CN110904070A - 一种促进心肌再生的重组人chk1蛋白激酶水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

一种促进心肌再生的重组人chk1蛋白激酶水凝胶及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促进心肌再生的重组人CHK1蛋白激酶水凝胶及其制备方法与应用，属于生物医学技术领域。重组人CHK1蛋白激酶包括CHK1蛋白激酶序列和穿膜肽序列，注射给药后可通过激活心肌再生的关键通路来影响心肌细胞DNA合成、细胞周期、有丝分裂等进程，促进急性心肌梗死后的心肌再生修复，减少心肌梗死面积和纤维化，改善心功能的恢复。同时小分子水凝胶液态凝固形成的三维网状结构可为心室提供机械支撑力，延缓心室重构；小分子水凝胶的多孔隙结构，便于再生心肌细胞的生长从而促进心肌修复。

Description

一种促进心肌再生的重组人CHK1蛋白激酶水凝胶及其制备方 法与应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种以水凝胶为载体的重组人CHK1蛋白激酶产品及其应用。
背景技术
随着临床医疗技术的不断发展，急性心肌梗死患者的死亡率虽然有所降低，但其仍然是威胁人类生命的严重疾病。急性心梗发生后，尽早、充分、持续开通梗死相关冠状动脉，挽救缺血濒死心肌、保护心功能是目前治疗急性心肌梗死的主要策略。然而，目前无论药物溶栓、经皮冠状动脉介入治疗或冠状动脉旁路移植等心梗后再灌注手段，都只能改善心肌的血液供应，而并不能增加心肌细胞的数量或使已坏死的心肌再生，心梗发生后损伤区域仍由纤维瘢痕修复，将不可避免地降低心肌收缩力，从而在疾病远期预后中导致心脏重构、心功能障碍甚至心力衰竭终末事件的发生。实现心肌细胞的有效再生，减少瘢痕形成对逆转或延缓心肌梗死后疾病的进展具有重要意义，这也是目前心血管领域的重大难题之一。
长期以来研究者们一直认为，由于心肌细胞在出生后即进入终末分化而退出细胞周期，心肌损伤导致的心肌细胞减少是不可逆的过程。而近年来，越来越多的研究发现，成人心脏中心肌细胞仍然保持着极其微弱的自我增殖更新能力，这一发现为成人心肌梗死后探究促进梗死边缘区域残存心肌细胞自我增殖以缩小梗死区域、改善心肌损伤后心功能的治疗带来了希望，促进内源性心肌细胞增殖已经被证明是一个有应用前景的促进心肌再生的方法。
CHK1属于磷酸化蛋白激酶，定位于胞浆及胞核，在哺乳动物中高度保守，最初被发现为细胞发育中的一个关卡(checkpoint)；当细胞发生DNA损伤时，DNA损伤感应蛋白PIKKs(ATM或ATR)迅速磷酸化激活相应底物，包括CHK1、CHK2，启动DNA损伤反应。在哺乳动物胚胎早期，CHK1基因缺失可导致胚胎干细胞(ES)增殖严重缺陷甚至死亡，从而导致在小鼠胚胎着床期胚胎致死。
通过检索国内外文献，尚没有发现CHK1蛋白激酶可促进心肌细胞增殖或改善心功能恢复的文献报道。
发明内容
针对目前急性心肌梗死后心肌修复的治疗现状，本发明的目的在于提供一种促进心肌再生的重组人CHK1蛋白激酶水凝胶及其制备方法与应用。
本发明人长期致力于开发一种促进心肌再生的药物，令人意外地是，我们的研究首次发现并验证CHK1激酶在新生心肌中活性上升，其可通过mTORC1/P70S6K信号通路，影响细胞周期，加快DNA合成和有丝分裂等进程，促进心肌细胞增殖，进而促进急性心肌梗死后的心肌再生修复，减少心肌梗死面积，改善心功能的恢复。
基于此，本发明人对CHK1蛋白激酶进行改造后，首先提供了一种CHK1蛋白激酶与穿膜肽的融合蛋白，该融合蛋白包括CHK1蛋白激酶序列和穿膜肽序列，所述CHK1蛋白激酶序列和所述穿膜肽序列通过连接肽连接。
进一步优选地，如上所述的穿膜肽-CHK1蛋白激酶融合蛋白，其中的CHK1蛋白激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步优选地，如上所述的穿膜肽-CHK1蛋白激酶融合蛋白，其中的穿膜肽选自如下的任意一个：TAT、MPG、MPGΔNLS、Stearyl-R8、Transportan、Pep-1。
进一步优选地，如上所述的穿膜肽-CHK1蛋白激酶融合蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
为了将局部心肌注射的重组人CHK1蛋白激酶更高效、准确、持续地在急性心肌梗死周围区域发挥作用，本发明人利用生物组织工程学材料来解决这一难题，即提供一种促进心肌再生的重组人CHK1蛋白激酶水凝胶。
具体地，一种含有上述融合蛋白的可注射水凝胶，其由所述融合蛋白与成胶前体分子在水相中混匀而成，所述成胶前体分子为dFEFKdFEFKYRGD，其分子量为1612。CHK1融合蛋白与成胶前体分子预聚物溶液通过一定的配方相混合，然后注射入急性心肌梗死边缘处，体温下的成胶前体分子发生液-固相转变，从而将CHK1融合蛋白包裹在水凝胶里，随着水凝胶降解而缓慢释放。
进一步优选地，如上所述的可注射水凝胶，其中融合蛋白与成胶前体分子的质量比为1：(1.9～2.1)。
本发明还提供了一种CHK1蛋白激酶-穿膜肽融合蛋白的可注射水凝胶制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)称取所述成胶前体分子粉末，室温下用双蒸水充分溶解，过滤灭菌，用无菌碳酸氢钠调pH至7.3-7.5，按照成胶前体分子浓度为18-22mg/mL浓度的定容，得到A液，备用；
(2)取含有所述融合蛋白的溶液，加无菌PBS使蛋白溶液的浓度为9-11mg/mL，得到B液，备用；
(3)室温下将步骤(1)得到的A液和步骤(2)得到的B液混合，缓慢吹打混匀，得到可注射水凝胶。
本发明的第三个方面提供了上述CHK1蛋白激酶-穿膜肽融合蛋白在制备治疗心肌病的药物中的应用。所述的心肌病选自急性心肌梗死、心肌缺血损伤、陈旧性心肌梗死、冠状动脉粥样硬化、心梗后心室重构、心肌缺血或梗死引起的心律失常中的一种或几种。所述的药物通过冠状动脉内注射或直接心肌注射给药。
与现有技术相比，本发明涉及的重组人CHK1蛋白激酶水凝胶具有如下优点和进步性：
(1)本发明以小分子水凝胶作为载体携带重组人CHK1蛋白激酶，通过注射器注射至急性心肌梗死边缘处，液体形态注射入心脏局部的小分子水凝胶可以充分贴合心梗创面，体温下凝胶液-固相转变的发生，可将CHK1包裹在小分子水凝胶里，形成保护和支撑。在心肌局部，CHK1可随着小分子水凝胶降解而缓漫释放发挥功效，促进了心肌再生修复，减少梗死面积，抑制心脏重构，改善心脏功能。
(2)注射小分子水凝胶可为心室提供机械支撑力，延缓心室重构，预防心室腔扩张，同时凝固后的水凝胶呈多孔隙状态，可为再生的心肌细胞提供支撑和空间，便于再生心肌细胞的生长从而促进心肌修复，是急性心肌梗死等心肌病的最理想治疗模式。
(3)试验显示，急性心肌梗死小鼠局部心肌注射本发明的重组人CHK1蛋白激酶水凝胶后，CHK1可随着小分子水凝胶降解而缓漫释放发挥功效，最终促进了心肌再生，抑制心室重构，减少了梗死面积，显著提高了心功能。
(4)本发明仅需注射操作，方便易行，可以避免体外循环、异体心脏移植等治疗的高风险。另外，本发明操作简单、实施条件可行，提供了一种新的心肌组织工程产品，为急性心肌梗死的生物学治疗提供了新的策略。
附图说明
图1为构建的pFastBacHTA-CHEK1昆虫细胞载体及酶切位点；
图2为制备的高浓度重组人CHK1蛋白激酶的电泳验证；
图3为小鼠心肌局部注射重组人CHK1蛋白激酶水凝胶后7天后心肌CHK1的表达；
图4为应用重组人CHK1蛋白激酶水凝胶可以明显促进小鼠MI后心功能的恢复；
图5为应用重组人CHK1蛋白激酶水凝胶可以显著减少小鼠MI后的梗死面积(A.TTC)和纤维化程度(B.masson染色)；
图6为应用重组人CHK1蛋白激酶水凝胶可以促进小鼠MI后心肌细胞增殖，包括DNA合成(A,EDU+),细胞周期活性(B,Ki67+)，有丝分裂(C,PH3+),胞质分裂(D,Aurora B+)。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明的技术方案和技术效果作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。另外，实施例中未注明具体技术操作步骤或条件者，均按照本领域内的文献所描述的一般技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1具有生物活性的重组人CHK1蛋白激酶的制备
1.>TAT-CHEK1(核苷酸序列)如SEQ NO.3所示。
2.构建pFastBacHTA-CHEK1昆虫细胞载体
Bac-to-BacHTVectorKit设计用于在大肠杆菌(E.coli)中生成杆状病毒载体后，在Sf9、Sf21或HighFive细胞中表达和纯化带组氨酸标签的重组蛋白。pFastBacHT载体具有以下特点：(1)用于表达蛋白质的多角体强启动子；(2)用于简化克隆的三个读码框；(3)用于轻松纯化重组融合蛋白的N-端6xHis标签；(4)用于在蛋白质纯化后去除组氨酸标签的TEV蛋白酶切割位点。
重组载体的构建过程
(1)质粒设计：
pUCori，F1ori终止子:SV40poly(A)signal；酶切位点5’BamHI，3’HindIII；TAT-CHEK1引物序列：
F：CTGTATTTTCAGGGCGCCATGGATCCCATGGACTACAAGGACGACG
R：CCTCTAGTACTTCTCGACAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCC
(2)PCR扩增TAT-CHEK1片段，并进行鉴定纯化
使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase试剂盒，体系条件如下：
引物各稀释到10nmol/ul浓度加入到反应体系中。(引物稀释到标准浓度)
PCR50ul反应体系(冰上进行)：
Figure BDA0002304806220000051
PCR反应条件：
Figure BDA0002304806220000052
PCR出来的产物进行纯化
纯化步骤：
binding buffer，12000rpm离心1分钟
Washing buffer12000rpm，1min清洗两次
再用20-50ul的水洗脱下来
(3)连接载体与TAT-CHKE1，进行重组
Figure BDA0002304806220000053
MultiS One Step Cloning Kit试剂盒进行重组(编号：C113)：
每个片段最适使用量＝[0.02×片段碱基对数]ng
例如，将长度分别为0.5kb、1kb、2kb的插入片段克隆至长度为5kb的克隆载体时，载体与各片段最适使用量为：
线性化克隆载体最适使用量：0.02×5000＝100ng；
0.5kb插入片段最适使用量：0.02×500＝10ng；
1kb插入片段最适使用量：0.02×1000＝20ng；
2kb插入片段最适使用量：0.02×2000＝40ng；
A.线性化克隆载体的使用量应在50ng-200ng之间。当使用上述公式计算DNA最适使用量超出这个范围时，直接选择最低/最高使用量即可。
B.各插入片段的使用量应大于10ng。当使用上述公式计算最适使用量低于这个值时，直接使用10ng即可。
C.线性化克隆载体和插入片段扩增产物不进行DNA纯化直接使用时，加入总体积应不超过反应体系体积的1/5，即4μl。
重组反应：
于冰上配置以下反应体系：
Figure BDA0002304806220000061
为了确保加样的准确性，在配置重组反应体系前可将线性化载体与插入片段进行适当稀释，个组分加样量不能低于1ul
(4)重组产物鉴定
PCR鉴定
测序鉴定
构建好的载体信息及酶切位点如图1所示。
3.DH10Bac感受态细胞转化
(1)取感受态细胞置于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，置于冰浴中。(一次转化感受态细胞的建议用量为50-100μl，可以根据实际情况分装使用。应注意所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。)以下实验以100ul感受态细胞为例。
(2)向感受态细胞悬液中加入1-10ng的pFastBacHTA-CHEK1重组质粒，轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置30分钟。
(3)将离心管置于42℃水浴中放置30秒，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2分钟，该过程不要摇动离心管。
(4)向每个离心管中加入900ul无菌的SOC(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm，摇床振荡培养4小时。
(5)用SOC培养基进行10倍梯度稀释，如分成3个稀释梯度10-1，10-2，10-3。
(6)取100ul的各个梯度的培养物用于涂布。等平板中的液体完全吸收后，倒置平板，37℃培养24-48小时。
(7)保留剩余的菌液于4℃冰箱中，视平板上菌落生长情况决定去留。
(8)选择4个隔离良好的大的(>1mm)白色菌落，再次涂板划线，至少生长16小时；
(9)过夜培养；
(10)选取重组成功的菌落(白色)PCR验证重组。
(11)验证引物为：M13-F：CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG
M13-R：AGCGGATAACAATTTCACACAGG
PCR鉴定出的片段长度为2.3kb+插入片段长度，若能鉴定出则代表转化成功，病毒体已和质粒成功连接。
4.Bacmids的提取
使用阳性克隆的midiprep(Qiagen试剂盒，货号：12243)，用无菌水洗脱(对于常规的miniprep柱，重组bacmid太大)。将纯bacmid进行分装，冷冻至-80C。其能快速、高效产生的重组AcMNPV病毒。取杆状病毒(baculovirus)和质粒(plasmid)的英文字头字尾命名为Bacmid，即杆状病毒质粒之意。该载体可像质粒一样在大肠杆菌中生长，又对鳞翅目昆虫细胞具有感染性。
5.bacmids转染Sf9细胞
(1)使用CELLFECTIN试剂盒(gibco，货号：10362100)将bacmids转染Sf9细胞。
(2)转染后的病毒滴度应在2-4×107pfu/ml左右。再进行两次转染，病毒的滴度将超过109pfu/ml。使用转染病毒三次过后的细胞检测蛋白的表达(2.5-3×106个细胞，25ml培养液，15cm皿)。
6.蛋白的提取
(1)将125毫升sf9细胞培养基加入在锥形玻璃瓶中,添加50～100μl的病毒滴度109pfu/ml的sf9细胞(转染三到四次过后)，在sf9培养箱中培养三天。
(2)加入裂解液充分裂解。
7.纯化蛋白
(1)将Ni-NTAslurry放入树脂中并进行清洗。
(2)将lysate-Ni-NTA混合物分步装入5ml的塑料柱中，直到所有混合物装入。此时，如果蛋白质被EGFP标记，由于EGFP标记的蛋白质与树脂结合，树脂(原色为蓝色)会变成浅绿色。
(3)用2x8ml缓冲液清洗树脂。如果egfp标记蛋白的树脂结合良好，则洗涤后的树脂保持浅绿色。
(4)添加0.75ml洗脱缓冲液到树脂中洗脱蛋白质，标记为(E1)。此时，如果洗脱良好，树脂的颜色会变回蓝色。
(5)继续加入4×0.75ml洗脱缓冲液，收集E2、E3、E4、E5。E1-E5各20μl用Biorad方法检测蛋白。如果蛋白质含量良好，检测结果将很快变为蓝色。
(6)E1-E5合并一起通过凝胶排阻旋转过滤器,总量约为3.75毫升(0.75毫升×5),自旋为20分钟,直到大约200μl体积减少。此时，浓缩的洗脱液为绿色，表明蛋白逐步成呈颗粒状。每次用吸管混合，避免蛋白质沉淀。然后加入2ml缓冲液，开始下一轮的操作，再次降至200ul，再重复两轮。最后，原始缓冲液的总稀释量约为18×10×10×10＝1.8×104。然后以将交换的洗脱液告诉旋转10分钟，小心地将上清转移到另一管中，不要搅动变性的蛋白颗粒。测量蛋白质浓缩的OD600值,在液氮中快速冻结并存储在-80℃。
8.蛋白质的验证
(1)蛋白提取后跑胶考染、银染；
(2)WB跑flag、重组人CHK1等与考染结果相互验证，验证蛋白纯度(见图2)。
实施例2重组人CHK1蛋白激酶水凝胶的制备
(1)称取成胶前体分子粉末20mg，室温下用800μL双蒸水充分溶解。用0.22μm滤菌器过滤溶解液灭菌，用无菌碳酸氢钠粉末将pH调节至7.4，并将溶解液的总体积补至1000ul(以下称A液)。
(2)从-80℃冰箱中取出制备好的已知浓度的重组人CHK1蛋白激酶溶液于冰上溶解，取含有10mg蛋白激酶的溶液，用无菌PBS将蛋白溶液的总体积补至1000ul(以下称B液)
(3)室温下将A液和B液各1000ul混合，以移液器缓慢吹打混匀，即得到小分子水凝胶-重组人CHK1蛋白激酶混合物，并须立即使用。
实施例3重组人CHK1蛋白激酶水凝胶在促进心肌再生修复的应用
1.小鼠急性心梗模型的制备及给药
采用50只8周龄(P56)雄性小鼠，予以1.2070Avertin腹腔注射(/kg)麻醉，气管插管后予以小动物呼吸机进行人工通气。采用眼科剪沿左侧第四肋肋间隙剪开皮肤，眼科镊钝性分离肋间肌肉后进入胸腔，暴露左心耳，采用6-0自左心耳最下缘进针，心室前壁心肌变苍白，自肺动脉圆锥与左心耳交界处出针，结扎LAD缝合线观察左提示结扎正确。手术者上提结扎线两端以固定心脏位置，由助手持胰岛素针，选取左心室前壁心肌变苍白的类圆形区域边缘的上方、左侧、右侧进行心肌内注射30-50uL水凝胶预混液。实验分组：CHK1凝胶组(n＝25)，注射重组人CHK1蛋白激酶水凝胶(实施例2制备)。对照组(n＝25)，单纯注射不含重组人CHK1蛋白激酶的水凝胶。所注射的水凝胶经台盼蓝预染。而后，采用6-0缝合线逐层缝合肋间肌与皮肤切口。术闭后将小鼠置于恒温台上待其苏醒。心梗术后第4天行心脏超声检测心梗损伤模型构建成功。
本实施方式的重组人CHK1蛋白激酶水凝胶注射入心肌梗死边缘处，体温下凝胶液-固相转变的发生，从而将CHK1包裹在小分子水凝胶里，随着水凝胶的降解而缓慢释放。
2.重组人CHK1蛋白激酶水凝胶在急性心肌梗死再生修复中的应用评估
术后22天CHK1凝胶组存活20只，单纯凝胶组存活15只。应用心超评估心梗小鼠心功能发现，相比于单纯凝胶对照组，CHK1凝胶组小鼠的EF值、FS值显著提高，表明CHK1水凝胶可以明显促进小鼠MI后心功能的恢复(见图4)。
处死小鼠，取新鲜心脏组织行TTC染色及masson染色发现CHK1凝胶组小鼠较单纯凝胶组的心肌梗死面积以及纤维化程度显著减少(见图5)。
取新鲜心梗边缘区组织制作石蜡切片或冰冻切片，分别进行EDU、Ki67、PH3及Aurora B染色发现，CHK1凝胶组小鼠的梗死边缘区的心肌细胞的DNA合成、细胞周期活性、有丝分裂及胞质分裂显著增多，提示重组人CHK1蛋白激酶水凝胶可以促进小鼠MI后心肌细胞的增殖(见图6)。
以上结果说明，重组人CHK1蛋白激酶水凝胶可促进心肌再生修复，减少梗死面积，抑制心脏重构，改善心脏功能。本实施方式表明重组人CHK1蛋白激酶水凝胶可作为急性心肌梗死后心肌再生修复治疗的新策略。
序列表
<110> 王连生
<120> 一种促进心肌再生的重组人CHK1蛋白激酶水凝胶及其制备方法与应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 476
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 1
Met Ala Val Pro Phe Val Glu Asp Trp Asp Leu Val Gln Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Gly Ala Tyr Gly Glu Val Gln Leu Ala Val Asn Arg Val Thr Glu
20 25 30
Glu Ala Val Ala Val Lys Ile Val Asp Met Lys Arg Ala Val Asp Cys
35 40 45
Pro Glu Asn Ile Lys Lys Glu Ile Cys Ile Asn Lys Met Leu Asn His
50 55 60
Glu Asn Val Val Lys Phe Tyr Gly His Arg Arg Glu Gly Asn Ile Gln
65 70 75 80
Tyr Leu Phe Leu Glu Tyr Cys Ser Gly Gly Glu Leu Phe Asp Arg Ile
85 90 95
Glu Pro Asp Ile Gly Met Pro Glu Pro Asp Ala Gln Arg Phe Phe His
100 105 110
Gln Leu Met Ala Gly Val Val Tyr Leu His Gly Ile Gly Ile Thr His
115 120 125
Arg Asp Ile Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Asp Glu Arg Asp Asn Leu
130 135 140
Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val Phe Arg Tyr Asn Asn Arg
145 150 155 160
Glu Arg Leu Leu Asn Lys Met Cys Gly Thr Leu Pro Tyr Val Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Lys Arg Arg Glu Phe His Ala Glu Pro Val Asp Val Trp
180 185 190
Ser Cys Gly Ile Val Leu Thr Ala Met Leu Ala Gly Glu Leu Pro Trp
195 200 205
Asp Gln Pro Ser Asp Ser Cys Gln Glu Tyr Ser Asp Trp Lys Glu Lys
210 215 220
Lys Thr Tyr Leu Asn Pro Trp Lys Lys Ile Asp Ser Ala Pro Leu Ala
225 230 235 240
Leu Leu His Lys Ile Leu Val Glu Asn Pro Ser Ala Arg Ile Thr Ile
245 250 255
Pro Asp Ile Lys Lys Asp Arg Trp Tyr Asn Lys Pro Leu Lys Lys Gly
260 265 270
Ala Lys Arg Pro Arg Val Thr Ser Gly Gly Val Ser Glu Ser Pro Ser
275 280 285
Gly Phe Ser Lys His Ile Gln Ser Asn Leu Asp Phe Ser Pro Val Asn
290 295 300
Ser Ala Ser Ser Glu Glu Asn Val Lys Tyr Ser Ser Ser Gln Pro Glu
305 310 315 320
Pro Arg Thr Gly Leu Ser Leu Trp Asp Thr Ser Pro Ser Tyr Ile Asp
325 330 335
Lys Leu Val Gln Gly Ile Ser Phe Ser Gln Pro Thr Cys Pro Asp His
340 345 350
Met Leu Leu Asn Ser Gln Leu Leu Gly Thr Pro Gly Ser Ser Gln Asn
355 360 365
Pro Trp Gln Arg Leu Val Lys Arg Met Thr Arg Phe Phe Thr Lys Leu
370 375 380
Asp Ala Asp Lys Ser Tyr Gln Cys Leu Lys Glu Thr Cys Glu Lys Leu
385 390 395 400
Gly Tyr Gln Trp Lys Lys Ser Cys Met Asn Gln Val Thr Ile Ser Thr
405 410 415
Thr Asp Arg Arg Asn Asn Lys Leu Ile Phe Lys Val Asn Leu Leu Glu
420 425 430
Met Asp Asp Lys Ile Leu Val Asp Phe Arg Leu Ser Lys Gly Asp Gly
435 440 445
Leu Glu Phe Lys Arg His Phe Leu Lys Ile Lys Gly Lys Leu Ile Asp
450 455 460
Ile Val Ser Ser Gln Lys Ile Trp Leu Pro Ala Thr
465 470 475
<210> 2
<211> 527
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser Arg Lys
1 5 10 15
Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser Arg Lys Lys Arg
20 25 30
Arg Gln Arg Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
35 40 45
Gly Gly Gly Ser Ala Val Pro Phe Val Glu Asp Trp Asp Leu Val Gln
50 55 60
Thr Leu Gly Glu Gly Ala Tyr Gly Glu Val Gln Leu Ala Val Asn Arg
65 70 75 80
Val Thr Glu Glu Ala Val Ala Val Lys Ile Val Asp Met Lys Arg Ala
85 90 95
Val Asp Cys Pro Glu Asn Ile Lys Lys Glu Ile Cys Ile Asn Lys Met
100 105 110
Leu Asn His Glu Asn Val Val Lys Phe Tyr Gly His Arg Arg Glu Gly
115 120 125
Asn Ile Gln Tyr Leu Phe Leu Glu Tyr Cys Ser Gly Gly Glu Leu Phe
130 135 140
Asp Arg Ile Glu Pro Asp Ile Gly Met Pro Glu Pro Asp Ala Gln Arg
145 150 155 160
Phe Phe His Gln Leu Met Ala Gly Val Val Tyr Leu His Gly Ile Gly
165 170 175
Ile Thr His Arg Asp Ile Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Asp Glu Arg
180 185 190
Asp Asn Leu Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val Phe Arg Tyr
195 200 205
Asn Asn Arg Glu Arg Leu Leu Asn Lys Met Cys Gly Thr Leu Pro Tyr
210 215 220
Val Ala Pro Glu Leu Leu Lys Arg Arg Glu Phe His Ala Glu Pro Val
225 230 235 240
Asp Val Trp Ser Cys Gly Ile Val Leu Thr Ala Met Leu Ala Gly Glu
245 250 255
Leu Pro Trp Asp Gln Pro Ser Asp Ser Cys Gln Glu Tyr Ser Asp Trp
260 265 270
Lys Glu Lys Lys Thr Tyr Leu Asn Pro Trp Lys Lys Ile Asp Ser Ala
275 280 285
Pro Leu Ala Leu Leu His Lys Ile Leu Val Glu Asn Pro Ser Ala Arg
290 295 300
Ile Thr Ile Pro Asp Ile Lys Lys Asp Arg Trp Tyr Asn Lys Pro Leu
305 310 315 320
Lys Lys Gly Ala Lys Arg Pro Arg Val Thr Ser Gly Gly Val Ser Glu
325 330 335
Ser Pro Ser Gly Phe Ser Lys His Ile Gln Ser Asn Leu Asp Phe Ser
340 345 350
Pro Val Asn Ser Ala Ser Ser Glu Glu Asn Val Lys Tyr Ser Ser Ser
355 360 365
Gln Pro Glu Pro Arg Thr Gly Leu Ser Leu Trp Asp Thr Ser Pro Ser
370 375 380
Tyr Ile Asp Lys Leu Val Gln Gly Ile Ser Phe Ser Gln Pro Thr Cys
385 390 395 400
Pro Asp His Met Leu Leu Asn Ser Gln Leu Leu Gly Thr Pro Gly Ser
405 410 415
Ser Gln Asn Pro Trp Gln Arg Leu Val Lys Arg Met Thr Arg Phe Phe
420 425 430
Thr Lys Leu Asp Ala Asp Lys Ser Tyr Gln Cys Leu Lys Glu Thr Cys
435 440 445
Glu Lys Leu Gly Tyr Gln Trp Lys Lys Ser Cys Met Asn Gln Val Thr
450 455 460
Ile Ser Thr Thr Asp Arg Arg Asn Asn Lys Leu Ile Phe Lys Val Asn
465 470 475 480
Leu Leu Glu Met Asp Asp Lys Ile Leu Val Asp Phe Arg Leu Ser Lys
485 490 495
Gly Asp Gly Leu Glu Phe Lys Arg His Phe Leu Lys Ile Lys Gly Lys
500 505 510
Leu Ile Asp Ile Val Ser Ser Gln Lys Ile Trp Leu Pro Ala Thr
515 520 525
<210> 3
<211> 1581
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgaaaaaagc ggagacagag acggcgggga ggcggcgggt ctcgaaaaaa gcggagacag 60
agacggcggg gcggaggggg cagccgaaaa aagcggagac agagacggcg gggaggcggc 120
gggtctggcg gagggggcag cggaggaggc ggctctgcag tgccctttgt ggaagactgg 180
gacttggtgc aaaccctggg agaaggtgcc tatggagaag ttcaacttgc tgtgaataga 240
gtaactgaag aagcagtcgc agtgaagatt gtagatatga agcgtgccgt agactgtcca 300
gaaaatatta agaaagagat ctgtatcaat aaaatgctaa atcatgaaaa tgtagtaaaa 360
ttctatggtc acaggagaga aggcaatatc caatatttat ttctggagta ctgtagtgga 420
ggagagcttt ttgacagaat agagccagac ataggcatgc ctgaaccaga tgctcagaga 480
ttcttccatc aactcatggc aggggtggtt tatctgcatg gtattggaat aactcacagg 540
gatattaaac cagaaaatct tctgttggat gaaagggata acctcaaaat ctcagacttt 600
ggcttggcaa cagtatttcg gtataataat cgtgagcgtt tgttgaacaa gatgtgtggt 660
actttaccat atgttgctcc agaacttctg aagagaagag aatttcatgc agaaccagtt 720
gatgtttggt cctgtggaat agtacttact gcaatgctcg ctggagaatt gccatgggac 780
caacccagtg acagctgtca ggagtattct gactggaaag aaaaaaaaac atacctcaac 840
ccttggaaaa aaatcgattc tgctcctcta gctctgctgc ataaaatctt agttgagaat 900
ccatcagcaa gaattaccat tccagacatc aaaaaagata gatggtacaa caaacccctc 960
aagaaagggg caaaaaggcc ccgagtcact tcaggtggtg tgtcagagtc tcccagtgga 1020
ttttctaagc acattcaatc caatttggac ttctctccag taaacagtgc ttctagtgaa 1080
gaaaatgtga agtactccag ttctcagcca gaaccccgca caggtctttc cttatgggat 1140
accagcccct catacattga taaattggta caagggatca gcttttccca gcccacatgt 1200
cctgatcata tgcttttgaa tagtcagtta cttggcaccc caggatcctc acagaacccc 1260
tggcagcggt tggtcaaaag aatgacacga ttctttacca aattggatgc agacaaatct 1320
tatcaatgcc tgaaagagac ttgtgagaag ttgggctatc aatggaagaa aagttgtatg 1380
aatcaggtta ctatatcaac aactgatagg agaaacaata aactcatttt caaagtgaat 1440
ttgttagaaa tggatgataa aatattggtt gacttccggc tttctaaggg tgatggattg 1500
gagttcaaga gacacttcct gaagattaaa gggaagctga ttgatattgt gagcagccag 1560
aagatttggc ttcctgccac a 1581

Claims (10)

1.一种CHK1蛋白激酶与穿膜肽的融合蛋白，其特征在于，该融合蛋白包括CHK1蛋白激酶序列和穿膜肽序列，所述CHK1蛋白激酶序列和所述穿膜肽序列通过连接肽连接。
2.根据权利要求1所述的穿膜肽-CHK1蛋白激酶融合蛋白，其特征在于，所述的CHK1蛋白激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述的穿膜肽-CHK1蛋白激酶融合蛋白，其特征在于，所述的穿膜肽选自如下的任意一个：TAT、MPG、MPGΔNLS、Stearyl-R8、Transportan、Pep-1。
4.根据权利要求1所述的穿膜肽-CHK1蛋白激酶融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
5.根据权利要求1所述的穿膜肽-CHK1蛋白激酶融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
6.一种含有权利要求1所述融合蛋白的可注射水凝胶，其特征在于，由所述融合蛋白与成胶前体分子在水相中混匀而成，所述成胶前体分子为dFEFKdFEFKYRGD。
7.根据权利要求6所述的可注射水凝胶，其特征在于，所述融合蛋白与成胶前体分子的质量比为1：(1.9～2.1)。
8.一种根据权利要求6所述可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)称取所述成胶前体分子粉末，室温下用双蒸水充分溶解，过滤灭菌，用无菌碳酸氢钠调pH至7.3-7.5，按照成胶前体分子浓度为18-22mg/mL浓度的定容，得到A液，备用；
(2)取含有所述融合蛋白的溶液，加无菌PBS使蛋白溶液的浓度为9-11mg/mL，得到B液，备用；
(3)室温下将步骤(1)得到的A液和步骤(2)得到的B液混合，缓慢吹打混匀，得到可注射水凝胶。
9.权利要求1所述CHK1蛋白激酶与穿膜肽的融合蛋白在制备治疗心肌病的药物中的应用，所述的心肌病选自急性心肌梗死、心肌缺血损伤、陈旧性心肌梗死、冠状动脉粥样硬化、心梗后心室重构、心肌缺血或梗死引起的心律失常中的一种或几种。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的药物通过冠状动脉内注射或直接心肌注射给药。
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