CN114761566A - 用于治疗病毒感染的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了利用只可以在病毒聚合酶的存在下转录的形式的编码趋化因子、细胞因子或细胞凋亡诱导蛋白(例如胱天蛋白酶9(Casp9))或其他毒素的重组核酸构建体或无复制能力的病毒样颗粒的方法和组合物。这些方法可以适于靶向许多病毒感染并降低或消除病毒载量，并提供用于病毒感染的根本不同的治疗。

Description

用于治疗病毒感染的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求以下的优先权：于2019年8月29日提交的美国临时申请号62/893,460；于2020年1月31日提交的美国临时申请号62/968,387；于2020年2月14日提交的美国临时申请号62/976,491；以及于2020年3月5日提交的美国临时申请号62/985,597，其每一件的全部内容通过援引并入本文。
技术领域
本公开提供了利用只能在病毒聚合酶的存在下转录的形式的编码趋化因子、细胞因子或细胞凋亡诱导蛋白(如胱天蛋白酶9(Casp9))的重组核酸构建体或无复制能力的病毒样颗粒的方法和组合物。这些方法可以适于靶向许多病毒感染并降低或消除病毒载量，并提供用于病毒感染的根本不同的治疗。
背景技术
病毒感染是全球公共卫生的一个具有挑战性的问题。在治疗某些病毒感染中已经取得了一些进展，但这些治疗中的许多对世界许多地区来说无效或成本过高。例如，乙型肝炎病毒(HBV)感染，作为难以治疗、慢性病毒感染的模型，仍然是巨大的公共卫生挑战。自从引入HBV疫苗以来，包括垂直母婴传播和水平传播的传播风险显著减少。然而，据估计，全世界仍有2.48亿人长期感染HBV。这给流行地区和国家带来了沉重的社会经济负担。慢性乙型肝炎(CHB)的临床结果变化很大，范围从乙型肝炎的自发消退到严重的有害后果，包括发展为肝功能衰竭、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。由宿主抗病毒免疫介导的持续性或复发性肝脏坏死性炎症是疾病进展的主要原因，最终导致肝的晚期纤维化和癌变。CHB严重不良后果的终生风险高达15％–40％。需要对有风险的人进行早期诊断和及时的抗病毒治疗，以预防不良临床结果的发展。
因此，需要新的、更有效和更广泛可用的治疗来治疗病毒感染，诸如HBV。开发有效病毒治疗的挑战方面之一是其复杂的生命周期，这与宿主细胞的生命周期密切相关。例如，HBV在受感染的肝实质细胞中的持续性是由于共价闭合环状DNA(cccDNA)的存在，它是病毒RNA转录的模板。使用核苷类似物的抗病毒疗法会抑制受感染细胞的细胞质中存在的衣壳中HBV DNA的复制，但不会降低或破坏核cccDNA。尽管取得了一些进展，但抗病毒药物目前仅针对少数病毒性疾病有效。
因此，需要根本不同的治疗途径来改变治疗病毒感染的前景。
发明内容
本文提供了一种重组核酸序列，所述重组核酸分子包括：负链核酸分子或pgRNA核酸分子，所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白或其组合，所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子侧翼是第一和第二病毒转录识别信号，以及进一步包括在所述第一病毒转录识别信号上游(5')的第一启动子以及第二启动子，所述第二启动子与编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白或其组合的负链核酸分子或pgRNA核酸分子相邻且在所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子的5'处。
在某些实施方式中，所述负链核酸分子是负义RNA、负义DNA、表达非编码负义RNA或pgRNA的单链或双链DNA，或其任何组合。
在额外的实施方式中，所述病毒转录识别信号选自病毒，所述病毒选自负链病毒、RNA逆转录病毒或DNA逆转录病毒。
在额外的实施方式中，所述重组核酸进一步包括在编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白或其组合的所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子下游(3')的多聚A尾。
在额外的实施方式中，所述细胞凋亡诱导蛋白选自由以下组成的组：BAX、BID、BAK、BAD、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶10、胱天蛋白酶11、胱天蛋白酶12、细胞色素C、SMAC和细胞凋亡诱导因子，或其任何组合。
在还额外的实施方式中，所述第一启动子包括强遍在启动子或肝组织特异性启动子，选自由以下组成的组：TBG(甲状腺素结合球蛋白)、白蛋白启动子和/或增强元件、AFP(α-甲胎蛋白)启动子、AAT(α-1-抗胰蛋白酶)启动子、ApoE(载脂蛋白E)启动子或PEPCK(磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶)启动子。
在还额外的实施方式中，所述第二启动子包括延伸因子1α结合序列(EFS)。
在额外的实施方式中，所述趋化因子选自CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、XCL1、XCL2和CX3CL1。
在另外的实施方式中，所述细胞因子选自由以下组成的组：IL-15、IL-2、IL-8、IL-10、IL-12、IL-6、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、CD40L、Mig和Crg-2。
在额外的实施方式中，所述病毒转录识别信号包括ε识别信号(SEQ ID NO:1)。
在额外的实施方式中，所述病毒为乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、人副流感病毒1、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人呼吸道合胞病毒、水疱性口炎印第安纳病毒、狂犬病病毒、牛暂时热病毒(bovine ephemeral fever virus)、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、布尼奥罗病毒、汉坦病毒、内罗毕绵羊病病毒(Nairobi sheep disease virus)、白蛉热西西里病毒、甲型流感病毒、丙型流感病毒、索戈托病毒(Thogoto virus)、小鼠乳腺肿瘤病毒、鼠白血病病毒、禽白血病病毒、Mason-Pfizer猴病毒、牛白血病病毒、人免疫缺陷病毒1、人泡沫状病毒属(human spumavirus)、鸭乙型肝炎病毒及其组合。
在额外的实施方式中，所述核酸分子不包括病毒聚合酶、逆转录酶、衣壳、包膜、包装信号或易位基序的序列(编码或非编码)。
本文提供了包括本文所述的任何重组核酸序列的载体。
在额外的实施方式中，所述载体包括用于递送至哺乳动物细胞的递送载体或负载体。
在额外的实施方式中，所述载体或负载体包括VLP、腺相关病毒(AAV)、脂质体、纳米颗粒、胶束、聚合物囊泡或聚合物泡囊。
本文提供了包括本文所述的任何重组核酸序列或本文所述的任何载体的药物组合物。
本文提供了一种无复制能力的病毒样颗粒(VLP)，包括：
任选的易位基序(TLM)，所述任选的易位基序(TLM)与来自乙型肝炎病毒衣壳或丁型肝炎病毒衣壳的衣壳蛋白融合；以及
负链核酸分子或pgRNA核酸分子，所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白或其组合，所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子侧翼是第一和第二病毒转录识别信号，以及进一步包括第一启动子，所述第一启动子在第一病毒转录识别信号上游(5'),以及第二启动子，所述第二启动子与编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白或其组合的负链核酸分子或pgRNA核酸分子相邻且在所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子的5'处。
本文另外提供了一种无复制能力的病毒样颗粒(VLP)，包括：
负链核酸分子或pgRNA核酸分子，所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白或其组合，所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子侧翼是第一和第二靶病毒转录识别信号，以及进一步包括在所述第一病毒转录识别信号上游(5')的第一启动子，以及第二启动子，所述第二启动子与编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白或其组合的负链核酸分子或pgRNA核酸分子相邻且在所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子的5'处，其中，所述VLP表现出对靶病毒感染细胞的趋向性。
在额外的实施方式中，所述负链核酸分子是负义RNA、负义DNA、表达非编码负义RNA或pgRNA的单链或双链DNA，或其任何组合。
在额外的实施方式中，所述无复制能力的病毒样颗粒(VLP)进一步包括在编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白或其组合的所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子下游(3')的多聚A尾。
在额外的实施方式中，所述第一启动子包括强遍在启动子或肝组织特异性启动子，选自由以下组成的组：TBG(甲状腺素结合球蛋白)、白蛋白启动子和/或增强元件、AFP(α-甲胎蛋白)启动子、AAT(α-1-抗胰蛋白酶)启动子、ApoE(载脂蛋白E)启动子或PEPCK(磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶)启动子。
在额外的实施方式中，所述第二启动子包括延伸因子1α结合序列(EFS)。
在额外的实施方式中，所述病毒转录识别信号选自病毒，所述病毒选自负链病毒、RNA逆转录病毒或DNA逆转录病毒。
在额外的实施方式中，所述病毒转录识别信号包括ε识别信号(SEQ ID NO:1)。
在额外的实施方式中，所述细胞凋亡诱导蛋白选自由以下组成的组：BAX、BID、BAK、BAD、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶10、胱天蛋白酶11、胱天蛋白酶12、细胞色素C、SMAC和细胞凋亡诱导因子。
在额外的实施方式中，所述趋化因子选自CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、XCL1、XCL2和CX3CL1。
在额外的实施方式中，所述细胞因子选自由以下组成的组：IL-15、IL-2、IL-8、IL-10、IL-12、IL-6、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、CD40L、Mig和Crg-2。
在额外的实施方式中，所述病毒为乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、人副流感病毒1、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人呼吸道合胞病毒、水疱性口炎印第安纳病毒、狂犬病病毒、牛暂时热病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、布尼奥罗病毒、汉坦病毒、内罗毕绵羊病病毒、白蛉热西西里病毒、甲型流感病毒、丙型流感病毒、索戈托病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、鼠白血病病毒、禽白血病病毒、Mason-Pfizer猴病毒、牛白血病病毒、人免疫缺陷病毒1、人泡沫状病毒属、鸭乙型肝炎病毒、冠状病毒及其组合。
在额外的实施方式中，所述核酸分子不包括病毒衣壳、聚合酶、逆转录酶、包膜、包装信号或易位基序的序列(编码或非编码)。
另外提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本文所述的任何无能力的病毒样颗粒。
另外提供了一种在有此需要的受试者中治疗病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者给药本文所述的重组核酸分子、或本文所述的载体、或本文所述的药物组合物、或本文所述的无复制能力的病毒样颗粒。
在额外的实施方式中，所述病毒感染包括来自分类在巴尔的摩分类IV、V、VI或VII下的病毒的感染。
在额外的实施方式中，所述病毒感染包括来自选自由以下组成的组的病毒的感染：乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、人副流感病毒1、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人呼吸道合胞病毒、水疱性口炎印第安纳病毒、狂犬病病毒、牛暂时热病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、布尼奥罗病毒、汉坦病毒、内罗毕绵羊病病毒、白蛉热西西里病毒、甲型流感病毒、丙型流感病毒、索戈托病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、鼠白血病病毒、禽白血病病毒、Mason-Pfizer猴病毒、牛白血病病毒、人免疫缺陷病毒1、人泡沫状病毒属、鸭乙型肝炎病毒及其任何组合。
在额外的实施方式中，所述病毒感染包括来自选自由以下组成的组的病毒的感染：甲型、乙型、丙型流感和/或任何冠状病毒和/或来自巴尔的摩分类组IV的任何病毒。
在额外的实施方式中，所述病毒感染包括来自选自由以下组成的组的病毒的感染：丝状病毒、副黏病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒属(rubulavirus)、肺病毒、水泡性病毒属、狂犬病病毒属(lyssavrius)、暂时热病毒属(ephemerovirus)、沙粒病毒、布尼亚病毒、汉坦病毒、内罗毕病毒、白蛉病毒、正肝病毒属、禽肝病毒属、哺乳动物B型逆转录病毒、哺乳动物C型逆转录病毒、禽C型逆转录病毒、D型逆转录病毒、BLV-HTLV逆转录病毒、慢病毒、泡沫状病毒属及其组合。
在一些实施方式中，所述病毒感染包括来自冠状病毒，诸如称为COVID-19、SARS或MERS的病毒的感染。
在额外的实施方式中，所述核酸分子、载体、药物组合物或无复制能力的病毒样颗粒在给药后进入肝细胞。
在额外的实施方式中，所述核酸分子、载体、药物组合物或无复制能力的病毒样颗粒在给药后将所述核酸分子递送至肝细胞并且所述核酸分子在所述肝细胞中表达。
在额外的实施方式中，所述受试者患有急性、慢性或潜伏性病毒感染。
在额外的实施方式中，给药诱导针对被引起所述病毒感染的病毒所感染的细胞的免疫应答。
在额外的实施方式中，给药诱导在被引起所述病毒感染的病毒所感染的细胞中的细胞凋亡。
另外提供了一种在有此需要的受试者中诱导针对被病毒感染的细胞的免疫应答的方法，所述方法包括使所述受试者与本文所述的重组核酸分子、或本文所述的载体、或本文所述的药物组合物、或本文所述的无复制能力的病毒样颗粒中的任何接触。
另外提供了一种在有此需要的受试者中诱导针对被病毒感染的细胞的细胞凋亡应答的方法，所述方法包括使所述受试者与本文所述的重组核酸分子、或本文所述的载体、或本文所述的药物组合物、或本文所述的无复制能力的病毒样颗粒中的任何接触。
在额外的实施方式中，所述病毒是HBV、HDV、甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)或其任何组合。
另外提供了一种在受试者中治疗乙型肝炎的方法，所述方法包括向所述受试者给药本文所述的重组核酸分子、或本文所述的载体、或本文所述的药物组合物、或本文所述的无复制能力的病毒样颗粒。
在额外的实施方式中，所述方法进一步包括给药至少一种抗病毒剂、HBV聚合酶抑制剂、干扰素、TLR调节剂诸如TLR-7激动剂或TLR-9激动剂、治疗性疫苗、某些细胞病毒RNA传感器的免疫激活因子、病毒进入抑制剂、病毒成熟抑制剂、不同的衣壳组装调节剂、不同或未知机制的抗病毒化合物及其任何组合。
在额外的实施方式中，所述方法进一步包括给药至少一种抗病毒剂3TC、FTC、L-FMAU、干扰素、阿德福韦酯、恩替卡韦(entecavir)、替比夫定(telbivudine，L-dT)、伐托他滨(valtorcitabine，3'-缬氨酰L-dC)、β-D-二氧杂环戊基-鸟嘌呤(DXG)、β-D-二氧杂环戊基-2,6-二氨基嘌呤(DAPD)、β-D-二氧杂环戊基-6-氯嘌呤(ACP)、泛昔洛韦(famciclovir)、喷昔洛韦(penciclovir)、洛布卡韦(lobucavir)、更昔洛韦(ganciclovir)、利巴韦林(ribavirin)及任何组合。
在额外的实施方式中，所述治疗为周期性给药，包括每周一次、每2周一次、每3周一次、每月一次、至每两个月一次、至每3个月一次、至每4个月一次、至每5个月一次、至每6个月一次、或每7个月一次、或每8个月一次、或每9个月一次、或每10个月一次、或每11个月一次、或每年一次作为维持治疗，或者持续只要患者需要达到稳定或无法检测到的疾病即可。
附图说明
图1A和图1B包括示出AAV8-HBV-DRS2构建体(6005bp)的特征的质粒图和重组构建体示意图。
图2A、图2B和图2C示出了非限制性质粒图，示出HepG2(野生型)和HepAD38细胞中的测试和对照构建体的活细胞数据的图，连同实验1的数字数据。
图3A和图3B显示了非限制性质粒图和胱天蛋白酶-9抑制剂的化学结构，以及示出实验2的HepG2(野生型)细胞中的测试和对照构建体的活细胞数据的图。
图4A、图4B和图4C显示了非限制性质粒图和胱天蛋白酶-9抑制剂的化学结构(图4A)，示出HepAD38细胞(HBV模型细胞)中测试和对照构建体的活细胞数据的图(图4B)，连同实验2的数字数据(图4C)。
图5A和图5B示出了质粒图(图5A)和示出实验2的HepG2对比于HepAD38细胞中测试和对照构建体的结果的比较图(图5B)。
图6A、图6B和图6C示出了测试构建体AAV-HBV-DRS2(TBG>HBV-rcCasp9)的质粒图和胱天蛋白酶-9抑制剂的化学结构(图6A)，以及示出HepG2对比于HepAD38细胞中测试和对照构建体的活细胞数据的比较图(图6B)，连同实验3的数字数据(图6C)。
图7是示出AAV8-HBV-DRS1构建体的特征的质粒图和构建体示意图以及序列。
图8是示出AAV8-HBV-DRS2构建体的特征的质粒图和构建体示意图以及序列。
图9是显示利用模型小鼠进行体内测试以评价靶向重组构建体的分布、功效、特异性/功能性和安全性的示意图。
图10A和图10B是示出“流感劫持/自杀载体”如何劫持病毒机制以在受感染细胞中诱导细胞凋亡的示意图和图表(图10A)，以及体外结果，其示出反式递送以与流感聚合酶结合的测试构建体劫持病毒机制，以比未经治疗的感染细胞快40％地诱导流感感染细胞中的细胞死亡(图10B)。
图11A、图11B和图11C是示出在小鼠模型中使用HBV劫持构建体的结果的图像、图表和示意图。
图12A和图12B是示出冠状病毒“劫持-RNA”构建体的设计概述的示意图。
图13显示了示出SARS-CoV-2劫持RNA在SARS-CoV-2感染细胞中的作用机制的示意图。
图14显示了示出Cov-2劫持DTA体外转录载体的特征和序列的非限制性质粒图和构建体示意图。
图15显示了示出SARS-CoV-2劫持RNA构建体的特征和序列的非限制性质粒图和构建体示意图。
图16A和图16B是示出了用测试或对照构建体治疗后SARS-CoV-2感染或未感染细胞的生存力的比较图表。
具体实施方式
在某些实施方式中，提供了利用只能在病毒聚合酶的存在下转录的编码趋化因子、细胞因子或细胞凋亡诱导蛋白(例如胱天蛋白酶9(Casp9)和本文提供的其他)的重组核酸构建体或无复制能力的病毒样颗粒的方法和组合物。在某些实施方式中，构建体携带编码Casp9的序列，这将导致病毒感染的细胞被杀死。这些方法可以适于针对许多病毒感染并降低或消除病毒载量，并提供用于病毒感染的根本不同的治疗。
利用病毒机制破坏病毒感染的细胞
尽管不希望受理论束缚，但本方法和组合物至少部分基于利用通常存在于受感染细胞的细胞质中的病毒机制。在某些实施方式中，将重组核酸构建体或无复制能力的病毒样颗粒(VLP)引导或注射到病毒感染的细胞中，其中，构建体或VLP包括单链RNA核酸构建体，该单链RNA核酸构建体包含编码趋化因子、细胞因子或细胞凋亡诱导蛋白例如Casp 9(及其启动子)的序列，侧翼是乙型肝炎ε信号结合序列，以形成仅在乙型肝炎逆转录酶识别时才会转录，将与ε序列结合以转录该片段并导致Casp 9编码序列的翻译的构建体，这将引发乙型肝炎感染细胞的细胞凋亡。这些构建体将有效地起到“病毒特异性自杀构建体”的作用，否则它们将在非病毒感染的细胞中降解。
因此，在某些实施方式中，本发明的组合物和方法涵括设计用于靶向乙型肝炎感染细胞的重组核酸构建体和无复制能力的病毒样颗粒。HBV来自巴尔的摩组VII，其包括通过单链RNA中间体复制的双链DNA病毒。这一小组病毒，以乙型肝炎病毒为例，具有双链、有缺口的基因组，随后被填充形成共价闭合环(cccDNA)，作为产生病毒mRNA和亚基因组RNA的模板。前基因组RNA用作病毒逆转录酶的模板，用于产生DNA基因组。该病毒聚合酶识别本文所述的重组核酸构建体和无复制能力的病毒样颗粒中的侧翼ε序列，并导致毒剂的产生。因此，只有病毒感染的细胞会被趋化因子、细胞因子或细胞凋亡诱导蛋白(例如胱天蛋白酶9(Casp9))的产生杀死。
在一些实施方式中，趋化因子、细胞因子或细胞凋亡诱导蛋白的侧翼是病毒5'UTR和病毒3'UTR，使得核酸可以由式X-Y-Z表示，其中，X是病毒5'UTR，Y是目的蛋白，诸如趋化因子、细胞因子或细胞凋亡诱导蛋白(例如胱天蛋白酶9或本文提供的其他，或白喉毒素A片段)，以及Z是病毒3'UTR。5'UTR和目的蛋白质之间或3'UTR和目的蛋白质之间可能存在插入序列。当细胞识别转录物时，转录物会产生编码目的蛋白的5'-3’反向互补序列。这也可以在AAV表达载体或其他合适的病毒载体中递送。
在一些实施方式中，5'-UTR是冠状病毒(诸如被称为COVID-19(或COVD-19)、SARS或MERS的病毒)的5'前导序列。在一些实施方式中，5'-UTR包括以下序列或其互补序列：
ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAACAAACCAACCAACTTTCGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGAACTTTAAAATCTGTGTGGCTGTCACTCGGCTGCATGCTTAGTGCACTCACGCAGTATAATTAATAACTAATTACTGTCGTTGACAGGACACGAGTAACTCGTCTATCTTCTGCAGGCTGCTTACGGTTTCGTCCGTGTTGCAGCCGATCATCAGCACATCTAGGTTTCGTCCGGGTGTGACCGAAAGGTAAG(SEQ ID NO:25)
在一些实施方式中，3’UTR包括以下序列或其互补序列：
CAATCTTTAATCAGTGTGTAACATTAGGGAGGACTTGAAAGAGCCACCACATTTTCACCGAGGCCACGCGGAGTACGATCGAGTGTACAGTGAACAATGCTAGGGAGAGCTGCCTATATGGAAGAGCCCTAATGTGTAAAATTAATTTTAGTAGTGCTATCCCCATGTGATTTTAATAGCTTCTTAGGAGAATGACAAAAAAACAATCTTGCTAAACACTGTCTTCATG(SEQ ID NO:26)
在一些实施方式中，编码白喉毒素A片段的核酸序列包括以下(或其互补序列)：
ATGGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAATCTTTTGTGATGGAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAACCTGGTTATGTAGATTCCATTCAAAAAGGTATACAAAAGCCAAAATCTGGTACACAAGGAAATTATGACGATGATTGGAAAGGGTTTTATAGTACCGACAATAAATACGACGCTGCGGGATACTCTGTAGATAATGAAAACCCGCTCTCTGGAAAAGCTGGAGGCGTGGTCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAAGTGGATAATGCCGAAACTATTAAGAAAGAGTTAGGTTTAAGTCTCACTGAACCGTTGATGGAGCAAGTCGGAACGGAAGAGTTTATCAAAAGGTTCGGTGATGGTGCTTCGCGTGTAGTGCTCAGCCTTCCCTTCGCTGAGGGGAGTTCTAGCGTTGAATATATTAATAACTGGGAACAGGCGAAAGCGTTAAGCGTAGAACTTGAGATTAATTTTGAAACCCGTGGAAAACGTGGCCAAGATGCGATGTATGAGTATATGGCTCAAGCCTGTGCAGGAAATCGTGTCAGGCGATCAGTAGGTAGCTCATTGTAA(SEQ ID NO:27)
在一些实施方式中，提供了包括以下序列的组合物:
ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAACAAACCAACCAACTTTCGATCTCTTGTAGATCTGTTCTCTAAACGAACTTTAAAATCTGTGTGGCTGTCACTCGGCTGCATGCTTAGTGCACTCACGCAGTATAATTAATAACTAATTACTGTCGTTGACAGGACACGAGTAACTCGTCTATCTTCTGCAGGCTGCTTACGGTTTCGTCCGTGTTGCAGCCGATCATCAGCACATCTAGGTTTCGTCCGGGTGTGACCGAAAGGTAAGATGGGCGCTGATGATGTTGTTGATTCTTCTAAATCTTTTGTGATGGAAAACTTTTCTTCGTACCACGGGACTAAACCTGGTTATGTAGATTCCATTCAAAAAGGTATACAAAAGCCAAAATCTGGTACACAAGGAAATTATGACGATGATTGGAAAGGGTTTTATAGTACCGACAATAAATACGACGCTGCGGGATACTCTGTAGATAATGAAAACCCGCTCTCTGGAAAAGCTGGAGGCGTGGTCAAAGTGACGTATCCAGGACTGACGAAGGTTCTCGCACTAAAAGTGGATAATGCCGAAACTATTAAGAAAGAGTTAGGTTTAAGTCTCACTGAACCGTTGATGGAGCAAGTCGGAACGGAAGAGTTTATCAAAAGGTTCGGTGATGGTGCTTCGCGTGTAGTGCTCAGCCTTCCCTTCGCTGAGGGGAGTTCTAGCGTTGAATATATTAATAACTGGGAACAGGCGAAAGCGTTAAGCGTAGAACTTGAGATTAATTTTGAAACCCGTGGAAAACGTGGCCAAGATGCGATGTATGAGTATATGGCTCAAGCCTGTGCAGGAAATCGTGTCAGGCGATCAGTAGGTAGCTCATTGTAACAATCTTTAATCAGTGTGTAACATTAGGGAGGACTTGAAAGAGCCACCACATTTTCACCGAGGCCACGCGGAGTACGATCGAGTGTACAGTGAACAATGCTAGGGAGAGCTGCCTATATGGAAGAGCCCTAATGTGTAAAATTAATTTTAGTAGTGCTATCCCCATGTGATTTTAATAGCTTCTTAGGAGAATGACAAAAAAACAATCTTGCTAAACACTGTCTTCATG(SEQ ID NO:28)
其编码5'UTR、3'UTR和目的蛋白，该目的蛋白可以是本文提供的任何序列。在上面的实例中，该序列编码白喉毒素A片段。
在一些实施方式中，编码白喉毒素A片段的核酸序列作为反向互补序列提供，其可以包括以下序列：
TTACAATGAGCTACCTACTGATCGCCTGACACGATTTCCTGCACAGGCTTGAGCCATATACTCATACATCGCATCTTGGCCACGTTTTCCACGGGTTTCAAAATTAATCTCAAGTTCTACGCTTAACGCTTTCGCCTGTTCCCAGTTATTAATATATTCAACGCTAGAACTCCCCTCAGCGAAGGGAAGGCTGAGCACTACACGCGAAGCACCATCACCGAACCTTTTGATAAACTCTTCCGTTCCGACTTGCTCCATCAACGGTTCAGTGAGACTTAAACCTAACTCTTTCTTAATAGTTTCGGCATTATCCACTTTTAGTGCGAGAACCTTCGTCAGTCCTGGATACGTCACTTTGACCACGCCTCCAGCTTTTCCAGAGAGCGGGTTTTCATTATCTACAGAGTATCCCGCAGCGTCGTATTTATTGTCGGTACTATAAAACCCTTTCCAATCATCGTCATAATTTCCTTGTGTACCAGATTTTGGCTTTTGTATACCTTTTTGAATGGAATCTACATAACCAGGTTTAGTCCCGTGGTACGAAGAAAAGTTTTCCATCACAAAAGATTTAGAAGAATCAACAACATCATCAGCGCCCAT(SEQ ID NO:29)
在一些实施方式中，序列作为反向互补序列提供，其可以包括以下序列：
CATGAAGACAGTGTTTAGCAAGATTGTTTTTTTGTCATTCTCCTAAGAAGCTATTAAAATCACATGGGGATAGCACTACTAAAATTAATTTTACACATTAGGGCTCTTCCATATAGGCAGCTCTCCCTAGCATTGTTCACTGTACACTCGATCGTACTCCGCGTGGCCTCGGTGAAAATGTGGTGGCTCTTTCAAGTCCTCCCTAATGTTACACACTGATTAAAGATTGTTACAATGAGCTACCTACTGATCGCCTGACACGATTTCCTGCACAGGCTTGAGCCATATACTCATACATCGCATCTTGGCCACGTTTTCCACGGGTTTCAAAATTAATCTCAAGTTCTACGCTTAACGCTTTCGCCTGTTCCCAGTTATTAATATATTCAACGCTAGAACTCCCCTCAGCGAAGGGAAGGCTGAGCACTACACGCGAAGCACCATCACCGAACCTTTTGATAAACTCTTCCGTTCCGACTTGCTCCATCAACGGTTCAGTGAGACTTAAACCTAACTCTTTCTTAATAGTTTCGGCATTATCCACTTTTAGTGCGAGAACCTTCGTCAGTCCTGGATACGTCACTTTGACCACGCCTCCAGCTTTTCCAGAGAGCGGGTTTTCATTATCTACAGAGTATCCCGCAGCGTCGTATTTATTGTCGGTACTATAAAACCCTTTCCAATCATCGTCATAATTTCCTTGTGTACCAGATTTTGGCTTTTGTATACCTTTTTGAATGGAATCTACATAACCAGGTTTAGTCCCGTGGTACGAAGAAAAGTTTTCCATCACAAAAGATTTAGAAGAATCAACAACATCATCAGCGCCCATCTTACCTTTCGGTCACACCCGGACGAAACCTAGATGTGCTGATGATCGGCTGCAACACGGACGAAACCGTAAGCAGCCTGCAGAAGATAGACGAGTTACTCGTGTCCTGTCAACGACAGTAATTAGTTATTAATTATACTGCGTGAGTGCACTAAGCATGCAGCCGAGTGACAGCCACACAGATTTTAAAGTTCGTTTAGAGAACAGATCTACAAGAGATCGAAAGTTGGTTGGTTTGTTACCTGGGAAGGTATAAACCTTTAAT(SEQ ID NO:30)
尽管本文提供的序列(上文和下文)表示为DNA序列，但也提供了相应的RNA序列。
如本文所用，术语“核酸序列”和“核酸分子”可以互换使用。
在一些实施方式中，提供了重组核酸序列，其包括：编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白或其组合的负链核酸分子或pgRNA核酸分子，该负链核酸分子或pgRNA核酸分子侧翼是第一和第二病毒转录识别信号，并且进一步包括在第一病毒转录识别信号上游(5')的第一启动子以及与编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白或其组合的负链核酸分子或pgRNA核酸分子相邻且在该负链核酸分子或pgRNA核酸分子5'处的第二启动子。本文提供了趋化因子、细胞因子和细胞凋亡诱导蛋白的非限制性实例。侧翼是第一和第二病毒转录识别信号的实际蛋白可以是任何合适的蛋白。这种编码的蛋白也可以用任何目的蛋白代替，而不仅仅是编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白质或白喉毒素A(或其片段)的蛋白。
如本文所提供的，负链核酸分子可以是负义RNA、负义DNA、表达非编码负义RNA或pgRNA的单链或双链DNA，或其任何组合。在一些实施方式中，负链核酸分子是负义RNA。在一些实施方式中，负链核酸分子是负义DNA。在一些实施方式中，负链核酸分子是表达非编码负义RNA的单链或双链DNA。在一些实施方式中，负链核酸分子是pgRNA。
如本文所提供的，在一些实施方式中，病毒转录识别信号源自或基于病毒，该病毒是例如负链病毒、RNA逆转录病毒或DNA逆转录病毒。在一些实施方式中，病毒转录识别信号是负链病毒病毒转录识别信号。在一些实施方式中，病毒转录识别信号是RNA逆转录病毒病毒转录识别信号。在一些实施方式中，病毒转录识别信号是DNA逆转录病毒病毒转录识别信号。
在一些实施方式中，重组核酸序列包括在负链核酸分子或pgRNA核酸分子下游(3')的多聚A尾，其也编码目的蛋白，诸如毒素、趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白或其组合。
细胞凋亡诱导蛋白可以是基于其在细胞中的表达能够诱导细胞凋亡的任何蛋白。实例包括但不限于BAX、BID、BAK、BAD、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶10、胱天蛋白酶11、胱天蛋白酶12、细胞色素C、SMAC和细胞凋亡诱导因子，或其任何组合。因此，这些蛋白可以表达为构建体中的目的蛋白，将该构建体给药于受感染的个体或与受感染的细胞接触以通过这些目的蛋白的表达来诱导细胞死亡。
在一些实施方式中，目的蛋白质不是病毒蛋白。
本实施方式可以使用或编码的趋化因子的实例包括但不限于CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、XCL1、XCL2和/或CX3CL1。在一些实施方式中，细胞因子选自由以下组成的组：IL-15、IL-2、IL-8、IL-10、IL-12、IL-6、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、CD40L、Mig和Crg-2。
如本文所提供，在一些实施方式中，重组核酸序列可以进一步包括指导核酸序列在细胞中表达的启动子。在一些实施方式中，启动子是组成型启动子。在一些实施方式中，启动子是组织特异性启动子。在一些实施方式中，启动子是肝组织特异性启动子。肝组织特异性启动子的实例包括但不限于TBG(甲状腺素结合球蛋白)、白蛋白启动子和/或增强元件、AFP(α-甲胎蛋白)启动子、AAT(α-1-抗胰蛋白酶)启动子、ApoE(载脂蛋白E)启动子或PEPCK(磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶)启动子。启动子可以用作本文所提及的第一启动子。
在一些实施方式中，重组核酸序列包括第二启动子。这种第二启动子的非限制性实例是延伸因子1α结合序列(EFS)。
在一些实施方式中，病毒转录识别信号(序列)包括ε识别信号(SEQ ID NO:1)或冠状病毒识别序列(诸如在SEQ ID:25、SEQ ID:26、SEQ ID:28或SEQ ID:30中发现的那些)。其他病毒转录识别信号序列也可以被使用，以及被替代对待治疗的病毒或病毒感染的特异的序列。
如本文所提供的，本实施方式可以用于治疗病毒感染。并且在一些实施方式中，组合物和方法可以用于特异性杀死病毒感染的细胞。特异性杀死病毒感染细胞的益处是其可以导致仅破坏携带病毒的细胞。可以用于病毒转录识别信号的病毒的实例包括但不限于冠状病毒(例如COVID-19、SARS、MERS)、乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、人副流感病毒1、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人呼吸道合胞病毒、水疱性口炎印第安纳病毒、狂犬病病毒、牛暂时热病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、布尼奥罗病毒、汉坦病毒、内罗毕绵羊病病毒、白蛉热西西里病毒、甲型流感病毒、丙型流感病毒、索戈托病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、鼠白血病病毒、禽白血病病毒、Mason-Pfizer猴病毒、牛白血病病毒、人免疫缺陷病毒1、人泡沫状病毒属、鸭乙型肝炎病毒、冠状病毒及其组合。不受任何特定理论的束缚，病毒转录识别信号序列的选择可以用于确定治疗哪种类型的病毒感染。例如，如果病毒转录识别信号序列是COVID-19病毒转录识别信号序列，则本文提供的核酸分子将仅在感染COVID-19的细胞中表达。仅将COVID-19用作非限制性实例，并且不应用于限制本文提供的实施方式。
在一些的实施方式中，核酸分子不包括病毒聚合酶、逆转录酶、衣壳、包膜、包装信号或易位基序的序列(编码或非编码)。在一些实施方式中，重组核酸分子不包括病毒聚合酶的序列(编码或非编码)。在一些实施方式中，重组核酸分子不包括逆转录酶的序列(编码或非编码)。在一些实施方式中，重组核酸分子不包括衣壳蛋白的序列(编码或非编码)。在一些实施方式中，重组核酸分子不包括包膜蛋白的序列(编码或非编码)。在一些实施方式中，重组核酸分子不包括包装信号的序列(编码或非编码)。在一些实施方式中，重组核酸分子不包括易位基序的序列(编码或非编码)。
本文提供的重组核酸分子可以在载体中提供。例如，载体可以是递送载体或负载体，用于递送至例如哺乳动物细胞，诸如人细胞。在一些实施方式中，细胞是猿(cyno)(例如猴)细胞。在一些实施方式中，载体是可以将重组核酸分子递送至人和猿细胞的载体。在一些实施方式中，载体是可以将重组核酸分子递送至人细胞但不递送至猿细胞的载体。在一些实施方式中，载体是可以将重组核酸分子递送至猿细胞但不递送至人细胞的载体。
在一些实施方式中，递送载体或负载体是VLP、腺相关病毒(AAV)、脂质体、纳米颗粒、胶束、聚合物囊泡或聚合物泡囊。在一些实施方式中，递送载体或负载体是AAV载体。在一些实施方式中，递送载体或负载体是脂质体。在一些实施方式中，递送载体或负载体是纳米颗粒。在一些实施方式中，递送载体或负载体是胶束。在一些实施方式中，递送载体或负载体是聚合物囊泡。在一些实施方式中，递送载体或负载体是聚合物泡囊。递送载体或负载体的非限制性实例包括在以下中描述的那些：美国专利申请公开号20200206362、美国专利申请公开号20200246267、美国专利申请公开号20170273907和美国专利号10,556,018，其每一件的全部内容通过援引并入本文。
17.本文还提供了可以包括本文提供的重组核酸分子的无复制能力的病毒样颗粒(VLP)。在一些实施方式中，VLP包括与来自目的病毒的衣壳蛋白融合的任选易位基序(TLM)。例如，衣壳蛋白可以是乙型肝炎病毒衣壳或丁型肝炎病毒衣壳或冠状病毒融合蛋白。
在一些实施方式中，由VLP提供的重组核酸分子是编码目的蛋白的负链核酸分子或pgRNA核酸分子。如本文所提供的，目的蛋白是趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白、白喉毒素A(或其片段)或其组合。如本文所提供的，编码目的蛋白的序列的侧翼可以是第一和第二病毒转录识别信号，以及进一步包括在第一病毒转录识别信号上游(5')的第一启动子以及与编码目的蛋白(例如趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白或其组合)的负链核酸分子或pgRNA核酸分子相邻且在该负链核酸分子或pgRNA核酸分子5'处。本文提供了趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白或其组合的非限制性实例。
在一些实施方式中，提供了无复制能力的病毒样颗粒(VLP)，其包括编码目的蛋白(例如趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白或其组合)的重组核酸分子，诸如本文提供的那些(例如负链核酸分子或pgRNA核酸分子)，重组核酸分子的侧翼是第一和第二靶病毒转录识别信号，并且进一步包括在第一病毒转录识别信号上游(5')的第一启动子以及与编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白或其组合的负链核酸分子或pgRNA核酸分子相邻且在该负链核酸分子或pgRNA核酸分子的5'处的第二启动子，其中，VLP表现出对靶病毒感染细胞的趋向性。可以通过以下来控制趋向性：表达在VLP表面上的病毒蛋白的表达以及通过由重组核酸分子编码的病毒转录识别信号序列的来源来控制核酸分子的表达。
如本文所提供，在一些实施方式中，负链核酸分子是负义RNA、负义DNA、表达非编码负义RNA或pgRNA的单链或双链DNA，或其任何组合。
在一些实施方式中，无复制能力的病毒样颗粒进一步包括在编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白或其组合的负链核酸分子或pgRNA核酸分子下游(3')的多聚A尾序列。
在一些实施方式中，无复制能力的病毒样颗粒包括启动子(例如第一启动子和第二启动子)。本文提供了这样的启动子的非限制性实例。
如本文所述的总体设计和重组核酸构建体和无复制能力的病毒样颗粒可适用于涵盖来自巴尔的摩组IV、V、VI和VII的病毒。为了靶向组IV-VII病毒中的一种，利用特定的病毒聚合酶识别信号，该信号将替代例如如对于HBV实例所描述的ε识别信号序列(SEQ IDNO:1)。巴尔的摩组描述如下：
巴尔的摩组IV病毒：具有正义单链RNA基因组，包括小RNA病毒(这是一个病毒科，包括周知的病毒，如甲型肝炎病毒、肠道病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒和口蹄疫病毒)、SARS病毒、丙型肝炎病毒、黄热病毒和风疹病毒。该组还包括冠状病毒、肝炎病毒(戊型肝炎)以及黄病毒(flavivivirus)，诸如登革热病毒、丙型肝炎病毒、黄热病毒和寨卡病毒。
巴尔的摩组V病毒：单链RNA病毒；负义(例如正粘病毒、弹状病毒)。
巴尔的摩组VI病毒：通过DNA中间体复制的正义单链RNA病毒。(例如逆转录病毒)。
巴尔的摩组VII病毒：通过单链RNA中间体复制的双链DNA病毒。
NSV生命周期和复制
负链RNA病毒(NSV，或巴尔的摩组V病毒)可以分为21个不同的科。由非分段基因组组成的科包括弹状-(Rhabdo-)、副黏-(Paramyxo-)、丝状-(Filo-)和博尔纳-(Borna-)。正黏(Orthomyxo-)、布尼奥(Bunya)-、沙粒(Arenaviridae-)分别包含六至八个、三个或两个负义RNA片段的基因组。(参见Palese,P.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11354-11358,1996；以及Boritz,Eli et al.Journal of Virology.73(8):6937-6945,1999)。
NSV中包括许多高度流行的人病原体，诸如呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒、流感病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒。NSV的生命周期具有许多步骤。病毒首先通过经由病毒表面糖蛋白与宿主细胞受体结合来感染宿主细胞。在酸性环境中糖蛋白病毒膜与宿主细胞质膜的融合允许病毒核糖核蛋白(RNP)复合物释放到细胞质中。大多数NSV在受感染细胞的细胞质中复制。新合成的RNP复合物与病毒结构蛋白在质膜处或在高尔基体膜处组装。紧随其后的是新合成的病毒的释放。
关于非分段NSV的复制和转录，这些NSV的基因由三个调控区组成：基因末端信号、基因间区和基因起始信号。基因末端信号的一个实例是称为水疱性口炎病毒(VSV)的特定病毒，它包含高度保守的基因末端信号。基因间区高度可变，并且由保守的二核苷酸、三核苷酸或多至143个核苷酸的区组成。各种长度的基因间区与转录衰减相关，然而不同的基因间区不会改变基因表达。基因起始信号是高度特异性，因为前三个核苷酸对基因表达至关重要。
乙型肝炎病毒(HBV)，是嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)的成员，是具有与逆转录病毒相似的不寻常特征的小DNA病毒。HBV通过RNA中间体复制，并可以整合到宿主基因组中。HBV复制周期的独特特征赋予病毒在受感染细胞中持续存在的独特能力。已经将病毒学和血清学测定开发用于诊断各种形式的HBV相关疾病和治疗慢性乙型肝炎感染。HBV感染导致广泛的肝病，范围从急性(包括暴发性肝功能衰竭)到慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。急性HBV感染可以是无症状的，或可以是以具有症状的急性肝炎存在。感染病毒的大多数成年人会康复，但5％–10％无法清除病毒并成为慢性感染。许多慢性感染者患有的轻度肝病，具有很少或没有长期发病率或死亡率。具有慢性HBV感染的其他个体发展为活动性疾病，其可以发展为肝硬化和肝癌。此外，一些个体感染了除HBV之外的其他肝炎病毒，诸如如甲型肝炎(HAV)、丙型肝炎(HCV)、丁型肝炎(HDV)或戊型肝炎(HEV)。因此，治疗HBV将有助于克服这些合并感染，尤其是HDV，它需要HBV用于其复制。治疗HBV也将减少致癌异常和肝硬化的可能性。
为了更容易理解本发明，以下特定定义了某些技术和科学术语。除非在本文件中的其他地方特别定义，否则本文所使用的所有其他技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。
如本文所用，并且除非另有说明，否则术语“约”旨在意指其所修饰值的±5％。因此，约100意指95至105。此外，术语“约”修饰一系列术语中的术语，诸如“约1、2、3、4或5”，其应理解该术语“约”修改列表的成员中的每一个，使得“约1、2、3、4或5”可以理解为意指“约1、约2、约3、约4、或约5”。对于由术语“至少”或其他量化修饰词(诸如但不限于“小于”、“大于”等)修饰的列表也是如此。
除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求中所用，单数形式(一个/一种(a/an)和“所述/该(the)”)包括复数引用。
如本文所用，术语“包括(comprise)”、“具有/患有(have/has)”和“包括(include)”及其词形变化，如本文所用，意指“包括但不限于”。虽然各种组合物和方法按照“包括”各种组分或步骤(解释为意指“包括但不限于”)来描述，但组合物、方法和装置也可以“基本上由各种组分和步骤组成”或“由各种组分和步骤组成”，并且这样的技术术语应该被解释为定义基本上封闭的成员组。
用于测试本文所述的重组变体的示例性构建体的载体图在图1A、图1B、图2A、图3A、图4A、图5A、图6A、图7和图8中示出。同时测试这些构建体的结果图在图2B、图3B、图4B图4C、图5B、图6B和图6C中示出。可用于这些构建体的示例性序列在SEQ ID NO:1-9中提供。这些是非限制性实例并且可以基于待治疗的目的病毒进行修改或定制。
术语“共同给药”等意指涵括向单个患者给药所选的治疗剂，并且旨在包括其中将药剂通过相同或不同的给药途径或在相同或不同的时间给药的治疗方案。
如本文所用，术语“激动剂”是指化合物，其存在导致蛋白的生物活性与由蛋白的天然产生的配体的存在导致的生物活性相同。
如本文所用，术语“部分激动剂”是指化合物，其存在导致蛋白的生物活性与由蛋白的天然产生的配体的存在导致的生物活性类型相同，但大小较低。
如本文所用，术语“拮抗剂”是指化合物，其存在导致蛋白的生物活性的大小降低。在某些实施方式中，拮抗剂的存在导致蛋白的生物活性的完全抑制。在某些实施方式中，拮抗剂是抑制剂。
当连同治疗组合物(例如重组核酸构建体和无复制能力的病毒样颗粒和包括这些产物的组合物)使用时，“给药”意指将治疗剂直接给药到靶组织内或靶组织上，或者向患者给药治疗剂，由此治疗剂积极影响被靶向的组织。
如本文所用，术语“受试者”或“患者”包括但不限于人和非人脊椎动物，诸如野生、家养和农场动物。在某些实施方式中，本文所述的受试者或患者是动物。在某些实施方式中，受试者或患者是哺乳动物。在某些实施方式中，受试者是人。在某些实施方式中，受试者或患者是非人动物。在某些实施方式中，受试者或患者是非人哺乳动物。在某些实施方式中，受试者或患者是家养动物，诸如狗、猫、牛、猪、马、绵羊或山羊。在某些实施方式中，受试者或患者是伴生动物，诸如狗或猫。在某些实施方式中，受试者或患者是家畜动物，诸如牛、猪、马、绵羊或山羊。在某些实施方式中，受试者或患者是动物园动物。在另一实施方式中，受试者或患者是研究动物，诸如啮齿动物、狗或非人灵长类。在某些实施方式中，受试者或患者是非人转基因动物，诸如转基因小鼠或转基因猪。
术语“抑制”包括给药本文实施方式的治疗剂以预防症状的发作、减轻症状或消除疾病、病症或疾患。
“药学上可接受的”，它意指载体、稀释剂或赋形剂必须与治疗剂的其他成分相容并且对其接受者无害。
如本文所用，术语“treat(治疗)”、“treated(治疗)”或“treating(治疗)”是指治疗性治疗以及防治性或预防性措施两者，其中目的是抑制、预防或减缓(减轻)不期望的生理病症、疾患或疾病，或改进、抑制或以其他方式获得有益或期望的临床结果。为了本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于改进或减轻症状；减弱病症、疾患或疾病的程度；稳定(即不恶化)病症、疾患或疾病的状态；延缓病症、疾患或疾病的发作或减慢进展；改善病症、疾患或疾病状态；以及缓解(无论是部分的还是全部的)，无论是可检测的还是不可检测的，或者增强或改进的病症、疾患或疾病。治疗包括在没有过度水平的副作用下引发临床上显著的应答。治疗还包括与如果未接受治疗的预期生存期相比延长的生存期。
如本文所用，术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体可以以各种各样的形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体。
术语“抗体片段”是指完整抗体的部分并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab’)2和Fv片段、线性抗体、scFv抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，术语“抗原”定义为引发免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的激活，或两者兼而有之。技术人员将理解任何大分子，包括几乎所有的蛋白或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以来源于重组或基因组DNA。技术人员将理解，包括编码引发免疫应答的蛋白的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码如本文所用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。很明显，实施方式包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发期望的免疫应答。而且，技术人员将理解抗原根本不需要由“基因”编码。很明显，抗原可以合成生成或源自生物样品。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、怀疑包含病毒的组织样品、细胞或生物流体。
如本文所用，术语“抗原”定义为引发免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的激活，或两者兼而有之。
如本文所用，术语“离体”是指体“外”。
“疾病”是受试者的健康状态，其中受试者不能维持体内平衡，并且其中如果疾病没有得到改善，则动物的健康继续恶化。相比之下，受试者的“疾患”是一种健康状态，其中受试者能够维持体内平衡，但其中受试者的健康状态比不存在疾患时的健康状态要差。如果不治疗，疾患不一定会引起受试者的健康状况进一步下降。
如本文所用，“有效量”意指提供治疗性或防治性的益处的量。
“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中特异性核苷酸序列的固有特性，其用作在生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板，具有限定的核苷酸(即rRNA、tRNA和mRNA)序列或限定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白，则该基因编码蛋白。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，并且通常在序列表中提供)和非编码链(用作基因或cDNA转录的模板)两者可以称为编码该基因或cDNA的蛋白或其他产物。
如本文所用，“内源性”是指来自生物体、细胞、组织或系统内部或者在生物、细胞、组织或系统内部产生的任何材料。
如本文所用，术语“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何材料。
如本文所用，术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
“表达载体”是指包括重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包括与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包括用于表达的足够的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，诸如引入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
“同源”是指两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当相同的碱基或氨基酸单体亚基占据两个比较序列的两者中的位置时，例如，如果腺嘌呤占据两个DNA分子中的每一个中的位置，则分子在该位置处是同源的。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共有的匹配或同源位置的数量除以比较的位置数量X 100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中有6个匹配或同源，则这两个序列是60％同源的。借助于实例，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。通常，当比对两个序列以获得最大同源性时进行比较。
在一些实施方式中，蛋白与本文提供的序列至少或约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％同源。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
如本文所用，术语“免疫球蛋白”或“Ig”定义为作为抗体作用的一类蛋白。B细胞表达的抗体有时称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。此类蛋白中包括的五个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。
“分离的”意指从自然状态改变或去除。例如，活体动物中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但与其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境诸如例如宿主细胞中。“分离的”生物组分(诸如核酸、蛋白或细胞)已经从其他生物组分(诸如细胞碎片、其他蛋白、核酸或细胞类型)中基本分离或纯化。已经“分离”的生物组分包括通过标准纯化方法纯化的那些组分。
预防、治疗或改善疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的完全发展。“治疗”是指在疾病或病理病症开始发展后改善其体征或症状的治疗性干预。“改善”是指降低疾病体征或症状的数量或严重程度。
如本文所用，重组体通常是指以下：重组核酸或蛋白是具有非天然产生的序列或者具有由两个以其他方式分开的序列片段的人工组合制造的序列的核酸或蛋白。这种人工组合通常通过化学合成或通过人工操作分离的核酸片段，例如通过基因工程技术来完成。
如本文所用，使用以下常见核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，以及“U”是指尿苷。
如本文所用，术语“白血球”或“白细胞”是指任何免疫细胞，包括单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞。如本文所用，术语“淋巴细胞”是指通常存在于淋巴中的细胞，并且包括自然杀伤细胞(NK细胞)、T细胞和B细胞。本领域技术人员将理解，可以将上面列出的免疫细胞类型分成进一步的亚群。
如本文所用，术语“肿瘤浸润白血球”是指存在于实体瘤中的白血球。
如本文所用，术语“血液样品”是指从血液制备的任何样品，诸如血浆、从血液中分离的血细胞等。
如本文所用，术语“纯化样品”是指其中富集一种或多种细胞亚群的任何样品。样品可以通过基于诸如尺寸、蛋白质表达等特征的细胞的去除或分离来纯化。
药学上可接受的负载体：可用于本公开的药学上可接受的载体(负载体)是常规的。Remington’s Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,15th Edition(1975)描述了适用于一种或多种治疗组合物以及额外的药物剂的药物递送的组合物和制剂。
通常，用于递送的合适载体或负载体的性质将取决于所采用的特定给药方式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射流体，该可注射流体包括药学上和生理学上可接受的流体，诸如水、生理盐水、平衡盐溶液、水性右旋糖、甘油等作为负载体。对于固体组合物(例如，粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可以包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性载体之外，待给药的药物组合物可以包含少量无毒辅助物质，诸如润湿或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或单月桂酸山梨醇酐酯。
在一些实施方式中，组合物，无论它们是溶液、悬浮液还是其他类似形式，都可以包括以下一种或多种：DMSO、无菌稀释剂诸如注射用水、盐水溶液，优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、非挥发性油诸如可以用作溶剂或悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节等渗压的剂诸如氯化钠或右旋糖。
本文所述的组合物和方法可以治疗的疾病包括微生物感染，诸如病毒感染。
“病毒感染”意指由体内存在病毒引起的感染。病毒感染包括慢性或持续的病毒感染，这是以下的病毒感染：该病毒感染能够感染宿主并在宿主细胞内繁殖很长一段时间——通常是数周、数月或数年，然后才被证明是致命的。
引起慢性感染的病毒包括例如人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹和其他疱疹病毒、乙型和丙型肝炎病毒以及其他肝炎病毒、人免疫缺陷病毒和麻疹病毒，所有这些都可以产生重要的临床疾病。长期感染可能最终导致疾病的诱发，例如在丙型肝炎病毒肝癌的情况下，这可能对患者是致命的。可以根据本发明治疗的其他慢性病毒感染包括利用病毒特异性聚合酶的任何组V-VII病毒，该聚合酶可以用作转录如本文所述的无活性重组核苷酸载体/VLP的活化酶。
在某些实施方式中，重组核酸构建体和无复制能力的病毒样颗粒，或包括这样的构建体/颗粒的组合物可以与抗微生物剂、抗病毒剂和/或其他治疗剂同时给药。替代地，构建体/颗粒或包括这样的构建体/颗粒的组合物可以在给药抗微生物剂、抗病毒剂和其他治疗剂时在提前的时间的选定时间给药。
抗病毒剂包括但不限于利托那韦(ritonavir)、阿昔洛韦(ritonavir)、西多福韦(cidofovir)、更昔洛韦(ganciclovir)、膦甲酸、齐多夫定(zidovudine)、利巴韦林(ribavirin)和羟氯喹。
抗病毒剂进一步包括但不限于HIV治疗，诸如：
小分子HIV融合或进入抑制剂包括：bevirimat(DSB；PA-457)；维立韦罗(Vicriviroc)、马拉韦罗(Maraviroc)(一种趋化因子受体拮抗剂”或“CCR5抑制剂”)、T-20(恩夫韦肽(enfuvirtide)，Fuzeon，由Roche和Trimeris开发)、TRI-1144和TRI-999(参见Qian,K et al,Med Res Rev.2009 Mar；29(2):369–393,以及Haggani and Tilton,Antiviral Res.2013 May；98(2):158-70)。类似地，抗HIV mAb的实例包括针对CCR5和CD4的那些，并且具体地：伊巴组单抗(Ibalizumab)(商品名Trogarzo)是结合CD4的非免疫抑制性人源化单克隆抗体；PRO 140是靶向针对CCR5的人源化单克隆抗体。
用于组合治疗的抗病毒剂可以包括以下任何一种或组合：HBV聚合酶抑制剂、干扰素、TLR调节剂例如TLR-7激动剂或TLR-9激动剂、治疗性疫苗、某些细胞病毒RNA传感器的免疫激活因子、病毒进入抑制剂、病毒成熟抑制剂、不同的衣壳组装调节剂、不同或未知机制的抗病毒化合物。
抗病毒剂也可以是以下任何一种或组合：3TC、FTC、L-FMAU、干扰素、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定(L-dT)、伐托他滨(3'-缬氨酰L-dC)、β-D-二氧杂环戊基-鸟嘌呤(DXG)、β-D-二氧杂环戊基-2,6-二氨基嘌呤(DAPD)、β-D-二氧杂环戊基-6-氯嘌呤(ACP)、泛昔洛韦、喷昔洛韦、洛布卡韦、更昔洛韦、利巴韦林、替诺福韦(tenofovir)、比卡格韦(bictegravir)、恩曲他滨(emtricitabine)、必妥维及任何组合。
在一些实施方式中，“治疗有效量”是如本文所述的重组核酸构建体和无复制能力的病毒样颗粒或包括这样的构建体/颗粒的组合物的量，该量相对于未给药本发明的重组核酸构建体和无复制能力的病毒样颗粒或包括这样的构建体/颗粒的组合物的动物或动物组(例如，两只、三只、五只、十只或更多只动物)中的病毒滴度或微生物滴度，该量导致在给药重组核酸构建体和无复制能力的病毒样颗粒或包括这样的构建体/颗粒的组合物以及用本文所述的相关方法治疗受试者/患者/动物中的病毒滴度降低至少2.5％、至少5％、至少10％、至少15％、至少25％、至少35％、至少45％、至少50％、至少75％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
病毒载体介导的转移方法的实例
在某些实施方式中，将重组核酸构建体引入病毒样颗粒(其自我复制能力缺陷)以介导基因转移至细胞。通常，在生理条件下使病毒简单地暴露于适当的宿主细胞，从而允许吸收病毒。(参见美国专利号9,089,520)本方法可以适于利用各种各样的病毒载体或病毒样颗粒将重组构建体递送至期望的细胞靶标，如下论述，并且包括腺病毒载体系统，其是被优化为无能力或不可复制的VLP。
1.腺病毒
腺病毒特别适用于作为基因转移载体，因为它的中等尺寸的DNA基因组、易于操作、高滴度、广泛的靶细胞范围和高感染性。大约36kb的病毒基因组以100-200对碱基对(bp)反向末端重复(ITR)为界，其中包含病毒DNA复制和包装所必需的顺式作用元件。包含不同转录单位的基因组的早期(E)和晚期(L)区由病毒DNA复制的开始进行划分。
E1区(E1A和E1B)编码负责调控病毒基因组和一些细胞基因的转录的蛋白。E2区(E2A和E2B)的表达导致用于病毒DNA复制的蛋白的合成。这些蛋白参与DNA复制、晚期基因表达和宿主细胞关闭(Renan,M.J.(1990)Radiother Oncol.,19,197-218)。晚期基因(L1、L2、L3、L4和L5)的产物，包括大多数病毒衣壳蛋白，仅在由主要晚期启动子(MLP)发出的单个初级转录物的显著处理后才表达。MLP(位于16.8图距单位)在感染后期的时期特别有效，并且从该启动子发出的所有mRNA都具有5'三联体前导(TL)序列，这使得它们可用于翻译。
在某些情况下，使AAV的承载能力最大化是有帮助的，以便可以包括大的DNA片段。降低与某些腺病毒产物相关的毒性和免疫反应也是非常理想的。这两个目标在一定程度上是一致的，因为腺病毒基因的消除服务于两个目的。
DNA的大位移是可能的，因为病毒DNA复制所需的顺式元件都位于线性病毒基因组任一端的反向末端重复(ITR)(100-200bp)中。包含ITR的质粒可以在非缺陷腺病毒的存在下复制(Hay,R.T.,et al.,J Mol.Biol.1984 Jun.5；175(4):493-510)。因此，在腺病毒载体中缺失这些元件将阻止独立复制。
另外，用于病毒包封的包装信号位于病毒基因组左端的194-385bp(0.5-1.1图距单位)之间(Hearing et al.,J.(1987)Virol.,67,2555-2558)。该信号模拟噬菌体λDNA中的蛋白识别位点，其中靠近左端但在粘性端序列之外的特定序列介导与将DNA插入头部结构所需的蛋白的结合。Ad的E1置换载体已经证明，病毒基因组左端处的450bp(0-1.25图距单位)片段可以指导293个细胞中的包装(Levrero et al.,Gene,101:195-202,1991)。
先前，已经示出腺病毒基因组的某些区可以引入哺乳动物细胞的基因组中并且表达由此编码的基因。这些细胞系能够支持在由细胞系编码的腺病毒功能中缺陷的腺病毒载体的复制。还报道了通过“辅助”载体例如野生型病毒或条件性缺陷突变体来进行复制缺陷腺病毒载体的互补。
为了在体外产生VLP/复制缺陷腺病毒载体，这些缺陷载体可以通过辅助病毒反式互补。然而，这不允许复制缺陷载体的分离，然而，因为提供复制功能所需的辅助病毒的存在会污染任何制剂。因此，需要增加复制缺陷载体的复制和/或包装特异性的额外的元件。该元件来源于腺病毒的包装功能。
已经示出，腺病毒的包装信号存在于常规腺病毒图(map)的左端(Tibbettset.al.(1977)Cell,12,243-249)。后来的研究示出，即使在互补早期(E1A)功能的细胞系中，基因组的E1A(194-358bp)区中缺失的突变体也生长不良(Hearing and Shenk,(1983)J.Mol.Biol.167,809-822)。当互补的腺病毒DNA(0-353bp)重组到突变体的右端时，病毒被正常包装。进一步的突变分析在Ad5基因组的左端识别出了短的、重复的、位置依赖性的元件。如果存在于基因组的任一端，则发现重复的一个拷贝足以有效包装，但当移向Ad5 DNA分子的内部时则不能(Hearing et al.,J.(1987)Virol.,67,2555-2558)。
通过使用包装信号的突变形式，可以生成以不同效率包装的辅助病毒。通常，突变是点突变或缺失。当具有低效率包装的辅助病毒在辅助细胞中生长时，病毒被包装，尽管与野生型病毒相比以降低的速率，从而允许辅助病毒的繁殖。然而，当这些辅助病毒连同包含野生型包装信号的病毒在细胞中生长时，野生型包装信号优先于突变形式而被识别。鉴于包装因子的有限数量，当与辅助病毒相比时，选择性地包装包含野生型信号的病毒。如果优性足够大，可以实现接近同质性的储备量(stock)。
为了改进ADV构建体对特定组织或物种的趋向性，受体结合纤维序列通常可以在腺病毒分离物之间进行置换。例如，在腺病毒5中发现的柯萨奇(Coxsackie)腺病毒受体(CAR)配体可以置换来自腺病毒35的CD46结合纤维序列，从而使病毒对人造血细胞的结合亲和力极大改进。所得“假型”病毒Ad5f35已经成为几种临床开发的病毒分离物的基础。而且，存在各种生化方法来修饰纤维以使病毒重新靶向靶细胞。方法包括使用双功能抗体(具有结合CAR配体的一端和结合靶序列的一端)，以及纤维的新陈代谢生物素化以允许与定制的基于抗生物素蛋白的嵌合配体结合。替代地，可以将配体(例如抗CD205)通过异双功能接头(例如含PEG)连接到腺病毒颗粒上。
2.逆转录病毒
逆转录病毒是一组单链RNA病毒，其特征在于能够通过逆转录过程在感染细胞中将其RNA转化为双链DNA(Coffin,(1990)In:Virology,ed.,New York:Raven Press,pp.1437-1500)。然后将所得DNA作为前病毒稳定地整合到细胞染色体中并指导病毒蛋白的合成。整合导致病毒基因序列保留在受体细胞及其后代中。逆转录病毒基因组包括三个基因——gag、pol和env——分别编码衣壳蛋白、聚合酶和包膜组分。在gag基因上游发现的称为psi的序列作为将基因组包装到病毒粒子中的信号发挥作用。在病毒基因组的5'和3'端存在两个长末端重复(LTR)序列。这些包含强启动子和增强子序列，并且也是整合到宿主细胞基因组中所需要的(Coffin,1990)。
为了构建逆转录病毒载体，将编码启动子的核酸插入病毒基因组中某些病毒序列的位置以产生复制缺陷病毒。为了产生病毒粒子，构建了包含gag、pol和env基因但不含LTR和psi组分的包装细胞系(Mann et al.,(1983)Cell,33,153-159)。当将包含人cDNA连同逆转录病毒LTR和psi序列的重组质粒引入该细胞系(例如通过磷酸钙沉淀)时，psi序列允许将重组质粒的RNA转录物包装到病毒颗粒中，然后将其分泌到培养基中(Nicolas,J.F.,andRubenstein,J.L.R.,(1988)In:Vectors:a Survey of Molecular Cloning Vectors andTheir Uses,Rodriquez and Denhardt,Eds.)。Nicolas and Rubenstein；Temin et al.,(1986)In:Gene Transfer,Kucherlapati(ed.),New York:Plenum Press,pp.149-188；Mann et al.,1983)。收集包含重组逆转录病毒的培养基，任选浓缩，并用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染广泛的各种各样的细胞类型。然而，许多类型的逆转录病毒的整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(Paskind et al.,(1975)Virology,67,242-248)。最近开发了旨在允许逆转录病毒载体的特异性靶向的途径，该方法基于通过将半乳糖残基化学添加到病毒包膜来对逆转录病毒进行化学修饰。这种修饰可以允许经由去唾液酸糖蛋白受体对细胞诸如肝实质细胞的特异性感染，这可能是期望的。
设计了靶向重组逆转录病毒的不同途径，其中使用了针对逆转录病毒包膜蛋白和针对特异性细胞受体的生物素化抗体。通过使用链霉亲和素经由生物素组分偶联抗体(Roux et al.,(1989)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,86,9079-9083)。使用针对主要组织相容性复合体I类和II类抗原的抗体，在体外用同向性病毒(ecotropic virus)证明了具有那些表面抗原的各种各样人细胞的感染(Roux等，1989)。
3.腺相关病毒
AAV利用约4700对碱基对的线性单链DNA。反向末端重复位于基因组的侧翼。基因组中存在两个基因，产生了许多不同的基因产物。第一个是cap基因，它产生三种不同的病毒粒子蛋白(VP)，称为VP-1、VP-2和VP-3。第二个是rep基因，它编码四种非结构蛋白(NS)。这些rep基因产物中的一种或多种负责反式激活AAV转录。
AAV中的三个启动子由它们在基因组中的位置(以图距单位表示)来指定。这些从左到右是p5、p19和p40。转录产生六个转录物，在三个启动子中的每一处启动两个，每对中的一个被剪接。源自图距单位42-46的剪接位点对于每个转录物都是相同的。四种非结构蛋白显然来源于较长的转录物，并且三种病毒粒子蛋白都来源于最小的转录物。
AAV与人的任何病理状态无关。有趣的是，为了有效复制，AAV需要来自病毒诸如单纯疱疹病毒I和II、巨细胞病毒、伪狂犬病病毒，以及当然还有腺病毒的“辅助”功能。辅助病毒的最佳表征的是腺病毒，并且已经示出该病毒的许多“早期”功能有助于AAV复制。AAVrep蛋白的低水平表达被认为保持AAV结构表达受抑制，并且辅助病毒感染被认为可以去除这种阻滞。
AAV载体的末端重复可以通过AAV或包含修饰的AAV基因组的质粒诸如p201(Samulski et al.,J.Virol.,61:3096-3101(1987))的限制性核酸内切酶消化获得，或通过其他方法，包括但不限于基于公开的AAV序列的末端重复的化学或酶合成。例如，可以通过缺失分析确定允许功能(即稳定和位点特异性整合)所需的AAV ITR的最小序列或部分。还可以确定在保持末端重复引导稳定、位点特异性整合的能力的同时，可以耐受序列的哪些微小修饰。
已经证明基于AAV的载体是用于体外基因递送的安全且有效的负载体，并且这些载体正在临床前和临床阶段进行开发和测试，以广泛应用于潜在的基因疗法，包括离体和体内两者(Carter and Flotte,(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.,770；79-90；Chatteijee,etal.,(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.,770,79-90；Ferrari et al.,(1996)J.Virol.,70,3227-3234；Fisher et al.,(1996)J.Virol.,70,520-532；Flotte et al.,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA,90,10613-10617,(1993)；Goodman et al.(1994),Blood,84,1492-1500；Kaplitt et al.,(1994)Nat’l Genet.,8,148-153；Kaplitt,M.G.,et al.,Ann ThoracSurg.1996December；62(6):1669-76；Kessler et al.,(1996)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,93,14082-14087；Koeberl et al.,(1997)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,94,1426-1431；Mizukami et al.,(1996)Virology,217,124-130)。
肺中AAV介导的有效基因转移和表达已经导致用于治疗囊性纤维化的临床试验(Carter and Flotte,1995；Flotte et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,90,10613-10617,(1993)).同样，通过AAV介导的肌营养不良蛋白基因向骨骼肌的基因递送来治疗肌营养不良，通过将酪氨酸羟化酶基因递送到脑来治疗帕金森病，通过因子IX基因递送到肝来治疗血友病B以及潜在地通过血管内皮生长因子基因递送到心脏来治疗心肌梗死的前景似乎很有希望，因为最近已示出这些器官中AAV介导的转基因表达是高效的(Fisher et al.,(1996)J.Virol.,70,520-532；Flotte et al.,1993；Kaplitt et al.,1994；1996；Koeberlet al.,1997；McCown et al.,(1996)Brain Res.,713,99-107；Ping et al.,(1996)Microcirculation,3,225-228；Xiao et al.,(1996)J.Virol.,70,8098-8108)。
与肝导向基因疗法相关的挑战是肝实质细胞的有效靶向、载体基因组的稳定性和持续的高水平表达。这些障碍中的许多可以通过腺相关病毒(AAV)基因转移载体来克服。用于体内使用而开发的第一个AAV基因转移载体是基于AAV2血清型。AAV2具有广泛的趋向性并在体内相对有效地转导许多细胞类型，包括肝实质细胞。衣壳蛋白赋予血清学特征，并且已经表征了至少12种灵长类的AAV血清型。重要的是，用不同的衣壳蛋白对重组AAV载体进行假型化可以显著改变趋向性。与AAV2相比，AAV8和AAV9两者对肝实质细胞具有更高的亲和力。尤其是，与AAV2相比，AAV8可以转导的肝实质细胞是AAV2的3-4倍，并且每个转导的细胞可以递送的基因组是AAV2的3-4倍(参见Mark S.Sands,Methods Mol.Biol.2011；807:141–157)。根据剂量，AAV8可以在门静脉内注射后转导小鼠肝中高达90-95％的肝实质细胞。有趣的是，静脉内注射后可以实现相当的转导水平。AAV载体的直接实质内注射也介导相对高水平的长期表达。通过使用肝特异性启动子连同AAV8衣壳蛋白，可以赋予额外的特异性。除了治疗原发性肝实质细胞缺陷外，通过绕过肝的固定组织巨噬细胞、库普弗细胞，并且限制肝实质细胞的表达，可以使转基因产物的免疫反应最小化。凭借AAV血清型靶向肝实质细胞的能力和肝特异性启动子的使用允许测试新型治疗途径。
4.慢病毒载体
在某些实施方式中，通过电穿孔或通过核酸、蛋白质、位点特异性核酸酶、自我复制RNA病毒或整合缺陷慢病毒载体的转染，将重组核酸或无复制能力的VLP转导到靶细胞中。(对于这样的载体，参见美国专利号10,131,876)。
在某些实施方式中，用慢病毒、γ-、α-逆转录病毒或腺病毒进行转导，或者通过核酸(DNA、mRNA、miRNA、antagomirs、ODN)、蛋白、位点特异性核酸酶(锌指核酸酶、TALEN、CRISP/R)、自我复制的RNA病毒(例如马脑病病毒)或整合缺陷慢病毒载体进行电穿孔或转染来进行转导。
在另外的实施方式中，重组核酸或无复制能力VLP的递送可以通过用慢病毒载体转导所述细胞来进行(参见Cockrell Adam S et al.,“Gene delivery by lentivirusvectors”,Molecular Biotechnology,vol.36,No.3,Jul.2007.)
具有VSVG假型的慢病毒载体能够在自动化制造方法下进行有效转导。然而，本方法完全适用于使用慢病毒载体(例如麻疹病毒(ML-LV)、长臂猿白血病病毒(GALV)、猫内源性逆转录病毒(RD114)、狒狒内源性逆转录病毒(BaEV)衍生的假型包膜)的任何类型。可以使用其他病毒载体，诸如γ或α逆转录病毒载体。必要时可以使用本发明中描述的自动化制造添加转导增强剂试剂。
5.其他病毒载体
其他病毒载体可以采用作为本方法和组合物中的表达构建体。采用源自病毒诸如痘苗病毒(Ridgeway,(1988)In:Vectors:A survey of molecular cloning vectors andtheir uses,pp.467-492；Baichwal and Sugden,(1986)In,Gene Transfer,pp.117-148；Coupar et al.,Gene,68:1-10,1988)、金丝雀痘病毒和疱疹病毒的的载体。这些病毒提供了用于将基因转移到各种哺乳动物细胞中的几个特征。
用于治疗疾病的方法
本方法还涵括治疗或预防病毒性疾病或病症的方法，其中重组核酸、VLP产物或药物组合物的给药可以以各种有效的量递送。
与接种物有关的术语“单位剂量”是指适合作为用于哺乳动物的单位剂量的物理离散单位，每个单位包含预定量的药物组合物，其经计算可产生与所需稀释剂相关的期望免疫原性作用。接种物的单位剂量规格由以下决定并取决于以下：药物组合物的独特特性和要实现的特定免疫作用。
重组核酸、VLP产物或其药物组合物的有效量将是以下的量，使得超过60％、70％、80％、85％、90％、95％或97％的病毒感染的，例如HBV、Covid-19等感染的细胞被杀死。该术语也是“足够量”的同义词。
任何特定应用的有效量可以取决于诸如所治疗的疾病或病症、所给药的特定组合物、受试者的尺寸和/或疾病或病症的严重程度的因素而变化。无需过度实验即可凭经验确定本文提出的特定组合物的有效量。
当应用于细胞、组织或生物体时，本文所用术语“接触”和“暴露”描述将药物组合物和/或另一种药剂诸如例如抗病毒剂递送至靶细胞、组织或生物体或者与靶细胞、组织或生物体直接并列放置的过程。为了实现细胞杀伤或停滞，将重组核酸、VLP产物或其药物组合物和/或额外的一种或多种药剂以有效杀死一种或多种病毒感染细胞或阻止它们分裂的组合量递送至一个或多个细胞。重组核酸、VLP产物或药物组合物的给药可以在其他一种或多种药剂之前、同时或之后，间隔范围在几分钟至几周。在药物组合物和其他一种或多种药剂分别施用于细胞、组织或生物体的实施方式中，人们通常会确保在每次递送的时间之间没有过期很长一段时间，以使药物组合物和一种或多种药剂仍能够对细胞、组织或生物体发挥有利的组合作用。例如，在这种情况下，考虑到可以使细胞、组织或生物体与药物组合物基本上同时(即，在少于约一分钟内)以两种、三种、四种或更多种形式接触。在其他方面，可以在给药重组核酸、VLP或药物产品，约1分钟、至约24小时至约7天至约1至约8周或更长时间以及其中可推导的任何范围之前和/或之后基本上同时给药一种或多种药剂。还另外，可以采用本文提出的药物组合物和一种或多种药剂的各种组合方案。
用于向患者给药的制剂和途径
在考虑临床应用的情况下，有必要以适合预期应用的形式制备药物组合物——表达构建体、表达载体、融合蛋白、转染或转导的细胞。通常，这将需要制备基本上不含热原以及可能对人或动物有害的其他杂质的组合物。
可以例如以每剂约1-5百万颗粒的剂量递送重组核酸、VLP产物或其药物组合物。可以提供包含产品的小瓶或其他容器，例如每小瓶的体积为约0.25ml至约10ml，例如约0.25、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10ml，例如约2ml。
当将重组核酸或VLP产物引入患者时，人们通常可能期望采用合适的盐和缓冲液。短语“药学上或药理学上可接受的”是指当向动物或人给药时不产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这种介质和药剂用于药物活性物质的用途是已知的。除非任何常规介质或试剂与载体或细胞不相容，否则考虑其在治疗组合物中的用途。补充活性成分也可以引入组合物中。
配制后，溶液将以与剂量制剂相容的方式和以治疗有效的这样的量给药。制剂易于以各种各样的剂型诸如可注射溶液、药物释放胶囊等给药。例如，对于在水溶液中的肠胃外给药，如果需要，可以将溶液适当地缓冲并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹腔内给药。在这方面，可以采用无菌水性介质。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等渗NaCl溶液中，并且添加到1000ml的皮下输液流体中或在建议的输注部位注射(参见例如“Remington’s PharmaceuticalSciences”15th Edition,pages 1035-1038 and 1570-1580)。取决于被治疗受试者的病症，必然会出现剂量的一些变化。在任何情况下，负责给药的人员将确定用于个体受试者的适当剂量。而且，对于人给药，制剂可以符合FDA生物制品标准办公室(FDA Office ofBiologics standards)所要求的无菌度、热原性以及一般安全性和纯度标准。
可以将组合物配制用于向受试者雾化递送。对于气溶胶递送，所述组合物可以配制在水溶液诸如如水或者在生理相容的缓冲液诸如如汉克氏溶液(Hanks’s solution)、林格氏溶液(Ringer’s solution)或生理盐水缓冲液中。该溶液可以包含一种或多种配方剂，诸如悬浮剂、稳定剂或分散剂。
将本公开的多核苷酸递送至受试者的期望细胞的本公开的递送系统不限于本公开的VLP。在一些实施方式中，递送载体包括腺相关病毒(AAV)载体、脂质体、纳米颗粒、胶束、聚合物囊泡或聚合物泡囊。
在一些实施方式中，递送载体包括衍生自AAV的载体。AAV载体是基因疗法中最常用的载体之一。AAV是小型、无包膜的II类病毒，其基因组编码在一个长的单链DNA分子中。AAV衍生载体具有以下的能力：附着并进入靶细胞，将遗传物质转移到细胞核，并且在通常没有毒性下可以表达该信息持续一段时间。AAV衍生载体通常不编码将位点特异性整合到宿主基因组中所必需的AAV组分，并且通常作为染色体外元件持续存在。AAV载体在一定程度上也能够选择性靶向组织和器官。因此，AAV载体是用于将本公开的单链DNA多核苷酸递送至受试者的期望细胞的可能的递送机制。
在一些实施方式中，可以将本公开的重组多核苷酸包装到非病毒递送系统中以递送至受试者的期望靶细胞。在一些实施方式中，将本公开的多核苷酸包装到纳米颗粒、胶束、聚合物囊泡或聚合物泡囊中，以递送至受试者的期望靶细胞。在一些实施方式中，可以将这些产品配制成气溶胶以通过吸入装置或通过纳米颗粒递送。额外的递送途径包括：局部、经皮、静脉内、皮下和鞘内递送。在一些实施方式中，纳米颗粒包封编码治疗剂的ssRNA，然后可以将其全身或局部给药，诸如如通过气溶胶递送。气溶胶递送可以用于将治疗剂递送至感染了本文提供的病毒诸如冠状病毒的患者的肺中。
此外，在某些患者中，预计这种治疗将定期重复以降低或消除任何剩余的病毒/病毒粒子。这种周期性治疗可以变化，每周一次、每2周一次、每3周一次、每月一次、至每两个月一次、至每3个月一次、至每4个月一次、至每5个月一次、至每6个月一次、或每7个月一次、或每8个月一次、或每9个月一次、或每10个月一次、或每11个月一次、或每年一次作为维持治疗，只要患者需要达到稳定或无法检测到的疾病即可。
组合和交替疗法
已经认识到，包括HIV、HBV和HCV的许多病毒感染的耐药变体可以在用抗病毒剂长期治疗后出现。耐药性最通常发生在编码诸如以下的蛋白的基因的突变，该蛋白诸如病毒复制中使用的酶，以及最通常在HIV的情况下，逆转录酶、蛋白酶或DNA聚合酶，以及在HBV的情况下，DNA聚合酶，或者在HCV的情况下，RNA聚合酶、蛋白酶或解旋酶。最近，已经证明，通过将化合物与诱导由主药物引起的不同的突变的第二种以及可能的第三种抗病毒化合物组合或交替给药，可以延长、增强或恢复药物抗HIV感染的功效。可以用于组合的化合物选自由以下组成的组：HBV聚合酶抑制剂、干扰素、TLR调节剂诸如TLR-7激动剂或TLR-9激动剂、治疗性疫苗、某些细胞病毒RNA传感器的免疫激活因子、病毒进入抑制剂、病毒成熟抑制剂、不同的衣壳组装调节剂、不同或未知机制的抗病毒化合物及其组合。替代地，药物的药代动力学、生物分布或其他参数可以通过这种组合或交替疗法来改变。通常，组合疗法通常优于交替疗法，因为它会同时对病毒诱导多种胁迫。
在某些实施方式中，该方法包括通过以下来控制细胞死亡的方案：在递送构建体期间使患者保持抗病毒治疗，诸如替诺福韦等；然后使患者停止抗病毒治疗循环持续范围在2周至1个月的时间段或时间，从而允许病毒复制并限制病毒细胞死亡，使得不会出现巨大的病毒性肝细胞死亡，或类似的细胞死亡。
在这样的循环之后，患者返回到抗病毒治疗，允许组织修复；并且只要对患者有益，则每8周、每12周、每16周、每20周等重复该循环。
用于治疗HBV的组合或交替疗法的额外的化合物包括3TC、FTC、L-FMAU、干扰素、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定(L-dT)、伐托他滨(3'-缬氨酰L-dC)、β-D-二氧杂环戊基-鸟嘌呤(DXG)、β-D-二氧杂环戊基-2,6-二氨基嘌呤(DAPD)、β-D-二氧杂环戊基-6-氯嘌呤(ACP)、泛昔洛韦、喷昔洛韦、洛布卡韦、更昔洛韦和利巴韦林。
试剂盒
此外，这些重组核酸、VLP产物或其药物组合物的某些组分或实施方式可以在试剂盒中提供。例如，重组核酸或VLP产物的任何一种可以由以下提供：冷冻并包装为试剂盒，单独地或连同来自预处理或后处理步骤的任何其他剂的单独容器，以及用于使用的任选地说明书。
一些实施方式还涉及试剂盒中的任何上述组合物。在一些实施方式中，试剂盒可以包括安瓿、一次性注射器、胶囊、小瓶、管等。在一些实施方式中，该试剂盒可以包括单剂量容器或多剂量容器，其包括本文实施方式的局部制剂。在一些实施方式中，每个剂量容器可以包含一个或多个单位剂量。在一些实施方式中，试剂盒可以包括敷贴器。在一些实施方式中，试剂盒包括调理/治疗阶段所需的所有组分。在一些实施方式中，细胞组合物可以具有防腐剂或不含防腐剂(例如，在一次性容器中)。在一些实施方式中，重组核酸或VLP产物可以在期望阶段制备并冷冻，适用于运送到医院或治疗中心。
此外，在某些患者中，预计将定期重复方法或治疗方案的任何一种以增强免疫系统对病毒剂的应答。这种周期性治疗可以变化，每周、每月一次、至每两个月一次、至每3个月一次、至每4个月一次、至每5个月一次、至每6个月一次、或每7个月一次、或每8个月一次、或每9个月一次、或每10个月一次、或每11个月一次、或每年一次作为维持治疗，只要患者需要即可。
尽管本发明已经针对各种优选实施方式进行了描述，但本发明并不旨在限于此，而是本领域的技术人员将认识到，可以在其中进行变化和修改，其在本发明的精神内以及所附权利要求的范围内。
在某些实施方式中，本文所述的测试构建体利用AAV8作为递送载体，因为它靶向肝细胞；非特异性靶向将在所示的各种对照中进行测试。将TBG(甲状腺素结合球蛋白)用作肝特异性启动子，它由仅在肝细胞中产生的特异性转录因子打开。这将驱动重组转录物的表达，该重组转录物处于反向互补结构，并且因此被认为是无功能的并且在不存在病毒转录识别信号(在这种情况下是ε序列(SEQ ID NO:1))下进一步经历降解。
这些实验旨在示出测试构建体将仅在存在HBV DNA聚合酶的HBV感染的肝细胞中表达，并与嵌入的HBVε转录识别序列相互作用并转录HBV“病毒自杀”转录物。在这个过程之后，有义HBV转录物(它是被ε序列识别的有义转录物，编码Casp9)现在可以被宿主细胞机制转录并翻译以编码Casp 9，其在强组成型活性EFS启动子下，即启动病毒感染的宿主细胞的程序性细胞死亡——细胞凋亡，使任何其他未感染的细胞免于细胞凋亡。
这些结果在来自图1-12的示意图、图、图表和表格中说明，并且在下面的实施例1-6中更充分地解释。
实施例1
HepAD38是在可以用四环素调节的条件下复制人乙型肝炎病毒(HBV)的细胞系。在抗生素的存在下，由于前基因组(pg)RNA合成的抑制，该细胞系不含病毒。在从培养基中去除四环素后，细胞表达病毒pg RNA，在细胞质中积累包含病毒复制特征性的DNA中间体的亚病毒颗粒，并将病毒样颗粒分泌到上清液中。由于HepAD38细胞系可以产生高水平的HBVDNA，因此它应该有助于分析依赖于病毒DNA以同步方式合成的病毒复制周期。另外，已经将该细胞系格式化为高通量、基于细胞的测定，其允许大规模筛选各种化合物库用于新类别的HBV复制抑制剂。参见Ladner S.K.et al.Antimicrob Agents Chemother.1997Aug；41(8):1715-20。因此，该HepAD38细胞系是研究人乙型肝炎病毒(HBV)的合适的体外模型系统。
Hep G2是永生细胞系，其来源于患有高分化肝细胞癌的欧洲血统的15岁美国青春期男孩的肝组织。这些细胞在形态上是上皮细胞，具有的染色体众数为55，并且在裸小鼠中不致瘤。细胞分泌各种各样的主要血浆蛋白，例如白蛋白和急性期蛋白纤维蛋白原、α2-巨球蛋白、α1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白和纤溶酶原。它们已经在大规模培养系统中成功生长。在这些细胞上未检测到乙型肝炎病毒表面抗原。Hep G2会对人生长激素的刺激产生反应。因此，Hep G2细胞是用于研究极化人肝实质细胞的合适体外模型系统。
为了测试本文所述的“病毒特异性细胞毒性”构建体，利用HepG2细胞作为正常、健康肝细胞的对照。由于HepG2细胞是未感染HBV的肝细胞，因此它们应该不受实验1中使用的测试无复制能力：AAV8-HBV-DRS1(EF1a>HBV-rcCasp9)的影响，结果在图2A和图2C中示出。
相比之下，将HepAD38细胞系用作HBV+模型，用于测试本文所述的“病毒特异性细胞毒性”构建体之一：无复制能力的构建体：AAV8-HBV-DRS1(EF1a>HBV-rcCasp9)(载体在图FIGURE2A)中示出。实验1的组1-3显示的结果示出，在HepAD38细胞中组2测试构建体AAV8-HBV-DRS1(EF1a>HBV-rcCasp9)表现出病毒特异性细胞死亡，如图2B的图形数据中以及图2C中描述的相应细胞数和生存力所示出。
实施例2
此外，在图3A和图3B以及图4A、图4B和图4C中示出的实验2中，进一步在HepG2细胞和HepAD38细胞中测试了AAV8-HBV-DRS1(EF1a>HBV-rcCasp9)构建体，并且在某些测试组中，使用胱天蛋白酶-9抑制剂Z-LEHD-FMK来说明杀死是Casp9表达的结果(参见组3和组5)。这些实验的结果说明了组2 HepAD38细胞中的病毒特异性细胞死亡，其表现出几乎80％的细胞死亡率。图5A是载体图，以及图5B是组合图，示出了在HepG2细胞和HepAD38细胞中的测试构建体和各种对照的作用，以突出感染AAV8-HBV-DRS1(EF1a>HBV-rcCasp9)构建体的HepAD38细胞中的剧烈细胞死亡。
实施例3
最后，在实验3中，测试了AAV8-HBV-DRS2(TBG>HBV-rcCasp9)构建体。该构建体包含肝特异性启动子、甲状腺素结合球蛋白(TBG)。这些实验的结果说明了组2 HepAD38细胞中的病毒特异性细胞死亡，其表现出几乎80％的细胞死亡率(图6A和图6B)。在该分组中，组1细胞未转导，组2细胞为转导AAV8-HBV-DRS2(TBG>HBV-rcCasp9)的测试细胞；组3细胞相同并添加Casp9抑制剂z-LEHD.fmk；组4细胞仅与Casp9抑制剂z-LEHD.fmk接触作为对照；组5细胞用包含GFP的构建体转导以进一步跟踪构建体表达；组6细胞用相同的GFP构建体转导，并且还与Casp9抑制剂z-LEHD.fmk一起温育。
实验2-3中的测试载体+Casp9抑制剂对照组说明细胞死亡是由胱天蛋白酶-9引发的，并不是由载体/DNA毒性引发的。
实验2-3中的GFP-AAV对照组说明细胞死亡不是由于AAV毒性。
实施例4
在实验4中，HBV感染或产生HBV的细胞用本文提供的HBV RNA治疗，并且基于细胞生存力计算平均细胞死亡百分比。到第4天，各种各样产生HBV的细胞的平均细胞死亡为92％(范围为88.6％至95.8％)。在未感染的细胞中未观察到明显的细胞死亡。RT和泛胱天蛋白酶抑制剂分别阻止了AAV治疗的感染细胞中的细胞死亡。这些结果示出HBV RNA构建体选择性地杀死HBV感染或产生细胞。
实施例5
体内小鼠肝炎模型实验
在体内小鼠模型中进一步测试了这些构建体，并且结果说明了测试构建体AAV8-HBV-DRS1(EF1a>HBV-rcCasp9)和AAV8-HBV-DRS2(TBG>HBV-rcCasp9)的病毒特异性细胞死亡(图9)。
在上面的部分中，已经显示了来自新型体外概念验证的结果，该概念选择乙型肝炎病毒(HBV)聚合酶(pol)来诱导受感染肝实质细胞的细胞凋亡。HBV转基因小鼠模型也用于在体内评价这些构建体和途径的机制的功效和特异性。
方法
AAV颗粒与专有载体构建体一起包装，该载体构建体表达侧翼在对HBV pol(HBVpol/RT)的逆转录酶(RT)结构域特异的序列之间的非功能性非编码(nc)RNA。ncRNA将被HBVpol/RT识别并被逆转录成双链(ds)DNA，该双链DNA被编码为过表达胱天蛋白酶-9(casp-9)(图1A和图1B)。向每组5只HBV转基因小鼠注射在EF1a或肝特异性甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子下的AAV颗粒、GFP载体或安慰剂。每周监测外周血的肝酶和HBeAg。在第14天或第28天收获心脏、肺、肾和肝，并通过IHC和蛋白质印迹评价AAV VP的组织分布。还通过IHC评价了Casp-9、胱天蛋白酶切割产物和HBV核心蛋白与casp-9的双重染色。另外，将表达或不表达HBV pol的HepG2-Red-Fluc细胞与基质胶一起植入裸小鼠的肝中，以促进局部肿瘤生长。然后用表达测试载体的AAV治疗小鼠。在不同的时间点，向小鼠注射D-荧光素底物以使用IVIS Lumina S5成像系统量化肿瘤尺寸的变化。
结果
在治疗后第14天从转基因小鼠收获的器官在表达HBV的肝和肾细胞中示出显著的casp-9表达，但在不表达HBV的那些细胞中则没有。与未治疗和GFP对照相比，用携带TBG启动子的载体治疗的小鼠的肾组织没有增加casp-9表达。而且，其他器官中对治疗AAV颗粒染色呈阳性的细胞没有表现出casp-9过表达。在治疗后第28天收获的肝在治疗组中示出弥漫性细胞凋亡中性粒细胞浸润区域，但在对照组中则没有(图11A)。在治疗组的第4周，与GFP-AAV和安慰剂对照相比，ALT水平增加到1.8-2.2倍；并且AST水平增加到1.4倍。(图11B)。外周HBeAg没有显著变化。将评价裸小鼠异种移植治愈研究的结果。
结论
一种新型劫持HBV pol的AAV载体在体外和体内特异性诱导HBV表达细胞中Casp-9的过表达和细胞凋亡。图11C中示出了该过程的概述的示意图。预计外周HBeAg没有降低是因为在转基因小鼠中再生的肝组织组成性地表达抗原。这些数据表明治疗或治愈HBV感染的潜在新途径。
序列
SEQ ID NO:1:HBV RNA聚合酶ε信号
UGUUCAUGUCCUACUGUUCAAGCCUCCAAGCUGUGCCUUGGGUGGCUUUGGGGCAUGGACA
SEQ ID NO:2:EFS启动子
GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGATCCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGG
SEQ ID NO:3:胱天蛋白酶9(Casp9)人ORF
ATGGACGAAGCGGATCGGCGGCTCCTGCGGCGGTGCCGGCTGCGGCTGGTGGAAGAGCTGCAGGTGGACCAGCTCTGGGACGCCCTGCTGAGCCGCGAGCTGTTCAGGCCCCATATGATCGAGGACATCCAGCGGGCAGGCTCTGGATCTCGGCGGGATCAGGCCAGGCAGCTGATCATAGATCTGGAGACTCGAGGGAGTCAGGCTCTTCCTTTGTTCATCTCCTGCTTAGAGGACACAGGCCAGGACATGCTGGCTTCGTTTCTGCGAACTAACAGGCAAGCAGCAAAGTTGTCGAAGCCAACCCTAGAAAACCTTACCCCAGTGGTGCTCAGACCAGAGATTCGCAAACCAGAGGTTCTCAGACCGGAAACACCCAGACCAGTGGACATTGGTTCTGGAGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCATAA
SEQ ID NO:4:Casp9的反向互补序列
TTATGATGTTTTAAAGAAAAGTTTTTTCCGGAGGAAATTAAAGCAACCAGGCATCTGTTTATAAATCCCTTTCACCGAAACAGCATTAGCGACCCTAAGCAGGAGGGACTGCAGGTCTTCAGAGTGAGCCCACTGCTCAAAGATGTCGTCCAGGGTCTCAACGTACCAGGAGCCACTCTTGGGGTCCCTCCAGGAAACAAAACCTGGGAAAGTAGAGTAGGACACAAAGATGTCACTGGGTGTGGGCAAACTAGATATGGCGTCCAGCTGGTCGAAGGTCCTCAAACCTTCCTGGAACGGGGTGGCATCTGGCTCGGGGTTACTGCCAGGGGACTCGTCTTCAGGGGAAGTGGAGGCCACCTCAAACCCATGGTCTTTCTGCTCCCCACCACAGGCCTGGATGAAAAAGAGCTTGGGCTTCCCTCCCAGGCTGGGGCAGCTGGTCCCATTGAAGATGTTCACAATCTTCTCGACCGACACAGGGCATCCATCTGTGCCGTAGACAGCCCCTGGGAACTGCAGGTGGCTGGCCTGACAGCCGTGAGAGAGAATGACCACCACGCAGCAGTCCAGAGCACCGTGGTCCTGCTGCGCCAGCTCCAGCAAAGCCAGCACCATTTTCTTGGCAGTCAGGTCGCCCTTCACCTCCACCATGAAATGCAGCGAGGAGAAGCGACGCCGCAACTTCTCACAGTCGATGTTGGAGCCAGTGCGGGTGCGGAGCCCGGACTCACGGCAGAAGTTCACATTGTTGATAATGAGGCAGTGGCCACAGGGCTCCATGCTCAGGATGTAAGCCAAATCTGCATTTCCCCTCAAACTCTCAAGAGCACCGACATCACCAAATCCTCCAGAACCAATGTCCACTGGTCTGGGTGTTTCCGGTCTGAGAACCTCTGGTTTGCGAATCTCTGGTCTGAGCACCACTGGGGTAAGGTTTTCTAGGGTTGGCTTCGACAACTTTGCTGCTTGCCTGTTAGTTCGCAGAAACGAAGCCAGCATGTCCTGGCCTGTGTCCTCTAAGCAGGAGATGAACAAAGGAAGAGCCTGACTCCCTCGAGTCTCCAGATCTATGATCAGCTGCCTGGCCTGATCCCGCCGAGATCCAGAGCCTGCCCGCTGGATGTCCTCGATCATATGGGGCCTGAACAGCTCGCGGCTCAGCAGGGCGTCCCAGAGCTGGTCCACCTGCAGCTCTTCCACCAGCCGCAGCCGGCACCGCCGCAGGAGCCGCCGATCCGCTTCGTCCAT
SEQ ID NO:5:EFS启动子的反向互补序列
CCTGTGTTCTGGCGGCAAACCCGTTGCGAAAAAGAACGTTCACGGCGACTACTGCACTTATATACGGTTCTCCCCCACCCTCGGGAAAAAGGCGGAGCCAGTACACGACATCACTTTCCCAGTTTACCCCGCGCCACCTTCTCTAGGCACCGGATCAATTGCCGACCCCTCCCCCCAACTTCTCGGGGACTGTGGGCGATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCACCGGAGCC
SEQ ID NO:6:SV40多聚A
ACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTCT
SEQ ID NO:7:SV40多聚A的反向互补序列
AGAGCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGT
SEQ ID NO:8:构建体(转录物):(1746bp)
ATGTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACAAGAGCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTTATGATGTTTTAAAGAAAAGTTTTTTCCGGAGGAAATTAAAGCAACCAGGCATCTGTTTATAAATCCCTTTCACCGAAACAGCATTAGCGACCCTAAGCAGGAGGGACTGCAGGTCTTCAGAGTGAGCCCACTGCTCAAAGATGTCGTCCAGGGTCTCAACGTACCAGGAGCCACTCTTGGGGTCCCTCCAGGAAACAAAACCTGGGAAAGTAGAGTAGGACACAAAGATGTCACTGGGTGTGGGCAAACTAGATATGGCGTCCAGCTGGTCGAAGGTCCTCAAACCTTCCTGGAACGGGGTGGCATCTGGCTCGGGGTTACTGCCAGGGGACTCGTCTTCAGGGGAAGTGGAGGCCACCTCAAACCCATGGTCTTTCTGCTCCCCACCACAGGCCTGGATGAAAAAGAGCTTGGGCTTCCCTCCCAGGCTGGGGCAGCTGGTCCCATTGAAGATGTTCACAATCTTCTCGACCGACACAGGGCATCCATCTGTGCCGTAGACAGCCCCTGGGAACTGCAGGTGGCTGGCCTGACAGCCGTGAGAGAGAATGACCACCACGCAGCAGTCCAGAGCACCGTGGTCCTGCTGCGCCAGCTCCAGCAAAGCCAGCACCATTTTCTTGGCAGTCAGGTCGCCCTTCACCTCCACCATGAAATGCAGCGAGGAGAAGCGACGCCGCAACTTCTCACAGTCGATGTTGGAGCCAGTGCGGGTGCGGAGCCCGGACTCACGGCAGAAGTTCACATTGTTGATAATGAGGCAGTGGCCACAGGGCTCCATGCTCAGGATGTAAGCCAAATCTGCATTTCCCCTCAAACTCTCAAGAGCACCGACATCACCAAATCCTCCAGAACCAATGTCCACTGGTCTGGGTGTTTCCGGTCTGAGAACCTCTGGTTTGCGAATCTCTGGTCTGAGCACCACTGGGGTAAGGTTTTCTAGGGTTGGCTTCGACAACTTTGCTGCTTGCCTGTTAGTTCGCAGAAACGAAGCCAGCATGTCCTGGCCTGTGTCCTCTAAGCAGGAGATGAACAAAGGAAGAGCCTGACTCCCTCGAGTCTCCAGATCTATGATCAGCTGCCTGGCCTGATCCCGCCGAGATCCAGAGCCTGCCCGCTGGATGTCCTCGATCATATGGGGCCTGAACAGCTCGCGGCTCAGCAGGGCGTCCCAGAGCTGGTCCACCTGCAGCTCTTCCACCAGCCGCAGCCGGCACCGCCGCAGGAGCCGCCGATCCGCTTCGTCCATCCTGTGTTCTGGCGGCAAACCCGTTGCGAAAAAGAACGTTCACGGCGACTACTGCACTTATATACGGTTCTCCCCCACCCTCGGGAAAAAGGCGGAGCCAGTACACGACATCACTTTCCCAGTTTACCCCGCGCCACCTTCTCTAGGCACCGGATCAATTGCCGACCCCTCCCCCCAACTTCTCGGGGACTGTGGGCGATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCACCGGAGCCTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATAA
SEQ ID NO:9:
“EFS启动子驱动zsGreen基因”的反向互补序列侧翼在BV ε信号之间：
ATGTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACAAGAGCCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTTAGGGCAAGGCGGAGCCGGAGGCGATGGCGTGCTCGGTCAGGTGCCACTTCTGGTTCTTGGCGTCGCTGCGGTCCTCGCGGGTCAGCTTGTGCTGGATGAAGTGCCAGTCGGGCATCTTGCGGGGCACGGACTTGGCCTTGTACACGGTGTCGAACTGGCAGCGCAAGCGGCCACCGTCCTTCAGCAGCAGGTACATGCTCACGTCGCCCTTCAAGATGCCCTGCTTGGGCACGGGGATGATCTTCTCGCAGGAGGGCTCCCAGTTGTCGGTCATCTTCTTCATCACGGGGCCGTCGGCGGGGAAGTTCACGCCGTAGAACTTGGACTCGTGGTACATGCAGTTCTCCTCCACGCTCACGGTGATGTCGGCGTTGCAGATGCACACGGCGCCGTCCTCGAACAGGAAGGAGCGGTCCCAGGTGTAGCCGGCGGGGCAGGAGTTCTTGAAGTAGTCGACGATGTCCTGGGGGTACTCGGTGAACACGCGGTTGCCGTACATGAAGGCGGCGGACAAGATGTCCTCGGCGAAGGGCAAGGGGCCGCCCTCCACCACGCACAGGTTGATGGCCTGCTTGCCCTTGAAGGGGTAGCCGATGCCCTCGCCGGTGATCACGAACTTGTGGCCGTCCACGCAGCCCTCCATGCGGTACTTCATGGTCATCTCCTTGGTCAGGCCGTGCTTGGACTGGGCCATCCTGTGTTCTGGCGGCAAACCCGTTGCGAAAAAGAACGTTCACGGCGACTACTGCACTTATATACGGTTCTCCCCCACCCTCGGGAAAAAGGCGGAGCCAGTACACGACATCACTTTCCCAGTTTACCCCGCGCCACCTTCTCTAGGCACCGGATCAATTGCCGACCCCTCCCCCCAACTTCTCGGGGACTGTGGGCGATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCACCGGAGCCTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATAA
实施例6
流感特异性Casp9构建体和实验
以下序列和构建体将用于设计治疗流感病毒的测试构建体。由于流感病毒是单链负义RNA病毒，它利用流感聚合酶复合物来表达病毒蛋白或复制其病毒基因组，因此已经设计了表达负义非编码(nc)RNA的载体构建体以与流感聚合酶结合(以与实施例1-4中描述的特异性于HBV设计的相似的方式)。ncRNA“劫持”病毒机制以在感染细胞中特异性诱导细胞凋亡，这是潜在的抗病毒治疗(图10A和图10B)。
方法
腺相关病毒(AAV)与表达ncRNA的新型载体(可以被认为是流感“劫持RNA”，或流感感染细胞的RNA自杀载体)一起包装，该载体在流感基因组RNA非编码序列(NCS)区之间转录zsGreen标志物(AAV.infv.rcZsGreen)或胱天蛋白酶-9(casp9)基因(AAV.infv.rcCasp9)的反向互补链，这些区在多种流感病毒毒株中高度保守。这些序列的实施方式在下文示出为SEQ ID NO 10-24。Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞以0.1MOI感染甲型H1N1或H3N2或者乙型流感病毒，作为测试这些流感(nc)RNA构建体的体外系统。在存在和不存在casp9抑制剂Z-LEHD-FMK下，用AAV.infv.rcZsGreen载体和AAV.infv.rcCasp9转导流感感染和未感染的MDCK细胞以确定流感感染细胞的劫持载体或RNA自杀载体的功能性。将流式细胞术用于确定zsGreen表达。每天通过FACS、膜联蛋白测定和自动细胞计数评价细胞生存力和增殖。
结果
所有AAV.infv.rcZsGreen载体转导的流感感染细胞都成功地产生了zsGreen蛋白，证实劫持/自杀RNA构建体在每个流感毒株中被聚合酶复合物识别和转录。流感感染在第6天杀死了60％-68％的未治疗细胞。在流感感染后24小时，用casp9劫持/自杀载体治疗的感染细胞中有91％-95％在治疗后第3天死亡。在培养回收载体中的Casp-9抑制诱导细胞死亡并将受感染细胞的寿命延长至5-6天(图10B)。在未感染的对照组中没有显著的细胞死亡。
结论
以反式递送以与流感聚合酶结合的载体劫持病毒机制，以比未治疗的感染细胞快40％地诱导流感感染细胞的死亡。这种作用在病毒毒株中可见，可能是由于流感聚合酶的保守性质。这种新型途径可以用于开发有效的流感治疗。
序列
SEQ ID NO:10:
载体的3’非编码区
5’CCTGCTTTTGCT 3’
SEQ ID NO:11:
载体的5’非编码区
5’AGTAGAAACAAGG 3’
SEQ ID NO:12:
流感特异性Casp9载体
AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTATCATTATGATGTTTTAAAGAAAAGTTTTTTCCGGAGGAAATTAAAGCAACCAGGCATCTGTTTATAAATCCCTTTCACCGAAACAGCATTAGCGACCCTAAGCAGGAGGGACTGCAGGTCTTCAGAGTGAGCCCACTGCTCAAAGATGTCGTCCAGGGTCTCAACGTACCAGGAGCCACTCTTGGGGTCCCTCCAGGAAACAAAACCTGGGAAAGTAGAGTAGGACACAAAGATGTCACTGGGTGTGGGCAAACTAGATATGGCGTCCAGCTGGTCGAAGGTCCTCAAACCTTCCTGGAACGGGGTGGCATCTGGCTCGGGGTTACTGCCAGGGGACTCGTCTTCAGGGGAAGTGGAGGCCACCTCAAACCCATGGTCTTTCTGCTCCCCACCACAGGCCTGGATGAAAAAGAGCTTGGGCTTCCCTCCCAGGCTGGGGCAGCTGGTCCCATTGAAGATGTTCACAATCTTCTCGACCGACACAGGGCATCCATCTGTGCCGTAGACAGCCCCTGGGAACTGCAGGTGGCTGGCCTGACAGCCGTGAGAGAGAATGACCACCACGCAGCAGTCCAGAGCACCGTGGTCCTGCTGCGCCAGCTCCAGCAAAGCCAGCACCATTTTCTTGGCAGTCAGGTCGCCCTTCACCTCCACCATGAAATGCAGCGAGGAGAAGCGACGCCGCAACTTCTCACAGTCGATGTTGGAGCCAGTGCGGGTGCGGAGCCCGGACTCACGGCAGAAGTTCACATTGTTGATAATGAGGCAGTGGCCACAGGGCTCCATGCTCAGGATGTAAGCCAAATCTGCATTTCCCCTCAAACTCTCAAGAGCACCGACATCACCAAATCCTCCAGAACCAATGTCCACTGGTCTGGGTGTTTCCGGTCTGAGAACCTCTGGTTTGCGAATCTCTGGTCTGAGCACCACTGGGGTAAGGTTTTCTAGGGTTGGCTTCGACAACTTTGCTGCTTGCCTGTTAGTTCGCAGAAACGAAGCCAGCATGTCCTGGCCTGTGTCCTCTAAGCAGGAGATGAACAAAGGAAGAGCCTGACTCCCTCGAGTCTCCAGATCTATGATCAGCTGCCTGGCCTGATCCCGCCGAGATCCAGAGCCTGCCCGCTGGATGTCCTCGATCATATGGGGCCTGAACAGCTCGCGGCTCAGCAGGGCGTCCCAGAGCTGGTCCACCTGCAGCTCTTCCACCAGCCGCAGCCGGCACCGCCGCAGGAGCCGCCGATCCGCTTCGTCCATTCCCCTGCTTTTGCT
主要特征5'：
SEQ ID NO:13:载体的5’非编码区AGTAGAAACAAGG
SEQ ID NO:14:非特异性缓冲序列GTG
SEQ ID NO:15:U5-7重复，在逆转录期间将“断断续续(stuttered)”成多聚A信号：TTTTTT
SEQ ID NO:16:非特异性缓冲序列，最常见于流感物种：ATCA
SEQ ID NO:17:“最终+有义Casp9转录物”的终止密码子：TTA
主要特征3'：
SEQ ID NO:18:“最终+有义Casp9转录物”的起始密码子：CAT
SEQ ID NO:19:非特异性缓冲序列:TCC
SEQ ID NO:20:载体的3’非编码区CCTGCTTTTGCT
SEQ ID NO:21:
用于流感聚合酶复合物识别和逆转录的(-)ssRNA转录物
(由受试载体表达的转录物)
AGUAGAAACAAGGGUGUUUUUUAUCAUUAUGAUGUUUUAAAGAAAAGUUUUUUCCGGAGGAAAUUAAAGCAACCAGGCAUCUGUUUAUAAAUCCCUUUCACCGAAACAGCAUUAGCGACCCUAAGCAGGAGGGACUGCAGGUCUUCAGAGUGAGCCCACUGCUCAAAGAUGUCGUCCAGGGUCUCAACGUACCAGGAGCCACUCUUGGGGUCCCUCCAGGAAACAAAACCUGGGAAAGUAGAGUAGGACACAAAGAUGUCACUGGGUGUGGGCAAACUAGAUAUGGCGUCCAGCUGGUCGAAGGUCCUCAAACCUUCCUGGAACGGGGUGGCAUCUGGCUCGGGGUUACUGCCAGGGGACUCGUCUUCAGGGGAAGUGGAGGCCACCUCAAACCCAUGGUCUUUCUGCUCCCCACCACAGGCCUGGAUGAAAAAGAGCUUGGGCUUCCCUCCCAGGCUGGGGCAGCUGGUCCCAUUGAAGAUGUUCACAAUCUUCUCGACCGACACAGGGCAUCCAUCUGUGCCGUAGACAGCCCCUGGGAACUGCAGGUGGCUGGCCUGACAGCCGUGAGAGAGAAUGACCACCACGCAGCAGUCCAGAGCACCGUGGUCCUGCUGCGCCAGCUCCAGCAAAGCCAGCACCAUUUUCUUGGCAGUCAGGUCGCCCUUCACCUCCACCAUGAAAUGCAGCGAGGAGAAGCGACGCCGCAACUUCUCACAGUCGAUGUUGGAGCCAGUGCGGGUGCGGAGCCCGGACUCACGGCAGAAGUUCACAUUGUUGAUAAUGAGGCAGUGGCCACAGGGCUCCAUGCUCAGGAUGUAAGCCAAAUCUGCAUUUCCCCUCAAACUCUCAAGAGCACCGACAUCACCAAAUCCUCCAGAACCAAUGUCCACUGGUCUGGGUGUUUCCGGUCUGAGAACCUCUGGUUUGCGAAUCUCUGGUCUGAGCACCACUGGGGUAAGGUUUUCUAGGGUUGGCUUCGACAACUUUGCUGCUUGCCUGUUAGUUCGCAGAAACGAAGCCAGCAUGUCCUGGCCUGUGUCCUCUAAGCAGGAGAUGAACAAAGGAAGAGCCUGACUCCCUCGAGUCUCCAGAUCUAUGAUCAGCUGCCUGGCCUGAUCCCGCCGAGAUCCAGAGCCUGCCCGCUGGAUGUCCUCGAUCAUAUGGGGCCUGAACAGCUCGCGGCUCAGCAGGGCGUCCCAGAGCUGGUCCACCUGCAGCUCUUCCACCAGCCGCAGCCGGCACCGCCGCAGGAGCCGCCGAUCCGCUUCGUCCAUUCCCCUGCUUUUGCU
通用载体结构
在一些实施方式中，通用载体结构具有下式：
SEQ ID NO:22-ORF-SEQ ID NO:23，其中
SEQ ID NO:22是AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTATCATTA；
ORF是任何蛋白编码序列；并且
SEQ ID NO:23是CATTCCCCTGCTTTTGCT。
SEQ ID NO:24:
用于实验检测的GFP标志物构建体(代替Casp9)
AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTTATCATTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAGGGCGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCTGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTCACCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCCATGATATAGACGTTGTGGCTGTTGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTAGCGGCTGAAGCACTGCACGCCGTAGGTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATTCCCCTGCTTTTGCT
实施例7
在该实验中，Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞未被感染，被甲型流感(H1N1或H3N2)或乙型流感病毒感染。接下来，用包括编码人casp9的劫持RNA的AAV颗粒或包括GFP的AAV颗粒治疗未感染和感染的细胞。进行了三个独立的实验，每个实验一式三份。
通过流式细胞术测量Casp9表达及其切割产物(胱天蛋白酶3和7)。与未感染的细胞相比，具有H1N1流感感染的Casp9表达增加到4x。劫持RNA AAV对未感染细胞没有作用，但当用于受感染细胞时，与未感染细胞相比，“劫持”RNA AAV使casp9增加到10x，并且与未经治疗的感染细胞相比增加到3x。
通过使用自动细胞计数和FACS分析监测细胞生存力和增殖，每天测量劫持RNAAAV的有效性。用“劫持”RNA AAV治疗未感染的细胞对细胞生存力没有作用。然而，与未经治疗的感染细胞或经GFP AAV治疗的感染细胞相比，用劫持RNA AAV治疗乙型流感、H1N1或H3N2感染的细胞可使细胞生存力增加了120小时。
使用FACS分析经由流感核蛋白细胞内染色监测培养物中的感染的细胞百分比。使用劫持RNA AAV治疗将H1N1、H3N2或乙型流感感染细胞的百分比降低了72小时，并在96小时内完全根除流感感染。
这些结果示出表达胱天蛋白酶-9的劫持RNA AAV有效地杀死细胞培养中的流感感染。
实施例8
冠状病毒构建体设计
通过CoV聚合酶(RNA依赖性RNA聚合酶或RdRp)从(+)ssRNA合成亚基因组(-)ssRNA。冠状病毒RdRp在基因间模板转换供体信号处暂停，并通过复制选择机制转移到基因组5'端附近高度相似的受体位点，以复制5'端前导。将转录调控序列(TRS)用作模板转换信号。TRS是正链上的5'ACGAAC3'(SEQ ID NO:31)和负链上的3'UGCUUG5'(SEQ ID NO:32)。如果亚基因组mRNA(sgmRNA)中仍具有多个TRS，RdRp将新的smRNA视为一个小基因组，在其上启动负链合成，并在内部供体信号处切换模板以制造负链模板以在内部合成较短的嵌套的sgmRNA。前导RNA(60-80nt)序列始终位于亚基因组负链的3’端和亚基因组mRNA的5’端。
亚基因组(-)ssRNA是产生用于病毒蛋白合成的新mRNA的中间体。因此，可以将冠状病毒“劫持RNA”设计为(-)ssRNA，它模拟前导RNA和TRS序列，但携带目的基因(例如胱天蛋白酶-9)的负链。该策略的概述在图12A和图12B中示出。
标准方法
分子生物学中的标准方法描述于Sambrook,Fritsch and Maniatis(1982&19892nd Edition,2001 3rd Edition)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.217,Academic Press,San Diego,CA)中。标准方法也出现在Ausbel,et al.(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vols.1-4,John Wiley and Sons,Inc.New York,NY中，其描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)、哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)、糖缀合物和蛋白表达(第3卷)以及生物信息学(第4卷)。
描述了用于蛋白质纯化的方法，包括免疫沉淀、色谱法、电泳、离心和结晶(Coligan,et al.(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.1,John Wileyand Sons,Inc.,New York)。描述了化学分析、化学修饰、翻译后修饰、融合蛋白的产生、蛋白的糖基化(参见，例如Coligan,et al.(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.2,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel,et al.(2001)Current Protocolsin Molecular Biology,Vol.3,John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY,pp.16.0.5-16.22.17；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；pp.45-89；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,pp.384-391)。描述了多克隆和单克隆抗体的产生、纯化和片段化(Coligan,et al.(2001)CurrentProtcols in Immunology,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow andLane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY；Harlow and Lane,同上)。可使用用于表征配体/受体相互作用的标准技术(参见，例如Coligan,et al.(2001)Current Protocols in Immunology,Vol.4,John Wiley,Inc.,New York)。
本文引用的所有参考文献均通过援引并入，其程度与将每个单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利具体且单独地指示来通过援引并入的程度相同。申请人根据7C.F.R.§1.57(B)(1)预期的该通过援引并入的声明涉及每个和每一个单独的公开、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利，其中的每一个都根据37C.F.R.§1.57(b)(2)明确标识，即使这样的引文与通过援引并入的专门声明不直接相邻。如果有的话，在说明书中包括通过援引并入的专门声明不会以任何方式削弱通过援引并入的该一般声明。本文引用参考文献并不旨在承认该参考文献是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文件的内容或日期的任何承认。
实施例9
在该实验中，测试了被设计为由SARS-CoV-2RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)识别的合成RNA(“劫持RNA”)在细胞培养中根除SARS-CoV-2感染的能力。识别后，劫持RNA将被转录成白喉毒素片段A(DT-A)，以在感染细胞中特异性诱导细胞凋亡，这可能是潜在的治疗(图13)。
方法
腺相关病毒(AAV)与表达SARS-CoV-2劫持RNA的新型载体(图15)包装在一起，该载体包含DT-A cDNA的反向互补链和SARS-CoV-2sgRNA的二级结构。以0.1 MOI用SARS-CoV-2USA-WA1/2020毒株感染Vero细胞。用测试(图15)或对照(GFP)AAV转导SARS-CoV-2感染和未感染的vero细胞。也用测试AAV转导未感染的Jurkat、HEK和BHK-21细胞，以进一步研究劫持RNA在未感染细胞中的潜在脱靶效应。每天通过FACS和自动化细胞计数评价细胞死亡和生存力。通过经由细胞成像观察的细胞病变效应(CPE)以及通过经由病毒蛋白的细胞内染色的FACS来确定细胞培养中感染的根除。通过培养上清液和细胞裂解物的蛋白质印迹(WB)分析来测量感染和未感染的细胞中的DT-A产生。通过用不同(0-100ng)浓度的体外转录劫持RNA(图14)转染细胞来重复相同的实验。还生成了稳定表达SARS-COV-2 RDRP的Vero和Jurkat细胞系以评估劫持RNA的RDRP特异性表达。
结果
从测试AAV转导的48h内的培养物中成功地消除了SARS-COV-2感染，通过细胞增殖测定和细胞图像中的CPE的不存在以及FACS分析证实了这一点(图16A)。在劫持RNA转染后24小时内观察到相同的结果。测试AAV或劫持RNA对未感染的细胞没有作用(图16B)。在表达RdRp的细胞系中观察到类似的结果，证实了假设的作用机制。
结论
反式递送或表达以与SARS-CoV-2 RdRp结合的RNA劫持了病毒机制，并在受感染的细胞中诱导了快速死亡，但在未感染的细胞中却没有。劫持RNA翻译成杀死分子DT-A依赖于病毒RdRp，这在几种不同的细胞系中得到了证明，证实了治疗的特异性和灵敏性。这种新型途径可以用于开发有效的治疗来根除COVID-19感染。
本发明的范围不受本文所述的特定实施方式的限制。实际上，根据前面的描述和附图，除了在此描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。这种修改旨在落入所附权利要求的范围内。
序列表
<110> G科技生物有限责任公司 （G TECH BIO LLC）
<120> 用于治疗病毒感染的组合物和方法
<130> PTR22170316HK
<150> US 62/893,460
<151> 2019-08-29
<150> US 62/968,387
<151> 2020-01-31
<150> US 62/976,491
<151> 2020-02-14
<150> US 62/985,597
<151> 2020-03-05
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 61
<212> RNA
<213> 乙型肝炎病毒
<400> 1
uguucauguc cuacuguuca agccuccaag cugugccuug gguggcuuug gggcauggac 60
a 61
<210> 2
<211> 232
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60
ggaggggtcg gcaattgatc cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120
gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca 180
gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca gg 232
<210> 3
<211> 1251
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
atggacgaag cggatcggcg gctcctgcgg cggtgccggc tgcggctggt ggaagagctg 60
caggtggacc agctctggga cgccctgctg agccgcgagc tgttcaggcc ccatatgatc 120
gaggacatcc agcgggcagg ctctggatct cggcgggatc aggccaggca gctgatcata 180
gatctggaga ctcgagggag tcaggctctt cctttgttca tctcctgctt agaggacaca 240
ggccaggaca tgctggcttc gtttctgcga actaacaggc aagcagcaaa gttgtcgaag 300
ccaaccctag aaaaccttac cccagtggtg ctcagaccag agattcgcaa accagaggtt 360
ctcagaccgg aaacacccag accagtggac attggttctg gaggatttgg tgatgtcggt 420
gctcttgaga gtttgagggg aaatgcagat ttggcttaca tcctgagcat ggagccctgt 480
ggccactgcc tcattatcaa caatgtgaac ttctgccgtg agtccgggct ccgcacccgc 540
actggctcca acatcgactg tgagaagttg cggcgtcgct tctcctcgct gcatttcatg 600
gtggaggtga agggcgacct gactgccaag aaaatggtgc tggctttgct ggagctggcg 660
cagcaggacc acggtgctct ggactgctgc gtggtggtca ttctctctca cggctgtcag 720
gccagccacc tgcagttccc aggggctgtc tacggcacag atggatgccc tgtgtcggtc 780
gagaagattg tgaacatctt caatgggacc agctgcccca gcctgggagg gaagcccaag 840
ctctttttca tccaggcctg tggtggggag cagaaagacc atgggtttga ggtggcctcc 900
acttcccctg aagacgagtc ccctggcagt aaccccgagc cagatgccac cccgttccag 960
gaaggtttga ggaccttcga ccagctggac gccatatcta gtttgcccac acccagtgac 1020
atctttgtgt cctactctac tttcccaggt tttgtttcct ggagggaccc caagagtggc 1080
tcctggtacg ttgagaccct ggacgacatc tttgagcagt gggctcactc tgaagacctg 1140
cagtccctcc tgcttagggt cgctaatgct gtttcggtga aagggattta taaacagatg 1200
cctggttgct ttaatttcct ccggaaaaaa cttttcttta aaacatcata a 1251
<210> 4
<211> 1251
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
ttatgatgtt ttaaagaaaa gttttttccg gaggaaatta aagcaaccag gcatctgttt 60
ataaatccct ttcaccgaaa cagcattagc gaccctaagc aggagggact gcaggtcttc 120
agagtgagcc cactgctcaa agatgtcgtc cagggtctca acgtaccagg agccactctt 180
ggggtccctc caggaaacaa aacctgggaa agtagagtag gacacaaaga tgtcactggg 240
tgtgggcaaa ctagatatgg cgtccagctg gtcgaaggtc ctcaaacctt cctggaacgg 300
ggtggcatct ggctcggggt tactgccagg ggactcgtct tcaggggaag tggaggccac 360
ctcaaaccca tggtctttct gctccccacc acaggcctgg atgaaaaaga gcttgggctt 420
ccctcccagg ctggggcagc tggtcccatt gaagatgttc acaatcttct cgaccgacac 480
agggcatcca tctgtgccgt agacagcccc tgggaactgc aggtggctgg cctgacagcc 540
gtgagagaga atgaccacca cgcagcagtc cagagcaccg tggtcctgct gcgccagctc 600
cagcaaagcc agcaccattt tcttggcagt caggtcgccc ttcacctcca ccatgaaatg 660
cagcgaggag aagcgacgcc gcaacttctc acagtcgatg ttggagccag tgcgggtgcg 720
gagcccggac tcacggcaga agttcacatt gttgataatg aggcagtggc cacagggctc 780
catgctcagg atgtaagcca aatctgcatt tcccctcaaa ctctcaagag caccgacatc 840
accaaatcct ccagaaccaa tgtccactgg tctgggtgtt tccggtctga gaacctctgg 900
tttgcgaatc tctggtctga gcaccactgg ggtaaggttt tctagggttg gcttcgacaa 960
ctttgctgct tgcctgttag ttcgcagaaa cgaagccagc atgtcctggc ctgtgtcctc 1020
taagcaggag atgaacaaag gaagagcctg actccctcga gtctccagat ctatgatcag 1080
ctgcctggcc tgatcccgcc gagatccaga gcctgcccgc tggatgtcct cgatcatatg 1140
gggcctgaac agctcgcggc tcagcagggc gtcccagagc tggtccacct gcagctcttc 1200
caccagccgc agccggcacc gccgcaggag ccgccgatcc gcttcgtcca t 1251
<210> 5
<211> 232
<212> DNA
<213> 智人
<400> 5
cctgtgttct ggcggcaaac ccgttgcgaa aaagaacgtt cacggcgact actgcactta 60
tatacggttc tcccccaccc tcgggaaaaa ggcggagcca gtacacgaca tcactttccc 120
agtttacccc gcgccacctt ctctaggcac cggatcaatt gccgacccct ccccccaact 180
tctcggggac tgtgggcgat gtgcgctctg cccactgacg ggcaccggag cc 232
<210> 6
<211> 135
<212> DNA
<213> 猿猴病毒40
<400> 6
acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa 60
ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt 120
atcatgtctg gctct 135
<210> 7
<211> 135
<212> DNA
<213> 猿猴病毒40
<400> 7
agagccagac atgataagat acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg 60
aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag 120
ctgcaataaa caagt 135
<210> 8
<211> 1746
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 8
atgtgttcat gtcctactgt tcaagcctcc aagctgtgcc ttgggtggct ttggggcatg 60
gacaagagcc agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc 120
agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta 180
taagctgcaa taaacaagtt tatgatgttt taaagaaaag ttttttccgg aggaaattaa 240
agcaaccagg catctgttta taaatccctt tcaccgaaac agcattagcg accctaagca 300
ggagggactg caggtcttca gagtgagccc actgctcaaa gatgtcgtcc agggtctcaa 360
cgtaccagga gccactcttg gggtccctcc aggaaacaaa acctgggaaa gtagagtagg 420
acacaaagat gtcactgggt gtgggcaaac tagatatggc gtccagctgg tcgaaggtcc 480
tcaaaccttc ctggaacggg gtggcatctg gctcggggtt actgccaggg gactcgtctt 540
caggggaagt ggaggccacc tcaaacccat ggtctttctg ctccccacca caggcctgga 600
tgaaaaagag cttgggcttc cctcccaggc tggggcagct ggtcccattg aagatgttca 660
caatcttctc gaccgacaca gggcatccat ctgtgccgta gacagcccct gggaactgca 720
ggtggctggc ctgacagccg tgagagagaa tgaccaccac gcagcagtcc agagcaccgt 780
ggtcctgctg cgccagctcc agcaaagcca gcaccatttt cttggcagtc aggtcgccct 840
tcacctccac catgaaatgc agcgaggaga agcgacgccg caacttctca cagtcgatgt 900
tggagccagt gcgggtgcgg agcccggact cacggcagaa gttcacattg ttgataatga 960
ggcagtggcc acagggctcc atgctcagga tgtaagccaa atctgcattt cccctcaaac 1020
tctcaagagc accgacatca ccaaatcctc cagaaccaat gtccactggt ctgggtgttt 1080
ccggtctgag aacctctggt ttgcgaatct ctggtctgag caccactggg gtaaggtttt 1140
ctagggttgg cttcgacaac tttgctgctt gcctgttagt tcgcagaaac gaagccagca 1200
tgtcctggcc tgtgtcctct aagcaggaga tgaacaaagg aagagcctga ctccctcgag 1260
tctccagatc tatgatcagc tgcctggcct gatcccgccg agatccagag cctgcccgct 1320
ggatgtcctc gatcatatgg ggcctgaaca gctcgcggct cagcagggcg tcccagagct 1380
ggtccacctg cagctcttcc accagccgca gccggcaccg ccgcaggagc cgccgatccg 1440
cttcgtccat cctgtgttct ggcggcaaac ccgttgcgaa aaagaacgtt cacggcgact 1500
actgcactta tatacggttc tcccccaccc tcgggaaaaa ggcggagcca gtacacgaca 1560
tcactttccc agtttacccc gcgccacctt ctctaggcac cggatcaatt gccgacccct 1620
ccccccaact tctcggggac tgtgggcgat gtgcgctctg cccactgacg ggcaccggag 1680
cctgttcatg tcctactgtt caagcctcca agctgtgcct tgggtggctt tggggcatgg 1740
acataa 1746
<210> 9
<211> 1191
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 9
atgtgttcat gtcctactgt tcaagcctcc aagctgtgcc ttgggtggct ttggggcatg 60
gacaagagcc agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc 120
agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta 180
taagctgcaa taaacaagtt tagggcaagg cggagccgga ggcgatggcg tgctcggtca 240
ggtgccactt ctggttcttg gcgtcgctgc ggtcctcgcg ggtcagcttg tgctggatga 300
agtgccagtc gggcatcttg cggggcacgg acttggcctt gtacacggtg tcgaactggc 360
agcgcaagcg gccaccgtcc ttcagcagca ggtacatgct cacgtcgccc ttcaagatgc 420
cctgcttggg cacggggatg atcttctcgc aggagggctc ccagttgtcg gtcatcttct 480
tcatcacggg gccgtcggcg gggaagttca cgccgtagaa cttggactcg tggtacatgc 540
agttctcctc cacgctcacg gtgatgtcgg cgttgcagat gcacacggcg ccgtcctcga 600
acaggaagga gcggtcccag gtgtagccgg cggggcagga gttcttgaag tagtcgacga 660
tgtcctgggg gtactcggtg aacacgcggt tgccgtacat gaaggcggcg gacaagatgt 720
cctcggcgaa gggcaagggg ccgccctcca ccacgcacag gttgatggcc tgcttgccct 780
tgaaggggta gccgatgccc tcgccggtga tcacgaactt gtggccgtcc acgcagccct 840
ccatgcggta cttcatggtc atctccttgg tcaggccgtg cttggactgg gccatcctgt 900
gttctggcgg caaacccgtt gcgaaaaaga acgttcacgg cgactactgc acttatatac 960
ggttctcccc caccctcggg aaaaaggcgg agccagtaca cgacatcact ttcccagttt 1020
accccgcgcc accttctcta ggcaccggat caattgccga cccctccccc caacttctcg 1080
gggactgtgg gcgatgtgcg ctctgcccac tgacgggcac cggagcctgt tcatgtccta 1140
ctgttcaagc ctccaagctg tgccttgggt ggctttgggg catggacata a 1191
<210> 10
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 10
cctgcttttg ct 12
<210> 11
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 11
agtagaaaca agg 13
<210> 12
<211> 1292
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 12
agtagaaaca agggtgtttt ttatcattat gatgttttaa agaaaagttt tttccggagg 60
aaattaaagc aaccaggcat ctgtttataa atccctttca ccgaaacagc attagcgacc 120
ctaagcagga gggactgcag gtcttcagag tgagcccact gctcaaagat gtcgtccagg 180
gtctcaacgt accaggagcc actcttgggg tccctccagg aaacaaaacc tgggaaagta 240
gagtaggaca caaagatgtc actgggtgtg ggcaaactag atatggcgtc cagctggtcg 300
aaggtcctca aaccttcctg gaacggggtg gcatctggct cggggttact gccaggggac 360
tcgtcttcag gggaagtgga ggccacctca aacccatggt ctttctgctc cccaccacag 420
gcctggatga aaaagagctt gggcttccct cccaggctgg ggcagctggt cccattgaag 480
atgttcacaa tcttctcgac cgacacaggg catccatctg tgccgtagac agcccctggg 540
aactgcaggt ggctggcctg acagccgtga gagagaatga ccaccacgca gcagtccaga 600
gcaccgtggt cctgctgcgc cagctccagc aaagccagca ccattttctt ggcagtcagg 660
tcgcccttca cctccaccat gaaatgcagc gaggagaagc gacgccgcaa cttctcacag 720
tcgatgttgg agccagtgcg ggtgcggagc ccggactcac ggcagaagtt cacattgttg 780
ataatgaggc agtggccaca gggctccatg ctcaggatgt aagccaaatc tgcatttccc 840
ctcaaactct caagagcacc gacatcacca aatcctccag aaccaatgtc cactggtctg 900
ggtgtttccg gtctgagaac ctctggtttg cgaatctctg gtctgagcac cactggggta 960
aggttttcta gggttggctt cgacaacttt gctgcttgcc tgttagttcg cagaaacgaa 1020
gccagcatgt cctggcctgt gtcctctaag caggagatga acaaaggaag agcctgactc 1080
cctcgagtct ccagatctat gatcagctgc ctggcctgat cccgccgaga tccagagcct 1140
gcccgctgga tgtcctcgat catatggggc ctgaacagct cgcggctcag cagggcgtcc 1200
cagagctggt ccacctgcag ctcttccacc agccgcagcc ggcaccgccg caggagccgc 1260
cgatccgctt cgtccattcc cctgcttttg ct 1292
<210> 13
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 13
agtagaaaca agg 13
<210> 14
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 14
cctgcttttg ct 12
<210> 15
<211> 1292
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 15
aguagaaaca aggguguuuu uuaucauuau gauguuuuaa agaaaaguuu uuuccggagg 60
aaauuaaagc aaccaggcau cuguuuauaa aucccuuuca ccgaaacagc auuagcgacc 120
cuaagcagga gggacugcag gucuucagag ugagcccacu gcucaaagau gucguccagg 180
gucucaacgu accaggagcc acucuugggg ucccuccagg aaacaaaacc ugggaaagua 240
gaguaggaca caaagauguc acugggugug ggcaaacuag auauggcguc cagcuggucg 300
aagguccuca aaccuuccug gaacggggug gcaucuggcu cgggguuacu gccaggggac 360
ucgucuucag gggaagugga ggccaccuca aacccauggu cuuucugcuc cccaccacag 420
gccuggauga aaaagagcuu gggcuucccu cccaggcugg ggcagcuggu cccauugaag 480
auguucacaa ucuucucgac cgacacaggg cauccaucug ugccguagac agccccuggg 540
aacugcaggu ggcuggccug acagccguga gagagaauga ccaccacgca gcaguccaga 600
gcaccguggu ccugcugcgc cagcuccagc aaagccagca ccauuuucuu ggcagucagg 660
ucgcccuuca ccuccaccau gaaaugcagc gaggagaagc gacgccgcaa cuucucacag 720
ucgauguugg agccagugcg ggugcggagc ccggacucac ggcagaaguu cacauuguug 780
auaaugaggc aguggccaca gggcuccaug cucaggaugu aagccaaauc ugcauuuccc 840
cucaaacucu caagagcacc gacaucacca aauccuccag aaccaauguc cacuggucug 900
gguguuuccg gucugagaac cucugguuug cgaaucucug gucugagcac cacuggggua 960
agguuuucua ggguuggcuu cgacaacuuu gcugcuugcc uguuaguucg cagaaacgaa 1020
gccagcaugu ccuggccugu guccucuaag caggagauga acaaaggaag agccugacuc 1080
ccucgagucu ccagaucuau gaucagcugc cuggccugau cccgccgaga uccagagccu 1140
gcccgcugga uguccucgau cauauggggc cugaacagcu cgcggcucag cagggcgucc 1200
cagagcuggu ccaccugcag cucuuccacc agccgcagcc ggcaccgccg caggagccgc 1260
cgauccgcuu cguccauucc ccugcuuuug cu 1292
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 16
agtagaaaca agggtgtttt ttatcatta 29
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 17
cattcccctg cttttgct 18
<210> 18
<211> 761
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 18
agtagaaaca agggtgtttt ttatcattac ttgtacagct cgtccatgcc gagagtgatc 60
ccggcggcgg tcacgaactc cagcaggacc atgtgatcgc gcttctcgtt ggggtctttg 120
ctcagggcgg actgggtgct caggtagtgg ttgtcgggca gcagcacggg gccgtcgccg 180
atgggggtgt tctgctggta gtggtcggcg agctgcacgc tgccgtcctc gatgttgtgg 240
cggatcttga agttcacctt gatgccgttc ttctgcttgt cggccatgat atagacgttg 300
tggctgttgt agttgtactc cagcttgtgc cccaggatgt tgccgtcctc cttgaagtcg 360
atgcccttca gctcgatgcg gttcaccagg gtgtcgccct cgaacttcac ctcggcgcgg 420
gtcttgtagt tgccgtcgtc cttgaagaag atggtgcgct cctggacgta gccttcgggc 480
atggcggact tgaagaagtc gtgctgcttc atgtggtcgg ggtagcggct gaagcactgc 540
acgccgtagg tcagggtggt cacgagggtg ggccagggca cgggcagctt gccggtggtg 600
cagatgaact tcagggtcag cttgccgtag gtggcatcgc cctcgccctc gccggacacg 660
ctgaacttgt ggccgtttac gtcgccgtcc agctcgacca ggatgggcac caccccggtg 720
aacagctcct cgcccttgct caccattccc ctgcttttgc t 761
<210> 19
<211> 265
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 19
attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60
gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact 120
cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc 180
ttctgcaggc tgcttacggt ttcgtccgtg ttgcagccga tcatcagcac atctaggttt 240
cgtccgggtg tgaccgaaag gtaag 265
<210> 20
<211> 229
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 20
caatctttaa tcagtgtgta acattaggga ggacttgaaa gagccaccac attttcaccg 60
aggccacgcg gagtacgatc gagtgtacag tgaacaatgc tagggagagc tgcctatatg 120
gaagagccct aatgtgtaaa attaatttta gtagtgctat ccccatgtga ttttaatagc 180
ttcttaggag aatgacaaaa aaacaatctt gctaaacact gtcttcatg 229
<210> 21
<211> 603
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 21
atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 60
taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 120
tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagggt tttatagtac cgacaataaa 180
tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 240
gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 300
gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 360
acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 420
ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta 480
agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 540
gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg tagctcattg 600
taa 603
<210> 22
<211> 1097
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 22
attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 60
gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact 120
cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc 180
ttctgcaggc tgcttacggt ttcgtccgtg ttgcagccga tcatcagcac atctaggttt 240
cgtccgggtg tgaccgaaag gtaagatggg cgctgatgat gttgttgatt cttctaaatc 300
ttttgtgatg gaaaactttt cttcgtacca cgggactaaa cctggttatg tagattccat 360
tcaaaaaggt atacaaaagc caaaatctgg tacacaagga aattatgacg atgattggaa 420
agggttttat agtaccgaca ataaatacga cgctgcggga tactctgtag ataatgaaaa 480
cccgctctct ggaaaagctg gaggcgtggt caaagtgacg tatccaggac tgacgaaggt 540
tctcgcacta aaagtggata atgccgaaac tattaagaaa gagttaggtt taagtctcac 600
tgaaccgttg atggagcaag tcggaacgga agagtttatc aaaaggttcg gtgatggtgc 660
ttcgcgtgta gtgctcagcc ttcccttcgc tgaggggagt tctagcgttg aatatattaa 720
taactgggaa caggcgaaag cgttaagcgt agaacttgag attaattttg aaacccgtgg 780
aaaacgtggc caagatgcga tgtatgagta tatggctcaa gcctgtgcag gaaatcgtgt 840
caggcgatca gtaggtagct cattgtaaca atctttaatc agtgtgtaac attagggagg 900
acttgaaaga gccaccacat tttcaccgag gccacgcgga gtacgatcga gtgtacagtg 960
aacaatgcta gggagagctg cctatatgga agagccctaa tgtgtaaaat taattttagt 1020
agtgctatcc ccatgtgatt ttaatagctt cttaggagaa tgacaaaaaa acaatcttgc 1080
taaacactgt cttcatg 1097
<210> 23
<211> 603
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 23
ttacaatgag ctacctactg atcgcctgac acgatttcct gcacaggctt gagccatata 60
ctcatacatc gcatcttggc cacgttttcc acgggtttca aaattaatct caagttctac 120
gcttaacgct ttcgcctgtt cccagttatt aatatattca acgctagaac tcccctcagc 180
gaagggaagg ctgagcacta cacgcgaagc accatcaccg aaccttttga taaactcttc 240
cgttccgact tgctccatca acggttcagt gagacttaaa cctaactctt tcttaatagt 300
ttcggcatta tccactttta gtgcgagaac cttcgtcagt cctggatacg tcactttgac 360
cacgcctcca gcttttccag agagcgggtt ttcattatct acagagtatc ccgcagcgtc 420
gtatttattg tcggtactat aaaacccttt ccaatcatcg tcataatttc cttgtgtacc 480
agattttggc ttttgtatac ctttttgaat ggaatctaca taaccaggtt tagtcccgtg 540
gtacgaagaa aagttttcca tcacaaaaga tttagaagaa tcaacaacat catcagcgcc 600
cat 603
<210> 24
<211> 1097
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 24
catgaagaca gtgtttagca agattgtttt tttgtcattc tcctaagaag ctattaaaat 60
cacatgggga tagcactact aaaattaatt ttacacatta gggctcttcc atataggcag 120
ctctccctag cattgttcac tgtacactcg atcgtactcc gcgtggcctc ggtgaaaatg 180
tggtggctct ttcaagtcct ccctaatgtt acacactgat taaagattgt tacaatgagc 240
tacctactga tcgcctgaca cgatttcctg cacaggcttg agccatatac tcatacatcg 300
catcttggcc acgttttcca cgggtttcaa aattaatctc aagttctacg cttaacgctt 360
tcgcctgttc ccagttatta atatattcaa cgctagaact cccctcagcg aagggaaggc 420
tgagcactac acgcgaagca ccatcaccga accttttgat aaactcttcc gttccgactt 480
gctccatcaa cggttcagtg agacttaaac ctaactcttt cttaatagtt tcggcattat 540
ccacttttag tgcgagaacc ttcgtcagtc ctggatacgt cactttgacc acgcctccag 600
cttttccaga gagcgggttt tcattatcta cagagtatcc cgcagcgtcg tatttattgt 660
cggtactata aaaccctttc caatcatcgt cataatttcc ttgtgtacca gattttggct 720
tttgtatacc tttttgaatg gaatctacat aaccaggttt agtcccgtgg tacgaagaaa 780
agttttccat cacaaaagat ttagaagaat caacaacatc atcagcgccc atcttacctt 840
tcggtcacac ccggacgaaa cctagatgtg ctgatgatcg gctgcaacac ggacgaaacc 900
gtaagcagcc tgcagaagat agacgagtta ctcgtgtcct gtcaacgaca gtaattagtt 960
attaattata ctgcgtgagt gcactaagca tgcagccgag tgacagccac acagatttta 1020
aagttcgttt agagaacaga tctacaagag atcgaaagtt ggttggtttg ttacctggga 1080
aggtataaac ctttaat 1097

Claims (52)

1.一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包括：
负链核酸分子或pgRNA核酸分子，所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白、白喉毒素A(或其片段)或其任何组合，所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子侧翼是第一和第二病毒转录识别信号；
在所述第一病毒转录识别信号上游(5')的第一启动子；以及
第二启动子，所述第二启动子与编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白、白喉毒素A(或其片段)或其任何组合的所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子相邻且在所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子的5’处。
2.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其中，所述负链核酸分子是负义RNA、负义DNA、表达非编码负义RNA的单链或双链DNA，或其任意组合。
3.根据权利要求1或2所述的重组核酸分子，其中，所述第一和第二病毒转录识别信号选自病毒，所述病毒选自负链病毒、RNA逆转录病毒或DNA逆转录病毒。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组核酸分子，进一步包括在编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白或其组合的所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子下游(3')的多聚A尾。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组核酸分子，其中，所述细胞凋亡诱导蛋白选自由以下组成的组：BAX、BID、BAK、BAD、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶10、胱天蛋白酶11、胱天蛋白酶12、细胞色素C、SMAC和细胞凋亡诱导因子，或其任何组合。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的重组核酸分子，其中，所述第一启动子包括强遍在启动子或肝组织特异性启动子，选自由以下组成的组：TBG(甲状腺素结合球蛋白)、白蛋白启动子和/或增强元件、AFP(α-甲胎蛋白)启动子、AAT(α-1-抗胰蛋白酶)启动子、ApoE(载脂蛋白E)启动子或PEPCK(磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶)启动子。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的重组核酸分子，其中，所述第二启动子包括延伸因子1α结合序列(EFS)。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的重组核酸分子，其中，所述趋化因子选自CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、XCL1、XCL2和CX3CL1。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的重组核酸分子，其中，所述细胞因子选自由以下组成的组：IL-15、IL-2、IL-8、IL-10、IL-12、IL-6、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、CD40L、Mig和Crg-2。
10.根据权利要求3所述的重组核酸分子，其中，所述病毒转录识别信号包括如SEQ IDNO:1所示的ε识别信号或选自由以下组成的组的冠状病毒识别序列：SEQ ID:25、SEQ ID:26、SEQ ID:28和SEQ ID:30。
11.根据权利要求3所述的重组核酸分子，其中，所述病毒为冠状病毒、乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、人副流感病毒1、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人呼吸道合胞病毒、水疱性口炎印第安纳病毒、狂犬病病毒、牛暂时热病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、布尼奥罗病毒、汉坦病毒、内罗毕绵羊病病毒、白蛉热西西里病毒、甲型流感病毒、丙型流感病毒、索戈托病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、鼠白血病病毒、禽白血病病毒、Mason-Pfizer猴病毒、牛白血病病毒、人免疫缺陷病毒1、人泡沫状病毒属、鸭乙型肝炎病毒、冠状病毒及其任何组合。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的重组核酸分子，其中，所述核酸分子不包括病毒聚合酶、逆转录酶、衣壳、包膜、包装信号或易位基序的序列(编码或非编码)。
13.一种载体，所述载体包括根据权利要求1-12中任一项所述的重组核酸序列。
14.根据权利要求13所述的载体，其中，所述载体包括用于递送至哺乳动物细胞的递送载体或负载体。
15.根据权利要求14所述的递送载体或负载体，其中，所述载体或负载体包括VLP、腺相关病毒(AAV)、脂质体、纳米颗粒、胶束、聚合物囊泡或聚合物泡囊。
16.一种药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求1-12所述的任何一种重组核酸序列或权利要求13-15所述的任何一种载体。
17.一种无复制能力的病毒样颗粒(VLP)，包括：
任选的易位基序(TLM)，所述任选的易位基序(TLM)与来自乙型肝炎病毒衣壳或丁型肝炎病毒衣壳的衣壳蛋白或者冠状病毒融合蛋白融合；以及
负链核酸分子或pgRNA核酸分子，所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白、白喉毒素A(或其片段)或其任何组合，所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子侧翼是第一和第二病毒转录识别信号；
在所述第一病毒转录识别信号上游(5')的第一启动子；以及
第二启动子，所述第二启动子与编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白、白喉毒素A(或其片段)或其任何组合的所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子相邻且在所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子的5'处。
18.一种无复制能力的病毒样颗粒(VLP)，包括：
负链核酸分子或pgRNA核酸分子，所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白、白喉毒素A(或其片段)或其任何组合，所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子侧翼是第一和第二靶病毒转录识别信号；
在所述第一病毒转录识别信号上游(5')的第一启动子；以及
第二启动子，所述第二启动子与编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白、白喉毒素A(或其片段)或其任何组合的所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子相邻且在所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子的5'处，其中，所述VLP表现出对靶病毒感染细胞的趋向性。
19.根据权利要求17或18所述的无复制能力的病毒样颗粒，其中，所述负链核酸分子是负义RNA、负义DNA、表达非编码负义RNA的单链或双链DNA，或其任何组合。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的无复制能力的病毒样颗粒，进一步包括在编码趋化因子、细胞因子、细胞凋亡诱导蛋白或其组合的所述负链核酸分子或pgRNA核酸分子下游(3')的多聚A尾。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的无复制能力的病毒样颗粒，其中，所述第一启动子包括强遍在启动子或肝组织特异性启动子，选自由以下组成的组：TBG(甲状腺素结合球蛋白)、白蛋白启动子和/或增强元件、AFP(α-甲胎蛋白)启动子、AAT(α-1-抗胰蛋白酶)启动子、ApoE(载脂蛋白E)启动子或PEPCK(磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶)启动子。
22.根据权利要求17-21中任一项所述的无复制能力的病毒样颗粒，其中，所述第二启动子包括延伸因子1α结合序列(EFS)。
23.根据权利要求17-22中任一项所述的无复制能力的病毒样颗粒，其中，所述病毒转录识别信号选自病毒，所述病毒选自负链病毒、RNA逆转录病毒或DNA逆转录病毒。
24.根据权利要求23所述的无复制能力的病毒样颗粒，其中，所述病毒转录识别信号包括ε识别信号(SEQ ID NO:1)或冠状病毒的病毒识别序列，诸如SEQ ID:25或SEQ ID:26。
25.根据权利要求17-24中任一项所述的无复制能力的病毒样颗粒，其中，所述细胞凋亡诱导蛋白选自由以下组成的组：BAX、BID、BAK、BAD、胱天蛋白酶2、胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶10、胱天蛋白酶11、胱天蛋白酶12、细胞色素C、SMAC和细胞凋亡诱导因子。
26.根据权利要求17-25中任一项所述的无复制能力的病毒样颗粒，其中，所述趋化因子选自CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、XCL1、XCL2和CX3CL1。
27.根据权利要求17-26中任一项所述的无复制能力的病毒样颗粒，其中，所述细胞因子选自由以下组成的组：IL-15、IL-2、IL-8、IL-10、IL-12、IL-6、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、CD40L、Mig和Crg-2。
28.根据权利要求17-27中任一项所述的无复制能力的病毒样颗粒，其中，所述病毒为冠状病毒、乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、人副流感病毒1、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人呼吸道合胞病毒、水疱性口炎印第安纳病毒、狂犬病病毒、牛暂时热病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、布尼奥罗病毒、汉坦病毒、内罗毕绵羊病病毒、白蛉热西西里病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、索戈托病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、鼠白血病病毒、禽白血病病毒、Mason-Pfizer猴病毒、牛白血病病毒、人免疫缺陷病毒1、人泡沫状病毒属、鸭乙型肝炎病毒、冠状病毒及其任何组合。
29.根据权利要求17-28中任一项所述的无复制能力的病毒样颗粒，其中，所述核酸分子不包括病毒衣壳、聚合酶、逆转录酶、包膜、包装信号或易位基序的序列(编码或非编码)。
30.一种药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求17-29中任一项所述的无复制能力的病毒样颗粒。
31.一种在有此需要的受试者中治疗病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者给药根据权利要求1-12中任一项所述的重组核酸分子、或根据权利要求13-15中任一项所述的载体、根据权利要求16或30所述的药物组合物、或根据权利要求17-29中任一项所述的无复制能力的病毒样颗粒。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述病毒感染包括来自分类在巴尔的摩分类IV、V、VI或VII下的病毒的感染。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述病毒感染包括来自选自由以下组成的组的病毒的感染：冠状病毒、乙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、人副流感病毒1、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人呼吸道合胞病毒、水疱性口炎印第安纳病毒、狂犬病病毒、牛暂时热病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、布尼奥罗病毒、汉坦病毒、内罗毕绵羊病病毒、白蛉热西西里病毒、甲型流感病毒、丙型流感病毒、索戈托病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、鼠白血病病毒、禽白血病病毒、Mason-Pfizer猴病毒、牛白血病病毒、人免疫缺陷病毒1、人泡沫状病毒属、鸭乙型肝炎病毒及其任何组合。
34.根据权利要求32所述的方法，其中，所述病毒感染包括来自选自由以下组成的组的病毒的感染：丝状病毒、副黏病毒、麻疹病毒属、腮腺炎病毒属、肺病毒属、水泡性病毒属、狂犬病病毒属、暂时热病毒属、沙粒病毒、布尼亚病毒、汉滩病毒、内罗毕病毒、白蛉病毒、正肝病毒属、禽肝病毒属、哺乳动物B型逆转录病毒、哺乳动物C型逆转录病毒、禽C型逆转录病毒、D型逆转录病毒、BLV-HTLV逆转录病毒、慢病毒、泡沫状病毒属及其组合。
35.根据权利要求31所述的方法，其中，所述核酸分子、载体、药物组合物或无复制能力的病毒样颗粒在给药后进入肝细胞。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述核酸分子、载体、药物组合物或无复制能力的病毒样颗粒在给药后将所述核酸分子递送至肝细胞并且所述核酸分子在所述肝细胞中表达。
37.根据权利要求31-36中任一项所述的方法，其中，所述受试者患有急性、慢性或潜伏性病毒感染。
38.根据权利要求31-37中任一项所述的方法，其中，给药诱导针对被引起所述病毒感染的病毒所感染的细胞的免疫应答。
39.根据权利要求31-38中任一项所述的方法，其中，给药诱导被引起所述病毒感染的病毒所感染的细胞中的细胞凋亡。
40.一种在有此需要的受试者中诱导针对被病毒感染的细胞的免疫应答的方法，所述方法包括使所述受试者与根据权利要求1-12中任一项所述的重组核酸分子、或根据权利要求13-15中任一项所述的载体、或根据权利要求16或30所述的药物组合物、或根据权利要求17-29中任一项所述的无复制能力的病毒样颗粒接触。
41.一种在有此需要的受试者中诱导针对被病毒感染的细胞的细胞凋亡应答的方法，所述方法包括使所述受试者与包括根据权利要求1-12中任一项所述的重组核酸分子的药物组合物、或根据权利要求13-15中任一项所述的载体、或根据权利要求16或30所述的药物组合物、或根据权利要求17-29中任一项所述的无复制能力的病毒样颗粒接触。
42.根据权利要求31-41中任一项所述的方法，其中，所述病毒是冠状病毒、流感、HBV、HDV、甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)或其任何组合。
43.一种在受试者中治疗乙型肝炎、流感或冠状病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者给药根据权利要求1-12中任一项所述的重组核酸分子、或根据权利要求13-15中任一项所述的载体、或根据权利要求16或30所述的药物组合物、或根据权利要求17-29中任一项所述的无复制能力的病毒样颗粒。
44.根据权利要求31-43中任一项所述的方法，所述方法进一步包括给药至少一种抗病毒剂、HBV聚合酶抑制剂、干扰素、TLR调节剂诸如TLR-7激动剂或TLR-9激动剂、治疗性疫苗、某些细胞病毒RNA传感器的免疫激活因子、病毒进入抑制剂、病毒成熟抑制剂、不同的衣壳组装调节剂、不同或未知机制的抗病毒化合物及其任何组合。
45.根据权利要求44所述的方法，所述方法进一步包括给药至少一种抗病毒剂3TC、FTC、L-FMAU、干扰素、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定(L-dT)、伐托他滨(3'-缬氨酰L-dC)、β-D-二氧杂环戊基-鸟嘌呤(DXG)、β-D-二氧杂环戊基-2,6-二氨基嘌呤(DAPD)、β-D-二氧杂环戊基-6-氯嘌呤(ACP)、泛昔洛韦、喷昔洛韦、洛布卡韦、更昔洛韦、利巴韦林、替诺福韦、比卡格韦、恩曲他滨、必妥维及任何组合。
46.一种在有此需要的受试者中诱导针对被流感病毒感染的细胞的细胞凋亡应答的方法，所述方法包括使所述受试者与根据权利要求1-12中任一项所述的重组核酸分子、或根据权利要求13-15中任一项所述的载体、或根据权利要求16或30所述的药物组合物、或根据权利要求17-29中任一项所述的无复制能力的病毒样颗粒接触。
47.根据权利要求31-41中任一项所述的方法，其中，所述病毒包括流感病毒，所述流感病毒是甲型流感、乙型流感、丙型流感或其任何组合。
48.一种在受试者中治疗流感的方法，所述方法包括向所述受试者给药根据权利要求1-12中任一项所述的重组核酸分子、或根据权利要求13-15中任一项所述的载体、或根据权利要求16或30所述的药物组合物、或根据权利要求17-29中任一项所述的无复制能力的病毒样颗粒。
49.根据权利要求31-43中任一项所述的方法，所述方法进一步包括给药至少一种抗病毒剂3TC、FTC、L-FMAU、干扰素、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定(L-dT)、伐托他滨(3'-缬氨酰L-dC)、β-D-二氧杂环戊基-鸟嘌呤(DXG)、β-D-二氧杂环戊基-2,6-二氨基嘌呤(DAPD)、β-D-二氧杂环戊基-6-氯嘌呤(ACP)、泛昔洛韦、喷昔洛韦、洛布卡韦、更昔洛韦、利巴韦林、替诺福韦、比卡格韦、恩曲他滨、必妥维及任何组合。
50.一种在有此需要的受试者中诱导针对被冠状病毒感染的细胞的细胞凋亡应答的方法，所述方法包括使所述受试者与根据权利要求1-12中任一项所述的重组核酸分子、或根据权利要求13-15中任一项所述的载体、或根据权利要求16或30所述的药物组合物、或根据权利要求17-29中任一项所述的无复制能力的病毒样颗粒接触。
51.一种在受试者中治疗冠状病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者给药根据权利要求1-12中任一项所述的重组核酸分子、或根据权利要求13-15中任一项所述的载体、或根据权利要求16或30所述的药物组合物、或根据权利要求17-29中任一项所述的无复制能力的病毒样颗粒。
52.根据权利要求31-51中任一项所述的方法，其中，所述治疗为周期性给药，包括每周一次、每2周一次、每3周一次、每月一次、至每两个月一次、至每3个月一次、至每4个月一次、至每5个月一次、至每6个月一次、或每7个月一次、或每8个月一次、或每9个月一次、或每10个月一次、或每11个月一次、或每年一次作为维持治疗，或者持续只要所述患者需要达到稳定或无法检测到的疾病即可。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220282279A1 (en) * 2021-03-06 2022-09-08 Serhat Gumrukcu Compositions and methods for treating and preventing coronavirus infections
WO2023220086A1 (en) * 2022-05-13 2023-11-16 Suntec Medical, Inc. Method for treating infectious disease

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010049145A1 (en) * 2000-04-20 2001-12-06 Wang-Shick Ryu Hepatitis B virus vectors for gene therapy
WO2012170431A2 (en) * 2011-06-06 2012-12-13 Bluebird Bio, Inc. Improved geneswitch systems
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Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20010049145A1 (en) * 2000-04-20 2001-12-06 Wang-Shick Ryu Hepatitis B virus vectors for gene therapy
WO2012170431A2 (en) * 2011-06-06 2012-12-13 Bluebird Bio, Inc. Improved geneswitch systems
US20180312546A1 (en) * 2014-06-20 2018-11-01 Drexel University Tagged hepadnavirus e antigen and its use in screening antiviral substances

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PROTZER U等: "Interferon gene transfer by a hepatitis B virus vector efficiently suppresses wild-type virus infection", 《PROC NATL ACAD SCI U S A》, vol. 96, no. 19, XP002129421, DOI: 10.1073/pnas.96.19.10818 *

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