CN106636175A - 细胞损伤修复蛋白在毕氏酵母中的诱导表达、纯化方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人源重组rhMG53(TRIM72)蛋白在毕氏酵母中的诱导表达、纯化方法及其应用，其是根据人源MG53蛋白的氨基酸序列，依据毕氏酵母密码子偏爱性对其密码子进行优化，得到完全不同的编码人源MG53蛋白的核酸序列，并在该序列的N端加上HIS(6×his)标签，然后构建入毕氏酵母表达载体中，转入毕氏酵母GS115进行诱导表达，表达产物通过亲和层析获得纯化的人源MG53蛋白。本发明的人源MG53在毕氏酵母中的诱导表达及纯化方法设计巧妙，能够高效表达人源MG53，通过层析纯化获得高纯度的重组蛋白，应用于神经细胞，肾小管上皮细胞，骨骼肌细胞、心肌细胞的损伤及肾脏损伤、肌肉损伤、心脏损伤的修复。

Description

细胞损伤修复蛋白在毕氏酵母中的诱导表达、纯化方法及其 应用
技术领域
本发明涉及蛋白表达技术领域，特别涉及人源蛋白在毕氏酵母中的诱导表达技术领域，具体是指一种细胞损伤修复蛋白rhMG53(TRIM72)在毕氏酵母中的诱导表达方法、纯化方法及其应用。
背景技术
有关细胞膜的损伤与修复研究要追溯到18世纪20年，Wilson等发现，多细胞生物的细胞膜损伤后细胞仍然能够存活[1]，但由于当时研究手段及设备落后，直至1958年，Heilbrunn等研究发现，在一定生理浓度的Ca2+存在下，细胞质内的囊泡迅速的在细胞膜损伤位点聚集，参与损伤细胞膜的修复，他们推测，当没有或低Ca2+时，胞质将从损伤位点不断外溢而导致细胞死亡[2]，具体机制了解的非常有限。后来，Bi和Miyake&McNeil等发现，细胞膜损伤活化了Ca2+依赖的胞内囊破的外泌，从而大量囊泡聚集在损伤位点，介导膜的修复[3,4]。而Morinoto等发现，突触结合蛋白Ⅰ(synaptotagminⅠ)是Ca2+感应器，从而诱发含有乙酰胆碱的囊泡外泌而聚集于细胞膜损伤位点[5]。随后根据细胞膜修复机制研究的结论提出了两种假设即：细胞膜张力的减少和修补复合物的形成。细胞膜张力的减少归功于膜损伤诱导内膜系统的外泌，包括细胞膜中PIP2介导的细胞骨架与细胞膜的粘附，细胞膜断裂而活化Ca2+活化的肌动蛋白切割/解聚酶，从而介导皮质肌动蛋白微丝的重排与解聚而减少膜张力，促进膜修复[6,7]；修补复合物的形成是在膜断裂位点Ca的迅速增加，更大囊泡的聚集及部分细胞器的参与如卵黄颗粒的参与[8,9]。
另外，参与细胞膜修复的外泌囊泡隔间及细胞器包含有皮质颗粒，卵黄颗粒，溶酶体及Enlargosomes等[2,10,11]。目前，也已经鉴定了部分蛋白参与细胞膜的修复调控机制。桥粒连接蛋白(Desmoyokin/AHNAK)是蛋白激酶B(PKB)的底物，定位于质膜面向胞质的一面，细胞膜的断裂诱导的胞外分泌将AHNAK从胞内转到胞膜外，具体功能还不清楚。SNARE蛋白被认为是膜修复过程中内膜融合的关键调控分子，定位于参与膜断裂修复的囊泡内，该蛋白家族由三十多位成员组成，在许多哺乳动物体内均有表达[2,12]。
TRIM72(又称Mitsugumin 53或MG53)是一种新发现的、在骨骼肌和心肌特异性表达的三重基序(Tripartite motif,TRIM)家族蛋白，它由一个RING finger、两个B-boxmotif、一个coiled-coil region和羧基端的一个PRY-SPRY结构域构成[13]。Takeshima等于2005年通过免疫蛋白质组学方法首次克隆MG53基因，之后采用生物化学和RNA杂交等方法研究发现MG53主要表达在骨骼肌细胞和心肌细胞内，然而通过遗传学方法敲除MG53并没有明显影响动物的行为和生育能力，随后，Ma JJ博士实验室研究发现，MG53-/-小鼠在下坡跑练习中，与正常小鼠相比，其骨骼肌和心肌由于缺乏质膜修复能力而受到严重损伤。Cai等研究发现，在不同细胞中MG53的过表达，增加胞内囊泡向质膜运输，出现丝状伪足样结构。因此，推断含MG53囊泡可能参与质膜急性损伤后修复补丁的形成，随后一系列研究显示，MG53是细胞膜修复机制中的关键蛋白分子。与此同时，来自Young-Gyu Ko’s实验室的独立实验，采用比较二位电泳分析肌小管细胞系C2C12的抗去垢剂脂质筏鉴定了MG53在细胞膜损伤的修复过程中发挥重要的作用[14]。细胞膜修复是一个非常保守而复杂的过程，目前已报道，dysferlin、annexin、caipain、驱动蛋白ⅡA、非肌肉肌球蛋白ⅡB及MG53等多个蛋白参与这一过程。大多数细胞膜损伤的修复都是由钙离子向膜损伤部位聚集而触发，是一个主动过程。细胞膜的破损，导致定位于膜间质的磷脂酰丝氨酸转移至受损的膜表面，与MG53结合，然后与细胞内囊泡及细胞膜结合，破损的细胞膜诱使囊泡向膜破损处转运，转运至膜破损处后，MG53通过氧化低聚化的形式联接，最终在钙离子等相关因子的作用下细胞内囊泡与破损细胞膜融合完成细胞膜的修复[15]。MG53除了参与细胞膜损伤的修复之外，还能增加信号转导通路中与存活相关的蛋白激酶如Akt、GSK3β、ERK1/2的磷酸化水平，激活PI3K-Akt-GSK3β和ERK1/2信号转导，随后激活心脏的缺血预适应保护中的重要信号通路RISK信号通路而不是SAFE途径，因此，TRIM72在细胞膜损伤修复，心肌缺血/再灌注诱导损伤中具有重要的临床应用价值[16]。近期多篇文章报道，重组人源TRIM72(rhTRIM72)对细胞膜损伤具有保护作用，而且对缺血诱导肌肉、心脏、脑、肺、肾脏损伤也有明显的保护作用[17-22]。
综上所述，人源重组rhTRIM72蛋白具有较好的应用前景，而建立简易、高效的构建高效的人源重组rhTRIM72蛋白生产方法显得尤为重要，具有重要的应用价值。本发明采用安全、高效的毕氏酵母表达人源重组rhTRIM72蛋白，能够直接得到高级结构的目的蛋白，产量高，方法简单，排除内毒素的干扰，容易推广，广阔的应用与开发价值。
参考文献
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发明内容
本发明的目的是克服了目前已有技术中的缺点，提供一种人源MG53(TRIM72)在毕氏酵母中的诱导表达方法、表达的人源rhMG53(TRIM72)蛋白及其应用，该诱导表达设计巧妙，从而可以高效表达用于预防和治疗由于(细胞和/或细胞膜)损伤而导致的脑神经损伤、肾脏衰竭、肺部损伤、心肌损伤、肌肉萎缩等诱发的相关疾病；另外，毕氏酵母诱导表达的人源rhMG53(TRIM72)具有类似于人源蛋白的特异氨基酸位点糖基化修饰和(或)硝基化修饰，所得蛋白具有高级结构，并且排除内毒素毒性，从而使所表达蛋白具有安全性好，生物活性高，体内半衰期更长，抵抗体内ROS等对目的蛋白的氧化损伤以及泛素化修饰介导的降解所用，提高目的蛋白的预防与治疗效果；我们所用诱导表达方法中的纯化方法简单易行，适于大规模推广应用。
为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种人源rhMG53(TRIM72)在毕氏酵母中的诱导表达方法，其特点是，将经过密码子优化的编码人源rhMG53(TRIM72)的核酸序列构建入经过改造的毕氏酵母诱导表达载体中，然后转入毕氏酵母进行诱导表达，获得所述人源rhMG53(TRIM72)蛋白。
显然，采用上述方法可以表达任何感兴趣的蛋白。较佳地，所述核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示的序列、
毕氏酵母诱导表达载体pHKY01改造自pPIC9K，转入毕氏酵母前去掉了抗性筛选基因AmpR和KanR，这样在使用毕氏酵母表达过程中不会产生AmpR和KanR蛋白干扰，利于目的蛋白的纯化。较佳地，所述毕氏酵母诱导表达载体是pHKY01.
毕氏酵母也可以选择任意的毕氏酵母菌株，均可以实现本发明。较佳地，所述毕氏酵母是毕氏酵母GS115。
为了使表达的人源rhMG53(TRIM72)蛋白纯度更高，较佳地，在获得所述人源rhMG53(TRIM72)蛋白在毕氏酵母中的诱导表达方法还包括采用离子交换层析法纯化所述人源rhMG53(TRIM72)蛋白。
在本发明的第一方面，提供了一种人源rhMG53(TRIM72)蛋白表达的载体，其特点是在转入毕氏酵母前去掉了抗生素抗性基因AmpR和KanR；
在本发明的第二方面，通过密码子优化，提供了一种新的表达人源rhMG53(TRIM72)蛋白的核酸序列；
在本发明的第三方面，提供了一种人源rhMG53(TRIM72)蛋白的纯化方法；
在本发明的第四方面，提供了一种人源rhMG53(TRIM72)蛋白在相关疾病中的预防与治疗应用。
本发明的有益效果在于：
本发明中的人源rhMG53(TRIM72)蛋白在毕氏酵母中的诱导表达方法是将经过密码子优化的编码人源rhMG53(TRIM72)蛋白的核苷酸序列构建入毕氏酵母诱导表达载体中，所采用载体是经过改造后，在构建入毕氏酵母前去掉了抗性基因Ampr和Kanr，获得所述人源MG53(TRIM72)蛋白，表达量可达约100mg/L；所述人源rhMG53(TRIM72)蛋白经体外细胞实验，动物模型实验表明在体内外能很好保护由于细胞(和/或细胞膜)损伤而诱发的脑神经、肾脏、肺、心肌、肌肉萎缩等疾病的发生，本发明设计巧妙，降低了抗性基因蛋白杂质和内毒素的干扰，简化单笔纯化工艺，提高蛋白纯度，同时也提高了蛋白的生物活性，延长蛋白在体内的半衰期，适于大规模推广应用。
附图说明
图1载体pHKY01构建流程图
图2表达载体pHKY01-6XHIS-rhMG53的构建流程图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明的保护范围不仅仅局限于实施例。
实施例1 6XHIS-rhMG53片段的合成
在所设计的引物P1中包含六个编码组氨酸的核酸序列，序列如P1；引物P60中引入限制性酶切位点EcoR I，在Genebank中查找MG53(TRIM72)的蛋白质序列，之后通过在线软件分析，并根据毕氏酵母密码子偏爱性优化核甘酸序列如下，并设计合成引物P1-P60，引物序列如下，设计退货温度为62℃：其中：
P1：5’-CATCATCATCATCATCATATGTCTGCAGCACCAGGATTGC-3’
P60：5’-GTAGAATTC(EcoR I)CCTTCAAGCCTCTGCACCCTCGGGACC-3’
密码子优化后的人源MG53(TRIM72)核苷酸序列：
TRIM72优化后的序列
引物序列
通过PCR一步法或两步法合成DNA片段6XHIS-rhMG53，引物浓度为1μM，反应体系为50μL，
反应条件：
实施例2两步法合成DNA片段6XHIS-rhMG53
方法同实施例1，首先分别采用引物P1-P32和P29-P60合成DNA片段F1和F2，然后通过PCR将F1和F2拼接成完整的片段6XHIS-rhMG53，拼接反应如下：
反应条件：
实施例3毕氏酵母表达载体pHKY01的构建
具体步骤：
1、载体pPIC9K用限制性内切酶AatⅡ和Sca I在37℃水浴条件下消化2小时左右，然后琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化，再采用T4DNA聚合酶在12℃水浴条件下消化20分钟作用，将粘性末端削平，用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，采用含卡纳抗生素(50μg/mL)的LB培养基筛选阳性克隆，并用用AatⅡ和Sca I酶切鉴定，阳性克隆为pPIC9K1；
2、PCR扩增片段AmpR+pBR322
根据载体pPIC9K序列，设计引物P61，P62，以载体pPIC9K为模板，通过PCR富集片段AmpR+pBR322，反应体系为50μL，
P61 5’-ATTGTCGACTTTCCATAGGCTCCGCCC-3’Tm＝60℃，下划线为SalI限制性内切酶识别序列
P62 5’-ATGGTCGACCGCGGAACCCCTATTTGT-3’Tm＝60℃，下划线为SalI限制性内切酶识别序列
反应条件：
3、pPIC9K2载体的构建
将构建的载体pPIC9K1与片段AmpR+pBR322用限制性内切酶SalI消化，在37℃水浴1小时后，采用琼脂糖凝胶电泳分离纯化，通过T4DNA连接酶连接，转入大肠杆菌DH5α，用含卡纳抗生素(50μg/mL)的LB培养基筛选阳性克隆，采用BglⅡ和Xma I酶切鉴定，阳性克隆为pPIC9K2；
3、载体pHKY01的构建
用限制性内切酶BglⅡ和Xma I在37℃水浴条件下消化2小时左右，然后琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化含多克隆位点的大片段，再采用T4DNA聚合酶在12℃水浴条件下消化20分钟作用，将粘性末端削平，用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，用含氨苄抗生素(100μg/mL)的LB培养基筛选阳性克隆，采用BglⅡ和Xma I酶切鉴定，阳性克隆为pHKY01；
实施例4毕氏酵母表达载体pHKY01-6XHIS-rhMG53的构建和表达
将实施例1中合成的片段6XHIS-rhMG53和载体pHKY01用限制性内切酶Sal I，在37℃水浴消化1小时，琼脂糖凝胶电泳分离纯化，然后采用T4DNA连接酶连接后，转入大肠杆菌DH5α，用含氨苄抗生素(100μg/mL)的LB培养基筛选阳性克隆，并用Sal I酶切鉴定。
实施例5表达载体pHKY01-6XHIS-rhMG53转入毕氏酵母GS115，获得高表达量的毕氏酵母菌株GSY001
构建好的pHKY01-6XHIS-rhMG53表达载体用SalI酶切将质粒线性化，通过琼脂糖凝胶电泳分离获得含目的基因6XHIS-rhMG53的片段，同时也去掉了载体上的抗性基因AmpR，然后通过电转化毕氏酵母GS115，挑选阳性克隆，首先采用菌落PCR鉴定阳性克隆，获得含有6XHIS-rhMG53片段的毕氏酵母GS115菌株，然后根据InvitrogenTM的酵母表达手册，采用500mL的摇瓶，甲醇诱导表达培养，采用下列方法进行筛选(1)SDS-PAGE电泳检测；(2)Dot Blot；(3)Western blotting；获得高表达目的蛋白的菌株，最后筛选到高表达菌株GSY001(表达量约100mg/L)。
实施例6人源重组rhMG53蛋白的纯化
因为所表达的人源重组rhMG53蛋白带有HIS标签，主要采用常规镍柱亲和纯化，纯化后纯度达到95％以上。
实施例7在体药效试验(主要参考姚永刚等，rhMG53蛋白对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用研究。解放军医学杂志，2014，39(6)：439-433)
试验动物采用4月龄SD大鼠，体重在200-240克。
1、局灶性脑I/R模型的建立
采用2.5％戊巴比妥钠对SD大鼠进行腹腔注射，待麻醉后，将大鼠固定于手术台上，在颈部偏左做一切口，露出左侧颈总动脉及颈外动脉、颈内动脉，将颈外动脉分支分离开，用细线结扎后，剪断颈外动脉。结扎游离的颈外动脉远心端，近心端用缝合线打一活结，然后用血管夹夹闭颈总动脉和颈内动脉。在颈外动脉距颈总动脉分叉4-5毫米处做一切口，将闹栓尼龙线(直径约0.24毫米)从切口处插进，将近心端的活结轻轻扎住，打开颈内动脉的血管夹，迅速将尼龙线推进至距离颈总动脉分叉18-20厘米处，此时即可阻塞左侧大脑中动脉的血流。缺血小时后进行复灌，拔出栓线，扎紧颈外动脉根部的活结，打开颈总动脉血管夹，缝合皮肤。假手术组仅暴露颈总动脉分叉和颈内动脉而不插线。术中维持SD大鼠体温在37±5℃，术后将大鼠放回笼中，保证食物、水的供应，维持室温在37±5℃，24小时后进行各项指标的测定。
2、动物分组及给药方式
动物分组：SD大鼠随机分为假手术组(n＝10只/组)、I/R组(n＝10只/组)、I/R+6XHIS-rhMG53处理组，根据给药时间的不同，I/R+6XHIS-rhMG53处理组又分为预给药组、再灌注后0、1、2、4、6小时不同时间点给药组(n＝10只/组)
给药方式：6XHIS-rhMG53用生理盐水溶解，静脉注射，3毫克/公斤，I/R组给予同体积的生理盐水。
3、结果分析
神经学评分：SD大鼠缺血1小时后再灌注24小时，根据Zea-Longa评分系统进行神经功能障碍评分：0分-无神经损伤症状；1分-不能完全伸直右前爪(轻度)；2分-行走时向右侧旋转(中度)；3分-行走时向右侧倾斜(重度)；4分-不能自发性行走，意识昏迷；5分-大鼠死亡。
脑梗死区域的计算：缺血再灌注24小时后，断颈处死SD大鼠(每组7只)，将脑组织迅速置于–20℃冷冻30分钟，取出后切片，厚度2～3毫米，共5片。将脑切片浸入1％TTC溶液中，37℃孵育20分钟，每5分钟翻动脑切片，梗死区为苍白色，未梗死区为红色。最后将脑切片放入4％多聚甲醛溶液中固定。24小时后照相，采用Image J软件分析梗死区域的面积。
病理切片制作：缺血再灌注24小时后，2.5％戊巴比妥钠麻醉SD大鼠(每组3只)，通过颈总动脉灌注4％多聚甲醛溶液固定脑组织，取脑后再放入4％多聚甲醛溶液中固定24小时，制作石蜡切片，HE染色。
统计学处理采用SPSS 17.0软件进行统计分析，各组间Zea-Longa评分、梗死区域面积的比较均采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，进一步两两比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。
结构：通过以上方法证实人源重组6XHIS-rhMG53蛋白对脑缺血再灌注诱导神经损伤的保护效果。
实施例8在体实验(参考文献Cao CM,et al.MG53constitutes a primarydeterminant of cardiac ischemic preconditioning.Circulation,2010,121(23):2565-74)分析人源重组蛋白6XHIS-rhMG53对缺血再灌注诱导心肌损伤的保护作用。
结果：证实人源重组6XHIS-rhMG53蛋白对缺血再灌注诱导心肌(或心脏)损伤有较好的保护效果。
以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。

Claims (6)

1.细胞损伤修复蛋白在毕氏酵母中的诱导表达、纯化方法，其特征在于，根据人源MG53蛋白氨基酸序列及毕氏酵母密码子偏爱性，将经过密码子优化后的编码人源rhMG53(TRIM72)的核苷酸序列与HIS(6×his)标签连接，构建入酵母表达载体pHKY01中，然后转入毕氏酵母GS115，通过阳性克隆筛选，获得rhMG53(TRIM72)高表达量菌株GSY001，表达产物通过Ni-镍亲和纯化柱层析获得纯化蛋白rhMG53(TRIM72)。
2.根据权利要求1所述的细胞损伤修复蛋白在毕氏酵母中的诱导表达、纯化方法，其特征在于，所述表达载体是pHKY01。
3.根据权利要求1所述的细胞损伤修复蛋白在毕氏酵母中的诱导表达、纯化方法，其特征在于，所采用的表达宿主菌为毕氏酵母GS115。
4.根据权利要求1所述的细胞损伤修复蛋白在毕氏酵母中的诱导表达、纯化方法，其特征在于，所筛选到的高表达宿主菌菌株编号为GSY001。
5.根据权利要求1所述的细胞损伤修复蛋白在毕氏酵母中的诱导表达、纯化方法，其特征在于，所述的蛋白在毕氏酵母中的诱导表达方法还包括诱导表达rhMG53(TRIM72)蛋白后，采用Ni-镍亲和纯化柱层析方法纯化所述蛋白。
6.权利要求1-7任一权利要求所述的细胞损伤修复蛋白在制备细胞损伤修复或细胞凋亡抑制药物中的应用。
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