CN103044556A

CN103044556A - 一种重组融合蛋白vip-tat及其应用

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Publication number: CN103044556A
Application number: CN2013100113895A
Authority: CN
Inventors: 余榕捷; 张华华
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-01-14
Filing date: 2013-01-14
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2033-01-14
Also published as: CN103880964A; CN103044556B; CN103880964B

Abstract

本发明公开了一种重组融合蛋白VIP-TAT及其应用。本发明重组融合蛋白VIP-TAT的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，编码该蛋白的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。本发明重组融合蛋白VIP-TAT具有VIP所不具备的生物学活性，包括：高效激活细胞内/细胞核定位的VIP受体，抑制结肠癌细胞HT29的增殖，可通过呼吸道吸收进入脑部，显著提高机体SOD水平及显著抗东莨菪碱诱导学习记忆损伤。这些活性使得VIP-TAT在预防与治疗结肠癌、抗脑部氧化损伤、抗学习记忆损伤以及预防和治疗老年痴呆方面具备VIP所不具备的应用前景。而且VIP-TAT可通过呼吸道吸入用药，改善了其用药途径，扩大其应用范围，极大地提高了VIP-TAT在脑部、肺部中的应用价值。

Description

一种重组融合蛋白VIP-TAT及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体地说，涉及一种重组融合蛋白VIP-TAT及其应用。

背景技术

血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide, VIP) 是1970年发现的具有显著扩张血管功能的神经肽，属于是促胰液素/胰高血糖素/胰泌素家族。VIP及其受体不仅分布在中枢神经系统和外周神经系统，在外周组织和器官，如心、肺、血管、胃肠道、胰腺、泪腺、泌尿生殖道等，也广泛分布。而且VIP及其受体还在免疫系统，如胸腺、淋巴，和免疫细胞中表达，具有免疫调节的功能。已有的研究发现：VIP具有调节循环系统（调节血压、增强心肌收缩力和扩张血管）、调节消化系统（促进消化上皮分泌和调节胃肠道蠕动），免疫调节（抗T细胞凋亡、调节免疫相关细胞因子的释放）及抗炎的作用。

VIP受体可分为3类：VPAC1，VPAC2和PAC1。VPAC1和VPAC2都是VIP和PACAP共同分享的受体，而PAC1则是和VIP结合较弱的受体，其与VIP的结合力是其与PACAP结合力的1/1000。已有研究表明，VPAC受体不仅分布在细胞膜上，而且在癌细胞，如乳腺癌细胞和结肠癌细胞的细胞内/细胞核和核膜上也有功能性的分布。而且已有发现表明VIP的各个受体可以通过内化内转移到细胞核上，然后介导不同于细胞膜上受体所介导的生物学功能。也就是说，激活细胞内/细胞膜上的VIP受体可产生与激活细胞膜表面受体不同的生物学功能。本发明首次将VIP与一穿膜肽TAT融合构建能够高效激活细胞内/细胞核膜上的VIP受体的新型多肽VIP-TAT，从而实现了其活性的突破——VIP-TAT具有天然VIP所不具备的生物学活性。

TAT 是一种蛋白转导域（Protein transduction domain，PTD），最初发现于HIV病毒TAT 蛋白中的具有穿膜功能的核心区；由11个氨基酸YGRKKRRQRRR组成，含有8个碱性氨基酸，生理条件下带较高的正电荷，并形成稳定的a螺旋结构。TAT具有强大的运载潜能，能将外源性蛋白质、DNA、RNA、化学药物等转运至细胞内，甚至可以穿越血脑屏障。此过程不受化合物／复合物分子类型和大小的限制，并且对宿主细胞没有显著毒副作用。

本研究首次构建了将VIP和TAT融合的新型融合蛋白VIP-TAT，并且发现其具备现有VIP所没有的新型生物学活性，包括：1）重组融合蛋白VIP-TAT可高效激活核转位的VIP受体；2）重组融合蛋白VIP-TAT抑制结肠癌细胞增殖；3）重组融合蛋白VIP-TAT可通过呼吸道高效吸收进入脑部；4）重组融合蛋白VIP-TAT显著提高血液及脑部超氧化物歧化酶（Super Oxygen Dehydrogenises，SOD）含量；5）融合蛋白VIP-TAT抗东莨菪碱诱导的学习记忆损伤的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组融合蛋白VIP-TAT及其应用。

一种重组融合蛋白VIP-TAT，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。编码重组融合蛋白VIP-TAT的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述重组融合蛋白VIP-TAT在制备激活细胞内/细胞核定位的VIP受体药物中的应用。

所述重组融合蛋白VIP-TAT在制备抑制结肠癌细胞增殖药物中的应用。

所述重组融合蛋白VIP-TAT在制备提高血液或脑部SOD含量药物中的应用。VIP-TAT可作为抗脑部氧化损伤和抗脑部衰老的药用。

所述重组融合蛋白VIP-TAT在制备抗东莨菪碱诱导学习记忆损伤药物中的应用。VIP-TAT可作为抗老年痴呆的药物。

所述重组融合蛋白VIP-TAT可通过呼吸道高效吸收进入机体血液和脑部的生物活性，VIP-TAT可通过鼻粘膜吸收，简化用药途径。

本发明首次实现重组的VIP和TAT融合的新型融合蛋白VIP-TAT的制备及生物学功能的研究。首次发现VIP-TAT具有和VIP显著不同的生物活性。

VIP-TAT具有的与VIP的区别如下：

	VIP	VIP-TAT
			1.对细胞内/细胞核上受体的激活	不可激活	可以穿过细胞膜，实现激活
2.对结肠癌细胞	增殖	抑制增殖
			3.提高机体SOD水平	没有显著作用	具有显著作用
4.对抗东莨菪碱诱导记忆损伤	短期用药有作用，长期用药具有副作用	短期、长期用药均具有显著作用
			5.通过呼吸道吸收进入脑部	效率很低	效率是VIP的10倍以上

鉴于VIP-TAT具有VIP所不具备的生物学活性，本发明具有如下有益效果：

1.本发明的重组融合蛋白VIP-TAT具有的高效细胞内/激活核转位的VIP受体的生物活性；这种活性是VIP-TAT具有与VIP不同的活性的生物学基础；这预示着随着研究的深入，VIP-TAT可能有更多的、不同于VIP的活性被发现。

2.细胞水平研究发现本发明的重组融合蛋白VIP-TAT抑制结肠癌的增殖，这表明VIP-TAT可能成为预防与治疗结肠癌的潜在药物。

3.动物实验结果发现，VIP-TAT显著提高机体SOD水平，表明VIP-TAT具有显著抗氧化的功能，VIP-TAT可作为抗脑部氧化损伤和抗脑部衰老的药用。

4.动物实验结果发现，不论短期或长期使用VIP-TAT，VIP-TAT均显著低抗东莨菪碱诱导的学习记忆损伤，表明其可以作为治疗记忆损伤、老年痴呆和神经损伤的潜在药物。

5.动物实验结果发现，VIP-TAT可通过喷雾法，呼吸道吸入进入机体，并穿越血脑屏障和气血屏障，这将不仅极大地提高其在脑部，眼部、肺部等部位的应用价值，而且可以尝试喷雾或鼻粘膜吸收，改善其用药途径和方便用药。

附图说明

图1为重组融合蛋白VIP-TAT结构示意图。

图2为重组融合蛋白VIP-TAT纯化的SDS-PAGE电泳图；

其中，M为蛋白marker，1为菌体IPTG诱导前，2为菌体IPTG诱导后，3为菌体IPTG诱导后破碎上清，4为上清过几丁质柱流出液，5为洗柱流出液， 6/7/8为硫醇切割后洗脱液（含目的蛋白），9为硫醇切割后柱填料上结合蛋白，10为目的多肽的westernblot鉴定。

图3为VIP-TAT和VIP进入细胞的荧光观察（绿色代表FITC荧光标记的多肽）。

图4为VIP-TAT和VIP对结肠癌HT29细胞活性的影响（*，P<0.01，VIP-TAT对于空白对照； # P<0.01，VIP对于空白对照）。

图5为VIP-TAT和VIP提高细胞核內cAMP水平的活性测定（*，P<0.01，VIP-TAT对于空白对照）。

图6为短期用药VIP-TAT和VIP抗东莨菪碱诱导学习记忆损伤活性（*，P<0.01，对于阴性对照； △, P<0.01，VIP-TAT对于VIP）。

图7-9为长期用药VIP-TAT和VIP抗东莨菪碱诱导学习记忆损伤活性，

图7为对延迟时间的作用，图8为对脑部丙二醛水平的作用，图9为对脑部乙酰胆碱酯酶活性的作用（*，P<0.01，对于阴性对照； △, P<0.01，VIP-TAT对于VIP）。

图10-11为长期用药VIP-TAT和VIP对SOD水平的影响，

图10为对脑部SOD水平的作用，图11为对血液中SOD水平的作用（*，P<0.01，VIP-TAT对于阴性对照； △, P<0.01，VIP-TAT对于阳性对照）。

图12-13为喷雾给药VIP-TAT和VIP通过呼吸道吸收效率的比较，

图12为多肽呼吸道吸入效率比较，图13为喷雾给药后多肽抗东莨菪碱诱导学习记忆损伤的作用（*，P<0.01，VIP-TAT对于TAT； △, P<0.01，VIP-TAT对于阴性性对照）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

实施例1 重组融合蛋白VIP-TAT的制备

本实施例重组融合蛋白VIP-TAT的制备，包括如下步骤：

1. VIP-TAT基因的扩增及克隆：

首先设计并合成4条引物（引物位置和方向可见图1）：

引物 F1： ACC GAT AAC TAT ACC CGT CTG CGT AAA CAG ATG GCG GTG AAA AAA TAT CTG AAC；

引物 R2： ACG TTT TTT ACG GCC ATA GTT CAG AAT GCT GTT CAG ATA TTT TTT CAC CGC CAT；

引物 F2： XXXXXXXX CAT ATG CAT AGC GAT GCG GTG TTT ACC GAT AAC TAT ACC CGT CTG；

引物 R2： XXXXXXXX CTC GAG ACG ACG ACG CTG ACG ACG TTT TTT ACG GCC ATA GTT CAG；

上述四条引物中，N代表保护碱基，CAT ATG为NdeI酶切位点，CTCGAG为XhoI酶切位点。

经过两步PCR：

（1）第一步PCR，以现有F1和R1经过变性退火及延伸，反应体系为：引物F1（0.01A/μL）1μL、引物R1（0.01A/μl）1μL、dNTP 10μL、10×TaKaRa Ex Buffer 10μL、TaKaRa Ex Taq酶1μL和H₂O 78μL；PCR反应条件为：94℃，4 min；94℃，45 sec、55℃，45 sec 、72℃，60 sec，1个循环；72℃，10 min；

（2）第二步PCR，以第一步PCR反应产物为模板，PCR反应体系为：引物F2（0.01A/μL）1μL、引物R2（0.01A/μl）1μL、第一步PCR反应液 1μL、dNTP 10μL、10×TaKaRa Ex Buffer 10μL、TaKaRa Ex Taq酶1μL和H₂O 76μL；PCR反应条件为：94℃，4 min；94℃，45 sec、58℃，45 sec 、72℃，60 sec，35个循环；72℃，10 min。

上述两步PCR所涉及到的试剂均为市售或者采用试剂盒配带的均可。

2.重组质粒的构建：

用NdeI和XhoI，将VIP-TAT基因克隆到质粒pKYB（市售）的NdeI和XhoI位点间，构建重组质粒pKY-VIP-TAT；

3.表达工程菌的构建：

重组质粒pKY-VIP-TAT转化表达宿主菌E.coliStrain ER2566（市售），构建表达工程菌pKY-VIP-TAT-ER；

4.诱导剂IPTG诱导由目的多肽、蛋白内含肽和几丁质结合域（Chitin binding domain, CBD）组成的“三元”融合蛋白的表达：

挑取单克隆于5mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基，摇菌培养过夜，以1∶20（体积比）接于1L含50mg/L卡那霉素的LB培养基，37℃摇菌至OD₆₀₀为0.5-0.8，加入诱导剂异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度1mmol/L，30℃诱导融合蛋白表达4h，离心收集菌体，重悬于60 mL 的溶液A（20mM Tris.HCl, 500mM NaCl, 1mM EDTA，pH8.0），然后超声破碎，20,000g离心30min，收集上清，作为后续纯化的上样样品。

5. 融合蛋白的纯化：

取10 mL几丁质珠装填2.5×10 cm层析柱，溶液A（20 mM Tris-HCl，0.5 M NaCl，1 mM EDTA，pH 8.0）洗柱；取上述上样样品以0.5 mL/min 的流速上样；溶液A以2 mL/min洗去杂蛋白，30mL溶液B（20 mM Tris-HCl，0.5 M NaCl，1 mM EDTA，50 mM β-巯基乙醇，pH 8.0）快速过柱，使β-巯基乙醇均匀分布并浸泡柱内填料，室温20℃诱导蛋白肽切割24h；溶液A洗脱目的多肽，分管收集，每2mL为一管，目的多肽大多存在于前10管中。

SDS-PAGE鉴定目的多肽，电泳结果如图2所示，从图中可以看出融合蛋白部分以可溶状态存在于破碎上清，并能有效与几丁质柱结合（过柱后目的带消失），经硫醇切割后，融合蛋白能有效释放目的多肽VIP-TAT，其电泳位置与预期相吻合；而柱填料上能够检测出原融合蛋白和切割后融合蛋白两种蛋白。

4℃透析过夜除去β-巯基乙醇。

重组多肽VIP-TAT经过抗VIP特异的单克隆抗体的westernblot检测发现其具备VIP的免疫原性（图2）。

实施例2 重组融合蛋白VIP-TAT可进入结肠癌HT29细胞，并与细胞内/细胞核上受体结合

利用FITC（异硫氰酸荧光素）标记试剂盒，对VIP-TAT和VIP分别进行荧光标记，分别将标记好的VIP-TAT和VIP与结肠癌细胞HT29共同孵育0.5h后，PBS洗涤细胞后，荧光共聚焦显微镜观察。结果如图3所示，VIP-TAT处理的细胞的细胞内/细胞核上有显著荧光信号，而VIP处理细胞的荧光信号仅在细胞表面。因此，此结果表明VIP-TAT有效进入细胞内，结合于细胞内/细胞核上，而VIP仍然停留的细胞膜上。

实施例3 重组融合蛋白VIP-TAT抑制结肠癌细胞HT29的增殖

将结肠癌细胞HT29铺板于96孔板，待细胞密度达到80%左右，改用无血清培养（饥饿培养）过夜，分别加入梯度浓度的VIP-TAT和VIP（1nM，10 nM，100nM，1000 nM）孵育，24小时后用MTT测定细胞活性。结果如图4所示，100nM和1000nM的VIP-TAT显著有效抑制HT29的增殖（P<0.01），100nM和1000nM的VIP则是显著促进其增殖（P<0.01）。分别分离1000nM的VIP-TAT和1000nM的VIP处理的细胞的细胞核，采用cAMP免疫测定试剂盒测定核內的cAMP的浓度，结果（如图5）发现，VIP-TAT有效提高核內cAMP的浓度（P<0.01），而VIP对核內的cAMP水平没有显著的影响。

实施例4 实验动物检测重组融合蛋白VIP-TAT的抗东莨菪碱诱导学习记忆损伤及提高机体SOD水平的功能

一次性用药实验：清洁级小鼠40只，体重25g, 随机分成四组，每组10只，分别为阳性组、阴性组、VIP组、VIP-TAT组。阳性组不做任何处理，其他各组分别注射PBS、100nmol/kg的VIP、100nmol/kg的VIP-TAT，注射后0.5h，除阳性组外各组小鼠注射东莨菪碱(3mg/kg)，半小时后，进行小鼠的避暗仪电击训练，每组训练5min,电压为80V，直到小鼠不进入暗室。第二天（训练24h后），将小鼠放入小鼠避暗仪，检测小鼠进入暗室的情况，记录各组小鼠进入暗室的延迟时间。延迟时间越长，说明记忆保存越好，延迟时间越短，则记忆破坏越严重。结果如图6所示，VIP-TAT能够有效延长小鼠进入暗室的时间（P<0.01，VIP-TAT组对于阴性对照组），说明其能有效提高小鼠记忆；而且VIP-TAT的活性显著比VIP强（P<0.01，VIP-TAT组对于VIP组）。

长期实验：清洁级小鼠40只，体重25g, 随机分成四组，每组10只，分别为阳性组、阴性组、VIP组、VIP-TAT组。阳性组不做任何处理，其他各组分别注射PBS、100nmol/kg的VIP、100nmol/kg的VIP-PTD；连续注射14天。第15天进行东莨菪碱注射——进行最后一次注射蛋白药物后半小时，对除阳性组外各组小鼠注射东莨菪碱(3mg/kg)，半小时后，进行小鼠的避暗仪电击训练，每组训练5min,电压为80V，直到小鼠不进入暗室。第16天（训练24h后），将小鼠放入小鼠避暗仪，检测小鼠进入暗室的情况，记录各组小鼠进入暗室的延迟时间。然后迅速眼眶采血采集小鼠血液，并处死小鼠取脑组织，对脑部所含乙酰胆碱酯酶、氧化指标丙二醛（MDA）、以及脑部和血液中SOD的水平进行检测。

结果如图7－9所示，VIP-TAT长期用药不仅显著有效增加延迟时间，提高记忆力，而且有效降低脑部的氧化产物丙二醛，并抑制可降解脑部神经传导介质乙酰胆碱的乙酰胆碱酯酶的活性，提高神经传导效率和敏感性。而长期VIP注射则表现出反作用的倾向。

对脑部和血液中SOD的水平检测发现（如图10－11所示），VIP-TAT不仅逆转东莨菪碱导致的SOD水平下降，而且对于正常的阳性对照组，也有显著的提高作用（P<0.01）；这表明VIP-TAT在机体内具有显著提高SOD水平的功能。

实施例5 重组融合蛋白VIP-TAT通过呼吸道吸收的活性

利用FITC（异硫氰酸荧光素）标记试剂盒，对VIP-TAT，VIP进行荧光标记，测定标记蛋白浓度及标记蛋白荧光值，计算多肽标记效率（即每mol多肽所携带FITC的值）。KM小鼠按体重随机分两组组，每组10只，分别放置于一个50cm×25cm×25cm的封闭箱中，雾化器分别雾化FITC标记的VIP-TAT（100nM/kg）和VIP（100nM/kg）导入封闭箱中，给药1h后，眼眶采血，用荧光分光光度计，激发光495nm，检测血浆在520nm的发射强度。颈椎脱臼处死小鼠并解剖取脑组织，用PBS漂洗数次，以150mg湿重脑组织/1ml PBS的比例分装至EP管中，超声破碎45s，4℃下16000g离心30min，取上清200ul加入96孔板中，用荧光分光光度计，激发光495nm，检测在520nm的发射强度。采用公式：多肽穿越屏障效率（%）=(样品荧光值-空白对照荧光值)/（标记效率W×蛋白上样量），计算多肽通过呼吸道进入血液和脑部的效率。结果如图12所示，VIP-TAT通过呼吸道进入血液的效率是VIP的2倍左右，而穿过血脑屏障进入脑部的效率是VIP的10倍以上。

采用一次性喷雾吸入法给药后，测定其抗东莨菪碱诱导学习记忆损伤，发现（如图13）喷雾法用药后，VIP-TAT不仅显著延长延迟时间，而且比VIP效果更为显著（P<0.01）。

SEQUENCE LISTING

<110> 余榕捷

<120> 一种重组融合蛋白VIP-TAT及其应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 45

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met His Ser Asp Ala Val Phe Thr Asp Asn Tyr Thr Arg Leu Arg

1 5 10 15

Lys Gln Met Ala Val Lys Lys Tyr Leu Asn Ser Ile Ley Asn Tyr

20 25 30

Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Glu Gly Ser Ser

35 40 45

<210> 2

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atg cat agc gat gcg gtg ttt acc gat aac tat acc cgt ctg cgt 45

aaa cag atg gcg gtg aaa aaa tat ctg aac agc att ctg aac tat 90

ggc cgt aaa aaa cgt cgt cag cgt cgt cgt ctc gag ggc tct tcc 135

Claims

1.一种重组融合蛋白VIP-TAT，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述重组融合蛋白VIP-TAT的基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2 所示。

3.权利要求1所述重组融合蛋白VIP-TAT在制备激活细胞内/细胞核定位的VIP受体药物中的应用。

4.权利要求1所述重组融合蛋白VIP-TAT在制备抑制结肠癌细胞增殖药物中的应用。

5.权利要求1所述重组融合蛋白VIP-TAT在制备提高血液或脑部SOD含量药物中的应用。

6.权利要求1所述重组融合蛋白VIP-TAT在制备抗东莨菪碱诱导学习记忆损伤药物中的应用。