CN107158361B

CN107158361B - Reg1a蛋白在制备治疗和/或预防视网膜细胞凋亡药物中的应用

Info

Publication number: CN107158361B
Application number: CN201710379361.5A
Authority: CN
Inventors: 金子兵; 高美玲
Original assignee: Wenzhou Medical University
Current assignee: Wenzhou Medical University
Priority date: 2017-05-25
Filing date: 2017-05-25
Publication date: 2019-03-12
Anticipated expiration: 2037-05-25
Also published as: CN107158361A

Abstract

本发明提供了REG1A蛋白在制备治疗和/或预防视网膜细胞凋亡药物中的应用，属于生物医药领域。本发明所述应用提供了一个治疗和/或预防视网膜细胞凋亡新的作用蛋白，所述REG1A蛋白通过与视网膜细胞表面的受体EXTL3结合，抑制视网膜细胞凋亡。本发明提供的应用没有发现有毒副作用；具有用量小、安全、长期稳定，机体无排除反应等优点，适用于临床治疗。

Description

REG1A蛋白在制备治疗和/或预防视网膜细胞凋亡药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及REG1A蛋白在制备治疗和/或预防视网膜细胞凋亡药物中的应用。

背景技术

光作用于视觉器官，使其感受细胞兴奋，其信息经视觉神经系统加工后便产生视觉。通过视觉，人和动物感知外界物体的大小、明暗、颜色、动静，获得对机体生存具有重要意义的各种信息，至少有80％以上的外界信息经视觉获得，视觉是人和动物最重要的感觉。视觉器官眼睛的视网膜上亿的神经细胞排列成三层，通过突触组成一个处理信息的复杂网络。第一层是光感受器，第二层是中间神经细胞，包括双极细胞、水平细胞和无长突细胞等，第三层是神经节细胞。它们间通过突触连接，无论视网膜上的哪种细胞发生变性或病变都会影响正常视觉，进而给患者的正常生活造成影响。

随着对视网膜细胞凋亡诱导诱导因素基因调控等方面的深入研究，发现视网膜细胞的凋亡与眼底病变关系密切，常见的视网膜细胞凋亡导致的疾病有很多，例如老年性黄斑变性，视网膜色素膜变性，椎体杆体细胞营养不良和青光眼等。针对视网膜细胞凋亡导致的病变，通过预防或防治视网膜细胞凋亡的发生，将可能成为防治疾病的可靠途径。

目前，针对视网膜细胞凋亡疾病的治疗手段较多，例如，视网膜的移植，但是该方法可能会造成慢性排斥反应，同时对患者的生理和心理造成很大的创伤。另外，基因治疗是利用载体、化学或物理方法将正常基因导入眼组织相应细胞内让其表达，但是基因治疗的机理尚不能完全明确，并且目的基因有效转染、功能基因的长期持续表达等问题也有待解决，因此，基因治疗方法还需要深入研究才能够应用于临床。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供REG1A蛋白在制备治疗和/或预防视网膜细胞凋亡药物中的应用，使该应用作用机理清楚，治疗效果显著。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了REG1A蛋白在制备治疗和预防视网膜细胞凋亡药物中的应用。

优选的，REG1A蛋白通过与视网膜细胞表面的受体EXTL3结合，抑制视网膜细胞凋亡。

优选的，所述的视网膜细胞包括感光细胞和视网膜色素上皮细胞。

优选的，药物的剂型包括注射剂。

优选的，所述注射剂包括REG1A蛋白和可接受的辅料。

优选的，所述注射剂中REG1A蛋白的浓度为0.6～2.5mg/ml。

优选的，所述的辅料包括0.9％氯化钠溶液。

本发明提供了REG1A蛋白在制备治疗和/或预防视网膜细胞凋亡药物中的应用。本发明所述应用提供了一个治疗和/或预防视网膜细胞凋亡新的作用蛋白，所述REG1A蛋白通过与视网膜细胞表面的受体EXTL3结合，抑制视网膜细胞凋亡。本发明提供的应用没有发现有毒副作用；具有用量小、安全、长期稳定，机体无排除反应等优点，适用于临床治疗。

进一步的，本发明提供的应用能够治疗和/或预防感光细胞和视网膜色素上皮细胞凋亡引起的视网膜变性。

附图说明

图1为实施例1中小鼠各个组织器官中REG1A的表达量的电泳图；

图2为实施例2中小鼠视网膜中REG1A的定位的免疫荧光图片；

图3为实施例3中分析重组蛋白His-REG1A表达的SDS-PAGE电泳图；

图4为实施例4中REG1A蛋白对光照诱导的感光细胞凋亡的影响趋势；

图5为实施例4中REG1A抑制661W细胞光损伤的细胞形态图片；

图6为实施例5中重组REG1A蛋白对RPE细胞活力的影响趋势；

图7为实施例6中REG1A的受体EXTL3在661W细胞及ARPE-19细胞中表达的电泳图；

图8为实施例6中REG1A的受体EXTL3在视网膜光感受器的外节表达的免疫荧光图片；

图9为实施例7中REG1A蛋白抑制离体培养视网膜细胞凋亡结果；

图10显示纯化后的REG1A蛋白和商业化REG1A蛋白电泳条带。

具体实施方式

本发明中，所述视网膜细胞凋亡优选是由光照诱导产生的。

本发明中，所述REG1A蛋白通过与视网膜细胞表面的受体EXTL3结合，抑制视网膜细胞凋亡。

本发明中，所述的视网膜细胞优选包括感光细胞和视网膜色素上皮细胞。

本发明中，药物的剂型优选包括注射剂。

本发明中，所述注射剂优选包括REG1A蛋白和可接受的辅料。

本发明中，所述REG1A蛋白的来源是由北京义翘神州生物技术有限公司合成。所述REG1A蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No 10所示。

本发明中，所述注射剂中REG1A蛋白的浓度优选为0.6～2.5mg/m1，更优选为0.625mg/ml。

本发明中，所述的辅料优选包括无菌0.9％氯化钠溶液。

本发明还提供了所述药物的制备方法，包括以下步骤：将0.6～2.5mg粉末状REG1A蛋白制剂溶于0.1ml无菌0.9％氯化钠溶液，重复溶解后，得到药物。所述药物作为添加剂加入离体视网膜培养系统，终浓度为0.6～2.5mg/ml，能明显减少视网膜细胞的凋亡。

下面结合实施例对本发明提供的REG1A蛋白在制备治疗和/或预防视网膜细胞凋亡药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

神经分泌因子reg1a基因在小鼠视网膜中表达情况

取小鼠各部位作为实验材料，包括胰腺、肾脏、心脏、皮肤、小肠组织、大脑、睾丸、脉络膜、肝脏、脾脏、肺、额下腺、角膜、视网膜及晶状体。将上述材料采用试剂盒法提取各材料的mRNA。

将提取的mRNA经过质量检测后，将完整性高的mRNA进行半定量PCR检测。具体是采用逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA，对REG1A基因进行半定量PCR反应，以GAPDH作为内参基因，EG1A基因和mGAPDH的引物序列见表1，PCR反应体系见表2，PCR程序见表3。

表1 REG1A基因和GAPDH的引物序列

表2 reg1a基因和GAPDH的PCR扩增体系

成分	体积
		2×Power Taq PCR MasterMix	10μl
Primer(F+R)	2μl
		cDNA	2μl
ddH<sub>2</sub>O	6μl
		总体系	20μl

表3 reg1a基因和GAPDH的PCR反应条件

PCR反应结束，将PCR产物在0.1％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，经过EB染色后再凝胶成像系统下观察并拍照，电泳图如图1所示。

由图1中可以看出，reg1a在肾脏、小肠和胰腺中有很高的表达量，而且在眼睛的不同组织也有表达，包括角膜、视网膜及晶状体，这说明在视网膜组织内表达regla基因。

实施例2

免疫染色步骤：

解剖小鼠视网膜，放入4％多聚甲醛中固定1h，经15％和30％葡萄糖脱水处理后，放入OCT包埋剂中包埋，制备冰冻切片；

清洗，将视网膜切片放入DPBS中，置于摇床上缓慢漂洗3遍，每次5分钟。

漂洗结束，每孔加入500μl用DPBS配制的0.5％的Triton X-100穿透液，室温通透细胞10分钟，吸去穿透液。

重复步骤3，每孔加入500μl用DPBS配制的3％的H₂O₂，室温10min，去除过氧化物酶的影响。

吸去H₂O₂，重复步骤3。用4％BSA(用DPBS配制)室温封闭30min。

吸去BSA后，重复步骤3。将REG1A抗体按1∶100稀释后，加入培养皿内，4℃孵育过夜。

回收一抗，重复步骤3。将FITC标记的荧光二抗按1∶200稀释后加入细胞培养皿内，锡箔纸包被避光，室温孵育1小时。

吸去二抗，DPBS漂洗3次，加入DAPI染色液，进行复染。并将盖玻片盖在滴有防淬灭剂的视网膜切片上面，盖玻片周围用指甲油封闭。

待干燥后，在荧光显微镜下观察，拍片并分析结果。以IgG作为对照，按照上述方法进行免疫荧光实验。视网膜中免疫荧光结果如图2所示。

由图2可知，用免疫荧光染色的方法研究小鼠视网膜中REG1A的定位，发现REG1A特异性的表达在小鼠视网膜的神经节细胞层，而在视网膜其他细胞中均未见表达。

实施例3

重组REG1A蛋白的表达纯化

将reg1a基因按照实施例1中PCR扩增方法，得到reg1a基因片段的经过琼脂糖凝胶电泳，胶回收后得到大量reg1a基因片段。利用连接试剂盒，将回收的reg1a基因片段与pET28a载体进行酶切连接，得到重组载体。将重组载体转化到大肠杆菌菌株BL-1中，摇床培养，培养得到的菌落经过菌落PCR验证阳性菌。向阳性菌种加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，离心收集菌体，加入缓冲液，制成菌体混悬液，超声波破碎，离心收集蛋白质。比较添加IPTG前后细菌中蛋白表达变化，将提取的蛋白质进行PAGE凝胶电泳，结果如图3所示，其中Marker代表低分子量标准蛋白；+IPTG：加入0.1mMIPTG诱导的质粒pET28a-His-REG1A转化的BL21全菌；-IPTG表示未经IPTG诱导的质粒pET28a-His-REG1A转化的BL21全菌；R1-3表示经Ni²⁺-NTAagaros纯化的His-REG1A洗脱液1，2，3。

从图3中可以得到，加入IPTG诱导后的菌落提取的蛋白质经过电泳分离，在20kDa的位置有明显的融合蛋白表达条带，而未经IPTG诱导的样品对应位置无明显条带。这说明reg1a基因片段在重组菌种成功表达REG1A蛋白。

实施例4

661W细胞是鼠源感光细胞系，根据专利号为ZL 2013 1 0631831.4的专利公开的″温度与光照可控型视网膜光损伤定量研究装置″成功建立了光损伤661W细胞模型。用0.625mg/ml，1.25mg/ml和2.5mg/ml的重组REG1A蛋白预处理光损伤的661W细胞2h，然后予以10000lux光照刺激，此方案为实验组。以未加入重组REG1A蛋白的一组作为对照。对实验组和对照组进行形态学观察并在光学显微镜下拍照，并且通过Cell counting kit检测重组REG1A蛋白处理实验组和对照组的细胞活力，两组细胞活力见图4，两组细胞的形态如图5所示。

由图4可以看出，发现光照后，未加入重组REG1A蛋白组，细胞活力显著下降，约为实验组的50％。但是加入不同浓度的REG1A蛋白均对细胞凋亡具有抑制作用，而且随着蛋白浓度的增加，细胞活力显著提高。说明REG1A蛋白能够抑制光照引起的感光细胞凋亡。

由图5可以看出，611W细胞经过10000lux白光光照8h后，细胞形态发生明显改变，细胞呈扁圆状，贴壁不牢，是明显的细胞凋亡状态，而加入1.25mg/ml的REG1A蛋白的细胞形态与健康611W细胞形态变化不大，未见明显凋亡细胞。从细胞形态可观察到，加有REG1A蛋白处理后光照8h的661W细胞较未加REG1A蛋白的处理的细胞，其细胞状态明显变好。这些结果表明，神经分泌因子REG1A蛋白能够抑制光照诱导的661W细胞凋亡。

实施例5

REG1A蛋白对RPE细胞系ARPE-19细胞凋亡的抑制作用

将ARPE-19培养于低糖低血清的培养基中，一个月后，ARPE-19细胞呈明显的六边形，并有少量色素形成，得到与体内的RPE细胞具有类似的特征的ARPE-19细胞。向ARPE-19细胞加入1.25mg/ml的重组REG1A蛋白，测定细胞活力，该组作为实验组，以未加入重组REG1A蛋白细胞活力处理作为对照组，测定细胞活力。ARPE-19细胞经10000lux白光光照8h后加入1.25mg/ml的重组REG1A蛋白，测定细胞活力，该组作为实验组，以未加入重组REG1A蛋白细胞活力处理作为对照组，测定细胞活力。将四组测定的细胞活力建立柱状图，如图6所示。

从图6可知，未经光照的实验组和对照组细胞活力稍有差异，而经过光照的实验组比对照组相比存在显著差异，并且加入重组REG1A蛋白后细胞活性显著提高，该结果证明重组REG1A蛋白对RPE细胞也具有明显的保护作用。

实施例6

神经分泌因子REG1A蛋白干预光照诱导的细胞凋亡的机制

检测REG1A的受体EXTL3在661W细胞及ARPE-19细胞中表达情况，以GAPDH作为内参基因，扩增EXTL3和GAPDH基因的引物和PCR反应程序为如表4所示，PCR反应体系如表5所示。扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(如图7中A部分所示)。

按照实施例3中的方法制备重组EXTL3蛋白，并且对重组EXTL3蛋白进行蛋白印迹(如图7中B部分所示)。

由图7可知，受体EXTL3在661W细胞及ARPE19细胞中均有表达，而且，免疫荧光结果也证明了，受体EXTL3在小鼠视网膜中，主要在感光细胞中表达。

采用实施例2中的免疫荧光检测的方法检测661W细胞及ARPE19细胞中EXTL3的表达情况(如图8)。免疫荧光结果也证明了，受体EXTL3在小鼠视网膜中也表达，主要在视网膜光感受器的外节。

基于上述结果，REG1A蛋白是有视网膜神经节细胞的分泌的一种神经营养因子，通过与感光细胞和RPE细胞表面的受体EXTL3结合，发挥作用。起到保护感光细胞和RPE细胞的作用，抑制感光细胞和RPE细胞的凋亡。

表4.PCR引物及程序

表5 hEXTL3基因和GAPDH的PCR扩增体系

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

实施例7

神经分泌因子REG1A蛋白干预离体培养视网膜

解剖刚出生小鼠视网膜(此时小鼠视网膜并未完全发育)，以传统离体视网膜培养方法进行培养(有参考文献)作为对照，将0.625mg/ml的REG1A蛋白添加至离体培养视网膜培养系统作为实验组，将对照组和实验组视网膜培养14天后，分别进行荧光染色和统计视网膜凋亡水平。

REG1A蛋白抑制离体培养视网膜细胞凋亡结果见图9，其中A为TUNEL检测离体培养视网膜中细胞凋亡情况；B为统计的凋亡细胞数量。对照组和实验组小鼠视网膜培养14天发育成结构稳定的三层结构，但是对照组视网膜细胞凋亡很多，而添加REG1A蛋白的实验组较对照组，细胞凋亡明显减少。由此可知，REG1A蛋白能有效抑制视网膜细胞凋亡。

SEQUENCE LISTING

<110> 温州医科大学

<120> REG1A蛋白在制备治疗和/或预防视网膜细胞凋亡药物中的应用

<130> 2016

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccatcaccat cttccaggag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccacagtct tctgggtggc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtctccaagc caaggccagg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccagacattg gcgtctgtag 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

catcttccag gagcgagatc c 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

caccactgac acgttggcag tg 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ctccaactac tcctgtgagc 20

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gggagtcatc atgagacagg 20

<210> 9

<211> 501

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atggctcaga ccagctcata cttcatgctg atctcctgcc tgatgtttct gtctcagagc 60

caaggccaag aggcccagac agagttgccc caggcccgga tcagctgccc agaaggcacc 120

aatgcctatc gctcctactg ctactacttt aatgaagacc gtgagacctg ggttgatgca 180

gatctctatt gccagaacat gaattcgggc aacctggtgt ctgtgctcac ccaggccgag 240

ggtgcctttg tggcctcact gattaaggag agtggcactg atgacttcaa tgtctggatt 300

ggcctccatg accccaaaaa gaaccgccgc tggcactgga gcagtgggtc cctggtctcc 360

tacaagtcct ggggcattgg agccccaagc agtgttaatc ctggctactg tgtgagcctg 420

acctcaagca caggattcca gaaatggaag gatgtgcctt gtgaagacaa gttctccttt 480

gtctgcaagt tcaaaaacta g 501

<210> 10

<211> 166

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Ala Gln Thr Ser Ser Tyr Phe Met Leu Ile Ser Cys Leu Met Phe

1 5 10 15

Leu Ser Gln Ser Gln Gly Gln Glu Ala Gln Thr Glu Leu Pro Gln Ala

20 25 30

Arg Ile Ser Cys Pro Glu Gly Thr Asn Ala Tyr Arg Ser Tyr Cys Tyr

35 40 45

Tyr Phe Asn Glu Asp Arg Glu Thr Trp Val Asp Ala Asp Leu Tyr Cys

50 55 60

Gln Asn Met Asn Ser Gly Asn Leu Val Ser Val Leu Thr Gln Ala Glu

65 70 75 80

Gly Ala Phe Val Ala Ser Leu Ile Lys Glu Ser Gly Thr Asp Asp Phe

85 90 95

Asn Val Trp Ile Gly Leu His Asp Pro Lys Lys Asn Arg Arg Trp His

100 105 110

Trp Ser Ser Gly Ser Leu Val Ser Tyr Lys Ser Trp Gly Ile Gly Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Val Asn Pro Gly Tyr Cys Val Ser Leu Thr Ser Ser Thr

130 135 140

Gly Phe Gln Lys Trp Lys Asp Val Pro Cys Glu Asp Lys Phe Ser Phe

145 150 155 160

Val Cys Lys Phe Lys Asn

165

Claims

1.REG1A蛋白在制备治疗和/或预防视网膜细胞凋亡药物中的应用；所述视网膜细胞凋亡是由光照诱导产生；

所述的视网膜细胞为感光细胞和视网膜色素上皮细胞。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，药物的剂型包括注射剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述注射剂包括REG1A蛋白和注射剂可接受的辅料。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在视网膜细胞离体培养中，所述注射剂中REG1A蛋白的浓度为0.625～2.5mg/ml。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的辅料包括0.9％氯化钠溶液。