JP2018536420A - 蝸牛および前庭細胞に核酸を送達するための材料および方法 - Google Patents

Abstract

本明細書に提供されるのは、蝸牛および前庭細胞に核酸を効率的に送達するための材料および方法である。

Description

本開示は、一般に、蝸牛および前庭細胞に核酸を送達するための材料および方法に関する。

遺伝的な聴覚喪失は、蝸牛移植以外の治療選択肢がわずかである重要な問題である。遺伝性の聴覚の問題は、単一の遺伝子欠損によることが多い。言語習得前の難聴は、１／５００の幼児において診断され、その約５０％は遺伝的病因を有する。それぞれが多くの異なる遺伝子のいずれかにおける突然変異によって引き起こされうる多くの異なる臨床亜型と関連するアッシャー症候群は、幼児期の難聴の３〜６％の原因であるが、より蔓延している遺伝子欠損のうちの１つは、遺伝性の難聴の１〜２％と推定され、ＴＭＣ１遺伝子において発生する。

内耳、例えば、蝸牛、特に、蝸牛中の内有毛細胞および外有毛細胞（ＩＨＣおよびＯＨＣ）は、聴覚喪失および様々な病因による難聴、最も直接的には一遺伝子性の遺伝性難聴に介入するための遺伝子治療アプローチのための魅力的な標的である。しかしながら、ＩＨＣおよびＯＨＣだけでなく、遺伝子治療アプローチに関係しうる他の内耳細胞を効率的に標的とし、形質導入することは挑戦的なことであった。

聴覚喪失は、世界的に最も一般的な感覚器障害であり、言語習得前の難聴の半分は遺伝子の原因による。それにもかかわらず、蝸牛遺伝子治療の臨床への移行は、安全で臨床的に意義のある効率的な送達モダリティーのないことによって遅らされてきた。しかしながら、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく新しい組成物および方法を含む本明細書に記載の新規遺伝子送達モダリティーは、ＩＨＣおよびＯＨＣをどちらも含む内耳細胞への高効率の遺伝子導入を提供する。本明細書に示す通り、Ａｎｃ８０または特異的Ａｎｃ８０カプシドタンパク質（例えば、Ａｎｃ８０−００６５）と呼ばれる祖先足場カプシドタンパク質を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、内耳中のＩＨＣおよびＯＨＣを含む様々な細胞をインビボで標的とすることにおいて驚くほど効率的である。

一態様において、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質およびＴＭＣ１またはＴＭＣ２導入遺伝子を含むＡＡＶベクターが提供される。別の態様において、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質、およびＭＹＯ７Ａ、ＵＳＣＨ１Ｃ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＳＡＮＳ、ＣＩＢ２、ＵＳＨ２Ａ、ＶＬＧＲ１、ＷＨＲＮ、ＣＬＲＮ１、ＰＤＺＤ７からなる群から選択される１つまたは複数の導入遺伝子を含む、ＡＡＶベクターが提供される。一実施形態において、ＡＡＶベクターは、異種プロモーターをさらに含む。

なお別の態様において、対象の内耳中の１つまたは複数の細胞に導入遺伝子を送達する方法が提供される。そのような方法は、典型的に、対象の内耳にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を投与するステップを含み、ＡＡＶは、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質および導入遺伝子を含む。

また別の態様において、対象における聴覚障害を治療する方法（例えば、聴覚回復）または聴覚喪失（もしくはさらなる聴覚喪失）を予防する方法が提供される。そのような方法は、典型的に、ＡＡＶを対象に投与するステップを含み、ＡＡＶは、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質、および内耳中の１または複数の細胞において発現したときに対象に聴覚を回復させる導入遺伝子を含む。

一実施形態において、内耳中の１つまたは複数の細胞は、内有毛細胞（ＩＨＣ）および外有毛細胞（ＯＨＣ）からなる群から選択される。一部の実施形態において、導入遺伝子は、内有毛細胞の少なくとも８０％および外有毛細胞の少なくとも８０％に送達される。一部の実施形態において、内耳中の１つまたは複数の細胞は、らせん神経節ニューロン、前庭有毛細胞、前庭神経節ニューロン、支持細胞および血管条中の細胞からなる群から選択される。

一部の実施形態において、導入遺伝子は、ＡＣＴＧ１、ＡＤＣＹ１、ＡＴＯＨＩ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ１、ＢＤＮＦ、ＢＤＰ１、ＢＳＮＤ、ＤＡＴＳＰＥＲ２、ＣＡＢＰ２、ＣＤ１６４、ＣＤＣ１４Ａ、ＣＤＨ２３、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＨＤ７、ＣＣＤＣ５０、ＣＩＢ２、ＣＬＤＮ１４、ＣＬＩＣ５、ＣＬＰＰ、ＣＬＲＮ１、ＣＯＣＨ、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２、ＣＲＹＭ、ＤＣＤＣ２、ＤＦＮＡ５、ＤＦＮＢ３１、ＤＦＮＢ５９、ＤＩＡＰＨ１、ＥＤＮ３、ＥＤＮＲＢ、ＥＬＭＯＤ３、ＥＭＯＤ３、ＥＰＳ８、ＥＰＳ８Ｌ２、ＥＳＰＮ、ＥＳＲＲＢ、ＥＹＡ１、ＥＹＡ４、ＦＡＭ６５Ｂ、ＦＯＸＩ１、ＧＩＰＣ３、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ６、ＧＰＲ９８、ＧＲＨＬ２、ＧＰＳＭ２、ＧＲＸＣＲ１、ＧＲＸＣＲ２、ＨＡＲＳ２、ＨＧＦ、ＨＯＭＥＲ２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＩＬＤＲ１、ＫＡＲＳ、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＪ１０、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ４、ＫＩＴＬＧ、ＬＡＲＳ２、ＬＨＦＰＬ５、ＬＯＸＨＤ１、ＬＲＴＯＭＴ、ＭＡＲＶＥＬＤ２、ＭＣＭ２、ＭＥＴ、ＭＩＲ１８３、ＭＩＲＮ９６、ＭＩＴＦ、ＭＳＲＢ３、ＭＴ−ＲＮＲ１、ＭＴ−ＴＳ１、ＭＹＨ１４、ＭＹＨ９、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ１Ａ、ＭＹＯ３Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ７Ａ、ＮＡＲＳ２、ＮＤＰ、ＮＦ２、ＮＴ３、ＯＳＢＰＬ２、ＯＴＯＡ、ＯＴＯＦ、ＯＴＯＧ、ＯＴＯＧＬ、Ｐ２ＲＸ２、ＰＡＸ３、ＰＣＤＨ１５、ＰＤＺＤ７、ＰＪＶＫ、ＰＮＰＴ１、ＰＯＬＲ１Ｄ、ＰＯＬＲ１Ｃ、ＰＯＵ３Ｆ４、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＲＰＳ１、ＰＴＰＲＱ、ＲＤＸ、Ｓ１ＰＲ２、ＳＡＮＳ、ＳＥＭＡ３Ｅ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＳＬＣ１７Ａ８、ＳＬＣ２２Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ５、ＳＩＸ１、ＳＩＸ５、ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯ、ＳＮＡＩ２、ＳＯＸ１０、ＳＴＲＣ、ＳＹＮＥ４、ＴＢＣ１Ｄ２４、ＴＣＯＦ１、ＴＥＣＴＡ、ＴＩＭＭ８Ａ、ＴＪＰ２、ＴＮＣ、ＴＭＣ１、ＴＭＣ２、ＴＭＩＥ、ＴＭＥＭ１３２Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＲＰＮ、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＳＰＥＡＲ、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ、ＵＳＨ２Ｄ、ＶＬＧＲ１、ＷＦＳ１、ＷＨＲＮ、およびＸＩＡＰからなる群から選択される。

一部の実施形態において、導入遺伝子は、神経栄養因子（例えば、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３およびＨＳＰ７０）をコードする。一部の実施形態において、導入遺伝子は、抗体またはその断片をコードする。一部の実施形態において、導入遺伝子は、免疫調節タンパク質をコードする。一部の実施形態において、導入遺伝子は、抗発癌性転写物をコードする。一部の実施形態において、導入遺伝子は、アンチセンス、サイレンシング、または長鎖非コードＲＮＡ種をコードする。一部の実施形態において、導入遺伝子は、遺伝子操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲからなる群から選択されるゲノム編集システムをコードする。

一部の実施形態において、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質は、配列番号１に示される配列を有する。一部の実施形態において、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質は、配列番号２に示される配列を有する。一部の実施形態において、導入遺伝子は、異種プロモーター配列の制御下にある。代表的な異種プロモーター配列としては、非限定的に、ＣＭＶプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ−１プロモーター、アルファ９ニコチン受容体プロモーター、プレスチン（prestin）プロモーター、ＫＣＮＱ４プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、Ｍｙｏ６プロモーター、Ｇｆｉｌプロモーター、Ｖｇｌｕｔ３プロモーターおよびＡｔｏｈ１プロモーターが挙げられる。

一部の実施形態において、投与するステップは、蝸牛窓を通してＡｎｃＡＡＶを注入することを含む。一部の実施形態において、ＡｎｃＡＡＶは、蝸牛窓を通る注入により投与される。一部の実施形態において、ＡｎｃＡＡＶは、蝸牛開窓術（cochleostomy）の間またはカナロストミー（canalostomy）の間に投与される。一部の実施形態において、ＡｎｃＡＡＶは、１つまたは複数のドラッグデリバリービヒクルによって中耳および／または蝸牛窓に投与される。

一部の実施形態において、導入遺伝子の発現は、内有毛細胞（ＩＨＣ）、外有毛細胞（ＯＨＣ）、らせん神経節ニューロン、血管条、前庭有毛細胞および／または前庭神経節ニューロン（例えば、Ａｔｏｈ１、ＮＦ２）の再生をもたらし、それによって、聴覚または前庭機能を回復させる。

一態様において、ＡＡＶベクターおよび医薬組成物を含む製造品が提供される。そのような製造品において、ＡＡＶベクターは、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質およびプロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を含む。一部の実施形態において、導入遺伝子は、ＡＣＴＧ１、ＡＤＣＹ１、ＡＴＯＨＩ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ１、ＢＤＮＦ、ＢＤＰ１、ＢＳＮＤ、ＤＡＴＳＰＥＲ２、ＣＡＢＰ２、ＣＤ１６４、ＣＤＣ１４Ａ、ＣＤＨ２３、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＨＤ７、ＣＣＤＣ５０、ＣＩＢ２、ＣＬＤＮ１４、ＣＬＩＣ５、ＣＬＰＰ、ＣＬＲＮ１、ＣＯＣＨ、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２、ＣＲＹＭ、ＤＣＤＣ２、ＤＦＮＡ５、ＤＦＮＢ３１、ＤＦＮＢ５９、ＤＩＡＰＨ１、ＥＤＮ３、ＥＤＮＲＢ、ＥＬＭＯＤ３、ＥＭＯＤ３、ＥＰＳ８、ＥＰＳ８Ｌ２、ＥＳＰＮ、ＥＳＲＲＢ、ＥＹＡ１、ＥＹＡ４、ＦＡＭ６５Ｂ、ＦＯＸＩ１、ＧＩＰＣ３、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ６、ＧＰＲ９８、ＧＲＨＬ２、ＧＰＳＭ２、ＧＲＸＣＲ１、ＧＲＸＣＲ２、ＨＡＲＳ２、ＨＧＦ、ＨＯＭＥＲ２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＩＬＤＲ１、ＫＡＲＳ、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＪ１０、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ４、ＫＩＴＬＧ、ＬＡＲＳ２、ＬＨＦＰＬ５、ＬＯＸＨＤ１、ＬＲＴＯＭＴ、ＭＡＲＶＥＬＤ２、ＭＣＭ２、ＭＥＴ、ＭＩＲ１８３、ＭＩＲＮ９６、ＭＩＴＦ、ＭＳＲＢ３、ＭＴ−ＲＮＲ１、ＭＴ−ＴＳ１、ＭＹＨ１４、ＭＹＨ９、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ１Ａ、ＭＹＯ３Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ７Ａ、ＮＡＲＳ２、ＮＤＰ、ＮＦ２、ＮＴ３、ＯＳＢＰＬ２、ＯＴＯＡ、ＯＴＯＦ、ＯＴＯＧ、ＯＴＯＧＬ、Ｐ２ＲＸ２、ＰＡＸ３、ＰＣＤＨ１５、ＰＤＺＤ７、ＰＪＶＫ、ＰＮＰＴ１、ＰＯＬＲ１Ｄ、ＰＯＬＲ１Ｃ、ＰＯＵ３Ｆ４、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＲＰＳ１、ＰＴＰＲＱ、ＲＤＸ、Ｓ１ＰＲ２、ＳＡＮＳ、ＳＥＭＡ３Ｅ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＳＬＣ１７Ａ８、ＳＬＣ２２Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ５、ＳＩＸ１、ＳＩＸ５、ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯ、ＳＮＡＩ２、ＳＯＸ１０、ＳＴＲＣ、ＳＹＮＥ４、ＴＢＣ１Ｄ２４、ＴＣＯＦ１、ＴＥＣＴＡ、ＴＩＭＭ８Ａ、ＴＪＰ２、ＴＮＣ、ＴＭＣ１、ＴＭＣ２、ＴＭＩＥ、ＴＭＥＭ１３２Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＲＰＮ、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＳＰＥＡＲ、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ、ＵＳＨ２Ｄ、ＶＬＧＲ１、ＷＦＳ１、ＷＨＲＮ、およびＸＩＡＰからなる群から選択される。

別の態様において、対象の内耳中の１つまたは複数の細胞にＴＭＣ１またはＴＭＣ２導入遺伝子を送達する方法が提供される。そのような方法は、典型的に、対象の内耳にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を投与するステップを含み、ＡＡＶは、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質および導入遺伝子を含む。また別の態様において、対象における聴覚障害を処置する方法が提供される。そのような方法は、典型的に、対象にＡＡＶを投与するステップを含み、ＡＡＶは、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質、および内耳中の１つまたは複数の細胞において発現したときに、対象に聴覚を回復させまたは対象における聴覚喪失（たとえば、さらなる聴覚喪失）を予防するＴＭＣ１またはＴＭＣ２導入遺伝子を含む。

なお別の態様において、対象の内耳中の１つまたは複数の細胞にアッシャー導入遺伝子を送達する方法が提供される。そのような方法は、典型的に、対象の内耳にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を投与するステップを含み、ＡＡＶは、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質および導入遺伝子を含む。また別の態様において、対象における聴覚障害を処置する方法が提供される。そのような方法は、対象にＡＡＶを投与するステップを含み、ＡＡＶは、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質、および内耳中の１つまたは複数の細胞において発現したときに、対象に聴覚を回復させるアッシャー導入遺伝子を含むことができる。代表的なアッシャー導入遺伝子としては、非限定的に、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＣＨ１Ｃ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＳＡＮＳ、ＣＩＢ２、ＵＳＨ２Ａ、ＶＬＧＲ１、ＷＨＲＮ、ＣＬＲＮ１、ＰＤＺＤ７が挙げられる。

一実施形態において、内耳中の１つまたは複数の細胞は、内有毛細胞（ＩＨＣ）および外有毛細胞（ＯＨＣ）からなる群から選択される。一実施形態において、導入遺伝子は、内有毛細胞の少なくとも８０％および外有毛細胞の少なくとも８０％に送達される。一実施形態において、内耳中の１つまたは複数の細胞は、らせん神経節ニューロン、前庭有毛細胞、前庭神経節ニューロン、支持細胞および血管条中の細胞からなる群から選択される。

一実施形態において、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質は、配列番号１に示される配列を有する。一実施形態において、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質は、配列番号２に示される配列を有する。一実施形態において、導入遺伝子は、異種プロモーター配列の制御下にある。代表的な異種プロモーター配列としては、非限定的に、ＣＭＶプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ−１プロモーター、アルファ９ニコチン受容体プロモーター、プレスチンプロモーター、ＫＣＮＱ４プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、Ｍｙｏ６プロモーター、Ｇｆｉｌプロモーター、Ｖｇｌｕｔ３プロモーターおよびＡｔｏｈ１プロモーターが挙げられる。

一実施形態において、投与するステップは、蝸牛窓を通してＡｎｃＡＡＶを注入することを含む。一実施形態において、ＡｎｃＡＡＶは、蝸牛窓を通る注入により投与される。一実施形態において、ＡｎｃＡＡＶは、蝸牛開窓術の間またはカナロストミーの間に投与される。一実施形態において、ＡｎｃＡＡＶは、１つまたは複数のドラッグデリバリービヒクルによって中耳および／または蝸牛窓に投与される。

一実施形態において、導入遺伝子の発現は、内有毛細胞（ＩＨＣ）、外有毛細胞（ＯＨＣ）、らせん神経節ニューロン、血管条、前庭有毛細胞および／または前庭神経節ニューロン（例えば、Ａｔｏｈ１、ＮＦ２）の再生をもたらし、それによって、聴覚もしくは前庭機能を回復させ、かつ／または聴覚喪失（例えば、さらなる聴覚喪失）を予防する。

別段の定めのない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、方法および物質の組成物が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものに類似するまたは等価な方法および材料が、方法および物質の組成物の実践または試験において使用されうるが、好適な方法および材料が以下に記載される。加えて、材料、方法および例は、例示的であるだけで、限定的であることを意図されない。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、参照することによりその全体として本明細書に組み込まれる。

第１部：高効率の蝸牛遺伝子導入
図１Ａ−１Ｇは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの蝸牛外植片におけるｅＧＦＰ導入遺伝子発現のための数種のＡＡＶ血清型のインビトロでの比較の代表的な共焦点投射図を示す画像である。図１Ａ〜１Ｇは、すべての血清型についての蝸牛基底（cochlear base）における発現ならびに示されるＡＡＶについての頂端および基底を示す。スケールバー＝１００μＭ。上：Ｍｙｏ７Ａ＋ＴｕＪ１；下：ｅＧＦＰのみ；中：オーバーレイ；Ｓ．細胞＝支持細胞、ＯＨＣ：外有毛細胞、ＩＨＣ：内有毛細胞、図１Ｈ〜１Ｋは、４８ｈまたは４８ｈ＋５日のインキュベーション後の１００μＭ当たりのｅＧＦＰ陽性有毛細胞のパーセンテージを示すグラフである。４８ｈについてはＮ＝３、４８ｈ＋５ｄについてはＮ＝２。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。 図２Ａ−２Ｇは、各パネルの上に示された力価の示されたＡＡＶ血清型のインビボでの蝸牛形質導入を示す画像である。図２Ａは、Ａｌｅｘａ−５４６−ファロイジン（赤色）で対比染色され、ｅＧＦＰ（緑色）についてイメージングされた、マウスコルチ器官の共焦点画像である。スケールバー＝５０μｍ。図２Ｂは、ＡＡＶ−ｅＧＦＰを注入された蝸牛の基底および頂端におけるｅＧＦＰ陽性ＩＨＣの定量化を示すグラフである。図２Ｃは、ＡＡＶ−ｅＧＦＰを注入された蝸牛の基底および頂端におけるｅＧＦＰ陽性ＯＨＣの定量化を示すグラフである。図２Ｄは、ｅＧＦＰ陰性ＯＨＣ（黒）およびｅＧＦＰ陽性ＯＨＣ（緑色）からのＰ７（左）で記録された感覚変換電流群を示す画像である。垂直のスケールバーは２００ｐＡを示し；水平のスケールバーは２０ミリ秒を示す。ｅＧＦＰ陰性（黒）およびｅＧＦＰ陽性（緑色）のＰ３５のＩＨＣからの電流が右側に示される。垂直のスケールバーは１００ｐＡを示し；水平のスケールバーは２０ミリ秒を示す。図２Ｅは、下に示された齢における１０３のＩＨＣおよびＯＨＣについてプロットした感覚変換電流の振幅を示すグラフである。ｅＧＦＰ陰性（黒）およびｅＧＦＰ陽性（緑色）からのデータが示される。各群の細胞数をグラフ上に示す。図２Ｆは、平均±標準偏差（ＳＤ）を示すグラフである。注入関連の損傷（赤色）のためにｅＧＦＰ蛍光のない、１つの注入した耳のデータとともに、４つのＡｎｃ８０を注入した耳（緑色）および４つの注入しない耳（黒）についてプロットしたＡＢＲ閾値。図２Ｇは、平均±ＳＤを示すグラフである。ＤＰＯＡＥ閾値を、４つのＡｎｃ８０を注入した耳（緑色）および４つの注入しない耳（黒）および注入による損傷があり、ｅＧＦＰ蛍光のない１つの陰性対照の耳（赤色）についてプロットする。図２Ｂ〜２Ｇ中のデータ点についての注入力価は図２Ａの通りである。 図３Ａ−３Ｄは、前庭感覚上皮におけるＡｎｃ８０−ｅＧＦＰの形質導入を示す画像である。図３Ａは、１μＬのＡｎｃ８０−ｅＧＦＰ（１．７×１０^１２ＧＣ／ｍＬ）を注入したＰ１マウス由来のマウス卵形嚢を示す画像である。組織を採取し、固定し、Ａｌｅｘａ５４６−ファロイジン（赤色）で染色し、ｅＧＦＰ（緑色）についてイメージングした。スケールバー＝１００μｍ。図３Ｂは、図３Ａに記載の同じマウス由来の後部三半規管の稜を示す画像である。スケールバー＝５０μｍ。図３Ｃは、ヒト卵形嚢の感覚上皮を示す画像である。組織をＡｎｃ８０−ｅＧＦＰベクターに曝露し、培養し、固定し、Ａｌｅｘａ５４６−ファロイジン（赤色）で染色し、ｅＧＦＰ蛍光（緑色）についてイメージングした。スケールバー＝１００μｍ。図３Ｄは、Ａｌｅｘａ５４６−ファロイジン（赤色）およびＭｙｏ７Ａ（青色）で染色し、図３Ｃと同一条件で形質導入したｅＧＦＰ（緑色）についてイメージングした、卵形嚢中のヒト上皮の高倍率図を示す画像である。オーバーレイパネル中の白い矢印は、選択されたｅＧＦＰ陽性／Ｍｙｏ７Ａ陽性細胞を示す。スケールバー＝２０μｍ。 図４Ａ−４Ｊは、数種のＡＡＶ血清型の、ＣＢＡ／ＣａＪマウスの蝸牛外植片中のｅＧＦＰ発現に関するインビトロの比較の代表的画像である。図４Ａ〜４Ｆは、等用量のＡＡＶ血清型におけるインキュベーション後の結果を示す画像である。スケールバー＝２００μｍ。図４Ｇ〜４Ｊに示すエラーバーは、ＳＥＭを表す。 図５Ａ−５Ｈは、注目される発現のないことを表す「０」（図５Ｄ、５Ｈ）、薄暗く発現している一部の細胞「１」（図５Ｃ、５Ｇ）、顕微鏡視野当たりの有意な数の細胞における低レベルから中レベルの発現「２」（図５Ｂ、５Ｆ）および中度から高度にわたるレベルでｅＧＦＰを発現している高いパーセンテージの細胞「３」（図５Ａ、５Ｅ）により、感染細胞の数および強度の点から発現の範囲を例解するために、０（図５Ｄ、５Ｈ）（最低の発現）から３（図５Ａ、５Ｅ）（最高レベルの発現）までにわたる、ｅＧＦＰ定性的発現スコアリングシステムを示す画像である。（図５Ａ〜５Ｄに関して）図５Ａおよび（図５Ｅ〜５Ｈに関して）図５Ｅに示されるスケールバー＝２０μｍ。 図６は、上の図５に詳述したｅＧＦＰスコアリングシステムを使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの縁、支持細胞およびらせん神経節ニューロンにおけるｅＧＦＰ発現を示すグラフである。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ＳＧＮの形質導入は、顕微鏡視野当たりのｅＧＦＰ陽性細胞数により評価した。 図７は、上の図５に詳述したｅＧＦＰスコアリングシステムを使用して、ＣＢＡ／ＣａＪマウスの縁、支持細胞およびらせん神経節ニューロンにおけるｅＧＦＰ発現を示すグラフである。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ＳＧＮの形質導入は、顕微鏡視野当たりのｅＧＦＰ陽性細胞数により評価した。 図８Ａ−８Ｅは、Ａｎｃ８０によるマウス蝸牛における広範な内有毛細胞および外有毛細胞の形質導入を示す画像である。図８Ａは、Ａｎｃ８０−ｅＧＦＰを注入したマウス蝸牛の全頂端部分の低倍率図を示す画像である。蝸牛を採取し、Ａｌｅｘａ５４６−ファロイジン（赤色）で染色し、ｅＧＦＰ（緑色）についてイメージングした。スケールバー＝１００μｍ。図８Ｂは、Ａｎｃ８０−ｅＧＦＰを注入した異なるマウスの蝸牛由来の基底部分の高倍率図を示す画像である。蝸牛を採取し、Ａｌｅｘａ５４６−ファロイジン（赤色）で染色し、ｅＧＦＰ（緑色）についてイメージングした。スケールバー＝２０μｍ。図８Ｃおよび８Ｄは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの蝸牛窓注入後の内有毛細胞および外有毛細胞の形質導入効率の定量的比較を示すグラフである。図８Ｅは、Ａｎｃ８０有毛細胞形質導入の用量依存性を示す画像である。２つの異なるＡｎｃ８０−ｅＧＦＰ力価に蝸牛を曝露し、固定し、Ａｌｅｘａ５４６−ファロイジン（赤色）で染色し、ｅＧＦＰ（緑色）についてイメージングした。スケールバー＝２０μｍ。 図９Ａ−９Ｈは、ＴｕＪ１（赤色）およびＭｙｏ７Ａ（マゼンダ）について染色した組織切片におけるｅＧＦＰ導入遺伝子発現について評価した、マウス蝸牛の基底から頂端までの両側性蝸牛形質導入を示す画像である。頂端まで広がる効率的なＡｎｃ８０形質導入が、注入された蝸牛において（図９Ａ／９Ｆ）、および対側の注入されない耳においても（図９Ｂ〜９Ｅ＝頂端から基底まで）観察された。ｅＧＦＰ陽性およびＴｕＪ１陽性のらせん神経節ニューロンの接写画像（図９Ｇ）。Ａｎｃ８０形質導入のＳＧＮ評価のための再構築３Ｄ画像（図９Ｈ）。スケールバー＝１００μｍ（図９Ａ〜９Ｅ）および２０μｍ（図９Ｆ／９Ｇ）。 図１０Ａ−１０Ｂは、Ａｎｃ８０による片側性蝸牛注入後のマウス脳の横断面を示す顕微鏡画像の表示である（図１０Ａ）。小脳、特にプルキンエ細胞（白い矢じり）において、卓越した発現が観察された（図１０Ｂ）。スケールバー１ｍｍ（図１０Ａ）および３００μｍ（図１０Ｂ）。図１０Ｃは、注入しないおよびＡｎｃ８０ＲＷＭを注入した動物の血清および脳脊髄液（ＣＳＦ）中の抗ＡＡＶ中和抗体（ＮＡＢ）力価を示す画像である。力価は、ＮＡＢアッセイにおいて形質導入の５０％阻害が観察される、血清またはＣＳＦの希釈率を反映する。試料体積の制限のために、血清ＮＡＢについての感度の限界は１／４、ＣＳＦについては１／５２．５であった。 図１１Ａ−１１Ｂは、それぞれ、Ａｎｃ８０蝸牛形質導入後の前庭機能を示す、画像およびグラフである。マウスにＡｎｃ８０−ｅＧＦＰを注入し、発現およびロータロッド装置上の平衡機能について評価した。図１１Ａは、Ｍｙｏ７Ａ（赤色）についての免疫蛍光染色を伴う共焦点顕微鏡観察による、前庭組織中のｅＧＦＰ（緑色）の発現を示す画像である。図１１Ｂは、マウスが装置から落下するまでの平均時間±ＳＥＭを示すグラフである。スケールバー＝５０μｍ。 第２部−遺伝子治療がアッシャー症候群のマウスモデルにおいて機能を回復させる 図１２Ａ−１２Ｌは、Ｕｓｈ１ｃｃ．２１６Ｇ＞Ａ突然変異体マウスのコルチ器官の走査電子顕微鏡観察を示す画像である。図１２Ａ〜１２Ｆは、ｃ．２１６ＧＡおよびｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスのイメージングしたコルチ器官の基底、中間および頂端領域を示す画像である。図１２Ｇ〜１２Ｌは、ＯＨＣ（図１２Ｇ〜１２Ｈ）およびＩＨＣ（図１２Ｉ〜１２Ｊ）の高倍率画像である。星印は、保存された毛束；矢じり、秩序の乱れた毛束；および矢印、波状のＩＨＣ束を示す。スケールバー低倍率：５μｍ（図１２Ａ〜１２Ｆ）；高倍率：２μｍ（図１２Ｇ）、３μｍ（図１２Ｈ）、２μｍ（図１２Ｉ〜１２Ｊ）および１μｍ（図１２Ｋ、１２Ｌ）。 図１３Ａ−１３Ｈは、Ｕｓｈ１ｃｃ．２１６Ｇ＞Ａ新生児突然変異体マウスの有毛細胞におけるメカノトランスダクションを示す画像である。図１３Ａ〜１３Ｄは、ｃ．２１６ＧＡおよびｃ．２１６ＡＡマウスの有毛細胞中のオープントランスダクションチャネルの存在を評価するためのＦＭ１−４３染色を示す画像である。ＩＨＣのＦＭ１−４３蛍光は、ＩＨＣが異なる焦点面にあるとき薄暗く見える。左：ＤＩＣ、右：ＦＭ１−４３；スケールバー １０μｍ；図１３Ｃ、スケールバー ５０μｍ；図１３Ｄ、スケールバー １０μｍ。図１３Ｄの白線は、ストリオーラ（取り込みなし）およびストリオーラ外（取り込み）を描写する。図１３Ｅ〜１３Ｈは、新生児ｃ．２１６ＧＡおよびｃ．２１６ＡＡマウスのＯＨＣ、ＩＨＣおよびＶＨＣにおいて評価したメカノトランスダクションを示すグラフである。代表的なトランスダクション電流（図１３Ｅ）、２次Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ関数に当てはめたそれに関連した電流／変位プロット（図１３Ｆ）および平均ピークトランスダクション電流をプロットした（図１３Ｇ〜１３Ｈ）。平均ピークトランスダクションは、ＯＨＣ、ＩＨＣおよびＶＨＣにおいて２つの遺伝子型の間で有意に相違した（^＊＊＊Ｐ＜０．０１、一元配置ＡＮＯＶＡ）。 図１４Ａ−１４Ｅは、インビトロおよびインビボでアデノ随伴ウイルスベクターに曝露した組織中の蛍光標識ｈａｒｍｏｎｉｎの発現および局在化を示す画像である。図１４Ａ〜１４Ｃは、ＡＡＶ２／１ベクターに曝露し、培養し、固定し、対比染色し（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ファロイジン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、共焦点顕微鏡でイメージングした、直ちに解剖した内耳組織を示す。図１４Ａスケールバー：１０μｍ−上のパネル；５μｍ−下のパネル；図１４Ｂスケールバー：１０μｍ；図１４Ｃスケールバー：３μｍ；図１４Ｄスケールバー：３０μｍ；図１４Ｅスケールバー：５μｍ。 図１５Ａ−１５Ｃは、Ａｎｃ８０ｈａｒｍｏｎｉｎベクターを注入したマウスの有毛細胞におけるメカノトランスダクションの回復を示す画像である。図１５Ａ〜１５Ｃは、ｃ．２１６ＡＡ非注入対照マウスおよびＡｎｃ８０ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１を注入したまたはＡｎｃ８０ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１とＡｎｃ８０ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１を組み合わせ注入したｃ．２１６ＡＡマウスのＩＨＣにおいて記録したメカノトランスダクション電流を示す。器官型培養を準備し、記録を実施した。各データセットについての対応するＩ／Ｘ曲線および二重Ｂｏｌｔｚｍａｎｎフィット関数。各最大メカノトランスダクション電流Ｉｍａｘ＝１０２．１ｐＡ（ｃ．２１６ＡＡ）；４２４．３ｐＡ（ｃ．２１６ＡＡ＋ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１）および３４１．１ｐＡ（ｃ．２１６ＡＡ＋ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１＆−ｂ１）（図１５Ｂ）。平均反応（平均±ＳＤ）は、非注入マウスに対して、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１およびｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１＋−ｂ１を注入したマウスについてトランスダクションの有意な回復（^＊＊＊Ｐ＜０．００１）を示す。平均トランスダクション電流は、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１を注入したマウスとｃ．２１６ＧＡ対照マウスで有意に相違しなかった（ＮＳ Ｐ＞０．５）。メカノトランスダクションの回復は、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａおよびｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂを組み合わせたときにも有意に改善しなかった。図１５Ｃは、一元配置ＡＮＯＶＡを示す。 図１６Ａ−１６Ｅは、Ａｎｃ８０ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１を注入したマウスにおけるＡＢＲおよびＤＰＯＡＥ閾値の回復を示す画像である。図１６Ａは、ｃ．２１６ＡＡ対照マウスおよびｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１または２つの組み合わせをコードしたベクターを注入したｃ．２１６ＡＡマウスにおける１６ｋＨｚ発信音についての代表的なＡＢＲ反応を示す画像である。３０ｄＢ ＳＰＬ近辺の回復したＡＢＲ閾値を、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１単独またはｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１とｂ１を一緒に注入したマウスにおいて測定した。図１６Ｂは、ｃ．２１６ＡＡ；ｃ．２１６ＧＡ；ｃ．２１６ＡＡ＋ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１；ｃ．２１６ＡＡ＋ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１；ｃ．２１６ＡＡ＋ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１＆−ｂ１について得られた平均ＡＢＲ反応を示す画像である。平均±ＳＥ、実線。点線：その１６ｋＨｚの記録が図１６Ａに示されるマウスの全周波数範囲についてのＡＢＲ閾値。図１６Ｃは、ｃ．２１６ＡＡ；ｃ．２１６ＧＡ；ｃ．２１６ＡＡ＋ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１；ｃ．２１６ＡＡ＋ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１；ｃ．２１６ＡＡ＋ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１＆−ｂ１について得られた平均ＤＰＯＡＥ反応を示す。平均±ＳＥ、実線。点線：その記録が図１６Ａに図示される４頭のマウスについてのＤＰＯＡＥ閾値。矢印は、閾値が試験した最大刺激レベルよりも高いことを示す。図１６Ｄ〜１６Ｅは、４５ｄＢ未満または４５ｄＢに等しい最初のＡＢＲ閾値を示したマウスにおいて６週および３カ月で得られたＡＢＲおよびＤＰＯＡＥ反応を示す。８頭のうちの６頭のマウスを６カ月飼育し、ＡＢＲおよびＤＰＯＡＥを評価した（点線）。平均±ＳＥ。最初の３カ月間、ＡＢＲおよびＤＰＯＡＥ閾値のシフトが明白であった一方、聴覚レスキューは、低周波数範囲において６カ月齢でなお卓越していた。 図１７Ａ−１７Ｅは、Ａｎｃ８０ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１およびＡｎｃ８０ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１を注入したマウスにおける驚愕反応、ロータロッド成績およびオープンフィールド行動の回復を示す画像である。図１７Ａは、対照ｃ．２１６ＧＡ、ｃ．２１６ＡＡおよび注入したｃ．２１６ＡＡマウスにおいて記録したホワイトノイズ刺激に対する驚愕反応を示す。部分的な驚愕レスキューが、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１を注入したマウスにおいて明白であったが、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１ではそうでなかった。平均を、±ＳＥで示す。図１７Ｂは、対照ｃ．２１６ＧＡ、ｃ．２１６ＡＡおよび注入したｃ．２１６ＡＡマウスにおけるロータロッド成績を示す。ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１およびｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１／ｂ１を注入したマウスにおいて完全な回復が観察され；ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１単独では回復を観察しなかった。平均を、±ＳＥで示す。図１７Ｃ〜１７Ｅは、対照ｃ．２１６ＧＡ、ｃ．２１６ＡＡならびに注入したｃ．２１６ＡＡおよびｃ．２１６ＧＡマウスにおいて５分間実施したオープンフィールド観察を示す。代表的な２．５分にわたるトラックを示す（図１７Ｂ）。ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスが全フィールドを探索し、繰り返して全身回転（full body rotation）を行ったが、Ｐ１でｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１または２つのベクターの組み合わせを注入したｃ．２１６ＡＡマウスは、そのヘテロ接合性ｃ．２１６ＧＡカウンターパートまたは切断型ベクターを注入したｃ．２１６ＧＡマウスと同様の正常行動を示した。図１７Ｃは、回転数および１分あたりの進んだ距離についての平均±ＳＥを図示するグラフを示す。有意な回復＊＊＊Ｐ＜０．００１が、非注入および注入したマウスの間で観察された。一元配置ＡＮＯＶＡによる統計解析。 Ａｎｃ８０ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１を注入したマウスのコルチ器官の走査電子顕微鏡画像である。ｃ．２１６ＧＡ、ｃ．２１６ＡＡおよびｃ．２１６ＡＡマウスにおいてコルチ器官の基底、中間および頂端領域をイメージングした。ｃ．２１６ＧＡマウスではＯＨＣおよびＩＨＣ毛束が保存されたが、ｃ．２１６ＡＡマウスではコルチ器官に沿って秩序が乱れて見えた。器官の基底末端におけるよりはっきりした変性とともに、ｃ．２１６ＡＡマウスにおいて注目すべき有毛細胞喪失（アスタリスク）および毛束の秩序の乱れが観察された。ｃ．２１６ＡＡマウスの毛束は正常な不動毛の列がなかった。ｃ．２１６ＡＡマウスにおいて、低い列は引っ込んで見えたが、より高い列は維持された（矢印）。レスキューされたｃ．２１６ＡＡマウスにおいて有毛細胞の喪失および束の秩序の乱れがなお明白であった一方、器官の基底および中間領域において有毛細胞の生存は著しく高かった。有毛細胞数を棒グラフに要約する。全部で１８２４個の細胞をｃ．２１６ＡＡマウスにおいて、７９２個をレスキューされたｃ．２１６ＡＡマウスにおいてカウントした。平均±ＳＥ。高倍率イメージングは、多くのしかしすべてではない細胞（矢じり）における注入したｃ．２１６ＡＡマウス（矢印）の階段状の列のレスキューを明らかにした。スケールバー低倍率：５μｍ；高倍率：１μｍ。 図１９Ａ−１９Ｌは、Ｕｓｈ１ｃｃ．２１６Ｇ＞Ａマウスの毛束形態のＳＥＭによる分析を示す画像である。図１９Ａ〜１９Ｃは、正常な毛束形態を呈するヘテロ接合性ｃ．２１６ＧＡマウスを示す。図１９Ｄ〜１９Ｉは、ホモ接合性ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスの器官に沿って観察された秩序の乱れた毛束を示す。図１９Ｊ〜１９Ｌは、ｃ．２１６ＡＡマウスで穏やかに秩序の乱れたＩＨＣ毛束を示す。頂端から測定した距離：基底３．５〜４ｍｍ；中間１．８〜２．２ｍｍ；頂端０．６〜０．８ｍｍ。スケールバー低倍率：５μｍ；高倍率：１μｍ。 図２０Ａ−２０Ｊは、ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスにおけるメカノトランスダクション特性を示す画像である。図２０Ａ〜２０Ｅは、蝸牛の中間および中回転〜頂回転からの新生児ＯＨＣにおけるメカノトランスダクションの分析を示す。ｃ．２１６ＧＡおよびｃ．２１６ＡＡ突然変異体における順応を評価するために、〜Ｐ０＝０．５からの代表的な電流トレースを二重指数関数的減衰関数にフィットさせた（図２０Ａ）。あてはめを使用して、早い（図２０Ｅ）および遅い（図２０Ｄ）時定数だけでなく、順応の程度（図２０Ｅ）を生成した。１０〜９０％の作動範囲は、有意に変化しなかった（図２０Ｂ）。ｃ．２１６ＡＡマウスにおける順応の程度は、この分散プロット（図２０Ｅ）に示すヘテロ接合性ＯＨＣよりも有意に小さかった。図２０Ｆ〜２０Ｊは、新生児ＩＨＣにおけるメカノトランスダクションの分析を示す。１０〜９０％の作動範囲の値は、ｃ．２１６ＧＡ対ｃ．２１６ＡＡＩＨＣでより小さかった（図２０Ｇ）。順応が常に存在したが、ｃ．２１６ＡＡ ＩＨＣではわずかに遅く、程度は有意に小さかった（図２０Ｈ〜２０Ｊ）。統計解析を各プロットに示す：^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡ。 図２１Ａ−２１Ｃは、Ｐ１での二重ベクター注入後６週間の、ｃ．２１６ＡＡのコルチ器官中の蛍光標識したｈａｒｍｏｎｉｎ−ａおよびｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ Ａｎｃ８０ベクターの発現を示すデータである。図２１Ａ〜２１Ｃは、Ｐ１でのＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｔｄＴｏｍａｔｏ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１（０．５μｌ；４．１１Ｅ＾１２ｇｃ／ｍｌ）およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１（０．５μｌ；２．９９Ｅ＾１２ｇｃ／ｍｌ）の同時注入後の６週齢のｃ．２１６ＡＡマウスの基底回転の共焦点画像を示す。それぞれ、全細胞数の６９％および７４％が、ｅＧＦＰ（図２１Ａ）およびｔｄＴｏｍａｔｏ（図２１Ｃ）を発現し、６５％が両マーカーを発現し、成功した同時形質導入を実証している。スケールバー：２０μｍ。 図２２Ａ−２２Ｆは、対照ｃ．２１６ＧＡおよび注入され、レスキューされたｃ．２１６ＡＡマウスのＡＢＲ反応の分析を示すデータである。図２２Ａおよび２２Ｄは、対照ｃ．２１６ＧＡおよびレスキューされたｃ．２１６ＡＡマウスについての８および１６ｋＨｚにおけるＡＢＲ反応の例を示す。図２２Ｂ〜２２Ｃおよび２２Ｅ〜２２Ｆは、平均ピーク１の振幅（図２２Ｂ〜２２Ｄ）および匹敵する閾値（ｎ＝８ ｃ．２１６ＧＡ、ｎ＝５ ｃ．２１６ＡＡ＋Ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１ ＲＷＭ Ｐ１）を有するｒ６週齢のマウスにおける８〜１１．３および１６ｋＨｚでの潜時（図２２Ｃ〜２２Ｄ）を示す。平均±ＳＥ：一元配置ＡＮＯＶＡ。 図２３Ａ−２３Ｄは、Ｕｓｈ１ｃｃ．２１６Ｇ＞Ａマウスで発現したｈａｒｍｏｎｉｎの突然変異型が、有毛細胞または聴覚機能を変更しないことを示す。図２３Ａは、野生型ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１タンパク質とＵｓｈ１ｃ遺伝子のエクソン３における潜在性スプライシングおよびアカディア（acadian）Ｇ＞Ａ突然変異を伴うフレームシフトの結果として分泌される切断型ｈａｒｍｏｎｉｎの間の配列アラインメントである。図２３Ｂは、野生型マウス、ｃ．２１６ＧＡおよびｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスの聴覚器官からの半定量的ＲＴ−ＰＣＲが、野生型（４５０ｂｐ）およびｃ．２１６ＧＡおよびｃ．２１６ＡＡマウスの切断型（−３５ｂｐ）ｈａｒｍｏｎｉｎの発現を確認することを示す。図２３Ｃ〜２３Ｄは、聴性脳幹反応（ＡＢＲ、図２３Ｃ）および歪成分（ＤＰＯＡＥ、図２３Ｄ）を、注入したｃ．２１６ＧＡマウスおよび対照ｃ．２１６ＧＡおよびｃ．２１６ＡＡマウスにおいて測定したことを示す。プロットは、平均±ＳＥとして示す。 図２４Ａ−２４Ｃは、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１を注入した６週齢のマウスの内耳における正確なＵｓｈ１ｃスプライシングの回復を示す画像である。図２４Ａは、Ｕｓｈ１ｃ．２１６Ａアレル由来の正確にスプライシングされた（４５０ｂｐ）および異常な（４１５ｂｐ）ｍＲＮＡの半定量的ＲＴ−ＰＣＲによる定量化が、レスキューされたｃ．２１６ＡＡマウス＃１および＃２の注入した（Ｉ）および対側の耳（図２４Ｃ）における正確なＵｓｈ１ｃスプライシングの回復を示すことを示している（注入した耳からの１１．３ｋＨｚにおける３５ｄＢ ＳＰＬの反応）。ＡＢＲ反応不良のマウス＃３（１１．３ｋＨｚにおいて９０ｄＢ ＳＰＬ）は、正確なｍＲＮＡ発現の中程度の回復を示し、マウス＃４（１１．３ｋＨｚにおいて１００ｄＢ ＳＰＬ）は回復を示さなかった。注入しないｃ．２１６ＡＡマウス（マウス＃５、６）においては正確なスプライス型を検出しないが、正確および切断型のスプライス型の両方をｃ．２１６ＧＡマウス（マウス＃７、８、９）で検出する。物質の相対量を確認するために、下のパネルに示す、対応するマウスＧＡＰＤＨを増幅した。図２４Ｂは、半定量的放射標識ＲＣＲ解析が、Ｕｓｈ１ｃ．２１６ＡＡマウスの注入したおよび対側の耳におけるＡＡＶ−ｍＵｓｈ１ｃの存在を確認したことを示す画像である。相対的レベルのＡＡＶ−ｍＵｓｈ１ｃＤＮＡが存在したが、マウス＃３および＃４では低減していた。図２４Ｃは、相対量のＡＡＣ−ｍＵｓｈ１ｃがＡＢＲ閾値と相関していたことを示す。１１．３および１６ｋＨｚについての分析を例証する。線形回帰が、２つの間の高い相関を示した。 図２５は、長期のＡＢＲ閾値の回復が、聴覚器官の中間〜頂端領域におけるＯＨＣの生存と相関したことを示すグラフである。コルチ器官全体にわたる有毛細胞の計数を、３頭の非注入ｃ．２１６ＡＡおよび５頭の注入したｃ．２１６ＡＡの左耳で死後に実施した。ＩＨＣおよびＯＨＣ有毛細胞の総数は、注入したマウスにおいて増加した。レスキューされた注入したマウスとレスキューが不良であった注入したマウスの比較は、ＩＨＣの数は相違しなかったが、レスキューされたマウスではかなりの数のＯＨＣが注目された。器官の長さ全体にわたる分析は、相違が、器官の中間から頂端領域からの有毛細胞の生存の増加によると説明できることを示した。挿入図：マウスのうちの２頭（マウス＃１、２）が試験範囲全体にわたりＡＢＲ反応閾値の不良を示した（≧９５ｄＢ ＳＰＬ）一方、３頭（＃３、４、５）は、５．６から１６ｋＨｚの間の音刺激に対して３５から５５ｄＢ ＳＰＬにわたる閾値をもって反応した。 第３部−聴覚喪失に関与するさらなる突然変異の遺伝子治療 図２６Ａ−２６Ｄは、ＲＷＭを通してＡｎｃ８０−Ｈａｒｍｏｎｉｎ：：ＧＦＰ（すなわち、ＧＦＰがＨａｒｍｏｎｉｎポリペプチドに融合されている）を注入し、採取し、アクチン（赤色；図２６Ａ）、Ｍｙｏ７Ａ（青色；図２６Ｂ）染色し、ＧＦＰについてイメージングした（緑色；図２６Ｃ）、Ｕｓｈ１ｃ突然変異体マウスの蝸牛の代表的な共焦点画像である。図２６Ａ、２６Ｂおよび２６Ｃの重ね合わせ画像を図２６Ｄに示す。 図２７は、Ｕｓｈ１ｃ突然変異体マウス（四角）およびＡｎｃ８０−Ｈａｒｍｏｎｉｎ：：ＧＦＰベクターを注入したＵｓｈ１ｃ突然変異体マウス（丸）についての音の周波数の関数としてプロットしたＡＢＲ閾値を示すグラフである。 図２８Ａ−２８Ｃは、ＲＷＭを通してＡｎｃ８０−ＫＣＮＱ４を注入し、採取し、Ａｌｅｘａ５４６−ファロイジン（赤色）およびＫＣＮＱ４に対する抗体（緑色）で染色したＫＣＮＱ４−／−蝸牛の、高倍率の注入しない蝸牛（図２８Ｃ）に比較した、低倍率（図２８Ａ）または高倍率（図２８Ｂ）の代表的な共焦点画像を示す。 図２９Ａ−２９Ｃは、野生型マウス（図２９Ａ）、Ｐ１０のＫＣＮＱ４−／−マウス（図２９Ｂ）およびＰ１０のＡｎｃ８０−ＫＣＮＱ４を注入したＫＣＮＱ４−／−マウス（図２９Ｃ）におけるＫＣＮＱ４電流を示す一連のグラフである。注入の８日後に蝸牛を採取した。 図３０は、Ａｎｃ８０ Ｔｍｃ１ベクターを注入したＴｍｃ１−／−組織におけるＦＭ１−４３の取り込み（ＦＭ１−４３は、機能的Ｔｍｃ１チャネルのみを透過する）を示す一連の３つの画像である。 図３１Ａは、野生型マウス（左）、Ｔｍｃ１−／−マウス（中間）およびＡｎｃ８０ Ｔｍｃ１を注入したＴｍｃ１−／−マウス（右）のＩＨＣから記録した感覚変換電流の代表的な群を示す画像である。注入の８日後に蝸牛を採取した。 図３１Ｂは、図３１Ａに示すマウスの回復率のグラフ表示である。図３１Ｂ中のグラフは、野生型マウス（左）、Ｔｍｃ１−／−マウス（中間）およびＡｎｃ８０ Ｔｍｃ１を注入したＴｍｃ１−／−マウス（右）における機能的細胞のパーセンテージを示す。 図３２は、歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）閾値を、野生型、Ｔｍｃ１−／−マウスおよびＡｎｃ８０ Ｔｍｃ１を注入したＴｍｃ１−／−マウスについての刺激周波数の関数として示すグラフである。

成体哺乳動物蝸牛の感覚細胞は自己修復能力を欠くため、（障害のレベルおよび正確な位置に依存する）現行の治療ストラテジーは、聴覚神経を形成し、音響情報を中継して脳へ伝える一次感覚有毛細胞またはらせん神経節ニューロンの永久的損傷を補償するために、増幅（補聴器）、音のより良い伝達（中耳プロステーシス／能動型インプラント）または直接的な神経刺激（蝸牛移植片）に依存する。これらのアプローチは変革的なものであった一方、現代生活にとって重要な複雑なヒトの聴覚機能を回復させるために最適なものからは遠いままであった。特に、主要な問題は、限定された周波数感度、不自然な音知覚、およびうるさい環境での限定された語音弁別をなお含む。

蝸牛への治療的遺伝子導入は、加齢性および環境誘発の聴覚喪失から遺伝型の難聴にわたる現行の標準的治療にさらなる改善を加えると考えられてきた。３００超の遺伝子座が、記載された７０を超える原因遺伝子による遺伝性の聴覚喪失と関係があるとされてきた（Parker & Bitner-Glindzicz, 2015, Arch. Dis. Childhood, 100:271-8）。これらのアプローチにおける治療の成功は、蝸牛のコルチ器官（ＯＣ）中の関連する治療標的細胞への外来遺伝子構築物の安全で効率的な送達に大いに依存する。

ＯＣは、２つの種類の感覚有毛細胞：音によって運ばれた機械的情報を、神経構造に伝達される電気シグナルに変換するＩＨＣおよび複雑な聴覚機能に必要とされるプロセスである、蝸牛反応を増幅し、調整する役割を果たすＯＨＣを含む。内耳中の他の潜在的な標的としては、らせん神経節ニューロン、らせん板縁の円柱細胞が挙げられ、これらは、保護機能を有し、早期の新生児期までに有毛細胞への分化転換を誘発されうる、隣接する蓋膜または支持細胞の維持に重要である。

高カリウム内リンパ液で満たされた蝸牛管への注入は、有毛細胞への直接アクセスを提供しうる。しかしながら、このデリケートな流体環境の変化は、蝸牛内電位を乱し、注入関連毒性のリスクを高める可能性がある。蝸牛管、鼓室階および前庭階を取り巻く外リンパで満たされた空間は、前庭窓膜または蝸牛窓膜（ＲＷＭ）のいずれかを通って中耳からアクセス可能である。内耳への唯一の非骨質開口部であるＲＷＭは、多くの動物モデルにおいて比較的容易にアクセスでき、この経路を使用するウイルスベクターの投与は、よく忍容されている。ヒトにおいて、蝸牛移植片の設置は、ＲＷＮを通る手術用電極の挿入に日常的に依存する。

器官型蝸牛外移植片およびインビボの内耳注入においてＡＡＶ血清型を評価する先の研究は、遺伝性難聴のマウスモデルで聴覚の部分的なレスキューのみをもたらした。予想外に、祖先ＡＡＶカプシドタンパク質を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）は高効率でＯＨＣに形質導入する。この知見は、従来のＡＡＶ血清型を使用する蝸牛遺伝子治療の開発の成功を限定してきた、低い導入率を克服する。本明細書に記載の祖先ＡＡＶカプシドタンパク質を含有するＡＡＶは、ＩＨＣおよびＯＨＣだけでなく、遺伝性の聴覚および平衡障害によって損なわれた多くの他の内耳細胞型への内耳遺伝子送達のための価値あるプラットフォームを提供する。高い導入率を提供することに加えて、本明細書に記載の祖先ＡＡＶカプシドタンパク質を含有するＡＡＶは、全身注射に際してマウスおよび非ヒト霊長類において類似した安全性プロフィールを有し、循環中のＡＡＶとは抗原性が異なり、従来のＡＡＶベクターの有効性を制限する既存の免疫に関して潜在的な利益を提供することが示された。

しかしながら、細胞、特に内耳、例えば、蝸牛内の細胞（または蝸牛の細胞もしくは蝸牛細胞）への核酸の高効率の送達を可能とする組成物および方法が本明細書に記載される。本明細書中で使用されるとき、内耳細胞は、非限定的に、内有毛細胞（ＩＨＣ）、外有毛細胞（ＯＨＣ）、らせん神経節ニューロン、前庭有毛細胞、前庭神経節ニューロン、支持細胞および血管条中の細胞をさす。支持細胞は、興奮性でない耳の中の細胞、例えば、有毛細胞またはニューロンでない細胞をさす。支持細胞の例はシュワン細胞である。

本明細書に記載の１つまたは複数の核酸の内耳細胞への送達は、典型的に、部分的な聴覚喪失または完全な難聴により定義される、任意の数の遺伝性または後天性聴覚障害を治療するために使用可能である。本明細書に記載の方法は、非限定的に、劣性難聴、優性難聴、アッシャー症候群および他の症候群性難聴だけでなく、外傷または加齢による聴覚喪失のような聴覚障害を治療するために使用されうる。

特定の導入遺伝子を保有するウイルスを作製する方法
本明細書に記載される通り、祖先ＡＡＶカプシドタンパク質を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、内耳細胞へ核酸（例えば、導入遺伝子）を送達することにおいて特に効率的であり、特に有効な種類の祖先ＡＡＶカプシドタンパク質が、Ａｎｃ８０と名付けられた祖先足場カプシドタンパク質により表され、配列番号１に示される。Ａｎｃ８０祖先カプシドタンパク質の種類に属する１つの具体的な祖先カプシドタンパク質は、Ａｎｃ８０−００６５（配列番号２）であるが、国際公開第２０１５／０５４６５３号パンフレットは、Ａｎｃ８０祖先カプシドタンパク質の種類に属する多くのさらなる祖先カプシドタンパク質を記載している。

Ａｎｃ８０カプシドタンパク質を含有する、本明細書に記載のウイルスは、様々な核酸を内耳細胞に送達するために使用されうる。発現の目的のために細胞に送達される核酸配列は、しばしば導入遺伝子と呼ばれる。内耳細胞に送達され、そこで発現しうる代表的な導入遺伝子としては、非限定的に、神経栄養因子（例えば、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ノイロトロピン−３（ＮＴ３）、もしくは熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）−７０）、免疫調節タンパク質または抗発癌性転写物をコードする導入遺伝子が挙げられる。加えて、内耳細胞に送達され、そこで発現しうる代表的な導入遺伝子としては、非制限的に、抗体もしくはその断片、アンチセンス、サイレンシングもしくは長鎖非コードＲＮＡ種、またはゲノム編集システム（例えば、遺伝子改変ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、もしくはクラスター化規則的間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ））をコードする導入遺伝子が挙げられる。さらに、内耳細胞に送達され、そこで発現しうる代表的な導入遺伝子としては、ＡＣＴＧ１、ＡＤＣＹ１、ＡＴＯＨＩ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ１、ＢＤＮＦ、ＢＤＰ１、ＢＳＮＤ、ＤＡＴＳＰＥＲ２、ＣＡＢＰ２、ＣＤ１６４、ＣＤＣ１４Ａ、ＣＤＨ２３、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＨＤ７、ＣＣＤＣ５０、ＣＩＢ２、ＣＬＤＮ１４、ＣＬＩＣ５、ＣＬＰＰ、ＣＬＲＮ１、ＣＯＣＨ、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２、ＣＲＹＭ、ＤＣＤＣ２、ＤＦＮＡ５、ＤＦＮＢ３１、ＤＦＮＢ５９、ＤＩＡＰＨ１、ＥＤＮ３、ＥＤＮＲＢ、ＥＬＭＯＤ３、ＥＭＯＤ３、ＥＰＳ８、ＥＰＳ８Ｌ２、ＥＳＰＮ、ＥＳＲＲＢ、ＥＹＡ１、ＥＹＡ４、ＦＡＭ６５Ｂ、ＦＯＸＩ１、ＧＩＰＣ３、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ６、ＧＰＲ９８、ＧＲＨＬ２、ＧＰＳＭ２、ＧＲＸＣＲ１、ＧＲＸＣＲ２、ＨＡＲＳ２、ＨＧＦ、ＨＯＭＥＲ２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＩＬＤＲ１、ＫＡＲＳ、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＪ１０、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ４、ＫＩＴＬＧ、ＬＡＲＳ２、ＬＨＦＰＬ５、ＬＯＸＨＤ１、ＬＲＴＯＭＴ、ＭＡＲＶＥＬＤ２、ＭＣＭ２、ＭＥＴ、ＭＩＲ１８３、ＭＩＲＮ９６、ＭＩＴＦ、ＭＳＲＢ３、ＭＴ−ＲＮＲ１、ＭＴ−ＴＳ１、ＭＹＨ１４、ＭＹＨ９、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ１Ａ、ＭＹＯ３Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ７Ａ、ＮＡＲＳ２、ＮＤＰ、ＮＦ２、ＮＴ３、ＯＳＢＰＬ２、ＯＴＯＡ、ＯＴＯＦ、ＯＴＯＧ、ＯＴＯＧＬ、Ｐ２ＲＸ２、ＰＡＸ３、ＰＣＤＨ１５、ＰＤＺＤ７、ＰＪＶＫ、ＰＮＰＴ１、ＰＯＬＲ１Ｄ、ＰＯＬＲ１Ｃ、ＰＯＵ３Ｆ４、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＲＰＳ１、ＰＴＰＲＱ、ＲＤＸ、Ｓ１ＰＲ２、ＳＡＮＳ、ＳＥＭＡ３Ｅ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＳＬＣ１７Ａ８、ＳＬＣ２２Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ５、ＳＩＸ１、ＳＩＸ５、ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯ、ＳＮＡＩ２、ＳＯＸ１０、ＳＴＲＣ、ＳＹＮＥ４、ＴＢＣ１Ｄ２４、ＴＣＯＦ１、ＴＥＣＴＡ、ＴＩＭＭ８Ａ、ＴＪＰ２、ＴＮＣ、ＴＭＣ１、ＴＭＣ２、ＴＭＩＥ、ＴＭＥＭ１３２Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＲＰＮ、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＳＰＥＡＲ、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ、ＵＳＨ２Ｄ、ＶＬＧＲ１、ＷＦＳ１、ＷＨＲＮ、およびＸＩＡＰと名付けられた核酸が挙げられる。本明細書において使用される命名法の説明および定義は、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂのｈｅｒｅｄｉｔａｒｙｈｅａｒｉｎｇｌｏｓｓ．ｏｒｇ／において見出されうる。

導入遺伝子の発現は、導入遺伝子の自然のプロモーター（すなわち、導入遺伝子のコード配列とともに天然に見出されるプロモーター）により指令されるか、または導入遺伝子の発現は、異種プロモーターにより指示されてもよい。例えば、本明細書に記載のいずれの導入遺伝子もその自然のプロモーターとともに使用されうる。代替的に、本明細書に記載のいずれの導入遺伝子も異種プロモーターとともに使用されうる。本明細書中で使用されるとき、異種プロモーターは、その配列の発現を自然に指令しない（すはわち、自然においてその配列とともに見出されない）プロモーターをさす。本明細書に示されるいずれかの導入遺伝子の発現を指令するために使用されうる代表的な異種プロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、トリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、合成ＣＡＳＩプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、および伸長因子（ＥＦ）−１プロモーター、アルファ９ニコチン性受容体プロモーター、プレスチンプロモーター、成長因子非依存性（ＧＦＩ１）プロモーター、および小胞グルタミン酸トランスポーター３（ＶＧＬＵＴ３）プロモーターが挙げられる。加えて、上記導入遺伝子のうちの１つの発現を自然に指令するプロモーター（例えば、ＫＣＮＱ４プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、Ｍｙｏ６プロモーターまたはＡＴＯＨ１プロモーター）は、導入遺伝子の発現を指令するための異種プロモーターとして使用されうる。

Ａｎｃ８０カプシドタンパク質を含有するウイルス中へパッケージングするための導入遺伝子を作製する方法は、当分野で知られており、従来の分子生物学および組換え核酸技術を利用する。一実施形態において、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質をコードする核酸配列を含む構築物および好適な逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接した導入遺伝子を保有する構築物が提供され、これは、導入遺伝子がＡｎｃ８０カプシドタンパク質内にパッケージングされることを可能とする。

導入遺伝子は、例えば、パッケージング宿主細胞を使用して、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質を含有するＡＡＶ中にパッケージングされうる。ウイルス粒子の構成要素（例えば、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、逆位末端反復（ＩＴＲ）配列）が、本明細書に記載の１つまたは複数の構築物を使用して、一過性にまたは安定的にパッケージング宿主細胞に導入されうる。本明細書に記載のウイルスは、少なくともＡｎｃ８０カプシドタンパク質を含有し；ウイルス粒子の他の構成要素（たとえば、ｒｅｐ配列、ＩＴＲ配列）は、祖先配列または現代の配列に基づくことができる。一部の場合において、例えば、ウイルス粒子全体が祖先配列に基づくことができる。そのようなウイルスは、日常的な方法を使用して精製されうる。

１つまたは１つを超える導入遺伝子が内耳に送達されうることが理解されうる。Ａｎｃ８０カプシドタンパク質を含む単一のＡＡＶベクターを使用して、またはＡｎｃ８０カプシドタンパク質を含む複数のＡＡＶベクターを使用して、１を超える導入遺伝子が内耳に送達されうることも理解されうる。

一般に、本明細書中で使用されるとき、「核酸」は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むことができ、１つまたは複数のヌクレオチド類似体または骨格改変を含有する核酸も含むことができる。核酸は、一本鎖または二本鎖であることができ、これは、通常その意図される用途に依存する。本明細書に記載の方法において使用可能な核酸は、知られた核酸配列と同一であることができるかまたは本明細書に記載の方法において使用可能な核酸は、そのような知られた配列とは配列が異なることができる。単に例として、核酸（またはコードされるポリペプチド）は、知られた配列に対して少なくとも７５％の配列同一性（例えば、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有することができる。

配列同一性パーセントを計算することにおいて、２つの配列がアラインされ、２つの配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の完全な一致の数が決定される。完全な一致の数が、アラインされた領域の長さ（すなわち、アラインされたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数）で割られ、１００をかけると、配列同一性パーセント値となる。アラインされた領域の長さが、一方または両方の配列の一部から最短の配列の完全長サイズまでであることができるのは理解される。単一の配列が、１つを超える他の配列とアラインすることができ、したがって、アラインされた各領域にわたって、異なる配列同一性パーセント値を有しうることも理解される。

配列同一性パーセントを決定するための２つ以上の配列のアラインメントは、コンピュータプログラムＣｌｕｓｔａｌＷおよびデフォルトパラメータを使用して実施され、これは核酸またはポリペプチド配列のアラインメントが、その長さ全体にわたって実行されることを可能とする（グローバルアラインメント）。Chenna et al., 2003, Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500。ＣｌｕｓｔａｌＷは、クエリと１つまたは複数の対象配列との間のベストマッチを計算し、同一性、類似性および相違が決定されるように、これらをアラインする。配列アラインメントを最大化するために、１つまたは複数の残基のギャップがクエリ配列、対象配列またはその両方に挿入されうる。核酸配列のペアワイズアラインメントのためには、デフォルトパラメータが使用され（すなわち、ワードサイズ：２；ウィンドウサイズ：４；スコアリング法：パーセンテージ；トップダイアゴナルの数：４；およびギャップペナルティー：５）；多重核酸配列のアラインメントのためには、以下のパラメータが使用される：ギャップ開始ペナルティー：１０．０；ギャップ伸長ペナルティー：５．０；およびウエイトトランジッション：あり。ポリペプチド配列のペアワイズアラインメントのためには、以下のパラメータが使用される：ワードサイズ：１；ウィンドウサイズ：５；スコアリング法：パーセンテージ；トップダイアゴナルの数：５およびギャップペナルティー：３。ポリペプチド配列の多重アラインメントのためには、以下のパラメータが使用される：ウエイトマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ（置換マトリックスをブロック（blocks substitution matrix））；ギャップ開始ペナルティー：１０．０；ギャップ伸長ペナルティー：０．０５；親水性ギャップ：オン、疎水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；ならびに残基特異的なギャップペナルティー：オン。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓｅａｒｃｈ ＬａｕｎｃｈｅｒウエブサイトまたはＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ ＷｅｂのＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅウエブサイトにおいて実行されうる。

核酸配列に変化が導入可能であり、これは、その核酸配列がコード配列である場合には、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらしうる。変化は、例えば、突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ介在性突然変異誘発）を使用してまたはそのような変化を有する核酸分子を化学合成することにより、核酸コード配列に導入されうる。そのような核酸の変化は、１つまたは複数のアミノ酸残基における保存的および／または非保存的アミノ酸置換に導きうる。「保存的アミノ酸置換」は、１のアミノ酸残基が、類似する側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置換されるもの（例えば、アミノ酸置換についての度数分布表を提供する、Ｄａｙｈｏｆｆら（1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5（Suppl. 3）:345-352）を参照されたい）であり、非保存的置換は、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有さないアミノ酸残基で置換されるものである。

核酸は、ベクターまたはプラスミドとも呼ばれうる構築物内に含有されうる。構築物は、市販されているかまたは当分野において日常的な組換え技術により生成されうる。核酸を含有する構築物は、そのような核酸の発現を指令および／または制御する発現エレメントを含むことができ、構築物を維持するための配列（例えば、複製の起点、選択マーカー）のような配列を含むこともできる。発現エレメントは、当分野において知られており、例えば、プロモーター、イントロン、エンハンサー配列、応答性エレメントまたは誘導性エレメントを含む。

核酸を内耳細胞に送達する方法
核酸を細胞に送達する方法は、一般に、当分野において知られており、導入遺伝子を含有する（ウイルス粒子とも呼ばれうる）ウイルスをインビボで内耳細胞に送達する方法は本明細書に記載されている。本明細書に記載される通り、約１０^８〜約１０^１２個のウイルス粒子を対象に投与することができ、ウイルスは好適な体積（例えば、１０μＬ、５０μＬ、１００μＬ、５００μＬ、または１０００μＬ）の、例えば、人工の外リンパ液に懸濁されうる。

本明細書に記載の導入遺伝子を含有するウイルスは、任意の数のメカニズムを使用して内耳細胞（例えば、蝸牛中の細胞）に送達されうる。例えば、本明細書に記載の１つまたは複数の異なるタイプの導入遺伝子を含有するウイルス粒子を含む組成物の治療有効量が、蝸牛窓または前庭窓を通して、典型的には比較的単純な（例えば、外来患者）手順で注入されうる。一部の実施形態において、本明細書に記載の導入遺伝子を含有するかまたは異なるウイルス粒子の１つまたは複数の組を含有するウイルス粒子の治療有効数を含む組成物であって、組の中の各粒子は同じタイプの導入遺伝子を含むことができるが、粒子の各組は他の組とは異なるタイプの導入遺伝子を含む、組成物が、手術（例えば、蝸牛開窓術またはカナロストミー）の間に耳の中の適切な位置に送達されうる。

加えて、鼓膜を横切りかつ／または蝸牛窓を通る薬剤の移動を促進する送達ビヒクル（例えば、ポリマー）が利用可能であり、任意のそのような送達ビヒクルが、本明細書に記載のウイルスを送達するために使用されうる。例えば、Arnold et al., 2005, Audiol. Neurootol., 10:53-63を参照されたい。

本明細書に記載の組成物および方法は、内耳細胞、例えば、蝸牛細胞への核酸の高効率の送達を可能とする。例えば、本明細書に記載の組成物および方法は、導入遺伝子の、内有毛細胞の少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）への送達および発現を可能とするかまたは外有毛細胞の少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％）への送達およびそこにおける発現を可能とする。

本明細書において実証される通り、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質を含有するＡＡＶを使用して送達された導入遺伝子の発現は、聴覚または前庭機能が延長された期間（例えば、数カ月間、数年間、数十年間、一生涯）回復させられるように、内有毛細胞（ＩＨＣ）、外有毛細胞（ＯＨＣ）、らせん神経節ニューロン、血管条、前庭有毛細胞、および／または前庭神経節ニューロン（例えば、Ａｔｏｈ１、ＮＦ２）の再生をもたらしうる。

国際公開第２０１５／０５４６５３号パンフレットに記載された通り、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質を含有するＡＡＶは、その血清有病率および／または従来のＡＡＶ（すなわち、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質を含有しないＡＡＶ）と比較してそれが中和される程度に特徴を有しうる。当分野において血清有病率は、血清反応陽性の（すなわち、特定の病原体または免疫原に曝露されてきた）集団における対象の割合をさすと理解され、特別な病原体または免疫原に対して抗体を産生する集団における対象の数を、検査した集団中の個体の総数で割ったものとして計算される。ウイルスの血清有病率を決定することは、当分野において日常的に実施され、個体の特別な集団由来の試料（例えば、血液試料）中の１つまたは複数の抗体の蔓延を決定するためには、典型的にイムノアッセイを使用することを含む。加えて、血清試料中の中和抗体の程度を決定するための数種の方法が利用可能である。例えば、中和抗体アッセイは、抗体を含まない対照試料に比較して５０％以上感染を中和する抗体濃度を実験試料が含有する、力価を測定する。Ｆｉｓｈｅｒら（1997, Nature Med., 3:306-12）およびＭａｎｎｉｎｇら（1998, Human Gene Ther., 9:477-85）も参照されたい。代表的な従来のＡＡＶとしては、非限定的に、ＡＡＶ８（またはＡＡＶ８カプシドタンパク質を含むウイルス）および／またはＡＡＶ２（またはＡＡＶ２カプシドタンパク質を含むウイルス）が挙げられる。

アッシャー症候群
ヒトアッシャー症候群（ＵＳＨ）は、合併した難聴と失明の原因となる稀な遺伝子疾患である。これは常染色体劣性形質として遺伝し、米国において１６，０００〜２０，０００人を冒し、３〜６％の幼児期難聴の原因となる。アッシャー症候群は、症状の重症度により３つの臨床亜型（ＵＳＨ−１、−２および−３）に分類される。ＵＳＨ１は、最も重症型である。ＵＳＨ１に冒された患者は、先天性の両側性重度感音性難聴、前庭反射消失および思春期前の網膜色素変性症（進行性の網膜の桿体および錐体機能の両側性対称性変性）を患う。蝸牛移植片を装着されない限り、個体は典型的に発声する能力を発達させない。現在、アッシャー患者のための生物学的治療法は存在しないが、欠陥遺伝子の野生型形態の早期再導入は疾患の回復を可能としうる。

６つのアッシャー遺伝子：ＭＹＯ７Ａ（ｍｙｏｓｉｎ ７ａ）、ＵＳＨ１Ｃ（ｈａｒｍｏｎｉｎ）、ＣＤＨ２３（ｃａｄｈｅｒｉｎ ２３）、ＰＣＤＨ１５（ｐｒｏｔｏｃａｄｈｅｒｉｎ １５）、ＳＡＮＳ（ｓａｎｓ）およびＣＩＢ２（ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ２）がＵＳＨ１と関連する。これらの遺伝子は、内耳中の毛束の形態形成に関与し、インタラクトームの一部であるタンパク質をコードする（例えば、Mathur & Yang, 2015, Biochim. Biophys. Acta, 1852:406-20を参照されたい）。ｈａｒｍｏｎｉｎは、それが他のＵｓｈｅｒ１タンパク質に結合する、ＵＳＨ１インタラクトームの中心に存在する。そのＰＤＺ（ＰＳＤ−５９ ９５／Ｄｌｇ／ＺＯ−１）相互作用ドメインのために、ｈａｒｍｏｎｉｎは、足場タンパク質として機能することが提案されてきた。インビトロの結合研究は、すべての他の知られたＵＳＨ１タンパク質が、ＵＳＨ２タンパク質のうちの２つであるｕｓｈｅｒｉｎおよびＶＬＧＲ１と同様にｈａｒｍｏｎｉｎのＰＤＺドメインに結合することを示した。ＵＳＨ１Ｃ遺伝子は、タンパク質のドメイン組成に依存して３つの異なるサブクラス（ａ、ｂおよびｃ）に分類される、ｈａｒｍｏｎｉｎの１０種のオルタナティブスプライス型をコードする、２８のエクソンからなる。３つのアイソフォームは、ＰＤＺタンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、コイルドコイル（ＣＣ）ドメインおよびプロリン−セリン−スレオニン（ＰＳＴ）リッチドメインの数が異なる。

ＵＳＨ１タンパク質は、多数の細胞外連結によって相互接続された何百もの不動毛から構成される機械感覚性毛束中の有毛細胞の頂端に局在化している。Ｕｓｈｅｒ遺伝子（それぞれ、ＵＳＨ１ＤおよびＵＳＨ１Ｅ）の産物であるカドヘリン２３およびプロトカドヘリン１５は、不動毛の遠位末端に位置する感覚糸（tip-link）を形成する。ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂは、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、Ｆ−アクチンおよびそれ自身に結合する。有毛細胞の感覚糸挿入点近くの不動毛の先端において認められ、そこで有毛細胞における伝達と順応に機能的役割を演じると考えられている。ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂは、出生後の早い段階で発現するが、その発現は、蝸牛および前庭の両方において出生後３０日（Ｐ３０）近辺で消失する。ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａも、カドヘリン２３にも結合し、不動毛に認められる。最近の報告は、シナプスにおけるｈａｒｍｏｎｉｎ−ａのさらなる役割を明らかにし、そこにおいて、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａはＣａｖ１．３ Ｃａ２＋チャネルと結合して、ユビキチン依存性経路によるチャネルの利用可能性を制限する。

アッシャー症候群の数種のマウスモデルが、同定されまたは過去１０年間にわたって操作され、そのうちの７種はｈａｒｍｏｎｉｎに影響を及ぼす。これらの中で、唯一のモデル、Ｕｓｈ１ｃｃ．２１６Ｇ＞Ａモデルのみが、ヒトアッシャー症候群を特徴づける聴覚および網膜欠損の両方を再現する。Ｕｓｈ１ｃｃ．２１６Ｇ＞Ａは、フランス系アカディア人ＵＳＨ１Ｃ患者のコホートにおいて認められるものに類似する点突然変異により、すべての従来のｈａｒｍｏｎｉｎアイソフォームの発現に影響を及ぼすノックインマウスモデルである。突然変異は、Ｕｓｈ１ｃ遺伝子のエクソン３の末端に隠れたスプライス部位を導入する。この隠れたスプライス部位の使用は、３５ｂｐの欠失を含むフレームシフトした転写物を生成し、ＰＤＺ、ＰＳＴおよびＣＣドメインを欠く、著しく切断されたタンパク質の翻訳をもたらす。ホモ接合性のＣ．２１６ＡＡノックインマウスは、１カ月齢で重症の聴覚喪失を患うが、ヘテロ接合性のｃ．２１６ＧＡマウスはいかなる異常な表現型も呈さない。ｃ．２１６ＡＡマウスにおける蝸牛の組織構造は、Ｐ３０における中回転および基底回転の無秩序な毛束、異常な細胞の列ならびに内有毛細胞および外有毛細胞の喪失を示す。

特に、ｈａｒｍｏｎｉｎ導入遺伝子と組み合わせた本明細書に記載の祖先ＡＡＶカプシドタンパク質を使用して、有毛細胞にうまく形質導入し、ｈａｒｍｏｎｉｎスプライス型の発現および正確な局在化を推進し、それにより野生型ｈａｒｍｏｎｉｎを再導入して、アッシャー症候群関連の難聴、例えば、ＵＳＨ１Ｃ関連難聴と診断された患者を治療することができる。さらに、出生後早期の蝸牛窓膜への本明細書に記載の祖先ＡＡＶカプシドタンパク質を含有するＡＡＶの注入が、ホモ接合性ｃ．２１６ＡＡマウスにおいて、聴覚および前庭機能をうまく回復させることが、本明細書において実証される。注入されたマウスにおける聴覚機能の回復は、野生型ｈａｒｍｏｎｉｎをコードするｍＲＮＡの発現の回復だけでなく、毛束形態の保存およびメカノトランスダクションと関連している。

ＴＭＣ１／ＴＭＣ２
４０超の異なる突然変異が、難聴を引き起こすＴＭＣ１において同定されている。これらは、３５の劣性突然変異および５の優性突然変異にさらに分割される。劣性突然変異のほとんどは、重度の先天性聴覚喪失をもたらす（例えば、ＤＦＮＢ７／１１）が、少数は後発性の中程度から重度の聴覚喪失を引き起こす。すべての優性突然変異は、十代半ばに発症する、進行性の聴覚喪失（例えば、ＤＦＮＡ３６）を引き起こす。特に、本明細書に記載のＡｎｃ８０カプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターは、非突然変異体（例えば、野生型）ＴＭＣ１配列またはＴＭＣ２配列を送達し、それにより聴覚喪失（例えば、さらなる聴覚喪失）を予防しかつ／または聴覚機能を回復させるために、使用されうる。

当業者のスキルの範囲内の従来の分子生物学、微生物学、生化学および組換えＤＮＡ技術が、本開示に従って使用されうる。そのような技術は、文献中で十分に説明されており、以下の実施例のいくつかにおいて例証されている。本発明は、請求の範囲に記載された方法および組成物の範囲を限定することのない、以下の例においてさらに記載される。

第１部：高効率の蝸牛遺伝子導入
実施例１
祖先ＡＡＶカプシドタンパク質を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、安全かつ効率的な蝸牛遺伝子導入をもたらす
以下の方法および材料を実施例１において使用した。

ウイルスベクター
ＣＭＶ駆動ｅＧＦＰ導入遺伝子を含むＡＡＶ２／１、２／２、２／６、２／８、２／９およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）カセットを、先に記載した通りに（Zinn et al., 2015, Cell Reports, 12:1056-68）マサチューセッツ眼科耳科（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｅｙｅ ａｎｄ Ｅａｒ）のＧｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ（ｖｅｃｔｏｒ．ｍｅｅｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ）において調製した。ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０Ｌ６５プラスミド試薬はａｄｄｇｅｎｅ．ｃｏｍより入手可能である。

インビトロの外植片培養
両系統の仔マウスからの全部で１５６の蝸牛外植片培養を、先の刊行物（Dilwali et al., 2015, Scientific Reports, 5:18599）に記載された通りに評価するために出生後４日目に調製した。すなわち、断頭後にマウス側頭骨を採取し、らせん神経節ニューロン領域に接続された器官型外植片として培養するために、蝸牛を解剖した。蝸牛当たり２つの検体を得て、１つ（「頂端」）は下部頂回転から、１つ（「基底」）は上部基底回転からなる。各血清型について、最も少なくて４つ（ＣＢＡ／ＣａＪ、４８ｈ）、２つ（ＣＢＡ／ＣａＪ、４８ｈ＋５ｄ）、３つ（Ｃ５７ＢＬ／６、４８ｈ）、２つ（Ｃ５７ＢＬ／６、４８ｈ＋５ｄ）の基底および頂端検体を接種した。蝸牛の形態が培養中に維持されなかった場合には、検体を除外した。形質導入のばらつきについての情報を与え、さらなるインビボの評価のための選択の基礎を提供するために、試料の数を選択した。培地（９８％ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１％アンピリシンおよび最初の１２時間の間の１％Ｎ_２補充、プラス１％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ））および１０^１０ＧＣのＡＡＶとともに外植片を４８ｈ、５０μｌ中でインキュベートした。４８ｈ＋５ｄの条件のためには、追加の５日間、ＡＡＶを含む培地をＡＡＶを含まない新鮮な培地に交換した。前庭神経鞘腫切除を受けている４人の同意を得た成人患者から得た、卵形嚢由来のヒト前庭上皮を先に記載された通りに培養し（Kesser et al., 2007, Gene Ther., 14:1121-1131）、１０^１０ＧＣのＡＡＶに２４時間曝露し、１０日間培養中に維持し、その後、組織を固定してファロイジンで染色してイメージングした。試験は、参照番号１１／ＬＯ／０４７５でＳｕｒｒｅｙ Ｂｏｒｄｅｒｓ ＮＲＥＳ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ Ｌｏｎｄｏｎ （Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）により承認された。

動物モデルおよび一般的方法
野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＣＢＡ／ＣａＪマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手し、いずれかの性別の動物を推定５０／５０の比率で実験に使用した。インビトロおよびインビボの形質導入アッセイならびに後続のエンドポイントのための実験当たりの群サイズは、検体へのアクセスおよび技術的実行可能性により決定した。Ａｎｃ８０形質導入について報告された観察を、（検体へのアクセスの独特で制限された性質のため、ヒト前庭組織形質導入を除き）様々なベクターロットを使用する後続の実験において定性的に確認した。検体への制限されたアクセスおよび報告された知見の定性的性質のため、血清型の間の形質導入効率の統計学的分析は実施しなかった。

ＣＳＦおよび血液のサンプリング
大槽からの脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプリング（Lui & Duff, 2008, J. Visualized Exp., 21:e960）および開胸による心臓内血液採取を最終手順において実施した。ミクロキャピラリー管を通じて、動物当たり最大量（５μＬ以下）の清澄なＣＳＦを、体積６０μＬのＰＢＳ中に採取し、これは、わずかに異なる開始希釈液をもたらし、その後実験開始前にさらなる対照ＰＢＳにより標準化した。１．１ｍＬのＺ−Ｇｅｌマイクロ管（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に血液試料を得た後、これを８，０００ｒｐｍで８分間、沈降させ、血清を（ＰＢＳ中の）ＣＳＦ試料とともに、さらなる使用まで−８０℃で保管した。

実施例１Ａ−組織学的分析
５〜２９日間のフォローアップ期間の後、動物を屠殺し、蝸牛の全組織標本を先に報告された通りに調製した（Sergeyenko et al., 2013, J. Neurosci., 33:13686-94）。蝸牛全組織標本および外植片の両方を、対応する二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５抗マウス抗体およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗ウサギ抗体、＃Ａ−２１４２２および＃Ａ−２１２４５ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ、１：１０００）とともにミオシン７Ａ（Ｍｙｏ７Ａ、＃２５−６７９０ Ｐｒｏｔｅｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｒａｍｏｎａ， ＣＡ、１：４００）およびベータ−チューブリン（ＴｕＪ１、＃ＭＭＳ−４３５Ｐ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ、１：２００）に対する抗体で染色した（Dilwali et al., 2015, Scientific Reports, 5:18599）。検体をマウントし、その後共焦点顕微鏡法を行った。所与の一連の実験の各画像を、同じ設定で、蛍光の飽和を防ぐために最も強いｅＧＦＰシグナルを有する検体に基づいて選択したレーザー強度を使用して得た。コルチ器官およびらせん神経節ニューロン（ＳＧＮ）域のために概観画像およびズームイン写真についてＺスタックを得た。ＡＭＩＲＡによる３Ｄ再構成を、ＳＧＮトランスフェクションをより正確に決定するために使用した。

図１および図４の結果は、Ｃ５７ＢＬ／６およびＣＢＡ／ＣａＪにおいてｅＧＦＰをそれぞれコードするＡＡＶの発現によりモニターした、５つの血清型のトロピズムを図示する。特に、ｅＧＦＰ発現は、Ａｎｃ８０に曝露した蝸牛培養において定性的により明るく、多くの蝸牛細胞型において発現が明白であった。

実施例１Ｂ−ｅＧＦＰ発現の定量化
インビトロのデータのために、各検体について基底および頂端試料当たり１または２の１００μｍ切片当たりの外有毛細胞または内有毛細胞の総数でｅＧＦＰ陽性細胞の数を割ることによって、ｅＧＦＰ陽性の内有毛細胞（ＩＨＣ）および外有毛細胞（ＯＨＣ）のパーセンテージを蝸牛に沿って手動で定量化した。蝸牛外移植片中のすべての目に見えるＳＧＮをそれらのｅＧＦＰ発現に関して評価した。らせん板縁および支持細胞の面積を、（上で説明した通り、各一連の実験に応じて調整した）定性的アプローチにより、０（発現なし）から３（最強のシグナル）のスケールで評価した。自己蛍光を除外するためにＡＡＶを含まない対照サンプルを使用した。データは、試験した両マウス系統で、頂端および基底において６０から１００％の間の効率でＡｎｃ８０がＩＨＣおよびＯＨＣを標的化したことを実証した。Ａｎｃ８０は、ＡＡＶ２に比較して、ＩＨＣおよびＯＨＣにおいて一貫してかつ定性的により明るいｅＧＦＰ発現を示した（図１および図４）。

２日目の（早期）時点における発現の過小評価をもたらしうる、異なるＡＡＶの間の発現開始における潜在的な相違を調整するために、より長期の実験を行った。新たな蝸牛の組に同一の条件で形質導入したが、ＡＡＶとの４８ｈのインキュベーション後に外植片培養のベクターを含有する培地を除去し、新しい培地に交換して、さらに５日間、培養を生存可能に維持した（４８ｈ＋５ｄと称する）。類似の発現パターンを、この長期試験においてＡＡＶ２およびＡｎｃ８０について観察した。ＣＢＡ／ＣａＪマウスでは、特に基底回転において（図１Ｊ、１Ｋおよび図４Ｉ、４Ｊ）、ＡＡＶ６、８および９について発現の中程度の増加に注目した。他の細胞型は、すべての血清型により標的化され、支持細胞よりも縁がより許容的であり、それに続いてＳＧＮであった（図５、６および７）。より明るいｅＧＦＰ蛍光により証明された通り、Ａｎｃ８０形質導入は、一貫してより高い効率およびより強い発現を生じさせた。

実施例１Ｃ−インビボの注入
仔マウス（Ｐ０〜Ｐ２）に、斜角研磨したガラスマイクロインジェクションピペットを使用して、蝸牛窓膜（ＲＷＭ）を介して注入した。Ｐ−２０００ピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）においてキャピラリーガラス（ＷＰＩ）からピペットを引き、マイクロピペットベベラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）を使用して斜角研磨した（２８°の角度で、〜２０μｍの先端径）。手術部位（左乳様突起）を覆うために滅菌スワブを使用する鎮痛のために、ＥＭＬＡクリーム（リドカイン２．５％およびプリロカイン２．５％）を外部に塗布した。術前は３８℃のウォームパッド上で体温を維持した。意識喪失するまで、２〜３分間、氷／水中で急速な体温低下を誘導することによって仔を麻酔し、手術中、５〜１０分間、冷却プラットフォーム上でこの状態を維持した。べタジンでごしごし擦り、７０％エタノールで拭くことを３回繰り返して、手術部位を消毒した。耳後部の切開を行って透明な耳嚢を露出させ、嚢および覆っている筋膜を通してマイクロピペットを手動ですすめ、マイクロピペットの先端によりＲＷＭを穿通した。およそ１μＬのウイルスを、片側性に１分以内で５頭の（ＡＡＶ１）、４頭の（ＡＡＶ２）、２頭の（ＡＡＶ８）、１頭の（ＡＡＶ６）、３頭の（Ａｎｃ８０）Ｃ５７ＢＬ／６動物の左耳に手動で注入した。質および純度のような特定のベクター調製物に関する因子を調整するために、本明細書に提示する本発明者らの定性的知見を確認するための独立した調製物由来の異なるベクターロットを使用する後続の試験においてＡｎｃ８０の結果を確認した（データは示さない）。非盲検様式で群ごとに注入を実施した。時折、注射針の挿入は深すぎ、浅すぎまたは誤った角度で行われた。中耳または内耳構造に目に見える損傷があった場合には、試料をさらなる分析から除外した。注入の成功率は、注入する人の経験レベル次第で、〜５０％から〜８０％の間で変動した。注入後、６−０の黒色モノフィラメント縫合糸（Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ，Ｗｙｏｍｉｓｓｉｎｇ，ＰＡ）を使用して皮膚切開を閉じた。その後、仔を３８℃のウォーミングパッドに５〜１０分間戻し、次いで、飼育のためにそれらの母親に戻した。

先の報告と一致して、ＡＡＶ１は中程度から高度の効率でＩＨＣに形質導入した（図２Ａ、２Ｂ）。これらの研究は、ＡＡＶ２、６および８が少数のＩＨＣを標的化し、ＡＡＶ８のみが頂端および基底においておおよそ同等の形質導入を実証していることを示している（図２Ｂ）。また、先の報告と一致して、試験した従来のＡＡＶ血清型のすべてについてＯＨＣ形質導入は最小限であった（＜５％）。しかしながら、Ａｎｃ８０は、２０倍（ＡＡＶ１について）〜３倍（ＡＡＶ２について）低い用量で、ほぼ１００％のＩＨＣおよび〜９０％のＯＨＣ（図２Ａ〜２Ｃ）に形質導入した。落射蛍光顕微鏡法による生細胞イメージングにより観察した通り、すべての血清型について１．３６×１０^１２ＧＣの等用量における形質導入は、Ａｎｃ８０については実質的なＩＨＣおよびＯＨＣの形質導入をもたらしたが、ＡＡＶ１、２および８ではＩＨＣの標的化は最小限であり、ＯＨＣでは認められなかった（図８Ｃ、８Ｄ）。

続いて、Ａｎｃ８０で形質導入した試料を固定し、染色し、共焦点顕微鏡法によりイメージングし、有毛細胞形質導入の用量依存性を明らかにした（図８Ｅ）。比類のないＯＨＣ標的化（図２Ｃ、図８）は、他のＡＡＶに比較して質的にはっきりと異なるＡｎｃ８０による形質導入の生物学を例証している。同様のレベルのＡｎｃ８０による形質導入を、Ａｎｃ８０を注入した全３頭のマウスの基底から頂端までの蝸牛全体において認めた（図２Ａ、Ｂ、Ｃ）。蝸牛頂端の低倍率写真（図８Ａ）は、注入部位から遠くで強力なｅＧＦＰ発現を示した。基底の高倍率画像は、１００％のＩＨＣおよび９５％のＯＨＣ形質導入を明らかにしている（図８Ｂ）。

一部の動物において、注入していない対側の耳に強いｅＧＦＰ発現を認めた（図９）。マウスにおいては、蝸牛水管は開存しており、蝸牛外リンパからＣＳＦ、対側水管および対側蝸牛への流体通路を提供している。かくして、ＲＷＭを介して注入したＡｎｃ８０−ｅＧＦＰが脳内のニューロンに形質導入できるかを調べた。実際に、小脳の横断面は、小脳プルキンエニューロンにおける強いｅＧＦＰ発現を明らかにした（図１０Ａ、１０Ｂ）。

遺伝性の難聴の一部の型は、前庭機能不全も引き起こすため、Ａｎｃ８０は、ヒト前庭器官への遺伝子送達に有用なベクターである可能性がある。この可能性を調べるために、前庭シュワン細胞腫の切除を受けている４人の成人患者からヒト前庭上皮を採取し；感覚上皮を先に記載の通りに培養中に置いた（Kesser et al., 2007, Gene Ther., 14:1121-31）。ＡＡＶで形質導入した試料について、図３Ｃは、ヒト前庭上皮全体で両有毛細胞および支持細胞における強力なｅＧＦＰ蛍光を明らかにした。図３Ｄ中のＭｙｏ７Ａで対比染色した上皮の高倍率写真は、Ｍｙｏ７Ａ陽性有毛細胞の８３％（１９／２３）が、ｅＧＦＰ陽性でもあったことを明らかにし、Ａｎｃ８０がマウスおよびヒト両方の有毛細胞に効率的に形質導入できることを示唆している。

実施例１Ｄ−免疫学的アッセイ
ＣＳＦおよび血清中のＡｎｃ８０に対する抗体力価を、中和アッセイにより決定した（Zinn et al., 2015, Cell Reports, 12:1056-68）。９６ウエルフォーマットを使用して、（上記の通りに採取した）熱失活させたＣＳＦまたは血清試料を連続的に無血清培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で希釈し、次いで、Ａｎｃ８０−ルシフェラーゼ（１０^６ＧＣ／ウエル）で１時間、３７℃で処理した。次いで、試料／Ａｎｃ８０−ルシフェラーゼ混合物を、前日にアデノウイルス（ＭＯＩ２０）で処理したＨＥＫ２９３細胞に移植した。３７℃で１時間後、希釈した血清培地（１部の無血清培地、２部の血清培地）を各ウエルに添加した。

２日後、細胞を溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で処理し、−８０℃で３０分間凍結した。次いで、基質バッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＡＴＰ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｄ−ルシフェリン（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ））で処理する前に、細胞を３７℃で１５分間解凍した。Ｓｙｎｅｒｇｙ ＢｉｏＴｅｋ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用してルミネッセンスのアウトプットを読み取った。

アッセイの感度およびサンプリングのレベルにおいて、ベクターに対する低レベルの中和を、注入したマウスの血清中で検出することができたが、ＣＳＦでは検出できなかった（図１０Ｃ）。

実施例１Ｅ−有毛細胞の電気生理学
蝸牛を切除し、カバーガラスに載せ、６３ｘ水浸対物レンズおよび微分干渉オプティクスを備えたＡｘｉｏ Ｅｘａｍｉｎｅｒ．Ａ１正立顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ， Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で眺めた。電気生理学的記録をＭＥＭ中、（ｍＭで）１３７ＮａＣｌ、５．８ＫＣｌ、１０ＨＥＰＥＳ、０．７ＮａＨ_２ＰＯ_４、１．３ＣａＣｌ_２、０．９ＭｇＣｌ_２および５．６Ｄ−グルコース、ビタミン（１：１００）およびアミノ酸（１：５０）を含有する標準液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）（ｐＨ７．４；〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ）中、室温（２２℃〜２４℃）で実施した。

記録用電極（３〜４ＭΩ）をＲ−６ガラス（Ｋｉｎｇ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｇｌａｓｓ，Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から引き出し、（ｍＭで）１４０ＣｓＣｌ、５ＥＧＴＡ−ＫＯＨ、５ＨＥＰＥＳ、２．５Ｎａ_２ＡＴＰ、３．５ＭｇＣｌ_２および０．１ＣａＣｌ_２を含有する細胞内液（ｐＨ７．４；〜２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ）で満たした。Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用するメカノトランスダクション電流を記録するために、全細胞密封（whole-cell, tight-seal）技術を使用した。有毛細胞を−８４ｍＶに維持した。ローパスＢｅｓｓｅｌフィルターにより５ｋＨｚで電流をフィルタリングし、１２ビットの収集ボード（Ｄｉｇｉｄａｔａ １４４０Ａ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）により≧２０ｋＨｚにデジタル化し、ｐＣＬＡＭＰ１０ソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して記録した。

ＬＶＰＺＴ増幅器（Ｅ−５００．００、Ｐｈｙｓｉｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により駆動させたＰＩＣＭＡチップ型ピエゾアクチュエータ（Ｐｈｙｓｉｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に搭載した堅いガラスプローブを使用してＩＨＣおよびＯＨＣ由来の毛束を偏向させ、８−ポールＢｅｓｓｅｌフィルター（Ｍｏｄｅｌ ３３８４フィルター、Ｋｒｏｈｎ Ｈｉｔｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｒｏｋｔｏｎ，ＭＡ）により４０ｋＨｚでフィルタリングして、残留ピペット共振を排除した。全束の記録のために有毛細胞の不動毛の列の凹側面にフィットするように、堅いガラスプローブをデザインした（ＯＨＣ用には直径３〜４μｍ、ＩＨＣ用には直径４〜５μｍ）。Ｐ１０を超える全細胞の電気生理学的記録のために、蝸牛組織をＰ５〜７で切開し、ＭＥＭ（１Ｘ）＋１％ＦＢＳを含むＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ−１培地中、３７℃、５％ＣＯ_２において３０日間以下インキュベートした。

毛束の偏りによって、Ｐ７のＯＨＣおよびＰ３５のＩＨＣから誘発された代表的な電流は、ｅＧＦＰ陽性細胞およびｅＧＦＰ陰性対照細胞の間に、振幅、感度またはキネティクスの相違のないことを明らかにした（図２Ｄ）。５１個のｅＧＦＰ陽性および５２個のｅＧＦＰ陰性有毛細胞を、Ａｎｃ８０への曝露後、蝸牛のすべての領域および１から５週齢の間で記録した。すべての場合において、反応は野生型から識別不可能であり（図２Ｅ）、これは、Ａｎｃ８０による形質導入が感覚細胞機能に有害な効果を及ぼさなかったことを確認した。

実施例１Ｆ−聴覚試験
聴性脳幹反応（ＡＢＲ）および歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）データを、先に記載の通りに収集した（Askew et al., 2015, Science Translational Med., 7:285ra108）。ＤＰＯＡＥは、適切な蝸牛の増幅および同調に関するアッセイであり、外有毛細胞の生存可能性の敏感な尺度である（Guinan et al., 2012, Hearing Res., 293:12-20）。麻酔したマウスにおいて試験した刺激は、５．６、８、１１．３、１６、２２．６および３２ＫＨｚの周波数の１０から９０ｄＢの間の音圧レベルで変化した。４つのＡｎｃ８０を注入した耳と４つの注入しない耳および１つのｅＧＦＰ蛍光を含まない注入による損傷を伴う陰性対照耳を、Ｐ２８〜Ｐ３０で分析した。

ＡＢＲを誘発するために必要な最小限の音閾値をプロットし（図２Ｆ）、注入したおよび注入しない耳の間で閾値に相違のなかったことを明らかにした。組織学的解析は、４つの注入した耳のすべてにおいて強力なｅＧＦＰ蛍光を明らかにした（データは示さない）。１の事例においては、ｅＧＦＰ陽性細胞はなく、ＡＢＲ閾値が上昇し（図２Ｆ）、注入が失敗し、針が蝸牛管を破って永久的な損傷をもたらしたかもしれないことを示唆している。Ａｎｃ８０−ｅＧＦＰによる強い外有毛細胞の形質導入にもかかわらず、注入しない対照耳と比べたＤＰＯＡＥ閾値に相違を認めなかった（図２Ｇ）。よって、ＡＢＲおよびＤＰＯＡＥのデータは、ＩＨＣおよびＯＨＣにおけるＲＷＭ注入、Ａｎｃ８０形質導入および導入遺伝子の発現は、すべて聴覚機能にとって安全であることを示している。

実施例１Ｇ−ロータロッド試験
ロータロッド装置上での平衡行動について５頭のＣ５７ＢＬ／６マウスを試験した。前庭機能の障害を有するマウスは、ロータロッド装置上での成績が良くないことが知られている（Parker & Bitner-Glindzicz, 2015, Archives Dis. Childhood, 100:271-8）。先の研究は、一方の耳のみが冒されている場合に平衡機能不全を検出するためのこのロータロッド試験の能力を強調した（Fukui & Raphael, 2013, Hearing Res., 297:99-105; Geleoc & Holt, 2014年, Science, 344:1241062）。Ｐ１において３頭のマウスに注入し、Ｐ３６において試験し、２頭はＰ７９において注入していない対照マウスであった。以下のロータロッドプロトコールを使用して、すべてのマウスを試験した。１日目に、４ＲＰＭで回転しているロッド上で５分間平衡を保つためにマウスを訓練した。２日目に、各トライアルを５分間隔てた５回のトライアルにおいてマウスを試験した。２ＲＰＭの開始速度から、各トライアルごとにロッドを１ＲＰＭ加速した（Fukui & Raphael, 2013, Hearing Res., 297:99-105）。マウスが装置から落下するまでの時間を（秒で）記録した。

蝸牛の外リンパ液は前庭迷路の外リンパ液と連続しているため、蝸牛ＲＷＭを介して注入したＡｎｃ８０−ｅＧＦＰが前庭感覚器官に形質導入しうるかを評価した。実際に、前庭上皮の全組織標本は、重力および直線的な頭の動きに対して敏感な前庭器官である卵形嚢のＩ型およびＩＩ型有毛細胞の両方における、ならびに回転性の頭の動きに対して敏感な三半規管における強力なｅＧＦＰ発現を明らかにした（図３Ａ、３Ｂ）。よって、Ａｎｃ８０形質導入が平衡に影響しうるという安全性の懸念に取り組むために、前庭における発現が確認された注入したマウスは、前庭機能に関するロータロッド試験の成績が注入しなかった対照と同様であった（図１１）。

第２部−遺伝子治療はアッシャー症候群のマウスモデルにおいて機能を回復させる
実施例２
アッシャー症候群のマウスモデル
以下の方法および材料を実施例２において使用した。

組織標本
電気生理学的研究のために、Ｕｓｈ１ｃｃ．２１６Ｇ＞Ａヘテロ接合性またはホモ接合性突然変異体マウス由来の卵形嚢およびコルチ器官を、出生後０日目から８日目まで（Ｐ０〜Ｐ８）採取した。出生後の仔マウスを、迅速な断頭によって殺した。側頭骨を切除し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を補充したＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に浸した。先に記載の通りに酵素を使用せずにコルチ器官を切り離した。０．１ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼによる１０分間の処理後（Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＸＸＩＶ， Ｓｉｇｍａ）に卵形嚢を切除した。切除した器官を丸いカバーガラスに載せた。先にカバーガラスに接着剤でつけた一組の細いガラス繊維を組織の縁に置いて、下向きに安定化させた。組織を急性的に使用するかまたは１％ウシ胎仔血清の存在下で培養中に保持した。培養を７から８日間維持し、インビトロのウイルスベクター感染を伴う実験のために、２〜３日ごとに培地を交換した。

動物
Ｕｓｈ１ｃｃ．２１６Ｇ＞Ａノックインマウスを、ルイジアナ州立大学のＨｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｅｒから入手した。Ｃ５７ＢＬ６のバックグラウンドを有する輸入した系統は、加齢性の聴覚喪失を引き起こすＣｄｈ２３（Ａｈｌ）突然変異から先に育種された。（Ｐ８よりも前に）トゥクリップまたは（Ｐ８の後に）イヤーパンチを使用してマウスの遺伝子型を同定し、先に記載の通りにＰＣＲを実施した（Lentz et al., 2007, Mutat. Res., 616:139-44）。すべての試験について、雄性および雌性マウスをおよそ等しい割合で用いた。その他の方法で無作為化パラダイムは適用しなかった。

ウイルスベクターの生成
ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスの蝸牛から全ＲＮＡを単離し（ＲＮＡｑｕｅｏｕｓ ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ，Ａｍｂｉｏｎ）、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して逆転写した。ｔｒｕｎｃ−ｈａｒｍｏｎｉｎのｃＤＮＡを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびプライマー：Ｔｒｕｎｃ−ｈａｒｍｏｎｉｎ．Ｆ（ＫｐｎＩ）ＧＡＧ ＧＴＡ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＣＣ ＧＧＡ ＡＧＧ ＴＧＧ ＣＣＣ ＧＡＧ（配列番号９）；Ｔｒｕｎｃ−ｈａｒｍｏｍｉｎ．ＲＶ（ＢａｍＨＩ）ＣＡＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＡＣ ＡＡＴ ＴＴＣ ＡＴＣ ＣＣＣ ＴＡＣ（配列番号１０）を使用してＰＣＲにより増幅した。３８７ｂｐのＰＣＲ産物を、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりクローニングし、シーケンシングにより確認した。ＧＦＰ融合構築物を生成するために、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩを使用して、切断したｈａｒｍｏｎｉｎ断片をｐＥＧＦＰ−Ｃ１中へサブクローニングした。ＮｈｅＩ−ＸｂａＩ ＥＧＦＰ：：ｔｒｕｎｃ−ｈａｒｍｏｎｉｎ ｃＤＮＡを、ＡＡＶシャトルベクターに導入した。慣用のベクターをＡＡＶ２逆位末端反復配列（ＩＴＲ）とともにＡＡＶ１カプシドへパッケージングし、ここで、導入遺伝子カセットが、ＣＭＶプロモーター（ＡＡＶ２／１．ＣＭＶ．ＥＧＦＰ：：ｔｒｕｎｃ−ｈａｒｍｏｍｉｎ．ｈＧＨ、１．９２ Ｅ１４ｇｃ／ｍ，ＢＣＨ）により駆動される。

ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１およびｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１プラスミドを、Ｌｉｌｙ ＺｈｅｎｇおよびＪａｍｅｓ Ｂａｒｔｌｅｓからご厚意により提供されたＥＧＦＰタグ付き標識構築物（Zheng et al., 2010, J. Neurosci., 30:7187-201）（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｆｅｉｎｂｅｒｇ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）から、本発明者らの研究室において調製した。ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１は、元々、マウス腎臓から、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１は単離されたマウス蝸牛感覚上皮にから得た。ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１構築物は、そのＮ末端においてＥＧＦＰタグをｔｄＴｏｍａｔｏで置換するために、さらに修飾した。蛍光標識したおよび非標識構築物をＡＡＶベクターにパッケージングした。Ｂｏｓｔｏｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌのウイルスコア施設およびＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｅｙｅ ａｎｄ Ｅａｒ ＩｎｆｉｒｍａｒｙのＧｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅがウイルスベクターを生成した。以下のベクター：ＡＡＶ２／１．ＣＭＶ．ｔｄＴｏｍａｔｏ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１ ４．３３ １０＾１３ｇｃ／ｍｌ（ＢＣＨ）；ＡＡＶ２／１．ＣＭＶ．ＥＧＦＰ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１ ２．７３ ５６４ １０＾１４ｇｃ／ｍｌ（ＢＣＨ）；ＡＡＶ２／１．ＣＭＶ．ＥＧＦＰ−ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１：２．８１ １０＾１２ｇｃ／ｍｌ（ＭＥＥＩ）；ＡＡＶ２／１．ＣＭＶ．ＥＧＦＰ−ｔｒｕｎｃ−ｈａｒｍｏｎｉｎ；１．９２ １０＾１４ｇｃ／ｍｌ（ＢＣＨ）；ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１：１．９３ １０＾１２ｇｃ／ｍｌ（ＭＥＥＩ）；ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１：１．７４ １０＾１２ｇｃ／ｍｌ（ＭＥＥＩ）；ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｔｒｕｎｃ−ｈａｒｍ．ＷＰＲＥ：９．０２ ５６７ １０＾１２ｇｃ／ｍｌ（ＭＥＥＩ）を生成した。インビトロの実験のために、１０μｌの濃縮したベクターを、１％ウシ胎仔血清の存在下で迅速に切開した組織の１ｍｌ ＭＥＭを補充した培地に２４ｈ添加した。その後、培養を最長１０日、維持した。

蝸牛窓膜（ＲＷＭ）注入
ＲＷＭ注入を、Ｂｏｓｔｏｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌの動物実験委員会により認可された動物プロトコール#１５−０１−２８７８Ｒの通りに実施した。０．８μｌ〜１μｌのＡＡＶベクターを新生児マウスＰ０〜Ｐ１およびＰ１０〜Ｐ１２に注入した。最初に、低体温への曝露を使用してＰ０〜Ｐ１マウスを麻酔したが、Ｐ１０〜Ｐ１２マウスはイソフルランにより麻酔した。麻酔に際して、耳嚢を露出させ、蝸牛を可視化するために、耳後部を切開した。マイクロマニピュレーター（Askew et al., 2015, Sci. Transl. Med., 7:295ra108）により制御したガラスマイクロピペットを使用してＲＷＭを通して注入を行った。注入した材料の体積を、１０分間、およそ０．０２μｌ／分に制御した。標準的な術後ケアを適用した。試料サイズを最適化し、変動を減少させるために、インビボ試験のための試料サイズを継続的に決定した。

電気生理学的記録
（ｍＭで）１４４ ＮａＣｌ、０．７ ＮａＨ_２ＰＯ_４、５．８ ＫＣｌ、１．３ ＣａＣｌ_２、０．９ ＭｇＣｌ_２、５．６ Ｄ−グルコースおよび１０ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨを含有する、ｐＨ７．４および３２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇに調整した標準的な人工の外リンパ液中で記録を実施した。濃縮物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から、ビタミン（１：５０）およびアミノ酸（１：１００）を添加した。６３Ｘ水浸対物レンズおよび微分干渉オプティクスを備えた正立Ａｘｉｏｓｋｏｐ ＦＳ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、頂端表面から有毛細胞を眺めた。記録用ピペット（３〜５ＭΩ）を、ホウケイ酸キャピラリーガラス（Ｇａｒｎｅｒ Ｇｌａｓｓ，Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から引き、（ｍＭで）１３５ ＫＣｌ、５ ＥＧＴＡ−ＫＯＨ、１０ ＨＥＰＥＳ、２．５ Ｋ_２ＡＴＰ、３．５ ＭｇＣｌ_２、０．１ ＣａＣｌ_２を含有するｐＨ ７．４の細胞内液で満たした。全細胞電位固定下、−６４ｍＶの保持電位、室温において電流を記録した。ローパスＢｅｓｓｅｌフィルターにより１０ｋＨｚでフィルタリングし、Ａｘｏｐａｔｃｈ Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ ７００ＡまたはＡｘｏｐａｔｃｈ ２００Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、１２ビットの収集ボード（Ｄｉｇｉｄａｔａ １３２２）により≧２０ｋＨｚにデジタル化し、ｐＣｌａｍｐ８．２および１０．５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用してデータを収集した。データをＯｒｉｇｉｎＬａｂソフトウエアによりオフラインで解析し、特記しない限り、平均±標準偏差として表す。

統計解析
再現性を確実にするために、各時点において、１群当たり少なくとも３頭のラットにおいて試験および対照ベクターを評価した。試料サイズは図の凡例に記されている。ＲＷＭ注入が成功したすべての動物を試験の解析に含めた。注入が成功しなかった動物は、平均から除外したが、完全な開示のために、凡例に含めた。注入の成功を、閾値＞９０ｄＢ ＳＰＬのＡＢＲの回復により決定した。統計解析を、Ｏｒｉｇｉｎ ２０１６（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して実施した。本文および図の凡例に記した通り、データは、平均±標準偏差（ＳＤ）または平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。平均の間の有意な相違を決定するために、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用した。

実施例２Ａ−マウスアッシャーモデルにおける走査電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）
対照および突然変異体マウスのコルチ器官に沿って、Ｐ７、Ｐ１８および〜Ｐ４２（６週）においてＳＥＭを実施した。Ｐ１８のＳＥＭを、ワシントン大学のＤｒ． Ｅｄｗｉｎ Ｒｕｂｅｌと共同して実施した。内耳を０．１Ｍ リン酸ナトリウム中、４％グルタルアルデヒド中で、４℃で一夜、固定した。翌日、０．１Ｍ リン酸ナトリウムバッファー（ＰＢ）で検体を３回すすぎ、３０分間、氷浴中で０．１Ｍ ＰＢ中、１％四酸化オスミウム中に後固定した。次いで、０．１Ｍ ＰＢで検体をすすぎ、段階的な一連のエタノール：３５％、７０％、９５％、および１００％（×２）により脱水した。試料を臨界点乾燥し、ＳＥＭスタブに搭載し、Ａｕ／Ｐｄでスパッタ被覆した。ＪＥＯＬ ＪＳＭ−８４０Ａ走査電子顕微鏡を使用してＳＥＭを実施した。同様の調製をＰ８および６週の段階について実施した。コルチ器官外植片を、２ｍＭＣａＣｌ_２を補充した、０．１Ｍカコジル酸バッファー（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中、２．５％グルタルアルデヒド中で、１時間、室温で固定した。段階的な一連のアセトン中で検体を脱水し、液体ＣＯ_２から臨界点乾燥し、４〜５ｎｍのプラチナ（Ｑ１５０Ｔ、Ｑｕｏｒｕｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）でスパッタ被覆し、電界放出走査電子顕微鏡（Ｓ−４８００、Ｈｉｔａｃｈｉ、Ｊａｐａｎ）で観察した。

ホモ接合性ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスは、耳が聞こえず、循環行動および頭を振りたてる行動を特徴とする前庭機能不全を示す。先の研究（Lentz et al., 2010, Dev., Neurobiol., 70:253-67）は、Ｐ３０における蝸牛の基底の明白な内有毛細胞および外有毛細胞の変性を記載した。変性および有毛細胞死は、中回転においても観察したが、器官の頂端部分は、１月齢においてより良く保存されていた。有毛細胞の変性は、内耳器官の発達中は漸進的に発生すると仮定され、より早い段階での有毛細胞の生存を評価するために、Ｐ８およびＰ１８においてコルチ器官に沿ってＳＥＭ分析を実施した。ヘテロ接合性ｃ．２１６ＧＡマウスの外有毛細胞（ＯＨＣ）および内有毛細胞（ＩＨＣ）を保存し、その束は、これらの年齢では、適切に方向づけられていた（図１２Ａ〜１２Ｃ、１２Ｇ、１２Ｉおよび図１９Ａ〜１９Ｃ、１９Ｋ）。しかしながら、分析した両年齢においてホモ接合性ｃ．２１６ＡＡマウスのコルチ器官の全長に沿って、秩序の乱れた毛束が明白であった（図１２Ｄ〜１２Ｆ、１２Ｈ、１２Ｊ〜１２Ｌおよび図１９Ｄ〜１９Ｊ、１９Ｌ）。Ｐ８では、ＩＨＣ束は基底、中間および頂端領域において中程度に秩序が乱れていた（図１２Ｄ〜１２Ｆ、１２Ｊ）。多くのＩＨＣ束が、波状のパターンおよび不動毛の列の軽い秩序の乱れを示した（図１２Ｊ）。ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスの多くのＯＨＣが良く保存された毛束を有した（図１２Ｈ、１２Ｋ）一方、断片化し、秩序の乱れた毛束が器官に沿ってまばらにあることが明らかであった（図１２Ｄ〜１２Ｆ、１２Ｌ）。Ｐ１８では、破壊がより明白であったが、有毛細胞の大部分は先に報告された通りになお存在していた（Lentz et al., 2013, Nat. Med., 19:345-50）（図１９Ｄ〜１９Ｆ）。

ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１による遺伝子治療を受けたマウスにおける毛束の形態を評価するために、６週齢の未処置（または注入されない）および処置した（または注入した）マウスの側頭骨を、ＳＥＭ分析のために調製した。未処置のｃ．２１６ＡＡマウスは、器官の基底および中間領域における重度の有毛細胞損失を示した（図１８）。基底領域においては、ＯＨＣは最初の列ではほとんど存在せず、第２および第３の列にまばらに存在した。器官の中間領域でも、ＯＨＣの最初の列は大部分が存在しなかった。頂端にはより穏やかな表現型を観察した。高倍率ＳＥＭも、ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスの器官の全長に沿って重度に秩序の乱れた毛束を明らかにした。驚くべきことに、６週齢のｃ．２１６ＡＡマウスにおいては、毛束を観察せず、３列すべてが不動毛である典型的な階段構造を保持していた。その代わりに、ｃ．２１６ＡＡマウス由来の有毛細胞は、最初の列に沿って引っ込んだ不動毛、異常な第２の列およびわずかに保存された最も高い列を有する、秩序の乱れた毛束を示した。対照的に、低減した有毛細胞損失および正常な毛束を、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１による処置後のｃ．２１６ＡＡマウスにおいて観察した。有毛細胞数を、代表的な視野中の毛束の存在または非存在から推定した。

データは、注入したマウスにおける、器官の基底から頂端における有毛細胞数の明白な保存、基底における４０〜７９％、中間における６８〜９５％、および頂端における９３〜９９％を明らかにした（ｎ＝４のｃ．２１６ＡＡマウスの耳からのｎ＝１８２４個の細胞およびｎ＝２のレスキューされたｃ．２１６ＡＡの耳からのｎ＝７９２）。異常な毛束がｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１を注入したマウスにおいてなお明白であり、ほとんどの毛束は３列の不動毛を有し、それらのヘテロ接合性対照からほとんど識別不可能な形態を有していた（図１８）。

実施例２Ｂ−アッシャーマウスモデルにおけるＦＭ１−４３イメージング
５マイクロモルのＦＭ１−４３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、細胞外記録液で希釈し、１０秒間組織に適用し、次いで、細胞外記録液で３回洗浄して、過剰の色素を除去し、エンドサイトーシスによる取り込みを防止した。５分後、水浸２０×、４０×および６３×対物レンズを有するＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ ＦＳ ｐｌｕｓにおいて落射蛍光光源、微分干渉オプティクスおよびＦＭ１−４３フィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、細胞内ＦＭ１−４３をイメージングした。ＣＣＤカメラおよびバックグラウンド蛍光差分法を使用するＡｒｇｕｓ−２０イメージプロセッサー（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を使用して１６ビットで画像を捉えた。同じゲインおよびコントラスト設定を、すべての画像の取得のために維持し、Ａｄｏｂｅ ＰｈｏｔｏｓｈｏｐまたはＩｍａｇｅ−Ｊソフトウエアを使用してオフラインで分析した。

早い段階の有毛細胞機能を評価するために、急速に解剖した内耳器官におけるＦＭ１−４３の取り込みをＰ４において分析した。短時間（＜１０秒）の適用に際して、ＦＭ１−４３は、機能的な機械受容性チャネルを有する有毛細胞に浸透した。均一なＦＭ１−４３の取り込みをｃ．２１６ＧＡマウスの有毛細胞で観察したが（図１３Ａ）、取り込みのレベルはｃ．２１６ＡＡマウスのＯＨＣの間で変動し、いくつかの、しかしすべてではない細胞が機能的な伝達チャネルを保持したこと（図１３Ｂ）を示唆している。同様の観察を蝸牛の全長に沿って行った。周波数特異的な相違は認めなかった。ＦＭ１−４３の取り込みも、出生後の最初の１週間、ｃ．２１６ＡＡマウスのＩＨＣで減少した（データは示さない）。ＦＭ１−４３の取り込みを、突然変異体マウスの卵形嚢の有毛細胞においても評価した。興味深いことに、ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスにおいては、取り込みはＰ６ではストリオーラ外領域に限定され、ストリオーラ領域の有毛細胞に、安静時に開口する機械受容性チャネルのないことを示唆している（図１３Ｃ、１３Ｄ）。

実施例２Ｃ−アッシャーマウスモデルにおける機械刺激
ＯＨＣおよびＩＨＣ：４００ｍＡ ＥＮＶ４００Ａｍｐｌｉｆｉｅｒ（Ｐｉｅｚｏｓｙｓｔｅｍ Ｊｅｎａ Ｇｅｒｍａｎｙ）により駆動されるワン−５２４ディメンショナルＰＩＣＭＡチップピエゾアクチュエーター（one-524 dimensional PICMA chip piezo actuator）（Ｐｈｙｓｉｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗａｌｄｂｒｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に搭載した堅いガラスプローブを介して機械刺激を伝達した。プローブの先端は、不動毛の束にフィットするように、先端熱加工した（Ｆｉｒｅ ｐｏｌｉｓｈｅｒ、Ｈ６０２、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）（Stauffer & Holt, 2007年, J. Neurophysiol., 98:3360-9）。８−ポールＢｅｓｓｅｌフィルター（Ｋｈｒｏｎ−Ｈｉｔｅ，５２８ Ｂｒｏｃｋｔｏｎ，ＭＡ）を５０ｋＨｚで使用してフィルタリングした電圧ステップを印加することによって、偏りを誘発し、残留ピペット共振を排除した。Ｃ２４００ ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を使用して、毛束の偏りをモニターした。刺激プローブの動きを、その静止位置の±２μｍ近辺に較正するために、電圧ステップを使用した。軸はずれの動きのないことを確認するために、プローブのビデオ画像を記録し、プローブの動きを較正した（〜４ｎｍの空間分解能）。プローブの立ち上がり時間の１０〜９０％は〜２０μ秒であった。

ＶＨＣ：圧電バイモルフ要素に搭載した堅いガラスプローブを介して機械刺激を伝達した。刺激ピペット中への動毛の穏やかな吸引によりカップリングを実施した。連続的に搭載され、刺激プローブに直接カップリングした２つのバイモルフからなる圧電装置に電圧ステップを印加することによって、偏りを誘発した。ｐＣｌａｍｐ８．０ソフトウエアにより電圧ステップを制御し、８ポールＢｅｓｓｅｌフィルターにより１ｋＨｚでフィルタリングした（Ｋｈｒｏｎ−Ｈｉｔｅ，Ｂｒｏｃｋｔｏｎ，ＭＡ）。Ｃ２４００ ＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）を使用して毛束の偏りをモニターした。実験の前に、刺激プローブの動きをその静止位置近辺（±２μｍ）に較正した。

出生後の最初の１週間の間、聴覚および前庭上皮は、比較的正常な形態を有するものを含む機械受容性有毛細胞を保持している（図１２）。コルチ器官において、Ｐ３〜Ｐ６のｃ．２１６ＡＡマウスの蝸牛の中回転および頂回転から、正常に見える束を有する有毛細胞およびより重度に破壊された毛束を有するものから記録を得た。ｃ．２１６ＡＡ突然変異体において、ＯＨＣは機械受容性を保持していたが、反応の振幅は１７０±８０ｐＡまで、〜６３％、有意に低減した（ｎ＝２４；ｐ＜０．００１、図１３Ｅ、１３Ｆ、１３Ｇ）。ｃ．２１６ＡＡマウスにおいて、３１から２９２ｐＡの間の広範な反応の振幅をＯＨＣ中で観察した。毛束の形態に従ってデータを群分けすると、有意差（ｐ＜０．０１）が認められ：重度に秩序の乱れた束を有した突然変異体有毛細胞において誘発された電流は、毛束がより保存された突然変異体細胞において誘発されたものよりも小さく、それぞれ、１２０±６５ｐＡ（ｎ＝９）および２０１±７４ｐＡ（ｎ＝１５）であった。電流振幅の低減にもかかわらず、機械的変位に対する有毛細胞の反応は、ヘテロ接合性ｃ．２１６ＧＡマウスのものに類似した特性を保持していた。刺激応答［Ｉ（Ｘ）］曲線を、２次Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ方程式を使用してフィットさせ（図１３Ｆ）、このあてはめを１０〜９０％の作動範囲を決定するために使用した（図２０Ｂ）。ｃ．２１６ＧＡおよびｃ．２１６ＡＡから記録したＯＨＣの間では、作動範囲の有意な差は認めなかった（ｐ＝０．０５４）。同様に、ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスのＩＨＣ由来の毛束は、ＤＩＣ顕微鏡下で軽度に破壊されて見え、Ｐ６においてトランスダクション電流が有意に低減された（図１３Ｅ、１３Ｆ、１３Ｇ）。−６４ｍＶの保持電位で、ヘテロ接合性ｃ．２１６ＧＡのＩＨＣ（Ｐ６〜Ｐ７）における最大トランスダクション電流は平均して５８７±９６ｐＡ（ｎ＝２１）であったが、ｃ．２１６ＡＡのＩＨＣでは３１６±１２７ｐＡ（ｎ＝１９；ｐ＜０．００１）まで４６％低減された。作動範囲における有意な（ｐ＜０．０１）低減を、ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスのＩＨＣで測定した（図２０Ｇ）。・

定常的な束の偏りの存在下でのトランスダクション電流の低下と定義される、順応も、ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウスに存在した。順応速度論を、速い成分および遅い成分を決定するために、二重指数関数あてはめを使用して解析した。両成分は、ｃ．２１６ＡＡ突然変異体マウス由来のＩＨＣおよびＯＨＣにおいてより遅かったが、その相違は、遅い成分に関してのみ有意であった（ＯＨＣにおいてｐ＜０．０５およびＩＨＣにおいてｐ＜０．００１；図２０Ｃ、２０Ｄ、２０Ｈ、２０Ｉ）。一方、Ｐｏｐｅｎ＝０．５で測定した順応の程度は、ｃ．２１６ＧＡよりもｃ．２１６Ａの有毛細胞のＯＨＣおよびＩＨＣで有意に少なかった（図２０Ｅ、２０Ｊ；ｐ＜０．００１）。合わせると、これらの結果は、機械受容性がｃ．２１６ＡＡマウスの内有毛細胞および外有毛細胞において軽度に損なわれ、重要なことに、両細胞型が、遺伝子治療および細胞機能の回復のための必要条件である、出生後の最初の１週間全体を通して生存したことを実証している。

前庭有毛細胞では、ｃ．２１６ＡＡマウスにおいてメカノトランスダクション電流の低減も観察した。ストリオーラ外領域では、ｃ．２１６ＡＡの電流は、１０９±３０ｐＡ（ｎ＝９、Ｐ５〜Ｐ７）まで有意に低減した（ｐ＜０．００１）のに対して、ｃ．２１６ＧＡの電流は２３１±５３ｐＡ（ｎ＝８、Ｐ６〜Ｐ７）であった（図１３Ｅ、１３Ｆ、１３Ｈ）。ストリオーラ領域におけるＦＭ１−４３の取り込みがないこと（以下を参照されたい；図１３Ｃ、１３Ｄ）と一致して、ストリオーラ領域中の有毛細胞からは非常に小さな電流が記録されたかまたは電流は記録されなかった（６±１３ｐＡ、ｎ＝６、Ｐ５〜Ｐ７）。ＤＩＣ顕微鏡観察により、卵形嚢の毛束が極めてよく保存されて見えた一方、トランスダクション電流は、ストリオーラ外およびストリオーラそれぞれにおいて、有毛細胞で著しく低減されたかまたは存在しなかった。よって、ストリオーラ領域を除き、これらの結果は、突然変異体マウスにおいて、トランスダクション装置が正確にアセンブルされ、標的化されるが、機能的な複合体の数は新生児マウスで低減されることを示唆している。

次に、ｈａｒｍｏｎｉｎ発現を駆動するＡＡＶベクターに曝露したｃ．２１６ＡＡ有毛細胞における機能を評価した。外来のｈａｒｍｏｎｉｎによる機能的レスキューの可能性を高めるために、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるタグ付けされていないｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１またはｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１コード配列を、Ａｎｃ８０として知られるＡＡＶカプシド中にパッケージングした（Zinn et al., 2015, Cell Rep., 12:1056-68）。本明細書中に示す通り、Ａｎｃ８０カプシドは、ＩＨＣの１００％およびＯＨＣの８０〜９０％にインビボで形質導入する。ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂがＩＨＣおよびＯＨＣの両方におけるメカノトランスダクションに必要であり、両細胞型における聴覚機能に必要であると仮定した。ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１（０．８μｌ、１．９×１０＾１２ｇｃ／ｍｌ）、これとは別にＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１（１．７×１０＾１２ ｇｃ／ｍｌ）＋ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１（０．５μｌ＋０．５μｌ）の混合物のＲＷＭ注入を実施し、メカノトランスダクション反応を処置の２週間後に評価した。

蝸牛が骨化する前に、Ｐ５〜Ｐ６で組織を抽出し、培養中に１０日間維持した。成熟ＯＨＣ（＞Ｐ１０）はエクスビボで記録のパラダイムを生存しないが、頑強な電気生理学的記録を、Ｐ１４〜Ｐ１６に相当するときにＩＨＣから得た。結果を図１５に表す。注入しないマウス由来のＩＨＣが、大幅に低減されたトランスダクション電流をＰ１６で示したが（７９±４３ｐＡ、ｎ＝８）、感覚変換の回復は、ＡＡＶ処置を受けたマウスにおいて明らかであった。Ｐ１にｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１またはｂ１とａ１両方の組み合わせを注入したマウスにおいて、それぞれ、３３８±６６ｐＡ（ｎ＝１５）および３５２±２８ｐＡ（ｎ＝７；図１５Ｃ）の平均最大トランスダクション電流により有意な回復（^＊＊＊Ｐ＜０．００１）を観察した。ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１による処置後のＩＨＣにおけるトランスダクション電流の振幅は、対照ｃ．２１６ＧＡマウスと有意に相違しなかった。回復のレベルは、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１とｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１の同時注入によって有意に変化しなかった。これらの結果は、早い段階でのＲＷＭ注入による外来ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１の送達が、ＩＨＣにおいてメカノトランスダクションを回復させうることを示唆している。

実施例２Ｄ−アッシャーマウスモデルにおける共焦点イメージング
出生後のマウスＰ０〜Ｐ８からの共焦点イメージングのための組織を準備するために、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を使用して、１５分間、固定を行った。０．０１％トライトンによる透過処理およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒファロイジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１／２００）による対比染色を使用して、アクチンフィラメントを標識した。ＬＳＭ７００Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡で画像を得た。より高齢のマウス（４〜８週）においては、安楽死後に側頭骨を除去し、４％ＰＦＡ中に１時間おき、それに続いて１２０ｍＭ ＥＤＴＡにより２４〜３６時間、脱灰した。次いで、感覚上皮を切り出し、免疫染色のために上記の通りに注入した。マウス抗ＣＴＢＰ２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＃６１２０４４、１／２００）を４８時間適用し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒヤギ抗マウス抗体（１／２００）で一夜、４℃で対比染色して、リボンシナプスを標識した。Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０レーザー共焦点顕微鏡（ＩＤＤＲＣ Ｉｍａｇｉｎｇ ＣｏｒｅグラントＰ３０ ＨＤ１８６５５）で画像を取得し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭイメージビューワー４．２を使用して加工した。

先の研究は、感覚有毛細胞中のｈａｒｍｏｎｉｎの２つのオルタナティブスプライス型の発現を明らかにした。外来ｈａｒｍｏｎｉｎスプライス型の発現を駆動するＡＡＶベクターの能力を評価するために、新生児ｃ．２１６ＡＡおよび野生型（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウス由来の卵形嚢およびコルチ器官を、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１のＮ末端に融合したｅＧＦＰ（ｅＧＦＰ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１）またはｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１の１８１Ｎ末端に融合したｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄＴｏｍａｔｏ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１）をコードするＡＡＶ２／１ベクターに曝露した。ベクターは、Ｐ１において、インビトロまたはＲＷＮ注入（１μｌ）によりインビボで適用した。インビトロで適用する場合、ベクターの存在下でＰ０〜Ｐ１の組織を２４時間インキュベートし、１週間、培養中に維持した。共焦点画像は、野生型、ｃ．２１６ＧＡおよびＣ．２１６ＡＡマウスの有毛細胞が、形質導入に成功したことを示した（図１４Ａ〜１４Ｃ、１４Ｅ）。ＶＨＣ（図１４Ａ）、ＩＨＣおよびＯＨＣ（図１４Ｂ、１４Ｃ）中の不動毛の先端においてＥＧＦＰ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１シグナルがはっきり表れた。ＥＧＦＰシグナルは、Ｐ１で注入したマウスの蝸牛基底部分のＯＨＣおよびＩＨＣ中でもＰ６０で検出した（図１４Ｄ）。ｔｄＴｏｍａｔｏ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１は、聴覚有毛細胞の基底で検出した（図１４Ｅ）。リボンシナプスマーカーＣＴＢＰ２との共染色は、Ｐ７のＩＨＣにおける共局在化を頻繁に明らかにしたが（図１４Ｅ）、Ｐ７の卵形嚢ではそうでなかった（データは示さない）。

外来融合構築物の局在化は、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂの感覚糸挿入物の近くの不動毛の遠位末端へのおよびｈａｒｍｏｎｉｎ−ａのシナプスへの局在化という先の研究と一致した。

実施例２Ｅ−聴性脳幹反応（ＡＢＲ）および歪成分（ＤＰＯＡＥ）
ＡＢＲおよびＤＰＯＡＥを、キシラジン（５〜１０ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）およびケタミン（６０〜１００ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）で麻酔したマウスから記録した。皮下用針電極を、ａ）２つの耳の間の背部の（参照電極）；ｂ）左の耳介の後ろの（記録用電極）；およびｃ）動物の尻の背部の（接地電極）皮膚に挿入した。耳介基部の管をトリミングして外耳道を露出させた。ＡＢＲ記録のために、外耳道および聴覚装置（ＥＰＬ Ａｃｏｕｓｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ，ＭＥＥＩ，Ｂｏｓｔｏｎ）に、５ミリ秒のトーンピップを提示する。反応を増幅し（１０，０００倍）、フィルタリングし（０．１〜３ｋＨｚ）、ＰＣに基づくデータ取得システム（ＥＰＬ，Ｃｏｃｈｌｅａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｓｕｉｔｅ，ＭＥＥＩ，Ｂｏｓｔｏｎ）のアナログ・デジタルボードにより平均した。音のレベルを、０〜１１０ｄＢの音圧レベル（デシベルＳＰＬ）から５〜１０ｄＢずつ上げた。各レベルにおいて、「アーチファクト除去」後に、（刺激の極性を交互に入れ替えることにより）５１２〜１０２４の反応を平均した。目視検査によって閾値を決定した。データを解析し、Ｏｒｉｇｉｎ−２０１５（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＭＡ）を使用してプロットした。特に明記しない限り、閾値の平均±標準偏差を提示する。ＤＰＯＡＥのために、ｆ１およびｆ２プライマリートーン（ｆ２／ｆ１＝１．２）を、５．６と４５．２ｋＨｚの間で半オクターブずつ変化するｆ２およびＬ１−Ｌ２＝１０ｄＢ ＳＰＬとともに提示した。各ｆ２において、Ｌ２は１０ｄＢ ＳＰＬきざみで１０から８０ｄＢ ＳＰＬの間で変化した。ＤＰＯＡＥ閾値は、ノイズフロアを５ｄＢ ＳＰＬ上回る大きさのＤＰＯＡＥを誘発するＬ２レベルとして、平均スペクトルから定義した。平均ノイズフロアレベルは、すべての周波数にわたって０ｄＢ ＳＰＬを下回った。ＳＡ−１スピーカードライバ（Ｔｕｃｋｅｒ−Ｄａｖｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で増幅した、ＰＸＩ−１０４２Ｑ筐体中の２４ビットのデジタルＩ−Ｏカード（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＰＸＩ−４４６１）により刺激を生成し、本発明者らの慣用の音響システム中の２つの静電ドライバー（ＣＵＩ ＣＤＭＧ１５００８−０３Ａ）から送達した。小さなプローブ管の末端のエレクトレットマイク（Ｋｎｏｗｌｅｓ ＦＧ−２３３２９−Ｐ０７）を使用して、外耳道内の音圧をモニターした。これらの実験の大部分は、盲検条件下で実施しなかった。

切断型ｈａｒｍｏｎｉｎが正常な聴覚機能を妨げたかを決定するために、切断型タンパク質を過剰発現させるためのＡｎｃ８０．ＣＭＶ．ｔｒｕｎｃ−ｈａｒｍベクターを作製した。ベクターは、ＲＷＭを介してｃ．２１６ＧＡマウスの内耳に注入した。ＡＢＲおよびＤＰＯＡＥＳを、４、６および１２週で測定し、注入したおよび注入しないｃ．２１６ＧＡマウスの間に閾値の相違はなかった（図２３Ｃ〜２３Ｄに示す６週齢マウスからの記録）。このデータは、注入技術についての対照としての役割を果たし、重要なことには、ベクターは、外来の切断型ｈａｒｍｏｎｉｎが内在性の完全長ｈａｒｍｏｎｉｎと競合しないと主張し、ｃ．２１６ＡＡ有毛細胞中の内在性切断型が、遺伝子治療用ベクターを介して発現する外来の完全長ｈａｒｍｏｎｉｎを妨害しないことを暗示している。

ｈａｒｍｏｎｉｎ遺伝子の増大がＵｓｈ１ｃマウスにおける聴覚および平衡機能をレスキューすることができるかを決定するために、Ｐ０〜Ｐ１でＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１（０．８μＬ、１．７×１０＾１２ｇｃ／ｍｌ）またはＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１（０．８μｌ、１．９×１０＾１２ｇｃ／ｍｌ）のＲＷＭ注入を実施し、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）、歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）、聴覚性驚愕反射、オープンフィールドおよびロータロッド行動を評価した。ｃ．２１６ＡＡマウスが深刻な聴覚喪失および前庭機能不全を患う段階である６週において、マウスを評価した。一部のマウスを３および６カ月でさらに試験した。

ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１を注入した１２頭のマウスのうち、６週間で聴覚機能を回復したものはなく（図１６Ａ〜１６Ｃ）、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１の外来性発現が聴覚のレスキューのためには不十分であることを示唆している。しかしながら、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１を注入した２５頭のマウスのうちの１９頭は、６週間で聴覚機能を顕著に回復した。低周波数（５．６〜１６ｋＨｚ）において、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１を注入した耳の最良のＡＢＲ閾値は２５〜３０ｄＢ ＳＰＬにおけるものであり、野生型マウスの閾値に驚くほど類似していた（図１６Ａ〜１６Ｂ）。部分的なレスキューを、２２．６ｋＨｚで観察し、３２ｋＨｚではほとんどないかまたは全くなかった。ＯＨＣにおける機能のレスキューと一致して、ＤＰＯＡＥ閾値のレスキューも明白であった（図１６Ｃ）。８〜１１．３ｋＨｚの刺激について４５ｄＢ ＳＰＬ未満の可聴閾を有するマウスのうちの８頭を、後の段階で試験して、レスキューの寿命を評価した。６週から３カ月まで、〜１０ｄＢ ＳＰＬのＡＢＲ閾値のシフトを低周波数範囲において、〜３０ｄＢ ＳＰＬを高周波数範囲において観察した（図１６Ｄ）。同様のシフトを、ＤＰＯＡＥ閾値においても観察した（図１６Ｅ）。この時点の後、ＡＢＲ閾値およびＤＰＯＡＥは、試験した最も遅い時点である６か月齢まで安定なままであった（図１６Ｄ〜１６Ｅ）。

より完全な聴覚レスキューのために、特に高周波数末端（high frequency end）でｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１およびｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１が両方とも必要であるかを評価するために、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｔｄＴｏｍａｔｏ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１（０．５μｌ；２３８ ４．１Ｅ＾１２ ｇｃ／ｍｌ）およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１（０．５μｌ；３．０Ｅ＾１２ ｇｃ／ｍｌ）を同時注入した。両蛍光タグについて陽性の細胞から明らかな通り、有毛細胞の６５％が、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１およびｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１を両方とも発現した（図２１）。蛍光標識したｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１は、おそらく過剰発現により、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｔｄＴｏｍａｔｏ：：ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１に曝露したマウスの不動毛中に時折観察された。非標識ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１およびｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１ベクターを同時注入したマウスにおけるＡＢＲおよびＤＰＯＡＥ閾値（図１６）は、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１単独を注入したものに類似し、さらなる改善を提供せず、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１が聴覚機能に不可欠ではない可能性を示唆している。重要なことには、データは、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１単独が、低周波数における可聴閾の顕著な回復に十分であることを実証している（図１６）。

レスキューの程度をさらに評価するために、４５ｄＢ ＳＰＬ以下の閾値を有するマウス由来のＡＢＲ波形を分析し、８頭の対照ｃ．２１６ＧＡマウスとＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１を注入した５頭のｃ．２１６ＡＡマウスの間で比較した。８〜１１．３ｋＨｚおよび１６ｋＨｚにおける反応の分析は、正常波１の振幅（有意でない相違、Ｐ＞０．２、スチューデントｔ検定）およびより長いピーク１潜時（Ｐ＞０．００１）（図２２）を明らかにし、シナプスにおける神経伝達の遅れの可能性を示唆している。多くの動物で、聴覚レスキューは対側耳でも観察され、ＡＢＲ閾値は１１．３ｋＨｚで２０ｄＢ ＳＰＬと低かった（ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１：平均５９．７±５．３ｄＢ ＳＰＬ、ｎ＝１５／２５；ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１＋−ｂ１：２５５平均７６．２±１０．３ｄＢ ＳＰＬ、ｎ＝４〜６）。ＡＡＶベクターの対側耳への拡散は以前に観察されており、新生児マウスのクモ膜下腔と連続したままである外リンパ管を介して発生する可能性がある。

本発明者らは、より遅い発達段階での注入が部分的な聴覚レスキューをもたらしうるかも調べた。Ｐ１０〜Ｐ１２でＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１（０．８μｌ）のＲＷＭ注入を実施し、可聴閾を６週で評価した。Ｐ１０〜Ｐ１２で注入したマウスのいずれも検出可能なＤＰＯＡＥを有さず、そのＡＢＲ閾値は注入しないｃ．２１６ＡＡ対照マウスと相違せず（ｎ＝１０；データは示さない）、おそらくより高齢の組織における低いウイルス形質導入効率または後の発達段階におけるコルチ器官の縮退のため、治療介入の機会が出生後の早期段階に限られる可能性があることを示唆している。

実施例２Ｆ−アッシャーマウスモデルにおけるＲＴ−ＰＣＲ
Ｐ２〜Ｐ３の野生型ヘテロ接合性およびホモ接合性Ｕｓｈ１ｃｃ．２１６Ｇ＞Ａマウスの６つの聴覚器官から、ＱＵＡＮＴＩＴＥＣＴ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｃＤＮＡを調製した。完全長（４５０ｂｐ）または切断型ｈａｒｍｏｎｉｎ（〜３５ｂｐ）をコードするｃＤＮＡを、以下のプライマー：フォワードプライマーｍＵｓｈ１ｃ＿Ｅｘ２Ｆ：５’ ＣＴＣ ＡＴＴ ＧＡＡ ＡＡＴ ＧＡＣ ＧＣＡ ＧＡＧ ＡＡＧ Ｇ ３’（配列番号１１）、リバースｍＵｓｈ１ｃ＿Ｅｘ５Ｒ：５’ ＴＣＴ ＣＡＣ ＴＴＴ ＧＡＴ ＧＧＡ ＣＡＣ ＧＧＴ ＣＴＴ ３’（配列番号１２）を使用して増幅した。これらのプライマーは、マウスＵｓｈ１ｃ配列に特異的であり、標的配列がＵｓｈ１ｃｃ．２１６Ａアレルのヒトのノックイン部分の領域外にあるため、内在性およびＡＡＶ２由来のＵｓｈ１ｃを両方とも増幅する。処置の６週間後に採取したマウス組織から、ＤＮＡおよびＲＮＡレベルも評価した。製造業者のプロトコールに従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、蝸牛からＤＮＡおよびＲＮＡを単離した。ＧｏＳｃｒｉｐｔ逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用してＲＮＡを逆転写した。ＧｏＴａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、放射標識ＰＣＲを実施した。ウイルスＤＮＡの増幅のために、マウスＵｓｈ１ｃ特異的なプライマー：ｍＵｓｈ１ｃ＿Ｅｘ３Ｆ（５’−ＧＡＡ ＣＣＣ ＡＡＣ ＣＧＣ ＣＴＧ ＣＣＧ（配列番号１３））およびｍＵｓｈ１ｃ＿Ｅｘ４ＷＴＲ（５’−ＴＧＣ ＡＧＡ ＣＧＧ ＴＣＣ ＡＡＧ ＣＧＴ−３’（配列番号１４））を使用した。

これらのプライマーは、ウイルスＵｓｈ１ｃＤＮＡのみを増幅し、それは、ホモ接合性Ｕｓｈ１ｃ．２１６ＡＡマウスが、エクソン３およびエクソン４にノックインされ、マウス配列を置換しているヒトＵＳＨ１Ｃｃ．２１６Ａ遺伝子を有するからである（Lentz et al., 2007, Mutat. Res., 616:139-44）。完全長（４５０ｂｐ）および異常にスプライシングされた／切断されたｈａｒｍｏｎｉｎ（４１５ｂｐ）のｃＤＮＡ増幅のためには、上記と同じプライマーを使用した（ｍＵｓｈ１ｃ＿Ｅｘ２ＦおよびｍＵｓｈ１ｃ＿Ｅｘ５Ｒ）。Ｇａｐｄｈプライマーは：ｍＧａｐｄｈ＿Ｅｘ３Ｆ（５’−６１１ ＧＴＧ ＡＧＧ ＣＣＧ ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＧＴ ＡＴＧ−３’（配列番号１５）およびｍＧａｐｄｈ＿Ｅｘ４Ｒ（５’−ＧＣＣ ＡＡＡ ＧＴＴ ＧＴＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＡＣ−３’（配列番号１６）であった。生成物を、６％非変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４００ホスホイメージャー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して定量化した。

先の研究が、切断型ｈａｒｍｏｎｉｎが内在性結合パートナーについて完全長ｈａｒｍｏｎｉｎと競合することによって機能を破壊しうる可能性を提起したため、切断型タンパク質の持続的な発現が、外来性の完全長ｈａｒｍｏｎｉｎを発現するベクターを注入したｃ．２１６ＡＡマウスにおける回復を制限するかを調査した（図２３Ａ）。この懸念に取り組むために、ＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して、ｃ．２１６ＧＡおよびｃ．２１６ＡＡマウスにおけるＵｓｈ１ｃ転写物の発現を調べた。先の報告と一致して、完全長および切断型ｈａｒｍｏｎｉｎをコードするＵｓｈ１ｃ転写物が、ｃ．２１６ＧＡ蝸牛において検出され、ｃ．２１６ＡＡの蝸牛では、切断型ｈａｒｍｏｎｉｎをコードする転写物のみが検出された（図２３Ｂ）。

ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１の発現を確認し、ウイルス発現レベルとＡＢＲ閾値の間の関係を調査するために、注入した蝸牛と対側の蝸牛からＤＮＡおよびＲＮＡを単離し、それぞれ、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲで定量化した。６週齢のｃ．２１６ＧＡマウスならびにＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１（０．８μｌ；１．９３ １０＾１２ｇｃ／ｍｌ）を注入したおよび注入しないｃ．２１６ＡＡマウスで発現を評価した。試料は、ＡＢＲレスキューが良好な（１１．３ｋＨｚにおける閾値≦３５ｄＢ ＳＰＬ）注入した２頭のマウスおよびＡＢＲレスキューが不良の（１１．３ｋＨｚにおける閾値≧９０ｄＢ ＳＰＬ）２頭を含んでいた。ｈａｒｍｏｎｉｎの正確なスプライシング型をコードするＲＮＡ（図２４Ａ）およびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１ ＤＮＡ（図２４Ｂ）を、注入したすべての蝸牛で検出し、比較的程度は低いが、試験したすべての動物の対側蝸牛で検出した。

ＡＢＲ閾値ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの発現量で、動物間にばらつきがあった（図２４Ｃ）。しかしながら、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１ ＤＮＡレベル、ｈａｒｍｏｎｉｎの正確なスプライシング型をコードするＲＮＡの量およびＡＢＲ閾値レベルの間には強い相関が見られ、これは、ＡＢＲデータのばらつきが、ＡＡＶ発現の直接の結果でありうることを示唆している。ＡＢＲ閾値の回復がうまくいったマウスにおける有毛細胞の長期生存を評価するために、６週齢の５頭のマウスにおいて組織を準備し、ＩＨＣおよびＯＨＣの数を計数した（図２５）。２つのコホートにおいてＩＨＣの数が変動しなかった一方、長期のＡＢＲレスキューを示した３頭のマウスにおいては５０％以上のＯＨＣが残存した。ＯＨＣの生存を、基底回転を除き、器官全体にわたって観察した（図２５）。

実施例２Ｇ−アッシャーマウスモデルにおける聴覚性驚愕反応
Ｓｔａｒｔｌｅ Ｍｏｎｉｔｏｒ（Ｋｉｎｄｅｒ Ｓｉｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して聴覚性驚愕反応（ＡＳＲ）を測定した。ピエゾ／プレキシガラスセンシングアセンブリに固定した小さなサイズの非拘束性立方体Ｐｌｅｘｉｇｌａｓ記録チャンバー（２７ｃｍ×１０ｃｍ×１２．５ｃｍ）にマウスを入れ、６０ｄＢ ＳＰＬのバックグラウンドホワイトノイズで５分間、慣れさせた。各セッションは３５回のトライアルからなり、その間、平均３０秒（２５〜３５秒範囲）のトライアル間インターバルで、単一のノイズパルスは強度１０ｄＢ ＳＰＬ単位で６０〜１２０ｄＢ ＳＰＬの範囲にわたって送達した。外部ノイズによる干渉を制限するための定常的な６０ｄＢ ＳＰＬのバックグラウンドノイズにおいて、パルスを疑似ランダム順に配置した。Ｓｔａｒｔｌｅ Ｍｏｎｉｔｏｒシステムは、ピーク驚愕反応（ＡＳＲ振幅）および刺激からピーク驚愕反応までの時間（ＡＳＲ潜時）の計算のために、各パルスに対する反応を最初のＮ、最大のＮおよび反応の最大時間（ｍｓ）の測定に減らした。ＡＳＲはすべて盲検で行った。

ＡＢＲ／ＤＰＯＡＥの回復が、行動に関連した聴覚機能の回復を生じさせたかを評価するために、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１を注入したマウスおよび両ベクターを注入したマウスにおいて聴性驚愕反応を測定した。ホワイトノイズに対する驚愕反応の分析は６週齢のＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１を注入したマウスおよび両ベクターを同時注入したマウスで反応の部分的レスキューを示した（図１７Ａ）。ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１のみを注入したマウスは、注入しないｃ．２１６ＡＡマウスに類似して、驚愕反応を回復しなかった。

実施例２Ｈ−アッシャーマウスモデルにおける前庭評価
オープンフィールドおよびロータロッド平衡試験を使用して、前庭機能を評価した。中心を３０ルクスに設定した天井のＬＥＤ照明を有する音響チャンバーの内部に置いた、直径４２ｃｍの円形フレームを使用し、薄暗い室内でオープンフィールド試験を行った。一度に１頭のマウスを円形のオープンフィールドに入れ、５分間探索させた。行動を記録し、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ ＸＴを使用して追跡し、移動距離と速度の測定を可能とした。オープンフィールド評価はすべて盲検で行った。ロータロッドの実施は、密閉した筐体において、４ｒｐｍで回転を開始し０．１ｒｐｍ ｓ^−１の割合で加速したロッドにマウスを置くことを含んだ。１日目は、機器に慣れさせるために５分間、マウスをロッド上に置いた。翌日、全部で５回のトライアルで動物をロッド上に置いた。トライアル間で５分間の静止期を与えた。筐体の機器装備した床に落下する前に動物が装置上に留まることのできた時間の長さを、タイマーに表示し、各試験ランの後に記録した。

外リンパ腔は蝸牛と前庭迷路の間で連続しているため、ＲＷＭを介して注入したＡＡＶベクターは、前庭感覚器官に同様に形質導入しうる。前庭の行動を評価するために、ロータロッド上でのその成績についてマウスを試験した。不良のロータロッド成績を、ｃ．２１６ＡＡおよびＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１を注入したｃ．２１６ＡＡマウス（落下までの潜時＜平均２２秒）で観察し、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１を注入したｃ．２１６ＡＡマウスならびにｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１および−ｂ１ベクターを同時注入したものは、ロータロッド上で６０〜１２０秒、平衡機能を維持し、対照ｃ．２１６ＧＡマウスと一致した（図１７Ｂ）。

オープンフィールド行動の回復は、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１、ならびにｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１およびｂ１を二重に注入したｃ．２１６ＡＡマウスにおいても観察した。代表的なオープンフィールド探索の追跡を図１７Ｃにプロットする。ｃ．２１６ＧＡマウスはフィールドの縁を探索し、最小の全身回転を示したが、ｃ．２１６ＡＡマウスは、回転数／分として定量化した全身回転の増加を伴うチャンバー全体のいたるところにおけるさらなる活動を示した（図１７Ｄ〜１７Ｅ）。驚くべきことに、ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１を注入したマウスではＡＢＲレスキューを観察しなかったが、オープンフィールドデータは、対照マウスのレベルへの前庭機能の回復を実証した。ＡＡＶ２／Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．ｔｒｕｎｃ−ｈａｒｍｏｎｉｎを注入したｃ．２１６ＧＡマウスの行動は、対照ｃ．２１６ＧＡマウスと相違せず、ここでも、切断型および野生型ｈａｒｍｏｎｉｎの間に妨害のないことを示している。

ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１を注入したマウスは、旋回行動は消失したが、ロータロッド試験には不合格であったため、行動アッセイは、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ａ１による部分的な前庭レスキューを実証した。一方、ｈａｒｍｏｎｉｎ−ｂ１を注入したマウスは、両試験において機能を回復した（図１７）。ストリオーラ領域における形質導入およびＦＭ１−４３の取り込みのないことは、ストリオーラ領域の有毛細胞およびおそらくＩ型細胞の機能が、適切なｈａｒｍｏｎｉｎ発現に依存することを示している（図１３）。

聴覚レスキューが高周波数でなく低周波数で卓越した一方（図１６）、６週における毛束形態の保存を器官全体に沿って観察した（図１８）。高周波数においてレスキューのないことは、注入に起因する損傷による可能性は低い。高周波数の聴覚喪失は、ＡＡＶベクターを注入したｃ．２１６ＧＡのいずれでも観察しなかった（図２３Ｃ〜２３Ｄ）。蝸牛の長さ全体に沿ったＡＡＶターゲティングは、説明として基底における形質導入効率を欠くことと相反する。１つの可能性は、短いｈａｒｍｏｎｉｎ−ｃのような他のｈａｒｍｏｎｉｎアイソフォームが、蝸牛の基底高周波数末端における機能のレスキューに必要でありうるということである。代替的に、蝸牛の発達は基底末端（basal end）から始まるため、Ｐ０までに、基底高周波数末端由来の有毛細胞が修復点を超えて成熟した可能性がある。もしそうなら、胚への介入が高周波数領域におけるより良いレスキューを可能としうる。

第３部−聴覚喪失に関与するさらなる突然変異の遺伝子治療
実施例３Ａ−インビボ実験
改変ＣＭＶプロモーターにより駆動されるマウスＴＭＣ１のコード配列を保有するＡｎｃ８０ベクターを、ヘルパーウイルスフリーシステムおよび先に記載の二重トランスフェクション法を使用して作製した（Grimm et al., 2003, Mol. Ther., 7:839:50）。トリプルｆｌａｇタグ（ＦＬＡＧ）配列をＴＭＣコード配列のＣ末端に融合させて、発現したタンパク質の可視化を可能とした。イオジキサノールステップグラジエント、それに続いてイオン交換クロマトグラフィーを使用して、Ａｎｃ８０．ＣＭＶ．Ｔｍｃベクターを精製した。ヒトベータグロブリンイントロンエレメントに特異的なプライマーセットを使用する定量的ＰＣＲにより測定して、力価は１×１０^１２から１×１０^１３ｇｃ／ｍｌの範囲にわたった。ウイルスのアリコートを−８０℃で保管し、使用直前に解凍した。

Ｐ０〜Ｐ２齢のマウスを、Ｂｏｓｔｏｎ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌの動物実験委員会により認可されたプロトコール（プロトコール#２６５９、＃２１４６）に従って、以下に記載の通りにウイルスベクターのインビボ送達のために使用した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス系統（Ｔａｃｏｎｉｃ）を、野生型対照マウスとして使用し、ＴＭＣ１突然変異体アレル（ＴＭＣ１Δ／ΔまたはＴｍｃ１−／−）を保有するマウスは、先に記載の通りにＣ５７ＢＬ／６Ｊをバックグラウンドとした（Kawashima et al., 2011, J. Clin. Invest., 121:4796-809）。

評価のための組織を準備するために、Ｐ０〜Ｐ１０の仔マウスから側頭骨を採取した。迅速な断頭によって仔を安楽死させ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０５ｍｇ／ｍｌ アンピシリンおよび０．０１ｍｇ／ｍｌ シプロフロキサシンを補充したＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＨ７．４０中で側頭骨を解剖した。解剖鏡下で膜迷路を単離し、ライスナー膜を剥がし、蓋膜および血管条を機械的に除去した。コルチ器官培養を、１つの端がＳｙｌｇａｒｄにより１８ｍｍの丸いカバーガラスに接着された一対の細いガラスファイバーの下に平らにピンで留めた。急性的に組織を電気生理学的研究に使用した。Ｐ１０よりも高齢のマウスについては、吸入したＣＯ_２により動物を安楽死させた後に、側頭骨を採取し、蝸牛全組織標本を作製した。

図中に表したすべての平均値およびエラーバーは、平均±ＳＤを表す。注入した耳および注入しない耳の間の統計学的有意性についての比較を、対応のある両側ｔ検定を使用して実施した。Ｐ＜０．０５が有意と考えた。

実施例３Ｂ−ウイルスベクターのインビボ注入
蝸牛窓膜（ＲＷＭ）を介して、斜角研磨したガラスマイクロインジェクションピペットを使用して仔マウス（Ｐ０〜Ｐ２）に注入した。Ｐ−２０００ピペットプラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）においてキャピラリーガラスからピペットを引き、マイクロピペットベベラー（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して斜角研磨した（２８°の角度で、〜２０μｍの先端径）。手術部位（左乳様突起）を覆うために滅菌スワブを使用する鎮痛のために、ＥＭＬＡクリーム（リドカイン２．５％およびプリロカイン２．５％）を外部に塗布した。術前は３７℃のウォームパッド上で３０〜６０分、体温を維持した。

意識喪失するまで、２〜３分間、急速な体温低下を誘導することによって仔を麻酔し、手術中、１０〜１５分間この冷却プラットフォーム上でこの状態を維持した。べタジンでごしごし擦り、７０％エタノールで拭くことを３回繰り返して、手術部位を消毒した。耳後部の切開を行って透明な耳嚢を露出させ、耳嚢および覆っている筋膜を通してマイクロピペットをマイクロマニピュレーター（ＭＰ−３０，Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）ですすめ、マイクロピペットの先端によりＲＷＭを穿通した。

１０^１２から１０^１４ｇｃ／ｍＬの間の力価のおよそ１μＬのウイルス（１０^９から１０^１１個の全ウイルス粒子）を、片側性に０．１μｌ／分で、空圧マイクロインジェクター（ＷＰＩ Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ ２０１０）を使用して左耳に注入した。６−０のモノフィラメント縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ）を使用して皮膚切開を閉じた。その後、回復のために仔をウォーミングパッドに戻した。

実施例３Ｃ−免疫蛍光法
ウイルスベクターにより送達した導入遺伝子の発現の分布を決定するために免疫染色を実施した。そのために、新たに解剖したコルチ器官に対して免疫染色を実施し、ＰＢＳで希釈した４％パラホルムアルデヒドにより室温で１時間、液浸固定した。次いで、組織をＰＢＳですすぎ、０．０１〜０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で３０分間、透過化処理し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６−ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、１：２００希釈液）で１時間、対比染色して、線維状アクチンを標識した。

外因性に発現したＴＭＣ：：ＦＬＡＧ融合タンパク質の局在化のために、２％ ＢＳＡおよび５％正常ヤギ血清を使用して、１時間、組織をブロッキングし、ＦＬＡＧモチーフに対する抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１：２００希釈液）とともに４℃で一夜、インキュベートした。有毛細胞計数のために、正常ヤギ血清中で組織を１時間、ブロッキングし、ウサギ抗ミオシンＶＩＩａ一次抗体（Ｐｒｏｔｅｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１：１０００希釈液）により、４℃で一夜染色し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：２００希釈液）にコンジュゲーションしたヤギ抗ウサギ抗体で１時間標識した。試料を、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともにカバーガラスに搭載し、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡を使用して使用倍率１０Ｘ〜６３Ｘでイメージングした。

図２６は、ｈａｒｍｏｎｉｎのＵｓｈ１ｃ突然変異体マウスへの均一なＡｎｃ８０送達を実証する免疫蛍光法を示し、図２８は、ＫＣＮＱ４のＫＣＮＱ４突然変異体マウスの細胞へのＡｎｃ８０送達を実証する免疫蛍光法を示す。よって、Ａｎｃ８０は、聴覚消失をもたらす（多くの異なる遺伝子座における）多くの異なる遺伝子異常を処置するための有効なベクターである。

実施例３Ｄ−有毛細胞の電気生理学
器官型蝸牛培養を、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．７ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、５．８ｍＭ ＫＣｌ、１．３ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．９ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓおよび５．６ｍＭ Ｄ−グルコースを含有する標準的な人工の外リンパ液に浸した。濃縮物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からビタミン（１：５０）およびアミノ酸（１：１００）を溶液に添加し、最終的なｐＨを７．４０（３１０ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ）に調整するためにＮａＯＨを使用した。記録用ピペット（３〜５メガオーム）を、Ｒ６キャピラリーガラス（Ｋｉｎｇ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｇｌａｓｓ）から引き、１３５ｍＭ ＣｓＣｌ、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２．５ｍＭ Ｎａ_２−アデノシン３リン酸および０．１ｍＭ ＣａＣｌ_２を含有する細胞内液で満たし、最終的なｐＨを７．４０（２８５ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ）に調整するためにＣｓＯＨを使用した。Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、−８４ｍＶ、室温（２２〜２４℃）において全細胞密封電圧クランプ記録を行った。ローパスＢｅｓｓｅｌフィルターにより１０ｋＨｚで感覚変換電流をフィルタリングし、１６ビットの収集ボード（Ｄｉｇｉｄａｔａ １４４０Ａ）およびｐＣＬＡＭＰ１０ソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により≧２０ｋＨｚにデジタル化した。ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ８（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ）を使用するオフラインで解析のためにデータを記録した。

図２９は、突然変異体マウス（図２９Ｂ）に対するＡｎｃ８０−ＫＣＮＱ４でトランスフェクトしたＫＣＮＱ４−／−細胞（図１０Ｃ）における野生型レベル近くまでのカリウム流の回復を示し（図２９Ａ）、それにより、Ａｎｃ８０を使用する遺伝子治療が機能を回復できることを実証している。

実施例３Ｅ−聴性脳幹反応（ＡＢＲ）
先に記載の通りに（Maison et al., 2010, J. Neurosci., 30:6751-62）、ＡＢＲ記録を行った。すなわち、Ｐ２５〜Ｐ３０のマウスを、５ｍｌの０．９％食塩水に希釈した５０ｍｇのケタミンおよび５ｍｇのキシラジンを含むＩＰ注射（０．１ｍｌ／１０ｇ体重）により麻酔した。ＡＢＲ実験を、３２℃において防音チャンバー内で実施した。聴覚機能を試験するために、１０から１１５ｄＢの間、５ｄＢずつの音圧レベルにおいて、再現可能なＡＢＲ波形（ピークＩ〜ＩＶ）を誘発する閾値強度を検出するまで、５．６ｋＨｚ、８ｋＨｚ、１１．３ｋＨｚ、１６ｋＨｚ、２２．６ｋＨｚまたは３２ｋＨｚの純音刺激をマウスに提示する。交番極性刺激を使用して、５１２〜１０２４の反応を集め、各音圧レベルについて平均した。１５μＶ（最高最低間）より大きな振幅を有する波形は、「アーチファクト除去」機能により捨てた。

ＡＢＲ試験の開始前、典型的に外耳道の入り口を見えなくする、垂れ下がった皮膚および軟骨を解剖はさみによって切り取り、すべての刺激周波数において、各個別の被験対象について外耳道の入り口の音圧を較正した。音刺激を、プライマリートーンを生成するための２つの静電イヤホン（ＣＵＩ Ｍｉｎｉａｔｕｒｅ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）および外耳道内音圧を記録するためのＫｎｏｗｌｅｓミニチュアマイクロフォン（エレクトレットコンデンサ）からなる慣用のプローブチューブスピーカー／マイクロフォンアセンブリ（ＥＰＬ ＰＸＩ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって、試験される耳に直接送達した。音刺激は、５ミリ秒のバースト音（ｃｏｓ^２開始で０．５ミリ秒の上昇下降で、４０／秒で送達された）。

耳介（活動電極）、頭頂（参照電極）および尻（接地電極）に挿入した皮下針電極を使用して、ＡＢＲシグナルを収集した。ＡＢＲ電位を増幅し（１０，０００×）、パスフィルタリングし（０．３〜１０ｋＨｚ）、慣用のデータ取得ソフトウエア（ＬａｂＶＩＥＷ）を使用してデジタル化した。デジタルＩ−Ｏボード（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、音刺激および電極電圧を４０μ秒の間隔でサンプリングし、オフライン解析のために保管した。音の強さが増大するにつれて任意の波（Ｉ−ＩＶ）が検出され、再現された最低デシベルレベルとして、閾値を視覚的に定義した。各実験群内でＡＢＲ閾値を平均し、統計解析のために使用した。

図２７は、Ｈａｒｍｏｎｉｎをコードし、発現するＡｎｃ８０ウイルスベクターの送達が、特に、低い周波数（例えば、約５〜約２２ｋＨｚ）において、聴覚機能の完全に近い回復をもたらすことができることを図により実証している。

実施例３Ｆ−定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析
インビボ投与後に蝸牛中に存在するウイルス量を評価するために実験を行った。２頭のＴＭＣ１−／−マウスに、Ｐ１で左耳に注入した。蝸牛を左右の耳から切除し、Ｐ１０に相当する３日間培養中に維持した。ＲＮＡを抽出し、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して質を確認し、先に記載の通りに（Kawashima et al., 2011, J. Clin. Invest., 121:4796-809）ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＥＲ ｑＰＣＲ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する、ＴＭＣ１特異的な効率的プライマーセットによる定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析のためにｃＤＮＡに逆転写した。

ＴＭＣ１の断片を増幅するために、以下のプライマー：５’−ＣＡＴ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＣＡ ＡＣＴ ＴＴＧ ＧＴＧ ＴＧＴ−３’（配列番号１７）および５’−ＡＧＡ ＧＧＴ ＡＧＣ ＣＧＧ ＡＡＡ ＴＴＣ ＡＧＣ ＣＡＴ−３’（配列番号１８）を使用した。発現レベルを、５’−ＴＧＡ ＧＣＧ ＣＡＡ ＧＴＡ ＣＴＣ ＴＧＴ ＧＴＧ ＧＡＴ−３’（配列番号１９）および５’−ＡＣＴ ＣＡＴ ＣＧＴ ＡＣＴ ＣＣＴ ＧＣＴ ＴＧＣ ＴＧＡ−３’（配列番号２０）により増幅した（β−アクチンをコードする）Ａｃｔｂの発現レベルに正規化した。すべてのプライマーを、イントロンに橋をかけるようデザインし、融解曲線解析および陰性対照を使用して検証した。Ａｃｔｂならびに注入したおよび注入しない耳の間の相違に関連して、ΔΔＣＴ法を使用してデータを解析した。

これらの結果は、注入した耳において、注入しない耳よりもＴＭＣ１ ｍＲＮＡの発現が１２倍高かったことを実証している。

実施例３Ｇ−ＦＭ１−４３の標識化
ＦＭ１−４３色素ローディング実験を先に記載の通りに実施した（Gale et al., 2001, J. Neurosci., 21:7013-25; Meyers et al., 2003, J. Neurosci., 23:4054-65;およびGeleoc & Holt, 2003, Nat. Neurosci., 10:1019-20）。接着性の蝸牛培養を有するカバーガラスを、ガラス底のチャンバー上の正立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ ＦＳ Ｐｌｕｓ）下に置いた。人工の外リンパ液で希釈した５μＭのＦＭ１−４３ＦＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１０秒間添加し、人工の外リンパ液で組織を３回洗浄して、細胞膜の外葉から色素を除去した。５分後、細胞内ＦＭ１−４３を、ＦＭ１−４３フィルターセットおよび６３Ｘ水浸対物レンズを有する落射蛍光光源を使用してイメージングした。上記の通りに、組織を固定し、免疫蛍光法のために加工した。

図３０は、本明細書に記載のＡｎｃ８０ウイルスベクターに曝露した細胞によるＦＭ１−４３色素の取り込みを示す、免疫染色画像であり、図３１は、本明細書に記載のＡｎｃ８０ウイルスベクターにより送達されたＴＭＣ１が、インビボでＴｍｃ１欠損有毛細胞において感覚変換を回復させたことを図により実証している。

実施例３Ｈ−歪成分耳音響放射（ＤＰＯＡＥ）
ＡＢＲデータと同じ条件下で、同じ記録セッションの間にＤＰＯＡＥデータを収集した。２ｆ１−ｆ２でのＤＰＯＡＥの生成のために１．２の周波数割合（ｆ２／ｆ１）でプライマリートーンを作り、各ｆ２／ｆ１対について、ｆ２レベルはｆ１レベルよりも１０ｄＢ、音圧レベル低かった。ｆ２レベルを、５−ｄＢずつ２０から８０ｄＢまで動かした。記録した外耳道音圧のシグナル対ノイズ比を増加させるために、波形およびスペクトル平均化を各レベルで使用した。平均したスペクトルから、２ｆ１−ｆ２におけるＤＰＯＡＥの振幅を、スペクトルの隣接点におけるノイズフロアとともに抽出した。ＤＰＯＡＥ振幅対音レベルのプロットから、等反応曲線を内挿した。閾値を、０ｄＢにおいてＤＰＯＡＥを生成するために必要なｆ２レベルとして定義した。

図３２は、本明細書に記載のＡｎｃ８０ウイルスベクターを使用して送達したＴＭＣ１が、ＴＭＣ１−／−マウス、特に低周波数（例えば、約５〜約１６ｋＨｚ）において、外有毛細胞の機能をレスキューすることを図により実証する。

他の実施形態
方法および物質の組成物が、多くの異なる態様と併せて本明細書に記載されたが、様々な態様の上記記載が、例示を目的とし、方法および物質の組成物の範囲を制限するものでないことは理解されるべきである。他の態様、利益および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。

開示されるのは、開示された方法および組成物のために使用可能であり、それをともに使用可能であり、その準備において使用可能であり、またはその生成物である、方法および組成物である。これらおよびその他の材料が本明細書に記載され、これらの方法および組成物の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されることが理解される。すなわち、様々な個々のものおよび集合的な組み合わせの具体的な参照およびこれらの組成物および方法の並べ替えは、明示的に開示されないかもしれないが、それぞれが具体的に考慮され、本明細書に記載される。例えば、物質の特別な組成物または特別な方法が開示され、議論され、多数の組成物または方法が議論される場合、組成物および方法のそれぞれならびに各組み合わせおよび並べ替えは、特にそうでないと示されない限り、具体的に考慮される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも、具体的に考慮され、開示される。

Claims (39)

1. Ａｎｃ８０カプシドタンパク質、およびＴＭＣ１、ＴＭＣ２、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＣＨ１Ｃ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＳＡＮＳ、ＣＩＢ２、ＵＳＨ２Ａ、ＶＬＧＲ１、ＷＨＲＮ、ＣＬＲＮ１、ＰＤＺＤ７からなる群から選択される１つまたは複数の導入遺伝子を含む、ＡＶＶベクター。
2. 対象の内耳中の１つまたは複数の細胞に導入遺伝子を送達する方法であって、
   対象の内耳にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を投与するステップを含み、前記ＡＡＶはＡｎｃ８０カプシドタンパク質および導入遺伝子を含む、方法。
3. 前記内耳中の１つまたは複数の細胞が、内有毛細胞（ＩＨＣ）および外有毛細胞（ＯＨＣ）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
4. 前記導入遺伝子が、内有毛細胞の少なくとも８０％および外有毛細胞の少なくとも８０％に送達される、請求項３に記載の方法。
5. 前記内耳中の１つまたは複数の細胞が、らせん神経節ニューロン、前庭有毛細胞、前庭神経節ニューロン、支持細胞および血管条中の細胞からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
6. 前記導入遺伝子が、ＡＣＴＧ１、ＡＤＣＹ１、ＡＴＯＨＩ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ１、ＢＤＮＦ、ＢＤＰ１、ＢＳＮＤ、ＤＡＴＳＰＥＲ２、ＣＡＢＰ２、ＣＤ１６４、ＣＤＣ１４Ａ、ＣＤＨ２３、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＨＤ７、ＣＣＤＣ５０、ＣＩＢ２、ＣＬＤＮ１４、ＣＬＩＣ５、ＣＬＰＰ、ＣＬＲＮ１、ＣＯＣＨ、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２、ＣＲＹＭ、ＤＣＤＣ２、ＤＦＮＡ５、ＤＦＮＢ３１、ＤＦＮＢ５９、ＤＩＡＰＨ１、ＥＤＮ３、ＥＤＮＲＢ、ＥＬＭＯＤ３、ＥＭＯＤ３、ＥＰＳ８、ＥＰＳ８Ｌ２、ＥＳＰＮ、ＥＳＲＲＢ、ＥＹＡ１、ＥＹＡ４、ＦＡＭ６５Ｂ、ＦＯＸＩ１、ＧＩＰＣ３、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ６、ＧＰＲ９８、ＧＲＨＬ２、ＧＰＳＭ２、ＧＲＸＣＲ１、ＧＲＸＣＲ２、ＨＡＲＳ２、ＨＧＦ、ＨＯＭＥＲ２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＩＬＤＲ１、ＫＡＲＳ、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＪ１０、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ４、ＫＩＴＬＧ、ＬＡＲＳ２、ＬＨＦＰＬ５、ＬＯＸＨＤ１、ＬＲＴＯＭＴ、ＭＡＲＶＥＬＤ２、ＭＣＭ２、ＭＥＴ、ＭＩＲ１８３、ＭＩＲＮ９６、ＭＩＴＦ、ＭＳＲＢ３、ＭＴ−ＲＮＲ１、ＭＴ−ＴＳ１、ＭＹＨ１４、ＭＹＨ９、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ１Ａ、ＭＹＯ３Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ７Ａ、ＮＡＲＳ２、ＮＤＰ、ＮＦ２、ＮＴ３、ＯＳＢＰＬ２、ＯＴＯＡ、ＯＴＯＦ、ＯＴＯＧ、ＯＴＯＧＬ、Ｐ２ＲＸ２、ＰＡＸ３、ＰＣＤＨ１５、ＰＤＺＤ７、ＰＪＶＫ、ＰＮＰＴ１、ＰＯＬＲ１Ｄ、ＰＯＬＲ１Ｃ、ＰＯＵ３Ｆ４、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＲＰＳ１、ＰＴＰＲＱ、ＲＤＸ、Ｓ１ＰＲ２、ＳＡＮＳ、ＳＥＭＡ３Ｅ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＳＬＣ１７Ａ８、ＳＬＣ２２Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ５、ＳＩＸ１、ＳＩＸ５、ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯ、ＳＮＡＩ２、ＳＯＸ１０、ＳＴＲＣ、ＳＹＮＥ４、ＴＢＣ１Ｄ２４、ＴＣＯＦ１、ＴＥＣＴＡ、ＴＩＭＭ８Ａ、ＴＪＰ２、ＴＮＣ、ＴＭＣ１、ＴＭＣ２、ＴＭＩＥ、ＴＭＥＭ１３２Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＲＰＮ、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＳＰＥＡＲ、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ、ＵＳＨ２Ｄ、ＶＬＧＲ１、ＷＦＳ１、ＷＨＲＮ、およびＸＩＡＰからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
7. 前記導入遺伝子が、神経栄養因子をコードする、請求項２に記載の方法。
8. 前記神経栄養因子が、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３およびＨＳＰ７０からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
9. 前記導入遺伝子が、抗体またはその断片をコードする、請求項２に記載の方法。
10. 前記導入遺伝子が、免疫調節タンパク質をコードする、請求項２に記載の方法。
11. 前記導入遺伝子が、抗発癌性転写物をコードする、請求項２に記載の方法。
12. 前記導入遺伝子が、アンチセンス、サイレンシング、または長鎖非コードＲＮＡ種をコードする、請求項２に記載の方法。
13. 前記導入遺伝子が、遺伝子操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲからなる群から選択されるゲノム編集システムをコードする、請求項２に記載の方法。
14. 前記Ａｎｃ８０カプシドタンパク質が、配列番号１に示される配列を有する、請求項２に記載の方法。
15. 前記Ａｎｃ８０カプシドタンパク質が、配列番号２に示される配列を有する、請求項２に記載の方法。
16. 前記導入遺伝子が、異種プロモーター配列の制御下にある、請求項３に記載の方法。
17. 前記異種プロモーター配列が、ＣＭＶプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ−１プロモーター、アルファ９ニコチン受容体プロモーター、プレスチンプロモーター、ＫＣＮＱ４プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、Ｍｙｏ６プロモーター、Ｇｆｉｌプロモーター、Ｖｇｌｕｔ３プロモーターおよびＡｔｏｈ１プロモーターからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記投与するステップが、蝸牛窓を通してＡｎｃＡＡＶを注入することを含む、請求項２に記載の方法。
19. 前記ＡｎｃＡＡＶが、蝸牛窓を通る注入により投与される、請求項２に記載の方法。
20. 前記ＡｎｃＡＡＶが、蝸牛開窓術の間またはカナロストミーの間に投与される、請求項２に記載の方法。
21. 前記ＡｎｃＡＡＶが、１つまたは複数のドラッグデリバリービヒクルによって中耳および／または蝸牛窓に投与される、請求項２に記載の方法。
22. 前記導入遺伝子の発現が、内有毛細胞（ＩＨＣ）、外有毛細胞（ＯＨＣ）、らせん神経節ニューロン、血管条、前庭有毛細胞および／または前庭神経節ニューロンの再生をもたらし、それによって、聴覚または前庭機能を回復させる、請求項２に記載の方法。
23. ＡＡＶベクターおよび医薬組成物を含む製造品であって、前記ＡＡＶベクターは、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質およびプロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を含む、製造品。
24. 前記導入遺伝子が、ＡＣＴＧ１、ＡＤＣＹ１、ＡＴＯＨＩ、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ１、ＢＤＮＦ、ＢＤＰ１、ＢＳＮＤ、ＤＡＴＳＰＥＲ２、ＣＡＢＰ２、ＣＤ１６４、ＣＤＣ１４Ａ、ＣＤＨ２３、ＣＥＡＣＡＭ１６、ＣＨＤ７、ＣＣＤＣ５０、ＣＩＢ２、ＣＬＤＮ１４、ＣＬＩＣ５、ＣＬＰＰ、ＣＬＲＮ１、ＣＯＣＨ、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ９Ａ１、ＣＯＬ９Ａ２、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１１Ａ２、ＣＲＹＭ、ＤＣＤＣ２、ＤＦＮＡ５、ＤＦＮＢ３１、ＤＦＮＢ５９、ＤＩＡＰＨ１、ＥＤＮ３、ＥＤＮＲＢ、ＥＬＭＯＤ３、ＥＭＯＤ３、ＥＰＳ８、ＥＰＳ８Ｌ２、ＥＳＰＮ、ＥＳＲＲＢ、ＥＹＡ１、ＥＹＡ４、ＦＡＭ６５Ｂ、ＦＯＸＩ１、ＧＩＰＣ３、ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＧＪＢ６、ＧＰＲ９８、ＧＲＨＬ２、ＧＰＳＭ２、ＧＲＸＣＲ１、ＧＲＸＣＲ２、ＨＡＲＳ２、ＨＧＦ、ＨＯＭＥＲ２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＩＬＤＲ１、ＫＡＲＳ、ＫＣＮＥ１、ＫＣＮＪ１０、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ４、ＫＩＴＬＧ、ＬＡＲＳ２、ＬＨＦＰＬ５、ＬＯＸＨＤ１、ＬＲＴＯＭＴ、ＭＡＲＶＥＬＤ２、ＭＣＭ２、ＭＥＴ、ＭＩＲ１８３、ＭＩＲＮ９６、ＭＩＴＦ、ＭＳＲＢ３、ＭＴ−ＲＮＲ１、ＭＴ−ＴＳ１、ＭＹＨ１４、ＭＹＨ９、ＭＹＯ１５Ａ、ＭＹＯ１Ａ、ＭＹＯ３Ａ、ＭＹＯ６、ＭＹＯ７Ａ、ＮＡＲＳ２、ＮＤＰ、ＮＦ２、ＮＴ３、ＯＳＢＰＬ２、ＯＴＯＡ、ＯＴＯＦ、ＯＴＯＧ、ＯＴＯＧＬ、Ｐ２ＲＸ２、ＰＡＸ３、ＰＣＤＨ１５、ＰＤＺＤ７、ＰＪＶＫ、ＰＮＰＴ１、ＰＯＬＲ１Ｄ、ＰＯＬＲ１Ｃ、ＰＯＵ３Ｆ４、ＰＯＵ４Ｆ３、ＰＲＰＳ１、ＰＴＰＲＱ、ＲＤＸ、Ｓ１ＰＲ２、ＳＡＮＳ、ＳＥＭＡ３Ｅ、ＳＥＲＰＩＮＢ６、ＳＬＣ１７Ａ８、ＳＬＣ２２Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ５、ＳＩＸ１、ＳＩＸ５、ＳＭＡＣ／ＤＩＡＢＬＯ、ＳＮＡＩ２、ＳＯＸ１０、ＳＴＲＣ、ＳＹＮＥ４、ＴＢＣ１Ｄ２４、ＴＣＯＦ１、ＴＥＣＴＡ、ＴＩＭＭ８Ａ、ＴＪＰ２、ＴＮＣ、ＴＭＣ１、ＴＭＣ２、ＴＭＩＥ、ＴＭＥＭ１３２Ｅ、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＲＰＮ、ＴＲＩＯＢＰ、ＴＳＰＥＡＲ、ＵＳＨ１Ｃ、ＵＳＨ１Ｇ、ＵＳＨ２Ａ、ＵＳＨ２Ｄ、ＶＬＧＲ１、ＷＦＳ１、ＷＨＲＮ、およびＸＩＡＰからなる群から選択される、請求項２３に記載の製造品。
25. 対象の内耳中の１つまたは複数の細胞にＴＭＣ１またはＴＭＣ２導入遺伝子を送達する方法であって、
    対象の内耳にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を投与するステップを含み、前記ＡＡＶは、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質および導入遺伝子を含む、方法。
26. 対象の内耳中の１つまたは複数の細胞にアッシャー導入遺伝子を送達する方法であって、
    対象の内耳にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を投与するステップを含み、前記ＡＡＶは、Ａｎｃ８０カプシドタンパク質および導入遺伝子を含む、方法。
27. 前記アッシャー導入遺伝子が、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＣＨ１Ｃ、ＣＤＨ２３、ＰＣＤＨ１５、ＳＡＮＳ、ＣＩＢ２、ＵＳＨ２Ａ、ＶＬＧＲ１、ＷＨＲＮ、ＣＬＲＮ１、ＰＤＺＤ７からなる群から選択される、請求項２５または２６に記載の方法。
28. 前記内耳中の１つまたは複数の細胞が、内有毛細胞（ＩＨＣ）および外有毛細胞（ＯＨＣ）からなる群から選択される、請求項２５または２６に記載の方法。
29. 前記導入遺伝子が、内有毛細胞の少なくとも８０％および外有毛細胞の少なくとも８０％に送達される、請求項２８に記載の方法。
30. 前記内耳中の１つまたは複数の細胞が、らせん神経節ニューロン、前庭有毛細胞、前庭神経節ニューロン、支持細胞および血管条中の細胞からなる群から選択される、請求項２５または２６に記載の方法。
31. 前記Ａｎｃ８０カプシドタンパク質が、配列番号１に示される配列を有する、請求項２５または２６に記載の方法。
32. 前記Ａｎｃ８０カプシドタンパク質が、配列番号２に示される配列を有する、請求項２５または２６に記載の方法。
33. 前記導入遺伝子が、異種プロモーター配列の制御下にある、請求項２５または２６に記載の方法。
34. 前記異種プロモーター配列が、ＣＭＶプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ−１プロモーター、アルファ９ニコチン受容体プロモーター、プレスチンプロモーター、ＫＣＮＱ４プロモーター、Ｍｙｏ７ａプロモーター、Ｍｙｏ６プロモーター、Ｇｆｉｌプロモーター、Ｖｇｌｕｔ３プロモーターおよびＡｔｏｈ１プロモーターからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
35. 前記投与するステップが、蝸牛窓を通してＡｎｃＡＡＶを注入することを含む、請求項２５または２６に記載の方法。
36. 前記ＡｎｃＡＡＶが、蝸牛窓を通る注入により投与される、請求項２５または２６に記載の方法。
37. 前記ＡｎｃＡＡＶが、蝸牛開窓術の間またはカナロストミーの間に投与される、請求項２５または２６に記載の方法。
38. 前記ＡｎｃＡＡＶが、１つまたは複数のドラッグデリバリービヒクルによって中耳および／または蝸牛窓に投与される、請求項２５または２６に記載の方法。
39. 前記導入遺伝子の発現が、内有毛細胞（ＩＨＣ）、外有毛細胞（ＯＨＣ）、らせん神経節ニューロン、血管条、前庭有毛細胞および／または前庭神経節ニューロンの再生をもたらし、それによって、聴覚または前庭機能を回復させる、請求項２５または２６に記載の方法。