JP2022046484A - 蝸牛および前庭細胞に核酸を送達するための材料および方法 - Google Patents

蝸牛および前庭細胞に核酸を送達するための材料および方法 Download PDF

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Abstract

【課題】蝸牛および前庭細胞に核酸を効率的に送達するための材料および方法に関する。【解決手段】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、対象にＴＭＣ１導入遺伝子を送達する方法における使用のための組成物であって、前記方法が、対象の内耳にＡＡＶベクターを投与するステップを含み、前記ＡＡＶベクターは、（ｉ）特定のアミノ酸配列を有するＡｎｃ８０カプシドタンパク質、および（ｉｉ）ＴＭＣ１導入遺伝子を含み、前記導入遺伝子は、対象の内耳の内有毛細胞（ＩＨＣ）の少なくとも８０％および外有毛細胞の少なくとも８０％に送達される、組成物である。【選択図】なし

Description

本開示は、一般に、蝸牛および前庭細胞に核酸を送達するための材料および方法に関す
る。
遺伝的な聴覚喪失は、蝸牛移植以外の治療選択肢がわずかである重要な問題である。遺
伝性の聴覚の問題は、単一の遺伝子欠損によることが多い。言語習得前の難聴は、１／５
００の幼児において診断され、その約５０％は遺伝的病因を有する。それぞれが多くの異
なる遺伝子のいずれかにおける突然変異によって引き起こされうる多くの異なる臨床亜型
と関連するアッシャー症候群は、幼児期の難聴の３～６％の原因であるが、より蔓延して
いる遺伝子欠損のうちの１つは、遺伝性の難聴の１～２％と推定され、ＴＭＣ１遺伝子に
おいて発生する。
内耳、例えば、蝸牛、特に、蝸牛中の内有毛細胞および外有毛細胞（ＩＨＣおよびＯＨ
Ｃ）は、聴覚喪失および様々な病因による難聴、最も直接的には一遺伝子性の遺伝性難聴
に介入するための遺伝子治療アプローチのための魅力的な標的である。しかしながら、Ｉ
ＨＣおよびＯＨＣだけでなく、遺伝子治療アプローチに関係しうる他の内耳細胞を効率的
に標的とし、形質導入することは挑戦的なことであった。
聴覚喪失は、世界的に最も一般的な感覚器障害であり、言語習得前の難聴の半分は遺伝
子の原因による。それにもかかわらず、蝸牛遺伝子治療の臨床への移行は、安全で臨床的
に意義のある効率的な送達モダリティーのないことによって遅らされてきた。しかしなが
ら、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく新
しい組成物および方法を含む本明細書に記載の新規遺伝子送達モダリティーは、ＩＨＣお
よびＯＨＣをどちらも含む内耳細胞への高効率の遺伝子導入を提供する。本明細書に示す
通り、Ａｎｃ８０または特異的Ａｎｃ８０カプシドタンパク質（例えば、Ａｎｃ８０－０
０６５）と呼ばれる祖先足場カプシドタンパク質を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ
）は、内耳中のＩＨＣおよびＯＨＣを含む様々な細胞をインビボで標的とすることにおい
て驚くほど効率的である。
一態様において、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質およびＴＭＣ１またはＴＭＣ２導入遺
伝子を含むＡＡＶベクターが提供される。別の態様において、Ａｎｃ８０カプシドタンパ
ク質、およびＭＹＯ７Ａ、ＵＳＣＨ１Ｃ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＳＡＮＳ、ＣＩＢ
２、ＵＳＨ２Ａ、ＶＬＧＲ１、ＷＨＲＮ、ＣＬＲＮ１、ＰＤＺＤ７からなる群から選択さ
れる１つまたは複数の導入遺伝子を含む、ＡＡＶベクターが提供される。一実施形態にお
いて、ＡＡＶベクターは、異種プロモーターをさらに含む。
なお別の態様において、対象の内耳中の１つまたは複数の細胞に導入遺伝子を送達する
方法が提供される。そのような方法は、典型的に、対象の内耳にアデノ随伴ウイルス（Ａ
ＡＶ）を投与するステップを含み、ＡＡＶは、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質および導入
遺伝子を含む。
また別の態様において、対象における聴覚障害を治療する方法（例えば、聴覚回復）ま
たは聴覚喪失（もしくはさらなる聴覚喪失）を予防する方法が提供される。そのような方
法は、典型的に、ＡＡＶを対象に投与するステップを含み、ＡＡＶは、Ａｎｃ８０カプシ
ドタンパク質、および内耳中の１または複数の細胞において発現したときに対象に聴覚を
回復させる導入遺伝子を含む。
一実施形態において、内耳中の１つまたは複数の細胞は、内有毛細胞（ＩＨＣ）および
外有毛細胞（ＯＨＣ）からなる群から選択される。一部の実施形態において、導入遺伝子
は、内有毛細胞の少なくとも８０％および外有毛細胞の少なくとも８０％に送達される。
一部の実施形態において、内耳中の１つまたは複数の細胞は、らせん神経節ニューロン、
前庭有毛細胞、前庭神経節ニューロン、支持細胞および血管条中の細胞からなる群から選
択される。
一部の実施形態において、導入遺伝子は、ＡＣＴＧ１、ＡＤＣＹ１、ＡＴＯＨＩ、ＡＴ
Ｐ６Ｖ１Ｂ１、ＢＤＮＦ、ＢＤＰ１、ＢＳＮＤ、ＤＡＴＳＰＥＲ２、ＣＡＢＰ２、ＣＤ１
６４、ＣＤＣ１４Ａ、ＣＤＨ２３、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＨＤ７、ＣＣＤＣ５０、ＣＩＢ
２、ＣＬＤＮ１４、ＣＬＩＣ５、ＣＬＰＰ、ＣＬＲＮ１、ＣＯＣＨ、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯ
Ｌ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ１
、ＣＯＬ１１Ａ２、ＣＲＹＭ、ＤＣＤＣ２、ＤＦＮＡ５、ＤＦＮＢ３１、ＤＦＮＢ５９、
ＤＩＡＰＨ１、ＥＤＮ３、ＥＤＮＲＢ、ＥＬＭＯＤ３、ＥＭＯＤ３、ＥＰＳ８、ＥＰＳ８
Ｌ２、ＥＳＰＮ、ＥＳＲＲＢ、ＥＹＡ１、ＥＹＡ４、ＦＡＭ６５Ｂ、ＦＯＸＩ１、ＧＩＰ
Ｃ３、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ６、ＧＰＲ９８、ＧＲＨＬ２、ＧＰＳＭ２、ＧＲＸＣ
Ｒ１、ＧＲＸＣＲ２、ＨＡＲＳ２、ＨＧＦ、ＨＯＭＥＲ２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＩＬＤＲ１
、ＫＡＲＳ、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＪ１０、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ４、ＫＩＴＬＧ、ＬＡＲ
Ｓ２、ＬＨＦＰＬ５、ＬＯＸＨＤ１、ＬＲＴＯＭＴ、ＭＡＲＶＥＬＤ２、ＭＣＭ２、ＭＥ
Ｔ、ＭＩＲ１８３、ＭＩＲＮ９６、ＭＩＴＦ、ＭＳＲＢ３、ＭＴ－ＲＮＲ１、ＭＴ－ＴＳ
１、ＭＹＨ１４、ＭＹＨ９、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ１Ａ、ＭＹＯ３Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ
７Ａ、ＮＡＲＳ２、ＮＤＰ、ＮＦ２、ＮＴ３、ＯＳＢＰＬ２、ＯＴＯＡ、ＯＴＯＦ、ＯＴ
ＯＧ、ＯＴＯＧＬ、Ｐ２ＲＸ２、ＰＡＸ３、ＰＣＤＨ１５、ＰＤＺＤ７、ＰＪＶＫ、ＰＮ
ＰＴ１、ＰＯＬＲ１Ｄ、ＰＯＬＲ１Ｃ、ＰＯＵ３Ｆ４、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＲＰＳ１、ＰＴ
ＰＲＱ、ＲＤＸ、Ｓ１ＰＲ２、ＳＡＮＳ、ＳＥＭＡ３Ｅ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＳＬＣ１７
Ａ８、ＳＬＣ２２Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ５、ＳＩＸ１、ＳＩＸ５、ＳＭＡ
Ｃ／ＤＩＡＢＬＯ、ＳＮＡＩ２、ＳＯＸ１０、ＳＴＲＣ、ＳＹＮＥ４、ＴＢＣ１Ｄ２４、
ＴＣＯＦ１、ＴＥＣＴＡ、ＴＩＭＭ８Ａ、ＴＪＰ２、ＴＮＣ、ＴＭＣ１、ＴＭＣ２、ＴＭ
ＩＥ、ＴＭＥＭ１３２Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＲＰＮ、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＳＰＥＡＲ、Ｕ
ＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ、ＵＳＨ２Ｄ、ＶＬＧＲ１、ＷＦＳ１、ＷＨＲＮ、お
よびＸＩＡＰからなる群から選択される。
一部の実施形態において、導入遺伝子は、神経栄養因子（例えば、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ
、ＮＴ３およびＨＳＰ７０）をコードする。一部の実施形態において、導入遺伝子は、抗
体またはその断片をコードする。一部の実施形態において、導入遺伝子は、免疫調節タン
パク質をコードする。一部の実施形態において、導入遺伝子は、抗発癌性転写物をコード
する。一部の実施形態において、導入遺伝子は、アンチセンス、サイレンシング、または
長鎖非コードＲＮＡ種をコードする。一部の実施形態において、導入遺伝子は、遺伝子操
作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲからなる群から
選択されるゲノム編集システムをコードする。
一部の実施形態において、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質は、配列番号１に示される配
列を有する。一部の実施形態において、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質は、配列番号２に
示される配列を有する。一部の実施形態において、導入遺伝子は、異種プロモーター配列
の制御下にある。代表的な異種プロモーター配列としては、非限定的に、ＣＭＶプロモー
ター、ＣＢＡプロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ－１プロ
モーター、アルファ９ニコチン受容体プロモーター、プレスチン（prestin）プロモータ
ー、ＫＣＮＱ４プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、Ｍｙｏ６プロモーター、Ｇｆｉ
ｌプロモーター、Ｖｇｌｕｔ３プロモーターおよびＡｔｏｈ１プロモーターが挙げられる
。
一部の実施形態において、投与するステップは、蝸牛窓を通してＡｎｃＡＡＶを注入す
ることを含む。一部の実施形態において、ＡｎｃＡＡＶは、蝸牛窓を通る注入により投与
される。一部の実施形態において、ＡｎｃＡＡＶは、蝸牛開窓術（cochleostomy）の間ま
たはカナロストミー（canalostomy）の間に投与される。一部の実施形態において、Ａｎ
ｃＡＡＶは、１つまたは複数のドラッグデリバリービヒクルによって中耳および／または
蝸牛窓に投与される。
一部の実施形態において、導入遺伝子の発現は、内有毛細胞（ＩＨＣ）、外有毛細胞（
ＯＨＣ）、らせん神経節ニューロン、血管条、前庭有毛細胞および／または前庭神経節ニ
ューロン（例えば、Ａｔｏｈ１、ＮＦ２）の再生をもたらし、それによって、聴覚または
前庭機能を回復させる。
一態様において、ＡＡＶベクターおよび医薬組成物を含む製造品が提供される。そのよ
うな製造品において、ＡＡＶベクターは、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質およびプロモー
ターに作動可能に連結された導入遺伝子を含む。一部の実施形態において、導入遺伝子は
、ＡＣＴＧ１、ＡＤＣＹ１、ＡＴＯＨＩ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ１、ＢＤＮＦ、ＢＤＰ１、ＢＳ
ＮＤ、ＤＡＴＳＰＥＲ２、ＣＡＢＰ２、ＣＤ１６４、ＣＤＣ１４Ａ、ＣＤＨ２３、ＣＥＡ
ＣＡＭ１６、ＣＨＤ７、ＣＣＤＣ５０、ＣＩＢ２、ＣＬＤＮ１４、ＣＬＩＣ５、ＣＬＰＰ
、ＣＬＲＮ１、ＣＯＣＨ、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＣＯＬ４Ａ５、
ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２、ＣＲＹＭ、ＤＣＤＣ２
、ＤＦＮＡ５、ＤＦＮＢ３１、ＤＦＮＢ５９、ＤＩＡＰＨ１、ＥＤＮ３、ＥＤＮＲＢ、Ｅ
ＬＭＯＤ３、ＥＭＯＤ３、ＥＰＳ８、ＥＰＳ８Ｌ２、ＥＳＰＮ、ＥＳＲＲＢ、ＥＹＡ１、
ＥＹＡ４、ＦＡＭ６５Ｂ、ＦＯＸＩ１、ＧＩＰＣ３、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ６、Ｇ
ＰＲ９８、ＧＲＨＬ２、ＧＰＳＭ２、ＧＲＸＣＲ１、ＧＲＸＣＲ２、ＨＡＲＳ２、ＨＧＦ
、ＨＯＭＥＲ２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＩＬＤＲ１、ＫＡＲＳ、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＪ１０、
ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ４、ＫＩＴＬＧ、ＬＡＲＳ２、ＬＨＦＰＬ５、ＬＯＸＨＤ１、ＬＲ
ＴＯＭＴ、ＭＡＲＶＥＬＤ２、ＭＣＭ２、ＭＥＴ、ＭＩＲ１８３、ＭＩＲＮ９６、ＭＩＴ
Ｆ、ＭＳＲＢ３、ＭＴ－ＲＮＲ１、ＭＴ－ＴＳ１、ＭＹＨ１４、ＭＹＨ９、ＭＹＯ１５Ａ
、ＭＹＯ１Ａ、ＭＹＯ３Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ７Ａ、ＮＡＲＳ２、ＮＤＰ、ＮＦ２、ＮＴ
３、ＯＳＢＰＬ２、ＯＴＯＡ、ＯＴＯＦ、ＯＴＯＧ、ＯＴＯＧＬ、Ｐ２ＲＸ２、ＰＡＸ３
、ＰＣＤＨ１５、ＰＤＺＤ７、ＰＪＶＫ、ＰＮＰＴ１、ＰＯＬＲ１Ｄ、ＰＯＬＲ１Ｃ、Ｐ
ＯＵ３Ｆ４、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＲＰＳ１、ＰＴＰＲＱ、ＲＤＸ、Ｓ１ＰＲ２、ＳＡＮＳ、
ＳＥＭＡ３Ｅ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＳＬＣ１７Ａ８、ＳＬＣ２２Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ４、
ＳＬＣ２６Ａ５、ＳＩＸ１、ＳＩＸ５、ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯ、ＳＮＡＩ２、ＳＯＸ１
０、ＳＴＲＣ、ＳＹＮＥ４、ＴＢＣ１Ｄ２４、ＴＣＯＦ１、ＴＥＣＴＡ、ＴＩＭＭ８Ａ、
ＴＪＰ２、ＴＮＣ、ＴＭＣ１、ＴＭＣ２、ＴＭＩＥ、ＴＭＥＭ１３２Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ３
、ＴＲＰＮ、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＳＰＥＡＲ、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ、ＵＳ
Ｈ２Ｄ、ＶＬＧＲ１、ＷＦＳ１、ＷＨＲＮ、およびＸＩＡＰからなる群から選択される。
別の態様において、対象の内耳中の１つまたは複数の細胞にＴＭＣ１またはＴＭＣ２導
入遺伝子を送達する方法が提供される。そのような方法は、典型的に、対象の内耳にアデ
ノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を投与するステップを含み、ＡＡＶは、Ａｎｃ８０カプシドタ
ンパク質および導入遺伝子を含む。また別の態様において、対象における聴覚障害を処置
する方法が提供される。そのような方法は、典型的に、対象にＡＡＶを投与するステップ
を含み、ＡＡＶは、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質、および内耳中の１つまたは複数の細
胞において発現したときに、対象に聴覚を回復させまたは対象における聴覚喪失（たとえ
ば、さらなる聴覚喪失）を予防するＴＭＣ１またはＴＭＣ２導入遺伝子を含む。
なお別の態様において、対象の内耳中の１つまたは複数の細胞にアッシャー導入遺伝子
を送達する方法が提供される。そのような方法は、典型的に、対象の内耳にアデノ随伴ウ
イルス（ＡＡＶ）を投与するステップを含み、ＡＡＶは、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質
および導入遺伝子を含む。また別の態様において、対象における聴覚障害を処置する方法
が提供される。そのような方法は、対象にＡＡＶを投与するステップを含み、ＡＡＶは、
Ａｎｃ８０カプシドタンパク質、および内耳中の１つまたは複数の細胞において発現した
ときに、対象に聴覚を回復させるアッシャー導入遺伝子を含むことができる。代表的なア
ッシャー導入遺伝子としては、非限定的に、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＣＨ１Ｃ、ＣＤＨ２３、Ｐ
ＣＤＨ１５、ＳＡＮＳ、ＣＩＢ２、ＵＳＨ２Ａ、ＶＬＧＲ１、ＷＨＲＮ、ＣＬＲＮ１、Ｐ
ＤＺＤ７が挙げられる。
一実施形態において、内耳中の１つまたは複数の細胞は、内有毛細胞（ＩＨＣ）および
外有毛細胞（ＯＨＣ）からなる群から選択される。一実施形態において、導入遺伝子は、
内有毛細胞の少なくとも８０％および外有毛細胞の少なくとも８０％に送達される。一実
施形態において、内耳中の１つまたは複数の細胞は、らせん神経節ニューロン、前庭有毛
細胞、前庭神経節ニューロン、支持細胞および血管条中の細胞からなる群から選択される
。
一実施形態において、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質は、配列番号１に示される配列を
有する。一実施形態において、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質は、配列番号２に示される
配列を有する。一実施形態において、導入遺伝子は、異種プロモーター配列の制御下にあ
る。代表的な異種プロモーター配列としては、非限定的に、ＣＭＶプロモーター、ＣＢＡ
プロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ－１プロモーター、ア
ルファ９ニコチン受容体プロモーター、プレスチンプロモーター、ＫＣＮＱ４プロモータ
ー、Ｍｙｏ７ａプロモーター、Ｍｙｏ６プロモーター、Ｇｆｉｌプロモーター、Ｖｇｌｕ
ｔ３プロモーターおよびＡｔｏｈ１プロモーターが挙げられる。
一実施形態において、投与するステップは、蝸牛窓を通してＡｎｃＡＡＶを注入するこ
とを含む。一実施形態において、ＡｎｃＡＡＶは、蝸牛窓を通る注入により投与される。
一実施形態において、ＡｎｃＡＡＶは、蝸牛開窓術の間またはカナロストミーの間に投与
される。一実施形態において、ＡｎｃＡＡＶは、１つまたは複数のドラッグデリバリービ
ヒクルによって中耳および／または蝸牛窓に投与される。
一実施形態において、導入遺伝子の発現は、内有毛細胞（ＩＨＣ）、外有毛細胞（ＯＨ
Ｃ）、らせん神経節ニューロン、血管条、前庭有毛細胞および／または前庭神経節ニュー
ロン（例えば、Ａｔｏｈ１、ＮＦ２）の再生をもたらし、それによって、聴覚もしくは前
庭機能を回復させ、かつ／または聴覚喪失（例えば、さらなる聴覚喪失）を予防する。
別段の定めのない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、
方法および物質の組成物が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有
する。本明細書に記載されたものに類似するまたは等価な方法および材料が、方法および
物質の組成物の実践または試験において使用されうるが、好適な方法および材料が以下に
記載される。加えて、材料、方法および例は、例示的であるだけで、限定的であることを
意図されない。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考
文献は、参照することによりその全体として本明細書に組み込まれる。
第１部：高効率の蝸牛遺伝子導入
図１Ａ－１Ｇは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの蝸牛外植片におけるｅＧＦＰ導入遺伝子発現のための数種のＡＡＶ血清型のインビトロでの比較の代表的な共焦点投射図を示す画像である。図１Ａ～１Ｇは、すべての血清型についての蝸牛基底（cochlear base）における発現ならびに示されるＡＡＶについての頂端および基底を示す。スケールバー＝１００μＭ。上：Ｍｙｏ７Ａ＋ＴｕＪ１；下：ｅＧＦＰのみ；中：オーバーレイ；Ｓ．細胞＝支持細胞、ＯＨＣ：外有毛細胞、ＩＨＣ：内有毛細胞、図１Ｈ～１Ｋは、４８ｈまたは４８ｈ＋５日のインキュベーション後の１００μＭ当たりのｅＧＦＰ陽性有毛細胞のパーセンテージを示すグラフである。４８ｈについてはＮ＝３、４８ｈ＋５ｄについてはＮ＝２。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。 図２Ａ－２Ｇは、各パネルの上に示された力価の示されたＡＡＶ血清型のインビボでの蝸牛形質導入を示す画像である。図２Ａは、Ａｌｅｘａ－５４６－ファロイジン（赤色）で対比染色され、ｅＧＦＰ（緑色）についてイメージングされた、マウスコルチ器官の共焦点画像である。スケールバー＝５０μｍ。図２Ｂは、ＡＡＶ－ｅＧＦＰを注入された蝸牛の基底および頂端におけるｅＧＦＰ陽性ＩＨＣの定量化を示すグラフである。図２Ｃは、ＡＡＶ－ｅＧＦＰを注入された蝸牛の基底および頂端におけるｅＧＦＰ陽性ＯＨＣの定量化を示すグラフである。図２Ｄは、ｅＧＦＰ陰性ＯＨＣ（黒）およびｅＧＦＰ陽性ＯＨＣ（緑色）からのＰ７（左）で記録された感覚変換電流群を示す画像である。垂直のスケールバーは２００ｐＡを示し；水平のスケールバーは２０ミリ秒を示す。ｅＧＦＰ陰性（黒）およびｅＧＦＰ陽性（緑色）のＰ３５のＩＨＣからの電流が右側に示される。垂直のスケールバーは１００ｐＡを示し；水平のスケールバーは２０ミリ秒を示す。図２Ｅは、下に示された齢における１０３のＩＨＣおよびＯＨＣについてプロットした感覚変換電流の振幅を示すグラフである。ｅＧＦＰ陰性（黒）およびｅＧＦＰ陽性（緑色）からのデータが示される。各群の細胞数をグラフ上に示す。図２Ｆは、平均±標準偏差（ＳＤ）を示すグラフである。注入関連の損傷（赤色）のためにｅＧＦＰ蛍光のない、１つの注入した耳のデータとともに、４つのＡｎｃ８０を注入した耳（緑色）および４つの注入しない耳（黒）についてプロットしたＡＢＲ閾値。図２Ｇは、平均±ＳＤを示すグラフである。ＤＰＯＡＥ閾値を、４つのＡｎｃ８０を注入した耳（緑色）および４つの注入しない耳（黒）および注入による損傷があり、ｅＧＦＰ蛍光のない１つの陰性対照の耳（赤色）についてプロットする。図２Ｂ～２Ｇ中のデータ点についての注入力価は図２Ａの通りである。 図３Ａ－３Ｄは、前庭感覚上皮におけるＡｎｃ８０－ｅＧＦＰの形質導入を示す画像である。図３Ａは、１μＬのＡｎｃ８０－ｅＧＦＰ（１．７×１０１２ＧＣ／ｍＬ）を注入したＰ１マウス由来のマウス卵形嚢を示す画像である。組織を採取し、固定し、Ａｌｅｘａ５４６－ファロイジン（赤色）で染色し、ｅＧＦＰ（緑色）についてイメージングした。スケールバー＝１００μｍ。図３Ｂは、図３Ａに記載の同じマウス由来の後部三半規管の稜を示す画像である。スケールバー＝５０μｍ。図３Ｃは、ヒト卵形嚢の感覚上皮を示す画像である。組織をＡｎｃ８０－ｅＧＦＰベクターに曝露し、培養し、固定し、Ａｌｅｘａ５４６－ファロイジン（赤色）で染色し、ｅＧＦＰ蛍光（緑色）についてイメージングした。スケールバー＝１００μｍ。図３Ｄは、Ａｌｅｘａ５４６－ファロイジン（赤色）およびＭｙｏ７Ａ（青色）で染色し、図３Ｃと同一条件で形質導入したｅＧＦＰ（緑色）についてイメージングした、卵形嚢中のヒト上皮の高倍率図を示す画像である。オーバーレイパネル中の白い矢印は、選択されたｅＧＦＰ陽性／Ｍｙｏ７Ａ陽性細胞を示す。スケールバー＝２０μｍ。 図４Ａ－４Ｊは、数種のＡＡＶ血清型の、ＣＢＡ／ＣａＪマウスの蝸牛外植片中のｅＧＦＰ発現に関するインビトロの比較の代表的画像である。図４Ａ～４Ｆは、等用量のＡＡＶ血清型におけるインキュベーション後の結果を示す画像である。スケールバー＝２００μｍ。図４Ｇ～４Ｊに示すエラーバーは、ＳＥＭを表す。 図５Ａ－５Ｈは、注目される発現のないことを表す「０」（図５Ｄ、５Ｈ）、薄暗く発現している一部の細胞「１」（図５Ｃ、５Ｇ）、顕微鏡視野当たりの有意な数の細胞における低レベルから中レベルの発現「２」（図５Ｂ、５Ｆ）および中度から高度にわたるレベルでｅＧＦＰを発現している高いパーセンテージの細胞「３」（図５Ａ、５Ｅ）により、感染細胞の数および強度の点から発現の範囲を例解するために、０（図５Ｄ、５Ｈ）（最低の発現）から３（図５Ａ、５Ｅ）（最高レベルの発現）までにわたる、ｅＧＦＰ定性的発現スコアリングシステムを示す画像である。（図５Ａ～５Ｄに関して）図５Ａおよび（図５Ｅ～５Ｈに関して）図５Ｅに示されるスケールバー＝２０μｍ。 図６は、上の図５に詳述したｅＧＦＰスコアリングシステムを使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの縁、支持細胞およびらせん神経節ニューロンにおけるｅＧＦＰ発現を示すグラフである。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ＳＧＮの形質導入は、顕微鏡視野当たりのｅＧＦＰ陽性細胞数により評価した。 図７は、上の図５に詳述したｅＧＦＰスコアリングシステムを使用して、ＣＢＡ／ＣａＪマウスの縁、支持細胞およびらせん神経節ニューロンにおけるｅＧＦＰ発現を示すグラフである。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ＳＧＮの形質導入は、顕微鏡視野当たりのｅＧＦＰ陽性細胞数により評価した。 図８Ａ－８Ｅは、Ａｎｃ８０によるマウス蝸牛における広範な内有毛細胞および外有毛細胞の形質導入を示す画像である。図８Ａは、Ａｎｃ８０－ｅＧＦＰを注入したマウス蝸牛の全頂端部分の低倍率図を示す画像である。蝸牛を採取し、Ａｌｅｘａ５４６－ファロイジン（赤色）で染色し、ｅＧＦＰ（緑色）についてイメージングした。スケールバー＝１００μｍ。図８Ｂは、Ａｎｃ８０－ｅＧＦＰを注入した異なるマウスの蝸牛由来の基底部分の高倍率図を示す画像である。蝸牛を採取し、Ａｌｅｘａ５４６－ファロイジン（赤色）で染色し、ｅＧＦＰ（緑色）についてイメージングした。スケールバー＝２０μｍ。図８Ｃおよび８Ｄは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの蝸牛窓注入後の内有毛細胞および外有毛細胞の形質導入効率の定量的比較を示すグラフである。図８Ｅは、Ａｎｃ８０有毛細胞形質導入の用量依存性を示す画像である。２つの異なるＡｎｃ８０－ｅＧＦＰ力価に蝸牛を曝露し、固定し、Ａｌｅｘａ５４６－ファロイジン（赤色）で染色し、ｅＧＦＰ（緑色）についてイメージングした。スケールバー＝２０μｍ。 図９Ａ－９Ｈは、ＴｕＪ１（赤色）およびＭｙｏ７Ａ（マゼンダ）について染色した組織切片におけるｅＧＦＰ導入遺伝子発現について評価した、マウス蝸牛の基底から頂端までの両側性蝸牛形質導入を示す画像である。頂端まで広がる効率的なＡｎｃ８０形質導入が、注入された蝸牛において（図９Ａ／９Ｆ）、および対側の注入されない耳においても（図９Ｂ～９Ｅ＝頂端から基底まで）観察された。ｅＧＦＰ陽性およびＴｕＪ１陽性のらせん神経節ニューロンの接写画像（図９Ｇ）。Ａｎｃ８０形質導入のＳＧＮ評価のための再構築３Ｄ画像（図９Ｈ）。スケールバー＝１００μｍ（図９Ａ～９Ｅ）および２０μｍ（図９Ｆ／９Ｇ）。 図１０Ａ－１０Ｂは、Ａｎｃ８０による片側性蝸牛注入後のマウス脳の横断面を示す顕微鏡画像の表示である（図１０Ａ）。小脳、特にプルキンエ細胞（白い矢じり）において、卓越した発現が観察された（図１０Ｂ）。スケールバー１ｍｍ（図１０Ａ）および３００μｍ（図１０Ｂ）。図１０Ｃは、注入しないおよびＡｎｃ８０ＲＷＭを注入した動物の血清および脳脊髄液（ＣＳＦ）中の抗ＡＡＶ中和抗体（ＮＡＢ）力価を示す画像である。力価は、ＮＡＢアッセイにおいて形質導入の５０％阻害が観察される、血清またはＣＳＦの希釈率を反映する。試料体積の制限のために、血清ＮＡＢについての感度の限界は１／４、ＣＳＦについては１／５２．５であった。 図１１Ａ－１１Ｂは、それぞれ、Ａｎｃ８０蝸牛形質導入後の前庭機能を示す、画像およびグラフである。マウスにＡｎｃ８０－ｅＧＦＰを注入し、発現およびロータロッド装置上の平衡機能について評価した。図１１Ａは、Ｍｙｏ７Ａ（赤色）についての免疫蛍光染色を伴う共焦点顕微鏡観察による、前庭組織中のｅＧＦＰ（緑色）の発現を示す画像である。図１１Ｂは、マウスが装置から落下するまでの平均時間±ＳＥＭを示すグラフである。スケールバー＝５０μｍ。 第２部－遺伝子治療がアッシャー症候群の マウスモデルにおいて機能を回復させる 図１２Ａ－１２Ｌは、Ｕｓｈ１ｃｃ．２１６Ｇ＞Ａ突然変異体マウスのコルチ器官の走査電子顕微鏡観察を示す画像である。図１２Ａ～１２Ｆは、ｃ．２１６ＧＡおよびｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスのイメージングしたコルチ器官の基底、中間および頂端領域を示す画像である。図１２Ｇ～１２Ｌは、ＯＨＣ（図１２Ｇ～１２Ｈ）およびＩＨＣ（図１２Ｉ～１２Ｊ）の高倍率画像である。星印は、保存された毛束；矢じり、秩序の乱れた毛束；および矢印、波状のＩＨＣ束を示す。スケールバー低倍率：５μｍ（図１２Ａ～１２Ｆ）；高倍率：２μｍ（図１２Ｇ）、３μｍ（図１２Ｈ）、２μｍ（図１２Ｉ～１２Ｊ）および１μｍ（図１２Ｋ、１２Ｌ）。 図１３Ａ－１３Ｈは、Ｕｓｈ１ｃｃ．２１６Ｇ＞Ａ新生児突然変異体マウスの有毛細胞におけるメカノトランスダクションを示す画像である。図１３Ａ～１３Ｄは、ｃ．２１６ＧＡおよびｃ．２１６ＡＡマウスの有毛細胞中のオープントランスダクションチャネルの存在を評価するためのＦＭ１－４３染色を示す画像である。ＩＨＣのＦＭ１－４３蛍光は、ＩＨＣが異なる焦点面にあるとき薄暗く見える。左：ＤＩＣ、右：ＦＭ１－４３；スケールバー １０μｍ；図１３Ｃ、スケールバー ５０μｍ；図１３Ｄ、スケールバー １０μｍ。図１３Ｄの白線は、ストリオーラ（取り込みなし）およびストリオーラ外（取り込み）を描写する。図１３Ｅ～１３Ｈは、新生児ｃ．２１６ＧＡおよびｃ．２１６ＡＡマウスのＯＨＣ、ＩＨＣおよびＶＨＣにおいて評価したメカノトランスダクションを示すグラフである。代表的なトランスダクション電流（図１３Ｅ）、２次Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ関数に当てはめたそれに関連した電流／変位プロット（図１３Ｆ）および平均ピークトランスダクション電流をプロットした（図１３Ｇ～１３Ｈ）。平均ピークトランスダクションは、ＯＨＣ、ＩＨＣおよびＶＨＣにおいて２つの遺伝子型の間で有意に相違した（＊＊＊Ｐ＜０．０１、一元配置ＡＮＯＶＡ）。 図１４Ａ－１４Ｅは、インビトロおよびインビボでアデノ随伴ウイルスベクターに曝露した組織中の蛍光標識ｈａｒｍｏｎｉｎの発現および局在化を示す画像である。図１４Ａ～１４Ｃは、ＡＡＶ２／１ベクターに曝露し、培養し、固定し、対比染色し（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ファロイジン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、共焦点顕微鏡でイメージングした、直ちに解剖した内耳組織を示す。図１４Ａスケールバー：１０μｍ－上のパネル；５μｍ－下のパネル；図１４Ｂスケールバー：１０μｍ；図１４Ｃスケールバー：３μｍ；図１４Ｄスケールバー：３０μｍ；図１４Ｅスケールバー：５μｍ。 図１５Ａ－１５Ｃは、Ａｎｃ８０ｈａｒｍｏｎｉｎベクターを注入したマウスの有毛細胞におけるメカノトランスダクションの回復を示す画像である。図１５Ａ～１５Ｃは、ｃ．２１６ＡＡ非注入対照マウスおよびＡｎｃ８０ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１を注入したまたはＡｎｃ８０ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１とＡｎｃ８０ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１を組み合わせ注入したｃ．２１６ＡＡマウスのＩＨＣにおいて記録したメカノトランスダクション電流を示す。器官型培養を準備し、記録を実施した。各データセットについての対応するＩ／Ｘ曲線および二重Ｂｏｌｔｚｍａｎｎフィット関数。各最大メカノトランスダクション電流Ｉｍａｘ＝１０２．１ｐＡ（ｃ．２１６ＡＡ）；４２４．３ｐＡ（ｃ．２１６ＡＡ＋ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１）および３４１．１ｐＡ（ｃ．２１６ＡＡ＋ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１＆－ｂ１）（図１５Ｂ）。平均反応（平均±ＳＤ）は、非注入マウスに対して、ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１およびｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１＋－ｂ１を注入したマウスについてトランスダクションの有意な回復（＊＊＊Ｐ＜０．００１）を示す。平均トランスダクション電流は、ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１を注入したマウスとｃ．２１６ＧＡ対照マウスで有意に相違しなかった（ＮＳ Ｐ＞０．５）。メカノトランスダクションの回復は、ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａおよびｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂを組み合わせたときにも有意に改善しなかった。図１５Ｃは、一元配置ＡＮＯＶＡを示す。 図１６Ａ－１６Ｅは、Ａｎｃ８０ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１を注入したマウスにおけるＡＢＲおよびＤＰＯＡＥ閾値の回復を示す画像である。図１６Ａは、ｃ．２１６ＡＡ対照マウスおよびｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１、ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１または２つの組み合わせをコードしたベクターを注入したｃ．２１６ＡＡマウスにおける１６ｋＨｚ発信音についての代表的なＡＢＲ反応を示す画像である。３０ｄＢ ＳＰＬ近辺の回復したＡＢＲ閾値を、ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１単独またはｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１とｂ１を一緒に注入したマウスにおいて測定した。図１６Ｂは、ｃ．２１６ＡＡ；ｃ．２１６ＧＡ；ｃ．２１６ＡＡ＋ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１；ｃ．２１６ＡＡ＋ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１；ｃ．２１６ＡＡ＋ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１＆－ｂ１について得られた平均ＡＢＲ反応を示す画像である。平均±ＳＥ、実線。点線：その１６ｋＨｚの記録が図１６Ａに示されるマウスの全周波数範囲についてのＡＢＲ閾値。図１６Ｃは、ｃ．２１６ＡＡ；ｃ．２１６ＧＡ；ｃ．２１６ＡＡ＋ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１；ｃ．２１６ＡＡ＋ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１；ｃ．２１６ＡＡ＋ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１＆－ｂ１について得られた平均ＤＰＯＡＥ反応を示す。平均±ＳＥ、実線。点線：その記録が図１６Ａに図示される４頭のマウスについてのＤＰＯＡＥ閾値。矢印は、閾値が試験した最大刺激レベルよりも高いことを示す。図１６Ｄ～１６Ｅは、４５ｄＢ未満または４５ｄＢに等しい最初のＡＢＲ閾値を示したマウスにおいて６週および３カ月で得られたＡＢＲおよびＤＰＯＡＥ反応を示す。８頭のうちの６頭のマウスを６カ月飼育し、ＡＢＲおよびＤＰＯＡＥを評価した（点線）。平均±ＳＥ。最初の３カ月間、ＡＢＲおよびＤＰＯＡＥ閾値のシフトが明白であった一方、聴覚レスキューは、低周波数範囲において６カ月齢でなお卓越していた。 図１７Ａ－１７Ｅは、Ａｎｃ８０ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１およびＡｎｃ８０ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１を注入したマウスにおける驚愕反応、ロータロッド成績およびオープンフィールド行動の回復を示す画像である。図１７Ａは、対照ｃ．２１６ＧＡ、ｃ．２１６ＡＡおよび注入したｃ．２１６ＡＡマウスにおいて記録したホワイトノイズ刺激に対する驚愕反応を示す。部分的な驚愕レスキューが、ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１を注入したマウスにおいて明白であったが、ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１ではそうでなかった。平均を、±ＳＥで示す。図１７Ｂは、対照ｃ．２１６ＧＡ、ｃ．２１６ＡＡおよび注入したｃ．２１６ＡＡマウスにおけるロータロッド成績を示す。ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１およびｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１／ｂ１を注入したマウスにおいて完全な回復が観察され；ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１単独では回復を観察しなかった。平均を、±ＳＥで示す。図１７Ｃ～１７Ｅは、対照ｃ．２１６ＧＡ、ｃ．２１６ＡＡならびに注入したｃ．２１６ＡＡおよびｃ．２１６ＧＡマウスにおいて５分間実施したオープンフィールド観察を示す。代表的な２．５分にわたるトラックを示す（図１７Ｂ）。ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスが全フィールドを探索し、繰り返して全身回転（full body rotation）を行ったが、Ｐ１でｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１、ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１または２つのベクターの組み合わせを注入したｃ．２１６ＡＡマウスは、そのヘテロ接合性ｃ．２１６ＧＡカウンターパートまたは切断型ベクターを注入したｃ．２１６ＧＡマウスと同様の正常行動を示した。図１７Ｃは、回転数および１分あたりの進んだ距離についての平均±ＳＥを図示するグラフを示す。有意な回復＊＊＊Ｐ＜０．００１が、非注入および注入したマウスの間で観察された。一元配置ＡＮＯＶＡによる統計解析。 Ａｎｃ８０ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１を注入したマウスのコルチ器官の走査電子顕微鏡画像である。ｃ．２１６ＧＡ、ｃ．２１６ＡＡおよびｃ．２１６ＡＡマウスにおいてコルチ器官の基底、中間および頂端領域をイメージングした。ｃ．２１６ＧＡマウスではＯＨＣおよびＩＨＣ毛束が保存されたが、ｃ．２１６ＡＡマウスではコルチ器官に沿って秩序が乱れて見えた。器官の基底末端におけるよりはっきりした変性とともに、ｃ．２１６ＡＡマウスにおいて注目すべき有毛細胞喪失（アスタリスク）および毛束の秩序の乱れが観察された。ｃ．２１６ＡＡマウスの毛束は正常な不動毛の列がなかった。ｃ．２１６ＡＡマウスにおいて、低い列は引っ込んで見えたが、より高い列は維持された（矢印）。レスキューされたｃ．２１６ＡＡマウスにおいて有毛細胞の喪失および束の秩序の乱れがなお明白であった一方、器官の基底および中間領域において有毛細胞の生存は著しく高かった。有毛細胞数を棒グラフに要約する。全部で１８２４個の細胞をｃ．２１６ＡＡマウスにおいて、７９２個をレスキューされたｃ．２１６ＡＡマウスにおいてカウントした。平均±ＳＥ。高倍率イメージングは、多くのしかしすべてではない細胞（矢じり）における注入したｃ．２１６ＡＡマウス（矢印）の階段状の列のレスキューを明らかにした。スケールバー低倍率：５μｍ；高倍率：１μｍ。 図１９Ａ－１９Ｌは、Ｕｓｈ１ｃｃ．２１６Ｇ＞Ａマウスの毛束形態のＳＥＭによる分析を示す画像である。図１９Ａ～１９Ｃは、正常な毛束形態を呈するヘテロ接合性ｃ．２１６ＧＡマウスを示す。図１９Ｄ～１９Ｉは、ホモ接合性ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスの器官に沿って観察された秩序の乱れた毛束を示す。図１９Ｊ～１９Ｌは、ｃ．２１６ＡＡマウスで穏やかに秩序の乱れたＩＨＣ毛束を示す。頂端から測定した距離：基底３．５～４ｍｍ；中間１．８～２．２ｍｍ；頂端０．６～０．８ｍｍ。スケールバー低倍率：５μｍ；高倍率：１μｍ。 図２０Ａ－２０Ｊは、ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスにおけるメカノトランスダクション特性を示す画像である。図２０Ａ～２０Ｅは、蝸牛の中間および中回転～頂回転からの新生児ＯＨＣにおけるメカノトランスダクションの分析を示す。ｃ．２１６ＧＡおよびｃ．２１６ＡＡ突然変異体における順応を評価するために、～Ｐ０＝０．５からの代表的な電流トレースを二重指数関数的減衰関数にフィットさせた（図２０Ａ）。あてはめを使用して、早い（図２０Ｅ）および遅い（図２０Ｄ）時定数だけでなく、順応の程度（図２０Ｅ）を生成した。１０～９０％の作動範囲は、有意に変化しなかった（図２０Ｂ）。ｃ．２１６ＡＡマウスにおける順応の程度は、この分散プロット（図２０Ｅ）に示すヘテロ接合性ＯＨＣよりも有意に小さかった。図２０Ｆ～２０Ｊは、新生児ＩＨＣにおけるメカノトランスダクションの分析を示す。１０～９０％の作動範囲の値は、ｃ．２１６ＧＡ対ｃ．２１６ＡＡＩＨＣでより小さかった（図２０Ｇ）。順応が常に存在したが、ｃ．２１６ＡＡ ＩＨＣではわずかに遅く、程度は有意に小さかった（図２０Ｈ～２０Ｊ）。統計解析を各プロットに示す：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡ。 図２１Ａ－２１Ｃは、Ｐ１での二重ベクター注入後６週間の、ｃ．２１６ＡＡのコルチ器官中の蛍光標識したｈａｒｍｏｎｉｎ－ａおよびｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ Ａｎｃ８０ベクターの発現を示すデータである。図２１Ａ～２１Ｃは、Ｐ１でのＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｔｄＴｏｍａｔｏ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１（０．５μｌ；４．１１Ｅ＾１２ｇｃ／ｍｌ）およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１（０．５μｌ；２．９９Ｅ＾１２ｇｃ／ｍｌ）の同時注入後の６週齢のｃ．２１６ＡＡマウスの基底回転の共焦点画像を示す。それぞれ、全細胞数の６９％および７４％が、ｅＧＦＰ（図２１Ａ）およびｔｄＴｏｍａｔｏ（図２１Ｃ）を発現し、６５％が両マーカーを発現し、成功した同時形質導入を実証している。スケールバー：２０μｍ。 図２２Ａ－２２Ｆは、対照ｃ．２１６ＧＡおよび注入され、レスキューされたｃ．２１６ＡＡマウスのＡＢＲ反応の分析を示すデータである。図２２Ａおよび２２Ｄは、対照ｃ．２１６ＧＡおよびレスキューされたｃ．２１６ＡＡマウスについての８および１６ｋＨｚにおけるＡＢＲ反応の例を示す。図２２Ｂ～２２Ｃおよび２２Ｅ～２２Ｆは、平均ピーク１の振幅（図２２Ｂ～２２Ｄ）および匹敵する閾値（ｎ＝８ ｃ．２１６ＧＡ、ｎ＝５ ｃ．２１６ＡＡ＋Ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１ ＲＷＭ Ｐ１）を有するｒ６週齢のマウスにおける８～１１．３および１６ｋＨｚでの潜時（図２２Ｃ～２２Ｄ）を示す。平均±ＳＥ：一元配置ＡＮＯＶＡ。 図２３Ａ－２３Ｄは、Ｕｓｈ１ｃｃ．２１６Ｇ＞Ａマウスで発現したｈａｒｍｏｎｉｎの突然変異型が、有毛細胞または聴覚機能を変更しないことを示す。図２３Ａは、野生型ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１タンパク質とＵｓｈ１ｃ遺伝子のエクソン３における潜在性スプライシングおよびアカディア（acadian）Ｇ＞Ａ突然変異を伴うフレームシフトの結果として分泌される切断型ｈａｒｍｏｎｉｎの間の配列アラインメントである。図２３Ｂは、野生型マウス、ｃ．２１６ＧＡおよびｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスの聴覚器官からの半定量的ＲＴ－ＰＣＲが、野生型（４５０ｂｐ）およびｃ．２１６ＧＡおよびｃ．２１６ＡＡマウスの切断型（－３５ｂｐ）ｈａｒｍｏｎｉｎの発現を確認することを示す。図２３Ｃ～２３Ｄは、聴性脳幹反応（ＡＢＲ、図２３Ｃ）および歪成分（ＤＰＯＡＥ、図２３Ｄ）を、注入したｃ．２１６ＧＡマウスおよび対照ｃ．２１６ＧＡおよびｃ．２１６ＡＡマウスにおいて測定したことを示す。プロットは、平均±ＳＥとして示す。 図２４Ａ－２４Ｃは、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１を注入した６週齢のマウスの内耳における正確なＵｓｈ１ｃスプライシングの回復を示す画像である。図２４Ａは、Ｕｓｈ１ｃ．２１６Ａアレル由来の正確にスプライシングされた（４５０ｂｐ）および異常な（４１５ｂｐ）ｍＲＮＡの半定量的ＲＴ－ＰＣＲによる定量化が、レスキューされたｃ．２１６ＡＡマウス＃１および＃２の注入した（Ｉ）および対側の耳（図２４Ｃ）における正確なＵｓｈ１ｃスプライシングの回復を示すことを示している（注入した耳からの１１．３ｋＨｚにおける３５ｄＢ ＳＰＬの反応）。ＡＢＲ反応不良のマウス＃３（１１．３ｋＨｚにおいて９０ｄＢ ＳＰＬ）は、正確なｍＲＮＡ発現の中程度の回復を示し、マウス＃４（１１．３ｋＨｚにおいて１００ｄＢ ＳＰＬ）は回復を示さなかった。注入しないｃ．２１６ＡＡマウス（マウス＃５、６）においては正確なスプライス型を検出しないが、正確および切断型のスプライス型の両方をｃ．２１６ＧＡマウス（マウス＃７、８、９）で検出する。物質の相対量を確認するために、下のパネルに示す、対応するマウスＧＡＰＤＨを増幅した。図２４Ｂは、半定量的放射標識ＲＣＲ解析が、Ｕｓｈ１ｃ．２１６ＡＡマウスの注入したおよび対側の耳におけるＡＡＶ－ｍＵｓｈ１ｃの存在を確認したことを示す画像である。相対的レベルのＡＡＶ－ｍＵｓｈ１ｃＤＮＡが存在したが、マウス＃３および＃４では低減していた。図２４Ｃは、相対量のＡＡＣ－ｍＵｓｈ１ｃがＡＢＲ閾値と相関していたことを示す。１１．３および１６ｋＨｚについての分析を例証する。線形回帰が、２つの間の高い相関を示した。 図２５は、長期のＡＢＲ閾値の回復が、聴覚器官の中間～頂端領域におけるＯＨＣの生存と相関したことを示すグラフである。コルチ器官全体にわたる有毛細胞の計数を、３頭の非注入ｃ．２１６ＡＡおよび５頭の注入したｃ．２１６ＡＡの左耳で死後に実施した。ＩＨＣおよびＯＨＣ有毛細胞の総数は、注入したマウスにおいて増加した。レスキューされた注入したマウスとレスキューが不良であった注入したマウスの比較は、ＩＨＣの数は相違しなかったが、レスキューされたマウスではかなりの数のＯＨＣが注目された。器官の長さ全体にわたる分析は、相違が、器官の中間から頂端領域からの有毛細胞の生存の増加によると説明できることを示した。挿入図：マウスのうちの２頭（マウス＃１、２）が試験範囲全体にわたりＡＢＲ反応閾値の不良を示した（≧９５ｄＢ ＳＰＬ）一方、３頭（＃３、４、５）は、５．６から１６ｋＨｚの間の音刺激に対して３５から５５ｄＢ ＳＰＬにわたる閾値をもって反応した。 第３部－聴覚喪失に関与するさらな る突然変異の遺伝子治療 図２６Ａ－２６Ｄは、ＲＷＭを通してＡｎｃ８０－Ｈａｒｍｏｎｉｎ：：ＧＦＰ（すなわち、ＧＦＰがＨａｒｍｏｎｉｎポリペプチドに融合されている）を注入し、採取し、アクチン（赤色；図２６Ａ）、Ｍｙｏ７Ａ（青色；図２６Ｂ）染色し、ＧＦＰについてイメージングした（緑色；図２６Ｃ）、Ｕｓｈ１ｃ突然変異体マウスの蝸牛の代表的な共焦点画像である。図２６Ａ、２６Ｂおよび２６Ｃの重ね合わせ画像を図２６Ｄに示す。 図２７は、Ｕｓｈ１ｃ突然変異体マウス（四角）およびＡｎｃ８０－Ｈａｒｍｏｎｉｎ：：ＧＦＰベクターを注入したＵｓｈ１ｃ突然変異体マウス（丸）についての音の周波数の関数としてプロットしたＡＢＲ閾値を示すグラフである。 図２８Ａ－２８Ｃは、ＲＷＭを通してＡｎｃ８０－ＫＣＮＱ４を注入し、採取し、Ａｌｅｘａ５４６－ファロイジン（赤色）およびＫＣＮＱ４に対する抗体（緑色）で染色したＫＣＮＱ４－／－蝸牛の、高倍率の注入しない蝸牛（図２８Ｃ）に比較した、低倍率（図２８Ａ）または高倍率（図２８Ｂ）の代表的な共焦点画像を示す。 図２９Ａ－２９Ｃは、野生型マウス（図２９Ａ）、Ｐ１０のＫＣＮＱ４－／－マウス（図２９Ｂ）およびＰ１０のＡｎｃ８０－ＫＣＮＱ４を注入したＫＣＮＱ４－／－マウス（図２９Ｃ）におけるＫＣＮＱ４電流を示す一連のグラフである。注入の８日後に蝸牛を採取した。 図３０は、Ａｎｃ８０ Ｔｍｃ１ベクターを注入したＴｍｃ１－／－組織におけるＦＭ１－４３の取り込み（ＦＭ１－４３は、機能的Ｔｍｃ１チャネルのみを透過する）を示す一連の３つの画像である。 図３１Ａは、野生型マウス（左）、Ｔｍｃ１－／－マウス（中間）およびＡｎｃ８０ Ｔｍｃ１を注入したＴｍｃ１－／－マウス（右）のＩＨＣから記録した感覚変換電流の代表的な群を示す画像である。注入の８日後に蝸牛を採取した。 図３１Ｂは、図３１Ａに示すマウスの回復率のグラフ表示である。図３１Ｂ中のグラフは、野生型マウス（左）、Ｔｍｃ１－／－マウス（中間）およびＡｎｃ８０ Ｔｍｃ１を注入したＴｍｃ１－／－マウス（右）における機能的細胞のパーセンテージを示す。 図３２は、歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）閾値を、野生型、Ｔｍｃ１－／－マウスおよびＡｎｃ８０ Ｔｍｃ１を注入したＴｍｃ１－／－マウスについての刺激周波数の関数として示すグラフである。
成体哺乳動物蝸牛の感覚細胞は自己修復能力を欠くため、（障害のレベルおよび正確な
位置に依存する）現行の治療ストラテジーは、聴覚神経を形成し、音響情報を中継して脳
へ伝える一次感覚有毛細胞またはらせん神経節ニューロンの永久的損傷を補償するために
、増幅（補聴器）、音のより良い伝達（中耳プロステーシス／能動型インプラント）また
は直接的な神経刺激（蝸牛移植片）に依存する。これらのアプローチは変革的なものであ
った一方、現代生活にとって重要な複雑なヒトの聴覚機能を回復させるために最適なもの
からは遠いままであった。特に、主要な問題は、限定された周波数感度、不自然な音知覚
、およびうるさい環境での限定された語音弁別をなお含む。
蝸牛への治療的遺伝子導入は、加齢性および環境誘発の聴覚喪失から遺伝型の難聴にわ
たる現行の標準的治療にさらなる改善を加えると考えられてきた。３００超の遺伝子座が
、記載された７０を超える原因遺伝子による遺伝性の聴覚喪失と関係があるとされてきた
（Parker & Bitner-Glindzicz, 2015, Arch. Dis. Childhood, 100:271-8）。これらのア
プローチにおける治療の成功は、蝸牛のコルチ器官（ＯＣ）中の関連する治療標的細胞へ
の外来遺伝子構築物の安全で効率的な送達に大いに依存する。
ＯＣは、２つの種類の感覚有毛細胞：音によって運ばれた機械的情報を、神経構造に伝
達される電気シグナルに変換するＩＨＣおよび複雑な聴覚機能に必要とされるプロセスで
ある、蝸牛反応を増幅し、調整する役割を果たすＯＨＣを含む。内耳中の他の潜在的な標
的としては、らせん神経節ニューロン、らせん板縁の円柱細胞が挙げられ、これらは、保
護機能を有し、早期の新生児期までに有毛細胞への分化転換を誘発されうる、隣接する蓋
膜または支持細胞の維持に重要である。
高カリウム内リンパ液で満たされた蝸牛管への注入は、有毛細胞への直接アクセスを提
供しうる。しかしながら、このデリケートな流体環境の変化は、蝸牛内電位を乱し、注入
関連毒性のリスクを高める可能性がある。蝸牛管、鼓室階および前庭階を取り巻く外リン
パで満たされた空間は、前庭窓膜または蝸牛窓膜（ＲＷＭ）のいずれかを通って中耳から
アクセス可能である。内耳への唯一の非骨質開口部であるＲＷＭは、多くの動物モデルに
おいて比較的容易にアクセスでき、この経路を使用するウイルスベクターの投与は、よく
忍容されている。ヒトにおいて、蝸牛移植片の設置は、ＲＷＮを通る手術用電極の挿入に
日常的に依存する。
器官型蝸牛外移植片およびインビボの内耳注入においてＡＡＶ血清型を評価する先の研
究は、遺伝性難聴のマウスモデルで聴覚の部分的なレスキューのみをもたらした。予想外
に、祖先ＡＡＶカプシドタンパク質を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）は高効率で
ＯＨＣに形質導入する。この知見は、従来のＡＡＶ血清型を使用する蝸牛遺伝子治療の開
発の成功を限定してきた、低い導入率を克服する。本明細書に記載の祖先ＡＡＶカプシド
タンパク質を含有するＡＡＶは、ＩＨＣおよびＯＨＣだけでなく、遺伝性の聴覚および平
衡障害によって損なわれた多くの他の内耳細胞型への内耳遺伝子送達のための価値あるプ
ラットフォームを提供する。高い導入率を提供することに加えて、本明細書に記載の祖先
ＡＡＶカプシドタンパク質を含有するＡＡＶは、全身注射に際してマウスおよび非ヒト霊
長類において類似した安全性プロフィールを有し、循環中のＡＡＶとは抗原性が異なり、
従来のＡＡＶベクターの有効性を制限する既存の免疫に関して潜在的な利益を提供するこ
とが示された。
しかしながら、細胞、特に内耳、例えば、蝸牛内の細胞（または蝸牛の細胞もしくは蝸
牛細胞）への核酸の高効率の送達を可能とする組成物および方法が本明細書に記載される
。本明細書中で使用されるとき、内耳細胞は、非限定的に、内有毛細胞（ＩＨＣ）、外有
毛細胞（ＯＨＣ）、らせん神経節ニューロン、前庭有毛細胞、前庭神経節ニューロン、支
持細胞および血管条中の細胞をさす。支持細胞は、興奮性でない耳の中の細胞、例えば、
有毛細胞またはニューロンでない細胞をさす。支持細胞の例はシュワン細胞である。
本明細書に記載の１つまたは複数の核酸の内耳細胞への送達は、典型的に、部分的な聴
覚喪失または完全な難聴により定義される、任意の数の遺伝性または後天性聴覚障害を治
療するために使用可能である。本明細書に記載の方法は、非限定的に、劣性難聴、優性難
聴、アッシャー症候群および他の症候群性難聴だけでなく、外傷または加齢による聴覚喪
失のような聴覚障害を治療するために使用されうる。
特定の導入遺伝子を保有するウイルスを作製する方法
本明細書に記載される通り、祖先ＡＡＶカプシドタンパク質を含有するアデノ随伴ウイ
ルス（ＡＡＶ）は、内耳細胞へ核酸（例えば、導入遺伝子）を送達することにおいて特に
効率的であり、特に有効な種類の祖先ＡＡＶカプシドタンパク質が、Ａｎｃ８０と名付け
られた祖先足場カプシドタンパク質により表され、配列番号１に示される。Ａｎｃ８０祖
先カプシドタンパク質の種類に属する１つの具体的な祖先カプシドタンパク質は、Ａｎｃ
８０－００６５（配列番号２）であるが、国際公開第２０１５／０５４６５３号パンフレ
ットは、Ａｎｃ８０祖先カプシドタンパク質の種類に属する多くのさらなる祖先カプシド
タンパク質を記載している。
Ａｎｃ８０カプシドタンパク質を含有する、本明細書に記載のウイルスは、様々な核酸
を内耳細胞に送達するために使用されうる。発現の目的のために細胞に送達される核酸配
列は、しばしば導入遺伝子と呼ばれる。内耳細胞に送達され、そこで発現しうる代表的な
導入遺伝子としては、非限定的に、神経栄養因子（例えば、グリア細胞株由来神経栄養因
子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ノイロトロピン－３（ＮＴ３）、も
しくは熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）－７０）、免疫調節タンパク質または抗発癌性転
写物をコードする導入遺伝子が挙げられる。加えて、内耳細胞に送達され、そこで発現し
うる代表的な導入遺伝子としては、非制限的に、抗体もしくはその断片、アンチセンス、
サイレンシングもしくは長鎖非コードＲＮＡ種、またはゲノム編集システム（例えば、遺
伝子改変ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（
ＴＡＬＥＮ）、もしくはクラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ））を
コードする導入遺伝子が挙げられる。さらに、内耳細胞に送達され、そこで発現しうる代
表的な導入遺伝子としては、ＡＣＴＧ１、ＡＤＣＹ１、ＡＴＯＨＩ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ１、
ＢＤＮＦ、ＢＤＰ１、ＢＳＮＤ、ＤＡＴＳＰＥＲ２、ＣＡＢＰ２、ＣＤ１６４、ＣＤＣ１
４Ａ、ＣＤＨ２３、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＨＤ７、ＣＣＤＣ５０、ＣＩＢ２、ＣＬＤＮ１
４、ＣＬＩＣ５、ＣＬＰＰ、ＣＬＲＮ１、ＣＯＣＨ、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯ
Ｌ４Ａ４、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ
２、ＣＲＹＭ、ＤＣＤＣ２、ＤＦＮＡ５、ＤＦＮＢ３１、ＤＦＮＢ５９、ＤＩＡＰＨ１、
ＥＤＮ３、ＥＤＮＲＢ、ＥＬＭＯＤ３、ＥＭＯＤ３、ＥＰＳ８、ＥＰＳ８Ｌ２、ＥＳＰＮ
、ＥＳＲＲＢ、ＥＹＡ１、ＥＹＡ４、ＦＡＭ６５Ｂ、ＦＯＸＩ１、ＧＩＰＣ３、ＧＪＢ２
、ＧＪＢ３、ＧＪＢ６、ＧＰＲ９８、ＧＲＨＬ２、ＧＰＳＭ２、ＧＲＸＣＲ１、ＧＲＸＣ
Ｒ２、ＨＡＲＳ２、ＨＧＦ、ＨＯＭＥＲ２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＩＬＤＲ１、ＫＡＲＳ、Ｋ
ＣＮＥ１、ＫＣＮＪ１０、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ４、ＫＩＴＬＧ、ＬＡＲＳ２、ＬＨＦＰ
Ｌ５、ＬＯＸＨＤ１、ＬＲＴＯＭＴ、ＭＡＲＶＥＬＤ２、ＭＣＭ２、ＭＥＴ、ＭＩＲ１８
３、ＭＩＲＮ９６、ＭＩＴＦ、ＭＳＲＢ３、ＭＴ－ＲＮＲ１、ＭＴ－ＴＳ１、ＭＹＨ１４
、ＭＹＨ９、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ１Ａ、ＭＹＯ３Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ７Ａ、ＮＡＲＳ
２、ＮＤＰ、ＮＦ２、ＮＴ３、ＯＳＢＰＬ２、ＯＴＯＡ、ＯＴＯＦ、ＯＴＯＧ、ＯＴＯＧ
Ｌ、Ｐ２ＲＸ２、ＰＡＸ３、ＰＣＤＨ１５、ＰＤＺＤ７、ＰＪＶＫ、ＰＮＰＴ１、ＰＯＬ
Ｒ１Ｄ、ＰＯＬＲ１Ｃ、ＰＯＵ３Ｆ４、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＲＰＳ１、ＰＴＰＲＱ、ＲＤＸ
、Ｓ１ＰＲ２、ＳＡＮＳ、ＳＥＭＡ３Ｅ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＳＬＣ１７Ａ８、ＳＬＣ２
２Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ５、ＳＩＸ１、ＳＩＸ５、ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬ
Ｏ、ＳＮＡＩ２、ＳＯＸ１０、ＳＴＲＣ、ＳＹＮＥ４、ＴＢＣ１Ｄ２４、ＴＣＯＦ１、Ｔ
ＥＣＴＡ、ＴＩＭＭ８Ａ、ＴＪＰ２、ＴＮＣ、ＴＭＣ１、ＴＭＣ２、ＴＭＩＥ、ＴＭＥＭ
１３２Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＲＰＮ、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＳＰＥＡＲ、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳ
Ｈ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ、ＵＳＨ２Ｄ、ＶＬＧＲ１、ＷＦＳ１、ＷＨＲＮ、およびＸＩＡＰと
名付けられた核酸が挙げられる。本明細書において使用される命名法の説明および定義は
、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂのｈｅｒｅｄｉｔａｒｙｈｅａｒｉｎｇｌｏｓｓ．ｏｒ
ｇ／において見出されうる。
導入遺伝子の発現は、導入遺伝子の自然のプロモーター（すなわち、導入遺伝子のコー
ド配列とともに天然に見出されるプロモーター）により指令されるか、または導入遺伝子
の発現は、異種プロモーターにより指示されてもよい。例えば、本明細書に記載のいずれ
の導入遺伝子もその自然のプロモーターとともに使用されうる。代替的に、本明細書に記
載のいずれの導入遺伝子も異種プロモーターとともに使用されうる。本明細書中で使用さ
れるとき、異種プロモーターは、その配列の発現を自然に指令しない（すはわち、自然に
おいてその配列とともに見出されない）プロモーターをさす。本明細書に示されるいずれ
かの導入遺伝子の発現を指令するために使用されうる代表的な異種プロモーターとしては
、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、トリベータアクチン（ＣＢＡ
）プロモーター、合成ＣＡＳＩプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プ
ロモーター、および伸長因子（ＥＦ）－１プロモーター、アルファ９ニコチン性受容体プ
ロモーター、プレスチンプロモーター、成長因子非依存性（ＧＦＩ１）プロモーター、お
よび小胞グルタミン酸トランスポーター３（ＶＧＬＵＴ３）プロモーターが挙げられる。
加えて、上記導入遺伝子のうちの１つの発現を自然に指令するプロモーター（例えば、Ｋ
ＣＮＱ４プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、Ｍｙｏ６プロモーターまたはＡＴＯＨ
１プロモーター）は、導入遺伝子の発現を指令するための異種プロモーターとして使用さ
れうる。
Ａｎｃ８０カプシドタンパク質を含有するウイルス中へパッケージングするための導入
遺伝子を作製する方法は、当分野で知られており、従来の分子生物学および組換え核酸技
術を利用する。一実施形態において、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質をコードする核酸配
列を含む構築物および好適な逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接した導入遺伝子を保有す
る構築物が提供され、これは、導入遺伝子がＡｎｃ８０カプシドタンパク質内にパッケー
ジングされることを可能とする。
導入遺伝子は、例えば、パッケージング宿主細胞を使用して、Ａｎｃ８０カプシドタン
パク質を含有するＡＡＶ中にパッケージングされうる。ウイルス粒子の構成要素（例えば
、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、逆位末端反復（ＩＴＲ）配列）が、本明細書に記載の１つま
たは複数の構築物を使用して、一過性にまたは安定的にパッケージング宿主細胞に導入さ
れうる。本明細書に記載のウイルスは、少なくともＡｎｃ８０カプシドタンパク質を含有
し；ウイルス粒子の他の構成要素（たとえば、ｒｅｐ配列、ＩＴＲ配列）は、祖先配列ま
たは現代の配列に基づくことができる。一部の場合において、例えば、ウイルス粒子全体
が祖先配列に基づくことができる。そのようなウイルスは、日常的な方法を使用して精製
されうる。
１つまたは１つを超える導入遺伝子が内耳に送達されうることが理解されうる。Ａｎｃ
８０カプシドタンパク質を含む単一のＡＡＶベクターを使用して、またはＡｎｃ８０カプ
シドタンパク質を含む複数のＡＡＶベクターを使用して、１を超える導入遺伝子が内耳に
送達されうることも理解されうる。
一般に、本明細書中で使用されるとき、「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むことが
でき、１つまたは複数のヌクレオチド類似体または骨格改変を含有する核酸も含むことが
できる。核酸は、一本鎖または二本鎖であることができ、これは、通常その意図される用
途に依存する。本明細書に記載の方法において使用可能な核酸は、知られた核酸配列と同
一であることができるかまたは本明細書に記載の方法において使用可能な核酸は、そのよ
うな知られた配列とは配列が異なることができる。単に例として、核酸（またはコードさ
れるポリペプチド）は、知られた配列に対して少なくとも７５％の配列同一性（例えば、
少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％
、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％
、または９９％の配列同一性）を有することができる。
配列同一性パーセントを計算することにおいて、２つの配列がアラインされ、２つの配
列間のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の完全な一致の数が決定される。完全な一致の数
が、アラインされた領域の長さ（すなわち、アラインされたヌクレオチドまたはアミノ酸
残基の数）で割られ、１００をかけると、配列同一性パーセント値となる。アラインされ
た領域の長さが、一方または両方の配列の一部から最短の配列の完全長サイズまでである
ことができるのは理解される。単一の配列が、１つを超える他の配列とアラインすること
ができ、したがって、アラインされた各領域にわたって、異なる配列同一性パーセント値
を有しうることも理解される。
配列同一性パーセントを決定するための２つ以上の配列のアラインメントは、コンピュ
ータプログラムＣｌｕｓｔａｌＷおよびデフォルトパラメータを使用して実施され、これ
は核酸またはポリペプチド配列のアラインメントが、その長さ全体にわたって実行される
ことを可能とする（グローバルアラインメント）。Chenna et al., 2003, Nucleic Acids
Res., 31(13):3497-500。ＣｌｕｓｔａｌＷは、クエリと１つまたは複数の対象配列との
間のベストマッチを計算し、同一性、類似性および相違が決定されるように、これらをア
ラインする。配列アラインメントを最大化するために、１つまたは複数の残基のギャップ
がクエリ配列、対象配列またはその両方に挿入されうる。核酸配列のペアワイズアライン
メントのためには、デフォルトパラメータが使用され（すなわち、ワードサイズ：２；ウ
ィンドウサイズ：４；スコアリング法：パーセンテージ；トップダイアゴナルの数：４；
およびギャップペナルティー：５）；多重核酸配列のアラインメントのためには、以下の
パラメータが使用される：ギャップ開始ペナルティー：１０．０；ギャップ伸長ペナルテ
ィー：５．０；およびウエイトトランジッション：あり。ポリペプチド配列のペアワイズ
アラインメントのためには、以下のパラメータが使用される：ワードサイズ：１；ウィン
ドウサイズ：５；スコアリング法：パーセンテージ；トップダイアゴナルの数：５および
ギャップペナルティー：３。ポリペプチド配列の多重アラインメントのためには、以下の
パラメータが使用される：ウエイトマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ（置換マトリックスをブ
ロック（blocks substitution matrix））；ギャップ開始ペナルティー：１０．０；ギャ
ップ伸長ペナルティー：０．０５；親水性ギャップ：オン、疎水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；ならびに残基特異
的なギャップペナルティー：オン。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌ
ｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓｅａｒｃｈ Ｌａｕｎｃｈｅｒウエブサイトまた
はＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ ＷｅｂのＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅウエブサイトにおいて実行されうる。
核酸配列に変化が導入可能であり、これは、その核酸配列がコード配列である場合には
、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらしうる。変化は、例えば、突
然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ介在性突然変異誘発）を使用して
またはそのような変化を有する核酸分子を化学合成することにより、核酸コード配列に導
入されうる。そのような核酸の変化は、１つまたは複数のアミノ酸残基における保存的お
よび／または非保存的アミノ酸置換に導きうる。「保存的アミノ酸置換」は、１のアミノ
酸残基が、類似する側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置換されるもの（例えば、アミノ
酸置換についての度数分布表を提供する、Ｄａｙｈｏｆｆら（1978, Atlas of Protein S
equence and Structure, 5（Suppl. 3）:345-352）を参照されたい）であり、非保存的置
換は、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有さないアミノ酸残基で置換されるものである。
核酸は、ベクターまたはプラスミドとも呼ばれうる構築物内に含有されうる。構築物は
、市販されているかまたは当分野において日常的な組換え技術により生成されうる。核酸
を含有する構築物は、そのような核酸の発現を指令および／または制御する発現エレメン
トを含むことができ、構築物を維持するための配列（例えば、複製の起点、選択マーカー
）のような配列を含むこともできる。発現エレメントは、当分野において知られており、
例えば、プロモーター、イントロン、エンハンサー配列、応答性エレメントまたは誘導性
エレメントを含む。
核酸を内耳細胞に送達する方法
核酸を細胞に送達する方法は、一般に、当分野において知られており、導入遺伝子を含
有する（ウイルス粒子とも呼ばれうる）ウイルスをインビボで内耳細胞に送達する方法は
本明細書に記載されている。本明細書に記載される通り、約１０８～約１０１２個のウイ
ルス粒子を対象に投与することができ、ウイルスは好適な体積（例えば、１０μＬ、５０
μＬ、１００μＬ、５００μＬ、または１０００μＬ）の、例えば、人工の外リンパ液に
懸濁されうる。
本明細書に記載の導入遺伝子を含有するウイルスは、任意の数のメカニズムを使用して
内耳細胞（例えば、蝸牛中の細胞）に送達されうる。例えば、本明細書に記載の１つまた
は複数の異なるタイプの導入遺伝子を含有するウイルス粒子を含む組成物の治療有効量が
、蝸牛窓または前庭窓を通して、典型的には比較的単純な（例えば、外来患者）手順で注
入されうる。一部の実施形態において、本明細書に記載の導入遺伝子を含有するかまたは
異なるウイルス粒子の１つまたは複数の組を含有するウイルス粒子の治療有効数を含む組
成物であって、組の中の各粒子は同じタイプの導入遺伝子を含むことができるが、粒子の
各組は他の組とは異なるタイプの導入遺伝子を含む、組成物が、手術（例えば、蝸牛開窓
術またはカナロストミー）の間に耳の中の適切な位置に送達されうる。
加えて、鼓膜を横切りかつ／または蝸牛窓を通る薬剤の移動を促進する送達ビヒクル（
例えば、ポリマー）が利用可能であり、任意のそのような送達ビヒクルが、本明細書に記
載のウイルスを送達するために使用されうる。例えば、Arnold et al., 2005, Audiol. N
eurootol., 10:53-63を参照されたい。
本明細書に記載の組成物および方法は、内耳細胞、例えば、蝸牛細胞への核酸の高効率
の送達を可能とする。例えば、本明細書に記載の組成物および方法は、導入遺伝子の、内
有毛細胞の少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４
、９５、９６、９７、９８または９９％）への送達および発現を可能とするかまたは外有
毛細胞の少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、
９５、９６、９７、９８または９９％）への送達およびそこにおける発現を可能とする。
本明細書において実証される通り、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質を含有するＡＡＶを
使用して送達された導入遺伝子の発現は、聴覚または前庭機能が延長された期間（例えば
、数カ月間、数年間、数十年間、一生涯）回復させられるように、内有毛細胞（ＩＨＣ）
、外有毛細胞（ＯＨＣ）、らせん神経節ニューロン、血管条、前庭有毛細胞、および／ま
たは前庭神経節ニューロン（例えば、Ａｔｏｈ１、ＮＦ２）の再生をもたらしうる。
国際公開第２０１５／０５４６５３号パンフレットに記載された通り、Ａｎｃ８０カプ
シドタンパク質を含有するＡＡＶは、その血清有病率および／または従来のＡＡＶ（すな
わち、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質を含有しないＡＡＶ）と比較してそれが中和される
程度に特徴を有しうる。当分野において血清有病率は、血清反応陽性の（すなわち、特定
の病原体または免疫原に曝露されてきた）集団における対象の割合をさすと理解され、特
別な病原体または免疫原に対して抗体を産生する集団における対象の数を、検査した集団
中の個体の総数で割ったものとして計算される。ウイルスの血清有病率を決定することは
、当分野において日常的に実施され、個体の特別な集団由来の試料（例えば、血液試料）
中の１つまたは複数の抗体の蔓延を決定するためには、典型的にイムノアッセイを使用す
ることを含む。加えて、血清試料中の中和抗体の程度を決定するための数種の方法が利用
可能である。例えば、中和抗体アッセイは、抗体を含まない対照試料に比較して５０％以
上感染を中和する抗体濃度を実験試料が含有する、力価を測定する。Ｆｉｓｈｅｒら（19
97, Nature Med., 3:306-12）およびＭａｎｎｉｎｇら（1998, Human Gene Ther., 9:477
-85）も参照されたい。代表的な従来のＡＡＶとしては、非限定的に、ＡＡＶ８（または
ＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むウイルス）および／またはＡＡＶ２（またはＡＡＶ２
カプシドタンパク質を含むウイルス）が挙げられる。
アッシャー症候群
ヒトアッシャー症候群（ＵＳＨ）は、合併した難聴と失明の原因となる稀な遺伝子疾患
である。これは常染色体劣性形質として遺伝し、米国において１６，０００～２０，００
０人を冒し、３～６％の幼児期難聴の原因となる。アッシャー症候群は、症状の重症度に
より３つの臨床亜型（ＵＳＨ－１、－２および－３）に分類される。ＵＳＨ１は、最も重
症型である。ＵＳＨ１に冒された患者は、先天性の両側性重度感音性難聴、前庭反射消失
および思春期前の網膜色素変性症（進行性の網膜の桿体および錐体機能の両側性対称性変
性）を患う。蝸牛移植片を装着されない限り、個体は典型的に発声する能力を発達させな
い。現在、アッシャー患者のための生物学的治療法は存在しないが、欠陥遺伝子の野生型
形態の早期再導入は疾患の回復を可能としうる。
６つのアッシャー遺伝子：ＭＹＯ７Ａ（ｍｙｏｓｉｎ ７ａ）、ＵＳＨ１Ｃ（ｈａｒｍ
ｏｎｉｎ）、ＣＤＨ２３（ｃａｄｈｅｒｉｎ ２３）、ＰＣＤＨ１５（ｐｒｏｔｏｃａｄ
ｈｅｒｉｎ １５）、ＳＡＮＳ（ｓａｎｓ）およびＣＩＢ２（ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｄ
ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ２）がＵＳＨ１と関連する。これら
の遺伝子は、内耳中の毛束の形態形成に関与し、インタラクトームの一部であるタンパク
質をコードする（例えば、Mathur & Yang, 2015, Biochim. Biophys. Acta, 1852:406-20
を参照されたい）。ｈａｒｍｏｎｉｎは、それが他のＵｓｈｅｒ１タンパク質に結合する
、ＵＳＨ１インタラクトームの中心に存在する。そのＰＤＺ（ＰＳＤ－５９ ９５／Ｄｌ
ｇ／ＺＯ－１）相互作用ドメインのために、ｈａｒｍｏｎｉｎは、足場タンパク質として
機能することが提案されてきた。インビトロの結合研究は、すべての他の知られたＵＳＨ
１タンパク質が、ＵＳＨ２タンパク質のうちの２つであるｕｓｈｅｒｉｎおよびＶＬＧＲ
１と同様にｈａｒｍｏｎｉｎのＰＤＺドメインに結合することを示した。ＵＳＨ１Ｃ遺伝
子は、タンパク質のドメイン組成に依存して３つの異なるサブクラス（ａ、ｂおよびｃ）
に分類される、ｈａｒｍｏｎｉｎの１０種のオルタナティブスプライス型をコードする、
２８のエクソンからなる。３つのアイソフォームは、ＰＤＺタンパク質－タンパク質相互
作用ドメイン、コイルドコイル（ＣＣ）ドメインおよびプロリン－セリン－スレオニン（
ＰＳＴ）リッチドメインの数が異なる。
ＵＳＨ１タンパク質は、多数の細胞外連結によって相互接続された何百もの不動毛から
構成される機械感覚性毛束中の有毛細胞の頂端に局在化している。Ｕｓｈｅｒ遺伝子（そ
れぞれ、ＵＳＨ１ＤおよびＵＳＨ１Ｅ）の産物であるカドヘリン２３およびプロトカドヘ
リン１５は、不動毛の遠位末端に位置する感覚糸（tip-link）を形成する。ｈａｒｍｏｎ
ｉｎ－ｂは、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、Ｆ－アクチンおよびそれ自身に結合する。有毛
細胞の感覚糸挿入点近くの不動毛の先端において認められ、そこで有毛細胞における伝達
と順応に機能的役割を演じると考えられている。ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂは、出生後の早い
段階で発現するが、その発現は、蝸牛および前庭の両方において出生後３０日（Ｐ３０）
近辺で消失する。ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａも、カドヘリン２３にも結合し、不動毛に認めら
れる。最近の報告は、シナプスにおけるｈａｒｍｏｎｉｎ－ａのさらなる役割を明らかに
し、そこにおいて、ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａはＣａｖ１．３ Ｃａ２＋チャネルと結合して
、ユビキチン依存性経路によるチャネルの利用可能性を制限する。
アッシャー症候群の数種のマウスモデルが、同定されまたは過去１０年間にわたって操
作され、そのうちの７種はｈａｒｍｏｎｉｎに影響を及ぼす。これらの中で、唯一のモデ
ル、Ｕｓｈ１ｃｃ．２１６Ｇ＞Ａモデルのみが、ヒトアッシャー症候群を特徴づける聴覚
および網膜欠損の両方を再現する。Ｕｓｈ１ｃｃ．２１６Ｇ＞Ａは、フランス系アカディ
ア人ＵＳＨ１Ｃ患者のコホートにおいて認められるものに類似する点突然変異により、す
べての従来のｈａｒｍｏｎｉｎアイソフォームの発現に影響を及ぼすノックインマウスモ
デルである。突然変異は、Ｕｓｈ１ｃ遺伝子のエクソン３の末端に隠れたスプライス部位
を導入する。この隠れたスプライス部位の使用は、３５ｂｐの欠失を含むフレームシフト
した転写物を生成し、ＰＤＺ、ＰＳＴおよびＣＣドメインを欠く、著しく切断されたタン
パク質の翻訳をもたらす。ホモ接合性のＣ．２１６ＡＡノックインマウスは、１カ月齢で
重症の聴覚喪失を患うが、ヘテロ接合性のｃ．２１６ＧＡマウスはいかなる異常な表現型
も呈さない。ｃ．２１６ＡＡマウスにおける蝸牛の組織構造は、Ｐ３０における中回転お
よび基底回転の無秩序な毛束、異常な細胞の列ならびに内有毛細胞および外有毛細胞の喪
失を示す。
特に、ｈａｒｍｏｎｉｎ導入遺伝子と組み合わせた本明細書に記載の祖先ＡＡＶカプシ
ドタンパク質を使用して、有毛細胞にうまく形質導入し、ｈａｒｍｏｎｉｎスプライス型
の発現および正確な局在化を推進し、それにより野生型ｈａｒｍｏｎｉｎを再導入して、
アッシャー症候群関連の難聴、例えば、ＵＳＨ１Ｃ関連難聴と診断された患者を治療する
ことができる。さらに、出生後早期の蝸牛窓膜への本明細書に記載の祖先ＡＡＶカプシド
タンパク質を含有するＡＡＶの注入が、ホモ接合性ｃ．２１６ＡＡマウスにおいて、聴覚
および前庭機能をうまく回復させることが、本明細書において実証される。注入されたマ
ウスにおける聴覚機能の回復は、野生型ｈａｒｍｏｎｉｎをコードするｍＲＮＡの発現の
回復だけでなく、毛束形態の保存およびメカノトランスダクションと関連している。
ＴＭＣ１／ＴＭＣ２
４０超の異なる突然変異が、難聴を引き起こすＴＭＣ１において同定されている。これ
らは、３５の劣性突然変異および５の優性突然変異にさらに分割される。劣性突然変異の
ほとんどは、重度の先天性聴覚喪失をもたらす（例えば、ＤＦＮＢ７／１１）が、少数は
後発性の中程度から重度の聴覚喪失を引き起こす。すべての優性突然変異は、十代半ばに
発症する、進行性の聴覚喪失（例えば、ＤＦＮＡ３６）を引き起こす。特に、本明細書に
記載のＡｎｃ８０カプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターは、非突然変異体（例えば、
野生型）ＴＭＣ１配列またはＴＭＣ２配列を送達し、それにより聴覚喪失（例えば、さら
なる聴覚喪失）を予防しかつ／または聴覚機能を回復させるために、使用されうる。
当業者のスキルの範囲内の従来の分子生物学、微生物学、生化学および組換えＤＮＡ技
術が、本開示に従って使用されうる。そのような技術は、文献中で十分に説明されており
、以下の実施例のいくつかにおいて例証されている。本発明は、請求の範囲に記載された
方法および組成物の範囲を限定することのない、以下の例においてさらに記載される。
第１部：高効率の蝸牛遺伝子導入
実施例１
祖先ＡＡＶカプシドタンパク質を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、安全かつ効
率的な蝸牛遺伝子導入をもたらす
以下の方法および材料を実施例１において使用した。
ウイルスベクター
ＣＭＶ駆動ｅＧＦＰ導入遺伝子を含むＡＡＶ２／１、２／２、２／６、２／８、２／９
およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（
ＷＰＲＥ）カセットを、先に記載した通りに（Zinn et al., 2015, Cell Reports, 12:10
56-68）マサチューセッツ眼科耳科（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｅｙｅ ａｎｄ Ｅ
ａｒ）のＧｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ（ｖｅｃｔｏｒ．ｍｅｅ
ｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ）において調製した。ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５プラスミ
ド試薬はａｄｄｇｅｎｅ．ｃｏｍより入手可能である。
インビトロの外植片培養
両系統の仔マウスからの全部で１５６の蝸牛外植片培養を、先の刊行物（Dilwali et a
l., 2015, Scientific Reports, 5:18599）に記載された通りに評価するために出生後４
日目に調製した。すなわち、断頭後にマウス側頭骨を採取し、らせん神経節ニューロン領
域に接続された器官型外植片として培養するために、蝸牛を解剖した。蝸牛当たり２つの
検体を得て、１つ（「頂端」）は下部頂回転から、１つ（「基底」）は上部基底回転から
なる。各血清型について、最も少なくて４つ（ＣＢＡ／ＣａＪ、４８ｈ）、２つ（ＣＢＡ
／ＣａＪ、４８ｈ＋５ｄ）、３つ（Ｃ５７ＢＬ／６、４８ｈ）、２つ（Ｃ５７ＢＬ／６、
４８ｈ＋５ｄ）の基底および頂端検体を接種した。蝸牛の形態が培養中に維持されなかっ
た場合には、検体を除外した。形質導入のばらつきについての情報を与え、さらなるイン
ビボの評価のための選択の基礎を提供するために、試料の数を選択した。培地（９８％ダ
ルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１％アンピリシンおよび最初の１２時間の間の
１％Ｎ２補充、プラス１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））および１０１０ＧＣのＡＡＶととも
に外植片を４８ｈ、５０μｌ中でインキュベートした。４８ｈ＋５ｄの条件のためには、
追加の５日間、ＡＡＶを含む培地をＡＡＶを含まない新鮮な培地に交換した。前庭神経鞘
腫切除を受けている４人の同意を得た成人患者から得た、卵形嚢由来のヒト前庭上皮を先
に記載された通りに培養し（Kesser et al., 2007, Gene Ther., 14:1121-1131）、１０
１０ＧＣのＡＡＶに２４時間曝露し、１０日間培養中に維持し、その後、組織を固定して
ファロイジンで染色してイメージングした。試験は、参照番号１１／ＬＯ／０４７５でＳ
ｕｒｒｅｙ Ｂｏｒｄｅｒｓ ＮＲＥＳ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｌｏｎｄｏｎ （Ｈｅａ
ｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）により承認された。
動物モデルおよび一般的方法
野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＣＢＡ／ＣａＪマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手し、いずれかの性別の動物を推定５
０／５０の比率で実験に使用した。インビトロおよびインビボの形質導入アッセイならび
に後続のエンドポイントのための実験当たりの群サイズは、検体へのアクセスおよび技術
的実行可能性により決定した。Ａｎｃ８０形質導入について報告された観察を、（検体へ
のアクセスの独特で制限された性質のため、ヒト前庭組織形質導入を除き）様々なベクタ
ーロットを使用する後続の実験において定性的に確認した。検体への制限されたアクセス
および報告された知見の定性的性質のため、血清型の間の形質導入効率の統計学的分析は
実施しなかった。
ＣＳＦおよび血液のサンプリング
大槽からの脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプリング（Lui & Duff, 2008, J. Visualized Exp.
, 21:e960）および開胸による心臓内血液採取を最終手順において実施した。ミクロキャ
ピラリー管を通じて、動物当たり最大量（５μＬ以下）の清澄なＣＳＦを、体積６０μＬ
のＰＢＳ中に採取し、これは、わずかに異なる開始希釈液をもたらし、その後実験開始前
にさらなる対照ＰＢＳにより標準化した。１．１ｍＬのＺ－Ｇｅｌマイクロ管（Ｓａｒｓ
ｔｅｄｔ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に血液試料を得た後、これを８，０
００ｒｐｍで８分間、沈降させ、血清を（ＰＢＳ中の）ＣＳＦ試料とともに、さらなる使
用まで－８０℃で保管した。
実施例１Ａ－組織学的分析
５～２９日間のフォローアップ期間の後、動物を屠殺し、蝸牛の全組織標本を先に報告
された通りに調製した（Sergeyenko et al., 2013, J. Neurosci., 33:13686-94）。蝸牛
全組織標本および外植片の両方を、対応する二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５
抗マウス抗体およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗ウサギ抗体、＃Ａ－２１４２２お
よび＃Ａ－２１２４５ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌ
ｔｈａｍ， ＭＡ、１：１０００）とともにミオシン７Ａ（Ｍｙｏ７Ａ、＃２５－６７９
０ Ｐｒｏｔｅｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｒａｍｏｎａ， ＣＡ、１：４００）
およびベータ－チューブリン（ＴｕＪ１、＃ＭＭＳ－４３５Ｐ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ、１：２００）に対する抗体で染色した（Dilwali et al.,
2015, Scientific Reports, 5:18599）。検体をマウントし、その後共焦点顕微鏡法を行
った。所与の一連の実験の各画像を、同じ設定で、蛍光の飽和を防ぐために最も強いｅＧ
ＦＰシグナルを有する検体に基づいて選択したレーザー強度を使用して得た。コルチ器官
およびらせん神経節ニューロン（ＳＧＮ）域のために概観画像およびズームイン写真につ
いてＺスタックを得た。ＡＭＩＲＡによる３Ｄ再構成を、ＳＧＮトランスフェクションを
より正確に決定するために使用した。
図１および図４の結果は、Ｃ５７ＢＬ／６およびＣＢＡ／ＣａＪにおいてｅＧＦＰをそ
れぞれコードするＡＡＶの発現によりモニターした、５つの血清型のトロピズムを図示す
る。特に、ｅＧＦＰ発現は、Ａｎｃ８０に曝露した蝸牛培養において定性的により明るく
、多くの蝸牛細胞型において発現が明白であった。
実施例１Ｂ－ｅＧＦＰ発現の定量化
インビトロのデータのために、各検体について基底および頂端試料当たり１または２の
１００μｍ切片当たりの外有毛細胞または内有毛細胞の総数でｅＧＦＰ陽性細胞の数を割
ることによって、ｅＧＦＰ陽性の内有毛細胞（ＩＨＣ）および外有毛細胞（ＯＨＣ）のパ
ーセンテージを蝸牛に沿って手動で定量化した。蝸牛外移植片中のすべての目に見えるＳ
ＧＮをそれらのｅＧＦＰ発現に関して評価した。らせん板縁および支持細胞の面積を、（
上で説明した通り、各一連の実験に応じて調整した）定性的アプローチにより、０（発現
なし）から３（最強のシグナル）のスケールで評価した。自己蛍光を除外するためにＡＡ
Ｖを含まない対照サンプルを使用した。データは、試験した両マウス系統で、頂端および
基底において６０から１００％の間の効率でＡｎｃ８０がＩＨＣおよびＯＨＣを標的化し
たことを実証した。Ａｎｃ８０は、ＡＡＶ２に比較して、ＩＨＣおよびＯＨＣにおいて一
貫してかつ定性的により明るいｅＧＦＰ発現を示した（図１および図４）。
２日目の（早期）時点における発現の過小評価をもたらしうる、異なるＡＡＶの間の発
現開始における潜在的な相違を調整するために、より長期の実験を行った。新たな蝸牛の
組に同一の条件で形質導入したが、ＡＡＶとの４８ｈのインキュベーション後に外植片培
養のベクターを含有する培地を除去し、新しい培地に交換して、さらに５日間、培養を生
存可能に維持した（４８ｈ＋５ｄと称する）。類似の発現パターンを、この長期試験にお
いてＡＡＶ２およびＡｎｃ８０について観察した。ＣＢＡ／ＣａＪマウスでは、特に基底
回転において（図１Ｊ、１Ｋおよび図４Ｉ、４Ｊ）、ＡＡＶ６、８および９について発現
の中程度の増加に注目した。他の細胞型は、すべての血清型により標的化され、支持細胞
よりも縁がより許容的であり、それに続いてＳＧＮであった（図５、６および７）。より
明るいｅＧＦＰ蛍光により証明された通り、Ａｎｃ８０形質導入は、一貫してより高い効
率およびより強い発現を生じさせた。
実施例１Ｃ－インビボの注入
仔マウス（Ｐ０～Ｐ２）に、斜角研磨したガラスマイクロインジェクションピペットを
使用して、蝸牛窓膜（ＲＷＭ）を介して注入した。Ｐ－２０００ピペットプラー（Ｓｕｔ
ｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）においてキャピラリーガラス（Ｗ
ＰＩ）からピペットを引き、マイクロピペットベベラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を使用して斜角研磨した（２８°の角度で、～２０μｍの
先端径）。手術部位（左乳様突起）を覆うために滅菌スワブを使用する鎮痛のために、Ｅ
ＭＬＡクリーム（リドカイン２．５％およびプリロカイン２．５％）を外部に塗布した。
術前は３８℃のウォームパッド上で体温を維持した。意識喪失するまで、２～３分間、氷
／水中で急速な体温低下を誘導することによって仔を麻酔し、手術中、５～１０分間、冷
却プラットフォーム上でこの状態を維持した。べタジンでごしごし擦り、７０％エタノー
ルで拭くことを３回繰り返して、手術部位を消毒した。耳後部の切開を行って透明な耳嚢
を露出させ、嚢および覆っている筋膜を通してマイクロピペットを手動ですすめ、マイク
ロピペットの先端によりＲＷＭを穿通した。およそ１μＬのウイルスを、片側性に１分以
内で５頭の（ＡＡＶ１）、４頭の（ＡＡＶ２）、２頭の（ＡＡＶ８）、１頭の（ＡＡＶ６
）、３頭の（Ａｎｃ８０）Ｃ５７ＢＬ／６動物の左耳に手動で注入した。質および純度の
ような特定のベクター調製物に関する因子を調整するために、本明細書に提示する本発明
者らの定性的知見を確認するための独立した調製物由来の異なるベクターロットを使用す
る後続の試験においてＡｎｃ８０の結果を確認した（データは示さない）。非盲検様式で
群ごとに注入を実施した。時折、注射針の挿入は深すぎ、浅すぎまたは誤った角度で行わ
れた。中耳または内耳構造に目に見える損傷があった場合には、試料をさらなる分析から
除外した。注入の成功率は、注入する人の経験レベル次第で、～５０％から～８０％の間
で変動した。注入後、６－０の黒色モノフィラメント縫合糸（Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｓｐｅ
ｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｗｙｏｍｉｓｓｉｎｇ，ＰＡ）を使用して皮膚切開を閉じた。その後
、仔を３８℃のウォーミングパッドに５～１０分間戻し、次いで、飼育のためにそれらの
母親に戻した。
先の報告と一致して、ＡＡＶ１は中程度から高度の効率でＩＨＣに形質導入した（図２
Ａ、２Ｂ）。これらの研究は、ＡＡＶ２、６および８が少数のＩＨＣを標的化し、ＡＡＶ
８のみが頂端および基底においておおよそ同等の形質導入を実証していることを示してい
る（図２Ｂ）。また、先の報告と一致して、試験した従来のＡＡＶ血清型のすべてについ
てＯＨＣ形質導入は最小限であった（＜５％）。しかしながら、Ａｎｃ８０は、２０倍（
ＡＡＶ１について）～３倍（ＡＡＶ２について）低い用量で、ほぼ１００％のＩＨＣおよ
び～９０％のＯＨＣ（図２Ａ～２Ｃ）に形質導入した。落射蛍光顕微鏡法による生細胞イ
メージングにより観察した通り、すべての血清型について１．３６×１０１２ＧＣの等用
量における形質導入は、Ａｎｃ８０については実質的なＩＨＣおよびＯＨＣの形質導入を
もたらしたが、ＡＡＶ１、２および８ではＩＨＣの標的化は最小限であり、ＯＨＣでは認
められなかった（図８Ｃ、８Ｄ）。
続いて、Ａｎｃ８０で形質導入した試料を固定し、染色し、共焦点顕微鏡法によりイメ
ージングし、有毛細胞形質導入の用量依存性を明らかにした（図８Ｅ）。比類のないＯＨ
Ｃ標的化（図２Ｃ、図８）は、他のＡＡＶに比較して質的にはっきりと異なるＡｎｃ８０
による形質導入の生物学を例証している。同様のレベルのＡｎｃ８０による形質導入を、
Ａｎｃ８０を注入した全３頭のマウスの基底から頂端までの蝸牛全体において認めた（図
２Ａ、Ｂ、Ｃ）。蝸牛頂端の低倍率写真（図８Ａ）は、注入部位から遠くで強力なｅＧＦ
Ｐ発現を示した。基底の高倍率画像は、１００％のＩＨＣおよび９５％のＯＨＣ形質導入
を明らかにしている（図８Ｂ）。
一部の動物において、注入していない対側の耳に強いｅＧＦＰ発現を認めた（図９）。
マウスにおいては、蝸牛水管は開存しており、蝸牛外リンパからＣＳＦ、対側水管および
対側蝸牛への流体通路を提供している。かくして、ＲＷＭを介して注入したＡｎｃ８０－
ｅＧＦＰが脳内のニューロンに形質導入できるかを調べた。実際に、小脳の横断面は、小
脳プルキンエニューロンにおける強いｅＧＦＰ発現を明らかにした（図１０Ａ、１０Ｂ）
。
遺伝性の難聴の一部の型は、前庭機能不全も引き起こすため、Ａｎｃ８０は、ヒト前庭
器官への遺伝子送達に有用なベクターである可能性がある。この可能性を調べるために、
前庭シュワン細胞腫の切除を受けている４人の成人患者からヒト前庭上皮を採取し；感覚
上皮を先に記載の通りに培養中に置いた（Kesser et al., 2007, Gene Ther., 14:1121-3
1）。ＡＡＶで形質導入した試料について、図３Ｃは、ヒト前庭上皮全体で両有毛細胞お
よび支持細胞における強力なｅＧＦＰ蛍光を明らかにした。図３Ｄ中のＭｙｏ７Ａで対比
染色した上皮の高倍率写真は、Ｍｙｏ７Ａ陽性有毛細胞の８３％（１９／２３）が、ｅＧ
ＦＰ陽性でもあったことを明らかにし、Ａｎｃ８０がマウスおよびヒト両方の有毛細胞に
効率的に形質導入できることを示唆している。
実施例１Ｄ－免疫学的アッセイ
ＣＳＦおよび血清中のＡｎｃ８０に対する抗体力価を、中和アッセイにより決定した（
Zinn et al., 2015, Cell Reports, 12:1056-68）。９６ウエルフォーマットを使用して
、（上記の通りに採取した）熱失活させたＣＳＦまたは血清試料を連続的に無血清培地（
Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で希釈し、次いで、Ａ
ｎｃ８０－ルシフェラーゼ（１０６ＧＣ／ウエル）で１時間、３７℃で処理した。次いで
、試料／Ａｎｃ８０－ルシフェラーゼ混合物を、前日にアデノウイルス（ＭＯＩ２０）で
処理したＨＥＫ２９３細胞に移植した。３７℃で１時間後、希釈した血清培地（１部の無
血清培地、２部の血清培地）を各ウエルに添加した。
２日後、細胞を溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で処理し、
－８０℃で３０分間凍結した。次いで、基質バッファー（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２
、ＡＴＰ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｄ－ルシ
フェリン（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）
）で処理する前に、細胞を３７℃で１５分間解凍した。Ｓｙｎｅｒｇｙ ＢｉｏＴｅｋ
Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用してルミネ
ッセンスのアウトプットを読み取った。
アッセイの感度およびサンプリングのレベルにおいて、ベクターに対する低レベルの中
和を、注入したマウスの血清中で検出することができたが、ＣＳＦでは検出できなかった
（図１０Ｃ）。
実施例１Ｅ－有毛細胞の電気生理学
蝸牛を切除し、カバーガラスに載せ、６３ｘ水浸対物レンズおよび微分干渉オプティク
スを備えたＡｘｉｏ Ｅｘａｍｉｎｅｒ．Ａ１正立顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ， Ｏ
ｂｅｒｋｏｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で眺めた。電気生理学的記録をＭＥＭ中、（ｍ
Ｍで）１３７ＮａＣｌ、５．８ＫＣｌ、１０ＨＥＰＥＳ、０．７ＮａＨ２ＰＯ４、１．３
ＣａＣｌ２、０．９ＭｇＣｌ２および５．６Ｄ－グルコース、ビタミン（１：１００）お
よびアミノ酸（１：５０）を含有する標準液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃ
ａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）（ｐＨ７．４；～３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ）中、室温（２２℃～２
４℃）で実施した。
記録用電極（３～４ＭΩ）をＲ－６ガラス（Ｋｉｎｇ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｇｌａｓ
ｓ，Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から引き出し、（ｍＭで）１４０ＣｓＣｌ、５ＥＧＴＡ
－ＫＯＨ、５ＨＥＰＥＳ、２．５Ｎａ２ＡＴＰ、３．５ＭｇＣｌ２および０．１ＣａＣｌ
２を含有する細胞内液（ｐＨ７．４；～２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ）で満たした。Ａｘｏｐａ
ｔｃｈ ２００Ｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）
を使用するメカノトランスダクション電流を記録するために、全細胞密封（whole-cell,
tight-seal）技術を使用した。有毛細胞を－８４ｍＶに維持した。ローパスＢｅｓｓｅｌ
フィルターにより５ｋＨｚで電流をフィルタリングし、１２ビットの収集ボード（Ｄｉｇ
ｉｄａｔａ １４４０Ａ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，
ＣＡ）により≧２０ｋＨｚにデジタル化し、ｐＣＬＡＭＰ１０ソフトウエア（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して記録した。
ＬＶＰＺＴ増幅器（Ｅ－５００．００、Ｐｈｙｓｉｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ，Ｋａ
ｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により駆動させたＰＩＣＭＡチップ型ピエゾアクチュ
エータ（Ｐｈｙｓｉｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ
）に搭載した堅いガラスプローブを使用してＩＨＣおよびＯＨＣ由来の毛束を偏向させ、
８－ポールＢｅｓｓｅｌフィルター（Ｍｏｄｅｌ ３３８４フィルター、Ｋｒｏｈｎ Ｈ
ｉｔｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｒｏｋｔｏｎ，ＭＡ）により４０ｋＨｚでフィルタ
リングして、残留ピペット共振を排除した。全束の記録のために有毛細胞の不動毛の列の
凹側面にフィットするように、堅いガラスプローブをデザインした（ＯＨＣ用には直径３
～４μｍ、ＩＨＣ用には直径４～５μｍ）。Ｐ１０を超える全細胞の電気生理学的記録の
ために、蝸牛組織をＰ５～７で切開し、ＭＥＭ（１Ｘ）＋１％ＦＢＳを含むＧｌｕｔａＭ
ＡＸＴＭ－１培地中、３７℃、５％ＣＯ２において３０日間以下インキュベートした。
毛束の偏りによって、Ｐ７のＯＨＣおよびＰ３５のＩＨＣから誘発された代表的な電流
は、ｅＧＦＰ陽性細胞およびｅＧＦＰ陰性対照細胞の間に、振幅、感度またはキネティク
スの相違のないことを明らかにした（図２Ｄ）。５１個のｅＧＦＰ陽性および５２個のｅ
ＧＦＰ陰性有毛細胞を、Ａｎｃ８０への曝露後、蝸牛のすべての領域および１から５週齢
の間で記録した。すべての場合において、反応は野生型から識別不可能であり（図２Ｅ）
、これは、Ａｎｃ８０による形質導入が感覚細胞機能に有害な効果を及ぼさなかったこと
を確認した。
実施例１Ｆ－聴覚試験
聴性脳幹反応（ＡＢＲ）および歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）データを、先に記載の
通りに収集した（Askew et al., 2015, Science Translational Med., 7:285ra108）。Ｄ
ＰＯＡＥは、適切な蝸牛の増幅および同調に関するアッセイであり、外有毛細胞の生存可
能性の敏感な尺度である（Guinan et al., 2012, Hearing Res., 293:12-20）。麻酔した
マウスにおいて試験した刺激は、５．６、８、１１．３、１６、２２．６および３２ＫＨ
ｚの周波数の１０から９０ｄＢの間の音圧レベルで変化した。４つのＡｎｃ８０を注入し
た耳と４つの注入しない耳および１つのｅＧＦＰ蛍光を含まない注入による損傷を伴う陰
性対照耳を、Ｐ２８～Ｐ３０で分析した。
ＡＢＲを誘発するために必要な最小限の音閾値をプロットし（図２Ｆ）、注入したおよ
び注入しない耳の間で閾値に相違のなかったことを明らかにした。組織学的解析は、４つ
の注入した耳のすべてにおいて強力なｅＧＦＰ蛍光を明らかにした（データは示さない）
。１の事例においては、ｅＧＦＰ陽性細胞はなく、ＡＢＲ閾値が上昇し（図２Ｆ）、注入
が失敗し、針が蝸牛管を破って永久的な損傷をもたらしたかもしれないことを示唆してい
る。Ａｎｃ８０－ｅＧＦＰによる強い外有毛細胞の形質導入にもかかわらず、注入しない
対照耳と比べたＤＰＯＡＥ閾値に相違を認めなかった（図２Ｇ）。よって、ＡＢＲおよび
ＤＰＯＡＥのデータは、ＩＨＣおよびＯＨＣにおけるＲＷＭ注入、Ａｎｃ８０形質導入お
よび導入遺伝子の発現は、すべて聴覚機能にとって安全であることを示している。
実施例１Ｇ－ロータロッド試験
ロータロッド装置上での平衡行動について５頭のＣ５７ＢＬ／６マウスを試験した。前
庭機能の障害を有するマウスは、ロータロッド装置上での成績が良くないことが知られて
いる（Parker & Bitner-Glindzicz, 2015, Archives Dis. Childhood, 100:271-8）。先
の研究は、一方の耳のみが冒されている場合に平衡機能不全を検出するためのこのロータ
ロッド試験の能力を強調した（Fukui & Raphael, 2013, Hearing Res., 297:99-105; Gel
eoc & Holt, 2014年, Science, 344:1241062）。Ｐ１において３頭のマウスに注入し、Ｐ
３６において試験し、２頭はＰ７９において注入していない対照マウスであった。以下の
ロータロッドプロトコールを使用して、すべてのマウスを試験した。１日目に、４ＲＰＭ
で回転しているロッド上で５分間平衡を保つためにマウスを訓練した。２日目に、各トラ
イアルを５分間隔てた５回のトライアルにおいてマウスを試験した。２ＲＰＭの開始速度
から、各トライアルごとにロッドを１ＲＰＭ加速した（Fukui & Raphael, 2013, Hearing
Res., 297:99-105）。マウスが装置から落下するまでの時間を（秒で）記録した。
蝸牛の外リンパ液は前庭迷路の外リンパ液と連続しているため、蝸牛ＲＷＭを介して注
入したＡｎｃ８０－ｅＧＦＰが前庭感覚器官に形質導入しうるかを評価した。実際に、前
庭上皮の全組織標本は、重力および直線的な頭の動きに対して敏感な前庭器官である卵形
嚢のＩ型およびＩＩ型有毛細胞の両方における、ならびに回転性の頭の動きに対して敏感
な三半規管における強力なｅＧＦＰ発現を明らかにした（図３Ａ、３Ｂ）。よって、Ａｎ
ｃ８０形質導入が平衡に影響しうるという安全性の懸念に取り組むために、前庭における
発現が確認された注入したマウスは、前庭機能に関するロータロッド試験の成績が注入し
なかった対照と同様であった（図１１）。
第２部－遺伝子治療はアッシャー症候群のマウスモデルにおいて機能を回復させる
実施例２
アッシャー症候群のマウスモデル
以下の方法および材料を実施例２において使用した。
組織標本
電気生理学的研究のために、Ｕｓｈ１ｃｃ．２１６Ｇ＞Ａヘテロ接合性またはホモ接合
性突然変異体マウス由来の卵形嚢およびコルチ器官を、出生後０日目から８日目まで（Ｐ
０～Ｐ８）採取した。出生後の仔マウスを、迅速な断頭によって殺した。側頭骨を切除し
、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を補充したＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ
ｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に浸した。先に記載の通りに酵素を使用せずにコルチ器官を切り
離した。０．１ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼによる１０分間の処理後（Ｐｒｏｔｅａｓｅ
ＸＸＩＶ， Ｓｉｇｍａ）に卵形嚢を切除した。切除した器官を丸いカバーガラスに載せ
た。先にカバーガラスに接着剤でつけた一組の細いガラス繊維を組織の縁に置いて、下向
きに安定化させた。組織を急性的に使用するかまたは１％ウシ胎仔血清の存在下で培養中
に保持した。培養を７から８日間維持し、インビトロのウイルスベクター感染を伴う実験
のために、２～３日ごとに培地を交換した。
動物
Ｕｓｈ１ｃｃ．２１６Ｇ＞Ａノックインマウスを、ルイジアナ州立大学のＨｅａｌｔｈ
Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒから入手した。Ｃ５７ＢＬ６のバックグラウンドを有す
る輸入した系統は、加齢性の聴覚喪失を引き起こすＣｄｈ２３（Ａｈｌ）突然変異から先
に育種された。（Ｐ８よりも前に）トゥクリップまたは（Ｐ８の後に）イヤーパンチを使
用してマウスの遺伝子型を同定し、先に記載の通りにＰＣＲを実施した（Lentz et al.,
2007, Mutat. Res., 616:139-44）。すべての試験について、雄性および雌性マウスをお
よそ等しい割合で用いた。その他の方法で無作為化パラダイムは適用しなかった。
ウイルスベクターの生成
ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスの蝸牛から全ＲＮＡを単離し（ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ
ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ，Ａｍｂｉｏｎ）、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａ
ｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して逆転写した。ｔｒｕｎｃ－ｈａ
ｒｍｏｎｉｎのｃＤＮＡを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ Ｈｉｇｈ
Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびプライマー：Ｔｒｕｎｃ－ｈａｒｍ
ｏｎｉｎ．Ｆ（ＫｐｎＩ）ＧＡＧ ＧＴＡ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＣＣ ＧＧＡ ＡＧＧ
ＴＧＧ ＣＣＣ ＧＡＧ（配列番号９）；Ｔｒｕｎｃ－ｈａｒｍｏｍｉｎ．ＲＶ（Ｂａｍ
ＨＩ）ＣＡＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＡＣ ＡＡＴ ＴＴＣ ＡＴＣ ＣＣＣ ＴＡＣ（配
列番号１０）を使用してＰＣＲにより増幅した。３８７ｂｐのＰＣＲ産物を、ＴＡクロー
ニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりクローニングし、シーケンシングにより確
認した。ＧＦＰ融合構築物を生成するために、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩを使用して、切
断したｈａｒｍｏｎｉｎ断片をｐＥＧＦＰ－Ｃ１中へサブクローニングした。ＮｈｅＩ－
ＸｂａＩ ＥＧＦＰ：：ｔｒｕｎｃ－ｈａｒｍｏｎｉｎ ｃＤＮＡを、ＡＡＶシャトルベ
クターに導入した。慣用のベクターをＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）とともにＡＡ
Ｖ１カプシドへパッケージングし、ここで、導入遺伝子カセットが、ＣＭＶプロモーター
（ＡＡＶ２／１．ＣＭＶ．ＥＧＦＰ：：ｔｒｕｎｃ－ｈａｒｍｏｍｉｎ．ｈＧＨ、１．９
２ Ｅ１４ｇｃ／ｍ，ＢＣＨ）により駆動される。
ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１およびｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１プラスミドを、Ｌｉｌｙ Ｚｈ
ｅｎｇおよびＪａｍｅｓ Ｂａｒｔｌｅｓからご厚意により提供されたＥＧＦＰタグ付き
標識構築物（Zheng et al., 2010, J. Neurosci., 30:7187-201）（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎ
ｔ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｎｏｒｔｈｗｅ
ｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｆｅｉｎｂｅｒｇ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｍｅｄ
ｉｃｉｎｅ， Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）から、本発明者らの研究室において調製した。
ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１は、元々、マウス腎臓から、ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１は単離され
たマウス蝸牛感覚上皮にから得た。ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１構築物は、そのＮ末端におい
てＥＧＦＰタグをｔｄＴｏｍａｔｏで置換するために、さらに修飾した。蛍光標識したお
よび非標識構築物をＡＡＶベクターにパッケージングした。Ｂｏｓｔｏｎ Ｃｈｉｌｄｒ
ｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌのウイルスコア施設およびＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｅ
ｙｅ ａｎｄ Ｅａｒ ＩｎｆｉｒｍａｒｙのＧｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏ
ｒ Ｃｏｒｅがウイルスベクターを生成した。以下のベクター：ＡＡＶ２／１．ＣＭＶ．
ｔｄＴｏｍａｔｏ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１ ４．３３ １０＾１３ｇｃ／ｍｌ（ＢＣ
Ｈ）；ＡＡＶ２／１．ＣＭＶ．ＥＧＦＰ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１ ２．７３ ５６４
１０＾１４ｇｃ／ｍｌ（ＢＣＨ）；ＡＡＶ２／１．ＣＭＶ．ＥＧＦＰ－ｈａｒｍｏｎｉ
ｎ－ａ１：２．８１ １０＾１２ｇｃ／ｍｌ（ＭＥＥＩ）；ＡＡＶ２／１．ＣＭＶ．ＥＧ
ＦＰ－ｔｒｕｎｃ－ｈａｒｍｏｎｉｎ；１．９２ １０＾１４ｇｃ／ｍｌ（ＢＣＨ）；Ａ
ＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１：１．９３ １０＾１２ｇｃ／ｍ
ｌ（ＭＥＥＩ）；ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１：１．７４
１０＾１２ｇｃ／ｍｌ（ＭＥＥＩ）；ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｔｒｕｎｃ－ｈａ
ｒｍ．ＷＰＲＥ：９．０２ ５６７ １０＾１２ｇｃ／ｍｌ（ＭＥＥＩ）を生成した。イ
ンビトロの実験のために、１０μｌの濃縮したベクターを、１％ウシ胎仔血清の存在下で
迅速に切開した組織の１ｍｌ ＭＥＭを補充した培地に２４ｈ添加した。その後、培養を
最長１０日、維持した。
蝸牛窓膜（ＲＷＭ）注入
ＲＷＭ注入を、Ｂｏｓｔｏｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌの動物実験委
員会により認可された動物プロトコール#１５－０１－２８７８Ｒの通りに実施した。０
．８μｌ～１μｌのＡＡＶベクターを新生児マウスＰ０～Ｐ１およびＰ１０～Ｐ１２に注
入した。最初に、低体温への曝露を使用してＰ０～Ｐ１マウスを麻酔したが、Ｐ１０～Ｐ
１２マウスはイソフルランにより麻酔した。麻酔に際して、耳嚢を露出させ、蝸牛を可視
化するために、耳後部を切開した。マイクロマニピュレーター（Askew et al., 2015, Sc
i. Transl. Med., 7:295ra108）により制御したガラスマイクロピペットを使用してＲＷ
Ｍを通して注入を行った。注入した材料の体積を、１０分間、およそ０．０２μｌ／分に
制御した。標準的な術後ケアを適用した。試料サイズを最適化し、変動を減少させるため
に、インビボ試験のための試料サイズを継続的に決定した。
電気生理学的記録
（ｍＭで）１４４ ＮａＣｌ、０．７ ＮａＨ２ＰＯ４、５．８ ＫＣｌ、１．３ Ｃ
ａＣｌ２、０．９ ＭｇＣｌ２、５．６ Ｄ－グルコースおよび１０ ＨＥＰＥＳ－Ｎａ
ＯＨを含有する、ｐＨ７．４および３２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇに調整した標準的な人工の
外リンパ液中で記録を実施した。濃縮物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃ
Ａ）から、ビタミン（１：５０）およびアミノ酸（１：１００）を添加した。６３Ｘ水浸
対物レンズおよび微分干渉オプティクスを備えた正立Ａｘｉｏｓｋｏｐ ＦＳ顕微鏡（Ｚ
ｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、頂端表面から有毛細胞
を眺めた。記録用ピペット（３～５ＭΩ）を、ホウケイ酸キャピラリーガラス（Ｇａｒｎ
ｅｒ Ｇｌａｓｓ，Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から引き、（ｍＭで）１３５ ＫＣｌ、
５ ＥＧＴＡ－ＫＯＨ、１０ ＨＥＰＥＳ、２．５ Ｋ２ＡＴＰ、３．５ ＭｇＣｌ２、
０．１ ＣａＣｌ２を含有するｐＨ ７．４の細胞内液で満たした。全細胞電位固定下、
－６４ｍＶの保持電位、室温において電流を記録した。ローパスＢｅｓｓｅｌフィルター
により１０ｋＨｚでフィルタリングし、Ａｘｏｐａｔｃｈ Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ ７０
０ＡまたはＡｘｏｐａｔｃｈ ２００Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｐａｌ
ｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、１２ビットの収集ボード（Ｄｉｇｉｄａｔａ １３２
２）により≧２０ｋＨｚにデジタル化し、ｐＣｌａｍｐ８．２および１０．５（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用してデータを収集した
。データをＯｒｉｇｉｎＬａｂソフトウエアによりオフラインで解析し、特記しない限り
、平均±標準偏差として表す。
統計解析
再現性を確実にするために、各時点において、１群当たり少なくとも３頭のラットにお
いて試験および対照ベクターを評価した。試料サイズは図の凡例に記されている。ＲＷＭ
注入が成功したすべての動物を試験の解析に含めた。注入が成功しなかった動物は、平均
から除外したが、完全な開示のために、凡例に含めた。注入の成功を、閾値＞９０ｄＢ
ＳＰＬのＡＢＲの回復により決定した。統計解析を、Ｏｒｉｇｉｎ ２０１６（Ｏｒｉｇ
ｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して実施した。本文および図の凡例に記し
た通り、データは、平均±標準偏差（ＳＤ）または平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す
。平均の間の有意な相違を決定するために、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用した
。
実施例２Ａ－マウスアッシャーモデルにおける走査電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）
対照および突然変異体マウスのコルチ器官に沿って、Ｐ７、Ｐ１８および～Ｐ４２（６
週）においてＳＥＭを実施した。Ｐ１８のＳＥＭを、ワシントン大学のＤｒ． Ｅｄｗｉ
ｎ Ｒｕｂｅｌと共同して実施した。内耳を０．１Ｍ リン酸ナトリウム中、４％グルタ
ルアルデヒド中で、４℃で一夜、固定した。翌日、０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファ
ー（ＰＢ）で検体を３回すすぎ、３０分間、氷浴中で０．１Ｍ ＰＢ中、１％四酸化オス
ミウム中に後固定した。次いで、０．１Ｍ ＰＢで検体をすすぎ、段階的な一連のエタノ
ール：３５％、７０％、９５％、および１００％（×２）により脱水した。試料を臨界点
乾燥し、ＳＥＭスタブに搭載し、Ａｕ／Ｐｄでスパッタ被覆した。ＪＥＯＬ ＪＳＭ－８
４０Ａ走査電子顕微鏡を使用してＳＥＭを実施した。同様の調製をＰ８および６週の段階
について実施した。コルチ器官外植片を、２ｍＭＣａＣｌ２を補充した、０．１Ｍカコジ
ル酸バッファー（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、２
．５％グルタルアルデヒド中で、１時間、室温で固定した。段階的な一連のアセトン中で
検体を脱水し、液体ＣＯ２から臨界点乾燥し、４～５ｎｍのプラチナ（Ｑ１５０Ｔ、Ｑｕ
ｏｒｕｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）でスパッタ被覆
し、電界放出走査電子顕微鏡（Ｓ－４８００、Ｈｉｔａｃｈｉ、Ｊａｐａｎ）で観察した
。
ホモ接合性ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスは、耳が聞こえず、循環行動および頭を振
りたてる行動を特徴とする前庭機能不全を示す。先の研究（Lentz et al., 2010, Dev.,
Neurobiol., 70:253-67）は、Ｐ３０における蝸牛の基底の明白な内有毛細胞および外有
毛細胞の変性を記載した。変性および有毛細胞死は、中回転においても観察したが、器官
の頂端部分は、１月齢においてより良く保存されていた。有毛細胞の変性は、内耳器官の
発達中は漸進的に発生すると仮定され、より早い段階での有毛細胞の生存を評価するため
に、Ｐ８およびＰ１８においてコルチ器官に沿ってＳＥＭ分析を実施した。ヘテロ接合性
ｃ．２１６ＧＡマウスの外有毛細胞（ＯＨＣ）および内有毛細胞（ＩＨＣ）を保存し、そ
の束は、これらの年齢では、適切に方向づけられていた（図１２Ａ～１２Ｃ、１２Ｇ、１
２Ｉおよび図１９Ａ～１９Ｃ、１９Ｋ）。しかしながら、分析した両年齢においてホモ接
合性ｃ．２１６ＡＡマウスのコルチ器官の全長に沿って、秩序の乱れた毛束が明白であっ
た（図１２Ｄ～１２Ｆ、１２Ｈ、１２Ｊ～１２Ｌおよび図１９Ｄ～１９Ｊ、１９Ｌ）。Ｐ
８では、ＩＨＣ束は基底、中間および頂端領域において中程度に秩序が乱れていた（図１
２Ｄ～１２Ｆ、１２Ｊ）。多くのＩＨＣ束が、波状のパターンおよび不動毛の列の軽い秩
序の乱れを示した（図１２Ｊ）。ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスの多くのＯＨＣが良く
保存された毛束を有した（図１２Ｈ、１２Ｋ）一方、断片化し、秩序の乱れた毛束が器官
に沿ってまばらにあることが明らかであった（図１２Ｄ～１２Ｆ、１２Ｌ）。Ｐ１８では
、破壊がより明白であったが、有毛細胞の大部分は先に報告された通りになお存在してい
た（Lentz et al., 2013, Nat. Med., 19:345-50）（図１９Ｄ～１９Ｆ）。
ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１による遺伝子治療を受けたマウスにおける毛束の形態を評価す
るために、６週齢の未処置（または注入されない）および処置した（または注入した）マ
ウスの側頭骨を、ＳＥＭ分析のために調製した。未処置のｃ．２１６ＡＡマウスは、器官
の基底および中間領域における重度の有毛細胞損失を示した（図１８）。基底領域におい
ては、ＯＨＣは最初の列ではほとんど存在せず、第２および第３の列にまばらに存在した
。器官の中間領域でも、ＯＨＣの最初の列は大部分が存在しなかった。頂端にはより穏や
かな表現型を観察した。高倍率ＳＥＭも、ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスの器官の全長
に沿って重度に秩序の乱れた毛束を明らかにした。驚くべきことに、６週齢のｃ．２１６
ＡＡマウスにおいては、毛束を観察せず、３列すべてが不動毛である典型的な階段構造を
保持していた。その代わりに、ｃ．２１６ＡＡマウス由来の有毛細胞は、最初の列に沿っ
て引っ込んだ不動毛、異常な第２の列およびわずかに保存された最も高い列を有する、秩
序の乱れた毛束を示した。対照的に、低減した有毛細胞損失および正常な毛束を、ｈａｒ
ｍｏｎｉｎ－ｂ１による処置後のｃ．２１６ＡＡマウスにおいて観察した。有毛細胞数を
、代表的な視野中の毛束の存在または非存在から推定した。
データは、注入したマウスにおける、器官の基底から頂端における有毛細胞数の明白な
保存、基底における４０～７９％、中間における６８～９５％、および頂端における９３
～９９％を明らかにした（ｎ＝４のｃ．２１６ＡＡマウスの耳からのｎ＝１８２４個の細
胞およびｎ＝２のレスキューされたｃ．２１６ＡＡの耳からのｎ＝７９２）。異常な毛束
がｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１を注入したマウスにおいてなお明白であり、ほとんどの毛束は
３列の不動毛を有し、それらのヘテロ接合性対照からほとんど識別不可能な形態を有して
いた（図１８）。
実施例２Ｂ－アッシャーマウスモデルにおけるＦＭ１－４３イメージング
５マイクロモルのＦＭ１－４３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、細胞外記録液で希釈し、
１０秒間組織に適用し、次いで、細胞外記録液で３回洗浄して、過剰の色素を除去し、エ
ンドサイトーシスによる取り込みを防止した。５分後、水浸２０×、４０×および６３×
対物レンズを有するＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ ＦＳ ｐｌｕｓにおいて落射蛍光
光源、微分干渉オプティクスおよびＦＭ１－４３フィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、細胞内ＦＭ１－４３をイメージングした。ＣＣＤカ
メラおよびバックグラウンド蛍光差分法を使用するＡｒｇｕｓ－２０イメージプロセッサ
ー（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を使用して１６ビットで画像を捉えた。同じゲインおよびコン
トラスト設定を、すべての画像の取得のために維持し、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ
またはＩｍａｇｅ－Ｊソフトウエアを使用してオフラインで分析した。
早い段階の有毛細胞機能を評価するために、急速に解剖した内耳器官におけるＦＭ１－
４３の取り込みをＰ４において分析した。短時間（＜１０秒）の適用に際して、ＦＭ１－
４３は、機能的な機械受容性チャネルを有する有毛細胞に浸透した。均一なＦＭ１－４３
の取り込みをｃ．２１６ＧＡマウスの有毛細胞で観察したが（図１３Ａ）、取り込みのレ
ベルはｃ．２１６ＡＡマウスのＯＨＣの間で変動し、いくつかの、しかしすべてではない
細胞が機能的な伝達チャネルを保持したこと（図１３Ｂ）を示唆している。同様の観察を
蝸牛の全長に沿って行った。周波数特異的な相違は認めなかった。ＦＭ１－４３の取り込
みも、出生後の最初の１週間、ｃ．２１６ＡＡマウスのＩＨＣで減少した（データは示さ
ない）。ＦＭ１－４３の取り込みを、突然変異体マウスの卵形嚢の有毛細胞においても評
価した。興味深いことに、ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスにおいては、取り込みはＰ６
ではストリオーラ外領域に限定され、ストリオーラ領域の有毛細胞に、安静時に開口する
機械受容性チャネルのないことを示唆している（図１３Ｃ、１３Ｄ）。
実施例２Ｃ－アッシャーマウスモデルにおける機械刺激
ＯＨＣおよびＩＨＣ：４００ｍＡ ＥＮＶ４００Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ（Ｐｉｅｚｏｓｙ
ｓｔｅｍ Ｊｅｎａ Ｇｅｒｍａｎｙ）により駆動されるワン－５２４ディメンショナル
ＰＩＣＭＡチップピエゾアクチュエーター（one-524 dimensional PICMA chip piezo act
uator）（Ｐｈｙｓｉｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）に搭載した堅いガラスプローブを介して機械刺激を伝達した。プローブの先端は、不
動毛の束にフィットするように、先端熱加工した（Ｆｉｒｅ ｐｏｌｉｓｈｅｒ、Ｈ６０
２、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｒａｓ
ｏｔａ，ＦＬ）（Stauffer & Holt, 2007年, J. Neurophysiol., 98:3360-9）。８－ポー
ルＢｅｓｓｅｌフィルター（Ｋｈｒｏｎ－Ｈｉｔｅ，５２８ Ｂｒｏｃｋｔｏｎ，ＭＡ）
を５０ｋＨｚで使用してフィルタリングした電圧ステップを印加することによって、偏り
を誘発し、残留ピペット共振を排除した。Ｃ２４００ ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓ
ｕ，Ｊａｐａｎ）を使用して、毛束の偏りをモニターした。刺激プローブの動きを、その
静止位置の±２μｍ近辺に較正するために、電圧ステップを使用した。軸はずれの動きの
ないことを確認するために、プローブのビデオ画像を記録し、プローブの動きを較正した
（～４ｎｍの空間分解能）。プローブの立ち上がり時間の１０～９０％は～２０μ秒であ
った。
ＶＨＣ：圧電バイモルフ要素に搭載した堅いガラスプローブを介して機械刺激を伝達し
た。刺激ピペット中への動毛の穏やかな吸引によりカップリングを実施した。連続的に搭
載され、刺激プローブに直接カップリングした２つのバイモルフからなる圧電装置に電圧
ステップを印加することによって、偏りを誘発した。ｐＣｌａｍｐ８．０ソフトウエアに
より電圧ステップを制御し、８ポールＢｅｓｓｅｌフィルターにより１ｋＨｚでフィルタ
リングした（Ｋｈｒｏｎ－Ｈｉｔｅ，Ｂｒｏｃｋｔｏｎ，ＭＡ）。Ｃ２４００ ＣＣＤカ
メラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を使用して毛束の偏りをモニターした。実験の
前に、刺激プローブの動きをその静止位置近辺（±２μｍ）に較正した。
出生後の最初の１週間の間、聴覚および前庭上皮は、比較的正常な形態を有するものを
含む機械受容性有毛細胞を保持している（図１２）。コルチ器官において、Ｐ３～Ｐ６の
ｃ．２１６ＡＡマウスの蝸牛の中回転および頂回転から、正常に見える束を有する有毛細
胞およびより重度に破壊された毛束を有するものから記録を得た。ｃ．２１６ＡＡ突然変
異体において、ＯＨＣは機械受容性を保持していたが、反応の振幅は１７０±８０ｐＡま
で、～６３％、有意に低減した（ｎ＝２４；ｐ＜０．００１、図１３Ｅ、１３Ｆ、１３Ｇ
）。ｃ．２１６ＡＡマウスにおいて、３１から２９２ｐＡの間の広範な反応の振幅をＯＨ
Ｃ中で観察した。毛束の形態に従ってデータを群分けすると、有意差（ｐ＜０．０１）が
認められ：重度に秩序の乱れた束を有した突然変異体有毛細胞において誘発された電流は
、毛束がより保存された突然変異体細胞において誘発されたものよりも小さく、それぞれ
、１２０±６５ｐＡ（ｎ＝９）および２０１±７４ｐＡ（ｎ＝１５）であった。電流振幅
の低減にもかかわらず、機械的変位に対する有毛細胞の反応は、ヘテロ接合性ｃ．２１６
ＧＡマウスのものに類似した特性を保持していた。刺激応答［Ｉ（Ｘ）］曲線を、２次Ｂ
ｏｌｔｚｍａｎｎ方程式を使用してフィットさせ（図１３Ｆ）、このあてはめを１０～９
０％の作動範囲を決定するために使用した（図２０Ｂ）。ｃ．２１６ＧＡおよびｃ．２１
６ＡＡから記録したＯＨＣの間では、作動範囲の有意な差は認めなかった（ｐ＝０．０５
４）。同様に、ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスのＩＨＣ由来の毛束は、ＤＩＣ顕微鏡下
で軽度に破壊されて見え、Ｐ６においてトランスダクション電流が有意に低減された（図
１３Ｅ、１３Ｆ、１３Ｇ）。－６４ｍＶの保持電位で、ヘテロ接合性ｃ．２１６ＧＡのＩ
ＨＣ（Ｐ６～Ｐ７）における最大トランスダクション電流は平均して５８７±９６ｐＡ（
ｎ＝２１）であったが、ｃ．２１６ＡＡのＩＨＣでは３１６±１２７ｐＡ（ｎ＝１９；ｐ
＜０．００１）まで４６％低減された。作動範囲における有意な（ｐ＜０．０１）低減を
、ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスのＩＨＣで測定した（図２０Ｇ）。・
定常的な束の偏りの存在下でのトランスダクション電流の低下と定義される、順応も、
ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスに存在した。順応速度論を、速い成分および遅い成分を
決定するために、二重指数関数あてはめを使用して解析した。両成分は、ｃ．２１６ＡＡ
突然変異体マウス由来のＩＨＣおよびＯＨＣにおいてより遅かったが、その相違は、遅い
成分に関してのみ有意であった（ＯＨＣにおいてｐ＜０．０５およびＩＨＣにおいてｐ＜
０．００１；図２０Ｃ、２０Ｄ、２０Ｈ、２０Ｉ）。一方、Ｐｏｐｅｎ＝０．５で測定し
た順応の程度は、ｃ．２１６ＧＡよりもｃ．２１６Ａの有毛細胞のＯＨＣおよびＩＨＣで
有意に少なかった（図２０Ｅ、２０Ｊ；ｐ＜０．００１）。合わせると、これらの結果は
、機械受容性がｃ．２１６ＡＡマウスの内有毛細胞および外有毛細胞において軽度に損な
われ、重要なことに、両細胞型が、遺伝子治療および細胞機能の回復のための必要条件で
ある、出生後の最初の１週間全体を通して生存したことを実証している。
前庭有毛細胞では、ｃ．２１６ＡＡマウスにおいてメカノトランスダクション電流の低
減も観察した。ストリオーラ外領域では、ｃ．２１６ＡＡの電流は、１０９±３０ｐＡ（
ｎ＝９、Ｐ５～Ｐ７）まで有意に低減した（ｐ＜０．００１）のに対して、ｃ．２１６Ｇ
Ａの電流は２３１±５３ｐＡ（ｎ＝８、Ｐ６～Ｐ７）であった（図１３Ｅ、１３Ｆ、１３
Ｈ）。ストリオーラ領域におけるＦＭ１－４３の取り込みがないこと（以下を参照された
い；図１３Ｃ、１３Ｄ）と一致して、ストリオーラ領域中の有毛細胞からは非常に小さな
電流が記録されたかまたは電流は記録されなかった（６±１３ｐＡ、ｎ＝６、Ｐ５～Ｐ７
）。ＤＩＣ顕微鏡観察により、卵形嚢の毛束が極めてよく保存されて見えた一方、トラン
スダクション電流は、ストリオーラ外およびストリオーラそれぞれにおいて、有毛細胞で
著しく低減されたかまたは存在しなかった。よって、ストリオーラ領域を除き、これらの
結果は、突然変異体マウスにおいて、トランスダクション装置が正確にアセンブルされ、
標的化されるが、機能的な複合体の数は新生児マウスで低減されることを示唆している。
次に、ｈａｒｍｏｎｉｎ発現を駆動するＡＡＶベクターに曝露したｃ．２１６ＡＡ有毛
細胞における機能を評価した。外来のｈａｒｍｏｎｉｎによる機能的レスキューの可能性
を高めるために、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるタグ付けされていないｈａｒｍｏ
ｎｉｎ－ａ１またはｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１コード配列を、Ａｎｃ８０として知られるＡ
ＡＶカプシド中にパッケージングした（Zinn et al., 2015, Cell Rep., 12:1056-68）。
本明細書中に示す通り、Ａｎｃ８０カプシドは、ＩＨＣの１００％およびＯＨＣの８０～
９０％にインビボで形質導入する。ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂがＩＨＣおよびＯＨＣの両方に
おけるメカノトランスダクションに必要であり、両細胞型における聴覚機能に必要である
と仮定した。ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１（０．８μｌ、１
．９×１０＾１２ｇｃ／ｍｌ）、これとは別にＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍ
ｏｎｉｎ－ａ１（１．７×１０＾１２ ｇｃ／ｍｌ）＋ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．
ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１（０．５μｌ＋０．５μｌ）の混合物のＲＷＭ注入を実施し、メ
カノトランスダクション反応を処置の２週間後に評価した。
蝸牛が骨化する前に、Ｐ５～Ｐ６で組織を抽出し、培養中に１０日間維持した。成熟Ｏ
ＨＣ（＞Ｐ１０）はエクスビボで記録のパラダイムを生存しないが、頑強な電気生理学的
記録を、Ｐ１４～Ｐ１６に相当するときにＩＨＣから得た。結果を図１５に表す。注入し
ないマウス由来のＩＨＣが、大幅に低減されたトランスダクション電流をＰ１６で示した
が（７９±４３ｐＡ、ｎ＝８）、感覚変換の回復は、ＡＡＶ処置を受けたマウスにおいて
明らかであった。Ｐ１にｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１またはｂ１とａ１両方の組み合わせを注
入したマウスにおいて、それぞれ、３３８±６６ｐＡ（ｎ＝１５）および３５２±２８ｐ
Ａ（ｎ＝７；図１５Ｃ）の平均最大トランスダクション電流により有意な回復（＊＊＊Ｐ
＜０．００１）を観察した。ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１による処置後のＩＨＣにおけるトラ
ンスダクション電流の振幅は、対照ｃ．２１６ＧＡマウスと有意に相違しなかった。回復
のレベルは、ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１とｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１の同時注入によって有意
に変化しなかった。これらの結果は、早い段階でのＲＷＭ注入による外来ｈａｒｍｏｎｉ
ｎ－ｂ１の送達が、ＩＨＣにおいてメカノトランスダクションを回復させうることを示唆
している。
実施例２Ｄ－アッシャーマウスモデルにおける共焦点イメージング
出生後のマウスＰ０～Ｐ８からの共焦点イメージングのための組織を準備するために、
４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を使用して、１５分間、固定を行った。０．０１％
トライトンによる透過処理およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ、１／２００）による対比染色を使用して、アクチンフィラメントを標識した。Ｌ
ＳＭ７００Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡で画像を得た。より高齢のマウス（４～８週）におい
ては、安楽死後に側頭骨を除去し、４％ＰＦＡ中に１時間おき、それに続いて１２０ｍＭ
ＥＤＴＡにより２４～３６時間、脱灰した。次いで、感覚上皮を切り出し、免疫染色の
ために上記の通りに注入した。マウス抗ＣＴＢＰ２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃６
１２０４４、１／２００）を４８時間適用し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒヤギ抗マウス抗体
（１／２００）で一夜、４℃で対比染色して、リボンシナプスを標識した。Ｚｅｉｓｓ
ＬＳＭ ７１０レーザー共焦点顕微鏡（ＩＤＤＲＣ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｅグラント
Ｐ３０ ＨＤ１８６５５）で画像を取得し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭイメージビューワー４．
２を使用して加工した。
先の研究は、感覚有毛細胞中のｈａｒｍｏｎｉｎの２つのオルタナティブスプライス型
の発現を明らかにした。外来ｈａｒｍｏｎｉｎスプライス型の発現を駆動するＡＡＶベク
ターの能力を評価するために、新生児ｃ．２１６ＡＡおよび野生型（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）
マウス由来の卵形嚢およびコルチ器官を、ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１のＮ末端に融合したｅ
ＧＦＰ（ｅＧＦＰ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１）またはｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１の１８１
Ｎ末端に融合したｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄＴｏｍａｔｏ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１）を
コードするＡＡＶ２／１ベクターに曝露した。ベクターは、Ｐ１において、インビトロま
たはＲＷＮ注入（１μｌ）によりインビボで適用した。インビトロで適用する場合、ベク
ターの存在下でＰ０～Ｐ１の組織を２４時間インキュベートし、１週間、培養中に維持し
た。共焦点画像は、野生型、ｃ．２１６ＧＡおよびＣ．２１６ＡＡマウスの有毛細胞が、
形質導入に成功したことを示した（図１４Ａ～１４Ｃ、１４Ｅ）。ＶＨＣ（図１４Ａ）、
ＩＨＣおよびＯＨＣ（図１４Ｂ、１４Ｃ）中の不動毛の先端においてＥＧＦＰ：：ｈａｒ
ｍｏｎｉｎ－ｂ１シグナルがはっきり表れた。ＥＧＦＰシグナルは、Ｐ１で注入したマウ
スの蝸牛基底部分のＯＨＣおよびＩＨＣ中でもＰ６０で検出した（図１４Ｄ）。ｔｄＴｏ
ｍａｔｏ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１は、聴覚有毛細胞の基底で検出した（図１４Ｅ）。
リボンシナプスマーカーＣＴＢＰ２との共染色は、Ｐ７のＩＨＣにおける共局在化を頻繁
に明らかにしたが（図１４Ｅ）、Ｐ７の卵形嚢ではそうでなかった（データは示さない）
。
外来融合構築物の局在化は、ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂの感覚糸挿入物の近くの不動毛の遠
位末端へのおよびｈａｒｍｏｎｉｎ－ａのシナプスへの局在化という先の研究と一致した
。
実施例２Ｅ－聴性脳幹反応（ＡＢＲ）および歪成分（ＤＰＯＡＥ）
ＡＢＲおよびＤＰＯＡＥを、キシラジン（５～１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）およびケタ
ミン（６０～１００ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）で麻酔したマウスから記録した。皮下用針電
極を、ａ）２つの耳の間の背部の（参照電極）；ｂ）左の耳介の後ろの（記録用電極）；
およびｃ）動物の尻の背部の（接地電極）皮膚に挿入した。耳介基部の管をトリミングし
て外耳道を露出させた。ＡＢＲ記録のために、外耳道および聴覚装置（ＥＰＬ Ａｃｏｕ
ｓｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ，ＭＥＥＩ，Ｂｏｓｔｏｎ）に、５ミリ秒のトーンピップを提示
する。反応を増幅し（１０，０００倍）、フィルタリングし（０．１～３ｋＨｚ）、ＰＣ
に基づくデータ取得システム（ＥＰＬ，Ｃｏｃｈｌｅａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔ
ｓｕｉｔｅ，ＭＥＥＩ，Ｂｏｓｔｏｎ）のアナログ・デジタルボードにより平均した。
音のレベルを、０～１１０ｄＢの音圧レベル（デシベルＳＰＬ）から５～１０ｄＢずつ上
げた。各レベルにおいて、「アーチファクト除去」後に、（刺激の極性を交互に入れ替え
ることにより）５１２～１０２４の反応を平均した。目視検査によって閾値を決定した。
データを解析し、Ｏｒｉｇｉｎ－２０１５（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ，ＭＡ）を使用してプロットした。特に明記しない限り、閾値の平均±標準偏差を提示
する。ＤＰＯＡＥのために、ｆ１およびｆ２プライマリートーン（ｆ２／ｆ１＝１．２）
を、５．６と４５．２ｋＨｚの間で半オクターブずつ変化するｆ２およびＬ１－Ｌ２＝１
０ｄＢ ＳＰＬとともに提示した。各ｆ２において、Ｌ２は１０ｄＢ ＳＰＬきざみで１
０から８０ｄＢ ＳＰＬの間で変化した。ＤＰＯＡＥ閾値は、ノイズフロアを５ｄＢ Ｓ
ＰＬ上回る大きさのＤＰＯＡＥを誘発するＬ２レベルとして、平均スペクトルから定義し
た。平均ノイズフロアレベルは、すべての周波数にわたって０ｄＢ ＳＰＬを下回った。
ＳＡ－１スピーカードライバ（Ｔｕｃｋｅｒ－Ｄａｖｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｉｎｃ．）で増幅した、ＰＸＩ－１０４２Ｑ筐体中の２４ビットのデジタルＩ－Ｏカード
（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＰＸＩ－４４６１）により刺激を生成し
、本発明者らの慣用の音響システム中の２つの静電ドライバー（ＣＵＩ ＣＤＭＧ１５０
０８－０３Ａ）から送達した。小さなプローブ管の末端のエレクトレットマイク（Ｋｎｏ
ｗｌｅｓ ＦＧ－２３３２９－Ｐ０７）を使用して、外耳道内の音圧をモニターした。こ
れらの実験の大部分は、盲検条件下で実施しなかった。
切断型ｈａｒｍｏｎｉｎが正常な聴覚機能を妨げたかを決定するために、切断型タンパ
ク質を過剰発現させるためのＡｎｃ８０．ＣＭＶ．ｔｒｕｎｃ－ｈａｒｍベクターを作製
した。ベクターは、ＲＷＭを介してｃ．２１６ＧＡマウスの内耳に注入した。ＡＢＲおよ
びＤＰＯＡＥＳを、４、６および１２週で測定し、注入したおよび注入しないｃ．２１６
ＧＡマウスの間に閾値の相違はなかった（図２３Ｃ～２３Ｄに示す６週齢マウスからの記
録）。このデータは、注入技術についての対照としての役割を果たし、重要なことには、
ベクターは、外来の切断型ｈａｒｍｏｎｉｎが内在性の完全長ｈａｒｍｏｎｉｎと競合し
ないと主張し、ｃ．２１６ＡＡ有毛細胞中の内在性切断型が、遺伝子治療用ベクターを介
して発現する外来の完全長ｈａｒｍｏｎｉｎを妨害しないことを暗示している。
ｈａｒｍｏｎｉｎ遺伝子の増大がＵｓｈ１ｃマウスにおける聴覚および平衡機能をレス
キューすることができるかを決定するために、Ｐ０～Ｐ１でＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭ
Ｖ．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１（０．８μＬ、１．７×１０＾１２ｇｃ／ｍｌ）またはＡＡ
Ｖ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１（０．８μｌ、１．９×１０＾１２
ｇｃ／ｍｌ）のＲＷＭ注入を実施し、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）、歪成分耳音響放射（ＤＰ
ＯＡＥ）、聴覚性驚愕反射、オープンフィールドおよびロータロッド行動を評価した。ｃ
．２１６ＡＡマウスが深刻な聴覚喪失および前庭機能不全を患う段階である６週において
、マウスを評価した。一部のマウスを３および６カ月でさらに試験した。
ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１を注入した１２頭のマウスの
うち、６週間で聴覚機能を回復したものはなく（図１６Ａ～１６Ｃ）、ｈａｒｍｏｎｉｎ
－ａ１の外来性発現が聴覚のレスキューのためには不十分であることを示唆している。し
かしながら、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１を注入した２５頭
のマウスのうちの１９頭は、６週間で聴覚機能を顕著に回復した。低周波数（５．６～１
６ｋＨｚ）において、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１を注入し
た耳の最良のＡＢＲ閾値は２５～３０ｄＢ ＳＰＬにおけるものであり、野生型マウスの
閾値に驚くほど類似していた（図１６Ａ～１６Ｂ）。部分的なレスキューを、２２．６ｋ
Ｈｚで観察し、３２ｋＨｚではほとんどないかまたは全くなかった。ＯＨＣにおける機能
のレスキューと一致して、ＤＰＯＡＥ閾値のレスキューも明白であった（図１６Ｃ）。８
～１１．３ｋＨｚの刺激について４５ｄＢ ＳＰＬ未満の可聴閾を有するマウスのうちの
８頭を、後の段階で試験して、レスキューの寿命を評価した。６週から３カ月まで、～１
０ｄＢ ＳＰＬのＡＢＲ閾値のシフトを低周波数範囲において、～３０ｄＢ ＳＰＬを高
周波数範囲において観察した（図１６Ｄ）。同様のシフトを、ＤＰＯＡＥ閾値においても
観察した（図１６Ｅ）。この時点の後、ＡＢＲ閾値およびＤＰＯＡＥは、試験した最も遅
い時点である６か月齢まで安定なままであった（図１６Ｄ～１６Ｅ）。
より完全な聴覚レスキューのために、特に高周波数末端（high frequency end）でｈａ
ｒｍｏｎｉｎ－ａ１およびｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１が両方とも必要であるかを評価するた
めに、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｔｄＴｏｍａｔｏ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１（
０．５μｌ；２３８ ４．１Ｅ＾１２ ｇｃ／ｍｌ）およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭ
Ｖ．ｅＧＦＰ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１（０．５μｌ；３．０Ｅ＾１２ ｇｃ／ｍｌ）
を同時注入した。両蛍光タグについて陽性の細胞から明らかな通り、有毛細胞の６５％が
、ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１およびｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１を両方とも発現した（図２１）
。蛍光標識したｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１は、おそらく過剰発現により、ＡＡＶ２／Ａｎｃ
８０．ＣＭＶ．ｔｄＴｏｍａｔｏ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１に曝露したマウスの不動毛
中に時折観察された。非標識ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１およびｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１ベク
ターを同時注入したマウスにおけるＡＢＲおよびＤＰＯＡＥ閾値（図１６）は、ｈａｒｍ
ｏｎｉｎ－ｂ１単独を注入したものに類似し、さらなる改善を提供せず、ｈａｒｍｏｎｉ
ｎ－ａ１が聴覚機能に不可欠ではない可能性を示唆している。重要なことには、データは
、ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１単独が、低周波数における可聴閾の顕著な回復に十分であるこ
とを実証している（図１６）。
レスキューの程度をさらに評価するために、４５ｄＢ ＳＰＬ以下の閾値を有するマウ
ス由来のＡＢＲ波形を分析し、８頭の対照ｃ．２１６ＧＡマウスとＡＡＶ２／Ａｎｃ８０
．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１を注入した５頭のｃ．２１６ＡＡマウスの間で比較し
た。８～１１．３ｋＨｚおよび１６ｋＨｚにおける反応の分析は、正常波１の振幅（有意
でない相違、Ｐ＞０．２、スチューデントｔ検定）およびより長いピーク１潜時（Ｐ＞０
．００１）（図２２）を明らかにし、シナプスにおける神経伝達の遅れの可能性を示唆し
ている。多くの動物で、聴覚レスキューは対側耳でも観察され、ＡＢＲ閾値は１１．３ｋ
Ｈｚで２０ｄＢ ＳＰＬと低かった（ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１：平均５９．７±５．３ｄ
Ｂ ＳＰＬ、ｎ＝１５／２５；ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１＋－ｂ１：２５５平均７６．２±
１０．３ｄＢ ＳＰＬ、ｎ＝４～６）。ＡＡＶベクターの対側耳への拡散は以前に観察さ
れており、新生児マウスのクモ膜下腔と連続したままである外リンパ管を介して発生する
可能性がある。
本発明者らは、より遅い発達段階での注入が部分的な聴覚レスキューをもたらしうるか
も調べた。Ｐ１０～Ｐ１２でＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１（
０．８μｌ）のＲＷＭ注入を実施し、可聴閾を６週で評価した。Ｐ１０～Ｐ１２で注入し
たマウスのいずれも検出可能なＤＰＯＡＥを有さず、そのＡＢＲ閾値は注入しないｃ．２
１６ＡＡ対照マウスと相違せず（ｎ＝１０；データは示さない）、おそらくより高齢の組
織における低いウイルス形質導入効率または後の発達段階におけるコルチ器官の縮退のた
め、治療介入の機会が出生後の早期段階に限られる可能性があることを示唆している。
実施例２Ｆ－アッシャーマウスモデルにおけるＲＴ－ＰＣＲ
Ｐ２～Ｐ３の野生型ヘテロ接合性およびホモ接合性Ｕｓｈ１ｃｃ．２１６Ｇ＞Ａマウス
の６つの聴覚器官から、ＱＵＡＮＴＩＴＥＣＴ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓ
ｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡを調製した。完全長（４
５０ｂｐ）または切断型ｈａｒｍｏｎｉｎ（～３５ｂｐ）をコードするｃＤＮＡを、以下
のプライマー：フォワードプライマーｍＵｓｈ１ｃ＿Ｅｘ２Ｆ：５’ ＣＴＣ ＡＴＴ
ＧＡＡ ＡＡＴ ＧＡＣ ＧＣＡ ＧＡＧ ＡＡＧ Ｇ ３’（配列番号１１）、リバー
スｍＵｓｈ１ｃ＿Ｅｘ５Ｒ：５’ ＴＣＴ ＣＡＣ ＴＴＴ ＧＡＴ ＧＧＡ ＣＡＣ
ＧＧＴ ＣＴＴ ３’（配列番号１２）を使用して増幅した。これらのプライマーは、マ
ウスＵｓｈ１ｃ配列に特異的であり、標的配列がＵｓｈ１ｃｃ．２１６Ａアレルのヒトの
ノックイン部分の領域外にあるため、内在性およびＡＡＶ２由来のＵｓｈ１ｃを両方とも
増幅する。処置の６週間後に採取したマウス組織から、ＤＮＡおよびＲＮＡレベルも評価
した。製造業者のプロトコールに従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、蝸牛からＤＮＡおよびＲＮＡを単離し
た。ＧｏＳｃｒｉｐｔ逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用
してＲＮＡを逆転写した。ＧｏＴａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、放射標識ＰＣＲを実施した。ウイルスＤＮＡ
の増幅のために、マウスＵｓｈ１ｃ特異的なプライマー：ｍＵｓｈ１ｃ＿Ｅｘ３Ｆ（５’
－ＧＡＡ ＣＣＣ ＡＡＣ ＣＧＣ ＣＴＧ ＣＣＧ（配列番号１３））およびｍＵｓｈ
１ｃ＿Ｅｘ４ＷＴＲ（５’－ＴＧＣ ＡＧＡ ＣＧＧ ＴＣＣ ＡＡＧ ＣＧＴ－３’（
配列番号１４））を使用した。
これらのプライマーは、ウイルスＵｓｈ１ｃＤＮＡのみを増幅し、それは、ホモ接合性
Ｕｓｈ１ｃ．２１６ＡＡマウスが、エクソン３およびエクソン４にノックインされ、マウ
ス配列を置換しているヒトＵＳＨ１Ｃｃ．２１６Ａ遺伝子を有するからである（Lentz et
al., 2007, Mutat. Res., 616:139-44）。完全長（４５０ｂｐ）および異常にスプライ
シングされた／切断されたｈａｒｍｏｎｉｎ（４１５ｂｐ）のｃＤＮＡ増幅のためには、
上記と同じプライマーを使用した（ｍＵｓｈ１ｃ＿Ｅｘ２ＦおよびｍＵｓｈ１ｃ＿Ｅｘ５
Ｒ）。Ｇａｐｄｈプライマーは：ｍＧａｐｄｈ＿Ｅｘ３Ｆ（５’－６１１ ＧＴＧ ＡＧ
Ｇ ＣＣＧ ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＧＴ ＡＴＧ－３’（配列番号１５）およびｍＧａｐｄ
ｈ＿Ｅｘ４Ｒ（５’－ＧＣＣ ＡＡＡ ＧＴＴ ＧＴＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＡＣ－３’
（配列番号１６）であった。生成物を、６％非変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、Ｔ
ｙｐｈｏｏｎ ９４００ホスホイメージャー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して
定量化した。
先の研究が、切断型ｈａｒｍｏｎｉｎが内在性結合パートナーについて完全長ｈａｒｍ
ｏｎｉｎと競合することによって機能を破壊しうる可能性を提起したため、切断型タンパ
ク質の持続的な発現が、外来性の完全長ｈａｒｍｏｎｉｎを発現するベクターを注入した
ｃ．２１６ＡＡマウスにおける回復を制限するかを調査した（図２３Ａ）。この懸念に取
り組むために、ＲＴ－ＰＣＲアッセイを使用して、ｃ．２１６ＧＡおよびｃ．２１６ＡＡ
マウスにおけるＵｓｈ１ｃ転写物の発現を調べた。先の報告と一致して、完全長および切
断型ｈａｒｍｏｎｉｎをコードするＵｓｈ１ｃ転写物が、ｃ．２１６ＧＡ蝸牛において検
出され、ｃ．２１６ＡＡの蝸牛では、切断型ｈａｒｍｏｎｉｎをコードする転写物のみが
検出された（図２３Ｂ）。
ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１の発現を確認し、ウイルス発
現レベルとＡＢＲ閾値の間の関係を調査するために、注入した蝸牛と対側の蝸牛からＤＮ
ＡおよびＲＮＡを単離し、それぞれ、ＰＣＲおよびＲＴ－ＰＣＲで定量化した。６週齢の
ｃ．２１６ＧＡマウスならびにＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１
（０．８μｌ；１．９３ １０＾１２ｇｃ／ｍｌ）を注入したおよび注入しないｃ．２１
６ＡＡマウスで発現を評価した。試料は、ＡＢＲレスキューが良好な（１１．３ｋＨｚに
おける閾値≦３５ｄＢ ＳＰＬ）注入した２頭のマウスおよびＡＢＲレスキューが不良の
（１１．３ｋＨｚにおける閾値≧９０ｄＢ ＳＰＬ）２頭を含んでいた。ｈａｒｍｏｎｉ
ｎの正確なスプライシング型をコードするＲＮＡ（図２４Ａ）およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８
０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１ ＤＮＡ（図２４Ｂ）を、注入したすべての蝸牛で
検出し、比較的程度は低いが、試験したすべての動物の対側蝸牛で検出した。
ＡＢＲ閾値ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの発現量で、動物間にばらつきがあった（図２
４Ｃ）。しかしながら、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１ ＤＮ
Ａレベル、ｈａｒｍｏｎｉｎの正確なスプライシング型をコードするＲＮＡの量およびＡ
ＢＲ閾値レベルの間には強い相関が見られ、これは、ＡＢＲデータのばらつきが、ＡＡＶ
発現の直接の結果でありうることを示唆している。ＡＢＲ閾値の回復がうまくいったマウ
スにおける有毛細胞の長期生存を評価するために、６週齢の５頭のマウスにおいて組織を
準備し、ＩＨＣおよびＯＨＣの数を計数した（図２５）。２つのコホートにおいてＩＨＣ
の数が変動しなかった一方、長期のＡＢＲレスキューを示した３頭のマウスにおいては５
０％以上のＯＨＣが残存した。ＯＨＣの生存を、基底回転を除き、器官全体にわたって観
察した（図２５）。
実施例２Ｇ－アッシャーマウスモデルにおける聴覚性驚愕反応
Ｓｔａｒｔｌｅ Ｍｏｎｉｔｏｒ（Ｋｉｎｄｅｒ Ｓｉｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し
て聴覚性驚愕反応（ＡＳＲ）を測定した。ピエゾ／プレキシガラスセンシングアセンブリ
に固定した小さなサイズの非拘束性立方体Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ記録チャンバー（２７ｃｍ
×１０ｃｍ×１２．５ｃｍ）にマウスを入れ、６０ｄＢ ＳＰＬのバックグラウンドホワ
イトノイズで５分間、慣れさせた。各セッションは３５回のトライアルからなり、その間
、平均３０秒（２５～３５秒範囲）のトライアル間インターバルで、単一のノイズパルス
は強度１０ｄＢ ＳＰＬ単位で６０～１２０ｄＢ ＳＰＬの範囲にわたって送達した。外
部ノイズによる干渉を制限するための定常的な６０ｄＢ ＳＰＬのバックグラウンドノイ
ズにおいて、パルスを疑似ランダム順に配置した。Ｓｔａｒｔｌｅ Ｍｏｎｉｔｏｒシス
テムは、ピーク驚愕反応（ＡＳＲ振幅）および刺激からピーク驚愕反応までの時間（ＡＳ
Ｒ潜時）の計算のために、各パルスに対する反応を最初のＮ、最大のＮおよび反応の最大
時間（ｍｓ）の測定に減らした。ＡＳＲはすべて盲検で行った。
ＡＢＲ／ＤＰＯＡＥの回復が、行動に関連した聴覚機能の回復を生じさせたかを評価す
るために、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１、ＡＡＶ２／Ａｎｃ
８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１を注入したマウスおよび両ベクターを注入したマ
ウスにおいて聴性驚愕反応を測定した。ホワイトノイズに対する驚愕反応の分析は６週齢
のＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１を注入したマウスおよび両ベ
クターを同時注入したマウスで反応の部分的レスキューを示した（図１７Ａ）。ｈａｒｍ
ｏｎｉｎ－ａ１のみを注入したマウスは、注入しないｃ．２１６ＡＡマウスに類似して、
驚愕反応を回復しなかった。
実施例２Ｈ－アッシャーマウスモデルにおける前庭評価
オープンフィールドおよびロータロッド平衡試験を使用して、前庭機能を評価した。中
心を３０ルクスに設定した天井のＬＥＤ照明を有する音響チャンバーの内部に置いた、直
径４２ｃｍの円形フレームを使用し、薄暗い室内でオープンフィールド試験を行った。一
度に１頭のマウスを円形のオープンフィールドに入れ、５分間探索させた。行動を記録し
、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ ＸＴを使用して追跡し、移動距離と速度の測定を可能とした。
オープンフィールド評価はすべて盲検で行った。ロータロッドの実施は、密閉した筐体に
おいて、４ｒｐｍで回転を開始し０．１ｒｐｍ ｓ－１の割合で加速したロッドにマウス
を置くことを含んだ。１日目は、機器に慣れさせるために５分間、マウスをロッド上に置
いた。翌日、全部で５回のトライアルで動物をロッド上に置いた。トライアル間で５分間
の静止期を与えた。筐体の機器装備した床に落下する前に動物が装置上に留まることので
きた時間の長さを、タイマーに表示し、各試験ランの後に記録した。
外リンパ腔は蝸牛と前庭迷路の間で連続しているため、ＲＷＭを介して注入したＡＡＶ
ベクターは、前庭感覚器官に同様に形質導入しうる。前庭の行動を評価するために、ロー
タロッド上でのその成績についてマウスを試験した。不良のロータロッド成績を、ｃ．２
１６ＡＡおよびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１を注入したｃ．
２１６ＡＡマウス（落下までの潜時＜平均２２秒）で観察し、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．Ｃ
ＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１を注入したｃ．２１６ＡＡマウスならびにｈａｒｍｏｎｉ
ｎ－ａ１および－ｂ１ベクターを同時注入したものは、ロータロッド上で６０～１２０秒
、平衡機能を維持し、対照ｃ．２１６ＧＡマウスと一致した（図１７Ｂ）。
オープンフィールド行動の回復は、ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１、ならびにｈａｒｍｏｎｉ
ｎ－ａ１およびｂ１を二重に注入したｃ．２１６ＡＡマウスにおいても観察した。代表的
なオープンフィールド探索の追跡を図１７Ｃにプロットする。ｃ．２１６ＧＡマウスはフ
ィールドの縁を探索し、最小の全身回転を示したが、ｃ．２１６ＡＡマウスは、回転数／
分として定量化した全身回転の増加を伴うチャンバー全体のいたるところにおけるさらな
る活動を示した（図１７Ｄ～１７Ｅ）。驚くべきことに、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ
．ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１を注入したマウスではＡＢＲレスキューを観察しなかったが、
オープンフィールドデータは、対照マウスのレベルへの前庭機能の回復を実証した。ＡＡ
Ｖ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｔｒｕｎｃ－ｈａｒｍｏｎｉｎを注入したｃ．２１６ＧＡマ
ウスの行動は、対照ｃ．２１６ＧＡマウスと相違せず、ここでも、切断型および野生型ｈ
ａｒｍｏｎｉｎの間に妨害のないことを示している。
ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１を注入したマウスは、旋回行動は消失したが、ロータロッド試
験には不合格であったため、行動アッセイは、ｈａｒｍｏｎｉｎ－ａ１による部分的な前
庭レスキューを実証した。一方、ｈａｒｍｏｎｉｎ－ｂ１を注入したマウスは、両試験に
おいて機能を回復した（図１７）。ストリオーラ領域における形質導入およびＦＭ１－４
３の取り込みのないことは、ストリオーラ領域の有毛細胞およびおそらくＩ型細胞の機能
が、適切なｈａｒｍｏｎｉｎ発現に依存することを示している（図１３）。
聴覚レスキューが高周波数でなく低周波数で卓越した一方（図１６）、６週における毛
束形態の保存を器官全体に沿って観察した（図１８）。高周波数においてレスキューのな
いことは、注入に起因する損傷による可能性は低い。高周波数の聴覚喪失は、ＡＡＶベク
ターを注入したｃ．２１６ＧＡのいずれでも観察しなかった（図２３Ｃ～２３Ｄ）。蝸牛
の長さ全体に沿ったＡＡＶターゲティングは、説明として基底における形質導入効率を欠
くことと相反する。１つの可能性は、短いｈａｒｍｏｎｉｎ－ｃのような他のｈａｒｍｏ
ｎｉｎアイソフォームが、蝸牛の基底高周波数末端における機能のレスキューに必要であ
りうるということである。代替的に、蝸牛の発達は基底末端（basal end）から始まるた
め、Ｐ０までに、基底高周波数末端由来の有毛細胞が修復点を超えて成熟した可能性があ
る。もしそうなら、胚への介入が高周波数領域におけるより良いレスキューを可能としう
る。
第３部－聴覚喪失に関与するさらなる突然変異の遺伝子治療
実施例３Ａ－インビボ実験
改変ＣＭＶプロモーターにより駆動されるマウスＴＭＣ１のコード配列を保有するＡｎ
ｃ８０ベクターを、ヘルパーウイルスフリーシステムおよび先に記載の二重トランスフェ
クション法を使用して作製した（Grimm et al., 2003, Mol. Ther., 7:839:50）。トリプ
ルｆｌａｇタグ（ＦＬＡＧ）配列をＴＭＣコード配列のＣ末端に融合させて、発現したタ
ンパク質の可視化を可能とした。イオジキサノールステップグラジエント、それに続いて
イオン交換クロマトグラフィーを使用して、Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．Ｔｍｃベクターを精製
した。ヒトベータグロブリンイントロンエレメントに特異的なプライマーセットを使用す
る定量的ＰＣＲにより測定して、力価は１×１０１２から１×１０１３ｇｃ／ｍｌの範囲
にわたった。ウイルスのアリコートを－８０℃で保管し、使用直前に解凍した。
Ｐ０～Ｐ２齢のマウスを、Ｂｏｓｔｏｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌの
動物実験委員会により認可されたプロトコール（プロトコール#２６５９、＃２１４６）
に従って、以下に記載の通りにウイルスベクターのインビボ送達のために使用した。Ｃ５
７ＢＬ／６Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはＳｗｉｓｓ Ｗｅｂ
ｓｔｅｒマウス系統（Ｔａｃｏｎｉｃ）を、野生型対照マウスとして使用し、ＴＭＣ１突
然変異体アレル（ＴＭＣ１Δ／ΔまたはＴｍｃ１－／－）を保有するマウスは、先に記載
の通りにＣ５７ＢＬ／６Ｊをバックグラウンドとした（Kawashima et al., 2011, J. Cli
n. Invest., 121:4796-809）。
評価のための組織を準備するために、Ｐ０～Ｐ１０の仔マウスから側頭骨を採取した。
迅速な断頭によって仔を安楽死させ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５ｍｇ／ｍｌ アン
ピシリンおよび０．０１ｍｇ／ｍｌ シプロフロキサシンを補充したＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）、ｐＨ７．４０中で側頭骨を解剖した。解剖鏡下で膜迷路を単離し、ライス
ナー膜を剥がし、蓋膜および血管条を機械的に除去した。コルチ器官培養を、１つの端が
Ｓｙｌｇａｒｄにより１８ｍｍの丸いカバーガラスに接着された一対の細いガラスファイ
バーの下に平らにピンで留めた。急性的に組織を電気生理学的研究に使用した。Ｐ１０よ
りも高齢のマウスについては、吸入したＣＯ２により動物を安楽死させた後に、側頭骨を
採取し、蝸牛全組織標本を作製した。
図中に表したすべての平均値およびエラーバーは、平均±ＳＤを表す。注入した耳およ
び注入しない耳の間の統計学的有意性についての比較を、対応のある両側ｔ検定を使用し
て実施した。Ｐ＜０．０５が有意と考えた。
実施例３Ｂ－ウイルスベクターのインビボ注入
蝸牛窓膜（ＲＷＭ）を介して、斜角研磨したガラスマイクロインジェクションピペット
を使用して仔マウス（Ｐ０～Ｐ２）に注入した。Ｐ－２０００ピペットプラー（Ｓｕｔｔ
ｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）においてキャピラリーガラスからピペットを引き、マイ
クロピペットベベラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して斜角研磨し
た（２８°の角度で、～２０μｍの先端径）。手術部位（左乳様突起）を覆うために滅菌
スワブを使用する鎮痛のために、ＥＭＬＡクリーム（リドカイン２．５％およびプリロカ
イン２．５％）を外部に塗布した。術前は３７℃のウォームパッド上で３０～６０分、体
温を維持した。
意識喪失するまで、２～３分間、急速な体温低下を誘導することによって仔を麻酔し、
手術中、１０～１５分間この冷却プラットフォーム上でこの状態を維持した。べタジンで
ごしごし擦り、７０％エタノールで拭くことを３回繰り返して、手術部位を消毒した。耳
後部の切開を行って透明な耳嚢を露出させ、耳嚢および覆っている筋膜を通してマイクロ
ピペットをマイクロマニピュレーター（ＭＰ－３０，Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）ですすめ、マイクロピペットの先端によりＲＷＭを穿通した。
１０１２から１０１４ｇｃ／ｍＬの間の力価のおよそ１μＬのウイルス（１０９から１
０１１個の全ウイルス粒子）を、片側性に０．１μｌ／分で、空圧マイクロインジェクタ
ー（ＷＰＩ Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ ２０１０）を使用して左耳に注入した。６－０のモノ
フィラメント縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ）を使用して皮膚切開を閉じた。その後、回復のた
めに仔をウォーミングパッドに戻した。
実施例３Ｃ－免疫蛍光法
ウイルスベクターにより送達した導入遺伝子の発現の分布を決定するために免疫染色を
実施した。そのために、新たに解剖したコルチ器官に対して免疫染色を実施し、ＰＢＳで
希釈した４％パラホルムアルデヒドにより室温で１時間、液浸固定した。次いで、組織を
ＰＢＳですすぎ、０．０１～０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中で３０分間、透過化処
理し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６－ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ
ｓ、１：２００希釈液）で１時間、対比染色して、線維状アクチンを標識した。
外因性に発現したＴＭＣ：：ＦＬＡＧ融合タンパク質の局在化のために、２％ ＢＳＡ
および５％正常ヤギ血清を使用して、１時間、組織をブロッキングし、ＦＬＡＧモチーフ
に対する抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１：２００希釈液）とともに４℃で一夜
、インキュベートした。有毛細胞計数のために、正常ヤギ血清中で組織を１時間、ブロッ
キングし、ウサギ抗ミオシンＶＩＩａ一次抗体（Ｐｒｏｔｅｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ、１：１０００希釈液）により、４℃で一夜染色し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：２００希釈液）にコンジュゲーションしたヤギ
抗ウサギ抗体で１時間標識した。試料を、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともにカバーガラスに搭載し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７０
０共焦点顕微鏡を使用して使用倍率１０Ｘ～６３Ｘでイメージングした。
図２６は、ｈａｒｍｏｎｉｎのＵｓｈ１ｃ突然変異体マウスへの均一なＡｎｃ８０送達
を実証する免疫蛍光法を示し、図２８は、ＫＣＮＱ４のＫＣＮＱ４突然変異体マウスの細
胞へのＡｎｃ８０送達を実証する免疫蛍光法を示す。よって、Ａｎｃ８０は、聴覚消失を
もたらす（多くの異なる遺伝子座における）多くの異なる遺伝子異常を処置するための有
効なベクターである。
実施例３Ｄ－有毛細胞の電気生理学
器官型蝸牛培養を、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．７ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、５．８ｍＭ
ＫＣｌ、１．３ｍＭ ＣａＣｌ２、０．９ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓお
よび５．６ｍＭ Ｄ－グルコースを含有する標準的な人工の外リンパ液に浸した。濃縮物
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からビタミン（１：５０）およびアミノ酸（１：１００）を溶
液に添加し、最終的なｐＨを７．４０（３１０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ）に調整するためにＮ
ａＯＨを使用した。記録用ピペット（３～５メガオーム）を、Ｒ６キャピラリーガラス（
Ｋｉｎｇ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｇｌａｓｓ）から引き、１３５ｍＭ ＣｓＣｌ、５ｍＭ
Ｈｅｐｅｓ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ Ｎａ２－アデ
ノシン３リン酸および０．１ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する細胞内液で満たし、最終的なｐ
Ｈを７．４０（２８５ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ）に調整するためにＣｓＯＨを使用した。Ａｘ
ｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、－
８４ｍＶ、室温（２２～２４℃）において全細胞密封電圧クランプ記録を行った。ローパ
スＢｅｓｓｅｌフィルターにより１０ｋＨｚで感覚変換電流をフィルタリングし、１６ビ
ットの収集ボード（Ｄｉｇｉｄａｔａ １４４０Ａ）およびｐＣＬＡＭＰ１０ソフトウエ
ア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により≧２０ｋＨｚにデジタル化した。Ｏｒ
ｉｇｉｎＰｒｏ８（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ）を使用するオフラインで解析のためにデータを
記録した。
図２９は、突然変異体マウス（図２９Ｂ）に対するＡｎｃ８０－ＫＣＮＱ４でトランス
フェクトしたＫＣＮＱ４－／－細胞（図１０Ｃ）における野生型レベル近くまでのカリウ
ム流の回復を示し（図２９Ａ）、それにより、Ａｎｃ８０を使用する遺伝子治療が機能を
回復できることを実証している。
実施例３Ｅ－聴性脳幹反応（ＡＢＲ）
先に記載の通りに（Maison et al., 2010, J. Neurosci., 30:6751-62）、ＡＢＲ記録
を行った。すなわち、Ｐ２５～Ｐ３０のマウスを、５ｍｌの０．９％食塩水に希釈した５
０ｍｇのケタミンおよび５ｍｇのキシラジンを含むＩＰ注射（０．１ｍｌ／１０ｇ体重）
により麻酔した。ＡＢＲ実験を、３２℃において防音チャンバー内で実施した。聴覚機能
を試験するために、１０から１１５ｄＢの間、５ｄＢずつの音圧レベルにおいて、再現可
能なＡＢＲ波形（ピークＩ～ＩＶ）を誘発する閾値強度を検出するまで、５．６ｋＨｚ、
８ｋＨｚ、１１．３ｋＨｚ、１６ｋＨｚ、２２．６ｋＨｚまたは３２ｋＨｚの純音刺激を
マウスに提示する。交番極性刺激を使用して、５１２～１０２４の反応を集め、各音圧レ
ベルについて平均した。１５μＶ（最高最低間）より大きな振幅を有する波形は、「アー
チファクト除去」機能により捨てた。
ＡＢＲ試験の開始前、典型的に外耳道の入り口を見えなくする、垂れ下がった皮膚およ
び軟骨を解剖はさみによって切り取り、すべての刺激周波数において、各個別の被験対象
について外耳道の入り口の音圧を較正した。音刺激を、プライマリートーンを生成するた
めの２つの静電イヤホン（ＣＵＩ Ｍｉｎｉａｔｕｒｅ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）および外耳
道内音圧を記録するためのＫｎｏｗｌｅｓミニチュアマイクロフォン（エレクトレットコ
ンデンサ）からなる慣用のプローブチューブスピーカー／マイクロフォンアセンブリ（Ｅ
ＰＬ ＰＸＩ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって、試験される耳に直接送達した。音刺激は、５
ミリ秒のバースト音（ｃｏｓ２開始で０．５ミリ秒の上昇下降で、４０／秒で送達された
）。
耳介（活動電極）、頭頂（参照電極）および尻（接地電極）に挿入した皮下針電極を使
用して、ＡＢＲシグナルを収集した。ＡＢＲ電位を増幅し（１０，０００×）、パスフィ
ルタリングし（０．３～１０ｋＨｚ）、慣用のデータ取得ソフトウエア（ＬａｂＶＩＥＷ
）を使用してデジタル化した。デジタルＩ－Ｏボード（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔｓ）を使用して、音刺激および電極電圧を４０μ秒の間隔でサンプリングし、オ
フライン解析のために保管した。音の強さが増大するにつれて任意の波（Ｉ－ＩＶ）が検
出され、再現された最低デシベルレベルとして、閾値を視覚的に定義した。各実験群内で
ＡＢＲ閾値を平均し、統計解析のために使用した。
図２７は、Ｈａｒｍｏｎｉｎをコードし、発現するＡｎｃ８０ウイルスベクターの送達
が、特に、低い周波数（例えば、約５～約２２ｋＨｚ）において、聴覚機能の完全に近い
回復をもたらすことができることを図により実証している。
実施例３Ｆ－定量的ＲＴ－ＰＣＲ解析
インビボ投与後に蝸牛中に存在するウイルス量を評価するために実験を行った。２頭の
ＴＭＣ１－／－マウスに、Ｐ１で左耳に注入した。蝸牛を左右の耳から切除し、Ｐ１０に
相当する３日間培養中に維持した。ＲＮＡを抽出し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙ
ｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して質を確認し、先に記載
の通りに（Kawashima et al., 2011, J. Clin. Invest., 121:4796-809）ＳＹＢＲ Ｇｒ
ｅｅｎＥＲ ｑＰＣＲ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する、ＴＭＣ１特異的な効率
的プライマーセットによる定量的ＲＴ－ＰＣＲ解析のためにｃＤＮＡに逆転写した。
ＴＭＣ１の断片を増幅するために、以下のプライマー：５’－ＣＡＴ ＣＴＧ ＣＡＧ
ＣＣＡ ＡＣＴ ＴＴＧ ＧＴＧ ＴＧＴ－３’（配列番号１７）および５’－ＡＧＡ
ＧＧＴ ＡＧＣ ＣＧＧ ＡＡＡ ＴＴＣ ＡＧＣ ＣＡＴ－３’（配列番号１８）を
使用した。発現レベルを、５’－ＴＧＡ ＧＣＧ ＣＡＡ ＧＴＡ ＣＴＣ ＴＧＴ Ｇ
ＴＧ ＧＡＴ－３’（配列番号１９）および５’－ＡＣＴ ＣＡＴ ＣＧＴ ＡＣＴ Ｃ
ＣＴ ＧＣＴ ＴＧＣ ＴＧＡ－３’（配列番号２０）により増幅した（β－アクチンを
コードする）Ａｃｔｂの発現レベルに正規化した。すべてのプライマーを、イントロンに
橋をかけるようデザインし、融解曲線解析および陰性対照を使用して検証した。Ａｃｔｂ
ならびに注入したおよび注入しない耳の間の相違に関連して、ΔΔＣＴ法を使用してデー
タを解析した。
これらの結果は、注入した耳において、注入しない耳よりもＴＭＣ１ ｍＲＮＡの発現
が１２倍高かったことを実証している。
実施例３Ｇ－ＦＭ１－４３の標識化
ＦＭ１－４３色素ローディング実験を先に記載の通りに実施した（Gale et al., 2001,
J. Neurosci., 21:7013-25; Meyers et al., 2003, J. Neurosci., 23:4054-65;およびG
eleoc & Holt, 2003, Nat. Neurosci., 10:1019-20）。接着性の蝸牛培養を有するカバー
ガラスを、ガラス底のチャンバー上の正立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ Ｆ
Ｓ Ｐｌｕｓ）下に置いた。人工の外リンパ液で希釈した５μＭのＦＭ１－４３ＦＸ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１０秒間添加し、人工の外リンパ液で組織を３回洗浄して、細
胞膜の外葉から色素を除去した。５分後、細胞内ＦＭ１－４３を、ＦＭ１－４３フィルタ
ーセットおよび６３Ｘ水浸対物レンズを有する落射蛍光光源を使用してイメージングした
。上記の通りに、組織を固定し、免疫蛍光法のために加工した。
図３０は、本明細書に記載のＡｎｃ８０ウイルスベクターに曝露した細胞によるＦＭ１
－４３色素の取り込みを示す、免疫染色画像であり、図３１は、本明細書に記載のＡｎｃ
８０ウイルスベクターにより送達されたＴＭＣ１が、インビボでＴｍｃ１欠損有毛細胞に
おいて感覚変換を回復させたことを図により実証している。
実施例３Ｈ－歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）
ＡＢＲデータと同じ条件下で、同じ記録セッションの間にＤＰＯＡＥデータを収集した
。２ｆ１－ｆ２でのＤＰＯＡＥの生成のために１．２の周波数割合（ｆ２／ｆ１）でプラ
イマリートーンを作り、各ｆ２／ｆ１対について、ｆ２レベルはｆ１レベルよりも１０ｄ
Ｂ、音圧レベル低かった。ｆ２レベルを、５－ｄＢずつ２０から８０ｄＢまで動かした。
記録した外耳道音圧のシグナル対ノイズ比を増加させるために、波形およびスペクトル平
均化を各レベルで使用した。平均したスペクトルから、２ｆ１－ｆ２におけるＤＰＯＡＥ
の振幅を、スペクトルの隣接点におけるノイズフロアとともに抽出した。ＤＰＯＡＥ振幅
対音レベルのプロットから、等反応曲線を内挿した。閾値を、０ｄＢにおいてＤＰＯＡＥ
を生成するために必要なｆ２レベルとして定義した。
図３２は、本明細書に記載のＡｎｃ８０ウイルスベクターを使用して送達したＴＭＣ１
が、ＴＭＣ１－／－マウス、特に低周波数（例えば、約５～約１６ｋＨｚ）において、外
有毛細胞の機能をレスキューすることを図により実証する。
他の実施形態
方法および物質の組成物が、多くの異なる態様と併せて本明細書に記載されたが、様々
な態様の上記記載が、例示を目的とし、方法および物質の組成物の範囲を制限するもので
ないことは理解されるべきである。他の態様、利益および改変は、以下の特許請求の範囲
の範囲内にある。
開示されるのは、開示された方法および組成物のために使用可能であり、それをともに
使用可能であり、その準備において使用可能であり、またはその生成物である、方法およ
び組成物である。これらおよびその他の材料が本明細書に記載され、これらの方法および
組成物の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されることが理解される。す
なわち、様々な個々のものおよび集合的な組み合わせの具体的な参照およびこれらの組成
物および方法の並べ替えは、明示的に開示されないかもしれないが、それぞれが具体的に
考慮され、本明細書に記載される。例えば、物質の特別な組成物または特別な方法が開示
され、議論され、多数の組成物または方法が議論される場合、組成物および方法のそれぞ
れならびに各組み合わせおよび並べ替えは、特にそうでないと示されない限り、具体的に
考慮される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも、具体的に考慮され
、開示される。
開示されるのは、開示された方法および組成物のために使用可能であり、それをともに使用可能であり、その準備において使用可能であり、またはその生成物である、方法および組成物である。これらおよびその他の材料が本明細書に記載され、これらの方法および組成物の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されることが理解される。すなわち、様々な個々のものおよび集合的な組み合わせの具体的な参照およびこれらの組成物および方法の並べ替えは、明示的に開示されないかもしれないが、それぞれが具体的に考慮され、本明細書に記載される。例えば、物質の特別な組成物または特別な方法が開示され、議論され、多数の組成物または方法が議論される場合、組成物および方法のそれぞれならびに各組み合わせおよび並べ替えは、特にそうでないと示されない限り、具体的に考慮される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも、具体的に考慮され、開示される。

本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．Ａｎｃ８０カプシドタンパク質、およびＴＭＣ１、ＴＭＣ２、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＣＨ１Ｃ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＳＡＮＳ、ＣＩＢ２、ＵＳＨ２Ａ、ＶＬＧＲ１、ＷＨＲＮ、ＣＬＲＮ１、ＰＤＺＤ７からなる群から選択される１つまたは複数の導入遺伝子を含む、ＡＶＶベクター。
２．対象の内耳中の１つまたは複数の細胞に導入遺伝子を送達する方法であって、
対象の内耳にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を投与するステップを含み、前記ＡＡＶはＡｎｃ８０カプシドタンパク質および導入遺伝子を含む、方法。
３．前記内耳中の１つまたは複数の細胞が、内有毛細胞（ＩＨＣ）および外有毛細胞（ＯＨＣ）からなる群から選択される、上記２に記載の方法。
４．前記導入遺伝子が、内有毛細胞の少なくとも８０％および外有毛細胞の少なくとも８０％に送達される、上記３に記載の方法。
５．前記内耳中の１つまたは複数の細胞が、らせん神経節ニューロン、前庭有毛細胞、前庭神経節ニューロン、支持細胞および血管条中の細胞からなる群から選択される、上記２に記載の方法。
６．前記導入遺伝子が、ＡＣＴＧ１、ＡＤＣＹ１、ＡＴＯＨＩ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ１、ＢＤＮＦ、ＢＤＰ１、ＢＳＮＤ、ＤＡＴＳＰＥＲ２、ＣＡＢＰ２、ＣＤ１６４、ＣＤＣ１４Ａ、ＣＤＨ２３、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＨＤ７、ＣＣＤＣ５０、ＣＩＢ２、ＣＬＤＮ１４、ＣＬＩＣ５、ＣＬＰＰ、ＣＬＲＮ１、ＣＯＣＨ、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２、ＣＲＹＭ、ＤＣＤＣ２、ＤＦＮＡ５、ＤＦＮＢ３１、ＤＦＮＢ５９、ＤＩＡＰＨ１、ＥＤＮ３、ＥＤＮＲＢ、ＥＬＭＯＤ３、ＥＭＯＤ３、ＥＰＳ８、ＥＰＳ８Ｌ２、ＥＳＰＮ、ＥＳＲＲＢ、ＥＹＡ１、ＥＹＡ４、ＦＡＭ６５Ｂ、ＦＯＸＩ１、ＧＩＰＣ３、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ６、ＧＰＲ９８、ＧＲＨＬ２、ＧＰＳＭ２、ＧＲＸＣＲ１、ＧＲＸＣＲ２、ＨＡＲＳ２、ＨＧＦ、ＨＯＭＥＲ２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＩＬＤＲ１、ＫＡＲＳ、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＪ１０、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ４、ＫＩＴＬＧ、ＬＡＲＳ２、ＬＨＦＰＬ５、ＬＯＸＨＤ１、ＬＲＴＯＭＴ、ＭＡＲＶＥＬＤ２、ＭＣＭ２、ＭＥＴ、ＭＩＲ１８３、ＭＩＲＮ９６、ＭＩＴＦ、ＭＳＲＢ３、ＭＴ－ＲＮＲ１、ＭＴ－ＴＳ１、ＭＹＨ１４、ＭＹＨ９、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ１Ａ、ＭＹＯ３Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ７Ａ、ＮＡＲＳ２、ＮＤＰ、ＮＦ２、ＮＴ３、ＯＳＢＰＬ２、ＯＴＯＡ、ＯＴＯＦ、ＯＴＯＧ、ＯＴＯＧＬ、Ｐ２ＲＸ２、ＰＡＸ３、ＰＣＤＨ１５、ＰＤＺＤ７、ＰＪＶＫ、ＰＮＰＴ１、ＰＯＬＲ１Ｄ、ＰＯＬＲ１Ｃ、ＰＯＵ３Ｆ４、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＲＰＳ１、ＰＴＰＲＱ、ＲＤＸ、Ｓ１ＰＲ２、ＳＡＮＳ、ＳＥＭＡ３Ｅ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＳＬＣ１７Ａ８、ＳＬＣ２２Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ５、ＳＩＸ１、ＳＩＸ５、ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯ、ＳＮＡＩ２、ＳＯＸ１０、ＳＴＲＣ、ＳＹＮＥ４、ＴＢＣ１Ｄ２４、ＴＣＯＦ１、ＴＥＣＴＡ、ＴＩＭＭ８Ａ、ＴＪＰ２、ＴＮＣ、ＴＭＣ１、ＴＭＣ２、ＴＭＩＥ、ＴＭＥＭ１３２Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＲＰＮ、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＳＰＥＡＲ、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ、ＵＳＨ２Ｄ、ＶＬＧＲ１、ＷＦＳ１、ＷＨＲＮ、およびＸＩＡＰからなる群から選択される、上記２に記載の方法。
７．前記導入遺伝子が、神経栄養因子をコードする、上記２に記載の方法。
８．前記神経栄養因子が、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３およびＨＳＰ７０からなる群から選択される、上記７に記載の方法。
９．前記導入遺伝子が、抗体またはその断片をコードする、上記２に記載の方法。
１０．前記導入遺伝子が、免疫調節タンパク質をコードする、上記２に記載の方法。
１１．前記導入遺伝子が、抗発癌性転写物をコードする、上記２に記載の方法。
１２．前記導入遺伝子が、アンチセンス、サイレンシング、または長鎖非コードＲＮＡ種をコードする、上記２に記載の方法。
１３．前記導入遺伝子が、遺伝子操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲからなる群から選択されるゲノム編集システムをコードする、上記２に記載の方法。
１４．前記Ａｎｃ８０カプシドタンパク質が、配列番号１に示される配列を有する、上記２に記載の方法。
１５．前記Ａｎｃ８０カプシドタンパク質が、配列番号２に示される配列を有する、上記２に記載の方法。
１６．前記導入遺伝子が、異種プロモーター配列の制御下にある、上記３に記載の方法。１７．前記異種プロモーター配列が、ＣＭＶプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ－１プロモーター、アルファ９ニコチン受容体プロモーター、プレスチンプロモーター、ＫＣＮＱ４プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、Ｍｙｏ６プロモーター、Ｇｆｉｌプロモーター、Ｖｇｌｕｔ３プロモーターおよびＡｔｏｈ１プロモーターからなる群から選択される、上記１６に記載の方法。
１８．前記投与するステップが、蝸牛窓を通してＡｎｃＡＡＶを注入することを含む、上記２に記載の方法。
１９．前記ＡｎｃＡＡＶが、蝸牛窓を通る注入により投与される、上記２に記載の方法。２０．前記ＡｎｃＡＡＶが、蝸牛開窓術の間またはカナロストミーの間に投与される、上記２に記載の方法。
２１．前記ＡｎｃＡＡＶが、１つまたは複数のドラッグデリバリービヒクルによって中耳および／または蝸牛窓に投与される、上記２に記載の方法。
２２．前記導入遺伝子の発現が、内有毛細胞（ＩＨＣ）、外有毛細胞（ＯＨＣ）、らせん神経節ニューロン、血管条、前庭有毛細胞および／または前庭神経節ニューロンの再生をもたらし、それによって、聴覚または前庭機能を回復させる、上記２に記載の方法。
２３．ＡＡＶベクターおよび医薬組成物を含む製造品であって、前記ＡＡＶベクターは、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質およびプロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を含む、製造品。
２４．前記導入遺伝子が、ＡＣＴＧ１、ＡＤＣＹ１、ＡＴＯＨＩ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ１、ＢＤＮＦ、ＢＤＰ１、ＢＳＮＤ、ＤＡＴＳＰＥＲ２、ＣＡＢＰ２、ＣＤ１６４、ＣＤＣ１４Ａ、ＣＤＨ２３、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＨＤ７、ＣＣＤＣ５０、ＣＩＢ２、ＣＬＤＮ１４、ＣＬＩＣ５、ＣＬＰＰ、ＣＬＲＮ１、ＣＯＣＨ、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２、ＣＲＹＭ、ＤＣＤＣ２、ＤＦＮＡ５、ＤＦＮＢ３１、ＤＦＮＢ５９、ＤＩＡＰＨ１、ＥＤＮ３、ＥＤＮＲＢ、ＥＬＭＯＤ３、ＥＭＯＤ３、ＥＰＳ８、ＥＰＳ８Ｌ２、ＥＳＰＮ、ＥＳＲＲＢ、ＥＹＡ１、ＥＹＡ４、ＦＡＭ６５Ｂ、ＦＯＸＩ１、ＧＩＰＣ３、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ６、ＧＰＲ９８、ＧＲＨＬ２、ＧＰＳＭ２、ＧＲＸＣＲ１、ＧＲＸＣＲ２、ＨＡＲＳ２、ＨＧＦ、ＨＯＭＥＲ２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＩＬＤＲ１、ＫＡＲＳ、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＪ１０、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ４、ＫＩＴＬＧ、ＬＡＲＳ２、ＬＨＦＰＬ５、ＬＯＸＨＤ１、ＬＲＴＯＭＴ、ＭＡＲＶＥＬＤ２、ＭＣＭ２、ＭＥＴ、ＭＩＲ１８３、ＭＩＲＮ９６、ＭＩＴＦ、ＭＳＲＢ３、ＭＴ－ＲＮＲ１、ＭＴ－ＴＳ１、ＭＹＨ１４、ＭＹＨ９、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ１Ａ、ＭＹＯ３Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ７Ａ、ＮＡＲＳ２、ＮＤＰ、ＮＦ２、ＮＴ３、ＯＳＢＰＬ２、ＯＴＯＡ、ＯＴＯＦ、ＯＴＯＧ、ＯＴＯＧＬ、Ｐ２ＲＸ２、ＰＡＸ３、ＰＣＤＨ１５、ＰＤＺＤ７、ＰＪＶＫ、ＰＮＰＴ１、ＰＯＬＲ１Ｄ、ＰＯＬＲ１Ｃ、ＰＯＵ３Ｆ４、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＲＰＳ１、ＰＴＰＲＱ、ＲＤＸ、Ｓ１ＰＲ２、ＳＡＮＳ、ＳＥＭＡ３Ｅ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＳＬＣ１７Ａ８、ＳＬＣ２２Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ５、ＳＩＸ１、ＳＩＸ５、ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯ、ＳＮＡＩ２、ＳＯＸ１０、ＳＴＲＣ、ＳＹＮＥ４、ＴＢＣ１Ｄ２４、ＴＣＯＦ１、ＴＥＣＴＡ、ＴＩＭＭ８Ａ、ＴＪＰ２、ＴＮＣ、ＴＭＣ１、ＴＭＣ２、ＴＭＩＥ、ＴＭＥＭ１３２Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＲＰＮ、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＳＰＥＡＲ、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ、ＵＳＨ２Ｄ、ＶＬＧＲ１、ＷＦＳ１、ＷＨＲＮ、およびＸＩＡＰからなる群から選択される、上記２３に記載の製造品。
２５．対象の内耳中の１つまたは複数の細胞にＴＭＣ１またはＴＭＣ２導入遺伝子を送達する方法であって、
対象の内耳にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を投与するステップを含み、前記ＡＡＶは、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質および導入遺伝子を含む、方法。
２６．対象の内耳中の１つまたは複数の細胞にアッシャー導入遺伝子を送達する方法であって、
対象の内耳にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を投与するステップを含み、前記ＡＡＶは、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質および導入遺伝子を含む、方法。
２７．前記アッシャー導入遺伝子が、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＣＨ１Ｃ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＳＡＮＳ、ＣＩＢ２、ＵＳＨ２Ａ、ＶＬＧＲ１、ＷＨＲＮ、ＣＬＲＮ１、ＰＤＺＤ７からなる群から選択される、上記２５または２６に記載の方法。
２８．前記内耳中の１つまたは複数の細胞が、内有毛細胞（ＩＨＣ）および外有毛細胞（ＯＨＣ）からなる群から選択される、上記２５または２６に記載の方法。
２９．前記導入遺伝子が、内有毛細胞の少なくとも８０％および外有毛細胞の少なくとも８０％に送達される、上記２８に記載の方法。
３０．前記内耳中の１つまたは複数の細胞が、らせん神経節ニューロン、前庭有毛細胞、前庭神経節ニューロン、支持細胞および血管条中の細胞からなる群から選択される、上記２５または２６に記載の方法。
３１．前記Ａｎｃ８０カプシドタンパク質が、配列番号１に示される配列を有する、上記２５または２６に記載の方法。
３２．前記Ａｎｃ８０カプシドタンパク質が、配列番号２に示される配列を有する、上記２５または２６に記載の方法。
３３．前記導入遺伝子が、異種プロモーター配列の制御下にある、上記２５または２６に記載の方法。
３４．前記異種プロモーター配列が、ＣＭＶプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ－１プロモーター、アルファ９ニコチン受容体プロモーター、プレスチンプロモーター、ＫＣＮＱ４プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、Ｍｙｏ６プロモーター、Ｇｆｉｌプロモーター、Ｖｇｌｕｔ３プロモーターおよびＡｔｏｈ１プロモーターからなる群から選択される、上記３３に記載の方法。
３５．前記投与するステップが、蝸牛窓を通してＡｎｃＡＡＶを注入することを含む、上記２５または２６に記載の方法。
３６．前記ＡｎｃＡＡＶが、蝸牛窓を通る注入により投与される、上記２５または２６に記載の方法。
３７．前記ＡｎｃＡＡＶが、蝸牛開窓術の間またはカナロストミーの間に投与される、上記２５または２６に記載の方法。
３８．前記ＡｎｃＡＡＶが、１つまたは複数のドラッグデリバリービヒクルによって中耳および／または蝸牛窓に投与される、上記２５または２６に記載の方法。
３９．前記導入遺伝子の発現が、内有毛細胞（ＩＨＣ）、外有毛細胞（ＯＨＣ）、らせん神経節ニューロン、血管条、前庭有毛細胞および／または前庭神経節ニューロンの再生をもたらし、それによって、聴覚または前庭機能を回復させる、上記２５または２６に記載の方法。

Claims (39)

  1. Ａｎｃ８０カプシドタンパク質、およびＴＭＣ１、ＴＭＣ２、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＣＨ１
    Ｃ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＳＡＮＳ、ＣＩＢ２、ＵＳＨ２Ａ、ＶＬＧＲ１、ＷＨＲ
    Ｎ、ＣＬＲＮ１、ＰＤＺＤ７からなる群から選択される１つまたは複数の導入遺伝子を含
    む、ＡＶＶベクター。
  2. 対象の内耳中の１つまたは複数の細胞に導入遺伝子を送達する方法であって、
    対象の内耳にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を投与するステップを含み、前記ＡＡＶは
    Ａｎｃ８０カプシドタンパク質および導入遺伝子を含む、方法。
  3. 前記内耳中の１つまたは複数の細胞が、内有毛細胞（ＩＨＣ）および外有毛細胞（ＯＨ
    Ｃ）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
  4. 前記導入遺伝子が、内有毛細胞の少なくとも８０％および外有毛細胞の少なくとも８０
    ％に送達される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記内耳中の１つまたは複数の細胞が、らせん神経節ニューロン、前庭有毛細胞、前庭
    神経節ニューロン、支持細胞および血管条中の細胞からなる群から選択される、請求項２
    に記載の方法。
  6. 前記導入遺伝子が、ＡＣＴＧ１、ＡＤＣＹ１、ＡＴＯＨＩ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ１、ＢＤＮ
    Ｆ、ＢＤＰ１、ＢＳＮＤ、ＤＡＴＳＰＥＲ２、ＣＡＢＰ２、ＣＤ１６４、ＣＤＣ１４Ａ、
    ＣＤＨ２３、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＨＤ７、ＣＣＤＣ５０、ＣＩＢ２、ＣＬＤＮ１４、Ｃ
    ＬＩＣ５、ＣＬＰＰ、ＣＬＲＮ１、ＣＯＣＨ、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ
    ４、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２、Ｃ
    ＲＹＭ、ＤＣＤＣ２、ＤＦＮＡ５、ＤＦＮＢ３１、ＤＦＮＢ５９、ＤＩＡＰＨ１、ＥＤＮ
    ３、ＥＤＮＲＢ、ＥＬＭＯＤ３、ＥＭＯＤ３、ＥＰＳ８、ＥＰＳ８Ｌ２、ＥＳＰＮ、ＥＳ
    ＲＲＢ、ＥＹＡ１、ＥＹＡ４、ＦＡＭ６５Ｂ、ＦＯＸＩ１、ＧＩＰＣ３、ＧＪＢ２、ＧＪ
    Ｂ３、ＧＪＢ６、ＧＰＲ９８、ＧＲＨＬ２、ＧＰＳＭ２、ＧＲＸＣＲ１、ＧＲＸＣＲ２、
    ＨＡＲＳ２、ＨＧＦ、ＨＯＭＥＲ２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＩＬＤＲ１、ＫＡＲＳ、ＫＣＮＥ
    １、ＫＣＮＪ１０、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ４、ＫＩＴＬＧ、ＬＡＲＳ２、ＬＨＦＰＬ５、
    ＬＯＸＨＤ１、ＬＲＴＯＭＴ、ＭＡＲＶＥＬＤ２、ＭＣＭ２、ＭＥＴ、ＭＩＲ１８３、Ｍ
    ＩＲＮ９６、ＭＩＴＦ、ＭＳＲＢ３、ＭＴ－ＲＮＲ１、ＭＴ－ＴＳ１、ＭＹＨ１４、ＭＹ
    Ｈ９、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ１Ａ、ＭＹＯ３Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ７Ａ、ＮＡＲＳ２、Ｎ
    ＤＰ、ＮＦ２、ＮＴ３、ＯＳＢＰＬ２、ＯＴＯＡ、ＯＴＯＦ、ＯＴＯＧ、ＯＴＯＧＬ、Ｐ
    ２ＲＸ２、ＰＡＸ３、ＰＣＤＨ１５、ＰＤＺＤ７、ＰＪＶＫ、ＰＮＰＴ１、ＰＯＬＲ１Ｄ
    、ＰＯＬＲ１Ｃ、ＰＯＵ３Ｆ４、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＲＰＳ１、ＰＴＰＲＱ、ＲＤＸ、Ｓ１
    ＰＲ２、ＳＡＮＳ、ＳＥＭＡ３Ｅ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＳＬＣ１７Ａ８、ＳＬＣ２２Ａ４
    、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ５、ＳＩＸ１、ＳＩＸ５、ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯ、Ｓ
    ＮＡＩ２、ＳＯＸ１０、ＳＴＲＣ、ＳＹＮＥ４、ＴＢＣ１Ｄ２４、ＴＣＯＦ１、ＴＥＣＴ
    Ａ、ＴＩＭＭ８Ａ、ＴＪＰ２、ＴＮＣ、ＴＭＣ１、ＴＭＣ２、ＴＭＩＥ、ＴＭＥＭ１３２
    Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＲＰＮ、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＳＰＥＡＲ、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ
    、ＵＳＨ２Ａ、ＵＳＨ２Ｄ、ＶＬＧＲ１、ＷＦＳ１、ＷＨＲＮ、およびＸＩＡＰからなる
    群から選択される、請求項２に記載の方法。
  7. 前記導入遺伝子が、神経栄養因子をコードする、請求項２に記載の方法。
  8. 前記神経栄養因子が、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３およびＨＳＰ７０からなる群から選
    択される、請求項７に記載の方法。
  9. 前記導入遺伝子が、抗体またはその断片をコードする、請求項２に記載の方法。
  10. 前記導入遺伝子が、免疫調節タンパク質をコードする、請求項２に記載の方法。
  11. 前記導入遺伝子が、抗発癌性転写物をコードする、請求項２に記載の方法。
  12. 前記導入遺伝子が、アンチセンス、サイレンシング、または長鎖非コードＲＮＡ種をコ
    ードする、請求項２に記載の方法。
  13. 前記導入遺伝子が、遺伝子操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよ
    びＣＲＩＳＰＲからなる群から選択されるゲノム編集システムをコードする、請求項２に
    記載の方法。
  14. 前記Ａｎｃ８０カプシドタンパク質が、配列番号１に示される配列を有する、請求項２
    に記載の方法。
  15. 前記Ａｎｃ８０カプシドタンパク質が、配列番号２に示される配列を有する、請求項２
    に記載の方法。
  16. 前記導入遺伝子が、異種プロモーター配列の制御下にある、請求項３に記載の方法。
  17. 前記異種プロモーター配列が、ＣＭＶプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＡＳＩプ
    ロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ－１プロモーター、アルファ９ニコチン受容体プ
    ロモーター、プレスチンプロモーター、ＫＣＮＱ４プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモータ
    ー、Ｍｙｏ６プロモーター、Ｇｆｉｌプロモーター、Ｖｇｌｕｔ３プロモーターおよびＡ
    ｔｏｈ１プロモーターからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記投与するステップが、蝸牛窓を通してＡｎｃＡＡＶを注入することを含む、請求項
    ２に記載の方法。
  19. 前記ＡｎｃＡＡＶが、蝸牛窓を通る注入により投与される、請求項２に記載の方法。
  20. 前記ＡｎｃＡＡＶが、蝸牛開窓術の間またはカナロストミーの間に投与される、請求項
    ２に記載の方法。
  21. 前記ＡｎｃＡＡＶが、１つまたは複数のドラッグデリバリービヒクルによって中耳およ
    び／または蝸牛窓に投与される、請求項２に記載の方法。
  22. 前記導入遺伝子の発現が、内有毛細胞（ＩＨＣ）、外有毛細胞（ＯＨＣ）、らせん神経
    節ニューロン、血管条、前庭有毛細胞および／または前庭神経節ニューロンの再生をもた
    らし、それによって、聴覚または前庭機能を回復させる、請求項２に記載の方法。
  23. ＡＡＶベクターおよび医薬組成物を含む製造品であって、前記ＡＡＶベクターは、Ａｎ
    ｃ８０カプシドタンパク質およびプロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を含む
    、製造品。
  24. 前記導入遺伝子が、ＡＣＴＧ１、ＡＤＣＹ１、ＡＴＯＨＩ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ１、ＢＤＮ
    Ｆ、ＢＤＰ１、ＢＳＮＤ、ＤＡＴＳＰＥＲ２、ＣＡＢＰ２、ＣＤ１６４、ＣＤＣ１４Ａ、
    ＣＤＨ２３、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＨＤ７、ＣＣＤＣ５０、ＣＩＢ２、ＣＬＤＮ１４、Ｃ
    ＬＩＣ５、ＣＬＰＰ、ＣＬＲＮ１、ＣＯＣＨ、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ
    ４、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２、Ｃ
    ＲＹＭ、ＤＣＤＣ２、ＤＦＮＡ５、ＤＦＮＢ３１、ＤＦＮＢ５９、ＤＩＡＰＨ１、ＥＤＮ
    ３、ＥＤＮＲＢ、ＥＬＭＯＤ３、ＥＭＯＤ３、ＥＰＳ８、ＥＰＳ８Ｌ２、ＥＳＰＮ、ＥＳ
    ＲＲＢ、ＥＹＡ１、ＥＹＡ４、ＦＡＭ６５Ｂ、ＦＯＸＩ１、ＧＩＰＣ３、ＧＪＢ２、ＧＪ
    Ｂ３、ＧＪＢ６、ＧＰＲ９８、ＧＲＨＬ２、ＧＰＳＭ２、ＧＲＸＣＲ１、ＧＲＸＣＲ２、
    ＨＡＲＳ２、ＨＧＦ、ＨＯＭＥＲ２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＩＬＤＲ１、ＫＡＲＳ、ＫＣＮＥ
    １、ＫＣＮＪ１０、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ４、ＫＩＴＬＧ、ＬＡＲＳ２、ＬＨＦＰＬ５、
    ＬＯＸＨＤ１、ＬＲＴＯＭＴ、ＭＡＲＶＥＬＤ２、ＭＣＭ２、ＭＥＴ、ＭＩＲ１８３、Ｍ
    ＩＲＮ９６、ＭＩＴＦ、ＭＳＲＢ３、ＭＴ－ＲＮＲ１、ＭＴ－ＴＳ１、ＭＹＨ１４、ＭＹ
    Ｈ９、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ１Ａ、ＭＹＯ３Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ７Ａ、ＮＡＲＳ２、Ｎ
    ＤＰ、ＮＦ２、ＮＴ３、ＯＳＢＰＬ２、ＯＴＯＡ、ＯＴＯＦ、ＯＴＯＧ、ＯＴＯＧＬ、Ｐ
    ２ＲＸ２、ＰＡＸ３、ＰＣＤＨ１５、ＰＤＺＤ７、ＰＪＶＫ、ＰＮＰＴ１、ＰＯＬＲ１Ｄ
    、ＰＯＬＲ１Ｃ、ＰＯＵ３Ｆ４、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＲＰＳ１、ＰＴＰＲＱ、ＲＤＸ、Ｓ１
    ＰＲ２、ＳＡＮＳ、ＳＥＭＡ３Ｅ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＳＬＣ１７Ａ８、ＳＬＣ２２Ａ４
    、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ５、ＳＩＸ１、ＳＩＸ５、ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯ、Ｓ
    ＮＡＩ２、ＳＯＸ１０、ＳＴＲＣ、ＳＹＮＥ４、ＴＢＣ１Ｄ２４、ＴＣＯＦ１、ＴＥＣＴ
    Ａ、ＴＩＭＭ８Ａ、ＴＪＰ２、ＴＮＣ、ＴＭＣ１、ＴＭＣ２、ＴＭＩＥ、ＴＭＥＭ１３２
    Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＲＰＮ、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＳＰＥＡＲ、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ
    、ＵＳＨ２Ａ、ＵＳＨ２Ｄ、ＶＬＧＲ１、ＷＦＳ１、ＷＨＲＮ、およびＸＩＡＰからなる
    群から選択される、請求項２３に記載の製造品。
  25. 対象の内耳中の１つまたは複数の細胞にＴＭＣ１またはＴＭＣ２導入遺伝子を送達する
    方法であって、
    対象の内耳にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を投与するステップを含み、前記ＡＡＶは
    、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質および導入遺伝子を含む、方法。
  26. 対象の内耳中の１つまたは複数の細胞にアッシャー導入遺伝子を送達する方法であって
    、
    対象の内耳にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を投与するステップを含み、前記ＡＡＶは
    、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質および導入遺伝子を含む、方法。
  27. 前記アッシャー導入遺伝子が、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＣＨ１Ｃ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５
    、ＳＡＮＳ、ＣＩＢ２、ＵＳＨ２Ａ、ＶＬＧＲ１、ＷＨＲＮ、ＣＬＲＮ１、ＰＤＺＤ７か
    らなる群から選択される、請求項２５または２６に記載の方法。
  28. 前記内耳中の１つまたは複数の細胞が、内有毛細胞（ＩＨＣ）および外有毛細胞（ＯＨ
    Ｃ）からなる群から選択される、請求項２５または２６に記載の方法。
  29. 前記導入遺伝子が、内有毛細胞の少なくとも８０％および外有毛細胞の少なくとも８０
    ％に送達される、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記内耳中の１つまたは複数の細胞が、らせん神経節ニューロン、前庭有毛細胞、前庭
    神経節ニューロン、支持細胞および血管条中の細胞からなる群から選択される、請求項２
    ５または２６に記載の方法。
  31. 前記Ａｎｃ８０カプシドタンパク質が、配列番号１に示される配列を有する、請求項２
    ５または２６に記載の方法。
  32. 前記Ａｎｃ８０カプシドタンパク質が、配列番号２に示される配列を有する、請求項２
    ５または２６に記載の方法。
  33. 前記導入遺伝子が、異種プロモーター配列の制御下にある、請求項２５または２６に記
    載の方法。
  34. 前記異種プロモーター配列が、ＣＭＶプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＡＳＩプ
    ロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ－１プロモーター、アルファ９ニコチン受容体プ
    ロモーター、プレスチンプロモーター、ＫＣＮＱ４プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモータ
    ー、Ｍｙｏ６プロモーター、Ｇｆｉｌプロモーター、Ｖｇｌｕｔ３プロモーターおよびＡ
    ｔｏｈ１プロモーターからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記投与するステップが、蝸牛窓を通してＡｎｃＡＡＶを注入することを含む、請求項
    ２５または２６に記載の方法。
  36. 前記ＡｎｃＡＡＶが、蝸牛窓を通る注入により投与される、請求項２５または２６に記
    載の方法。
  37. 前記ＡｎｃＡＡＶが、蝸牛開窓術の間またはカナロストミーの間に投与される、請求項
    ２５または２６に記載の方法。
  38. 前記ＡｎｃＡＡＶが、１つまたは複数のドラッグデリバリービヒクルによって中耳およ
    び／または蝸牛窓に投与される、請求項２５または２６に記載の方法。
  39. 前記導入遺伝子の発現が、内有毛細胞（ＩＨＣ）、外有毛細胞（ＯＨＣ）、らせん神経
    節ニューロン、血管条、前庭有毛細胞および／または前庭神経節ニューロンの再生をもた
    らし、それによって、聴覚または前庭機能を回復させる、請求項２５または２６に記載の
    方法。
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