CN110982802B - 一种重组人sgk3蛋白激酶水凝胶及其制备方法与促进心肌再生的应用 - Google Patents

一种重组人sgk3蛋白激酶水凝胶及其制备方法与促进心肌再生的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种重组人SGK3蛋白激酶水凝胶及其制备方法与促进心肌再生的应用，涉及生物医学技术领域。该可注射水凝胶由成胶前体分子预聚物溶液与重组人SGK3蛋白激酶按一定比例混合而成。重组人SGK3蛋白激酶由SGK3蛋白激酶序列与穿膜肽序列通过连接肽连接而成，局部给药后，SGK3蛋白激酶可通过激活细胞增殖的关键通路来调节细胞周期进展，促进心肌梗死后的心肌再生修复，减少瘢痕面积，改善心功能。此外，体温下的液相水凝胶发生固相转化后，不仅有助于重组人SGK3蛋白激酶的缓慢释放而持续发挥作用，也为再生的心肌细胞提供支撑。

Description

一种重组人SGK3蛋白激酶水凝胶及其制备方法与促进心肌再生的应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体而言，涉及一种以水凝胶为载体的重组人SGK3蛋白激酶产品及促进心肌再生的应用。
背景技术
急性心肌梗死是世界范围内导致死亡的主要原因之一，极大地增加了社会负担。随着医疗技术的进步，虽然药物溶栓、经皮冠状动脉介入治疗及冠状动脉旁路移植等早期再灌注手段可以迅速恢复缺血区的血流，挽救濒死的心肌细胞，提高患者的生存率，然而再灌注并不能使已坏死的心肌恢复活性。在幸存的心梗患者中，坏死的心肌组织被瘢痕组织取代，这势必会导致心室重构、心力衰竭甚至死亡。药物治疗虽然可以改善心功能，延缓病程，但终究无法改变疾病转归，因此实现心肌细胞的有效再生、减少心肌梗死后的瘢痕面积对逆转或减缓心肌梗死后的病情进展具有重要意义。
近年来研究发现，哺乳动物心肌细胞并未完全退出有丝分裂事件，而是保持着极低比例的自我分裂增殖能力：人类心肌细胞每年自我更新率在青春期约1％至老年期约0.45％。此外，新生小鼠一周内发生的心梗可引起已存在的心肌细胞增殖，并在1个月内实现心脏结构及功能的完全恢复，与新生小鼠相似，新生人类也可能具有修复心肌损伤和恢复损伤后心功能的潜在能力。这些结果表明，通过促进成人心肌梗死边缘区的心肌细胞内源性再生来实现心功能的恢复是可行的，为本发明提供了理论基础。
SGK(也被称为丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶)是在包括血清和糖皮质激素的几种刺激物的急性转录控制之下的丝氨酸/苏氨酸激酶的一个亚家族。在大多数脊椎动物包括人类中，存在由基因SGK1、SGK2和SGK3编码的三种同工型，其中SGK1基因已被最深入地研究。SGK1通过磷脂酰肌醇-3-激酶、磷酸肌醇依赖性激酶PDK1和哺乳动物的雷帕霉素靶点mTORC2被胰岛素和生长因子激活，并对转运、激素释放、神经兴奋能力、炎性、细胞增殖和凋亡的调控有贡献。研究显示，在离散的发育阶段和例如高血压、糖尿病性神经病变、缺血、创伤和神经变性疾病的病例状况两者，SGK1的表达受到调控(Lang等，2010The Journal ofPhysiology 588：3349-3354；Lang等，2013FASEB Journal.27(1)：3-12；Schoenebeck等，2005Molecular and Cellular Neurosciences30(2)：249-264)。SGK3激酶属于AGC家族的丝氨酸/苏氨酸激酶，在胚胎期心脏中主要定位于心肌细胞质，且在人和小鼠中具有高度同源性。
通过广泛检索国内外文献，尚未发现有文献报道SGK3蛋白激酶具有促进心肌细胞增殖或改善心功能的作用。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种促进心肌再生的重组人SGK3蛋白激酶水凝胶及其制备方法与应用。
本发明人长期致力于研发可促进心肌再生、改善心功能的药物，通过前期的不断研究，我们首次发现并证实SGK3在新生的哺乳动物心脏中高度表达，且其表达量在出生7天后显著降低。新生哺乳动物心肌梗死后，SGK3可与CDK9相互作用，通过调节下游靶基因的表达，影响细胞周期进展，进而促进心肌细胞增殖，减少瘢痕面积，改善心肌梗死后的心功能。
为使外源性SGK3顺利进入细胞内发挥作用，本发明人对SGK3蛋白激酶进行改造，提供一种促进心肌再生的重组人SGK3蛋白激酶，即将SGK3蛋白激酶与穿膜肽重组为融合蛋白。具体地，该重组蛋白由SGK3蛋白激酶序列和穿膜肽序列通过连接肽连接而成。
进一步优选地，如上所述促进心肌再生的重组人SGK3蛋白激酶，其中SGK3蛋白激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；其中穿膜肽选自如下的任意一个：TAT、MPG、MPGΔNLS、Stearyl-R8、Transportan、Pep-1。
进一步优选地，如上所述促进心肌再生的重组人SGK3蛋白激酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
为将局部注射的重组人SGK3蛋白激酶更高效且持续地在梗死周围区域发挥作用，本发明人在此利用生物组织工程学材料来解决这一难题，即提供一种含有重组人SGK3蛋白激酶的可注射水凝胶。
具体地，该水凝胶由所述重组人SGK3蛋白激酶与成胶前体分子预聚物溶液通过一定的配方混合而成。所述成胶前体分子为dFEFKdFEFKYRGD，其分子量为1612。上述的可注射水凝胶按重组人SGK3蛋白激酶与成胶前体分子的质量比为1：(1.9～2.1)制备后，注射入急性心肌梗死边缘区，液相的成胶前体分子在体温下发生液-固相转变，使包裹于其内的重组人SGK3蛋白激酶随着水凝胶降解而缓慢释放。
本发明在此提供了一种含有重组人SGK3蛋白激酶的可注射水凝胶制备方法，该方法步骤如下：
(1)A液配制：称取所述成胶前体分子粉末，室温下双蒸水充分溶解，并用碳酸氢钠调节pH于7.35-7.45后，将溶液定容至成胶前体分子浓度为18-22mg/mL，再过滤灭菌，备用。
(2)B液配制：取含有所述重组人SGK3蛋白激酶的无菌溶液，用无菌PBS定容至蛋白溶液浓度为9-11mg/mL，备用。
(3)水凝胶的制备：室温下将A液和B液混合，以移液器缓慢吹打混匀即得到可注射水凝胶。
本发明的第三个方面提供了上述重组人SGK3蛋白激酶水凝胶作为促进心肌再生药物在心肌病中的应用。所述的心肌病为急性心肌梗死、心肌缺血损伤、陈旧性心肌梗死、冠状动脉粥样硬化、心梗后心室重构、心肌缺血或梗死引起的心律失常中的一种或几种。所述的药物通过冠状动脉内注射或直接心肌注射给药。
与现有技术相比，本发明涉及的重组人SGK3蛋白激酶水凝胶具有如下优点和进步性：
(1)SGK3的心脏保护作用：本发明以SGK3蛋白激酶为作用核心，含SGK3蛋白激酶的融合蛋白借助体温下固相水凝胶的缓慢溶解而释放，其后SGK3蛋白激酶在与其相连的穿膜肽的介导下进入心肌细胞，通过作用于心肌细胞增殖的关键通路，发挥促进心肌细胞增殖和心肌再生修复的作用，进而减少梗死面积，抑制心脏重塑，改善心功能。
(2)以水凝胶为载体的独特作用：注射小分子水凝胶可为梗死后的心室提供机械支撑力，延缓心室重构，预防心室腔扩张；同时凝固后的水凝胶呈多孔隙状态，可为再生的心肌细胞提供支撑和空间，便于再生心肌细胞的生长从而促进心肌修复，是急性心肌梗死等心肌病的理想治疗模式。
(3)操作的易行性及安全性：本发明提供的心肌组织工程产品仅需局部注射操作，方便易行且安全性高，有效避免体外循环、异体心脏移植等手段所伴随的高风险。此外，注射后的重组人SGK3蛋白激酶在局部缓慢释放，可持续的发挥作用，为急性心肌梗死的生物学治疗提供了新的策略。
(4)心脏保护作用的疗效确切：实验显示，在急性心肌梗死小鼠的梗死区边缘注射本发明的重组人SGK3蛋白激酶水凝胶后，体温下水凝胶发生液-固相转变，SGK3随着水溶胶的降解而缓慢释放发挥功效，促进心肌细胞内源性再生，减少瘢痕面积，最终抑制心脏重塑，显著提高心功能。
附图说明
图1为构建的pFastBacHTA-SGK3昆虫细胞载体及酶切位点；
图2为制备的高浓度重组人SGK3蛋白激酶的电泳图；
图3为小鼠心肌局部注射重组人SGK3蛋白激酶水凝胶7天后心肌SGK3的表达；
图4为应用重组人SGK3蛋白激酶水凝胶可以明显促进小鼠MI后心功能的恢复；
图5为应用重组人SGK3蛋白激酶水凝胶可以显著减少小鼠MI后的梗死面积(A.TTC)和纤维化程度(B.masson染色)；
图6为应用重组人SGK3蛋白激酶水凝胶可以促进小鼠MI后心肌细胞增殖，包括DNA合成(A,EDU+)，细胞周期活性(B,Ki67+)，有丝分裂(C,PH3+),胞质分裂(D,Aurora B+)。
具体实施方式
下面通过具体的实施例和附图进一步对本发明的技术实施和技术效果进行详细说明，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为对本发明适用范围的一种限制。实施例中未注明具体技术操作步骤或操作条件者，均按照本领域内文献所描述的一般技术或条件进行，或按照相关产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1具有生物活性的重组人SGK3蛋白激酶的制备
1.TAT-SGK3(核苷酸序列)如SEQ NO.3所示。
2.构建pFastBacHTA-SGK3昆虫细胞载体
Bac-to-BacHTVectorKit设计用于在大肠杆菌(E.coli)中生成杆状病毒载体后，在Sf9、Sf21或HighFive细胞中表达和纯化带组氨酸标签的重组蛋白。pFastBacHT载体具有以下特点：(1)用于表达蛋白质的多角体强启动子；(2)用于简化克隆的三个读码框；(3)用于轻松纯化重组融合蛋白的N-端6xHis标签；(4)用于在蛋白质纯化后去除组氨酸标签的TEV蛋白酶切割位点。
重组载体的构建过程
(1)质粒设计：
pUCori，F1ori终止子:SV40poly(A)signal；酶切位点5’BamHI，3’HindIII；TAT-SGK3引物序列：
F：GAGGAGGCGGCTCTATGCAAAGAGATCACACCAT
R：GAGCCGCCTCCTCCTCACAAAAATAAGTCT
(2)PCR扩增TAT-SGK3片段，并进行鉴定纯化
使用PrimeSTARHS DNAPolymerase试剂盒，体系条件如下：
PCR50ul反应体系(冰上进行)：
Figure BDA0002334021720000051
引物各稀释到10nmol/ul浓度加入到反应体系中。
PCR反应条件：
Figure BDA0002334021720000052
PCR出来的产物进行纯化
纯化步骤：
bindingbuffer，12000rpm离心1分钟
Washingbuffer12000rpm，1min清洗两次
再用20-50ul的水洗脱下来
(3)连接载体与TAT-SGK3，进行重组
Figure BDA0002334021720000061
MultiS One Step Cloning Kit试剂盒进行重组(编号：C113)：
每个片段最适使用量＝[0.02×片段碱基对数]ng
例如，将长度分别为0.5kb、1kb、2kb的插入片段克隆至长度为5kb的克隆载体时，载体与各片段最适使用量为：
线性化克隆载体最适使用量：0.02×5000＝100ng；
0.5kb插入片段最适使用量：0.02×500＝10ng；
1kb插入片段最适使用量：0.02×1000＝20ng；
2kb插入片段最适使用量：0.02×2000＝40ng；
A.线性化克隆载体的使用量应在50ng-200ng之间。当使用上述公式计算DNA最适使用量超出这个范围时，直接选择最低/最高使用量即可。
B.各插入片段的使用量应大于10ng。当使用上述公式计算最适使用量低于这个值时，直接使用10ng即可。
C.线性化克隆载体和插入片段扩增产物不进行DNA纯化直接使用时，加入总体积应不超过反应体系体积的1/5，即4μl。
重组反应，于冰上配置以下反应体系：
Figure BDA0002334021720000062
为了确保加样的准确性，在配置重组反应体系前可将线性化载体与插入片段进行适当稀释，个组分加样量不能低于1ul
(4)重组产物鉴定
PCR鉴定
测序鉴定
构建好的载体信息及酶切位点如图1所示。
3.DH10Bac感受态细胞转化
(1)取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，置于冰浴中。(一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μl，可以根据实际情况分装使用。应注意所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。)以下实验以100ul感受态细胞为例。
(2)向感受态细胞悬液中加入1-10ng的pFastBacHTA-SGK3重组质粒，轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置30分钟。
(3)将离心管置于42℃水浴中放置30秒，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2分钟，该过程不要摇动离心管。
(4)向每个离心管中加入900ul无菌的SOC(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm，摇床振荡培养4小时。
(5)用SOC培养基进行10倍梯度稀释，如分成3个稀释梯度10-1，10-2，10-3。
(6)取100ul的各个梯度的培养物用于涂布。等平板中的液体完全吸收后，倒置平板，37℃培养24-48小时。
(7)保留剩余的菌液于4℃冰箱中，视平板上菌落生长情况决定去留。
(8)选择4个隔离良好的大的(>1mm)白色菌落，再次涂板划线，至少生长16小时；
(9)过夜培养；
(10)选取重组成功的菌落(白色)PCR验证重组。
(11)验证引物为：M13-F：CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG
M13-R：AGCGGATAACAATTTCACACAGG
PCR鉴定出的片段长度为2.3kb+插入片段长度，若能鉴定出则代表转化成功，病毒体已和质粒成功连接。
4.Bacmids的提取
使用阳性克隆的midiprep(Qiagen试剂盒，货号：12243)，用无菌水洗脱(对于常规的miniprep柱，重组bacmid太大)。将纯bacmid进行分装，冷冻至-80C。其能快速、高效产生的重组AcMNPV病毒。取杆状病毒(baculovirus)和质粒(plasmid)的英文字头字尾命名为Bacmid，即杆状病毒质粒之意。该载体可像质粒一样在大肠杆菌中生长，又对鳞翅目昆虫细胞具有感染性。
5.bacmids转染Sf9细胞
(1)使用CELLFECTIN试剂盒(gibco，货号：10362100)将bacmids转染Sf9细胞。
(2)转染后的病毒滴度应在2-4×107pfu/ml左右。再进行两次转染，病毒的滴度将超过109pfu/ml。使用转染病毒三次过后的细胞检测蛋白的表达(2.5-3×106个细胞，25ml培养液，15cm皿)。
6.蛋白的提取
(1)将125毫升sf9细胞培养基加入在锥形玻璃瓶中,添加50～100μl的病毒滴度109pfu/ml的sf9细胞(转染三到四次过后)，在sf9培养箱中培养三天。
(2)加入裂解液充分裂解。
7.纯化蛋白
(1)将Ni-NTAslurry放入树脂中并进行清洗。
(2)将lysate-Ni-NTA混合物分步装入5ml的塑料柱中，直到所有混合物装入。此时，如果蛋白质被EGFP标记，由于EGFP标记的蛋白质与树脂结合，树脂(原色为蓝色)会变成浅绿色。
(3)用2x8ml缓冲液清洗树脂。如果egfp标记蛋白的树脂结合良好，则洗涤后的树脂保持浅绿色。
(4)添加0.75ml洗脱缓冲液到树脂中洗脱蛋白质，标记为(E1)。此时，如果洗脱良好，树脂的颜色会变回蓝色。
(5)继续加入4×0.75ml洗脱缓冲液，收集E2、E3、E4、E5。E1-E5各20μl用Biorad方法检测蛋白。如果蛋白质含量良好，检测结果将很快变为蓝色。
(6)E1-E5合并一起通过凝胶排阻旋转过滤器,总量约为3.75毫升(0.75毫升×5),自旋为20分钟,直到大约200μl体积减少。此时，浓缩的洗脱液为绿色，表明蛋白逐步成呈颗粒状。每次用吸管混合，避免蛋白质沉淀。然后加入2ml缓冲液，开始下一轮的操作，再次降至200ul，再重复两轮。最后，原始缓冲液的总稀释量约为18×10×10×10＝1.8×104。然后以将交换的洗脱液告诉旋转10分钟，小心地将上清转移到另一管中，不要搅动变性的蛋白颗粒。测量蛋白质浓缩的OD600值,在液氮中快速冻结并存储在-80℃。
8.蛋白质的验证
(1)蛋白提取后跑胶考染、银染；
(2)WB跑flag、重组人SGK3等与考染结果相互验证，验证蛋白纯度(见图2)。
实施例2重组人SGK3蛋白激酶水凝胶的制备
(1)称取成胶前体分子粉末20mg，室温下用800μL双蒸水充分溶解。用0.22μm滤菌器过滤溶解液灭菌，用无菌碳酸氢钠粉末将pH调节至7.4，并将溶解液的总体积补至1000ul(以下称A液)。
(2)从-80℃冰箱中取出制备好的已知浓度的重组人SGK3蛋白激酶溶液于冰上溶解，取含有10mg蛋白激酶的溶液，用无菌PBS将蛋白溶液的总体积补至1000ul(以下称B液)
(3)室温下将A液和B液各1000ul混合，以移液器缓慢吹打混匀，即得到小分子水凝胶-重组人SGK3蛋白激酶混合物，并须立即使用。
实施例3重组人SGK3蛋白激酶水凝胶在促进心肌再生修复的应用
1.小鼠急性心梗模型的制备及给药
采用50只8周龄(P56)雄性小鼠，予以1.2070Avertin腹腔注射(/kg)麻醉，气管插管后予以小动物呼吸机进行人工通气。采用眼科剪沿左侧第四肋肋间隙剪开皮肤，眼科镊钝性分离肋间肌肉后进入胸腔，暴露左心耳，采用6-0自左心耳最下缘进针，心室前壁心肌变苍白，自肺动脉圆锥与左心耳交界处出针，结扎LAD缝合线观察左提示结扎正确。手术者上提结扎线两端以固定心脏位置，由助手持胰岛素针，选取左心室前壁心肌变苍白的类圆形区域边缘的上方、左侧、右侧进行心肌内注射30-50uL水凝胶预混液。实验分组：SGK3凝胶组(n＝25)，注射重组人SGK3蛋白激酶水凝胶(实施例2制备)。对照组(n＝25)，单纯注射不含重组人SGK3蛋白激酶的水凝胶。所注射的水凝胶经台盼蓝预染。而后，采用6-0缝合线逐层缝合肋间肌与皮肤切口。术闭后将小鼠置于恒温台上待其苏醒。心梗术后第4天行心脏超声检测心梗损伤模型构建成功。
本实施方式的重组人SGK3蛋白激酶水凝胶注射入心肌梗死边缘处，体温下凝胶液-固相转变的发生，从而将SGK3包裹在小分子水凝胶里，随着水凝胶的降解而缓慢释放。
2.重组人SGK3蛋白激酶水凝胶在急性心肌梗死再生修复中的应用评估
术后22天SGK3凝胶组存活21只，单纯凝胶组存活16只。应用心超评估心梗小鼠心功能发现，相比于单纯凝胶对照组，SGK3凝胶组小鼠的EF值、FS值显著提高，表明SGK3水凝胶可以明显促进小鼠MI后心功能的恢复(见图4)。
处死小鼠，取新鲜心脏组织行TTC染色及masson染色发现SGK3凝胶组小鼠较单纯凝胶组的心肌梗死面积以及纤维化程度显著减少(见图5)。
取新鲜心梗边缘区组织制作石蜡切片或冰冻切片，分别进行EDU、Ki67、PH3及Aurora B染色发现，SGK3凝胶组小鼠的梗死边缘区的心肌细胞的DNA合成、细胞周期活性、有丝分裂及胞质分裂显著增多，提示重组人SGK3蛋白激酶水凝胶可以促进小鼠MI后心肌细胞的增殖(见图6)。
以上结果说明，重组人SGK3蛋白激酶水凝胶可促进心肌再生修复，减少梗死面积，抑制心脏重构，改善心脏功能。本实施方式表明重组人SGK3蛋白激酶水凝胶可作为急性心肌梗死后心肌再生修复治疗的新策略。
序列表
<110> 王连生
<120> 一种重组人SGK3蛋白激酶水凝胶及其制备方法与促进心肌再生的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 496
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 1
Met Gln Arg Asp His Thr Met Asp Tyr Lys Glu Ser Cys Pro Ser Val
1               5                   10                  15
Ser Ile Pro Ser Ser Asp Glu His Arg Glu Lys Lys Lys Arg Phe Thr
            20                  25                  30
Val Tyr Lys Val Leu Val Ser Val Gly Arg Ser Glu Trp Phe Val Phe
        35                  40                  45
Arg Arg Tyr Ala Glu Phe Asp Lys Leu Tyr Asn Thr Leu Lys Lys Gln
    50                  55                  60
Phe Pro Ala Met Ala Leu Lys Ile Pro Ala Lys Arg Ile Phe Gly Asp
65                  70                  75                  80
Asn Phe Asp Pro Asp Phe Ile Lys Gln Arg Arg Ala Gly Leu Asn Glu
                85                  90                  95
Phe Ile Gln Asn Leu Val Arg Tyr Pro Glu Leu Tyr Asn His Pro Asp
            100                 105                 110
Val Arg Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Pro Lys His Gln Ser Asp Pro
        115                 120                 125
Ser Glu Asp Glu Asp Glu Arg Ser Ser Gln Lys Leu His Ser Thr Ser
    130                 135                 140
Gln Asn Ile Asn Leu Gly Pro Ser Gly Asn Pro His Ala Lys Pro Thr
145                 150                 155                 160
Asp Phe Asp Phe Leu Lys Val Ile Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys Val
                165                 170                 175
Leu Leu Ala Lys Arg Lys Leu Asp Gly Lys Phe Tyr Ala Val Lys Val
            180                 185                 190
Leu Gln Lys Lys Ile Val Leu Asn Arg Lys Glu Gln Lys His Ile Met
        195                 200                 205
Ala Glu Arg Asn Val Leu Leu Lys Asn Val Lys His Pro Phe Leu Val
    210                 215                 220
Gly Leu His Tyr Ser Phe Gln Thr Thr Glu Lys Leu Tyr Phe Val Leu
225                 230                 235                 240
Asp Phe Val Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Gln Arg Glu Arg
                245                 250                 255
Ser Phe Pro Glu His Arg Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ala Ser
            260                 265                 270
Ala Leu Gly Tyr Leu His Ser Ile Lys Ile Val Tyr Arg Asp Leu Lys
        275                 280                 285
Pro Glu Asn Ile Leu Leu Asp Ser Val Gly His Val Val Leu Thr Asp
    290                 295                 300
Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Ala Ile Ser Asp Thr Thr Thr Thr
305                 310                 315                 320
Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val Ile Arg Lys Gln
                325                 330                 335
Pro Tyr Asp Asn Thr Val Asp Trp Trp Cys Leu Gly Ala Val Leu Tyr
            340                 345                 350
Glu Met Leu Tyr Gly Leu Pro Pro Phe Tyr Cys Arg Asp Val Ala Glu
        355                 360                 365
Met Tyr Asp Asn Ile Leu His Lys Pro Leu Ser Leu Arg Pro Gly Val
    370                 375                 380
Ser Leu Thr Ala Trp Ser Ile Leu Glu Glu Leu Leu Glu Lys Asp Arg
385                 390                 395                 400
Gln Asn Arg Leu Gly Ala Lys Glu Asp Phe Leu Glu Ile Gln Asn His
                405                 410                 415
Pro Phe Phe Glu Ser Leu Ser Trp Ala Asp Leu Val Gln Lys Lys Ile
            420                 425                 430
Pro Pro Pro Phe Asn Pro Asn Val Ala Gly Pro Asp Asp Ile Arg Asn
        435                 440                 445
Phe Asp Thr Ala Phe Thr Glu Glu Thr Val Pro Tyr Ser Val Cys Val
    450                 455                 460
Ser Ser Asp Tyr Ser Ile Val Asn Ala Ser Val Leu Glu Ala Asp Asp
465                 470                 475                 480
Ala Phe Val Gly Phe Ser Tyr Ala Pro Pro Ser Glu Asp Leu Phe Leu
                485                 490                 495
<210> 2
<211> 548
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser Arg Lys
1               5                   10                  15
Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser Arg Lys Lys Arg
            20                  25                  30
Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
        35                  40                  45
Gly Gly Gly Ser Met Gln Arg Asp His Thr Met Asp Tyr Lys Glu Ser
    50                  55                  60
Cys Pro Ser Val Ser Ile Pro Ser Ser Asp Glu His Arg Glu Lys Lys
65                  70                  75                  80
Lys Arg Phe Thr Val Tyr Lys Val Leu Val Ser Val Gly Arg Ser Glu
                85                  90                  95
Trp Phe Val Phe Arg Arg Tyr Ala Glu Phe Asp Lys Leu Tyr Asn Thr
            100                 105                 110
Leu Lys Lys Gln Phe Pro Ala Met Ala Leu Lys Ile Pro Ala Lys Arg
        115                 120                 125
Ile Phe Gly Asp Asn Phe Asp Pro Asp Phe Ile Lys Gln Arg Arg Ala
    130                 135                 140
Gly Leu Asn Glu Phe Ile Gln Asn Leu Val Arg Tyr Pro Glu Leu Tyr
145                 150                 155                 160
Asn His Pro Asp Val Arg Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Pro Lys His
                165                 170                 175
Gln Ser Asp Pro Ser Glu Asp Glu Asp Glu Arg Ser Ser Gln Lys Leu
            180                 185                 190
His Ser Thr Ser Gln Asn Ile Asn Leu Gly Pro Ser Gly Asn Pro His
        195                 200                 205
Ala Lys Pro Thr Asp Phe Asp Phe Leu Lys Val Ile Gly Lys Gly Ser
    210                 215                 220
Phe Gly Lys Val Leu Leu Ala Lys Arg Lys Leu Asp Gly Lys Phe Tyr
225                 230                 235                 240
Ala Val Lys Val Leu Gln Lys Lys Ile Val Leu Asn Arg Lys Glu Gln
                245                 250                 255
Lys His Ile Met Ala Glu Arg Asn Val Leu Leu Lys Asn Val Lys His
            260                 265                 270
Pro Phe Leu Val Gly Leu His Tyr Ser Phe Gln Thr Thr Glu Lys Leu
        275                 280                 285
Tyr Phe Val Leu Asp Phe Val Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu
    290                 295                 300
Gln Arg Glu Arg Ser Phe Pro Glu His Arg Ala Arg Phe Tyr Ala Ala
305                 310                 315                 320
Glu Ile Ala Ser Ala Leu Gly Tyr Leu His Ser Ile Lys Ile Val Tyr
                325                 330                 335
Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Ile Leu Leu Asp Ser Val Gly His Val
            340                 345                 350
Val Leu Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Ala Ile Ser Asp
        355                 360                 365
Thr Thr Thr Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val
    370                 375                 380
Ile Arg Lys Gln Pro Tyr Asp Asn Thr Val Asp Trp Trp Cys Leu Gly
385                 390                 395                 400
Ala Val Leu Tyr Glu Met Leu Tyr Gly Leu Pro Pro Phe Tyr Cys Arg
                405                 410                 415
Asp Val Ala Glu Met Tyr Asp Asn Ile Leu His Lys Pro Leu Ser Leu
            420                 425                 430
Arg Pro Gly Val Ser Leu Thr Ala Trp Ser Ile Leu Glu Glu Leu Leu
        435                 440                 445
Glu Lys Asp Arg Gln Asn Arg Leu Gly Ala Lys Glu Asp Phe Leu Glu
    450                 455                 460
Ile Gln Asn His Pro Phe Phe Glu Ser Leu Ser Trp Ala Asp Leu Val
465                 470                 475                 480
Gln Lys Lys Ile Pro Pro Pro Phe Asn Pro Asn Val Ala Gly Pro Asp
                485                 490                 495
Asp Ile Arg Asn Phe Asp Thr Ala Phe Thr Glu Glu Thr Val Pro Tyr
            500                 505                 510
Ser Val Cys Val Ser Ser Asp Tyr Ser Ile Val Asn Ala Ser Val Leu
        515                 520                 525
Glu Ala Asp Asp Ala Phe Val Gly Phe Ser Tyr Ala Pro Pro Ser Glu
    530                 535                 540
Asp Leu Phe Leu
545
<210> 3
<211> 1647
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgaaaaaagc ggagacagag acggcgggga ggcggcgggt ctcgaaaaaa gcggagacag 60
agacggcggg gcggaggggg cagccgaaaa aagcggagac agagacggcg gggaggcggc 120
gggtctggcg gagggggcag cggaggaggc ggctctatgc aaagagatca caccatggac 180
tacaaggaaa gctgcccaag tgtaagcatt cccagctccg atgaacacag agagaaaaag 240
aagaggttta ctgtttataa agttctggtt tcagtgggaa gaagtgaatg gtttgtcttc 300
aggagatatg cagagtttga taaactttat aacactttaa aaaaacagtt tcctgctatg 360
gccctgaaga ttcctgccaa gagaatattt ggtgataatt ttgatccaga ttttattaaa 420
caaagacgag caggactaaa cgaattcatt cagaacctag ttaggtatcc agaactttat 480
aaccatccag atgtcagagc attccttcaa atggacagtc caaaacacca gtcagatcca 540
tctgaagatg aggatgaaag aagttctcag aagctacact ctacctcaca gaacatcaac 600
ctgggaccgt ctggaaatcc tcatgccaaa ccaactgact ttgatttctt aaaagttatt 660
ggaaaaggca gctttggcaa ggttcttctt gcaaaacgga aactggatgg aaaattttat 720
gctgtcaaag tgttacagaa aaaaatagtt ctcaacagaa aagagcaaaa acatattatg 780
gctgaacgta atgtgctctt gaaaaatgtg aaacatccgt ttttggttgg attgcattat 840
tccttccaaa caactgaaaa gctttatttt gttctggatt ttgttaatgg aggggagctt 900
tttttccact tacaaagaga acggtccttt cctgagcaca gagctaggtt ttacgctgct 960
gaaattgcta gtgcattggg ttacttacat tccatcaaaa tagtatacag agacttgaaa 1020
ccagaaaata ttcttttgga ttcagtagga catgttgtct taacagattt tgggctttgt 1080
aaagaaggaa ttgctatttc tgacaccact accacatttt gtgggacacc agagtatctt 1140
gcacctgaag taattagaaa acagccctat gacaatactg tagattggtg gtgccttggg 1200
gctgttctgt atgaaatgct gtatggattg cctccttttt attgccgaga tgttgctgaa 1260
atgtatgaca atatccttca caaaccccta agtttgaggc caggagtgag tcttacagcc 1320
tggtccattc tggaagaact cctagaaaaa gacaggcaaa atcgacttgg tgccaaggaa 1380
gactttcttg aaattcagaa tcatcctttt tttgaatcac tcagctgggc tgaccttgta 1440
caaaagaaga ttccaccacc atttaatcct aatgtggctg gaccagatga tatcagaaac 1500
tttgacacag catttacaga agaaacagtt ccatattctg tgtgtgtatc ttctgactat 1560
tctatagtga atgccagtgt attggaggca gatgatgcat tcgttggttt ctcttatgca 1620
cctccttcag aagacttatt tttgtga 1647

Claims (4)

1.一种重组人SGK3蛋白激酶在制备促进心肌再生并治疗心肌病的药物中的应用，所述的重组人SGK3蛋白激酶由SGK3蛋白激酶和穿膜肽通过连接肽连接而成，所述的SGK3蛋白激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述的穿膜肽选自如下的任意一个：TAT、MPG、MPGΔNLS、Stearyl-R8、Transportan、Pep-1；所述的心肌病为急性心肌梗死。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组人SGK3蛋白激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组人SGK3蛋白激酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物通过冠状动脉内注射或直接心肌注射给药。
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