JP2022517435A - Ｅｎｐｐ１またはｅｎｐｐ３の欠乏をともなう疾患の治療 - Google Patents

Ｅｎｐｐ１またはｅｎｐｐ３の欠乏をともなう疾患の治療 Download PDF

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Abstract

本開示は、数ある中でも、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３のインビボでの発現のためのベクター、ならびに対象の石灰化および骨化の疾患の治療のための方法を提供する。

Description

相互参照
本出願は、２０１９年１月１８日（０１／１８／２０１９）に出願された米国出願第６２／７９４，４５０号、２０１９年３月２１日（０３／２１／２０１９）に出願された米国出願第６２／８２１，６９２号および２０１９年７月２２日（０７／２２／２０１９）に出願された米国出願第６２／８７７，０４４号に対して優先権を主張するものであり、これらのそれぞれの内容は、参照により完全に本明細書に組み込まれる。
本発明は、一般に、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードする核酸を哺乳動物に提供することによる、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の欠乏をともなう疾患の治療に関する。
ＥＮＰＰ１（ＰＣ－１としても知られる）は、骨芽細胞および軟骨細胞のミネラル沈着マトリックス小胞に位置する２型細胞外膜結合糖タンパク質であり、細胞外ヌクレオチド（主としてＡＴＰ）をアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）および無機ピロリン酸（ＰＰｉ）に加水分解する。ＰＰｉは、新生ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）結晶に結合することによって異所性の組織ミネラル化の強力な阻害剤として機能し、それによって、これらの結晶の将来的な成長を妨害する。ＥＮＰＰ１はヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）の加水分解によってＰＰｉを生成し、進行性硬直症タンパク質（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ Ａｎｋｙｌｏｓｉｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＡＮＫ）は細胞内のＰＰｉを細胞外間隙に輸送し、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＰ）はＰｉへのＰＰｉの直接加水分解を介してＰＰｉを除去する。ＷＯ２０１１／１１３０２７－Ｑｕｉｎｎら、ＷＯ２０１２／１２５１８２－Ｑｕｉｎｎら、ＷＯ２０１６／１００８０３－Ｑｕｉｎｎら、およびＷＯ２０１７／２１８７８６－Ｙａｎらは、ＮＰＰ１を説明する。
ＥＮＰＰ１のようにＥＮＰＰ３もホスホジエステラーゼＩ／ヌクレオチドピロホスファターゼ酵素ファミリーに属する。これらの酵素は、デオキシヌクレオチド、ＮＡＤおよびヌクレオチド糖を含めた様々な分子のホスホジエステルおよびホスホスルフェート結合の切断を触媒するＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＥＮＰＰ１は、異所性の組織石灰化のある特定の疾患の治療、例えば、乳児に生じ、広範な動脈石灰化に関与する重度の疾患であるＧＡＣＩ（乳児の全身性動脈石灰化）のマウスモデルにおける全身性動脈石灰化の低減に有効であることが示されている（Ａｌｂｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍ．１０００６）。
発明の概要
一態様では、本開示は、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）またはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）を含む組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の組換えポリヌクレオチドのいずれかを含むウイルスベクターを提供する。
いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドはヒトＥＮＰＰ１またはヒトＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする。したがって、本開示は、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）またはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）を含む組換えポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含むウイルスベクターも提供する。
本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、組換えポリペプチドはＥＮＰＰ１融合ポリペプチドである。
本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、組換えポリペプチドはＥＮＰＰ３融合ポリペプチドである。
本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１融合ポリペプチドは、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドまたはＥＮＰＰ１－アルブミン融合ポリペプチドである。
本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ３融合ポリペプチドはＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合ポリペプチドまたはＥＮＰＰ３－アルブミン融合ポリペプチドである。
本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、組換えポリペプチドはＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３に融合したシグナルペプチドを含む。
本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、シグナルペプチドはアズロシジンシグナルペプチドまたはＮＰＰ２シグナルペプチドまたはＮＰＰ７シグナルペプチドである。
本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクターまたは単純ヘルペスベクターまたはアルファウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。本発明の一態様では、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）の血清型は、ＡＡＶ１またはＡＡＶ２またはＡＡＶ３またはＡＡＶ４またはＡＡＶ５またはＡＡＶ６またはＡＡＶ７またはＡＡＶ８またはＡＡＶ９またはＡＡＶ－ｒｈ７４である。
さらに別の態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする組換えポリペプチドを含むアデノ随伴ウイルスベクターを提供する。
さらに別の態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドに融合したアズロシジンシグナルペプチドを含む組換えポリペプチドをコードする組換えポリペプチドを含むアデノ随伴ウイルスベクターを提供する。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、バキュロウイルスベクターなどの昆虫ウイルスベクターではない。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞（例えば、ヒト肝細胞またはＨＥＫ細胞、ＨｅＬａまたはＡ５４９または肝実質細胞）に感染することができる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ヒト細胞などの哺乳動物細胞に感染する、該細胞に進入する、および／または該細胞と融合することができる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターのポリヌクレオチドのすべてまたは（例えば、本明細書に記載のポリペプチドを発現することができる）機能的部分は、本明細書に記載のウイルスベクターが接触する細胞のゲノムに統合される（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｓ）か、または組み込まれる（ｉｓ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターのポリヌクレオチドのすべてまたは機能的部分は、本明細書に記載のウイルスベクターが接触する哺乳類細胞のゲノムに統合されることなく、染色体外の状態を持続することができる。
いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、ウイルスタンパク質および／またはヒトＥＮＰＰ１をコードするベクターまたはプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、ウイルスタンパク質および／またはヒトＥＮＰＰ３をコードするベクターまたはプラスミドを含む。いくつかの実施形態では、ベクターまたは前記プラスミドは、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）に、またはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）に融合したアズロシジンシグナルペプチドを含む、コードされるポリペプチドを発現することができる。
いくつかの実施形態では、コードされるポリペプチドは、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）に融合したアズロシジンシグナルペプチドを含み、膜貫通ドメイン、ソマトメジンドメイン、触媒ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む。
いくつかの実施形態では、コードされるポリペプチドは、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）に融合したアズロシジンシグナルペプチドを含み、サイトゾルに分泌される。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）に融合した膜貫通ドメインを含み、分泌されず、膜結合型である。
いくつかの実施形態では、本開示は、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）を含むポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）を含むポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基を含む。
いくつかの実施形態では、コードされるポリペプチドは、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）に融合したアズロシジンシグナルペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）に融合したアズロシジンシグナルペプチドを含むコードされるポリペプチドは、ポリアスパラギン酸ドメインまたは負に荷電した骨標的化ドメインを欠く。
いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかは、ＥＮＰＰ１に融合したアズロシジンシグナルペプチド、またはＥＮＰＰ３に融合したアズロシジンシグナルペプチドおよびＦｃポリペプチドに融合したＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードして、それぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端の順で、アズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ１－Ｆｃまたはアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ３－Ｆｃを形成する。
いくつかの実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、ＥＮＰＰ１に融合したアズロシジンシグナルペプチドまたはＥＮＰＰ３に融合したアズロシジンシグナルペプチドおよびヒト血清アルブミンに融合したＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードして、それぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端の順で、アズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ１－アルブミンまたはアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ３－アルブミンを形成する。
いくつかの実施形態では、Ｆｃまたはアルブミン配列は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質のＣ末端に直接融合している。いくつかの実施形態では、Ｆｃまたはアルブミン配列は、可動性リンカーなどのリンカーを介してＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質のＣ末端に融合している。いくつかの実施形態では、リンカーは配列番号５７～８８から選択される。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３のＮ末端に融合したシグナルペプチドをコードする核酸配列を含み、それを発現することができる。ウイルスベクターのいくつかの実施形態では、ベクターはプロモーターを含む。ウイルスベクターのいくつかの実施形態では、プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。
ウイルスベクターのいくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、アルブミンプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーターおよびアルファ－１－アンチトリプシンプロモーターからなる群から選択される。ウイルスベクターのいくつかの実施形態では、ベクターはポリアデニル化シグナルをコードする配列を含む。
ウイルスベクターのいくつかの実施形態では、シグナルペプチドはアズロシジンシグナルペプチドである。ウイルスベクターのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ウイルスベクターのいくつかの実施形態では、血清型を有するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶ－ｒｈ７４からなる群から選択される。
ウイルスベクターのいくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＥＮＰＰ１に融合したアズロシジンシグナルペプチドまたはＥＮＰＰ３に融合したアズロシジンシグナルペプチドおよびＦｃポリペプチドに融合したＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードして、それぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端の順で、アズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ１－Ｆｃまたはアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ３－Ｆｃを形成する。
ウイルスベクターのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＥＮＰＰ１に融合したアズロシジンシグナルペプチドまたはＥＮＰＰ３に融合したアズロシジンシグナルペプチドおよびヒト血清アルブミンに融合したＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードして、それぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端の順で、アズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ１－アルブミンまたはアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ３－アルブミンを形成する。
さらに別の態様では、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、げっ歯類細胞、非ヒト霊長類細胞またはヒト細胞）を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、以下のステップを含む、組換えウイルスベクターを得る方法も提供する：
ｉ．本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を提供するステップ、
ｉｉ．ウイルスのアセンブリーに適切な条件下で細胞を維持するステップ、および
ｉｉｉ．細胞によって産生されたウイルスベクターを精製するステップ。
別の態様では、本開示は、組換えウイルスベクターを産生する方法を提供する。方法は、以下のステップを含む：
ｉ．本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または細胞の集団を提供するステップであって、細胞が、組換えウイルスベクターへのポリヌクレオチドのパッケージングまたはアセンブリーに必須なウイルスタンパク質を発現するステップ；および
ｉｉ．前記組換えウイルスベクターのパッケージングのアセンブリーに適切な条件下で、細胞または細胞の集団を維持するステップ。
いくつかの実施形態では、方法は、細胞もしくは細胞の集団から、または細胞もしくは細胞の集団が維持されていた培地からウイルスベクターを精製することを含む。
いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞、例えば、げっ歯類細胞（例えば、ラット細胞、マウス細胞、ハムスター細胞）、非ヒト霊長類細胞、またはヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａまたはＡ５４９）である。
いくつかの実施形態では、方法は、１種または複数のウイルスタンパク質（例えば、ウイルスベクターのパッケージングまたはアセンブリーに必須なもの）をコードする組換え核酸を細胞または細胞の集団中に導入すること、例えば、細胞または細胞の集団にそのような組換え核酸を含むヘルパーウイルスを感染させること、そのような組換え核酸を含むヘルパープラスミドでの細胞または細胞の集団のトランスフェクションなどをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、標的細胞における感染の際に、本明細書に記載の１種または複数のポリペプチドを発現することができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の精製されたウイルスベクターを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の無菌／内毒素フリーの精製されたウイルスベクターを含む無菌の医薬組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の方法のいずれかによって得られ、精製されたウイルスベクターを提供する。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の方法のいずれかによって得られ、精製されたウイルスベクターのいずれかを含む医薬組成物を提供する。
ある種の実施形態では、本発明は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を哺乳動物に提供する方法であって、本発明のウイルスベクターを哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。
ある種の実施形態では、本開示は、哺乳動物（例えばヒト、例えばそのような発現を必要としているヒト）においてＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現させる方法であって、本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかを哺乳動物に投与することを含む方法を提供する。哺乳動物へのウイルスベクターの投与より前に、該投与と同時に、および／または該投与の後に、方法は、哺乳動物から得られた生物試料において、以下のパラメーター：ＥＮＰＰ１および／もしくはＥＮＰＰ３の発現、ＥＮＰＰ１および／もしくはＥＮＰＰ３の活性レベル、ならびに／またはピロリン酸のレベルもしくは濃度のうちの１つまたは複数を検出および／または測定することをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のパラメーターは、哺乳動物へのウイルスベクターの投与の後１週、１～２週以内に、および／または１月以内に検出または測定される。いくつかの実施形態では、哺乳動物（例えばヒト）は、ＥＮＰＰ１またはＡＢＣＣ６の欠乏を有するものである。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかおよび生理学的に適合する担体を含む医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、状態または疾患の進行を予防するかまたは低減させることを必要とする哺乳動物において状態または疾患の進行を予防するかまたは低減させる方法であって、治療有効量の本発明による組成物を前記哺乳動物に投与することを含み、状態または疾患としては、限定はされないが、以下：ＮＰＰ１の欠乏、低レベルのＰＰｉ、動脈および／または結合組織におけるカルシウムおよび他のミネラルの沈着物の蓄積を特徴とする進行性障害、軟組織の異所性石灰化、動脈または静脈石灰化、心臓組織、例えば、大動脈組織および冠血管組織の石灰化、弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）、Ｘ連鎖性低リン酸血症（ＸＬＨ）、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、ミネラル骨障害（ＭＢＤ）、血管石灰化、軟組織の病的石灰化、軟組織の病的骨化、乳児の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、ならびに後縦靱帯骨化症（ＯＰＬＬ）のうちの１つまたは複数が挙げられ、それによって、前記哺乳動物の前記疾患は予防されるか、またはその進行は低減させられる方法を提供する。
別の態様では、本開示は、病的石灰化または病的骨化の疾患または障害を治療、予防および／または改善することを必要とする対象において病的石灰化または病的骨化の疾患または障害を治療、予防および／または改善する方法であって、治療有効量の本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかを投与し、それによって、前記疾患または障害を治療、予防または改善することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ヒトＥＮＰＰ１またはヒトＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
別の態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１タンパク質の欠乏を有する対象を治療する方法であって、組換えＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする治療有効量のウイルスベクターを対象に投与し、それによって、対象を治療することを含む方法を提供する。本発明の一態様では、ウイルスベクターはヒトＥＮＰＰ１またはヒトＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする。
別の態様では、対象は、対象のＮＰＰ１遺伝子の機能欠損型突然変異または対象のＡＢＣＣ６遺伝子の機能欠損型突然変異と関連する疾患もしくは障害またはＥＮＰＰ１タンパク質の欠乏を有する。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターはＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするＡＡＶベクターであり、ベクターは、１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、好ましくは１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／ｋｇの投薬量で対象に投与される。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターはＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするＡＡＶベクターであり、ベクターは、５×１０１１～５×１０１５ ｖｇ／ｋｇの投薬量で対象に投与される。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターはＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするＡＡＶベクターであり、ＥＮＰＰ１－Ｆｃポリペプチドの送達および発現のために、対象あたりおよそ１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇが投与される。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターはＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするＡＡＶベクターであり、ベクターは、１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、好ましくは１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／ｋｇの投薬量で対象に投与される。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターはＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするＡＡＶベクターであり、ベクターは、５×１０１１～５×１０１５ ｖｇ／ｋｇの投薬量で対象に投与される。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターはＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードするＡＡＶベクターであり、ＥＮＰＰ３－Ｆｃポリペプチドの送達および発現のために、対象あたりおよそ１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇが投与される。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、対象へのＥＮＰＰ１－ＦｃポリペプチドをコードするＡＡＶベクターの投与は、前記対象において、血漿ピロリン酸（ＰＰｉ）の用量依存的増加および血漿ＥＮＰＰ１濃度の用量依存的増加をもたらす。
哺乳動物へのウイルスベクターの投与より前に、該投与と同時に、および／または該投与の後に、本明細書に記載の方法のいずれかは、哺乳動物から得られた生物試料において、以下のパラメーター：ＥＮＰＰ１および／もしくはＥＮＰＰ３の発現、ＥＮＰＰ１および／もしくはＥＮＰＰ３の活性レベル、ならびに／またはピロリン酸のレベルもしくは濃度のうちの１つまたは複数を検出および／または測定することをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のパラメーターは、哺乳動物へのウイルスベクターの投与の後１週、１～２週以内に、および／または１月以内に検出または測定される。
さらに別の態様では、本開示は、病的石灰化または病的骨化の疾患または障害を治療または予防することを必要とする対象において病的石灰化または病的骨化の疾患または障害を治療または予防する方法であって、組換えＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする治療有効量のウイルスベクターを前記対象に投与し、それによって、前記疾患または障害を治療または予防することを含む方法を提供する。
別の態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１タンパク質の欠乏を有する対象を治療する方法であって、組換えＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする治療有効量のウイルスベクターを前記対象に投与し、それによって、前記対象を治療することを含む方法を提供する。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、前記疾患もしくは障害または前記ＥＮＰＰ１タンパク質の欠乏は、前記対象におけるＮＰＰ１遺伝子の機能欠損型突然変異またはＡＢＣＣ６遺伝子の機能欠損型突然変異と関連する。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、前記ウイルスベクターは組換えＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、前記ウイルスベクターは組換えＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、前記ウイルスベクターは組換えＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドまたは組換えＥＮＰＰ１－アルブミン融合ポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、前記ウイルスベクターは組換えＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合ポリペプチドまたは組換えＥＮＰＰ３－アルブミン融合ポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、前記ウイルスベクターはＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３に融合したシグナルペプチドを含む組換えポリペプチドをコードする。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、前記ベクターはＥＮＰＰ１－ＦｃまたはＥＮＰＰ１－アルブミンをコードする。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、前記シグナルペプチドはアズロシジンシグナルペプチド、ＮＰＰ２シグナルペプチドまたはＮＰＰ７シグナルペプチドである。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクターまたは単純ヘルペスベクターまたはアルファウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）の血清型は、ＡＡＶ１またはＡＡＶ２またはＡＡＶ３またはＡＡＶ４またはＡＡＶ５またはＡＡＶ６またはＡＡＶ７またはＡＡＶ８またはＡＡＶ９またはＡＡＶ－ｒｈ７４である。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターはＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドに融合したアズロシジンシグナルペプチドを含む組換えポリペプチドをコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、前記ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする前記ＡＡＶベクターは、１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇの投薬量で対象に投与される。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、前記投薬量は１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／ｋｇである。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、前記ＡＡＶベクターは、５×１０１１～５×１０１５ ｖｇ／ｋｇの投薬量で対象に投与される。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、前記ベクターは、ＥＮＰＰ１－ＦｃをコードするＡＡＶベクターであり、１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇの投薬量で対象に投与される。
前述の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＥＮＰＰ１－Ｆｃポリペプチドをコードする前記ＡＡＶベクターの対象への投与は、前記対象において、血漿ピロリン酸（ＰＰｉ）の用量依存的増加および血漿ＥＮＰＰ１濃度の用量依存的増加をもたらす。
別の態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質の触媒ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むウイルスベクターを特色とする。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質の細胞外ドメインを含む。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドはＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質の膜貫通ドメインを含む。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドはＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質のヌクレアーゼドメインを含む。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは配列番号１の残基９９～９２５（Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）を含む。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは配列番号７の残基３１～８７５（Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ～Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｉｌｅ）を含む。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは配列番号１の残基１９１～５９１（Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ～Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ）を含む。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは配列番号７の残基１４０～５１０（Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ～Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ）を含む。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは配列番号９２の残基１～８２７（Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）を含む。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは配列番号８９の残基１～８３３（Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｌａ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）または配列番号９１の残基１～８３０（Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）を含む。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターは昆虫ウイルスベクターではない。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターは哺乳動物細胞に感染する、または感染することができる。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列はプロモーター配列をコードする。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、前記プロモーターは肝臓特異的プロモーターである。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、アルブミンプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーターおよびアルファ－１－アンチトリプシンプロモーターからなる群から選択される。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列を含む。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列に対してアミノ末端にあるシグナルペプチドをコードする。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、シグナルペプチドはアズロシジンシグナルペプチドである。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶ－ｒｈ７４からなる群から選択される血清型を有する。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチド配列は、前記ＥＮＰＰ１に融合した前記アズロシジンシグナルペプチドまたは前記ＥＮＰＰ３に融合した前記アズロシジンシグナルペプチドおよびＦｃポリペプチドに融合した前記ＥＮＰＰ１または前記ＥＮＰＰ３をコードして、それぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端の順で、アズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ１－Ｆｃまたはアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ３－Ｆｃを形成する。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、前記ポリヌクレオチド配列は、前記ＥＮＰＰ１に融合した前記アズロシジンシグナルペプチドまたは前記ＥＮＰＰ３に融合した前記アズロシジンシグナルペプチドおよびヒト血清アルブミンに融合した前記ＥＮＰＰ１または前記ＥＮＰＰ３をコードして、それぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端の順で、アズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ１－アルブミンまたはアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ３－アルブミンを形成する。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは、（ｉ）ＥＮＰＰ１タンパク質またはＥＮＰＰ３タンパク質および（ｉｉ）半減期延長ドメインを含む融合タンパク質である。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインまたはその機能的フラグメントが存在しない場合のポリペプチドの半減期と比較して、哺乳動物においてポリペプチドの半減期を延ばすことができる、ＩｇＧ ＦｃドメインまたはＩｇＧ Ｆｃドメインの機能的フラグメントである。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、アルブミンドメインまたはその機能的フラグメントが存在しない場合のポリペプチドの半減期と比較して、哺乳動物においてポリペプチドの半減期を延ばすことができる、アルブミンドメインまたはアルブミンドメインの機能的フラグメントである。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、Ｅ融合タンパク質において、ＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質に対してカルボキシ末端にある。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ＩｇＧ Ｆｃドメインは配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、アルブミンドメインは配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはリンカー配列をコードする。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、リンカー配列は配列番号５７～８８からなる群から選択される。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、リンカー配列は、融合タンパク質のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質と半減期延長ドメインを接続する。
本明細書に記載のウイルスベクターのいずれかのいくつかの実施形態では、ポリペプチドは配列番号８９、９１、９２および９３に示されるアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本開示は、以下のステップを含む、組換えウイルスベクターを産生するための方法を提供する：
ｉ．ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質の触媒ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞または細胞の集団を提供するステップであって、細胞が、組換えウイルスベクターへのポリヌクレオチドのパッケージングおよび／またはアセンブリーに必須なウイルスタンパク質を発現するステップ；ならびに
ｉｉ．ポリヌクレオチドを含む前記組換えウイルスベクターのパッケージングのアセンブリーに適切な条件下で、細胞または細胞の集団を維持するステップ。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はげっ歯類細胞またはヒト細胞である。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターは本明細書に記載のウイルスベクターのいずれか１つである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかは、細胞もしくは細胞の集団から、または細胞もしくは細胞の集団が維持されていた培地から組換えウイルスベクターを精製することをさらに含むことができる。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載の組換えウイルスベクターを産生および／または精製するための方法から精製された組換えウイルスベクターを特色とする。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のウイルスベクターまたは組換えウイルスベクターのいずれか１つおよび医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
さらに別の態様では、本開示は、疾患の進行を予防するかまたは低減させることを必要とする哺乳動物において疾患の進行を予防するかまたは低減させる方法であって、治療有効量の、本明細書に記載の医薬組成物のいずれか１つを前記哺乳動物に投与して、それによって、疾患または障害の進行を予防するかまたは低減させることを含む方法を提供する。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、疾患は、Ｘ連鎖性低リン酸血症（ＸＬＨ）、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、ミネラル骨障害（ＭＢＤ）、血管石灰化、軟組織の病的石灰化、軟組織の病的骨化、ＰＸＥ、乳児の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）および後縦靱帯骨化症（ＯＰＬＬ）からなる群から選択される。
別の態様では、本開示は、病的石灰化または病的骨化の疾患または障害を治療または予防することを必要とする対象において病的石灰化または病的骨化の疾患または障害を治療または予防する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載のウイルスベクターまたは医薬組成物のいずれか１つを対象に投与し、それによって、前記疾患または障害を治療または予防することを含む方法を提供する。
別の態様では、本開示は、ＥＮＰＰ１タンパク質の欠乏を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載のウイルスベクターまたは医薬組成物のいずれか１つを対象に投与し、それによって、前記対象を治療することを含む方法を特色とする。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、前記疾患もしくは障害または前記ＥＮＰＰ１タンパク質の欠乏は、前記対象におけるＮＰＰ１遺伝子の機能欠損型突然変異またはＡＢＣＣ６遺伝子の機能欠損型突然変異と関連する。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターまたは医薬組成物は、１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／対象または哺乳動物のｋｇの投薬量で投与される。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターまたは医薬組成物は、１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／対象または哺乳動物のｋｇの投薬量で投与される。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターまたは医薬組成物は、５×１０１１～５×１０１５ ｖｇ／対象または哺乳動物のｋｇの投薬量で投与される。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ウイルスベクターまたは医薬組成物は、１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／対象または哺乳動物のｋｇの投薬量で投与される。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、前記ウイルスベクターまたは医薬組成物の対象または哺乳動物への投与は、前記対象または哺乳動物において、血漿ピロリン酸（ＰＰｉ）および／または血漿ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３濃度を高める。
いくつかの実施形態では、前述の方法のいずれかは、対象または哺乳動物から得られた生物試料において、以下のパラメーター：（ｉ）ピロリン酸の濃度、（ｉｉ）ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の発現レベル、および（ｉｉｉ）ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の酵素活性のうちの１つまたは複数を検出または測定することをさらに含むことができる。
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、検出または測定は、ウイルスベクターまたは医薬組成物を投与する前に行われる。
ＡＡＶコンストラクトを示す概略図である。 ＮＰＰ２およびＮＰＰ７シグナル配列と比較した場合の、アズロシジンシグナル配列を使用した場合のＥＮＰＰ１の発現量の増加を示す図である。 ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合を発現するベクターのプラスミドマップ モデルマウスへのＥＮＰＰ１コンストラクトを含むウイルス粒子の投与を示す概略図である。 ウイルスベクターの投与後７日目、２８日目および５６日目に収集された、対照、低用量および高用量マウスコホートから得られた血漿試料における、ＥＮＰＰ１活性の用量依存的増加を示す図である。 ウイルスベクターの投与後７日目、２８日目および５６日目に収集された、対照、低用量および高用量マウスコホートから得られた血漿試料における、ＥＮＰＰ１濃度の用量依存的増加を示す図である。 ウイルスベクターの投与後７日目、２８日目および５６日目に収集された、対照、低用量および高用量マウスコホートから得られた血漿試料における、血漿ＰＰｉ濃度の用量依存的増加を示す図である。 ウイルスベクター投与後１１２日間までのＥＮＰＰ１の持続的発現を示す図である。 ウイルスベクターの投与後７日目、２８日目、５６日目および１１２日目に収集された、対照、低用量および高用量マウスコホートから得られた血漿試料における、ＥＮＰＰ１活性の用量依存的増加を示す図である。
本発明は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の欠乏を有する哺乳動物への哺乳動物のＥＮＰＰ１または哺乳動物のＥＮＰＰ３をコードする核酸の送達に関する。
定義
別段規定されない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または均等ないかなる方法および材料も本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的方法および材料を記載する。本明細書で使用する場合、以下の用語のそれぞれは、本セクションにおいてそれと関連する意味を有する。
冠詞「１つ（ａ）」および「１つ（ａｎ）」は、冠詞の文法的対象物の１つまたは１つより多い（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「１つ（ａｎ）の要素」は、１つの要素または１つより多い要素を意味する。
以下の表記が明確さのために本開示に適用される。いずれにせよ、この決まり事に従わない本明細書のいかなる教示も依然として本開示の一部であり、教示が開示されている文脈を考慮して十分に理解され得る。タンパク質記号は、非イタリック体の大文字で開示される。非限定例として、「ＥＮＰＰ１」はタンパク質を指す。ある種の実施形態では、タンパク質がヒトタンパク質である場合、タンパク質記号の前に「ｈ」が使用される。他の実施形態では、タンパク質がマウスタンパク質である場合、記号の前に「ｍ」が使用される。ヒトＥＮＰＰ１は「ｈＥＮＰＰ１」と称され、マウスＥＮＰＰ１は「ｍＥＮＰＰ１」と称される。ヒトの遺伝子記号はイタリック体の大文字で開示される。非限定例として、タンパク質ｈＥＮＰＰ１に対応するヒト遺伝子はＥＮＰＰ１である。マウスの遺伝子記号は最初の文字を大文字で、残りの文字を小文字で開示され；さらに、マウス遺伝子記号はイタリック体にされる。非限定例として、タンパク質ｍＥｎｐｐ１を生成するマウス遺伝子はＥｎｐｐ１である。遺伝子突然変異についての表記は大文字のテキストで示される。
「ヒトＥＮＰＰ１」：ヒトＮＰＰ１（ＮＣＢＩアクセションＮＰ＿００６１９９／Ｕｎｉｐｒｏｔ－Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ Ｐ２２４１３）
「可溶性ヒトＥＮＰＰ１」：ＮＣＢＩアクセションＮＰ＿００６１９９の残基９６～９２５
「ヒトＥＮＰＰ３」：ヒトＮＰＰ３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｏ１４６３８．２）
「可溶性ヒトＥＮＰＰ３」：ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｏ１４６３８．２の残基４９～８７５
「石灰化の低減」：本明細書で使用する場合、石灰化の低減は、Ｘ線、マイクロＣＴおよびＭＲＩのような非侵襲性の方法を使用することによって観察される。石灰化の低減はまた、９９ｍＴｃ－ピロリン酸（９９ｍＰＹＰ）の取り込みを用いる放射性イメージングを使用することによって推測される。マウスにおける石灰化の存在は、Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｖｏｌｕｍｅ ６，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１０００６（２０１５））によって確立されたプロトコールに従った、マイクロコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンならびにヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）およびアリザリンレッドなどの色素を使用する、心臓、大動脈および腎臓から得られた組織切片による検死を介して評価される。
ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３についての「酵素的に活性」は、ＡＭＰおよびＰＰｉへのＡＴＰ加水分解活性ならびに／またはＡＴＰへのＡＰ３ａ加水分解を有すると定義される。基質結合活性を有する。
ＡＴＰ加水分解活性は、以下のように決定することができる。
ＮＰＰ１のＡＴＰ加水分解活性
ＮＰＰ１は、ＡＴＰをＡＭＰおよびＰＰｉに容易に加水分解する。ＮＰＰ１の定常状態ミカエリス－メンテン酵素定は、基質としてＡＴＰを使用して決定される。酵素反応のＨＰＬＣ分析によってＮＰＰ１がＡＴＰを切断することを示すことができ、ＡＴＰ、ＡＭＰおよびＡＤＰ標準を使用することによって、反応の基質と生成物の同一性が確認される。ＡＴＰ基質は、酵素的生成物ＡＭＰの蓄積をともなって、ＮＰＰ１の存在下で経時的に分解する。様々な濃度のＡＴＰ基質を使用して、ＡＴＰの存在下でＮＰＰ１に対する初速度（ｉｎｉｔｉａｌ ｒａｔｅ ｖｅｌｏｃｉｔｉｅｓ）を導き出し、データを曲線に適合して、酵素速度定数を導き出す。生理的ｐＨで、ＮＰＰ１の動力学的速度定数はＫｍ＝１４４μＭおよびｋｃａｔｔ＝７．８ｓ－１である。
ＮＰＰ３のＡＴＰ加水分解活性
ＮＰＰ３の酵素活性は、基質としてｐＮＰ－ＴＭＰまたはＡＴＰを用いて測定した。ＮＰＰ３タンパク質をｐＨ８．９の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌおよび５ｍＭ ｐＮＰ－ＴＭＰまたは５０μＭ［γ－３２Ｐ］ＡＴＰのいずれかの存在下で、３７℃でインキュベートした。３％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸中に１０倍希釈することによって、ｐＮＰ－ＴＭＰの加水分解を止めた。続いて、反応混合物を６０μｌの５Ｎ ＮａＯＨで中和し、形成したｐ－ニトロフェノール（ｐＮＰ）を４０５ｎｍで比色測定で定量化した。１００ｍＭ ＥＤＴＡを添加することによって、ＡＴＰの加水分解を停止した。ポリエチレンイミンセルロースプレート（Ｍｅｒｃｋ）での薄層クロマトグラフィーによって、１μｌの反応混合物を分析した。ｐＨ３．０の７５０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４における上昇クロマトグラフィーによって、ヌクレオチドおよび分解産物を分離した。放射性スポットをオートラジオグラフィーによって可視化した。Ｂｌｙｔｔ ｅｔ ａｌ．（Ｈ．Ｊ．Ｂｌｙｔｔ，Ｊ．Ｅ．Ｂｒｏｔｈｅｒｔｏｎ，Ｌ．Ｂｕｔｌｅｒ Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４７（１９８５），ｐｐ．５１７－５２０）に従って、若干の変更を加えて（Ｒ．Ｇｉｊｓｂｅｒｓ，Ｈ．Ｃｅｕｌｅｍａｎｓ，Ｗ．Ｓｔａｌｍａｎｓ，Ｍ．Ｂｏｌｌｅｎ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（２００１），ｐｐ．１３６１－１３６８）、５０μＭ［α－３２Ｐ］ＡＴＰの加水分解の間に形成されたヌクレオチジル化した中間体をトラップした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後に、トラップした中間体をオートラジオグラフィーによって可視化した。ビス－ｐＮＰＰおよびｐＮＰＰもＮＰＰ３の基質として試験した。ｐＨ８．９の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌおよび５ｍＭのビス－ｐＮＰＰまたはｐＮＰＰのいずれかの中で３７℃で２．５時間、ＮＰＰ３アイソフォームをインキュベートした。続いて、形成したｐＮＰを４０５ｎｍで比色測定で定量化した（Ｇｉｊｓｂｅｒｓ Ｒ１，Ａｏｋｉ Ｊ，Ａｒａｉ Ｈ，Ｂｏｌｌｅｎ Ｍ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００３ Ｍａｒ １３；５３８（１－３）：６０－４．）。生理的ｐＨで、ＮＰＰ３は、ＥＮＰＰ１と類似した、約２．５９（±０．０４）ｓ－１のｋｃａｔ値およびＫｍ（＜８μＭ）値を有する（ＷＯ２０１７／０８７９３６）。
ＨＰＬＣプロトコール
ＮＰＰ１によるＡＴＰ切断を測定するために、および生成物の同定のために使用するＨＰＬＣプロトコールを、文献（Ｓｔｏｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４６：１１８－１２４）から改変する。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣ１、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍＭ ＣａＣｌ２緩衝液中に様々な濃度のＡＴＰを含む反応を０．２～１μＭのＮＰＰ１を添加することによって開始し、この反応を当量の３Ｍギ酸または０．５Ｎ ＫＯＨによって様々な時点でクエンチし、氷酢酸によってｐＨ６に再酸性化する。クエンチした反応溶液を系統的に希釈し、これをＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ Ｍａｓｓ．）にロードし、２５４または２５９ｎｍのＵＶ吸光度によって基質および生成物をモニターする。０％～１０％（または２０％）のメタノール勾配を用いて、１５ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ６．０溶液を使用して、Ｃ１８、５ｕｍ ２５０×４．６ｍｍ ＨＰＬＣカラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）で、基質および生成物を分離する。生成物および基質をそれらの対応するピークの積分および式：
Figure 2022517435000002
 に従って定量化し、式中、［基質］は最初の基質濃度である。式で使用されるＡＭＰ、ＡＤＰおよびＡＴＰの消衰係数は１５．４ｍＭ－１ｃｍ’であった。２５４ｎｍでモニターする場合、反応と同じ日に実施される基質および生成物の標準物質を使用して、積分した生成物／基質ピーク面積を濃度に変換した。
「病的石灰化」：本明細書で使用する場合、本用語は、体の軟組織、分泌性および排出性導管における、それを硬化させるカルシウム塩の異常な沈着を指す。死にかけている組織および死んでいる組織で生じる異栄養性石灰化、ならびに細胞および組織の恒常性能力を超えてカルシウムの細胞外レベルを上昇させた転移性石灰化（高カルシウム血症）の２つの型がある。石灰化は、細胞ならびに細胞外基質成分、例えば、基底膜のコラーゲンおよび動脈壁の弾性線維を含み得る。石灰化する傾向がある組織のいくつかの例としては、胃粘膜－胃の内部上皮内層、腎臓および肺、角膜、全身の動脈および肺の静脈が挙げられる。
「病的骨化」：本明細書で使用する場合、本用語は、骨が、骨系にない組織および骨形成特性を通常顕在化しない結合組織に生じる病態を指す。骨化は、影響を受ける組織または臓器の性質に応じて３つの型に分類され、内軟骨性骨化は、軟骨に生じ、および軟骨に置き換わる骨化である。膜内骨化は、結合組織に生じ、結合組織に置き換わる、骨の骨化である。変形骨化、通常は軟らかい体構造における骨質の発生、従属栄養骨化とも呼ばれる。
ＮＰＰ１の「欠乏」は、対象が、血漿中に正常レベルの５％～１０％以下のＮＰＰ１しか有さない状態を指す。健康なヒト対象のＮＰＰ１の正常レベルは、およそ１０～３０ｎｇ／ｍｌの間である（Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００１ Ｆｅｂ；１５８（２）：５４３－５５４．）。
「低」レベルのＰＰｉは、対象が、正常レベルの２％～５％以下の血漿ピロリン酸（ＰＰｉ）しか有さない状態を指す。健康なヒト対象の血漿ＰＰｉの正常レベルは、およそ１．８～２．６μＭである（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．８（Ａｕｇｕｓｔ １９７９））。
「異所性石灰化」は、組織内のカルシウム塩の病的沈着または軟組織中の骨成長を特徴とする状態を指す。
「軟組織の異所性石灰化」は、軟組織に生じ、軟組織の硬化の喪失につながる、典型的にはリン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、シュウ酸カルシウムおよびリン酸八カルシウムから構成される、不適切なバイオミネラル化を指す。「動脈石灰化」は、動脈および心臓弁に生じ、動脈の硬化およびまたは狭小化につながる、異所性石灰化を指す。動脈の石灰化は、アテローム性動脈硬化性プラーク負荷および心筋梗塞のリスクの増大、末梢血管疾患における虚血性エピソードの増加ならびに血管形成術後の解離リスクの増大と関連する。
「静脈石灰化」は、静脈の弾性を低減させ、血流を制限し、次いで血圧の上昇および冠血管欠損につながり得る、静脈に生じる異所性石灰化を指す。
「血管石灰化」は、血管系におけるミネラルの病的な沈着を指す。これは、内膜石灰化および中膜石灰化を含めた様々な形態を有するが、心臓の弁にも見出され得る。血管石灰化は、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、ある特定の遺伝性状態および腎疾患、特にＣＫＤと関連する。血管石灰化を有する患者は、有害な心血管イベントに対するリスクがより高い。血管石灰化は、多種多様の患者に影響を及ぼす。特発性の乳児動脈石灰化は、新生児の動脈が石灰化する、血管石灰化のまれな形態である。
「脳石灰化」（ＢＣ）は、血管壁および実質組織のカルシウムおよび他のミネラルの沈着が生じ、ニューロン死および神経膠症につながる、非特異的神経病態を指す。脳石灰化は、ダウン症候群、レビー小体病、アルツハイマー病、パーキンソン病、血管性認知症、脳腫瘍および様々な内分泌学的状態を含めた様々な慢性および急性の脳障害と関連することが多い。
心臓組織の石灰化は、心臓の組織、例えば、大動脈組織および冠血管組織におけるカルシウム（おそらく、他のミネラルを含む）沈着物の蓄積を指す。
「慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）」は、本明細書で使用する場合、本用語は、健康に影響がある、３か月を超えて持続する腎臓の構造または機能の異常を指す。一般に、大抵の慢性腎臓疾患において、排出、内分泌および代謝の機能が同時に減退する。心血管疾患は、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）を有する患者の最も一般的な死因であり、血管石灰化は、心血管リスクの最も強い予測因子のうちの１つである。腎臓機能の低下とともに、血管石灰化の有病率が高まり、石灰化は、一般集団のものと比べて、ＣＫＤ患者で何年も早く生じる。血管石灰化を予防する、低減させる、および／または逆行させることによって、ＣＫＤを有する患者の生存時間を増加させることができる。
慢性腎臓疾患の臨床症状としては、そう痒、筋攣縮、悪心、食欲不振、足および足首の腫脹、不眠および努力性呼吸が挙げられる。慢性腎臓疾患は、治療せずに放置した場合、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）に進行する傾向がある。ＥＳＲＤの一般的な症状としては、排尿不能、疲労、倦怠感、体重減少、骨痛、皮膚の色の変化、挫傷の頻繁な形成ならびに手指、足指、手および足のような外側の四肢の浮腫が挙げられる。カルシフィラキシーまたは尿毒症性動脈石灰化（ｃａｌｃｉｆｉｃ ｕｒｅｍｉｃ ａｒｔｅｒｉｏｌｏｐａｔｈｙ）（ＣＵＡ）は、脂肪および皮膚の血管の内側にカルシウムを蓄積させる状態である。ＥＳＲＤを罹患する患者の亜集団は、カルシフィラキシーを発生する可能性もある。カルシフィラキシーの一般的な症状としては、皮膚の大きな紫色の網様のパターン、治らない黒褐色の痂皮をともなう開放創を作出する、潰瘍化する深く有痛性の塊、下肢または脂肪含量がより高い領域、例えば、大腿、乳房、臀部および腹部の皮膚病変が挙げられる。カルシフィラキシーを有する人は、血中カルシウム（高カルシウム血症）およびリン酸（高リン酸血症）が正常レベルよりも高い可能性がある。彼らはまた、副甲状腺機能亢進の症状を有し得る。副甲状腺機能亢進は、副甲状腺が過剰な副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を作る場合に生じる。血漿ピロリン酸（ＰＰｉ）レベルの低減は、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）と関連する血管石灰化にも存在する。
ＥＳＲＤと関連する血管石灰化は、脈圧を高める、高血圧症を引き起こすまたは悪化させる、ならびに心筋梗塞および卒中を誘導するかまたは強めることによって、不良転帰に寄与する。ＥＳＲＤを有する大抵の患者は腎不全で死なないが、ＥＳＲＤの心血管合併症で死に、透析中の、ＥＳＲＤを有する多くの非常に若い患者は、冠動脈の石灰化を有することに留意することが重要である。ＣＫＤと関連する血管石灰化の組織学的サブタイプはメンケベルク硬化症として知られ、これは、中膜血管壁（ｍｅｄｉａｌ ｖａｓｃｕｌａｒ ｗａｌｌ）の筋層にカルシウムの沈着が見られる血管硬化の形態である。石灰化のこの形態は、アテローム性動脈硬化症で一般に観察される内膜または新内膜血管壁の石灰化と組織学的に異なるが、ヒトＣＫＤ患者および本明細書に記載の疾患のげっ歯類モデルで観察される血管石灰化と同一である。
「乳児の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）」（ＩＡＣＩとしても知られる）は、本明細書で使用する場合、出生前または生後数ヶ月以内に明らかになる、循環系に影響を及ぼす障害を指す。これは、心臓から体のその他の部分に血液を運ぶ血管（動脈）の壁における、ミネラルカルシウムの異常な蓄積（石灰化）を特徴とする。石灰化は、動脈壁の内層（内膜）の肥厚とともに生じることが多い。これらの変化は、動脈の狭小化（狭窄）および硬直につながり、これは、血液を送り出すために心臓をより激しく働かせることになる。その結果、呼吸困難、四肢における体液の蓄積（浮腫）、皮膚または唇の青みを帯びた様子（チアノーゼ）、重度の高血圧（高血圧症）および肥大した心臓（心肥大）を含めた徴候および症状をともなって、罹患者において心不全が発生する可能性がある。ＧＡＣＩを有する人々はまた、他の臓器および組織、特に関節の周囲に石灰化を有し得る。さらに、彼らは、難聴またはくる病と称される骨の軟化および弱化を有し得る。
一般的な動脈石灰化（ＧＡＣＩ）または特発性の乳児動脈石灰化（ＩＩＡＣ）は、心臓から体のその他の部分に血液を運ぶ血管（動脈）の壁における、ミネラルカルシウムの異常な蓄積（石灰化）を特徴とする。石灰化は、動脈壁の内層（内膜）の肥厚とともに生じることが多い。これらの変化は、動脈の狭小化（狭窄）および硬直につながり、これは、血液を送り出すために心臓をより激しく働かせることになる。その結果、呼吸困難、四肢における体液の蓄積（浮腫）、皮膚または唇の青みを帯びた様子（チアノーゼ）、重度の高血圧（高血圧症）および肥大した心臓（心肥大）を含めた徴候および症状をともなって、罹患者において心不全が発生する可能性がある。
「動脈石灰化」または「血管石灰化」または「動脈の硬化」は、本明細書で使用する場合、本用語は、筋動脈壁の肥厚および弾性の喪失を特徴とするプロセスを指す。肥厚および弾性の喪失は、２つの異なる部位、すなわち、血管構造の内膜および中膜層において生じる（中膜血管石灰化）。内膜石灰化はアテローム性動脈硬化性プラークと関連し、中膜石灰化は血管硬直および動脈硬化症を特徴とする。これは、動脈の弾性を低減させ、心血管系の血行動態の機能障害が理由で、罹患率および死亡率の傾向を高める。
「ミネラル骨障害（ＭＢＤ）」は、本明細書で使用する場合、本用語は、異常なホルモンレベルを特徴とする障害が人の血液中のカルシウムおよびリンレベルを不安定にすることを指す。ミネラルおよび骨障害は、一般に、ＣＫＤを有する人々で生じ、透析を受けている腎不全を有する大抵の人々に影響を及ぼす。
骨減少症は、骨の弱化および骨折のリスクの増大につながる骨密度の低下を特徴とする、骨の状態である。骨軟化症は、新しく形成される骨のミネラル化の低下を特徴とする骨障害である。骨軟化症は、重度のビタミンＤ欠乏（これは、栄養的なものであり得るか、または遺伝性症候群によって引き起こされ得る）によって、および非常に低い血中リン酸レベルを引き起こす状態によって、引き起こされる。骨軟化症と骨減少症の両方とも骨を折るリスクを高める。骨軟化症の症状としては、骨痛および筋力低下、骨圧痛、歩行困難および筋痙攣が挙げられる。
「加齢性骨減少症」は、本明細書で使用する場合、骨ミネラル量が正常より低い状態を指す。一般に、骨減少症を有する患者は、－１．０～－２．５の骨ミネラル量Ｔ－スコアを有する。骨減少症は、治療せずに放置した場合、骨が脆くなり、破断する傾向が極度にある骨粗鬆症に進行する。
「後縦靱帯骨化症（ＯＰＬＬ）」は、本明細書で使用する場合、本用語は、後縦靱帯の異所性石灰化をもたらす骨化過剰（過度の骨成長）状態を指す。後縦靱帯は、脊柱の骨を結合し、安定化する。肥厚化または石灰化靱帯は脊髄を圧迫し、ミエロパシーをもたらす可能性がある。ミエロパシーの症状としては、歩行困難ならびに腸および膀胱の制御の困難が挙げられる。ＯＰＬＬはまた、神経根症または神経根の圧迫を引き起こし得る。頸部神経根症の症状としては、首、肩、腕または手の疼痛、刺痛または痺れが挙げられる。
ＯＰＬＬによって引き起こされる臨床症状および徴候は、以下のように分類される：（１）上肢および下肢の運動および感覚障害を有するミエロパシーまたは脊髄病変、痙縮および膀胱機能不全；（２）上肢の疼痛および感覚障害を有する頸部神経根症；ならびに（３）首の周囲に疼痛および硬直を有する、軸の違和感（ａｘｉａｌ ｄｉｓｃｏｍｆｏｒｔ）。初期のＯＰＬＬの最も一般的な症状としては、手の異常感覚およびピリピリ感、ならびにぎこちなさが挙げられる。神経障害の進行とともに、下肢の症状、例えば歩行障害が現れる可能性がある。ＯＰＬＬは側面単純Ｘ線写真で検出され、頸部ＯＰＬＬの診断および形態学的な詳細は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）およびコンピュータ断層撮影（ＣＴ）によって明確に示されている。
「弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）」は、本明細書で使用する場合、本用語は、弾性線維におけるカルシウムおよび他のミネラルの沈着物の蓄積（ミネラル化）を特徴とする進行性障害を指す。弾性線維は、体全体にわたって構造に強度および可動性を与える結合組織の成分である。ＰＸＥでは、ミネラル化は、皮膚、眼および血管の、ならびにそれほど多くはないが消化管などの他の領域の弾性線維に影響を及ぼし得る。ＰＸＥを有する人々は、首、腋の下および関節が曲がるときに触れる皮膚の他の領域に丘疹と呼ばれる黄色がかった隆起を有し得る。心臓から体のその他の部分に血液を運ぶ血管（動脈）のミネラル化は、ＰＸＥの他の徴候および症状を引き起こし得る。例えば、この状態を有する人々は、動脈の狭小化（動脈硬化症）または腕および足への血流の低下による運動中の筋痙攣および疼痛を特徴とする跛行と呼ばれる状態を発生する可能性がある。
グレンブラッド－ストランドバーグ症候群としても知られる弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）は、いくつかの組織において弾性線維のフラグメント化およびミネラル化を引き起こす遺伝性疾患である。最も一般的な問題は、皮膚および眼に生じ、その後、早発性アテローム性動脈硬化症の形態で血管に生じる。ＰＸＥは、第１６染色体の短腕（１６ｐ１３．１）にあるＡＢＣＣ６遺伝子の常染色体劣性突然変異によって引き起こされる。ある場合には、乳児の一部は、ＧＡＣＩを切り抜けて生き延び、成長して成人になると、最終的に弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）を発生する。ＰＸＥは、結合組織の成分である弾性線維中のカルシウムおよび他のミネラル（ミネラル化）の蓄積を特徴とする。結合組織は、体全体にわたって構造に強度および可動性を与える。ＧＡＣＩにも生じるＰＸＥに特有の特色としては、腋の下および関節が曲がるときに触れる皮膚の他の領域（屈筋領域）の丘疹と呼ばれる黄色がかった隆起；動脈狭窄、および眼検査中に検出される、眼の後ろ側の組織に影響を及ぼす網膜色素線条と呼ばれる異常（網膜出血）が挙げられる。
「末期腎疾患（ＥＳＲＤ）：本明細書で使用する場合、本用語は、患者の腎臓がもはや機能的でない、慢性腎臓疾患の進行した段階を指す。一般的な症状としては、貧血（低血中鉄）と関連する疲労、食欲減退、悪心、嘔吐、カリウムの上昇を含めた異常な臨床検査値、骨の健康に関係しているホルモンの異常、リンの上昇および／またはカルシウムの低下、高血圧（高血圧症）、手／足／眼／腰（仙骨）の腫脹ならびに息切れが挙げられる。
「尿毒症性動脈石灰化（ＣＵＡ）」または「カルシフィラキシー」は、本明細書で使用する場合、腎疾患を有する患者、特に末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を有する患者に見られる、高い罹患率および死亡率をともなう状態を指す。これは、過度の石灰化によって引き起こされる血流の低減が理由で血餅および皮膚細胞死につながる、脂肪組織および皮膚のより深層の中に位置する小血管の石灰化を特徴とする。
「低リン血症性くる病」は、本明細書で使用する場合、血液中の低レベルのリン酸が理由で骨が柔らかくなり、容易に曲がる障害を指す。症状は、通常、幼児期前期に始まり、重症度が足の内反、骨の変形；骨痛；関節痛；不十分な骨成長；および低身長に及び得る。
「遺伝性低リン血症性くる病」は、本明細書で使用する場合、血液中の低レベルのリン酸に関係している障害（低リン酸血症）を指す。リン酸は、骨および歯の正常な形成に必須なミネラルである。最も一般的には、これは、ＰＨＥＸ遺伝子の突然変異によって引き起こされる。この状態に関与する他の遺伝子としては、ＣＬＣＮ５、ＤＭＰ１、ＥＮＰＰ１、ＦＧＦ２３およびＳＬＣ３４Ａ３遺伝子が挙げられる。遺伝性低リン血症性くる病の他の徴候および症状としては、頭蓋骨の早発性融合（頭蓋縫合早期癒合症）および歯の異常を挙げることができる。この障害は、関節に付着している靱帯および腱の異常な骨成長（腱付着部症）も引き起こし得る。成人では、低リン酸血症は、骨軟化症として知られる、骨の軟化を特徴とする。この障害の別のまれな型は、高カルシウム尿症をともなう遺伝性低リン血症性くる病（ＨＨＲＨ）として知られ、低リン酸血症に加えて、この状態は、尿中の高レベルのカルシウムの排出（高カルシウム尿症）を特徴とする。
「Ｘ連鎖性低リン酸血症（ＸＬＨ）」は、本明細書で使用する場合、Ｘ連鎖優性低リン血症性くる病またはＸ連鎖ビタミンＤ抵抗性くる病とも呼ばれる、用語、Ｘ連鎖性低リン酸血症（ＸＬＨ）は、ビタミンＤ補充がこれを治癒させないという点においてくる病の大抵の症例と異なる、くる病（または骨軟化症）のＸ連鎖優性型である。これは、低身長および内反膝（がに股）を含めた骨変形を引き起こし得る。これは、ＰＨＥＸ遺伝子の突然変異配列（Ｘｐ．２２）およびその後のＰＨＥＸタンパク質の不活性と関連する。
「常染色体劣性低リン酸血症くる病２型（ＡＲＨＲ２）」は、本明細書で使用する場合、本用語は、くる病および／または骨軟化症および成長の遅さを特徴とする遺伝性腎リン酸消耗障害低リン酸血症を指す。常染色体劣性低リン血症性くる病２型（ＡＲＨＲ２）は、ＥＮＰＰ１遺伝子のホモ接合性機能喪失型突然変異によって引き起こされる。
「常染色体優性低リン血症性くる病（ＡＤＨＲ）」は、本明細書で使用する場合、尿中のリン酸の過度の喪失が、形成が不十分な骨（くる病）、骨痛および歯膿瘍につながる、まれな遺伝性疾患を指す。ＡＤＨＲは、維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）の突然変異によって引き起こされる。ＡＤＨＲは、骨のミネラル化の障害、くる病および／または骨軟化症、カルシトリオール（１，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３）のレベルの抑制、腎リン酸塩消耗および低血清リン酸を特徴とする。ＦＧＦ２３の突然変異は、タンパク質がより安定になり、プロテアーゼによって切断することが不可能になり、その結果、ＦＧＦ２３の生物活性が増強される。ＦＧＦ２３突然変異体の増強された活性は、近位腎尿細管細胞の先端面でナトリウム・リン酸共輸送体、ＮＰＴ２ａおよびＮＰＴ２ｃの発現を低減し、腎リン酸塩消耗をもたらす。
低リン血症性くる病（以前はビタミンＤ抵抗性くる病呼ばれていた）は、血液中の低レベルのリン酸により、骨が痛いほど柔らかくなり、かつ容易に曲がるようになる障害である。症状としては、足の内反および他の骨の変形；骨痛；関節痛；不十分な骨成長；および低身長を挙げることができる。罹患した赤ん坊の中には、頭蓋骨の間の空間が早く閉じすぎて、頭蓋縫合早期癒合症に至るものもいる。大抵の患者は、カルシウム－リン酸代謝の異常、歯エナメル質の異常、歯の萌出遅延および細長い頭（長頭症）を示す。
本明細書で互換的に使用される、用語「アデノ随伴ウイルスベクター」、「ＡＡＶベクター」、「アデノ随伴ウイルス」、「ＡＡＶウイルス」、「ＡＡＶビリオン」、「ＡＡＶウイルス粒子」および「ＡＡＶ粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（好ましくは、特定のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質のすべて）およびカプシドで包まれた組換えウイルスゲノムから構成されるウイルス粒子を指す。粒子は、ヒトＥＮＰＰ１もしくはヒトＥＮＰＰ３またはそれらの機能的に同等の変異体およびＡＡＶ逆方向末端反復に隣接するプロモーターを少なくとも含む転写制御領域をコードする配列を含む異種性ポリヌクレオチドを有する組換えウイルスゲノムを含む。粒子は、典型的には、「ＡＡＶベクター粒子」または「ＡＡＶベクター」と称される。
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は、それに連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。いくつかの実施形態では、ベクターはプラスミド、すなわち、さらなるＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスゲノム中にさらなるヌクレオチド配列がライゲーションされ得るウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、導入される宿主細胞中で自律複製することができる（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他の実施形態では、ベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）が、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクター（発現ベクター）は、それに作動可能に連結された遺伝子の発現を導くことができる。
本明細書で使用する場合、用語「組換え宿主細胞」（または、単に「宿主細胞」）は、本明細書で使用する場合、外来性の核酸および／または組換えベクターが導入された細胞を意味する。「組換え宿主細胞」および「宿主細胞」は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代も意味することを理解されたい。突然変異または環境上の影響のいずれかにより、ある特定の改変が後の世代で生じ得るので、そのような後代は、実際に、親細胞と同一でない可能性があるが、本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。
用語「組換えウイルスゲノム」は、本明細書で使用する場合、少なくとも１つの外来の発現カセットポリヌクレオチドが天然に存在するＡＡＶゲノムに挿入されるＡＡＶゲノムを指す。本発明によるＡＡＶのゲノムは、典型的にはシス作用性５’および３’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）ならびに発現カセットを含む。
用語「発現カセット」は、本明細書で使用する場合、標的細胞において特定の核酸の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有する、組換えで、または合成的に生成された核酸コンストラクトを指す。本発明によるＡＡＶベクターの組換えウイルスゲノムの発現カセットは、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３またはそれらの機能的に同等の変異体をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している転写制御領域を含む。
用語「転写制御領域」は、本明細書で使用する場合、１つまたは複数の遺伝子の発現を調節することができる核酸フラグメントを指す。本発明による転写制御領域は、プロモーターおよび場合によりエンハンサーを含む。
用語「プロモーター」は、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド配列（複数可）の上流に位置する、１つまたは複数のポリヌクレオチドの転写を制御するように機能する核酸フラグメントであって、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する結合部位、転写開始部位、ならびに任意の他のＤＮＡ配列、例えば、限定されないが、転写因子結合部位、リプレッサー、およびアクチベータータンパク質結合部位、ならびにプロモーターからの転写の量を調節するように直接的または間接的に作用することが当技術分野で既知のヌクレオチドの任意の他の配列の存在によって、構造的に特定される核酸フラグメントを指す。誘導性プロモーター、構成的プロモーターおよび組織特異的プロモーターを含めた任意の種類のプロモーターを本発明で使用することができる。
用語「エンハンサー」は、本明細書で使用する場合、遺伝子転写を増大するために転写因子が結合するＤＮＡ配列エレメントを指す。エンハンサーの例は、限定されないが、ＲＳＶエンハンサー、ＣＭＶエンハンサー、ＨＣＲエンハンサーなどであり得る。別の実施形態では、エンハンサーは肝臓特異的エンハンサー、より好ましくは肝臓制御領域エンハンサー（ＨＣＲ）である。
用語「作動可能に連結している」は、本明細書で使用する場合、目的のポリヌクレオチドに対するプロモーター配列の機能的な関係および位置を指す（例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結している）。一般に、作動可能に連結しているプロモーターは目的の配列に近接している。しかし、エンハンサーは、目的の配列の発現を制御するためにそれに近接している必要がない。別の実施形態では、プロモーターおよびＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３またはそれらの機能的に同等の変異体をコードするヌクレオチド配列。
用語「治療有効量」は、所望の生物学的結果を提供するための、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードするウイルスベクターの無毒であるが十分な量を指す。その結果は、疾患の徴候、症状もしくは原因の低減および／もしくは軽減、または生物システムの任意の他の所望の変化であり得る。例えば、本発明によるＡＡＶベクター治療有効量の治療有効量は生成するのに十分である量である。
用語「Ｃａｐタンパク質」は、本明細書で使用する場合、天然ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質（例えば、ＶＰ、ＶＰ２、ＶＰ３）の少なくとも１つの機能活性を有するポリペプチドを指す。Ｃａｐタンパク質の機能活性の例としては、カプシドの形成を誘導する、一本鎖ＤＮＡの蓄積を容易にする、カプシド中へのＡＡＶ ＤＮＡのパッケージング（すなわち、カプシド形成）を容易にする、細胞受容体に結合する、および宿主細胞へのビリオンの侵入を容易にする能力が挙げられる。原則として、任意のＣａｐタンパク質を本発明において使用することができる。
用語「カプシド」は、本明細書で使用する場合、ウイルスゲノムがパッケージされる構造体を指す。カプシドは、タンパク質でできているいくつかのオリゴマー構造サブユニットからなる。例えば、ＡＡＶは、３種のカプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の相互作用によって形成される正２０面体のカプシドを有する。
用語「Ｒｅｐタンパク質」は、本明細書で使用する場合、天然ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ４０、５２、６８、７８）の少なくとも１つの機能活性を有するポリペプチドを指す。Ｒｅｐタンパク質の「機能活性」は、タンパク質の生理機能と関連する任意の活性、例えば、ＤＮＡ複製のＡＡＶ開始点の認識、結合およびニッキングを通してＤＮＡの複製を容易にすること、ならびにＤＮＡヘリカーゼ活性である。さらな機能としては、ＡＡＶ（または他の異種性）プロモーターからの転写のモジュレーションおよび宿主染色体へのＡＡＶ ＤＮＡの部位特異的組み込みが挙げられる。特定の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶｒｈ１０に；より好ましくは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶｒｈ１０からなる群から選択されるＡＡＶ血清型に由来する。
表現「ＡＡＶが複製を依存しているウイルスタンパク質」は、本明細書で使用する場合、ＡＡＶが複製を依存している機能（すなわち、「ヘルパー機能」）を果たすポリペプチドを指す。ヘルパー機能としては、限定されないが、ＡＡＶ遺伝子の転写の活性化、段階特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡの複製、ｃａｐ発現産物の合成およびＡＡＶカプシドのアセンブリーに関与する部分を含めた、ＡＡＶ複製に必要とされるそうした機能が挙げられる。ウイルスベースのアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）およびワクシニアウイルスなどの既知のヘルパーウイルスのいずれかに由来する。ヘルパー機能としては、限定されないが、アデノウイルスのＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡおよびＥ４またはヘルペスウイルスのＵＬ５、ＵＬＢ、ＵＬ５２およびＵＬ２９、ならびにヘルペスウイルスのポリメラーゼが挙げられる。別の実施形態では、ＡＡＶが複製を依存しているタンパク質はアデノウイルスに由来する。
用語「アデノ随伴ウイルスＩＴＲ」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、本明細書で使用する場合、アデノ随伴ウイルスのゲノムのＤＮＡ鎖の両端に存在する逆方向末端反復を指す。ＩＴＲ配列はＡＡＶゲノムの効率的な増殖に必要とされる。これらの配列の別の特性は、ヘアピンを形成するその能力である。この特徴は、第２のＤＮＡ鎖のプライマーゼ非依存性合成を可能にするその自己プライミングに寄与する。これらのＩＴＲ配列を改変する手順は当技術分野で既知である（Ｂｒｏｗｎ Ｔ，“Ｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＧＢ，１９９５；Ｗａｔｓｏｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ”，２ｎｄ Ｅｄ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳ，１９９２；Ａｌｂｅｒｔｓ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ”，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳ，２００８；Ｉｎｎｉｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳ，１９９０；およびＳｃｈｌｅｅｆ Ｍ，Ｅｄ．，“Ｐｌａｓｍｉｄ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ”，Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ， Ｄｅｌ．，２００１）。
用語「組織特異的」プロモーターは、特定の型の分化細胞または組織でのみ活性である。典型的には、組織特異的プロモーターの下流遺伝子は、任意の他の組織よりも、それが特異的である組織（複数可）において、はるかに高い程度まで活性があるものである。この場合、それが特異的である組織（複数可）以外の任意の組織において、プロモーターの活性がほとんどまたは実質的にない可能性がある。
用語「骨格筋特異的プロモーター」は、本明細書で使用する場合、プロモーターとして働き（すなわち、プロモーターに作動可能に連結している選択された核酸配列の発現を調節する）、骨格筋の特異的な組織細胞において選択された核酸配列の発現を促進する、核酸配列を指す。骨格筋特異的プロモーターの例としては、限定されないが、ミオシン軽鎖プロモーター（ＭＬＣ）および筋クレアチンキナーゼプロモーター（ＭＣＫ）が挙げられる。
用語「肝臓特異的プロモーター」は、本明細書で使用する場合、プロモーターとして働き（すなわち、プロモーターに作動可能に連結している選択された核酸配列の発現を調節する）、肝実質細胞において選択された核酸配列の発現を促進する、核酸配列を指す。典型的には、肝臓特異的プロモーターは、体内の任意の他の組織におけるその活性と比較して、肝臓でより活性である。肝臓特異的プロモーターは、構成的または誘導性であり得る。適切な肝臓特異的プロモーターとしては、限定されないが、［アルファ］１－抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、甲状腺ホルモン結合グロブリンプロモーター、アルファフェトプロテインプロモーター、アルコール脱水素酵素プロモーター、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）プロモーター、ＨＢＶ基本コアプロモーター（ＢＣＰ）およびＰｒｅＳ２プロモーター、アルブミンプロモーター、－４６０～７３ｂｐホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、肝臓制御領域（ＨＣＲ）－ＡｐｏＣＩＩハイブリッドプロモーター、ＨＣＲ－ｈＡＡＴハイブリッドプロモーター、マウスアルブミン遺伝子エンハンサー（Ｅａｌｂ）エレメントと組み合わされたＡＡＴプロモーター、アポリポタンパク質Ｅプロモーター、低密度リポタンパク質プロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター、レシチン－コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）プロモーター、アポリポタンパク質Ｈ（ＡｐｏＨ）プロモーター、トランスフェリンプロモーター、トランスチレチンプロモーター、アルファ－フィブリノーゲンおよびベータ－フィブリノーゲンプロモーター、アルファ１－抗キモトリプシンプロモーター、アルファ２－ＨＳ糖タンパク質プロモーター、ハプトグロビンプロモーター、セルロプラスミンプロモーター、プラスミノーゲンプロモーター、補体タンパク質（ＣＩｑ、ＣＩｒ、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ９、補体因子ＩおよびＨ因子）のプロモーター、Ｃ３補体活性化因子ならびに［アルファ］－酸性糖タンパク質プロモーターが挙げられる。さらなる組織特異的プロモーターは、組織特異的プロモーターデータベース、ＴｉＰｒｏＤ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｊ４：Ｄ１０４～Ｄ１０７（２００６））に見出すことができる。別の実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、アルブミンプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーターおよびアルファ１－アンチトリプシンプロモーターからなる群から選択され、より好ましくはアルファ１－アンチトリプシンプロモーターであり、さらにより好ましくはヒトアルファ１－アンチトリプシンプロモーターである。
用語「誘導性プロモーター」は、本明細書で使用する場合、例えば化学的誘導物質の適用によって生理的または発生的に調節されるプロモーターを指す。例えば、これは、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ミフェプリストン（ＲＵ－４８６）誘導性プロモーターなどであり得る。
用語「構成的プロモーター」は、本明細書で使用する場合、細胞環境条件をほとんどまたは全く考慮することなく、生物のすべての細胞で、または大抵の発生段階の間、その活性が比較的一定のレベルで維持されるプロモーターを指す。別の実施形態では、転写制御領域はＥＮＰＰ１の構成的発現を可能にする。構成的プロモーターの例としては、限定されないが、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合により、ＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合により、ＣＭＶエンハンサーを有する）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１ａプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９８５；４１：５２１－５３０）が挙げられる。好ましくは、構成的プロモーターは、肝臓におけるＥＮＰＰ１の発現に適しており、構成的プロモーターとしては、限定されないが、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）のプロモーター、アデノシンデアミナーゼのプロモーター、ピルビン酸キナーゼのプロモーター、β－アクチンのプロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチン（Ｕｂｃ）プロモーター、アルブミンプロモーターおよび他の構成的プロモーターが挙げられる。細胞で構成的に機能する例示的ウイルスプロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４－３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７－７９７）またはヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１－１４４５）が挙げられる。
用語「ポリアデニル化シグナル」は、本明細書で使用する場合、ｍＲＮＡの３’末端へのポリアデニンストレッチの付着を媒介する核酸配列に関する。適切なポリアデニル化シグナルとしては、限定されないが、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、ＨＳＶチミジンキナーゼポリアデニル化シグナル、プロタミン遺伝子ポリアデニル化シグナル、アデノウイルス５ ＥＩｂポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル、ヒト変異体成長ホルモンポリアデニル化シグナルなどが挙げられる。
用語「ヌクレオチドまたは核酸配列」は、「ポリヌクレオチド」と互換的に本明細書で使用され、任意の長さのヌクレオチドの任意のポリマー形態に関する。前記ヌクレオチド配列は、シグナルペプチドおよびＥＮＰＰ１タンパク質またはそれらの機能的に同等の変異体をコードする。
用語「シグナルペプチド」は、本明細書で使用する場合、タンパク質翻訳の間に、目的の新生タンパク質のアミノ末端に結合されるアミノ酸残基の配列（１０～３０残基の長さにわたる）を指す。シグナルペプチドはシグナル認識粒子（ＳＲＰ）によって認識され、小胞体での輸送後にシグナルペプチダーゼによって切断される（Ｌｏｄｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）。
用語「対象」は、本明細書で使用する場合、個々の哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーおよび他の類人猿およびサルの種）、家畜（例えば、鳥、魚、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）、家畜哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）、または実験動物（例えばげっ歯、例えば、マウス、ラットおよびモルモット）を指す。本用語は、任意の年齢または性別の対象を含む。別の実施形態では、対象は哺乳動物、好ましくはヒトである。
疾患または障害は、疾患もしくは障害の症状の重症度、そのような症状を患者が経験する頻度、または両方が低減する場合に、「軽減される」。
本明細書で使用する場合、用語「変化」、「欠損」、「変異」または「突然変異」は、ミスセンスおよびナンセンス突然変異、挿入、欠失、フレームシフトならびに早期終結を含めた、それがコードするポリペプチドの機能、活性、発現（転写もしくは翻訳）またはコンフォメーションに影響を及ぼす、細胞における遺伝子の突然変異を指す。
「疾患」は、動物が恒常性を維持することができず、疾患が改善されない場合、動物の健康は悪化し続ける、動物の健康状態である。
動物の「障害」は、動物が恒常性を維持することができるが、動物の健康状態が、障害がないであろう場合よりも良好ではない、健康状態である。治療せずに放置した場合、障害は、動物の健康状態のさらなる低下を必ずしも引き起こすとは限らない。
本明細書で使用する場合、用語「免疫応答」または「免疫反応」は、病原性生物中の抗原に対する、または外来性タンパク質の導入または発現に対する、宿主の免疫系を指す。免疫応答は、一般に体液性および局部的であり、Ｂ細胞によって産生された抗体は、抗原－抗体複合体中で抗原と結合して、抗原を不活化させるかまたは中和する。免疫応答は、ヒトタンパク質がマウスモデル系に注射される場合に観察されることが多い。一般に、マウスモデル系は、より良い生存率を確実にするために、外来抗原の導入より前に免疫サプレッサー注射することによって、免疫寛容にさせられる。
本明細書で使用する場合、用語「免疫抑制」は、外来性タンパク質などの外来抗原、臓器移植片、骨髄および組織移植に対する免疫寛容を助長するための、免疫抑制薬を使用した、宿主免疫系の活性化または有効性の計画的な低減である。免疫抑制薬の非限定例としては、抗ＣＤ４（ＧＫ１．５）抗体、シクロホスファミド、アザチオプリン（イムラン）、ミコフェノール酸モフェチル（セルセプト）、シクロスポリン（ネオーラル、サンディミュン、ゲングラフ（Ｇｅｎｇｒａｆ））、メトトレキサート（リウマトレックス）、レフルノミド（アラバ）、シクロホスファミド（シトキサン）およびクロラムブシル（ロイケラン）が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「ＥＮＰＰ」または「ＮＰＰ」は、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼを指す。
本明細書で使用する場合、用語「ＥＮＰＰ１タンパク質」または「ＥＮＰＰ１ポリペプチド」は、ＥＮＰＰ１遺伝子にコードされるエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１タンパク質を指す。コードされるタンパク質はＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、ヌクレオチドとヌクレオチド糖のホスホジエステル結合およびヌクレオチドとヌクレオチド糖のピロリン酸結合を含めた様々な基質を切断する。ＥＮＰＰ１タンパク質は膜貫通ドメインおよび可溶性細胞外ドメインを有する。細胞外ドメインは、ソマトメジンＢドメイン、触媒ドメインおよびヌクレアーゼドメインにさらに細分される。野生型ＥＮＰＰ１の配列および構造は、Ｂｒａｄｄｏｃｋらに対するＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１４／１２６９６５号に詳細に記載されており、これは、参照により完全に本明細書に組み込まれる。
哺乳動物のＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３ポリペプチド、それらの突然変異体または突然変異フラグメントは、国際ＰＣＴ出願公開第ＷＯ／２０１４／１２６９６５号－Ｂｒａｄｄｏｃｋら、第ＷＯ／２０１６／１８７４０８号－Ｂｒａｄｄｏｃｋら、第ＷＯ／２０１７／０８７９３６号－Ｂｒａｄｄｏｃｋら、および第ＷＯ２０１８／０２７０２４号－Ｂｒａｄｄｏｃｋらに以前に開示されており、それらすべては参照により完全に本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用する場合、用語「ＥＮＰＰ３タンパク質」または「ＥＮＰＰ３ポリペプチド」は、ＥＮＰＰ３遺伝子にコードされるエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３タンパク質を指す。コードされるタンパク質はＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、ヌクレオチドとヌクレオチド糖のホスホジエステル結合およびヌクレオチドとヌクレオチド糖のピロリン酸結合を含めた様々な基質を切断する。ＥＮＰＰ３タンパク質は膜貫通ドメインおよび可溶性細胞外ドメインを有する。野生型ＥＮＰＰ３の配列および構造はＢｒａｄｄｏｃｋらに対するＰＣＴ出願公開第ＷＯ／２０１７／０８７９３６号に詳細に記載されており、これは、参照により完全に本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用する場合、用語「ＥＮＰＰ１前駆体タンパク質」は、ＥＮＰＰ１のＮ末端にそのシグナルペプチド配列を有するＥＮＰＰ１を指す。タンパク質分解の際に、ＥＮＰＰ１からシグナル配列が切断されて、ＥＮＰＰ１タンパク質がもたらされる。本発明内で有用なシグナルペプチド配列としては、限定されないが、アルブミンシグナル配列、アズロシジンシグナル配列、ＥＮＰＰ１シグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ２シグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ７シグナルペプチド配列および／またはＥＮＰＰ５シグナルペプチド配列が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「ＥＮＰＰ３前駆体タンパク質」は、ＥＮＰＰ３のＮ末端にそのシグナルペプチド配列を有するＥＮＰＰ３を指す。タンパク質分解の際に、ＥＮＰＰ３からシグナル配列が切断されて、ＥＮＰＰ３タンパク質がもたらされる。本発明内で有用なシグナルペプチド配列としては、限定されないが、アルブミンシグナルペプチド配列、アズロシジンシグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ１シグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ２シグナルペプチド配列、ＥＮＰＰ７シグナルペプチド配列および／またはＥＮＰＰ５シグナルペプチド配列が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「アズロシジンシグナルペプチド配列」は、ヒトアズロシジンに由来するシグナルペプチドを指す。カチオン性抗菌タンパク質ＣＡＰ３７またはヘパリン結合タンパク質（ＨＢＰ）としても知られるアズロシジンは、ヒトにおいて、ＡＺＵ１遺伝子にコードされるタンパク質である。アズロシンシグナルペプチド（ＭＴＲＬＴＶＬＡＬＬＡＧＬＬＡＳＳＲＡ）をコードするヌクレオチド配列は、コードされる場合にＥＮＰＰ１前駆体タンパク質またはＥＮＰＰ３前駆体タンパク質を生成する、ＮＰＰ１またはＮＰＰ３遺伝子のヌクレオチド配列と融合される。（Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＣＨＯ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ，Ｋｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２０１３ Ａｐｒ；１１０（４）：１１６４－７３）。
本明細書で使用する場合、用語「ＥＮＰＰ１－Ｆｃコンストラクト」は、ＩｇＧ分子（好ましくは、ヒトＩｇＧ）のＦｃＲ結合ドメインに組換えで融合しているおよび／または化学的にコンジュゲートしている（共有結合性コンジュゲーションと非共有結合性コンジュゲーションの両方を含める）ＥＮＰＰ１を指す。ある種の実施形態では、ＥＮＰＰ１のＣ末端がＦｃＲ結合ドメインのＮ末端に融合またはコンジュゲートしている。
本明細書で使用する場合、用語「ＥＮＰＰ３－Ｆｃコンストラクト」は、ＩｇＧ分子（好ましくは、ヒトＩｇＧ）のＦｃＲ結合ドメインに組換えで融合しているおよび／または化学的にコンジュゲートしている（共有結合性コンジュゲーションと非共有結合性コンジュゲーションの両方を含める）ＥＮＰＰ３を指す。ある種の実施形態では、ＥＮＰＰ１のＣ末端がＦｃＲ結合ドメインのＮ末端に融合またはコンジュゲートしている。
本明細書で使用する場合、用語「Ｆｃ」は、ヒトＩｇＧ（免疫グロブリン）Ｆｃドメインを指す。ＩｇＧのサブタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４はＦｃドメインとしての使用が企図される。
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ領域またはＦｃポリペプチド」は、ＩｇＧ分子のパパイン消化によって得られる結晶性フラグメントと関連がある、ＩｇＧ分子の部分である。Ｆｃ領域は、ジスルフィド結合によって連結している、ＩｇＧ分子の２つの重鎖のＣ末端半分を含む。これは、抗原結合活性を有さないが、炭水化物部分ならびに補体およびＦｃ受容体、例えば、ＦｃＲｎ受容体に対する結合部位を含む。Ｆｃフラグメントは、完全な第２の定常ドメインＣＨ２（Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って、ヒトＩｇＧ１の残基２３１～３４０）および第３の定常ドメインＣＨ３（残基３４１～４４７）を含む。用語「ＩｇＧヒンジ－Ｆｃ領域」または「ヒンジ－Ｆｃフラグメント」は、Ｆｃ領域（残基２３１～４４７）およびＦｃ領域のＮ末端から伸びるヒンジ領域（残基２１６～２３０）からなるＩｇＧ分子の領域を指す。用語「定常ドメイン」は、免疫グロブリンの他の部分、すなわち、抗原結合部位を含む可変ドメインと比較して、より保存されたアミノ酸配列を有する、免疫グロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインならびに軽鎖のＣＨＬドメインを含む。
本明細書で使用する場合、核酸に適用される用語「フラグメント」は、より大きな核酸の部分配列を指す。核酸の「フラグメント」は、少なくとも約１５、５０～１００、１００～５００、５００～１０００、１０００～１５００ヌクレオチド、１５００～２５００または２５００ヌクレオチド（およびその間の任意の整数値）であり得る。本明細書で使用する場合、タンパク質またはペプチドに適用される用語「フラグメント」は、より大きなタンパク質またはペプチドの部分配列を指し、少なくとも約２０、５０、１００、２００、３００または４００アミノ酸の長さ（およびその間の任意の整数値）であり得る。
「単離されている」は、天然の状態から変えられたまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはポリペプチドは「単離されて」いないが、その天然の状態の共存する物質から部分的にまたは完全に分離された同じ核酸またはポリペプチドは、「単離されている」。単離核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、または例えば宿主細胞などの非天然環境に存在することができる。
「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、長さが少なくとも２、ある種の実施形態では少なくとも８、１５または２５ヌクレオチドの範囲である核酸であるが、最大５０、１００、１０００もしくは５０００ヌクレオチドの長さまででもよく、またはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする化合物でもよい。
本明細書で使用する場合、用語「患者」、「個体」または「対象」はヒトを指す。
本明細書で使用する場合、用語「医薬組成物」または「組成物」は、本発明内で有用な少なくとも１つの化合物と医薬的に許容可能な担体の混合物を指す。医薬組成物は、患者への化合物の投与を容易にする。限定されないが、皮下、静脈内、経口、エアロゾル、吸入、直腸、腟、経皮、鼻腔内、バッカル、舌下、非経口、髄腔内、胃内、眼部、肺、および局所投与を含めた、化合物を投与する複数の技法が当技術分野に存在する。
本明細書で使用する場合、用語「医薬的に許容可能」は、化合物の生物活性または特性を妨げず、比較的無毒である材料、例えば、担体または希釈剤を指し、すなわち、材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含まれる組成物の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、個体に投与することができ、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。
本明細書で使用する場合、用語「血漿ピロリン酸（ＰＰｉ）レベル」は、動物の血漿中に存在するピロリン酸の量を指す。ある種の実施形態では、動物としては、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ヒト、雌ウシおよびウマが挙げられる。血小板からの放出が理由で、血清ではなく血漿中のＰＰｉを測定することが必要である。ＰＰｉを測定するためのいくつかの方法があり、そのうちの１つは、修正した、ウリジンジホスホグルコース（ＵＤＰＧ）ピロホスホリラーゼを使用した酵素アッセイによるものである（Ｌｕｓｔ ＆ Ｓｅｅｇｍｉｌｌｅｒ、１９７６、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ６６：２４１～２４９；Ｃｈｅｕｎｇ ＆ Ｓｕｈａｄｏｌｎｉｋ、１９７７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８３：６１～６３）。典型的には、健康な対象の正常なＰＰｉレベルは、約１μｍ～約３μＭ、ある場合には１～２μｍの範囲である。ＥＮＰＰ１発現が不完全な対象は低いＰＰｉレベルを示す傾向があり、そのレベルは、正常レベルより少なくとも１０％低い、正常レベルより少なくとも２０％低い、正常レベルより少なくとも３０％低い、正常レベルより少なくとも４０％低い、正常レベルより少なくとも５０％低い、正常レベルより少なくとも６０％低い、正常レベルより少なくとも７０％低い、正常レベルより少なくとも８０％低い、およびそれらの組み合わせの範囲である。ＧＡＣＩに罹患した患者では、ＰＰｉレベルは、１μｍ未満であることが分かり、ある場合には検出レベルより低い。ＰＸＥに罹患した患者では、ＰＰｉレベルは０．５μｍより低い（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ．２０１４ Ｓｅｐ；３４（９）：１９８５－９；Ｂｒａｄｄｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５；６：１０００６．）。
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して連結した、アミノ酸残基、関連したそれらの天然に存在する構造変異体および合成の天然に存在しない類似体から構成されるポリマーを指す。
本明細書で使用する場合、用語「ＰＰｉ」はピロリン酸を指す。
本明細書で使用する場合、用語「予防する」または「予防」は、何も生じなかった場合は、障害もしくは疾患が発生しないこと、または障害もしくは疾患の発生が既にある場合は、さらなる障害もしくは疾患が発生しないことを意味する。障害または疾患と関連する症状のいくつかまたはすべてを予防する能力も考慮される。
「試料」または「生物試料」は、本明細書で使用する場合、対象から単離された生物物質を意味する。生物試料は、対象において生理的もしくは病的プロセスのｍＲＮＡ、ポリペプチドまたは他のマーカーを検出するのに適した任意の生物物質を含むことができ、個体から得られる体液、組織、細胞性および／または非細胞性物質を含むことができる。
本明細書で使用する場合、「実質的に精製された」は、本質的に他の成分がないことを指す。例えば、実質的に精製されたポリペプチドは、その天然に存在する状態でそれが通常は結合している他の成分から分離されたポリペプチドである。非限定的実施形態としては、９５％の純度、９９％の純度、９９．５％の純度、９９．９％の純度および１００％の純度が挙げられる。
本明細書で使用する場合、用語「治療」または「治療すること」は、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患もしくは障害を発生する可能性を治癒させる、治す、軽減する、和らげる、変化させる、救治する、改善する、好転させる、またはそれらに影響を及ぼすことを目的とした、患者への治療剤、すなわち、本発明内で有用な（単独の、もしくは別の医薬品と組み合わせた）化合物の適用もしくは投与、または疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、もしくは疾患もしくは障害を発生する可能性を有する患者から単離された組織もしくは細胞株への治療剤の（例えば、診断もしくはエキソビボ適用のための）適用もしくは投与と定義される。
用語「予防する」、「予防すること」、および「予防」は、本明細書で使用する場合、対象において、疾患の始まりを阻害すること、または疾患の発生を低下させることを指す。予防は完全（例えば、対象の病的細胞が完全にないこと）でもよく、または部分的でもよい。予防は、臨床状態に対する感受性の低減も指す。
本明細書で使用する場合、用語「野生型」は、天然に存在する供給源から単離された遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は、集団内で最も頻繁に観察され、したがって、任意に、ヒトＮＰＰ１またはＮＰＰ３遺伝子の「正常」または「野生型」形態と呼ばれる。これに対して、用語「機能的に同等」は、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較して配列および／または機能的特性の改変（すなわち、変化した特徴）を示す、ＮＰＰ１またはＮＰＰ３の遺伝子または遺伝子産物を指す。天然に存在する突然変異体は単離することができ、これらは、これらが野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較して変化した特徴（変化した核酸配列を含める）を有するという事実によって、特定される。
用語「機能的に同等の変異体」は、本明細書で使用する場合、（上記で定義された）ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の配列に実質的に相同であり、それぞれＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の酵素活性および生物活性を保持するポリペプチドに関する。ネイティブのＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の生物活性を変異体が保持するかどうかを決定するための方法は当業者に広く既知であり、前記出願の実験部分で使用されるアッセイのいずれかが挙げられる。特に、ウイルスベクターによって送達されるＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の機能的に同等の変異体は、本発明に包含される。
ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の機能的に同等の変異体は、それぞれネイティブのＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３に実質的に相同なポリペプチドである。表現「実質的に相同」は、前記タンパク質配列が、上記のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３配列に対して、それぞれ少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性度を有する場合のタンパク質配列に関する。
２つのポリペプチド間の同一性度は、当業者に広く既知であるコンピュータアルゴリズムおよび方法を使用して決定される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））を使用することによって好ましくは決定されるが、他の同様のアルゴリズムも使用することができる。配列同一性パーセントを決定するために、本明細書に記載のパラメーターを用いてＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０が使用される。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターを通して公的に入手可能である。
ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の「機能的に同等の変異体」は、それぞれＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を産生するために使用される宿主細胞におけるコドン選好性の説明となる、ポリヌクレオチド内のヌクレオチドを置き換えることによって得ることができる。そのような「コドン最適化」は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓによって提供されるコドン選好性のための「Ｈｕｍａｎ ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」のようなコドン頻度表を組み込むコンピュータアルゴリズムを介して決定することができる。
本明細書で使用する「約」は、測定可能な値、例えば、量、時間的持続期間などに言及する場合、特定の値から±２０％または±１０％、ある種の実施形態では±５％、ある種の実施形態では±１％、ある種の実施形態では±０．１％の変動を包含することを意味し、なぜならば、そのような変動は、開示される方法を実施するために適切であるからである。
本開示は、本発明のタンパク質配列および核酸配列の代表例を提供する。記載されるタンパク質配は、逆翻訳およびコドン最適化を行うことによって核酸配列に変換することができる。そのような変換を可能にするＥｘｐａｓｙ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）およびバイオインフォマティクスサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ）など、技術分野で利用可能ないくつかのツールが存在する。
範囲：本開示の全体を通して、本発明による様々な態様は範囲型式で提示され得る。範囲型式での記載は単に便宜および簡潔さのためであり、本発明による範囲に対する変更できない制限として解釈されるべきでないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、具体的に開示されるすべての可能な部分範囲および範囲内の個々の数値を有すると見なされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、具体的に開示される部分範囲、例えば、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６など、および範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３および６を有すると見なされるべきである。これは、範囲の幅に関わらず適用される。
ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３のインビボ発現のためのウイルスベクター
ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３ポリペプチドの欠乏を補償するために、ＮＰＰ１またはＮＰＰ３配列を含むポリペプチドなどの遺伝物質を哺乳動物に挿入することができる。
ある特定の改変ウイルスは、哺乳動物に投与した後に、ウイルスが細胞に感染し、コードされるタンパク質を発現するので、コード配列を運ぶためのベクターとして使用されることが多い。本発明によって有用な改変ウイルスは、例えば以下を含めたウイルスに由来する：パルボウイルス、ピコルナウイルス、偽性狂犬病ウイルス、肝炎ウイルスＡ、ＢまたはＣ、パピローマウイルス、パポーバウイルス（例えば、ポリオーマおよびＳＶ４０）またはヘルペスウイルス（例えば、エプスタイン‐バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、帯状疱疹ウイルスならびに単純ヘルペスウイルス１型および２型）、ＲＮＡウイルスまたはレトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルスまたはレンチウイルス（すなわち、ヒト免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルスなどに由来する）。本発明によって有用なＤＮＡウイルスの中には、以下がある：アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、アルファウイルスおよびレンチウイルス。
ウイルスベクターは、一般に、体内に直接、またはそれが個々の細胞によって取り込まれる特定の組織に直接、大抵の場合（ＩＶによる）静脈内注射によって、投与される。代わりに、ウイルスベクターは、ウイルスベクターを患者の細胞の試料とエキソビボで接触させ、それによって、ウイルスベクターを細胞に感染させることによって投与することができ、次いで、ベクターを含む細胞が患者に戻される。一旦ウイルスベクターが送達されると、コード配列が発現し、機能的タンパク質がもたらされる。一般に、ウイルスベクターの細胞の感染および形質導入は、以下の一連の連続的なイベントによって生じる：ウイルスのカプシドと標的細胞の表面上の受容体との相互作用、エンドサイトーシスによる内部移行、エンドサイトーシス／プロテアソームコンパートメントを通した細胞内輸送、エンドソーム脱出、核内移行、ビリオン脱外被、および目的の組換えコード配列の転写および発現につながるウイルスＤＮＡ二本鎖変換（Ｃｏｌｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１７ Ｄｅｃ １；８：８７－１０４．）。
本発明によるアデノ随伴ウイルスベクター
ＡＡＶは、パルボウイルス科のディペンドウイルス属に属するウイルスを指す。ＡＡＶゲノムはおよそ４．７キロベースの長さであり、プラスまたはマイナスセンスのいずれかであり得る直鎖状の一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）から構成される。ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端の逆方向末端反復（ＩＴＲ）ならびに２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：ｒｅｐおよびｃａｐを含む。ｒｅｐフレームは、ＡＡＶの生活環に必要とされる非構造的複製（Ｒｅｐ）タンパク質をコードする４種の重複遺伝子からできてきる。ｃａｐフレームは、一緒に相互作用して、正２０面体の対称のカプシドを形成する、構造的ＶＰカプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の重複ヌクレオチド配列を含む。
末端の１４５ヌクレオチドは自己相補的であり、Ｔ形ヘアピンを形成するエネルギー的に安定な分子内二本鎖が形成され得るように組織化される。これらのヘアピン構造は、ウイルスのＤＮＡ複製のための開始点として機能し、細胞性ＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとして働く。哺乳動物細胞における野生型ＡＡＶの感染後、ｒｅｐ遺伝子（すなわち、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２）がそれぞれＰ５プロモーターおよびＰ１９プロモーターから発現し、両方のＲｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムの複製において機能を有する。ｒｅｐ ＯＲＦのスプライシングイベントは、実際に４種のＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）の発現をもたらす。しかし、哺乳動物細胞おける、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質をコードするスプライシングを受けていないｍＲＮＡは、ＡＡＶベクター生成に十分であることが示されている。昆虫細胞でも、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質はＡＡＶベクター生成に十分である。
ＡＡＶベクターは、典型的にはｒｅｐおよびｃａｐフレームを欠く。そのようなＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）をコードし発現するベクターでトランスフェクトされた宿主細胞に存在し、宿主細胞が、アデノウイルのオープンリーディングフレームＥ４ｏｒｆ６由来のタンパク質をコードし発現するベクターでトランスフェクトされている場合に、複製することができ、感染性ウイルス粒子中にパッケージングされ得る。
一実施形態では、本発明は、哺乳動物のＥＮＰＰ１または哺乳動物のＥＮＰＰ３をコードする配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）発現ベクターに関し、哺乳動物への投与の際に、ベクターは、細胞中でＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３前駆体を発現し、前駆体は、そのカルボキシ末端でＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３のアミノ末端に融合しているアズロシジンシグナルペプチドを含む。ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３前駆体は、安定化ドメイン、例えば、ＩｇＧ Ｆｃ領域またはヒトアルブミンを含むことができる。細胞からの前駆体の分泌の際に、シグナルペプチドは切断され、酵素的に活性な可溶性の哺乳動物ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３が細胞外にもたらされる。
ＡＡＶ発現ベクターは発現カセットを含むことができ、この発現カセットは、アズロシジンシグナルペプチド配列およびエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ（ＥＮＰＰ１）ポリペプチド配列を含むポリペプチドをコードする組換え核酸配列に作動可能に連結している転写制御領域を含むヌクレオチド配列に作動可能に連結している転写制御領域を含む。
いくつかの実施形態では、発現カセットは、プロモーターおよびエンハンサー、コザック配列ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ、哺乳動物ＮＰＰ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列または哺乳動物ＮＰＰ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列、他の適切な調節エレメント、およびポリアデニル化シグナルを含む。
いくつかの実施形態では、本発明によるＡＡＶベクターのＡＡＶ組換えゲノムは、ｒｅｐオープンリーディングフレームおよび／またはｃａｐオープンリーディングフレームを欠く。
本発明によるＡＡＶベクターは、任意の血清型由来のカプシドを含む。一般に、ＡＡＶ血清型はアミノ酸および核酸レベルで有意な相同性のゲノム配列を有し、同一セットの遺伝的機能を提供し、事実上同一のメカニズムを通して複製およびアセンブルする。特に、本発明のＡＡＶは、ＡＡＶの血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａ型および３Ｂ型を含める）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、またはヒツジＡＡＶに属し得る。
様々なＡＡＶ血清型のゲノムの配列の例は、文献に、またはＧｅｎＢａｎｋなどの公的なデータベースに見出すことができる。例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＣ＿００１４０１．２（ＡＡＶ２）、ＮＣ＿００１８２９．１（ＡＡＶ４）、ＮＣ＿００６１５２．１（ＡＡＶ５）、ＡＦ０２８７０４．１（ＡＡＶ６）、ＮＣ＿００６２６０．１（ＡＡＶ７）、ＮＣ＿００６２６１．１（ＡＡＶ８）、ＡＸ７５３２５０．１（ＡＡＶ９）およびＡＸ７５３３６２．１（ＡＡＶ１０）である。
いくつかの実施形態では、本発明によるアデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶｒｈ１０血清型からなる群から選択される血清型に由来するカプシドを含む。別の実施形態では、ＡＡＶの血清型はＡＡＶ８である。ウイルスベクターがカプシドタンパク質をコードする配列を含む場合は、これらは、ＡＡＶを特定の細胞型（複数可）に導くための、または標的にされるベクターの細胞への送達の効率を高めるための、またはＡＡＶの精製もしくは検出を容易にするための、または宿主応答を低減させるための外来性配列を含むように改変され得る。
その内容が参照により完全に本明細書に組み込まれる公開出願ＵＳ２０１７／０２９０９２６－Ｓｍｉｔｈらは、ＡＡＶベクターが生成され、送達される、および投与されるプロセスを詳細に記載している。
本発明によって有用なアデノウイルスベクター
アデノウイルスは、所望の遺伝子産物（例えば、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３）をコードおよび発現し、同時に、通常の溶解性ウイルス生活環において複製するその能力に関して不活化されるように操作され得る。さらに、アデノウイルスは、気道上皮に対して天然の指向性を有する。ウイルスは、気道で見られるように静止状態の細胞に感染することができ、レトロウイルスと比べて大きな利点を提供する。アデノウイルスの発現は、宿主細胞の染色体中へのウイルスＤＮＡの組み込みなしで達成され、それによって、挿入変異誘発についての懸念を軽減する。さらに、アデノウイルスは、優れた安全性プロファイルをともなって、生の腸ワクチンとして長年使用されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ａ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９７４）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１０９：２３３－２３８）。最後に、コトンラットの肺へのアルファ－１－アンチトリプシンおよびＣＦＴＲの移行（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１－４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１４３－１５５）を含めて、アデノウイルス媒介性遺伝子移入がいくつかの例で示されている。さらに、ヒト癌における原因因子としてアデノウイルスを確立しようと試みる広範な研究は、一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：６６０６）。
シュードアデノウイルスベクター（ＰＡＶ）－ＰＡＶｓは、アデノウイルスの逆方向末端反復およびベクターのヘルパーウイルス依存的複製およびパッケージングに必要とされる最小アデノウイルス５’配列を含む。これらのベクターは、潜在的に有害なウイルス遺伝子を含まず、外来性物質に対してほぼ３６ｋｂの理論的収容能力を有し、適度に高い力価をもたらすことができ、分裂および非分裂ヒト標的細胞型に対する親ウイルスの指向性を維持する。ＰＡＶベクターは、プラスミド由来のコンストラクトとして、または感染性ウイルス粒子としてのいずれかで維持することができる。プラスミドコンストラクトとして、ＰＡＶは、野生型または不完全なヘルパーウイルスのいずれかによる、これらの配列の効率的な複製およびパッケージングに必要である野生型アデノウイルス２型由来の最小配列、ならびに任意の所望のさらなる外来性遺伝物質から構成される。
米国特許公開ＵＳ７，３１８，９１９－Ｇｒｅｇｏｒｙらは、アデノウイルスベクターが生成され、送達されるプロセス、および疾患の治療のためのそれらの対応する使用を詳細に記載しており、その内容は参照により完全に本明細書に組み込まれる。本発明は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードするヌクレオチドをそれらを必要とする対象に送達するためのアデノウイルスベクターの使用、およびこれを使用した治療の方法を企図する。
本発明によって有用な単純ヘルペスベクター
単純ヘルペスベクター（ＨＳＶベースのウイルスベクター）は、多数の細胞型に核酸配列を導入するためのベクターとしての使用に適する。成熟したＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂの直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを有する、エンベロープで覆われた正２０面体カプシドからなる。別の実施形態では、ＨＳＶベースのウイルスベクターは、少なくとも１つの必須のＨＳＶ遺伝子が欠損している。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの必須のＨＳＶ遺伝子が欠損しているＨＳＶベースのウイルスベクターは複製欠損性である。大抵の複製欠損性ＨＳＶベクターは、複製を防止するために、１種または複数の中間－初期、初期または後期ＨＳＶ遺伝子を除去するための欠失を含む。例えば、ＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７およびこれらの組み合わせからなる群から選択される最初期遺伝子が欠損している可能性がある。ＨＳＶベクターの利点は、長期のＤＮＡ発現をもたらすことができる潜伏期に入るその能力、および２５ｋｂまでの外来性ＤＮＡインサートを収容することができる、その大きなウイルスＤＮＡゲノムである。
ＨＳＶベースのベクターは、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号－Ｐｒｅｓｔｏｎら、第５，８４６，７８２号－Ｗｉｃｋｈａｍら、および第５，８０４，４１３号－Ｄｅｌｕｃａら、ならびに国際特許出願ＷＯ９１／０２７８８－Ｐｒｅｓｔｏｎら、ＷＯ９６／０４３９４－Ｐｒｅｓｔｏｎら、ＷＯ９８／１５６３７－Ｄｅｌｕｃａら、およびＷＯ９９／０６５８３－Ｇｌｏｒｉｏｓｏらに記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。ＨＳＶベクターは、ＨＳＶゲノムの初期領域のみ、ＨＳＶゲノムの最初期領域のみ、ＨＳＶゲノムの後期領域のみ、またはＨＳＶゲノムの初期領域と後期領域の両方の複製に必須の遺伝子機能が欠損している可能性がある。ＨＳＶベクターの生成は、当技術分野で周知である標準的な分子生物学的手法の使用を含む。
複製欠損性ＨＳＶベクターは、典型的には、高力価のウイルスベクターストックを生成するために適切なレベルで、複製欠損性ＨＳＶベクターに存在しないが、ウイルス増殖に必要とされる遺伝子機能を提供する補完細胞株中で産生される。タンパク質をコードする核酸配列の発現は、核酸配列に作動可能に連結している適切な発現制御配列によって制御される。「発現制御配列」は、別の核酸配列の発現（典型的には、および好ましくは転写）を促進する、増強する、または制御する任意の核酸配列である。
適切な発現制御配列としては、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーターおよびエンハンサーが挙げられる。ベクター中のタンパク質をコードする核酸配列は、その内在性プロモーターによって、または好ましくは、非天然プロモーター配列によって調節され得る。適切な非天然プロモーターの例としては、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＨＣＭＶ最初期プロモーター（ＨＣＭＶ ＩＥｐ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来するプロモーター、例えば、ＨＩＶロングターミナルリピートプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、例えば、ＲＳＶロングターミナルリピート、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｌａｐ２プロモーターまたはヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７８，１４４４－１４４５（１９８１））、ＳＶ４０またはエプスタイン－バーウイルスに由来するプロモーターなどが挙げられる。別の実施形態では、プロモーターはＨＣＭＶ ＩＥｐである。
プロモーターはまた、誘導性プロモーター、すなわち、適切なシグナルに応じてアップおよび／またはダウンレギュレートされるプロモーターでもよい。例えば、医薬品によってアップレギュレートされる発現制御配列は、疼痛管理適用で特に有用である。例えば、プロモーターは、医薬的に誘導可能なプロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性）であり得る。プロモーターは、当技術分野で既知の方法によって、例えば、ゲノムの所与の領域にユニークな制限部位を導入にすることによって、ベクターのゲノムに挿入することができる。
米国特許公開ＵＳ７，５３１，１６７－Ｇｌｏｒｉｏｓｏらは、単純ヘルペスベクターが生成され、送達されるプロセス、および疾患の治療のためのそれらの対応する使用を詳細に記載しており、その内容は参照により完全に本明細書に組み込まれる。本発明は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードするヌクレオチドをそれらを必要とする対象に送達するための単純ヘルペスベクターの使用、およびこれを使用した治療の方法を企図する。
本発明によって有用なアルファウイルスベクター
アルファウイルス発現ベクターは、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）およびベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスを含めた異なる型のアルファウイルスから開発された。アルファウイルスレプリコンは、ウイルスレプリカーゼ（Ｒｅｐ）をコードするオープンリーディングフレームをその５’末端に含み、これは、ウイルスＲＮＡが細胞にトランスフェクトされる場合に翻訳される。Ｒｅｐはポリタンパク質として発現され、これは、続いてプロセッシングを受けて４つのサブユニット（ｎｓｐｓ１～４）になる。プロセッシングを受けないＲｅｐは、ＲＮＡベクターをマイナス鎖ＲＮＡにコピーすることができ、これは、トランスフェクションまたは感染後の最初の３～４時間の間に起こるプロセスである。一旦プロセッシングを受けると、Ｒｅｐは、より多くのレプリコン分子を合成するための鋳型としてマイナス鎖ＲＮＡを使用する。プロセッシングを受けたＲｅｐは、マイナス鎖ＲＮＡの内部配列、またはサブゲノムのプロモーターを認識することもでき、そこから、レプリコンの３’末端に対応するサブゲノムのプラス鎖ＲＮＡを合成する。このサブゲノムＲＮＡは翻訳されて、異種タンパク質を大量に産生する。
ｎｓｐ２の位置７２６に単一のアミノ酸変化（ＰがＬ（Ｐ ｆｏｒ Ｌ））を含むＳＩＮから単離された非細胞変性の突然変異体（ｎｓｐ２におけるＳＩＮ Ｐ７２６Ｌベクター）は、Ｒｅｐハイパープロセシングを示した（Ｆｒｏｌｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３８５４－６５）。この突然変異体は、ＢＨＫ細胞において連続的な複製を効率的に確立することができた。この非細胞変性のＳＩＮベクターは、インビトロで広く使用されており、なぜならば、良好な安定性レベルおよび元のＳＩＮベクターを用いて得られたものの約４％の発現レベルで長期持続性の導入遺伝子発現を提供することができるからである（Ａｇａｐｏｖ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９５：１２９８９－９４）。同様に、特許出願ＷＯ２００８０６５２２５－Ｓｍｅｒｄｏｕらは、非細胞変性のＳＦＶベクターがレプリカーゼｎｓｐ２サブユニットに突然変異Ｒ６４９Ｈ／Ｐ７１８Ｔを有することを記載している。前述のベクターは、アルファウイルスベクターに組み込まれている抗生物質抵抗性遺伝子の存在下で培養することによって、目的の遺伝子を構成的かつ安定して発現することができる細胞株を得ることを可能にする（Ｃａｓａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．２００８．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．３７６：２４２－５１）。
本発明は、部位特異的組換のための認識配列とともにＮＰＰ１またはＮＰＰ３などの目的の遺伝子の配列が組み込まれたアルファウイルスレプリコンに相補的なＤＮＡ配列を含むベクターを設計することを企図する。前記ベクターによって、目的の遺伝子の配列を含むアルファウイルスレプリコンが細胞ゲノムに組み込まれ、その結果、細胞が安定してＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３ポリペプチドを発現する細胞を得ることおよび選択することが可能である。本発明は、アルファウイルスレプリコンが誘導性プロモーターの制御下にある発現ベクターを生成することも企図する。アルファウイルスレプリコンの転写を調節するプロモーターの活性を正に調節することができる所与のリガンドの存在下で、転写活性化因子をコードする発現カセットを組み込むことによってさらに改変された細胞に組み込まれた場合の前記ベクター。
米国特許公開ＵＳ１０，０１１，８４７－Ａｒａｎｄａらは、アルファウイルスベクターが生成され、送達されるプロセス、および疾患の治療のためのそれらの対応する使用を詳細に記載しており、その内容は参照により完全に本明細書に組み込まれる。本発明は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードするヌクレオチドをそれらを必要とする対象に送達するためのアルファウイルスベクターの使用、およびこれを使用した治療の方法を企図する。
本発明によって有用なレンチウイルスベクター
レンチウイルスはレトロウイルス科のウイルスの属に属し、長いインキュベーション期間を特徴とする。レンチウイルスはかなりの量のウイルスＲＮＡを宿主細胞のＤＮＡに送達することができ、非分裂細胞に感染することができるという、レトロウイルスの中でユニークな能力を有する。レンチウイルスベクター、特にＨＩＶ－１に由来するものは広く研究されており、頻繁に使用されるベクターである。レンチウイルスベクターのバックボーンの進化、およびウイルスが組換えＤＮＡ分子（導入遺伝子）を標的細胞に送達する能力は、遺伝子療法における機能遺伝子の修復およびインビトロでの組換えタンパク質産生におけるその使用につながった。
本発明は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３などの目的のタンパク質を発現すために適切なプロモーターおよび導入遺伝子含むレンチウイルスベクターを企図する。典型的には、ベクターのバックボーンは、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、例えばＳＩＶ１またはアフリカミドリザルＳＩＶ（ＳＩＶ－ＡＧＭ）に由来する。一実施形態では、プロモーターは、好ましくは、ハイブリッドヒトＣＭＶエンハンサー／ＥＦ１ａ（ｈＣＥＦ）プロモーターである。本発明は、レンチウイルスベクターを製造する方法、目的の遺伝子を発現するレンチウイルスベクターを含む組成物、および石灰化または骨化の疾患を治療する目的でＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質を発現させるための遺伝子療法における使用を包含する。本発明によるレンチウイルスベクターは、治療用タンパク質の分泌を促進するための遺伝子療法の方法で使用することもできる。さらなる例として、本発明は、呼吸器の管腔または循環系への治療用タンパク質の分泌を提供する。したがって、本発明によるベクターの投与および気道細胞によるその取り込みは、次いで分泌され、治療レベルで全身の循環に入り、ここで、目的の細胞／組織に移動して、治療効果を誘発することができる治療用タンパク質を産生する「工場」としての肺（または鼻または気道）の使用を可能にし得る。細胞内タンパク質または膜タンパク質と対照的に、そのような分泌タンパク質の産生は、形質導入される特定の疾患標的細胞に依拠せず、これは、重要な利点であり、高レベルのタンパク質発現を達成する。したがって、レンチウイルスベクターによって、呼吸器疾患ではない他の疾患、例えば、心血管疾患および血液障害を治療することもできる。レンチウイルスベクター、例えば本発明によるものは、形質導入された細胞のゲノムに組み込まれ、長期持続性発現を導き、それを幹／前駆細胞の形質導入に適したものにすることができる。
米国特許出願公開ＵＳ２０１７／００９６６８４－Ａｌｔｏｎらは、レンチウイルスベクターが生成され、送達されるプロセスおよび疾患の治療のためのそれらの対応する使用を詳細に記載しており、その内容は参照により完全に本明細書に組み込まれる。本発明は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードするヌクレオチドをそれらを必要とする対象に送達するためのレンチウイルスベクターの使用、およびこれを使用した治療の方法を企図する。
配列
配列番号１－ＥＮＰＰ１アミノ酸配列－野生型
Figure 2022517435000003
Figure 2022517435000004
Figure 2022517435000005
 上に示されるＮＰＰ１アミノ酸配列は、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、ＳＭＢ１ドメイン、ＳＭＢ２ドメイン、ホスホジエステラーゼ／触媒ドメイン、リンカードメインおよびヌクレアーゼドメインを含む。ＳＭＢ１ドメイン、ＳＭＢ２ドメイン、触媒ドメイン、リンカードメインおよびヌクレアーゼドメインは一緒に細胞外ドメインと称される。残基１～７６（Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ａｒｇ～Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ）は、細胞質ドメインに対応する。残基７７～９７（Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ～Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ）は膜貫通ドメインに対応する。残基９９～９２５（Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）は細胞外ドメインに対応する。残基１０４～１４４（Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ～Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ）はＳＭＢ１ドメインに対応し、残基１４５～１８９（Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｔｒｐ～Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ）はＳＭＢ２ドメインに対応する。残基５９７～６４７は触媒およびヌクレアーゼドメインを結合するリンカードメインに対応する。残基１９１～５９１（Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ～Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ）は触媒／ホスホジエステラーゼドメインに対応する。残基６５４～９２５（Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）はヌクレアーゼドメインに対応する。残基の番号付けおよびドメイン分類は、ヒトＮＰＰ１配列（ＮＣＢＩアクセションＮＰ＿００６１９９／Ｕｎｉｐｒｏｔ－Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ Ｐ２２４１３）に基づく。
配列番号２－アズロシジン－ＥＮＰＰ１－ＦＣ
Figure 2022517435000006
Figure 2022517435000007
 一重下線－アズロシジンシグナル配列、二重下線－ＥＮＰＰ１配列の開始および終了、太字の残基－Ｆｃ配列、＊＊シグナル配列の切断点を示す。
配列番号３－アズロシジン－ＥＮＰＰ１－Ａｌｂ
Figure 2022517435000008
 一重下線－アズロシジンシグナル配列、二重下線－ＥＮＰＰ１配列の開始および終了、太字の残基－アルブミン配列、＊＊シグナル配列の切断点を示す。
配列番号４－アズロシジン－ＥＮＰＰ１
Figure 2022517435000009
Figure 2022517435000010
 一重下線－アズロシジンシグナル配列、二重下線－ＥＮＰＰ１配列の開始および終了、＊＊シグナル配列の切断点を示す。
配列番号５－ＥＮＰＰ２アミノ酸配列－野生型
Figure 2022517435000011
Figure 2022517435000012
Figure 2022517435000013
配列番号６－ＥＮＰＰ３の細胞外ドメイン：
Figure 2022517435000014
Figure 2022517435000015
Figure 2022517435000016
配列番号７－ＮＰＰ３アミノ酸配列：
Figure 2022517435000017
Figure 2022517435000018
Figure 2022517435000019
 上に示されるＮＰＰ３アミノ酸配列は、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、ホスホジエステラーゼ／触媒ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む。触媒ドメインおよびヌクレアーゼドメインは一緒に細胞外ドメインと称される。残基１～１１（Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｓｅｒ～Ａｌａ Ｔｈｒ Ｇｌｕ）は細胞質ドメインに対応する。残基１２～３０（Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ～Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ）は膜貫通ドメインに対応する。残基３１～８７５（Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ～Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｉｌｅ）は細胞外ドメインに対応する。残基１４０～５１０（Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ～Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ）は触媒／ホスホジエステラーゼドメインに対応する。残基６０５～８７５（Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ～Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｉｌｅ）はヌクレアーゼドメインに対応する。残基の番号付けおよびドメイン分類はヒトＮＰＰ３配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｏ１４６３８．２）に基づく。
配列番号８－アズロシジン－ＥＮＰＰ３－ＦＣ
Figure 2022517435000020
 一重下線－アズロシジンシグナル配列、二重下線－ＥＮＰＰ３配列の開始および終了、太字の残基－Ｆｃ配列、＊＊はシグナル配列の切断点を示す。
配列番号９－アズロシジン－ＥＮＰＰ３－アルブミン
Figure 2022517435000021
Figure 2022517435000022
 一重下線－アズロシジンシグナル配列、二重下線－ＥＮＰＰ３配列の開始および終了、太字の残基－アルブミン配列、＊＊はシグナル配列の切断点を示す。
配列番号１０－アズロシジン－ＥＮＰＰ３
Figure 2022517435000023
 一重下線－アズロシジンシグナル配列、二重下線－ＥＮＰＰ３配列の開始および終了、＊＊はシグナル配列の切断点を示す。
配列番号１１－ＥＮＰＰ４アミノ酸配列－野生型
Figure 2022517435000024
Figure 2022517435000025
配列番号１２－ＥＮＰＰ５１アミノ酸配列
Figure 2022517435000026
Figure 2022517435000027
Figure 2022517435000028
Figure 2022517435000029
 一重下線付き：シグナルペプチド配列；二重下線付き：ＮＰＰ１の開始および終了；＊＊＝シグナルペプチド配列の切断位置
配列番号１３－ＥＮＰＰ５１－ＡＬＢアミノ酸配列：
Figure 2022517435000030
Figure 2022517435000031
Figure 2022517435000032
Figure 2022517435000033
 一重下線付き：シグナルペプチド配列；二重下線付き：ＮＰＰ１の開始および終了；＊＊＝シグナルペプチド配列の切断位置；太字の残基はアルブミン配列を示す。
配列番号１４－ＥＮＰＰ５－ＮＰＰ３－Ｆｃ配列
Figure 2022517435000034
Figure 2022517435000035
Figure 2022517435000036
 一重下線付き：シグナルペプチド配列；二重下線付き：ＮＰＰ３３の開始および終了；＊＊＝シグナルペプチド配列の切断位置；太字の残基はアルブミン配列を示す。
配列番号１５－ＥＮＰＰ５－ＮＰＰ３－アルブミン配列
Figure 2022517435000037
Figure 2022517435000038
Figure 2022517435000039
Figure 2022517435000040
Figure 2022517435000041
 一重下線付き：シグナルペプチド配列；二重下線付き：ＮＰＰ３の開始および終了；＊＊＝シグナルペプチド配列の切断位置；太字の残基はアルブミン配列を示す。
配列番号１６－ＥＮＰＰ５タンパク質排出シグナル配列
Figure 2022517435000042
配列番号１７－ＥＮＰＰ５－１－Ｆｃ
Figure 2022517435000043
Figure 2022517435000044
Figure 2022517435000045
Figure 2022517435000046
 一重下線付き：シグナルペプチド配列；二重下線付き：ＮＰＰ３の開始および終了；＊＊＝シグナルペプチド配列の切断位置；太字の残基はＦｃ配列を示す。
配列番号１８－ＥＮＰＰ７－１－Ｆｃアミノ酸配列
Figure 2022517435000047
Figure 2022517435000048
Figure 2022517435000049
Figure 2022517435000050
 一重下線付き：シグナルペプチド配列；二重下線付き：ＮＰＰ１の開始および終了；＊＊＝シグナルペプチド配列の切断位置；太字の残基はＦｃ配列を示す。
配列番号１９－ＥＮＰＰ７１（ＮＰＰ１のＮ末端ＧＬＫを欠く）アミノ酸配列：
Figure 2022517435000051
Figure 2022517435000052
Figure 2022517435000053
 一重下線付き：シグナルペプチド配列；二重下線付き：ＮＰＰ３の開始および終了；＊＊＝シグナルペプチド配列の切断位置。
配列番号２０－ＥＮＰＰ７１（ＮＰＰ１のＮ末端ＧＬＫを欠く）－Ｆｃアミノ酸配列：
Figure 2022517435000054
Figure 2022517435000055
Figure 2022517435000056
Figure 2022517435000057
 一重下線付き：シグナルペプチド配列；二重下線付き：ＮＰＰ１の開始および終了；＊＊＝シグナルペプチド配列の切断位置；太字の残基はＦｃ配列を示す。
配列番号２１－ＥＮＰＰ７－１（ＮＰＰ１のＮ末端ＧＬＫを欠く）－ＡＬＢアミノ酸配列
Figure 2022517435000058
Figure 2022517435000059
Figure 2022517435000060
Figure 2022517435000061
Figure 2022517435000062
 一重下線付き：シグナルペプチド配列；二重下線付き：ＮＰＰ１の開始および終了；＊＊＝シグナルペプチド配列の切断位置；太字の残基はアルブミン配列を示す。
配列番号２２－ＥＮＰＰ７－ＮＰＰ３－Ｆｃ配列：
Figure 2022517435000063
Figure 2022517435000064
Figure 2022517435000065
 一重下線付き：シグナルペプチド配列；二重下線付き：ＮＰＰ３の開始および終了；＊＊＝シグナルペプチド配列の切断位置；太字の残基はＦｃ配列を示す。
配列番号２３－ＥＮＰＰ７－１－アルブミン
Figure 2022517435000066
Figure 2022517435000067
Figure 2022517435000068
Figure 2022517435000069
 一重下線付き：シグナルペプチド配列；二重下線付き：ＮＰＰ３の開始および終了；＊＊＝シグナルペプチド配列の切断位置；太字の残基はＦｃ配列を示す。
配列番号２４－ＥＮＰＰ７－ＮＰＰ３－アルブミン
Figure 2022517435000070
Figure 2022517435000071
Figure 2022517435000072
Figure 2022517435000073
Figure 2022517435000074
 一重下線付き：シグナルペプチド配列；二重下線付き：ＮＰＰ３の開始および終了；＊＊＝シグナルペプチド配列の切断位置；太字の残基はアルブミン配列を示す。
配列番号２５－ＥＮＰＰ７－ＥＮＰＰ３－アルブミン
Figure 2022517435000075
Figure 2022517435000076
Figure 2022517435000077
Figure 2022517435000078
Figure 2022517435000079
 一重下線付き：シグナルペプチド配列；二重下線付き：ＮＰＰ３の開始および終了；＊＊＝シグナルペプチド配列の切断位置；太字の残基はアルブミン配列を示す。
配列番号２６－ＥＮＰＰ７１－ＧＬＫアミノ酸配列
Figure 2022517435000080
Figure 2022517435000081
Figure 2022517435000082
 一重下線付き：シグナルペプチド配列；二重下線付き：ＮＰＰ１の開始および終了；＊＊＝シグナルペプチド配列の切断位置。
配列番号２７－ＥＮＰＰ１２１アミノ酸配列
Figure 2022517435000083
Figure 2022517435000084
Figure 2022517435000085
 一重下線付き：シグナルペプチド配列；二重下線付き：ＮＰＰ１の開始および終了；＊＊＝シグナルペプチド配列の切断位置。
配列番号２８－ＥＮＰＰ１２１－Ｆｃアミノ酸配列
Figure 2022517435000086
Figure 2022517435000087
Figure 2022517435000088
 一重下線付き：シグナルペプチド配列；二重下線付き：ＮＰＰ１の開始および終了；＊＊＝シグナルペプチド配列の切断位置；太字の残基はＦｃ配列を示す。
配列番号２９－ＥＮＰＰ１２１－ＡＬＢアミノ酸配列：
Figure 2022517435000089
Figure 2022517435000090
Figure 2022517435000091
Figure 2022517435000092
 一重下線付き：シグナルペプチド配列；二重下線付き：ＮＰＰ１の開始および終了；＊＊＝シグナルペプチド配列の切断位置；太字の残基はアルブミン配列を示す。
配列番号３０－ＥＮＰＰ１２１－ＮＰＰ３－Ｆｃ配列
Figure 2022517435000093
Figure 2022517435000094
Figure 2022517435000095
 一重下線付き：シグナルペプチド配列；二重下線付き：ＮＰＰ１の開始および終了；＊＊＝シグナルペプチド配列の切断位置；太字の残基はＦｃ配列を示す。
配列番号３１－ＥＮＰＰ１２１－ＮＰＰ３－アルブミン配列
Figure 2022517435000096
Figure 2022517435000097
Figure 2022517435000098
Figure 2022517435000099
 一重下線付き：シグナルペプチド配列；二重下線付き：ＮＰＰ３の開始および終了；＊＊＝シグナルペプチド配列の切断位置；太字の残基はアルブミン配列を示す。
配列番号３２－ＥＮＰＰ１２１ＧＬＫタンパク質排出シグナル配列
Figure 2022517435000100
配列番号３３－アルブミン配列
Figure 2022517435000101
Figure 2022517435000102
Figure 2022517435000103
配列番号３４－ヒトＩｇＧ Ｆｃドメイン、Ｆｃ
Figure 2022517435000104
配列番号３５－アルブミン配列
Figure 2022517435000105
Figure 2022517435000106
Figure 2022517435000107
配列番号３６－ＥＮＰＰ２シグナルペプチド
Figure 2022517435000108
配列番号３７－シグナル配列ＥＮＰＰ７
Figure 2022517435000109
配列番号３８－シグナル配列ＥＮＰＰ７
Figure 2022517435000110
配列番号３９－シグナル配列ＥＮＰＰ１－２－１
Figure 2022517435000111
Figure 2022517435000112
配列番号４０－ｅｘＥＮＰＰ３
Figure 2022517435000113
配列番号４１－シグナル配列ＥＮＰＰ５：
Figure 2022517435000114
配列番号４２－アズロシジン－ＥＮＰＰ１－ＦＣヌクレオチド配列
Figure 2022517435000115
Figure 2022517435000116
 説明文：青＝制限部位；太字＝開始／終止コドン；緑＝コザック配列；下線付き＝シグナルペプチドのヌクレオチド配列。
配列番号４３－アズロシジン－ＥＮＰＰ１－アルブミンヌクレオチド配列
Figure 2022517435000117
Figure 2022517435000118
配列番号４４－アズロシジン－ＥＮＰＰ１ヌクレオチド配列
Figure 2022517435000119
Figure 2022517435000120
配列番号４５－アズロシジン－ＥＮＰＰ３－ＦＣヌクレオチド配列
Figure 2022517435000121
Figure 2022517435000122
配列番号：４６－アズロシジン－ＥＮＰＰ３－アルブミンヌクレオチド配列
Figure 2022517435000123
Figure 2022517435000124
配列番号４７－アズロシジン－ＥＮＰＰ３－ヌクレオチド配列
Figure 2022517435000125
Figure 2022517435000126
配列番号４８－ＥＮＰＰ７－１－Ｆｃヌクレオチド配列
Figure 2022517435000127
Figure 2022517435000128
Figure 2022517435000129
配列番号４９－ＥＮＰＰ７－ＮＰＰ１アルブミンヌクレオチド配列：
Figure 2022517435000130
Figure 2022517435000131
Figure 2022517435000132
配列番号５０－ＮＰＰ１２１－ＮＰＰ３－Ｆｃのヌクレオチド配列
Figure 2022517435000133
Figure 2022517435000134
Figure 2022517435000135
配列番号５１－ＮＰＰ１２１－ＮＰＰ３－Ｆｃのヌクレオチド配列
Figure 2022517435000136
Figure 2022517435000137
Figure 2022517435000138
Figure 2022517435000139
配列番号５２－ｈＮＰＰ３－ｈＦｃ－ｐｃＤＮＡ３のヌクレオチド配列
Figure 2022517435000140
Figure 2022517435000141
Figure 2022517435000142
Figure 2022517435000143
Figure 2022517435000144
Figure 2022517435000145
配列番号５３－ＥＮＰＰ１２１－Ｆｃ－ヌクレオチド配列
Figure 2022517435000146
Figure 2022517435000147
配列番号５４－ＥＮＰＰ１２１－アルブミンヌクレオチド配列
Figure 2022517435000148
Figure 2022517435000149
Figure 2022517435000150
Figure 2022517435000151
配列番号５５－ＥＮＰＰ３ヌクレオチド配列
Figure 2022517435000152
Figure 2022517435000153
配列番号５６－ＥＮＰＰ１ヌクレオチド配列：
Figure 2022517435000154
Figure 2022517435000155
配列番号５７－リンカー
Figure 2022517435000156
配列番号５８－リンカー
Figure 2022517435000157
配列番号５９－リンカー
Figure 2022517435000158
配列番号６０－リンカー
Figure 2022517435000159
配列番号６１－リンカー
Figure 2022517435000160
配列番号６２－リンカー
Figure 2022517435000161
配列番号６３－リンカー
Figure 2022517435000162
配列番号６４－リンカー
Figure 2022517435000163
配列番号６５－リンカー
Figure 2022517435000164
配列番号６６－リンカー
Figure 2022517435000165
配列番号６７－リンカー
Figure 2022517435000166
配列番号６８－リンカー
Figure 2022517435000167
配列番号６９－リンカー
Figure 2022517435000168
配列番号７０－リンカー
Figure 2022517435000169
配列番号７１－リンカー
Figure 2022517435000170
配列番号７２－リンカー
Figure 2022517435000171
配列番号７３－リンカー
Figure 2022517435000172
配列番号７４－リンカー
Figure 2022517435000173
配列番号７５－リンカー
Figure 2022517435000174
配列番号７６－リンカー
Figure 2022517435000175
配列番号７７－リンカー
Figure 2022517435000176
配列番号７８－リンカー
Figure 2022517435000177
配列番号７９－リンカー
Figure 2022517435000178
配列番号８０－リンカー
Figure 2022517435000179
配列番号８１－リンカー
Figure 2022517435000180
配列番号８２－リンカー
Figure 2022517435000181
配列番号８３－リンカー
Figure 2022517435000182
配列番号８４－リンカー
Figure 2022517435000183
配列番号８５－リンカー
Figure 2022517435000184
配列番号８６－リンカー
Figure 2022517435000185
配列番号８７－リンカー
Figure 2022517435000186
配列番号８８－リンカー
Figure 2022517435000187
配列番号８９－可溶性ＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質配列
Figure 2022517435000188
Figure 2022517435000189
 二重下線付き：ＮＰＰ１の開始および終了；太字の残基はＦｃ配列を示す。
配列番号９０－可溶性ＮＰＰ１－Ｆｃのヌクレオチド配列
Figure 2022517435000190
Figure 2022517435000191
Figure 2022517435000192
配列番号９１－可溶性ＮＰＰ１－（ＧＬＫ）－Ｆｃ融合タンパク質配列
Figure 2022517435000193
Figure 2022517435000194
 二重下線付き：ＮＰＰ１の開始および終了；太字の残基はＦｃ配列を示す。
配列番号９２－可溶性ＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質配列
Figure 2022517435000195
Figure 2022517435000196
Figure 2022517435000197
 二重下線付き：ＮＰＰ１の開始および終了；太字の残基はＦｃ配列を示す。
配列番号９３－可溶性ＮＰＰ１－Ｆｃ融合タンパク質配列
Figure 2022517435000198
Figure 2022517435000199
 二重下線付き：ＮＰＰ１の開始および終了；太字の残基はＦｃ配列を示す。
配列番号９４－リンカー
Figure 2022517435000200
本発明による医薬組成物
本発明によるＡＡＶベクターは、従来の方法によってヒトまたは動物の体に投与することができ、これは、医薬組成物への前記ベクターの製剤化を必要とする。一実施形態では、本発明は、組換えウイルスゲノムを含むＡＡＶベクターを含む医薬組成物（以下、「本発明による医薬組成物」と称される）に関し、前記組換えウイルスゲノムは、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３またはそれらの機能的に同等の変異体をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している転写制御領域を含む発現カセットを含む。
本発明によるアデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスベクター、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターと関連して開示されているすべての実施形態はまた、本発明による医薬組成物に適用可能である。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療的有効量の本発明によるＡＡＶベクターおよび医薬的に許容可能な担体を含むことができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療的有効量の本発明によるアデノウイルスベクターおよび医薬的に許容可能な担体を含むことができる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療的有効量の本発明によるレンチウイルスベクターおよび医薬的に許容可能な担体を含むことができる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療的有効量の本発明によるアルファウイルスベクターおよび医薬的に許容可能な担体を含むことができる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療的有効量の本発明による単純ヘルペスウイルスベクターおよび医薬的に許容可能な担体を含むことができる。
用語「治療的有効量」は、所望の効果をもたらすように計算された本発明によるＡＡＶベクターの量を指し、一般に、他にも理由があるが、本発明によるウイルスベクターの特有の特色および得られる治療効果によって決定される。疾患の治療に有効である本発明によるウイルスベクターの量は、本明細書に記載のまたは当技術分野で既知の標準的な臨床的技法によって決定することができる。さらに、最適投薬量範囲を特定するのを支援するために、インビトロ試験を場合により使用することができる。製剤で使用するための正確な用量は、投与経路および状態の重症度に依存し、これは、医師の判断で、および各患者の状況に応じて決定されるべきである。
プロモーター
遺伝子療法で使用されるベクターは発現カセットを必要とする。発現カセットは、３つの重要な成分：プロモーター、治療遺伝子およびポリアデニル化シグナルからなる。プロモーターは、治療遺伝子の発現を制御するために必須である。組織特異的プロモーターは、ある特定の細胞型でのみ活性を有するプロモーターである。発現カセットにおける組織特異的プロモーターの使用は、望まれない導入遺伝子発現を制限することができ、持続的な導入遺伝子発現を容易にすることができる。遺伝子療法のために一般に使用されるプロモーターとしては、サイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ－ＩＥ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスロングターミナルリピート（ＲＳＶ－ＬＴＲ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲおよび他のレトロウイルスのＬＴＲプロモーターが挙げられる。真核プロモーターを遺伝子療法のために使用することができ、真核プロモーターの一般例としては、ヒトａ１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）およびマウスＲＮＡポリメラーゼＩＩ（大サブユニット）プロモーターが挙げられる。核内低分子ＲＮＡ Ｕ１ｂプロモーター、ＥＦ１αプロモーターおよびＰＧＫ１プロモーターなどの非組織特異的プロモーターも遺伝子療法で使用するために利用可能である。Ａｐｏ Ａ－Ｉ、ＡｐｏＥおよびａ１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）などの組織特異的プロモーターは、遺伝子療法において目的のタンパク質の組織特異的発現を可能にする。Ｐａｐａｄａｋｉｓら（Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ：Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００４，４，８９－１１３）の表Ｉは、遺伝子療法で真核プロモーターを使用する転写標的化の例を収載し、それらすべては、参照により完全に本明細書に組み込まれる。
投薬量および投与様式
ＡＡＶ力価は、ｍｌあたりのベクターまたはウイルスゲノム（ｖｇ／ｍｌ）の、またはキログラム投薬量あたりのベクターまたはウイルスゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の「物理的」力価として示される。精製されたベクター粒子のＱＰＣＲを使用して、力価を決定することができる。ＡＡＶ ＶＧ数の力価測定を行うための１つの方法は、以下の通りである：精製されたＡＡＶベクター試料をＤＮａｓｅで最初に処理して、カプシドで包まれていないＡＡＶゲノムＤＮＡまたは生成プロセスからの混入プラスミドＤＮＡを除去する。ＤＮａｓｅ抵抗性粒子を次いで熱処理にかけて、カプシドからゲノムを放出させる。ウイルスゲノムの特定の領域を標的化するプライマー／プローブセットを使用して、放出されたゲノムをリアルタイムＰＣＲで定量化する。
ウイルス組成物は、ヒト患者に対して、約１．０×１０９ ｖｇ／ｋｇ～約１．０×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、好ましくは１．０×１０１２ ｖｇ／ｋｇ～１．０×１０１４ ｖｇ／ｋｇの範囲でウイルスベクターの量を含むように、投薬単位で製剤化することができる。好ましくは、製剤中のウイルスの用量は、１．０×１０９ ｖｇ／ｋｇ、５．０×１０９ ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０１０ ｖｇ／ｋｇ、５．０×１０１０ ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０１１ ｖｇ／ｋｇ、５．０×１０１１ ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０１２ ｖｇ／ｋｇ、５．０×１０１２ ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１３ ｖｇ／ｋｇ、５．０×１０１３ ｖｇ／ｋｇ、１．０×１０１４ ｖｇ／ｋｇ、５．０×１０１４ ｖｇ／ｋｇ、または１．０×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、または５．０×１０１５ ｖｇ／ｋｇである。
いくつかの実施形態では、本発明による文脈において、哺乳動物、特にヒトに投与される用量は、特定のウイルスベクター、ベクターおよびそのための担体を含む組成物（上述）、ならびに投与様式によって変化する。用量は、望ましい時間枠内で、望ましい応答、例えば、治療的または予防的応答をもたらすのに十分である。ウイルスベクターの点から、用量は１×１０１５ ｖｇ／ｋｇまでであり得る。
本発明のベクターは長期的遺伝子発現を可能にし、その結果、治療用タンパク質の長期的効果をもたらす。フレーズ「長期的発現」、「継続的発現」および「持続的発現」は互換的に使用される。本発明による長期的発現は、好ましくは、少なくとも４５日間、少なくとも６０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１２０日間、少なくとも１８０日間、少なくとも２５０日間、少なくとも３６０日間、少なくとも４５０日間、少なくとも７３０日間またはそれ以上の治療レベルでの治療遺伝子および／またはタンパク質の発現を意味する。好ましくは、長期的発現は、少なくとも９０日間、少なくとも１２０日間、少なくとも１８０日間、少なくとも２５０日間、少なくとも３６０日間、少なくとも４５０日間、少なくとも７２０日間またはそれ以上、より好ましくは、少なくとも３６０日間、少なくとも４５０日間、少なくとも７２０日間またはそれ以上の発現を意味する。この長期的発現は、反復用量（可能であれば）によって、または単回用量によって、達成することができる。
反復用量は、１日２回、１日１回、週２回、週１回、月１回、２か月ごと、３か月ごと、４か月ごと、６か月ごと、年１回、２年ごと、またはそれ以上投与することができる。投薬は、必要な限り長く、例えば、少なくとも６か月、少なくとも１年、２年、３年、４年、５年、１０年、１５年、２０年またはそれ以上にわたって、最大で治療される患者の生涯にわたって、継続することができる。
本発明による医薬組成物は、局部的または全身的に、筋肉内に、静脈内に、および非経口的に投与することができる。本発明による治療的組成物の送達は、中枢神経系、心臓系および肺系に向けられ得る。一般的な送達ストラテジーは、直接筋肉内注射である。非限定例として、骨格筋は、効率的に形質導入される標的組織型であることが示されている。一旦形質導入されると、筋細胞は、多くのＡＡＶ変異体によって、局部的または全身的に作用することができるタンパク質産生の産生部位として働く。
一実施形態では、医薬組成物は、その細胞が形質導入されることになる組織または臓器の近くに投与される。特定の実施形態では、本発明による医薬組成物は、肝実質中への注射によって肝臓に局部的に投与される。別の実施形態では、本発明による医薬組成物は全身的に投与される。
非限定例として、全身投与としては、本発明によるＡＡＶベクターの全身注射、例えば、筋肉内（ｉｍ）、血管内（ｉｅ）、動脈内（ｉａ）、静脈内（ｉｖ）、腹腔内（ｉｐ）または皮下注射が挙げられる。好ましくは、全身投与は、ｉｍ、ｉｐ、ｉｓまたはｉｖ注射を介する。いくつかの実施形態では、本発明によるＡＡＶベクターは静脈内注射を介して投与される。
別の実施形態では、本発明による医薬組成物は対象の肝臓に送達される。肝臓への投与は、当技術分野で既知の方法、例えば、限定されないが、静脈内投与、門脈内投与、胆管内の投与、動脈内投与および肝実質中への直接注射を使用して達成される。別の実施形態では、医薬組成物は静脈内に投与される。
本発明による医薬組成物は単回用量で投与することができ、または本発明による特定の実施形態では、複数回用量（例えば、２、３、４回もしくはそれ以上の投与）を用いて治療効果を達成することができる。好ましくは、本発明による医薬組成物に含まれるＡＡＶベクターは、中和抗体の効果を除去するために、複数回用量が必要とされる場合に、異なる血清型に由来する。
製剤
調製物は緩衝塩を含むこともできる。あるいは、組成物は、使用前に適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含有しない無菌水）と構成するために、粉末状でもよい。必要な場合、組成物は、注射部位の疼痛を和らげるために、リドカインなどの局部麻酔薬を含むこともできる。組成物が浸潤により投与される予定である場合は、これは、医薬品品質の水または生理食塩水を含む浸潤ボトルで調剤することができる。組成物が注射によって投与される場合は、投与前に成分を混合することができるように、注射または無菌食塩水用の水バイアルを提供することができる。好ましくは、医薬的に許容可能な担体は生理食塩水およびプルロニック（登録商標）などの界面活性剤である。
本発明による組成物は、獣医学的目的の動物（例えば、家畜（ウシ、ブタなど）および他のヒト以外の哺乳動物対象に、ならびにヒト対象に送達するために製剤化することができる。ＡＡＶベクターは、遺伝子移入および遺伝子療法適用で使用するための生理学的に許容可能な担体とともに製剤化することができる。非限定例として、本発明によるＡＡＶベクターと組み合わせて、または混合して、アジュバントを使用することも包含される。企図されるアジュバントとしては、限定されないが、無機塩アジュバントまたは無機塩ゲルアジュバント、粒子性アジュバント、微粒子性アジュバント、粘膜アジュバントが挙げられる。アジュバントは本発明によるＡＡＶベクターとの混合物として対象に投与することができ、または前記ＡＡＶベクターと組み合わせて使用することができる。
用語「医薬的に許容可能な担体」、「医薬的に許容可能な希釈剤」、「医薬的に許容可能な賦形剤」または「医薬的に許容可能なビヒクル」は本明細書で互換的に使用され、無毒の固体、半固体または液体のフィラー、希釈剤、カプセル化材、または任意の従来の型の補助的製剤を指す。医薬的に許容可能な担体は、用いられる投与量および濃度で受容者に対して本質的に無毒であり、製剤の他の成分に適合する。医薬的に許容可能な担体の数および性質は所望の投与形態に依存する。医薬的に許容可能な担体は既知であり、当技術分野で周知の方法によって調製することができる（Ｆａｕｌｉ ｉ Ｔｒｉｌｌｏ Ｃ，“Ｔｒａｔａｄｏ ｄｅ Ｆａｒｍａｃｉａ Ｇａｌｅｎｉｃａ”．Ｅｄ．Ｌｕｚａｎ ５，Ｓ．Ａ．，Ｍａｄｒｉｄ，ＥＳ，１９９３；Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ，Ｅｄ．，“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ”２０ｔｈ ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，ＵＳ，２００３）。
非限定例として、ＡＡＶベクターは、注射による（例えば、ボーラス注射または持続注入による）非経口投与のために製剤化することができる。注射用製剤は、防腐剤が添加された単位剤形（例えば、アンプルまたは多回用量容器）中で提供することができる。ウイルス組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤のような形態をとることができ、懸濁化剤、安定化または分散化剤などの調合剤を含むことができる。ＡＡＶ製剤の液体調製物は、医薬的に許容可能な添加剤、例えば、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素添加食用脂）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画植物油（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｏｉｌｓ））、および防腐剤（例えば、メチルまたはプロピル－ｐ－ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）を用いて、従来の手段によって調製することができる。
非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、および製剤を所定の受容者の血液と等張にする溶質を含むことができる、水性および非水性の等張の無菌注射液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤および防腐剤を含むことができる、水性および非水性の無菌懸濁剤が挙げられる。製剤は、単位用量または複数用量の密封容器、例えば、アンプルおよびバイアル中で提供することができ、使用直前に、注射のために、無菌の液体賦形剤、例えば水を添加することしか必要としない、フリーズドライした（凍結乾燥した）状態で保存することができる。即時の注射液および懸濁剤は、前述の種類の無菌の粉末剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。
さらに、組成物は、さらなる治療的または生物学的に活性な薬剤を含むことができる。例えば、特定の適応症の治療で有用である治療的因子が存在し得る。炎症を制御する因子、例えば、イブプロフェンまたはステロイドは、ベクターのインビボ投与と関連する腫脹および炎症ならびに生理的な苦痛を低減するために、組成物の一部であり得る。ベクター自体に対する、または障害と関連する任意の免疫応答を低減するために、免疫系サプレッサーを組成物の方法で投与することができる。免疫抑制医薬品または免疫抑制剤の投与は、計画的に誘導される免疫抑制の主な方法であり、最適な状況では、免疫抑制薬物は、免疫系の任意の活動亢進成分のみを標的にする。
免疫抑制薬物または免疫抑制剤または抗拒絶反応医薬品は、免疫系の活性を阻害または防止する薬物である。そのような薬物としては、グルココルチコイド、細胞分裂阻害薬、抗体、イムノフィリンに作用する薬物が挙げられる。薬理学的（超生理的）用量では、様々なアレルギー反応および炎症反応を抑制するために、グルココルチコイド、例えば、プレドニゾン、デキサメタゾンおよびヒドロコルチゾンが使用される。細胞分裂阻害薬、例えば、プリン類似体、アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（シクロホスファミド）、ニトロソ尿素、白金化合物など。シクロホスファミド（Ｂａｘｔｅｒのシトキサン）はおそらく最も強力な免疫抑制化合物である。代謝拮抗剤、例えば、葉酸類似体、例えばメトトレキサート、プリン類似体、例えばアザチオプリンおよびメルカプトプリン、ピリミジン類似体、例えばフルオロウラシル、ならびにタンパク質合成阻害剤。細胞傷害性抗生物質、中でも、ダクチノマイシンは最も重要である。これは腎臓移植で使用される。他の細胞傷害性抗生物質はアントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシンである。抗体は、急性の拒絶反応を予防するために、急速かつ強力な免疫抑制療法として使用されることもある（例えば、抗ＣＤ２０モノクローナル）。
あるいは、疾患に対して体の天然の防御をアップレギュレートするために、免疫賦活薬を組成物に含めることができる。
抗生物質、すなわち、殺菌薬および殺真菌薬は、遺伝子移入手順および他の障害と関連する感染のリスクを低減させるために、存在し得る。
医薬組成物は、ヒトへの静脈内、皮下または筋肉内投与に適した医薬組成物として、ルーチンの手順に従って製剤化することができる。
本発明による治療方法
非限定例として、ヒトＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードするウイルスベクターが哺乳動物に投与され、その結果、哺乳動物において、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードするＤＮＡの送達、およびタンパク質の発現がもたらされ、それによって軟組織の石灰化または骨化を低減させるのに必要とされるＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３のレベルが回復する。
一態様では、本発明は、組換えウイルスゲノムを含むアデノ随伴ウイルスベクターであって、前記組換えウイルスゲノムが、ＥＮＰＰ１もしくはＥＮＰＰ３もしくはそれらの機能的に同等の変異体をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している転写制御領域を含む発現カセットを含むアデノ随伴ウイルスベクター、または病的石灰化もしくは骨化の疾患の治療および／もしくは予防で使用するための前記ウイルスベクターを含む医薬組成物に関する。
別の態様では、本発明は、病的石灰化または骨化の疾患疾患の治療および／または予防のための医薬の製造のための、組換えウイルスゲノムを含むアデノ随伴ウイルスベクターであって、前記組換えウイルスゲノムが、ＥＮＰＰ１もしくはＥＮＰＰ３もしくはそれらの機能的に同等の変異体をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している転写制御領域を含む発現カセットを含むアデノ随伴ウイルスベクター、または前記ウイルスベクターを含む医薬組成物の使用に関する。
別の態様では、本発明は、病的石灰化または骨化の疾患の治療および／または予防を必要とする対象において病的石灰化または骨化の疾患の治療および／または予防のための方法を提供し、これは、組換えウイルスゲノムを含むアデノ随伴ウイルスベクターであって、前記組換えウイルスゲノムが、ＥＮＰＰ１もしくはＥＮＰＰ３もしくはそれらの機能的に同等の変異体をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している転写制御領域を含む発現カセットを含むアデノ随伴ウイルスベクター、または前記ウイルスベクターを含む医薬組成物の前記対象への投与を含む。
別の態様では、本発明の組成物および方法によって治療を受ける病的石灰化または骨化の疾患は、Ｘ連鎖性低リン酸血症（ＸＬＨ）、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、ミネラル骨障害（ＭＢＤ）、血管石灰化、軟組織の病的石灰化、軟組織の病的骨化、乳児の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、後縦靱帯骨化症（ＯＰＬＬ）からなる群から選択される。
本発明によるポリヌクレオチド、ベクターおよびプラスミド
本発明は、ウイルスベクター、例えば、本発明によるＡＡＶベクターを生成するのに有用なポリヌクレオチドにも関する。一実施形態では、本発明は、アデノ随伴ウイルスＩＴＲに隣接する発現カセットを含むポリヌクレオチド（「本発明によるポリヌクレオチド」）に関し、前記発現カセットは、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３またはそれらの機能的に同等の変異体をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している転写制御領域を含む。
一実施形態では、本発明によるポリヌクレオチドは、プロモーター、好ましくは構成的プロモーター、より好ましくは肝臓特異的プロモーター、より好ましくは、アルブミンプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーターおよびアルファ１－アンチトリプシンプロモーターからなる群から選択される肝臓特異的プロモーター（最も好ましくはヒトアルファ１－アンチトリプシンプロモーターである）を含む転写制御領域を含む。別の実施形態では、本発明によるポリヌクレオチドの転写制御領域は、プロモーターに作動可能に連結しているエンハンサー、好ましくは肝臓特異的エンハンサー、より好ましくは肝臓制御領域エンハンサー（ＨＣＲ）をさらに含む。
別の実施形態では、本発明によるポリヌクレオチドの発現カセットは、ポリアデニル化シグナル、より好ましくはＳＶ４０ポリＡをさらに含む。別の実施形態では、本発明によるポリヌクレオチドにコードされるＥＮＰＰ１は、ヒトＥＮＰＰ１およびヒトＥＮＰＰ３からなる群から選択される。
本発明によるポリヌクレオチドは、例えばプラスミドなどのベクターに組み込むことができる。したがって、別の態様では、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターまたはプラスミドに関する。特定の実施形態では、本発明によるポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルスベクターまたはプラスミドに組み込まれる。
好ましくは、アデノ随伴ウイルスの生成に必要なすべての他の構造的および非構造的コード配列は、別のベクター、例えばプラスミドによって、またはパッケージング細胞株中に配列を安定して組み込むことによって、トランスで提供することができるので、ウイルスベクター中に存在しない。
本発明によるＡＡＶを得るための方法
本発明は、本発明によるウイルスベクター、非限定例としてＡＡＶベクターを得るための方法にも関する。前記ＡＡＶベクターは、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を構成的に発現する、またはＲｅｐおよびＣａｐコード配列がプラスミドまたはベクター中に提供される細胞に本発明によるポリヌクレオチドを導入することによって、得ることができる。したがって、別の態様では、本発明は、以下のステップを含む、アデノ随伴ウイルスベクターを得るための方法に関する：
（ｉ）本発明によるポリヌクレオチド、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質、および場合により、ＡＡＶが複製を依存しているウイルスタンパク質を含む細胞を提供するステップ、
（ｉｉ）ＡＡＶのアセンブリーに適切な条件下で細胞を維持するステップ、ならびに
（ｉｉｉ）細胞によって産生されたアデノ随伴ウイルスベクターを精製するステップ。
導入遺伝子をベクター化するための組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の生成は以前に記載されている（Ａｙｕｓｏ Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０，１０：４２３－４３６；Ｏｋａｄａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９，２０：１０１３－１０２１；Ｚｈａｎｇ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９，２０：９２２－９２９；およびＶｉｒａｇ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００９，２０：８０７－８１７）。これらのプロトコールは、本発明によるＡＡＶを生成するために使用する、または適合させることができる。哺乳類細胞および昆虫細胞を含めて、アデノ随伴ウイルスベクターを産生することができる任意の細胞を本発明で使用することができる。
一実施形態では、プロデューサー細胞株は、本発明によるポリヌクレオチド（ＩＴＲに隣接する発現カセットを含む）ならびにＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードし、ヘルパー機能を提供するコンストラクト（複数可）で一過的にトランスフェクトされる。別の実施形態では、細胞株はヘルパー機能を安定して供給し、本発明によるポリヌクレオチド（ＩＴＲに隣接する発現カセットを含む）ならびにＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードするコンストラクト（複数可）で一過的にトランスフェクトされる。
別の実施形態では、細胞株は、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質ならびにヘルパー機能を安定して供給し、本発明によるポリヌクレオチドで一過的にトランスフェクトされる。別の実施形態では、細胞株は、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を安定して供給し、本発明によるポリヌクレオチドおよびヘルパー機能をコードするポリヌクレオチドで一過的にトランスフェクトされる。さらに別の実施形態では、細胞株は、本発明によるポリヌクレオチド、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質ならびにヘルパー機能を安定して供給する。これらおよび他のＡＡＶシステム製造および使用する方法は、当技術分野で説明されている。
別の実施形態では、プロデューサー細胞株は、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質を提供するバキュロウイルス発現ベクターに感染している昆虫細胞株（典型的には、Ｓｆ９細胞）である。このシステムは、アデノウイルスヘルパー遺伝子を必要としない（Ａｙｕｓｏ Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０，１０：４２３－４３６）。
別の実施形態では、ＡＡＶの導入遺伝子送達能力は、アニールして頭－尾コンカテマーを形成することができる２つのゲノムのＡＡＶ ＩＴＲを提供することによって、増大され得る。一般に、宿主細胞へのＡＡＶの侵入の際に、導入遺伝子を含む一本鎖ＤＮＡは、宿主細胞のＤＮＡポリメラーゼ複合体によって二本鎖ＤＮＡに変換され、その後、ＩＴＲは核内でのコンカテマー形成を援助する。代替法として、自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶになるようにＡＡＶを操作することができ、これは、標的細胞中への侵入の際にウイルスベクターが第２鎖合成のステップをバイパスすることを可能にし、より速くかつ潜在的により高い（例えば、１００倍までの）導入遺伝子発現を有するｓｃＡＡＶウイルスベクターを提供する。
例えば、それぞれ導入遺伝子ユニットおよびその相補体をコードする２つの結合した一本鎖ＤＮＡを含むゲノムを有するようにＡＡＶを操作することができ、これらの一本鎖ＤＮＡは、標的細胞中への送達後に一緒にかみ合い（ｓｎａｐ ｔｏｇｅｔｈｅｒ）、目的の導入遺伝子ユニットをコードする二本鎖ＤＮＡをもたらすことができる。自己相補的ＡＡＶは当技術分野で説明されている（Ｃａｒｔｅｒ Ｂ、米国特許第６，５９６，５３５号、Ｃａｒｔｅｒ Ｂ、米国特許第７，１２５，７１７号、およびＴａｋａｎｏ Ｈら、米国特許第７，４５６，６８３号）。
好ましくは、すべての構造的および非構造的コード配列（Ｃａｐタンパク質およびＲｅｐタンパク質）は、ベクター、例えばプラスミドによってトランスで提供することができるので、ＡＡＶベクター中に存在しない。Ｃａｐタンパク質は、ＡＡＶウイルスの宿主指向性、細胞、組織または臓器特異性、受容体の使用、感染効率および免疫原性に影響を与えることが報告されている。したがって、ｒＡＡＶで使用するためのＡＡＶ Ｃａｐは、例えば、対象の種（例えば、ヒトまたは非ヒト）、対象の免疫学的状態、長期もしくは短期の治療に対する対象の適合性、または特定の治療用途（例えば、特定の疾患もしくは障害の治療、もしくは特定の細胞、組織もしくは臓器への送達）を考慮して選択することができる。
別の実施形態では、Ｃａｐタンパク質は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶｒｈ１０血清型からなる群のＡＡＶに由来する。別の実施形態では、Ｃａｐタンパク質はＡＡＶ８に由来する。
いくつかの実施形態では、本発明による方法で使用するためのＡＡＶ Ｃａｐは、前述のＡＡＶ Ｃａｐまたはそのコード核酸のうちの１つの変異誘発によって（すなわち、挿入、欠失または置換によって）生成することができる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃａｐは、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％またはそれ以上、前述のＡＡＶ Ｃａｐのうちの１つまたは複数と類似している。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃａｐは、前述のＡＡＶ Ｃａｐの２つ、３つ、４つまたはそれ以上からのドメインを含むキメラである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｃａｐは、２つまたは３つの異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶ由来のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３モノマーのモザイクである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、前述のＣａｐのうちの１つより多くを含む。
いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物で使用するためのＡＡＶ Ｃａｐは、異種配列または他の修飾を含むように操作される。例えば、選択的標的化または免疫回避を与えるペプチドまたはタンパク質配列をＣａｐタンパク質中に操作することができる。あるいは、またはさらに、ｒＡＡＶの表面がポリエチレングリコール化（すなわち、ペグ化された）されるようにＣａｐを化学的に修飾することができ、これは、免疫回避を容易にし得る。Ｃａｐタンパク質を、（例えば、その天然のレセプター結合を除去するために、または免疫原性エピトープをマスクするために）変異誘発することもできる。
いくつかの実施形態では、本発明による方法で使用するためのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質は、前述のＡＡＶ Ｒｅｐまたはそのコード核酸のうちの１つの変異誘発によって（すなわち、挿入、欠失または置換によって）生成することができる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ Ｒｅｐは、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％またはそれ以上、前述のＡＡＶ Ｒｅｐのうちの１つまたは複数と類似している。
別の実施形態では、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびＡＡＶｒｈ１０からなる群から選択されるＡＡＶ血清型に由来する。
いくつかの実施形態では、本発明による方法で使用するための、ＡＡＶが複製を依存しているウイルスタンパク質は、前述のウイルスタンパク質またはそのコード核酸のうちの１つの変異誘発によって（すなわち、挿入、欠失または置換によって）生成することができる。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％またはそれ以上、前述のウイルスタンパク質のうちの１つまたは複数と類似している。
Ｃａｐタンパク質、Ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶが複製を依存しているウイルスタンパク質の機能をアッセイするための方法は、当技術分野で周知である。遺伝子ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐおよびヘルパー機能を提供する遺伝子は、前記遺伝子をベクター、例えばプラスミドなどに組み込み、前記ベクターを細胞に導入することによって、細胞に挿入することができる。遺伝子は同じプラスミドまたは異なるプラスミドに組み込むことができる。別の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子は１つのプラスミドに組み込まれる、ヘルパー機能を提供する遺伝子は別のプラスミドに組み込まれる。本発明による方法を用いた使用に適するＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むプラスミドの例としては、ｐＨＬＰ１９およびｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクター（Ｃｏｌｉｓｉ Ｐ、米国特許第６，００１，６５０号およびＲｕｓｓｅｌｌ Ｄら、米国特許第６，１５６，３０３号）が挙げられる。
本発明によるポリヌクレオチドならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子またはヘルパー機能を提供する遺伝子を含むポリヌクレオチドは、当技術分野で周知である任意の適切な方法によって細胞に挿入することができる。トランスフェクション方法の例としては、限定されないが、リン酸カルシウムとの共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン、ポリブレン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム媒介性融合、リポフェクション、レトロウイルスの感染、およびバイオリスティックトランスフェクションが挙げられる。特定の実施形態では、トランスフェクションはリン酸カルシウムとの共沈殿によって行われる。細胞がＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびにアデノウイルスのヘルパー機能を提供する遺伝子のいずれかの発現を欠く場合、本発明によるポリヌクレオチドと同時に前記遺伝子を細胞に挿入することができる。
あるいは、前記遺伝子は、本発明によるポリヌクレオチドの導入の前または後に細胞に挿入することができる。特定の実施形態では、細胞は、以下の３つのプラスミドで同時にトランスフェクトされる：
１）本発明によるポリヌクレオチドを含むプラスミド
２）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むプラスミド
３）ヘルパー機能を提供する遺伝子を含むプラスミド。
あるいは、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびにヘルパー機能を提供する遺伝子は、エピソーム的におよび／またはパッケージング細胞のゲノムに組み込まれて、パッケージング細胞によって運ばれ得る。
本発明は、ＡＡＶのアセンブリーに適切な条件下で細胞を維持することを含む方法を包含する。パッケージング細胞を培養する方法およびＡＡＶベクター粒子の放出を促進する例示的条件、例えば、細胞可溶化物の生成などは、本明細書の実施例に記載されているように行うことができる。ＡＡＶのアセンブリーおよび培地中へのウイルスベクターの放出を促進するために、プロデューサー細胞を適切な期間増殖させる。一般に、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、最大で約１０日間まで細胞を増殖させることができる。約１０日間後（または、使用される培養条件および特定のプロデューサー細胞に応じてもっと早く）、産生のレベルは、一般に有意に低下する。一般に、培養の時間はウイルス産生の時点から測定される。例えば、ＡＡＶの場合には、ウイルス産生は、一般に、本明細書に記載の適切なプロデューサー細胞においてヘルパーウイルス機能を供給すると開始する。一般に、細胞は、ヘルパーウイルスの感染から（またはウイルス産生が開始してから）約４８～約１００、好ましくは約４８～約９６、好ましくは約７２～約９６、好ましくは約６８～約７２時間後に回収される。
本発明は、細胞によって産生されたアデノ随伴ウイルスベクターを精製する方法を包含する。本発明によるＡＡＶは、ｉ）本発明によるポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞ｉｉ）トランスフェクションから一定期間後、好ましくは７２時間後の前記細胞の培養培地の両方から得ることができる。前記細胞または前記培養培地からのＡＡＶの精製のための任意の方法を本発明によるＡＡＶを得るために使用することができる。特定の実施形態では、本発明によるＡＡＶは、ポリエチレングリコール沈殿ステップおよび２つの連続した塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配に基づいて最適化された方法に従って精製される。本発明による精製されたＡＡＶをＰＢＳに対して透析し、濾過し、－８０℃で保存することができる。ウイルスゲノムの力価は、検量線として直鎖状にしたプラスミドＤＮＡを使用した、ＡＡＶ２参照標準物質について記載されたプロトコール（Ｌｏｃｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０；２１：１２７３－１２８５）に従って、定量的ＰＣＲによって決定することができる。
別の実施形態では、精製は、ポリエチレングリコール沈殿ステップまたは塩化セシウム勾配分画によって、さらに行われる。いくつかの実施形態では、この方法は、精製ステップ、例えば、ベンゾナーゼによる細胞可溶化物の処理、ＣｓＣｌ勾配による細胞可溶化物の精製、またはヘパリン硫酸クロマトグラフィーを使用する細胞可溶化物の精製などをさらに含む（Ｈａｌｂｅｒｔ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００４；２４６：２０１－２１２）。
様々な天然に存在するおよび組換えのＡＡＶ、それらのコード核酸、ＡＡＶ ＣａｐおよびＲｅｐタンパク質およびそれらの配列、ならびに、そのようなＡＡＶ、特に、ＡＡＶの産生での使用に適したそれらのカプシドを単離または生成する、増殖させるおよび精製するための方法は、当技術分野で既知である。
動物モデル
以下は、病的骨化または石灰化の進行を予防するかまたは低減させるためにＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を投与することの有効性を試験するために使用することができる非限定的な動物モデルである。
１．乳児期の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）のＥｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊモデル；Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ＆ Ｍｅｃｈ．６（５）：１２２７－３５。
２．乳児期の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）のＥｎｐｐ１ａｓｊ／ａｓｊモデル；Ｌｉ，ｅｔ ａｌ，２０１４，ＰｌｏＳ ｏｎｅ ９（１２）：ｅｌ １３５４２。
３．弾性線維性仮性黄色腫（ＰＸＥ）のＡＢＣＣ６－／－マウスモデル；Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．１２７（６）：１３９２－４１０２。
４．Ｘ連鎖低ホスファターゼ症（ＸＬＨ）のＨＹＰマウスモデル；Ｌｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．８５（３）：２３５－４６。
５．ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群のＬｍｎａＧ６０９Ｇ／＋マウスモデル；Ｖｉｌｌａ－Ｂｅｌｌｏｓｔａ，ｅｔａｌ，２０１３，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １２７（２４）：２４４２－５１。
６．後縦靱帯の骨化（ＯＰＬＬ）（Ｏｋａｗａ，ｅｔ ａｌ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９（３）：２７１－３；Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｌ０４（６）：４９２－７）および骨関節症（Ｂｅｒｔｒａｎｄ，ｅｔ ａｌ，２０１２，Ａｎｎａｌｓ Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ ７１（７）：１２４９－５３）のつま先歩行（Ｔｉｐ ｔｏｅ ｗａｌｋｉｎｇ）（ｔｔｗ）マウスモデル。
７．アデニン食による慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）のラットモデル；Ｓｃｈｉｂｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９６８，Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．３５（２）：３６３－７２；Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，ｅｔａｌ，２０１１，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．７９（５）：５１２－７。
８．アデニン食による慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）のマウスモデル；Ｊｉａ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＢＭＣ Ｎｅｐｈｒｏｌ．１４：１１６。
９．ＣＫＤの５／６ｔｈ腎摘出ラットモデル；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９６２，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．１１：３２１－３２；Ｓｈｉｍａｍｕｒａ ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９７５，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．７９（１）：９５－１０６。
１０．ＧＡＣＩおよび骨減少症のＥＮＰＰ１ノックアウトマウスモデル；Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ，ｅｔ ａｌ，２０１２，ＰｌｏＳ ｏｎｅ ７（２）：ｅ３２１７７。
上記のような動物モデルは、本発明によるＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３をコードするベクターの投与の際の軟組織石灰化および骨化の変化について試験するために使用される。例えば、以下のマウスモデル：（ａ）Ｎｐｔ２ａ－／－（ｂ）二重突然変異体Ｎｐｔ２ａ－／－／Ｅｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊ、および（ｃ）食餌誘導性の腎結石形成にかけられたＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）（食餌は高カルシウム、低マグネシウム食（例えば、Ｔｅｋｌａｄ Ｌａｂｓ ｄｉｅｔ ＴＤ．０００４２、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）である）。
Ｎｐｔ２ａ－／－マウスは、離乳年齢から一般的な固形飼料を使用して餌を与え、少なくとも１０週齢まで持続する場合に、腎臓結石形成を示す。逆に、二重突然変異体Ｎｐｔ２ａ－／－／Ｅｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスは、一般的な固形飼料を与えた場合のＮｐｔ２ａ－／－マウスと比較した場合に、２倍の腎臓結石形成レベルを呈する。Ｎｐｔ２ａ－／－マウスおよびＮｐｔ２ａ－／－／Ｅｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＭＥから市販されている。二重突然変異体マウス（Ｎｐｔ２ａ－／－／Ｅｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊ）は、当技術分野で既知の標準的なプロトコール（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｒｅｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ，（２００７，１－２９））に従って、Ｎｐｔ２ａ－／－マウスとＥｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスを交雑育種することによって作製される。腎結石関連疾患のためのＮｐｔ２ａ－／－またはＮｐｔ２ａ－／－／Ｅｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊ二重突然変異体マウスモデルは、本発明による治療の有効性を試験するために使用することができる（Ｋｈａｎ ＆ Ｃａｎａｌｅｓ，２０１１，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１８６（３）：１１０７－１３；Ｗｕ，２０１５，Ｕｒｏｌｉｔｈｉａｓｉｓ ４３（Ｓｕｐｐｌ １）：６５－７６）。シュウ酸塩石形成げっ歯類モデル、すなわち、エチレングリコール、ヒドロキシルプリンを与えたマウスもしくはラット、またはマウスおよびラットのシュウ酸ナトリウムの腹腔内注射（Ｋｈａｎ ＆ Ｇｌｅｎｔｏｎ，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ １８４：１１８９－１１９６）、尿酸結石形成（Ｗｕ，ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１（２）：７４２－６）、ならびにシスチン尿症マウスモデル（Ｚｅｅ，ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２３（３）：２８８－２９０；Ｓａｈｏｔａ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｕｒｏｌｏｇｙ ８４（５）：１２４９ ｅ９－１５）も試験することができる。
ある種の実施形態では、文献において、常染色体劣性低リン血症くる病２型（ＡＲＨＲ２）（Ｌｅｖｙ－Ｌｉｔａｎ，ｅｔ ａｌ，２０１０，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎ．８６（２）：２７３－８．）とも称されるヒト疾患ＧＡＣＩの成人型を再現するげっ歯類モデルは存在しない。
ＥＮＰＰ１の酵素活性、ＥＮＰＰ３の酵素活性、血漿ＰＰｉの定量化、マイクロＣＴスキャン、血漿ＰＰｉ取り込みの定量化に関する実験の詳細は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３３２３６－Ｂｒａｄｄｏｃｋら、ＷＯ２０１４／１２６９６５－Ｂｒａｄｄｏｃｋら、ＷＯ２０１７／０８７９３６－Ｂｒａｄｄｏｃｋら、およびＵＳ２０１５／０３５９８５８－Ｂｒａｄｄｏｃｋらの特許出願および公報に詳細に記載されており、それらすべては、本明細書に完全に組み込まれる。
本発明を以下の実施例によりさらに例示し、これは、さらに限定するものとして決して解釈すべきではない。本出願の全体を通して引用されるすべての引用される参考文書（参考文献、登録特許、公開特許出願および同時係属特許出願を含める）の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
実施例：１－ＡＡＶシステムへのＮＰＰ１配列のクローニング、ＡＡＶ感染のためのコンストラクトの生成、ＡＡＶの産生および精製
本実施例で使用されるＡＡＶプラスミドは、ＡＡＶ２由来の２つのＩＴＲに隣接する発現カセットを含む。ＡＡＶ２のゲノムはＡＡＶ８で偽型化することができる。発現カセットは、５から３’の方向に以下のエレメントを有し得る：肝臓特異的エンハンサー肝臓制御領域（ＨＣＲ）、肝臓特異的プロモーターヒトアルファ抗トリプシン（ｈＡＡＴ）、イントロン、Ｎ末端アズロシジンシグナル配列を含むポリペプチド、ＮＰＰ１ ｃＤＮＡ、Ｃ末端Ｆｃ配列、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル。発現カセットは、ＡＡＶ２由来の５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲに隣接する。生成されたコンストラクトを図１の概略図に示す。
ＥＮＰＰ１タンパク質は、独特な膜内ドメインを用いて細胞表面に局在する膜貫通タンパク質である。膜貫通ドメインを取り除くことによってＥＮＰＰ１タンパク質を可溶性にした。ヒトＮＰＰ１（ＮＣＢＩアクセションＮＰ＿００６１９９）を、その膜貫通領域（例えば、ＥＮＰＰ１、ＮＣＢＩアクセションＮＰ＿００６１９９の残基７７～９８）を（ａ）ヒトＮＰＰ２（ＮＣＢＩアクセションＮＰ＿００１ １２４３３５）の残基１２～３０、または（ｂ）ＥＮＰＰ７の残基１～２２、または（ｃ）ＥＮＰＰ５の残基１～２４、または（ｄ）ヒト血清アルブミン、または（ｅ）ヒトアズロシジンからなる群から選択される適切なシグナルペプチド配列と置き換えることによって、可溶性の組換えタンパク質を発現するように改変した。
配列番号（１～４、６～１５、１７～３１および４２～５６）は、いくつかのＥＮＰＰ１－ＦｃおよびＥＮＰＰ３－Ｆｃコンストラクトを示し、これらすべてをＡＡＶシステムへのＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３配列のクローニング、ＡＡＶ感染のためのコンストラクトの生成に使用することができる。
標準的な分子生物学プロトコールを使用して、改変ＮＰＰ１配列をプラスミドにクローニングした。コンストラクトの同じ成分を保有するが、ＮＰＰ１ ｃＤＮＡがなく、およびマルチクローニングサイトを有する非コードプラスミドを使用して、対照としてヌル粒子を産生した。
感染性ＡＡＶベクター粒子は、リン酸カルシウム共沈殿によって、１２５μｇのｒｅｐ／ｃａｐプラスミド（ＡＡＶ粒子のカプシドタンパク質およびウイルス複製に必要なタンパク質を発現する）ならびにアデノウイルスのヘルパー機能を発現する１５０μｇのヘルパープラスミドとともに１２５μｇのベクタープラスミド（ＩＴＲおよび発現カセットを含む）で各ローラボトルをコトランスフェクトすることにより、ローラボトル中で培養されたＨｅｋ２９３細胞中で生成した。各ベクター調製のために、合計で１０個のローラボトルを使用する。トランスフェクションからおよそ３日後に、細胞を回収し、２５００ｇで１０分間遠心分離する。次いで、細胞ペレットおよび培地を別々に処理する。ＴＢＳ（５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０）中で細胞ペレットを完全に再構成した。
３回の凍結／融解サイクル後に、可溶化液を２５００ｇで３０分間遠心分離する。この遠心分離からの上清を培地に添加し、１５時間にわたる８％のＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ）とのインキュベーションによってベクター粒子を沈殿させ、２５００ｇで３０分間ペレット化する。細胞および培地からのベクターを含むペレットをＴＢＳ中で完全に再構成し、ベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ）で３７℃で３０分間処理し、１０，０００ｇで１０分間遠心分離する。１．３～１．５ｇ／ｍｌのＣｓＣｌ密度ステップ勾配を含む３７．５ｍｌウルトラクリアチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ）に上清を装填し、ＳＷ２８ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）中で２８，０００ｒｐｍで１７時間遠心分離する。１０ｍｌのシリンジおよび１８ゲージのニードルを使用してウイルスのバンドを収集し、これを新しい１２．５ｍｌのウルトラクリアチューブに移し、このチューブは、連続勾配を生成するように１．３７９ｇ／ｍｌのＣｓＣｌ溶液で満たされている。ＳＷ４０Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ）中でチューブを３８，０００ｒｐｍで４８時間遠心分離する。最後に、完全な粒子のバンドを収集し、１０ＫＤａ膜（Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してＰＢＳ中で透析し、０．４５μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターで濾過する。このＰＥＧおよびＣｓＣｌベースの精製プロトコールは、空のＡＡＶカプシドならびにウイルスストック由来のＤＮＡおよびタンパク質不純物を劇的に低減させ、したがって、ＡＡＶ純度を高め、最終的に、インビボでより高い形質導入をもたらす。いかなるＥＮＰＰタンパク質もコードしない「ヌル」ベクターを保有する感染性ＡＡＶ粒子を生成するために、同じプロトコールを使用する。
実施例－２－異なるシグナル配列を使用したＥＮＰＰ１の発現
ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３哺乳動物細胞において安定なトランスフェクションを確立することによって、ＥＮＰＰ１を生成する。安定な細胞株を確立するために、ＥＮＰＰ１融合タンパク質（例えば、本明細書の他の個所で開示される配列）をコードする核酸配列を大規模なタンパク質産生に適したベクター中に配置する。商業的供給元から入手可能な様々なそのようなベクターが存在する。
例えば、図３は、適切なエンドヌクレアーゼ制限部位を用いてｐｃＤＮＡ３プラスミドにクローニングされたＮＰＰ２シグナル－ＮＰＰ１－Ｆｃ、ｐｃＤＮＡ３プラスミドにクローニングされたＮＰＰ７シグナル－ＮＰＰ１－Ｆｃ、およびｐｃＤＮＡ３プラスミドにクローニングされたアズロシジンシグナル－ＮＰＰ１－Ｆｃのプラスミドマップを示す。エレクトロポレーションまたはリポフェクタミンなどの確立された技法を使用して、所望のタンパク質コンストラクトを含むｐｃＤＮＡ３プラスミドを発現プラスミドに安定的にトランスフェクトし、抗生物質選択下で細胞を増殖させて、安定的にトランスフェクトされた細胞を増やす。
次いで、単一の安定的にトランスフェクトされた細胞のクローンを確立し、所望の融合タンパク質の高発現クローンをスクリーニングする。ＥＮＰＰ１タンパク質発現のための単一細胞クローンのスクリーニングは、ＥＮＰＰ１ついて以前に述べられているように（Ｓａｕｎｄｅｒｓ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．７（１０）：３３５２－６２；Ａｌｂｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．６：１０００６）、合成酵素基質ｐＮＰ－ＴＭＰを使用して、９６ウェルプレートにおいてハイスループットで行う。
スクリーニングを通して高発現クローンを特定すると、タンパク質産生は、ＥＮＰＰ１について以前に述べられているように（Ａｌｂｒｉｇｈｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．６：１０００６）、振盪フラスコ中で、またはバイオリアクターを使用して、行う。ＥＮＰＰ１の精製は、当技術分野で既知の標準的な精製技法の組み合わせを使用して行う。
図２で示されるように、アズロシジンシグナル配列を含むコンストラクトは最も高い量のＮＰＰ１タンパク質を産生する。アズロシジンシグナル配列を使用して産生されたＥＮＰＰ１タンパク質の量（７３１ｍｇ／リットル）は、ＮＰＰ２（１２７ｍｇ／リットル）を使用して、またはＮＰＰ７（１３６ｍｇ／リットル）シグナル配列を使用して産生されたＥＮＰＰ１タンパク質と比較した場合よりも驚いたことに５倍高い。このようにして産生されたＥＮＰＰ１タンパク質を上記のようなさらなる技法および／またはクロマトグラフィーステップを使用してさらに精製して、約９９％の純度などの実質的により高い純度に到達させる。
このようにして産生されたＥＮＰＰ１の酵素活性は、ＨＰＬＣを使用して、ヒトＮＰＰ１によるＡＴＰの定常状態の加水分解を決定することによって測定する。手短に言えば、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４．５ｎＭ ＫＣｌ、１４μＭ ＺｎＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍＭ ＣａＣｌ２を含む反応緩衝液中の様々な濃度のＡＴＰに１０ｎＭ ＥＮＰＰ１を添加することによって、酵素反応を開始する。様々な時点で、５０μｌの反応溶液を取り出し、当量の３Ｍギ酸でクエンチする。クエンチした反応溶液を５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．０）溶液中で平衡化したＣ－１８（５μｍ、２５０×４．６ｍｍ）カラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）に装填し、０％～２０％のメタノール勾配で溶出する。基質および生成物を２５９ｎｍのＵＶ吸光度によってモニターし、それらの対応するピークの積分と検量線によって定量化した。このように、ＥＮＰＰ１タンパク質は、本明細書およびＰＣＴ／２０１４／０１５９４５－Ｂｒａｄｄｏｃｋら；ＰＣＴ／２０１６／０３３２３６－Ｂｒａｄｄｏｃｋら、およびＰＣＴ／２０１６／０６３０３４－Ｂｒａｄｄｏｃｋらの他の個所で論じられるプロトコールに従って特徴づけられる。
実施例－３－ＥＮＰＰ１－ＦｃをコードするＡＡＶウイルス粒子のマウスへの注射ならびに体重増加、骨密度、骨強度および骨量の測定
マウスモデル、例えば、Ｅｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスモデル、ＡＢＣＣ６－／－マウスモデル、ＨＹＰマウスモデル、ｔｔｗマウスモデル、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）のマウスモデル、またはＣＫＤの５／６ｔｈ腎摘出ラットモデルを使用して、ＮＰＰ１またはＮＰＰ３をコードし発現することができるベクターの送達の有効性を試験する。非限定例として、以下の実験は、マウスモデルとしてＥｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスを、マウスモデルに送達されるポリヌクレオチドとしてアズロシジン－ＮＰＰ１－Ｆｃコンストラクトを使用し、送達は、インビボで、ＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質をコードするＡＡＶ粒子（実施例１に示すように調製した）を使用することによって、行う。
病的石灰化または骨化の疾患を治療するための遺伝子療法の有効性を試験するために、代替マウスモデル、本発明に開示されている異なるＥＮＰＰ１融合タンパク質（ＥＮＰＰ１－アルブミン、もしくはＥＮＰＰ１－Ｆｃ、もしくはＥＮＰＰ１機能的同等物、もしくはＦｃもしくはアルブミンドメインを欠くＥＮＰＰ１など）、または異なるＥＮＰＰ３融合タンパク質（ＥＮＰＰ３－Ｆｃ、もしくはＥＮＰＰ３－アルブミン、もしくはＦｃもしくはアルブミンドメインを欠くＥＮＰＰ３、もしくはＥＮＰＰ３機能的同等物など）をコードする、代替シグナル配列（ＮＰＰ２、ＮＰＰ５、ＮＰＰ７、アルブミンまたはアズロシジなど）を含む代替ポリヌクレオチドコンストラクトを使用することによって、同じ実験を反復することができることを当業者は認識するであろう。実験で利用するアズロシジン－ＮＰＰ１－Ｆｃコンストラクトは、概念実証としてヒトＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質をコードし、ヒトＥＮＰＰ３－Ｆｃをコードするアズロシジン－ＮＰＰ３－Ｆｃコンストラクトを用いて同じ実験を反復することができる。
本実験では４セットのマウスを使用し、各セットは、少なくとも５匹のマウス（６～８週齢）を有し、ＡＡＶ粒子の注射前に、１０００μｇ／ｍｌの濃度（２５～４０μｇ／動物の最終用量）のＴｉｔｅｒ ＧＫ１．５ＣＤ４抗体の腹腔内注射によって全セットのマウスを寛容化して、ＡＡＶコンストラクトによって産生されるヒトタンパク質に対するマウスの免疫応答を低減させ、対照群として働くＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第１のコホートにヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射し、対照群として働くＥＮＰＰ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスの第２のコホートにヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射し、研究群として働くＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第３のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ粒子を注射し、試験群として働くＥＮＰＰ１ ａｓｊ／ａｓｊの第４のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むＡＡＶ粒子を注射する。寛容化の注射は、各コホートへのＡＡＶ注射後、週１回（すなわち、ＡＡＶ投与後７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、８４、９１、９８および１０５日目に）反復する。
実験のマウスに、リンが強化されマグネシウム含量が低減している促進食（ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ ｄｉｅｔ）（（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ、Ｒｏｄｅｎｔ ｄｉｅｔ ＴＤ．００４４２、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）または通常の固形飼料（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｃｌａｖａｂｌｅ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ ５０１０；ＰＭＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｂｒｅｎｔｗｏｏｄ、ＭＯ）のいずれかを与え、６～８週齢後に、ＰＢＳ ｐＨ７．４中の約１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、好ましくは１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／ｋｇの後眼窩注射または尾静脈注射をすべてのマウスに行う。注射するベクターは、空「ヌル」（対照群）であるか、またはＮＰＰ１遺伝子（研究群）を保有するかのいずれかである。体重測定を１日１回行い、ＡＡＶ注射後の体重のいかなる増加または低下も記録する。マウスから血液、尿、骨および組織試料を収集し、以下のように分析する。実験プロトコールは、Ａｌｂｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１５ Ｄｅｃ １；６：１０００６、およびＣａｂａｌｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１７；１２（７）：ｅ０１８００９８に詳細に収載されており、それらのすべての内容は、参照により完全に本明細書に組み込まれる。研究の終わり（７、２８および１１２日目に、イソフルランによる深麻酔下での眼窩採血に続いてすべてのマウスを安楽死させ、生命の維持に必要な臓器を技術分野で説明されているように取り出す（Ｉｍｐａｉｒｅｄ ｕｒｉｎａｒｙ ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｐｔ２ａ－／－ ｍｉｃｅ．，Ｃａｂａｌｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１７ Ｊａｎ １；３１２（１）：Ｆ７７－Ｆ８３；Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｎｐｔ２ａ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ｔｏ ｄｉｅｔａｒｙ ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ，Ｌｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１７；１２（４）：ｅ０１７６２３２．）。
血漿ＰＰｉの定量化
ヘパリン化したマイクロピペットを使用して動物を後眼窩出血させ、ヘパリン処理したエッペンドルフチューブ中に血液を分注し、これを氷上に置く。４℃の予め冷却した微量遠心機中で４，０００ｒ．ｐ．ｍで５分間試料を回転させ、血漿を収集し、１容量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－酢酸ｐＨ＝８．０に希釈する。収集した血漿を超遠心分離（ＮａｎｏＳｅｐ ３００Ｋ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｕｒ、ＭＩ）によって３００ＫＤａ膜を通して濾過し、－８０℃で凍結する。ピロリン酸は、ウリジン５’ジホスホ［１４Ｃ］グルコースを使用する標準的な３ステップ酵素的アッセイを使用して定量化して、反応生成物、すなわち、ウリジン５’ジホスホ［１４Ｃ］グルコン酸を記録する（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｔ ｔｈｅ ｐｉｃｏｍｏｌｅ ｌｅｖｅｌ．Ｃｈｅｕｎｇ ＣＰ， Ｓｕｈａｄｏｌｎｉｋ ＲＪ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７７ Ｎｏｖ；８３（１）：６１－３）。手短に言えば、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、９０ｍＭ ＫＣＬ、６３ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ７．６）、１ｎｍｏｌ ＮＡＤＰ＋、２ｎｍｏｌグルコース１，６－二リン酸、４００ｐｍｏｌウリジン５’－ジホスホグルコース、０．０２μＣｉウリジン５’ジホスホ［１４Ｃ］グルコース、０．２５ユニットのウリジン５’－ジホスホグルコースピロホスホリラーゼ、０．２５ユニットのホスホグルコースムターゼ、０．５ユニットのグルコース６－リン酸脱水素酵素および無機ピロリン酸（５０～２００ｐｍｏｌ）を含む反応混合物（１００μｌ）を３７℃で３０分間インキュベートした。水に十分に懸濁させた２００μｌの２％チャコールを添加することによって、反応を終了する。次いで、上清の２００μｌのアリコートをシンチレーション溶液中でカウントする。
インビボでの９９ｍＰＹＰイメージング
必要に応じて、骨イメージングを行うことができる。骨イメージング剤９９ｍＴｃ－ピロリン酸Ｐｈａｒｍａｌｕｃｅｎｃｅ，Ｉｎｃ）を、二重の１ｍｍピンホールコリメータ（Ｘ－ＳＰＥＣＴ、Ｇａｍｍａ Ｍｅｄｉｃａ－Ｉｄｅａｓ）３８を用いる前臨床マイクロＳＰＥＣＴ／ＣＴハイブリッドイメージングシステムを使用した動物のコホートで評価する。２～５ｍＣｉの放射標識されたトレーサーを各動物に腹腔内注射し、注射から１～１．５時間後にこの動物をイメージングする。ＳＰＥＣＴ画像との解剖学的共存のために、ＣＴスキャン（５０ｋＶｐ、８００ｕＡおよび１．２５の拡大係数で５１２投影）を得る。反時計回りでコリメータヘッドあたり１８０°、３２投影、７．０ｃｍのＲＯＲ、８．９５ｃｍのＦＯＶおよび１４０ｋｅＶ±２０のエネルギーウィンドウでの投影あたり６０秒で、ＳＰＥＣＴイメージングを得る。ＣＴ画像は、フィルター処理された逆投影を使用してＦＬＥＸ Ｘ－Ｏ ＣＴソフトウェア（Ｇａｍｍａ Ｍｅｄｉｃａ－Ｉｄｅａｓ）で再構成するものとする。ＳＰＥＣＴ画像は、ＦＬＥＸ ＳＰＥＣＴソフトウェア（５回の繰り返し、４つのサブセット）を使用して再構成するものとし、続いて、ＣＴ画像と融合させ、ＡＭＩＲＡソフトウェアを使用して分析する。
９９ｍＰＹＰ取り込みの定量化
９９ｍＰＹＰのマウスのスキャンのために、注射の７日以内に動物をイメージングする。得られたＳＰＥＣＴスキャンをＮＩＨのＩｍａｇｅＪ画像処理ソフトウェアにインポートし、各動物の頭（標的臓器）および全身を囲んで目的の領域を描く。「注射用量パーセント（ｐｅｒ ｃｅｎｔ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｄｏｓｅ）」と称されることが多い注射放射能パーセント（Ｐｅｒ ｃｅｎｔ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ）（ＰＩＡ）は、頭のカウント対全身のカウントの比を比較することによって計算し、注射用量パーセントとして表して、目的の領域（頭）によって放射性トレーサーが取り込まれる親和性の尺度を得る。各スキャンの全カウントを注射用量の全身尺度と見なす。
血液および尿のパラメーター
生化学的分析はまた、午前１０時から午後２時の間の同じ時刻に同時に、一晩の絶食の後に収集された（眼窩採血によって得られた）血液試料およびスポット尿を使用して行うことができる。濾過（ＮａｎｏＳｅｐ ３００ Ｋ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）による、ヘパリン処理した血漿の除タンパクに続いて、蛍光プローブ（ＡＢ１１２１５５、ＡＢＣＡＭ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用して、血漿および尿の全ピロリン酸（ＰＰｉ）濃度を決定する。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって、またはアッセイ間の変動性を調整するための適切な対照を使用するＥＬＩＳＡによって測定された尿クレアチニンに対して、尿ＰＰｉを補正する。
腎臓の組織像
左側の腎臓を４％ホルマリン／ＰＢＳ中で４℃で１２時間固定し、次いで、エタノールおよびキシレンの濃度を増大させて脱水し、続いて、パラフィン包埋する。１％メチルグリーンで対比染色された１０ｕｍのフォンコッサ染色切片でミネラルの沈着を測定する。形態的評価として、ヘマトキシリン／エオシンを対比染色として使用する。皮質、髄質および腎盂（ｐｅｌｖｉｓ）を含む矢状腎臓切片の組織形態計測的評価は、オステオメジャー（Ｏｓｔｅｏｍｅａｓｕｒｅ）システム（Ｏｓｔｅｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）を使用して、２人の独立した観察者によって盲検化して行う。石灰化面積パーセントは、式：％計算面積＝１００＊石灰化面積／全面積（皮質、髄質および腎盂（ｐｅｌｖｉｃ）管腔を含む）を使用して決定し、切片あたりの観察された領域の数に依存する。ミネラル化のサイズは、式：計算サイズ＝石灰化面積／切片あたりの観察された石灰化の数を使用して決定する。
透過型電子顕微鏡のために、左側の腎臓の１ｍｍ３のブロックを２．５％グルタルアルデヒドおよび２％パラホルムアルデヒドのリン酸緩衝食塩水中で２時間固定し、続いて、１％オスミウム液中で後固定を２時間行う。一連のエタノール濃度（５０％～１００％）を使用して脱水を行う。腎組織をエポキシ樹脂に包埋し、重合を６０℃で一晩行う。薄切片（５０ｎｍ）を調製した後、組織をウラニウムおよび鉛で二重染色し、これをＴｅｃｎａｉ Ｂｉｏｔｗｉｎ（ＬａＢ６、８０ｋＶ）（ＦＥＩ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、ＯＲ）を使用して観察する。
組織像、組織形態計測およびマイクロＣＴ
マウスの脛骨および大腿骨は、軟組織をはぎとり、７０％エタノール中で固定し、脱水し、メタクリル酸メチル中に包埋してから、切片を作り、トルイジンブルーで染色する（Ｃ．Ｂ．Ｗａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｏｗ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｇｅｎｅ ｃａｕｓｅｓ ｐｌａｃｅｎｔａｌ，ｓｋｅｌｅｔａｌ，ｎｅｕｒａｌ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｄｅｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｐｅｒｉｎａｔａｌ ｄｅａｔｈ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１，１２８３－１２９９（１９９５））。組織形態計測的な測定は、一次海綿質に対応する成長板の直下の固定された領域で行い（Ａ．Ｍ．Ｐａｒｆｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｎｅ ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ：ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，ｓｙｍｂｏｌｓ，ａｎｄ ｕｎｉｔｓ．Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ ＡＳＢＭＲ Ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ ２，５９５－６１０（１９８７））、オステオメジャーソフトウェア（Ｏｓｔｅｏｍｅｔｒｉｃｓ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）によって分析する。骨は、Ｓｃａｎｃｏ μＣＴ－３５（Ｓｃａｎｃｏ、Ｂｒｕｔｉｓｓｅｌｌｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してスキャンし、成長板直下の近位脛骨および遠位大腿骨（骨梁骨）と脛骨または大腿骨の中央骨幹（皮質骨）の両方で多数の構造パラメーターを分析する。
骨の生体力学的試験
促進食をとっているマウスの大腿骨は、三点曲げで破壊するまで荷重し、通常の固形飼料をとっているマウスの大腿骨は、４点曲げで破壊するまで荷重する。すべての全骨試験は、前方の４分の１区が引張荷重を受けるように、後方から前方の方向へ大腿骨に荷重することによって行う。４点曲げ装置の下部支持物および上部支持物の幅は、それぞれ７ｍｍおよび３ｍｍである。試験は、サーボ油圧試験機（Ｉｎｓｔｒｏｎモデル８８７４；Ｉｎｓｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｎｏｒｗｏｏｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、０．０５ｍｍ／秒のたわみ速度で行う。荷重およびミッドスパンのたわみは、２００Ｈｚのサンプリング周波数で直接得る。荷重－たわみ曲線を剛性、最大荷重および破断までの仕事量について分析する。降伏は、初期の接線剛性と比較して、割線剛性（たわみ範囲に対して正規化された荷重範囲）の１０％の低減と定義される。大腿骨は室温で試験し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で湿潤に保つ。破壊時のたわみから降伏時のたわみを引いたものと定義される降伏後のたわみも同様に測定する。
実施例４－ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するウイルスベクターを使用した慢性腎臓疾患の治療
以下の実施例は、ＣＫＤと関連する血管石灰化および症状の治療に有効であることが予想されるＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶを提供する。例示を目的としてＥＮＰＰ１－ＦｃおよびＥＮＰＰ３－Ｆｃを本実施例で使用し、本発明の他のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合体を使用して同様の結果を得ることができる。
ＥＮＰＰ１－ＦｃおよびＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するＡＡＶビリオンを実施例１に従って作製し、ＣＫＤマウス（これは、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）のモデルである（ＢＭＣ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，２０１３，１４：１１６）に投与する。ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３による治療のために、６セットのマウスを使用する。
対照コホート：本実験では、対照群として働くＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第１のコホートにヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射し、対照群として働くＣＫＤマウスの第２のコホーにヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ１治療マウスのコホート：ＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第３のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、ＣＫＤマウスの第４のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ３治療マウスのコホート：ＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第５のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、ＣＫＤマウスの第６のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。
アデニン食：ＣＫＤマウスをアデニン食で維持し、一方で野生型マウスを通常の固形飼料（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｃｌａｖａｂｌｅ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ ５０１０；ＰＭＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｂｒｅｎｔｗｏｏｄ、ＭＯ）で維持する。ＣＫＤマウスが摂取するアデニン含有固形飼料を提供するために、アデニンを臭いおよび味を鈍らせるカゼインベースの食餌と混合する。アデニンはＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭＯ、ＵＳＡ）から購入し、粉末化したカゼインベースの食餌はＳｐｅｃｉａｌ Ｄｉｅｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＳＤＳ、ＵＫ）（参照番号８２４５２２）から購入する。食餌の他の成分は、トウモロコシデンプン（３９．３％）、カゼイン（２０．０％）、マルトデキストリン（１４．０％）、ショ糖（９．２％）、トウモロコシ／トウモロコシ油（５％）、セルロース（５％）、ビタミン混合物（１．０％）、ＤＬ－メチオニン（０．３％）および重酒石酸コリン（０．２％）である。
ベクターの注射：２週齢後に、マウスあたり、ＰＢＳ ｐＨ７．４中の約１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、好ましくは、１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／ｋｇの後眼窩注射または尾静脈注射をすべてのマウスに行う。注射するベクターは空「ヌル」（対照群）であるか、またはＮＰＰ１もしくはＮＰＰ３遺伝子を（研究群）保有していたかのいずれかである。
アッセイ：腎臓の組織像、ＰＰｉレベルおよび血液尿パラメーター、例えば、ＦＧＦ－２３レベル、ビタミンＤ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）レベル、血清／血液尿素レベル、血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベル、血清／血液クレアチンレベルおよび血漿ピロリン酸（ＰＰｉ）を実施例３に記載されているように各コホートについて分析する。尿は、自発的な排尿後にスポット尿試料として収集する。血清および尿のカルシウム、リン、クレアチニンおよび尿素レベルは、Ｋｏｎｅｌａｂ ２０ＸＴｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｉｎｌａｎｄ）で測定する。クレアチニン濃度は比色アッセイ（ＢｉｏＣｈａｉｎ、ＣＡ ＵＳＡ）で確認する。ＰＴＨはマウスインタクトＰＴＨ ＥＬＩＳＡキット（Ｉｍｍｕｔｏｐｉｃｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって測定し、ＦＧＦ２３レベルはインタクトＦＧＦ２３ ＥＬＩＳＡ（Ｋａｉｎｏｓ、Ｊａｐａｎ）で測定し、ビタミンＤはＥＩＡキット（Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）で測定する。実験の詳細は、ＢＭＣ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，２０１３，１４：１１６、およびＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１７ Ｊｕｌ １３；１２（７）に収載される。
結果：未治療のＣＫＤマウスは、一般に、体重の低減および減退する腎臓機能の徴候、例えば、尿中尿素／血清尿素および尿クレアチニン／血清クレアチニンの比の低下を示す。これに対して、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質を発現するＡＡＶで治療したＣＫＤマウスは、正常なＷＴマウスの体重範囲に近づく体重の増加を示すことが予想される。一般に、８０～１００ｍｇ／ｄＬの範囲の血清尿素レベルは最適であると考えられる。１００ｍｇ／ｄＬを超える尿素レベルは、体重減少および身体活動の低減とともに罹患率の増加と関連する。治療した（ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を有するＡＡＶ）ＣＫＤマウスは、より高い尿中尿素／血清尿素比につながる血清尿素レベルの低下および尿中尿素レベルの増加によって顕在化される腎臓機能の改善を示すことが予想される。
ＣＫＤマウスの腎臓組織の腎組織像分析は、尿細管管腔、微小膿瘍および拡張した尿細管などの領域における結晶構造体の沈着、拡張したボーマン腔を示す過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色、タンパク円柱をともなう萎縮性尿細管の存在（「甲状腺化」）および尿細管基底膜の肥厚をともなう尿細管萎縮、Ｌａｄｅｗｉｇ染色を通して見ることができる軽度の間質線維化の存在、ならびにフォンコッサ染色を通して見られる尿細管構造の広範な石灰化の出現を示すことが予想される。これに対して、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３で本発明に従って治療したＣＫＤマウスは、健康な野生型マウスのものと類似した組織像で、尿細管管腔および軟組織血管構造中に腎ミネラル沈着の低減または該沈着がないことを示すことが予想される。
未治療のＣＫＤマウスは、健康な野生型マウスのもの（ＰＰｉの正常レベルは約２～４μＭであり；ＰＴＨについては約１０～６５ｎｇ／Ｌであり；ＦＧＦ２３レベルの中央値は１３ＲＵ／ｍｌであり、正常なＦＧＦ２３レベルは５～２１０ＲＵ／ｍｌの範囲であり；正常なビタミンＤレベルは２０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬである）と比較した場合に、有意な血清無機リン（ｐｉ）の増加、ＰＴＨおよびＦＧＦ２３レベルの増加を示すが、１，２５（ＯＨ）２－ビタミンＤレベルの低下、およびより低いＰＰｉレベル（約０．５μＭ）を示すことが予想される。これに対して、治療したＣＫＤマウスは、ＰＰｉレベルの上昇（約４～５μＭ）を示すことが予想され、これは、未治療のＣＫＤマウスで見られるＰＰｉレベル（約０．５μＭ）よりも高いことが予想される。したがって、組織学的解析を通して可視化される腎臓の軟組織および冠動脈の石灰化の低減（２５％または５０％または７０％または９０％または１００％の低減）、血液分析からの血清ＰＰｉレベルの増加、ビタミンＤレベルの正常化、正常な範囲に対するＦＧＦ２３レベルの低減、ＰＴＨレベルの正常化、生存時間の増加、体重増加の増大とともに尿中尿素およびクレアチンの増加によって観察される腎臓機能の改善のような１つまたは複数の因子の観察によって、当業者は、慢性腎臓疾患の治療におけるベクターベースのＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の治療有効性を決定することができる。
ヒト対象の治療：
ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を送達および発現させることができる、対象あたり、ｐＨ７．４の１×ＰＢＳ中におよそ５×１０１１～５×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、いくつかの実施形態ではｐＨ７．４の１×ＰＢＳ中におよそ１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇを含む静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎａｌ）注射をすることによって、ＣＫＤを罹患するヒト患者を治療する。ＣＫＤの治療の成功は、マウスモデルについて述べたような定期的な血液および尿検査を通して１種または複数の前述のパラメーターモニターすることによって観察される。生きている患者で実施することが可能ではない、腎臓スライスまたは動脈組織の染色を必要とする組織学的解析ではなくて、代わりに、ＣＴスキャン、超音波または静脈性腎盂造影のような、技術分野で一般に知られている非侵襲的可視化技法を使用して、ＣＫＤを罹患する患者において石灰化の存在ならびにベクターベースのＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の送達および発現に応じた石灰化の低減を可視化する。静脈性腎盂造影は、尿路を可視化し、腎石灰化の存在を検出するのを支援するための色素として機能する造影剤を使用するＸ線検査である。コンピュータ断層撮影は、尿路などの体の内部構造を描写するためにＸ線技術を使用する非侵襲的イメージング技法である。腎石灰化はＣＴスキャンで可視化される。ＣＴスキャンは、体の周りの様々な角度からＸ線画像を収集して、詳細な断面画像ならびに体の内部構造および臓器の３次元画像を生成する。ＣＴスキャンは、動脈で使用して、治療後の石灰化の存在およびその後の石灰化の低減を検出することもできる。コンピュータは、体を通って透過した放射線を分析して、内部構造および臓器の画像を再構築する。
軟組織の石灰化、心臓の石灰化、心筋梗塞を可視化する技能を有する医師は、ヒトＥＮＰＰ１またはヒトＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶビリオンを投与することによって、ＣＫＤに罹患した対象の治療を企てる。医師は、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３のコンストラクトを送達し、誘導性プロモーターの制御下にある対応するタンパク質を発現するウイルス粒子を投与する。したがって、医師は、症状の改善の速度および範囲に基づいて投与量（発現されるｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３の量）を制御するためのオプションを有する。治療の成功は、腎臓機能の改善、尿中クレアチンレベルの改善（尿中の正常なクレアチンレベルは、男性について４０～２７８ｍｇ／ｄＬであり、女性について２９～２２６ｍｇ／ｄＬである）および尿中尿素レベルの改善（成人についての尿中の正常な尿素レベルは、２６～４３ｇ／２４時間である）、正常な血清クレアチンレベル（正常な血清クレアチニン範囲は、女性で０．６～１．１ｍｇ／ｄＬであり、男性で０．７～１．３ｍｇ／ｄＬである）、正常なビタミンＤレベル（２０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍＬが健康な人々にとって適切であると考えられる。１２ｎｇ／ｍＬ未満のレベルはビタミンＤ欠乏を示す）、正常な血中尿素窒素レベル（健康な成人についてのＢＵＮレベルは７～２０ｍｇ／ｄＬである）、体重増加、血清ＰＰｉレベルの増加（少なくとも約４～５μｍ）、動脈組織の石灰化の低減（２５％もしくは５０％もしくは７０％もしくは９０％もしくは１００％の低減）、ならびにまたはＣＴもしくは超音波スキャンなどの非侵襲的技法によって可視化される腎臓尿細管の石灰化の低減などの１つまたは複数の陽性症状を観察することによって、本分野の医療専門家によって観察される。
実施例５－ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するウイルスベクターを使用したＧＡＣＩの治療
以下の実施例は、ＧＡＣＩと関連する血管石灰化および症状の治療に有効であることが予想されるＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶを提供する。例示を目的としてＥＮＰＰ１－ＦｃおよびＥＮＰＰ３－Ｆｃを本実施例で使用し、本発明の他のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合体を使用して同様の結果を得ることができる。
ＥＮＰＰ１－ＦｃおよびＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するＡＡＶビリオンを実施例１に従って作製し、Ｅｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊマウス（これは、乳児期の全身性動脈石灰化のモデルである（Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ＆ Ｍｅｃｈ．６（５）：１２２７－３５）に投与する。ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３による治療のために、６セットのマウスを使用する。
対照コホート：本実験では、対照群として働くＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第１のコホートにヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射し、対照群として働くＥＮＰＰ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスの第２のコホートにヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ１治療マウスのコホート：ＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第３のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、ＥＮＰＰ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスの第４のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ３治療マウスのコホート：ＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第５のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、ＥＮＰＰ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスの第６のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。野生型マウスを通常の固形飼料で維持し、Ｅｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスに高リン酸Ｔｅｋｌａｄ食を与える。
ベクターの注射：２週齢後に、マウスあたり、ＰＢＳ ｐＨ７．４中の約１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、好ましくは１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／ｋｇの後眼窩注射または尾静脈注射をすべてのマウスに行う。注射するベクターは空「ヌル」（対照群）であるか、またはＮＰＰ１またはＮＰＰ３遺伝子（研究群）を保有していたかのいずれかである。
アッセイ：腎臓の組織像、ＰＰｉレベルおよび血液尿パラメーター、例えば、ＦＧＦ－２３レベル、ビタミンＤ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）レベル、血清／血液尿素レベル、血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベル、血清／血液クレアチンレベルおよび血漿ピロリン酸（ＰＰｉ）を実施例３および４に記載されているように各コホートについて分析する。
結果：未治療のＥｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスは、一般に、体重の低減および死亡率の増加を示す。これに対して、ＥＮＰＰ１タンパク質またはＥＮＰＰ３タンパク質を発現するＡＡＶで治療したＥｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスは、正常なＷＴマウスの体重範囲に近づく体重の増加を示すことが予想される。
ヌルベクターで治療したＥｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスは、心臓、大動脈および冠動脈の石灰化、ならびに右心室の自由壁における心筋梗塞の組織学的エビデンス、冠動脈、心臓、上行大動脈および下行大動脈の石灰化、心筋の細胞壊死、ならびに冠動脈の石灰化の領域に隣接する心筋組織における心筋線維化を示すことが予想される。これに対して、ＥＮＰＰ１－ＦｃまたはＥＮＰＰ３－Ｆｃを発現するＡＡＶで治療したＥｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊ動物は、組織像または死後のマイクロＣＴで、心臓、動脈または大動脈の石灰化がないことを示すことが予想される。ヌルベクターで治療したＥｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスは、外髄質を中心とし、腎皮質への拡大をともなう激しい広範な石灰化とともに、腎髄質を中心とした石灰化も示す。これに対して、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を用いて本発明に従って治療したＥｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスは、健康な野生型マウスのものと類似した組織像で、尿細管管腔および軟組織血管構造中に腎ミネラル沈着の低減または該沈着がないことを示すことが予想される。
生存時間、毎日の動物の体重、および終わりの組織像に加えて、血管石灰化、血漿ＰＰｉ濃度、および９９ｍＴｃ ＰＰｉ（９９ｍＰＹＰ）の取り込みをイメージングするための死後の高解像度マイクロＣＴスキャンによって治療応答を評価する。未治療の（ヌルベクター）Ｅｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊコホートの大動脈、冠動脈および心臓で予想される劇的な石灰化と対照的に、ＷＴおよび治療した（ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するベクター）Ｅｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊのいずれも、マイクロＣＴを介して任意の血管石灰化を有さないことが予想される。さらに、治療した（ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するベクター）Ｅｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊ動物の血清ＰＰｉ濃度（５．２μＭ）は、ＷＴレベル（４．４μＭ）まで上昇し、未治療のｅｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊのレベル（０．５μＭ）を有意に上回ることが予想される。
９９ｍＰＹＰは、心臓イメージングおよび骨リモデリングで典型的に用いられるイメージング剤である。これは、ヒドロキシアパタイトの表面に局在し、次いで、破骨細胞に取り込まれ得るので、異常に高い骨再構築活性の領域に感受性である。未治療のＥｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊ動物の週１回の連続的イメージングは、治療したＥｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊ動物と比較して、頭において９９ｍＰＹＰのより大きな取り込みを示すことが予想される。測定は、ヌルベクターまたはＥＮＰＰ１を発現するベクターを含むウイルス粒子の投与後３０～３５日目および５０～６５日間に行う。これらの実験群の比較は、ＥＮＰＰ１－ＦｃまたはＥＮＰＰ３－Ｆｃ治療がＧＡＣＩマウスにおける９９ｍＰＹＰの取り込みをＷＴレベルに戻したことを示すことが予想され、これは、ＥＮＰＰ１－ＦｃまたはＥＮＰＰ３－Ｆｃ治療が、細胞外のＰＰｉ濃度を上げることによって、Ｅｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスにおいて、制御されていない組織、洞毛および頭蓋のミネラル化を妨げることができることを示唆する。これらの観察は、ＥＮＰＰ１－ＦｃまたはＥＮＰＰ３－Ｆｃを発現するベクターを含むウイルス粒子が投与されたＥｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスは血管石灰化がなく、正常な血漿ＰＰｉ濃度を有することを示すことが予想される。
未治療のＥｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスは、健康な野生型マウスのもの（ＰＰの正常レベルは約２～４μＭであり；ＰＴＨについては約１０～６５ｎｇ／Ｌであり；ＦＧＦ２３レベルの中央値は１３ＲＵ／ｍｌであり、正常なＦＧＦ２３レベルは５～２１０ＲＵ／ｍｌの範囲であり；正常なビタミンＤレベルは２０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬである）と比較した場合に、有意な血清無機リン（ｐｉ）の増加、ＰＴＨおよびＦＧＦ２３レベルの増加を示すが、１，２５（ＯＨ）２－ビタミンＤレベルの低下、およびより低いＰＰｉレベル（約０．５μＭ）も予想される。これに対して、治療したＥｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスは、ＰＰｉレベルの上昇（約４～５μＭ）を示すことが予想され、これは、未治療のＣＫＤマウスで見られるＰＰｉレベル（約０．５μＭ）よりも高いことが予想される。したがって、組織学的解析を通して可視化される腎臓の軟組織および冠動脈の石灰化の低減（２５％または５０％または７０％または９０％または１００％の低減）、血液分析からの血清ＰＰｉレベルの増加、ビタミンＤレベルの正常化、正常な範囲に対するＦＧＦ２３レベルの低減およびＰＴＨレベルの正常化、生存時間の増加、体重増加の増大とともに尿中尿素およびクレアチンの増加によって観察される腎臓機能の改善のような１つまたは複数の因子の観察によって、当業者は、ＧＡＣＩの治療におけるベクターベースのＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の治療有効性を決定することができる。
ヒト対象の治療
ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３を送達および発現させることができる、対象あたり、ｐＨ７．４の１×ＰＢＳ中におよそ５×１０１１～５×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、いくつかの実施形態では、ｐＨ７．４の１×ＰＢＳ中におよそ１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇを含む注射をすることによって、ＧＡＣＩを罹患するヒト患者を治療する。ＧＡＣＩの治療の成功は、マウスモデルについて述べたような定期的な血液および尿検査を通して１種または複数の前述のパラメーターをモニターすることによって観察される。生きている患者で実施することが可能ではない、腎臓スライスまたは動脈組織の染色を必要とする組織学的解析ではなくて、代わりに、実施例４で述べたような非侵襲的可視化技法を使用する。
軟組織の石灰化、心臓の石灰化、心筋梗塞を可視化する技能を有する医師は、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶビリオンを投与することによって、ＧＡＣＩに罹患した対象の治療を企てる。医師は、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３をコードするコンストラクトを送達するウイルス粒子を投与し、ベクターは、誘導性プロモーターの制御下でＥＮＰＰタンパク質を発現する。医師は、症状の改善の速度および範囲に基づいて、投与量（発現されるｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３の量）を制御することができる。治療の成功は、正常なビタミンＤレベル（２０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍＬが健康な人々にとって適切であると考えられる。１２ｎｇ／ｍＬ未満のレベルはビタミンＤ欠乏を示す）、正常な血中尿素窒素レベル（健康な成人についてのＢＵＮレベルは７～２０ｍｇ／ｄＬである）、体重増加、血清ＰＰｉレベルの増加（少なくとも約４～５μｍ）、動脈組織の石灰化の低減（２５％もしくは５０％もしくは７０％もしくは９０％もしくは１００％の低減）および／またはＣＴもしくは超音波スキャンなどの非侵襲的技法によって可視化される腎臓尿細管の石灰化の低減などの１つまたは複数の陽性症状を観察することによって、本分野の医療専門家によって観察される。
実施例６－ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するウイルスベクターを使用したＰＸＥの治療
以下の実施例は、ＰＸＥと関連する血管石灰化および症状の治療に有効であることが予想されるＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶを提供する。例示を目的としてＥＮＰＰ１－ＦｃおよびＥＮＰＰ３－Ｆｃを本実施例で使用し、本発明の他のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合体を使用して同様の結果を得ることができる。
ＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質およびＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するＡＡＶビリオンを実施例１に従って作製し、ＡＢＣＣ６－／－マウス（これは、弾性線維性仮性黄色腫のモデルである；Ｊｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．１２７（６）：１３９２－４１０２）に投与する。ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３による治療のために、６セットのマウスを使用する。
対照コホート：本実験では、対照群として働くＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第１のコホートにヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射し、対照群として働くＡＢＣＣ６－／－マウスの第２のコホートにヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ１治療マウスのコホート：ＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第３のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、ＡＢＣＣ６－／－マウスの第４のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ３治療マウスのコホート：ＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第５のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、ＡＢＣＣ６－／－マウスの第６のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。野生型マウスを通常の固形飼料で維持し、ＡＢＣＣ６－／－マウスに高リン酸Ｔｅｋｌａｄ食を与える。
ベクターの注射：２週齢後に、マウスあたり、ＰＢＳ ｐＨ７．４中のおよそ１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、好ましくは１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／ｋｇの後眼窩注射または尾静脈注射をすべてのマウスに行う。注射するベクターは空「ヌル」（対照群）であるか、またはＮＰＰ１またはＮＰＰ３遺伝子（研究群）を保有していたかのいずれかである。
アッセイ：腎臓の組織像、ＰＰｉレベルおよび血液尿パラメーター、例えば、ＦＧＦ－２３レベル、ビタミンＤ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）レベル、血清／血液尿素レベル、血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベル、血清／血液クレアチンレベルおよび血漿ピロリン酸（ＰＰｉ）を実施例３および４に記載されているように各コホートについて分析する。
結果：未治療のＡＢＣＣ６－／－マウスは、一般に、体重の低減および死亡率の増加を示す。これに対して、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質を発現するＡＡＶで治療したＡＢＣＣ６－／－マウスは、正常なＷＴマウスの体重範囲に近づく体重の増加を示すことが予想される。ヌルベクターで治療したＡＢＣＣ６－／－マウスは、心臓、大動脈および冠動脈の石灰化、ならびに右心室の自由壁における心筋梗塞の組織学的エビデンス、冠動脈、心臓、上行大動脈および下行大動脈の石灰化、心筋の細胞壊死、ならびに冠動脈の石灰化の領域に隣接する心筋組織における心筋線維化を示すことが予想される。これに対して、ＥＮＰＰ１－ＦｃまたはＥＮＰＰ３－Ｆｃを発現するベクターで治療したＡＢＣＣ６－／－動物は、組織像または死後のマイクロＣＴで、心臓、動脈または大動脈の石灰化がないことを示すことが予想される。ヌルベクターで治療したＥｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスは、外髄質を中心とし、腎皮質への拡大をともなう激しい広範な石灰化とともに、腎髄質を中心とした石灰化も示す。これに対して、ウイルスベクターベースのＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の発現で治療したＥｎｐｐ１ ａｓｊ／ａｓｊマウスは、健康な野生型マウスのものと類似した組織像で、尿細管管腔および軟組織血管構造中に腎ミネラル沈着の低減または該沈着がないことを示すことが予想される。
生存時間、毎日の動物の体重、および終わりの組織像に加えて、血管石灰化および血漿ＰＰｉ濃度をイメージングするための死後の高解像度マイクロＣＴスキャンによって治療応答を評価する。ＷＴおよび治療した（ＥＮＰＰ１を発現するベクター）ＡＢＣＣ６－／－のいずれも、未治療の（ヌルベクター）ＡＢＣＣ６－／－コホートの大動脈、冠動脈および心臓で見られることが予想される劇的な石灰化と対照的に、マイクロＣＴを介して任意の血管石灰化を有さないことが予想される。さらに、治療した（ＥＮＰＰ１を発現するベクター）ＡＢＣＣ６－／－動物（５．２μＭ）の血清ＰＰｉ濃度は、ＷＴレベル（４．４μＭ）まで上昇し、未治療のＡＢＣＣ６－／－のレベル（０．５μＭ）を有意に上回ることが予想される。
未治療のＡＢＣＣ６－／－マウスは、健康な野生型マウスのもの（ＰＰの正常レベルは約２～４μＭであり；ＰＴＨについては約１０～６５ｎｇ／Ｌであり；ＦＧＦ２３レベルの中央値は１３ＲＵ／ｍｌであり、正常なＦＧＦ２３レベルは５～２１０ＲＵ／ｍｌの範囲であり；正常なビタミンＤレベルは２０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬである）と比較した場合に、有意な血清無機リン（ｐｉ）の増加、ＰＴＨおよびＦＧＦ２３レベルの増加を示すが、１，２５（ＯＨ）２－ビタミンＤレベルの低下、およびより低いＰＰｉレベル（約０．５μＭ）も予想される。これに対して、治療したＡＢＣＣ６－／－マウスは、ＰＰｉレベルの上昇（約４～５μＭ）を示すことが予想され、これは、未治療のＡＢＣＣ６－／－マウスで見られるＰＰｉレベル（約０．５μＭ）よりも高いことが予想される。したがって、組織学的解析を通して可視化される腎臓の軟組織および冠動脈の石灰化の低減（２５％または５０％または７０％または９０％または１００％の低減）、血液分析からの血清ＰＰｉレベルの増加、ビタミンＤレベルの正常化、正常な範囲に対するＦＧＦ２３レベルの低減およびＰＴＨレベルの正常化、生存時間の増加、ならびに体重増加の増大とともに尿中尿素およびクレアチンの増加によって観察される腎臓機能の改善のような１つまたは複数の因子の観察によって、当業者は、ＰＸＥの治療におけるベクターベースのＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の治療有効性を決定することができる。
ヒト対象の治療：
ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を送達および発現させることができる、対象あたり、ｐＨ７．４の１×ＰＢＳ中におよそ５×１０１１～５×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、いくつかの実施形態では、ｐＨ７．４の１×ＰＢＳ中におよそ１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇを含む静脈内注射をすることによって、ＰＸＥを罹患するヒト患者を治療する。ＰＸＥの治療の成功は、マウスモデルについて述べたような定期的な血液および尿検査を通して１種または複数の前述のパラメーターをモニターすることによって観察される。生きている患者で実施することが可能ではない、腎臓スライスまたは動脈組織の染色を必要とする組織学的解析ではなくて、代わりに、実施例４で述べたような非侵襲的可視化技法を使用する。
軟組織の石灰化、心臓の石灰化、心筋梗塞を可視化する技能を有する医師は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶビリオンを投与することによって、ＰＸＥに罹患した対象の治療を企てることができる。医師は、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３のコンストラクトを送達し、誘導性プロモーターの制御下にある対応するタンパク質を発現するウイルス粒子を使用することもできる。したがって、医師は、症状の改善の速度および範囲に基づいて投与量（発現されるＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の量）を制御するためのオプションを有する。治療の成功および適切な投与量は、正常なビタミンＤレベル（２０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍＬが健康な人々にとって適切であると考えられる。１２ｎｇ／ｍＬ未満のレベルはビタミンＤ欠乏を示す）、網膜色素線条の消失もしくはそのサイズおよびもしくは数の低減、網膜出血の低減もしくは該出血がないこと、正常な血中尿素窒素レベル（健康な成人についてのＢＵＮレベルは７～２０ｍｇ／ｄＬである）、体重増加、血清ＰＰｉレベルの増加（少なくとも約４～５μｍ）、動脈組織、結合組織の石灰化の低減（２５％もしくは５０％もしくは７０％もしくは９０％もしくは１００％の低減）、ならびにまたはＣＴもしくは超音波スキャンなどの非侵襲的技法によって可視化される腎臓尿細管の石灰化の低減などの１つまたは複数の陽性症状を観察することによって、本分野の医療専門家によって容易に推測される。
実施例７－ヒトＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するウイルスベクターを使用したＯＰＬＬの治療
以下の実施例は、ＰＸＥと関連する血管石灰化および症状の治療に有効であることが予想される、ヒトＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶを提供する。例示を目的としてＥＮＰＰ１－ＦｃおよびＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合体を本実施例で使用し、本発明の他のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合体を使用して同様の結果を得ることができる。
ＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質またはＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するＡＡＶビリオンを実施例１に従って作製し、つま先歩行（ｔｔｗ）マウス（これは、後縦靱帯の骨化のモデルである；（Ｏｋａｗａ，ｅｔ ａｌ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９（３）：２７１－３；Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｌ０４（６）：４９２－７）に投与する。ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３による治療のために、６セットのマウスを使用する。
対照コホート：本実験では、対照群として働くＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第１のコホートにヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射し、対照群として働くｔｔｗマウスの第２のコホートにヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ１治療マウスのコホート：ＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第３のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、ｔｔｗマウスの第４のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ３治療マウスのコホート：ＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第５のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、ｔｔｗマウスの第６のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。野生型マウスを通常の固形飼料で維持し、ｔｔｗマウスに高リン酸Ｔｅｋｌａｄ食を与える。
ベクターの注射：２週齢後に、マウスあたり、ＰＢＳ ｐＨ７．４中の約１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、好ましくは１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／ｋｇの後眼窩注射または尾静脈注射をすべてのマウスに行う。注射するベクターは空「ヌル」（対照群）であるか、またはＮＰＰ１またはＮＰＰ３遺伝子（研究群）を保有していたかのいずれかである。
アッセイ：腎臓の組織像、ＰＰｉレベルおよび血液尿パラメーター、例えば、ＦＧＦ－２３レベル、ビタミンＤ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）レベル、血清／血液尿素レベル、血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベル、血清／血液クレアチンレベルおよび血漿ピロリン酸（ＰＰｉ）を実施例３および４に記載されているように各コホートについて分析する。
結果：未治療のｔｔｗマウスは、一般に、体重の低減、脊椎の肥厚、嗜眠および死亡率の増加を示す。これに対して、ＥＮＰＰ１タンパク質またはＥＮＰＰ３タンパク質を発現するＡＡＶで治療したｔｔｗマウスは、正常なＷＴマウスの体重範囲に近づく体重の増加、正常な覚醒、および野生型マウスの厚さに近づく脊椎厚の低減を示すことが予想される。ヌルベクターで治療したｔｔｗマウスは、心臓、大動脈および冠動脈の石灰化、ならびに右心室の自由壁における心筋梗塞の組織学的エビデンス、冠動脈、心臓、上行大動脈および下行大動脈の石灰化、心筋の細胞壊死、ならびに冠動脈の石灰化の領域に隣接する心筋組織における心筋線維化を示すことが予想される。これに対して、ＥＮＰＰ１－ＦｃまたはＥＮＰＰ３－Ｆｃを発現するベクターで治療したｔｔｗ動物は、組織像または死後のマイクロＣＴで、心臓、動脈または大動脈の石灰化がないことを示すことが予想される。ヌルベクターで治療したｔｔｗマウスは、外髄質を中心とし、腎皮質への拡大をともなう激しい広範な石灰化とともに、腎髄質を中心とした石灰化も示す。これに対して、ウイルスベクターベースのＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の発現で治療したｔｔｗマウスは、健康な野生型マウスのものと類似した組織像で、尿細管管腔中に腎ミネラル沈着の低減または該沈着がないこと、脊椎および軟組織血管構造の石灰化の低減を示すことが予想される。
生存時間、毎日の動物の体重、および終わりの組織像に加えて、血管石灰化および血漿ＰＰｉ濃度をイメージングするための死後の高解像度マイクロＣＴスキャンによって治療応答を評価する。ＷＴまたは治療した（ＥＮＰＰ１を発現するベクター）ｔｔｗのいずれも、未治療の（ヌルベクター）ｔｔｗコホートの大動脈、冠動脈および心臓で見られることが予想される劇的な石灰化と対照的に、マイクロＣＴを介して任意の血管石灰化を有さないことが予想される。さらに、治療した（ＥＮＰＰ１を発現するベクター）ｔｔｗ－動物の血清ＰＰｉ濃度（５．２μＭ）は、ＷＴレベル（４．４μＭ）まで上昇し、未治療のｔｔｗのレベル（０．５μＭ）を有意に上回ることが予想される。
未治療のｔｔｗマウスは、健康な野生型マウスのもの（ＰＰの正常レベルは約２～４μＭであり；ＰＴＨについては約１０～６５ｎｇ／Ｌであり；ＦＧＦ２３レベルの中央値は１３ＲＵ／ｍｌであり、正常なＦＧＦ２３レベルは５～２１０ＲＵ／ｍｌの範囲であり；正常なビタミンＤレベルは２０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬである）と比較した場合に、有意な血清無機リン（ｐｉ）の増加、ＰＴＨおよびＦＧＦ２３レベルの増加を示すが、１，２５（ＯＨ）２－ビタミンＤレベルの低下、およびより低いＰＰｉレベル（約０．５μＭ）も予想される。これに対して、治療したｔｔｗマウスは、ＰＰｉレベルの上昇（約４～５μＭ）を示すことが予想され、これは、未治療のｔｔｗマウスで見られるＰＰｉレベル（約０．５μＭ）よりも高いことが予想される。したがって、組織学的解析を通して可視化される腎臓の軟組織および冠動脈の石灰化の低減（２５％または５０％または７０％または９０％または１００％の低減）、血液分析からの血清ＰＰｉレベルの増加、ビタミンＤレベルの正常化、正常な範囲に対するＦＧＦ２３レベルの低減およびＰＴＨレベルの正常化、生存時間の増加、ならびに体重増加の増大とともに尿中尿素およびクレアチンの増加によって観察される腎臓機能の改善のような１つまたは複数の因子の観察によって、当業者は、ＯＰＬＬの治療におけるベクターベースのＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の治療有効性を決定することができる。
ヒト対象の治療：
ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３を送達および発現させることができる、対象あたり、ｐＨ７．４の１×ＰＢＳ中におよそ５×１０１１～５×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、いくつかの実施形態では、ｐＨ７．４の１×ＰＢＳ中におよそ１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇを含む静脈内注射をすることによって、ＯＰＬＬを罹患するヒト患者を治療する。ＯＰＬＬの治療の成功は、マウスモデルについて述べたような定期的な血液および尿検査を通して１種または複数の前述のパラメーターをモニターすることによって観察される。生きている患者で実施することが可能ではない、腎臓スライスまたは動脈組織の染色を必要とする組織学的解析ではなくて、代わりに、実施例４で述べたような非侵襲的可視化技法を使用する。
軟組織の石灰化、心臓の石灰化、心筋梗塞を可視化する技能を有する医師は、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶビリオンの投与によって、ＯＰＬＬに罹患した対象の治療を企てることができる。いくつかの実施形態では、医師は、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３のコンストラクトを送達し、誘導性プロモーターの制御下にある対応するタンパク質を発現するウイルス粒子を使用する。したがって、医師は、症状の改善の速度および範囲に基づいて、投与量（発現されるｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３の量）を制御するためのオプションを有する。治療の成功および適切な投与量は、正常なビタミンＤレベル（２０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍＬが健康な人々にとって適切であると考えられる。１２ｎｇ／ｍＬ未満のレベルはビタミンＤ欠乏を示す）、正常な血中尿素窒素レベル（健康な成人についてのＢＵＮレベルは７～２０ｍｇ／ｄＬである）、体重増加、血清ＰＰｉレベルの増加（少なくとも約４～５μｍ）、動脈組織の石灰化の低減（２５％または５０％または７０％または９０％または１００％の低減）、脊椎の厚さおよび痛覚の低減、ＣＴ、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）または超音波スキャンなどの非侵襲的技法によって可視化される脊柱管狭の低減などの１つまたは複数の陽性症状を観察することによって、本分野の医療専門家によって容易に推測される。
実施例８－ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するウイルスベクターを使用した骨減少症およびまたは骨軟化症の治療
以下の実施例は、骨減少症および／または骨軟化症と関連する症状の治療に有効であることが予想されるＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶを提供する。例示を目的としてＥＮＰＰ１－ＦｃおよびＥＮＰＰ３－Ｆｃを本実施例で使用し、本発明の他のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合体を使用して同様の結果を得ることができる。
ＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質またはＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するＡＡＶビリオンを実施例１に従って作製し、つま先歩行（ｔｔｗ）マウス（これは、骨関節症のマウスモデルである（Ｂｅｒｔｒａｎｄ，ｅｔ ａｌ，２０１２，Ａｎｎａｌｓ Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ ７１（７）：１２４９－５３））に投与する。ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３による治療のために、６セットのマウスを使用する。ＧＡＣＩに加えて骨減少症のモデルとしても働く（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ， ｅｔ ａｌ，２０１２，ＰｌｏＳ ｏｎｅ ７（２）：ｅ３２１７７）、ＥＮＰＰ１ノックアウトマウス（ＥＮＰＰ１ＫＯ）を使用して、同様の実験を反復する。
対照コホート：本実験では、対照群として働くＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第１のコホートにヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射し、対照群として働くｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）マウスの第２のコホートにヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ１治療マウスのコホート：ＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第３のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、ｔｔｗマウス（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）の第４のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ３治療マウスのコホート：ＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第５のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、ｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）マウスの第６のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。野生型マウスを通常の固形飼料で維持し、ｔｔｗマウス（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）に高リン酸Ｔｅｋｌａｄ食を与える。
ベクターの注射：２週齢後に、マウスあたり、ＰＢＳ ｐＨ７．４中の約１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、好ましくは、１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／ｋｇの後眼窩注射または尾静脈注射をすべてのマウスに行う。注射するベクターは空「ヌル」（対照群）であるか、またはＮＰＰ１もしくはＮＰＰ３遺伝子（研究群）を保有していたかのいずれかである。
アッセイ：腎臓の組織像、ＰＰｉレベルおよび血液尿パラメーター、例えば、ＦＧＦ－２３レベル、ビタミンＤ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）レベル、血清／血液尿素レベル、血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベル、血清／血液クレアチンレベルおよび血漿ピロリン酸（ＰＰｉ）を実施例３および４に記載されているように各コホートについて分析する。
組織像、組織形態計測およびマイクロＣＴ：実施例３に記載されているプロトコールに従って骨分析を行う。
骨の生体力学的試験：実施例３に記載されているプロトコールに従って骨分析を行う。
結果：未治療のｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）マウスは、一般に、野生型と比較して、体重の低減、嗜眠、皮質骨厚および骨梁骨量の減少、軟骨および靱帯の石灰化、大腿骨および脛骨などの骨密度の低減、ならびに死亡率の増加を示す。これに対して、ＥＮＰＰ１タンパク質またはＥＮＰＰ３タンパク質を発現するＡＡＶで治療したｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）マウスは、正常なＷＴマウスの体重範囲に近づく体重の増加、正常な覚醒、骨ミネラル量の増加、皮質骨厚および骨梁骨量の改善、骨強度および骨の柔軟性の増加を示すことが予想される。ヌルベクターで治療したｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）マウスは、心臓、大動脈および冠動脈の石灰化、ならびに右心室の自由壁における心筋梗塞の組織学的エビデンス、冠動脈、心臓、上行大動脈および下行大動脈の石灰化、心筋の細胞壊死、ならびに冠動脈の石灰化の領域に隣接する心筋組織における心筋線維化を示すことが予想される。これに対して、ＥＮＰＰ１－ＦｃまたはＥＮＰＰ３－Ｆｃを発現するベクターで治療したｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）動物は、組織像または死後のマイクロＣＴで、心臓、動脈または大動脈の石灰化がないことを示すことが予想される。ヌルベクターで治療したｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）マウスは、外髄質を中心とし、腎皮質への拡大をともなう激しい広範な石灰化とともに、腎髄質を中心とした石灰化も示す。これに対して、ウイルスベクターベースのＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の発現で治療したｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）マウスは、健康な野生型マウスのものと類似した組織像で、尿細管管腔中に腎ミネラル沈着の低減または該沈着がないこと、脊椎および軟組織血管構造の石灰化の低減を示すことが予想される。
生存時間、毎日の動物の体重、および終わりの組織像に加えて、血管石灰化および血漿ＰＰｉ濃度をイメージングするための死後の高解像度マイクロＣＴスキャンによって治療応答を評価する。ＷＴまたは治療した（ＥＮＰＰ１を発現するベクター）ｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）のいずれも、未治療の（ヌルベクター）ｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）コホートの大動脈、冠動脈および心臓で見られることが予想される劇的な石灰化と対照的に、マイクロＣＴを介して任意の血管石灰化を有さないことが予想される。さらに、治療した（ＥＮＰＰ１を発現するベクター）ｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）動物の血清ＰＰｉ濃度（５．２μＭ）は、ＷＴレベル（４．４μＭ）まで上昇し、未治療のｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）のレベル（０．５μＭ）を有意に上回ることが予想される。
未治療のｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）マウスは、健康な野生型マウスのもの（ＰＰの正常レベルは約２～４μＭであり；ＰＴＨについては約１０～６５ｎｇ／Ｌであり；ＦＧＦ２３レベルの中央値は１３ＲＵ／ｍｌであり、正常なＦＧＦ２３レベルは５～２１０ＲＵ／ｍｌの範囲であり；正常なビタミンＤレベルは２０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬである）と比較した場合に、有意な血清無機リン（ｐｉ）の増加、ＰＴＨおよびＦＧＦ２３レベルの増加を示すが、１，２５（ＯＨ）２－ビタミンＤレベルの低下、およびより低いＰＰｉレベル（約０．５μＭ）も予想される。これに対して、治療したｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）マウスは、ＰＰｉレベルの上昇（約４～５μＭ）を示すことが予想され、これは、未治療のｔｔｗ（またはＥＮＰＰ１ＫＯ）マウスで見られるＰＰｉレベル（約０．５μＭ）よりも高いことが予想される。したがって、組織学的解析を通して可視化される腎臓の軟組織および冠動脈の石灰化の低減（２５％または５０％または７０％または９０％または１００％の低減）、血液分析からの血清ＰＰｉレベルの増加、ビタミンＤレベルの正常化、正常な範囲に対するＦＧＦ２３レベルの低減およびＰＴＨレベルの正常化、長骨強度の改善、骨密度の増加、皮質骨（ｃｏｒｔｉｃｕｌａｒ ｂｏｎｅ）厚および骨梁骨量の改善、生存時間の増加、ならびに体重増加の増大とともに尿中尿素およびクレアチンの増加によって観察される腎臓機能の改善のような１つまたは複数の因子の観察によって、当業者は、骨減少症または骨軟化症または骨関節症の治療におけるベクターベースのＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の治療有効性を決定することができる。
ヒト対象の治療：
ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３を送達および発現させることができる、対象あたり、ｐＨ７．４の１×ＰＢＳ中におよそ５×１０１１～５×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、いくつかの実施形態では、ｐＨ７．４の１×ＰＢＳ中におよそ１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇを含む静脈内注射をすることによって、骨減少症または骨軟化症または骨関節症を罹患するヒト患者を治療する。骨減少症または骨軟化症または骨関節症の治療の成功は、マウスモデルについて述べたような定期的な骨強度、骨密度の血液および尿検査を通して、１種または複数の前述のパラメーターをモニターすることによって観察される。生きている患者で実施することが可能ではない、腎臓スライスまたは動脈組織の染色を必要とする組織学的解析ではなくて、代わりに、実施例４で述べたような非侵襲的可視化技法を使用する。
同様に、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）または末梢二重エネルギーＸ線吸収測定法（ｐＤＸＡ）または定量的超音波（ＱＵＳ）または末梢定量的コンピュータ断層撮影法（ｐＱＣＴ）を使用して、患者を定期的な骨密度測定にかける。これらの方法のうちの１つから得られた骨密度スコアは、治療後に得られた状態および進行の指標を提供する。１．０以上のＴ－スコアは正常な骨密度として見なされ、－１．０～－２．５の間のＴ－スコアは骨減少症の存在を示し、一方で、－２．５以下のＴ－スコアは骨粗鬆症の存在を示す。本発明のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３で治療した患者において、Ｔ－スコアの段階的な改善が予想される。
軟組織の石灰化、心臓の石灰化、骨密度視覚化を視覚化する技能を有する医師は、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶビリオンの投与によって、骨減少症または骨関節症に罹患した対象の治療を企てる。いくつかの実施形態では、医師は、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３のコンストラクトを送達し、誘導性プロモーターの制御下にある対応するタンパク質を発現するウイルス粒子を使用する。したがって、医師は、症状の改善の速度および範囲に基づいて、投与量（発現されるｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３の量）を制御するためのオプションを有する。治療の成功および適切な投与量は、正常なビタミンＤレベル（２０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍＬが健康な人々にとって適切であると考えられる。１２ｎｇ／ｍＬ未満のレベルはビタミンＤ欠乏を示す）、正常な骨密度（≧－１のＴスコア）、正常な血中尿素窒素レベル（健康な成人についてのＢＵＮレベルは７～２０ｍｇ／ｄＬである）、体重増加、血清ＰＰｉレベルの増加（少なくとも約４～５μｍ）、動脈組織の石灰化の低減（２５％または５０％または７０％または９０％または１００％の低減）、ＣＴ、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）または超音波スキャンなどの非侵襲的技法によって可視化される骨強度の改善などの１つまたは複数の陽性症状を観察することによって、本分野の医療専門家によって容易に推測される。
実施例９－ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するウイルスベクターを使用したＡＤＨＲ－２またはＡＲＨＲ－２およびまたはＸＬＨの治療
以下の実施例は、ＡＤＨＲ－２またはＡＲＨＲ－２またはＸＬＨと関連する症状の治療に有効であることが予想されるＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶを提供する。例示を目的としてＥＮＰＰ１－ＦｃおよびＥＮＰＰ３－Ｆｃを本実施例で使用し、本発明の他のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３融合体を使用して同様の結果を得ることができる。
ＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質またはＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するＡＡＶビリオンを実施例１に従って作製し、Ｘ連鎖低ホスファターゼ症（ＸＬＨ）のＨＹＰマウスモデル（Ｌｉａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｔ．８５（３）：２３５－４６）に投与する。ＥＮＰＰ１およびＥＮＰＰ３による治療のために、６セットのマウスを使用する。ＧＡＣＩに加えてＡＲＨＲ－２のモデルとしても働く（Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０１０ Ｆｅｂ １２；８６（２）：２７３－２７８．）ＥＮＰＰ１老齢関節硬直マウス（ＥＮＰＰ１ ａｇｅ ｓｔｉｆｆｅｎｅｄ ｊｏｉｎｔ ｍｏｕｓｅ）（ＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）を使用して、同様の実験を反復する。
対照コホート：本実験では、対照群として働くＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第１のコホートにヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射し、対照群として働くＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスの第２のコホートにヌルベクターを含むＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ１治療マウスのコホート：ＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第３のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、ＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスの第４のコホートにＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。
ＥＮＰＰ３治療マウスのコホート：ＥＮＰＰ１ ｗｔマウスの第５のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射し、ＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスの第６のコホートにＥＮＰＰ３－Ｆｃタンパク質を発現するように操作されたＡＡＶ粒子を注射する。野生型マウスを通常の固形飼料で維持し、ＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスに高リン酸Ｔｅｋｌａｄ食を与える。
ベクターの注射：２週齢後に、マウスあたり、ＰＢＳ ｐＨ７．４中のおよそ１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、好ましくは１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／ｋｇの後眼窩注射または尾静脈注射をすべてのマウスに行う。注射するベクターは、空「ヌル」（対照群）であるか、またはＮＰＰ１もしくはＮＰＰ３遺伝子（研究群）を保有していたかのいずれかである。
アッセイ：腎臓の組織像、ＰＰｉレベルおよび血液尿パラメーター、例えば、ＦＧＦ－２３レベル、ビタミンＤ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）レベル、血清／血液尿素レベル、血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベル、血清／血液クレアチンレベルおよび血漿ピロリン酸（ＰＰｉ）を実施例３および４に記載されているように各コホートについて分析する。
組織像、組織形態計測およびマイクロＣＴ：実施例３に記載されているプロトコールに従って骨分析を行う。
骨の生体力学的試験：実施例３に記載されているプロトコールに従って骨分析を行う。
結果：未治療のＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスは、一般に、野生型と比較して、体重の低減、嗜眠、皮質骨厚および骨梁骨量の減少、軟骨および靱帯の石灰化、大腿骨および脛骨などの骨密度の低減、ならびに死亡率の増加を示す。これに対して、ＥＮＰＰ１タンパク質またはＥＮＰＰ３タンパク質を発現するＡＡＶで治療したＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスは、正常なＷＴマウスの体重範囲に近づく体重の増加、正常な覚醒、骨ミネラル量の増加、皮質骨厚および骨梁骨量の改善、骨強度および骨の柔軟性の増加を示すことが予想される。ヌルベクターで治療したＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスは、心臓、大動脈および冠動脈の石灰化、ならびに右心室の自由壁における心筋梗塞の組織学的エビデンス、冠動脈、心臓、上行大動脈および下行大動脈の石灰化、心筋の細胞壊死、ならびに冠動脈の石灰化の領域に隣接する心筋組織における心筋線維化を示すことが予想される。これに対して、ＥＮＰＰ１－ＦｃまたはＥＮＰＰ３－Ｆｃを発現するベクターで治療したＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスは、組織像または死後のマイクロＣＴで、心臓、動脈または大動脈の石灰化がないことを示すことが予想される。ヌルベクターで治療したＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスは、外髄質を中心とし、腎皮質への拡大をともなう激しい広範な石灰化とともに、腎髄質を中心とした石灰化も示す。これに対して、ウイルスベクターベースのＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の発現で治療したＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスは、健康な野生型マウスのものと類似した組織像で、尿細管管腔中に腎ミネラル沈着の低減または該沈着がないこと、脊椎および軟組織血管構造の石灰化の低減を示すことが予想される。
生存時間、毎日の動物の体重、および終わりの組織像に加えて、血管石灰化および血漿ＰＰｉ濃度をイメージングするための死後の高解像度マイクロＣＴスキャンによって治療応答を評価する。ＷＴまたは治療した（ＥＮＰＰ１を発現するベクター）ＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスのいずれも、未治療の（ヌルベクター）ＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）コホートの大動脈、冠動脈および心臓で見られることが予想される劇的な石灰化と対照的に、マイクロＣＴを介して任意の血管石灰化を有さないことが予想される。さらに、治療した（ＥＮＰＰ１を発現するベクター）ＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスの血清ＰＰｉ濃度（５．２μＭ）は、ＷＴレベル（４．４μＭ）まで上昇し、未治療のＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）のレベル（０．５μＭ）を有意に上回ることが予想される。
未治療のＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスは健康な野生型マウスのもの（ＰＰの正常レベルは約２～４μＭであり；ＰＴＨについては約１０～６５ｎｇ／Ｌであり；ＦＧＦ２３レベルの中央値は１３ＲＵ／ｍｌであり、正常なＦＧＦ２３レベルは５～２１０ＲＵ／ｍｌの範囲であり；正常なビタミンＤレベルは２０ｎｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬである）と比較した場合に、有意な血清無機リン（ｐｉ）の増加、ＰＴＨおよびＦＧＦ２３レベルの増加を示すが、１，２５（ＯＨ）２－ビタミンＤレベルの低下、およびより低いＰＰｉレベル（約０．５μＭ）も予想される。これに対して、治療したＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスは、ＰＰｉレベルの上昇（約４～５μＭ）を示すことが予想され、これは、未治療のＨＹＰ（またはＥＮＰＰ１ａｓｊ／ａｓｊ）マウスで見られるＰＰｉレベル（約０．５μＭ）よりも高いことが予想される。したがって、組織学的解析を通して可視化される腎臓の軟組織および冠動脈の石灰化の低減（２５％または５０％または７０％または９０％または１００％の低減）、血液分析からの血清ＰＰｉレベルの増加、ビタミンＤレベルの正常化、正常な範囲に対するＦＧＦ２３レベルの低減およびＰＴＨレベルの正常化、長骨強度の改善、骨密度の増加、皮質骨厚および骨梁骨量の改善、生存時間の増加、ならびに体重増加の増大とともに尿中尿素およびクレアチンの増加によって観察される腎臓機能の改善のような１つまたは複数の因子の観察によって、当業者は、ＡＤＨＲ－２またはＡＲＨＲ－２またはＸＬＨの治療におけるベクターベースのＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の治療有効性を決定することができる。
ヒト対象の治療：
ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３を送達および発現させることができる、対象あたり、ｐＨ７．４の１×ＰＢＳ中におよそ５×１０１１～５×１０１５ ｖｇ／ｋｇ、いくつかの実施形態では、ｐＨ７．４の１×ＰＢＳ中におよそ１×１０１２～１×１０１５ｖｇ／ｋｇを含む静脈内注射をすることによって、ＡＤＨＲ－２またはＡＲＨＲ－２またはＸＬＨを罹患するヒト患者を治療する。ＡＤＨＲ－２またはＡＲＨＲ－２またはＸＬＨの治療の成功は、マウスモデルについて述べたような定期的な骨強度、骨密度の血液および尿検査を通して、１種または複数の前述のパラメーターをモニターすることによって観察される。生きている患者で実施することが可能ではない、腎臓スライスまたは動脈組織の染色を必要とする組織学的解析ではなくて、代わりに、実施例４で述べたような非侵襲的可視化技法を使用する。
同様に、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）または末梢二重エネルギーＸ線吸収測定法（ｐＤＸＡ）または定量的超音波（ＱＵＳ）または末梢定量的コンピュータ断層撮影法（ｐＱＣＴ）を使用して、患者を定期的な骨密度測定にかける。これらの方法のうちの１つから得られた骨密度スコアは、治療後に得られた状態および進行の指標を提供する。１．０以上のＴ－スコアは正常な骨密度として見なされ、－１．０～－２．５の間のＴ－スコアは骨減少症の存在を示し、一方で、－２．５以下のＴ－スコアは骨粗鬆症の存在を示す。本発明のＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３で治療した患者において、Ｔ－スコアの段階的な改善が予想される。
軟組織の石灰化、心臓の石灰化、骨密度視覚化を視覚化する技能を有する医師は、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３を発現するＡＡＶビリオンを投与することによって、ＡＤＨＲ－２またはＡＲＨＲ－２またはＸＬＨに罹患した対象の治療を企てる。いくつかの実施形態では、医師は、ｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３のコンストラクトを送達し、誘導性プロモーターの制御下にある対応するタンパク質を発現するウイルス粒子を使用する。したがって、医師は、症状の改善の速度および範囲に基づいて、投与量（発現されるｈＥＮＰＰ１またはｈＥＮＰＰ３の量）を制御するためのオプションを有する。治療の成功および適切な投与量は、正常なビタミンＤレベル（２０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍＬが健康な人々にとって適切であると考えられる。１２ｎｇ／ｍＬ未満のレベルはビタミンＤ欠乏を示す）、正常な骨密度（≧－１のＴスコア）、正常な血中尿素窒素レベル（健康な成人についてのＢＵＮレベルは７～２０ｍｇ／ｄＬである）、体重増加、血清ＰＰｉレベルの増加（少なくとも約４～５μｍ）、動脈組織の石灰化の低減（２５％または５０％または７０％または９０％または１００％の低減）、ＣＴ、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）または超音波スキャンなどの非侵襲的技法によって可視化される骨強度の改善などの１つまたは複数の陽性症状を観察することによって、本分野の医療専門家によって容易に推測される。
実施例１０－ウイルス投与後のモデルマウスにおける血漿ＰＰｉレベル、ＥＮＰＰ１の濃度および活性レベルの分析
正常なマウスの３つのコホートを本実験に使用した。各コホートは５匹の成体マウスを含む。第１のコホートは「対照群」として使用し、生理食塩水を対照群に注射した。第２のコホートは「低用量群」として使用し、１ｅ１３ ｖｇ／ｋｇ濃度のＡＡＶベクターを低用量群に注射した。第３のコホートは「高用量群」を使用し、１ｅ１４ ｖｇ／ｋｇ濃度のＡＡＶベクターを高用量群に注射した。ＡＡＶコンストラクトからウイルス粒子を生成し、ＥＮＰＰ１融合タンパク質を含む組換えＡＡＶウイルス粒子を正常なマウスに注射するプロセスを概略的に図４に示す。注射後７、２８および５６日目にすべてのコホートのマウスから採血して、血漿および血清を収集した。
ヘパリン処理したチューブに血液を収集した。Ｎａｎｏｓｅｐ ３０ｋＤａ Ｏｍｅｇａ遠心濾過器（Ｐａｌｌ、ＯＤ０３０Ｃ３５）によって濾過することによって、血漿を単離し、血小板を除去した。試料を最高速度（約２０ｋｇ）で２０分間４℃で遠心分離した。フロースルーを収集し、ドライアイス上において、試料を急速凍結した。後でアッセイに使用するために、試料を－８０℃で保存した。
最初に、比色基質、ｐ－ニトロフェニルチミジン５’－一リン酸（Ｓｉｇｍａ）を使用してＥＮＰＰ１の活性レベルを決定するために、収集した試料をアッセイした。１％Ｔｒｉｔｏｎ、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０緩衝液中で１ｍｇ／ｍｌのｐ－ニトロフェニルチミジン５’－一リン酸とともに血漿試料を１時間インキュベートした。１時間後に１００ｍＭ ＮａＯＨを添加して、反応を停止させ、４０５ｎｍで吸光度を測定した。組換えヒトＥＮＰＰ－１についてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓによって開示される以下のアッセイプロトコール；カタログ番号：６１３６－ＷＮによって、比活性を決定した。
Figure 2022517435000201
 ＊基質ブランクに対して調整
＊＊較正標準４－ニトロフェノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号２４１３２６）を使用して得られる
ＥＮＰＰ１活性アッセイの結果は図５にあり、これは、注射後にＥＮＰＰ１活性の用量依存的増加があることを示す。正常なマウスの血漿を参照標準として使用して、ＥＮＰＰ１活性レベルを正規化し、一元配置ＡＮＯＶＡを統計解析に使用した。図５は、ＥＮＰＰ１活性レベルは、対照群のものと比較した場合に、低用量群でより高かったことを示す。同様に、ＥＮＰＰ１活性レベルは、低用量群および対照群のものと比較した場合に、高用量群でより高かった。低用量および高用量コホートの中で、ＥＮＰＰ１活性は高用量群において７～５６日までの血漿試料で安定であったが、低用量群において２８～５６日目までＥＮＰＰ１活性のわずかな低下があった。
次いで、Ｓｉｇｍａ（ＳＡＢ１４００１９９）から得たＥＮＰＰ１ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法アッセイを使用してＥＮＰＰ１の濃度を決定するために、試料をアッセイした。９６ウェル透明平底ポリスチレン高結合マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号９０１８）、ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ ＃７９０６）、１０×ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号１１９－０６８－１０１）、Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ２２８７）、マウスで産生された抗ＥＮＰＰ１抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ＳＡＢ１４００１９９）、Ｓｕｒｅ Ｂｌｕｅ ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質（１－成分）（ＫＰＬ製品番号５２－００－０１）、２Ｎ硫酸（ＢＤＨ製品番号ＢＤＨ７５００－１）、ＭｉｌｌｉＱ水、Ｃ５７ＢＬ／６マウス血漿ＮａＨｅｐプールドジェンダー（Ｐｏｏｌｅｄ Ｇｅｎｄｅｒ）（ＢｉｏＩＶＴカタログ番号ＭＳＥ０１ＰＬＮＨＰＮＮ）、マウス血清（ＢＩＯ ＩＶＴ ｅｌｅｖａｔｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号ＭＳＥ０１ＳＲＭＰＮＮ）をＥＬＩＳＡアッセイに使用した。
ＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質に対する検量線は、本分野で既知の以下の標準的手順によって作成する。手短に言えば、２ｍｇ／ｍｌ～３０ｎｇ．ｍｌの範囲のＥＮＰＰ１－Ｆｃタンパク質の段階希釈を作成した。１μｇ／１ｍＬの１×ＰＢＳ中にＥＮＰＰ１捕捉抗体を含むオーバーナイトコート溶液で９６ウェルプレートを最初にコーティングした。次いで、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡとともにウェルを１時間インキュベートし、次いで、ポストブロック溶液で洗浄した。コーティングした９６ウェルプレートにＥＮＰＰ１希釈試料を添加し、これを１．５時間インキュベートした。インキュベーション後、３００μｌの０．０５Ｔ％ＰＢＳＴでウェルを４回洗浄した。次いで、洗浄したウェルを１００μＬ／ウェルの検出ＨＲＰ抗体コンジュゲートで処理し、１時間インキュベートした。ＨＲＰ抗体コンジュゲートとともにインキュベートした後、３００μｌの０．０５Ｔ％ＰＢＳＴでウェルを４回洗浄した。次いで、洗浄したウェルをウェルあたり１００μｌのＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ基質で処理し、暗所で３０分間インキュベートした。次いで、３００μｌの０．０５Ｔ％ＰＢＳＴでウェルを４回洗浄し、２Ｎ硫酸を使用して反応を止めた。４５０ｎｍの波長でマイクロプレートリーダーを使用してウェルの吸光度を読み取った。読み取った吸光度およびＥＮＰＰ１段階希釈試料の対応する濃度を使用して、検量線を作成した。
次いで、ウイルス注射後７、２８および５６日目の対照、低用量および高用量コホートから得られた血漿試料を使用して、アッセイを反復した。各血漿試料で生成した吸光度をＥＮＰＰ１－Ｆｃの検量線と相関させて、血漿試料中のＥＮＰＰ１－Ｆｃの濃度を決定した。ＥＮＰＰ１濃度アッセイの結果を図６に示し、これは、ウイルスベクターの注射後にＥＮＰＰ１濃度の用量依存的増加を示す。正常なマウスの血漿を参照標準として使用して、ＥＮＰＰ１濃度レベルを正規化し、一元配置ＡＮＯＶＡを統計解析に使用した。図６は、ＥＮＰＰ１濃度は、対照群のものと比較した場合に、低用量群で高かったことを示す。同様に、ＥＮＰＰ１活性レベルは、低用量群および対照群のものと比較した場合に、高用量群でより高かった。低用量および高用量コホートの中で、ＥＮＰＰ１レベルは高用量群において７～５６日目までの試料で安定であったが、低用量群において２８～５６日目までＥＮＰＰ１レベルのわずかな低下があった。
試料はまた、スルフリラーゼアッセイを使用して血漿ＰＰｉの濃度を決定するためにアッセイした。ＡＴＰスルフリラーゼ（ＮＥＢ－Ｍ０３９４Ｌ、ロット番号：１００２８５２９）、アデノシン５’－ホスホスルフェート（ＡＰＳ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－２１４５０６））、ＰＰｉ：１００ｕＭストック、ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ ＢＢ２０７６）、１Ｍの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）溶液、１Ｍの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）溶液、ＢａｃｔｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ８２３１）、プレート（Ｃｏｓｔａｒ ３９１５、黒色平底）、およびプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｉ３ｘ）をＰＰｉ－スルフリラーゼアッセイに使用した。段階希釈を使用して、ＰＰｉ標準（０．１２５～４μＭ）を水中で調製した。過剰なアデノシン５’ホスホスルフェート（ＡＰＳ）の存在下で、ＡＴＰスルフリラーゼによって、ＰＰｉ標準および濾過した血漿試料中のＰＰｉをＡＴＰに変換した。８ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、８０ｕＭ ＡＰＳ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－２１４５０６）、および０．１Ｕ／ｍｌ ＡＴＰスルフリラーゼ（ＮＥＢ－Ｍ０３９４Ｌ）を含む５μｌの混合物で試料（１５μｌ）を処理した。混合物を３７℃で４０分間インキュベートし、その後、９０℃で１０分間インキュベートすることによって、ＡＴＰスルフリラーゼを不活化した。２０μｌの処理した試料または標準を２０μｌのＢａｃｔｉｔｅｒＧｌｏ試薬と混合することによって、ＢａｃｔｉｔｅｒＧｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｇ８２３１）を使用して、生成されたＡＴＰを測定した。続いて、マイクロプレートリーダーで生物発光を測定し、続いて、検量線から、各試料で生成されたＰＰｉの量を決定した。
血漿ＰＰｉアッセイの結果を図７に示す。結果は、ウイルスベクターの注射後に、血漿ＰＰｉの用量依存的増加を示す。正常なマウスの血漿を参照標準として使用して、血漿ＰＰｉ濃度レベルを正規化し、一元配置ＡＮＯＶＡを統計解析に使用した。図７は、血漿ＰＰｉ濃度は、対照群のものと比較した場合に、低用量群でわずかに高かったことを示す。同様に、血漿ＰＰｉ濃度は、低用量群および対照群のものと比較した場合に、高用量群でより高かった。低用量および高用量コホートの中で、ＥＮＰＰ１レベルは高用量群において７～５６日までの血漿試料で安定であったが、低用量群において２８～５６日目までＥＮＰＰ１レベルのわずかな低下が観察された。
関連した実験では、単回用量の１ｅ１４ ｖｇ／ｋｇのＡＡＶウイルスベクターまたはビヒクル対照（ＡＡＶベクターを含まない）を５～６週齢のＣ５７／Ｂｌ雄マウスに静脈内投与した。動物にＧＫ１．５（ウイルスベクターまたはビヒクルの投与より１日前に４０μｇ／マウス、次いで、その後、研究が完了するまで７日ごとに２５μｇ／マウス）を投与した。ＡＡＶウイルスベクターは、融合タンパク質のＥＮＰＰ部分およびＩｇＧ Ｆｃ部分が以下のリンカーアミノ酸配列：ＧＧＧＧＳで接続された以外は実施例１０に記載されているポリペプチドと同様である、ＥＮＰＰ１とＩｇＧ Ｆｃの融合タンパク質を発現するように操作した。ＡＡＶウイルスベクターが投与されたマウスは、およそ４０日の期間にわたって測定した場合、ビヒクルのみの対照よりも高いレベルのＥＮＰＰ１の酵素活性を示した。
実施例１１－ウイルス投与後１１２日目のモデルマウスウイルスにおけるＥＮＰＰ１の濃度および活性レベルの分析
正常なマウスの３つのコホートを本実験に使用した。各コホートは５匹の成体マウスを含む。第１のコホートは「対照群」として使用し、生理食塩水を対照群に注射した。第２のコホートは「低用量群」として使用し、１ｅ１３ ｖｇ／ｋｇ濃度のＡＡＶベクターを低用量群に注射した。第３のコホートは「高用量群」を使用し、１ｅ１４ ｖｇ／ｋｇ濃度のＡＡＶベクターを高用量群に注射した。ＡＡＶコンストラクトからウイルス粒子を生成し、ＥＮＰＰ１融合タンパク質を含む組換えＡＡＶウイルス粒子を正常なマウスに注射するプロセスを概略的に図４に示す。注射後７、２８、５６および１１２日目にすべてのコホートのマウスから採血して、血漿および血清を収集した。
ヘパリン処理したチューブに血液を収集した。試料を最高速度（約２０ｋｇ）で２０分間４℃で遠心分離した。フロースルーを収集し、ドライアイス上において、試料を急速凍結した。後でアッセイに使用するために、試料を－８０℃で保存した。
最初に、実施例１０に記載されているように、比色基質、ｐ－ニトロフェニルチミジン５’－一リン酸（Ｓｉｇｍａ）を使用してＥＮＰＰ１の活性レベルを決定するために、収集した試料をアッセイした。ＥＮＰＰ１活性アッセイの結果を図９に示し、これは、注射後にＥＮＰＰ１活性の用量依存的増加があることを示す。正常なマウスの血漿を参照標準として使用して、ＥＮＰＰ１活性レベルを正規化し、一元配置ＡＮＯＶＡを統計解析に使用した。図９は、ＥＮＰＰ１活性レベルは、対照群のものと比較した場合に、低用量群でより高かったことを示す。同様に、ＥＮＰＰ１活性レベルは、低用量群および対照群のものと比較した場合に、高用量群でより高かった。
次いで、実施例１０に教示されるプロトコールに従って、Ｓｉｇｍａ（ＳＡＢ１４００１９９）から得たＥＮＰＰ１ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法アッセイを使用してＥＮＰＰ１の濃度を決定するために、試料をアッセイした。次いで、ウイルス注射後７、２８、５６および１１２日目の対照、低用量および高用量コホートから得られた血漿試料を使用して、アッセイを反復した。各血漿試料で生成した吸光度をＥＮＰＰ１－Ｆｃの検量線と相関させて、血漿試料中のＥＮＰＰ１－Ｆｃの濃度を決定した。
ＥＮＰＰ１濃度アッセイの結果を図８に示し、これは、ウイルスベクターの注射後にＥＮＰＰ１濃度の用量依存的増加を示す。正常なマウスの血漿を参照標準として使用して、ＥＮＰＰ１濃度レベルを正規化し、一元配置ＡＮＯＶＡを統計解析に使用した。図８は、ＥＮＰＰ１濃度は、対照群のものと比較した場合に、低用量群でより高かったことを示す。同様に、ＥＮＰＰ１レベルは、低用量群および対照群のものと比較した場合に、高用量群でより高かった。
他の実施形態
前述の記載から、病的石灰化または骨化の存在によって特徴づけられる任意の疾患を治療するために、技術分野で既知の、異なるプロモーターもしくはエンハンサーを有する異なるウイルスベクターまたは異なる細胞型でＥＮＰＰ１もしくはＥＮＰＰ３の機能変異体またはそれらの組み合わせを発現させるための異なるシグナル配列の使用を含めた、様々な使用法および条件に採用するために、本明細書に記載の本発明に対して変形および修正を行うことができることは、本発明による範囲であることは明らかであろう。本発明による他の実施形態は以下の特許請求の範囲内である。
本明細書の変数の任意の定義における要素のリストの記述は、リストされた要素の任意の単一の要素または組み合わせ（もしくは部分的組み合わせ）として、その変数の定義を含む。本明細書の一実施形態の記述は、任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態またはそれらの部分と組み合わせて、その実施形態を含む。
本明細書で言及するすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する分野の当業者の技能レベルを示す。すべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が具体的におよび個々に示されて、参考として組み込まれる場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。

Claims (94)

  1. エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－１（ＥＮＰＰ１）またはエクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ－３（ＥＮＰＰ３）に融合したアズロシジンシグナルペプチドを含む前駆体ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドであって、哺乳動物細胞における前記ポリヌクレオチドの発現の際に、前記前駆体ポリペプチドがタンパク分解的に切断されて、軟組織の異所性石灰化を低減させる活性がある可溶性ＥＮＰＰ１または可溶性ＥＮＰＰ３を生成する、組換えポリヌクレオチド。
  2. ベクターまたはプラスミドを含む、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド。
  3. 前記ベクターまたは前記プラスミドが前記コードされるポリペプチドを発現することができる、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド。
  4. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項３に記載の組換えポリヌクレオチド。
  5. 前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項４に記載の組換えポリヌクレオチド。
  6. 前記ポリヌクレオチドが、前記ＥＮＰＰ１に融合した前記アズロシジンシグナルペプチドまたは前記ＥＮＰＰ３に融合した前記アズロシジンシグナルペプチドおよびＦｃポリペプチドに融合した前記ＥＮＰＰ１または前記ＥＮＰＰ３をコードして、それぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端の順で、アズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ１－Ｆｃまたはアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ３－Ｆｃを形成する、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
  7. 前記ポリヌクレオチドが、前記ＥＮＰＰ１に融合した前記アズロシジンシグナルペプチドまたは前記ＥＮＰＰ３に融合した前記アズロシジンシグナルペプチドおよびヒト血清アルブミンに融合した前記ＥＮＰＰ１または前記ＥＮＰＰ３をコードして、それぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端の順で、アズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ１－アルブミンまたはアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ３－アルブミンを形成する、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換えポリヌクレオチド。
  8. ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３のＮ末端に融合したシグナルペプチドをコードする核酸配列を含み、それを発現することができる、ウイルスベクター。
  9. プロモーターを含む、請求項８に記載のウイルスベクター。
  10. 前記プロモーターが肝臓特異的プロモーターである、請求項９に記載のウイルスベクター。
  11. 前記肝臓特異的プロモーターが、アルブミンプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーターおよびアルファ－１－アンチトリプシンプロモーターからなる群から選択される、請求項１０に記載のウイルスベクター。
  12. ポリアデニル化シグナルをコードする配列を含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  13. 前記シグナルペプチドがアズロシジンシグナルペプチドである、請求項８～１２のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  14. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項８～１３のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  15. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶ－ｒｈ７４からなる群から選択される血清型を有する、請求項１４に記載のウイルスベクター。
  16. 前記ポリヌクレオチドが、前記ＥＮＰＰ１に融合した前記アズロシジンシグナルペプチドまたは前記ＥＮＰＰ３に融合した前記アズロシジンシグナルペプチドおよびＦｃポリペプチドに融合した前記ＥＮＰＰ１または前記ＥＮＰＰ３をコードして、それぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端の順で、アズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ１－Ｆｃまたはアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ３－Ｆｃを形成する、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  17. 前記ポリヌクレオチドが、前記ＥＮＰＰ１に融合した前記アズロシジンシグナルペプチドまたは前記ＥＮＰＰ３に融合した前記アズロシジンシグナルペプチドおよびヒト血清アルブミンに融合した前記ＥＮＰＰ１または前記ＥＮＰＰ３をコードして、それぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端の順で、アズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ１－アルブミンまたはアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ３－アルブミンを形成する、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  18. 請求項８～１７のいずれか一項に記載の組換えウイルスベクターを得る方法であって、
    ｉ．請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞を提供するステップ、
    ｉｉ．ウイルスのアセンブリーに適切な条件下で前記細胞を維持するステップ、および
    ｉｉｉ．前記細胞によって産生された前記ウイルスベクターを精製するステップ
    を含む、方法。
  19. ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質を哺乳動物に提供する方法であって、
    請求項８～１７のいずれか一項に記載のウイルスベクターを前記哺乳動物に投与することを含む、方法。
  20. 請求項８～１７のいずれか一項に記載のウイルスベクターおよび生理学的に適合する担体を含む、医薬組成物。
  21. 疾患の進行を予防するかまたは低減させることを必要とする哺乳動物において疾患の進行を予防するかまたは低減させる方法であって、治療有効量の請求項２０に記載の医薬組成物を前記哺乳動物に投与することを含み、前記疾患が、Ｘ連鎖性低リン酸血症（ＸＬＨ）、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、ミネラル骨障害（ＭＢＤ）、血管石灰化、軟組織の病的石灰化、軟組織の病的骨化、乳児の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）および後縦靱帯骨化症（ＯＰＬＬ）からなる群から選択され、それによって、前記哺乳動物の前記疾患が予防されるか、またはその進行が低減させられる、方法。
  22. 請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、細胞。
  23. 病的石灰化または病的骨化の疾患または障害を治療または予防することを必要とする対象において病的石灰化または病的骨化の疾患または障害を治療または予防する方法であって、組換えＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする治療有効量のウイルスベクターを前記対象に投与し、それによって、前記疾患または障害を治療または予防することを含む、方法。
  24. ＥＮＰＰ１タンパク質の欠乏を有する対象を治療する方法であって、組換えＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする治療有効量のウイルスベクターを前記対象に投与し、それによって、前記対象を治療することを含む、方法。
  25. 前記疾患もしくは障害または前記ＥＮＰＰ１タンパク質の欠乏が、前記対象におけるＮＰＰ１遺伝子の機能欠損型突然変異またはＡＢＣＣ６遺伝子の機能欠損型突然変異と関連する、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 前記ウイルスベクターが組換えＥＮＰＰ１ポリペプチドをコードする、請求項２３～２５に記載の方法。
  27. 前記ウイルスベクターが組換えＥＮＰＰ３ポリペプチドをコードする、請求項２３～２５に記載の方法。
  28. 前記ウイルスベクターが組換えＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドまたは組換えＥＮＰＰ１－アルブミン融合ポリペプチドをコードする、請求項２３～２６に記載の方法。
  29. 前記ウイルスベクターが組換えＥＮＰＰ３－Ｆｃ融合ポリペプチドまたは組換えＥＮＰＰ３－アルブミン融合ポリペプチドをコードする、請求項２７に記載の方法。
  30. 前記ウイルスベクターがＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３に融合したシグナルペプチドを含む組換えポリペプチドをコードする、請求項２３～２９に記載の方法。
  31. 前記ベクターがＥＮＰＰ１－ＦｃまたはＥＮＰＰ１－アルブミンをコードする、請求項２３～３０に記載の方法。
  32. 前記シグナルペプチドがアズロシジンシグナルペプチド、ＮＰＰ２シグナルペプチドまたはＮＰＰ７シグナルペプチドである、請求項２３～３０に記載の方法。
  33. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスベクターまたは単純ヘルペスベクターまたはアルファウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである、請求項２３～３０に記載の方法。
  34. アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）の血清型が、ＡＡＶ１またはＡＡＶ２またはＡＡＶ３またはＡＡＶ４またはＡＡＶ５またはＡＡＶ６またはＡＡＶ７またはＡＡＶ８またはＡＡＶ９またはＡＡＶ－ｒｈ７４である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記ウイルスベクターが、ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドに融合したアズロシジンシグナルペプチドを含む組換えポリペプチドをコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項２３～３２に記載の方法。
  36. 前記ＥＮＰＰ１－Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする前記ＡＡＶベクターが、１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇの投薬量で対象に投与される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記投薬量が１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／ｋｇである、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記ＡＡＶベクターが５×１０１１～５×１０１５ ｖｇ／ｋｇの投薬量で対象に投与される、請求項３５に記載の方法。
  39. 前記ベクターが、ＥＮＰＰ１－ＦｃをコードするＡＡＶベクターであり、１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／ｋｇの投薬量で対象に投与される、請求項３５に記載の方法。
  40. ＥＮＰＰ１－Ｆｃポリペプチドをコードする前記ＡＡＶベクターの対象への投与が、前記対象において、血漿ピロリン酸（ＰＰｉ）の用量依存的増加および血漿ＥＮＰＰ１濃度の用量依存的増加をもたらす、請求項３５に記載の方法。
  41. ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質の触媒ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ウイルスベクター。
  42. ポリペプチド配列が、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質の細胞外ドメインを含む、請求項４１に記載のウイルスベクター。
  43. 前記ポリペプチドがＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質の膜貫通ドメインを含む、請求項４１または４２に記載のウイルスベクター。
  44. 前記ポリペプチドがＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質のヌクレアーゼドメインを含む、請求項４１～４３のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  45. 前記ポリペプチドが配列番号１の残基９９～９２５（Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）を含む、請求項４１～４４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  46. 前記ポリペプチドが配列番号７の残基３１～８７５（Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ～Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｉｌｅ）を含む、請求項４１～４４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  47. 前記ポリペプチドが配列番号１の残基１９１～５９１（Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｕ～Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｅｕ）を含む、請求項４１～４４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  48. 前記ポリペプチドが配列番号７の残基１４０～５１０（Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ～Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ）を含む、請求項４１～４４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  49. 前記ポリペプチドが配列番号９２の残基１～８２７（Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）を含む、請求項４１～４４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  50. 前記ポリペプチドが配列番号８９の残基１～８３３（Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｌａ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）または配列番号９１の残基１～８３０（Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ～Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ）を含む、請求項４１～４４のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  51. 昆虫ウイルスベクターではない、請求項４１～５０のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  52. 哺乳動物細胞に感染する、請求項４１～５１のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  53. 前記ポリヌクレオチド配列がプロモーター配列をコードする、請求項４１～５２のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  54. 前記プロモーターが肝臓特異的プロモーターである、請求項５３に記載のウイルスベクター。
  55. 前記肝臓特異的プロモーターが、アルブミンプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーターおよびアルファ－１－アンチトリプシンプロモーターからなる群から選択される、請求項５４に記載のウイルスベクター。
  56. 前記ポリヌクレオチド配列が、ポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項４１～５５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  57. 前記ポリヌクレオチドが、ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列に対してアミノ末端にあるシグナルペプチドをコードする、請求項４１～５５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  58. 前記シグナルペプチドがアズロシジンシグナルペプチドである、請求項５７に記載のウイルスベクター。
  59. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項４１～５８のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  60. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶ－ｒｈ７４からなる群から選択される血清型を有する、請求項５９に記載のウイルスベクター。
  61. 前記ポリヌクレオチド配列が、前記ＥＮＰＰ１に融合した前記アズロシジンシグナルペプチドまたは前記ＥＮＰＰ３に融合した前記アズロシジンシグナルペプチドおよびＦｃポリペプチドに融合した前記ＥＮＰＰ１または前記ＥＮＰＰ３をコードして、それぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端の順で、アズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ１－Ｆｃまたはアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ３－Ｆｃを形成する、請求項４１～６０のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  62. 前記ポリヌクレオチド配列が、前記ＥＮＰＰ１に融合した前記アズロシジンシグナルペプチドまたは前記ＥＮＰＰ３に融合した前記アズロシジンシグナルペプチドおよびヒト血清アルブミンに融合した前記ＥＮＰＰ１または前記ＥＮＰＰ３をコードして、それぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端の順で、アズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ１－アルブミンまたはアズロシジンシグナルペプチド－ＥＮＰＰ３－アルブミンを形成する、請求項４１～６０のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  63. 前記ポリペプチドが、（ｉ）ＥＮＰＰ１タンパク質またはＥＮＰＰ３タンパク質および（ｉｉ）半減期延長ドメインを含む融合タンパク質である、請求項４１～６２のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  64. 前記半減期延長ドメインが、ＩｇＧ Ｆｃドメインまたはその機能的フラグメントが存在しない場合の前記ポリペプチドの半減期と比較して、哺乳動物において前記ポリペプチドの半減期を延ばすことができる、前記ＩｇＧ Ｆｃドメインまたは前記ＩｇＧ Ｆｃドメインの機能的フラグメントである、請求項６３に記載のウイルスベクター。
  65. 前記半減期延長ドメインが、アルブミンドメインまたはその機能的フラグメントが存在しない場合の前記ポリペプチドの半減期と比較して、哺乳動物において前記ポリペプチドの半減期を延ばすことができる、前記アルブミンドメインまたは前記アルブミンドメインの機能的フラグメントである、請求項６３に記載のウイルスベクター。
  66. 前記半減期延長ドメインが、前記融合タンパク質において、前記ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質に対してカルボキシ末端にある、請求項６３～６５のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  67. 前記ＩｇＧ Ｆｃドメインが配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６４または６６に記載のウイルスベクター。
  68. 前記アルブミンドメインが配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項６５または６６に記載のウイルスベクター。
  69. 前記ポリヌクレオチドがリンカー配列をコードする、請求項４１～６８のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  70. 前記リンカー配列が配列番号５７～８８および９４からなる群から選択される、請求項６９に記載のウイルスベクター。
  71. 前記リンカー配列が、前記融合タンパク質の前記ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質と前記半減期延長ドメインを接続する、請求項６３～７０のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  72. 前記ポリペプチドが配列番号８９、９１、９２および９３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項４１～６４、６６または６７のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
  73. 組換えウイルスベクターを産生するための方法であって、
    ｉ．ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３タンパク質の触媒ドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞または細胞の集団を提供するステップであって、前記細胞が、組換えウイルスベクターへの前記ポリヌクレオチドのパッケージングおよび／またはアセンブリーに必須なウイルスタンパク質を発現するステップ；ならびに
    ｉｉ．前記ポリヌクレオチドを含む前記組換えウイルスベクターのパッケージングの前記アセンブリーに適切な条件下で、前記細胞または細胞の集団を維持するステップ
    を含む、方法。
  74. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記哺乳動物細胞がげっ歯類細胞またはヒト細胞である、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記ウイルスベクターが請求項４１～７２のいずれか一項に記載のベクターである、請求項７３～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記細胞もしくは細胞の集団から、または前記細胞もしくは細胞の集団が維持されていた培地から前記組換えウイルスベクターを精製することをさらに含む、請求項７３～７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. 請求項７７に記載の方法から精製された組換えウイルスベクター。
  79. 請求項４１～７２のいずれか一項に記載のウイルスベクターまたは請求項７８に記載の組換えウイルスベクターおよび医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
  80. 疾患の進行を予防するかまたは低減させることを必要とする哺乳動物において疾患の進行を予防するかまたは低減させる方法であって、治療有効量の請求項７９に記載の医薬組成物を前記哺乳動物に投与し、それによって、前記疾患または障害の進行を予防するかまたは低減させることを含む、方法。
  81. 前記哺乳動物がヒトである、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記疾患が、Ｘ連鎖性低リン酸血症（ＸＬＨ）、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、ミネラル骨障害（ＭＢＤ）、血管石灰化、軟組織の病的石灰化、軟組織の病的骨化、ＰＸＥ、乳児の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）および後縦靱帯骨化症（ＯＰＬＬ）からなる群から選択される、請求項８１または８２記載の方法。
  83. 病的石灰化または病的骨化の疾患または障害を治療または予防することを必要とする対象において病的石灰化または病的骨化の疾患または障害を治療または予防する方法であって、治療有効量の、請求項４１～７２のいずれか一項に記載のウイルスベクターまたは請求項７９に記載の医薬組成物を前記対象に投与して、それによって、前記疾患または障害を治療または予防することを含む、方法。
  84. ＥＮＰＰ１タンパク質の欠乏を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の、請求項４１～７２のいずれか一項に記載のウイルスベクターまたは請求項７９に記載の医薬組成物を前記対象に投与して、それによって、前記対象を治療することを含む、方法。
  85. 前記疾患もしくは障害または前記ＥＮＰＰ１タンパク質の欠乏が、前記対象におけるＮＰＰ１遺伝子の機能欠損型突然変異またはＡＢＣＣ６遺伝子の機能欠損型突然変異と関連する、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記ウイルスベクターまたは医薬組成物が、１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／対象または哺乳動物のｋｇの投薬量で投与される、請求項８０～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記ウイルスベクターまたは医薬組成物が、１×１０１３～１×１０１４ ｖｇ／対象または哺乳動物のｋｇの投薬量で投与される、請求項８０～８５のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記ウイルスベクターまたは医薬組成物が、５×１０１１～５×１０１５ ｖｇ／対象または哺乳動物のｋｇの投薬量で投与される、請求項８０～８５のいずれか一項に記載の方法。
  89. 前記ウイルスベクターまたは医薬組成物が、１×１０１２～１×１０１５ ｖｇ／対象または哺乳動物のｋｇの投薬量で投与される、請求項８０～８５のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記ウイルスベクターまたは医薬組成物の前記対象または哺乳動物への投与が、前記対象または哺乳動物において、血漿ピロリン酸（ＰＰｉ）および／または血漿ＥＮＰＰ１もしくはＥＮＰＰ３濃度を高める、請求項８０～８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記対象または哺乳動物から得られた生物試料において、以下のパラメーター：（ｉ）ピロリン酸の濃度、（ｉｉ）ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の発現レベル、および（ｉｉｉ）ＥＮＰＰ１またはＥＮＰＰ３の酵素活性のうちの１つまたは複数を検出または測定することをさらに含む、請求項８０～８９のいずれか一項に記載の方法。
  92. 前記検出または測定が、前記ウイルスベクターまたは医薬組成物を投与する前に行われる、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記検出または測定が、前記ウイルスベクターまたは医薬組成物の投与と同時またはほぼ同時に行われる、請求項９１または９２に記載の方法。
  94. 前記検出または測定が、前記ウイルスベクターまたは医薬組成物の投与の後に行われる、請求項９１～９３のいずれか一項に記載の方法。
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KR20230123932A (ko) * 2020-11-19 2023-08-24 이노자임 파마, 인코포레이티드 Enpp1 결핍증 및 abcc6 결핍증의 치료
AU2022353101A1 (en) * 2021-09-24 2024-05-09 Inozyme Pharma, Inc. Lyophilized enpp1 polypeptide formulations and uses thereof
WO2023196820A2 (en) * 2022-04-04 2023-10-12 Inozyme Pharma, Inc. Treatment of enpp1 deficiency and abcc6 deficiency

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6894022B1 (en) * 1998-08-27 2005-05-17 Eidgenossische Technische Hochschule Zurich Growth factor modified protein matrices for tissue engineering
EP1537140B1 (en) * 2001-11-07 2013-01-02 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 161p2f10b useful in treatment and detection of cancer
EP1736553A1 (en) * 2005-06-17 2006-12-27 Centre National De La Recherche Scientifique ENPP1 (PC-1) gene haplotype associated with the risk of obesity and type 2 diabetes and their applications
US10973931B2 (en) * 2014-09-16 2021-04-13 Universitat Autònoma De Barcelona Adeno-associated viral vectors for the gene therapy of metabolic diseases
WO2016100803A2 (en) * 2014-12-19 2016-06-23 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating tissue calcification
JP6995627B2 (ja) * 2015-05-19 2022-02-04 イエール ユニバーシティ 病的石灰化状態を治療するための組成物およびそれを使用する方法
US11390859B2 (en) * 2016-08-05 2022-07-19 Yale University Compositions and methods for stroke prevention in pediatric sickle cell anemia patients
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