CN1712415A - 连接蛋白转导结构域及辅助蛋白的生物活性蛋白、它的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一类连接蛋白转导结构域和辅助蛋白的生物活性蛋白及其应用。它解决了生物活性蛋白分子跨膜进入细胞的问题；它包括蛋白转导结构域、辅助蛋白和生物活性蛋白。辅助蛋白用于改善融合蛋白的表达水平、分离纯化、热稳定性和在细胞内的半衰期，以及调节生物活性蛋白，特别是酶分子的反应产物，从而提高生物活性蛋白的使用效果等。它可用作化妆品、炎症疾患和功能食品的有效成分。例如，GST、TAT、SOD融合蛋白可广泛用于美白、消除青春痘、疤痕、皱纹等调整皮肤失调方面，并可用于外部皮肤的局部应用和许多肤发疾病的治疗，具有防晒、抗辐射、增白、防皱、消炎和延缓衰老的功效；亦可用于调整关节炎等疑难病症。

Description

连接蛋白转导结构域及辅助蛋白的生物活性蛋白、它的制备方法和应用
技术领域：
本发明涉及一类融合蛋白(Protein Fusion)及其制备方法和应用。
背景技术：
1、生物活性蛋白的应用及其不足：
细胞是生命的基本单位，蛋白质参与几乎所有的生命活动过程，细胞内正常蛋白质的缺失或不足往往会导致细胞的病态和生命活动的异常。虽然基因疗法可望通过转录和翻译，补足这些蛋白质，但这种方法可使目标基因高效定位和目标蛋白长期表达的条件还有待于进一步探讨。因此把生物活性蛋白从细胞外直接导入细胞内，从而改善细胞的生理状态的蛋白质疗法是一个很有意义的替代方法。
但是，由于分子大小和生化特性的原因，用生物活性蛋白对细胞进行胞内治疗时，这些具有治疗功能的分子本身难以进入细胞，这使得它们的治疗价值受到极大限制[1]。在传统的实验和临床治疗上，已有许多方法用于将蛋白质递送进入活细胞中，这些方法可以分成病毒载体或非病毒载体法两大类。较之病毒载体法，非病毒递送策略在生物安全和给药方便性方面具有很大的优点。非病毒载体法包括：显微注射法，电穿孔法，脂质体法，细菌毒素、红细胞及受体介导的胞吞作用等；但是这些方法大都效率不高或费时、容易引起细胞死亡或形成胞内小泡而不能使外源蛋白有效地跨膜进入细胞[2]。为此，寻找一种能有效地将外源生物活性蛋白输入活细胞并使之在细胞内保持活性的方法就显得相当重要。
2、蛋白转导结构域(Protein Transduction Domain，PTD)的发现：
过去几年有报道指出一些蛋白质以非传统的内化方式跨膜进入细胞，如基态纤维细胞生长因子bFGF[3]，乳铁传递蛋白[4]，人体免疫缺陷病毒HIV-1的TAT蛋白[5-7]，B型肝炎病毒蛋白PreS2[8]，白介素-1[9]和果蝇触角足(ANTP)同源异型转录因子[10]等。进一步的研究发现，协助这些蛋白质分子跨膜转运的是一些被称为蛋白转导结构域(PTD)的肽片断(如表1)。
表1TAT、VP22和ANTP的转导结构域核心区氨基酸序列
  蛋白质   转导结构域核心区氨基酸序列
  TAT   YGRKKRRQRRR
  VP22[11]   DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE
  ANTP   RQIKIWFQNRRMKWKK
通过对这三个蛋白转导结构域核心区的氨基酸序列进行比较后发现：它们都富含碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)，这种带有正电荷的多肽片段可以通过静电相互吸引的作用结合到细胞膜上，从而促进与之融合的外源蛋白的跨膜递送。
3、辅助蛋白在融合蛋白中的作用：
融合蛋白(Fusion Protein)是由两个或两个以上连接而不同的蛋白质组成，它由融合基因生成。在宿主细胞中表达融合蛋白时，往往出现表达水平偏低，分离纯化困难等问题。在融合蛋白中增加辅助蛋白将有助于提高融合蛋白的表达水平和分离纯化效率。另外，辅助蛋白也可以用于提高融合蛋白在细胞内的作用时间，以及调节生物活性蛋白，特别是酶分子的反应产物，从而提高生物活性蛋白的使用效果。
发明内容：
本发明的目的之一就是提供一类具有高效跨膜递送能力的连接蛋白转导结构域及辅助蛋白的生物活性蛋白。
本发明的目的之二就是提供一类能提高融合蛋白的表达水平和分离纯化效率的连接蛋白转导结构域及辅助蛋白的生物活性蛋白。
本发明的目的之三就是提供一类能提高融合蛋白在细胞内的作用时间，以及调节生物活性蛋白，特别是酶分子的反应产物，从而提高生物活性蛋白的使用效果的连接蛋白转导结构域及辅助蛋白的生物活性蛋白。
本发明的技术方案如下：一种连接蛋白转导结构域及辅助蛋白的生物活性蛋白，它包括蛋白转导结构域、生物活性蛋白，其特征在于：它还包括辅助蛋白。
本发明的优点是含有生物活性蛋白的融合蛋白能够高效跨膜进入细胞内部，从而达到胞内治疗的目的。本发明在融合蛋白中增加辅助蛋白将有助于提高融合蛋白的表达水平、分离纯化效率和使用效果等。
附图说明：
图1细胞种类对GST-TAT-GFP和GST-GFP跨膜递送的影响，四种不同的细胞培养在含500ug/mL GST-TAT-GFP或GST-GFP新鲜的RMPI 1640培养液中，于5％的CO2、37℃培养6h后用荧光分光光度计定量测定荧光值。
图2、图3、图4分别是实验七的小鼠血清尿酸、乳酸脱氢酶、乳酸含量坐标图。图中横坐标的标注1、2、3、分别代表运动前30分钟、120分钟、240分钟给药的情况。
具体实施方式：
本发明的连接蛋白转导结构域及辅助蛋白的生物活性蛋白，它包括蛋白转导结构域、辅助蛋白、生物活性蛋白，三者共价连接，连接发生在沿着生物活性蛋白结构的任何不明显妨碍生物活性的部位。
本发明的连接蛋白转导结构域及辅助蛋白的生物活性蛋白可应用于化妆品中，或者将它应用在治疗炎症疾患中，或者将它应用在功能食品中。
实施例1：用DNA重组技术制备融合蛋白GST-TAT-GFP(GST：作为辅助蛋白的谷胱甘肽-S-转移酶；TAT：TAT蛋白的蛋白转导结构域；GFP：绿色荧光蛋白)。
用细菌质粒中GFP的编码基因的5’端引物1和3’端引物2做PCR扩增，在引物1的5’端还含有TAT的编码序列，这样可以扩增得到TAT和GFP的融合基因。扩增后的PCR产物经酶切和电泳回收后，插入质粒pGEX的多克隆位点，构建表达质粒pTAT-GFP，转化大肠杆菌BL21(DE3)，酶切鉴定筛选阳性克隆作为表达菌株。
挑取阳性单菌落接种于含氨苄青霉素的LB培养基，37℃生长约2h后，OD600达0.6左右，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，30℃诱导4h，离心收集菌体。从超声波破碎的细胞破碎液中回收得到GST-TAT-GFP。
                                实验一
本实验说明融合蛋白GST-TAT-GFP(GST：辅助蛋白谷胱甘肽-S-转移酶；TAT：TAT蛋白的蛋白转导结构域；GFP：绿色荧光蛋白)中的TAT能提高生物活性蛋白GFP的跨膜递送作用。
1.不同细胞实验结果：
本实验研究了融合蛋白GST-TAT-GFP对L-02、SMMC-7721、Hela和BEL-7402细胞跨膜递送作用。500μg/mL的融合蛋白与这些不同种类的细胞分别保温6h后，四种细胞在荧光显微镜下都呈现明亮的绿色，虽然它们的荧光强度稍微有所差别。而用对照的不含TAT的融合蛋白GST-GFP处理的四种细胞在荧光显微镜下只能看到细胞的背景色，没有荧光出现，即使把保温时间延长至24h也无法看到荧光。
用荧光分光光度计定量测定这些细胞的荧光强度(图1)，发现GST-TAT-GFP实验组的细胞的荧光强度达到未处理细胞的25倍以上，而对照的不含TAT的融合蛋白GST-GFP的实验组的细胞的荧光强度与未处理细胞没有太大的区别。以上结果表明TAT能够提高GFP的跨膜进入不同细胞的能力。
2.进入线虫实验：
通过融合蛋白GST-Tat-GFP(12μM)对线虫的喂食，研究该蛋白在活体内的跨膜递送。结果不仅线虫的整个消化管内有较强的绿色荧光，在原体腔也充满融合的荧光蛋白；且随着喂食时间(1h、3h、6h)的延长，观察到的绿色荧光逐渐增强。线虫体内的荧光强度与蛋白浓度(3μM、6μM、12μM)存在正相关关系；而对照的不含TAT的融合蛋白GST-GFP的实验组的线虫体内的绿色荧光只有些许的增加。以上实验说明TAT能够促进生物活性蛋白GFP跨膜进入线虫体内。
3.小鼠皮肤涂抹实验：
皮肤是机体与自然界之间的第一道屏障，其主要功能是保护作用，防止环境有害物质的入侵以及自身体液的丢失。本实验采用将小鼠腹部皮肤的冷冻切片直接置于荧光显微镜下观察的方法考察融合蛋白GST-Tat-GFP跨膜递送进入皮肤的情况。结果发现，深入真皮层的由内层的上皮细胞与外层的结缔组织构成的整个毛囊可见明显且分布均匀的绿色荧光，而阴性对照GST-GFP没有表现出跨膜效果。由此可见，TAT有助于GST-Tat-GFP通过皮肤涂抹进入小鼠的皮肤。
4、小鼠腹腔注射实验：
本实验用融合蛋白GST-Tat-GFP探讨其在小鼠体内组织的递送情况。按照10mg/kg(蛋白/鼠)的量施以腹腔注射，17h后解剖取出组织，制成冷冻切片，同样可在荧光显微镜下观察到其心、肝、肾组织切片均有较强的绿色荧光，且在组织中分布均匀，而阴性对照蛋白GST-GFP未观察到任何荧光。此外，在脑组织中也观察到绿色荧光，说明该融合蛋白成功地跨越了血脑屏障(BBB)。BBB主要由血管内皮细胞和脑组织的星状胶质细胞的足突构成，内皮细胞间的紧密连接和缺乏内吞囊泡的特点，限制了血与脑之间物质的交换，在生理状态下其防止血液中有害物质对脑功能的影响；然而在病理情况下却影响由于有治疗作用的蛋白多肽或化学药物受其限制无法通过。该体内实验证明了融合蛋白GST-Tat-GFP实现跨膜进入体内包括脑部组织在内的各个组织。
                               实验二
本实验说明融合蛋白GST-TAT-SOD(GST：辅助蛋白谷胱甘肽-S-转移酶；TAT：TAT蛋白的蛋白转导结构域，SOD：超氧化物歧化酶)中TAT提高生物活性蛋白SOD的跨膜递送作用。
为了研究TAT介导的SOD跨膜进入不同细胞的效率，本实验将融合蛋白GST-TAT-SOD与GST-SOD(对照蛋白)加入不同种类细胞(L-02、BEL-7402和Hela)的培养基中进行跨膜转导实验，融合蛋白的终浓度均为500μg/mL。温育4h后，测定细胞裂解液中的SOD酶活。结果发现，与细胞空白对照以及用GST-SOD处理的细胞比较，GST-TAT-SOD显示出很高的跨膜递送活性，细胞内的SOD活力提高了200％以上。
                               实验三
本实验说明融合蛋白GST-TAT-GFP(GST：辅助蛋白谷胱甘肽-S-转移酶，TAT：TAT蛋白的蛋白转导结构域，GFP：绿色荧光蛋白)中GST提高生物活性蛋白GFP的可溶性表达。
离心收集实施例1所述大量诱导的菌液，冰浴条件下超声波破碎菌体细胞后高速离心，结果上清呈亮绿色；SDS-PAGE电泳法检测发现约95％的融合蛋白GST-TAT-GFP呈可溶状态；同样的制备方法生产不含GST的融合蛋白TAT-GFP，SDS-PAGE电泳法检测发现只有少于5％的融合蛋白TAT-GFP呈可溶状态，其菌液的超声波破碎上清基本看不到绿色。
                               实验四
本实验说明融合蛋白TAT-SOD-CAT(TAT：TAT蛋白的蛋白转导结构域；SOD：超氧化物歧化酶；CAT：Catalase，过氧化氢酶)中CAT通过分解生物活性蛋白SOD的反应产物---过氧化氢，从而进一步改善SOD的生物活性。
在产生超氧化物自由基的黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶反应体系中，加入融合蛋白TAT-SOD-CAT与TAT-SOD(对照蛋白)。37℃保持10分钟后，用EPR(Electron paramagneticResonance)法测定反应体系中的超氧化物自由基。结果发现，与不含融合蛋白的磷酸缓冲液相比，TAT-SOD-CAT不但能够100％消除超氧阴离子自由基O2 -，而且100％消除羟基自由基OH-；而TAT-SOD只能100％消除O2 -，减少的OH-只达到50％。
                               实验五
本实验说明融合蛋白GST-TAT-SOD(TAT：TAT蛋白的蛋白转导结构域，SOD：超氧化物歧化酶)作为面霜有效成分在化妆品中的应用。
1、面霜处方：
硬脂酸130g，液体石蜡200g，石蜡130g，三乙醇胺30g，甘油100g，SOD2×105U，蒸馏水加至1000g。
2、面霜的制备：
取硬脂酸、液体石蜡和石蜡加热至80℃(油相)；另取三乙醇胺、甘油及蒸馏水亦加热至80℃(水相)。在搅拌下将水相缓缓加入80℃油相中，待乳化完全后，停止加热，搅拌至近凝，即得乳膏基质。取乳膏基质适量，每克加入200SOD活力单位的GST-TAT-SOD研匀，再分次加入乳膏基质至全量，研匀即得GST-TAT-SOD面霜。
3、使用方法：
用药前先用温水把脸洗干净，然后涂抹上适量GST-TAT-SOD面霜(存放于冰箱内或阴凉处)，每日擦2次。
4、评定方法：
每天随访一次，一周后评定效果。皮肤生理失调消失或部分消失为有效；不消失为无效。
5、结果：
附表1  GST-TAT-SOD霜剂的疗效统计
  测试方向   测试总人数   有效人数   无效人数   有效率
  美白除斑   32   28   4   87.5％
  除皱   10   8   0   80.0％
  除青春痘   50   34   16   68.0％
  去疤痕   8   6   0   75.0％
以上结果表明，加入GST-TAT-SOD融合蛋白的化妆品，对美白除斑，去除皱纹、青春痘和疤痕等美化皮肤、治疗皮肤受损和调整皮肤失调方面具有显著疗效。
                              实验六
本实验说明融合蛋白GST-TAT-SOD(TAT：TAT蛋白的蛋白转导结构域，SOD：超氧化物歧化酶)在调整类风湿性关节炎、过敏性皮炎、腱鞘炎等炎症疾病中的应用。
对附表2所列各种由类风湿或其它原因引起的关节炎等炎症疾病，使用GST-TAT-SOD药用霜剂(每克乳剂含1000U超氧化物歧化酶活性)进行治疗，每日擦1～3次，视各人疼痛情况而定。用药前先做热敷或轻轻拍打病灶部位致微热发红，然后涂抹上适量GST-TAT-SOD霜剂(保存于4度冰箱内或阴凉处)，每天观察一次，一周后评定效果如附表2。
附表2：跨膜SOD霜剂对关节、肌肉疼痛的疗效统计
  测试功能   测试总人数   有效人数   无效人数   有效率
  风湿、类风湿   16   15   1   93.8％
  过敏性皮炎   9   8   1   88.9％
  腱鞘炎   8   6   2   75.0％
  肩周炎   10   7   3   70.0％
备注：减轻或消除病灶部分疼痛为有效；否则无效。
                               实验七
本实验说明融合蛋白GST-TAT-SOD可应用于防止运动过度造成的肌肉疲劳、氧化破坏等生理失调的功能食品。
1.实验动物：成年昆明种雄性小鼠，体重18-22克。
2.实验步骤：无负重游泳至衰竭，捞起后分别经口给予GST-TAT-SOD后30，120，240分钟，置小鼠在游泳箱中游泳，水深40厘米，水温25摄氏度，鼠尾根部负重5％体重的铅皮。负重游泳5分钟后每组取12只小鼠吹干拔眼珠取血。
3.检测项目：血乳酸、乳酸脱氢酶、尿酸。
4.结果判定  统计结果采用方差分析，检测各项目结果显示有利于减少疲劳，且差异有显著性(P＜0.05)，可判定该受试物有抗疲劳效果。
实验结论：GST-TAT-SOD有明显降低血液尿酸和乳酸水平，提高血清乳酸脱氢酶水平，具有显著的抗疲劳作用，且最佳给药时间为运动前240分钟。
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Claims (10)

1、一类连接蛋白转导结构域及辅助蛋白的生物活性蛋白，它包括蛋白转导结构域、生物活性蛋白，其特征在于：它还包括辅助蛋白。
2.根据权利要求1所述的连接蛋白转导结构域及辅助蛋白的生物活性蛋白，其特征在于：所述的蛋白转导结构域、生物活性蛋白和辅助蛋白三者共价连接，连接发生在沿着生物活性蛋白结构的任何不明显妨碍生物活性的部位。
3、根据权利要求2所述的连接蛋白转导结构域及辅助蛋白的生物活性蛋白，其特征在于：所述的连接蛋白转导结构域及辅助蛋白的生物活性蛋白是GST-TAT-SOD融合蛋白。
4、根据权利要求1或2或3所述的连接蛋白转导结构域及辅助蛋白的生物活性蛋白的制备方法，其特征在于：用DNA重组技术制备融合基因，然后在转化的阳性菌株中表达并制备融合蛋白。
5.根据权利要求1或2或3所述的融合有蛋白转导结构域和辅助蛋白的生物活性蛋白的应用，其特征在于：将它应用在化妆品中。
6.根据权利要求1或2或3所述的连接蛋白转导结构域及辅助蛋白的生物活性蛋白的应用，其特征在于：将它应用在治疗炎症疾患中。
7.根据权利要求1或2或3所述的连接蛋白转导结构域及辅助蛋白的生物活性蛋白的应用，其特征在于：将它应用在功能食品中。
8.根据权利要求3所述的连接蛋白转导结构域及辅助蛋白的生物活性蛋白的应用，其特征在于：将所述的GST-TAT-SOD融合蛋白应用在化妆品中。
9.根据权利要求3所述的连接蛋白转导结构域及辅助蛋白的生物活性蛋白的应用，其特征在于：将所述的GST-TAT-SOD融合蛋白应用在治疗炎症疾患中。
10.根据权利要求3所述的连接蛋白转导结构域及辅助蛋白的生物活性蛋白的应用，其特征在于：将所述的GST-TAT-SOD融合蛋白应用在功能食品中。
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