CN113584082B - CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在制备治疗遗传性感音神经性聋的药物中的应用 - Google Patents

CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在制备治疗遗传性感音神经性聋的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在制备治疗遗传性感音神经性聋的药物中的应用，所述的基因编辑系统包括特异性靶向Myo6C442Y突变基因的gRNA以及SaCas9‑KKH，并通过AAV‑PHP.eB病毒载体递送，形成了有效的针对Myo6C442Y的敲除系统。本发明通过Myo6WT/C442Y小鼠模型实验，评价其对小鼠听力损失的影响，结果发现AAV‑SaCas9‑KKH‑Myo6‑g2系统能特异性地敲除Myo6WT/C442Y小鼠中的Myo6C442Y突变等位基因，且Myo6WT/C442Y小鼠中注射AAV‑SaCas9‑KKH‑Myo6‑g2后可在长达5个月的时间内，观察到听觉功能的恢复，同时，还观察到ABR I波潜伏期变短、细胞存活率提高、纤毛形态变规则，直观地验证了AAV‑SaCas9‑KKH‑Myo6‑g2系统对Myo6C442Y突变基因导致的半显性遗传感音神经性聋的治疗作用，可用于制备治疗半显性遗传感音神经性聋的药物。

Description

CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在制备治疗遗传性感音神经 性聋的药物中的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域、医药领域，具体涉及一种CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在制备治疗遗传性感音神经性聋的药物中的应用。
背景技术
肌球蛋白VI(Myosin VI，MYO VI)是一种非常规肌球蛋白，在内耳的内外毛细胞均有表达，特别是纤毛的表皮板，因此认为该蛋白对于纤毛在表皮板的锚定发挥重要作用。MYO6基因的致病变异导致常染色体显性遗传非综合征性听力丧失或常染色体隐性遗传性非综合征性听力丧失。对日本听力损失患者进行的大规模遗传分析发现，2.4％的常染色体显性遗传感音神经性耳聋病例是由MYO6突变引起的。肌球蛋白VI p.C442Y突变在人类引起在儿童时期开始发生进行性听力损失，到5岁时表现出严重的感音神经性聋。虽然MYO6突变在遗传性耳聋中发挥重要作用，但目前尚缺乏有效的治疗和预防方法。
腺相关病毒(AAV)介导的基因过表达治疗在隐性小鼠耳聋模型的多项临床前试验已报道成功地治疗了听力损伤。然而，这种策略的缺点是其有效期短，非靶细胞的过量蛋白表达造成未知风险，且缺乏控制基因表达的元件，这种疗法不适合于像肌球蛋白VIp.C442Y那样的半显性遗传突变。
因此，我们亟需寻找一种有效针对Myo6C442Y突变基因导致的半显性遗传感音神经性聋的治疗方法。
发明内容
本发明针对缺乏治疗Myo6C442Y突变基因导致的耳聋的问题，目的在于提供一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，用以特异性靶向并敲除Myo6C442Y突变基因，保留野生型链使Myo6WT基因发挥正常功能，从而治疗由Myo6C442Y突变基因导致的半显性遗传感音神经性聋，可制备治疗遗传性感音神经性聋的药物。
基于上述，本发明首先提供一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统特异性靶向并敲除Myo6C442Y突变基因，该基因编辑系统包含靶基因为Myo6C442Y突变基因的gRNA。
优选地，所述的gRNA的靶向序列如SEQ ID NO：2所示。
优选地，所述的Cas9为SaCas9-KKH。
优选地，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统通过腺相关病毒载体递送。
进一步地，所述的腺相关病毒为AAV-PHP.eB病毒。
本发明还提供了所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统在制备治疗遗传性感音神经性聋的药物中的应用；所述的遗传性感音神经性聋为Myo6C442Y突变基因导致的半显性遗传感音神经性聋。
所述的药物特异性靶向并敲除Myo6C442Y突变基因，保留野生型链使Myo6WT基因发挥正常功能。
本发明还提供了一种治疗遗传性感音神经性聋的药物组合物，所述的药物组合物包括：前面任一所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，以及药学上和生理学上可接受的载体。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
(1)本发明基于CRISPR/Cas9技术，提供了AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2系统，且通过Myo6WT/C442Y小鼠模型实验，评价其对小鼠听力损失的影响，结果发现AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2系统能特异性地敲除Myo6WT/C442Y小鼠中的Myo6C442Y突变等位基因，且在Myo6WT/C442Y小鼠中注射AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2治疗系统后长达5个月的时间内，可观察到听觉功能的恢复，同时，还观察到ABR I波潜伏期变短、细胞存活率提高、纤毛形态变规则，直观地验证了AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2治疗系统对Myo6C442Y突变基因导致的半显性遗传感音神经性聋的治疗作用。
(2)本发明提供的AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2系统特异性敲除Myo6WT/C442Y小鼠中的Myo6C442Y突变等位基因，保留Myo6WT等位基因使其发挥功能，首次验证敲除突变链，保留野生型链，可进行Myo6C442Y半显性耳聋治疗，为利用体内基因组编辑技术治疗各种半显性遗传形式的听力损失和其他半显性遗传疾病提供了进一步的证据和支持。
附图说明
图1为破坏Myo6C442Y突变等位基因的基因组编辑策略；其中：
A为SaCas9-KKH sgRNA的设计；
B为Myo6C442Y/C442Y mESCs体外研究示意图；
C-D为Myo6WT/WT、Myo6C442/C442Y和Myo6WT/C442Y mESCs中Myo6-g1和Myo6-g2的插入/缺失百分比；
E为SaCas9-KKH-Myo6-g2转染Myo6C442Y/C442Y mESCs后引起整码和移码突变的比例；
F-G为SaCas9-KKH-Myo6-g2转染Myo6C442Y/C442Y mESCs后引起的插入缺失图谱。
图2为使用AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2系统进行体内基因组编辑的研究及结果；其中：
A为AAV载体示意图和体内研究的实验流程图；
B-C为P14时治疗组、未治疗组感觉上皮细胞中的插入/缺失百分比；
D-E为SaCs9-KKH-Myo6-g2转染Myo6C442Y/C442Y和Myo6WT/C442Y后引起整码和移码突变的比例；
F为Myo6C442Y/C442Y和Myo6WT/C442Y治疗组小鼠中频率最高的突变类型。
图3为AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2对Myo6WT/C442Y小鼠内耳ABR阈值的影响；其中：
A为10周、15周、5个月和10个月时的各实验组小鼠内耳ABR阈值；
B为10周时在8kHz和16kHz的ABR I波潜伏期；
C为10周时在8kHz和16kHz的ABR I波振幅。
图4为AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2对Myo6WT/C442Y小鼠细胞存活率的影响；其中：
A-D为5个月、10个月时治疗组和未治疗组小鼠耳蜗每100μm切片的IHC和OHC数量；
E为10个月时治疗组和未治疗组小鼠耳蜗的代表性共聚焦图像。
图5为AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2对Myo6WT/C442Y小鼠毛束形态的影响；其中，Low表示低倍率，High表示高倍率。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
本发明首先提供了一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统特异性靶向并敲除Myo6C442Y突变基因，该基因编辑系统包含靶基因为Myo6C442Y突变基因的gRNA。
优选地，所述的gRNA的靶向序列如SEQ ID NO：2所示。
优选地，所述的Cas9为SaCas9-KKH。
优选地，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统通过腺相关病毒载体递送。
进一步地，所述的腺相关病毒为AAV-PHP.eB病毒。
通过以上技术方案，本发明提供了一种AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2治疗系统，并通过Myo6WT/C442Y小鼠模型实验，评价该治疗系统对听力损失的影响，结果发现AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2治疗系统能特异性地敲除Myo6WT/C442Y小鼠中的Myo6C442Y突变等位基因，且在Myo6WT/C442Y小鼠中注射AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2后长达5个月的时间内，可观察到听觉功能的恢复，直观地验证了AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2治疗系统对Myo6C442Y突变基因导致的耳聋的治疗作用。
本发明还提供了所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统在制备治疗遗传性感音神经性聋的药物中的应用；所述的遗传性感音神经性聋为Myo6C442Y突变基因导致的半显性遗传感音神经性聋。所述的药物特异性靶向并敲除Myo6C442Y突变基因，保留野生型链使Myo6WT基因发挥正常功能。
本发明还提供了一种治疗遗传性感音神经性聋的药物组合物，所述的药物组合物包括：本发明所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，以及药学上和生理学上可接受的载体。
合适的药学上可接受的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’sPharmaceutical Sciences中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、磷酸盐缓冲液、ringer溶液、生理盐水、平衡盐溶液、甘油或山梨醇等。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。
下面对本发明的实验过程及实验结果进行详细说明，从而证明本发明提供的AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2对Myo6突变基因导致的半显性遗传感音神经性聋的治疗作用，能够用于制备治疗相关半显性遗传感音神经性聋的药物。
本实验Myo6WT/C442Y和Myo6C442Y/C442Y(Myo6WT/WT作为对照)小鼠来源于北京百奥赛图基因生物技术有限公司，实验动物的研究得到复旦大学实验动物伦理委员会和上海市医学实验动物管理委员会的批准。所有动物均在复旦大学实验动物科学系饲养，所有实验程序均按照动物研究的政策和伦理进行。
(一)设计并筛选AAV-SaCas9-KKH-sgRNA系统
Myo6WT/C442Y小鼠有G到A的变化(NM_001039546.1：c.1325G>A)，因此本发明的Cas9蛋白选择SaCas9-KKH，其可区分Myo6C442Y等位基因和Myo6WT等位基因，且较短，可以成功和具有高效特异感染效率的AAV-PHP.eB病毒结合。针对突变的Myo6C442Y等位基因设计了两个sgRNA，sgRNA设计图(图1中的A)显示了两种sgRNA的靶向序列，分别为
Myo6-g1：AAGATGTTTCAAAAGGAAAGTACTGAT(SEQ ID NO：1)；
Myo6-g2：AATAAGAAGATGTTTCAAAAGGAAAGT(SEQ ID NO：2)。
图1中的B图表示AAV-SaCas9-KKH-sgRNA系统的体外编辑研究过程：取Myo6C442Y突变小鼠的胚胎构建胚胎干细胞系，在体外通过脂质体3000转染系统将SaCas9-KKH-sgRNA-GFP质粒导入到mESC(胚胎干细胞)中表达，48小时后通过流式分选收集带GFP荧光的细胞并提取基因组DNA，进行深度测序，分析测序结果得到Myo6-g1和Myo6-g2对突变位点的编辑效率，以筛选出效率高的sgRNA以待后续体内治疗使用；同时使用Cas-OFFinder软件检测Myo6-g2的脱靶情况，以评估其安全性。
结果表明，与Myo6-g1(0.27±0.06％)相比，Myo6-g2在突变型Myo6C442Y/C442Y小鼠胚胎干细胞(mESCs)中的靶向插入或缺失率(23.22±1.76％)更高，且Myo6C442Y/C442Y mESC中Myo6-g2编辑Myo6C442Y等位基因的效率比编辑Myo6WT/WT mESC中Myo6WT等位基因的效率(1.13±0.25％)高约21倍(图1中的C)。另外，Myo6WT/C442Y mESC中Myo6C442Y等位基因的Myo6-g2编辑效率(23.7±5 2.04％)也高于Myo6-g1(0.06±0.04％)，Myo6WT/C442Y mESC中Myo6-g2编辑Myo6C442Y等位基因的效率比编辑Myo6WT等位基因的效率(1.23±0.25％)高约19倍(图1中的D)。由此说明，Myo6-g2在Myo6C442Y/C442Y和Myo6WT/C442Y小鼠中特异性编辑Myo6C442Y等位基因。
插入缺失图谱显示，大多数Myo6-g2诱导的变异是插入和缺失，其中移码突变率为83.3％(图1中的E、F)。
在使用Cas-OFFinder软件对Myo6-g2进行的计算机模拟脱靶分析中，我们检查了用Myo6-g2、对照sgRNA(NT-sg)转染的mESC中15个脱靶位点的插入缺失频率，结果并没有观察到明显的插入缺失突变(图1中的G)。
以上结果表明，与SaCas9-KKH-Myo6-g1相比，SaCas9-KKH-Myo6-g2是更好的策略，并使用SaCas9-KKH-Myo6-g2用于随后的体内实验。
(二)使用SaCas9-KKH-Myo6-g2系统进行体内基因组编辑实验
1.实验过程
如图2中的A图为使用SaCas9-KKH-Myo6-g2系统进行体内基因组编辑的实验流程：包装AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2病毒治疗系统。冰麻的实验动物，在显微镜辅助下开放鼓室外侧壁，调整合适角度，暴露术野；将微量注射仪连接注射玻璃针，玻璃针微细的尖端通过耳蜗侧壁刺入中阶，按照169nl/min的速度缓慢通过中阶注入适量AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2病毒治疗系统；注射结束后，缝合皮下组织及皮肤并复温。
后续进行一系列的检测和观察。
2.检测
(1)听力脑干反应(Auditory brainstem response，ABR)：在小鼠10周龄、15周龄、5个月及10个月时，选取合适测听频率(4、8、16和24kHz)测试ABR反应，比较AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2对治疗耳和非治疗耳听力的影响。
(2)免疫荧光染色计数毛细胞数量：小鼠在5个月、10个月时，取双侧耳蜗，解剖感觉上皮区，通过免疫荧光染色并在激光共聚焦显微镜下拍照，并计数毛细胞数量，比较经AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2治疗后毛细胞数量的异同。其中，本实验使用Myosin7a标记成熟毛细胞，用DAPI标记细胞核。
(3)电镜法检测毛细胞纤毛形态：收获10周龄成年小鼠的颞骨，充分脱钙后，仔细解剖感觉上皮区。通过电子显微镜(日立S 4700FESEM)进行成像，观察经AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2治疗后毛细胞纤毛形态的异同。
3.实验结果
(1)SaCas9-KKH-Myo6-g2系统体内基因组编辑的效率
图2表示使用SaCas9-KKH-Myo6-g2系统进行体内基因组编辑的流程和编辑效果分析。在小鼠P14时，进行SaCas9-KKH-Myo6-g2系统在体内编辑的效果检测。结果表明，对于Myo6C442Y/C442Y小鼠，AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2治疗组的插入缺失频率为3.51±3.12％，而未治疗组的耳蜗基本上没有插入缺失；对于Myo6WT/WT小鼠，AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2治疗组和未治疗组之间的插入缺失频率没有显著差异(图2中的B)，这与体外实验结果一致。在Myo6WT/C442Y小鼠中，Myo6-g2专门编辑了Myo6C442Y等位基因，比编辑Myo6WT等位基因的效率高约17倍(图2中的C)。插入缺失图谱显示Myo6C442Y等位基因中AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2诱导的变异大部分为缺失，Myo6C442Y/C442Y和Myo6WT/C442Y的移码突变率分别为89.0％和92.3％(图2中的D)。其中最常见的突变变体是–1bp、–2bp和+1bp移码(图2中的E、F)。
以上结果表明AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2同样可以在体内特异性地编辑Myo6C442Y等位基因。
(2)Myo6C442Y等位基因的特异性敲除可改善听力功能
为了研究AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2系统对Myo6WT/C442Y小鼠听力功能的影响，记录了ABR，评估治疗组小鼠4kHz至32kHz频率范围内的听力恢复情况。首先通过实验证实了AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2治疗系统不影响野生型小鼠的听力功能。结果表明，在10周时，与未治疗组相比，经过AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2治疗的耳蜗中所有测试频率的ABR阈值均显著降低(图3中的A)，且治疗组的耳蜗中8kHz和16kHz的90dB SPL声音刺激的I波潜伏期更短，但10周时未治疗组和治疗组的耳蜗中ABR I波振幅的无显著变化(图3中的B、C)。
另外，在15周时，与未治疗组相比，治疗组耳蜗的ABR阈值同样显著降低，然而，到5个月时，其中有4个频率的改善幅度明显降低。随后通过长达10个月的连续观察，发现未经治疗的小鼠没有显示出可检测的ABR阈值，表明耳聋严重(图3中的A)。
以上结果表明，敲除Myo6C442Y突变等位基因最初可以改善听觉功能，但随着时间的推移，效果逐渐消失，5个月时听觉功能开始下降，10个月时听觉功能严重退化。
(3)Myo6C442Y等位基因的特异性敲除可提高毛细胞存活率
为了评估AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2基因编辑对毛细胞存活率的影响，我们在5个月和10个月时对毛细胞进行了计数。结果表明，在第5个月时，治疗组Myo6WT/C442Y小鼠的内毛细胞数量与未治疗组小鼠无明显差异，但治疗组小鼠的耳蜗中有更多的外毛细胞(图4中的A、B)。在第10个月时，在治疗组小鼠的耳蜗中观察到更多的内毛细胞，以及治疗组小鼠耳蜗的中圈观察到更多的外毛细胞(图4C、D)。在两组小鼠耳蜗的底圈中几乎都没有观察到外毛细胞(图4中的D)。
以上结果表明，Myo6C442Y等位基因的敲除显著提高了毛细胞的存活率，并且Myo6WT /C442Y小鼠的毛细胞丢失从外毛细胞进展到内毛细胞，从基底部到顶部。
(4)Myo6C442Y等位基因的特异性敲除改善毛束形态
毛细胞上的静纤毛束负责声音检测，静纤毛的形态缺陷会导致耳聋。因此，在本发明中，采用电子显微镜扫10周龄的治疗组和未治疗组Myo6WT/C442Y小鼠耳蜗，以评估毛束形态，同时扫描野生型小鼠耳蜗作对照。结果如图5所示，在野生型对照小鼠耳蜗中，外毛细胞和内毛细胞的毛术以阶梯状排列成两到三行。在Myo6WT/C442Y小鼠中，外毛细胞和内毛细胞在某些区域显示出明显的解体，当AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2被递送到Myo6WT/C442Y小鼠后，我们在治疗组耳蜗的外毛细胞和内毛细胞中观察到更有组织的纤毛束。由此说明，AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2治疗系统可修复由Myo6WT/C442Y突变引起的纤毛束缺失和形变。
综上所述，本发明提供了一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，该基因编辑系统为AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2，且通过Myo6WT/C442Y小鼠模型实验，评价其对小鼠听力损失的影响，结果发现该系统能特异性地敲除Myo6WT/C442Y小鼠中的Myo6C442Y突变等位基因，且Myo6WT/C442Y小鼠中注射治疗系统后长达5个月的时间内，可观察到听觉功能恢复，同时还观察到ABR I波潜伏期变短、细胞存活率提高、纤毛形态变规则，直观地验证了AAV-SaCas9-KKH-Myo6-g2治疗系统对Myo6C442Y突变基因导致的半显性遗传感音神经性聋的治疗作用。同时也首次验证敲除突变链，保留野生型链，可进行Myo6C442Y半显性耳聋治疗，为利用体内基因组编辑技术治疗各种半显性遗传形式的听力损失和其他半显性遗传疾病提供了进一步的证据和支持。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院
<120> CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在制备治疗遗传性感音神经性聋的药物中的应用
<141> 2021-06-22
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagatgtttc aaaaggaaag tactgat 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aataagaaga tgtttcaaaa ggaaagt 27

Claims (6)

1.一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统特异性靶向并敲除Myo6C442Y突变基因，该基因编辑系统包含靶基因为Myo6C442Y突变基因的gRNA，所述的gRNA的靶向序列如SEQ ID NO：2所示，所述的Cas9为SaCas9-KKH。
2.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统通过腺相关病毒载体递送。
3.如权利要求2所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述的腺相关病毒为AAV-PHP.eB病毒。
4.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统在制备治疗遗传性感音神经性聋的药物中的应用；所述的遗传性感音神经性聋为Myo6C442Y突变基因导致的半显性遗传感音神经性聋。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药物特异性靶向并敲除Myo6C442Y突变基因，保留野生型链使Myo6WT基因发挥正常功能。
6.一种治疗遗传性感音神经性聋的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：权利要求1-3任意一项所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，以及药学上和生理学上可接受的载体。
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