ES2960880T3 - Terapia génica mediada por AAV que restaura el gen de la otoferlina - Google Patents
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Abstract
Los presentes inventores informan aquí, en el modelo de ratón DFNB9 (ratones knock-out para OTOF), la primera prueba de principio de que la administración coclear de un ADNc fragmentado a través de un enfoque de vector dual-AAV puede corregir de manera eficaz y duradera la sordera profunda. fenotipo de estos ratones cuando se administra mucho después de que su sistema auditivo haya madurado (P30). Por lo tanto, la presente invención se refiere a un sistema vectorial que permite la expresión del polipéptido de Otoferlina de longitud completa, o de un fragmento funcional del mismo, en células ciliadas internas, para su uso en el tratamiento de pacientes que padecen sordera por DFNB9 o para prevenir la sordera por DFNB9 en pacientes que tienen mutaciones de DFNB9. , en el que dichos pacientes son pacientes que tienen un sistema auditivo desarrollado y maduro, tal como bebés recién nacidos, niños pequeños, lactantes, adolescentes o adultos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Terapia génica mediada por AAV que restaura el gen de la otoferlina
Antecedentes de la invención
Más de la mitad de los casos de sordera congénita profunda no sindrómica tienen una causa genética y la mayoría (~ 80%) son formas autosómicas recesivas (DFNB) (Duman D. & Tekin M,Front Biosci (Landmark Ed)17:2213-2236 (2012)). El diagnóstico genético de la sordera proporciona información esencial para las terapias génicas cocleares y en los últimos años se ha avanzado rápidamente tanto en la precisión como en la accesibilidad de las pruebas genéticas. La identificación de las mutaciones en los genes de la sordera sindrómica puede producirse muchos años antes de la aparición de los síntomas en los pacientes, lo que permite planificar el tratamiento de la enfermedad.
Los genes de la sordera codifican proteínas con una amplia gama de funciones moleculares vitales para el funcionamiento coclear, como el desarrollo del órgano sensorial, la transducción del sonido en los estereocilios de las células ciliadas, el mantenimiento del potencial endococlear (EP, por sus siglas en inglés) y la alta concentración de potasio extracelular, y la neurotransmisión sináptica entre las células ciliadas y las neuronas ganglionares espirales (SGN, por sus siglas en inglés). Entre las principales proteínas fabricadas a partir de los genes de la sordera se encuentran los canales y transportadores de iones, las uniones de huecos y las uniones estrechas, las subunidades proteicas del citoesqueleto y los motores moleculares, y los factores de transcripción que se expresan de forma transitoria en el desarrollo coclear. El hecho de que una mutación afecte al desarrollo coclear temprano y provoque una degeneración celular importante es un factor importante para determinar la “ventana de tiempo de tratamiento”, que es un problema crucial en este campo terapéutico.
Los implantes cocleares protésicos se utilizan actualmente para la rehabilitación (Kral A & O'Donoghue GMN Engl J Med363(15):1438-1450 (2010)), pero la recuperación de la audición dista mucho de ser perfecta, en particular para la percepción del habla en entornos ruidosos o de la música, debido a su limitación inherente de la resolución de frecuencias impuesta por las interferencias eléctricas entre canales.
Una de las principales motivaciones para el desarrollo de tratamientos biológicos es restaurar la audición sin necesidad de implantar ningún dispositivo prostético y conseguir una calidad de resolución del sonido y un costo unitario mucho mejor que el que se puede conseguir actualmente con los implantes cocleares. En particular, se ha propuesto previamente la terapia génica con virus local adenoasociado (AAV) para tratar formas humanas de sordera (Zhang et al,Frontiers in Molecular Neuroscience,vol.11, Art.221,2018).
Utilizando un modelo de ratón con activación del gen Ush1c c.216G>A para estudiar la enfermedad de Usher tipo I C, Pan et al. Nature biotechnology; 35(3):264-272 (2017) probaron si la terapia génica coclear podría utilizarse para dirigirse a las células ciliadas para corregir el fenotipo de la sordera. Un AAV sintético novedoso, Anc80L65, fue capaz de transducir >90% de las células ciliadas. El tratamiento demuestra la preservación morfológica en la cóclea, y que los umbrales auditivos mejoraron en 60-70 dB en comparación con los oídos no tratados cuando se inyectaron vectores virales recombinantes a los P0-P1 (es decir, el día en que los ratones nacen o el día después, que se denominan “días postnatales 0 o 1”). Las mismas inyecciones realizadas a los P10-P12 (es decir, diez o doce días después del nacimiento, justo antes del inicio de la audición, que se produce alrededor del P12 en esta especie) no produjeron ningún efecto del tratamiento (Pan et al. Nature biotechnology; 35(3):264-272 (2017).
Akil et al.Neuron75:283-293 (2012) utilizaron el AAV2/1 para administrar el ADNc del transportador vesicular de glutamato 3(Vglut3)en cócleas de ratones KO neonatales (es decir, días postnatales 1 a 12) con el fin de tratar un trastorno de la transmisión sináptica de las células ciliadas internas. Con base en los datos de la respuesta auditiva del tronco cerebral (ABR, por sus siglas en inglés) y los reflejos de sobresalto acústico, demostraron que la función auditiva en los oídos inyectados se recuperaba en dos semanas.
Estos dos estudios confirman un alivio significativo de la degeneración celular en la cóclea cuando se inyectaron vectores virales recombinantes en etapas postnatales tempranas, es decir, antes de la maduración de las células ciliadas del ratón.
Hasta la fecha, todos los estudios de terapia génica que han evaluado la terapia del oído interno en ratones han concluido que estas terapias no son eficientes en animales adultos. Por lo tanto, existe un consenso de que hay un período crítico para que la terapia génica sea eficaz en la preservación o recuperación de la audición, y que sólo existe una ventana de oportunidad para el tratamiento en ratones en la etapa embrionaria o en la etapa postnatal temprana, es decir, antes de que se produzca la aparición de la audición (Ahmed et al, JARO 18:649-670 (2017).
Es bien sabido que el oído interno de los ratones es todavía estructural y funcionalmente inmaduro al nacer, y que el inicio de la audición tiene lugar en esta especie animal en el día postnatal 12 (P12) para terminar alrededor del día postnatal 20 (P20) (Shnerson y Willott, J. Comp. Physiol. Psychol. 94, 36-40 (1980)). Sin embargo, el inicio y la maduración de la audición se producen en un momento completamente distinto en los seres humanos. De hecho, el oído interno humano es capaz de realizar la función auditiva a partir de los 4.5 meses en el útero y se termina al nacer (véase la figura 6 y Hepper PG & Shahidullah BSArch DisChild71(2):F81-87 (1994)).
Esto significa que los experimentos del estado de la técnica, cuyo objetivo es restaurar las funciones auditivas antes del inicio de la audición o antes del final de la maduración coclear, deberían realizarse en el útero cuando se trasladan a ensayos en seres humanos (figura 6). Sin embargo, hasta ahora no se ha tratado a ningún ser humano con terapia génica de células ciliadas, porque se consideraba imposible restaurar la audición en la etapa postnatal o en la infancia (es decir, cuando el sistema auditivo es totalmente maduro y funcional).
No obstante, el objetivo último de la terapia génica coclear es el tratamiento de la sordera genética común en los seres humanos después de que se pueda detectar o diagnosticar una posible sordera inducida genéticamente, es decir, la mayoría de las veces, después de su nacimiento.
De hecho, no es posible desarrollar protocolos de terapia génica que impliquen la administración en el útero de tratamientos en la cóclea, porque es probable que esta operación quirúrgica induzca una serie de efectos secundarios, entre ellos una pérdida de audición definitiva (Zhang et al,Frontiers in Molecular Neuroscience,vol.11, Art.221,2018). Además, es bien sabido que las sorderas DFNB se diagnostican típicamente en humanos durante el periodo neonatal, es decir, después del nacimiento, entre 0 y 4 meses.
Por lo tanto, para ser transponibles a los seres humanos, los enfoques de terapia génica deben ser evaluados y eficaces para revertir el fenotipo de sordera establecido que afecta a los sistemas auditivos maduros, por ejemplo, cuando se administran a ratones en días postnatales > P20 (correspondientes a los seres humanos jóvenes o adultos).
Esta será la única forma de identificar tratamientos cuya ventana temporal sea compatible con la ética y el bienestar humanos, ya que pueden administrarse en humanos postnatales, infantiles y adultos, en los que el sistema auditivo está completo.
Descripción detallada de la invención
Los presentes inventores han desarrollado estudios alternativos con el fin de identificar tratamientos que tengan una posibilidad realista de prevenir o revertir eficazmente la pérdida de audición en un sujeto, especialmente un humano, en el que el sistema auditivo, especialmente la cóclea, esté maduro, pero sin implicar la administración de genes embrionarios. En este contexto, se ha podido demostrar que la expresión recombinante de la proteína Otoferlina en las células ciliadas internas es capaz de restaurar la audición en ratones modelo tratados en días postnatales > P20 (correspondientes a los humanos jóvenes o adultos).
La otoferlina se expresa abundantemente en las células ciliadas internas (ICH) sensoriales de la cóclea. También se expresa en otras células del sistema nervioso central. Desempeña un papel clave en los pasos finales de la fusión de vesículas sinápticas en las sinapsis de las células ciliadas cocleares con las neuronas aferentes del ganglio espiral. Más concretamente, es importante para la exocitosis en la sinapsis de la cinta auditiva (Roux et al, Cell 127(2):277-89, 2006).
En los seres humanos, las mutaciones que afectan al gen de laOtoferlina(“genOTOF’)resultan en una grave pérdida bilateral no sindrómica de la audición que se produce después del nacimiento pero antes del desarrollo del lenguaje. Algunos de ellos también resultan en a una neuropatía auditiva no sindrómica sensible a la temperatura, que se desencadena cuando la temperatura corporal aumenta de manera importante (por ejemplo, en caso de fiebre, véase Marlin S. et al,Biochemical and Biophysical Research Communications,394 (2010) 737-742 y Varga R. et al,J. Med. Genet2006; 43:576-581). Hasta ahora se han identificado al menos 60 mutaciones (véase la figura 7), entre las que se sabe que 5 son termosensibles (P.Q994VfsX6, P.I515T, p.G541S, PR1607W, p.E1804del como se describe en Pangrsic T. et al,Trends in Neurosciences,2012, col.35, No.11).
Estos dos fenotipos de sordera (constitutiva e inducible) se encuentran en todo el mundo y se conocen como sordera “autosómica recesiva 9” o “DFNB9”.
La sordera DFNB9 representa hasta el 8% de las pérdidas auditivas autosómicas recesivas no sindrómicas en algunas poblaciones occidentales, por lo que se encuentra entre los cinco principales trastornos auditivos genéticos que aún requieren una intervención terapéutica.
Los presentes inventores informan en la presente, en el modelo de ratón DFNB9 (ratones con el gen OTOF desactivado), de la primera prueba de principio de que la administración coclear de un ADNc fragmentado mediante un enfoque de vector dual-AAV puede corregir de forma eficaz y duradera el fenotipo de sordera profunda de estos ratones cuando se administra mucho después de que su sistema auditivo haya madurado (P30). Este resultado sugiere que la ventana terapéutica para la transferencia local de genes en pacientes con sordera congénita debida a DFNB9 es de hecho más larga de lo que se sospechaba inicialmente.
De hecho, la administración de los vectores de la invención, cada uno de los cuales proporciona una porción del genOTOFy permite la expresión de la proteína OTOF de longitud completa en las células ciliadas internas transfectadas de los ratones con el OTOF inactivado en los últimos días postnatales (P30), conduce a mejores resultados que cuando se tratan ratones más jóvenes.
Esto es muy sorprendente dado que se enseñó en una serie de estudios que la ventana terapéutica para la transferencia local de genes en ratones afectados por sordera genética era embrionaria o en los primeros días postnatales (Ahmed et al, JARO 18:649-670 (2017); Zhang et al,Frontiers in Molecular Neuroscience,vol.11, Art.221, 2018).
Se sabe que, en los ratones, la gama completa de frecuencias de respuesta puede observarse hacia P14 (es decir, catorce días después del nacimiento). Las latencias de respuesta y los intervalos entre picos maduran rápidamente en el transcurso de la segunda y tercera semanas postnatales y alcanzan características similares a las de los adultos a los P18 (Song L. et al,J Acoust Soc Am119(4):2242-2257 (2006)). Por lo tanto, a P30, el sistema auditivo de los ratones está completamente maduro. Corresponde al sistema auditivo de un bebé o de un humano adulto (véase la figura 6).
Por lo tanto, los resultados obtenidos por los inventores sugieren que la terapia génica utilizada en la presente invención puede ser eficaz en humanos no sólo en una ventana temporal prenatal, sino también en pacientes infantiles a los que se les diagnostica sordera congénita DFNB9, o en pacientes adultos a los que se les diagnostica más tarde, por ejemplo, por ser portadores de mutaciones termosensibles en el genOTOF.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un sistema vectorial que comprende al menos dos partículas de AAV, comprendiendo cada una de ellas un polinucleótido que comprende una secuencia codificadora parcial que codifica i) la parte N-terminal del polipéptido de Otoferlina o de un fragmento funcional del mismo, por un lado, y ii) la parte C-terminal del polipéptido de Otoferlina o de un fragmento funcional del mismo, por el otro, permitiendo dicho sistema vectorial la expresión del polipéptido de Otoferlina de longitud completa, o de un fragmento funcional del mismo, en el interior células ciliadas, para uso en el tratamiento de pacientes que sufren de sordera DFNB9 o para prevenir la sordera DFNB9 en pacientes que tienen mutaciones de DFNB9, en el que dichos pacientes son humanos que tienen un sistema auditivo desarrollado y maduro, en en el que dichos pacientes son preferentemente niños pequeños, bebés, adolescentes o humanos adultos.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término “Otoferlina” designa al polipéptido Otoferlina. En el presente documento se abrevia como “OTOF”. Este polipéptido es conocido también como “AUNB1”; “DFNB6”; “DFNB9”; “NSRD9” y “FER1L2”.
La longitud completa de la isoforma 1 del polipéptido Otoferlina humano de tipo silvestre se muestra en la SEQ ID NO:1 (que corresponde al número AF183185.1 de Genbank). Este polipéptido es un miembro de la familia Ferlina de las proteínas transmembrana, que tiene dominios C2 como sinaptotagminas, PKC y PLC. Esta forma larga contiene seis dominios C2. Como se ha mencionado anteriormente, está implicada en fusión de vesículas sinápticas entre las células ciliadas cocleares y diferentes neuronas de ganglios espirales (Roux et al, Cell 127(2):277-89, 2006; Michalski et al, Elife, 2017 Nov 7;6 e31013).
El término “polipéptido Otoferlina” designa el polipéptido Otoferlina de la SEQ ID NO:1 y sus secuencias homólogas, que retienen al menos una función biológica del polipéptido Otoferlina que es de interés en el presente contexto. Por ejemplo, esta función biológica está relacionada con la modulación de la fusión de vesículas en las sinapsis de la cinta de células ciliadas internas de la cóclea que activan las neuronas auditivas primarias (Roux et al 2006; Michalski et al, Elife, 2017 Nov 7;6 e31013). Esta modulación podría evaluarse con medidas electrofisiológicas clásicasex vivo.
En una realización preferida, el sistema de vectores para uso de acuerdo con la invención permite la expresión de un polipéptido homólogo cuya secuencias de aminoácidos comparte al menos 70% de identidad y/o similitud con la SEQ ID NO:1. Dicha secuencia homóloga comparte más preferentemente al menos 75% y aún más preferentemente al menos 80% o al menos 90% de identidad y/o similitud con la SEQ ID NO:1. Cuando el polipéptido homólogo es mucho más corto que la SEQ ID NO:1, entonces se puede considerar el alineamiento local.
Dicho polipéptido homólogo puede tener, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:5 (que corresponde al número NP_001274418 de Genbank). Dicha secuencia caracteriza la isoforma e (variante 5) del polipéptido Otoferlina humano de tipo silvestre. Esta isoforma e está codificada por la variante del ADNc que tiene la secuencia SEQ ID NO:22. Esta variante carece de un exón en marco alterno en la región de codificación 3' y utiliza un codón de parada corriente abajo comparado con la SEQ ID NO.1. Codifica un extremo C distinto de acuerdo con lo comparado con la SEQ ID NO:1 (pero su extremo C es el mismo).
Dicho polipéptido homólogo puede tener también la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:6 (que corresponde al número NP_004793.2 de Genbank) o la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO:24 (que corresponde al número NP_919303.1 de Genbank) correspondientes a las isoformas cortas b y c (variantes 2 y 3) respectivamente. Con más precisión, la SEQ ID NO:6 representa la isoforma b (variante 2, también denominada “forma corta 1”) que tiene un extremo N más corto y carece de un segmento al compararla con la SEQ ID NO:1. Por otra parte, la SEQ ID NO:24 representa la isoforma c (variante 3, también denominada “forma corta 2”), que difiere en su 5' UTR y la secuencia codificadora en comparación con la variante 1 (SEQ ID NO:1) debido a que tiene un extremo más corto y distinto comparado con la SEQ ID NO:1.
Dicha secuencia homóloga puede ser, por ejemplo, el polipéptido Otoferlina de otras especies animales, tal como la SEQ ID NO:7, que es la isoforma 1 de longitud completa de ratón del polipéptido Otoferlina (que corresponde al número NP_001093865.1 de Genbank). Esta isoterma está codificada por el ADNc de la SEQ ID NO:16 (NM_1100395).
En el contexto de la invención, cuando el porcentaje de identidad entre dichas dos secuencias homólogas se puede identificar por un alineamiento global de las secuencias en su totalidad (por ejemplo, cuando las secuencias tienen aproximadamente el mismo tamaño), este alineamiento se puede realizar por medio de un algoritmo que es bien conocido por el técnico en la materia, tal como el divulgado en Needleman y Wunsch (1970), Por consiguiente, las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de nucleótidos se puede realizar, por ejemplo, utilizando cualquier software conocido por el técnico en la materia, tal como software de “aguja” utilizando el parámetro de “hueco abierto” de 10, el parámetro de “extensión de hueco” de 0.5 y la matriz “Blosum 62”.
Cuando se debe considerar el alineamiento local de las secuencias (por ejemplo, en el caso de homólogos que tienen un tamaño más pequeño que las secuencias de la invención), entonces dicho alineamiento se puede realizar por medio de un algoritmo convencional, tal como el divulgado en Smith y Waterman (J. Mol. Evol. 1981; 18(1) 38-46).
La invención proporciona sistemas que codifican las secuencias de aminoácidos que son “similares” a la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:5 o la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO:24. La “similitud” de dos secuencias de aminoácidos blanco puede determinarse calculando una puntuación de similitud para las dos secuencias de aminoácidos. Tal y como se utiliza en la presente, la “puntuación de similitud” se refiere a la puntuación generada para las dos secuencias utilizando la matriz de sustitución de aminoácidos BLOSUM62, una penalización de existencia de huecos de 11 y una penalización de extensión de huecos de 1, cuando las dos secuencias están alineadas de forma óptima. Dos secuencias están “óptimamente alineadas” cuando se alinean para que se produzca la máxima puntuación posible para ese par de secuencias, lo que podría requerir la introducción de huecos en una o ambas secuencias para lograr esa máxima puntuación. Dos secuencias de aminoácidos son sustancialmente similares si su puntuación de similitud supera un valor umbral determinado. El valor umbral puede ser cualquier número entero que vaya desde al menos 1190 hasta la puntuación más alta posible para una secuencia de referencia concreta (por ejemplo, la SEQ ID NO:1). Por ejemplo, el puntaje del umbral de similitud puede ser 1190, 1200, 1210, 1220, 1230, 1240, 1250, 1260, 1270, 1280, 1290, 1300, 1310, 1320, 1330, 1340, 1350, 1360, 1370, 1380, 1390, 1400, 1410, 1420, 1430, 1440, 1450, 1460, 1470, 1480, 1490, 1500, o más alto. Si en una realización particular de la invención, la puntuación del umbral se configura, por ejemplo, en 1300 y la secuencia de referencia es la SEQ ID NO:1, entonces cualquier secuencia de aminoácidos que se puede alinear de manera óptima con la SEQ ID NO:1 para generar una puntuación de similitud mayor a 1300 es “similar” a la SEQ ID NO:1. Las matrices de sustitución de aminoácidos y su uso para cuantificar la similitud entre dos secuencias son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Dayhoff et al. (1978), “A model of evolutionary change in proteins”, “Atlas of Protein Sequence and Structure,” Vol. 5, Suppl. 3 (ed. M. O. Dayhoff), p. 345-352. Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C. and in Henikoff et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919. Aunque la alineación y la puntuación óptimas pueden realizarse manualmente, el proceso se facilita mediante el uso de un algoritmo de alineación implementado por ordenador, por ejemplo, el “gapped BLAST 2.0”, descrito en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, y se puso a disposición del público en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica. Para generar puntuaciones de similitud exactos utilizando NCBI BLAST, es importante desactivar la filtración, por ejemplo, filtración por baja complejidad y desactivar el uso de las estadísticas basadas en la composición. Se debe confirmar que se utilicen la matriz de sustitución correcta y las penalidades por huecos. Los alineamientos óptimos, incluidos los alineamientos múltiples, se pueden preparar usando, por ejemplo, PSI-BLAST, disponible a través del sitio de Internet de NCBI y descrito por Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.
En otra realización, el sistema de vectores para uso de acuerdo con la invención puede permitir la expresión de un fragmento funcional del polipéptido Otoferlina. El término “fragmento funcional” en el presente documento designa cualquier fragmento del polipéptido Otoferlina humano o cualquier fragmento de un polipéptido que tenga una secuencia homóloga como se definió anteriormente, en la que dicho fragmento retiene al menos una función biológica del polipéptido Otoferlina que es de interés en el presente contexto. Por ejemplo, esta función biológica está relacionada con la modulación de la fusión de vesículas en las sinapsis de la cinta de células ciliadas internas de la cóclea que activan las neuronas auditivas primarias (Roux et al 2006; Michalski et al, Elife, 2017 Nov 7;6 e31013). Esta modulación podría evaluarse con medidas electrofisiológicas clásicasex vivo.
Por ejemplo, dicho fragmento funcional puede tener la secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 6 (correspondiente a la isoforma b que tiene el número NP_004793.2 de Genbank) o en la SEQ ID NO: 24 (correspondiente a la isoforma c que tiene el número NP_919303.1 de Genbank). Dichas secuencias caracterizan isoformas cortas del polipéptido Otoferlina humano de tipo silvestre, que comprende solo tres dominios C2.
En este aspecto de la invención, el sistema de vectores para uso de acuerdo con la invención se administra a pacientes que padecen sordera DFNB9. Por “pacientes que padecen sordera DFNB9”, se entiende en la presente un paciente, especialmente un paciente humano, que se cree que tiene (o se ha diagnosticado que tiene) una mutación en el gen constitutivo de la Otoferlina, dicha mutación desencadena una expresión anormal, una función o ambas, de la proteína Otoferlina. En una realización particular, dicha mutación puede ser termosensible.
Hasta la fecha, se han notificado más de 60 mutaciones patogénicas en la otoferlina (véase la Figura 7). Entre ellas hay al menos cinco mutaciones termosensibles, identificadas en pacientes afectados por sordera episódica condicionada por la fiebre (P.Q994VfsX6, P.I515T, p.G541S, PR1607W, p.E1804del).
Estos pacientes se pueden identificar por el médico experto, por ejemplo, utilizando una combinación de pruebas electrofisiológicas de las respuestas auditivas del tronco cerebral (ABR) y/o pruebas genéticas para identificar mutaciones en el gen OTOF. En algunas realizaciones, el paciente tiene una o más de las siguientes mutaciones sin sentido o con sentido erróneo en el gen OTOF: TYR730TER, GLN829TER, PR01825ALA, PRO50ARG, LEU1011PRO, ILE515THR, ARG1939GLN o GLY541SER. En algunas realizaciones, el paciente tiene una transición de A a G en la unión del intrón 8/exón 9 (IVS8-2A-G) o una transición de G a A en la posición 1, el primer nucleótido intrónico en el sitio donante de empalme del exón 5 o una transversión de G a C en el sitio donante de empalme del intrón 39. En algunas realizaciones, el paciente tiene una deleción de pares de bases (1778G) en el exón 16 que lleva a un codón de parada, y un cambio 6141G-A, lo que resulta en una sustitución de ARG a GLN en el exón 48.
Los pacientes a los que se administra el sistema de vectores para uso de acuerdo con invención son pacientes, especialmente humanos, en los que el sistema auditivo, especialmente la cóclea, ya está desarrollado y maduro. Estos pacientes, especialmente los pacientes humanos, no son, por lo tanto, embriones o fetos humanos, ya que la administración no está destinada a realizarse en el útero. De acuerdo con la figura 7, los pacientes a los que se dirige la presente invención son preferentemente bebés humanos recién nacidos, normalmente menores a 6 meses, o incluso menores a 3 meses, si la sordera DFNB9 se diagnostica tan joven. Estos bebés humanos tienen preferentemente entre 3 meses y 1 año.
Cabe señalar que la cóclea humana en su conjunto alcanza un tamaño adulto entre las 17 y las 19 semanas de gestación y es totalmente madura desde el punto de vista morfológico a las 30-36 semanas (lo que corresponde a 12 días después del nacimiento en el ratón). La maduración funcional de la sinapsis de la cinta de la célula ciliada interna puede evaluarse mediante el seguimiento de la onda I del registro de ABR, que puede registrarse aproximadamente a la semana 28 de gestación en los seres humanos. Los registros y los análisis de la onda I de la a Br (que refleja la función de las sinapsis de las células ciliadas internas con las neuronas auditivas primarias) han mostrado una maduración funcional completa en los bebés humanos al nacer (lo que corresponde a 20 días después del nacimiento en el ratón). Esto es bien conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Pujol et Lavigne-Rebillard, Acta oto-laryngologica. Supplementum ■ Febrero de 1991).
Por lo tanto, también es posible administrar el sistema de vectores para uso de acuerdo con la invención a pacientes humanos de mayor edad, como niños pequeños (de 2 a 6 años), bebés (de 6 a 12 años), adolescentes (de 12 a 18 años) o humanos adultos (de 18 años en adelante).
En conjunto, se prefiere por lo tanto administrar el sistema de vectores para uso de acuerdo con la invención a pacientes humanos de entre 3 meses y 25 años.
Los pacientes de la invención son, en particular, bebés humanos diagnosticados como afectados por la sordera DFNB9 después del desarrollo del lenguaje.
En otra realización particular, los pacientes de la invención son seres humanos de 6 años o más, es decir, la administración del tratamiento se produce cuando su Sistema Nervioso Central está completamente maduro (véase la figura 7).
En una realización particular, el sistema de vectores para uso de acuerdo con la invención se administra a pacientes humanos que padecen sordera DFNB9 inducida por mutaciones termosensibles, preferentemente a adolescentes o humanos adultos que portan al menos una de las mutaciones termosensibles de la Otoferlina mencionadas anteriormente.
Tal y como se utiliza en la presente, el término “que trata” se refiere a la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de uno de los sistemas de vectores de la invención a un paciente que padece sordera DFNB9, con el fin de recuperar parcial o totalmente la audición en dicho paciente. Dicha recuperación puede evaluarse probando las respuestas auditivas del tronco cerebral (ABR) con dispositivos electrofisiológicos. “Tratamiento de la sordera DFNB9” pretende designar en particular el restablecimiento completo de la función auditiva, independientemente de los mecanismos celulares implicados.
En el caso de los pacientes portadores de mutaciones termosensibles, el sistema de vectores también puede administrarse para prevenir la pérdida de audición inducida por la modulación de la temperatura corporal. En el contexto de la presente invención, el término “que previene” designa deteriorar o retrasar la pérdida de audición dentro del rango de frecuencia audible.
En estos y otros pacientes con DFNB9, el sistema de vectores puede administrarse tanto para prevenir la pérdida de audición antes de que se produzca, como para restaurar la capacidad auditiva cuando ya se ha producido una pérdida de audición.
Se han explorado múltiples vías de administración al oído interno. Estos incluyen la inyección en los espacios perilinfáticos a través de la membrana de la ventana redonda (RWM, por sus siglas en inglés) y a través de la ventana oval, y la inyección en la rampa timpánica o la rampa vestibular mediante cocleostomía. Se ha demostrado la distribución a lo largo de los espacios perilinfáticos para todas estas vías de administración. Además, se ha demostrado que el flujo de advección a través de la cóclea y los órganos vestibulares puede facilitar la distribución de agentes terapéuticos desde el lugar de la inyección a regiones más distantes del oído interno. La liberación en los espacios endolinfáticos también se ha explorado mediante cocleostomía en la escala media, mediante canalostomía y mediante inyección en el saco endolinfático. Estos enfoques también han producido una amplia distribución, pero enfrentan el desafío adicional de romper la barrera entre la endolinfa y la perilinfa con alto contenido de potasio. La ruptura de la barrera plantea dos problemas potenciales. En primer lugar, la fuga de potasio elevado a los espacios perilinfáticos que bañan la superficie basolateral de las células ciliadas y las neuronas puede despolarizar estas células de forma crónica y provocar la muerte celular. En segundo lugar, la ruptura de las uniones estrechas entre la endolinfa y la perilinfa puede provocar una disminución del potencial endococlear, que normalmente oscila entre 80 y 120 mV. El agotamiento del potencial endococlear reduce la fuerza impulsora de la transducción sensorial en las células ciliadas y, por lo tanto, conduce a una sensibilidad coclear reducida y umbrales auditivos elevados. Evitar estas complicaciones es particularmente difícil en la cóclea adulta. Sin embargo, al apuntar a los espacios endolinfáticos en el sistema vestibular, que no tienen un potencial endolinfático, pero son continuos con los espacios de la endolinfa coclear, estos problemas de confusión pueden minimizarse mientras se sigue proporcionando una distribución suficiente dentro de la cóclea (Ahmed et al, JARO 18:649-670 (2017)).
La cóclea está altamente compartimentada y separada del resto del cuerpo por la barrera hematococlear (BCB), que minimiza el volumen de inyección terapéutica y la fuga al sistema circulatorio general del cuerpo, para proteger el privilegio inmunológico coclear y reducir la posibilidad de respuestas inmunes adversas sistémicas. Como las células ciliadas y las células de soporte de la cóclea normalmente no se dividen, las células de la cóclea permanecen estables, por lo que es posible utilizar vectores virales no integradores (por ejemplo, AAV) para una expresión transgénica sostenida.
El enfoque semicircular se ha sugerido como una ruta de inyección prometedora para la futura terapia génica coclear en ensayos con humanos, ya que el canal semicircular posterior también parece ser accesible en los seres humanos (Suzuki et al., Sci. Rep. 7:45524 (2017); Yoshimura et al., Sci. Rep. 8:2980 (2018).
En una realización preferida de la invención, el sistema de vectores se administra en el oído humano a través de una de las dos técnicas comunes y bien establecidas que se utilizan rutinariamente en la práctica quirúrgica otológica clínica. Más concretamente, estos enfoques se adoptarán para dirigirse a los espacios perilinfáticos. Para ello, las inyecciones mediante un microcatéter se llevarán a cabo a través de la ventana oval mediante estapedotomía láser (trans-estapedotomía) o ventana transmastoidea / trans-redonda (Dai C. et al, JARO, 18:601-617, 2017).
También es posible la administración sistémica mediante inyecciones o infusiones intravenosas.
El sistema de vectores para uso de acuerdo con la invención contiene al menos un vector de polinucleótidos que puede desencadenar la expresión del polipéptido Otoferlina de longitud completa, o un fragmento funcional del mismo, en las células ciliadas internas. Preferentemente, dicho vector de polinucleótidos contiene una secuencia codificadora que codifica dicho polipéptido, o un fragmento funcional del mismo, que está operativamente relacionado con un promotor que permite la expresión del gen en dichas células específicamente.
Dicha secuencia codificadora es, por ejemplo, el gen humano de laOtoferlinade la SEQ ID NO: 2, que corresponde a la secuencia de ADNc de la isoforma 1 del gen humano de la otoferlina de tipo silvestre (NM_194248.2 = isoforma a o variante 1 , que es la isoforma más larga).
Dicha secuencia codificadora también puede ser la secuencia de ADNc más corta NM_001287489.1 (isoforma e o variante 5) de la SEQ ID NO:22, la secuencia de ADNc NM_004802.3 (isoforma b o variante 2), la secuencia de ADNc NM_194322.2 (isoforma c o variante 3), o la secuencia de ADNc NM_194323.2 (isoforma d o variante 4).
Se han desarrollado varios vectores víricos y no víricos para la administración de material genético en diversos tejidos y órganos. En la mayoría de los casos, estos vectores son incompetentes para la replicación y suponen una pequeña amenaza de enfermedad inducida por el virus. Más bien, el genoma viral se ha suprimido parcial o totalmente, ampliando la capacidad de permitir la inclusión de carga de ADN terapéutico dentro de la cápside viral. Algunos vectores incluyen ADN monocatenario, mientras que otros incluyen ADN bicatenario. Los vectores particularmente preferidos en el contexto de la invención son los vectores lentivirales, los vectores de adenovirus, los virus adenoasociados (AAV) como se divulga en Ahmed et al, JARO 18:649-670 (2017).
Específicamente, los AAV son pequeños virus dependientes de adenovirus de replicación de la familiaParvoviridae.Tienen una cápside icosaédrica de 20-25 nm de diámetro y un genoma de 4.8 kb flanqueado por dos repeticiones terminales invertidas (ITR). Después de desencapsularse en una célula hospedera, el genoma del AAV puede persistir en un estado de episoma estable formando concatámeros circulares cabeza-cola de alto peso molecular, o puede integrarse en el genoma de la célula hospedera. Ambos escenarios proporcionan una expresión transgénica de alto nivel y a largo plazo.
El AAV parece ser un virus prometedor para las terapias génicas cocleares con base en los resultados obtenidos en los ensayos en humanos de la terapia génica ocular. Las razones del éxito del AAV en la terapia génica ocular humana incluyen: (1) perfil de seguridad evaluado (un número alto de ensayos en humanos han demostrado que el AAV carece de patogenicidad y posee una inmunogenicidad muy baja), (2) expresión de transgenes de larga duración en células que no se dividen, (3) el pequeño tamaño del AAV (“ 20 nm, que es cinco veces más pequeño que los adenovirus) ayuda a la difusión a través de las barreras celulares para alcanzar las células blanco (Zhang et al,Frontiers in Molecular Neuroscience,vol.11, Art.221,2018).
El sistema de vectores para uso ed acuerdo con la invención comprende al menos dos partículas AAV, cada una de ellas con un polinucleótido que comprende una secuencia codificadora parcial que codifica i) la parte N-terminal del polipéptido Otoferlina, o de un fragmento funcional del mismo, para una, y ii) la parte C-terminal del polipéptido Otoferlina, o de un fragmento funcional del mismo, para la otra.
Hasta la fecha se han caracterizado doce serotipos naturales de AAV humanos. Estos serotipos tienen diferentes tropismos inherentes y eficiencias de transducción en músculos, pulmón, hígado, cerebro, retina y vasculatura. Múltiples intentos de pseudotipado del AAV y de ingeniería de la cápside han permitido mejorar considerablemente el tropismo y la eficacia de la transducción. En cuanto a las células del oído interno, se demostró que los AAV1-4, 7 y 8 infectanin vivoel limbo espiral, el ligamento espiral y las células ganglionares espirales. También se demostró la infección de las IHC por los AAV1-3, 5, 6 y 8. El<a>A<v>1 fue el más eficaz y ocasionalmente infectó las OHC y las células de soporte. Asimismo, el AAV5 demostró ser eficaz para las células Claudius, el ganglio espiral y las células del surco interno. Entre los vectores pseudotipados, se descubrió que el AAV2/1 transducía eficazmente las células progenitoras que resultan en las IHC y las OHC en la cóclea de ratón, y el AAV2/2 era óptimo para las IHC de la cóclea de cobaya (Ahmed et al, JARO 18:649-670 (2017)).
Por consiguiente, en una realización preferida, el sistema de vectores contiene un vector de AAV seleccionado en el grupo que consiste en: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 y AAV10.
En una realización más preferida, el serotipo de dicho vector es AAV2, AAV8, AAV5 o AAV1. En una realización aún más preferida, el serotipo de dicho vector es AAV2 o AAV8. AAV8, que es el serotipo más preferido en el contexto de la presente invención, se analiza actualmentein vivo.
Para aumentar la eficacia de la expresión génica y evitar la propagación involuntaria del virus, se pueden realizar modificaciones genéticas del AAV. Estas modificaciones genéticas incluyen la supresión de la región E1, la supresión de la región E1 junto con la supresión de la región E2 o E4, o la supresión de todo el genoma del adenovirus excepto las repeticiones terminales invertidas de acción cis y una señal de empaquetamiento. Tales vectores están ventajosamente incluidos en la presente invención.
Además, pueden utilizarse AAV modificados genéticamente que tengan una proteína de cápside mutada para dirigir la expresión del gen hacia un tipo de tejido concreto, por ejemplo, a las células auditivas. Para ello, se pueden utilizar vectores AAV modificados de los serotipos 2 y 8 en los que los residuos de tirosina de la envoltura viral se sustituyen por residuos de alanina. En el caso del serotipo-2 mutante en tirosina, la tirosina 444 puede sustituirse por alanina (AAV2-Y444A). En el caso del serotipo 8, la tirosina 733 puede sustituirse por un residuo de alanina (AAV8-Y733A). Utilizando AAV2-Y444A o AAV8-Y733A, es posible aumentar la transferencia de genes hasta 10,000 veces, disminuyendo la cantidad de AAV necesaria para infectar las células ciliadas sensoriales de la cóclea.
En una realización preferida, el polinucleótido o polinucleótidos que expresan el polipéptido o gen de laOtoferlinao un fragmento funcional del mismo, está contenido en partículas recombinantes de AAV2 en las que todos los residuos de tirosina han sido sustituidos por residuos de fenilalanina (AAV2 (Y->F) o Quad Y-F, como se divulga en Petrs-Silva H et al,Mol. Ther.19, 293-301 (2011) y en los ejemplos a continuación. Los residuos de tirosina mutados en la superficie exterior de las proteínas de la cápside incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, mutaciones de Tyr252 por Phe252 (Y252F), Tyr272 por Phe272 (Y272F), Tyr444 por Phe444 (Y444F), Tyr500 por Phe500 (Y500F), Tyr700 por Phe700 (Y700F), Tyr704 por Phe704 (Y704F), Tyr730 por Phe730 (Y730F) y Tyr733 por Phe733 (Y733F). Estos vectores modificados facilitan la penetración del vector a través de las membranas de la ventana redonda, lo que permite la entrega no invasiva de los vectores a las células ciliadas/neuronas ganglionares espirales de la cóclea. Estos vectores mutados evitan la degradación por el proteasoma, y su eficacia de transducción aumenta considerablemente.
Otras partículas de AAV recombinante que se derivan de los serotipos naturales 1-10 incluyen los híbridos AAV2-AAV3, AAVrh.10, AAVhu.14, AAV3a/3b, AAVrh32.33, AAV-HSC15, AAV-HSC17, AAVhu.37, AAVrh.8, CHt-P6, AAV2.5, AAV6.2, AAV2i8, AAV-HSC15/17, AAVM41, AAV9.45, AAV6 (Y445F/Y731F), AAV2.5T, AAV-HAE1/2, clona 32/83 de AAV, AAVShH10, AAV8 (Y733F), AAV2.15, AAV2.4, AAVM41, y AAVr3.45 (Asokan A. et al,Mol. Therapy,vol.20 n°4, 699-708, 2012).
También es posible utilizar el vector sintético Anc80L65, que ha demostrado tener la mayor eficiencia para la transducción de células ciliadas del oído interno reportada hasta la fecha (Suzuki et al., Sci. Rep. 7:45524 (2017)). También es posible utilizar AAV asociados a exosomas, como lo proponen Gyorgy et al, Mol. Ther. 25(2):379-391, 2017.
También es posible utilizar vectores AAV/PHP.B sobrecargados cuyas cápsides se han modificado para mejorar su capacidad de empaquetamiento.
Los procedimientos para preparar virus y viriones que comprenden un polinucleótido o construcción heteróloga son conocidos en la técnica. En el caso del AAV, las células pueden coinfectarse o transfectarse con adenovirus o construcciones de polinucleótidos que comprenden genes de adenovirus adecuados para la función de ayudante del AAV. Los ejemplos de materiales y procedimientos se describen, por ejemplo, en los la patentes estadounidenses 8,137,962 y 6,967,018.
El técnico en la materia determinaría fácilmente si es necesario, antes de la administración del vector o vectores de la invención, mejorar la permeabilidad de la membrana de la ventana redonda como se propone en el documento WO 2011/075838, dependiendo de la célula blanco.
Incluso cuando se utiliza el AAV, el sistema puede ser un sistema de un solo vector. En este caso, pueden utilizarse cápsides modificadas (cf. vectores AAV/PHP.B).
Si la cápside de AAV elegida tiene una capacidad de empaquetamiento limitada de 5 kilobases, es mejor utilizar sistemas de vectores duales, como se divulga, por ejemplo, en el documento WO 2013/075008, que se incorpora en la presente por referencia.
Los presentes inventores han utilizado dicho enfoque de vector dual-AAV para proporcionar las dos medias partes del gen de la Otoferlina a las células ciliadas internas, donde se produce una recombinación homóloga y se expresa la proteína de longitud completa. Sus resultados muestran que los dos vectores AAV distintos son capaces de transducir eficazmente las células ciliadas internas blanco, donde se produce la proteína Otoferlina y restablece de forma duradera el fenotipo de sordera profunda de los ratones OTOF KO que padecen sordera congénita por invalidación de DFNB9.
Por consiguiente, el sistema de vectores para uso de acuerdo con la invención comprende preferentemente al menos dos partículas AAV, cada una de dichas partículas AAV comprende:
a) un primer polinucleótido que comprende una repetición terminal invertida en cada extremo de dicho polinucleótido, y, entre dichas repeticiones terminales invertidas, de 5' a 3': un promotor adecuado seguido de una secuencia codificadora parcial que contiene la parte N-terminal del gen de laOtoferlina,y un sitio donante de empalme, o
b) un segundo polinucleótido que comprende una repetición terminal invertida en cada extremo de dicho polinucleótido, y, entre dichas repeticiones terminales invertidas, de 5' a 3': un sitio aceptor de empalme, una secuencia codificadora parcial que contiene la parte C-terminal del gen de laOtoferlina,opcionalmente seguida de una secuencia de poliadenilación,
en el que dichos primero y segundo polinucleótidos contienen también una secuencia recombinante que está situada después del sitio donante de empalme en dicho primer polinucleótido y antes del sitio aceptor de empalme en dicho segundo polinucleótido, y
en el que las secuencias codificadoras en el primer y segundo polinucleótidos, cuando se combinan, codifican la longitud completa del polipéptido Otoferlina.
Esta realización preferida utiliza un “primero” y un “segundo” polinucleótido. Sin embargo, se entiende que “primero” y “segundo” no implican un orden o importancia particular, a menos que se indique expresamente lo contrario.
Como se explica en la figura 1 y en el documento WO 2013/075008, los primero y segundo polinucleótidos utilizados en esta realización particular deben contener componentes genéticos específicos para inducir la recombinación y la expresión adecuadas de la proteína Otoferlina en las células blanco.
Estos componentes específicos son los siguientes:
• ITR
En alguna realización de la invención, el ADNc parcial o de longitud completa del gen OTOF se inserta en dos plásmidos que contienen ITR.
En alguna realización de la invención, el ADNc parcial o de longitud completa del gen OTOF se inserta en dos plásmidos que contienen ITR.
Si se utilizan vectores AAV, las secuencias ITR de un polinucleótido descrito en el presente documento pueden derivarse de cualquier serotipo de AAV (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) o pueden derivarse de más de un serotipo. En algunas realizaciones, el polinucleótido proporcionado en la presente, las secuencias de ITR están derivadas de AAV2. Las secuencias ITR y los plásmidos que contienen secuencias ITR son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente.
Una secuencia ITR de AAV2 ejemplar para flanquear el extremo 5' de una construcción de expresión comprende la secuencia SEQ ID NO:10. Una secuencia ITR de AAV2 ejemplar para flanquear el extremo 3' de una construcción de expresión comprende la secuencia SEQ ID NO:11.
Tales ITR también pueden utilizarse ventajosamente si el polinucleótido de la invención es un sistema de vectores único.
• Un promotor adecuado
Los promotores contemplados para su uso en el sistema de vectores incluyen, pero no se limitan a, el promotor del citomegalovirus (CMV), promotor del SV40, promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), promotor quimérico del CMV/de la beta-actina de pollo (CBA) y la forma truncada del CBA (smCBA) (patente estadounidense núm. 8,298,818). En una realización específica, el promotor es un promotor quimérico que comprende el CMV y el promotor de betaactina.
En una realización preferida, el promotor utilizado en el sistema de vectores para uso de acuerdo con la invención es el promotor quimérico truncado de CMV p actina (smcBA) de la SEQ ID NO:8 o un promotor que comprende una identidad de secuencia de al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% con la SEQ ID NO:8.
Tales promotores también pueden utilizarse ventajosamente si el polinucleótido de la invención es un sistema de vectores único.
Los promotores se pueden incorporar a un vector utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica. Pueden utilizarse múltiples copias de promotores o múltiples promotores en los sistemas de vectores. En una realización, el promotor puede situarse aproximadamente a la misma distancia del sitio de inicio de la transcripción que en su entorno genético natural. Se permite alguna variación en esta distancia sin que se produzca una disminución sustancial de la actividad del promotor. El vector suele incluir un sitio de inicio de la transcripción.
• Una secuencia recombinogénica que promueve la recombinación homóloga de las dos medias secuencias del ADNcin vivo,para producir la secuencia codificadora completa del polipéptido OTOF y su expresión en las células ciliadas internas transfectadas.
En algunas realizaciones, los dos polinucleótidos (por ejemplo, el primer y el segundo polinucleótidos) comprenden una denominada “región recombinogénica” que puede promover la recombinación homóloga entre los dos polinucleótidos una vez entregados a una célula (véase, por ejemplo, Ghosh et al. Hum Gene Ther. 2011 Jan;22(l):77-83).
Esta región recombinante consiste típicamente en una primera región del primer polinucleótido que tiene una región homóloga en el segundo polinucleótido, o viceversa. Las dos regiones tienen preferentemente un nivel de identidad de secuencia entre sí de al menos 75%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de identidad, como se ha definido anteriormente.
Esta región recombinogénica tiene preferentemente un tamaño comprendido entre 50 y 500, 50 y 400, 50 y 300, 100 y 500, 100 y 400, 100 y 300, 200 y 500, 200 y 400, o 200 y 300 nucleótidos.
En una realización preferida, las dos regiones son idénticas y tienen un tamaño comprendido entre 200 y 300 nucleótidos.
Estas secuencias recombinogénicas tienen secuencias que son suficientemente homólogas para permitir la hibridación entre ellas bajo condiciones estrictas y procedimientos estándar.
Como se usa en la presente, las condiciones “estrictas” para la hibridación se refieren a condiciones en las que la hibridación se lleva a cabo típicamente durante la noche a 20-25°C por debajo de la temperatura de fusión (Tm) del híbrido de ADN en 6x SSPE, 5x solución de Denhardt, 0.1% SDS, 0.1 mg/mL de ADN desnaturalizado. La temperatura de fusión se describe por la siguiente fórmula: Tm=81.5 C+16.6 Log[Na+]+0.41 (%G+C)-0.61 (% formamida)-600/longitud del dúplex en pares de bases.
Los lavados se realizan normalmente de la siguiente manera: (1) Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en 1x SSPE, 0.1% SDS (lavado de baja rigurosidad). (2) Una vez a Tm-20°C durante 15 minutos en 0.2 x SSPE, 0.1% SDS (lavado de moderada rigurosidad).
En una realización más preferida, las dos regiones son idénticas y tienen la secuencia SEQ ID NO:9 o una secuencia homóloga que tiene una identidad de secuencia de al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% con la SEQ ID NO:9.
• un sitio donante de empalme y un sitio aceptor de empalme
Una vez recombinadoin vivo,el ADNc de longitud completa contiene un par donante/aceptante de empalme que provoca el empalme de la región recombinogénica. Los polinucleótidos incluidos en el sistema de vectores dual comprenden un sitio donante de empalme o un sitio aceptor de empalme. En una realización preferida, los sitios donante de empalme y aceptor de empalme contienen secuencias de consenso de empalme. En una realización más preferida, los sitios donante y/o aceptor de empalme portados por los polinucleótidos incluidos en el sistema de vectores contienen secuencias consenso de empalme derivadas de la enzima fosfatasa alcalina.
En una realización preferida, los polinucleótidos incluidos en el sistema de vectores dual para uso de acuerdo con la invención comprende la SEQ ID NO:12 y/o la SEQ ID NO:13 como sitio donante y aceptor de empalme respectivamente, o sitios de empalme que comprenden una identidad de secuencia de al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% con la SEQ ID NO:12 y/o la SEQ ID NO:13.
Las secuencias de polinucleótidos, contenidas en un sistema de vectores único o doble, pueden contener otros componentes reguladores que sean funcionales en las células ciliadas internas en las que se va a expresar el vector. Un técnico en la materia puede seleccionar elementos reguladores para su uso en células ciliadas internas humanas. Los elementos reguladores incluyen, por ejemplo, el sitio de entrada del ribosoma interno (IRES), secuencias de terminación de la transcripción, secuencias de terminación de la traducción, potenciadores y elementos de poliadenilación.
Las regiones de terminación de la transcripción pueden obtenerse típicamente de la región 3' no traducida de una secuencia de genes eucariotas o virales. Las secuencias de terminación de la transcripción se pueden colocar corriente abajo de una secuencia codificadora para proporcionar una terminación eficiente. La secuencia del péptido señal es una secuencia amino-terminal que codifica la información responsable de la reubicación de un polipéptido enlazado operativamente a una amplia gama de destinos celulares postraduccionales, que van desde un compartimento orgánico específico hasta los sitios de acción de la proteína y el entorno extracelular. Los potenciadores son elementos de acción cis que aumentan la transcripción de genes y también pueden incluirse en un vector. Los elementos potenciadores son conocidos en la técnica, e incluyen, entre otros, el elemento potenciador CaMV 35S, el elemento potenciador del promotor temprano del citomegalovirus (CMV) y el elemento potenciador SV40.
Las secuencias de ADN que dirigen la poliadenilación del ARNm codificado por el gen estructural también pueden incluirse en un vector.
Un enfoque de vector dual es ventajoso para dividir la secuencia codificadora del gen OTOF en dos partes, con el fin de empacarse más fácilmente en viriones que tienen una capacidad de empaquetamiento limitada. Cuando se utilizan cápsides de AAV, se prefiere utilizar polinucleótidos que contengan una secuencia codificadora de OTOF que no contenga más de 5 kilobases, no más de 4 kilobases, y aún más preferentemente no más de 3 kilobases.
La secuencia codificadora del gen OTOF humano se corta preferentemente en un sitio de empalme natural.
Por ejemplo, la isoforma 1 del genOTOFhumano de la SEQ ID NO:2 puede dividirse en una parte N-terminal con una secuencia de nucleótidos como la presentada en la SEQ ID NO:3 (nucleótidos 1-2676 de la SEQ ID NO:2) y una parte C-terminal con una secuencia de nucleótidos como la presentada en la SEQ ID NO:4 (nucleótidos 2677-5994 de la SEQ ID NO:2). Y la isoforma 5 del gen OTOF humano que tiene la SEQ ID NO:22 puede dividirse en una parte N-terminal de la SEQ ID NO:3 y una parte C-terminal de la S<e>Q ID NO:23.
Los polinucleótidos ejemplares que pueden utilizarse como primer y segundo polinucleótido en el sistema de vectores de la invención son, por ejemplo, la SEQ ID NO:19 y la<s>E<q>ID NO:20 respectivamente. Estos dos polinucleótidos codifican respectivamente la parte N-terminal y la parte C-terminal de la isoforma 1 de la proteína humana Otoferlina. La SEQ ID NO:19 contiene:
- la secuencia 5 ITR de AAV2 que tiene la secuencia SEQ ID NO: 10 (nt 20-162)
- el potenciador del CMV (nt 186-440), el promotor de la p-actina de pollo (nt 441 - 835), el exón 1 y el intrón quimérico de la proteína p-actina (nt 836 - 1130), siendo los tres denominados “smCBA”, correspondientes a la secuencia SEQ ID NO:8,
- la parte 5' de la secuencia codificadora de la isoforma 1 de la Otoferlina humana que tiene la secuencia SEQ ID NO:3 (nt 1153-3558),
- el sitio donante de empalme de la fosfatasa alcalina que tiene la secuencia SEQ ID NO:12 (nt 3559-3642), - la secuencia recombinogénica que tiene la secuencia SEQ ID NO:9 (nt 3649-3935), y
- la secuencia 3' ITR de AAV2 que tiene la secuencia SEQ ID NO:11.
Por otra parte, la SEQ ID NO:20 contiene:
- la secuencia 5' ITR de AAV2 que tiene la secuencia SEQ ID NO: 10 (nt 20-162),
- la secuencia recombinogénica que tiene la secuencia SEQ ID NO:9 (nt 207-493), y
- el sitio aceptor de empalme de la fosfatasa alcalina que tiene la secuencia SEQ ID NO:13 (nt 516-564)
- la parte 3' de la secuencia codificadora de la isoterma 1 de la Otoferlina humana que tiene la secuencia SEQ ID NO:4 (nt 565-4152)
y
- la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (nt 4190-4411), y
- la secuencia 3 ’ ITR de AAV2 que tiene la secuencia SEQ ID NO:11.
Los polinucleótidos ejemplares que pueden utilizarse como primer y segundo polinucleótido en el sistema de vectores de la invención son, por ejemplo, la SEQ ID NO:19 y la SEQ ID NO:21 respectivamente. Estos dos polinucleótidos codifican respectivamente la parte N-terminal y la parte C-terminal de la isoforma 5 del gen humano de la Otoferlina de la SEQ ID NO:22 (como las partes N-terminales de las isoformas 1 y 5 son idénticas, es posible utilizar la SEQ ID NO:19 para inducir la expresión de las dos isoformas).
La SEQ ID NO:21 contiene:
- la secuencia 5’ ITR de AAV2 que tiene la secuencia SEQ ID NO: 10 (nt 20-162),
- la secuencia recombinogénica que tiene la secuencia SEQ ID NO:9 (nt 207-493), y
- el sitio aceptor de empalme de la fosfatasa alcalina que tiene la secuencia SEQ ID NO:13 (nt 516-564)
- la parte 3' de la secuencia codificadora de la isoforma 5 de la Otoferlina humana que tiene la SEQ ID NO:23 (nt 565-4152)
y
- la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (nt 4190-4411), y
- la secuencia 3 ’ ITR de AAV2 que tiene la secuencia SEQ ID NO:11.
Composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la invención
En otro aspecto, la presente invención se dirige a una composición farmacéutica que comprende el sistema de vectores de la invención, como se ha descrito anteriormente (es decir, los polinucleótidos o los viriones que contienen los mismos), para tratar a pacientes, especialmente a pacientes humanos, que tienen un sistema auditivo maduro, que sufren de sordera DFNB9 o para prevenir la sordera DFNB9 en pacientes que tienen mutaciones del DFNB9.
De manera más general, esta composición farmacéutica puede administrarse a sujetos humanos que padecen pérdida auditiva congénita debido a una expresión o deficiencia alterada del genDFNB59.Dicha deficiencia puede observarse, por ejemplo, cuando la Otoferlina se expresa a niveles normales pero no es funcional.
Se descrbe el uso del sistema de vectores, como se ha descrito anteriormente, para la fabricación de composiciones farmacéuticas destinadas a prevenir y/o tratar a los pacientes que tienen un sistema auditivo maduro, especialmente los seres humanos, que sufren de los trastornos antes citados, relacionados con la expresión o deficiencia alterada del genDFNB59.
Como se usa en la presente, “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, puede ser preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden comprender además pequeñas cantidades de sustancias auxiliares, como agentes humectantes o emulsionantes, conservadores o amortiguadores, que mejoran la vida útil o la eficacia de los compuestos antioxidantes o de las composiciones farmacéuticas que los contienen.
Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la invención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas farmacéuticas líquidas, semisólidas y sólidas, como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma utilizada depende del modo de administración y la aplicación terapéutica previstos. Las composiciones típicas se presentan en forma de soluciones inyectables o infusibles.
Las composiciones farmacéuticas suelen ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento.
La composición farmacéutica se formula preferentemente como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada a la alta concentración del fármaco. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando los vectores en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de una esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los vectores en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos liofilizados estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son el secado al vacío y el secado por pulverización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada estéril del mismo. La fluidez adecuada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensoactivos. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
En el contexto de la invención, el modo típico de administración de la composición es intratímpano (en el oído medio), intracoclear o parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular, intratecal). En un ejemplo, la composición farmacéutica se administra por infusión o inyección intravenosa. En otro ejemplo, la composición farmacéutica de la invención se administra en un lugar específico utilizando la administración estereostática, en particular a través de la membrana timpánica o la mastoides en el oído medio.
Más concretamente, las composiciones pueden administrarse mediante el uso de un microcatéter que se llevará a cabo ya sea a través de la ventana oval mediante estapedotomía láser (trans-estapedotomía) o ventana transmastoidea / trans-redonda (Dai C. et al, JARO, 18:601-617, 2017).
En una realización preferida, la composición farmacéutica de la invención se administra en el oído humano a través de la administración intracoclear, más precisamente dirigiéndose a los espacios endolinfáticos en el sistema vestibular o mediante el enfoque semicircular mencionado anteriormente.
Las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la invención típicamente incluyen una “cantidad terapéuticamente eficaz” o una “cantidad profilácticamente eficaz” de los vectores para uso de acuerdo con la invención. Una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a la cantidad de los vectores de la invención que es eficaz, en las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado, en este caso tanto para la profilaxis como para el tratamiento de la pérdida auditiva sin una toxicidad inaceptable o efectos secundarios indeseables.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de los vectores puede variar de acuerdo con factores tales como el estado patológico, la edad, el sexo y el peso del sujeto y la capacidad de dicho compuesto para provocar una respuesta deseada en el mismo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también puede ser aquella en la que los efectos terapéuticamente beneficiosos superen los efectos tóxicos o perjudiciales de los compuestos reivindicados. Una “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad de los vectores de la invención que es eficaz, en las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Normalmente, debido a que se puede usar una dosis profiláctica en sujetos antes o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz es normalmente menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. La forma de dosificación unitaria, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos mamíferos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto vector de la invención calculada para producir el efecto terapéutico o profiláctico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación de las formas de dosificación unitaria puede ser dictada y directamente dependiente de (a) las características únicas del vector o los vectores y el efecto terapéutico o profiláctico particular que se desea lograr, y (b) las limitaciones inherentes a la técnica de formular dicho(s) vector(es) para tratar o prevenir la pérdida de audición en un sujeto.
En algunas realizaciones, donde se van a usar partículas del primero y segundo AAV, los primero y segundo polinucleótidos / partículas de AAV pueden estar contenidos dentro de la misma composición o dentro de diferentes composiciones y pueden administrarse juntos o por separado.
En algunas realizaciones, la composición de la invención contiene de 106 a 1014 partículas/mL o de 1010 a 1015 partículas/mL, o cualquier valor intermedio para cualquier intervalo, tal como, por ejemplo, aproximadamente 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, o 1014 partículas/mL. En una realización, la composición de la invención contiene más de 1013 de partículas AAV/mL.
En algunas realizaciones, cuando se administra una primera partícula de AAV que comprende un primer polinucleótido y una segunda partícula de AAV que comprende un segundo polinucleótido, la cantidad administrada es la misma para ambas partículas.
Se describen procedimientos de tratamiento que implican la administración del sistema de vectores y composiciones farmacéuticas que lo contienen, a pacientes, especialmente pacientes humanos que tienen un sistema auditivo maduro, que padecen sordera DFNB9. Todas las realizaciones descritas anteriormente se aplican a dichos procedimientos de tratamiento.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la expresión de Otoferlina en células HEK293 después de la administración del vector dual de AAV.
A) Una representación esquemática del par de vectores AAV recombinantes utilizados en este estudio, y de los procesos de recombinación, transcripción, empalme y traducción que producen la proteína Otoferlina de longitud completa en células coinfectadas. Los vectores AAV-Otof NT y AAV-Otof CT recombinantes contienen las partes 5' y 3' del ADNc de Otoferlina, respectivamente. La secuencia puente recombinogénica presente en los dos vectores recombinantes está indicada por una esfera gris. Las barras rojas debajo del diagrama de proteínas indican los dos péptidos utilizados para producir los anticuerpos contra las partes N-terminal y C-terminal de la otoferlina. Abreviaturas: ITR, repeticiones de terminales invertidas; smCBA, promotor quimérico precoz inmediato de citomegalovirus / p-actina de pollo; SA, sitio aceptor de empalme; SD, sitio donante de empalme; poliA, señal de poliadenilación; C2, dominio C2; TM, dominio transmembrana. B) Se infectaron células HEK293 con AAV-Otof NT solo (panel superior), AAV-Otof CT solo (panel central) o AAV-Otof NT y AAV-Otof CT juntos (panel inferior). Se tiñeron para Otoferlina (verde) con un anticuerpo policlonal dirigido contra la parte C-terminal de la proteína 48 horas después, y los núcleos celulares se marcaron con DAPI (azul). Solo las células coinfectadas producen Otoferlina. Barras de escala: 15 pm.
La figura 2 muestra que la terapia génica dual mediada por AAV en ratones Otof -/- a los P10 restaura la expresión de Otoferlina y previene la sordera.
(a)Panel izquierdo: Imagen confocal en mosaico de las vueltas media y apical de la cóclea inyectada inmunoteñida para Otoferlina a los P70 (verde). Los núcleos celulares se tiñen con DAPI (azul). Una gran proporción de las IHC, pero ninguna de las células ciliadas externas (OHC), expresan la otoferlina. Las puntas de flecha indican IHC no transducidas. Recuadro: Mayor aumento del área enmarcada. Barras de escala: 50 pm y 10 pm (recuadro). Panel derecho; Imágenes de las IHC co-inmunoteñidas para otoferlina (verde), la proteína cinta Ribeye (azul), y la subunidad GluA2 de los receptores de glutamato postsinápticos (rojo). Las zonas activas sinápticas tienen una distribución normal en las HCI transducidas que expresan la otoferlina, mientras que tienden a formar grupos (puntas de flecha) en las HCI no transducidas (indicadas con líneas discontinuas). Barra de escala: 5 pm. (b)Panel izquierdo: Cuatro semanas después de la doble inyección de AAV, los ratonesOtof-/-mostraron umbrales de ABR en respuesta a clics o estallidos de tono a frecuencias de 8 kHz, 16 kHz y 32 kHz (puntos verdes, n = 8) cercanos a los de los ratones de tipo silvestre (puntos negros, n = 8). Por el contrario, los ratonesOtof -/-que recibieron AAV-Otof NT (puntos naranjas,n= 3) o ninguna inyección (puntos azules, n = 6) no tuvieron ondas<a>B<r>identificables hasta niveles de intensidad sonora de 86 dB SPL. Panel derecho; en los ratonesOtof-/-tratados a los P10 (flecha), los umbrales auditivos para los estímulos de clic se mantuvieron estables durante al menos seis meses después de la recuperación.(c)Panel izquierdo: Las trazas de ABR, registrados tres semanas después de la inyección terapéutica, en un ratón de tipo silvestre, un ratónOtof -/- (Otof -/-),y un ratónOtof -/-rescatado(Otof -/-inyectado), mostrando formas de onda similares en los ratones de tipo silvestre y en los rescatados. Panel derecho: el gráfico de barras muestra la latencia y la amplitud normalizada de la onda I de las ABR en ratonesOtof -/-rescatados (gris,n= 8) y ratones de tipo silvestre (negro,n= 5).
La figura 3 muestra que la terapia génica dual mediada por AAV en ratonesO tof -/-a los P17 restaura de forma duradera la expresión de la Otoferlina y la audición.
(a)Panel izquierdo: Imagen confocal en mosaico de los giros medio y apical de la cóclea inyectada, inmunoteñida para Otoferlina (verde) a los P80. Los núcleos celulares se tiñen con DAPI (azul). La mayoría de las IHC expresan otoferlina, mientras que las células ciliadas externas (OHC) no. Las puntas de flecha indican las IHC no transducidas. Recuadro: Mayor aumento del área enmarcada. Barras de escala: 5o pm y 10 pm (recuadro). Panel derecho; Imágenes de las IHC co-inmunoteñidas para otoferlina (verde), la proteína cinta Ribeye (azul), y la subunidad GluA2 de los receptores de glutamato postsinápticos (rojo). Las zonas activas sinápticas tienen una distribución normal en las HCI transducidas que expresan la Otoferlina, mientras que tienden a formar grupos (puntas de flecha) en las HCI no transducidas (indicadas con líneas discontinuas). Barra de escala: 5 pm. (b)Panel izquierdo: Umbrales de ABR de ratonesO tof-/-no tratados (azul, n = 5), ratonesOtof -/-tratados (verde, n = 5) y ratones de tipo silvestre (negro, n = 5) en respuesta a clics o estímulos de ráfagas de tonos a frecuencias de 8, 16 y 32 kHz, cuatro semanas después de la inyección intracoclear del par de vectores recombinantes en los ratones tratados. Panel derecho: curso temporal de la recuperación de la audición en los ratonesOtof-/-que recibieron las inyecciones a los P17 (flecha). El restablecimiento de la audición a niveles cercanos a los del tipo silvestre se mantiene durante al menos veinte semanas después de la inyección.(c)Panel izquierdo: trazas de ABR, registradas dos semanas después de la inyección terapéutica, en un ratón de tipo silvestre, un ratónOtof -/- (Otof -/-),y un ratónOtof -/-rescatado(Otof -/-inyectado), mostrando formas de onda similares en los ratones de tipo silvestre y en los rescatados. Panel derecho: gráfico de barras que muestra que la latencia de la onda I de la ABR en los ratonesOtof -/-rescatados (n = 5) es similar a la de los ratones de tipo silvestre (n = 5), mientras que su amplitud normalizada es aproximadamente la mitad de la de los ratones de tipo silvestre.
La figura 4 muestra que la terapia génica dual mediada por AAV en ratonesO to f-/- alos P30 restaura la expresión de la otoferlina y la audición de forma sostenida.
(a)Panel izquierdo: imagen confocal en mosaico de las vueltas media y apical de la cóclea inyectada inmunoteñida para Otoferlina a los P40 (verde). Los núcleos celulares se tiñen con D<a>P<i>(azul). La mayoría de las IHC expresan otoferlina, mientras que las células ciliadas externas (OHC) no. Las puntas de flecha indican las IHC no transducidas. Recuadro: Mayor aumento del área enmarcada. Barras de escala: 50 pm y 10 pm (recuadro). Panel derecho; Imágenes de las IHC co-inmunoteñidas para otoferlina (verde), la proteína cinta Ribeye (azul), y la subunidad GluA2 de los receptores de glutamato postsinápticos (rojo). Las zonas activas sinápticas tienen una distribución normal en las IHC transducidas que expresan la Otoferlina, mientras que tienden a formar grupos (puntas de flecha) en las IHC no transducidas (indicadas con líneas discontinuas). Barra de escala: 5 pm. (b) Umbrales de ABR de ratonesOtof-/-no tratados (azul,n= 3), ratonesOtof-/-tratados (verde,n= 3) y ratones de tipo silvestre (negro, n = 3) en respuesta a clics o estímulos de ráfaga de tonos a frecuencias de 8, 16 y 32 kHz, tres semanas (panel izquierdo), catorce semanas y veinte semanas (panel derecho) después de la inyección intracoclear del par de vectores recombinantes en los ratones tratados. En estos ratones, el restablecimiento de la audición a niveles cercanos a los del tipo silvestre se mantiene durante al menos veinte semanas después de la inyección.(c)Panel izquierdo: Las trazas de ABR, registrados siete semanas después de la inyección terapéutica, en un ratón de tipo silvestre, un ratónOtof -/- (Otof -/-), y un ratónOtof-/-rescatado(Otof -/-inyectado), mostrando formas de onda similares en los ratones de tipo silvestre y en los rescatados. Panel derecho: gráfico de barras que muestra que la latencia de la onda I del ABR en los ratonesOtof -/-rescatados (n = 3) es similar a la de los ratones de tipo silvestre (n = 3), mientras que su amplitud normalizada es aproximadamente la mitad de la de los ratones de tipo silvestre.
Lafigura 5muestra que la terapia génica dual mediada por AAV en ratonesOtofts/tsrestablece la expresión normal de la otoferlina y la audición. A) Imagen confocal de las IHC (delimitadas por líneas discontinuas) localizadas en la cóclea de media vuelta de un ratón de tipo silvestre(O to f+/+)(panel izquierdo), un ratónO to fts/ts(panel central) y un ratónOtof ts/tstratado (panel derecho), inmunotinción para otoferlina (verde). Mientras que la otoferlina muestra una agregación anormal en la base de las IHC en el ratónO tofts/ts,su expresión en las IHC de los ratones tratados es casi normal. B) Formas de onda de ABR, registradas cuatro semanas después de la inyección terapéutica, en un ratón de tipo silvestre (negro), un ratónO tofts/ts(azul), y un ratónO tofts/tsrescatado (verde), mostrando formas de onda similares en los ratones de tipo silvestre y rescatados, mientras que no se detectan ondas de ABR en el mutante no tratado.
El esquema de lafigura 6revela la maduración diferencial del sistema auditivo en humanos y en ratones (Shnerson and Willott,J. Comp. Physiol. Psychol.1980 Feb; 94(1):36-40).
Lafigura 7describe algunas de las mutaciones del gen DFNB9 que se han identificado hasta ahora. Estas mutaciones subyacen a la forma recesiva de la sordera prelingual DFNB9.
Lafigura 8muestra (A) la agregación proteica y el mal plegamiento de la Otoferlina en las células ciliadas internas del ratónO to fts/tsy (B) las respuestas auditivas del tronco cerebral (ABR) en los ratonesOtof /ts,yOtof ts/ts(véase también la figura 5).
Lafigura 9muestra el efecto de la inyección unilateral del par de vectores recombinantes AAV-Otof NT más AAV-Otof CT en ratonesO tofts/ts.5 semanas después de la inyección, el epitelio sensorial de las cócleas tratadas de tres ratonesO tofts/tsfue microdisecado e inmunomarcado para otoferlina. Se ha medido la expresión de la otoferlina en las IHC de la cóclea tratada y se ha comparado con su expresión en los ratones no tratados conO tofts/ts(véase también la figura 5).
Lafigura 10muestra la curva de activación de voltaje del loa(A)y las respuestas de ACm correspondientes(B)en las IHC de tipo silvestre, tratadas con Otof*57*5 y O to ^ . Los cambios en la capacitancia de la membrana celular (ACm) se utilizaron para monitorear la fusión de las vesículas sinápticas durante la exocitosis.
EJEMPLOS
I. Materiales y procedimientos
Animales
Los ratones con otoferlina(Otof-/-)desactivada producidos en la cepa C57BL/6 (Roux I. et al, Cell, 127, 277-289 (2006) se retrocruzaron con ratones FVB durante más de diez generaciones para obtener un fondo genético FVB homogéneo, ya que este fondo, a diferencia del C57BL/6, se asocia con umbrales auditivos estables en los primeros diez meses de vida (Kommareddi, P.,et al. J Assoc Res Otolaryngol16, 695-712 (2015)). Los vectores AAV2 recombinantes se administraron a los ratonesOtof -/-en un fondo genético FVB. Todos los procedimientos y la manipulación de los animales se ajustaron a las directrices de bienestar delInstitut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Institut Pasteur,y los NIH, así como a los requisitos del protocolo aprobado en la Universidad de California, San Francisco. Antes de la cirugía, los ratones fueron anestesiados mediante una inyección intraperitoneal de una mezcla de clorhidrato de ketamina (Ketaset, 100 mg/kg), clorhidrato de xilacina (Xyla-ject, 10 mg/kg) y acepromacina (2 mg/kg). La profundidad de la anestesia se comprobó mediante el monitoreo de la respuesta del tejido profundo al pellizco del dedo del pie. Antes y cada 24 horas después de la cirugía durante una semana, los ratones recibieron una inyección subcutánea de carprofeno (2 mg/kg) para reducir la inflamación y el dolor. Los animales se monitorearon en busca de signos de angustia y pérdida de peso anormal después de la cirugía.
Se generó un modelo de ratón portador de una mutación termosensible en el dominio C2F(Otofts/ts)(p.E1804del). Los ratonesOtofts/tsson profundamente sordos. Los resultados que se muestran en la figura 8 indican que la distribución de la otoferlina en las IHC de estos ratones es anormal/fuertemente perturbada: la proteína está agregada y mal plegada en las células ciliadas internas. Además, cuando se registran las respuestas auditivas del tronco encefálico (ABR) en ratonesO to f+/ts, yO to fts/tspara monitorear la respuesta eléctrica de las neuronas auditivas primarias y los sucesivos relés neuronales de la vía auditiva central a un estímulo de clic, se observa que, a la edad de un mes, se obtiene la forma de onda característica de las ABR en los ratonesO tof+/tsa las distintas intensidades evaluadas (40 86 dB), pero no se obtiene ninguna respuesta en los ratonesO tofts/ts,ni siquiera a 100 dB.
Construcciones de vectores AAV2 recombinantes y empaquetamiento
La secuencia codificadora completa del ADNc de la otoferlina murina (isoforma 1 deOtof1;NM_001100395.1) se dividió en un fragmento 5' (nucleótidos 1-2448) y un fragmento 3' (nucleótidos 2449-5979), y estos fragmentos se sintetizaron (Genscript, Piscataway, NJ). La construcción 5' contenía la parte 5' del ADNc deOtofl(que codifica los aminoácidos 1-816, que incluye los dominios C2A, C2B y C2C de la proteína) y un sitio donante de empalme (SD), y la construcción 3' contenía la parte 3' del ADNc deOtofl(que codifica los aminoácidos 817-1992, que incluye los dominios C2D, C2E, C2F y transmembrana de la proteína), un sitio aceptor de empalme (SA). Además, ambas construcciones contienen la secuencia puenteada recombinogénica de la fosfatasa alcalina [Lay Y et al,Hum Gene Ther17, 1036-1042 (2006); Ghosh A. et al,Hum Gene Ther22, 77-83 (2011); Dyka F.M. et al,Hum Gene Ther Methods25, 166-177 (2014)]. Los sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricciónNotl/NhelyMfel/Kpnlse agregaron a estas construcciones, que después se insertaron en un plásmido de vector AAV pTR22 como se ha descrito previamente [Lay Y et al,Hum Gene Ther17, 1036-1042 (2006); Ghosh A. et al,Hum Gene Ther22, 77-83 (2011) ; Dyka F.M. et al,Hum Gene Ther Methods25, 166-177 (2014)], que produce un par de vectores recombinantes denominados AAV-Otof NT y AAV-Otof CT. Se diseñó un vector recombinante adicional que contenía el ADNc de la proteína verde fluorescente (GFP) para que sirviera de control positivo de la transducción celular. Los vectores recombinantes se empaquetaron en la cápside AAV2 quadY-F (Petrs-Silva H. et al,Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy19, 293-301 (2011), y los virus recombinantes se purificaron y titularon por University of Florida Ocular Gene Therapy Core, como se ha descrito anteriormente [Zolotukhin S. et al,Methods28, 158-167 (2002); Jacobson SG et al.,Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy13, 1074-1084 (2006)].
Expresión del transgén en células HEK293 transfectadas
Las células HEK293 se cultivaron en placas de 6 pocillos sobre cubreobjetos recubiertos de polilisina en medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con 1x aminoácidos no esenciales y 10% de suero bovino fetal (Gibco), y penicilina-estreptomicina (Pen/Strep, Invitrogen). Al día siguiente, las células se infectaron como se ha descrito previamente (Lopes V.S. et al,Gene Ther20, 824-833 (2013). Brevemente, los cubreobjetos con las células al 75% de confluencia se incubaron en 200 pL de medio libre de suero que contenía uno o ambos virus recombinantes AAV2-Otof (10,000 partículas que contenían el genoma/célula para cada vector) a 37 °C con 5% de CO2. Dos horas después, se agregó 1 mL de medio completo. Al día siguiente se cambió el medio y se incubaron las células durante 48 horas más. Las células se fijaron con paraformaldehído al 4% en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) 0.1 M, pH 7.4, a 4°C durante dos horas, se enjuagaron tres veces con PBS y se incubaron con Tritón X-100 al 0.25% y suero de cabra normal al 5% en PBS a temperatura ambiente durante una hora. Posteriormente, las células se incubaron con anticuerpos policlonales de conejo previamente caracterizados, 14cc y C19, dirigidos contra la parte N-terminal (aminoácidos 196-211) y la parte C-terminal (aminoácidos 1848-1978) de la otoferlina, respectivamente (Roux I. et al, Cell, 127, 277-289 (2006) (dilución 1:200) a 4 °C durante la noche. Las muestras se enjuagaron dos veces con PBS y se incubaron con un anticuerpo secundario IgG anti-conejo de cabra conjugado con Cy3 (Life Technologies, dilución 1:2000) en PBS a temperatura ambiente durante dos horas. Después las muestras se enjuagaron dos veces en PBS, se tiñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para visualizar los núcleos celulares, se montaron en un portaobjetos de vidrio con una gota de medio Fluorsave (Biochem Laboratories, Francia) y se observaron con un microscopio confocal de inmunofluorescencia Olympus.
Administración del vector a la cóclea
El virus se administró a la cóclea izquierda como se ha descrito anteriormente (Akil O. et al,Neuron75, 283-293 (2012) ). Los ratones anestesiadosO tof-/-anestesiados recibieron una inyección del par de vectores AAV2-Otof a través de la membrana de la ventana redonda en la rampa timpánica de la cóclea a los P10, P17 o P30. La oreja se accedió mediante una incisión dorsal (Duan M et al,Gene Ther11 Suppl 1, S51-56 (2004). Se hizo un pequeño orificio en la bulla con una aguja 18G y se expandió con unas pinzas. La membrana de la ventana redonda se pinchó suavemente con una pipeta de vidrio capilar de borosilicato, que después se retiró. Cuando se detuvo el eflujo de la perilinfa, se inyectó un volumen fijo (2 pL) que contenía el par de vectores AAV2-Otof NT (6.3 x 1012 vg/mL) y AAV2-Otof CT (4.5 x 1012 vg/mL) en la rampa timpánica con una micropipeta fina de vidrio (diámetro de la punta exterior de 10 pm) durante un minuto. Se extrajo la pipeta y el nicho se selló rápidamente con fascia y tejido adiposo. La herida se suturó en capas con una sutura crómica absorbible 6-0 (Ethicon).
Pruebas auditivas
Las pruebas auditivas se realizaron en ratonesO tof+/+anestesiados, en ratonesOtof -/-y en ratonesOtof -/-rescatados en diferentes puntos temporales, en una cámara insonorizada, como se describió previamente (Akil O. et al,Neuron75, 283-293 (2012). Los ratones fueron anestesiados con una inyección intraperitoneal de una mezcla de clorhidrato de ketamina (Ketaset, 100 mg/mL) y clorhidrato de xilacina (Xyla-ject, 10 mg/mL), con inyecciones posteriores de una quinta parte de la dosis inicial si era necesario. La temperatura corporal se mantuvo con una almohadilla térmica y se controló con una sonda rectal durante todo el registro. Las respuestas auditivas del tronco encefálico (ABR) se registraron con el sistema TDT BioSig III (Tucker Davis Technologies) y tres electrodos de aguja subdérmicos situados en el cuero cabelludo del ratón: uno en el vértice, otro debajo del pabellón del oído izquierdo (electrodo de referencia) y otro debajo del oído contralateral (electrodo de tierra). Los estímulos sonoros eran clics (5 ms de duración, 31 Hz) y pitidos tonales a 8, 16 y 32 kHz (10 ms de duración, conformación de coseno al cuadrado, 21 Hz). Se administraron en condiciones de campo libre, con registro de la respuesta monoaural del oído izquierdo (el oído derecho se bloqueó durante el registro). Para cada estímulo sonoro, se registró la actividad electroencefalográfica (EEG) durante 20 ms a una frecuencia de muestreo de 25 kHz, con filtrado (0.3-3 kHz). Se promediaron las formas de onda del EEG para 512 estímulos y 1000 estímulos para los clics y las ráfagas de tonos, respectivamente. La intensidad del estímulo sonoro se redujo en intervalos de 5 dB de nivel de presión sonora (SPL) a partir de la intensidad máxima probada (86 dB SPL). El umbral de audición se definió como el nivel de estímulo más bajo en el que los picos ABR de las ondas I-V estaban presentes de forma clara y repetida en la inspección visual. Estas evaluaciones del umbral se confirmaron mediante el análisis fuera de línea de las formas de onda almacenadas. La latencia de la onda I de las ABR se midió como el intervalo de tiempo entre el estímulo del clic y la amplitud máxima de la onda I. Además, los valores de las amplitudes máximas de la onda I en los trazos de la ABR se normalizaron con respecto al valor medio en los ratones de tipo silvestre de control (tomado como 100 %) para una comparación entre los ratonesO tof-/-rescatados y los ratones de tipo silvestre.
Célula ciliada interna y conteos de la cinta sináptica
Las cócleas de ratón se perfundieron con paraformaldehído al 4% en PBS 0.1 M (pH 7.4) y se incubaron en el mismo fijador a 4°C durante dos horas. Las cócleas se enjuagaron tres veces con PBS y se descalcificaron mediante la incubación con ácido etilendiamino tetraacético (EDTa ) al 5% en PBS 0.1 M a 4°C durante toda la noche. El epitelio sensorial coclear (órgano de Corti) se microdiseccionó en una preparación de superficie, se preincubó en 0.25% de Triton X-100 y 5% de suero normal de cabra en PBS (amortiguador de bloqueo) a temperatura ambiente durante una hora, y se incubó con el anticuerpo primario a 4°C durante la noche. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: parte C-terminal de conejo antiotoferlina (C19, dilución 1:250) 1, ratón (IgG1) anti-CtBP2/Ribeye, subunidad A2 del receptor de glutamato de ratón (IgG2a) (Millipore, dilución 1:200), y conejo anti-GFP (Invitrogen, A11122; dilución 1:250). Las muestras se enjuagaron tres veces en PBS y se incubaron con el anticuerpo secundario apropiado: IgG1 de ratón conjugada con Alexa Fluor 488, IgG2a de ratón conjugada con Alexa Fluor 568 (Life Technologies, dilución 1:1000), o IgG de conejo conjugada con Atto Fluor 647 (Sigma, dilución 1:200). Las muestras se lavaron tres veces en PBS y se montaron en un portaobjetos de vidrio en una gota de Fluorsave, con DAPI para teñir los núcleos celulares. Se obtuvieron pilas z confocales de fluorescencia del órgano de Corti con un microscopio confocal LSM 700 (Zeiss, Oberkochen, Alemania) equipado con un objetivo de alta resolución (apertura numérica de 1.4, objetivo de inmersión en aceite de 60 x). Las imágenes se capturaron en una trama de 512 * 512 o 1024 * 1024 (tamaño de píxel = 0.036 |jm en x e y) con pasos de 0.2 jm en z. Las células ciliadas internas (IHC) que producen otoferlina y las cintas sinápticas se contaron mediante la representación en 3D de pilas z de hasta 20 imágenes confocales. Para calcular la proporción de IHC que expresan el transgén de otoferlina, se dividió el número total de IHC que producen otoferlina por el número total de IHC identificadas por sus núcleos celulares teñidos con DAPI (un mínimo de 150 consecutivos analizados).
Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR)
Se extrajo el ARNm total (Trizol, Invitrogen) de las cócleas izquierdas de seis ratonesOtof /+y seis ratonesOtof -/rescatados a los P10. La transcripción inversa (RT) se realizó con cebadores oligodT y el superíndice II RNasa H_ (Invitrogen) a 42°C durante 50 minutos. Se utilizaron dos microlitros del producto de la reacción RT para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR;TaqADN polimerasa, Invitrogen) que consistió en 35 ciclos (94°C durante 30 s, 60°C durante 45 s, 72°C durante 60 s) con extensión final a 72°C durante 10 minutos. El par de cebadores de la PCR (cebador directo TGTCTCAGAGCTCCGAGGCA (SEQ ID NO:14) y cebador inverso ATCGTGGAGGAACTGGGCA (SEQ ID NO:15) se diseñó para amplificar un fragmento intermedio de 2676 pb (nucleótidos 27 a 2702) del ADNc de la otoferlina (número de acceso NM_001100395.1 de GenBank) abarcando la unión entre los insertos AAV-OtofNT y AAV-Otof CT. Los productos de la PCR se purificaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2% que contenía 0.5 mg/mL de bromuro de etidio (kit de extracción en gel Qiaquick, QIAGEN), se secuenciaron (Elim Biopharmaceuticals) y se comprobó la identidad de la secuencia con el ADNc de la otoferlina.
Análisis estadísticos
Los datos se expresan como media ± desviación estándar (DE). Todos los análisis estadísticos se realizaron con la prueba no paramétricaUde Mann-Whitney. La significación estadística se indica en las figuras como sigue: n.s., no significativo; *,p< 0.05; **,p< 0.01; ***,p< 0.001.
II. Resultados
Se diseñó un vector basado en AAV2 para expresar el gen de la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control de un promotor quimérico CMV de p-actina de pollo. Este casete de expresión se empaquetó en la cápside de AAV2 quadY-F, en el que cuatro residuos de tirosina (Y) de la superficie de la cápside de a Av 2 se sustituyeron por residuos de fenilalanina (F), lo que demostró aumentar la eficiencia de la transferencia de genes en la retina (Petrs-Silva H. et al,Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy19(2):293-301 (2011)). El virus recombinante se inyectó a través de la membrana de la ventana redonda en la cóclea izquierda de cinco ratones de tipo silvestre a los P2. La inmunotinción con GFP del epitelio sensorial tres semanas después de la inyección reveló la transducción de varios tipos de células, incluidas las iHc. La tasa de transducción de las IHC fue del 78 ± 6% (media ± SD), lo que demuestra la adecuabilidad de este serotipo de AAV para administrar genes terapéuticos a estas células (no se muestra). La secuencia codificadora del ADNc de la otoferlina murina se dividió en un fragmento 5' (Otof NT, nucleótidos 1-2448) y un fragmento 3' (Otof CT, nucleótidos 2449-5979), cada uno de los cuales se insertó en un vector AAV que llevaba una secuencia puente recombinante (Ghosh A. et al,Hum Gene Ther22(1):77-83 (2011); Dyka FM et al,Hum Gene Ther Methods25(2):166-177 (2014)). El vector recombinante AAV-Otof NT lleva la parte 5' del ADNc seguida de un sitio donante de empalme, y el vector recombinante AAV-Otof CT lleva un sitio aceptor de empalme seguido de la parte 3' del ADNc (ver Procedimientos y la figura 1). Cada uno de estos vectores recombinantes se empacó en la cápside quadY-F del AAV. Las células HEK293 se infectaron con AAV-Otof NT, AAV Otof CT, o con ambos virus recombinantes, y se realizó una inmunotinción para la otoferlina 48 horas después. Se utilizaron dos anticuerpos diferentes, dirigidos contra la parte C-terminal o la parte N-terminal de la proteína (Roux I, et al, Cell 127:277-289 (2006)), y se obtuvieron resultados idénticos. La otoferlina se detectó únicamente en las células infectadas simultáneamente con ambos virus, lo que indica que los dos vectores fueron capaces de recombinarse y generar concámeros a través de sus repeticiones terminales invertidas, con un empalme correcto del transcrito resultante para producir la proteína (figura 1).
Se administró una única inyección unilateral del par de vectores recombinantes AAV-Otof NT más AAV-Otof CT a ratonesOtof -/-a través de la membrana de la ventana redonda en la cóclea izquierda, antes (a los P10) o después del inicio de la audición. Las inyecciones después del inicio de la audición se realizaron en uno de los dos puntos de tiempo diferentes, P17 y P30, porque la maduración de las sinapsis de la cinta de IHC todavía está en curso a los P17 (Kros CJ et al,Nature394(6690):281-284 (1998); Wong AB et al,EMBO J33(3):247-264 (2014)), mientras que la cóclea madura está madura a los P30 (Song L. et al,J Acoust Soc Am119(4):2242-2257 (2006)). Ocho semanas después de la inyección del par de vectores recombinantes a los P10, se microdiseccionó el epitelio sensorial de las cócleas tratadas de tres ratonesOtof -/-y se marcó inmunológicamente para la otoferlina (con un anticuerpo dirigido contra la parte C-terminal de la proteína) para estimar la tasa de transducción de las IHC. La proteína se detectó en más del 60% de las IHC (64 ± 6%, media ± SD, n = 3 cócleas), pero no en otros tipos de células (figura 2a, panel izquierdo). Este resultado proporciona evidencia de que un ADNc grande se puede reconstituir efectivamente en las células sensoriales cocleares después de la administración local de un par de vectores AAV recombinantesin vivo,con una producción sostenida y generalizada de la proteína por una gran proporción de las células. La exactitud del proceso de empalme del pre-ARNm en las células transducidas se comprobó mediante RT-PCR y se realizó un análisis de la secuencia de un fragmento grande del transcrito de otoferlina que abarca la unión entre los ADNc de Otof NT y Otof CT (no mostrados).
Los registros de la respuesta auditiva del tronco cerebral (ABR) en los ratones cuatro semanas después de la inyección a los P10 demostraron una restauración sustancial de los umbrales de audición en respuesta a los estímulos de clic y de ráfaga de tonos (8, 16 y 32 kHz) en todos los ratones tratados (n = 8), pero ninguna restauración en los ratonesOtof -/-que recibieron AAV-Otof NT o AAV-Otof CT solo (n = 3 cada uno), o en ausencia de inyección (n = 6) (figuras 2b,2c). Los umbrales de ABR para los estímulos de clics y ráfagas de tonos en los ratones tratados fueron similares a los de los ratones de tipo silvestre de control (n = 8; prueba U de Mann-Whitney, p >0.15 para todas las comparaciones). La eficacia a largo plazo de la terapia génica se evaluó realizando registros de ABR en respuesta a clics en varios puntos de tiempo posteriores a la inyección entre 1 y 30 semanas. A partir de la cuarta semana, los umbrales de a Br de los ratones tratados no diferían significativamente de los ratones de tipo silvestre (prueba U de Mann-Whitney,p> 0.05 para las comparaciones en todas las etapas) (Figura 2b). Sin embargo, las amplitudes de la onda I de la ABR, que refleja las respuestas eléctricas de las neuronas auditivas primarias al estímulo sonoro, eran 39 ± 7% (media ± DE) del valor medio de los ratones de tipo silvestre (prueba U de Mann-Whitney,p= 0.002), mientras que las latencias de la onda I (1.15 ± 0.09 ms) eran similares a las de los ratones de tipo silvestre (1.27 ± 0.05 ms; prueba U de Mann-Whitney,p= 0.06) (figura 2c).
Treinta semanas después de la inyección, seis de los ocho ratones que recibieron inyecciones a los P10 seguían teniendo umbrales de audición dentro de los 10 dB de los ratones de tipo silvestre. Por lo tanto, la terapia génica antes de la aparición de la audición previene la sordera en los ratonesO tof-/-.Los inventores han demostrado previamente que aproximadamente la mitad de las cintas de IHC se degeneran en los ratonesOtof -/-(Roux I, et al, Cell 127:277-289 (2006)). El número de cintas presinápticas (junto con los receptores de glutamato postsinápticos) se analizó en las IHC transducidas y en las IHC no transducidas de cócleasOtof -/-tratadas con ocho semanas después de la inyección a los P10, mediante inmunofluorescencia e imágenes de microscopía confocal 3D (figura 2a, panel derecho). El número de cintas por IHC en las células transducidas (12.5 ± 1.8, media ± SD, n = 48 células de 3 ratones) fue casi dos veces mayor que en las células no transducidas (6.9 ± 1. 3,n= 48 células de 3 ratones; prueba U de Mann-Whitney,p< 10-4), pero siguió siendo inferior a la de las IHC de tipo silvestre (16 ± 1.3, n = 48 células de 3 ratones; prueba U de Mann-Whitney,p< 10-4), lo que podría explicar la recuperación incompleta de la amplitud de la onda I en los registros de ABR.
Después de la inyección del par de vectores recombinantes en la cóclea de los ratonesOtof -/-a los P17 o P30, se detectó otoferlina en las IHC de toda la cóclea tratada, pero no en las IHC de la cóclea contralateral (no se muestra). Las tasas de transducción de las IHC fueron similares en los dos grupos de ratones (82 ± 9% y 85 ± 7%, paran= 5 yn= 3 cócleas tratadas a los P17 y P30, respectivamente), y superiores a las de los ratones que recibieron inyecciones a los P10 (prueba U de Mann-Whitney,p< 0.05 para ambas comparaciones) (Figuras 3a y 4a). Los registros de ABR realizados cuatro semanas después de la inyección mostraron una recuperación de la audición en todos los ratones que recibieron inyecciones a los P17 (n = 5), con umbrales de ABR en respuesta a clics o estímulos de ráfaga de tonos notablemente similares a los de los ratones de tipo silvestre (n = 5; prueba U de Mann-Whitney,p> 0.2 para todas las comparaciones). Los umbrales de audición en respuesta a los clics se mantuvieron sin cambios durante 20 semanas después de la inyección, lo que demuestra una restauración sostenida de la audición en estos ratones a pesar de una amplitud media de la onda I de ABR de aproximadamente la mitad que en los ratones de tipo silvestre (47 ± 10%) (Figuras 3b,c).
Asimismo, los ratonesOtof-/-que recibieron inyecciones a los P30 mostraron una recuperación similar de la audición tan pronto como tres semanas después de la inyección, con umbrales de ABR en respuesta a clics o estímulos de ráfaga de tonos que persistieron en el nivel de tipo silvestre durante 20 semanas después de la inyección(n= 3, prueba U de Mann-Whitney,p> 0.5 para las comparaciones en todas las etapas), a pesar de una amplitud media de la onda I de ABR aproximadamente la mitad (55 ± 10%) que en los ratones de tipo silvestre (Figura 4b,c). El número de cintas presinápticas (junto con los receptores de glutamato postsinápticos) se analizó en las IHC transducidas y en las IHC no transducidas de cócleas deOtof -/-tratadas a los P17 y a los P30, mediante inmunofluorescencia e imágenes de microscopía confocal 3D (Figuras 3a y 4a). El número de cintas por IHC en las células transducidas (10.0 ± 1.3, media ± SD,n= 48 células de 3 ratones tratados a los P17 y analizados a los P80, y 8.9 ± 2.3,n= 48 células de 3 ratones tratados a los P30 y analizados a los P40) era mayor que en las células no transducidas de las mismas cócleas (6.2 ± 1.3, n = 48 células, y 5.8 ± 0.7, n = 48 células, respectivamente; prueba de la U de Mann-Whitney,p< 10'4 para ambas comparaciones), pero fueron menores que en las IHC de ratones de tipo silvestre de 10 semanas de edad (16 ± 1.3,n= 48 células de 3 ratones; prueba de la U de Mann-Whitney,p< 10'4 para ambas comparaciones). Como el número de cintas por IHC ya estaba notablemente reducido en los ratonesOtof -/-no tratados y analizados a los P15 (8.2 ± 1.0,n= 48 células de 3 ratones), y se mantuvo inesperadamente estable en las IHC no transducidas de los ratones tratados en etapas posteriores (véanse anteriormente los valores para los P40, P70 y P80), puede deducirse que la terapia génica en las IHC de los ratonesOtof -/-aumentó el número de cintas promoviendo su producción en lugar de prevenir su degeneración.
Utilizando la terapia génica dual con AAV divulgada anteriormente, administrada a los P30 en los animales, también ha sido posible restaurar tanto la distribución normal de la otoferlina como la función auditiva hasta umbrales de ABR casi normales en un modelo de ratón portador de una mutación humana termosensible en su gen DFNB9 (ratonesOtofts/ts,figura 5).
Más concretamente, se ha demostrado que la terapia génica viral dual sobrescribe los agregados de otoferlina debido a la mutación humana termosensible en dicho modelo de ratón DFNB9 (Figura 9). En este experimento, se administró una única inyección unilateral del par de vectores recombinantes AAV-Otof NT más AAV-Otof CT a ratonesO tofts/tsa través de la membrana de la ventana redonda en la cóclea izquierda, después de que el inicio de la audición se llevara a cabo a los P30. 5 semanas después de la inyección, el epitelio sensorial de las cócleas tratadas de tres ratonesOtof ts/tsfue microdisecado e inmunomarcado para otoferlina (véase las figuras 9). La expresión de otoferlina en la IHC (líneas discontinuas) de la cóclea tratada se encontró casi normal en comparación con los agregados de otoferlina en la cóclea no tratada del ratónO tofts/ts(flechas).
Finalmente se ha comprobado que dicha terapia génica viral dual restablece las corrientes de calcio y la exocitosis de la IHC en este modelo animal, como se muestra en la figura 10.
Claims (15)
1. Un sistema de vectores que comprende al menos dos partículas de AVV, cada una de ellas con un polinucleótido que comprende una secuencia codificadora parcial que codifica i) la parte N-terminal del polipéptidoOtoferlina,o de un fragmento funcional del mismo, para una, y ii) la parte C-terminal del polipéptidoOtoferlina,o de un fragmento funcional del mismo, para la otra, permitiendo dicho sistema vectorial la expresión del polipéptido de Otoferlina de longitud completa, o de un fragmento funcional del mismo, en células ciliadas internas, para su uso en el tratamiento de pacientes que padecen sordera DFNB9 o para prevenir la sordera DFNB9 en pacientes que tienen mutaciones de DFNB9, en el que dichos pacientes son humanos que tienen un sistema auditivo desarrollado y maduro.
2. El sistema de vectores para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido de Otoferlina tiene la secuencia SEQ ID NO:1.
3. El sistema de vectores para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido de Otoferlina tiene la secuencia SEQ ID NO:5.
4. El sistema de vectores para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichos pacientes humanos son bebés recién nacidos, niños pequeños, infantes, adolescentes o adultos.
5. El sistema de vectores para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende al menos dos partículas de a Av , comprendiendo cada una de dichas partículas de AAV:
a) para una, un primer polinucleótido que comprende una repetición terminal invertida en cada extremo de dicho polinucleótido, y, entre dichas repeticiones terminales invertidas, de 5' a 3': un promotor adecuado seguido de una secuencia codificadora parcial que contiene la parte N-terminal del gen de laOtoferlina,y un sitio donante de empalme, y
b) para la otra, un segundo polinucleótido que comprende una repetición terminal invertida en cada extremo de dicho polinucleótido, y, entre dichas repeticiones terminales invertidas, de 5' a 3': un sitio aceptor de empalme, una secuencia codificadora parcial que contiene la parte C-terminal del gen de laOtoferlina,opcionalmente seguida de una secuencia de poliadenilación,
en el que los dichos primero y segundo polinucleótidos contienen también una secuencia recombinogénica que está situada después del sitio donante de empalme en dicho primer polinucleótido y antes del sitio aceptor de empalme en dicho segundo polinucleótido, y
en el que las secuencias codificadoras en el primer y segundo polinucleótidos, cuando se combinan, codifican la longitud completa del polipéptido Otoferlina, o un fragmento funcional del mismo.
6. El sistema de vectores para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho gen de laOtoferlinatiene la secuencia de la SEQ ID NO:2 o de la SEQ ID NO:22.
7. El sistema de vectores para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicha parte N-terminal del gen de laOtoferlinaes de la SEQ ID NO:3 y dicha parte C-terminal del gen de laOtoferlinaes de la SEQ ID NO:23 o de la SEQ ID NO:4.
8. El sistema de vectores para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que dichas partículas de AAV son del serotipo AAV2.
9. El sistema de vectores para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende las partículas de AAV2 en las que la cápside se ha modificado sustituyendo los residuos de aminoácidos tirosina por los residuos de aminoácido fenilalanina.
10. El sistema de vectores para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que dichos pacientes humanos se han diagnosticado con sordera DFMB9 después de desarrollar el lenguaje.
11. El sistema de vectores para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que dichos pacientes son humanos jóvenes o adultos que padecen sordera DFNB9 inducida por mutaciones termosensibles, preferentemente seleccionadas de: P.Q994VfsX6, P.I515T, p.G541S, PR1607W, p.E1804del.
12. Una composición farmacéutica que comprende al menos dos partículas de AAV, comprendiendo cada una de ellas un polinucleótido que comprende una secuencia codificadora parcial que codifica i) la parte N-terminal del polipéptido de Otoferlina o de un fragmento funcional del mismo, por una, y ii) la parte C-terminal del polipéptido de Otoferlina o de un fragmento funcional del mismo, por la otra, así como un vehículo farmacéuticamente aceptable, para su uso en el tratamiento de pacientes que padecen sordera DFNB9 o para la prevención de la sordera DFNB9 en pacientes que tienen mutaciones de DFNB9, en la que dichos pacientes son humanos que tienen un sistema auditivo desarrollado y maduro, tal como los recién nacidos, niños pequeños, infantes, adolescentes o adultos.
13. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, en la que dicha parte N-terminal del gen de Otoferlian es de la SEQ ID NO:3 y dicha parte C-terminal del gen de Otoferlina es de la SEQ ID NO:4 o de la SEQ ID NO: 23.
14. La composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 12 o 13, en la que dichas partículas de AAV son del serotipo AAV2, preferentemente en la que la cápsida se ha modificado sustituyendo los residuos de aminoácidos de tirosina por residuos de aminoácidos de fenilalanina.
15. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 12, 13 o 14, en la que dichos pacientes son adolescentes o seres humanos adultos que padecen sordera DFNB9 inducida por mutaciones termosensibles, preferentemente seleccionadas de: P.Q994VfsX6, P.I515T, p.G541S, PR1607W, p.E1804del.
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| Class et al. | Patent application title: METHOD OF TREATING OR PREVENTING HEARING LOSS Inventors: Manohar Bance (Halifax, CA) Manohar Bance (Halifax, CA) George Robertson (Halifax, CA) Jian Wang (Halifax, CA) Assignees: Audigen Inc. |