ＃ ５２－００－０１）、２Ｎ硫酸（ＢＤＨ Ｐｒｏｄｕｃｔ＃ ＢＤＨ７５００－１）、ＭｉｌｌｉＱ水、Ｃ５７ＢＬ／６マウス血漿ＮａＨｅｐプール性別（ＢｉｏＩＶＴ ｃａｔ＃ ＭＳＥ０１ＰＬＮＨＰＮＮ）、マウス血清（ＢＩＯ ＩＶＴ Ｅｌｅｖａｔｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｃａｔ＃ ＭＳＥ０１ＳＲＭＰＮＮ）をＥＬＩＳＡアッセイに使用した。
ＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質の標準曲線は、当技術分野で公知の標準的な手順に従って生成される。２ｍｇ／ｍｌ～３０ ｎｇ．ｍｌ の範囲のＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質の連続希釈を簡単に作製した。９６ウェルプレートを最初に、１ＸＰＢＳ中のＥＮＰＰ１捕捉抗体を含む１μｇ／１ｍＬの一晩コート溶液で被覆した。次いで、ウェルを、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡで、１時間培養し、次いでブロック後溶液で洗浄した。ＥＮＰＰ１希釈試料を、コーティングされた９６ウェルプレートに加え、１．５時間培養した。培養後、ウェルを、０．０５Ｔ％のＰＢＳＴの３００μｌで四回洗浄した。次いで、洗浄されたウェルを、検出ＨＲＰ抗体コンジュゲートの１００μｌ／ウェルで処理し、１時間培養した。ＨＲＰ抗体コンジュゲートでの培養後、ウェルを、０．０５Ｔ％のＰＢＳＴの３００μｌで四回洗浄した。次いで、洗浄されたウェルを、ウェル当たり１００μｌのＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質で処理し、暗所で３０分間培養した。次いで、ウェルを、３００μｌの０．０５Ｔ％のＰＢＳＴで四回洗浄し、２Ｎ硫酸を使用して反応を停止した。ウェルの吸光度を、４５０ｎｍの波長でマイクロプレートリーダーを使用して読み取った。標準曲線は、吸光度読み取りおよび対応するＥＮＰＰ１連続希釈試料の濃度を使用して生成された。
次いで、ウイルス注射の７、２８、および５６日後に、対照、低用量、および高用量コホートから得られた血漿試料を使用してアッセイを繰り返した。各血漿試料で生成された吸光度は、ＥＮＰＰ１－Ｆｃの標準曲線と相関して、血漿試料中のＥＮＰＰ１－Ｆｃの濃度を決定した。ＥＮＰＰ１濃度アッセイの結果を図６に示し、ウイルスベクター注射後のＥＮＰＰ１濃度の用量依存的な増加を示す。正常なマウス血漿を、ＥＮＰＰ１濃度レベルを正規化するための参照標準として使用し、一元配置分散分析を統計分析に使用した。図６は、ＥＮＰＰ１濃度が、対照群の濃度と比較して低用量群において高かったことを示す。同様に、ＥＮＰＰ１活性レベルは、低用量群および対照群のそれと比較して、高用量群の方が高かった。低用量および高用量コホートにおいて、ＥＮＰＰ１レベルは、高用量群の７日目から５６日目まで試料で安定していたが、低用量群の２８日目から５６日目までにＥＮＰＰ１レベルのわずかな減少があった。
試料も、スルフリラーゼアッセイを使用して血漿ＰＰｉの濃度を決定するためにアッセイされた。ＡＴＰスルフリラーゼ（ＮＥＢ－Ｍ０３９４Ｌ、ロット番号：１００２８５２９）、アデノシン５’－ホスホスルフェート（ＡＰＳ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－２１４５０６）、ＰＰｉ：１００ｕＭストック、ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．４緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ ＢＢ２０７６）、１Ｍの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）溶液、１Ｍの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）溶液、ＢａｃｔｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｐｌａｔｅ Ｇ８２３１）、プレート（Ｃｏｓｔａｒ ３９１５， ｂｌａｃｋ ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ）およびプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｉ３ｘ）が、ＰＰｉ－スルフリラーゼアッセイで使用された。Ｐｐｉ標準（０．１２５～４μＭ）を、連続希釈を使用して水中で調製した。濾過血漿試料中のＰＰｉ標準およびＰＰｉは、過剰なアデノシン５’－ホスホスルフェート（ＡＰＳ）の存在下で、ＡＴＰスルフリラーゼによってＡＴＰに変換された。試料（１５μｌ）を、８ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、８０ｕＭ ＡＰＳ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－２１４５０６）、および０．１Ｕ／ｍｌ ＡＴＰスルフリラーゼ（ＮＥＢ－Ｍ０３９４Ｌ）を含有する５μｌの混合物で処理した。混合物を、３７℃で４０分間培養し、その後、ＡＴＰスルフリラーゼを、９０℃で１０分間培養することによって不活化した。生成されたＡＴＰは、２０μｌの処理された試料または標準試料を２０μｌのＢａｃｔｉｔｅｒＧｌｏ試薬と混合することによって、ＢａｃｔｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ８２３１）を使用して決定された。次いで、マイクロプレートリーダーで生物発光を決定し、標準曲線から、各試料で生成されたＰＰｉの量を続いて決定した。
血漿ＰＰｉアッセイの結果を図７に示す。結果は、ウイルスベクター注射後の血漿ＰＰｉの用量依存性の増加を示す。正常なマウス血漿を、血漿ＰＰｉ濃度レベルを正規化するための参照標準として使用し、一元配置分散分析を統計分析に使用した。図７は、血漿ＰＰｉ濃度が、対照群のそれと比較して低用量群においてわずかに高いことを示す。同様に、血漿ＰＰｉ濃度は、低用量群および対照群のそれと比較して、高用量群の方が高かった。低用量および高用量コホートにおいて、ＥＮＰＰ１レベルは、高用量群の７日目から５６日目まで血漿試料で安定していたが、低用量群の２８日目から５６日目までにＥＮＰＰ１レベルのわずかな減少が観察された。
関連する実験では、５～６週齢のＣ５７／Ｂｌオスマウスに、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶウイルスベクター、またはビヒクル対照（ＡＡＶベクターを含まない）の単回用量を静脈内投与した。動物に、ＧＫ１．５を投与した（ウイルスベクターまたはビヒクルの投与の一日前に４０μｇ／マウス、その後、試験完了まで７日ごとに２５μｇ／マウス）。ＡＡＶウイルスベクターは、融合タンパク質のＥＮＰＰ１部分およびＩｇＧ Ｆｃ部分がリンカーアミノ酸配列：ＧＧＧＧＳによって結合されたことを除いて、実施例１０に記載されるポリペプチドと類似のＥＮＰＰ１およびＩｇＧ Ｆｃの融合タンパク質を発現するように操作された。ＡＡＶウイルスベクターを投与したマウスは、約４０日間にわたって測定されたように、ビヒクルのみの対照よりも高いレベルのＥＮＰＰ１酵素活性を示した。
実施例１１－ウイルス投与の１１２日後のモデルマウスにおけるＥＮＰＰ１濃度および活性レベルの分析。
この実験には、正常なマウスの三つのコホートを使用した。各コホートは、五匹の成体マウスを含む。第一のコホートを「対照群」として使用し、生理食塩水を対照群に注射した。第二のコホートを「低用量群」として使用し、１ｅ１３ｖｇ／ｋｇ濃度のＡＡＶベクターを低用量群に注射した。第三のコホートを「高用量群」として使用し、１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ濃度のＡＡＶベクターを高用量群に注射した。ＡＡＶ構築物からウイルス粒子を生成し、ＥＮＰＰ１融合タンパク質を含む組み換えＡＡＶウイルス粒子を正常なマウスに注入するプロセスを、図４に概略的に示す。すべてのコホートからのマウスを、投与後７日目、２８日目、５６日目、および１１２日目に採血し、血漿および血清を採取した。
血液をヘパリン処置チューブに採取した。試料を、最高速度（約２０ｋｇ）で４℃で２０分間遠心分離した。フロースルーを収集し、ドライアイス上に置き、試料を急速凍結した。試料を後にアッセイで使用するため－８０℃で保存した。
採取した試料を最初にアッセイして、実施例１０に記載される比色基質、ｐ－ニトロフェニルチミジン５’－モノホスフェート（Ｓｉｇｍａ）を使用して、ＥＮＰＰ１の活性レベルを決定した。ＥＮＰＰ１活性アッセイの結果は図９にあり、それらは注射後のＥＮＰＰ１活性の用量依存性の増加があることを示す。正常なマウス血漿を、ＥＮＰＰ１活性レベルを正規化するための参照標準として使用し、一元配置分散分析を統計分析に使用した。図９は、ＥＮＰＰ１活性レベルが、対照群のそれと比較して低用量群においてわずかに高いことを示す。同様に、ＥＮＰＰ１活性レベルは、低用量群および対照群のそれと比較して、高用量群の方が高かった。
次いで、実施例１０で教示されたプロトコルに従って、Ｓｉｇｍａ（ＳＡＢ１４００１９９）に由来するＥＮＰＰ１ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ使用して、試料をアッセイして、ＥＮＰＰ１の濃度を決定した。次いで、ウイルス注射の７、２８、５６、および１１２日後に、対照、低用量、および高用量コホートから得られた血漿試料を使用してアッセイを繰り返した。各血漿試料で生成された吸光度は、ＥＮＰＰ１－Ｆｃの標準曲線と相関して、血漿試料中のＥＮＰＰ１－Ｆｃの濃度を決定した。
ＥＮＰＰ１濃度アッセイの結果を図８に示し、それらはウイルスベクター注射後のＥＮＰＰ１濃度の用量依存性の増加を示す。正常なマウス血漿を、ＥＮＰＰ１濃度レベルを正規化するための参照標準として使用し、一元配置分散分析を統計分析に使用した。図８は、ＥＮＰＰ１濃度が、対照群のそれと比較して低用量群において高いことを示す。同様に、ＥＮＰＰ１レベルは、低用量群および対照群のそれと比較して、高用量群の方が高かった。
実施例１２－バリアントＮＰＰ１－Ｆｃ配列のＡＡＶシステムへのクローニング、ＡＡＶ感染、ＡＡＶ産生および精製のための構築物の生成
ＡＡＶ８プラスミドは、５’から３’の方向に以下の要素を有する発現カセットを含ｍｉながら生成された：三つの異なるプロモーター（以下を参照）のうちの一つ、Ｎ末端アズロシジンシグナル配列を含むポリヌクレオチド、以下に記載されるバリアントＥＮＰＰ１－Ｆｃ構築物をコードするポリヌクレオチド、およびＳＶ４０ポリアデニル化信号。発現カセットは、ＡＡＶ８から５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲに隣接されている。本明細書で言及されるように、構築物１０．１は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。構築物１０．２は、肝臓特異的プロモーターである肝臓プロモーター１（ＬＰ１）を含む（Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ ２００６； １０７（７）：２６５３－２６６１を参照）。構築物１０．３は、肝臓特異的プロモーター、ハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）を含む（ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２１（１７）：３３３５－４４を参照）。ＨＬＰ配列の例が配列番号９７に示される。
これらの構築物では、ＥＮＰＰ１－Ｆｃのバリアント形態を使用した。バリアントＥＮＰＰ１－Ｆｃは、３３２位（Ｉ３３２Ｔ；配列番号１に対する）での単一アミノ酸置換を含む組み換え可溶性ヒトＥＮＰＰ１ポリペプチド部分、リンカー配列（ＧＧＧＧＳ（配列番号９４）、および野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＥＵ番号によるＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）に対して三つのアミノ酸置換を含むヒトイムノグロブリンＩｇＧ１ Ｆｃ部分を含む。バリアントＥＮＰＰ１－Ｆｃの配列を以下に示す（アノテーションを含む）。
Figure 2023548758000179
アノテーションキー：
・下線のアミノ酸配列：アズロシジンシグナルペプチド；
・二重下線のアミノ酸配列：３３２位で単一アミノ酸置換を含むバリアントヒト可溶性ＥＮＰＰ１ポリペプチド（Ｉ３３２Ｔ、太字）；
・イタリック体アミノ酸配列：リンカーアミノ酸配列、および
・非修飾アミノ酸配列部分：太字で識別された三つのアミノ酸置換を含むバリアントヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分。
バリアントＥＮＰＰ１－Ｆｃ配列を、標準的な分子生物学プロトコルを使用してＡＡＶ８プラスミドにクローニングした。感染性ＡＡＶ８ベクター粒子を、上述のように生成した。
実施例１３－バリアントＥＮＰＰ１－ＦｃをコードするＡＡＶウイルス粒子のマウスへの注射およびＥＮＰＰ１酵素活性の測定。
バリアントＥＮＰＰ１－Ｆｃをコードするおよび発現することができるベクターの送達の有効性を、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）で試験した。この実験では、四セットのマウスを使用し、各セットは、５匹のマウス（５～６週齢）を含み、ＡＡＶ８粒子の注射前に、すべてのセットのマウスを、１０００μｇ／ｍｌの濃度（最終用量２５～４０μｇ／動物）の力価 ＧＫ１．５ＣＤ４抗体の腹腔内注射により寛容化し、ＡＡＶ８構築物によって産生されるヒトタンパク質に対するマウスの免疫反応を減少させた。対照群として機能したマウスの第一のコホートにビヒクル対照を注射し、試験群として機能した第二のコホートに、ＣＭＶプロモーター（構築物１０．１）によって駆動されるバリアントＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ８粒子を注射し、別の試験群として機能したマウスの第三のコホートに、ＬＰ１プロモーター（構築物１０．２）の制御下でバリアントＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ８粒子を注射し、およびさらに別の試験群として機能したマウスの第四のコホートに、ＨＬＰプロモーター（構築物１０．３）の制御下でバリアントＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ８粒子を注射した。各群の各マウスに、それぞれのＡＡＶ構築物のＩＶ注射１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ用量で投与した。各コホートへのＡＡＶ注射後、寛容化注射を毎週繰り返した。
－１（ＡＡＶ構築物の注射から）、７、２１、２８、および４２日目にマウスから血液を採取し、上述のようにＥＮＰＰ１酵素活性を測定した。
ＥＮＰＰ１活性アッセイの結果を図１０に示し、それらは、注射後、ＥＮＰＰ１活性が、構築物１０．１（ＣＭＶプロモーター）またはビヒクル対照と比較して、構築物１０．２（ＬＰ１プロモーター）および１０．３（ＨＬＰプロモーター）を投与された動物において、経時的に著しく高いことを示した。正常なマウス血漿を、ＥＮＰＰ１活性レベルを正規化するための参照標準として使用し、一元配置分散分析を統計分析に使用した。
これらの結果は、肝臓特異的プロモーターＬＰ１およびＨＬＰが、動物における組み換えＥＮＰＰ１構築物の発現を駆動するのにおいて非常に効率的であることを示す。
実施例１４－バリアントＮＰＰ３－Ｆｃ配列のＡＡＶシステムへのクローニング、ＡＡＶ感染、ＡＡＶ産生および精製のための構築物の生成
ＡＡＶ８プラスミドは、５’から３’の方向に以下の要素を有する発現カセットを含ｍｉながら生成された：三つの異なるプロモーター（以下を参照）のうちの一つ、Ｎ末端アズロシジンシグナル配列を含むポリヌクレオチド、以下に記載されるバリアントＥＮＰＰ３－Ｆｃ構築物をコードするポリヌクレオチド、およびＳＶ４０ポリアデニル化信号。発現カセットは、ＡＡＶ８から５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲに隣接されている。本明細書で言及されるように、構築物（ｘ）は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。構築物（ｙ）は、肝臓特異的プロモーターである肝臓プロモーター１（ＬＰ１）を含む（Ｎａｔｈｗａｎｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ ２００６； １０７（７）：２６５３－２６６１を参照）。構築物（ｚ）は、肝臓特異的プロモーター、ハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）を含む（ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２１（１７）：３３３５－４４を参照）。
これらの構築物では、ＥＮＰＰ３－Ｆｃのバリアント形態を使用した。バリアントＥＮＰＰ３－Ｆｃは、組み換え可溶性ヒトＥＮＰＰ３ポリペプチド、リンカー配列（ＧＧＧＧＳ（配列番号９４）、および野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（ＥＵ番号によるＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ）に対して三つのアミノ酸置換を含むヒトイムノグロブリンＩｇＧ１ Ｆｃ部分を含む。バリアントＥＮＰＰ３－Ｆｃの配列を以下に示す（アノテーションを含む）。
Figure 2023548758000180
アノテーションキー：
・下線のアミノ酸配列：アズロシジンシグナルペプチド；
・二重下線のアミノ酸配列：バリアントヒト可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチド
・イタリック体アミノ酸配列：リンカーアミノ酸配列、および
・非修飾アミノ酸配列部分：太字で識別された三つのアミノ酸置換を含むバリアントヒトＩｇＧ１ Ｆｃ部分。
・＊＊ － シグナル配列の切断点を示す。
バリアントＥＮＰＰ３－Ｆｃ配列は、標準的な分子生物学プロトコルを使用してＡＡＶ８プラスミドにクローニングされる。感染性ＡＡＶ８ベクター粒子は、上述のように生成される。
実施例１５－バリアントＥＮＰＰ３－ＦｃをコードするＡＡＶウイルス粒子のマウスへの注射およびＥＮＰＰ３酵素活性の測定。
バリアントＥＮＰＰ３－Ｆｃをコードするおよび発現することができるベクターの送達の有効性を、野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウス）で試験する。この実験では、四セットのマウスを使用し、各セットは、五匹のマウス（５～６週齢）を含み、ＡＡＶ８粒子の注射前に、すべてのセットのマウスを、１０００μｇ／ｍｌの濃度（最終用量２５～４０μｇ／動物）の力価 ＧＫ１．５ＣＤ４抗体の腹腔内注射により寛容化し、ＡＡＶ８構築物によって産生されるヒトタンパク質に対するマウスの免疫反応を減少させる。
マウスの第一のコホート（対照群）にビヒクル対照を注射し、第二のコホート（試験群－ｘ）に、ＣＭＶプロモーター（構築物ｘ）によって駆動されるバリアントＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ８粒子を注射し、マウスの第三のコホート（試験群－ｙ）に、ＬＰ１プロモーター（構築物ｙ）の制御下でバリアントＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ８粒子を注射し、およびマウスの第四のコホート（試験群－ｚ）に、ＨＬＰプロモーター（構築物ｚ）の制御下でバリアントＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ８粒子を注射した。各群の各マウスに、それぞれのＡＡＶ構築物のＩＶ注射１ｅ１４ｖｇ／ｋｇ用量で投与した。各コホートへのＡＡＶ注射後、寛容化注射を毎週繰り返した。
－１（ＡＡＶ構築物の注射から）、７、２１、２８、および４２日目にマウスから血液試料を採取し、上述のようにＥＮＰＰ３酵素活性を測定する。
実施例１６－ＥＮＰＰ１－ＦｃバリアントＰＫおよびＰＤプロファイルの評価
バリアントＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質を発現する単回用量ＡＡＶ８ベクター後のＰＫおよびＰＤプロファイルを評価するために、１０週間試験を実施した。２週齢のＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊマウスを四つの群に無作為に割り当て、ビヒクル（赤色ドットとして示される）、または単回静脈内（ＩＶ）用量のＡＡＶ８ ＥＮＰＰ１－Ｆｃを１×１０１０ｖｇ／ｋｇ（低用量、マゼンタドットとして示される）、１×１０１２ｖｇ／ｋｇ（中用量、オレンジ色ドットとして示される）、または１×１０１４ｖｇ／（高用量、黒色ドットとして示される）のいずれかを投与した。野生型マウスの一群（青色のドットとして示される）に、比較のためにビヒクルを投与した。
バリアントＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合は、配列番号９５に示されるアミノ酸配列を含む （ＥＵ番号によるＦｃ領域における配列番号１＆Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ変異に対するＩ３３２Ｔ変異を含むＥＮＰＰ１－Ｆｃバリアント）。ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合のためのヌクレオチドコード配列の発現は、ＨＬＰ肝臓特異的プロモーター（配列番号９７）によって駆動された。
血液試料を７、１４、２８、４２および７０日目に収集し、血漿ＥＮＰＰ１酵素活性およびＰＰｉレベルを測定した。試験終了時に、組織カルシウム分析のために大動脈、腎臓、脾臓、および感覚毛を採取した。
高用量のＡＡＶ８ ＥＮＰＰ１－Ｆｃで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊマウスは、試験期間中、有意に上昇した血漿ＥＮＰＰ１活性レベルを示した（図１１）。ＡＡＶ８ ＥＮＰＰ１－Ｆｃで処置された変異マウスは、血漿ＰＰｉ（図１２）および体重（図１３）の用量依存性の増加、ならびに組織カルシウム含量（図１４Ａ－Ｄ）の減少を示した。ＷＴマウスの平均血漿ＰＰｉレベルは、約４．９μＭであった。ビヒクルで処置したＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊマウスにおける約０．５μＭの血漿ＰＰｉレベルと比較して、ＡＡＶ８の中および高用量は、平均血漿ＰＰｉをそれぞれ３．３μＭおよび１２．９μＭに増加させた。１ｘ１０１４ｖｇ／ｋｇ（高用量、黒色ドットとして示される）でのＡＡＶ８ ＥＮＰＰ１－Ｆｃの単回用量は、Ｅｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊマウスにおいて、大動脈、感覚毛、脾臓、および腎臓における異所性組織石灰化を完全に防止した。
実施例１７－骨構造の評価
単一の高用量（２．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ８ ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合を処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊメスマウスの骨構造の変化を、ビヒクルのみで処置された年齢が合致した野生型マウスおよびＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊマウスの両方と比較して、評価する試験を実施した。実施例１６にあるように、ＡＡＶ８ ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合は、配列番号９５に示されたアミノ酸配列を含んだ（ＥＵ番号によるＦｃ領域における配列番号１＆Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ変異に対するＩ３３２Ｔ変異を含むＥＮＰＰ１－Ｆｃバリアント）。ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合のためのヌクレオチドコード配列の発現は、ＨＬＰ肝臓特異的プロモーター（配列番号９７）によって駆動された。
骨長、骨梁数、皮質厚、骨梁厚および骨梁骨体積を含む、これらの処置されたマウスの骨構造を評価するためにいくつかのパラメータを評価した。
すべての骨分析は、メスマウスから解剖された骨試料で行った。固定された大腿骨を、インビボマイクロＣＴスキャナで撮像した。骨形態学的および密度パラメータを計算するために、骨梁骨および皮質骨の関心領域（ＲＯＩ）を選択した。
単一の高用量（２．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ８ ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合で処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊメスマウスにおいて、賦形剤のみで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊ（ｐ＜０．００１）およびマウス野生型マウスの両方と比較して、骨長の有意な増加が観察された。ビヒクルのみで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊマウスは、ビヒクルのみで処置された野生型マウスと比較して、骨長の有意な減少を示した（ｐ＜０．０５）。図１５Ａ。
ビヒクルのみで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊマウスと比較して、単一の高用量（２．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ８ ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合で処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊメスマウスにおいて、皮質厚の有意な増加が観察されたが（ｐ＜０．０５）、この増加は、ビヒクルのみで処置された野生型マウスによって提示される皮質ｌの厚さと等しくなかった。ビヒクルのみで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊマウスは、ビヒクルのみで処置された野生型マウスと比較して皮質厚の減少を示した（ｐ＜０．０００１）。図１５Ｂ。
ビヒクルのみで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊマウスおよびビヒクルのみで処置された野生型マウスと比較して、単回の高用量（２．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ８ ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合で処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊメスマウスでは、それぞれ、骨梁数および厚さ（ｐ＜０．０５）および（ｐ＜０．００１）の有意な増加が観察された。ビヒクルのみで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊマウスは、ビヒクルのみで処置された野生型マウスと比較して、骨梁数および厚さの両方の減少を示した。それぞれ、図１５Ｃおよび１５Ｄ。
ビヒクルのみで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊマウスに対し、単回の高用量（２．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ８ ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合で処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊメスマウスにおいて、骨梁骨体積分画（ＢＶ／ＴＶ）（試料の単位体積当たりの石灰化骨体積）の有意な増加が観察された（Ｐ＜ ０．０１）。ビヒクルのみで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊマウスは、ビヒクルのみで処置された野生型マウスと比較して、骨体積の減少を示した。図１５Ｅ。
したがって、ビヒクルで処置したＥｎｐｐａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊマウスは、野生型マウスと比較して、骨長が短く、皮質骨が薄く、骨梁数および骨梁厚が小さく、骨梁骨体積が少なかった。２．５×１０１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＥＮＰＰ１－Ｆｃを用いた処置は、骨長を増加させ、変異マウスにおける大腿骨の骨梁および皮質領域の欠損を補正した。
実施例１８－骨芽細胞機能および成長の評価
単一の高用量（２．５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ８ ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合を処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊメスマウスの骨芽細胞機能の変化および成長を、ビヒクルのみで処置された年齢が合致した野生型マウスおよびＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊマウスの両方と比較して、評価する試験。実施例１６および１７にあるように、ＡＡＶ８ ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合は、配列番号９５に示されるアミノ酸配列を含んだ （ＥＵ番号によるＦｃ領域における配列番号１＆Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ変異に対するＩ３３２Ｔ変異を含むＥＮＰＰ１－Ｆｃバリアント）。ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合のためのヌクレオチドコード配列の発現は、ＨＬＰ肝臓特異的プロモーター（配列番号９７）によって駆動された。
動的組織形態計測分析のために、１０ｍｇ／ｋｇのカルセインを９日間の間隔でマウスに注射した。１０％中性緩衝ホルマリン中に固定した後、脱灰されていない大腿骨をメチルメタクリレートに包埋し、近位骨幹端を長軸方向に切片化し、骨芽細胞についてはトルイジンブルーで染色し、石灰化についてはフォンコッサで染色した。骨形成速度（ＢＦＲ）／骨表面（ＢＳ）、骨芽細胞面（Ｏｂ．Ｓ）／ＢＳを、骨幹端の骨梁骨で画定される関心領域で測定する。組織学的分析については、脛骨を１０％中性緩衝ホルマリン中に固定し、ＥＤＴＡにより２～４週間脱灰した。脱灰した脛骨をパラフィン包埋し、切断した。脱灰した脛骨の切片を、成長板内の軟骨細胞についてサフラニンＯで染色した。
単一の高用量（２．５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ８ ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合で処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊメスマウスにおいて、ビヒクルのみで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊと比較して、骨形成速度おとび骨芽細胞面の両方の有意な増加が観察された。これらの後者のマウスは、ビヒクルのみで処置された野生型マウスと比較して、骨形成速度および骨芽細胞面の両方の減少を示した。それぞれ、図１６Ａおよび１６Ｂ。
ビヒクルのみで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊマウスと比較して、単一の高用量（２．５ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）のＡＡＶ８ ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合で処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊマウスにおいて、異常肥大軟骨細胞の数および柱状組織の両方の減少により示されるように、くる病表現型の減少が観察された。これらの後者のマウスは、ビヒクルのみで処置された野生型マウスと比較して、くる病表現型の増加を示した。図１７。
したがって、野生型マウスと比較して、ビヒクルで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ－２Ｊ／ａｓｊ－２Ｊマウスは、低い骨形成速度、低い骨芽細胞面、およびくる病表現型の特徴である異常肥大軟骨細胞のより多くの層を示した。対照的に、２．５×１０１３ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ－ＥＮＰＰ１－Ｆｃを用いた処置は、変異型マウスにおける骨形成速度、骨芽細胞面積および成長板構造を正常化した。
実施例１９－脂質ナノ粒子の作製
ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰＥＮＰＰ３タンパク質の触媒ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞への送達における使用のための、安定化され、安全かつ有効な脂質ナノ粒子を調査するために、様々な製剤が調製され、試験される。ナノ粒子は、二つの流体ストリームのマイクロ流体およびＴ接合混合などの混合プロセスを用いて作製することができ、その一方は組み換え核酸を含有し、他方は脂質成分を有する。
カチオン性および／またはイオン化可能な脂質は、３－（ジドデシルアミノ）－Ｎ１、Ｎ１，４－トリドデシル（ｔｒｉｄｏｄｅｃｙｌ）－１－ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１－［２－（ジドデシルアミノ）エチル］－Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４－トリドデシル（ｔｒｉｄｏｄｅｃｙｌ）－１，４－ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５－ジトリデシル－１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル ４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２－（｛８－［（β３）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ〕オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ〕プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）－２－（｛８－［（β３）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ〕オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ〕プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、（２Ｓ）－２－（｛８－［（β３）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ〕オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ〕プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））、からなる非制限的な群から選択されてもよい。
脂質組成物は、エタノール中約５０ｍＭの濃度で、ＭＣ３、リン脂質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ， Ａｌａｂａｓｔｅｒ， Ａｌａ．から入手可能なＤＯＰＥまたはＤＳＰＣなど）、ＰＥＧ脂質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ， Ａｌａｂａｓｔｅｒ， Ａｌａ．から入手可能な、例えば、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール、ＰＥＧ－ＤＭＧとしても知られる）、および構造脂質（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙより入手可能なコレステロール、またはコルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、またはそれらの組み合わせ）などのイオン化可能な脂質を組み合わせることによって調製される。溶液は、例えば、－２０℃で保存するために冷却すべきである。
脂質を組み合わせて、所望のモル比（例えば、表１を参照）を得て、水およびエタノールで希釈して、約５．５ｍＭ～約２５ｍＭの最終脂質濃度とする。
Figure 2023548758000181
組み換え核酸成分および脂質成分を含む脂質ナノ粒子は、脂質成分対核酸成分の、約５：１～約５０：１の間のｗｔ：ｗｔ比で、脂質溶液と、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質の触媒ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの溶液と、を組み合わせることによって調製される。脂質溶液を、約１０ｍ１／分～約１８ｍ１／分の間の流量で、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒマイクロ流体系システムを使用して、治療用および／または予防的溶液中に急速に注入し、約１：１～約４：１の水対エタノール比の懸濁液を生成する。
脂質ナノ粒子は、エタノールを除去し、緩衝液交換を達成するために、透析によって処理することができる。製剤は、１０ｋＤの分子量カットオフで、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒカセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌ．）を使用して、一次生成物の体積の２００倍で、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４に対して二回透析される。最初の透析は、室温で３時間実施される。次いで、製剤を４℃で一晩透析する。得られたナノ粒子懸濁液を、０．２μｍの滅菌フィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ， Ｎｔｉｍｂｒｅｃｈｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を通してガラスバイアルに濾過する。
上述の方法は、ナノ沈殿および粒子形成を誘発する。Ｔ接合および直接注入を含むが、これに限定されない代替的プロセスを使用して、同じナノ沈殿を達成してもよい。したがって調製されるＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の触媒ドメインをコードする組み換え核酸を含むＬＰＮは、以下の実施例で特徴付けられ、投与される。
実施例２０－脂質ナノ粒子の特徴付け
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ， Ｍａｌｖｅｒｎ， Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ， ＵＫ）を使用して、粒子サイズを決定することができ、多分散度指数（ＰＤＩ）および１×ＰＢＳ中の脂質ナノ粒子のゼータ電位を使用して粒子サイズを、および１５ｍＭのＰＢＳを使用してゼータ電位を、決定することができる。
紫外可視分光法を使用して、脂質ナノ粒子中の組み換え核酸の濃度を決定することができる。１×ＰＢＳ中の希釈された製剤の１００μＬを、メタノールおよびクロロホルムの４：１（ｖ／ｖ）混合物の９００μＬに加える。混合後、溶液の吸光度スペクトルを、例えば、ＤＵ ８００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｂｒｅａ， Ｃａｌｉｆ．）上で２３０ｎｍ～３３０ｎｍの間で記録する。脂質ナノ粒子中の組み換え核酸の濃度を、組成物で使用される核酸の減退係数、および例えば、２６０ｎｍの波長での吸光度と、例えば、３３０ｎｍの波長でのベースライン値との間の差に基づいて計算することができる。
ｄｓ ＤＮＡを含む脂質ナノ粒子については、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ試薬を使用して、脂質ナノ粒子によるＤＮＡの封入を評価することができる。試料を、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中で、約５μｇ／ｍＬの濃度に希釈する。希釈された５０μＬの試料を、ポリスチレン９６ウェルプレートに移し、５０μＬのＴＥ緩衝液または５０μＬの２％のトリトンＸ－１００溶液のいずれか一つをウェルに加える。プレートを、３７℃の温度で１５分間培養する。Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（登録商標）試薬をＴＥ緩衝液中で１：１００に希釈し、この溶液の１００μＬを各ウェルに加える。蛍光強度は、例えば、約４８５ｎｍの励起波長および例えば、約５３５ｎｍの放射波長の蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ； Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓ．）を使用して測定することができる。試薬ブランクの蛍光値は、各試料の蛍光値から減算され、遊離ＤＮＡのパーセンテージは、完全な試料（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の添加なし）の蛍光強度を、破壊された試料の蛍光値（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の添加によって生じる）で割ることによって決定される。
ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質の触媒ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、このように調製され、インビボまたはインビトロで哺乳類細胞をトランスフェクトするために使用され得る。
実施例－２１－マウスへのＥＮＰＰ１－Ｆｃをコードする核酸を含むＬＮＰ粒子の注射および体重増加、骨密度、骨強度、および骨体積の測定。
ＮＰＰ１またはＮＰＰ３ポリペプチドをコードする組み換え核酸を含むＬＮＰの送達の有効性は、Ｅｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスモデル、ＡＢＣＣ６－／－マウスモデル、ＨＹＰマウスモデル、ｔｔｗマウスモデル、慢性腎臓疾患のマウスモデル（ＣＫＤ）、またはＣＫＤの５／６腎臓摘出のラットモデルなどのマウスモデルを使用して試験される。非限定的な例として、以下の実験では、マウスモデルとしてＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスを使用し、マウスモデルに送達されるポリヌクレオチドとしてアズロシジン－ＮＰＰ１－Ｆｃ構築物を使用し、送達は、インビボでＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質をコードするＬＮＰ粒子（実施例１９に示すように調製される）を使用することによって達成される。
当業者であれば、病理学的石灰化または骨化の疾患を治療する遺伝子療法の効果を試験するための本発明で開示される、代替のマウスモデル、異なるＥＮＰＰ１融合タンパク質（ＥＮＰＰ１－アルブミンまたはＥＮＰＰ１－ＦｃもしくはＥＮＰＰ１の機能的等価物、またはＦｃもしくはアルブミンドメインを欠くＥＮＰＰ１など）、または異なるＥＮＰＰ３融合タンパク質（ＥＮＰＰ３－ＦｃもしくはＥＮＰＰ３－アルブミンまたはＦｃもしくはアルブミンドメインを欠くＥＮＰＰ３もしくはＥＮＰＰ３の機能的等価物）をコードする代替のシグナル配列（ＮＰＰ２、ＮＰＰ５、ＮＰＰ７アルブミンまたはアズロシジンなど）を含む代替ポリヌクレオチド構築物を使用することにより、同じ実験を繰り返すことができることを認識するであろう。実験で利用されるアズロシジン－ＮＰＰ１－Ｆｃ構築物は、概念実証としてヒトＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質をコードし、ヒトＥＮＰＰ３－Ｆｃをコードするアズロシジン－ＮＰＰ３－Ｆｃ構築物で同じ実験を繰り返すことができる。
この実験では、四セットのマウスを使用し、各セットは少なくとも五匹のマウス（６～８週齢）を有し、 照群として機能するＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第一のコホートに、ヌルベクターを含むＬＮＰ粒子を注射し、対照群として機能するＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊマウスの第二のコホートに、ヌルベクターを含むＬＮＰ粒子を注射し、試験群として機能するＥＮＰＰ１ｗｔマウスの第三のコホートに、ＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＬＮＰ粒子を注射し、および試験群として機能するＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊの第四のコホートに、ＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＬＮＰ粒子を注射する。
実験のマウスは、加速食（リンに富み、マグネシウム含有量を減少させた（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ， Ｒｏｄｅｎｔ ｄｉｅｔ ＴＤ．００４４２， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ））、または通常の食事（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｃｌａｖａｂｌｅ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ ５０１０； ＰＭＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｂｒｅｎｔｗｏｏｄ， ＭＯ）のいずれかを与えられ、６～８週齢後、すべてのマウスは、ｐＨ ７．４のＰＢＳのＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ１－Ｆｃの触媒ドメインをコードする組み換え核酸を含むＬＮＰの後眼窩注射または尾静脈注射を受ける。注射されたベクターは、空の「ヌル」（対照群）であるか、またはＮＰＰ１遺伝子（試験群）を担持するのいずれかである。体重測定は、ＬＮＰ注射後のいかなる体重の増加または減少も記録するために毎日行われる。マウスからの血液、尿、骨、および組織試料を採取して、以下のとおり分析する。実験プロトコルは、Ａｌｂｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１５ Ｄｅｃ １；６：１０００６， およびＣａｂａｌｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１７； １２（７）： ｅ０１８００９８に詳細に列挙され、それらすべての内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。試験終了時（７、２８、および１１２日、マウスはすべて、イソフルランを用いた深層麻酔における眼窩放血により安楽死させ、重要な器官を、当技術分野で記載されるように除去する。（Ｉｍｐａｉｒｅｄ ｕｒｉｎａｒｙ ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｐｔ２ａ－／－ ｍｉｃｅ．， Ｃａｂａｌｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２０１７ Ｊａｎ １； ３１２（１）：Ｆ７７－Ｆ８３； Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｎｐｔ２ａ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ｔｏ ｄｉｅｔａｒｙ ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ，Ｌｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１７； １２（４）：ｅ０１７６２３２．）。
アッセイ：腎臓組織型、ＰＰｉレベル、および、ＦＧＦ－２３レベル、ビタミンＤ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）レベル、血清／血液尿素レベル、血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベル、血清／血液クレアチンレベル、および血漿ピロホスフェート（ＰＰｉ）などの血液尿パラメータを、実施例３および４に記載されるように各コホートについて分析する。
結果：未処置のＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスは、概して体重減少および死亡率の増加を呈する。対照的に、ＥＮＰＰ１の触媒ドメインをコードする組み換え核酸を含むＬＮＰで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスは、正常なＷＴマウスの体重範囲に近づく体重の増加を示すと予測される。
ヌルベクターで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスは、心臓、大動脈および冠動脈に石灰化、および右心室の自由壁の心筋梗塞の組織学的証拠、冠動脈、心臓、上行大動脈および下行大動脈の石灰化、心筋細胞壊死、ならびに冠動脈石灰化の領域に隣接する心筋組織における心筋線維症を示すことが予想される。対照的に、ＥＮＰＰ１－Ｆｃの触媒ドメインをコードする組み換え核酸を含むＬＮＰで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊ動物は、組織型または死後マイクロＣＴにおいて心臓、動脈、または大動脈の石灰化の非存在を呈することが予想される。ヌルベクターで処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスはまた、腎皮質への拡張を伴う、外側髄質を中心とする重度の広範な石灰化とともに、腎髄質を中心とする石灰化を示す。対照的に、ＥＮＰＰ１を用いて本発明により処置されたＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊマウスは、管腔における腎ミネラル沈着の減少または欠乏および健康な野生型マウスの組織型と類似した組織型を有する軟部組織の血管系を示すと予想される。
生存、毎日の動物体重、および末期組織型に加えて、治療応答は、死後高解像度マイクロＣＴスキャンを介して評価され、血管石灰化、血漿ＰＰｉ濃度、および９９ｍＴｃ ＰＰｉ（９９ｍＰＹＰ）取り込みを撮像する。ＷＴまたはＬＮＰ処置された（ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するベクターを含む）Ｅｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊのいずれも、未処置（ヌルベクター）Ｅｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊコホートの大動脈、冠動脈、および心臓に予想される劇的な石灰化とは対照的に、マイクロＣＴを介していかなる血管石灰化を有さないと予想される。さらに、ＬＮＰ処置した（ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するベクターを含む）Ｅｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊ動物（５．２μＭ）の血清ＰＰｉ濃度は、ＷＴレベル（４．４μＭ）まで上昇し、未処置のｅｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊレベル（０．５μＭ）を有意に上回ると予想される。
他の実施形態
前述の説明から、本発明に従う範囲内である病理学的石灰化または骨化の存在によって特徴付けられるあらゆる疾患を治療するための、当該技術分野で既知の異なるプロモーターもしくはエンハンサー、または異なる細胞型を有する異なるウイルスベクターにおける、ＥＮＰＰ１もしくはＥＮＰＰ３またはそれらの組み合わせの機能的バリアントを発現する異なるシグナル配列の使用を含む、様々な使用および条件にそれを採用するために、本明細書に記載される発明に変形および修正がなされ得ることは明らかであろう。本発明による他の実施形態は、以下の請求項の範囲内である。
本明細書の変数の任意の定義における要素の一覧の列挙は、任意の単一の要素または列挙された要素の組み合わせ（または部分的組み合わせ）としてのその変数の定義を含む。本明細書の実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはその一部と組み合わせたその実施形態を含む。
本明細書で言及される全ての刊行物および特許出願は、本発明が関連する当業者の技術レベルを示すものである。全ての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が、参照により組み込まれることを具体的かつ個別に示唆された場合と同じ程度で、参照により本明細書に組み込まれる。
他の実施形態は、以下の請求項の範囲内である。

Claims (107)

  1. （ａ）肝臓特異的プロモーターと、（ｂ）エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチドの触媒ドメインまたはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）ポリペプチドの触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列と、を含む組み換え核酸。
  2. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、可溶性ＥＮＰＰ１または可溶性ＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする、請求項１に記載の組み換え核酸。
  3. 前記核酸が、前記コードされたポリペプチドを発現することができるベクターまたはプラスミドを含む、請求項１または２に記載の組み換え核酸。
  4. 前記組み換え核酸がウイルスベクターによって送達される、請求項３に記載の組み換え核酸。
  5. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項４に記載の組み換え核酸。
  6. 前記核酸は、アズロシジンシグナルペプチドをコードし、前記シグナルペプチドは、前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドと動作可能に関連付けられている、請求項１～５のいずれか一項に記載の組み換え核酸。
  7. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドまたは前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドおよび異種タンパク質を含むＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードする、請求項１～６のいずれか一項に記載の組み換え核酸。
  8. 前記ヌクレオチド配列によってコードされる前記ＥＮＰＰ１融合タンパク質またはＥＮＰＰ３融合タンパク質が、哺乳動物において増加した循環半減期を、前記異種タンパク質を含まないＥＮＰＰ１ポリペプチドの前記循環半減期と比較して有する、請求項７に記載の組み換え核酸。
  9. 前記ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列によってコードされる前記異種タンパク質が、イムノグロブリン結晶化可能断片（Ｆｃ）ポリペプチドまたはアルブミンポリペプチドである、請求項７または８に記載の組み換え核酸。
  10. 前記ヌクレオチド配列によりコードされる前記ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質が、前記融合タンパク質のアミノ末端からカルボキシ末端の順序で、前記ＥＮＰＰ１または前記ＥＮＰＰ３ポリペプチドおよび前記Ｆｃポリペプチドまたは前記アルブミンポリペプチドを含む、請求項９に記載の組み換え核酸。
  11. 前記ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列によってコードされる前記Ｆｃポリペプチドが、ＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドである、請求項９または１０に記載の組み換え核酸。
  12. 前記コードされたＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドが、配列番号３４の前記アミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の組み換え核酸。
  13. 前記コードされたＩｇＧ１ Ｆｃポリペプチドが、バリアントＩｇＧ Ｆｃである、請求項９～１２のいずれか一項に記載の組み換え核酸。
  14. 前記コードされたバリアントＦｃポリペプチドが、ＥＵ番号によるＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅのアミノ酸置換を含む、請求項１３に記載の組み換え核酸。
  15. 前記コードされたバリアントＦｃポリペプチドが、配列番号９５のアミノ酸８５３～１０７９を含む、請求項１３または１４に記載の組み換え核酸。
  16. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号１のアミノ酸９９～９２５をコードする、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組み換え核酸。
  17. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、バリアント前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組み換え核酸。
  18. 前記コードされたバリアントＥＮＰＰ１ポリペプチドが、配列番号１に対して３３２位のアミノ酸置換をコードする配列を含む、請求項１７に記載の組み換え核酸。
  19. 配列番号１に対する３３２位の前記アミノ酸置換をコードする前記配列が、Ｉ３３２Ｔを含む、請求項１８に記載の組み換え核酸。
  20. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号９５のアミノ酸２１～８４７をコードする配列を含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の組み換え核酸。
  21. 前記ＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号９５のアミノ酸２０～８４７をコードする配列を含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の組み換え核酸。
  22. 前記コードされたＥＮＰＰ１融合タンパク質が、前記コードされたＥＮＰＰ１ポリペプチドと前記コードされた異種ポリペプチドとを連結するタンパク質リンカーをコードする配列を含む、請求項７～１９のいずれか一項に記載の組み換え核酸。
  23. 前記コードされたタンパク質リンカーが、配列番号９４（ＧＧＧＧＳ）の前記アミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の組み換え核酸。
  24. 前記ＥＮＰＰ１融合タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号９５のアミノ酸２１～１０７９を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組み換え核酸。
  25. 前記ＥＮＰＰ１融合タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号９５のアミノ酸２０～１０７９を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組み換え核酸。
  26. （ａ）肝臓特異的プロモーターと、（ａ）エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチドまたはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、を含む核酸を含むウイルスベクター。
  27. 前記肝臓特異的プロモーターが、肝臓プロモーター１（ＬＰ１）およびハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）からなる群から選択される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組み換え核酸または請求項２６のウイルスベクター。
  28. 前記ベクターが、ポリアデニル化信号をコードする配列を含む、請求項８～１２のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  29. 前記ベクターが、アズロシジンシグナルペプチドであるシグナルペプチドをコードする、請求項８～１３のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  30. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項８～１３のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  31. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ－ｒｈ７４からなる群から選択される血清型を有する、請求項１４に記載のウイルスベクター。
  32. 前記ウイルスベクターが、請求項１～２５のいずれか一項に記載の前記核酸を含む、請求項２６～３１のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  33. 請求項２６～３２のいずれか一項に記載の組み換えウイルスベクターを取得する方法であって、
    １．請求項４～２５のいずれか一項に記載の核酸を含む細胞を提供するステップと、
    ２．前記ウイルスの組立に適切な条件下に前記細胞を維持するステップと、
    ３．前記細胞によって産生される前記ウイルスベクターを精製するステップと、を含む方法。
  34. ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質を対象に提供する方法であって、
    前記哺乳動物に、請求項２６～３２のいずれか一項に記載のウイルスベクターを投与すること、を含む方法。
  35. 請求項２６～３２のいずれか一項に記載の前記ウイルスベクターおよび生理学的に適合する担体を含む医薬組成物。
  36. 疾患の予防または進行の低減を必要とする対象において疾患の予防または進行の低減をする方法であって、前記哺乳動物に、請求項３５に記載の治療有効量の前記医薬組成物を投与することを含み、前記疾患は、Ｘ連鎖性低リン血症（ＸＬＨ）、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、ミネラル骨障害（ＭＢＤ）、血管石灰化、軟部組織の病理学的石灰化、軟部組織の病理学的骨化、乳児の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、および後縦靱帯の骨化（ＯＰＬＬ）からなる群から選択され、前記哺乳動物における前記疾患が予防されるまたはその進行が低減される方法。
  37. 請求項１～２５のいずれか一項に記載の前記核酸を含む細胞。
  38. 病理学的石灰化または病理学的骨化の疾患または障害の治療または予防を必要とする対象において病理学的石灰化または病理学的骨化の疾患または障害の治療または予防をする方法であって、前記対象に、請求項２６～３２のいずれか一項に記載の前記ウイルスベクターの治療有効量、請求項３３に記載の前記方法によって作製されたウイルスベクター、または請求項３５に記載の前記医薬組成物を投与し、それによって前記疾患または障害を治療または予防することを含む方法。
  39. ＥＮＰＰ１タンパク質欠損を有する対象を治療する方法であって、前記対象に、請求項２６～３２のいずれか一項に記載の前記ウイルスベクターの治療有効量、請求項３３に記載の前記方法によって作製されたウイルスベクター、または請求項３５に記載の前記医薬組成物を投与し、それによって前記対象を治療することを含む方法。
  40. 前記疾患または障害または前記ＥＮＰＰ１タンパク質欠損が、前記対象におけるＮＰＰ１遺伝子の機能喪失変異、またはＡＢＣＣ６遺伝子の機能喪失変異と関連する、請求項３８または３９に記載の方法。
  41. 前記ウイルスベクターが、組み換えＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする、請求項３８～４０に記載の方法。
  42. 前記ウイルスベクターが、組み換えＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする、請求項３８～４０に記載の方法。
  43. ＥＮＰＰ１タンパク質欠損を有する対象を治療する方法であって、前記対象に、請求項２６～３２のいずれか一項に記載の前記ウイルスベクターの治療有効量、請求項３３に記載の前記方法によって作製されたウイルスベクター、または請求項３５に記載の前記医薬組成物を投与し、それによって前記対象を治療することを含む方法。
  44. 前記疾患または障害または前記ＥＮＰＰ１タンパク質欠損が、前記対象におけるＮＰＰ１遺伝子の機能喪失変異、またはＡＢＣＣ６遺伝子の機能喪失変異と関連する、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記ウイルスベクターまたは医薬組成物が、前記対象の１×１０１２～１×１０１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項３６または３８～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記ウイルスベクターまたは医薬組成物が、前記対象の１×１０１３～１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項３６または３８～４４のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記ウイルスベクターまたは医薬組成物が、前記対象の５×１０１１～５×１０１５ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項３６または３８～４４のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記ウイルスベクターまたは医薬組成物の前記対象への投与が、前記対象において、血漿ピロホスフェート（ＰＰｉ）および／または血漿ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３濃度を増加させる、請求項３６または３８～４４のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記対象から得られた生物学的試料において、以下（ｉ）前記ピロホスフェートの濃度、（ｉｉ）前記ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の発現レベル、および（ｉｉｉ）前記ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の酵素活性の一つ以上のパラメータを検出または測定することをさらに含む、請求項３６または３８～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記検出または測定が、前記ウイルスベクターまたは医薬組成物を投与する前に起こる、請求項４９に記載の方法。
  51. Ｅｎｐｐ１欠損対象において骨欠損を補正する方法であって、前記対象に、請求項２６～３２のいずれか一項に記載のウイルスベクターを、前記骨欠損を補正するのに有効な量で投与し、それによって前記骨欠損を補正することを含む方法。
  52. Ｅｎｐｐ１欠損対象において成長板構造を修復する方法であって、前記対象に、請求項２６～３２のいずれか一項に記載のウイルスベクターを、成長板構造を修復するのに有効な量で投与し、それによって前記対象において成長板構造を修復することを含む方法。
  53. Ｅｎｐｐ１欠損対象において異常な骨芽細胞機能の発達を阻害する方法であって、前記対象に、請求項２６～３２のいずれか一項に記載のウイルスベクターを、前記対象において前記異常な骨芽細胞機能の発達を阻害するのに有効な量で投与し、それによって前記対象において前記異常な骨芽細胞機能の発達を阻害することを含む方法。
  54. Ｅｎｐｐ１欠損対象において骨形成速度を増加する方法であって、前記対象に、請求項２６～３２のいずれか一項に記載のウイルスベクターを、骨形成を増加するのに有効な量で投与し、それによって前記対象において骨形成を増加することを含む方法。
  55. Ｅｎｐｐ１欠損対象において骨芽細胞面を増加する方法であって、前記対象に、請求項２６～３２のいずれか一項に記載のウイルスベクターを、骨芽細胞面を増加するのに有効な量で投与し、それによって前記対象において骨芽細胞面を増加する方法。
  56. 前記ウイルスベクターが単回投与で投与される、請求項５１～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記ウイルスベクターが、二回以上の用量で投与される、請求項５１～５５のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記補正が、骨長、イントラベキュラー（ｉｎｔｒａｂｅｃｕｌａｒ）数、皮質厚、骨梁厚、骨梁骨体積、骨形成速度、および骨芽細胞面からなる群の一つ以上の増加として、前記対象において表される、請求項５１に記載の方法。
  59. 前記補正、修復、阻害、および減少が、それぞれ、骨長、イントラベキュラー（ｉｎｔｒａｂｅｃｕｌａｒ）数、皮質厚、骨梁厚、骨梁骨体積、骨形成速度、および骨芽細胞面からなる群の一つ以上の増加として、前記対象において表される、請求項５１～５５のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記補正、修復、阻害、および減少が、それぞれ、非侵襲的撮像を介して検出される、請求項５１～５５のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記非侵襲的撮像が、動的組織形態計測分析を含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記検出が、前記対象への前記投与前の検出に関する、請求項６０に記載の方法。
  63. 前記エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチドの触媒ドメインまたは前記エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）ポリペプチドの触媒ドメインをコードする組み換え核酸であって、前記組み換え核酸が、非ウイルスベクターによって細胞内に送達される組み換え核酸。
  64. 前記組み換え核酸を含む前記非ウイルスベクターが、ＤＮＡ／カチオン性脂質（リポプレックス）、ＤＮＡ／カチオン性ポリマー（ポリプレックス）、ＤＮＡ／カチオン性ポリマー／カチオン性脂質（リポポリプレックス）、脂質ナノ粒子（ＬＰＮ）、イオン化可能な脂質、リピドイド、ペプチド系ベクターおよびポリマー系ベクターからなる群から選択される、請求項６３に記載の組み換え核酸。
  65. 前記非ウイルスベクターが、リポプレックス、ポリプレックス、リポポリプレックス、イオン化可能な脂質、リピドイド、脂質ナノ粒子（ＬＰＮ）、ペプチド系ベクターおよびポリマー系ベクターからなる群から選択される、請求項６４に記載の組み換え核酸。
  66. 前記非ウイルスベクターが、脂質ナノ粒子（ＬＰＮ）である、請求項６５に記載の組み換え核酸。
  67. 前記組み換え核酸の送達に使用される前記ＬＮＰが、ＬＮＰ安定性強化部分で被覆および／またはコンジュゲートされている、請求項６６に記載の組み換え核酸。
  68. ＬＮＰの前記ＬＮＰ安定性強化部分がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項６７に記載の組み換え核酸。
  69. 前記組み換え核酸の送達に使用される前記ＬＮＰが、標的部分で被覆および／またはコンジュゲートされている、請求項６６に記載の組み換え核酸。
  70. 前記標的部分が、鉄飽和トランスフェリン（Ｔｆ）、葉酸、アルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）およびアニサミドからなる群から選択される、請求項６９に記載の組み換え核酸。
  71. 前記組み換え核酸の送達に使用される前記ＬＮＰが、ｐＨ感受性リンカーとコンジュゲートされる、請求項６６に記載の組み換え核酸。
  72. 前記ｐＨ感受性リンカーが、ジオルトエステル、オルトエステル、ビニルエーテル、ホスホルアミデート、ヒドラジン、およびベータチオプロピオネートからなる群から選択される、請求項７１に記載の組み換え核酸。
  73. 前記組み換え核酸の送達に使用される前記ＬＮＰが、前記組み換え核酸を前記肝臓に送達するために標的部分で修飾される、請求項６６に記載の組み換え核酸。
  74. 前記組み換え核酸の送達に使用される前記ＬＮＰが、ビタミンＡ結合リポソームである、請求項７３に記載の組み換え核酸。
  75. 前記組み換え核酸の送達に使用される前記ＬＮＰが、特異的受容体を標的とするリガンドとコンジュゲートされる、請求項６６に記載の組み換え核酸。
  76. 前記特異的受容体が、コラーゲン型ＶＩ受容体、マンノース－６－ホスフェート受容体およびガラクトース受容体からなる群から選択される、請求項７５に記載の組み換え核酸。
  77. 前記非ウイルスベクターがペプチド系ベクターである、請求項６５に記載の組み換え核酸。
  78. 前記非ウイルスベクターがポリマー系ベクターである、請求項６５に記載の組み換え核酸。
  79. 前記エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）ポリペプチドの触媒ドメインまたは前記エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）ポリペプチドの触媒ドメインをコードする核酸を含む非ウイルスベクター。
  80. 前記核酸が肝臓特異的プロモーターをさらに含む、請求項７９に記載の非ウイルスベクター。
  81. 前記肝臓プロモーターが、肝臓プロモーター１（ＬＰ１）およびハイブリッド肝臓プロモーター（ＨＬＰ）からなる群から選択される、請求項８０に記載の非ウイルスベクター。
  82. 前記核酸が、アズロシジンシグナルペプチドであるシグナルペプチドをさらにコードする、請求項７９～８１のいずれか一項に記載の非ウイルスベクター。
  83. 前記非ウイルスベクターが、ＤＮＡ／カチオン性脂質（リポプレックス）、ＤＮＡ／カチオン性ポリマー（ポリプレックス）、ＤＮＡ／カチオン性ポリマー／カチオン性脂質（リポポリプレックス）、脂質ナノ粒子（ＬＰＮ）、イオン化可能な脂質、リピドイド、ペプチド系ベクターおよびポリマー系ベクターからなる群から選択される、請求項７９～８２のいずれか一項に記載の非ウイルスベクター。
  84. 前記非ウイルスベクターが、リポプレックス、ポリプレックス、リポポリプレックス、イオン化可能な脂質、リピドイド、脂質ナノ粒子（ＬＰＮ）、ペプチド系ベクターおよびポリマー系ベクターからなる群から選択される、請求項７９～８２のいずれか一項に記載の非ウイルスベクター。
  85. ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質を対象に提供する方法であって、
    前記哺乳動物に、請求項７９～８４のいずれか一項に記載の非ウイルスベクターを投与すること、を含む方法。
  86. 請求項７９～８４のいずれか一項に記載の前記非ウイルスベクターおよび生理学的に適合する担体を含む医薬組成物。
  87. 疾患の予防または進行の低減を必要とする対象において疾患の予防または進行の低減をする方法であって、前記哺乳動物に、請求項８６に記載の前記医薬組成物の治療有効量を投与することを含み、前記疾患が、Ｘ連鎖性低リン血症（ＸＬＨ）、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、ミネラル骨障害（ＭＢＤ）、血管石灰化、軟部組織の病理学的石灰化、軟部組織の病理学的骨化、乳児の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、および後縦靱帯の骨化（ＯＰＬＬ）からなる群から選択され、前記哺乳動物における前記疾患が予防されるまたはその進行が低減される方法。
  88. 病理学的石灰化または病理学的骨化の疾患または障害の治療または予防を必要とする対象において病理学的石灰化または病理学的骨化の疾患または障害の治療または予防をする方法であって、前記対象に、請求項７９～８４のいずれか一項に記載の前記非ウイルスベクターの治療有効量、または請求項８６に記載の前記医薬組成物を投与し、それによって前記疾患または障害を治療または予防することを含む方法。
  89. ＥＮＰＰ１タンパク質欠損を有する対象を治療する方法であって、前記対象に、請求項７９～８４のいずれか一項に記載の前記非ウイルスベクターの治療有効量、または請求項８６に記載の前記医薬組成物を投与し、それによって前記対象を治療することを含む方法。
  90. 前記疾患または障害または前記ＥＮＰＰ１タンパク質欠損が、前記対象におけるＮＰＰ１遺伝子の機能喪失変異またはＡＢＣＣ６遺伝子の機能喪失変異に関連する、請求項８８～８９に記載の方法。
  91. 前記非ウイルスベクターが、組み換えＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項８８～９０に記載の方法。
  92. 前記非ウイルスベクターが、組み換えＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項８８～９０に記載の方法。
  93. ＥＮＰＰ１タンパク質欠損を有する対象を治療する方法であって、前記対象に、請求項７９～８４のいずれか一項に記載の非ウイルスベクターの治療有効量、または請求項８６に記載の前記医薬組成物を投与することを含み、それによって前記対象を治療することを含む方法。
  94. 前記疾患または障害または前記ＥＮＰＰ１タンパク質欠損が、前記対象におけるＮＰＰ１遺伝子の機能喪失変異またはＡＢＣＣ６遺伝子の機能喪失変異に関連する、請求項９３に記載の方法。
  95. 前記非ウイルスベクターまたは医薬組成物の前記対象への投与が、前記対象において、血漿ピロホスフェート（ＰＰｉ）および／または血漿ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３濃度を増加する、請求項８７～９４のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記対象から得られた生物学的試料において、以下（ｉ）前記ピロホスフェートの濃度、（ｉｉ）前記ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の発現レベル、および（ｉｉｉ）前記ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の酵素活性の一つ以上のパラメータを検出または測定することをさらに含む、請求項８７～９４のいずれか一項に記載の方法。
  97. 前記検出または測定が、前記非ウイルスベクターまたは医薬組成物を投与する前に起こる、請求項９６に記載の方法。
  98. Ｅｎｐｐ１欠損対象において骨欠損を補正する方法であって、前記対象に、請求項７９～８４のいずれか一項に記載の非ウイルスベクターを、前記骨欠損を補正するのに有効な量で投与し、それによって前記骨欠損を補正することを含む方法。
  99. Ｅｎｐｐ１欠損対象において成長板構造を修復する方法であって、前記対象に、請求項７９～８４のいずれか一項に記載の非ウイルスベクターを、成長板構造を修復するのに有効な量で投与し、それによって前記対象において成長板構造を修復することを含む方法。
  100. Ｅｎｐｐ１欠損対象において異常な骨芽細胞機能の発達を阻害する方法であって、前記対象に、請求項７９～８４のいずれか一項に記載の非ウイルスベクターを、前記対象において異常な骨芽細胞機能の発達を阻害するのに有効な量で投与し、それによって前記対象における異常な骨芽細胞機能の発達を阻害することを含む方法。
  101. Ｅｎｐｐ１欠損対象において骨形成速度を増加する方法であって、前記対象に、請求項７９～８４のいずれか一項に記載の非ウイルスベクターを、骨形成を増加するのに有効な量で投与し、それによって前記対象における骨形成を増加することを含む方法。
  102. Ｅｎｐｐ１欠損対象において骨芽細胞面を増加する方法であって、前記対象に、請求項７９～８４のいずれか一項に記載の非ウイルスベクターを、骨芽細胞面を増加するのに有効な量で投与し、それによって前記対象において骨芽細胞面を増加することを含む方法。
  103. 前記補正が、前記対象において、骨長、イントラベキュラー（ｉｎｔｒａｂｅｃｕｌａｒ）数、皮質厚、骨梁厚、骨梁骨体積、骨形成速度、および骨芽細胞面からなる群の一つ以上の増加として表される、請求項９８に記載の方法。
  104. 前記補正、修復、阻害および減少が、それぞれ、前記対象において、骨長、イントラベキュラー（ｉｎｔｒａｂｅｃｕｌａｒ）数、皮質厚、骨梁厚、骨梁骨体積、骨形成速度、および骨芽細胞面からなる群の一つ以上の増加として表される、請求項９８～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  105. 前記補正、修復、阻害および減少が、それぞれ、非侵襲的撮像を介して検出される、請求項９８～１０２のいずれか一項に記載の方法。
  106. 前記非侵襲的撮像が、動的組織形態計測分析を含む、請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記検出が、前記対象への前記投与前の検出に関する、請求項１０５に記載の方法。
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