JP6990182B2 - 蝸牛および前庭細胞に核酸を送達するための材料および方法 - Google Patents
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Description
本明細書に記載される通り、祖先AAVカプシドタンパク質を含有するアデノ随伴ウイルス(AAV)は、内耳細胞へ核酸(例えば、導入遺伝子)を送達することにおいて特に効率的であり、特に有効な種類の祖先AAVカプシドタンパク質が、Anc80と名付けられた祖先足場カプシドタンパク質により表され、配列番号1に示される。Anc80祖先カプシドタンパク質の種類に属する1つの具体的な祖先カプシドタンパク質は、Anc80-0065(配列番号2)であるが、国際公開第2015/054653号パンフレットは、Anc80祖先カプシドタンパク質の種類に属する多くのさらなる祖先カプシドタンパク質を記載している。
核酸を細胞に送達する方法は、一般に、当分野において知られており、導入遺伝子を含有する(ウイルス粒子とも呼ばれうる)ウイルスをインビボで内耳細胞に送達する方法は本明細書に記載されている。本明細書に記載される通り、約108~約1012個のウイルス粒子を対象に投与することができ、ウイルスは好適な体積(例えば、10μL、50μL、100μL、500μL、または1000μL)の、例えば、人工の外リンパ液に懸濁されうる。
ヒトアッシャー症候群(USH)は、合併した難聴と失明の原因となる稀な遺伝子疾患である。これは常染色体劣性形質として遺伝し、米国において16,000~20,000人を冒し、3~6%の幼児期難聴の原因となる。アッシャー症候群は、症状の重症度により3つの臨床亜型(USH-1、-2および-3)に分類される。USH1は、最も重症型である。USH1に冒された患者は、先天性の両側性重度感音性難聴、前庭反射消失および思春期前の網膜色素変性症(進行性の網膜の桿体および錐体機能の両側性対称性変性)を患う。蝸牛移植片を装着されない限り、個体は典型的に発声する能力を発達させない。現在、アッシャー患者のための生物学的治療法は存在しないが、欠陥遺伝子の野生型形態の早期再導入は疾患の回復を可能としうる。
40超の異なる突然変異が、難聴を引き起こすTMC1において同定されている。これらは、35の劣性突然変異および5の優性突然変異にさらに分割される。劣性突然変異のほとんどは、重度の先天性聴覚喪失をもたらす(例えば、DFNB7/11)が、少数は後発性の中程度から重度の聴覚喪失を引き起こす。すべての優性突然変異は、十代半ばに発症する、進行性の聴覚喪失(例えば、DFNA36)を引き起こす。特に、本明細書に記載のAnc80カプシドタンパク質を含むAAVベクターは、非突然変異体(例えば、野生型)TMC1配列またはTMC2配列を送達し、それにより聴覚喪失(例えば、さらなる聴覚喪失)を予防しかつ/または聴覚機能を回復させるために、使用されうる。
実施例1
祖先AAVカプシドタンパク質を含有するアデノ随伴ウイルス(AAV)は、安全かつ効率的な蝸牛遺伝子導入をもたらす
以下の方法および材料を実施例1において使用した。
CMV駆動eGFP導入遺伝子を含むAAV2/1、2/2、2/6、2/8、2/9およびAAV2/Anc80L65およびウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子(WPRE)カセットを、先に記載した通りに(Zinn et al., 2015, Cell Reports, 12:1056-68)マサチューセッツ眼科耳科(Massachusetts Eye and Ear)のGene Transfer Vector Core(vector.meei.harvard.edu)において調製した。AAV2/Anc80L65プラスミド試薬はaddgene.comより入手可能である。
両系統の仔マウスからの全部で156の蝸牛外植片培養を、先の刊行物(Dilwali et al., 2015, Scientific Reports, 5:18599)に記載された通りに評価するために出生後4日目に調製した。すなわち、断頭後にマウス側頭骨を採取し、らせん神経節ニューロン領域に接続された器官型外植片として培養するために、蝸牛を解剖した。蝸牛当たり2つの検体を得て、1つ(「頂端」)は下部頂回転から、1つ(「基底」)は上部基底回転からなる。各血清型について、最も少なくて4つ(CBA/CaJ、48h)、2つ(CBA/CaJ、48h+5d)、3つ(C57BL/6、48h)、2つ(C57BL/6、48h+5d)の基底および頂端検体を接種した。蝸牛の形態が培養中に維持されなかった場合には、検体を除外した。形質導入のばらつきについての情報を与え、さらなるインビボの評価のための選択の基礎を提供するために、試料の数を選択した。培地(98%ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、1%アンピリシンおよび最初の12時間の間の1%N2補充、プラス1%ウシ胎仔血清(FBS))および1010GCのAAVとともに外植片を48h、50μl中でインキュベートした。48h+5dの条件のためには、追加の5日間、AAVを含む培地をAAVを含まない新鮮な培地に交換した。前庭神経鞘腫切除を受けている4人の同意を得た成人患者から得た、卵形嚢由来のヒト前庭上皮を先に記載された通りに培養し(Kesser et al., 2007, Gene Ther., 14:1121-1131)、1010GCのAAVに24時間曝露し、10日間培養中に維持し、その後、組織を固定してファロイジンで染色してイメージングした。試験は、参照番号11/LO/0475でSurrey Borders NRES Committee London (Health Research Authority)により承認された。
野生型C57BL/6JおよびCBA/CaJマウスを、Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)から入手し、いずれかの性別の動物を推定50/50の比率で実験に使用した。インビトロおよびインビボの形質導入アッセイならびに後続のエンドポイントのための実験当たりの群サイズは、検体へのアクセスおよび技術的実行可能性により決定した。Anc80形質導入について報告された観察を、(検体へのアクセスの独特で制限された性質のため、ヒト前庭組織形質導入を除き)様々なベクターロットを使用する後続の実験において定性的に確認した。検体への制限されたアクセスおよび報告された知見の定性的性質のため、血清型の間の形質導入効率の統計学的分析は実施しなかった。
大槽からの脳脊髄液(CSF)サンプリング(Lui & Duff, 2008, J. Visualized Exp., 21:e960)および開胸による心臓内血液採取を最終手順において実施した。ミクロキャピラリー管を通じて、動物当たり最大量(5μL以下)の清澄なCSFを、体積60μLのPBS中に採取し、これは、わずかに異なる開始希釈液をもたらし、その後実験開始前にさらなる対照PBSにより標準化した。1.1mLのZ-Gelマイクロ管(Sarstedt,Numbrecht,Germany)中に血液試料を得た後、これを8,000rpmで8分間、沈降させ、血清を(PBS中の)CSF試料とともに、さらなる使用まで-80℃で保管した。
5~29日間のフォローアップ期間の後、動物を屠殺し、蝸牛の全組織標本を先に報告された通りに調製した(Sergeyenko et al., 2013, J. Neurosci., 33:13686-94)。蝸牛全組織標本および外植片の両方を、対応する二次抗体(Alexa Fluor 555抗マウス抗体およびAlexa Fluor 647抗ウサギ抗体、#A-21422および#A-21245 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA、1:1000)とともにミオシン7A(Myo7A、#25-6790 Proteus Biosciences, Ramona, CA、1:400)およびベータ-チューブリン(TuJ1、#MMS-435P Biolegend, San Diego, CA、1:200)に対する抗体で染色した(Dilwali et al., 2015, Scientific Reports, 5:18599)。検体をマウントし、その後共焦点顕微鏡法を行った。所与の一連の実験の各画像を、同じ設定で、蛍光の飽和を防ぐために最も強いeGFPシグナルを有する検体に基づいて選択したレーザー強度を使用して得た。コルチ器官およびらせん神経節ニューロン(SGN)域のために概観画像およびズームイン写真についてZスタックを得た。AMIRAによる3D再構成を、SGNトランスフェクションをより正確に決定するために使用した。
インビトロのデータのために、各検体について基底および頂端試料当たり1または2の100μm切片当たりの外有毛細胞または内有毛細胞の総数でeGFP陽性細胞の数を割ることによって、eGFP陽性の内有毛細胞(IHC)および外有毛細胞(OHC)のパーセンテージを蝸牛に沿って手動で定量化した。蝸牛外移植片中のすべての目に見えるSGNをそれらのeGFP発現に関して評価した。らせん板縁および支持細胞の面積を、(上で説明した通り、各一連の実験に応じて調整した)定性的アプローチにより、0(発現なし)から3(最強のシグナル)のスケールで評価した。自己蛍光を除外するためにAAVを含まない対照サンプルを使用した。データは、試験した両マウス系統で、頂端および基底において60から100%の間の効率でAnc80がIHCおよびOHCを標的化したことを実証した。Anc80は、AAV2に比較して、IHCおよびOHCにおいて一貫してかつ定性的により明るいeGFP発現を示した(図1および図4)。
仔マウス(P0~P2)に、斜角研磨したガラスマイクロインジェクションピペットを使用して、蝸牛窓膜(RWM)を介して注入した。P-2000ピペットプラー(Sutter Instrument,Novato,CA)においてキャピラリーガラス(WPI)からピペットを引き、マイクロピペットベベラー(Sutter Instrument,Novato,CA)を使用して斜角研磨した(28°の角度で、~20μmの先端径)。手術部位(左乳様突起)を覆うために滅菌スワブを使用する鎮痛のために、EMLAクリーム(リドカイン2.5%およびプリロカイン2.5%)を外部に塗布した。術前は38℃のウォームパッド上で体温を維持した。意識喪失するまで、2~3分間、氷/水中で急速な体温低下を誘導することによって仔を麻酔し、手術中、5~10分間、冷却プラットフォーム上でこの状態を維持した。べタジンでごしごし擦り、70%エタノールで拭くことを3回繰り返して、手術部位を消毒した。耳後部の切開を行って透明な耳嚢を露出させ、嚢および覆っている筋膜を通してマイクロピペットを手動ですすめ、マイクロピペットの先端によりRWMを穿通した。およそ1μLのウイルスを、片側性に1分以内で5頭の(AAV1)、4頭の(AAV2)、2頭の(AAV8)、1頭の(AAV6)、3頭の(Anc80)C57BL/6動物の左耳に手動で注入した。質および純度のような特定のベクター調製物に関する因子を調整するために、本明細書に提示する本発明者らの定性的知見を確認するための独立した調製物由来の異なるベクターロットを使用する後続の試験においてAnc80の結果を確認した(データは示さない)。非盲検様式で群ごとに注入を実施した。時折、注射針の挿入は深すぎ、浅すぎまたは誤った角度で行われた。中耳または内耳構造に目に見える損傷があった場合には、試料をさらなる分析から除外した。注入の成功率は、注入する人の経験レベル次第で、~50%から~80%の間で変動した。注入後、6-0の黒色モノフィラメント縫合糸(Surgical Specialties,Wyomissing,PA)を使用して皮膚切開を閉じた。その後、仔を38℃のウォーミングパッドに5~10分間戻し、次いで、飼育のためにそれらの母親に戻した。
CSFおよび血清中のAnc80に対する抗体力価を、中和アッセイにより決定した(Zinn et al., 2015, Cell Reports, 12:1056-68)。96ウエルフォーマットを使用して、(上記の通りに採取した)熱失活させたCSFまたは血清試料を連続的に無血清培地(Life Technologies,Carlsbad,CA)で希釈し、次いで、Anc80-ルシフェラーゼ(106GC/ウエル)で1時間、37℃で処理した。次いで、試料/Anc80-ルシフェラーゼ混合物を、前日にアデノウイルス(MOI20)で処理したHEK293細胞に移植した。37℃で1時間後、希釈した血清培地(1部の無血清培地、2部の血清培地)を各ウエルに添加した。
蝸牛を切除し、カバーガラスに載せ、63x水浸対物レンズおよび微分干渉オプティクスを備えたAxio Examiner.A1正立顕微鏡(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)で眺めた。電気生理学的記録をMEM中、(mMで)137NaCl、5.8KCl、10HEPES、0.7NaH2PO4、1.3CaCl2、0.9MgCl2および5.6D-グルコース、ビタミン(1:100)およびアミノ酸(1:50)を含有する標準液(Life Technologies,Carlsbad,CA)(pH7.4;~310mOsm/kg)中、室温(22℃~24℃)で実施した。
聴性脳幹反応(ABR)および歪成分耳音響放射(DPOAE)データを、先に記載の通りに収集した(Askew et al., 2015, Science Translational Med., 7:285ra108)。DPOAEは、適切な蝸牛の増幅および同調に関するアッセイであり、外有毛細胞の生存可能性の敏感な尺度である(Guinan et al., 2012, Hearing Res., 293:12-20)。麻酔したマウスにおいて試験した刺激は、5.6、8、11.3、16、22.6および32KHzの周波数の10から90dBの間の音圧レベルで変化した。4つのAnc80を注入した耳と4つの注入しない耳および1つのeGFP蛍光を含まない注入による損傷を伴う陰性対照耳を、P28~P30で分析した。
ロータロッド装置上での平衡行動について5頭のC57BL/6マウスを試験した。前庭機能の障害を有するマウスは、ロータロッド装置上での成績が良くないことが知られている(Parker & Bitner-Glindzicz, 2015, Archives Dis. Childhood, 100:271-8)。先の研究は、一方の耳のみが冒されている場合に平衡機能不全を検出するためのこのロータロッド試験の能力を強調した(Fukui & Raphael, 2013, Hearing Res., 297:99-105; Geleoc & Holt, 2014年, Science, 344:1241062)。P1において3頭のマウスに注入し、P36において試験し、2頭はP79において注入していない対照マウスであった。以下のロータロッドプロトコールを使用して、すべてのマウスを試験した。1日目に、4RPMで回転しているロッド上で5分間平衡を保つためにマウスを訓練した。2日目に、各トライアルを5分間隔てた5回のトライアルにおいてマウスを試験した。2RPMの開始速度から、各トライアルごとにロッドを1RPM加速した(Fukui & Raphael, 2013, Hearing Res., 297:99-105)。マウスが装置から落下するまでの時間を(秒で)記録した。
実施例2
アッシャー症候群のマウスモデル
以下の方法および材料を実施例2において使用した。
電気生理学的研究のために、Ush1cc.216G>Aヘテロ接合性またはホモ接合性突然変異体マウス由来の卵形嚢およびコルチ器官を、出生後0日目から8日目まで(P0~P8)採取した。出生後の仔マウスを、迅速な断頭によって殺した。側頭骨を切除し、10mM HEPES(pH7.4)を補充したMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中に浸した。先に記載の通りに酵素を使用せずにコルチ器官を切り離した。0.1mg/mlのプロテアーゼによる10分間の処理後(Protease XXIV, Sigma)に卵形嚢を切除した。切除した器官を丸いカバーガラスに載せた。先にカバーガラスに接着剤でつけた一組の細いガラス繊維を組織の縁に置いて、下向きに安定化させた。組織を急性的に使用するかまたは1%ウシ胎仔血清の存在下で培養中に保持した。培養を7から8日間維持し、インビトロのウイルスベクター感染を伴う実験のために、2~3日ごとに培地を交換した。
Ush1cc.216G>Aノックインマウスを、ルイジアナ州立大学のHealth Science Centerから入手した。C57BL6のバックグラウンドを有する輸入した系統は、加齢性の聴覚喪失を引き起こすCdh23(Ahl)突然変異から先に育種された。(P8よりも前に)トゥクリップまたは(P8の後に)イヤーパンチを使用してマウスの遺伝子型を同定し、先に記載の通りにPCRを実施した(Lentz et al., 2007, Mutat. Res., 616:139-44)。すべての試験について、雄性および雌性マウスをおよそ等しい割合で用いた。その他の方法で無作為化パラダイムは適用しなかった。
c.216AA突然変異体マウスの蝸牛から全RNAを単離し(RNAqueous micro kit,Ambion)、QuantiTect Reverse Transcriptionキット(Qiagen)を使用して逆転写した。trunc-harmoninのcDNAを、Platinum Taq DNAポリメラーゼ High Fidelity(Invitrogen)およびプライマー:Trunc-harmonin.F(KpnI)GAG GTA CCA TGG ACC GGA AGG TGG CCC GAG(配列番号9);Trunc-harmomin.RV(BamHI)CAG GAT CCG GAC AAT TTC ATC CCC TAC(配列番号10)を使用してPCRにより増幅した。387bpのPCR産物を、TAクローニングキット(Invitrogen)によりクローニングし、シーケンシングにより確認した。GFP融合構築物を生成するために、KpnIおよびBamHIを使用して、切断したharmonin断片をpEGFP-C1中へサブクローニングした。NheI-XbaI EGFP::trunc-harmonin cDNAを、AAVシャトルベクターに導入した。慣用のベクターをAAV2逆位末端反復配列(ITR)とともにAAV1カプシドへパッケージングし、ここで、導入遺伝子カセットが、CMVプロモーター(AAV2/1.CMV.EGFP::trunc-harmomin.hGH、1.92 E14gc/m,BCH)により駆動される。
RWM注入を、Boston Children’s Hospitalの動物実験委員会により認可された動物プロトコール#15-01-2878Rの通りに実施した。0.8μl~1μlのAAVベクターを新生児マウスP0~P1およびP10~P12に注入した。最初に、低体温への曝露を使用してP0~P1マウスを麻酔したが、P10~P12マウスはイソフルランにより麻酔した。麻酔に際して、耳嚢を露出させ、蝸牛を可視化するために、耳後部を切開した。マイクロマニピュレーター(Askew et al., 2015, Sci. Transl. Med., 7:295ra108)により制御したガラスマイクロピペットを使用してRWMを通して注入を行った。注入した材料の体積を、10分間、およそ0.02μl/分に制御した。標準的な術後ケアを適用した。試料サイズを最適化し、変動を減少させるために、インビボ試験のための試料サイズを継続的に決定した。
(mMで)144 NaCl、0.7 NaH2PO4、5.8 KCl、1.3 CaCl2、0.9 MgCl2、5.6 D-グルコースおよび10 HEPES-NaOHを含有する、pH7.4および320mOsmol/kgに調整した標準的な人工の外リンパ液中で記録を実施した。濃縮物(Invitrogen,Carlsbad,CA)から、ビタミン(1:50)およびアミノ酸(1:100)を添加した。63X水浸対物レンズおよび微分干渉オプティクスを備えた正立Axioskop FS顕微鏡(Zeiss,Oberkochen,Germany)を使用して、頂端表面から有毛細胞を眺めた。記録用ピペット(3~5MΩ)を、ホウケイ酸キャピラリーガラス(Garner Glass,Claremont,CA)から引き、(mMで)135 KCl、5 EGTA-KOH、10 HEPES、2.5 K2ATP、3.5 MgCl2、0.1 CaCl2を含有するpH 7.4の細胞内液で満たした。全細胞電位固定下、-64mVの保持電位、室温において電流を記録した。ローパスBesselフィルターにより10kHzでフィルタリングし、Axopatch Multiclamp 700AまたはAxopatch 200A(Molecular Devices,Palo Alto,CA)を使用して、12ビットの収集ボード(Digidata 1322)により≧20kHzにデジタル化し、pClamp8.2および10.5(Molecular Devices,Palo Alto,CA)を使用してデータを収集した。データをOriginLabソフトウエアによりオフラインで解析し、特記しない限り、平均±標準偏差として表す。
再現性を確実にするために、各時点において、1群当たり少なくとも3頭のラットにおいて試験および対照ベクターを評価した。試料サイズは図の凡例に記されている。RWM注入が成功したすべての動物を試験の解析に含めた。注入が成功しなかった動物は、平均から除外したが、完全な開示のために、凡例に含めた。注入の成功を、閾値>90dB SPLのABRの回復により決定した。統計解析を、Origin 2016(OriginLab Corporation)を使用して実施した。本文および図の凡例に記した通り、データは、平均±標準偏差(SD)または平均の標準誤差(SEM)として表す。平均の間の有意な相違を決定するために、一元配置分散分析(ANOVA)を使用した。
対照および突然変異体マウスのコルチ器官に沿って、P7、P18および~P42(6週)においてSEMを実施した。P18のSEMを、ワシントン大学のDr. Edwin Rubelと共同して実施した。内耳を0.1M リン酸ナトリウム中、4%グルタルアルデヒド中で、4℃で一夜、固定した。翌日、0.1M リン酸ナトリウムバッファー(PB)で検体を3回すすぎ、30分間、氷浴中で0.1M PB中、1%四酸化オスミウム中に後固定した。次いで、0.1M PBで検体をすすぎ、段階的な一連のエタノール:35%、70%、95%、および100%(×2)により脱水した。試料を臨界点乾燥し、SEMスタブに搭載し、Au/Pdでスパッタ被覆した。JEOL JSM-840A走査電子顕微鏡を使用してSEMを実施した。同様の調製をP8および6週の段階について実施した。コルチ器官外植片を、2mMCaCl2を補充した、0.1Mカコジル酸バッファー(Electron Microscopy Sciences)中、2.5%グルタルアルデヒド中で、1時間、室温で固定した。段階的な一連のアセトン中で検体を脱水し、液体CO2から臨界点乾燥し、4~5nmのプラチナ(Q150T、Quorum Technologies、United Kingdom)でスパッタ被覆し、電界放出走査電子顕微鏡(S-4800、Hitachi、Japan)で観察した。
5マイクロモルのFM1-43(Invitrogen)を、細胞外記録液で希釈し、10秒間組織に適用し、次いで、細胞外記録液で3回洗浄して、過剰の色素を除去し、エンドサイトーシスによる取り込みを防止した。5分後、水浸20×、40×および63×対物レンズを有するZeiss Axioscope FS plusにおいて落射蛍光光源、微分干渉オプティクスおよびFM1-43フィルターセット(Chroma Technologies)を使用して、細胞内FM1-43をイメージングした。CCDカメラおよびバックグラウンド蛍光差分法を使用するArgus-20イメージプロセッサー(Hamamatsu)を使用して16ビットで画像を捉えた。同じゲインおよびコントラスト設定を、すべての画像の取得のために維持し、Adobe PhotoshopまたはImage-Jソフトウエアを使用してオフラインで分析した。
OHCおよびIHC:400mA ENV400Amplifier(Piezosystem Jena Germany)により駆動されるワン-524ディメンショナルPICMAチップピエゾアクチュエーター(one-524 dimensional PICMA chip piezo actuator)(Physik Instruments,Waldbronn,Germany)に搭載した堅いガラスプローブを介して機械刺激を伝達した。プローブの先端は、不動毛の束にフィットするように、先端熱加工した(Fire polisher、H602、World Precision Instruments Inc.、Sarasota,FL)(Stauffer & Holt, 2007年, J. Neurophysiol., 98:3360-9)。8-ポールBesselフィルター(Khron-Hite,528 Brockton,MA)を50kHzで使用してフィルタリングした電圧ステップを印加することによって、偏りを誘発し、残留ピペット共振を排除した。C2400 CCDカメラ(Hamamatsu,Japan)を使用して、毛束の偏りをモニターした。刺激プローブの動きを、その静止位置の±2μm近辺に較正するために、電圧ステップを使用した。軸はずれの動きのないことを確認するために、プローブのビデオ画像を記録し、プローブの動きを較正した(~4nmの空間分解能)。プローブの立ち上がり時間の10~90%は~20μ秒であった。
出生後のマウスP0~P8からの共焦点イメージングのための組織を準備するために、4%パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して、15分間、固定を行った。0.01%トライトンによる透過処理およびAlexa Fluorファロイジン(Invitrogen、1/200)による対比染色を使用して、アクチンフィラメントを標識した。LSM700Zeiss共焦点顕微鏡で画像を得た。より高齢のマウス(4~8週)においては、安楽死後に側頭骨を除去し、4%PFA中に1時間おき、それに続いて120mM EDTAにより24~36時間、脱灰した。次いで、感覚上皮を切り出し、免疫染色のために上記の通りに注入した。マウス抗CTBP2(BD Bioscience #612044、1/200)を48時間適用し、Alexa Fluorヤギ抗マウス抗体(1/200)で一夜、4℃で対比染色して、リボンシナプスを標識した。Zeiss LSM 710レーザー共焦点顕微鏡(IDDRC Imaging CoreグラントP30 HD18655)で画像を取得し、Zeiss LSMイメージビューワー4.2を使用して加工した。
ABRおよびDPOAEを、キシラジン(5~10mg/kg i.p.)およびケタミン(60~100mg/kg i.p.)で麻酔したマウスから記録した。皮下用針電極を、a)2つの耳の間の背部の(参照電極);b)左の耳介の後ろの(記録用電極);およびc)動物の尻の背部の(接地電極)皮膚に挿入した。耳介基部の管をトリミングして外耳道を露出させた。ABR記録のために、外耳道および聴覚装置(EPL Acoustic system,MEEI,Boston)に、5ミリ秒のトーンピップを提示する。反応を増幅し(10,000倍)、フィルタリングし(0.1~3kHz)、PCに基づくデータ取得システム(EPL,Cochlear function test suite,MEEI,Boston)のアナログ・デジタルボードにより平均した。音のレベルを、0~110dBの音圧レベル(デシベルSPL)から5~10dBずつ上げた。各レベルにおいて、「アーチファクト除去」後に、(刺激の極性を交互に入れ替えることにより)512~1024の反応を平均した。目視検査によって閾値を決定した。データを解析し、Origin-2015(OriginLab Corporation,MA)を使用してプロットした。特に明記しない限り、閾値の平均±標準偏差を提示する。DPOAEのために、f1およびf2プライマリートーン(f2/f1=1.2)を、5.6と45.2kHzの間で半オクターブずつ変化するf2およびL1-L2=10dB SPLとともに提示した。各f2において、L2は10dB SPLきざみで10から80dB SPLの間で変化した。DPOAE閾値は、ノイズフロアを5dB SPL上回る大きさのDPOAEを誘発するL2レベルとして、平均スペクトルから定義した。平均ノイズフロアレベルは、すべての周波数にわたって0dB SPLを下回った。SA-1スピーカードライバ(Tucker-Davis Technologies,Inc.)で増幅した、PXI-1042Q筐体中の24ビットのデジタルI-Oカード(National Instruments PXI-4461)により刺激を生成し、本発明者らの慣用の音響システム中の2つの静電ドライバー(CUI CDMG15008-03A)から送達した。小さなプローブ管の末端のエレクトレットマイク(Knowles FG-23329-P07)を使用して、外耳道内の音圧をモニターした。これらの実験の大部分は、盲検条件下で実施しなかった。
P2~P3の野生型ヘテロ接合性およびホモ接合性Ush1cc.216G>Aマウスの6つの聴覚器官から、QUANTITECT(登録商標)Reverse Transcription Kit(Qiagen)を使用してcDNAを調製した。完全長(450bp)または切断型harmonin(~35bp)をコードするcDNAを、以下のプライマー:フォワードプライマーmUsh1c_Ex2F:5’ CTC ATT GAA AAT GAC GCA GAG AAG G 3’(配列番号11)、リバースmUsh1c_Ex5R:5’ TCT CAC TTT GAT GGA CAC GGT CTT 3’(配列番号12)を使用して増幅した。これらのプライマーは、マウスUsh1c配列に特異的であり、標的配列がUsh1cc.216Aアレルのヒトのノックイン部分の領域外にあるため、内在性およびAAV2由来のUsh1cを両方とも増幅する。処置の6週間後に採取したマウス組織から、DNAおよびRNAレベルも評価した。製造業者のプロトコールに従ってTRIzol試薬(Life Technologies,Carlsbad,CA)を使用して、蝸牛からDNAおよびRNAを単離した。GoScript逆転写システム(Promega,Madison,WI)を使用してRNAを逆転写した。GoTaq Green Master Mix(Promega,Madison,WI)を使用して、放射標識PCRを実施した。ウイルスDNAの増幅のために、マウスUsh1c特異的なプライマー:mUsh1c_Ex3F(5’-GAA CCC AAC CGC CTG CCG(配列番号13))およびmUsh1c_Ex4WTR(5’-TGC AGA CGG TCC AAG CGT-3’(配列番号14))を使用した。
Startle Monitor(Kinder Sicientific)を使用して聴覚性驚愕反応(ASR)を測定した。ピエゾ/プレキシガラスセンシングアセンブリに固定した小さなサイズの非拘束性立方体Plexiglas記録チャンバー(27cm×10cm×12.5cm)にマウスを入れ、60dB SPLのバックグラウンドホワイトノイズで5分間、慣れさせた。各セッションは35回のトライアルからなり、その間、平均30秒(25~35秒範囲)のトライアル間インターバルで、単一のノイズパルスは強度10dB SPL単位で60~120dB SPLの範囲にわたって送達した。外部ノイズによる干渉を制限するための定常的な60dB SPLのバックグラウンドノイズにおいて、パルスを疑似ランダム順に配置した。Startle Monitorシステムは、ピーク驚愕反応(ASR振幅)および刺激からピーク驚愕反応までの時間(ASR潜時)の計算のために、各パルスに対する反応を最初のN、最大のNおよび反応の最大時間(ms)の測定に減らした。ASRはすべて盲検で行った。
オープンフィールドおよびロータロッド平衡試験を使用して、前庭機能を評価した。中心を30ルクスに設定した天井のLED照明を有する音響チャンバーの内部に置いた、直径42cmの円形フレームを使用し、薄暗い室内でオープンフィールド試験を行った。一度に1頭のマウスを円形のオープンフィールドに入れ、5分間探索させた。行動を記録し、Ethovision XTを使用して追跡し、移動距離と速度の測定を可能とした。オープンフィールド評価はすべて盲検で行った。ロータロッドの実施は、密閉した筐体において、4rpmで回転を開始し0.1rpm s-1の割合で加速したロッドにマウスを置くことを含んだ。1日目は、機器に慣れさせるために5分間、マウスをロッド上に置いた。翌日、全部で5回のトライアルで動物をロッド上に置いた。トライアル間で5分間の静止期を与えた。筐体の機器装備した床に落下する前に動物が装置上に留まることのできた時間の長さを、タイマーに表示し、各試験ランの後に記録した。
実施例3A-インビボ実験
改変CMVプロモーターにより駆動されるマウスTMC1のコード配列を保有するAnc80ベクターを、ヘルパーウイルスフリーシステムおよび先に記載の二重トランスフェクション法を使用して作製した(Grimm et al., 2003, Mol. Ther., 7:839:50)。トリプルflagタグ(FLAG)配列をTMCコード配列のC末端に融合させて、発現したタンパク質の可視化を可能とした。イオジキサノールステップグラジエント、それに続いてイオン交換クロマトグラフィーを使用して、Anc80.CMV.Tmcベクターを精製した。ヒトベータグロブリンイントロンエレメントに特異的なプライマーセットを使用する定量的PCRにより測定して、力価は1×1012から1×1013gc/mlの範囲にわたった。ウイルスのアリコートを-80℃で保管し、使用直前に解凍した。
蝸牛窓膜(RWM)を介して、斜角研磨したガラスマイクロインジェクションピペットを使用して仔マウス(P0~P2)に注入した。P-2000ピペットプラー(Sutter Instruments)においてキャピラリーガラスからピペットを引き、マイクロピペットベベラー(Sutter Instruments)を使用して斜角研磨した(28°の角度で、~20μmの先端径)。手術部位(左乳様突起)を覆うために滅菌スワブを使用する鎮痛のために、EMLAクリーム(リドカイン2.5%およびプリロカイン2.5%)を外部に塗布した。術前は37℃のウォームパッド上で30~60分、体温を維持した。
ウイルスベクターにより送達した導入遺伝子の発現の分布を決定するために免疫染色を実施した。そのために、新たに解剖したコルチ器官に対して免疫染色を実施し、PBSで希釈した4%パラホルムアルデヒドにより室温で1時間、液浸固定した。次いで、組織をPBSですすぎ、0.01~0.1%Triton X-100中で30分間、透過化処理し、Alexa Fluor546-ファロイジン(Molecular Probes、1:200希釈液)で1時間、対比染色して、線維状アクチンを標識した。
器官型蝸牛培養を、137mM NaCl、0.7mM NaH2PO4、5.8mM KCl、1.3mM CaCl2、0.9mM MgCl2、10mM Hepesおよび5.6mM D-グルコースを含有する標準的な人工の外リンパ液に浸した。濃縮物(Invitrogen)からビタミン(1:50)およびアミノ酸(1:100)を溶液に添加し、最終的なpHを7.40(310mosmol/kg)に調整するためにNaOHを使用した。記録用ピペット(3~5メガオーム)を、R6キャピラリーガラス(King Precision Glass)から引き、135mM CsCl、5mM Hepes、5mM EGTA、2.5mM MgCl2、2.5mM Na2-アデノシン3リン酸および0.1mM CaCl2を含有する細胞内液で満たし、最終的なpHを7.40(285mosmol/kg)に調整するためにCsOHを使用した。Axopatch 200B増幅器(Molecular Devices)を使用して、-84mV、室温(22~24℃)において全細胞密封電圧クランプ記録を行った。ローパスBesselフィルターにより10kHzで感覚変換電流をフィルタリングし、16ビットの収集ボード(Digidata 1440A)およびpCLAMP10ソフトウエア(Molecular Devices)により≧20kHzにデジタル化した。OriginPro8(OriginLab)を使用するオフラインで解析のためにデータを記録した。
先に記載の通りに(Maison et al., 2010, J. Neurosci., 30:6751-62)、ABR記録を行った。すなわち、P25~P30のマウスを、5mlの0.9%食塩水に希釈した50mgのケタミンおよび5mgのキシラジンを含むIP注射(0.1ml/10g体重)により麻酔した。ABR実験を、32℃において防音チャンバー内で実施した。聴覚機能を試験するために、10から115dBの間、5dBずつの音圧レベルにおいて、再現可能なABR波形(ピークI~IV)を誘発する閾値強度を検出するまで、5.6kHz、8kHz、11.3kHz、16kHz、22.6kHzまたは32kHzの純音刺激をマウスに提示する。交番極性刺激を使用して、512~1024の反応を集め、各音圧レベルについて平均した。15μV(最高最低間)より大きな振幅を有する波形は、「アーチファクト除去」機能により捨てた。
インビボ投与後に蝸牛中に存在するウイルス量を評価するために実験を行った。2頭のTMC1-/-マウスに、P1で左耳に注入した。蝸牛を左右の耳から切除し、P10に相当する3日間培養中に維持した。RNAを抽出し、Agilent Bioanalyzer(Agilent Technologies)を使用して質を確認し、先に記載の通りに(Kawashima et al., 2011, J. Clin. Invest., 121:4796-809)SYBR GreenER qPCR試薬(Invitrogen)を使用する、TMC1特異的な効率的プライマーセットによる定量的RT-PCR解析のためにcDNAに逆転写した。
FM1-43色素ローディング実験を先に記載の通りに実施した(Gale et al., 2001, J. Neurosci., 21:7013-25; Meyers et al., 2003, J. Neurosci., 23:4054-65;およびGeleoc & Holt, 2003, Nat. Neurosci., 10:1019-20)。接着性の蝸牛培養を有するカバーガラスを、ガラス底のチャンバー上の正立顕微鏡(Zeiss Axioscope FS Plus)下に置いた。人工の外リンパ液で希釈した5μMのFM1-43FX(Invitrogen)を、10秒間添加し、人工の外リンパ液で組織を3回洗浄して、細胞膜の外葉から色素を除去した。5分後、細胞内FM1-43を、FM1-43フィルターセットおよび63X水浸対物レンズを有する落射蛍光光源を使用してイメージングした。上記の通りに、組織を固定し、免疫蛍光法のために加工した。
ABRデータと同じ条件下で、同じ記録セッションの間にDPOAEデータを収集した。2f1-f2でのDPOAEの生成のために1.2の周波数割合(f2/f1)でプライマリートーンを作り、各f2/f1対について、f2レベルはf1レベルよりも10dB、音圧レベル低かった。f2レベルを、5-dBずつ20から80dBまで動かした。記録した外耳道音圧のシグナル対ノイズ比を増加させるために、波形およびスペクトル平均化を各レベルで使用した。平均したスペクトルから、2f1-f2におけるDPOAEの振幅を、スペクトルの隣接点におけるノイズフロアとともに抽出した。DPOAE振幅対音レベルのプロットから、等反応曲線を内挿した。閾値を、0dBにおいてDPOAEを生成するために必要なf2レベルとして定義した。
方法および物質の組成物が、多くの異なる態様と併せて本明細書に記載されたが、様々な態様の上記記載が、例示を目的とし、方法および物質の組成物の範囲を制限するものでないことは理解されるべきである。他の態様、利益および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
1.Anc80カプシドタンパク質、およびTMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7からなる群から選択される1つまたは複数の導入遺伝子を含む、AVVベクター。
2.対象の内耳中の1つまたは複数の細胞に導入遺伝子を送達する方法であって、
対象の内耳にアデノ随伴ウイルス(AAV)を投与するステップを含み、前記AAVはAnc80カプシドタンパク質および導入遺伝子を含む、方法。
3.前記内耳中の1つまたは複数の細胞が、内有毛細胞(IHC)および外有毛細胞(OHC)からなる群から選択される、上記2に記載の方法。
4.前記導入遺伝子が、内有毛細胞の少なくとも80%および外有毛細胞の少なくとも80%に送達される、上記3に記載の方法。
5.前記内耳中の1つまたは複数の細胞が、らせん神経節ニューロン、前庭有毛細胞、前庭神経節ニューロン、支持細胞および血管条中の細胞からなる群から選択される、上記2に記載の方法。
6.前記導入遺伝子が、ACTG1、ADCY1、ATOHI、ATP6V1B1、BDNF、BDP1、BSND、DATSPER2、CABP2、CD164、CDC14A、CDH23、CEACAM16、CHD7、CCDC50、CIB2、CLDN14、CLIC5、CLPP、CLRN1、COCH、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL9A1、COL9A2、COL11A1、COL11A2、CRYM、DCDC2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、DIAPH1、EDN3、EDNRB、ELMOD3、EMOD3、EPS8、EPS8L2、ESPN、ESRRB、EYA1、EYA4、FAM65B、FOXI1、GIPC3、GJB2、GJB3、GJB6、GPR98、GRHL2、GPSM2、GRXCR1、GRXCR2、HARS2、HGF、HOMER2、HSD17B4、ILDR1、KARS、KCNE1、KCNJ10、KCNQ1、KCNQ4、KITLG、LARS2、LHFPL5、LOXHD1、LRTOMT、MARVELD2、MCM2、MET、MIR183、MIRN96、MITF、MSRB3、MT-RNR1、MT-TS1、MYH14、MYH9、MYO15A、MYO1A、MYO3A、MYO6、MYO7A、NARS2、NDP、NF2、NT3、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、P2RX2、PAX3、PCDH15、PDZD7、PJVK、PNPT1、POLR1D、POLR1C、POU3F4、POU4F3、PRPS1、PTPRQ、RDX、S1PR2、SANS、SEMA3E、SERPINB6、SLC17A8、SLC22A4、SLC26A4、SLC26A5、SIX1、SIX5、SMAC/DIABLO、SNAI2、SOX10、STRC、SYNE4、TBC1D24、TCOF1、TECTA、TIMM8A、TJP2、TNC、TMC1、TMC2、TMIE、TMEM132E、TMPRSS3、TRPN、TRIOBP、TSPEAR、USH1C、USH1G、USH2A、USH2D、VLGR1、WFS1、WHRN、およびXIAPからなる群から選択される、上記2に記載の方法。
7.前記導入遺伝子が、神経栄養因子をコードする、上記2に記載の方法。
8.前記神経栄養因子が、GDNF、BDNF、NT3およびHSP70からなる群から選択される、上記7に記載の方法。
9.前記導入遺伝子が、抗体またはその断片をコードする、上記2に記載の方法。
10.前記導入遺伝子が、免疫調節タンパク質をコードする、上記2に記載の方法。
11.前記導入遺伝子が、抗発癌性転写物をコードする、上記2に記載の方法。
12.前記導入遺伝子が、アンチセンス、サイレンシング、または長鎖非コードRNA種をコードする、上記2に記載の方法。
13.前記導入遺伝子が、遺伝子操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALENおよびCRISPRからなる群から選択されるゲノム編集システムをコードする、上記2に記載の方法。
14.前記Anc80カプシドタンパク質が、配列番号1に示される配列を有する、上記2に記載の方法。
15.前記Anc80カプシドタンパク質が、配列番号2に示される配列を有する、上記2に記載の方法。
16.前記導入遺伝子が、異種プロモーター配列の制御下にある、上記3に記載の方法。
17.前記異種プロモーター配列が、CMVプロモーター、CBAプロモーター、CASIプロモーター、PGKプロモーター、EF-1プロモーター、アルファ9ニコチン受容体プロモーター、プレスチンプロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、Myo6プロモーター、Gfilプロモーター、Vglut3プロモーターおよびAtoh1プロモーターからなる群から選択される、上記16に記載の方法。
18.前記投与するステップが、蝸牛窓を通してAncAAVを注入することを含む、上記2に記載の方法。
19.前記AncAAVが、蝸牛窓を通る注入により投与される、上記2に記載の方法。
20.前記AncAAVが、蝸牛開窓術の間またはカナロストミーの間に投与される、上記2に記載の方法。
21.前記AncAAVが、1つまたは複数のドラッグデリバリービヒクルによって中耳および/または蝸牛窓に投与される、上記2に記載の方法。
22.前記導入遺伝子の発現が、内有毛細胞(IHC)、外有毛細胞(OHC)、らせん神経節ニューロン、血管条、前庭有毛細胞および/または前庭神経節ニューロンの再生をもたらし、それによって、聴覚または前庭機能を回復させる、上記2に記載の方法。
23.AAVベクターおよび医薬組成物を含む製造品であって、前記AAVベクターは、Anc80カプシドタンパク質およびプロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を含む、製造品。
24.前記導入遺伝子が、ACTG1、ADCY1、ATOHI、ATP6V1B1、BDNF、BDP1、BSND、DATSPER2、CABP2、CD164、CDC14A、CDH23、CEACAM16、CHD7、CCDC50、CIB2、CLDN14、CLIC5、CLPP、CLRN1、COCH、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL9A1、COL9A2、COL11A1、COL11A2、CRYM、DCDC2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、DIAPH1、EDN3、EDNRB、ELMOD3、EMOD3、EPS8、EPS8L2、ESPN、ESRRB、EYA1、EYA4、FAM65B、FOXI1、GIPC3、GJB2、GJB3、GJB6、GPR98、GRHL2、GPSM2、GRXCR1、GRXCR2、HARS2、HGF、HOMER2、HSD17B4、ILDR1、KARS、KCNE1、KCNJ10、KCNQ1、KCNQ4、KITLG、LARS2、LHFPL5、LOXHD1、LRTOMT、MARVELD2、MCM2、MET、MIR183、MIRN96、MITF、MSRB3、MT-RNR1、MT-TS1、MYH14、MYH9、MYO15A、MYO1A、MYO3A、MYO6、MYO7A、NARS2、NDP、NF2、NT3、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、P2RX2、PAX3、PCDH15、PDZD7、PJVK、PNPT1、POLR1D、POLR1C、POU3F4、POU4F3、PRPS1、PTPRQ、RDX、S1PR2、SANS、SEMA3E、SERPINB6、SLC17A8、SLC22A4、SLC26A4、SLC26A5、SIX1、SIX5、SMAC/DIABLO、SNAI2、SOX10、STRC、SYNE4、TBC1D24、TCOF1、TECTA、TIMM8A、TJP2、TNC、TMC1、TMC2、TMIE、TMEM132E、TMPRSS3、TRPN、TRIOBP、TSPEAR、USH1C、USH1G、USH2A、USH2D、VLGR1、WFS1、WHRN、およびXIAPからなる群から選択される、上記23に記載の製造品。
25.対象の内耳中の1つまたは複数の細胞にTMC1またはTMC2導入遺伝子を送達する方法であって、
対象の内耳にアデノ随伴ウイルス(AAV)を投与するステップを含み、前記AAVは、Anc80カプシドタンパク質および導入遺伝子を含む、方法。
26.対象の内耳中の1つまたは複数の細胞にアッシャー導入遺伝子を送達する方法であって、
対象の内耳にアデノ随伴ウイルス(AAV)を投与するステップを含み、前記AAVは、Anc80カプシドタンパク質および導入遺伝子を含む、方法。
27.前記アッシャー導入遺伝子が、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7からなる群から選択される、上記25または26に記載の方法。
28.前記内耳中の1つまたは複数の細胞が、内有毛細胞(IHC)および外有毛細胞(OHC)からなる群から選択される、上記25または26に記載の方法。
29.前記導入遺伝子が、内有毛細胞の少なくとも80%および外有毛細胞の少なくとも80%に送達される、上記28に記載の方法。
30.前記内耳中の1つまたは複数の細胞が、らせん神経節ニューロン、前庭有毛細胞、前庭神経節ニューロン、支持細胞および血管条中の細胞からなる群から選択される、上記25または26に記載の方法。
31.前記Anc80カプシドタンパク質が、配列番号1に示される配列を有する、上記25または26に記載の方法。
32.前記Anc80カプシドタンパク質が、配列番号2に示される配列を有する、上記25または26に記載の方法。
33.前記導入遺伝子が、異種プロモーター配列の制御下にある、上記25または26に記載の方法。
34.前記異種プロモーター配列が、CMVプロモーター、CBAプロモーター、CASIプロモーター、PGKプロモーター、EF-1プロモーター、アルファ9ニコチン受容体プロモーター、プレスチンプロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、Myo6プロモーター、Gfilプロモーター、Vglut3プロモーターおよびAtoh1プロモーターからなる群から選択される、上記33に記載の方法。
35.前記投与するステップが、蝸牛窓を通してAncAAVを注入することを含む、上記25または26に記載の方法。
36.前記AncAAVが、蝸牛窓を通る注入により投与される、上記25または26に記載の方法。
37.前記AncAAVが、蝸牛開窓術の間またはカナロストミーの間に投与される、上記25または26に記載の方法。
38.前記AncAAVが、1つまたは複数のドラッグデリバリービヒクルによって中耳および/または蝸牛窓に投与される、上記25または26に記載の方法。
39.前記導入遺伝子の発現が、内有毛細胞(IHC)、外有毛細胞(OHC)、らせん神経節ニューロン、血管条、前庭有毛細胞および/または前庭神経節ニューロンの再生をもたらし、それによって、聴覚または前庭機能を回復させる、上記25または26に記載の方法。
Claims (34)
- 配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列を有するAnc80カプシドタンパク質、およびTMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、およびPDZD7からなる群から選択される1つまたは複数の導入遺伝子を含む、アデノ随伴ウイルス(AVV)ベクターを含む、聴覚障害を治療する方法において用いるための組成物であって、前記1つまたは複数の導入遺伝子が、対象の内耳中の内有毛細胞(IHC)の少なくとも80%および外有毛細胞(OHC)の少なくとも80%に送達される、組成物。
- 配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列を有するAnc80カプシドタンパク質および導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを含む、対象の内耳中の1つまたは複数の細胞に導入遺伝子を送達し、聴覚障害を治療するための組成物であって、
前記導入遺伝子が、対象の内耳中の内有毛細胞(IHC)の少なくとも80%および外有毛細胞(OHC)の少なくとも80%に送達される、組成物。 - 前記導入遺伝子が、らせん神経節ニューロン、前庭有毛細胞、前庭神経節ニューロン、支持細胞および血管条中の細胞の一以上にさらに送達される、請求項2に記載の組成物。
- 前記導入遺伝子が、ACTG1、ADCY1、ATOHI、ATP6V1B1、BDNF、BDP1、BSND、DATSPER2、CABP2、CD164、CDC14A、CDH23、CEACAM16、CHD7、CCDC50、CIB2、CLDN14、CLIC5、CLPP、CLRN1、COCH、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL9A1、COL9A2、COL11A1、COL11A2、CRYM、DCDC2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、DIAPH1、EDN3、EDNRB、ELMOD3、EMOD3、EPS8、EPS8L2、ESPN、ESRRB、EYA1、EYA4、FAM65B、FOXI1、GIPC3、GJB2、GJB3、GJB6、GPR98、GRHL2、GPSM2、GRXCR1、GRXCR2、HARS2、HGF、HOMER2、HSD17B4、ILDR1、KARS、KCNE1、KCNJ10、KCNQ1、KCNQ4、KITLG、LARS2、LHFPL5、LOXHD1、LRTOMT、MARVELD2、MCM2、MET、MIR183、MIRN96、MITF、MSRB3、MT-RNR1、MT-TS1、MYH14、MYH9、MYO15A、MYO1A、MYO3A、MYO6、MYO7A、NARS2、NDP、NF2、NT3、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、P2RX2、PAX3、PCDH15、PDZD7、PJVK、PNPT1、POLR1D、POLR1C、POU3F4、POU4F3、PRPS1、PTPRQ、RDX、S1PR2、SANS、SEMA3E、SERPINB6、SLC17A8、SLC22A4、SLC26A4、SLC26A5、SIX1、SIX5、SMAC/DIABLO、SNAI2、SOX10、STRC、SYNE4、TBC1D24、TCOF1、TECTA、TIMM8A、TJP2、TNC、TMC1、TMC2、TMIE、TMEM132E、TMPRSS3、TRPN、TRIOBP、TSPEAR、USH1C、USH1G、USH2A、USH2D、VLGR1、WFS1、WHRN、およびXIAPからなる群から選択される、請求項2に記載の組成物。
- 前記導入遺伝子が、神経栄養因子をコードする、請求項2に記載の組成物。
- 前記神経栄養因子が、GDNF、BDNF、NT3およびHSP70からなる群から選択される、請求項5に記載の組成物。
- 前記導入遺伝子が、抗体またはその断片をコードする、請求項2に記載の組成物。
- 前記導入遺伝子が、免疫調節タンパク質をコードする、請求項2に記載の組成物。
- 前記導入遺伝子が、抗発癌性転写物をコードする、請求項2に記載の組成物。
- 前記導入遺伝子が、アンチセンス、サイレンシング、または長鎖非コードRNA種をコードする、請求項2に記載の組成物。
- 前記導入遺伝子が、遺伝子操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALENおよびCRISPRからなる群から選択されるゲノム編集システムをコードする、請求項2に記載の組成物。
- 前記Anc80カプシドタンパク質が、配列番号1に示される配列を有する、請求項2
に記載の組成物。 - 前記Anc80カプシドタンパク質が、配列番号2に示される配列を有する、請求項2
に記載の組成物。 - 前記導入遺伝子が、異種プロモーター配列の制御下にある、請求項2に記載の組成物。
- 前記異種プロモーター配列が、CMVプロモーター、CBAプロモーター、CASIプロモーター、PGKプロモーター、EF-1プロモーター、アルファ9ニコチン受容体プロモーター、プレスチンプロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、Myo6プロモーター、Gfilプロモーター、Vglut3プロモーターおよびAtoh1プロモーターからなる群から選択される、請求項14に記載の組成物。
- 前記投与するステップが、蝸牛窓を通してAAVベクターを注入することを含む、請求項2に記載の組成物。
- 前記AAVベクターが、蝸牛窓を通る注入により投与される、請求項2に記載の組成物。
- 前記AAVベクターが、蝸牛開窓術の間またはカナロストミーの間に投与される、請求項2に記載の組成物。
- 前記AAVベクターが、1つまたは複数のドラッグデリバリービヒクルによって中耳および/または蝸牛窓に投与される、請求項2に記載の組成物。
- 前記導入遺伝子の発現が、内有毛細胞(IHC)、外有毛細胞(OHC)、らせん神経節ニューロン、血管条、前庭有毛細胞および/または前庭神経節ニューロンの再生をもたらし、それによって、聴覚または前庭機能を回復させる、請求項3に記載の組成物。
- AAVベクターおよび医薬組成物を含む製造品であって、前記AAVベクターは、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列を有するAnc80カプシドタンパク質およびプロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子を含み、導入遺伝子を、対象の内耳中の内有毛細胞(IHC)の少なくとも80%および外有毛細胞(OHC)の少なくとも80%に送達して聴覚障害を治療する方法において用いるための、製造品。
- 前記導入遺伝子が、ACTG1、ADCY1、ATOHI、ATP6V1B1、BDNF、BDP1、BSND、DATSPER2、CABP2、CD164、CDC14A、CDH23、CEACAM16、CHD7、CCDC50、CIB2、CLDN14、CLIC5、CLPP、CLRN1、COCH、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL9A1、COL9A2、COL11A1、COL11A2、CRYM、DCDC2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、DIAPH1、EDN3、EDNRB、ELMOD3、EMOD3、EPS8、EPS8L2、ESPN、ESRRB、EYA1、EYA4、FAM65B、FOXI1、GIPC3、GJB2、GJB3、GJB6、GPR98、GRHL2、GPSM2、GRXCR1、GRXCR2、HARS2、HGF、HOMER2、HSD17B4、ILDR1、KARS、KCNE1、KCNJ10、KCNQ1、KCNQ4、KITLG、LARS2、LHFPL5、LOXHD1、LRTOMT、MARVELD2、MCM2、MET、MIR183、MIRN96、MITF、MSRB3、MT-RNR1、MT-TS1、MYH14、MYH9、MYO15A、MYO1A、MYO3A、MYO6、MYO7A、NARS2、NDP、NF2、NT3、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、P2RX2、PAX3、PCDH15、PDZD7、PJVK、PNPT1、POLR1D、POLR1C、POU3F4、POU4F3、PRPS1、PTPRQ、RDX、S1PR2、SANS、SEMA3E、SERPINB6、SLC17A8、SLC22A4、SLC26A4、SLC26A5、SIX1、SIX5、SMAC/DIABLO、SNAI2、SOX10、STRC、SYNE4、TBC1D24、TCOF1、TECTA、TIMM8A、TJP2、TNC、TMC1、TMC2、TMIE、TMEM132E、TMPRSS3、TRPN、TRIOBP、TSPEAR、USH1C、USH1G、USH2A、USH2D、VLGR1、WFS1、WHRN、およびXIAPからなる群から選択される、請求項21に記載の製造品。
- アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを含む、対象の内耳中の1つまたは複数の細胞にTMC1またはTMC2導入遺伝子を送達するための組成物であって、
前記AAVベクターは、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列を有するAnc80カプシドタンパク質および導入遺伝子を含み、TMC1またはTMC2導入遺伝子が、聴覚障害を治療するために対象の内耳中の内有毛細胞(IHC)の少なくとも80%および外有毛細胞(OHC)の少なくとも80%に送達される、組成物。 - アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを含む、対象の内耳中の1つまたは複数の細胞にアッシャー導入遺伝子を送達するための組成物であって、
前記AAVベクターは、配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列を有するAnc80カプシドタンパク質および導入遺伝子を含み、アッシャー導入遺伝子が、聴覚障害を治療するために対象の内耳中の内有毛細胞(IHC)の少なくとも80%および外有毛細胞(OHC)の少なくとも80%に送達される、組成物。 - 前記アッシャー導入遺伝子が、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7からなる群から選択される、請求項24に記載の組成物。
- 前記Anc80カプシドタンパク質が、配列番号1に示される配列を有する、請求項23または24に記載の組成物。
- 前記Anc80カプシドタンパク質が、配列番号2に示される配列を有する、請求項23または24に記載の組成物。
- 前記導入遺伝子が、異種プロモーター配列の制御下にある、請求項23または24に記載の組成物。
- 前記異種プロモーター配列が、CMVプロモーター、CBAプロモーター、CASIプロモーター、PGKプロモーター、EF-1プロモーター、アルファ9ニコチン受容体プロモーター、プレスチンプロモーター、KCNQ4プロモーター、Myo7aプロモーター、Myo6プロモーター、Gfilプロモーター、Vglut3プロモーターおよびAtoh1プロモーターからなる群から選択される、請求項28に記載の組成物。
- 前記投与するステップが、蝸牛窓を通してAAVベクターを注入することを含む、請求項23または24に記載の組成物。
- 前記AAVベクターが、蝸牛窓を通る注入により投与される、請求項23または24に記載の組成物。
- 前記AAVベクターが、蝸牛開窓術の間またはカナロストミーの間に投与される、請求項23または24に記載の組成物。
- 前記AAVベクターが、1つまたは複数のドラッグデリバリービヒクルによって中耳および/または蝸牛窓に投与される、請求項23または24に記載の組成物。
- 前記導入遺伝子の発現が、内有毛細胞(IHC)、外有毛細胞(OHC)、らせん神経節ニューロン、血管条、前庭有毛細胞および/または前庭神経節ニューロンの再生をもたらし、それによって、聴覚または前庭機能を回復させる、請求項23または24に記載の組成物。
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