CN109862851A - 用于治疗炎症的丝衍生蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本文描述了通过向患有炎性病症的受试者施用有效量的丝衍生蛋白(SDP)或其部分来减轻炎症的方法。所述方法包括治疗炎性病症和伤口，包括角膜伤口；所述方法包括局部施用有效量的本文所述的SDP材料。

Description

用于治疗炎症的丝衍生蛋白质
相关申请
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2016年8月12日提交的申请号为62/374,532、2016年10月13日提交的申请号为62/407,863、2017年3月6日提交的申请号为62/467,697的美国临时专利申请的优先权。上述在先申请在此通过引用全部纳入本文。
政府资助
本发明获得了由National Science Foundation提供的项目编号为1152561以及由US Army提供的项目编号为A151-061-0107的政府资助。美国政府对于本发明拥有一定的权益。
发明背景
炎症描述染病细胞对有害刺激(例如感染)或局部组织损伤的协同反应，以试图恢复免疫稳态。
驻留细胞暴露于这些异常状况会启动细胞内信号传导级联，导致炎症介质的产生和分泌。这些炎性实体的局部沉积用于将间质和脉管系统中的免疫细胞(例如嗜中性粒细胞)募集到受损伤或被侵入部位。成功消除刺激之后是组织修复，其引入新类型的免疫细胞(例如巨噬细胞)和信号传导中间体并且结束急性炎症反应(Medzhitov,Nature,2008.454(7203):428-435)。然而，如果在该时间跨度内未达到组织稳态，则会发生慢性炎症反应，由此将额外的免疫细胞引入损伤部位以试图对它进行控制。虽然如此，慢性炎症可能永久地破坏健康的组织状态。由慢性炎症引起的失调的信号传导途径涉及多种疾病，包括干眼症，自身免疫疾病，心血管疾病和癌症。
虽然免疫应答的起因可能对宿主来说是异常的，但是由于异常细胞信号传导导致的局部组织稳态破坏也可以形成驱动免疫细胞募集和响应的信号分子的浓度梯度。例如，眼睛顶面泪膜成分的破坏导致增加产生促炎细胞活素，其急性和慢性刺激免疫级联反应(Luo et al.,Eye&Contact Lens,2005.31(5):186-193)。这种称为干燥性角膜结膜炎或干眼综合征(DES)的病症由于经常的炎症刺激而持续存在，转化为改变的细胞机械应力(通过细胞收缩)和基因表达(Brocker et al.,Biomolecular Concepts,2012.3(4):345-364)。这进一步促进产生细胞活素，其作用于局部微环境并募集介质细胞类型的急性炎症反应。反过来，迁移性中性粒细胞分泌额外促炎形态成形素，改变眼角膜血管通透性，从而允许活化T细胞流入受刺激眼表，转变为慢性炎症状态(Baudouin,Survey of Ophthalmology,2001.45(2):S211-220)。
这种刺激的一个具体例子的发生伴有泪膜液高渗透压，其是由加速的泪液蒸发或泪腺分泌不足而引起。如果高渗刺激不能通过免疫细胞介质的作用而处置，则免疫稳态不能实现，并且眼表面和泪腺的破坏随着时间的推移通过眼表面的失调的组织重塑机制而发展。该级联作用可导致增加产生基质金属蛋白酶9(MMP-9)，其在组织重构的失控前馈机制中降解眼表面。
减轻炎症反应的方法通常针对促炎信号分子的产生。这些包括使用糖皮质激素类固醇，其功能是减少促炎蛋白的产生，同时增加受体细胞内抗炎蛋白的产生(Rhen et al.,The New England Journal of Medicine,2005.353(16):1711-1723)。然而，糖皮质激素信号传导的作用是有效的，并且不受限于免疫细胞信号传导，影响代谢和液体免疫稳态、神经元功能和胎儿发育。因此，糖皮质激素信号传导受到严格调节，并且通常限于慢性过度活跃的免疫系统疾病。相反，非甾体类抗炎药(NSAIDs)，其包括阿司匹林、布洛芬和萘普生，具有抑制环氧合酶(COX)酶活性的作用，这种活性在炎症细胞中大量增加的前列腺素产生之前(Ricciotti et al.,Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology,2011.31(5):986-1000)。NSAID是炎症过程的有效抗击物，但通常全身给药会抑制体内其他部位的COX酶的功能，可导致胃溃疡和肾功能障碍。考虑到上述治疗策略的脱靶副作用，理想地，抗炎剂应定位于受损或感染的组织(例如皮肤或眼表)。
靶向抗炎疗法的应用有望减少免疫细胞反应，且副作用最小。例如，针对促炎介质(例如趋化因子)拮抗剂抗体的开发可能有效地用于炎性疾病(Skov et al.,Journal ofImmunology,2008.181(1):669-679)。
然而，这些蛋白质的生产成本较高，并且抗体生产的可变性可能影响治疗功效。另外，趋化因子产生和/或分泌上游的信号传导途径的药理学抑制剂可能在理论上是理想的，因为它们将消除参与急性和最终慢性炎症反应的免疫细胞类型的募集。在这些理论目标中包括核因子-kappa B(NF-κB)转录因子家族，其与急性促炎形态成形素的产生密切相关(Hayden et al.,Cell Research,2011.21(2):223-244)。天然地，NF-κB亚基存在于细胞质中，并且通过掩蔽靶向递送至该区域的蛋白质残基来防止核转位。然而，在刺激后，抑制蛋白迅速降解，从而允许NF-κB蛋白的易位和DNA结合以及随后的基因转录。
存在许多天然和合成NF-κB抑制剂。前者包括丝素蛋白，其为由分离自家蚕茧的重蛋白链和轻蛋白链(分别为390kD和26kD)组成的二聚体(综述于Altman et al.,Biomaterials,2003.24(3):401-416)。这些球状蛋白质通过轻链和重链的二硫键聚集成纤维状结构，并且在β-折叠二级结构中表现显著均匀性。已显示丝素蛋白抑制NF-κB蛋白亚基的转录和上游活化(即通过抑制蛋白激酶)(Chon et al.,International Journal ofMolecular Medicine,2012.30(5):1203-1210)。此外，已显示丝素蛋白水解肽片段抑制通常受NF-κB控制的促炎分子转录(Kim et al.,J.Neurosurg.,2011.114(2):485-90；J.Microbiol.Biotechnol.,2012.22(4):494-500)。然而，丝素蛋白的使用尚未导致对炎性病症和伤口的有效治疗。
此外，眼部病症和损伤仍然是有关世界人口的持久和严重的问题。眼部病症和创伤对正常视力构成直接威胁，并且涉及愈合的整个过程，由于长期感染、慢性炎症和瘢痕形成而造成永久性残疾或失明的风险。因此，迫切需要治疗手段以减少炎症并加速受伤或发炎的眼组织的愈合。
发明概述
本发明提供了一种改良的丝素蛋白，用于治疗，例如减轻炎症以及促进伤口愈合和组织再生。所述改良的蛋白质已显示支持角膜上皮细胞附着和增殖。本文所述的丝衍生蛋白(SDP)是丝素衍生蛋白质组合物，其具有降低的β-折叠活性，产生高度可溶的和水稳定的材料。SDP可以很容易地以高浓度掺入基于溶液的产品配方中。另一个优点是SDP与其他溶解成分具有高度的混溶性，例如通常包含在眼科制剂中的那样。SDP的一个具体用途是将其作为新型蛋白质组分包含在眼科制剂中以增强眼表的溶液润湿特性。SDP可以分级，并且令人惊讶地发现SDP的低分子量级份具有增强的抗炎特性。
因此，本发明提供了一种丝素衍生蛋白质组合物，其在水溶液中具有增强的稳定性，其中丝素衍生蛋白质组合物的一级氨基酸序列与天然丝素蛋白的不同，相对于丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸含量的组合差异的绝对值相差至少4％；丝素蛋白重链和丝素蛋白轻链之间的半胱氨酸二硫键被减少或消除；蛋白质组合物中的多个肽链终止于酰胺(-C(＝O)NH2)基团；与天然丝素蛋白相比，所述组合物的丝氨酸含量降低了大于25％，其中所述丝氨酸含量为至少约5％；并且其中丝素衍生蛋白质组合物的平均分子量小于40kDa且大于2kDa。
在一些实施方式中，所述蛋白质组合物大于50％的蛋白质链的分子量为10kDa至60kDa。在各种实施方式中，所述蛋白质组合物在蛋白质组合物的水溶液超声处理时在高达10％w/w浓度不会凝胶化。
蛋白质组合物可具有小于8％的丝氨酸，小于7％的丝氨酸或小于6％的丝氨酸氨基酸残基。蛋白质组合物可以具有大于46％的甘氨酸氨基酸，大于46.5％的甘氨酸氨基酸。所述蛋白质可具有大于30％的丙氨酸氨基酸，或大于30.5％的丙氨酸氨基酸。
蛋白质组合物在干燥成薄膜后可以完全再溶解在水中。Beta-折叠蛋白质结构在水溶液中最小或不存在。在超声处理至少5秒后，蛋白质组合物可以保持在水溶液中的光吸收在550nm处小于0.25。
本发明还提供一种眼科制剂，其包含本文所述的蛋白质组合物和水，以及任选的一种或多种的缓冲介质、盐、稳定剂、防腐剂和润滑剂。
本发明进一步提供减轻炎症的方法，包括将丝素衍生蛋白质组合物施用于发炎组织；其中丝素衍生蛋白质组合物的一级氨基酸序列与天然丝素蛋白的不同，相对于丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸含量的组合差异的绝对值相差至少4％；丝素蛋白重链和轻链之间的半胱氨酸二硫键被减少或消除；蛋白质组合物中的多个肽链终止于酰胺(-C(＝O)NH2)基团；与天然丝素蛋白相比，所述组合物的丝氨酸含量降低大于25％，其中所述丝氨酸含量为至少约5％；并且其中丝素衍生蛋白质组合物平均分子量小于60kDa且大于2kDa；因此减少组织细胞核内的转录因子信号传导，从而减少炎症。丝素衍生蛋白质组合物的平均分子量也可小于55kDa,和/或大于约5kDa,大于10kDa,大于15kDa,或大于20kDa。
对发炎组织的施用可以降低一种或多种的炎性基因TNF-α，MMP-9，IL-1β和IL-6的转录。与不存在蛋白质组合物时相比，所述降低可达20％，40％，50％或60％。所述给药可以是对于角膜，而且所述给药可以减少角膜中MMP-9的存在。所述给药可以是对于眼睛，并且所述给药减少眼表面的炎症，比如通过泪膜中促炎标志物的ELISA测量所确定的。炎症的减少可以伴随着炎症部位细胞迁移速率的增加，比如通过MTT测定确定的细胞增殖的增加。
所述蛋白质组合物的平均分子量可小于40kDa，或小于35kDa。所述丝素衍生蛋白质组合物可以溶解于眼科制剂，其包含一种或多种的缓冲介质，盐，稳定剂，防腐剂和润滑剂。
所述炎症可以是由眼部病症引起，其中所述眼部病症是干眼症，角膜溃疡，角膜糜烂，角膜磨损，角膜变性，角膜穿孔，角膜瘢痕形成，上皮缺损，角膜结膜炎，特发性葡萄膜炎，角膜移植，年龄相关黄斑变性，糖尿病眼，睑缘炎，青光眼，高眼压，术后眼痛和炎症，后段新生血管，增生性玻璃体视网膜病变，巨细胞病毒性视网膜炎，眼内炎，脉络膜新生血管膜，血管闭塞性疾病，过敏性眼病，肿瘤，视网膜炎色素性，眼部感染，巩膜炎，眼睑下垂，瞳孔缩小，眼痛，瞳孔散大，神经痛，瘢痕性眼表疾病，眼部感染，炎症性眼病，眼表疾病，角膜病，视网膜疾病，全身性疾病的眼部表现，遗传性眼病，眼部肿瘤，眼内压增高确定，疱疹感染，Ptyrigium或巩膜肿瘤，持续到眼表的伤口，后屈光性角膜切开术眼睛疼痛和炎症，热或化学灼伤角膜，巩膜伤口，或圆锥角膜和结膜伤口。在一种实施方式中，所述炎症是由干眼症引起。
本发明进一步提供了本文所述的丝素衍生蛋白质组合物用于治疗炎症的用途，其中丝素衍生蛋白质组合物的一级氨基酸序列与天然丝素蛋白的不同，相对于丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸含量的组合差异的绝对值相差至少4％；丝素蛋白重链和丝素蛋白轻链之间的半胱氨酸二硫键被减少或消除；蛋白质组合物中的多个肽链终止于酰胺(-C(＝O)NH2)基团；与天然丝素蛋白相比，所述组合物的丝氨酸含量降低了大于25％，其中所述丝氨酸含量为至少约5％；并且其中丝素衍生蛋白质组合物的平均分子量小于60kDa且大于10kDa。其中，丝素衍生蛋白质组合物的平均分子量可以小于60kDa且大于10kDa。蛋白质组合物可具有小于35kDa的平均分子量。所述组合物可以是用于治疗干眼症的组合物。
因此，本文的SDP组合物在水溶液具有增强的稳定性，其中天然丝素蛋白的一级氨基酸序列由天然丝素蛋白修饰，其中丝素蛋白重链蛋白和轻链蛋白链之间的半胱氨酸二硫键减少或消除；其中所述组合物的丝氨酸含量与天然丝素蛋白相比降低了40％以上；其中SDP的平均分子量小于约60kDa。
附图说明
下述附图是说明书的一部分，并且被包括用以进一步说明本发明的某些实施方式或不同的方面。在一些情况下，通过参考附图结合本文给出的详细描述，可以更好地理解本发明的实施方式。说明描述和附图可以突出显示本发明的某个特定实施例或某个方面。然而，本领域技术人员会理解，所述实施例或方面的部分可以与本发明的其他实施例或方面组合运用。
图1A-D：hCLE的p65蛋白免疫染色(白色)培养用于NF-κB活化。(A)用PBS处理的阴性对照培养物显示胞质p65染色，表明天然NF-κB不活化。(B)用含有1ng/mL TNF-α的PBS处理的阳性对照培养物显示点状p65核染色，表明蛋白质易位并因此导致高水平的NF-κB活化。(C和D)用PBS，TNF-α和0.1％SDP或1％SDP处理的培养物，显示核p65染色的剂量依赖性减少，表明更高的SDP浓度分别更大程度地抑制NF-κB活化。(比例条＝20μm)。
图2：采用PBS，PBS加0.5％SDP，PBS加1ng/mL TNF-α细胞因子，和PBS加1ng/mLTNF-α细胞因子加0.5％SDP处理的hCLE培养物中TNF-α和MMP-9的相对倍数基因表达的总结qPCR结果。TNF-α和MMP-9是NF-κB活化的已知的遗传标记。发现用TNF-α刺激并用0.5％SDP处理的培养物相对于TNF-α细胞因子刺激的对照具有6倍的基因表达降低(Δp<0.01相较于各自GOI的PBS；Θp<0.01相较于各个GOI的SDP；以及#p<0.05相较于所示的组；n＝3)。
图3A-E：(A)从对MMP-9免疫染色的天然兔获得的角膜组织的代表性截面图像。(B-D)对于各种治疗组，在手术后72小时从兔获得的角膜截面的代表性免疫组织化学图像。与PBS处理的动物(B)相比，两种SDP处理组(C和D)的MMP-9染色均降低。(比例条带＝50μm)。(E)用PBS，0.5％SDP或2％SDP处理的角膜中MMP-9的测量染色强度(荧光强度)的总结图(*p<0.01相对于对照，#p<0.01相较于0.5％SDP,n＝3)。
图4：在上皮表面手术剥离后72小时内，用PBS，PBS加0.5％SDP和PBS加2％SDP处理的兔角膜中IL-1β和IL-6的相对倍数基因表达的qPCR结果。IL-1β和IL-6是角膜组织环境内炎症的已知遗传标记。在SDP处理下，两种标记物的表达显著降低(*p<0.01相对于PBS,对于每种GOI；n＝6)。
图5：在确定浓度的溶解蛋白质(PASF，SDP或SDP-4)存在下，通过电子顺磁共振(EPR)光谱测量H2O2水平的汇总图。在不存在(对照)或存在PASF，SDP或SDP-4(各自为0.5％，1％或5％)的条件下培育H2O2(20μM)，然后引入H2O2-特异性旋转探针。测量由氧化的自旋探针对每个样品产生的EPR信号，并将其标准化为对照样品(即缺乏蛋白质)。随着蛋白质浓度的增加，PASF增加EPR信号幅度。相反，SDP引起EPR信号幅度的浓度依赖性降低，表明SDP蛋白清除H2O2。在SDP-4蛋白存在下，H2O2的清除甚至更强。误差条表示为S.D.，N＝3。
图6：SDS-PAGE道2-5代表评估生物影响SEC级份SDP群体的相应分子量(MW)分布(SDP-1,SDP-2,SDP-3,SDP-4和SDP)。泳道6说明了从中获得分级的未分级SDP分布。MW标准显示在道1。
图7：来自体外伤口愈合测定的代表性图像表明，在5mg/mL SDP-3或SDP-4存在下，细胞生长和向白色轮廓的无细胞区域(伤口)的迁移显著加速。
图8：综合条形图显示在划痕伤口测定期间指定时间点的伤口闭合百分比(*p<0.05相对于对照样),(#p<0.05相对于SDP-1，n＝3),(相对于SDP-2,n＝3)。
图9：用5mg/mL分级SDP或(盐水缓冲液)对照处理的hCLE培养物中上皮细胞存活率的MTT分析。与对照细胞相比，用SDP-3和SDP-4处理显著增加细胞增殖。与对照相比，用SDP-1或SDP-2治疗没有改变细胞增殖(*p<0.05相对于对照样，n＝3；#p<0.05相对于SDP-1，n＝3；相对于SDP-2,n＝3)。
图10：未处理(天然)或用TNF-α刺激启动炎症信号传导的hCLE细胞中TNF-α，MMP-9和白细胞介素-1α/β，-6和-8转录的qPCR总结，并用1mg/mL分级SDP处理。与用PBS处理的对照细胞相比，用SDP-3和SDP-4处理显著降低了确定的炎性基因的转录。(相对于天然的，n＝3；*p<0.05相对于对照，n＝3)。
图11：未处理(天然)或用TNF-α刺激以启动炎症信号传导的hCLE细胞分泌TNF-α细胞因子的ELISA分析，并用1mg/mL SDP级份处理。与用PBS处理的对照细胞相比，用SDP-3和SDP-4处理显著降低促炎细胞因子TNF-α的分泌，而SDP-2显著增加分泌。(相对于天然，n＝3)，(*p<0.05相对于对照，n＝3)。
图12：转移盘迁移测定的综合结果证明相对于未处理的(天然)培养物，用TNF-α处理显著增加HL-60炎性细胞迁移。加入SDP-4(1mg/mL)导致TNF-α驱动的HL-60细胞迁移显著减少(相对于对照,n＝3；*p<0.05相对于天然,n＝3)。
发明详述
本发明提供了衍生自SDP的蛋白质组合物，用于治疗炎症和治疗伤口。证据支持从家蚕茧中分离的蛋白质刺激角膜细胞的生长并改变与伤口愈合和炎症有关的基因表达(图1-5)。所述蛋白质组合物还在水溶液中具有增强的溶解性和稳定性。制备蛋白质组合物的方法包括修饰天然丝素蛋白一级氨基酸序列，以减少或消除丝素蛋白重链和丝素蛋白轻链之间的半胱氨酸二硫键。另外，与天然丝素蛋白相比，所述蛋白质组合物的丝氨酸含量降低超过40％，并且蛋白质的平均分子量小于约60kDa。在一些情况下，本文所述蛋白质组合物包括或衍生自美国专利9,394,355描述的蛋白质组合物，其中全部公开的内容通过引用纳入本说明书。还可以分离较低的平均分子量级份，以提供具有增强抗炎活性的组合物，因为与较大分子量级份或整个SDP组合物相比，它们具有降低促炎基因表达的增强能力。
离散SDP亚群进一步增强愈合并减少体内炎症，特别是在角膜组织中。已显示选择的SDP级份增强SDP对细胞迁移反应和炎症的效力。通过在95℃下在0.3％碳酸钠中提取家蚕蚕丝纤维制备SDP级份，然后将丝素蛋白纤维溶解在54％LiBr溶液中。将溶解的溶液高压灭菌，粗过滤，然后通过渗滤纯化。该材料然后通过标称聚丙烯过滤器过滤以产生最终的SDP溶液。然后根据具体实验，通过使用两种方法之一将SDP溶液通过分子量(MW)分离。在第一种方法中，使用分子量截止滤器的离心用于通过截留分子量(MWCO)大小分离出SDP蛋白质级份。例如，SDP可以5000×g离心，直到样品减少至起始体积的10％(例如，对于本文所述的某些实验，15mL初始体积浓缩至1.5mL)。通过过滤器筛分的蛋白质小于特定过滤器的分子MWCO；保留的蛋白质通常具有相同或更高的分子量。在第二种方法中，样品SDP级份也可以通过尺寸排阻色谱(SEC)分离，以产生离散的蛋白质亚群或级份。产生四个降低平均分子量的级份，称为SDP-1，SDP-2，SDP-3和SDP-4(图6)。
两种最小分子量的SDP级份SDP-3和SDP-4通过增加的细胞迁移和增殖作用显著减少炎症并增强hCLE培养物的伤口愈合(图7-12)。这些SDP级份抑制炎症信号传导，其可以进一步增强伤口愈合并改善长期患者结果。因此，衍生自SDP的蛋白质级份可用于治疗炎症和相关病症。一种特定的治疗应用是治疗干眼症，其已知是炎性相关疾病，部分由NF-κB信号传导途径驱动，其被SDP抑制。在另一种特定的治疗应用中，SDP可用于治疗手术后损伤，以通过减少炎症和/或增加细胞增殖和/或迁移来诱导增强的愈合结果，例如在屈光性眼科手术或白内障摘除期间产生的那些损伤，和/或或角膜上皮受损的意外伤害。
定义
下面的定义是用来对说明书和权利要求书提供清晰和一致的理解。本文所采用的术语具有下述的含义。本说明书中所采用的其他术语和短语具有本领域技术人员所能理解的普通含义。这种普通含义可通过参考技术辞典获得，例如Hawley’s Condensed ChemicalDictionary 14th Edition,by R.J.Lewis,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,2001。
本说明书中提及的“一种实施方式”("one embodiment")、“实施方式”("anembodiment")等表明所描述的实施方式可包含特定的方面、特征、结构、部分或特性，但并不是每个实施方式都必须包含这些特定的方面、特征、结构、部分或特点。此外，这些短语可能，但并不一定，适用于在本说明书其它部分提及的相同的实施方式。此外，当特定的方面、特征、结构、部分或特点是结合某种实施方式进行描述的，本领域技术人员应当能够知道将这些特定的方面、特征、结构、部分或特点应用到或关联到其它的实施方式，无论是否明确地表述出来。
单数形式的冠词“a”“an”和“the”包括复数含义，除非上下文存在明确的不同阐述。因此，例如，“化合物”可以是指包括多个这样的化合物，从而化合物X包括多个的化合物X。进一步值得注意的是，权利要求书可能被撰写为排除任何可选元素。因此，本声明旨在作为排除性术语使用的前置基础，例如“单独(solely)”、“仅仅(only)”等术语，与本文所描述的任何元素相关联和/或作为对权利要求所述要素的限定或者用作“负面”限制。
术语“和/或”("and/or")是指相关项目的任何一项、任何组合，或它们的全部。短语“一个或多个”("one or more")和“至少一个”("at least one")是本领域技术人员都能容易理解的，尤其是根据上下文理解。例如，这些短语可以是指一、二、三、四、五、六、十、一百，或大约比已经列举的下限高出10、100或1000倍的任何上限值。
术语“大约”(“about”)表示特定值可以具有±5％、±10％、±20％或±25％的变化。例如，“大约50”百分比在一些实施方式中可变化为45到55百分比。对于整数范围，术语“大约”可包含在所指范围各端相较于所列举的整数小或大一个或两个整数。除非文中另有说明，术语“大约”是用来包括对于成分、组合或实施例的功能来说等同的接近所列范围的数值。术语“大约”也能够用来对本段前述范围的端点进行调整。
本领域技术人员应当能够理解，包括表示成分含量、诸如分子量的性质、反应条件等等的任何数目都可以是近似的，并且在各种情下都能够采用术语“大约”进行修饰。取决与本领据技术人员通过本文所述方法所期望获得的性质，这些值是可以有变化的。还应当理解，这些值，由于测试中出现的标准偏差必然会导致其内在的可变化性。
本领域技术人员应当理解，出于任何不同目的，尤其就提供文字描述来说，本文提供的任何范围还包括所有可能的子范围及其组合，以及构成所述范围的单独值，尤其是整数值。所引述范围(例如重量百分比或碳基团)包括各个特定的数值、整数、小数或所述范围内的特性。应当易于理解，所列举的任何范围能够充分描述并能够使的相同的范围被分解为相等的二等份、三等分、四等分、五等分或十等分。作为非限制性例子，本文所述的每个范围都可容易地分解为下三分之一，中三分之一和上三分之一等等。本领域技术人员也应当能够理解，诸于“高至”、“至少”、“高于”、“低于”、“多于”、“或以上”或类似的术语包含所列举的数字，并且这种术语还指所述范围可随后分成上文述及的子范围。同样地，本文所列的任何比率也包含落在较宽比率之内的子比率。因此，自由基、取代基和范围的具体数值只是用来进行说明；其不排除自由基和取代基的其它指定数值或其它指定范围的数值。
本领域技术人员还应当能够容易理解，当单元被按照通常的方式例如在马库什群组中被组合起来时，本发明不仅包括所列单元组合构成的整体，还包括所述群组单独的每个单元以及所述基本群组的任何可能的亚群组。另外，对于所有的目的，本发明不仅包括基本群组，还包括基本群组去掉一个或多个单元的群组。可见，本发明可以包括明确排除所引述群组的任何一个或多个单元。因此，有关约束条件可以附加于任何公开的范畴或实施方式，其中任何一个或多个单元、种类或实施方式，可从所述范畴或实施方式中排除出来，例如，用于明示负面限定的场合。
术语“接触”("contacting")是指触及、接触，或者邻接或紧密地靠近，例如，包括在细胞或分子水平，比如在溶液或反应混合物中，在体外或体内，发生生理反应、化学反应或物理变化。
对于治疗应用，术语“有效量”是指有效地治疗疾病、失调和/或病症，或者造成所述效果的量。例如，有效量可以是有效地减缓所治疗的病症或症状的进展或程度的剂量。对治疗上有效量是在本领域技术人员能力范围内能够确定的。术语“有效量”是指包括本文所描述的化合物的量，或本文所描述的肽类的组合的量，比如，是用于针对受试者有效地治疗或预防疾病或失调，或者治疗疾病或失调的症状。因此，“有效量”通常是指能提供预期效果的量。
丝素蛋白是源于家蚕的蚕茧(例如Bombyx mori)。丝素蛋白包括约350-400kda分子量的重链和约25kda分子量的轻链，其中所述重链和轻链通过二硫桥连接在一起。所述重链和轻链的初级序列在本领域是已知的。丝素蛋白链具有亲水的N和C末端结构域，以及疏水/亲水氨基酸序列的交替嵌段，从而允许与溶液中周围分子的空间和静电作用。在低浓度的稀释度(1％或以下)所述丝素蛋白分子已知呈现延长的蛋白链形式并且在溶液中不会立即聚结。所述丝素蛋白能够高度混溶于诸如HA、PEG、甘油和CMC的水合分子，并且被发现是高度生物相容的，在体内通过酶的作用自然结合或降解。天然的丝素蛋白质或现有技术丝素蛋白(PASF)是在本领域已知的，并且已被描述于，例如Daithankar et al.(IndianJ.Biotechnol.2005,4,115-121)。
术语“丝衍生蛋白(silk-derived protein)”(SDP)和“丝素衍生蛋白(fibroin-derived protein)”在本文中可以交换使用。这些物料由本文所述方法制备，涉及热、压力和重盐溶液的高浓度。因此“丝衍生的”和“丝素衍生的”指的是修饰丝素蛋白的工艺过程的原料，以获得具有本文所述结构、化学和物理性质的蛋白质组合物。SDP可能来自蚕丝(例如家蚕丝)、蜘蛛丝或基因工程丝。
本文中的术语“分子量(molecular weight)”和“平均分子量(average molecularweight)”是指通过用NuPAGETM 4％-12％Bis-Tris蛋白凝胶(ThermoFisher Scientific,Inc.)进行标准十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并与ImageJ软件(National Institutes of Health)组合分析测定的重均分子量。ImageJ用于确定样品中给定分子量的蛋白质的相对量。为此该软件通过将凝胶上的染色(即蛋白质的量)转化为定量信号强度来实现。然后，用户将该信号与由已知分子量的物质组成的标准(或梯子)进行比较。梯子上每个标记之间的信号量除以整个信号。每个蛋白质亚群的累积总和，在本文中也称为级份并且可互换地也称为片段，允许用户确定中值分子量，其在本文中称为平均分子量。在实践中，电泳凝胶被染色，然后扫描成灰度图像，使用ImageJ将其转换成直方图。每个凝胶泳道内的总像素强度通过ImageJ定量(即，直方图下的总面积)，随后分级成由在凝胶上染色的蛋白质分子量标准划分的群体。任何两个分子量标准之间的直方图像素区域除以蛋白质的总直方图面积，从而提供落入这些分子量内的总蛋白质的分数。其他方法的分析可能提供不同的值，其解释SDS-PAGE方法未解释的某些肽。例如，HPLC可用于分析平均分子量，该方法提供的值通常为约10-30％，低于通过SDS-PAGE测定的值(随着分子量降低而增加的差异)。
SDP组合物的制备
与天然丝素蛋白在水溶液中相比，本文所述的SDP组合物可具有增强的稳定性。本文提供的SDP组合物(本文中称SDP)实现的增强的稳定性，与天然/PASF蛋白(本文中称PASF)相比，使得所述材料能够显著更长地维持在溶液中。本文提供的SDP材料的增强的稳定性还允许制备高浓度的SDP溶液而没有聚集、沉淀或凝胶化。在诸如滴眼剂或需要蛋白质可溶于溶液的商业应用中，增强的稳定性可通过减少蛋白质聚集而提供适当长的保质期和提高产品质量。溶液中蛋白质的潜在聚集会对产品在特定应用中的期望性能产生负面影响。将SDP浓缩至溶液中较高组成(超过50％w/v或>500mg/mL)的能力对于贮存可以原样使用或稀释成任何量使用的有用工作溶液是非常有利的。此类使用的例子包括将SDP片段作为成分用作眼科制剂，例如本文所述，作为蛋白质补充剂或添加剂。
如本文所述，通过降低分子对聚集的敏感性，将天然丝素蛋白的一级氨基酸序列转化为SDP材料增强了其在水溶液中的稳定性。聚集最终导致凝胶形成。在天然丝素蛋白的转化中，丝氨酸和半胱氨酸氨基酸都在高温和脱水条件下裂解。同样，Patchornik et al.(J.Am.Chem.Soc.1964,86,1206)证明脱氢丙氨酸(DHA)中间体由溶液中的丝氨酸和半胱氨酸形成。氨基酸的降解进一步借助于强脱水溶剂系统，例如本文所述的50-55％w/v LiBr溶液，其中发生氢化物转移以诱导水的去除。降解反应可以在氢氧根离子(例如，pH7.5至pH11)的存在下进行，这进一步驱动DHA中间体的裂解。该裂解形成酰胺、丙酮酰肽和LiBr。式1中概述了一种用于丝氨酸氨基酸的可行化学机理，该式也适用于半胱氨酸氨基酸。将PASF蛋白的丝氨酸和半胱氨酸氨基酸化学改变为具有进一步水解切割的DHA中间体使得SDP产物的溶液稳定性增强。
式1：示意性详细描述了丝氨酸和半胱氨酸降解基于的化学反应。
通过在脱水高盐浓度环境下由氢化物转移反应形成的DHA中间体的产生来促进降解。然后通过碱性溶剂环境内的SN2反应完成DHA的降解。
上面讨论的这种裂解反应可以显著影响所得肽的大分子性质，这导致水溶液中的稳定的SDP材料。如Greving et al.(Biomacromolecules 2012,13(3):676-682)所述，丝素蛋白的初始蛋白质聚集被认为是由天然丝素蛋白重链和轻链在半胱氨酸氨基酸上的相互作用引发的。丝素蛋白轻链和重链内的半胱氨酸氨基酸通过二硫键相互作用。这些二硫键参与丝素蛋白聚集和凝胶网络絮凝。没有天然的丝素蛋白轻链存在，蛋白质明显不易聚集。因此，本文所述的方法可通过降低半胱氨酸含量从而降低或消除二硫键形成能力来有效降低天然丝素蛋白轻链形成二硫键的能力。通过这种机理，本文所述的转化过程通过降低或消除形成半胱氨酸衍生的聚集的能力在功能上稳定所得的SDP在溶液中。
除了聚集诱导二硫桥外，丝素蛋白进一步聚集成絮凝结构的敏感性也受到Mayenet al.(Biophysical Chemistry 2015,197:10-17)描述的蛋白质氨基酸化学的驱动。丝素蛋白丝氨酸，丙氨酸和甘氨酸氨基酸序列的分子模型显示，丝氨酸的存在通过更大的在相邻丝素蛋白链部分之间产生氢键的倾向增强了初始蛋白质与蛋白质的相互作用。模型表明，丝氨酸减少和丙氨酸和甘氨酸增加降低了蛋白质聚集的初始倾向。分子模拟观察表明，通过改变丝素蛋白的天然氨基酸化学，可以使得材料具有在水溶液中更高的稳定性。
实现增强稳定性的一种策略是从蛋白质中消除带电的官能团，比如羟基。由于羟基的相对高的电负性，该化学反应可以驱动与可用氢原子的氢键和与带正电荷的氨基酸基团的非特异性电荷相互作用。几乎12％的天然丝素蛋白含量是丝氨酸，其带有羟基官能团。因此，通过降低促进氢键的羟基的可用性，溶液中的总蛋白质稳定性增强。本文所述的方法有效地降低了丝氨酸含量并增加了相对丙氨酸和甘氨酸含量，这消除了可用于形成氢键的可用羟基的数量。通过这种机理，本文所述的过程在功能上稳定了所得的SDP以延长的时段(例如，至少几[6-8]个月，和/或超过1.5年；有关延长的研究还在进行，表明稳定性能够保持超过2年，或超过3年)。
除了半胱氨酸和丝氨酸部分的减少之外，溶剂电荷相互作用对于稳定蛋白质溶液是重要的。在最初的蛋白质絮凝之后，认为凝胶化过程继续推动天然丝素蛋白重链之间的更紧密的关联，这导致重链的疏水性嵌段之间的分子内和分子间β-折叠形成。一旦发生显著的β-折叠形成，丝素蛋白溶液就转变为凝胶。随着溶液转变为凝胶，并且丝素蛋白变得不可溶并且不再可用作基于溶液的产品。为了防止凝胶化，可以将SDP溶液的pH升高至高碱度，例如高于pH 7.5，以增强稳定性。结果，增高的pH产生额外的游离羟基，在溶液中的SDP分子周围形成价盾。形成的化合物屏蔽用于产生ζ电位，其通过减少源自氢键或非特异性带电和/或疏水相互作用的蛋白质─蛋白质相互作用来稳定蛋白质。丝素蛋白转化过程通过这种和其它机理在功能上稳定溶液中处理的SDP。SDP可衍生自Bombyx mori家蚕丝蛋白或Bombyx属的其他丝素蛋白或其他丝素蛋白。
SDP片段可以是通过以下过程制备：
1.通过去除蛹材料并在温水中预漂洗来制备丝茧。
2.通过在碱性pH以及高水温(通常95℃或以上)的水中洗涤茧，从胶状蛋白丝胶蛋白中提取天然丝素蛋白纤维。
3.将提取的丝素蛋白纤维干燥，然后使用能够中和β-折叠之间氢键的溶剂系统进行溶解；20％w/v丝素蛋白的54％LiBr水溶液对该中和步骤是有效的。
4.将LiBr溶液中溶解的丝素蛋白在高压釜环境(～121℃[～250°F]，在～15-17PSI压力下，在温度下处理约30分钟)进行处理。
5.然后对经热处理的丝素蛋白和LiBr溶液进行透析，以从溶液中除去锂和溴离子。在该过程的这个时间点，所述材料已经被化学转化为SDP。
6.然后经过透析的SDP被过滤，以除去任何未溶解的聚集体和污染的生物负载。
所述SDP溶液是通过与现有丝素蛋白溶液生产显著不同的方法进行生产。值得注意，丝素蛋白在溶液中与LiBr结合时的高压灭菌引发化学品转化以产生稳定的SDP材料。将丝素蛋白溶解在LiBr溶液中，中和溶解的天然丝素蛋白的氢键和静电相互作用。这使得在溶液中所述蛋白质没有特定的二级结构。结果，丝素蛋白链内的共价键水解所需的热力学能量达到其启动水解切割的最低能量需求。
在一种实施方式中，在15-17PSI高压釜条件下将温度设定为121℃达30分钟。然而，在各种实施例中，可以修改处理条件以使SDP材料稳定到不同的程度。在其他实施方式中，在所述方法中使用了其它的蛋白质增溶剂，包括其他或另外的诸如氯化钙的卤化物盐，硫氰酸钠，诸如尿素、盐酸胍和1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇的有机试剂，诸如硝酸钙和1-丁基-3-甲基咪唑氯化物或其组合的其它强离子液体溶液添加剂。
SDP组合物
本文提供的SDP组合物衍生自丝纤蛋白并且在水溶液中具有增强的溶解性和稳定性。所述组合物可用于治疗和减轻炎症。在一种实施方式中，SDP和/或其级分具有的一级氨基酸序列，在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸含量的组合差异的绝对值方面，与天然丝素的差异为至少4％(通过所述差异的绝对值的总和)。SDP的多个蛋白质片段可以终止于酰胺(-C(＝O)NH2)基团。与天然丝心蛋白相比，SDP可具有降低超过40％的丝氨酸含量，其中丝氨酸含量为至少约5％。所述丝素的丝素蛋白重链和丝素蛋白轻链之间的半胱氨酸二硫键能够被减少或消除。本文提供的SDP组合物在水溶液中具有增强的稳定性。在某些实施方式中，至少75％的蛋白质片段具有小于约60kDa的分子量并且充当抗炎剂，其还促进组织中的细胞迁移和增殖以闭合伤口。所述组合物可包含少于8.5％的丝氨酸氨基酸残基。在一些实施方式中，SDP的平均分子量小于55kDa。
本文提供的SDP组合物衍生自丝纤蛋白并且在水溶液中具有增强的溶解性和稳定性。在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物通过包括在升高的压力下加热水性丝素蛋白溶液的方法制备。水性丝素蛋白溶液包含浓度至少为8M的溴化锂。将水性丝素蛋白溶液在至少约10PSI的压力下加热到至少约105℃(221°F)达至少约20分钟，以提供蛋白质组合物。蛋白质组合物的多肽包含小于8.5％的丝氨酸氨基酸残基，且多个蛋白片段终止于酰胺(C(＝O)NH2)基团。
在一些情况下，本文提供的SDP组合物通过包括在升高的压力下加热水性丝素蛋白溶液的方法制备，其中水性丝素蛋白溶液包含浓度为9-10M的溴化锂，并且其中水性丝素蛋白溶液是在约15PSI至约20PSI的压力下加热至约115℃(239°F)至约125℃(257°F)的温度达至少约20分钟；以提供蛋白质组合物。所述蛋白质组合物可包含小于6.5％的丝氨酸氨基酸残基。
本文提供的SDP组合物在水溶液中具有增强的稳定性，其中：在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量(SDP对于PASF)的组合(绝对值)差异方面，SDP组合物的一级氨基酸序列与天然丝素蛋白的差异至少为4％；丝素蛋白重链和丝素蛋白轻链之间的半胱氨酸二硫键被减少或消除；与天然丝素蛋白相比，所述组合物的丝氨酸含量降低了25％以上。所述SDP组合物的平均分子量小于约60kDa且大于约2kDa，或大于约10kDa，由透析膜的MWCO和SDS-PAGE分析确定。
在一些实例中，本文提供的SDP组合物在水溶液中具有增强的稳定性，其中：在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的组合差异方面，SDP组合物的一级氨基酸序列与天然丝素蛋白的差异至少为6％；丝素蛋白重链和丝素蛋白轻链之间的半胱氨酸二硫键被减少或消除；与天然丝素蛋白相比，所述组合物的丝氨酸含量降低了40％以上。所述SDP组合物的平均分子量小于约55kDa且大于约10kDa，由透析膜的MWCO和SDS-PAGE分析确定。
在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物在水溶液中具有增强的稳定性，其中：SDP组合物的一级氨基酸序列是从天然丝素蛋白修饰的；丝素蛋白重链和丝素蛋白轻链之间的半胱氨酸二硫键被减少或消除；SDP组合物的平均分子量小于约60kDa且大于约10kDa；在声波处理5秒后，所述SDP组合物的5％w/w水溶液在550nm下的光学吸光度保持小于0.25达至少2小时。
在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物在水溶液中具有增强的稳定性，其中：SDP组合物的一级氨基酸序列从天然丝素蛋白修饰，在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的组合(绝对值)差异方面，它们与天然丝素蛋白相差至少5％。在一些实施例中，与天然丝素相比，差异至少为6％、8％、10％、12％或14％。丝素蛋白重链和丝素蛋白轻链之间的半胱氨酸二硫键被减少或消除；SDP组合物的平均分子量小于约60kDa且大于约15kDa；在声波处理5秒后，SDP组合物在550nm处的光学吸光度保持小于0.2达至少2小时。
在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物被分离和/或纯化为干粉或薄膜，例如通过透析和/或过滤的方式。或者，在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物可被分离和/或纯化为稳定的水溶液，其可以被修饰以用作治疗制剂，例如眼科制剂。
在各种实施方式中，本文提供的所述蛋白组合物中存在的SDP的氨基酸组成可以与天然丝素蛋白的氨基酸组成相差至少4％、至少4.5％、至少5％、至少5.5％或至少6％，就组合的丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的含量来说。
在一些实施方式中，本文提供的蛋白组合物可具有降低大于25％、大于30％、大于35％、大于40％或大于45％的丝氨酸含量，与天然丝素蛋白的丝氨酸含量相比。
本文提供的SDP组合物的平均分子量可以小于约80kDa、小于约70kDa、小于约60kDa、或小于约55kDa，或者组合物的平均分子量约为50-60kDa，或约51-55kDa。在一些实施方式中，SDP组合物的平均分子量可以大于约2kDa、大于约10kDa、大于约15kDa、大于约20kDa、大于约25kDa、大于约30kDa、大于约35kDa、大于约40kDa、或大于约50kDa。因此，本文提供的SDP组合物的(重均)平均分子量可以为约5kDa至约80kDa、约10kDa至约65kDa、约15kDa至约60kDa、约15kDa至约60kDa、约20kDa至约65kDa、约20kDa至约55kDa。在各种实施方式中，SDP组合物的平均分子量为约45kDa至约65kDa、约45kDa至约60kDa、约50kDa至约65kDa、或约50kDa至约60kDa。
本文提供的SDP组合物可以在40％w/w下溶于水，并且没有通过目测可观察到的任何沉淀。
在一些实施方式中，本文提供的蛋白质组合物包含少于8％的丝氨酸氨基酸残基。在一些情况下，本文提供的蛋白质组合物包含少于7.5％的丝氨酸氨基酸残基，少于7％的丝氨酸氨基酸残基，少于6.5％的丝氨酸氨基酸残基，或少于6％的丝氨酸氨基酸残基。肽组合物的丝氨酸含量一般为至少约4％，或至少约5％，或约4-5％。
在一些实施方式中，相对于蛋白质组合物的总氨基酸含量，本文提供的蛋白组合物包含大于46.5％的甘氨酸氨基酸。在一些情况下，本文提供的蛋白组合物包含大于47％的甘氨酸氨基酸，大于47.5％的甘氨酸氨基酸，或大于48％的甘氨酸氨基酸。
在一些实施方式中，相对于蛋白质组合物的总氨基酸含量，本文提供的蛋白组合物包含大于30％的丙氨酸氨基酸。在一些情况下，本文提供的蛋白组合物包含大于30.5％的丙氨酸，大于31％的丙氨酸，或大于31.5％的丙氨酸。
在一些实施方式中，本文提供的蛋白质组合物在干燥成薄膜后可完全再溶解。在各种实施方式中，本文提供的蛋白质组合物可以在水溶液中缺乏β-折叠蛋白质结构。在一些情况下，本文提供的蛋白质组合物在声波处理至少5秒后可以在550nm处保持水溶液中的光吸收小于0.25。
在一些实施方式中，本文提供的蛋白质组合物与水组合。在一些情况下，本文提供的蛋白质组合物可以在10％w/w的浓度完全溶解于水中，或甚至在更高的浓度，例如15％w/w，20％w/w，25％w/w，30％w/w，35％w/w，或40％w/w。在一些实施方式中，本文提供的蛋白质组合物可通过例如透析、过滤或其组合方法进行分离和纯化。
在各种实施方式中，本文提供的蛋白质组合物可以增强包含蛋白质组合物和眼科制剂组分的水溶液的扩散，例如，与不包含蛋白质组合物的相应组合物的扩散相比。这种增强的扩散可导致水溶液的表面积增加大于两倍或大于三倍。
在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物在浓度高达20％w/v、高达30％w/v或高达40％w/v时不形成凝胶。在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物具有甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸(GAGA)(SEQ ID NO:1)片段的氨基酸，其包括所述SDP组合物的的氨基酸的至少大约47.5％。在一些情况下，本文提供的SDP组合物具有GAGA(SEQ ID NO:1)片段的氨基酸，其包括所述蛋白组合物的氨基酸的至少大约48％，至少大约48.5％，至少大约49％，至少大约49.5％，至少大约50％。
在一些实施方式中，本文提供的SDP组合物具有甘氨酸-丙氨酸(GA)片段的氨基酸，其包括所述SDP组合物的氨基酸的至少大约59％。在一些情况下，本文提供的SDP组合物具有GA片段的氨基酸，其包括所述SDP组合物的氨基酸的至少大约59.5％，至少大约60％，至少大约60.5％，至少大约61％，或者至少大约61.5％。
在一些实施方式中，本文提供了一种SDP组合物，其制备方法包括：在升高的压力下加热水性丝素蛋白溶液，其中水性丝素蛋白溶液包含浓度为至少8M的溴化锂，并且其中水性丝素蛋白溶液是在至少约10PSI的压力下加热到至少约105℃(221°F)达至少约20分钟；提供蛋白质组合物，其包含小于8.5％的丝氨酸氨基酸残基。因此，本文还提供了制备SDP组合物的方法。本文提供的SDP组合物的制备方法可包括本文所述的一个或多个处理步骤。
在一些情况下，本文提供的制备方法可以使用浓度为约8.5M至约11M的溴化锂。在一些实施方式中，所述溴化锂的浓度为约9M至约10M，或约9.5M至约10M。
在一些实施方式中，将含有溴化锂的含水丝素蛋白溶液加热到至少约107℃(225°F)，至少约110℃(230°F)，至少约113℃(235°F)，至少约115℃(239°F)，或至少约120℃(248°F)。
在一些实施方式中，含有溴化锂的含水丝素蛋白溶液被加热于至少约12PSI、至少约14PSI、至少约15PSI、或至少约16PSI、高达约18PSI，或高达约20PSI的压力。
在一些实施方式中，将含有溴化锂的含水丝素蛋白溶液加热至少约20分钟、至少约30分钟、至少约45分钟、或至少约1小时，直至几十(例如12-24)小时。
在一些实施方式中，将蛋白质组合物以40％w/w溶解于水中而没有可观察到的沉淀。
在一些实施方式中，丝素蛋白已与丝胶蛋白分离。
在一些实施方式中，溴化锂已经被从蛋白质组合物中除去以提供纯化的蛋白质组合物。在各种实施方式中，蛋白质组合物已经分离和纯化，例如，通过透析、过滤或其组合的方法。
在另外的实施方式中，蛋白质组合物具有如上所述的性质，以及如上所述的关于丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸含量的氨基酸组成。
在各种实施方式中，蛋白质组合物在干燥后作为薄膜重新溶解。蛋白质组合物在溶液中可以缺乏β-折叠蛋白质结构。在声波处理至少5秒后，蛋白质组合物可以在550nm处保持溶液中的光吸收小于0.25。
在一种具体实施方式中，本发明提供了一种蛋白质组合物，其制备方法包括：在升高的压力下加热水性丝素蛋白溶液的方法制备的，其中所述水性丝素蛋白溶液包含浓度为9-10M的溴化锂，并且其中所述水性丝素蛋白在约15PSI至约20PSI的压力下被加热至约115℃(239°F)至约125℃(257°F)的温度达至少约30分钟；提供蛋白质组合物，其中蛋白质组合物包含小于6.5％的丝氨酸氨基酸残基，并且蛋白质组合物作为15％w/w水溶液具有小于10cP的水性粘度。
作为制备过程的结果，SDP组合物在化学上不同于天然丝素蛋白，导致氨基酸含量的变化和末端酰胺基团的形成。得到的SDP在水溶液中具有增强的溶解性和稳定性。所述SDP可用于，例如，制备具有本文所述蛋白质组合物(例如所述蛋白质组合物的水溶液)的眼科制剂的方法。所述溶液可包含约0.01％至约92％w/v SDP。所述溶液可以是约8％至约99.9％w/v水。
在一些实施方式中，提供了诱导所述丝素蛋白的水解、氨基酸降解或其组合的方法，使得丝素蛋白的蛋白质平均分子量从现有技术方法生产的约100-200kDa降低至本文所述SDP材料的约30-90kDa，或约30-50kDa。所得到的多肽可以是对于本文所述范围平均的各种分子量的随机分组。
此外，通过标准测定方法将半胱氨酸含量降低至不可检测的水平，可以改变氨基酸化学。例如，丝氨酸含量可以从天然丝素蛋白中发现的水平降低超过50％，这可以导致总丙氨酸和甘氨酸含量增加5％(相对氨基酸含量)，如通过标准测定方法测定的。SDP材料可具有小于约8％相对氨基酸含量的丝氨酸含量，或小于约6％相对氨基酸含量的丝氨酸含量。SDP材料可具有高于约46.5％的甘氨酸含量，和/或高于约30％或高于约30.5％的丙氨酸含量。SDP材料可以不具有可检测的半胱氨酸含量，例如，通过蛋白质组合物的水解多肽的HPLC分析所确定的。SDP材料可以形成，与天然丝素蛋白相比，少90％，少95％或少98％的β-折叠二级蛋白结构，其通过例如FTIR分析测定。
稳定性评价。可以通过许多不同方式评价蛋白质溶液的稳定性。一种适用的评价方法是下面实施例1中描述的劳伦斯稳定性测试。另一种适用的评估是对蛋白质溶液进用超声处理，然后进行光学吸光度分析以确认持续的光学透明度(以及缺乏聚集，β-折叠形成和/或凝胶化)。标准超声处理，或者超声波处理(声音频率大于20kHz)，可用于测试SDP溶液的稳定性。经过超声处理后，SDP的溶液稳定。在超声处理5秒后，SDP组合物在550nm处的光学吸光度保持小于0.25至少2小时。例如，在～20kHz超声处理5秒后，所述蛋白质组合物的5％w/w溶液可以在550nm保持小于0.1的光吸收，这是用于本文所述的超声处理的标准条件。在各种实施方式中，SDP组合物水溶液在超声处理时在高达10％w/w的浓度时不会发生凝胶化。在另外的实施方式中，SDP组合物水溶液在超声处理时，在浓度高达15％w/w，高达20％w/w，高达25％w/w，高达30％w/w，高达35％w/w，或高达40％w/w时，不会发生凝胶化。
低粘度。由于其制备过程及其肽链化学结构的变化，SDP具有比天然丝素蛋白(PASF)更低的粘度。作为5％w/w水溶液(25.6℃)，天然丝素蛋白的粘度约为5.8cP，而在相同条件下，SDP的粘度约为1.8cP，SDP-4的粘度为约2.7cP。与较高浓度的PASF相比，SDP保持低粘度。SDP组合物，作为10％w/w水溶液，可具有小于5cP或小于4cP的水性粘度。在各种实施方式中，SDP在溶液中保持至多9.8cP的粘度。SDP作为15％w/w水溶液还具有小于10cP的水性粘度。SDP作为24％w/w水溶液还可具有小于10cP的水性粘度。
本文所述的方法提供一种蛋白质组合物，其中丝素蛋白的轻链蛋白在加工后是不可识别的，当样品使用标准的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法、用NuPAGETM 4％-12％Bis-Tris蛋白质凝胶(ThermoFisher Scientific,Inc.)进行分析时也是如此。例如，在一种实施方式中，与天然丝素蛋白相比，SDP材料可以具有超过50％的丝素蛋白轻链被除去。此外，所得SDP材料在后处理中形成最少至没有β-折叠蛋白质二级结构，而使用现有技术方法产生的丝素蛋白溶液形成显著量的β-折叠二级结构。在一种实施方式中，SDP材料可以通过在40-60％w/v溴化锂(LiBr)溶液存在下在高压釜或类似于高压釜条件下(即，约120℃和14-18PSI)处理丝素蛋白纤维来制备。
SDP组分
Silk Technologies,Ltd.开发了丝衍生蛋白(SDP)产品，其可以容易地掺入眼科产品配方中，以减少炎症和增强伤口愈合过程。可以基于分子量将SDP产物分离成较小的蛋白质级份或亚群，以增强抗炎和伤口愈合性质。SDP蛋白亚群(也称为级份或片段)可以通过任何合适且有效的方法分离，例如通过尺寸排阻色谱法或膜透析法。例如，基于降低的平均分子量，可以将级份分成2-4个不同的组。实施例6描述了一种制备四种不同级份的方法，所述级份具有相同的总氨基酸含量和末端酰胺含量但不同的平均分子量。令人惊讶地发现，不同的级份也具有不同的生物学性质，例如，由于不同级份的细胞摄取的差异，减少了体内和各种组织中的炎症。
因此，本公开内容提供了使用SDP减少炎症和/或增强伤口愈合的方法，包括SDP的低平均分子量级份。本文还描述了用于治疗眼部病症(例如但不限于干眼病和/或损伤，包括角膜伤口)中的炎症的组合物。所述治疗可包括施用包含SDP或低分子量SDP亚群的制剂。在某些实施方式中，本发明提供治疗疾病状态和/或伤口的方法，包括向有需要的受试者施用包含低分子量SDP(例如SDP-3或SDP-4)的组合物。
所述方法可包括将SDP组分的组合物施用于患病或受损组织。所述蛋白质级份，在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸含量的组合差异绝对值方面，可具有与天然丝素蛋白的差异(通过绝对值差异的总和)为至少4％的一级氨基酸序列。多个蛋白质片段可以终止于酰胺(-C(＝O)NH2)基团。与天然丝素蛋白相比，本文提供的组合物可具有降低大于40％的丝氨酸含量，其中丝氨酸含量为至少约5％。所述丝素蛋白的丝素蛋白重链和丝素蛋白轻链之间的半胱氨酸二硫键被减少或消除。在一些实施方式中，至少75％的蛋白质片段具有小于约100kDa的分子量。此类组合物减少炎症，并促进组织中的细胞迁移和/或增殖，以治疗疾病状态和/或增强伤口闭合。SDP组合物在水溶液中具有增强的溶解性和稳定性。
SDP组合物级份可具有约2kDa至60kDa的平均分子量。在一种实施方式中，分离出平均分子量为25-38kDa，32-35kDa或约34kDa±5％的低分子量级份，该级份在本文中称为SDP-4。
在一些实施方式中，至少60％的蛋白质片段具有小于约60kDa，或小于约55kDa的分子量，以促进组织中的细胞迁移和增殖以闭合伤口。在另一种实施方式中，至少90％的蛋白质片段具有小于约100kDa的分子量并促进组织中的细胞迁移和增殖以闭合伤口。
在一些实施方式中，至少80％的蛋白质片段具有约10kDa至85kDa的分子量。在一些实施方式中，至少50％的蛋白质片段具有约20kDa至60kDa的分子量。在一些实施方式中，至少85％的蛋白质片段具有大于约10kDa的分子量。在一些实施方式中，至少90％的蛋白质片段具有大于约5kDa的分子量。
在一些实施方式中，本发明提供了包含低分子量SDP和药学上可接受的载体的SDP组合物。低分子量SDP可具有小于60kDa的平均分子量。在一些实施方式中，低分子量SDP小于40kDa，并且该级份减少炎症和/或增强细胞迁移和/或增殖。
在一种实施方式中，低分子量SDP，例如SDP-4，是组合物中总SDP的10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更高。在一些实施方式中，所述组合物不包含高分子量SDP，例如，样品的平均分子量小于约35kDa。
在一种实施方式中，SDP-4级份平均分子量为33-35kDa，通过SDS-PAGE/ImageJ分析测定，如前述，pH 8.1-8.3，渗透压约23mOsm，和在25℃下粘度为约1.5-3cP，各自为50mg/mL水溶液。
可以制备各种组合物以包括低分子量蛋白质片段或高分子量蛋白质片段或其组合。所述低分子量蛋白质片段可以减轻炎症和/或增强患病组织表面和/或伤口上的细胞迁移和/或增殖。由于活跃的疾病状态和/或伤口或伤口的存在，所述低分子量蛋白质片段也可用于治疗发炎组织表面。在一些情况下，应用所述低分子量蛋白质片段的组合物以增强伤口愈合过程可能是有用的。这些例子可能包括在战争期间战场上造成的伤员的伤口，希望术后例如加快感染痊愈或疼痛缓解的病员的手术伤口。通过增加细胞数量，减少诸如MMP-9的炎性分子和/或增加上皮细胞增殖来增强伤口愈合过程。
高分子量蛋白质片段可以增加细胞与基底膜的粘附或有助于基底膜形成。在一些情况下，所述高分子量蛋白质片段的组合物可以用于慢性伤口或溃疡性伤口或难以愈合的伤口，例如糖尿病性溃疡或皮肤灼伤。低分子量蛋白质片段可以相关于伤口闭合率，而高分子量蛋白质片段可以相关于伤口闭合质量。在某些情况下，可以施用精心选择量的低分子量蛋白质片段和高分子量蛋白质片段的组合物，以获得最佳的伤口愈合速率和质量。通过增加结构蛋白，例如粘着激酶(FAK)和/或细胞之间的紧密连接，例如闭合小带(ZO-1)结构，来增强伤口愈合过程。
低平均分子量级份如SDP-4具有某些性质，使得该级份不同于SDP和较高分子量级份。例如，SDP细胞摄取取决于肽链的分子量。尺寸小于约60kDa的SDP肽分子容易被培养中的细胞吸收，更具体地说是人角膜缘上皮(hCLE)细胞。大于约60kDa的SDP分子大多被排除在被细胞培养物吸收之外。值得注意的是，SDP分子不与溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1)共定位，后者是溶酶体内吞降解途径的标志物。结果，SDP分子似乎与非特异性细胞膜受体结合，其中小于约60kDa的分子随后被hCLE细胞吸收。更重要的是，因为SDP分子不通过溶酶体降解途径吸收，所以它们是生物可利用的并且能够引发生物活性。
SDP配方
本文所述的SDP组合物和亚级份可以用水和/或药物载体配制。所述药物载体可以是例如磷酸盐缓冲盐水，膜，纤维，泡沫，水凝胶，蛋白质或聚合物基质，三维支架，微粒，纳米颗粒，聚合物或垫料。在一些实施方式中，蛋白质片段可以附着于基质，例如角膜移植物，伤口敷料，隐形眼镜，组织，组织移植物或可降解材料。在一种具体实施方式中，所述载体，例如在眼科制剂中，是磷酸盐缓冲盐水。
在一些实施方式中，提供了眼科组合物用于治疗人或哺乳动物的干眼症。在一些实施方式中，本文提供的组合物是水溶液，其包含有效治疗干眼症的SDP量。例如，所述水溶液可包含约0.01％重量至约80％重量的SDP。在其他实施方式中，含有效SDP量的所述水溶液包含约0.1％重量至约10％重量，或约0.5％重量至约2％重量的SDP。在某些实施方式中，眼科用组合物包含约0.05％w/v SDP，约0.1％w/v SDP,约0.2％w/v SDP,约0.25％w/vSDP,约0.5％w/v SDP,约0.75％w/v SDP,约1％w/v SDP,约1.5％w/v SDP,约2％w/v SDP,约2.5％w/v SDP,约5％w/v SDP,约8％w/v SDP,或约10％w/v SDP。
在各种实施方式中，所述眼科制剂包括水溶液中的其他组分，例如缓和剂、缓冲剂和/或稳定剂。在一些实施方式中，所述缓和剂是透明质酸(HA)、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、葡聚糖、明胶、多元醇、羧甲基纤维素(CMC)、聚乙二醇、丙二醇(PG)、羟丙甲纤维素、甘油、聚山梨醇酯80、聚乙烯醇或聚维酮。在一些实施方式中，所述缓释剂为例如约0.01％重量至约10％重量,或约0.2％重量至约2％重量。在一种实施方式中，所述缓和剂是HA。在各种实施方式中，HA为制剂重量的约0.2％。
所述眼科制剂的缓冲剂或稳定剂可为磷酸盐缓冲盐水、硼酸盐缓冲盐水、柠檬酸盐缓冲盐水、氯化钠、氯化钙、氯化镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化锌、盐酸、氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠或其组合。
所述眼科制剂可进一步包括有效量的抗微生物防腐剂。在一些实施方式中，所述抗微生物防腐剂是，例如，过硼酸钠、聚季铵盐-1(例如防腐剂)、苯扎氯铵(BAK)氯化物、亚氯酸钠、溴莫尼定、溴莫尼定碳酸钠、波利克西通尼(polexitonium)或它们的组合。
所述眼科制剂还可包含有效量的血管收缩剂、抗组胺或它们的组合。所述血管收缩剂或抗组胺药是盐酸萘甲唑啉、盐酸麻黄碱、盐酸苯肾上腺素、盐酸四氢唑啉、马来酸吡嗪、或它们的组合。
在一种实施方式中，所述眼科制剂包括与水和一种或多种眼用组分组合的如本文所述的有效量的SDP片段。在一些实施方式中，所述眼用组分是，例如，a)聚乙烯醇；b)PEG和透明质酸；c)PEG和丙二醇；d)CMC和甘油；e)丙二醇和甘油；f)甘油，羟丙甲纤维素和PEG；或者前述组分中的任何一个或多个的组合。所述眼科制剂可以包括一种或多种非活性成分，例如HP-瓜尔胶，硼酸盐，氯化钙，氯化镁，氯化钾，氯化锌等。所述眼科制剂可以包括一种或多种眼科防腐剂，例如亚氯酸钠(防腐剂(NaClO2)，聚四联体，BAK，EDTA，山梨酸，苯甲醇等。所包括的眼科成分、无活性的成分和防腐剂的含量可以为约0.1％至约5％w/v，例如约0.25％、0.3％、0.4％、0.5％、1％、2％、2.5％或5％，或者在任何两个上述值之间。
本文提供了用于治疗人或哺乳动物的眼科疾病的眼科制剂，其包含水和如上所述的有效量的SDP。本文提供了用作人或哺乳动物眼睛治疗的眼科组合物，其包含水、缓冲剂和稳定剂中的一种或多种，以及如上所述的有效量的SDP。
所述SDP在水中高度稳定，其中保质期溶液的稳定性是溶液中天然丝素蛋白的两倍以上。例如，所述SDP在水中高度稳定，其中与溶液中的天然丝素蛋白相比，保质期溶液稳定性大10倍以上。当在水溶液中时，所述SDP材料在5％(50mg/mL)浓度的溶液超声处理时不凝胶。在其他实施方式中，当在水溶液中时，所述SDP材料在10％(100mg/mL)浓度下超声处理溶液时不凝胶化。
治疗方法
本发明提供了SDP在制剂中用于减轻炎症的用途，其中所述炎症为例如人角膜上或人角膜中的炎症。已经在体外和体内实验模型中证明了这种炎症的减轻。具体而言，研究工作表明SDP通过抑制NF-κB相关细胞信号通路(参见图1和图2)来减少人角膜模型中的炎症，这是一种已知的体内炎症驱动因子，其中一种特异性例如干眼病。已经发现，这些途径的抑制最终导致MMP-9的遗传表达和组织停留减少，MMP-9是干眼和眼部炎症的已知驱动因素(参见图4)。虽然这里列出的研究特异于角膜炎症，但受影响的生物过程也存在于身体的各种组织中。结果，本文公开的关于角膜的工作可以扩展到包含上皮表面的其他组织体系，例如皮肤。
因此，本发明提供了用于减轻炎症和治疗伤口(包括角膜伤口)的方法，包括将SDP施用于相关的部位。该方法可包括将包含丝衍生蛋白(SDP)组合物或其分子级分的制剂施用于发炎组织，例如伤口中的活动物组织。在一些实施方式中，受试者具有引起发炎组织的诸如干眼病的眼部病症。在一些实施方式中，所述伤口是眼部伤口，手术伤口，切口或擦伤。所述眼部伤口可以是例如角膜伤口。
因此，SDP可用于治疗和/或减少由诸如伤口、感染或疾病引起的炎症。这些病症的实例包括眼部伤口，手术伤口，切口或擦伤。在某些情况下，炎症是由眼部病症引起的，所述病症如干眼病或综合征，角膜溃疡，角膜糜烂，角膜磨损，角膜变性，角膜穿孔，角膜瘢痕，上皮缺损，角膜结膜炎，特发性葡萄膜炎，角膜移植，年龄相关性黄斑变性(AMD，湿性或干性)，糖尿病眼病，睑缘炎，青光眼，高眼压，术后眼痛和炎症，后段新生血管(PSNV)，增生性玻璃体视网膜病变(PVR)，巨细胞病毒性视网膜炎(CMV)，眼内炎，脉络膜新生血管膜(CNVM)，血管闭塞性疾病，过敏性眼病，肿瘤，视网膜炎猪粪，眼部感染，巩膜炎，眼睑下垂，瞳孔缩小，眼痛，瞳孔散大，神经痛，瘢痕性眼表疾病，眼部感染，炎症性眼病，眼表疾病，角膜疾病，视网膜疾病，全身性疾病的眼部表现，遗传性眼部病症，眼部肿瘤，眼压升高，疱疹感染，ptyrigium(巩膜肿瘤)，眼表面持续伤口，屈光性角膜切开术后眼痛和炎症，角膜热损伤或化学灼伤，巩膜伤口，圆锥角膜和结膜伤口。在一些实施方式中，炎症和/或眼部病症由衰老，自身免疫病症，创伤，感染，退行性病症，内皮营养不良和/或手术引起。在一个具体实例中，SDP用于治疗干眼症的配方中。
因此，在各种实施方式中，SDP和/或其部分例如SDP-4可用于通过清除活性氧(ROS)(例如过氧化氢)来抑制氧化还原调节的经典NF-κB途径活化的介质。在眼部环境的细胞内，以减少导致干眼症的炎症。干眼症状减轻的证据可以是MMP-9和TNF-α基因转录的减少，这是由NF-κB信号传导途径的激活驱动的。此外，MMP-9酶在角膜组织中的存在也将减少。
以下实施例是用来对上述发明内容进行说明，而不应被解释为限制发明的范围。本领域技术人员应很容易的认识到所述实施例能够提示本发明可以通过很多其他方法来实施。应当理解，在本发明的范围内可以进行很多的变化和修改。
实施例
实施例1：SDP制备及劳伦斯稳定性试验
材料：家蚕茧从日本田岛商事株式会社获得。溴化锂(LiBr)获自FMC Lithium,Inc.,NC。高压釜获自Tuttnauer Ltd.,NY。所述3,500Da分子量截留(MWCO)透析膜获自ThermoScientific,Inc.,MA。Oakton Bromide(Br-)双结离子选择性电极获自ISE,OaktonInstruments,IL。
工艺：制备了两个样品，SDP和PASF，如图1所示。简而言之，SDP是通过将无蛹的切割蚕茧(3-5切/茧)浸入在233mL水/克茧中含有0.3wt％NaCO3的95℃加热的去离子水(diH2O)中而制成。将茧在该溶液中搅拌75分钟以溶解丝胶，从而将其与丝纤维分离。随后将茧在稀释的diH2O中洗涤四次，每次冲洗20分钟，以去除去残留的丝胶。然后将纤维在对流烘箱中在60℃下干燥2小时，称重，并以4×LiBr体积/克提取纤维的比例溶解在54wt％LiBr水溶液中。将该溶液覆盖，然后在60℃的对流烘箱中加热2小时以加速提取的纤维溶解。然后将溶液置于高压釜中并暴露于灭菌条件(121℃,17PSI,90-100％湿度)30分钟以促进丝素蛋白转化。将所得溶液冷却至室温，然后用diH2O稀释至5％丝素蛋白，并使用3,500Da MWCO膜透析以除去LiBr盐。在diH2O中进行多次交换直至Br-离子小于1-ppm，如在Oakton Bromide(Br-)双结离子选择性电极上读取的水解丝素蛋白溶液中所测定的。然后使用1-5μm孔隙率过滤器进一步过滤溶液，接着通过0.2μm抛光过滤器过滤。该产品在图2中称为“SDP溶液”。
制备“对照组”丝素蛋白溶液，以提供“PASF溶液”。除高压釜步骤外，采用如上所述相同的过程。将来自每个样品的取样体积(5mL)置于单独的20mL玻璃烧杯中，并用箔密封。然后将样品进行劳伦斯稳定性测试。
所述劳伦斯稳定性测试是通过将含水蛋白质测试溶液(5％w/v,50mg/mL)置于高压釜室内来进行的。然后将高压釜在121℃，17PSI，30分钟，97-100％湿度条件下活化一个循环。循环完成后，使溶液冷却，然后从高压釜室中取出。然后摇动溶液以观察溶液凝胶化表现。如果溶液在摇动约10秒后凝胶化，则样品未通过劳伦斯稳定性试验。未通过测试表明该材料作为蛋白质溶液本质上不稳定。
劳伦斯稳定性测试在SDP溶液和PASF溶液进行。所述PASF溶液样品立即发生胶凝，因此未通过劳伦斯稳定性测试。相反，所述SDP溶液样品无限期地保留在溶液中，因此通过了劳伦斯稳定性测试。缺乏凝胶化可归因于SDP溶液生产结合了前述条件下的高压釜处理步骤。
实施例2：SDP分子量鉴定
为了评价工艺过程对溶解的蛋白质的分子量分布的影响，对SDP溶液和PASF溶液进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析，其通过分子量分离蛋白质。具体地，将15μg每种样品与含有十二烷基硫酸钠和二硫苏糖醇(Biorad Inc.,CA)的运行缓冲液混合，以分别除去任何二级折叠结构和二硫键。然后将混合物加热至70℃保持5分钟。将混合物与2.5-200kDa分子量梯(Life Technologies,CA)一起加载到含有Bis-Tris缓冲盐(Life Technologies,CA)的预制4-12％聚丙烯酰胺梯度凝胶上，然后暴露于BioRad PowerPac电源(BioRadInc.,CA)上的120V电场90分钟。然后取出凝胶并置于考马斯蓝染色中12小时以染色蛋白质，然后在diH2O中洗涤6小时。然后在Biorad GS-800Calibrated Desitometer(BioRadInc.,CA)上扫描凝胶。
结果显示，用于制备SDP溶液的处理显著地将重均分子量从天然丝素蛋白(PASF)的97kDa转变为SDP的约53kDa。分子量的变化清楚地表明原始天然丝蛋白的一级和二级结构的转化以及通过末端酰胺形成裂解破坏肽链。此外，在高压灭菌过程后SDP中不存在丝素蛋白的丝素蛋白轻链(在现有技术的丝素蛋白的泳道2中可见23-26kDa)，这表明蛋白质的丝素蛋白轻链部分已经降解，或通过处理而被去除。这些结果表明，高压釜处理将天然丝素蛋白转化为具有比天然丝素蛋白更小的肽片段的新材料。该过程进一步降解/改变丝素蛋白轻链。这些转化导致SDP材料由于这些化学变化而具有增强的溶液稳定性。
SDP的进一步分析显示组合物的平均分子量为约53kDa。此外，SDP的约77％的肽链在10-100kDa的范围内，SDP的肽链的约73％在10-85kDa的范围，SDP的肽链的约66％是在15-85kDa的范围，SDP肽链的约49％在20-60kDa的范围，并且约31％的SDP肽链在25-50kDa的范围。
实施例3：SDP稳定性研究
为了进一步确定高压釜工艺对所得SDP的稳定性与现有技术丝素蛋白的稳定性相比的功能影响，所述样品是通过使用Wang et al.(Biomaterials 2008,29(8):1054-1064)的方法进行分析以模拟丝素蛋白凝胶化充分表征的模型。将两个样品(0.5mL,SDP和PASF)加入1.7mL透明离心管中并进行超声处理(10Hz，15秒)。然后对含有所述溶液的透明管进行目测以观察凝胶形成，作为凝胶化的筛选。
所述SDP溶液样品未能形成凝胶，显示增强的稳定性。甚至在超声处理后3个月，所述SDP样品保持在溶液中并且通过视觉检查确定没有蛋白质聚集。所述PASF溶液样品在超声处理后迅速凝胶化(2小时内)。这些结果进一步表明，高压釜工艺将现有技术的丝素蛋白转化为新材料并导致所得SDP材料的稳定性。
实施例4.人角膜缘上皮(hCLE)培养物中NF-κB细胞信号通路的体外分析
Lan et al.(Nuclear Factor-κB:Central Regulator in Ocular SurfaceInflammation and Diseases,The Ocular Surface,10,137–148(2012))描述的p65测定法被用于评估SDP对hCLE细胞培养物的潜在抗炎活性。如前所述，核转录因子p65是NF-κB复合物的一部分，其在激活后易位至细胞核中以促进促炎基因表达，包括TNF-α和MMP-9。为了在体外评估p65活性，用含有有效炎性细胞因子TNF-α(一种NF-κB途径的自分泌介质)的PBS或PBS处理汇合的hCLE培养物。然后分别用含有0.1％或1.0％SDP的PBS或PBS处理细胞。对于未治疗的对照，p65的染色主要定位于细胞质，这对于处于非炎症状态的细胞是预期的(图1A)。然而，p65染色局限于培养基中用TNF-α攻击的细胞的细胞核，表明发生了NF-κB炎症途径的激活(图1B)。有趣的是，SDP处理的细胞的p65染色主要局限于细胞质，并且证明了剂量依赖性隔离，由此对于给予较高SDP浓度的细胞显示较少的核定位(图1C-D)。这些结果表明SDP蛋白在体外抑制人角膜上皮中的NF-κB炎症反应。
通过表征TNF-α和MMP-9基因表达进一步研究了SDP对NF-κB炎症信号传导途径的抑制作用，已知这些表达在NF-κB驱动的炎症过程中被上调。更具体地，TNF-α和MMP-9的基因表达增加是由NF-κB的激活介导的，并且是炎症细胞信号传导途径的生物标志物。使用qPCR在与PBS和TNF-α细胞因子预温育的hCLE培养物上测量基因表达，然后用和不用0.5％wt/vol处理。如上所述的SDP。观察到加入SDP引起TNF-α和MMP-9的基础基因表达没有变化(图2)。然而，用TNF-α刺激引起两种基因表达的显著增加(图2)，其复制人NF-κB驱动的炎症级联反应。重要的是，在TNF-α刺激时用SDP治疗引起TNF-α和MMP-9表达降低约6倍，从而证明SDP对TNF-α介导的NF-κB基因表达的强效抗炎作用。这些结果证实了先前的p65测定结果，共同支持SDP抑制NF-κB活化，并因此抑制促炎基因表达(即TNF-α和MMP-9)。
接下来，在兔角膜上皮损伤模型中进行研究以评估SDP的抗炎作用是否可以在体内延长。对兔子进行手术剥离角膜上皮以引发急性炎症级联反应，然后用PBS滴眼液，PBS加0.5％或PBS加2％SDP处理72小时，6小时给药频率约50μL。液滴体积直到完成上皮愈合。然后将解释的组织冷冻切片并用针对MMP-9蛋白的抗体进行免疫染色。如所预期的那样，天然的、未受伤的兔角膜表现出最小的MMP-9表达(图3A)，假设染色的存在减少表明发生了最小的炎症，如(The Practical Detection of MMP-9Diagnoses Ocular Surface Diseaseand May Help Prevent Its Complications,Cornea,32(2),p 211-216(2013))所述。然而，接着PBS处理的角膜剥离显示在整个上皮层中稳定的MMP-9表达，并且表明发生了高度的炎症(图3B)。
有趣的是，使用含有SDP的滴眼剂观察到兔角膜MMP-9表达的剂量依赖性降低(图3C和3D)。具体地，对于用2％SDP处理的角膜，MMP-9免疫染色显著降低至4倍(图3E)。重要的是，减弱的MMP-9表达不会损害保护性角膜上皮层的完整性，由具有SDP治疗的强健的分层角膜上皮所证实。这些数据表明SDP治疗对损伤后角膜上皮组织内炎症的影响，证据表明随着SDP浓度的增加MMP-9减少。此外，这些结果证明了SDP在活体动物组织环境中的有效抗炎能力，并证实了先前的体外研究。
为了进一步加强SDP的体内抗炎作用，对损伤后72小时从兔角膜上皮提取的逆转录的总RNA进行qPCR。具体地，评估了炎症信号传导的两种关键生物标志物，细胞因子白细胞介素(IL)-1β和IL-6。在SDP处理的存在下，IL-1β和IL-6的表达均显著降低(图4)。与PBS处理的对照动物相比，两种SDP浓度的基因表达分别降低了75％和95％。这些发现证明了SDP在体内抑制炎性基因表达的能力，并进一步证实了上述体内和体外数据。总之，实验证据表明SDP抑制体内炎症过程，这似乎与SDP的存在对NF-κB炎症信号传导途径激活的抑制直接相关。
材料和方法
SDP的制备。家蚕(Bombyx mori)蚕茧购自Tajima Shoji Co.(Yokohama,Japan)。由一批5克茧制备丝溶液，每个茧切成三片。将茧在2L 0.03M Na2CO3(Sigma-Aldrich)中煮沸45分钟以除去丝胶蛋白。在去离子水中漂洗四次后，将提取的丝纤蛋白纤维在室温下干燥过夜。然后将干燥的丝素蛋白纤维在9.7M LiBr溶液(Sigma-Aldrich)的浓溶液中在60℃下溶解2小时。然后，将溶液在12℃和121℃下在15PSI下高压灭菌30分钟以进行SDP化学转化。然后使用具有3,500分子量截止值(MWCO)的Snake-Skin透析管(Thermo FisherScientific,Inc.)对高压灭菌的SDP溶液对约200x体积的水透析48小时，并在1处进行6次水交换，间隔4小时，8小时，12小时，12小时和12小时。然后将透析的溶液以10,000×g离心20分钟，每次通过倾析上清液除去杂质。然后通过测量1mL SDP溶液样品(n＝3)干燥时的重量损失来计算蛋白质浓度。最后将溶液稀释至5重量/体积。使用无菌水浓缩％(50mg/mL)并在4℃下储存直至使用。
人角膜上皮细胞培养。将人角膜缘上皮(hCLE)细胞从液氮中储存解冻，并在角质形成细胞-SFM培养基(K-SFM,Thermo Fisher Scientific,Inc.)中培养72小时，所述培养基补充有0.2ng/mL小鼠上皮生长因子(EGF,Thermo Fisher Scientific,Inc.)，牛垂体提取物(BPE,Thermo Fisher Scientific,Inc.)，1％青霉素-链霉素(P/S,VWR,Inc.)和0.1％CaCl2.2H2O(Thermo Fisher Scientific,Inc.)。在常规传代期间使用标准细胞培养条件(37℃，5％CO 2，>95％湿度)。
hCLE p65染色用于NF-κB活化和荧光显微镜分析。
hCLE细胞生长至约80％汇合，每孔接种密度为25,000个细胞。将hCLE与DMEM/F12培养基一起在玻璃底24孔板中培养。在12小时攻击中，以10ng/mL和100ng/mL补充人重组TNF-α(PeproTech,London,UK)用于刺激的培养物。将SDP以1mg/mL和10mg/mL浓度添加到选定的培养物中。在实验完成时，使用新制备的4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水(PBS)固定培养物。将人p65抗体(Anti-NF-κB p65,ab16502,Abcam,Cambridge,UK)以1：200稀释度加入1％BSA和0.1％Tween的PBS中，并在4℃温育过夜。在PBS中以1：500稀释添加与抗兔反应的二抗(Alexa Fluor 546,Thermo Fisher Scientific,Inc.)。另外，在PBS中以1：10,000稀释度添加DAPI核染剂(Thermo Fisher Scientific,Inc.)。
使用1.6Optivar光学器件使用63x物镜拍摄荧光图像。使用Texas Red过滤器通道在0.25μm切片处捕获Z-堆叠图像(10-25层范围)。使用3D Huygens DeconvolutionSoftware(Scientific Volume Imaging BV,The Netherlands)在每个z-堆叠上进行图像去卷积，以帮助减少背景荧光。对于每个z-堆栈，使用软件的经典最大似然估计算法执行总共40次迭代，因为发现增加迭代次数对改善图像质量具有最小影响。所有其他设置保留在制造商的默认设置中。使用软件中包括的最大强度投影(MIP)算法产生图像，其中MIP阈值水平首先由默认制造商的对照角膜组织设置确定，以建立每个通道的相对荧光强度阈值。
TNF-α通过定量聚合酶链反应(qPCR)刺激炎症测定和基因表达分析。将hCLE细胞接种在35mm培养皿中并生长至约80％汇合，然后给予PBS或PBS加1ng/mL重组人TNF-α。然后将培养物在37℃下培养6小时。然后吸出培养基并用温热的1X PBS洗涤细胞，然后用浓度匹配的SDP级份以5mg/mL浓度处理6小时，而对照组给予相同体积的PBS。经过规定的时间后，使用Qiagen RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA,USA)从细胞中收集总RNA，并使用电泳和流式细胞仪验证RNA的完整性和数量(2100Bioanalyzer,Agilent Technologies,Santa Clara,CA)和UV吸收(Nanodrop Spectrophotometer,Thermo Scientific)。然后，使用High Capacity cDNA Reverse Transcription试剂盒(Applied Biosystems,LifeTechnologies,Grand Island,NY)将来自每个样品的450ng总RNA逆转录成cDNA。
使用SYBR Select Master Mix试剂盒(Applied Biosystems,LifeTechnologies,Grand Island,NY)在StepOne Plus实时PCR系统(Applied Biosystems,Life Technologies,Grand Island,NY)中进行定量PCR(qPCR)。对从未用TNF-α刺激的细胞获取的总RNA进行遗传表达，作为炎性刺激的阴性对照(Native)。将候选基因的表达相对于内源对照基因β-肌动蛋白标准化。使用2(-ΔΔCt)方法进行相对定量，其中对每种条件进行3次实验，每种条件每种条件含有三个生物学一式三份(N＝3，n＝3)。通过平均来自每个实验的平均值获得总体平均值，并计算每组的合并标准偏差。使用dCt值在组之间进行统计学比较，首先进行单因素方差分析，然后进行事后t检验，以使用Excel软件(Ver.14.6.7,Microsoft,Inc.)和StatPlus:mac LE软件(Ver.6.1.5.1,AnalystSoft,Inc.,Walnut,CA)确定p值。以下特异性引物组用于β-肌动蛋白，TNF-α和MMP-9(来自Integrated DNATechnologies,Inc.,Coralville,IA)：
hβ-Actin–Forward:5’-AATGTGGCCGAGGACTTTGATTGC-3’ (SEQ ID NO:2)
hβ-Actin–Reverse:5’-AGGATGGCAAGGGACTTCCTGTAA-3’ (SEQ ID NO:3)
hTNF-α-Forward:5’-GAGGCCAAGCCCTGGTATG-3’ (SEQ ID NO:4)
hTNF-α-Reverse:5’-CGGGCCGATTGATCTCAGC-3’ (SEQ ID NO:5)
hMMP-9-Forward:5’-TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3’ (SEQ ID NO:6)
hMMP-9-Reverse:5’GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3’ (SEQ ID NO:7)
兔角膜损伤模型，免疫组化荧光成像分析和qPCR基因转录分析。根据机构动物护理和使用委员会批准的方案，根据ARVO眼科和视觉研究中的动物使用声明处理所有动物。使用12只8-10周龄的新西兰白兔来评估SDP在体内降低MMP-9产生的能力。通过肌内注射35-50mg/kg氯胺酮，5-7.5mg/kg甲苯噻嗪和0.75mg/kg乙酰丙嗪麻醉兔子。局部用丙美卡因0.5重量/体积％滴眼液也用作补充麻醉剂。然后使用#15Bard-Parker刀片移除7mm的中央角膜上皮以在上皮表面中产生空隙。
随后，将兔子分成三个治疗组，其中受伤的角膜表面用200μL无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH7.4，载体处理)，5mg/mL(即0.5％)或20mg处理。PBS中的/mL(即2％)SDP溶液。在手术后立即将治疗局部施用于受伤的眼睛，局部施用莫西沙星抗生素滴剂(Vigamox,Alcon,Inc.)，随后以6小时的间隔直至完全上皮闭合。在整个愈合过程中，密切监测兔子的窘迫或感染迹象，每隔6小时检查一次上皮伤口闭合，方法是将50μL局部荧光素溶液(Sigma-Aldrich)用于受伤的角膜，并使用裂隙灯摄影在钴蓝色照明下对伤口进行成像。
在伤口愈合完成后(手术后72小时)立即处死来自每个治疗组的动物，使用过量的戊巴比妥(150mg/kg)给予耳静脉，并且将每个治疗组的角膜摘出并切除。对于前三只兔子，除去愈合的上皮表面，并使用Trizol-氯仿法(ThermoFisher Scientific,Inc.)提取总RNA。使用High Capacity cDNA Reverse Transcription试剂盒(Applied Biosystems,Life Technologies,Grand Island,NY)将来自每个样品的总RNA逆转录成cDNA。然后，将cDNA在-80℃冷冻直至使用。
剩余的三只兔子将提取的角膜立即在2wt./vol.％多聚甲醛中固定40分钟(Electron Microscopy Sciences,Hatfield,PA)。从对侧眼的没有经历外科剥脱的角膜也被获取并固定，以用作伤口愈合过程的阴性对照。随后将固定的角膜在PBS中洗涤三次，每次5分钟，然后置于30wt./vol.％蔗糖在4℃过夜，然后包埋于Tissue-TEK O.C.T(SakuraFinetek USA Inc.,Torrance,CA,USA)，并在-80℃冷冻用于低温切片。获得穿过角膜中心的10微米厚的截面并将其安装在Superfrost-plus载玻片(Thermo Fisher Scientific,Inc.)，用于免疫组织化学染色和分析。将样品在PBS中洗涤三次，然后在含有1wt./vol.％BSA(Sigma-Aldrich),0.25wt./vol.％Triton-X-100(Sigma-Aldrich)和在1X PBS中的2.5wt./vol.％山羊血清的封闭缓冲液中，在室温下培养1小时。封闭后，样品与用于MMP-9(ab58803,Abcam PLC,Cambridge,UK)的鼠一抗溶液(1:100)在4℃下温育过夜。
随后，用PBS彻底冲洗样品，然后在室温下以1:500稀释度与Alexa Fluor488Green goat抗小鼠二抗(ab150113,Abcam PLC,Cambridge,UK)一起避光温育1小时。样品也用Alexa568鬼笔环肽(Thermo Fisher Scientific,Inc.)以1:200稀释度在室温下染色20分钟，并保护其免于肌动蛋白细胞骨架结构光染色。用PBS洗涤后，用VAPASHIELDMounting Medium和DAPI(Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)固定样品以染色细胞核，并在成像前用玻璃盖玻片覆盖。
使用带有1.6Optivar光学的63x物镜拍摄荧光图像。使用绿色荧光蛋白(GFP)滤光器通道在0.25μm切片处捕获Z-堆叠图像(10-25层范围)。使用Huygens DeconvolutionSoftware(Scientific Volume Imaging BV,The Netherlands)在每个z-堆叠上进行图像去卷积，以帮助减少背景荧光。对于每个z-堆栈，使用软件的经典最大似然估计算法执行总共40次迭代，因为发现增加迭代次数对改善图像质量具有最小影响。所有其他设置保留在制造商的默认设置中。使用软件中包括的最大强度投影(MIP)算法产生图像，其中MIP阈值水平首先由制造商的对照角膜组织默认设置确定，以建立每个通道的相对荧光强度阈值。然后，使用这些相同的阈值设置对天然和SDP处理的角膜组成像，以允许荧光图像强度的组比较(N＝3,n＝3)。
接下来，使用ImageJ软件(NIH,Ver.1.48,NIH)通过从跟踪的荧光区域中减去非荧光区域的平均积分色密度来消除背景来测量每个图像的荧光强度。然后计算不同组之间的荧光强度值。采用单因素方差分析对各组进行统计比较，然后使用Excel软件(Microsoft,Inc.,Ver.14.6.7)和StatPlus:mac LE软件(AnalystSoft,Inc.,Ver.6.1.5.1)进行特别t检验，以确定p值。
使用SYBR Select Master Mix试剂盒(Applied Biosystems,LifeTechnologies)在ABI 7000实时PCR系统(Applied Biosystems,Life Technologies)进行定量PCR(qPCR)。对从兔角膜上皮获取的cDNA产生遗传表达。将候选基因的表达相对于内源对照基因β-肌动蛋白标准化。使用2(–ΔΔCt)方法进行相对定量。使用dCt值在组之间进行统计比较，首先进行单向ANOVA，然后进行事后t检验以使用Excel软件(Microsoft,Inc.,Ver.14.6.7)和StatPlus:mac LE软件(AnalystSoft,Inc.,Ver.6.1.5.1)确定p值。以下特异性引物组被用于β-肌动蛋白，IL-1β和IL-6基因(来自Integrated DNA Technologies,Inc.,Coralville,IA)：
rβ-actin–Forward:5’-GCTATTTGGCGCTGGACTT-3’ (SEQ ID NO:8)
rβ-actin–Reverse:5’-GCGGCTCGTAGCTCTTCTC-3’ (SEQ ID NO:9)
rIL-1β-Forward:5’-TTGAAGAAGAACCCGTCCTCTG-3’ (SEQ ID NO:10)
rIL-1β-Reverse:5’-CTCATACGTGCCAGACAACACC-3’ (SEQ ID NO:11)
rIL-6-Forward:5’-CTACCGCTTTCCCCACTTCAG-3’ (SEQ ID NO:12)
rIL-6-Reverse:5’-TCCTCAGCTCCTTGATGGTCT-3’ (SEQ ID NO:13)
实施例5：SDP和SDP-4抑制过氧化氢介导的氧化还原信号传导
电子顺磁共振(EPR)光谱用于选择性地量化溶液中过氧化氢(H2O2)的浓度。具体地，将20μM的H2O2加入到含有0,0.5,1.0或5.0％PASF，SDP或SDP-4的水溶液中，并在室温下温育24小时。然后，为了对温育后剩余H2O2水平进行定量，加入200μM的H2O2特异性旋转探针1-羟基-3-甲氧基羰基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷(CMH)以及测定试剂4-乙酰氨基苯酚(AAP,1mM)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA,200μM)和辣根过氧化物酶(HRP,1U/mL)。然后将该混合物在37℃下温育30分钟，在此期间AAP在HRP存在下被H2O2氧化以产生苯氧基自由基，然后与CMH自旋探针反应以产生CM自由基，其被检测和定量。通过EPR。
结果：随着蛋白质浓度的增加，PASF将EPR信号振幅提高到对照水平以上，表明PASF直接氧化H2O2自旋探针。相反，添加SDP引起EPR信号幅度的浓度依赖性降低，表明SDP蛋白在5.0％SDP下清除H2O2的40％。在存在SDP-4蛋白的情况下，这些降低甚至更显著，其中5.0％SDP-4将H2O2水平降低超过80％。见图5。
SDP以及更大程度上SDP-4清除H2O2和抑制氧化还原信号传导能力是酪氨酸驱动的。酪氨酸是一种已知的长效抗氧化剂，因为它具有芳香族和含羟基的官能团，可以容易地进行氧化还原信号传导所固有的电子改组(参见Van Overveld et al.,Chemico-Biological Interactions,127(2000),151–161)。SDP和SDP-4具有高酪氨酸组成(大于或等于约13％wt./wt.)，并且这些蛋白质增强酪氨酸向眼表面的递送。酪氨酸的生理溶解度为0.4mg/mL，而酪氨酸在1％wt/vol SDP中的的溶解度超过三倍(1.3mg/mL)，因此提供按每1％wt./vol SDP的成比例的增加。此外，SDP和SDP-4的水溶解度超过80％wt./vol.，远远大于其他已知蛋白质。
实施例6：SDP蛋白质溶液的分级和分子量分布
再生的SDP溶液的分级份离是通过使用100,50,30和10kDa MW截止值的AmiconUltra 15mL离心过滤器(EMD-Millipore,MA,USA)通过一系列离心步骤完成的。为了评估分级SDP溶液的分子量范围，使用SDS-PAGE显现SDP蛋白的电泳迁移率，并与未分级的SDP溶液进行比较。未分级SDP的SDS-PAGE表明溶液中SDP蛋白的分子量分布宽，正如大约300kDa和30kDa分子量范围之间的大涂片所证明的那样。
再生的SDP溶液的分级产生四种级份，分别来自高分子量SDP蛋白质和低分子量SDP蛋白质(分别为SDP-1，SDP-2，SDP-3和SDP-4)。参见图6。当与未分级的SDP溶液相比时，高分子量溶液的SDS-PAGE产生涂片，表明在300kDa和100kDa范围(SDP-1和SDP-2)之间的近似分子量分布，而低分子量溶液产生涂片，表明分子量分布主要在30kDa范围内(SDP-3和SDP-4)，因此证实了SDP分离成高分子量和低分子量SDP蛋白质溶液。
例如，将来自家蚕(Bombyx mori)蚕茧的50mg/mL SDP水溶液用于以下研究。使用100,50,30和10kDa MW截止值的Amicon Ultra 15mL离心过滤器(EMD-Millipore,MA,USA)完成SDP蛋白片段的分级。简言之，将15mL的40mg/mL SDP储备溶液加入到具有100kDa MW截止值的离心过滤器中，并以4,000×g离心30分钟以分离100kDa MW及以上的SDP蛋白片段。收集分离的浓缩物，随后将滤液转移至具有50kDa MW截止值的离心过滤器，并再次以4,000×g离心30分钟以分离～50kDa MW的SDP蛋白片段。收集分离的浓缩物，然后将滤液转移至具有30kDa MW截止值的离心过滤器，并再次以4,000×g离心30分钟以分离～30kDa MW的SDP蛋白片段。收集分离的浓缩物，然后将滤液转移到具有10kDa MW截止值的离心过滤器中，并再次以4,000×g离心30分钟以分离～10kDa MW的SDP蛋白片段。将来自每个MW截止值的收集的浓缩物用5mL dH 2O单独洗涤6次，并使用离心过滤器以4,000×g再次离心30分钟，每个浓缩物具有相应的MW截止过滤器尺寸。使用SDS-PAGE(图6)和考马斯蓝R-250染色(Gibco,Invitrogen Corporation,Grand Island,NY)验证SDP蛋白片段的分级。
SDP-4级份的ImageJ分析显示SDP-4的平均分子量为34kDa，通过SDS-PAGE测定。PASF(30kDa MWCO过滤器)的类似过滤提供了较低分子量级份，其平均分子量为51kDa，并且具有单独的较高平均分子量分数(90kDa)。SDP级份和PASF级份的进一步分析总结于下表。
平均分子量小于10kDa的级份在溶液中不稳定并在1-2小时内形成凝胶，因此一般从SDP组合物和级份中被除去。
实施例7：SDP-4和SDP-1-3的SDP稳定性研究
实施例3中描述的稳定性研究也在SDP-4和分离的天然丝素蛋白(PASF-4)的低平均分子量部分上进行。在进行超声处理后，发现超声诱导的二级结构形成和凝胶化在SDP-4溶液中不存在。SDP-4解决方案保持清晰且自由流动。缺乏凝胶化表明SDP-4的蛋白质稳定性显著更高，而PASF-4溶液在超声处理挑战后2小时内凝胶化，表明其在溶液中不稳定。在整个实验过程中(96小时)，SDP-4保持在溶液中。
还对较高分子量的SDP(相当于SDP-1，SDP-2和SDP-3的组合；称为SDP-1-3)进行稳定性研究。在整个实验过程中(超过24小时)，SDP-1-3的水溶液保持自由流动的溶液。然而，分离的天然丝素蛋白(PASF-1-3)的较高分子量级份在15分钟内胶凝，表明二级蛋白质结构形成并因此不稳定。
实验条件：将SDP-4，SDP-1-3，PASF-4和PASF-1-3的1mL 4％wt./wt.溶液在60％振幅，20Hz脉冲频率下超声处理3分钟。然后在室温下监测溶液直至PASF-4和PASF-1-3发生凝胶化。SDP-4和SDP-1-3分别在溶液中保持超过96小时和24小时(本研究的时间过程)。
实施例8：SDP-1和SDP-2的增强的伤口愈合特性
在不存在或存在SDP级份(10mg/mL)的情况下，在汇合的hCLE单层上进行伤口愈合评估伤口愈合。使用延时显微镜评估伤口闭合率。通过MTT测定评估用SDP或PBS对照处理的hCLE的增殖。
SDP MW对受损hCLE培养物的行为具有重要影响。低平均MW的<100kDa级份(即SDP-3和SDP-4)显著加速被裸露(划痕)hCLE细胞的再增殖6小时，相对于PBS处理的对照培养物，其持续至汇合(16小时相对于对照的20小时)(图7和8)。与用PBS处理的对照培养物相比，SDP-3和SDP-4显著增加hCLE增殖，如通过MTT测定结果增加(>50％)代谢活性所证明的。相反，>100kDa的高MW级份(即SDP-1和SDP-2)抑制了再增殖，尽管仍观察到SDP的促增殖作用(图9)。这些结果证明了SDP-3和SDP-4级份对体外hCLE细胞迁移结果的增强的效力。
实施例9：抗炎特性
在存在或不存在SDP级份情况下，在用促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α,1ng/mL)刺激的hCLE培养物上评估SDP级份1-4的炎症性能。qPCR用于定量炎症基因的后续表达。通过ELISA评估hCLE细胞分泌这些蛋白质。在存在或不存在SDP级份情况下，使用具有TNF-α刺激的hCLE培养物和早幼粒细胞免疫细胞系(HL-60)的Transwell共培养测定来评估改变的炎性基因表达的功能意义。
TNF-α挑战的hCLE培养物显著地增加炎性基因TNF-α，白细胞介素6和1αα/β以及蛋白酶MMP-9的表达，其表达用低MW SDP显著减弱(图10)。通过ELISA在8小时测量，这转化为刺激的hCLE分泌TNF-α和MMP-9的显著减少(图11)。TNF-α挑战的hCLE引起HL-60细胞的显著募集，其通过添加SDP-4而标准化，证明体外受损的炎症信号传导和下游免疫应答之间的功能关系(图12)。
实施例10：OTC和抗炎滴眼液的制备
可以制备滴眼剂组合物以利用SDP的治疗特性来治疗由于疾病或损伤引起的眼部系统。SDP分子可以基于分子量(例如，SDP-1，SDP-2，SDP-3，SDP-4或其组合)任选地分离，或者用作整个组合物(例如，SDP)。可以制备低平均分子量例如小于约40kDa的蛋白质分子的组合物，并称为SDP-4。还可以制备包含SDP组合物的所有分子量或大于约40kDa的分子的蛋白质分子的第二组合物。每种组合物可包括水，至少一种缓冲液或缓冲系统(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS)，柠檬酸盐，硼酸盐，Tris，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES))，任选地至少一种防腐剂(例如，过硼酸盐，苯扎氯铵(BAK))和任选的至少一种另外的赋形剂，表面活性剂，稳定剂或盐(例如，对氨基苯磺酸，海藻糖，甘油，乙二胺四乙酸(EDTA)，聚乙二醇(PEG)，甘露醇，聚山梨醇酯，氯化钠(NaCl)，氯化镁(MgCl2)，氯化钙(CaCl2)或溴化锂(LiBr))。
含有上述第一组合物的眼科制剂可以作为治疗产品应用于干眼病患者，受伤患者或健康患者的手术伤口(例如，用于后屈光或白内障手术)。可以随时间监测疾病或损伤的炎症和伤口闭合率，以及患者舒适度和疼痛评估。第二种组合物可用于非处方品，例如人工泪液滴眼剂产品，作为蛋白质赋形剂，有助于增强制剂润湿，铺展和患者舒适度。
滴眼剂制剂的实例含有低至0.1％wt./vol.SDP-4或SDP以及高达10％wt./vol.SDP-4或SDP。将SDP-4或SDP材料溶解于纯化水中，其中将产生浓度为1mmol至1,000mmol的缓冲系统，例如柠檬酸缓冲液，Tris缓冲液，PBS缓冲液或硼酸盐缓冲液。可以向制剂中加入另外的赋形剂成分。表面活性剂如聚山梨醇酯可以在0.01％-0.1％wt./vol.的浓度范围加入。可以加入稳定的糖分子，例如海藻糖，右旋糖或蔗糖，浓度范围为10mmol-500mmol。缓和剂分子可加入作为眼用润滑剂，例如PEG，羧甲基纤维素，羟丙甲纤维素，羟丙基甲基纤维素或甘油，其浓度范围为0.1％-2.0％wt./vol.。还可以添加盐以减少分子相互作用并稳定配方，例如NaCl，MgCl 2，CaCl 2或LiBr，浓度范围为10mmol-500mmol。氨基酸分子可以作为稳定剂加入，例如L-谷氨酰胺或L-精氨酸，浓度范围为10mmol-500mmol。螯合剂可以作为稳定剂加入，例如EDTA，浓度范围为0.01％-0.1％wt./vol.。在制剂中还可加入高达0.015％wt./vol.浓度的抗微生物剂，例如过硼酸盐或BAK。
下面是一些已经生产的含有SDP-4和/或SDP分子的基本配方的表格，其中可以添加额外的添加剂或赋形剂以增强上述配方应用：
SDP或诸如SDP-4的SDP级份也可以添加到已知的眼科制剂中，例如商业和处方滴眼剂和软膏，以改善润湿性和患者舒适度。可添加SDP或SDP-4的眼用溶液的实例包括酒石酸溴莫尼定，酒石酸溴莫尼定/马来酸噻吗洛尔，阿卡他定，比马前列素，环孢菌素，加替沙星，酮咯酸氨丁三醇或Lifitegrast眼用溶液。可以加入SDP或SDP-4的其它制剂的实例描述于美国专利5,468,743；5,880,283；6,333,045；6,562,873；6,627,210；6,641,834；6,673,337；7,030,149；7,320,976；7,323,463；7,351,404；7,388,029；7,642,258；7,842,714；7,851,504；8,008,338；8,038,988；8,101,161；8,133,890；8,207,215；8,263,054；8,278,353；8,299,118；8,309,605；8,338,479；8,354,409；8,377,982；8,512,717；8,524,777；8,541,463；8,541,466；8,569,367；8,569,370；8,569,730；8,586,630；8,629,111；8,632,760；8,633,162；8,642,556；8,648,048；8,648,107；8,664,215；8,685,930；8,748,425；8,772,338；8,858,961；8,906,962；和9,248,191,和美国专利7,314,938；7,745,460；7,790,743；7,928,122；8,084,047；8,168,655；8,367,701；8,592,450；8,927,574；9,045,457；9,085,553；9,216,174；9,353,088；和9,447,077。
文中描述了上述的一些实施方式和实施例，但这些描述都只是示意和说明性的，对本发明的范围不产生限制作用。根据本领域的普通技术可能进行一些改变和修饰，然而并不脱离本发明由下列权利要求所定义的较为宽泛的范围。
所有的出版物、授权专利和专利申请文献均通过参考纳入文本，就如各自单独通过参考纳入那样。由这些公开物，应当不会引入与本文公开内容不一致的限制。本发明的描述引述了各种特定和优选的实施方式和技术方案。应当理解，还有许多变化和修饰可被采纳，仍然都应属于本发明的精神和范围。

Claims (23)

1.一种丝素衍生蛋白质组合物，其在水溶液中具有增强的稳定性，其中：
所述丝素衍生蛋白质组合物的一级氨基酸序列，在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸含量的组合差异的绝对值方面，与天然丝素的差异为至少4％；
所述丝素的丝素蛋白重链和丝素蛋白轻链之间的半胱氨酸二硫键被减少或消除；
所述蛋白质组合物中的多个肽链终止于酰胺(-C(＝O)NH2)基团；
与天然丝素蛋白相比，所述组合物的丝氨酸含量降低了大于25％，其中所述丝氨酸含量为至少约5％；以及
其中，丝素衍生蛋白质组合物的平均分子量小于40kDa且大于2kDa。
2.权利要求1所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物的多于50％的蛋白质链具有的分子量为10kDa至60kDa。
3.权利要求1所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物在高达10％w/w的浓度下在所述蛋白质组合物的水溶液超声处理时不发生凝胶。
4.权利要求1所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物包含少于8％的丝氨酸氨基酸残基。
5.权利要求1所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物包含大于46.5％的甘氨酸氨基酸。
6.权利要求1所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物包含大于30.5％的丙氨酸氨基酸。
7.权利要求1所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物在干燥成薄膜后完全再溶于水。
8.权利要求1所述的蛋白质组合物，其中所述蛋白质组合物在水溶液中缺乏β-折叠蛋白质结构。
9.权利要求1所述的蛋白质组合物，其中在超声处理至少5秒后，所述蛋白质组合物在550nm处保持水溶液中小于0.25的光吸收。
10.一种眼科制剂，其包含权利要求1-9任一项所述的蛋白质组合物和水，以及任选的一种或多种的缓冲介质，盐，稳定剂，防腐剂和润滑剂。
11.一种减轻炎症的方法，其包括将丝素衍生蛋白质组合物施用于发炎组织；
其中，在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸含量的组合差异绝对值方面，丝素衍生蛋白质组合物的一级氨基酸序列与天然丝素蛋白的差异为至少4％；
丝素蛋白蛋白重链和丝素蛋白轻链之间的半胱氨酸二硫键被减少或消除；
所述蛋白质组合物中的多个肽链终止于酰胺(-C(＝O)NH2)基团；
与天然丝素蛋白相比，所述蛋白质组合物的丝氨酸含量降低了大于25％，并且其中丝氨酸含量为至少约5％；以及
其中所述丝素衍生蛋白质组合物的平均分子量小于60kDa且大于10kDa；
从而减少组织细胞核内的转录因子信号传导，从而减轻炎症。
12.权利要求11所述的方法，其中所述施用于发炎组织的给药减少一种或多种炎性基因TNF-α，MMP-9，IL-1β和IL-6的转录。
13.权利要求11所述的方法，其中所述给药是针对角膜的，并且所述施用的给药减少角膜中MMP-9的存在。
14.权利要求11所述的方法，其中所述施用的给药是针对眼睛的，并且所述施用的给药减轻眼表面上的炎症。
15.权利要求11所述的方法，其中所述减轻炎症伴随炎症位置细胞迁移率的增加。
16.权利要求11所述的方法，其中所述蛋白质组合物的平均分子量小于40kDa。
17.权利要求11所述的方法，其中所述蛋白质组合物的平均分子量小于35kDa。
18.权利要求11所述的方法，其中所述丝素衍生蛋白质组合物溶解于眼科制剂，其包含一种或多种的缓冲介质，盐，稳定剂，防腐剂和润滑剂中。
19.权利要求11所述的方法，其中所述炎症是由眼部病症引起，其中所述眼部病症是干眼症，角膜溃疡，角膜糜烂，角膜磨损，角膜变性，角膜穿孔，角膜瘢痕形成，上皮缺损，角膜结膜炎，特发性葡萄膜炎，角膜移植，年龄相关黄斑变性，糖尿病眼，睑缘炎，青光眼，高眼压，术后眼痛和炎症，后段新生血管，增生性玻璃体视网膜病变，巨细胞病毒性视网膜炎，眼内炎，脉络膜新生血管膜，血管闭塞性疾病，过敏性眼病，肿瘤，视网膜炎色素性，眼部感染，巩膜炎，眼睑下垂，瞳孔缩小，眼痛，瞳孔散大，神经痛，瘢痕性眼表疾病，眼部感染，炎症性眼病，眼表疾病，角膜病，视网膜疾病，全身性疾病的眼部表现，遗传性眼病，眼部肿瘤，眼内压增高确定，疱疹感染，Ptyrigium或巩膜肿瘤，持续到眼表的伤口，后屈光性角膜切开术眼睛疼痛和炎症，热或化学灼伤角膜，巩膜伤口，或圆锥角膜和结膜伤口。
20.权利要求19所述的方法，其中所述炎症是由干眼症引起。
21.一种丝素衍生蛋白质组合物用于治疗炎症的用途，其中在丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的氨基酸含量的组合差异绝对值方面，丝素衍生蛋白质组合物的一级氨基酸序列与天然丝素蛋白的差异为至少4％；所述丝素蛋白的丝素蛋白重链和丝素蛋白轻链之间的半胱氨酸二硫键被减少或消除；所述蛋白质组合物中的多个肽链终止于酰胺(-C(＝O)NH2)基团；与天然丝素蛋白相比，所述蛋白质组合物的丝氨酸含量降低了大于25％，并且其中丝氨酸含量为至少约5％；其中所述丝素衍生蛋白质组合物的平均分子量小于60kDa且大于10kDa。
22.权利要求21所述的用途，其中所述蛋白质组合物的平均分子量小于35kDa。
23.权利要求22所述的用途，其中所述蛋白质组合物是用于治疗干眼症的组合物。
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