DE10108412A1 - Pigmentepithelzelle des Auges, ihre Herstellung und Verwendung in der Therapie einer Augen- oder Nervenerkrankung - Google Patents
Pigmentepithelzelle des Auges, ihre Herstellung und Verwendung in der Therapie einer Augen- oder NervenerkrankungInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Pigmentepithelzelle des Auges, enthaltend Vektor-DNA eines adenoviralen Vektors mit großer DNA-Kapazität, die verbesserte Isolatierung und Kultivierung dieser Zellen und Verfahren zur Herstellung sowie die Verwendung in der Therapie einer Augen- oder Nervenerkrankung.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Pigmentepithelzelle des Auges enthaltend
Vektor-DNA eines adenoviralen Vektors mit großer DNA-Kapazität, die
verbesserte Isolatierung und Kultivierung dieser Zellen und Verfahren zur
Herstellung sowie die Verwendung in der Therapie einer Augen- oder
Nervenerkrankung.
Die fünf Primärsinne Tasten, Sehen, Hören, Schmecken und Riechen dienen der
Aufnahme von Information aus der Umwelt. Ca. 75% unserer Wahrnehmungen
laufen über den Gesichtssinn. Dieser hohe Prozentsatz verdeutlicht die heraus
ragende Bedeutung des Sehens in unserem täglichen Leben. Folglich stellt eine
Schwächung unserer Sehkraft einen immensen Einschnitt in den Lebensalltag dar.
Das Auge besteht aus einem zusammengesetzten Linsensystem, das auf der
Netzhaut ein umgekehrtes und verkleinertes Bild der Umwelt darstellt. Der
dioptische Apparat besteht aus der durchsichtigen Kornea (Hornhaut), der die
Pupille bildenden Iris, der Linse und dem Glaskörper, einer gallertartigen,
durchsichtigen Masse im Inneren des Augapfels zwischen Linse und Retina. Fig.
1 zeigt einen schematisierten Horizontalschnitt durch das Auge. Die Hülle des
Augapfels besteht aus 3 Schichten: der Sklera (Lederhaut), der Choroidea
(Aderhaut) und der Retina (Netzhaut). Die Retina wiederum besteht aus einer
äußeren Schicht, dem retinalen Pigmentepithel (RPE), sowie einer inneren
Schicht, der neurosensorischen Netzhaut.
Die ringförmige Regenbogenhaut (Iris) trennt die vordere von der hinteren
Augenkammer und bildet den vorderen Teil der Uvea (Gefäßhaut). Sie besteht
von anterior nach posterior aus einer kollagenreichen Extrazellularmatrix, dem
Irisstroma (es enthält Melanozyten, Fibrozyten, Nerven und Blutgefäße) und dem
Irispigmentepithel (IPE).
Das IPE ist zweilagig und besteht aus einer anterioren und einem posterioren
Pigmentepithelzellschicht (Freddo TF (1996) Ultrastructure of the iris. Microsc
Res Tech 33: 369-389). Die Zellen des posterioren Irispigmentepithels sind durch
Tight-Junctions verbunden. Das anteriore Pigmentepithel besitzt zusätzlich glatte
Muskelzellen (außer im Bereich des Sphinkters), die zur Dilatation der Iris
beitragen (Freddo 1996, supra). Das Irispigmentepithel hat dieselbe
embryologische Herkunft wie das retinale Pigmentepithel. Aus einer
menschlichen Iris können ca. 2,3 × 105 IPE Zellen gewonnen werden, von denen
90% in Zellkultur überleben (Hu DN, Ritch R, McCormick SA, Pelton-Henrion
K (1992) Isolation and cultivation of human iris pigment epithelium. Invest
Ophtalmol Vis Sci 33: 2443-2453). IPE Zellen sind stark pigmentiert und
enthalten viel Eumelanin. Melanin hat folgende schützenden Funktionen. Es kann
zweiwertige Eisen Ionen (Fe2+) und andere toxische Substanzen (z. B. Ca2+)
binden und damit dem Zellzytoplasma entziehen (Hill HZ (1992) The function of
melanin or six blind people examine an elephant. Bioessays 14: 49-56). Melanin
kann außerdem durch Redoxreaktionen Fe2+ in weniger toxisches Fe3+ überführen.
Andererseits haben die Vorstufen der Melaninsynthese Dihydroxyindol (DHI) und
Dihydroxyindolcarboxylsäure (DHIA) eine sehr starke antioxidative Wirkung, die
stärker ist als die von alpha Tocopherol (Memoli S, Napolitano A, d'Ischia M,
Misuraca G, Palumbo A, Prota G (1997) Diffusible melanin-related metabolites
are potent inhibitors of lipid peroxidation. Biochim Biophys Acta 1346: 61-68).
Melanin kann toxische Sauerstoffradikale, die im Auge durch den hohen
Sauerstoffpartialdruck in Kombination mit Lichtexposition entstehen, eliminieren.
Auch Elemente, die für die normale Funktion der Retina wichtig sind, wie
beispielsweise Zink, werden mit hohem Wirkungsgrad vom Melanin gespeichert.
Zink hat als Kofaktor für zum Beispiel antioxidative Enzyme (Superoxid
dismutase) oder bindegewebsabbauende Enzyme (Metalloproteinasen) mehrere
wichtige Bedeutungen im Auge und im zentralen Nervensystem (ZNS).
Das Pigmentepithel spielt eine wichtige Rolle im Stoffwechsel und bei der
Lichtabsorption des Auges. Es ist außerdem verantwortlich für die äußere Blut-
Retina-Schranke sowie für die Entsorgung abgestoßener Photorezeptorzellen.
Folglich bildet sie ein interessantes Ziel zur gentherapeutischen Behandlung von
Augenerkrankungen.
Bisher wurden einige Experimente zur genetischen Modifikation von Pigment
epithelzellen beschrieben, die jedoch im Hinblick auf Dauer und Stabilität der
Expression keine zufriedenstellenden Ergebnisse lieferten.
In einer Studie mit Labormäusen wurde ein adenoviraler Vektor der ersten
Generation für den Gentransfer in das retinale Pigmentepithel durch subretinale
Injektion verwendet, der das E.coli lacZ Gen unter Kontrolle des CMV Promotors
exprimierte. Adenovirale Vektoren der ersten Generation (Gilardi et al., FEBS
Letters 267, 60-62, 1990; Stratford-Perricaudet et al., Hum. Gene Ther. 1, 241-256,
1990) sind durch Deletionen der E1A- und E1B-Gene charakterisiert. E1A
und E1B haben transformierende und transaktivierende Eigenschaften. In einigen
Vektoren ist außerdem E3 deletiert, um die Kapazität für die Aufnahme fremder
DNA zu erhöhen. Obwohl der Gentransfer in das retinale Pigmentepithel effizient
war und kurz nach Injektion eine sehr gute Expression im retinalen
Pigmentepithel beobachtet wurde, war die Expression transient. 6 Wochen nach
Injektion waren nur noch vereinzelt lacZ positive retinale Pigmentepithelzellen zu
beobachten (Li T, Adamian M, Roof DJ, Berson EL, Dryia TP, Roessler BJ,
Davidson BL (1994) In vivo transfer of a reporter gene to the retina mediated by
an adenoviral vector. Invest Ophthalmol Vis Sci: 35, 2543-2549).
In einer weiteren Untersuchung, die an Laborratten mit einem Beobachtungs
zeitraum von 14 Tagen durchgeführt wurde, wurde ein Adenovirus der ersten
Generation verwendet, der das E.coli lacZ Gen unter Kontrolle des Rous Sarcoma
Virus (RSV) Promotors exprimierte. Obwohl der Gentransfer in das retinale
Pigmentepithel effizient war und 7 Tage nach Injektion eine sehr gute Expression
im retinalen Pigmentepithel beobachtet wurde, war die Expression eine Woche
später reduziert (Rakoczy PE, Lai CM, Shen WY, Daw N, Constable IJ (1998)
Recombinant adenovirus-mediated gene delivery into the rat retinal pigment
epithelium in vivo. Australian and New Zealand Journal of Ophthalmology 26
(Suppl.): S56-S58).
In einer anderen Studie, die an 6 Wochen alten RCS Ratten durchgeführt wurde,
wurde ein adenoviraler Vektor der ersten Generation verwendet, der das green
fluorescence protein (GFP) Gen unter Kontrolle des CMV Promotors exprimierte
(Anglade E, Csaky KG (1998) Recombinant adenovirus-mediated gene transfer
into the adult rat retina. Curr Eye Res 17: 316-321). Obwohl der Gentransfer in
das retinale Pigmentepithel nach subretinaler Injektion effizient war und 3 Tage
nach Injektion 30 bis 90% des retinalen Pigmentepithels im Bereich der
Injektionsstelle GFP positiv waren, war 6 Tage später (also 9 Tage nach Injektion)
keine GFP Expression mehr nachweisbar.
Während bei den oben genannten Beispielen des Gentransfers im Bereich des
Auges adenovirale Vektoren der ersten Generation verwendet wurden, wurde in
einer weiteren Publikation für die subretinale Injektion von Mäusen ein
adenoviraler Vektor verwendet, der als Adenovirus Minichromosom (EAM)
bezeichnet wird (Kumar-Singh R, Farber DB (1998) Encapsidated adenovirus
mini-chromosome-mediated delivery of genes to the retina: application to the
rescue of photoreceptor degeneration. Hum Mol Genet 7: 1893-1900). Hierbei
handelt es sich um einen Vektor, der keine Virusproteine exprimiert. Der Vektor
exprimierte die beta Einheit der zyklischen GMP Phosphodiesterase (PDE) unter
der Kontrolle des natürlichen PDE Promotors. Ferner exprimierte der Vektor das
E.coli lacZ Gen unter Kontrolle des CMV Promotors. Außerdem enthielt der
Vektor verschiedene E.coli Plasmidelemente (Plasmid backbone, Ampicillin
Resistenzgen, E.coli Ursprung der Replikation). Nach Produktion war der Vektor
durch ausgeprägte Variabilität seines Genoms charakterisiert. Monomere und
dimere Strukturen wurden beobachtet, letztere in Kopf-Kopf, Kopf-Schwanz und
Schwanz-Schwanz Orientierung (head-to-head, head-to-tail und tail-to-tail).
Wegen dieser Variabilität und des Vorliegens von Plasmidsequenzen inklusive
Antibiotikaresistenz ist dieser Vektor nicht für den therapeutischen Einsatz
geeignet. Die Gentransferexperimente wurden an rd Mäusen durchgeführt, die ein
Tiermodell für retinale Degeneration darstellen und durch eine für die
Degeneration ursächliche Mutation in der beta Einheit des PDE Gens
charakterisiert sind. In dieser Studie wurde die Expression ausschließlich im
neuronalen Anteil der Retina nachgewiesen, nicht jedoch im retinalen
Pigmentepithel. Obwohl die neuronalen Zellen post-mitotisch sind und sich also
nicht mehr teilen können, war die Expression des PDE Gens nur transient. Durch
verschiedene Methoden (RT-PCR, Western Blot Analyse und Bestimmung der
PDE Aktivität) wurde nachgewiesen, daß 4 Monate nach Injektion keine
Expression mehr nachweisbar war.
Für die Transfektion von IPE Zellen ist bisher lediglich das nicht-virale
Transfektionsreagenz Lipofectamine verwendet worden. In dieser Untersuchung
wurde das Plasmid pXCN2-bFGF hergestellt, das die bFGF cDNA der Ratte
exprimiert. Zusätzlich enthält das Plasmid eine Neomycin Resistenz Gen.
Kultivierte IPE Zellen der Ratte wurden mit diesem Plasmid transfiziert. Die
Zellen exprimierten die bFGF cDNA in vitro und die Autoren schreiben, daß nach
subretinaler Transplantation als Zellsuspension in der RCS Ratte die Degeneration
von Photorezeptoren bis zu 4 Wochen verzögert wurde (Tamai M, Yamada K,
Takeda N, Tomita H, Abe T, Kojima S, Ishiguro I (1997) bFGF transfected iris
pigment epithelial cells rescue photoreceptor cell degeneration in RCS rats. In: La
Vail M, eds. Degenerative retinal diseases. 323-328). Da jedoch, wie in der
genannten Arbeit gezeigt, auch in Ratten, die IPE Zellen nach Transfektion mit
einem Kontrollplasmid durch subretinale Injektion erhalten hatten, der gleiche
Effekt, nämlich Verzögerung der Degeneration von Photorezeptoren beobachtet
wurde, der durch die Transfektion nicht verbessert oder verlängert wurde,
handelte es sich hier nicht um einen Effekt, der auf einen gezielten Gentransfer
zurückgeführt werden konnte, sondern der allein durch die Transplantation der
IPE Zellen zu erklären war. Außerdem wurde kein Nachweis einer bFGF
Expression nach Transplantation geführt.
Die genannten Publikationen offenbaren daher kein Expressionssystem für
Pigmentepithelzellen des Auges, mit dem eine langfristige und stabile Expression
eines eingeschleusten Gens beobachtet werden kann. Eine langfristige und stabile
Expression eines solchen Gens ist zur Therapie einer Vielzahl von angeborenen
und erworbenen Erkrankungen des Auges aber erforderlich. Für viele
Anwendungen ist gerade die langfristige Produktion von therapeutischen
Proteinen der entscheidende Faktor für das Erzielen eines therapeutischen Effekts.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Pigmentepithelzellen des Auges
zur Verfügung zu stellen, die therapeutisch einsetzbar sind.
Die Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung einer Pigmentepithelzelle des
Auges.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß eine Pigmentepithelzelle des
Auges, die Vektor-DNA eines adenoviralen Vektor mit großer DNA-Kapazität
enthält, langfristig stabil mindestens ein eingeführtes Gen exprimiert und somit
therapeutisch einsetzbar ist.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Pigmentepithelzelle des
Auges, die eine Vektor-DNA eines adenoviralen Vektor mit großer DNA-
Kapazität enthält.
Unter einer Pigmentepithelzelle des Auges wird eine Epithelzelle des Auges
verstanden, in der Pigment, beispielsweise Melanin, eingelagert ist. Ein Beispiel
für eine Pigmentepithelzelle des Auges ist eine retinale Pigmentepithelzelle (RPE)
oder eine Irispigmentepithelzelle (IPE).
Unter einem adenoviralen Vektor großer DNA-Kapazität versteht der Fachmann
Adenoviren, die keine viralen kodierenden DNA-Sequenzen enthalten (Kochanek
S, Clemens PR, Mitani K, Chen HH, Chan S, Caskey CT (1996) A new
adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA
independently expressing both füll-length dystrophin and beta-galactosidase. Proc
Natl Acad Sci U.S.A. 93: 5731-5736; Fisher KJ, Choi H, Burda J, Chen SJ,
Wilson JM. (1996); Recombinant adenovirus deleted of all viral genes for gene
therapy of cystic fibrosis. Virology 217: 11-22; Kumar-Singh R, Chamberlain JS
(1996) Encapsidated adenovirus minichromosomes allow delivery and expression
of a 14 kb dystrophin cDNA to muscle cells. Hum Mol Genet 5: 913-921). Diese
Adenoviren enthalten lediglich die viralen Enden unter Einschluß der "inverted
terminal repeats" (ITRs) und des Verpackungssignals. Die Kapazität für die
Aufnahme fremder DNA beträgt beispielsweise bis zu etwa 37 kb, da der weit
überwiegende Teil des adenoviralen Genoms entfernt ist.
Adenoviren sind als Expressionsvektoren, insbesondere im Rahmen der
Gentherapie, von besonderer Bedeutung. Ein Vorteil von adenoviralen Vektoren
ist die Tatsache, daß diese Vektoren replizierende und nicht-replizierende Zellen
in vitro und in vivo effizient transduzieren können.
Es sind verschiedene Systeme zur Herstellung adenoviraler Vektoren großer
DNA-Kapazität beschrieben worden (Kochanek S (1999) High-capacity
adenoviral vectors for gene transfer and somatic gene therapy. Hum Gene Ther
10: 2451-2459). Der Vorteil dieser adenoviralen Vektoren mit großer DNA-
Kapazität im Vergleich zu adenoviralen Vektoren der ersten und zweiten
Generation liegt vor allem in der größeren Kapazität. Hierdurch ist es möglich, ein
oder mehrere Gene oder Expressionskassetten in die Pigmentepithelzellen
einzuführen.
Nach Aufnahme des adenoviralen Vektors in die Zelle wird die Hülle des Vektor
üblicherweise in Endosomen abgebaut. Die verbleibende Vektor-DNA wird dann
in den Zellkern transportiert und integriert in der Regel nicht in das zelluläre
Genom.
Ein Beispiel für einen adenoviralen Vektor mit großer DNA-Kapazität ist ein
Vektor, der das menschliche alphal-Antitrypsin Gen exprimiert (Schiedner G,
Morral N, Parks RJ, Wu Y, Koopmans SC, Langston C, Graham FL, Beaudet AL,
Kochanek S (1998) Genomic DNA transfer with a high capacity adenovirus
vector results in improved in vivo gene expression and decreased toxicity. Nature
Genetics 18: 180-183). Ein weiteres Beispiel ist eine Vektor, der das Dystrophin
Gen und das E.coli lacZ Gene exprimiert (Kochanek S, Clemens PR, Mitani K,
Chen HH, Chan S, Caskey CT (1996) A new adenoviral vector: Replacement of
all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full
length dystrophin and beta-galactosidase. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 93: 5731-
5736) In einer bevorzugten Ausführungsform wird HC-AdFK7 oder HC-
AdhCMV.PEDF als adenoviralen Vektor mit großer DNA-Kapazität verwendet.
HC-AdFK7 ist ein adenoviraler Vektor mit großer DNA-Kapazität, der das
"enhanced green flurorescence" Protein (EGFP) unter der Kontrolle des humanen
Zytomegalievirus Promotors exprimiert. HC-AdhCMV.PEDF ist ein adenoviraler
Vektor mit großer DNA-Kapazität, der das humane "pigment epithalial cell
derived factor" (PEDF) Gen unter der Kontrolle des Zytomegalievirus Promotors
exprimiert. In diesem Vektor ist das PEDF Protein durch das Anheften
(Expression als Fusionsprotein) eines Poly-Histidin Epitops markiert, so daß das
Protein durch Verwendung eines Anti-Poly-Histidin Antikörpers leicht
nachgewiesen werden kann.
Wie in den Beispielen gezeigt, sind Pigmentepithelzellen mit einen adenoviralen
Vektor großer DNA-Kapazität in vitro sehr effizient transduzierbar. Wie ebenfalls
in den Beispielen gezeigt, kommt es nach Transplantation dieser genetisch
modifizierten Zellen zu einer sehr langfristigen Genexpression, die konstant über
mindestens 4 Monate nachweisbar ist. Hierbei ist der Ort der Transplantation
offenbar nicht kritisch. Nach Transplantation der genetisch modifizierten
Pigmentepithelzellen sowohl in das Auge in den subretinalen Raum als auch
besonders überraschend in das ZNS in das Corpus striatum führte zu einer
langfristigen über mindestens 4 Monate (Auge) bzw. mindestens 2 Monate (ZNS)
nachweisbaren Genexpression.
Die meisten Experimente mit diesen Vektoren wurden bisher in der Leber und in
der Skelettmuskulatur durchgeführt. Nach Lebergentransfer mit einem das
menschliche alphal-Antitrypsin exprimierenden Vektor in Pavianen (Morral N,
O'Neal W, Rice K, Leland M, Kaplan J, Piedra PA, Zhou H, Parks RJ, Velji R,
Aguilar-Cordova E, Wadsworth S, Graham FL, Kochanek S, Carey KD, Beaudet
AL (1999) Administration of helper-dependent adenoviral vectors and sequential
delivery of different vector serotype for long-term liver-directed gene transfer in
baboons. Proc Natl Acad Sci USA 96: 12816-12821) kam es in zwei von drei
Tieren zwar zu einer längerfristigen Expression (länger als ein Jahr), dennoch
wurde im Gegensatz zu der vorliegenden Erfindung eine kontinuierliche
Abnahme der Expression beobachtet, die in einem der Tiere nach 16 Monaten
noch 19% und in dem zweiten Tier nach 24 Monaten noch 8% der
Ausgangswerte betrug. In einem dritten Tier kam es zu einem vollständigen
Verlust der Expression innerhalb von 10 Wochen. Über den Grund für die
langsame Abnahme der Expression in den zwei Tieren mit der verlängerten
Expression wurde spekuliert. Sowohl Wachstum der Tiere als auch langsame
Zellteilung der Hepatozyten wurden diskutiert. Letztlich ist die Ursache für den
langsamen Verlust der Expression nicht geklärt. In dem Tier, in dem ein rascher
Verlust der Expression beobachtet wurde, wurde die Entstehung von Antikörpern
beobachtet, die gegen das menschliche alphal-Antitrypsin gerichtet waren.
Eine deutlichen Abnahme der Expression eines LacZ Reportergens nach
Gentransfer in die Leber mit einem adenoviralen Vektor großer DNA-Kapazität
innerhalb von 30 Tagen nach Injektion wurde in einer weitere Studie beobachtet
(Parks RJ, Bramson JL, Wan Y, Addison CL, Graham FL (1999) Effects of
stuffer DNA on transgene expression from helper-dependent adenovirus vectors. J
Virol 73: 8027-8034).
Die Skelettmuskulatur ist ein Gewebe, das in bezug auf den natürlichen Umsatz
[Turnover] der Zellen den Pigmentepithelzellen des Auges ähnelt. Die
Skelettmuskelzellen sind postmitotische Zellen. Dies bedeutet, daß sie sich,
ähnlich wie Pigmentepithelzellen, nicht mehr teilen. Besondere Erfahrung besteht
im Gentransfer in die Skelettmuskulatur von Labortieren unter Verwendung von
adenoviralen Vektoren großer DNA-Kapazität. In diesen Experimenten erfolgte
der Gentransfer ähnlich wie bei der vorliegenden Erfindung durch direkte
Injektion in das Gewebe. Obwohl nach Gentransfer unter Verwendung eines
adenoviralen Vektoren großer DNA-Kapazität, der sowohl die Dystrophin cDNA
als auch das E.coli LacZ Gen exprimierte, eine Expression über einen längeren
Zeitraum zu verzeichnen war, wurde dennoch beobachtet, daß die Expression
innerhalb von 84 Tagen wiederum abnahm (Chen HH, Mack LM, Kelly R, Ontell
M, Kochanek S, Clemens PR (1997) Persistence in muscle of an adenoviral
vector that lacks all viral genes. Proc Natl Acad Sci USA 94: 1645-1650). In
immunokompetenten Tieren, die keine Toleranz gegenüber der E.coli beta-
Galaktosidase aufwiesen, kam es zu einem vollständigen Verlust der Expression
nach 84 Tagen.
Im Gegensatz zu den in der Literatur beschriebenen Experimenten war die
Stabilität der Expression der Gene, die mittels Gentransfer mit einem adeno
viralen Vektor großer DNA-Kapazität in die Pigmentepithelzelle eingeschleust
worden waren, überraschenderweise groß. Die Vorteile der adenoviralen Vektoren
großer DNA-Kapazität bei der erfindungsgemäßen Transfektion von
Pigmentepithelzellen des Auges gegenüber den bekannten Transfektionssytemen
sind folglich
- - die Gewährleistung einer stabilen Genexpression;
- - die Möglichkeit, regulierte Genexpression durch Verwendung konstitutiver, gewebespezifischer, regulierbarer Promotoren und regulierbarer Expressions systeme zu erzielen;
- - fehlende Immunogenität und Toxizität des Vektors;
- - hohe Transduktionseffizienz bei Verwendung von Pigmentepithelzellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält daher der adenovirale Vektor eine
therapeutische Nukleinsäure, insbesondere eine therapeutische DNA, die nicht
von dem adenoviralen Vektor abstammt. Hierbei könnte es sich beispielsweise um
ein therapeutisches Gen handeln. Unter einem therapeutischen Gen versteht der
Fachmann ein Gen, dessen Expressionsprodukt zur Therapie oder Diagnose einer
Krankheit dienen kann.
Unter einer Nukleinsäure versteht man ein Polymer, das bei Hydrolyse in Zucker,
insbesondere Pentosen, vor allem Ribose und Desoxyribose, heterozyklische
organische Basen, insbesondere Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin und Uracil,
und Phosphorsäure gespalten wird. Die Nukleinsäure kann beispielsweise eine
DNA oder RNA sein. Eine therapeutische Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure, die
selbst oder deren Produkt eine therapeutische Wirkung hervorruft.
Unter einem Gen versteht man einen linearen DNA-Abschnitt, der für ein Protein
oder eine RNA codiert. Das therapeutische Gen, das durch Gentransfer in die
Pigmentepithelzelle eingebracht wird, kann unterschiedlicher Natur sein. Die
Wahl wird vom therapeutischen Ziel bestimmt. Zum Beispiel kann ein Gen
verwendet werden, das für einen neurotrophen Faktoren kodiert. Beispiele für
neurotrophe Faktoren sind der "glial cell derived neurotrophic factor" (GDNF)
und der "pigment epithelial cell derived factor" (PEDF). Zum Beispiel können
auch Gene verwendet werden, die Neoangiogenese verhindern. Ein Beispiel ist
der lösliche Rezeptor für den "vascular endothelial cell growth factor" (VEGF)
mit der Bezeichnung löslicher "vascular endothelial cell growth factor receptor- 1
(sflt1) (Roeckl W, Hecht D, Sztajer H, Waltenberger J, Yayon A, Weich HA
(1998) Differential binding characteristics and cellular inhibition by soluble
VEFG receptors 1 and 2. Experimental cell research 241: 161-1709. Ein weiteres
Beispiel ist ein dominant-negativer VEGF Rezeptor 2 (KDR) (Machein MR,
Risau W, Plate KH (1999) Antiangiogenic gene therapy in a rat glioma model
using a dominant-negative vascular endothelial growth factor receptor 2. Hum
Gene Ther 10: 1117-1128). Weitere therapeutische Gene könnten beispielsweise
NGF, BDNF, CNTF, bFGF oder Neurotrophin 3,4-5 sein.
PEDF hat sehr starke neurotrophe und neuroprotektive Wirkung (King GL,
Suzuma K (2000) Pigment-epithelium-derived factor-a key coordinator of retinal
neuronal and vascular functions. N Engl J Med 342: 349-351). Dieser Faktor wird
unter normoxischen Bedingungen vom RPE gebildet. Bei Hypoxie wird die
Produktion eingestellt. Hierdurch wird die Neovaskularisation stark gefördert. Bei
der altersabhängigen Makuladegeneration (AMD) bilden die geschädigten RPE
Zellen zu wenig PEDF. Hierdurch wird eine unkontrollierte Gefäßneubildung
induziert. Im Auge besteht die zentrale Wirkung von PEDF darin, die Neubildung
von Gefäßen zu verhindern.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann daher eine genetisch modifizierte
Pigmentepithelzelle eine Pigmentepithelzelle sein, die nach genetischer
Modifikation mit einem PEDF exprimierenden adenoviralen Vektor großer DNA-
Kapazität PEDF sezerniert. Diese Zelle kann dann beispielsweise in den
subretinalen Raum nahe der Makula bei Patienten im Anschluß an die
chirurgische Entfernung von Neovaskularisationsmembranen transplantiert
werden. Die Pigmentepithelzelle kann so einerseits das entfernte retinale
Pigmentepithel ersetzen und andererseits den für die Verhinderung der
Neovaskularisation wesentlichen PEDF Faktor produzieren. Hierdurch wird das
Visus stabilisiert. PEDF kann außerdem vor Glutamat vermittelter Neurotoxizität
schützen.
Desweiteren können je nach Krankheitsursache verschiedene therapeutische Gene
von dem adenoviralen Vektoren großer DNA-Kapazität einzeln oder in
Kombination exprimiert werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform steht das Gen unter der Kontrolle
eines viralen oder nicht-viralen Promotors, der konstitutiv, gewebespezifisch
und/oder regulierbar aktiv ist.
Unter einem konstitutiv aktiven Promotor versteht man einen Promotor, der in
nahezu allen Geweben und nahezu unabhängig vom physiologischen Zustand der
Zelle die Transkription des nachgeschalteten Gens vermittelt. Ein Beispiel für
einen konstitutiv aktiven Promotor ist der SV40- oder der Zytomegalie-Virus-
Promotor.
Unter einem gewebespezifischen Promotor versteht man einen Promotor, der die
Transkription des nachgeschalteten Gens nur in einem bestimmten Gewebe
vermittelt. Die Verwendung des gewebespezifischen Promotors erlaubt die
gewebespezifische Expression eines Proteins oder einer funktionellen RNA in IPE
oder in RPE Zellen. Ein Beispiel für einen solchen gewebespezifischen Promotor
ist der Transthyretin Promotor, der eine gute Aktivität in RPE und in IPE Zellen
hat.
Unter einem regulierbaren Promotor versteht man einen Promotor, der
beispielsweise in Abhängigkeit von der Stoffwechselsituation der Zelle, der
Konzentration eines Moleküls oder der Temperatur die Transkription eines Gens
vermittelt. Die Genexpression kann quantitativ und qualitativ durch die
Verwendung eines regulierbaren Promotors kontrolliert werden. Ein Beispiel für
einen regulierbaren Promotors ist ein Promotor, der durch Einschluss eines
Hypoxie-sensitiven Elements im Falle einer Hypoxie aktiviert wird (Boast K,
Binley K, Iqball S, Price T, Spearman H, Kingsman S, Kingsman A, Naylor S
(1999) Characterization of physiologically regulated vectors for the treatment of
ischemic disease. Hum Gene Ther 10: 2197-2208).
Es kann aber auch ein regulierbares Expressionssystem verwendet, das
beispielsweise bei Gabe eines Medikamentes induziert oder inaktiviert wird. Ein
Beispiel für ein solches System ist ein Tetrazyklin-abhängiges Genexpressions
system (Freundlieb S, Schirra-Muller C, Bujard H (1999) A tetracycline
controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer
into mammalian cells. J Gene Med 1: 4-12).
Nach der Transduktion der Pigmentepithelzelle mit einem adenoviralen Vektor
mit großer DNA Kapazität kann die Zelle therapeutische Proteine oder RNAs
produzieren. Ein therapeutisches Protein ist ein Protein, das eine therapeutische
Wirkung hervorruft. Analoges gilt für eine therapeutische RNA, beispielsweise
eine anti-sense RNA oder ein Ribozym. Beispiele für therapeutische Proteine sind
die neurotrophen Faktoren PEDF, GDNF, NGF, BDNF, CNTF, bFGF oder
Neurotrophin 3,4-5 (Friedman WJ, Black IB, Kaplan DR (1998) Distribution of
the neurotrophins brain-derived neurotrophic factor, neurotrophin-3, and
neurotrophin-4/5 in the postnatal rat brain: an immunocytochemical study.
Neuroscience 84: 101-114) sowie anti-angiogenetisch wirksamen Faktoren, wie
zum Beispiel der lösliche VEGF Rezeptor-1 (sflt-1), der dominant-negativen
VEGFR-2 (KDR), sowie wiederum PEDF, das neben seiner neurotrophen
Funktion auch anti-angiogenetische Wirkung hat (Dawson DW, Volpert OV,
Gillis P, Crawford SE, Xu H, Benedict W, Bouck NP (1999) Pigment epithelium
derived factor: a potent inhibitor of angiogenesis. Science 285: 245-248).
Weitere Beispiele für therapeutische Gene sind lysosomale Enzyme (Cingle KA,
Kalski RS, Bruner WE, O'Brien cm, Erhard P, Wyszynski RE (1996) Age-related
changes of glycosidases in human retinal pigment epithelium. Curr Eye Res 115:
433-438) alpha-Mannosidase, beta-galactosidase, N-acetyl-beta-glucosaminidase
und N-acetyl-beta-galactosaminidase sowie Lipase. Diese Enzyme spielen beim
Abbau von Sehzellmembranen eine wichtige Rolle und können bei der AMD
vermindert sein.
Noch weitere Beispiele sind Gene, die für antioxidative Enzyme
(Superoxiddismutase, Katalase, Peroxydasen) kodieren, da diese ebenfalls in der
Pathogenese von AMD eine Rolle spielen können. (Frank RN, Amin RH, Puklin
JE (1999) Antioxidant enzymes in the macular retinal pigment epithelium of eyes
with neovascular age-related macular degeneration, J Ophthalmol 127: 694-709).
Weitere Beispiele sind Gene für Genprodukte, die die Aderhautdurchblutung
steigern können, beispielsweise NO-Synthasen, da verminderte Aderhautdurch
blutung bei der Pathogenese von AMD eine Rolle spielen können. (Luksch A,
Polak K, Beier C, Polska E, Wolzt M, Dorner GT, Eichler HG, Schmetterer L
(2000) Effects of systemic NO synthase inhibition on choroidal and optic nerve
head blood flow in healthy subjects. Invest Ophthalmol Vis Sci 41: 3080-3084).
Ein weiterer Gegenstand vorliegenden Erfindung ist eine Pigmentepithelzelle in
einem festen Zellverband, einem sog. Zellsheet. Im Rahmen der experimentellen
Therapie der AMD wurden bisher immer nur Einzelzellsuspensionen von
autologen IPE Zellen transplantiert. Der Vorteil solcher Zellsheets besteht darin,
daß man die Zellen transplantationstechnisch deutlich besser plazieren kann und
daß das Wegwandern der Zellen vom Transplantationsort verhindert wird.
Pigmentepithelzellen in einem festen Zellverband sind dadurch gekennzeichnet,
daß der Zellverband aus mindestens ca. 100, bevorzugt ca. 1000, besonders
bevorzugt ca. 10 000 Pigmentepithelzellen besteht und diese nicht durch moderate
Scherkräfte, insbesondere durch wiederholtes, beispielsweise zehnmaliges, Auf-
und Abbewegen in einer Lösung mittels Pipette, nicht voneinander getrennt
werden können.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Kultivierungssystem
enthaltend mindestens eine Pigmentepithelzelle des Auges und einen "feeder
layer". Üblicherweise ist die Vermehrung von IPE- und RPE Zellen nach ihrer
Isolierung sehr langwierig. Durch das erfindungsgemäße Kultivierungssystem
lassen sich große Zahlen von IPE- und RPE Zellen in sehr kurzer Zeit
produzieren.
Unter einem "feeder layer" versteht der Fachmann Zellen, die mit anderen Zellen
(Zielzellen) kokultiviert werden und das Wachstum der Zielzellen positiv
beeinflussen. Unter einer positiven Beeinflussung kann beispielsweise ein
schnelleres Wachstum der Zellen oder die Verhinderung von Differenzierung oder
Dedifferenzierung verstanden werden. Dies geschieht beispielsweise dadurch, daß
von den Zellen des "feeder layer" Moleküle in das Medium abgesondert werden,
die dann das Wachstum der Zielzelle positiv beeinflussen.
In der Regel werden inaktivierte Fibroblasten als "feeder layer" zur Kultivierung
von embryonalen Stammzellen verwendet werden. Die Inaktivierung der
Fibroblasten kann beispielsweise durch Behandlung mit Mitomycin C oder durch
γ-Strahlenexposition erreicht werden. Es können beispielsweise Fibroblasten eines
Säugetiers, insbesondere der Maus oder des Menschen, verwendet werden. In
einer Ausführungsform werden die Fibroblasten und Pigmentepithelzellen der
gleichen Spezies, insbesondere des selben Individuums, verwendet. Bei den
Fibroblasten kann es sich aber auch um eine permanente Zellinie, beispielsweise
STO-Fibroblasten oder 3T3 Fibroblasten, oder um primäre embryonale
Fibroblasten handeln. Die Herstellung der Fibroblasten ist dem Fachmann bekannt
(z. B. Abbondanzo S, Gadi I, Stewart C (1993) Derivation of embryonic stem cell
lines. Methods in Enzymology 225: 803-823).
Das Kultivierungssystem könnte beispielsweise ein Kulturgefäß beinhalten, in
dem die Pigmentepithelzellen des Auges und der "feeder layer" in einem
geeigneten Medium ummittelbar aneinander angrenzend, insbesondere
übereinander kultiviert werden. Die unterschiedlichen Zellen aber auch in einem
Kulturgefäß räumlich voneinander getrennt kultiviert werden, so daß der
Austausch von beispielsweise Faktoren zur Wachstumsstimulation lediglich über
das Medium erfolgt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
Herstellung einer Pigmentepithelzelle des Auges, wobei die Zelle mit Hilfe eines
adenoviralen Vektors großer DNA-Kapazität genetisch modifiziert wird.
Unter einer genetischen Modifikation versteht der Fachmann jegliche Verän
derung der Erbinformation der Zellen. Dies kann beispielsweise durch ein- oder
mehrfache Nukleotidaddition, -insertion, -substitution und/oder -deletion erreicht
werden. In einer besonderen Ausführungsform wird die genetische Modifikation
durch Gentransfer herbeigeführt, wobei das Gen beispielsweise extrachromosomal
in der Zelle vorliegen kann.
Unter Gentransfer versteht man das Einbringen eines oder mehrerer Gene in
beispielsweise eine Zelle. In der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise
mindestens ein Gen mit Hilfe eines adenoviralen Vektors mit großer DNA-
Kapazität in eine Pigmentepithelzelle eingebracht werden. Üblicherweise werden
cDNAs verwendet. Es können jedoch auch die Gene selbst (einschließlich ihrer
Introns und Exons) verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann
aber auch ein genetisch modifiziertes, natürlich vorkommendes Gen oder
künstliche Nukleinsäuren in die Pigmentepithelzelle eingeführt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahrung zur
Herstellung einer Pigmentepithelzelle des Auges enthaltend einen adenoviralen
Vektors großer DNA-Kapazität, wobei die Zelle in Serum-freiem Medium, in
Gegenwart eines "feeder layer" und/oder in einem festen Zellverband kultiviert
wird.
Zur Isolierung von Pigmentepithelzelle in einem festen Zellverband wird die Iris
oder ein Teil der Iris oder die Retina, insbesondere im peripheren retinalen
Bereich, beispielsweise mechanisch oder enzymatisch, insbesondere mit
Accutase, Chondroitinase und/oder Heparinase, insbesondere vom Stroma und der
Basalmembran, getrennt. Das Zellsheet kann dann in Zellkultur weiter kultiviert
werden. Bei Bedarf können die Zellsheets durch erneute Accutaseinkubation in
Einzellzellen zerlegt werden.
In Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß ein
Zellkulturmedium, das kein Serum beispielsweise foetales Kälberserum enthält,
das Wachstum der Pigmentepithelzellen des Auges positiv beeinflußt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von
genetisch modifizierten Pigmentepithelzellen zur Therapie Augenerkrankungen,
wobei es sich sowohl um eine angeborene als auch um eine erworbene
Augenerkrankung handeln kann. Beispiele für erworbene oder angeborene
Augenerkrankungen sind die altersabhängige Makuladegeration, das Glaukom,
und die diabetische Retinopathie.
Die altersabhängige Makuladegeneration (AMD) ist der häufigste Grund für die
gesetzliche Erblindung in westlichen Ländern. Durch Atrophie des submakulären
retinalen Pigmentepithels und durch die Entwicklung choroidaler
Neovaskularisationen (CNV) kommt es sekundär zum Verlust der zentralen
Sehschärfe. Für die Mehrzahl der Patienten mit subfovealer CNV und
geographischer Atrophie ist derzeit keine Behandlung zur Vermeidung des
Verlustes der zentralen Sehschärfe verfügbar. Frühe Zeichen von AMD sind
Ablagerungen (Drusen) zwischen retinalem Pigmentepithel und Bruchs
Membran. Im Verlauf der Erkrankung kommt es zur Einsprossung von
Aderhautgefäßen in den subretinalen Raum der Makula. Dies führt zum Verlust
des zentralen Sehens und der Lesefähigkeit. Ein Beispiel für ein therapeutisches
Gen, das für die Therapie des AMD eingesetzt werden kann, ist das PEDF Gen.
Glaukom bezeichnet eine Gruppe von Krankheiten, bei denen der Druck im Auge
anomal ansteigt. Dies führt zu Einschränkungen des Gesichtsfeldes und zu einem
allgemeinen Nachlassen der Sehfähigkeit. Die häufigste Form ist das primäre
Glaukom; hier werden zwei Formen unterschieden: das chronische Weitwinkel-
Glaukom und die akute Winkelblockung. Das sekundäre Glaukom kann durch
Infektionen, Tumoren oder Verletzungen verursacht werden. Ein dritter Typ, das
angeborene Glaukom, geht in der Regel auf Entwicklungsstörungen während der
Schwangerschaft zurück. Die Kammerflüssigkeit im Augapfel steht unter einem
bestimmten Druck, der für die optischen Eigenschaften des Auges notwendig ist.
Dieser Augeninnendruck beträgt normalerweise 15 bis 20 Millimeter Quecksilber
säule und wird durch das Gleichgewicht zwischen Flüssigkeitsproduktion und
Flüssigkeitsabfluss gesteuert. Beim Glaukom ist der Abfluss der Kammerflüssig
keit im Winkel der vorderen Augenkammer blockiert, so dass der Druck im
Augeninneren ansteigt. Meist entwickelt sich das Glaukom im mittleren oder
fortgeschrittenen Alter, aber auch angeborene Formen sowie Erkrankungen bei
Kindern und Jugendlichen sind nicht selten. Obwohl der Augeninnendruck nur
mäßig erhöht ist und ansonsten keine Symptome zu erkennen sind, treten
schleichende Schäden auf, insbesondere eine Einschränkung des Gesichtsfeldes.
Die akute Winkelblockung dagegen verursacht Schmerzen, Rötungen, eine
Erweiterung der Pupillen und schwere Sehstörungen. Die Hornhaut trübt sich, und
der Augeninnendruck ist stark erhöht. Im weiteren Verlauf der Krankheit wird das
Gesichtsfeld immer enger, was sich mit dem Perimeter, einem augenärztlichen
Instrument, leicht nachweisen lässt. Das chronische Glaukom spricht im
Allgemeinen gut auf lokal verabreichte Medikamente an, die den
Flüssigkeitsabfluss verstärken. Zur Verminderung der Flüssigkeitsproduktion
werden manchmal systemische Wirkstoffe gegeben. Nicht immer jedoch ist die
medikamentöse Behandlung erfolgreich. Bei Versagen der medikamentösen
Therapie kommen Lasertherapie oder herkömmliche Operationen zum Einsatz,
um einen neuen Abfluss für die Kammerflüssigkeit zu schaffen. Das akute
Glaukom ist ein medizinischer Notfall. Wird der Augeninnendruck nicht
innerhalb von 24 Stunden gesenkt, treten dauerhafte Schäden ein.
Eine Reihen von Wachstums- oder neurotrophen Faktoren kann das Überleben
glaukomatöser Neurone verlängern. Dazu gehören NGF, BDNF, CNTF, bFGF
und Neurotrophin 3,4-5. In einer bevorzugten Ausführungsform könnten
genetisch modizifierte Pigmentepithelzellen zur Therapie eines Glaukoms
verwendet werden, die als therapeutisches Gen das Gen für NGF, BDNF, CNTF,
bFGF und/oder Neurotrophin 3,4-5 enthalten. Diese Faktoren könnten dann das
Überleben durch Aktivierung spezieller Stoffwechselwege regulieren. Viele dieser
Faktoren haben eine kurze Halbwertszeit. Die stabile Expression dieser Faktoren
ist folglich von erheblicher therapeutischer Bedeutung.
Die Diabethische Retinopathie entsteht bei Diabetes mellitus infolge einer
Glykosilierung von Proteinen eine Verdickung der Basalmembran der
Gefäßendothelien. Sie ist die Ursache für eine frühzeitige Gefäßsklerose und die
Bildung von Kapillaraneurysmen. Diese Gefäßveränderungen führen in Verlauf
von Jahren zur Diabetischen Retinopathie. Die Gefäßveränderungen rufen eine
Minderperfusion von Kapillargebieten hervor. Dies führt zu Lipoidablagerungen
(harte Exsudate) und zu einer Vasoproliferation. Der klinische Verlauf kann bei
Patienten mit Diabetes mellitus verschieden sein. Beim Altersdiabetes (Typ II
Diabetes) treten zunächst Kapillaraneurysmen auf. Danach erscheinen aufgrund
der verschlechterten Kapillarperfusion harte und weiche Exsudate und
fleckförmige Blutungen im Netzhautparenchym. In späteren Stadien der
Retinopathia diabetica sind die Verfettungen kranzförmig um die Makula
angeordnet (Retinitis circinata). In Verbindung mit diesen Veränderungen kommt
es häufig zu ein Ödem am hinteren Augenpol. Wenn das Ödem die Makula
einbezieht, ist das Sehvermögen akut hochgradig vermindert. Das Hauptproblem
beim Typ-1-Diabetes ist die Gefäßproliferation im Bereich des Augenhinter
grunds. Standardtherapie ist die Laserkoagulation der betroffenen Bereiche des
Augenhintergrundes. Zunächst wird die Laserkoagulation fokal in den betroffenen
Netzhautarealen durchgeführt. Bei Fortbestehen der Exsudate wird die
Laserkoagulation flächenhaft ausgedehnt. Die Netzhautmitte mit der Stelle des
schärfsten Sehens, also die Makula und das papillomakuläre Bündel, kann nicht
koaguliert werden, da es durch den Eingriff zur Zerstörung der für das Sehen
wichtigsten Netzhautteile käme. Sind bereits Proliferationen entstanden, müssen
oft die Herde an der Basis der Proliferationen sehr dicht gesetzt werden. Dabei
wird die Netzhaut flächenhaft zerstört. Es entsteht ein entsprechender
Gesichtsfeldausfall. Beim Typ-1-Diabetes ist die rechtzeitige Laserkoagulation
häufig die einzige Chance, die Patienten vor der Erblindung zu bewahren.
Ein Beispiel für eine genetisch bedingte Erkrankung des Pigmentepithels die
autosomal-rezessive schwere retinale Dystrophie mit Beginn in der Kindheit, die
durch Mutation in dem RPE65 Gen verursacht wird (Gu SM, Thompson DA,
Srikumari CR, Lorenz B, Finckh U, Nicoletti A, Murthy KR, Rathmann M,
Kumaramanickavel G, Denton MJ, Gal A (1997) Mutations in RPE65 cause
autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy. Nat Genet 17: 194-
197. Von dem Einbringen des RPE65 Gens mit Hilfe eines adenoviralen Vektors
mit großer DNA Kapazität ist eine Korrektur des pathologischen Phänotyps zu
erwarten.
Weiterhin war völlig überraschend, daß Pigmentepithelzellen des Auges auch in
das ZNS transplantiert werden können. Es konnte in Rahmen der vorliegenden
Erfindung gezeigt werden, daß Pigmentepithelzellen den Beobachtungszeitraum
von 5 Wochen überlebten. Die histologische Untersuchung ergab keinen
Anhaltspunkt für die Induktion einer Schädigung neuraler Zellen. Stattdessen
konnte beobachtet werden, daß die Pigmentepithelzelen intensive Kontakte mit
Neuronen bildeten.
Bisher wurden eine Reihe von verschiedene Zelltypen im Tierexperiment oder bei
Patienten mit Morbus Parkinson im Rahmen von klinischen Studien eingesetzt:
Beispiele sind fetale Zellen, gewonnen aus Gehirnen von menschlichen Feten. Fetale Zellen aus dem ventralen Mittelhirn oder domaminerge Neurone wurden bereits in klinischen Studien bei über 300 Patienten mit Morbus Parkinson transplantiert (zur Übersicht siehe Alexi T, Borlongan CV, Faull RL, Williams CE, Clark RG, Gluckman PD, Hughes PE (2000) Neuroprotective strategies for basal ganglia degeneration: Parkinson's and Huntington's diseases. Prog Neurobiol 60: 409-470). Eine Reihe von verschiedenen Zelltypen, darunter auch nicht neuronale Zellen z. B. Zellen aus der Niebennierenrinde, Sertolizellen aus den Keimdrüsen oder Glomuszellen aus den Carotiden, Fibroblasten oder Astrozyten wurden bei Patienten mit Morbus Parkinson oder Tiermodellen verwendet, mit dem Ziel Dopamin spontan oder nach Gentransfer (Alexi et al. 2000, supra) zu substituieren. Die Überlebensrate transplantierter fetaler dopaminerger Neurone liegt bei 5-8%, was bereits geringe Verbesserung der klinischen Symptome verursachte (Alexi et al. 2000, supra).
Beispiele sind fetale Zellen, gewonnen aus Gehirnen von menschlichen Feten. Fetale Zellen aus dem ventralen Mittelhirn oder domaminerge Neurone wurden bereits in klinischen Studien bei über 300 Patienten mit Morbus Parkinson transplantiert (zur Übersicht siehe Alexi T, Borlongan CV, Faull RL, Williams CE, Clark RG, Gluckman PD, Hughes PE (2000) Neuroprotective strategies for basal ganglia degeneration: Parkinson's and Huntington's diseases. Prog Neurobiol 60: 409-470). Eine Reihe von verschiedenen Zelltypen, darunter auch nicht neuronale Zellen z. B. Zellen aus der Niebennierenrinde, Sertolizellen aus den Keimdrüsen oder Glomuszellen aus den Carotiden, Fibroblasten oder Astrozyten wurden bei Patienten mit Morbus Parkinson oder Tiermodellen verwendet, mit dem Ziel Dopamin spontan oder nach Gentransfer (Alexi et al. 2000, supra) zu substituieren. Die Überlebensrate transplantierter fetaler dopaminerger Neurone liegt bei 5-8%, was bereits geringe Verbesserung der klinischen Symptome verursachte (Alexi et al. 2000, supra).
In den letzten Jahren wurden neuronale Stammzellen aus Gehirnen von adulten
Vertebraten isoliert, in-vitro expandiert und ins ZNS reimplantiert, worauf sie sich
in reife Neurone differenzierten. Ihre Funktion im ZNS bleibt aber ungewiß.
Neuronale Vorläuferzellen wurden auch für Gentransfer benutzt (Raymon HK,
Thode S, Zhou J, Friedman GC, Pardinas JR, Barrere C, Johnson RM, Sah DW
(1999) Immortalized human dorsal root ganglion cells differentiate into neurons
with nociceptive properties. J Neurosci 19: 5420-5428). Schwannsche Zellen, die
NGF und GDNF überexprimierten hatten Neuroprotektion in Parkinsonmodellen
(Wilby MJ, Sinclair SR, Muir EM, Zietlow R, Adcock KB, Horellou P, Rogers
JH, Dunnett SB, Fawcett JW (1999) A glial cell line-derived neurotrophic factor
secreting clone of the Schwann cell line SCTM41 enhances survival and fiber
outgrowth from embryonic nigral neurons grafted to the striatum and to the
lesioned substantia nigra. J Neurosci 19: 2301-2312).
Der Vorteil der Pigmentepithelzellen gegenüber den bisher verwendeten Zellen
besteht darin, daß sie insbesondere bei Verwendung körpereigener (autologe)
Zellen nicht vom Immunsystem abgestoßen werden und damit erwartungsgemäß
eine sehr hohe Überlebensrate haben. Außerdem ersetzten sie natürliches
Melaninpigment, welches in der Substantia nigra von Parkinson Patienten
verloren geht. Dieses Melanin kann freies Fe++ detoxifizieren und damit den
Krankheitsverlauf günstig beeinflussen.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung
von Pigmentepithelzellen zur Therapie von Nervenerkrankungen, insbesondere
einer Erkrankung des Nervensytems, bevorzugt des ZNS, vor allem von Morbus
Parkinson.
Ein Beispiel für eine häufige Erkrankung des ZNS ist der Morbus Parkinson, bei
der es sich um ein chronisch-degenerative Erkrankung des Gehirns handelt.
Ursache der Erkrankung ist die Degeneration von spezialisierten neuronalen
Zellen im Bereich der Basalganglien. Wegen des Untergangs dopaminerger
Neurone kommt es beim Patienten mit Morbus Parkinson zur verminderten
Synthese von Dopamin, einem wichtigen Neurotransmitter. Standardtherapie ist
die medikamentöse Therapie mit L-Dopa. L-Dopa wird in den Basalganglien zu
Dopamin metabolisiert und übernimmt dort die Funktion ders fehlenden
endogenen Neurotransmitters. Nach einigen Jahren verliert die L-Dopa Therapie
jedoch ihre Wirksamkeit.
Pigmentepithelzellen produzieren bereits spontanerweise einige Faktoren, die eine
neuroprotektive Wirkung haben. Beispiele für solche Faktoren sind, die
beispielsweise von IPE Zellen produziert werden sind "nerve growth factor"
(NGF), "ciliary neurotrophic factor" (CNTF), "basic fibroblast growth factor"
(bFGF) oder Faktoren mit angiogener Wirkung wie zum Beispiel "vascular
endothelial growth factor" (VEGF) oder "platelet derived growth factors A und B"
(PDGF A + B). Ein Beispiel für einen neurotrophen Faktor, der in den genetisch
modifizierten IPE Zellen nach Gentransfer produziert werden kann, ist der "glial
cell derived neurotrophic factor" (GDNF).
Außerdem kann die natürliche Schutzfunktion der Pigmentepithelzellen
ausgenutzt werden. Bei Morbus Parkinson könnten transplantierte IPE Zellen
durch die antioxidative Wirkung ihrer Melaningranula neuroprotektive Wirkung
entfalten. Dieses könnte durch die Fähigkeit des Melanins und seiner Vorstufen
verursacht werden, Fe2+ und andere toxische Substanzen (z. B. Ca2+) zu binden
und damit dem Zellzytoplasma zu entziehen (Hill HZ (1992) The function of
melanin or six blind people examine an elephant. Bioessays 14: 49-56) bzw. sehr
stark antioxidativ zu wirken. IPE Zellen haben einen hohen Melaningehalt und
fahren auch dann fort, Melanin zu bilden, wenn sie in der Netzhaut, dem
subretinalen Raum oder dem ZNS lokalisiert sind. Ein eindeutiger Hinweis hierfür
ist das Vorliegen von zahlreichen frühen Melanogenesestadien (Prämelano
somen), die durch elektronenmikroskopische Untersuchungen nachgewiesen
werden konnte. Melanin hat antioxidative Eigenschaften, schützt vor
Lipidperoxidation, kann direkt Sauerstoffradikale binden (Hill HZ (1992) The
function of melanin or six blind people examine an elephant. Bioessays 14: 49-56)
und kann die Bildung neuer Sauerstoffradikale durch Bindung von Metallkationen
verhindern (Memoli S, Napolitano A, d'Ischia M, Misuraca G, Palumbo A, Prota
G (1997) Diffusible melanin-related metabolites are potent inhibitors of lipid
peroxidation. Biochim Biophys Acta 1346: 61-68). Bringt man stark pigmentierte
Irispigmentepithelzellen in Gewebe mit hohem oxidativen Stress, zum Beispiel in
die Substantia nigra von Patienten mit Morbus Parkinson, oder in die Papille von
Glaukompatienten, oder in die Nähe der Makula von AMD Patienten, dann tritt
bereits durch die Anwesenheit des Melanins in den IPE Zellen neuroprotektive
Wikung ein.
Ein Beispiel für ein Protein mit gutem therapeutischen Potential für die Therapie
von Patienten mit Morbus Parkinson ist glial cell derived neurotrophic factor
(GDNF) ein Überlebensfaktor für dopaminerge Neurone. GDNF wirkt bereits in
picomolarer Konzentration auf Überlebenrate und Wachstum dopaminerger
Neurone aus embryonalem Hirn. Tierexperimentelle Untersuchungen haben
gezeigt, daß direkter Gentransfer in die Substantia nigra einer GDNF
Expressionskassette unter Verwendungen verschiedener Vektoren (adenovirale
Vektoren der ersten Generation, AAV Vektoren oder lentivirale Vektoren)
dopaminerge Neurone im 6-OHDA Rattenmodel schützen konnte (Mandel RJ,
Spratt SK, Snyder RO, Leff SE (1997) Midbrain injection of recombinant adeno
associated virus encoding rat glial cell line-derived neurotrophic factor protects
nigral neurons in a progressive 6-hydroxydopamine-induced degeneration model
of Parkinson's disease in rats. Proc Natl Acad Sci USA. 94: 14083-14088). In
einer bevorzugten Ausführungsform wird GDNF in autologen IPE Zellen nach
Transduktion mit einem adenoviralen Vektors großer DNA-Kapazität exprimiert.
Die derart genetisch modifizierten Zellen werden dann stereotaktisch an den
Wirkort, zum Beispiel in das Striatum, implantiert. In einer weiteren
Ausführungsform wird das für das therapeutische Protein kodierende Gen
reguliert exprimiert, zum Beispiel durch Verwendung eines zellspezifischen
Promotors. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das therapeutische Gen
regulierbar, zum Beispiel durch Verwendung eines Tetrazyklin regulierbaren
Systems exprimiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung werden Pigmentepithel
zellen an den gewünschten Ort im ZNS implantiert. Die Zellen können
beispielsweise durch Injektion, zum Beispiel im Rahmen einer stereotaktischen
Operation, an den gewünschten Wirkort gebracht. Hierdurch ist es möglich
spezifische therapeutische Moleküle vor Ort zu produzieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden autologe Pigment
epithelzellen verwendet. Die Verwendung von autologen Pigmentepithelzellen hat
folgende Vorteile gegenüber anderen Zelltypen: es kommt nicht zu Abstoßungs
reaktionen, da die verwendete Pigmentepithelzellen von Patienten selbst stammt;
es handelt sich entwicklungsgeschichtlich um neuroepitheliale Zellen, die mit den
Zellen des Gehirns histogenetisch verwandt sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung werden Pigmentepithel
zellen, insbesondere autologe IPE Zellen, die genetisch modifiziert sind, zur
Therapie von Erkrankungen des ZNS, wie zum Beispiel dem Morbus Parkinson
verwendet.
Die erfindungsgemäßen Pigmentepithelzellen können desweiteren in der
Transplantation verwendet werden. In einer Ausführungsform der Erfindung
können die erfindungsgemäßen Pigmentepithelzellen durch Transplantation in das
Auge ihre therapeutische Wirkung entfalten.
Die Pigmentepithelzellen können beispielsweise in die Aderhaut transplantiert
werden und dort durch Produktion Pigmentepithel-endogener Faktoren oder durch
Produktion von therapeutischen Molekülen nach genetischer Modifikation mit
einem adenoviralen Vektor großer DNA-Kapazität einen therapeutischen Effekt
ausüben.
Die Pigmentepithelzellen können aber auch im Bereich der Papille eingesetzt. Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, daß die Zellen nach
Injektion in den posterioren Teil des Glasköpers in den Papillenkopf einwandern
und sich dort im Gewebeverband integrieren. Dies eröffnet die Möglichkeit zur
Therapie von Erkrankungen, die sich beispielsweise im Papillenkopf mani
festieren.
Die Pigmentepithelzellen können auch in den Glaskörper, insbesondere durch
einen transskleralen Zugang in den posterioren Teil des Glaskörpers, injiziert
werden. Es konnte durch fundoskopische Beobachtung bei RCS Ratten gezeigt
werden, daß die IPE Zellen über einen Beobachtungszeitraum von 2 Monaten
vollständig auf der Papille wiedergefunden werden. Histologisch war erkennbar,
daß die IPE Zellen in den Papillenkopf eingewandert waren und dort intensiven
Kontakt zu den Blutgefäßen und Axonen bildeten. Ultrastrukturell zeigt sich
keinerlei Schädigung neuronaler Zellen oder Proliferation von IPE Zellen im
Glaskörper. Diese Ausführungsform der Erfindung ermöglicht beispielsweise
einen direkten Zugang zum Papillenkopf und mit oder ohne genetische
Modifikation neuroprotektive Mediatoren in oder in unmittelbarer Nähe der
Papille freisetzen oder aktivieren.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die
Verwendung von adenoviralen Vektoren großer DNA-Kapazität zur genetischen
Modifikation von Pigmentepithelzellen in vivo. Wie in den Beispielen gezeigt,
führt die in vivo Transduktion von RPE Zellen durch subretinale Injektion mit
einem adenoviralen Vektor großer DNA-Kapazität zu einer überraschend stabilen
Expression von mindestens 6 Monaten.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Arzneimittel oder
Diagnostikum enthaltend eine erfindungsgemäße Pigmentepithelzelle sowie
geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe. Geeignete Hilfs- und Zusatzstoffe, die
beispielsweise der Stabilisierung oder Konservierung des Arzneimittels oder
Diagnostikums dienen, sind dem Fachmann allgemein bekannt (siehe z. B. Sucker
H et al. (1991) Pharmazeutische Technologie, 2. Auflage, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart). Beispiele für solche Hilfs- und/oder Zusatzstoffe sind physiologische
Kochsalzlösungen, Ringer-Dextrose, Dextrose, Ringer-Laktat, entmineralisiertes
Wasser, Stabilisatoren, Antioxidantien, Komplexbildner, antimikrobielle
Verbindungen, Proteinaseinhibitoren und/oder inerte Gase.
Die folgende Figur und die Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne
sie darauf zu beschränken.
Fig. 1 Schematisierter Querschnitt durch das rechte Auge.
Das Irispigmentepithel befindet sich auf der Seite der Iris, die der Linse
zugewandt ist. Die Makula ist der Bereich (ca. 6 mm Durchmesser), der die Fovea
unmittelbar umgibt.
Zur Isolierung der IPE-Zellen in Zellverbänden (Zellsheets) wurden Iridektomien
frisch aus dem Operationssaal nach einer Trabekulektomie oder einer basalen
Iridektomie abgeholt, in F12 Medium ((HAM) mit L-Glutamin, Gibco, Life
Technologies, Paisely Scotland) gebracht und direkt weiterverarbeitet. Basale
Iridektomien von Glaukompatienten oder Irisstücke von Ratten oder Schweinen
wurden mit Accutase (Cat. No. L11-007, PAA Laboratories) in Dulbeccco's PBS
mit 0,5 mmol/l EDTA × Na für 15-20 min behandelt. Das Gewebe, welches mit
einer Iridektomie gewonnen werden kann, hat eine Fläche von ca. 3,5 mm2 und
enthält ca. 20 000 IPE Zellen. Die Zellagen werden sehr behutsam mit F12
Medium auf und nieder pipettiert und auf Polystyrene ausplattiert. Es konnten die
IPE Zellen vollständig als doppelte Zellage mit intakter Basalmembran unter der
Stereolupe vom Stroma gelöst werden, was durch elektronenmikroskopische
Untersuchung nachgewiesen werden konnte. Durch Inkubation mit 0.1 U/ml
Chondroitinase ABC (Sigma) und 2.4 U/ml Heparinase (Sigma) in PBS bei pH
7.4 für 2 Stunden bei 37 Grad Celsius konnte diese Basalmembran vollständig
entfernt werden. Anschließend konnten die Zellsheets durch erneute 5 minütige
Accutaseinkubation in Einzellzellen zerlegt werden.
Zur Isolierung der RPE-Zellen in Zellverbänden (Zellsheets) wurden in
menschlichen Augen in der Peripherie nach lokaler Retinotomie autologe RPE
Zellsheets und Einzelzellen mechanisch losgelöst und mit einer Kanüle abgesaugt.
Lokal konnten 50 000 periphere RPE Zellen entnommen werden ohne dass die
Patienten später über unangenehme gravierende Gesichtfeldausfälle klagen. Die
Entnahme von je 50 000 RPE Zellen konnte an mehreren peripheren Stellen des
Auges erfolgen.
IPE oder RPE Zellen, die aus Iridektomien oder Augen von Organspendern
gewonnen wurden, wurden auf Fibroblasten (3T3 Fibroblastenzelllinie der Maus),
die als "feeder layer" dienen, in F12 Medium kultiviert. Die Zellen werden
innerhalb von einem Tag auf den Fibroblasten adhärent und beginnen zu
proliferieren. Die Zahl der Zellen verdrei- bis vervierfachte sich auf den
Fibroblasten innerhalb von 3 Tagen. Die Fibroblasten wurden zuvor mit 40 µg/ml
Mitomycin C behandelt, so dass sie nach spätestens 10 Tagen absterben. Nach
diesem Zeitpunkt erhält man eine Reinkultur an Pigmentepithelzellen.
IPE Zellen wurden als Einzellzellsuspension wie unter 1 beschrieben isoliert. Ein
Tiermodell Dir die altersabhängige Makuladegeneration und für die retinale
Degeneration, die durch einen spezifischen Phagozytosedefekt und Degeneration
des RPE bedingt ist, ist die Royal College of Surgeons Rat (RCS Ratte).
Dystrophen RCS Ratten (18 Tage alt) wurden in Ketanest/Nembutal Narkose die
obere Bindehaut durch einen 4 mm langen Schnitt 4 mm hinter dem Limbus
eröffnet. Dabei wurde die limbusnahe Bindehaut mit einer Kolibripinzette
festgehalten.
Bei der subretinalen Injektion wurden mit einer 26 Gauge Kanüle Sklera,
Aderhaut und retinales Pigmentepithel in Höhe des Äquators bis auf den
Glaskörper durchstochen. Eine Hamiltonspritze mit stumpfer 32 Gauge Kanüle
wurde 2-3 mm tangential zwischen Retina und RPE nach anterior eingeführt. Es
wurden 60 000 IPE Zellen in 0.5 µl Zellkulturmedium (F12 (HAM) mit L-
Glutamin, Gibco, Life Technologies, Paisely Scotland) injiziert. Nach Ablauf der
Beobachtungszeit von 6 und 8 Monaten wurden die RCS Ratten getötet. Die
Augen wurden enukleiert. Die Hornhäute wurden entfernt und die verbleibenden
Teile der Augen wurden in 3% Glutaraldehyd fixiert. Areale mit transplantierten
Iriszellen konnten leicht an der Pigmentierung erkannt werden, wurden
herausgeschnitten und für elektronenmikroskopischen Untersuchungen nach Rou
tineprotokoll eingebettet. Ultrastrukturell waren überlebende, d. h. morphologisch
intakte IPE Zellen im subretinalen Raum bis zu 8 Monaten nach Transplantation
nachweisbar. Überlebende Photorezeptoren mit Innensegmenten aber ohne
Außensegmente waren bis zu 6 Monaten nach subretinaler Transplantation
vorhanden.
Bei der Injektion in den Glaskörper erfolgte die Injektion an gleicher Stelle wie
subretinal in 6 Augen. Allerdings wurde die Kanüle wie eine Kreisbogensekante
1-2 mm tief in den Glaskörper eingeführt. Die Injektion von 60 000 IPE Zellen
erfolgte in der Nähe der Papille. Im Beobachtungszeitraum von 2 Monaten blieb
der Glaskörper und die Linse klar. Die IPE Zellen versammelten sich in allen 6
Augen makroskopisch oder funduskopisch sichtbar auf der Papille. Die Histologie
zeigte, dass die IPE Zellen in den Papillenkopf einwanderten. Die Zellen waren
stark pigmentiert und es gab keine Anzeichen von Zellschädigung oder
Proliferation.
Bei der Injektion in die Aderhaut wurde der gleiche Injektionsort wie subretinal
gewählt. Die Sklera wurde mit einem spitzen Skalpell durch einen 1 mm langen
Schnitt durchtrennt bis die Aderhaut sichtbar wurde. Die Kanüle wurde senkrecht
zum Augapfel auf die Schnittstelle gestellt und 60 000 IPE Zellen in 0.5 µl F12
Medium wurden in die Aderhaut injiziert. In die Aderhaut transplantierte IPE
Zellen führten in 15 Augen verglichen mit 6 unbehandelten Augen zu einem
Überleben von Photorezeptoren bis zu 6 Monaten. Sowohl die Anzahl der
überlebenden Photorezeptoren/mm Retina (p = 0.020) als auch die maximale
Kernhöhe (p = 0.019) waren im Mann-Whitney-Test signifikant unterschiedlich
gegenüber den unbehandelten Augen (Tabelle 1).
Bei der stereotaktische Implantationsmethode wurden Wistar Ratten durch 1 ml/
100 g Körpergewicht Avertin (2 g Tribromethanol 3,3,3(trocken), 1 g Pentanol
(flüssig), 8 ml 100%iger Ethanol und 90 ml Nacl 0,9%) in Form einer
intraperitonealen Injektion narkotisiert. Der Schädel wurde präzise reproduzierbar
an drei Knochenpunkten, den äußeren Gehörgängen und der Maxilla fixiert, so
daß das Calvarium in Höhe des Bregmas waagerecht stand. Nach der medialen
fronto-okzipitalen, 1,5 cm langen Hautinzision, wurde das Periost abgeschoben,
um freie Sicht auf die Suturen der Schädelkalotte zu haben, die als Bezugspunkt
für die stereotaktischen Koordinaten dienten. Die Koordinaten wurden anhand des
Atlas von Praxinos und Watson (Praxinos G, Watson C. The rat brain in
stereotactic coordinates. 1986; 2 end Dr., Academic Press, Sydney) ermittelt:
Die Punktionsstelle war vom Bregma 1,5 mm nach frontal und 2 mm nach rechts parietal. 4,5 mm in der Tiefe liegt der obere Anteil des Striatums. Das Bohrloch mit einem Durchmesser von etwa 0.5 mm wurde an der entsprechenden Position mit einem Präzisions-Wellenbohrer (Proxxon, Minimot 40IE) unter Vermeidung einer Duraläsion angebracht. 5-10 µl der Zellsuspension wurden mit einer 25 µl N-702-N Hamilton-Spritze mit fixierter Nadel durch dieses Bohrloch in einer Injektionstiefe von 5 mm, ab der Duraoberfläche gemessen, eingebracht. Es wurden 60 000 IPE Zellen von Long Evans Ratten in die Striata von je 4 Wistar Ratten injiziert. Bevor die Nadel herausgezogen wurde, wartete man 2 min, damit die Zellsuspension im Gewebe abdiffundieren und der lokal entstandene Druck abgebaut werden konnte. Anderenfalls war zu befürchten, daß Zellen der zurückgezogenen Nadel in den Punktionskanal oder in die darüber liegenden Gewebeabschnitte folgen hätten können. Aus dem gleichen Grunde wartete man, nachdem man die Nadel 4 mm zurückgezogen hatte, nochmals 30 sec. bevor sie ganz entfernt wurde. Anschließend wurde eine Hautnaht angefertigt.
Die Punktionsstelle war vom Bregma 1,5 mm nach frontal und 2 mm nach rechts parietal. 4,5 mm in der Tiefe liegt der obere Anteil des Striatums. Das Bohrloch mit einem Durchmesser von etwa 0.5 mm wurde an der entsprechenden Position mit einem Präzisions-Wellenbohrer (Proxxon, Minimot 40IE) unter Vermeidung einer Duraläsion angebracht. 5-10 µl der Zellsuspension wurden mit einer 25 µl N-702-N Hamilton-Spritze mit fixierter Nadel durch dieses Bohrloch in einer Injektionstiefe von 5 mm, ab der Duraoberfläche gemessen, eingebracht. Es wurden 60 000 IPE Zellen von Long Evans Ratten in die Striata von je 4 Wistar Ratten injiziert. Bevor die Nadel herausgezogen wurde, wartete man 2 min, damit die Zellsuspension im Gewebe abdiffundieren und der lokal entstandene Druck abgebaut werden konnte. Anderenfalls war zu befürchten, daß Zellen der zurückgezogenen Nadel in den Punktionskanal oder in die darüber liegenden Gewebeabschnitte folgen hätten können. Aus dem gleichen Grunde wartete man, nachdem man die Nadel 4 mm zurückgezogen hatte, nochmals 30 sec. bevor sie ganz entfernt wurde. Anschließend wurde eine Hautnaht angefertigt.
Nach 5 Wochen wurden die Gehirne mit 3% Glutaraldehyd in Cacodylatpuffer
perfusionsfixiert. Pigmentierte Areale aus den Striatum wurden herausgeschnitten
und für die Elektronenmikroskopie eingebettet.
Makroskopisch konnten die transplantierten Areale leicht durch die
Pigmentierung erkannt werden. Unter dem Elektronenmikroskop hatten die IPE
Zellen intakte Mitochondrien und Plasmamembranen. Sie waren stark
pigmentiert, enthielten Melanogenesestadien und bildeten Kontaktzonen mit
Neuronen. Die IPE Zellen wurden stets einzeln ohne Kontakte zu anderen IPE
Zellen angetroffen. Sie wurden auch 3-4 mm vom Stichkanal entfernt angetroffen,
was eine aktive Wanderung der Zellen vermuten läßt. Die Neurone, die an die IPE
Zellen angrenzten, waren morphologisch intakt. Immunkompetente Zellen
(Makrophagen, Lymphozyten) wurden nicht beobachtet.
Vereinzelte und adhärente Ratten- bzw. menschliche IPE-Zellen wurden in vitro
mit 20, 50 und 100 MOI (multiplicity of infection) des adenoviralen Vektors mit
grosser DNA Kapazität HC-Adenovirus "HC-AdFK7", der das EGFP (enhanced
green fluorescent protein) unter der Kontrolle des humanen CMV
(cytomegalovirus)-Promotors als Transgen trägt, transduziert. Dazu wurden 80%
konfluente Zellkulturen in F12 komplettem Medium mit der entsprechend
verdünnten Virusstammlösung über 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Medium
wurde am nächsten Morgen gewechselt. Die Expression des Transgens wurde 24,
48, 72 Stunden und dann jede weitere Woche unter einem Fluoreszenzmikroskop
mit FITC-Filter als grüne Fluoreszenz innerhalb der Zellen überprüft.
Schon 24 Stunden nach der Transduktion war eine zarte Fluoreszenz sichtbar, die
sich in den nächsten Tagen deutlich verstärkte. Die menschlichen IPE Zellen
waren bei 100 MOI zu 100% transduziert, die Rattenzellen bei 20 MOI zu 80%
und bei 50 und 100 MOI zu 100% transduziert. Eine Expression war bis zu einer
Zeitspanne von 8 Wochen und länger in vitro nachweisbar.
In einem weiteren Experiment wurde der adenovirale Vektor großer DNA
Kapazität AdhCMV.PEDF konstruiert. Dieser Vektor exprimiert die menschliche
PEDF cDNA unter der Kontrolle des humanen CMV Promotors. Zusätzlich ist
das PEDF Protein durch ein Poly-Histidin Epitop, das als Fusionsprotein mit dem
PEDF exprimiert wird, markiert. Dieser Vektor wurde nach einem
Standardverfahren (Schiedner G, Morral N, Parks RJ, Wu Y, Koopmans SC,
Langston C, Graham FL, Beaudet AL, Kochanek S (1998) Genomic DNA transfer
with a high capacity adenovirus vector results in improved in vivo gene
expression and decreased toxicity. Nature Genetics 18: 180-183) in Cre-
Rekombinase exprimierenden 293 Zellen produziert und durch CsCl
Dichtegradienten Zentrifugation aufgereinigt.
Cytokeratin-positive humane IPE Zellen der 2. Passage wurden mit dem HC-
Ad.CMV.PEDF Vektor transduziert. Dazu wurden 80% konfluente Zellkulturen
in F12 komplettem Medium mit der entsprechend verdünnten Virusstammlösung
über 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Medium wurde am nächsten Morgen
gewechselt. Die Expression des Transgens und die Sekretion des PEDF in den
Kulturüberstand wurde nach 72 Stunden mit Hilfe spezifischer anti-Polyhistidin-
Antikörper im ELISA überprüft. Die Kulturüberstände enthielten 150 ng
PEDF/ml. Dies entspricht einer Produktion von 60 pg PEDF pro 1000 Zellen/72
Stunden. Durch Verwendung eines weiteren Antikörpers, der spezifisch das
menschliche PEDF Protein erkennt, konnte in einem weiteren ELISA
nachgewiesen werden, dass menschliche IPE Zellen im Gegensatz zu
menschlichen RPE Zellen spontanerweise kein PEDF produzieren.
Neben Einzelzellen konnten auch Zellsheets transfiziert werden. Nach enzyma
tischer Entfernung der Basalmembranen waren IPE Zellsheets transfizierbar. Mit
intakter Basalmembran waren die Zellsheets nicht transfizierbar, was mit PCR
nachgewiesen wurde.
Zur Transfektion von Zellsheets wurden Schweineaugen aus dem Schlachthof
direkt nach der Schlachtung der Tiere in das Labor gebracht und weiterverarbeitet.
Der Vorderabschnitt wurde ca. 2 mm hinter dem Limbus zirkulär abgetrennt. Von
posterior wurde dann die Iris stumpf abpräpariert und für 15 min bei 37°C in 1 ml
Accutase inkubiert. Mit einer im Feuer gebogenen Glaspipette wird dann das IPE
vom Stroma der Iris gelöst. Eine Schätzung der Fläche der einzelnen erhaltenen
IPE Zellsheets ergab zwischen 40 000 und 70 000 IPE Zellen pro Zellsheet.
Die IPE sheets wurden mit 200 MOI des EGFP-exprimierenden adenoviralen
Vektors HC-AdFK7 über 24 h inkubiert. Nach 24 Stunden wurde das Medium
gewechselt. Die IPE sheets wurden in F12 kompl. Medium für 6 Tage
zwischenkultiviert und auf EGFP Fluoreszenz hin untersucht, diese konnte jedoch
aufgrund der Morphologie der Zellen mit sehr dicht konzentrierten
Melaningranula nicht sicher dargestellt werden. Daraufhin wurde mittels des
QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen) aus den Zellen DNA gewonnen. Die Angaben
des Herstellers wurden befolgt. Mit den Primern prod1, der im Bereich des CMV
Promotors und prod2, der im Bereich der Sequenz des EGFP an die DNA des HC-
AdFK7 bindet, wurde mittels PCR das Transgen nachgewiesen. Prod1 und prod2
produzierten bei erfolgreich transduzierten Zellen ein PCR-Produkt von ca. 700
Basenpaaren Länge. Als Positivkontrolle diente ein Plasmid pFK7 mit dem
gleichen insert wie es in HCAdFK7 zu finden ist.
Mit dem HC-AdFK7 Vektor transduzierte IPE Zellen von Long Evans Ratten
(albinotisch) wurden subretinal in 8 Augen von 8 Wistar Ratten transplantiert,
nach der gleichen Methode wie für nicht transfizierte IPE Zellen beschrieben.
Vier Augen, in die IPE Zellen transplantiert worden waren, wurden nach 2
Monaten enukleiert, in Tissue Freezing Medium (Jung, Heidelberg, Germany)
eingeschlossen und bei -80 C eingefroren. Kryostatschnitte (7 µm) wurden nach
dem Auftauen in Kaisers Glyceringelantine (Merck, Darmstadt, Germany)
eingeschlossen und in einem Zeiss Axiophot Lichtmikroskop bei einer
Anregungswellenlänge von 400-440 nm und einer Emissionswellenlänge von 470 nm
mikroskopiert. Die subretinal transplantierten IPE Zellen zeigten eine
deutliche Expression grün fluoreszierender Proteine.
Zur Auswertung mit dem Scanning Laser Ophtalmoscope (SLO) wurden die
übrigen 4 transfizierten Ratten nach 14 Tagen bzw. 4 Monaten nach der Transfek
tion untersucht. Die Tiere wurden mit Ketanest narkotisiert und mit dem Scanning
Laser Ophthalmoscope (Rodenstock, München) ausgewertet. Dabei wurde im
Fluo-Modus mit dem Infrarotlaser (780 nm) und dem Argongrün- (514 nm) bzw.
Argonblaulaser (488 nm) die Netzhaut der Ratten in Mydriasis gescannt. Das
Gerät benutzt in diesem Modus einen zur Fluoreszenzbeobachtung des EGFP
geeignetes Fluoreszeinsperrfilter. Die Bilder wurden auf S-VHS Video
aufgenommen. Die analogen Videobilder wurden auf DV digital umkopiert, von
repräsentativen Ausschnitten Bitmaps erstellt und mittels der Software Optimas
6.1 nach Fläche und Intensität ausgewertet.
Innerhalb des Beobachtungszeitraumes von 4 Monaten blieb die Intensität der
durch die transfizierten IPE Zellen verursachten Fluoreszenz sowie die
Flächenausdehnung der transplantierten Areale im Fundus in allen 4 Augen
konstant, d. h. die Expression der transfizierten Gene auf Proteinebene blieb
unverändert.
Zur subretinalen Injektion von freiem Vektor in vivo wurden verschiedene
Konzentrationen eines HC-Adenovirus "HC-AdFK7", der das EGFP (enhanced
green fluorescent protein) Gen unter der Kontrolle eines CMV (cytomegalovirus)-
Promotors als Transgen trägt, in Wistar Ratten subretinal injiziert. Die Expression
des Transgens wurde mit dem Scanning Laser Ophthalmoscope (Rodenstock,
München) ausgewertet. Dabei wurde im Fluo-Modus mit dem Infrarotlaser (780 nm)
und dem Argongrün- (514 nm) bzw. Argonblaulaser (488 nm) die Netzhaut
der Ratten in Mydriasis gescannt. Das Gerät benutzt in diesem Modus einen zur
Fluoreszenzbeobachtung des EGFP geeignetes Fluoreszeinsperrfilter. Die Bilder
wurden auf S-VHS Video aufgenommen. Die analogen Videobilder wurden auf
DV digital umkopiert, von repräsentativen Ausschnitten Bitmaps erstellt und
mittels der Software Optimas 6.1 nach Fläche und Intensität ausgewertet.
Innerhalb des Beobachtungszeitraumes von 6 Monaten blieb die Intensität der
durch die transfizierten IPE Zellen verursachten Fluoreszenz sowie die
Flächenausdehnung der transplantierten Areale im Fundus in allen 4 Augen
konstant, d. h. die Expression der transfizierten Gene auf Proteinebene blieb
unverändert. Nach 6 Monaten wurden die Tiere getötet, die Augen in 3%
Glutaraldehyd fixiert. Die Vorderabschnitte der Augen wurden entfernt und die
verbleibenden hinteren Augenbecher wurden viergeteilt. Nachdem die Netzhäute
entfernt wurden, wurden die Sklera, Aderhaut mit Pigmentepithel unter dem
Fluoreszensmikroskop (Axiovert Zeiss, Oberkochen, Germany) mit dem
Anregungsfilter 450-490 nm und Emissionsfilter 520 nm (AF Analysentechnik,
Tübingen, Germany) untersucht. Dabei zeigte sich die typisch hexagonale Form
transduzierter und EGFP positiver Pigmentepithelzellen.
Zur Transplantation genetisch modifizierter Zellen in das ZNS wurden mit dem
HC-AdFK7 Vektor transduzierte und EGFP-exprimierende IPE Zellen (60 000)
aus Long Evans Ratten stereotaktisch wie oben beschrieben in das Striatum von je
4 Wistar Ratten injiziert.
Nach 8 Wochen wurden die Tiere durch Genickbuch in CO2 Narkose getötet. Die
Gehirne wurden herauspräpariert. Pigmentierte Areale mit transplantierten Zellen
wurden aus dem Striatum herausgeschnitten und in Tissue Freezing Medium
(Jung, Heidelber, Germany) eingefroren. Die Fluoreszenz, verursacht durch die
Expression von EGFP der IPE Zellen, war in Gefrierschnitten 8 Wochen nach der
Transplantation in pigmentierten Zellen nachweisbar.
IPE Zellen wurden mit dem adenoviralem Vektor großer DNA Kapazität HC-
AdFK7, der das EGFP (enhanced green fluorescent protein) Gen unter der
Kontrolle eines CMV (Zytomegalovirus)-Promotors als Reportergen trägt, und
gleichzeitig mit dem PEDF exprimierendem adenoviralem Vektor großer DNA-
Kapazität HC-AdCMV.PEDF in vitro cotransfiziert und nach 6 Tagen in den
subretinalen Raum von Long Evans Ratten (60 000 Zellen/Auge) transplantiert (1.
Versuchsgruppe). Die PEDF Expressionskassette im adenoviralen Vektor großer
DNA Kapazität enthielt zusätzlich zur PEDF kodierenden Sequenz ein Poly-HIS-
Epitop zum Nachweis des Proteins mittels eines Anti-HIS-Antikörpers. Eine
Woche nach Injektion wurden die Ratten narkotisiert, die Pupillen wurden
dilatiert und die Ratten erhielten 3-4 Laserverbrennungen um den Nervus Opticus
mit einem blaugrünen Argon-Laser (Coherent, Inc., Santa Clara, CA, USA). Die
Energie des Lasers betrug 90 mW für 100 ms und der Strahldurchmesser war 100 µm.
Eine zweite Gruppe von Ratten erhielt nur Laserverbrennungen ohne
genetische Modifikation durch Zelltransplantation oder freie Vektoren. Nach 16
Tagen wurden die Ratten narkotisiert und erhielten 0,5 ml Liquemin i. p. (Roche,
Grenzach-Wyhlen, Deutschland). Die Aorta ascendens wurde kanuliert und nach
Eröffnung des rechten Vorhofes wurde das Blut mit 50 ml laktierter Ringerlösung
(Stereofundin, Braun, Melsungen, Deutschland) ausgewaschen. Anschließend
wurden 20 ml Ringerlösung mit 5 mg/ml FITC-Dextran (Sigma Deisenhofen,
Deutschland) perfundiert. Die Augen wurden enukleiert, in Höhe des Limbus mit
einem Scalpel angestochen und über Nacht in 4% Paraformaldehyd fixiert. Am
nächsten Tag wurde der Vorderabschnitt der Augen bis kurz hinter die Ora serrata
durch einen umlaufenden Schnitt abgetrennt. Durch 4 radiale Schnitte wurde der
verbleibende Augenbecher in Quadranten geteilt und die Netzhäute wurden
entfernt. Quadranten, bestehend aus Pigmentepithel, Chorioidea und Sklera, die
Lasernarben enthielten, wurden 4 × 10 min in Tris-Puffer (TBS) und dann 10 min
in 0,5 M NH4CL (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) und 0,25% Triton (Serva,
Heidelberg, Deutschland) inkubiert. Nach zwei weiteren Spülungen wurden die
Präparate mit 5% BSA (Albumin, Bovine Fraktion Sigma, Deisenhofen,
Deutschland) inkubiert. Ein Teil der Präparate wurde mit Antikörpern gegen
Histidin (Anti-His-Antibody, Qiagen, Hilden, Deutschland) inkubiert, um die
Histidinreste im PEDF zu detektieren. Die primären Antikörper wurden mit anti-
Maus IgG gekoppelt an den Fluoreszensfarbstoff Cy3 (Rockland, Gilbertsville,
PA, USA) sichtbar gemacht.
Ein anderer Teil der Präparate wurde mit anti-Maus CD 31 aus der Ratte
(PECAM-1, Pharmingen, San Jose, CA, USA) behandelt, um die Endothelzellen
sichtbar zu machen. Es folgte eine 2. Inkubation mit anti-Ratte IgG-Biotin
(Amersham, Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg, Deutschland) mit
anschließender Lokalisation des Biotins durch Fluorolink Cy3 (Amersham Life
Sciences, Braunschweig, Deutschland). In einigen Aderhautpräparaten erfolgte
eine Doppelmarkierung von PEDF und Endothelzellen. In diesen Fällen wurde
PEDF Expression mit Cy3, wie beschrieben, und der PECAM-Biotin-Komplex
mit Streptavidin-Alexa Fluor 350 (MoBiTec, Göttingen, Deutschland) sichtbar
gemacht.
Die "Flatmount-Präparate" wurden unter dem Fluoreszenzmikroskop (Axiophot,
Zeiss, Oberkochem, Deutschland) ausgewertet.
In Gruppe 1 war in 16 von 19 Lasernarben weder ein Austritt von FITC-Dextran
noch ein vermehrtes Auftreten von CD 31 positiven Zellen zu beobachten, wenn
PEDF exprimierende IPE Zellen im Abstand von 100-1000 µm von der Narbe
anwesend waren. Die Expression von PEDF durch die transplantierten IPE Zellen
wurde mit anti-His Antikörpern nachgewiesen.
In der Kontrollgruppe 2 (nur Laserverbrennung) war in 9 von 12 Lasernarben
Neovaskularisation vorhanden. Dies wurde erkannt am Austritt von Dextran-FITC
in und um den Narbenbereich als auch durch das Vorhandensein von abgeflachten
CD 31 positiven Endothelzellen in und um den Narbenbereich.
Damit wurde mit einer funktionellen (Dextran-Leakage) und einer immunologi
schen Methode (direkter Nachweis der neugebildeten Endothelzellen mit
Antikörpern) die Neovaskularisation im gleichen Auge nachgewiesen. Diese
"Flatmountpräparate" erlauben die Beurteilung der gesamten Aderhaut. Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Neovaskularisation durch Transplantation von IPE
Zellen, die PEDF von einem adenoviralen Vektor großer DNA Kapazität
exprimieren, inhibiert wird.
Claims (17)
1. Pigmentepithelzelle des Auges, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle
Vektor-DNA eines adenoviralen Vektors mit großer DNA-Kapazität enthält.
2. Pigmentepithelzelle des Auges nach Anspruch 1, wobei es sich um eine
retinale Pigmentepithelzelle oder um eine Irispigmentepithelzelle handelt.
3. Pigmentepithelzelle des Auges nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Vektor-
DNA mindestens eine therapeutische Nukleinsäure, insbesondere ein
therapeutisches Gen, bevorzugt für einen neurotrophen Faktor wie GDNF,
PEDF, NGF, BDNF, CNTF, bFGF oder Neurotrophin 3,4-5, einen anti
angiogenetischen Faktor wie einen löslichen VEGF-Rezeptor-1 (sflt-1), einen
dominant-negativen VEGF-Rezeptor-2 (KDR) oder PEDF, einen anti
oxidativen Faktor wie Superoxiddismutase, Katalase oder verschiedene
Peroxydasen, einen lysosomalen Faktor wie alpha-Mannosidase, beta
galactosidase, N-acetyl-beta-glucosaminidase, N-acetyl-beta-galactosamini
dase sowie Lipase, oder einen gefäßerweiternden Faktor wie NO-Synthase,
enthält.
4. Pigmentepithelzelle des Auges nach mindestens einem der Ansprüche 1-3,
wobei die Vektor-DNA einen konstitutiv aktiven, regulierbaren und/oder
einen gewebespezifischen Promotor und/oder ein regulierbares Expressions
system enthält.
5. Pigmentepithelzelle des Auges nach mindestens einem der Ansprüche 1-4,
wobei die Zelle mindestens ein therapeutisches Protein und/oder eine
therapeutische RNA produziert.
6. Pigmentepithelzelle des Auges nach mindestens einem der Ansprüche 1-5,
wobei die Zelle in einem festen Zellverband ist und/oder in Gegenwart eines
"feeder layer" und/oder in Serum-freiem Medium kultiviert worden ist.
7. Pigmentepithelzelle des Auges in Form eines festen Zellverbands.
8. Kultivierungssystem enthaltend mindestens eine Pigmentepithelzelle des
Auges und einen "feeder layer".
9. Verfahren zur Herstellung einer Pigmentepithelzelle des Auges gemäß
mindestens einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle
mit Hilfe eines adenoviralen Vektors mit großer DNA-Kapazität genetisch
modifiziert wird.
10. Verfahren zur Herstellung einer Pigmentepithelzelle des Auges nach
mindestens einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle
in Serum-freiem Medium und/oder in Gegenwart eines "feeder layer"
kultiviert wird.
11. Verfahren zur Herstellung von Pigmentepithelzellen des Auges in Form eines
festen Zellverbands gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der
Zellverband von umgebendem Gewebe, insbesondere enzymatisch, getrennt
wird.
12. Verfahren zur Herstellung von Pigmentepithelzellen, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zellen in einem Kultivierungssystem gemäß Anspruch 8 kultiviert
werden.
13. Verwendung einer Pigmentepithelzelle gemäß mindestens einem der
Ansprüche 1-7 zur Therapie einer Augenerkrankung, insbesondere von AMD,
einem Glaukom, diabethischer Retinopathie oder einer genetisch bedingten
Erkrankung des Pigmentepithels.
14. Verwendung einer Pigmentepithelzelle zur Therapie einer Nervenerkrankung,
insbesondere einer Erkrankung des Nervensystems, bevorzugt des ZNS, vor
allem von Morbus Parkinson.
15. Verwendung einer Pigmentepithelzelle gemäß mindestens einem der
Ansprüche 1-7 zur Therapie einer Nervenerkrankung, insbesondere einer
Erkrankung des Nervensystems, bevorzugt des ZNS, vor allem von Morbus
Parkinson.
16. Verwendung einer Pigmentepithelzelle nach mindestens einem der Ansprüche
11-15, dadurch gekennzeichnet, daß die Pigmentepithelzelle eine autologe
Pigmentepithelzelle ist.
17. Arzneimittel oder Diagnostikum enthaltend eine Pigmentepithelzelle des
Auges gemäß mindestens einem der Ansprüche 1-7 sowie weitere Hilfs-
und/oder Zusatzstoffe.
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