JP2022522996A - オトフェリン遺伝子を回復させるａａｖ媒介遺伝子治療 - Google Patents

Abstract

本発明者らは、本明細書において、ＤＦＮＢ９マウスモデル（ＯＴＯＦノックアウトマウス）において、デュアルＡＡＶベクターアプローチを介した断片化されたｃＤＮＡの蝸牛送達が、聴覚系が成熟した後（Ｐ３０）に十分に投与された場合に、これらのマウスの重度の難聴表現型を効果的且つ長期的に修正できるという最初の原理証明を報告する。したがって、本発明は、ＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者を治療するために、又はＤＦＮＢ９変異を有する患者においてＤＦＮＢ９難聴を予防するために使用するための、内有毛細胞における全長オトフェリンポリペプチド又はその機能的フラグメントの発現を可能にするベクターシステムであって、前記患者が、発達及び成熟した聴覚系を有するヒト、例えば、新生児、幼児、小児、ティーンエイジャー又は成人である、ベクターシステムに関する。

Description

非症候性の重度の先天性難聴（nonsyndromic profound congenital deafness）に関する症例の半数以上には遺伝的原因があり、ほとんど（～８０％）は常染色体劣性（ＤＦＮＢ）型である（Duman D. & Tekin M, Front Biosci (Landmark Ed) 17:2213-2236 (2012)）。難聴（deafness）の遺伝子診断は、蝸牛の遺伝子治療に不可欠な情報を提供し、過去数年間で遺伝子検査の正確性及び利用しやすさの両方において急速な進歩がなされた。症候群性の難聴遺伝子における変異の同定は、患者において症状が出現する何年も前のことであり得、疾患管理を計画するための時間を与える。

難聴遺伝子は、蝸牛が機能するのに不可欠な幅広い分子機能（例えば、感覚器官の発達、有毛細胞の不動毛における音の伝達、蝸牛内電位（ＥＰ）及び高濃度の細胞外カリウムの維持、有毛細胞及びらせん神経節ニューロン（ＳＧＮ：spiral ganglion neuron）の間のシナプス神経伝達）を有するタンパク質をコードする。難聴遺伝子から作られた主要なタンパク質には、イオンチャネル及びトランスポーター、ギャップジャンクション及びタイトジャンクション、細胞骨格及び分子モーターにおけるタンパク質サブユニット並びに蝸牛の発達において一過的に発現する転写因子が含まれる。変異が蝸牛の初期の発達に影響を及ぼし、重大な細胞変性を引き起こすか否かは、この治療分野において重大な問題である「治療時間枠（treatment time window）」を決定する際の主要な要因である。

補綴の人工内耳が、現在リハビリテーションに使用されているが（Kral A & O’Donoghue GM N Engl J Med 363(15):1438-1450 (2010)）、聴覚の回復には、特に、騒がしい環境での発話の知覚又は音楽の知覚に関しては、完全にはほど遠い。これは、チャネル間の電気的干渉によって課される周波数分解能の内在的な限界のためである。

生物学的治療を開発する主な動機は、任意の補綴デバイスを移植することなく聴覚を回復し、人工内耳によって現在達成可能なものよりもはるかに優れた音分解能の質（sound resolution quality）及び単価を達成することである。特に、局所的にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が媒介する遺伝子治療による遺伝子治療が、ヒト型の難聴を治療するために既に提案されている（Zhang et al, Frontiers in Molecular Neuroscience, vol.11, Art.221, 2018）。

アッシャータイプ１Ｃ疾患を研究するためのＵｓｈ１ｃ ｃ．２１６Ｇ＞Ａノックインマウスモデルを使用して、Pan et al. Nature biotechnology; 35(3):264-272 (2017)では、蝸牛の遺伝子治療を使用して有毛細胞を標的にし、難聴表現型を修正することができるか否かが試験された。新規の合成ＡＡＶであるＡｎｃ８０Ｌ６５は、９０％を超える有毛細胞に形質導入することができた。治療により蝸牛の形態学的な保護を示し、組換えウイルスベクターがＰ０～Ｐ１（すなわち、マウスが生まれた日又はその翌日、「生後０日又は１日」と呼ばれる）において注射された場合に、可聴閾値が、治療されていない耳と比較して６０～７０ｄＢ改善された。Ｐ１０～Ｐ１２（すなわち、生後１０日又は１２日、聴覚の発現直前－この種ではＰ１２頃に聴覚の発現が起こる）において実施された同じ注射は、まったく治療効果をもたらさなかった（Pan et al. Nature biotechnology; 35(3):264-272 (2017)）。

Akil et al. Neuron 75:283-293 (2012)では、内有毛細胞のシナプス伝達障害を治療するために、ＡＡＶ２／１を使用して小胞グルタミン酸トランスポーター３（Ｖｇｌｕｔ３）ｃＤＮＡを新生児（すなわち、生後１～１２日）のＫＯマウスの蝸牛に送達した。聴性脳幹反応（ＡＢＲ）及び聴覚性驚愕反射からのデータに基づいて、著者らは注射された耳の聴覚機能が２週間以内に回復したことを示した。

これらの２つの研究によって、組換えウイルスベクターが出生後の初期段階（すなわち、マウス有毛細胞の成熟前）に注射された場合に、蝸牛における細胞変性の顕著な軽減が確認されている。

今日まで、マウスにおける内耳治療を評価したすべての遺伝子治療研究は、これらの治療が成体動物において効果的でないと結論付けている。したがって、遺伝子治療が聴覚の保護又は回復に効果的であるための臨界期が存在し、治療の機会の窓は、胎児期又は出生後の初期段階、すなわち聴覚の発現が起こる前のマウスにのみ存在するというコンセンサスがある（Ahmed et al, JARO 18:649-670 (2017)）。

マウスの内耳は、出生時にはまだ構造的及び機能的に未成熟であり、この動物種では生後１２日（Ｐ１２）に聴覚の発現が起こり、生後２０日（Ｐ２０）頃に完了することがよく知られている（Shnerson and Willott, J. Comp. Physiol. Psychol. 94, 36-40 (1980)）。しかしながら、聴覚の発現及び成熟は、ヒトではまったく異なるタイミングで起こる。実際のところ、ヒトの内耳は、子宮内で早くも４．５か月で聴覚機能を発揮し、出生時には完了している（図６及びHepper PG & Shahidullah BS Arch Dis Child71(2):F81-87 (1994)を参照）。

このことは、聴覚の発現前又は蝸牛の成熟の完了前に聴覚機能を回復することを目的とする先行技術の実験は、ヒトの試験に置き換えられたときに子宮内で実行される必要があることを意味する（図６）。これまでのところ、出生後又は幼年期（すなわち、聴覚系が完全に成熟して機能的であるとき）に聴覚を回復させることは不可能であると考えられていたため、これまで有毛細胞の遺伝子治療により治療されたヒトは存在しない。

それにもかかわらず、蝸牛の遺伝子治療の最終的な目標は、遺伝的に誘発された可能性がある難聴が検出又は診断された後、すなわち、ほとんどの場合、出生後のヒトにおける一般的な遺伝性難聴の治療である。

蝸牛への治療の子宮内における送達を含む遺伝子治療プロトコルを開発することは実際には不可能である。なぜなら、この外科手術はいくつかの副作用を誘発する可能性があり、その中には決定的な聴覚低下（definitive hearing loss）がある（Zhang et al, Frontiers in Molecular Neuroscience, vol.11, Art.221, 2018）。さらに、ＤＦＮＢ難聴は通常、新生児期の間に、すなわち、出生後０～４か月の間にヒトにおいて診断されることがよく知られている。

したがって、ヒトに置き換え可能であるためには、遺伝子治療アプローチが試験され、例えば、出生からＰ２０より後のマウス（若人又は成人に相当）に投与された場合に、成熟した聴覚系を侵している確立された難聴表現型を逆転させるのに効率的である必要がある。

これは、聴覚系が完成している出生後のヒト、小児及び成人に投与可能であるため、時間枠が人間の倫理及び福祉に適合している治療を特定する唯一の方法である。

図１Ａは、この研究で使用された組換えＡＡＶベクターのペアと、同時感染細胞における全長タンパク質オトフェリンを生成する組換え、転写、スプライシング及び翻訳のプロセスとの概略図である。 図１Ｂは、デュアルＡＡＶベクター送達後のＨＥＫ２９３細胞におけるオトフェリンの発現を示す図である。 図２ａは、Ｐ７０において免疫染色された共焦点画像である。 図２ｂは、ＡＢＲ閾値及びクリック音刺激に対する聴覚閾値を示す図である。 図２ｃは、ＡＢＲトレースとＡＢＲ Ｉ波の潜時及び正規化されたＡＢＲ Ｉ波の振幅とを示す図である。 図３ａは、Ｐ８０において免疫染色された共焦点画像である。 図３ｂは、ＡＢＲ閾値及びクリック音刺激に対する聴覚閾値を示す図である。 図３ｃは、ＡＢＲトレースとＡＢＲ Ｉ波の潜時及び正規化されたＡＢＲ Ｉ波の振幅とを示す図である。 図４ａは、Ｐ４０において免疫染色された共焦点画像である。 図４ｂは、ＡＢＲ閾値を示す図である。 図４ｃは、ＡＢＲトレースとＡＢＲ Ｉ波の潜時及び正規化されたＡＢＲ Ｉ波の振幅とを示す図である。 図５は、Ｏｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウスにおけるデュアルＡＡＶ媒介遺伝子治療が、オトフェリンの正常な発現及び聴力を回復させることを示す図である。 図６は、ヒト及びマウスの聴覚系の成熟度の相違を示す図である。 図７は、これまでに同定されたＤＦＮＢ９遺伝子の変異のいくつかを示す図である。 図８は、（Ａ）Ｏｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウスの内有毛細胞におけるオトフェリンのタンパク質凝集及びミスフォールディング、及び（Ｂ）Ｏｔｏｆ^＋／ｔｓ及びＯｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウスにおける聴性脳幹反応（ＡＢＲ）を示す図である。 図９は、Ｏｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウスに対するＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＮＴ組換えベクター及びＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＣＴ組換えベクターのペアの片側性の注射（unilateral injection）の影響を示す図である。 図１０は、野生型、Ｏｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}及び処置されたＯｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}のＩＨＣにおける（Ａ）Ｉ_Ｃａの電位－活性化曲線（voltage-activation curve）及び（Ｂ）対応するΔＣｍ応答（ΔCm response）を示す図である。

本発明者らは、聴覚系（特に蝸牛）が成熟している対象（特にヒト）における聴覚低下（hearing loss）を効率的に予防する又は逆転させる現実的な見込みを有する治療であって、さらに、胎児期の遺伝子導入を伴わない治療を特定するために代替研究を開発した。これに関連して、本発明者らは、内有毛細胞におけるオトフェリンタンパク質の組換え発現によって、出生からＰ２０より後（若人又は成人に相当）に治療されたモデルマウスにおいて聴覚を回復可能であることを実証することができた。

オトフェリンは、蝸牛の感覚性の内有毛細胞（ＩＨＣ）において豊富に発現されている。また、中枢神経系のその他の細胞においても発現されている。それは、蝸牛有毛細胞シナプスにおける、求心性のらせん神経節ニューロンとのシナプス小胞融合の最終段階において重要な役割を果たす。より正確には、聴覚リボンシナプスにおけるエキソサイトーシスにとって重要である（Roux et al, Cell 127(2):277-89, 2006）。

ヒトにおいて、オトフェリン遺伝子（「ＯＴＯＦ遺伝子」）に影響を与える変異は、出生後、言語の習得前に発症する重度の非症候性の両側性の（bilateral）聴覚低下をもたらす。それらのいくつかはまた、体温が大きく上昇したときに誘発される温度感受性の非症候性オーディトリーニューロパチー（auditory neuropathy）をもたらす（例えば、発熱の場合、Marlin S. et al, Biochemical and Biophysical Research Communications, 394 (2010) 737-742 及び Varga R. et al, J. Med. Genet 2006; 43:576-581を参照）。今までのところ、少なくとも６０種の変異が同定されており（図７を参照）、そのうちの５種は温度感受性であることが知られている（Pangrsic T. et al, Trends in Neurosciences, 2012, col.35, No.11に記載のように、Ｐ．Ｑ９９４ＶｆｓＸ６、Ｐ．Ｉ５１５Ｔ、ｐ．Ｇ５４１Ｓ、ＰＲ１６０７Ｗ、ｐ．Ｅ１８０４ｄｅｌ）。

これらの２つの難聴表現型（構成性及び誘導性）は世界中で見られ、「Ｄｅａｆｎｅｓｓ，Ａｕｔｏｓｏｍａｌ Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ９」又は「ＤＦＮＢ９」難聴として知られている。

ＤＦＮＢ９難聴は、一部の西洋人集団における常染色体劣性非症候性の聴覚低下の最大８％を占めており、それにより、依然として治療的介入が必要な遺伝性の聴覚低下の上位５位以内に存在する。

本発明者らは、本明細書で、ＤＦＮＢ９マウスモデル（ＯＴＯＦノックアウトマウス）において、聴覚系が成熟した後（Ｐ３０）、十分に投与したときに、デュアルＡＡＶベクターアプローチを介した、断片化されたｃＤＮＡの蝸牛送達により、これらのマウスの重度の難聴表現型を効果的且つ長期的に修正可能であるという初めての原理証明を報告する。この結果は、ＤＦＮＢ９による先天性難聴の患者における局所的な遺伝子導入の治療域が実際に当初予想されていたよりも長いことを示唆している。

実際のところ、本発明のベクターの投与は、それぞれがＯＴＯＦ遺伝子の一部を提供し、出生後後期（Ｐ３０）において、ＯＴＯＦノックアウトマウスのトランスフェクトされた内有毛細胞における全長ＯＴＯＦタンパク質の発現を可能にし、より若いマウスを治療した場合よりも良い結果をもたらす。

遺伝性難聴に侵されたマウスにおける局所的な遺伝子導入に関する治療域は、胎児期又は出生後早期であることが多くの研究において教示されたこと（Ahmed et al, JARO 18:649-670 (2017); Zhang et al, Frontiers in Molecular Neuroscience, vol.11, Art.221, 2018）を考えると、これは非常に驚くことである。

マウスでは、全範囲の応答周波数がＰ１４（すなわち、生後１４日）までに観察され得ることが知られている。反応潜時（response latency）及びピーク間の間隔(interpeak interval)は、生後２週目及び３週目の間に急速に成熟し、Ｐ１８には成獣のような特徴となる（Song L. et al, J Acoust Soc Am 119(4):2242-2257 (2006)）。したがって、Ｐ３０において、マウスの聴覚系は完全に成熟している。これは、小児又は成人の聴覚系に相当する（図６を参照）。

したがって、本発明者らによって得られた結果は、本発明において使用される遺伝子治療が、出生前の時間枠におけるヒトだけでなく、先天性ＤＦＮＢ９難聴に罹患していると診断された小児患者においても、又は、例えばＯＴＯＦ遺伝子に温度感受性変異があるために、さらに後で診断された成人患者においても効果的であり得る。

第１の態様において、本発明は、ＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者を治療するために使用するための、内有毛細胞における全長オトフェリンポリペプチド又はその機能的フラグメントの発現を可能にするベクターシステムであって、前記患者は、好ましくは幼児、小児、ティーンエイジャー又は成人である、前記ベクターシステムに関する。

本明細書で使用される場合、「オトフェリン」という用語は、オトフェリンポリペプチドを指す。本明細書では「ＯＴＯＦ」と略記する。このポリペプチドはまた、「ＡＵＮＢ１」、「ＤＦＮＢ６」、「ＤＦＮＢ９」、「ＮＳＲＤ９」及び「ＦＥＲ１Ｌ２」としても知られている。

野生型ヒトオトフェリンポリペプチドのアイソフォーム１の全長は、配列番号１（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＡＦ１８３１８５．１に対応）に示されている。このポリペプチドは、膜貫通タンパク質であるＦｅｒｌｉｎファミリーのメンバーであり、シナプトタグミン、ＰＫＣ及びＰＬＣとしてＣ２ドメインを有する。この長いフォームには、６つのＣ２ドメインが含まれる。上記のように、それは蝸牛有毛細胞及び求心性のらせん神経節ニューロンの間のシナプス小胞融合に関与している（Roux et al, Cell 127(2):277-89, 2006; Michalski et al, Elife, 2017 Nov 7;6 e31013）。

「オトフェリンポリペプチド」という用語は、本文脈において目的のオトフェリンポリペプチドの少なくとも１つの生物学的機能を保持する、配列番号１のオトフェリンポリペプチド及びその相同配列を指す。例えば、この生物学的機能は、一次聴覚ニューロンを活性化する蝸牛内有毛細胞のリボンシナプスにおける小胞融合の調節に関連している（Roux et al 2006; Michalski et al, Elife, 2017 Nov 7;6 e31013）。この調節は、古典的なｅｘ ｖｉｖｏにおける電気生理学的測定により評価可能である。

好ましい実施形態において、本発明のベクターシステムは、アミノ酸配列が少なくとも７０％の配列番号１との同一性及び／又は類似性を共有する相同ポリペプチドの発現を可能にする。上記相同配列は、より好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の配列番号１との同一性及び／又は類似性を共有する。相同ポリペプチドが配列番号１よりもはるかに短い場合、ローカルアラインメントを考慮してもよい。

上記相同ポリペプチドは、例えば、配列番号５（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＰ＿００１２７４４１８に対応）に提示されるアミノ酸配列を有することができる。上記配列は、野生型ヒトオトフェリンポリペプチドのアイソフォームｅ（バリアント５）を特徴付ける。このアイソフォームｅは、配列番号２２の配列を有するｃＤＮＡバリアントによってコードされている。このバリアントは、３’コード領域に選択的なインフレームエクソンを欠いており、配列番号１と比較して下流の終止コドンを使用する。それは、配列番号１と比較して、異なるＣ末端をコードする（が、そのＮ末端部分は同じである）。

上記相同ポリペプチドはまた、配列番号６（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＰ＿００４７９３．２に対応）に示されるアミノ酸配列又は配列番号２４（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＰ＿９１９３０３．１に対応）に示されるアミノ酸配列を有することができる。これらは、それぞれ短いアイソフォームｂ及びｃ（バリアント２及び３）に対応している。より正確には、配列番号６は、アイソフォームｂ（バリアント２、「ショートフォーム１」とも呼ばれる）を表し、配列番号１と比較すると、より短いＮ末端を有し、セグメントを１つ欠いている。一方、配列番号２４は、アイソフォームｃ（バリアント３、「ショートフォーム２」とも呼ばれる）を表し、配列番号１と比較すると、より短く、異なるＣ末端を有するため、バリアント１（配列番号１）と比較すると、５’ＵＴＲ及びコード配列が異なる。

上記相同配列はまた、例えば、別の動物種のオトフェリンポリペプチド、例えば、オトフェリンポリペプチドのマウス全長アイソフォーム１である配列番号７（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＰ＿００１０９３８６５．１に対応）であり得る。このアイソフォームは、配列番号１６（ＮＭ＿１１００３９５）のｃＤＮＡによってコードされている。

本発明の文脈において、上記２種の相同配列間の同一性パーセンテージが、配列全体のグローバルアラインメントによって特定され得る場合（例えば、配列がほぼ同じサイズである場合）、このアラインメントは、当業者によく知られているアルゴリズム、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）に開示されているアルゴリズムによって実行され得る。したがって、２種のアミノ酸配列又は２種のヌクレオチド配列間の配列比較は、当業者に知られている任意のソフトウェア、例えば、「ギャップオープン」パラメータ１０、「ギャップエクステンド」パラメータ０．５及び「Ｂｌｏｓｕｍ６２」マトリックスを使用する「ｎｅｅｄｌｅ」ソフトウェアを使用することによって実行され得る。

配列のローカルアラインメントが考慮されるべきである場合（例えば、本発明の配列よりも小さいサイズを有する相同体の場合）、上記アラインメントは、従来のアルゴリズム、例えば、Smith and Waterman (J. Mol. Evol. 1981; 18(1) 38-46)に開示されているアルゴリズムによって実行され得る。

本発明は、配列番号１又は配列番号５又は配列番号６又は配列番号２４に「類似する」相同アミノ酸配列をコードするシステムを提供する。２種の標的アミノ酸配列の「類似性」は、２種のアミノ酸配列に関する類似性スコアを算出することによって決定可能である。本明細書で使用される場合、「類似性スコア」は、２種の配列が最適にアラインメントされた場合に、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換マトリックス、ギャップ存在ペナルティ１１及びギャップ延長ペナルティ１を使用して２種の配列に対して生成されたスコアを指す。２種の配列は、その配列のペアに対して可能な最大スコアを生成するようにアラインメントされる場合に「最適にアラインメント」される。その最大スコアを達成するには、一方又は両方の配列にギャップを導入する必要がある場合がある。類似性スコアが特定の閾値を超える場合、２種のアミノ酸配列は実質的に類似している。閾値は、特定の参照配列（例えば、配列番号１）に対して、少なくとも１１９０から可能な最高スコアまでの範囲の任意の整数であってよい。例えば、類似性スコアの閾値は、１１９０、１２００、１２１０、１２２０、１２３０、１２４０、１２５０、１２６０、１２７０、１２８０、１２９０、１３００、１３１０、１３２０、１３３０、１３４０、１３５０、１３６０、１３７０、１３８０、１３９０、１４００、１４１０、１４２０、１４３０、１４４０、１４５０、１４６０、１４７０、１４８０、１４９０、１５００又はそれ以上であってもよい。本発明の特定の実施形態において、閾値スコアが例えば１３００に設定され、参照配列が配列番号１であるとき、任意のアミノ酸配列が配列番号１と「類似」している場合とは、任意のアミノ酸配列が配列番号１と最適にアラインメントされて、１３００を超える類似性スコアを生成することができる場合である。２種の配列間の類似性を定量化する際のアミノ酸置換マトリックス及びその使用は、当技術分野において周知であり、例えば、Dayhoff et al. (1978), “A model of evolutionary change in proteins”, “Atlas of Protein Sequence and Structure,” Vol. 5, Suppl. 3 (ed. M. O. Dayhoff), pp. 345-352. Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C. 及び Henikoff et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919に記載されている。最適なアラインメント及びスコアリングは手動で実行可能であるが、このプロセスは、コンピュータにより実行されるアラインメントアルゴリズム、例えば、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ２．０（Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載され、アメリカ国立生物工学情報センターのＷｅｂサイトで一般に入手可能にされている）の使用により容易になる。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴを使用して正確な類似性スコアを生成するには、あらゆるフィルタリング（例えば、複雑度の低いフィルタリング（low complexity filtering））をオフにし、構成ベースの統計データ（composition based statistics）の使用を無効にすることが重要である。また、正しい置換マトリックス及びギャップペナルティが使用されていることを確認する必要がある。最適なアラインメント（複数のアラインメントを含む）は、例えば、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩのインターネットサイトを通じて入手可能であり、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されている）を使用して作成可能である。

別の実施形態において、本発明のベクターシステムは、オトフェリンポリペプチドの機能的フラグメントの発現を可能にすることができる。本明細書における「機能的フラグメント」という用語は、ヒトオトフェリンポリペプチドの任意のフラグメント又は上記で定義された相同配列を有するポリペプチドの任意のフラグメントを指し、上記フラグメントは、本文脈における目的のオトフェリンポリペプチドの少なくとも１つの生物学的機能を保持している。例えば、この生物学的機能は、一次聴覚ニューロンを活性化する蝸牛内有毛細胞のリボンシナプスにおける小胞融合の調節に関与している（Roux et al 2006; Michalski et al, Elife, 2017 Nov 7;6 e31013）。この調節は、古典的なｅｘ ｖｉｖｏにおける電気生理学的測定により評価可能である。

例えば、上記機能的フラグメントは、配列番号６（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＰ＿００４７９３．２を有するアイソフォームｂに対応）又は配列番号２４（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＰ＿９１９３０３．１を有するアイソフォームｃに対応）に提示されるアミノ酸配列を有し得る。上記配列は、３つのＣ２ドメインのみを含む、野生型ヒトオトフェリンポリペプチドの短いアイソフォームを特徴付ける。

本発明のこの態様において、本発明のベクターシステムは、ＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者に投与される。「ＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者」とは、本明細書において、構成的オトフェリン遺伝子に変異を有すると考えられる（又は有すると診断されている）患者、特にヒト患者を意味し、上記変異は、オトフェリンタンパク質の異常な発現、機能又はその両方を誘発する。特定の実施形態において、上記変異は温度感受性であり得る。

現在までに、オトフェリンでは６０種を超える病原性変異が報告されている（図７参照）。これらの中には、発熱によって条件付けられた発作性の難聴に侵されている患者において同定された、少なくとも５種の温度感受性変異がある（Ｐ．Ｑ９９４ＶｆｓＸ６、Ｐ．Ｉ５１５Ｔ、ｐ．Ｇ５４１Ｓ、ＰＲ１６０７Ｗ、ｐ．Ｅ１８０４ｄｅｌ）。

これらの患者は、例えば、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）の電気生理学的試験及び／又はＯＴＯＦ遺伝子における変異を特定するための遺伝子検査の組み合わせを使用して、熟練した医師によって特定され得る。いくつかの実施形態において、患者は、ＯＴＯＦ遺伝子に以下のナンセンス又はミスセンス変異：ＴＹＲ７３０ＴＥＲ、ＧＬＮ８２９ＴＥＲ、ＰＲＯ１８２５ＡＬＡ、ＰＲＯ５０ＡＲＧ、ＬＥＵ１０１１ＰＲＯ、ＩＬＥ５１５ＴＨＲ、ＡＲＧ１９３９ＧＬＮ又はＧＬＹ５４１ＳＥＲのうちの１種又は２種以上を有する。いくつかの実施形態において、患者は、イントロン８／エクソン９接合部（ＩＶＳ８－２Ａ－Ｇ）におけるＡからＧへのトランジション、又はエクソン５のスプライスドナー部位における最初のイントロンヌクレオチドである、位置＋１におけるＧからＡへのトランジション、又はイントロン３９のドナースプライス部位におけるＧからＣへのトランスバージョンを有する。いくつかの実施形態において、患者は、エクソン１６に終止コドンをもたらす１塩基対の欠失（１７７８Ｇ）及びエクソン４８にＡＲＧからＧＬＮへの置換をもたらす６１４１のＧからＡへの変化を有する。

本発明のベクターシステムが投与される患者は、聴覚系、特に蝸牛が既に発達して成熟している患者、特にヒト患者である。したがって、これらの患者、特にヒト患者は、投与が子宮内で行われることを意図していないため、ヒトの胚又は胎児ではない。図７によれば、本発明の対象となる患者は、ＤＦＮＢ９難聴がその齢で診断された場合、好ましくはヒト新生児であり、典型的には生後６か月未満、又は生後３か月未満でさえある。これらのヒトの赤子は、より好ましくは生後３か月～１年である。

注目すべきことに、ヒトの蝸牛は全体として、妊娠１７～１９週で成体のサイズに達し、３０～３６週（マウスにおける生後１２日に相当）で完全に形態学的に成熟する。内有毛細胞のリボンシナプスの機能的成熟は、ＡＢＲ測定のＩ波をモニターすることによって評価可能であり、これは、ヒトの妊娠２８週目頃に測定され得る。ＡＢＲのＩ波（一次聴覚ニューロンとの内有毛細胞シナプスの機能を反映）の記録及び分析は、出生時（マウスの出生後２０日に相当）のヒトの赤子の完全な機能的成熟を示す。これは当技術分野でよく知られている（例えば、Pujol et Lavigne-Rebillard, Acta oto-laryngologica. Supplementum ・ February 1991を参照されたい）。

したがって、本発明のベクターシステムを、年齢を重ねたヒト患者、例えば、幼児（２～６歳）、小児（６～１２歳）、ティーンエイジャー（１２～１８歳）又は成人（１８歳以上）に投与することも可能である。

したがって、全体として、３か月～２５歳のヒト患者に本発明のベクターシステムを投与することが好ましい。

本発明の患者は、特に、言語習得後にＤＦＮＢ９難聴に侵されていると診断されたヒトの乳児である。

別の特定の実施形態において、本発明の患者は６歳以上のヒトであり、すなわち、中枢神経系が完全に成熟しているときに治療の投与が行われる（図７を参照）。

特定の実施形態において、本発明のベクターシステムは、温度感受性変異によって誘発されるＤＦＮＢ９難聴に罹患しているヒト患者、好ましくは上記のオトフェリン温度感受性変異の少なくとも１種を保有するティーンエイジャー又は成人に投与される。

本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、患者の聴覚を部分的又は完全に回復させるために、治療有効量の本発明のベクターシステムの１つをＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者への投与を意味することを意図する。上記の回復は、電気生理学的デバイスにより聴性脳幹反応（ＡＢＲ）を試験することによって評価され得る。「ＤＦＮＢ９難聴の治療」は、特に、関与する細胞メカニズムに関係なく、聴覚機能の完全な回復を指すことを意図する。

温度感受性変異を有する患者の場合、本発明のベクターシステムを投与して、体温調節によって誘発される聴覚低下を予防することもできる。本発明の文脈において、「予防する」という用語は、可聴周波数範囲内の聴覚低下を弱めるか又は遅らせることを指す。

これら及びその他のＤＦＮＢ９患者において、本発明のベクターシステムは、聴覚低下が発生する前に予防するため、及び聴覚低下が既に発生している場合に聴力を回復させるための両方に投与可能である。

内耳への複数の送達経路が検討されてきた。これらには、正円窓膜（ＲＷＭ）及び卵円窓を介した外リンパ腔への注射、並びに蝸牛切開による鼓室階又は前庭階への注射が含まれる。外リンパ腔全体への分布は、これらすべての送達経路に対して実証されている。さらに、蝸牛及び前庭器官を通る移流の流れは、注射部位から内耳のより離れた領域への治療薬の分布を容易にすることができることが実証されている。内リンパ腔への送達は、蝸牛切開を介した中央階への送達、カナロストミー（canalostomy）及び注射による内リンパ嚢への送達も検討されてきた。これらのアプローチもまた幅広い分布をもたらしたが、高カリウムの内リンパと外リンパとの間のバリアを破るという追加の課題に直面している。バリアの破壊は、２つの潜在的な問題を引き起こす。第一に、有毛細胞及びニューロンの外底面を浸す外リンパ腔への高カリウムの漏出は、これらの細胞を慢性的に脱分極させ、細胞死を引き起こす可能性がある。第二に、内リンパと外リンパとの間のタイトジャンクションの破れは、通常＋８０～＋１２０ｍＶの範囲である蝸牛内電位の低下につながり得る。蝸牛内電位の低下は、有毛細胞における感覚伝達の駆動力を低下させ、したがって、蝸牛感度の低下及び聴覚閾値の上昇につながる。これらの合併症を回避することは、成人の蝸牛では特に困難である。しかしながら、蝸牛内直流電位を有しないが、蝸牛の内リンパ腔と連続している前庭系の内リンパ腔を標的にすることにより、蝸牛内に十分な分布を依然として提供しながら、これらの交絡問題を最小限に抑えることができる（Ahmed et al, JARO 18:649-670 (2017)）。

蝸牛は高度に区画化されており、血液蝸牛関門（ＢＣＢ）によって身体の残りの部分から分離されている。これにより、治療注射量及び身体の全身循環系への漏出が最小限に抑えられ、蝸牛の免疫特権が保護され、全身性の悪性の免疫応答の可能性が低くなる。蝸牛の有毛細胞及び支持細胞は通常は、分裂しないため、蝸牛の細胞は安定したままであり、したがって、持続的な導入遺伝子発現のために非組み込みウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を使用することが可能である。

後半規管はヒトにおいてもアクセス可能であると思われるため、三半規管アプローチは、ヒトの治験における将来の蝸牛遺伝子治療のための有望な注射経路として提案されている（Suzuki et al., Sci. Rep. 7:45524 (2017); Yoshimura et al., Sci. Rep. 8:2980 (2018)）。

本発明の好ましい実施形態において、本発明のベクターシステムは、臨床の耳鼻科手術の実務において日常的に使用される２つの一般的でよく確立された技術のうちの１つを介してヒトの耳に投与される。より正確には、これらのアプローチは、外リンパ腔を対象とするために採用される。この目的のために、マイクロカテーテルを使用した注射は、レーザーアブミ骨切除術（アブミ骨を横切って（trans-stapes））を使用した卵円窓、又は乳様突起を横切って（transmastoid）／正円窓を横切って（trans-round window）のいずれかを通じて実施される（Dai C. et al, JARO, 18:601-617, 2017）。

静脈内注射又は注入による全身投与も可能である。

本発明のベクターシステムは、内有毛細胞において全長オトフェリンポリペプチド又はその機能的フラグメントの発現を誘発することができる少なくとも１種のポリヌクレオチドベクターを含む。好ましくは、上記ポリヌクレオチドベクターは、上記細胞における遺伝子の発現を特異的に可能にするプロモーターと作動可能に連結された、上記ポリペプチド又はその機能的フラグメントをコードするコード配列を含む。

上記コード配列は、例えば、ヒト野生型オトフェリン遺伝子のアイソフォーム１のｃＤＮＡ配列に対応する配列番号２のヒトオトフェリン遺伝子である（ＮＭ＿１９２４８．２＝アイソフォームａ又はバリアント１。これは、最も長いアイソフォームである。）。

上記コード配列はまた、配列番号２２のより短い、ｃＤＮＡ配列ＮＭ＿００１１２８７４８９．１（アイソフォームｅ若しくはバリアント５）、ｃＤＮＡ配列ＮＭ＿００４８０２．３（アイソフォームｂ若しくはバリアント２）、ｃＤＮＡ配列ＮＭ＿１９４３２２．２（アイソフォームｃ若しくはバリアント３）又はｃＤＮＡ配列ＮＭ＿１９４３２３．２（アイソフォームｄ若しくはバリアント４）であり得る。

様々な組織及び器官における遺伝物質の送達のために、いくつかのウイルス及び非ウイルスベクターが開発されてきた。ほとんどの場合、これらのベクターは複製能力がなく、ウイルス誘発性疾患の脅威はほとんどない。むしろ、ウイルスゲノムは部分的又は完全に削除されており、ウイルスキャプシド内に治療用ＤＮＡカーゴを含めることができるように拡張されている。一本鎖ＤＮＡを含むベクターもあれば、二本鎖ＤＮＡを含むベクターもある。本発明の文脈において特に好ましいベクターは、Ahmed et al, JARO 18:649-670 (2017)に開示されているように、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。

具体的には、ＡＡＶは、パルボウイルス科の小型の複製欠損アデノウイルス依存性ウイルスである。それらは、直径２０～２５ｎｍのｉｃｏｓａｅｄｒｉｃａｌキャプシド及び２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接されている４．８ｋｂのゲノムを有する。宿主細胞内で脱被膜後、ＡＡＶゲノムは、高分子量のヘッドトゥーテールの円形コンカテマーを形成することにより、安定したエピソーム状態で存続し得るか、又は宿主細胞ゲノムに組み込まれ得る。どちらのシナリオも、長期的且つ高レベルの導入遺伝子発現を提供する。

ＡＡＶは、眼の遺伝子治療のヒト治験において得られた結果に基づくと、蝸牛遺伝子治療に対する有望なウイルスであるように思われる。ヒトの眼の遺伝子治療におけるＡＡＶの成功の理由には、（１）証明された安全性プロファイル（多数のヒト試験により、ＡＡＶは病原性を欠き、免疫原性が非常に低いことが示されている）、（２）非分裂細胞における長期間の導入遺伝子発現、（３）小さなサイズであるＡＡＶ（約２０ｎｍ、これはアデノウイルスの５分の１である）は、細胞の障壁を越えて拡散し、標的細胞に到達するのに役立つ（Zhang et al, Frontiers in Molecular Neuroscience, vol.11, Art.221, 2018）。

好ましい実施形態において、本発明のベクターシステムは、上記のように、全長オトフェリンポリペプチド又はその機能的フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１種のＡＡＶ粒子を含む。

別の好ましい実施形態において、本発明のベクターシステムは、少なくとも２種のＡＡＶ粒子を含み、それらのうち、ｉ）１種は、オトフェリンポリペプチド若しくはその機能的フラグメントのＮ末端部分をコードする部分的コード配列を含むポリヌクレオチドを含み、且つ、ｉｉ）別の１種は、オトフェリンポリペプチド若しくはその機能的フラグメントのＣ末端部分をコードする部分的コード配列を含むポリヌクレオチドを含む。

ヒトＡＡＶの１２種の自然発生血清型が、これまでに特徴付けられている。これらの血清型は、筋肉、肺、肝臓、脳、網膜及び血管系において異なる固有の指向性及び形質導入効率を有する。ＡＡＶのシュードタイプ決定及びキャプシドの操作についての複数の試みは、指向性及び形質導入の効率のかなりの改善をもたらした。内耳の細胞に関して、ＡＡＶ１～４、７及び８は、ｉｎ ｖｉｖｏでらせん板縁、らせん靭帯及びらせん神経節細胞に感染することが示された。ＩＨＣの感染は、ＡＡＶ１～３、５、６及び８についても示された。ＡＡＶ１は最も効率的であり、時折ＯＨＣ及び支持細胞に感染した。また、ＡＡＶ５は、クラウジウス細胞、らせん神経節及び内らせん溝細胞にも効率的であることが示された。シュードタイプベクターの中で、ＡＡＶ２／１は前駆細胞に効率的に形質導入してマウス蝸牛にＩＨＣ及びＯＨＣを生じさせることが見出され、ＡＡＶ２／２はモルモット蝸牛のＩＨＣに最適であった（Ahmed et al, JARO 18:649-670 (2017)）。

したがって、好ましい実施形態において、本発明のベクターシステムは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びＡＡＶ１０からなる群において選択されるＡＡＶベクターを含む。

より好ましい実施形態において、上記ベクターの血清型は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ５又はＡＡＶ１である。さらにより好ましい実施形態において、上記ベクターの血清型は、ＡＡＶ２又はＡＡＶ８である。本発明の文脈において最も好ましい血清型であるＡＡＶ８は、現在、ｉｎ ｖｉｖｏで試験されている。

遺伝子発現の有効性を高め、ウイルスの意図しない拡散を防ぐために、ＡＡＶの遺伝子改変を行うことができる。これらの遺伝子改変には、Ｅ１領域の欠失、Ｅ２又はＥ４領域のいずれかの欠失を伴うＥ１領域の欠失、又はシス作用性の逆方向末端反復及びパッケージングシグナルを除くアデノウイルスゲノム全体の欠失が含まれる。そのようなベクターは、本発明に有利に含まれる。

さらに、変異キャプシドタンパク質を有する遺伝子改変されたＡＡＶを使用して、遺伝子発現を特定の組織タイプ、例えば聴細胞に向けることができる。この目的では、ウイルスエンベロープ内のチロシン残基がアラニン残基で置換されている、改変された血清型－２及び－８のＡＡＶベクターを使用することができる。チロシン変異血清型－２の場合には、チロシン４４４をアラニンで置換することができる（ＡＡＶ２－Ｙ４４４Ａ）。血清型８の場合には、チロシン７３３をアラニン残基で置換することができる（ＡＡＶ８－Ｙ７３３Ａ）。ＡＡＶ２－Ｙ４４４Ａ又はＡＡＶ８－Ｙ７３３Ａを使用することにより、遺伝子導入を最大１０，０００倍に増やすことができ、蝸牛の感覚有毛細胞に感染するために必要なＡＡＶの量を減らすことができる。

好ましい実施形態において、オトフェリンポリペプチド又は遺伝子又はその機能的フラグメントを発現する本発明のポリヌクレオチドは、すべてのチロシン残基がフェニルアラニン残基で置換された組換えＡＡＶ２粒子（Petrs-Silva H et al, Mol. Ther. 19, 293-301 (2011)及び実施例に記載されるＡＡＶ２（Ｙ－＞Ｆ）又はＱｕａｄ Ｙ－Ｆ）に含まれる。キャプシドタンパク質の外表面上の変異チロシン残基には、例えば、Ｔｙｒ２５２からＰｈｅ２５２（Ｙ２５２Ｆ）、Ｔｙｒ２７２からＰｈｅ２７２（Ｙ２７２Ｆ）、Ｔｙｒ４４４からＰｈｅ４４４（Ｙ４４４Ｆ）、Ｔｙｒ５００からＰｈｅ５００（Ｙ５００Ｆ）、Ｔｙｒ７００からＰｈｅ７００（Ｙ７００Ｆ）、Ｔｙｒ７０４からＰｈｅ７０４（Ｙ７０４Ｆ）、Ｔｙｒ７３０からＰｈｅ７３０（Ｙ７３０Ｆ）及びＴｙｒ７３３からＰｈｅ７３３（Ｙ７３３Ｆ）の変異が含まれるが、これらに限定されない。これらの改変されたベクターは、正円窓膜を横切るベクターの浸透を促進し、これにより、蝸牛の有毛細胞／らせん神経節ニューロンへのベクターの非侵襲的送達が可能になる。これらの変異ベクターはプロテアソームによる分解を回避し、それらの形質導入効率が大幅に向上する。

天然の血清型１～１０に由来するその他の組換えＡＡＶ粒子には、ＡＡＶ２－ＡＡＶ３ハイブリッド、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．１４、ＡＡＶ３ａ／３ｂ、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ－ＨＳＣ１５、ＡＡＶ－ＨＳＣ１７、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＣＨｔ－Ｐ６、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ－ＨＳＣ１５／１７、ＡＡＶＭ４１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ６（Ｙ４４５Ｆ／Ｙ７３１Ｆ）、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＨＡＥ１／２、ＡＡＶクローン３２／８３、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ２．１５、ＡＡＶ２．４、ＡＡＶＭ４１及びＡＡＶｒ３．４５が含まれる（Asokan A. et al, Mol. Therapy, vol.20 n°4, 699-708, 2012）。

これまでに報告されている内耳有毛細胞の形質導入に最も高い効率を有することが示されている合成ベクターＡｎｃ８０Ｌ６５を使用することも可能である（Suzuki et al., Sci. Rep. 7:45524 (2017)）。Gyorgy et al, Mol. Ther. 25(2):379-391, 2017によって提案されたように、エクソソーム関連ＡＡＶを使用することもできる。

パッケージング能力を高めるためにキャプシドが改変されているオーバーロードされたＡＡＶ／ＰＨＰ．Ｂベクター（overloaded AAV/PHP.B vector）を使用することもできる。

異種ポリヌクレオチド又はコンストラクトを含むウイルス及びビリオンを調製する方法は、当技術分野で知られている。ＡＡＶの場合には、ＡＡＶヘルパー機能に適したアデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルス又はポリヌクレオチドコンストラクトを細胞に同時感染させる又はトランスフェクトすることができる。材料及び方法の例は、例えば、ＵＳ８，１３７，９６２及びＵＳ６，９６７，０１８に記載されている。

当業者は、本発明のベクターの投与前に、標的細胞に応じて、ＷＯ２０１１／０７５８３８で提案されているように正円窓膜の透過性を増強することが必要か否かを容易に決定するであろう。

ＡＡＶが使用される場合でさえ、本発明のシステムは、１つのベクターシステムであり得る。この場合には、改変されたキャプシドを使用してもよい（ＡＡＶ／ＰＨＰ．Ｂベクター参照）。

選択されたＡＡＶキャプシドが、５キロ塩基の制限されたパッケージング容量を有する場合、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／０７５００８に開示されるようなデュアルベクターシステムを使用することがより良い。

本発明者らは、上記デュアルＡＡＶベクターアプローチを使用して、オトフェリン遺伝子の２つの半分の部分を内有毛細胞に提供し、内有毛細胞において相同組換えが起こり、全長タンパク質が発現される。本発明者らの結果は、２種の異なるＡＡＶベクターが標的の内有毛細胞を効率的に形質導入することができ、内有毛細胞においてオトフェリンタンパク質が産生され、ＤＦＮＢ９の無効化（invalidation）による先天性難聴に罹患しているＯＴＯＦ ＫＯマウスの重度の難聴表現型を長期的に回復させ得ることを示している。

したがって、本発明のベクターシステムは、好ましくは、少なくとも２種のＡＡＶ粒子を含み、
前記ＡＡＶ粒子のそれぞれが、
ａ）前記ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復を含むとともに、前記逆方向末端反復の間に５’から３’に向かって、適切なプロモーターと、それに続く、オトフェリン遺伝子のＮ末端部分を含む部分的コード配列と、スプライスドナー部位とを含む第１のポリヌクレオチド、又は
ｂ）前記ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復を含むとともに、前記逆方向末端反復の間に５’から３’に向かって、スプライスアクセプター部位と、オトフェリン遺伝子のＣ末端部分を含む部分的コード配列と、場合により、それに続くポリアデニル化配列とを含む第２のポリヌクレオチド
のいずれかを含み、
前記第１及び第２のポリヌクレオチドが、それぞれ、前記第１のポリヌクレオチド中の前記スプライスドナー部位の後に位置する組換え誘導配列、及び、前記第２のポリヌクレオチド中の前記スプライスアクセプター部位の前に位置する組換え誘導配列（recombinogenic sequence）を含み、且つ、
前記第１及び第２のポリヌクレオチド中の前記コード配列が、組み合わさると、前記全長オトフェリンポリペプチドをコードする。

この好ましい実施形態は、「第１」及び「第２」のポリヌクレオチドを使用する。しかしながら、「第１」及び「第２」は、特に明記されていない限り、特定の順序又は重要性を意味するものではないことを理解されたい。

図１及びＷＯ２０１３／０７５００８において説明されるように、この特定の実施形態において使用される第１及び第２のポリヌクレオチドは、標的細胞におけるオトフェリンタンパク質の適切な組換え及び発現を誘導するために特定の遺伝的成分を含む必要がある。

これらの特定の成分は以下のとおりである。

・ＩＴＲ
本発明のいくつかの実施形態において、ＯＴＯＦ遺伝子の部分的又は全長のｃＤＮＡが、２つのＩＴＲ含有プラスミドに挿入される。

ＡＡＶベクターを使用する場合、本明細書に記載のポリヌクレオチドのＩＴＲ配列は、任意のＡＡＶ血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）に由来してもよく、或いは複数の血清型に由来してもよい。本明細書で提供されるポリヌクレオチドのいくつかの実施形態において、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。ＩＴＲ配列及びＩＴＲ配列を含むプラスミドは当技術分野で知られており、市販されている。

発現コンストラクトの５’末端に隣接する例示的なＡＡＶ２のＩＴＲ配列は、配列番号１０の配列を含む。発現コンストラクトの３’末端に隣接する例示的なＡＡＶ２のＩＴＲ配列は、配列番号１１の配列を含む。

このようなＩＴＲはまた、本発明のポリヌクレオチドが単一のベクターシステムである場合にも有利に使用することができる。

・適切なプロモーター
本発明のベクターシステムにおける使用が企図されるプロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、キメラＣＭＶ／ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＢＡ）及びトランケートフォームのＣＢＡ（ｓｍＣＢＡ）（米国特許第８，２９８，８１８号）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、プロモーターは、ＣＭＶ及びβ－アクチンプロモーターを含むキメラプロモーターである。

好ましい実施形態において、本発明のベクターシステムにおいて使用されるプロモーターは、配列番号８のトランケートされたキメラＣＭＶβアクチン（ｓｍＣＢＡ）プロモーター、又は配列番号８と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を含むプロモーターである。

そのようなプロモーターはまた、本発明のポリヌクレオチドが単一のベクターシステムである場合に有利に使用され得る。

プロモーターは、当技術分野で知られている標準的な技術を使用してベクターに組み込むことができる。プロモーターの複数のコピー又は複数種のプロモーターを本発明のベクターシステムにおいて使用することができる。一実施形態において、プロモーターは、その天然の遺伝的環境における転写開始部位からの距離とほぼ同じ転写開始部位からの距離に配置可能である。この距離におけるいくらかの変動は、プロモーター活性を実質的に低下させることなく許容される。転写開始部位は通常、ベクターに含まれる。

・ｉｎ ｖｉｖｏにおいてｃＤＮＡの２つの半分の配列の相同組換えを促進して、トランスフェクトされた内有毛細胞内でＯＴＯＦポリペプチドの全コード配列を生成し、その発現を生じる組換え誘導配列
いくつかの実施形態において、本発明の２種のポリヌクレオチド（例えば、第１及び第２のポリヌクレオチド）は、細胞に送達された２種のポリヌクレオチド間の相同組換えを促進することができる、いわゆる「組換え誘導領域（recombinogenic region）」を含む（例えば、Ghosh et al. Hum Gene Ther. 2011 Jan;22(l):77-83を参照）。

この組換え誘導領域は、典型的には、第２のポリヌクレオチド中に相同領域を有する第１のポリヌクレオチドの第１の領域であり、又はその逆である。２種の領域は、好ましくは、上で定義したように少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の同一性を互いに有する配列同一性の閾値レベルを有する。

この組換え誘導領域は、好ましくは、５０～５００、５０～４００、５０～３００、１００～５００、１００～４００、１００～３００、２００～５００、２００～４００又は２００～３００ヌクレオチドで構成されるサイズを有する。

好ましい実施形態において、２種の領域は同一であり、２００～３００ヌクレオチドで構成されるサイズを有する。

これらの組換え誘導配列は、標準的なストリンジェントな条件下及び標準的な方法の下で互いにハイブリダイゼーションを可能にするのに十分に相同である配列を有する。

本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな」条件は、ハイブリダイゼーションが、通常、６ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハルト溶液、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ変性ＤＮＡ中のＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より２０～２５℃下の温度で一晩行われる条件を指す。融解温度は以下の式：Ｔｍ＝８１．５Ｃ＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－０．６１（％ホルムアミド）－６００／塩基対中の二重鎖の長さによって表される。

洗浄は通常、以下のように行われる。（１）１ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中で室温において１５分間を２回（低ストリンジェンシー洗浄）。（２）０．２ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中でＴｍ－２０℃において１５分を１回（中程度のストリンジェンシー洗浄）。

より好ましい実施形態において、２種の領域は同一であり、配列番号９の配列又は配列番号９と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する相同配列を有する。

・スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位
ｉｎ ｖｉｖｏで組換えられると、全長のｃＤＮＡには、組換え誘導領域からのスプライシングを引き起こすスプライスドナー／スプライスアクセプターのペアが含まれる。本発明のデュアルベクターシステムに含まれるポリヌクレオチドは、スプライスドナー部位又はスプライスアクセプター部位を含む。好ましい実施形態において、スプライスドナー部位及び／又はスプライスアクセプター部位は、スプライスコンセンサス配列を含む。より好ましい実施形態において、本発明のベクターシステムに含まれるポリヌクレオチドによって有されるスプライスドナー部位及び／又はスプライスアクセプター部位は、アルカリホスファターゼ酵素に由来するスプライスコンセンサス配列を含む。

好ましい実施形態において、本発明のデュアルベクターシステムに含まれるポリヌクレオチドは、それぞれスプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位として配列番号１２及び／又は配列番号１３を含むか、或いは、配列番号１２及び／又は配列番号１３と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を含むスプライス部位を含む。

シングル又はデュアルベクターシステムのいずれかに含まれる本発明のポリヌクレオチド配列は、ベクターが発現される内有毛細胞において機能的であるその他の調節成分（regulatory component）を含み得る。当業者は、ヒト内有毛細胞において使用するための調節エレメントを選択することができる。調節エレメントには、例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、転写終結配列、翻訳終結配列、エンハンサー及びポリアデニル化エレメントが含まれる。

転写終結領域は、通常、真核生物又はウイルスの遺伝子配列の３’非翻訳領域から取得され得る。転写終結配列は、コード配列の下流に配置されて、効率的な終結を提供することができる。シグナルペプチド配列は、作動可能に連結されたポリペプチドを、特定のオルガネラコンパートメントからタンパク質の作用部位及び細胞外環境に至るまで、広範囲の翻訳後の細胞目的地に再配置するのに関与する情報をコードするアミノ末端配列である。エンハンサーは、遺伝子の転写を増加させるシス作用性エレメントであり、ベクターに含まれ得る。エンハンサーエレメントは当技術分野で知られており、ＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサーエレメント、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターエンハンサーエレメント及びＳＶ４０エンハンサーエレメントが含まれるが、これらに限定されない。

構造遺伝子によってコードされるｍＲＮＡのポリアデニル化を指示するＤＮＡ配列もベクターに含まれ得る。

デュアルベクターアプローチは、限られたパッケージング容量を有するビリオンにより簡単にパッケージングするために、ＯＴＯＦ遺伝子のコード配列を２つの部分に分割するのに有利である。ＡＡＶキャプシドを使用する場合、５キロ塩基以下、４キロ塩基以下、さらにより好ましくは３キロ塩基以下を含むＯＴＯＦコード配列を含むポリヌクレオチドを使用することが好ましい。

ヒトＯＴＯＦ遺伝子のコード配列は、好ましくは、天然のスプライシング部位において切断される。

例えば、配列番号２のヒトＯＴＯＦ遺伝子アイソフォーム１は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有するＮ末端部分（配列番号２のヌクレオチド１～２６７６）と、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有するＣ末端部分（配列番号２のヌクレオチド２６７７～５９９４）とに分割され得る。そして、配列番号２２を有するヒトＯＴＯＦ遺伝子アイソフォーム５は、配列番号３のＮ末端部分と配列番号２３のＣ末端部分とに分割され得る。

本発明のベクターシステムにおいて第１及び第２のポリヌクレオチドとして使用可能な例示的なポリヌクレオチドは、例えば、それぞれ、配列番号１９及び配列番号２０である。これら２種のポリヌクレオチドは、オトフェリンヒトタンパク質のアイソフォーム１のＮ末端部分及びＣ末端部分をそれぞれコードしている。

配列番号１９は、
・配列番号１０の配列を有するＡＡＶ２の５’ＩＴＲ配列（ｎｔ ２０～１６２）、
・ＣＭＶエンハンサー（ｎｔ １８６～４４０）、ニワトリβ－アクチンプロモーター（ｎｔ ４４１～８３５）、β－アクチンタンパク質のエクソン１及びキメライントロン（ｎｔ ８３６～１１３０）（３つすべてで「ｓｍＣＢＡ」と呼ばれ、配列番号８の配列に対応する）、
・配列番号３の配列を有するヒトオトフェリンアイソフォーム１コード配列の５’部分（ｎｔ １１５３～３５５８）、
・配列番号１２の配列を有するアルカリホスファターゼのスプライスドナー部位（ｎｔ ３５５９～３６４２）、
・配列番号９の配列を有する組換え誘導配列（ｎｔ ３６４９～３９３５）、及び
・配列番号１１の配列を有するＡＡＶ２の３’ＩＴＲ配列
を含む。

他方、配列番号２０は、
・配列番号１０の配列を有するＡＡＶ２の５’ＩＴＲ配列（ｎｔ ２０～１６２）、
・配列番号９の配列を有する組換え誘導配列（ｎｔ ２０７～４９３）、
・配列番号１３の配列を有するアルカリホスファターゼのスプライスアクセプター部位（ｎｔ ５１６～５６４）、
・配列番号４の配列を有するヒトオトフェリンアイソフォーム１のコード配列の３’部分（ｎｔ ５６５～４１５２）、
・ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル（ｎｔ ４１９０～４４１１）、及び
・配列番号１１の配列を有するＡＡＶ２の３’ＩＴＲ配列
を含む。

本発明のベクターシステムにおいて第１及び第２のポリヌクレオチドとして使用可能な例示的なポリヌクレオチドは、例えば、それぞれ、配列番号１９及び配列番号２１である。これら２種のポリヌクレオチドは、配列番号２２のオトフェリンヒト遺伝子のアイソフォーム５のＮ末端部分及びＣ末端部分をそれぞれコードしている（アイソフォーム１及び５のＮ末端部分は同一であるため、配列番号１９を使用して２種のアイソフォームの発現を誘導することができる）。

配列番号２１は、
・配列番号１０の配列を有するＡＡＶ２の５’ＩＴＲ配列（ｎｔ ２０～１６２）、
・配列番号９の配列を有する組換え誘導配列（ｎｔ ２０７～４９３）、
・配列番号１３の配列を有するアルカリホスファターゼのスプライスアクセプター部位（ｎｔ ５１６～５６４）、
・配列番号２３を有するヒトオトフェリンアイソフォーム５のコード配列の３’部分（ｎｔ ５６５～４１５２）、
・ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナル（ｎｔ ４１９０－４４１１）、及び
・配列番号１１の配列を有するＡＡＶ２の３’ＩＴＲ配列
を含む。

本発明の医薬組成物
別の態様において、本発明は、上記のような本発明のベクターシステム（すなわち、ポリヌクレオチド又はそれを含むビリオン）を含む、成熟した聴覚系を有し、ＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者、特にヒト患者を治療するための、又はＤＦＮＢ９変異を有する患者においてＤＦＮＢ９難聴を予防するための医薬組成物を対象とする。

より一般的には、この医薬組成物は、ＤＦＮＢ５９遺伝子発現の変化又は欠損による先天性の聴覚低下に罹患しているヒト対象に投与可能である。上記欠損は、例えば、オトフェリンが正常レベルで発現されているが機能していない場合に観察され得る。

言い換えれば、本発明は、成熟した聴覚系を有し、ＤＦＮＢ５９遺伝子発現の変化又は欠損に関連する上記に記載された障害に罹患している患者、特にヒトを予防及び／又は治療することを目的とした医薬組成物を製造するための、上記の本発明のベクターシステムの使用に関する。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」には、生理学的に適合性のあるありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に許容可能な担体の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等のうちの１種又は２種以上、並びにそれらの組み合わせが含まれる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、多価アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）、又は塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい場合がある。薬学的に許容可能な担体は、抗酸化化合物又はそれを含む医薬組成物の貯蔵寿命又は有効性を高める少量の補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、防腐剤又は緩衝剤をさらに含むことができる。

本発明の医薬組成物は、様々な形態であり得る。これらには、液体、半固体及び固体の剤形、例えば、液体溶液（例えば、注射可能及び注入可能な溶液）、分散液又は懸濁液、錠剤、ピル、粉末、リポソーム及び坐剤が含まれる。使用される形態は、意図される投与様式及び治療用途に依存する。典型的な組成物は、注射可能又は注入可能な溶液の形態である。

医薬組成物は、通常、製造及び保管の条件下で無菌且つ安定でなければならない。本発明の医薬組成物は、好ましくは、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム又は高薬物濃度に適したその他の規則正しい構造として調合される。滅菌注射液は、本発明のベクターを必要な量で適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙した成分の１種又は組み合わせとともに組み込み、次いで、濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散液は、本発明のベクターを、基本的な分散媒及び上に列挙されたものからの必要なその他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌の凍結乾燥粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び噴霧乾燥であり、これにより、その事前に滅菌濾過された溶液からの有効成分及び任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。溶液の適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に含めることによって達成可能である。

本発明の文脈において、本発明の組成物の典型的な投与様式は、鼓室内（中耳）、蝸牛内又は非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、髄腔内）である。一例において、本発明の医薬組成物は、静脈内注入又は注射によって投与される。別の例において、本発明の医薬組成物は、定位送達（stereostatic delivery）を使用して、特に中耳に鼓膜又は乳様突起（mastoid）を介して、特定の場所に送達される。

より正確には、本発明の組成物は、レーザーアブミ骨切除術（アブミ骨を横切って）を使用した卵円窓、又は乳様突起を横切って／正円窓を横切ってのいずれかを通じて実施されるマイクロカテーテルを使用して投与され得る（Dai C. et al, JARO, 18:601-617, 2017）。

本発明の好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、蝸牛内投与を介して、より正確には、前庭系の内リンパ腔を標的とすることによって、又は上記の三半規管アプローチによって、ヒトの耳に投与される。

本発明の医薬組成物は、典型的には、「治療有効量」又は「予防有効量」の本発明のベクターを含む。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために、この場合、許容することができない毒性又は望ましくない副作用なしに聴覚低下の予防及び治療の両方に対して、必要な投与量及び期間で有効である本発明のベクターの量を指す。

本発明のベクターの治療有効量は、要因、例えば、対象の病状、年齢、性別及び体重、並びに同様に所望の応答を誘発する上記化合物の能力に従って変化し得る。治療有効量はまた、特許請求の範囲の化合物の毒性又は有害な効果を、治療的に有益な効果が上回る量であり得る。「予防有効量」は、所望の予防結果を達成するために、必要な投与量及び期間で有効である本発明のベクターの量を指す。典型的には、予防用量は、疾患になる前又は疾患の初期段階の対象に使用可能であるため、予防有効量は、通常、治療有効量よりも少ない。

投与計画を調製して、最適な所望の応答（例えば、治療的又は予防的応答）を提供することができる。例えば、単一のボーラスを投与することができ、いくつかの分割された用量を経時的に投与することができ、或いは治療状況の緊急性によって示されるように、用量を相対的に減少又は増加させることができる。本明細書で使用される投与単位形態は、治療される哺乳動物対象の単一投与量として適した物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要な医薬担体とともに、所望の治療効果又は予防効果を生み出すように計算された、本発明の所定量のベクター化合物を含む。投与単位形態の仕様は、（ａ）ベクターの固有の特性及び達成される特定の治療効果又は予防効果、並びに（ｂ）対象における聴覚低下を治療又は予防するためのそのようなベクターを調合する技術に固有の制限によって決定され、直接依存する場合がある。

第１及び第２のＡＡＶ粒子が使用されるいくつかの実施形態において、第１及び第２のＡＡＶポリヌクレオチド／粒子は、同じ組成物内又は異なる組成物内に含まれ得、一緒に又は別々に投与され得る。

いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、１０^６～１０^１４粒子／ｍＬ若しくは１０^１０～１０^１５粒子／ｍＬ、又はいずれか範囲の間の任意の値、例えば、約１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３又は１０^１４粒子／ｍＬを含む。一実施形態において、本発明の組成物は、１０^１３ＡＡＶ粒子／ｍＬ超を含む。

いくつかの実施形態において、第１のポリヌクレオチドを含む第１のＡＡＶ粒子及び第２のポリヌクレオチドを含む第２のＡＡＶ粒子が投与される場合、投与される量は、両方の粒子について同じである。

本発明はまた、成熟した聴覚系を有し、ＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者、特にヒト患者への、ベクターシステム及びそれを含む医薬組成物の投与を含む治療方法に関する。上に開示されたすべての実施形態は、上記治療方法に適用される。

図面の簡単な説明
図１は、デュアルＡＡＶベクター送達後のＨＥＫ２９３細胞におけるオトフェリンの発現を示す。
（Ａ）この研究で使用された組換えＡＡＶベクターのペアと、同時感染細胞における全長タンパク質オトフェリンを生成する組換え、転写、スプライシング及び翻訳のプロセスとの概略図。組換えＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＮＴ及びＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＣＴベクターには、それぞれオトフェリンｃＤＮＡの５’部分及び３’部分が含まれる。２種の組換えベクターに存在する組換え誘導性のブリッジ配列（bridging sequence）は、灰色の球により示されている。タンパク質の図の下の赤いバーは、オトフェリンのＮ末端部分及びＣ末端部分に対する抗体を生成するために使用された２種のペプチドを示す。略語：ＩＴＲ、逆方向末端反復；ｓｍＣＢＡ、サイトメガロウイルス前初期／ニワトリβ－アクチンキメラプロモーター；ＳＡ、スプライスアクセプター部位：ＳＤ、スプライスドナー部位；ｐｏｌｙＡ、ポリアデニル化シグナル；Ｃ２、Ｃ２ドメイン；ＴＭ、膜貫通ドメイン。
（Ｂ）ＨＥＫ２９３細胞に、ＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＮＴ単独で（上のパネル）、ＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＣＴ単独で（中央のパネル）、又はＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＮＴ及びＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＣＴを合わせて（下のパネル）感染させた。４８時間後に、タンパク質のＣ末端部分に対して作製されたポリクローナル抗体によってオトフェリン（緑）に対してＨＥＫ２９３細胞を染色し、ＤＡＰＩ（青）によって細胞核を標識した。同時感染した細胞のみがオトフェリンを産生する。スケールバー：１５μｍ。

図２は、Ｐ１０のＯｔｏｆ－／－マウスにおけるデュアルＡＡＶ媒介遺伝子治療が、オトフェリンの発現を回復させ、難聴を予防することを示す。
（ａ）左パネル：Ｐ７０においてオトフェリン（緑）に対して免疫染色された、注射された蝸牛の中回転及び頂回転（middle and apical turns）のモザイク共焦点画像。細胞核はＤＡＰＩ（青）により染色されている。ＩＨＣの大部分は、オトフェリンを発現しているが、外有毛細胞（ＯＨＣ）のいずれもオトフェリンを発現していない。矢頭は、形質導入されていないＩＨＣを示す。挿入図：ボックスで囲われた領域の高倍率。スケールバー：５０μｍ及び１０μｍ（挿入図）。右パネル：オトフェリン（緑）、リボンタンパク質リブアイ（ribeye）（青）、及びシナプス後グルタミン酸受容体のＧｌｕＡ２サブユニット（赤）に対して共免疫染色されたＩＨＣの画像。シナプスの活性帯（active zone）は、オトフェリンを発現する形質導入されたＩＨＣにおいて通常の分布を有するが、形質導入されていないＩＨＣ（破線で示されている）ではクラスター（矢頭）を形成する傾向がある。スケールバー：５μｍ。
（ｂ）左パネル：デュアルＡＡＶ注射の４週間後、Ｏｔｏｆ－／－マウス（緑色のドット、ｎ＝８）は、クリック音又は８ｋＨｚ、１６ｋＨｚ及び３２ｋＨｚの周波数におけるトーンバーストに応答して、野生型マウス（黒色のドット、ｎ＝８）に近いＡＢＲ閾値を示した。対照的に、ＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＮＴ（オレンジ色のドット、ｎ＝３）を投与された又は注射なし（青色のドット、ｎ＝６）のＯｔｏｆ－／－マウスには、８６ｄＢ ＳＰＬの音響強度まで識別可能なＡＢＲ波が見られなかった。右パネル：Ｐ１０において処置されたＯｔｏｆ－／－マウス（矢印）において、クリック音刺激に対する聴覚閾値は回復後少なくとも６か月間安定していた。
（ｃ）左パネル：野生型マウス、Ｏｔｏｆ－／－マウス（Ｏｔｏｆ－／－）、及びレスキューされたＯｔｏｆ－／－マウス（注射されたＯｔｏｆ－／－）における、治療用注射の３週間後に記録されたＡＢＲトレースは、野生型マウス及びレスキューされたマウスで同様の波形を示す。右パネル：レスキューされたＯｔｏｆ－／－マウス（灰色、ｎ＝８）及び野生型マウス（黒色、ｎ＝５）におけるＡＢＲ Ｉ波の潜時及び正規化されたＡＢＲ Ｉ波の振幅を示す棒グラフ。

図３は、Ｐ１７のＯｔｏｆ－／－マウスにおけるデュアルＡＡＶ媒介遺伝子治療が、オトフェリンの発現及び聴覚を永続的に回復させることを示す。
（ａ）左パネル：Ｐ８０においてオトフェリン（緑）に対して免疫染色された、注射された蝸牛の中回転及び頂回転のモザイク共焦点画像。細胞核はＤＡＰＩ（青）により染色されている。ほとんどのＩＨＣは、オトフェリンを発現しているが、外有毛細胞（ＯＨＣ）は、オトフェリンを発現していない。矢頭は、形質導入されていないＩＨＣを示す。挿入図：ボックスで囲われた領域の高倍率。スケールバー：５０μｍ及び１０μｍ（挿入図）。右パネル：オトフェリン（緑）、リボンタンパク質リブアイ（青）、及びシナプス後グルタミン酸受容体のＧｌｕＡ２サブユニット（赤）に対して共免疫染色されたＩＨＣの画像。シナプスの活性帯は、オトフェリンを発現する形質導入されたＩＨＣにおいて通常の分布を有するが、形質導入されていないＩＨＣ（破線で示されている）ではクラスター（矢頭）を形成する傾向がある。スケールバー：５μｍ。
（ｂ）左パネル：処置されたマウスにおける組換えベクターのペアの蝸牛内注射の４週間後の、処置されていないＯｔｏｆ－／－マウス（青色、ｎ＝５）、処置されたＯｔｏｆ－／－マウス（緑色、ｎ＝５）及び野生型マウス（黒色、ｎ＝５）における、クリック音又は８ｋＨｚ、１６ｋＨｚ及び３２ｋＨｚの周波数におけるトーンバースト刺激に対する応答のＡＢＲ閾値。右パネル：Ｐ１７（矢印）に注射を受けたＯｔｏｆ－／－マウスの聴覚回復の時間経過。ほぼ野生型レベルへの聴覚回復は、注射後少なくとも２０週間維持される。
（ｃ）左パネル：野生型マウス（黒）、Ｏｔｏｆ－／－マウス（Ｏｔｏｆ－／－）及びレスキューされたＯｔｏｆ－／－マウス（注射されたＯｔｏｆ－／－）における、治療用注射の２週間後に記録されたＡＢＲトレースは、野生型マウス及びレスキューされたマウスで同様の波形を示す。右パネル：レスキューされたＯｔｏｆ－／－マウス（ｎ＝５）のＡＢＲ Ｉ波の潜時が野生型マウス（ｎ＝５）の潜時と類似しているのに対し、その正規化された振幅は野生型マウスの約半分であることを示す棒グラフ。

図４は、Ｐ３０のＯｔｏｆ－／－マウスにおけるデュアルＡＡＶ媒介遺伝子治療が、オトフェリンの発現及び聴力を持続的に回復させることを示す。
（ａ）左パネル：Ｐ４０においてオトフェリン（緑）に対して免疫染色された、注射された蝸牛の中回転及び頂回転のモザイク共焦点画像。細胞核はＤＡＰＩ（青）により染色されている。ほとんどのＩＨＣは、オトフェリンを発現しているが、外有毛細胞（ＯＨＣ）は、オトフェリンを発現していない。矢頭は、形質導入されていないＩＨＣを示す。挿入図：ボックスで囲われた領域の高倍率。スケールバー：５０μｍ及び１０μｍ（挿入図）。右パネル：オトフェリン（緑）、リボンタンパク質リブアイ（青）、及びシナプス後グルタミン酸受容体のＧｌｕＡ２サブユニット（赤）に対して共免疫染色されたＩＨＣの画像。シナプスの活性帯は、オトフェリンを発現する形質導入されたＩＨＣにおいて通常の分布を有するが、形質導入されていないＩＨＣ（破線で示されている）ではクラスター（矢頭）を形成する傾向がある。スケールバー：５μｍ。
（ｂ）処置されたマウスにおける組換えベクターのペアの蝸牛内注射の３週間後（左パネル）、１４週間後及び２０週間後（右パネル）の、処置されていないＯｔｏｆ－／－マウス（青色、ｎ＝３）、処置されたＯｔｏｆ－／－マウス（緑色、ｎ＝３）及び野生型マウス（黒色、ｎ＝３）における、クリック音又は８ｋＨｚ、１６ｋＨｚ及び３２ｋＨｚの周波数におけるトーンバースト刺激に対する応答のＡＢＲ閾値。これらのマウスにおいて、ほぼ野生型レベルへの聴覚回復は、注射後少なくとも２０週間維持される。
（ｃ）左パネル：野生型マウス（黒）、Ｏｔｏｆ－／－マウス（Ｏｔｏｆ－／－）及びレスキューされたＯｔｏｆ－／－マウス（注射されたＯｔｏｆ－／－）における、治療用注射の７週間後に記録されたＡＢＲトレースは、野生型マウス及びレスキューされたマウスで同様の波形を示す。右パネル：レスキューされたＯｔｏｆ－／－マウス（ｎ＝３）のＡＢＲ Ｉ波の潜時が野生型マウス（ｎ＝３）の潜時と類似しているのに対し、その正規化された振幅は野生型マウスの約半分であることを示す棒グラフ。

図５は、Ｏｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウスにおけるデュアルＡＡＶ媒介遺伝子治療が、オトフェリンの正常な発現及び聴力を回復させることを示す。
（Ａ）野生型（Ｏｔｏｆ^＋／＋）マウス（左パネル）、Ｏｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウス（中央パネル）、及び処置されたＯｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}（右パネル）からの中回転の蝸牛（mid-turn cochlea）に位置する、オトフェリン（緑）に対して免疫染色されたＩＨＣの共焦点画像（破線で囲まれている）。オトフェリンは、処置されていないＯｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウスにおけるＩＨＣの基底（IHC base）で異常な凝集を示すが、処置されたマウスのＩＨＣにおけるその発現はほぼ正常である。
（Ｂ）野生型マウス（黒）、Ｏｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウス（青）及びレスキューされたＯｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウス（緑）における、治療用注射の４週間後に記録されたＡＢＲ波形は、野生型及びレスキューされたマウスにおいて同様の波形を示すが、処置されていない変異体ではＡＢＲ波は検出されない。

図６の図解は、ヒト及びマウスの聴覚系の成熟度の相違を示す（Shnerson and Willott, J. Comp. Physiol. Psychol. 1980 Feb; 94(1):36-40）。

図７は、これまでに同定されたＤＦＮＢ９遺伝子の変異のいくつかを示す。これらの変異は、言語習得前難聴ＤＦＮＢ９の劣性型に内在する。

図８は、（Ａ）Ｏｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウスの内有毛細胞におけるオトフェリンのタンパク質凝集及びミスフォールディング、及び（Ｂ）Ｏｔｏｆ^＋／ｔｓ及びＯｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウスにおける聴性脳幹反応（ＡＢＲ）を示す（図５も参照）。

図９は、Ｏｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウスに対するＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＮＴ組換えベクター及びＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＣＴ組換えベクターのペアの片側性の注射の影響を示す。注射の５週間後、３匹のＯｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウスの処置された蝸牛の感覚上皮を顕微解剖し、オトフェリンに対して免疫標識した。処置された蝸牛のＩＨＣにおけるオトフェリンの発現が測定され、処置されていないＯｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウスにおけるその発現と比較された（図５も参照）。

図１０は、野生型、Ｏｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}及び処置されたＯｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}のＩＨＣにおける（Ａ）Ｉ_Ｃａの電位－活性化曲線及び（Ｂ）対応するΔＣｍ応答を示す。細胞膜静電容量（ΔＣｍ）の変化は、エキソサイトーシス中のシナプス小胞の融合をモニターするために使用された。

Ｉ．材料と方法
動物
Ｃ５７ＢＬ／６系統において作製されたオトフェリンノックアウト（Ｏｔｏｆ－／－）マウス（Roux I. et al, Cell, 127, 277-289 (2006)）は、均一なＦＶＢ遺伝的バックグラウンドを得るために、ＦＶＢマウスと１０世代以上戻し交配された。これは、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドとは異なり、このバックグラウンドは生後１０か月以内の安定した聴覚閾値に関連しているためである（Kommareddi, P., et al. J Assoc Res Otolaryngol 16, 695-712 (2015)）。組換えＡＡＶ２ベクターは、ＦＶＢ遺伝的バックグラウンドにおけるＯｔｏｆ－／－マウスに送達された。すべての手順及び動物の取り扱いは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ ｌａ Ｓａｎｔｅ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌｅ、パスツール研究所及びＮＩＨの福祉ガイドラインに準拠し、カリフォルニア大学サンフランシスコ校で承認されたプロトコル要件に準拠した。手術前に、塩酸ケタミン（Ｋｅｔａｓｅｔ、１００ｍｇ／ｋｇ）、塩酸キシラジン（Ｘｙｌａ－ｊｅｃｔ、１０ｍｇ／ｋｇ）及びアセプロマジン（２ｍｇ／ｋｇ）の混合物の腹腔内注射により、マウスを麻酔した。つま先をつまむことに対する深部組織の反応をモニターすることにより、麻酔深度をチェックした。手術前及び手術後２４時間ごとに一週間、マウスにカルプロフェン（２ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射して炎症及び痛みを軽減させた。手術後の苦痛及び異常な体重減少の兆候について動物をモニターした。

Ｃ２Ｆドメインに温度感受性変異（ｐ．Ｅ１８０４ｄｅｌ）を有するマウスモデル（Ｏｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}）を作製した。Ｏｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウスは重度の難聴である。図８に示す結果は、これらのマウスのＩＨＣにおけるオトフェリンの分布が、異常である／強く障害されている（そのタンパク質が内有毛細胞において凝集し、ミスフォールディングしている）ことを強調している。さらに、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）をＯｔｏｆ^＋／ｔｓ及びＯｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウスにおいて記録して、一次聴覚ニューロンの電気的応答及びクリック音刺激に対する中枢聴覚経路の連続的なニューロン伝達をモニターすると、１か月齢では、試験した様々な強度（４０～８６ｄＢ）でＯｔｏｆ^＋／ｔｓマウスのＡＢＲの特徴的な波形が得られるが、Ｏｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウスにおいては１００ｄＢでさえ応答が得られないことが観察される。

組換えＡＡＶ２ベクターのコンストラクト及びパッケージング
マウスオトフェリンｃＤＮＡの全長コード配列（Ｏｔｏｆ１アイソフォーム１；ＮＭ＿００１１００３９５．１）を５’フラグメント（ヌクレオチド１～２４４８）と３’フラグメント（ヌクレオチド２４４９～５９７９）とに分割し、これらのフラグメントを合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。５’コンストラクトは、Ｏｔｏｆ１のｃＤＮＡの５’部分（タンパク質のＣ２Ａ、Ｃ２Ｂ及びＣ２Ｃドメインを含むアミノ酸１～８１６をコードする）とスプライスドナー（ＳＤ）部位とを含み、３’コンストラクトは、Ｏｔｏｆ１のｃＤＮＡの３’部分（タンパク質のＣ２Ｄ、Ｃ２Ｅ、Ｃ２Ｆ及び膜貫通ドメインを含むアミノ酸８１７～１９９２をコードする）と、スプライスアクセプター部位（ＳＡ）とを含む。さらに、両方のコンストラクトは、アルカリホスファターゼ組換え誘導性のブリッジ配列を含む［Lay Y et al, Hum Gene Ther 17, 1036-1042 (2006); Ghosh A. et al, Hum Gene Ther 22, 77-83 (2011); Dyka F.M. et al, Hum Gene Ther Methods 25, 166-177 (2014)］。ＮｏｔＩ／ＮｈｅＩ及びＭｆｅＩ／ＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼの認識部位をこれらのコンストラクトに追加し、次いで、以前に記載されたようにこれらのコンストラクトをＡＡＶｐＴＲ２２ベクタープラスミドに挿入し［Lay Y et al, Hum Gene Ther 17, 1036-1042 (2006); Ghosh A. et al, Hum Gene Ther 22, 77-83 (2011); Dyka F.M. et al, Hum Gene Ther Methods 25, 166-177 (2014)］、ＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＮＴ及びＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＣＴを指す組換えベクターのペアを作製する。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のｃＤＮＡを含む追加の組換えベクターを設計して、細胞形質導入のポジティブコントロールとした。組換えベクターをＡＡＶ２ ｑｕａｄＹ－Ｆキャプシドにパッケージし（Petrs-Silva H. et al, Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 19, 293-301 (2011)）、以前に記載されたように、フロリダ大学のＯｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｏｒｅによって組換えウイルスを精製及び力価測定した［Zolotukhin S. et al, Methods 28, 158-167 (2002); Jacobson SG et al., Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 13, 1074-1084 (2006)］。

トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞における導入遺伝子の発現
１ｘ非必須アミノ酸、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）及びペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地中でポリリジンコーティングカバースリップ上の６ウェルプレートにおいてＨＥＫ２９３細胞を増殖させた。翌日、以前に記載されたように細胞を感染させた（Lopes V.S. et al, Gene Ther 20, 824-833 (2013)）。簡単に説明すると、ＡＡＶ２－Ｏｔｏｆ組換えウイルス（各ベクターに１００００ゲノム含有粒子／細胞）のいずれか１種又は両方を含む無血清培地２００μＬ中で、７５％コンフルエンスの細胞を含むカバースリップを３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートした。２時間後、１ｍＬの完全培地を添加した。翌日、培地を交換し、細胞をさらに４８時間インキュベートした。細胞を４％パラホルムアルデヒドの０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液、ｐＨ７．４により、４℃で２時間固定し、ＰＢＳにより３回リンスし、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００及び５％正常ヤギ血清を含むＰＢＳにより室温で１時間インキュベートした。次いで、細胞を、オトフェリンのＮ末端部分（アミノ酸１９６～２１１）及びＣ末端部分（アミノ酸１８４８～１９７８）に対してそれぞれ作製された、既に特徴付けられているウサギポリクローナル抗体、１４ｃｃ及びＣ１９（Roux I. et al, Cell, 127, 277-289 (2006)）（希釈１：２００）とともに４℃で一晩インキュベートした。サンプルをＰＢＳにより２回リンスし、Ｃｙ３コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、希釈率１：２０００）を含む液と室温で２時間インキュベートした。次いで、サンプルをＰＢＳにより２回リンスし、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）により染色して細胞核を可視化し、Ｆｌｕｏｒｓａｖｅ溶剤（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、フランス）の滴下によりスライドガラスにマウントし、オリンパス共焦点免疫蛍光顕微鏡により観察した。

蝸牛へのベクター送達
以前に記載されたように、ウイルスを左蝸牛に送達した（Akil O. et al, Neuron 75, 283-293 (2012)）。麻酔をかけたＯｔｏｆ－／－マウスに対して、正円窓膜を介してＰ１０、Ｐ１７又はＰ３０の蝸牛の鼓室階にＡＡＶ２－Ｏｔｏｆベクターペアを注射した。耳には背側切開を介してアプローチした（Duan M et al, Gene Ther 11 Suppl 1, S51-56 (2004)）。１８Ｇの針によってブラ（bulla）に小さな穴を開け、鉗子によって拡張した。正円窓膜をホウケイ酸毛細管ガラスピペットにより穏やかに穿刺し、次いで、それを取り除いた。外リンパの流出が止まったら、ＡＡＶ２－Ｏｔｏｆ ＮＴ（６．３ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ）及びＡＡＶ２－Ｏｔｏｆ ＣＴ（４．５ｘ１０^１２ｖｇ／ｍＬ）のベクターのペアを含む固定容量（２μＬ）を、細いガラスマイクロピペット（外側の先端の直径は１０μｍ）により鼓室階に１分間かけて注入した。ピペットを引き抜いて、隙間を筋膜及び脂肪組織により迅速に塞いだ。創傷は、６－０吸収性クロミック縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ）により層状に縫合された。

聴覚検査
麻酔をかけたＯｔｏｆ＋／＋マウス、Ｏｔｏｆ－／－マウス及びレスキューされたＯｔｏｆ－／－マウスに、以前に記載されたように、防音チャンバー内において、様々なタイムポイントで聴覚検査を実施した（Akil O. et al, Neuron 75, 283-293 (2012)）。塩酸ケタミン（Ｋｅｔａｓｅｔ、１００ｍｇ／ｍＬ）及び塩酸キシラジン（Ｘｙｌａ－ｊｅｃｔ、１０ｍｇ／ｍＬ）の混合物の腹腔内注射によりマウスに麻酔をかけ、次いで、必要に応じて初期用量の５分の１を注射した。体温を加熱パッドにより維持し、記録中は直腸プローブによりモニターした。聴性脳幹反応（ＡＢＲ）は、ＴＤＴ ＢｉｏＳｉｇ ＩＩＩシステム（Ｔｕｃｋｅｒ Ｄａｖｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、マウスの頭皮に配置された３つの皮下針電極（頭頂に１つ、左耳の耳介の下に１つ（参照電極）及び反対側の耳の下（接地電極））とを使用して記録された。音刺激は、クリック音（５ｍｓ持続時間、３１Ｈｚ）と８ｋＨｚ、１６ｋＨｚ及び３２ｋＨｚにおけるトーンピップ（１０ｍｓ持続時間、コサイン二乗形（cosine squared shaping）、２１Ｈｚ）とであった。それらは無響条件で伝達され、左耳から片耳の応答が記録された（記録の間、右耳はブロックされた）。各音刺激について、脳波（ＥＥＧ）活動は、フィルタリング（０．３～３ｋＨｚ）を使用して２５ｋＨｚのサンプリングレートにおいて２０ミリ秒間記録された。５１２刺激及び１０００刺激のＥＥＧ波形は、それぞれクリック音及びトーンバーストに対して平均化された。試験された最大強度（８６ｄＢ ＳＰＬ（音圧レベル））から５ｄＢ音圧レベル（ＳＰＬ）間隔で音刺激強度を減少させた。目視検査時にＩ～Ｖ波のＡＢＲピークが明確且つ繰り返し存在する最低刺激レベルとして、聴覚閾値を定義した。保存された波形のオフライン分析によって、これらの閾値の評価を確認した。ＡＢＲ Ｉ波の潜時は、クリック音刺激とＩ波のピーク振幅との間の時間間隔として測定された。さらに、レスキューされたＯｔｏｆ－／－マウスと野生型マウスとの比較に関して、ＡＢＲトレースにおけるＩ波ピーク振幅の値を、対照の野生型マウスの平均値（１００％と見なす）に対して正規化した。

内有毛細胞及びシナプスリボンの計数
マウス蝸牛を４％パラホルムアルデヒドの０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液により灌流し、同じ固定液中で４℃２時間インキュベートした。蝸牛をＰＢＳにより３回リンスし、５％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の０．１Ｍ ＰＢＳ溶液と４℃で一晩インキュベートすることによりカルシウムを除去した。蝸牛感覚上皮（コルチ器）を表面標本に顕微解剖し、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００及び５％正常ヤギ血清を含むＰＢＳ（ブロッキングバッファー）により室温で１時間プレインキュベートし、一晩４℃で一次抗体によりインキュベートした。以下の抗体：ウサギ抗オトフェリンＣ末端部分（Ｃ１９、１：２５０希釈）１、マウス（ｌｇＧ１）抗ＣｔＢＰ２／リブアイ、マウス（ｌｇＧ２ａ）抗グルタミン酸受容体サブユニットＡ２（ミリポア、１：２００希釈）及びウサギ抗ＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１１１２２；１：２５０希釈）を使用した。サンプルをＰＢＳにより３回リンスし、適切な二次抗体：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識抗マウスｌｇＧ１、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８標識抗マウスｌｇＧ２ａ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：１０００希釈）又はＡｔｔｏ Ｆｌｕｏｒ６４７標識抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、１：２００希釈）とインキュベートした。サンプルをＰＢＳにより３回洗浄し、細胞核を染色するためにＤＡＰＩを使用して、１滴のＦｌｕｏｒｓａｖｅによりスライドガラス上にマウントした。高解像度の対物レンズ（開口数１．４、６０ｘ油浸対物レンズ）を備えたＬＳＭ ７００共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、ドイツ）によって、コルチ器の蛍光共焦点ｚスタックを取得した。０．２μｍのｚステップにより５１２ｘ５１２又は１０２４ｘ１０２４ラスター（ｘ及びｙにおいてピクセルサイズ＝０．０３６μｍ）で画像を取得した。最大２０の共焦点画像のｚスタックの３Ｄレンダリングによって、オトフェリン及びシナプスリボンを生成する内有毛細胞（ＩＨＣ）を計数した。オトフェリン導入遺伝子を発現するＩＨＣの割合を計算するために、オトフェリンを産生するＩＨＣの総数を、ＤＡＰＩ染色された細胞核によって特定されたＩＨＣの総数により割った（最低１５０回の連続分析）。

逆転写酵素－ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）
６匹のＯｔｏｆ＋／＋マウス及びＰ１０においてレスキューされた６匹のＯｔｏｆ－／－マウスの左蝸牛から、トータルｍＲＮＡを抽出した（Ｔｒｉｚｏｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。逆転写（ＲＴ）は、ｏｌｉｇｏ ｄＴプライマー及びｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮａｓｅＨ^－（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して４２℃で５０分間行った。２マイクロリットルのＲＴ反応生成物を３５サイクル（９４℃で３０秒間、６０℃で４５秒間、７２℃で６０秒間）及び７２℃で１０分間の最終伸長からなるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に使用した。オトフェリンｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１００３９５．１）の、ＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＮＴインサートとＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＣＴインサートとの間の接合部を包含する２６７６ｂｐ中間フラグメント（ヌクレオチド２７～２７０２）を増幅するように、ＰＣＲプライマーのペア（フォワードプライマーＴＧＴＣＴＣＡＧＡＧＣＴＣＣＧＡＧＧＣＡ（配列番号１４）及びリバースプライマーＡＴＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡ（配列番号１５））を設計した。ＰＣＲ産物を、０．５ｍｇ／ｍＬ臭化エチジウムを含む２％アガロースゲルでの電気泳動により精製し（Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット、ＱＩＡＧＥＮ）、配列決定し（Ｅｌｉｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、オトフェリンｃＤＮＡ配列との配列同一性を確認した。

統計分析
データを平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。ノンパラメトリックなマンホイットニーＵ検定により、すべての統計分析を実施した。統計的有意性は、図に以下のように示されている。ｎ．ｓ．、有意差なし；^＊、ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．０１；^＊＊＊、ｐ＜０．００１。

ＩＩ．結果
キメラＣＭＶ－ニワトリβ－アクチンプロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を発現するように、ＡＡＶ２ベースのベクターを設計した。この発現カセットは、ＡＡＶ２キャプシドの４つの表面チロシン（Ｙ）残基がフェニルアラニン（Ｆ）残基に置換されている、ＡＡＶ２ ｑｕａｄＹ－Ｆキャプシドにパッケージされており、網膜における遺伝子導入の効率を高めることが示されている（Petrs-Silva H. et al, Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 19(2):293-301 (2011)）。組換えウイルスは、Ｐ２において５匹の野生型マウスの左蝸牛に正円窓膜を通じて注射された。注射の３週間後の感覚上皮のＧＦＰ免疫染色により、ＩＨＣを含む様々なタイプの細胞の形質導入を明らかにした。ＩＨＣの形質導入率は７８±６％（平均±ＳＤ）であり、これらの細胞に治療遺伝子を送達するためのこのＡＡＶ血清型の適合性を実証した（図示せず）。マウスオトフェリンｃＤＮＡのコード配列を５’フラグメント（Ｏｔｏｆ ＮＴ、ヌクレオチド１～２４４８）と３’フラグメント（Ｏｔｏｆ ＣＴ、ヌクレオチド２４４９～５９７９）とに分割し、それらのそれぞれを組換え誘導性のブリッジ配列を有するＡＡＶベクターに挿入した。（Ghosh A. et al, Hum Gene Ther 22(1):77-83 (2011); Dyka FM et al, Hum Gene Ther Methods 25(2):166-177 (2014)）。ＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＮＴの組換えベクターはｃＤＮＡの５’部分に続いてスプライスドナー部位を有し、ＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＣＴの組換えベクターはスプライスアクセプター部位に続いてｃＤＮＡの３’部分を有する（方法及び図１を参照）。これらの組換えベクターのそれぞれは、ＡＡＶ２ ｑｕａｄＹ－Ｆキャプシドにパッケージされた。ＨＥＫ２９３細胞をＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＮＴ、ＡＡＶ Ｏｔｏｆ ＣＴ又はこれらの両方の組換えウイルスに感染させ、４８時間後にオトフェリンに対して免疫染色を行った。タンパク質のＣ末端部分又はＮ末端部分に対して作製された２種の異なる抗体を使用して（Roux I, et al, Cell 127:277-289 (2006)）、同じ結果が得られた。オトフェリンは両方のウイルスに同時に感染した細胞でのみ検出されたため、２種のベクターが組換えされ、逆方向末端反復を介してコンカテマーを生じ、得られた転写産物を正しくスプライシングしてタンパク質を産生することができたことを示した（図１）。

ＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＮＴ及びＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＣＴ組換えベクターのペアの片側性の注射を、Ｏｔｏｆ－／－マウスに対して正円窓膜を通じて左蝸牛に、聴覚の発現前（Ｐ１０）又は聴覚の発現後に単回投与した。ＩＨＣリボンシナプスの成熟はＰ１７で依然として進行中である（the maturation of IHC ribbon synapses is still underway at P17）が（Kros CJ et al, Nature 394(6690):281-284 (1998); Wong AB et al, EMBO J 33(3):247-264 (2014)）、蝸牛はＰ３０で成熟する（the cochlea is mature at P30）ため（Song L. et al, J Acoust Soc Am 119(4):2242-2257 (2006)）、聴覚の発現後の注射は、Ｐ１７及びＰ３０の２つの異なるタイムポイントのいずれかで実施された。Ｐ１０において組換えベクターのペアを注射してから８週間後、３匹のＯｔｏｆ^－／－マウスの処置された蝸牛の感覚上皮を顕微解剖し、オトフェリンを（オトフェリンタンパク質のＣ末端部分に対して作製された抗体によって）免疫標識して、ＩＨＣ形質導入率を評価した。オトフェリンタンパク質はＩＨＣの６０％以上（６４±６％、平均±ＳＤ、ｎ＝３（蝸牛））において検出されたが、その他の細胞タイプでは検出されなかった（図２ａ、左パネル）。この結果は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて組換えＡＡＶ－ベクターのペアを局所的に送達すると、大きなｃＤＮＡが蝸牛感覚細胞中で効率的に再構成され、その細胞の大部分がそのタンパク質を持続的且つ広範囲に産生することができるという証拠を提供する。形質導入された細胞におけるプレｍＲＮＡスプライシングプロセスの精度を、ＲＴ－ＰＣＲによってチェックし、Ｏｔｏｆ ＮＴ及びＯｔｏｆ ＣＴのｃＤＮＡの間の接合部を含むオトフェリン転写物の大きな断片の配列分析を行った（図示せず）。

Ｐ１０の注射から４週間後のマウスにおける聴性脳幹反応（ＡＢＲ）の測定は、すべての処置されたマウス（ｎ＝８）においてクリック音刺激及びトーンバースト刺激（８ｋＨｚ、１６ｋＨｚ及び３２ｋＨｚ）に応答して聴覚閾値の実質的な回復を示したが、ＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＮＴ又はＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＣＴのいずれかを単独で投与されたマウス（各ｎ＝３）、又は注射を行わなかったマウス（ｎ＝６）では回復しなかった（図２ｂ、２ｃ）。処置されたマウスにおけるクリック音刺激及びトーンバースト刺激の両方のＡＢＲ閾値は、コントロールの野生型マウスの閾値と同様であった（ｎ＝８；マンホイットニーＵ検定、すべての比較についてｐ＞０．１５）。１～３０週間の間の注射後のいくつかのタイムポイントにおいて、クリック音に対するＡＢＲの測定を実施することによって遺伝子治療の長期的な有効性を評価した。４週目以降から、処置されたマウスのＡＢＲ閾値は、野生型マウスの閾値と有意に相違しなかった（マンホイットニーＵ検定、すべての段階での比較についてｐ＞０．０５）（図２ｂ）。しかしながら、音刺激に対する一次聴覚ニューロンの電気的応答を反映するＡＢＲのＩ波の振幅は、野生型マウスについての平均値の３９±７％（平均±ＳＤ）であった（マンホイットニーＵ検定、ｐ＝０．００２）。一方、Ｉ波の潜時（１．１５±０．０９ｍｓ）は、野生型マウス（１．２７±０．０５ｍｓ）と同様であった（マンホイットニーＵ検定、ｐ＝０．０６）（図２ｃ）。

注射から３０週間後、Ｐ１０において注射を受けた８匹のマウスのうちの６匹は、野生型マウスの聴覚閾値から１０ｄＢ以内の聴覚閾値を有していた。したがって、聴覚の発現前の遺伝子治療は、Ｏｔｏｆ－／－マウスにおける難聴を予防する。本発明者らは、ＩＨＣリボンの約半分がＯｔｏｆ－／－マウスにおいて変性していることを以前に示した（Roux I, et al, Cell 127:277-289 (2006)）。（シナプス後グルタミン酸受容体とともに）シナプス前リボンの数を、Ｐ１０における注射から８週間後の処置されたＯｔｏｆ－／－蝸牛の形質導入されているＩＨＣ及び形質導入されていないＩＨＣにおいて、免疫蛍光及び３Ｄ共焦点顕微鏡イメージングによって分析した（図２ａ、右パネル）。形質導入されている細胞におけるＩＨＣあたりのリボンの数（１２．５±１．８、平均±ＳＤ、ｎ＝４８（３匹のマウスからの細胞））は、形質導入されていない細胞におけるＩＨＣあたりのリボンの数（６．９±１．３、ｎ＝４８（３匹のマウスからの細胞））に対してほぼ２倍であったが（マンホイットニーＵ検定、ｐ＜１０^－４）、野生型ＩＨＣあたりのリボンの数（１６±１．３、ｎ＝４８（３匹のマウスからの細胞））よりも低いままであった（マンホイットニーＵ検定、ｐ＜１０^－４）。これは、ＡＢＲ測定におけるＩ波の振幅の不完全な回復を説明する可能性がある。

組換えベクターのペアをＰ１７又はＰ３０のＯｔｏｆ－／－マウスの蝸牛に注射した後、オトフェリンは、処置された蝸牛全体のＩＨＣでは検出されたが、反対側の蝸牛のＩＨＣでは検出されなかった（図示せず）。ＩＨＣ形質導入率は、２つの群のマウスにおいて同様であり（Ｐ１７及びＰ３０において処置されたｎ＝５及びｎ＝３の蝸牛についてそれぞれ８２±９％及び８５±７％）、Ｐ１０において注射を受けたマウスよりも高かった（マンホイットニーＵ検定、両方の比較についてｐ＜０．０５）（図３ａ及び４ａ）。注射から４週間後のＡＢＲ測定は、Ｐ１７において注射を受けたすべてのマウス（ｎ＝５）で聴覚回復を示し、クリック音刺激又はトーンバースト刺激に応答したＡＢＲ閾値は、野生型マウス（ｎ＝５）と著しく類似している（マン－ホイットニーＵ検定、すべての比較についてｐ＞０．２）。クリック音に応答した聴覚閾値は、注射後２０週間変化しなかった。これは、ＡＢＲ Ｉ波の振幅の平均が野生型マウスの約半分（４７±１０％）であるにもかかわらず、これらのマウスにおける聴覚の持続的な回復を示している（図３ｂ、ｃ）。

同様に、Ｐ３０において注射を受けたＯｔｏｆ－／－マウスは、注射後３週間で同様の聴覚回復を示し、ＡＢＲ Ｉ波の振幅の平均が野生型マウスの約半分（５５±１０％）であるにもかかわらず、クリック音刺激又はトーンバースト刺激に応答したＡＢＲ閾値が、野生型レベルで注射後２０週間持続した（ｎ＝３、マンホイットニーＵ検定、すべての段階比較についてｐ＞０．５）（図４ｂ、ｃ）。（シナプス後グルタミン酸受容体とともに）シナプス前リボンの数を、Ｐ１７及びＰ３０において処置されたＯｔｏｆ－／－蝸牛の形質導入されているＩＨＣ及び形質導入されていないＩＨＣにおいて、免疫蛍光及び３Ｄ共焦点顕微鏡イメージングによって分析した（図３ａ及び４ａ）。形質導入されている細胞におけるＩＨＣあたりのリボンの数（１０．０±１．３、平均±ＳＤ、ｎ＝４８（Ｐ１７において処置されてＰ８０において分析された３匹のマウスからの細胞）、及び８．９±２．３、ｎ＝４８（Ｐ３０において処置されてＰ４０において分析された３匹のマウスからの細胞））は、同じ蝸牛からの形質導入されていない細胞におけるＩＨＣあたりのリボンの数（それぞれ、６．２±１．３、ｎ＝４８細胞、及び５．８±０．７、ｎ＝４８細胞）よりも高かったが（マンホイットニーＵ検定、両方の比較についてｐ＜１０^－４）、１０週齢の野生型マウスのＩＨＣ（１６±１．３、ｎ＝４８（３匹のマウスからの細胞））よりも低かった（マンホイットニーＵ検定、両方の比較についてｐ＜１０^－４）。ＩＨＣあたりのリボンの数は、Ｐ１５において分析された処置されていないＯｔｏｆ－／－マウスにおいて既に著しく減少しており（８．２±１．０、ｎ＝４８（３匹のマウスからの細胞））、処置されたマウスの形質導入されていない後期におけるＩＨＣでは予想外に安定したままであり（上記のＰ４０、Ｐ７０及びＰ８０の値を参照）、Ｏｔｏｆ－／－マウスのＩＨＣにおける遺伝子治療は、変性を防ぐのではなく、生成を促進することによってリボンの数を増やしたと推測され得る。

動物にｐ３０で投与される上記のデュアルＡＡＶ遺伝子治療を使用すると、ＤＦＮＢ９遺伝子にヒトの温度感受性変異を有するマウスモデル（Ｏｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウス）において、オトフェリンの正常な分布を回復させ、且つ、聴覚機能をほぼ正常なＡＢＲ閾値まで回復させることも可能であった（図５）。

より正確には、デュアルウイルス遺伝子治療は、上記ＤＦＮＢ９マウスモデルにおけるヒトの温度感受性変異によるオトフェリン凝集体を上書きすることが示された（図９）。この実験では、聴覚の発現が起きた後（Ｐ３０）に、ＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＮＴ及びＡＡＶ－Ｏｔｏｆ ＣＴ組換えベクターのペアの片側性の注射を、Ｏｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウスに対して正円窓膜を通じて左蝸牛に単回投与した。注射から５週間後、３匹のＯｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウスの処置された蝸牛の感覚上皮を顕微解剖し、オトフェリンに対して免疫標識した（図９を参照）。処置された蝸牛のＩＨＣ（破線）におけるオトフェリンの発現は、Ｏｔｏｆ^{ｔｓ／ｔｓ}マウスの処置されていない蝸牛におけるオトフェリン凝集体（矢印）と比較した場合、ほぼ正常であることが見出された。

図１０に示すように、この動物モデルでは、上記のデュアルウイルス遺伝子治療によってＩＨＣのカルシウム電流及びエキソサイトーシスが回復することが最終的に見出された。

Claims (12)

1. ＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者を治療するために、又はＤＦＮＢ９変異を有する患者においてＤＦＮＢ９難聴を予防するために使用するための、内有毛細胞における全長オトフェリンポリペプチド又はその機能的フラグメントの発現を可能にするベクターシステムであって、前記患者が、発達及び成熟した聴覚系を有するヒト、例えば、新生児、幼児、小児、ティーンエイジャー又は成人である、前記ベクターシステム。
2. 前記オトフェリンポリペプチドが配列番号１の配列を有する、請求項１に記載の使用のためのベクターシステム。
3. 前記全長オトフェリンポリペプチド又はその機能的フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１種のＡＡＶ粒子を含む、請求項１に記載の使用のためのベクターシステム。
4. 前記ベクターシステムが、少なくとも２種のＡＡＶ粒子を含み、それらのうち、ｉ）１種は、オトフェリンポリペプチド若しくはその機能的フラグメントのＮ末端部分をコードする部分的コード配列を含むポリヌクレオチドを含み、且つ、ｉｉ）別の１種は、オトフェリンポリペプチド若しくはその機能的フラグメントのＣ末端部分をコードする部分的コード配列を含むポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の使用のためのベクターシステム。
5. 前記ベクターシステムが、少なくとも２種のＡＡＶ粒子を含み、
   前記ＡＡＶ粒子のそれぞれが、
   ａ）前記ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復を含むとともに、前記逆方向末端反復の間に５’から３’に向かって、適切なプロモーターと、それに続く、オトフェリン遺伝子のＮ末端部分を含む部分的コード配列と、スプライスドナー部位とを含む第１のポリヌクレオチド、又は
   ｂ）前記ポリヌクレオチドの各末端に逆方向末端反復を含むとともに、前記逆方向末端反復の間に５’から３’に向かって、スプライスアクセプター部位と、オトフェリン遺伝子のＣ末端部分を含む部分的コード配列と、場合により、それに続くポリアデニル化配列とを含む第２のポリヌクレオチド
   のいずれかを含み、
   前記第１及び第２のポリヌクレオチドが、それぞれ、前記第１のポリヌクレオチド中の前記スプライスドナー部位の後に位置する組換え誘導配列、及び、前記第２のポリヌクレオチド中の前記スプライスアクセプター部位の前に位置する組換え誘導配列を含み、且つ、
   前記第１及び第２のポリヌクレオチド中の前記コード配列が、組み合わさると、前記全長オトフェリンポリペプチド又はその機能的フラグメントをコードする、請求項１に記載の使用のためのベクターシステム。
6. 前記オトフェリン遺伝子が配列番号２の配列を有する、請求項５に記載の使用のためのベクターシステム。
7. 前記オトフェリン遺伝子の前記Ｎ末端部分が配列番号３の配列であり、前記オトフェリン遺伝子の前記Ｃ末端部分が配列番号４の配列である、請求項５に記載の使用のためのベクターシステム。
8. 前記ＡＡＶ粒子がＡＡＶ２血清型である、請求項３に記載の使用のためのベクターシステム。
9. チロシンアミノ酸残基をフェニルアラニンアミノ酸残基に置換することによってキャプシドが修飾されているＡＡＶ２粒子を含む、請求項１に記載の使用のためのベクターシステム。
10. 前記ヒト患者が、言語習得後にＤＦＮＢ９難聴であると診断されている、請求項１に記載の使用のためのベクターシステム。
11. 前記患者が、温度感受性変異、好ましくは、Ｐ．Ｑ９９４ＶｆｓＸ６、Ｐ．Ｉ５１５Ｔ、ｐ．Ｇ５４１Ｓ、ＰＲ１６０７Ｗ、ｐ．Ｅ１８０４ｄｅｌから選択される温度感受性変異によって誘発されるＤＦＮＢ９難聴に罹患しているティーンエイジャー又は成人である、請求項１に記載の使用のためのベクターシステム。
12. 請求項１～９のいずれか一項に記載のベクターシステムと、薬学的に許容可能なビヒクルとを含む、ＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者を治療するために、又はＤＦＮＢ９変異を有する患者においてＤＦＮＢ９難聴を予防するために使用するための医薬組成物であって、前記患者が、発達及び成熟した聴覚系を有するヒト、例えば、新生児、幼児、小児、ティーンエイジャー又は成人である、前記医薬組成物。

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